RS56809B1 - Vap-1 inhibitori za upotrebu u lečenju fibroznih stanja - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na inhibitore VAP-1 za upotrebu kao anti-fibrozni agensi.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Fibrozna stanja obično se javljaju kao rezultat poremećenog procesa zarastanja rana nakon traume ili hroničnog zapaljenja. Fibrozna patologija naročito preovlađuje u organima koji su redovno izloženi hemijskim i biološkim napadima, npr. jetra, pluća, koža i bubreg. Uprkos tome, ako je poremećaj akutan ili hroničan, oni dele zajednučku karakteristiku abnormalne aktivacije fibroblasta i akumulacije ekstracelularnog matriksa (ECM), što dovodi do gubitka funkcije organa jer je normalno tkivo zamenjeno tkivom sa ožiljcima. Stanje je progresivno, često nepovratno sa lošom prognozom i stopom preživljavanja.

[0003] Sastav fibroznih ožiljaka je prilično sličan bez obzira na uzrok povrede. Dijagnoza i verifikacija ozbiljnosti fibroze su od izuzetne važnosti sa prognostičke tačke gledište. Postupak donošenja odluke o lečenju u velikoj meri se zasniva na proceni fibroze, njene progresije i pojave komplikacija. Kod fibroze jetre, perkutana biopsija jetre je zlatni standard za određivanje klase i stupnja bolesti jetre. Ovo je, međutim, invazivna procedura sa određenim neizbežnim rizicima i komplikacijama obično povezanim sa bolom i nelagodnošću. Stopa smrtnosti, usled komplikacija iz procedure, u opsegu je od 1:1000 do 1:10000 (Crockett et al., 2006).

[0004] Pronađeno je da su nivoi aktivnosti monoamin oksidaze u serumu povišeni kod pacijenata sa cirozom, hroničnim hepatitisom i kancerom jetre povezanim sa fibrozom, ali je pronađeno da su normalni kod pacijenata sa zapaljenskim poremećajima vezivnog tkiva kao što je reumatoidni artritis ili sistemski eritemski lupus (McEwen i Castell 1967, J Lab Clin Med.70:36-47; Ito et al.1971 Digestion. 4:49-58; Ma Lin et al., 1976, Proc Soc Exp Biol Med.151:40-3). Međutim, povišena aktivnost monoamin oksidaze u serumu smatra se samo kao marker ili kao odgovor na oštećenje tkiva, a nije poznato da ima ulogu u patogenezi fibroze.

[0005] Konvencionalni terapeutski pristupi uglavnom su bili usmereni ka zapaljenskom procesu fibroze, upotrebom kortikosteroida i imunosupresivnih lekova. Međutim, nažalost ovi agensi imaju malo do nikakvog kliničkog efekta i postoji jasna potreba za novim lekovima za lečenje fibroznih stanja.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0006] Ciljevi ovog pronalaska odnose se na VAP-1 inhibitore za upotrebu kao anti-fibrozni agensi i upotrebe VAP-1 inhibitora za proizvodnju medikamenta za lečenje fibroznog stanja, pri čemu VAP-1 inhibitor predstavlja potpuno humano anti-VAP-1 antitelo koje obuhvata jednu do tri CDR konsenzusne sekvence odabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO 1 do 3 i/ili polipeptid lakog lanca koji obuhvata jednu do tri CDR konsenzusne sekvence odabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO 24 do 26. U nekim primerima izvođenja, pomenuto anti-VAP-1 antitelo ima polipeptid teškog lanca koji obuhvata prvu CDR sekvencu odabranu od SEQ ID NO 4 do 8, drugu CDR sekvencu odabranu od SEQ ID NO 9 do 13, i treću CDR sekvencu odabranu od SEQ ID NO 14 do 18, i/ili polipeptid lakog lanca koji obuhvata prvu CDR sekvencu odabranu od SEQ ID NO 27 do 31, drugu CDR sekvencu odabranu od SEQ ID NO 32 do 36 i treću CDR sekvencu odabranu od SEQ ID NO 37 do 41.

[0007] U nekim daljim primerima izvođenja, pomenuto anti-VAP-1 antitelo ima varijabilni region teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO 19 do 23, i odnosni varijabilni region lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO 42 do 46. U nekim još daljim primerima izvođenja, pomenuto antitelo je rekombinantno potpuno humano rekombinantno antitelo koje obuhvata polipeptid teškog lanca prikazan u SEQ ID NO 47 i polipeptid lakog lanca prikazan u SEQ ID NO 48.

[0008] U nekim daljim primerima izvođenja gornjih ciljeva, fibrozno stanje je odabrano iz grupe koju čine fibroza jetre i zapaljenska stanja koja su mu predodređena tj. akutni i hronični hepatitis, bilijarna bolest i toksično oštećenje jetre, plućna fibroza, bubrežna fibroza, uključujući ono koje potiče od dijabetesne nefropatije, mijelofibroza, fibroza pankreasa, skleroderma, bolesti vezivnog tkiva, ožiljci, fibroza kože, srčana fibroza, transplatacija organa, vaskularna stenoza, restenoza, fibroza arterija, artrofibroza, fibroza dojke, mišićna fibroza, retroperitonealna fibroza, tiroidna fibroza, fibroza limfnih čvorova, fibroza bešike, pleuralna fibroza i HOBP, bolest u kojoj su zidovi disajnih puteva fibrozni sa akumulacijom miofibroblasta i kolagena, i, kao i sva fibrozna tkiva, kontrahovani.

[0009] Drugi specifični primeri izvođenja ovog pronalaska navedeni su u zavisnim patentnim zahtevima.

[0010] Drugi ciljevi, detalji i prednosti ovog pronalaska postaće očigledni iz slika, detaljnog opisa i primera koji slede.

KRATAK OPIS SLIKA

[0011] U nastavku, ovaj pronalazak biće detaljnije opisan putem poželjnih primera izvođenja upućivanjem na priložene slike, u kojima

FIG.1 prikazuje da davanje VAP-1 antitela BTT-1029 dovodi do skoro potpune zaštite od CCI4 indukovane fibroze jetre. Bojenje Sirius crvenom jetri iz WT i VAP-1 nokaut miševa injektiranih sa mineralnim uljem (MO, kontrolna grupa), CCI4 ili CCI4 paralelno sa VAP-1 antitelom.

Kvantitativno merenje fibroznih ožiljaka izvedeno je upotrebom Image J analize praga. Prikazane su srednje vrednosti ±SEM iz tri seta. Uveličanje x10.

FIG.2 prikazuje da VAP-1 antitelom tretirane jetre i VAP-1 nokaut jetre pokazuju značajan nedostatak hepatitisa i nekrotičnih oblasti uprkos indukciji CCI4-fibroze. Prikazano je bojenje hematoksilinom i eozinom pri uveličanju x20 koje ističe nekrotične hepatocite (vrhovi strelica) i hepatitis u toku (strelice).

FIG.3 prikazuje da je povećanje ekspresije kolagena IV i elastina u fibroznim tkivima sprečeno VAP-1 antitelom. Kvantitativna merenja bojenja kolagena IV, elastina i laminina izvedena su upotrebom Image J analize praga. Prikazane su srednje vrednosti ±SEM iz tri seta.

FIG.4 prikazuje da mRNK nivoi ukazuju na regulatorni efekat VAP-1 na hepatične stelatne ćelije i fibroblaste. Prikazana je kvantitativna RT-PCR analiza elastina, aSMA, VAP-1 i TIMP1. Podaci su prikazani kao srednje vrednosti ±SEM iz tri miša merene tri puta. *p<0,05, **<0,01, ***<0,001 (ANOVA).

FIG.5 prikazuje da aktivnost rastvorljivog VAP-1 u SSAO u serumu raste kao odgovor na CCI4 indukovanu fibrozu jetre. FIG.5A prikazuje efekat CCI4-indukovane fibroze jetre na nivoe rastvorljivog VAP-1 u serumu analizirane sa vremenski razloženim fluorometrijskim DELFIA ogledom. FIG.5B prikazuje da su povišeni nivoi SSAO aktivnosti otkriveni u serumu iz CCI4-indukovanih WT jetri radiohemijskim ispitivanjem.

FIG.6 prikazuje da su glomerularne lezije indukovane sa CCI4 spašene u VAP-1 nokaut miševima i VAP-1 antitelom tretiranim C57BL/6 miševima. Prikazano je bojenje hematoksilinom i eozinom pri uveličanju x40, koje ističe glomerul.

FIG.7 prikazuje da je akumulacija kolagena, kao rezultat CCI4 indukovane glomerularne fibroze, značajno smanjena u VAP-1 nokaut miševima i VAP-1 antitelom tretiranim miševima. Prikazana su bojenja Sirius crvenom bubrega iz WT i VAP-1 nokaut miševa injektiranih mineralnim uljem (MO, kontrolna grupa), CCI4 ili CCI4 paralelno sa VAP-1 antitelom. Kvantitativno merenje fibroznih ožiljaka izvedeno je upotrebom Image J analize praga. Prikazane su srednje vrednosti ±SEM iz tri seta. Uveličanje x40.

FIG.8 prikazuje smanjenje ukupnog broja ćelija u tečnosti za bronhoalveolarni lavaž iz VAP-1 antitelom (BTT-1029) tretiranih miševa izloženih duvanskom dimu u poređenju sa miševima tretiranih nosačem.

FIG.9 prikazuje smanjenje ukupnog broja ćelija u tečnosti za bronhoalveolarni lavaž iz kontrolnih roflumilastom tretiranih miševa izloženih duvanskom dimu u poređenju sa miševima tretiranih nosačem.

FIG.10 prikazuje značajno smanjenje u formiranju medija u deksametazon-tretiranoj grupi i obe grupe tretirane SSAO inhibitorom (BTT-2089) u poređenju sa NaCl 0,9% tretiranom kontrolnom grupom.

FIG.11 prikazuje značajno smanjenje u formiranju neointime u deksametazon- tretiranoj grupi i obe grupe tretirane SSAO inhibitorom (BTT-2089) u poređenju sa NaCl 0,9% tretiranom kontrolnom grupom.

FIG.12 prikazuje primere hematoksilin floksin šafranom (HPS) obojenih segmenata krvnih sudova. Veličina lumena povećana je u SSAO inhibitorom tretiranim grupama C i D u poređenju sa kontrolnom grupom A. A - NaCl 0,9% grupa; B - Deksametazon; C - BTT208910mg/kg; D - BTT-208930mg/kg.

FIG.13 prikazuje tkivo iz normalne, NASH cirozne i ALD cirozne jetre obojene sa anti-VAP-1 antitelom ili izotipski odgovarajućim kontrolnim antitelom. VAP-1 bojenje prikazuje tamnije u NASH ciroznoj i ALD ciroznoj jetri u poređenju sa normalnom ili izotipskom kontrolom i odražava povećanje VAP-1 ekspresije u oblastima fibroze.

FIG.14 prikazuje tkivo iz normalne i NASH cirozne jetre obojene sa anti-VAP-1, anti-CD31 i antikolagen IV antitelom. VAP-1 bojenje naznačeno je strelicama i prisutno je pretežno samo u NASH ciroznoj jetri i odražava povećanje VAP-1 ekspresije u oblastima fibroze.

FIG.15 prikazuje tkivo iz NASH cirozne jetre obojeno sa anti-VAP-1, anti-CD90 i anti-CD3 antitelom. VAP-1 bojenje naznačeno je strelicama i prisutno je u NASH ciroznoj jetri i odražava povećanje VAP-1 ekspresije u oblastima fibroze.

FIG.16 prikazuje hepatične stelatne ćelije obojene sa anti-VAP-1 i anti-glatkomišićni aktin antitelom, i miofibroblaste jetre obojene sa anti-VAP-1, anti-CD90 i anti-kolagen IV antitelom. VAP-1 bojenje naznačeno je strelicama i prisutno je u hepatičnim stelatnim ćelijama i miofibroblastima jetre.

FIG.17 je dijagram rasipanja sVAP-1 nivoa i odgovarajućeg histološkog stupnja fibroze. Linije označavaju srednje vrednosti.

FIG.18 prikazuje krive radne karakteristike prijemnika (ROC) za sVAP-1 korišćen kao usamljen biomarker da bi se predvidela značajna fibroza jetre (F2-4) (Fig.18A), napredna fibroza jetre (F3-4) (Fig.18B) i ciroza (F4) (Fig.18C).

FIG.19 prikazuje krive radne karakteristike prijemnika (ROC) za rezultat fibroze izračunat iz sVAP-1 nivoa, statusa dijabetesa i AST/ALT odnosa (0,837 sVAP-1(ng/ml) x 0,001 dijabetes (da=1 ne=0) x 0,591 logAST/ALT x 0,8) da bi se predvidela značajna fibroza (F2-4) (Fig.19A), napredna fibroza (F3-4) (Fig.19B) i ciroza (F4) (Fig.19C).

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0012] Ovaj pronalazak zasniva se na iznenađujućem nalazu da Vaskularni Adhezivni Protein-1 (VAP-1), takođe poznat kao semikarbazid-osetljiva amin oksidaza (SSAO) i određen humanim genom AOC3, ima direktnu ulogu u formiranju fibroznog tkiva. Do danas, pokazalo se da je VAP-1 uključen u brojne zapaljenske bolesti posredovanjem u migraciji leukocita u tkivo, ali nije se pokazalo da je direktno uključen u patogenezu same fibroze.

[0013] Izraz "fibroza" odnosi se na formiranje ili prisustvo viška vezivnog tkiva u organu ili tkivu. Može se javiti kao odgovor popravke ili zamene na stimulans kao što je oštećenje ili zapaljenje tkiva.

[0014] Jedan od ciljeva koji su u osnovi ovog pronalaska bio je da se ispita uloga VAP-1 inhibitora u zaštiti različitih organa protiv fibroznog oštećenja. Dobijeni su odlični rezultati npr. kod hroničanog fibroznog oštećenja jetre uzrokovanog ugljenik tetrahloridom kod miševa, u mišjem modelu hronične obstruktivne bolesti pluća (HOBP) indukovane duvanskim dimom i u mišjem modelu vaskularnog remodelovanja, vaskularne stenoze i neointimalnog zadebljanja (fibroza). Tako, VAP-1 inhibitori zaista se mogu posmatrati kao antifibrozni agensi.

[0015] Ovde je opisan postupak smanjivanja ili lečenja fibroze in vivo, u ljudskom telu, davanjem, humanom pacijentu kom je potrebno takvo lečenje, efikasnog nivoa VAP-1 inhibitora. Izraz "tretman" ili "lečenje" ima za cilj da uključi davanje VAP-1 inhibitora subjektu za svrhe koje mogu da uključuju profilaksu, poboljšanje, prevenciju ili izlečenje poremećaja koji uključuju fibrozu, kao što su fibroza jetre i zapaljenska stanja koja su joj predodređena tj. akutni i hronični hepatitis, bilijarna bolest i toksično oštećenje jetre, plućna fibroza, bubrežna fibroza, uključujući onu koja potiče od dijabetesne nefropatije, mijelofibroza, fibroza pankreasa, skleroderma, bolesti vezivnog tkiva, ožiljci, fibroza kože, srčana fibroza, transplatacija organa, vaskularna stenoza, restenoza, fibroza arterija, artrofibroza, fibroza dojke, mišićna fibroza, retroperitonealna fibroza, tiroidna fibroza, fibroza limfnih čvorova, fibroza bešike, pleuralna fibroza i HOBP, bolest u kojoj su zidovi disajnih puteva fibrozni sa akumulacijom miofibroblasta i kolagena, i, kao i sva fibrozna tkiva, kontrahovani.

[0016] "Efikasan nivo" VAP-1 inhibitora znači nivo u kom su štetni efekti fibroze, najmanje, poboljšani. Količine i režimi za davanje VAP-1 inhibitora mogu se lako odrediti od strane prosečnih stručnjaka u kliničkoj oblasti lečenja fibroza-povezanih poremećaja. Poželjno, VAP-1 inhibitori koji su monoklonalna anti-VAP-1 antitela obezbeđuju se intravaskularno u intervalima koji su u opsegu između jednom nedeljno do jednom svaka tri meseca u dozama u opsegu od 0,01 do 20 mg/kg, poželjnije u opsegu od 0,1 do 15 mg/kg, najpoželjnije 1,0 do 10 mg/kg. Alternativno, VAP-1 inhibitori obezbeđuju se subkutano u intervalima koji su u opsegu između jednom nedeljno do jednom svaka tri meseca u dozama u opsegu od 0,1 do 20 mg/kg, poželjnije u opsegu od 0,2 do 10 mg/kg, najpoželjnije 0,5 do 5 mg/kg.

[0017] Takođe su opisani inhibitori SSAO, koji se mogu dati u efektivnoj količini unutar doznog opsega od oko 0,1 µg/kg do oko 300 mg/kg, poželjno između 1,0 µg/kg do 10 mg/kg. Takva jedinjenja mogu se dati u jednoj dnevnoj dozi, ili po kg telesne mase, a ukupna dnevna doza može se dati u podeljenim dozama dva, tri ili četiri puta dnevno.

[0018] Gornji aspekt može se formulisati na alternativan način, tj. tako da neki primeri izvođenja ovog pronalaska obezbeđuju anti-VAP-1 antitela kao antifibrozne agense za prevenciju, lečenje i/ili ublažavanje fibroznog stanja, kao što su fibroza jetre i zapaljenska stanja koja su mu predodređena tj. akutni i hronični hepatitis, bilijarna bolest i toksično oštećenje jetre, plućna fibroza, bubrežna fibroza, uključujući ono koje potiče od dijabetesne nefropatije, mijelofibroza, fibroza pankreasa, skleroderma, bolesti vezivnog tkiva, ožiljci, fibroza kože, srčana fibroza, transplatacija organa, vaskularna stenoza, restenoza, fibroza arterija, artrofibroza, fibroza dojke, mišićna fibroza, retroperitonealna fibroza, tiroidna fibroza, fibroza limfnih čvorova, fibroza bešike, pleuralna fibroza i HOBP, bolest u kojoj su zidovi disajnih puteva fibrozni sa akumulacijom miofibroblasta i kolagena, i, kao i sva fibrozna tkiva, kontrahovani. Prema tome, anti-VAP-1 antitela mogu da se koriste za proizvodnju medikamenta za pomenuta fibrozna stanja.

[0019] Izraz "VAP-1 inhibitor" odnosi se na bilo koje jedinjenje koje ima sposobnost da blokira funkciju VAP-1 ili njegovu SSAO aktivnost. VAP-1 inhibitori mogu da se podele u dve glavne kategorije, blokirajuća antitela i SSAO inhibitori.

[0020] Kako se ovde koristi, izraz "anti-VAP-1 antitelo" (Ab) ili "monoklonalno anti-VAP-1 antitelo" (MAb) znači da uključi netaknuta antitela kao i fragmente antitela, kao što su Fab i F(ab')2 fragmenti, koji mogu da se specifično vezuju za VAP-1 protein.

[0021] Pogodna anti-VAP-1 antitela za upotrebu u raznim aspektima ovog pronalaska dostupna su u ovoj oblasti, a dalja antitela mogu da se proizvedu postupcima poznatim prosečnom stručnjaku. Na primer, US Patent 5,580,780 opisuje monoklonalno antitelo (mAb), 1B2, koje prepoznaje humani VAP-1 i koje može da blokira limfocitno vezivanje za tonzilni HEV u ogledu sa zamrznutim delom. MAb 1 B2 je mišje IgM-antitelo i specifično je za humani VAP-1. Međunarodna objava patenta WO 03/093319 opisuje himerno anti-VAP-1 monoklonalno antitelo BTT-1002, koje smanjuje imunogenost u poređenju sa odgovarajućim mišjim antitelima. Međutim, budući da je himerno antitelo, njegova primenljivost na humano lečenje je ugrožena zbog njegove imunogenosti i rezultujuće proizvodnje antitela protiv toga.

[0022] Međunarodna objava patenta WO 2008/129124 opisuje potpuno humana anti-VAP-1 antitela sa smanjenom imunogenošću i oslobađanjem citokina. Primeri poželjnih potpuno humanih monoklonalnih anti-VAP-1 antitela uključuju one koji imaju polipeptid teškog lanca koji obuhvata jednu do tri CDR konsenzusne sekvence odabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO 1 do 3 i/ili polipeptid lakog lanca koji obuhvata jednu do tri CDR konsenzusne sekvence odabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO 24 do 26. Druga poželjna anti-VAP-1 antitela uključuju ona koja imaju polipeptid teškog lanca koji obuhvata prvu CDR sekvencu odabranu od SEQ ID NO 4 do 8, drugu CDR sekvencu odabranu od SEQ ID NO 9 do 13, i treću CDR sekvencu odabranu od SEQ ID NO 14 do 18 i/ili polipeptid lakog lanca koji obuhvata prvu CDR sekvencu odabranu od SEQ ID NO 27 do 31, drugu CDR sekvencu odabranu od SEQ ID NO 32 do 36 i treću CDR sekvencu odabranu od SEQ ID NO 37 do 41.

[0023] U drugim primerima izvođenja ovog pronalaska, potpuno humano anti-VAP-1 antitelo je ono označeno kao 8C10 i obuhvata varijabilni region teškog lanca prikazan u SEQ ID NO 19 i varijabilni region lakog lanca prikazan u SEQ ID NO 42. U nekim drugim primerima izvođenja, anti-VAP-1 antitelo je ono označeno kao 8A4 i ono obuhvata varijabilni region teškog lanca prikazan u SEQ ID NO 20 i varijabilni region lakog lanca prikazan u SEQ ID NO 43. U daljim primerima izvođenja, anti-VAP-1 antitelo je ono označeno kao 3F10 i koje obuhvata varijabilni region teškog lanca prikazan u SEQ ID NO 21 i varijabilni region lakog lanca prikazan u SQ ID NO 44. U još daljim primerima izvođenja, anti-VAP-1 antitelo je ono označeno kao 5F12 i koje obuhvata varijabilni region teškog lanca prikazan u SEQ ID NO 22 i varijabilni region lakog lanca prikazan u SEQ ID NO 45. U čak još daljim primerima izvođenja, anti-VAP-1 antitelo je ono označeno kao 4B3 i koje obuhvata varijabilni region teškog lanca prikazan u SEQ ID NO 23 i varijabilni region lakog lanca prikazan u SEQ ID NO 46. Ova antitela mogu takođe da budu obezbeđena kao rekombinantna antitela, kao što je rekombinantno r8C10 (BTT-1023) koje obuhvata polipeptid teškog lanca prikazan u SEQ ID NO 47 i polipeptid lakog lanca prikazan u SEQ ID NO 48.

[0024] Primeri SSAO inhibitora opisani ovde uključuju, ali bez ograničenja, derivate hidrazina kao što su alilhidrazini, naročito fenilalilhidrazini; i derivate hidroksilamina (tj. aminoksi). Specifičniji primeri fenilalilhidrazina uključuju, ali bez ograničenja, 2-(fenil-alil)-hidrazin, N-[2-(4'-fluorofenil)-alil]-hidrazin i (E)-1-fluoro-2-fenil-3-hidrazinopropen, pri čemu specifičniji primeri derivata hidroksilamina uključuju, ali bez ograničenja, 2-aminooksil-1-fenil-etanol, i 2-aminooksil-1-(3',4'-dimetoksi-fenil)-etanol. Takvi SSAO inhibitori opisani su u WO2006/094201 i WO2005/014530. Drugi derivati hidrazina uključuju acetohidrazide kao što je, ali bez ograničenja, 2-(4-{2-[5-(4-acetilpiperazin-1-il)piridin-2-il]etil}fenil)acetohidrazid opisan u WO 2009/145360; i hidrazin alkohole kao što su, ali bez ograničenja, (1R,2S)-2-(1-metilhidrazino)-1-fenil-1-propanol, (1R, 2S)-2-(1-metilhidrazino)-1,2-difeniletanol, 1-(1'-metilhidrazino)-3-(m-metoksifenoksi)-2-propanol, i (1S, 2R)-2-(1-metilhidrazino)-1,2-difeniletanol (BTT-2079) opisani u WO 02/02090; i hidrazin indane kao što je, ali bez ograničenja, (1S,2S)-2-(1-metilhidrazino)-1-indanol opisan u WO 03/006003 i WO2005/080319.

[0025] Dalji primeri SSAO inhibitora uključuju, ali bez ograničenja, propenil- i propargilamine, 4-supstituisane-2-butinilamine, haloalilamine (naročito 2- i 3- haloalilamini), derivate pirolina, propargildiamine, alilamine i diamine. Specifičniji primeri gornjih SSAO inhibitora uključuju, ali bez ograničenja, 5-fenoksipenta-2,3-dienilamin, 4-(4-metoksifenil)but-3-inilamin, 4-fenilbut-3-inilamin, 2-fenil-3-fluoroalilamin, S-(E)-4-(4-amino-2-fluorobut-2-eniloksi)-N-(1-feniletil)benzamid, (E)-3-fluoro-4-(4-(metilsulfonil)fenoksi)but-2-en-1-amin, (E)-3-fluoro-4-(2-metilbenzo[d]tiazol-5-iloksi)but-2-en-1-amin, (E)-4-(4-amino-2-fluorobut-2-eniloksi)-N-(1-feniletil)benzensulfonamid i (E)-2-(4-fluorofenetil)-3-fluoroalilamin (BTT-2089, mofegelin). Takva jedinjenja opisana su u WO 2007/005737, WO 2005/082343, WO 2009/066152, WO 2009/055002, i Palfreyman et al., J Neural Transm. (1994), 41, 407-414.

[0026] Još dalji primeri SSAO inhibitora uključuju, ali bez ograničenja, derivate 4,5,6,7-tetrahidroimidazo[4,5-c]piridina (opiseni u WO 02/38153), karboksamide kao što su N-hidroksi-2-(2-(2-metil-1H-indol-3-il)acetamido)acetamid i 5-amino-2-hidroksi-N-(2-hidroksibenzil)benzamid i sulfonamide kao što je N2-{[4-(1,1-dimetilpropil)fenil]sulfonil}-N1-hidroksiserinamid, opisane u WO2006/013209 i US2007/066646.

[0027] Osim toga, derivati tiazola i/ili gvanidina, naročito derivati 2-acilaminotriazola opisani su ovde. Specifičniji primeri takvih SSAO inhibitora uključuju, ali bez ograničenja, N-{4-[2-(4{[amino(imino)metil]amino}fenil)etil]-1,3-tiazol-2-il}acetamid, N-{4-[2-(4-{[amino(imino)metil]amino}fenil)etil]-5-[4-(metilsulfonil)benzil]-1,3-tiazol-2-il}acetamid, N-{4-[2-(4-{[2-amino-1H-imidazol-4-il)metil]fenil}etil)tiazol-2-il]-acetamid, 2-(4-{2-[2-(acetilamino)-1,3-tiazol-4-il]etil}fenil)-N-[amino(imino)metil]acetamid. Takva jedinjenja opisana su u

WO2004/087138, WO2004/067521, WO2006/028269, WO2006/011631, i WO2005/089755.

[0028] Dodatno, razni derivati oksima su SSAO inhibitori. Takvi derivati oksima uključuju, ali bez ograničenja, 5-bromo-1,3-benzodioksol-4-karbaldehid oksim, 6-etoksi-1,3-dimetil-2,4-diokso-1,2,3,4-tetrahidropirimidin-5-karbaldehid oksim, 1,3-dimetil-6-(metiltio)-2,4-diokso-1,2,3,4-tetra-hidropirimidin-5-karbaldehid oksim opisane u WO 2010/029379.

[0029] Takođe, dihidrazin, arilalkilamini, oksazolidinoni, haloalkilamini, i benfotiamin (vitamin B1) opisani u WO 2010/015870, WO 2005/072738, Lyles G. A., Int. J. Biochem. Cell Biol. Vol.28 pp259-276 (1996), i McDonald et al., Annual reports in Med. Chem. Vol.42 pp.229-243 (2007)) uključeni su kao SSAO inhibitori opisani ovde.

[0030] Dalji SSAO inhibitori uključuju derivate imidazopiridina opisane u WO 2010/064020.

[0031] Osim toga, SSAO inhibitori uključuju bilo koji stereoizomer, mešavinu stereoizomera, E ili Z oblike, mešavinu E i Z oblika, njihov prolek, metabolit, kristalni oblik, ne-kristalni oblik, hidrat, solvat ili so koji imaju sposobnost da inhibiraju ili blokiraju SSAO aktivnost VAP-1.

[0032] Drugi SSAO inhibitori mogu biti pregledani i identifikovani SSAO ogledima poznatim u ovoj oblasti. Takav neki ogled može da uključuje ogled VAP-1 SSAO aktivnosti upotrebom kuplovanog kolorimetrijskog postupka suštinski kako je opisano za monoamin oksidazu i srodne enzime (Holt, A., et al., Anal. Biochem.244:384-392 (1997)). SSAO aktivnost endotelijalnih ćelija može takođe da se nezavisno izmeri upotrebom reagensa Ampleks crveno (10-acetil-3,7-dihidroksifenoksazin), visoko osetljive i stabilne probe za H2O2 (Zhou M, Panchuk-Voloshina N. Anal Biochem.253(2):169-74 (1997)). Dodatno, aktivnost amin oksidaze može da se ispita radiohemijski upotrebom [7-14C]-benzilamin hidrohlorida kao supstrata (Jaakkola et al., Am J Pathol:155(6):1953-65 (1999)). Kao izvor VAP-1 SSAO enzima, može da se koristi rekombinantna humana VAP-1 SSAO eksprimirana u ćelijskim linijama kao što su ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) (Smith, D.J., et al., J. Exp. Med.188:17-27 (1998)). Drugi pogodni izvori SSAO VAP-1 enzima nogu da budu uzorci seruma i tkiva iz različitih vrsta kao što su primati i glodari.

[0033] Za upotrebu u skladu sa ovim primerima izvođenja, anti-VAP-1 antitela mogu da budu obezbeđena kao farmaceutska kompozicija koja obuhvata farmaceutski prihvatljivi nosač ili razblaživač i, kao aktivan sastojak, anti-VAP-1 antitelo. Kompozicija sadrži anti-VAP-1 antitelo u količini dovoljnoj da antagonizira (potpuno ili delimično) SSAO aktivnost kod pacijenata ili prirodno VAP-1 vezivanje za biološke ligande VAP-1 kod pacijenata kojima je potrebna takvo antagonizovanje.

[0034] Količine i režimi za davanje anti-VAP-1 antitela mogu se lako odrediti od strane prosečnih stručnjaka u oblasti kliničkog lečenja fibroza-povezanih poremećaja. Uopšteno, doziranje tretmana anti-VAP-1 antitela variraće u zavisnosti od okolnosti kao što su: starost, pol i opšte zdravlje pacijenta koji se leči; vrste istovremenog tretmana, ako ih ima; učestalost tretmana i priroda željenog efekta; stepen oštećenja tkiva; trajanje simptoma; i drugih varijabla koje će se podesiti od strane individualnog lekara. Željena doza može da se daje u jednoj ili više aplikacija da bi se dobili željeni rezultati. Farmaceutske kompozicije prema ovim primerima izvođenja mogu da se obezbede u jediničnim doznim oblicima.

[0035] Farmaceutske kompozicije mogu da se daju u bilo kom pogodnom farmakološkom nosaču za davanje. One mogu da se daju u bilo kom obliku koji deluje na profilaktičke, palijativne, preventivne ili lekovite uslove fibroznih stanja kod humanih ili životinjskih pacijenata.

[0036] Farmaceutske kompozicije za parenteralno i topikalno davanje uključuju sterilne vodene ili nevodene rastvarače, suspenzije i emulzije. Primeri ne-vodenih rastvarača su propilen glikol, polietilen glikol, biljno ulje, riblje ulje, i injektibilni organski estri. Vodeni nosači uključuju vodu, rastvore vodaalkohol, uključujući slani rastvor i puferisane medijalne parenteralne nosače uključujući rastvor natrijum hlorida, Ringerov rastvor sa dekstrozom, rastvor dekstroze plus natrijum hlorid, Ringerov rastvor koji sadrži laktozu, ili fiksna ulja. Intravenozni nosači uključuju punioce fluida i nutrienata, punioce elektrolita, kao što su oni koji se baziraju na Ringerovoj dekstrozi i slično. Vodene kompozicije prema primerima izvođenja mogu da obuhvataju pogodne puferne agense, kao što su natrijum i kalijum fosfati, citrat, acetat, karbonat ili glicin puferi koji zavise od ciljanog pH-opsega. Upotreba natrijum hlorida kao podešavača toničnosti takođe je korisna. Kompozicije mogu da uključuju druge ekscipijense, kao što su stabilizujući agensi ili konzervansi. Korisni stabilizujući ekscipijensi uključuju surfaktante (polisorbat 20 i 80, poloksamer 407), polimere (polietilen glikoli, povidoni), karbohidrate (saharoza, manitol, glukoza, laktoza), alkohole (sorbitol, glicerol propilen glikol, etilen glikol), pogodne proteine (albumin), pogodne aminokiseline (glicin, glutaminska kiselina), masne kiseline (etanolamin), antioksidanse (askorbinska kiselina, cistein itd.), helatne agense (EDTA soli, histidin, asparaginska kiselina) ili jone metala (Ca, Ni, Mg, Mn). Među korisnim agensima za konzerviranje su benzil alkohol, hlorbutanol, benzalkonijum hlorid i moguće parabeni.

[0037] Farmaceutska kompozicija može da bude obezbeđena u koncentrovanom obliku ili u obliku praha koji će se rekonstituisati prema potrebi. U takvim slučajevima, mogu da se koriste formulacije praha za rastvor za injekciju/infuziju ekscipijenasa pomenutih gore. U slučaju liofilizacije, poželjni su određeni krioprotektanti, uključujući polimere (povidoni, polietilen glikol, dekstran), šećere (saharoza, glukoza, laktoza), aminokiseline (glicin, arginin, glutaminska kiselina) i albumin. Ako je dodat rastvor za rekonstituciju u pakovanje, on može da sadrži npr., čistu vodu za injekciju ili rastvor natrijum hlorida ili rastvore dekstroze ili glukoze.

[0038] Terapeutski korisna anti-VAP-1 antitela mogu biti konjugovana, ili hemijski ili genetskim inženjeringom, sa drugim agensima, koji obezbeđuju ciljanje antitela ka željenom mestu delovanja. Alternativno, druga jedinjenja mogu biti konjugovana, ili hemijski ili genetskim inženjeringom, sa antitelima, kako bi se poboljšala ili obezbedila dodatna svojstva antitelima, naročito svojstva, koja poboljšavaju sposobnost antitela da promovišu ublažavanje štetnih efekata posredovanih VAP-1 vezivanjem.

[0039] Anti-VAP-1 antitela mogu biti obeležena, ili hemijski ili genetskim inženjeringom, kako bi se obezbedila detektabilna antitela. Takva obeležena antitela biće korisni alati za imidžing fibroznih mesta u ljudima, naročito za in vivo imunoscintigrafijski imidžing fibroznih mesta. Za svrhe imidžinga, upotreba fragmenata antitela može da bude poželjna za čitav pristup antitela anti-fibroznoj terapiji, a fragmenti izvedeni iz potpuno humanih antitela ipak bi trebalo da su bezbedniji od njihovih himernih ili mišjih ekvivalenata.

[0040] Neki aspekti ovog opisa odnose se na dijagnozu fibroznih stanja. U vezi sa ovim opisom, otkriveno je da povišeni nivoi rastvorljivog VAP-1 (sVAP-1) u telesnim fluidima (kao što je serum ili plazma) a, kao posledica, povišena SSAO aktivnost korelišu sa stepenom fibroze. Ovaj opis, prema tome, obezbeđuje sredstva i postupke za dijagnozu fibroznih stanja kao što su fibroza jetre i zapaljenska stanja koja su im predodređena tj. akutni i hronični hepatitis, bilijarna bolest i toksično oštećenje jetre, plućna fibroza, bubrežna fibroza, uključujući ona koja potiču od dijabetesne nefropatije, mijelofibroza, fibroza pankreasa, skleroderma, bolesti vezivnog tkiva, ožiljci, fibroza kože, srčana fibroza, transplatacija organa, vaskularna stenoza, restenoza, fibroza arterija, artrofibroza, fibroza dojke, mišićna fibroza, retroperitonealna fibroza, tiroidna fibroza, fibroza limfnih čvorova, fibroza bešike, pleuralna fibroza i HOBP, bolest u kojoj su zidovi disajnih puteva fibrozni sa akumulacijom miofibroblasta i kolagena, i, kao i sva fibrozna tkiva, kontrahovani.

[0041] Dijagnoza fibroznih stanja na osnovu povišenih sVAP-1 nivoa i/ili SSAO aktivnosti u telesnim fluidima može da se kombinuje sa analizom postojećih panela predikativnih biomarkera za fibrozna stanja. Ovo može da poboljša dijagnostički kapacitet postojećih biomarkera. Drugim rečima, sVAP-1 nivoi/SSAO aktivnost može da se koristi ili sama ili u kombinaciji sa drugim kliničkim i biohemijskim markerima kao nov neinvazivan test da bi se predvidilo prisustvo fibroze.

[0042] Nivo sVAP-1 u uzorku telesnog fluida kao što je serum može se odrediti sledećim postupkom: Vremenski razložen jednostepeni imunofluorometrijskii ogled (TR-IFMA) (DELFIA) za kvantifikovanje rastvorljivog VAP-1 koristi biotin-konjugovano mišje anti-humano VAP-1 antitelo TK8-14 (Biotie Therapies Corp.) kao hvatač na streptavidinom obloženu mikrotitar ploču. Detektovanje vezanog rastvorljivog VAP-1 izvodi se upotrebom evropijum-konjugovanog mišjeg anti-humanog VAP-1 antitela TK8-18 (Biotie Therapies Corp.) kao tragača. Oznaka se detektuje merenjem vremenski razložene fluorescencije (Victor3 multilabel brojač) na 615 nm. Brojanje fluorescencija direktno koreliše sa tim koliko je rastvorljivog VAP-1 prisutno u uzorku. Podaci o uzorku se zatim analiziraju u poređenju sa standardnom krivom reference.

[0043] U ovom opisu, fibroza može da se dijagnostikuje na osnovu SSAO aktivnosti u telesnom fluidu dobijenoj iz subjekta kom je potrebna takva dijagnoza i/ili za kog se sumnja da boluje od fibroze. Jedan pogodan postupak za ovu svrhu opisan je od strane Li et al. in J. Chromatogr. B, 810 (2004) 277-282. Druga sredstva i postupci određivanja SSAO aktivnosti poznati su u ovoj oblasti.

[0044] Štaviše, ovaj opis obezbeđuje komplet za upotrebu u dijagnozi fibroze. U nekim oblicima, komplet obuhvata jedan ili više reagenasa za ocenjivanje količine sVAP-1, kao što je specifično anti-VAP-1 antitelo, npr. jedno od anti-VAP-1 antitela pomenutih ovde. U drugim oblicima, komplet obuhvata jedan ili više reagenasa za ocenjivanje SSAO aktivnosti u telesnom fluidu kao što je serum ili plazma. Na primer, komplet može da obuhvata supstrat za VAP-1 SSAO, kao što su benzilamin, metilamin, aminoketon ili drugi alifatični ili aromatični monoamini, zajedno sa pogodnim puferom za ogled SSAO enzimske aktivnosti, i skup reagenasa i postupak za detektovanje SSAO aktivnosti. SSAO aktivnost može da se detektuje upotrebom kuplovanog ogleda u kom se meri stvaranje vodonik peroksida od delovanja SSAO aktivnosti na monoaminske supstrate, ili može da se meri direktno praćenjem konverzije amina rastvorljivog u vodi do aldehida rastvorljivog u organskom rastvaraču upotrebom<14>C obeleženog aminskog supstrata, kao što je benzilamin.

Primer 1. Efekti VAP-1 inhibitora u mišjem modelu fibroze jetre

[0045] Cilj studije bio je da se oceni efekat VAP-1 inhibitora na fibrozno oštećenje jetre kod miša.

[0046] Svi miševi održavani su i smešteni pod uobičajenim uslovima u Jedinici za biomedicinske usluge Birmingemskog Univerziteta, prema propisima Ministarstva unutrašnjih poslova. Četiri miša smeštena su po kavezu i aklimatizovana na kućne uslove tokom jedne nedelje pre eksperimenata. Ženke C57BL/6 i VAP-1-/- miševa (AOC3 gen nokaut miševi bez VAP-1) starosti od 8-10 nedelja korišćene su u toj studiji. C57BL/6 miševi dobijeni su iz štok kolonije iz Jedinice za biomedicinske usluge Birmingemskog Univerziteta, pri čemu su VAP-1-/- (AOC3 gen nokaut) miševi dobijeni od dogovorenog uzgajivača Taconic, Danska.

[0047] Mišji model hronične fibroze jetre ustanovljen je i.p. davanjem ugljenik tetrahlorida (CCI4;

Aldrich Chemical) u dozi od 1 ml/kg rastvorenog u mineralnom ulju dvonedeljno tokom 8 nedelja, pri čemu je kontrolna grupa primila samo mineralno ulje. Miševi tretirani mišjim anti-mišji VAP-1 antitelom BTT-1029 primali su nedeljno i.v. injekcije dve nedelje pre i tokom CCI4 davanja. Životinje su okončale 96 h nakon konačne doze CCI4. Uzorci krvi izvučeni su punkcijom srca tokom anestezije izofluranom, nakon čega su miševi ubijeni cervikalnom dislokacijom. Jetre su secirane i isečene na 4 dela radi različite obrade.

[0048] Statistička ANOVA izvedena je upotrebom SPSS za Windows verziju 11.0. Jednosmerna ANOVA praćena Fisher-ovim post hoc testom najmanje značajne razlike korišćena je za analizu značajnosti u uzorcima sa više od dve varijabilne grupe.

[0049] Uzorci jetre fiksirani su u 4% paraformaldehidu, ugrađeni u parafin i isečeni na delove od 4 µm. Delovi za histopatološku analizu su obojeni ili Sirius crvenom ili H&E prema standardnim procedurama. Za imunofluorescentno bojenje, fiksirane mišje jetre su krio-zaštićene potapanjem u 30% saharozu, brzo zamrznute i isečene u kriostatu na 7 µm. Ukratko, delovi su isprani fosfatno puferisanim slanim rastvorom koji sadrži 0,1% Triton X-100 (PBST) tokom 10 minuta i inkubirani 1 sat na sobnoj temperaturi sa 10% kozjim serumom u 0,1% PBST. Nakon inkubacije sa primarnim antitelima za elastin, kolagen IV i laminin (Abcam) razblaženim u serumu-PBST, slajdovi su isprani tri puta u PBST i inkubirani sa sekundarnim antitelom (Invitrogen) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi.

[0050] Kao što je očekivano, CCI4 je indukovao ozbiljno fibrozno oštećenje u C57BL/6 miševima. Do 8 nedelja miševi divljeg tipa pokazali su osmostruko povećanje u hepatičnom sadržaju Sirius crvenih fibrila sa nekrozom hepatocita i hepatitisom u toku. Interesantno, došlo je do značajnog smanjenja u fibroznom oštećenju i u VAP-1 deficijentnim miševima i u BTT-1029 tretiranim miševima divljeg tipa. Ovi miševi pokazali su samo male količine Sirius crvenih fibrila, a histologija jetre izgledala je blisko normalnoj sa potpunim odsustvom nekrotičnih oblasti i samo malim hepatitisom (FIG.1 i 2). Štaviše, postojali su značajno niži brojevi prisutnih zrelih makrofaga, što je opet ukazivalo na mnogo manje ozbiljno oštećenje u poređenju sa divljim tipom (podaci nisu prikazani).

[0051] mRNK nivoi gena povezanih sa aktivacijom hepatičnih stelatnih ćelija u jetri ocenjeni su qRT-PCR. Za ovaj cilj, ukupna RNK izvučena je iz mišjih jetri upotrebom Qiagen RNAeasy Mini Kit (#74104). RNK je obrnuto transkriptovana u cDNK template upotrebom slučajnih prajmera (Promega) i Superscript III od Invitrogen. Parametri za qRT-PCR bili su kako sledi: denaturacija 95°C za 10 min, amplifikacija 95°C za 10s, 55°C za 30s, 72°C za 1s, 55 ciklusa. Kvantitativna Real-time PCR izmerena je sa Roche LightCycler480 sistemom upotrebom referentnog gena GAPDH i sondi od Roche. Nivoi ekspresije kvantifikovani su upotrebom 'E-postupka' (Roche).

[0052] Podaci ukazuju na ulogu za VAP-1 u razvoju fibroze jetre regulisanjem hepatičnih stelatnih ćelija (HSC). Aktivirane HSC odnose se kao glavni izvor za sintezu ECM komponenata u fibroznoj jetri, uključujući elastin. Jetre divljeg tipa kojima je dat CCI4 pokazale su veliko povećanje u αSMA i elastin mRNK nivoima, što ukazuje na akumulaciju αSMA eksprimirajuće HSC i taloženje elastina (FIG.4). mRNK nivoi i αSMA i elastina u BTT-1029 tretiranim jetrama divljeg tipa i VAP-1-/- jetrama bili su značajno niži u poređenju sa jetrom divljeg tipa. Razlike u ekspresiji elastina i kolagena IV takođe su potvrđene konfokalnom mikroskopijom, dok su nivoi laminina ostali nepromenjeni (FIG.3).

[0053] Zaključno, BTT-1029 lečenje indukovalo je skoro potpunu zaštitu ustanovljene fibroze jetre smanjenjem aktivacije hepatičnih stelatnih ćelija, zbog čega se ograničava razvoj fibroblasta u fibroznim lezijama. Isti efekat takođe je prikazan u VAP-1-/- miševima, kod kojih se pokazala skoro potpuna zaštita protiv CCI4 indukovanog oštećenja. Rezultati ukazuju da VAP-1 ima ključnu ulogu u razvoju fibroze jetre preko regulatornih efekata na hepatične stelatne ćelije. VAP-1 SSAO je bakar amin oksidaza, a tako analogna lizil oksidazi, drugom enzimu bakar amin oksidaze odgovornom za umrežavanje ECM proteina kao što su elastin i kolagen. Ostaje mogućnost da SSAO aktivnost VAP-1 takođe ima direktan efekat na formiranje unakrsnih veza u ECM proteinima.

[0054] Štaviše, SSAO aktivnosti uzoraka seruma i tkiva jetre ispitivane su radiohemijski upotrebom [7-<14>C]-benzilamin hidrohlorida (spec. akt.57 mCi/mmol) kao supstrata (FIG.5). Serum (40 mg/ml protein) ili preparati tkiva (2 mg/ml proteina) preinkubirani su sa 5 µM klorgilinom i pargilinom, i sa cevima nespecifičnog vezivanja takođe sa 1 mM semikarbazidom na 37°C tokom 30 min. Ispitivanje je izvedeno na 37°C tokom jednog sata u krajnjoj zapremini od 200 µl 0,2 mM Na-fosfatnog pufera (pH 7,4) koja sadrži [7-<14>C]-benzilamin kao supstrat. Ogledi reakcije katalitičke aktivnosti enzima zaustavljeni su i tretirani kao što je opisano u Jaakkola et al., 1999 (American Journal of Pathology, 155, 6). Koncentracije proteina ispitivane su prema Bradford et al. (Bradford, M. M., 1976, Anal. Biochem.72, 248) upotrebom goveđeg seruma albumina kao standarda.

[0055] Rezultati su pokazali da pored toga što sprečava CCI4-indukovanu fibrozu jetre, BTT-1029 lečenje znatno smanjuje SSAO aktivnost u pomenutim uzorcima jetre.

Primer 2. Renoprotektivni efekti VAP-1 inhibitora u mišjem modelu renalnog oštećenja

[0056] Visoko izlaganje ugljenik tetrahloridu uzrokuje oštećenje i jetre i bubrega. Prema tome, bubrezi iz CCI4 tretiranih životinja opisani u Primeru 1 prikupljeni su i analizirani za efekat VAP-1 inhibitora na nefropatiju.

[0057] Bubrezi su fiksirani u 4 % paraformaldehidu, ugrađeni u parafin i isečeni u delove od 4 µm. Histopatološko ispitivanje izvedeno je na Sirius crvenom i H&E obojenim delovima. Bojenje je izvedeno prema standardnim procedurama. Količina Sirius crvenih fibrila kvantifikovana je analizom praga upotrebom Image J softvera.

[0058] Statistička ANOVA izvedena je upotrebom SPSS Windows, verzija 11.0. Jednosmerna ANOVA praćena Tukey HSD-ovim post hoc testom najmanje značajne razlike korišćena je za ispitivanje značajnosti u uzorcima sa više od dve varijabilne grupe.

[0059] Miševi kojima je dat CCI4 pokazali su fokalne glomerularne promene i sa segmentalnim i sa globalnim izmenama. H&E bojenje pokazalo je razne lezije npr. mezangijalna hipercelularnost, adhezija i skleroza domena vrha. Međutim, najviše je viđen globalni kolaps glomerularne rese sa samo zaostalim fragmentima glomerula (podaci nisu prikazani). Interesantno, VAP-1 nokaut miševi i BTT-1029 tretirani miševi potpuno su zaštićeni od glomerularnih lezija (FIG.6).

[0060] Akumulacija kolagena oko glomerula, kao indikacija fibroze, ocenjena je bojenjem Sirius crvenom. Davanje CCI4 u C57BL/6 miševe indukovalo je skoro dvostruko povećanje u akumulaciji kolagena oko glomerularne rese. Interesantno, miševi bez VAP-1 ili kojima je dat VAP-1 inhibitor pokazali su značajno smanjenje u nanosima kolagena slično kontroli (FIG.7). Rezultati su jasno pokazali zaštitnu ulogu VAP-1 u CCI4 indukovanoj nefropatiji.

Primer 3. Efekti VAP-1 inhibitora u mišjem modelu HOBP

[0061] Mišji model HOBP indukovane duvanskim dimom korišćen je za ocenu efekta VAP-1 inhibitora na lečenje HOBP.

[0062] C57BL/6J miševi bili su izloženi jednom dnevno duvanskom dimu (TS) tokom 11 uzastopnih dana što je rezultovalo zapaljenjem pluća 24 sata nakon poslednjeg TS izlaganja. Nakon 11 dana, odgovor je obuhvatao značajna povećanja u makrofagama, epitelijalnim ćelijama, eozinofilima, neutrofilima i limfocitima.

[0063] Miševi su nasumično podeljeni u studijske grupe (n=10) i tretirani nosačem (5 ml/kg PBS pH 7,4 0,1% Polisorbatom 80) ili mišjim monoklonalnim anti-VAP-1 antitelom (3 mg/kg ili 9 mg/kg BTT-1029 u nosaču) intravenozno na dane -1, 3, 6, i 9 u 4 h nakon TS izlaganja. Druga grupa (n=10) primila je nosač intravenozno i bila je izložena vazduhu za ekvivalentan vremenski period. Dve dalje grupe miševa (n=10) primile su drugi nosač (0,5% karboksimetilceluloza, natrijumova so (CMC) u sterilnoj vodi) ili referentno jedinjenje (5 mg/kg Roflumilasta u 0,5% CMC) oralno jednom dnevno tokom 11 uzastopnih dana, 1 h pre svakog TS izlaganja. Krajnja grupa (n=10) primila je oralni nosač (0,5% CMC) i bila je izložena vazduhu za ekvivalentan vremenski period.

[0064] Svi rezultati predstavljeni su kao pojedinačne tačke podataka za svaku životinju i srednja vrednost izračunata za svaku grupu. Gde su testovi za normalnost bili pozitivni, podaci su inicijalno podvrgnuti jednosmernoj analizi testa varijansi (ANOVA), praćeno Bonferroni korekcijom za višestruka poređenja radi ispitivanja značajnosti između tretiranih grupa. "p" vrednost ≤ 0,05 je razmatrana da je statistički značajna.

[0065] Svi podaci takođe su podvrgnuti Bartletovom testu za jednake varijanse i za većinu studija varijanse su bili uopšteno jednake, međutim, kao što se dogodilo u ovoj studiji, povremeno neke tretirane grupe dale su pozitivan rezultat. Ne-parametrijske analize su, prema tome, takođe korišćene. Kako su podaci normalno distribuirani, navedene su parametrijske analize (ANOVA).

[0066] Procenat inhibicija automatski je izračunavan unutar Excel tabele za podatak u ćeliji upotrebom formule dole:

[0067] BTT-1029, kada se daje intravenozno 4 sata nakon TS izlaganja od 9 i 3 mg/kg, na dane -1, 3, 6 i 9 studije, značajno smanjuje TS indukovano ćelijsko povećanje u BAL (38% i 33% inhibicija respektivno, p<0,001 za obe) (FIG.8). Ovo se sastoji od značajnih smanjenja u makrofagama, (29% i 22% inhibicija, p<0,01 i p<0,05 respektivno), neutrofilima (66 i 59% inhibicija, p<0,001 za obe), limfocitima (69% i 54% inhibicija, obe p<0,001) i eozinofilima (93% i 65% inhibicija, p<0,001 i p<0,01 respektivno).

[0068] Referentno jedinjenje, Roflumilast, kada se daje jedanput dnevno oralno, 1 h pre TS izlaganja, takođe značajno smanjuje ukupan broj ćelija (41%, p<0,001) (FIG.9). Ova inhibicija sastojala se od smanjenja u neutrofilima (63% p<0,001), epitelijalnim ćelijama (51% p<0,01) i limfocitima (65%, p<0,001). U ovoj studiji, Roflumilast nije značajno smanjio broj makrofaga i eozinofila pronađenih u BAL.

Referentni primer 4. Efekti VAP-1 inhibitora na neointimalnu i medijalnu fibrozu u vaskularnom zidu

[0069] Neointimalno i medijalo zadebljanje je rani i osnovni stadijum u razvoju aterosklerotičnih lezija i osnovna komponenta restenoze. Praćeno je fibroznim promenama u neointimi i mediji vaskularnog zida. Ova studija ocenila je ulogu blokiranja SSAO u fibroznoj bolesti ocenjivanjem efekta sistemske isporuke (dnevnom ip injekcijom) SSAO inhibitora malog molekula (mofegilin, BTT-2089) na manžetnaindukovano neointimalno zadebljanje (manžetna -indukovana stenoza) u femoralnoj arteriji ApoE3 Leiden miševa koji su primali umerenu ishranu zapadnog tipa.

[0070] Postupci: 40 mužjaka ApoE3*Leiden miševa (starosti 12 nedelja) hranjeni su blago hiperholesterolemičnom ishranom tokom 3 nedelje pre hirurškog postavljanja manžetne. Lečenje je bilo svakodnevno ip injekcijama sa 1) nosačem; 2) deksametazonom u pijaćoj vodi pri 9mg/l; 3) svakodnevne ip injekcije BTT-2089 pri 10 mg/kg; 4) BTT-2089 pri 30 mg/kg, pri čemu su sva započeta jedan dan pre operacije i nastavljena su tokom eksperimentalnog perioda. Na dan 0 operacija je izvedena, tj. neograničavajuća manžetna (2-3 mm dužine) postavljena je oko obe femoralne arterije miševa.10 miševa svake grupe žrtvovano je nakon 2 nedelje radi histomorfometrijske analize da bi se kvantifikovala inhibicija ubrzanih aterosklerotičnih lezija i formiranja neointime. Primećeno je značajno smanjenje u formiranju medija i neointime u deksametazon-tretiranoj pozitivnoj kontrolnoj grupi i obe BTT-2089 tretirane grupe u poređenju sa NaCl 0,9% tretiranom kontrolnom grupom (FIG.10 i 11). Ovo se ogledalo u povećanoj veličini lumena u primerima HPS obojenih segmenata krvnih sudova u SSAO inhibitorom tretiranim grupama u poređenju sa kontrolnom grupom (FIG.12).

[0071] Druga studija, u istom modelu, izvedena je sa drugim SSAO inhibitorom iz hemijske klase različite od BTT-2089. Ovaj inhibitor na bazi hidrazina (BTT-2079) doziran je na nivou 10 mg/kg svakodnevno i.p injekcijom i upoređen sa BTT-2089 pri 30mg/kg. U svim ostalim aspektima, studija je izvedena na isti način osim što je izostavljena kontrolna grupa sa deksametazonom. Inhibicija SSAO sa mofegilinom (BTT-2089) pri 30mg/kg i.p. svakodnevno ponovo je imala povoljan efekat i pokazala je značajno smanjenje u formiranju neointime i procentu stenoze lumena nakon SSAO inhibicije. Grupa tretirana sa SSAO inhibitorom BTT-207910mg/kg i.p. svakodnevno takođe je rezultovala u značajnom smanjenju u formiranju neointime. Nisu primećene nikakve značajne promene između svih grupa u prečniku zida krvnih sudova, oblasti medija i lumena. Odnosi intima-medija od BTT-207910 mg/kg i BTT-208930 mg/kg bili su značajno manji u poređenju sa kontrolnom grupom, ali procenat stenoze lumena bio je znatno manji samo u grupi sa BTT-208930 mg/kg u poređenju sa kontrolnom grupom. Vaskularni integritet nije bio pogođen.

[0072] Ove studije pokazuju da sistemsko doziranje sa SSAO inhibitorima rezultuje u manjem neointimalnom zadebljanju (neointimalna fibroza) u ApoE 3 Leiden mišjem modelu sa manžetnom kada se poredi sa kontrolnom tretiranom grupom.

Primer 5. Efekti VAP-1 inhibitora u mišjem modelu plućne fibroze

[0073] Bleomicin-indukovana plućna fibroza je ustanovljen i izvodljiv mišji model za ispitivanje plućne fibroze.

[0074] Mužjaci C57BL/6J miševa starosti 8 nedelja sistemski su tretirani bleomicinom (100 mg/kg) tokom 7 dana Alzet osmotskim minipumpama kako bi se izazvalo oštećenje pluća. Ne-pulmonarna toksičnost primećena je za dane 7-21 nakon implantacije pumpe. Do 21 dana bilo je 12-15% fibroze u plućima kako je ocenjeno histopatološki. Ovo je praćeno kliničkim oštećenjem pluća koje se može uočiti povećanom brzinom disanja i dramatičnim gubitkom telesne mase, a što eventualno dovodi do smrti u okviru 42 dana (ako se ne završi ranije).

[0075] Miševi su nasumično podeljeni u studijske grupe i tretirani nosačem, VAP-1 inhibitorom ili referentnim jedinjenjem i.v. injekcijom svakog trećeg dana od dana 0 do dana 28. Polovina miševa svake studijske grupe okončala je dana 21, dok je druga polovina okončala dana 28.

[0076] Na autopsiji, pluća su fiksirana (10% neutralno puferisan formalin) i podvrgnuta histopatološkoj obradi radi ocenjivanja fibroznih lezija. Delovi tkiva su obojeni sa H&E i Masonovim Trihromom kako bi se identifikovala fibroza. Odnos fibrozne oblasti pluća prema ukupnoj oblasti pluća kvantifikovan je analizom slike pomoću računara za svakog miša.

[0077] Jednosmerna ANOVA praćena odgovarajućim post hoc testom korišćena je za analizu značajnosti u uzorcima sa više od dve varijabilne grupe.

[0078] Smanjenje u plućnoj fibrozi, kako je dokazano statistički značajnim smanjenjima u rezultatu u poređenju sa kontrolama, može da bude prikazano.

Primer 6. Renoprotektivni efekti VAP-1 inhibitora u mišjem modelu dijabetesne bolesti bubrega

[0079] Dijabetes može da uzrokuje dijabetesnu nefropatiju (DN) povezanu sa progresivnom bubrežnom fibrozom, eventualno smanjujući funkcionisanje renalne mase. Kako bi se ocenio efekat anti-VAP-1 antitela i referentnih SSAO inhibitora na bubrežnu fibrozu, korišćen je dobro ustanovljen Db/db dijabetesni mišji model za dijabetesnu bolest bubrega.

[0080] Svi aspekti ovih eksperimenata (smeštaj, eksperimentisanje i odstranjivanje životinja) izvedeni su u opštoj saglasnosti sa Uputstvom za brigu i korišćenje laboratorijskih životinja (National Academy Press, Washington, D.C., 1996).

[0081] Referentni predmet testiranja, SSAO inhibitor BTT-2079, ocenjen je za mogući renoprotektivni efekat u mišjem modelu dijabetesne nefropatije. Testna supstanca i nosač davani su intraperitonealno (IP) jednom dnevno tokom 42 uzastopna dana db/db miševima (BKS Cg-Lepr db/Lepr db) starosti od 15 nedelja kada je dijabetes totalno ustanovljen. Db/m miševi služili su kao mršava normalna kontrola. db/db miševi pokazali su povišen kreatinin u plazmi, ukazujući na oštećenu funkciju bubrega, kao i hiperglikemiju i dislipidemiju (LDL, ukupan holesterol i trigliceridi) u poređenju sa db/m miševima.

Dijabetesni miševi bili su povezani sa gojaznošću, poliurijom, albuminurijom i povećanom frakcionom urinarnom Na<+>ekskrecijom (FENa), što ukazuje na oštećenu tubularnu Na<+>reapsorpciju. Endogeni klirens kreatinina (CCr), procena brzine glomerularne filtracije, ima tendenciju da bude niži kod dijabetesnih miševa vs db/m miševi.

[0082] Mužjaci db/db miševa sa insulin nezavisnom šećernom bolešću dodeljeni su tretiranim grupama, kako je naznačeno dole.

Tabela 1. Sažetak eksperimentalnog dizajna

[0083] Po završetku životne faze izvedena je nekropsija, uključujući prikupljanje i očuvanje tkiva. Desni bubreg iz sve 32 životinje fiksiran je u 10% neutralno puferisanom formalinu. Uzdužni delovi su doterani i obrađeni u parafinske blokove, isečeni na 3 mikrometara i obojeni perjodnom kiselinom po Schiffu (PAS) za ocenjivanje pomoću svetlosnog mikroskopa. Ekspanzija mezangijalnog matriksa ocenjena je u 50 glomerula po bubregu prema šemi semikvantitativne ocene naznačenoj u protokolu dole.

[0084] Pedeset glomerula iz svakog bubrega ocenjeno je za ekspanziju mezangijalnog matriksa prema sledećem sistemu.

[0085] Prosečan rezultat ekspanzije mezangijalnog matriksa za svaku grupu dobijen je sabiranjem rezultata mezangijalnog matriksa za sve životinje u svakoj grupi i deljenjem te sume ukupnim brojem životinja u grupi. Srednji rezultati ekspanzije mezangijalnog matriksa po grupi predstavljeni su u tabeli koja sledi.

Tabela 2. Srednji rezultati ekspanzije mezangijalnog matriksa po grupi

[0086] Mali glomerularni mezangijalni matriks može se videti u normalnim životinjama, ali ekspanzija mezangijalnog matriksa karakteristika je raznih stanja bolesti kao što je šećerna bolest. Mezangijalni matriks uključuje bazalnu membranu i povezane polianjonske proteoglikane i druge molekule koji su obojeni crveno do ružičasto u postupku sa perjodnom kiselinom po Schiffu (PAS). Prema tome, količina PAS pozitivnog materijala u glomerulu je mera količine prisutnog mezangijalnog matriksa.

[0087] Pedeset glomerula iz svake životinje ocenjeno je pri uveličanju od 200 X i ocenjeno za raširen mezangijalni matriks upotrebom sistema ocenjivanja opisanog ovde. Srednji rezultati ekspanzije mezangijalnog matriksa po grupi izračunati su sabiranjem rezultata za svaki glomerul ocenjen za svaku životinju. Rezultati ekspanzije mezangijalnog matriksa za sve životinje u grupi zatim su sabrani i podeljeni sa brojem životinja po grupi kako bi se dobio srednji rezultat ekspanzije mezangijalnog matriksa po grupi. Na osnovu ovih podataka, tretman sa BTT-2079 pri 5 i 15 mg/kg smanjio je rezultat ekspanzije mezangijalnog matriksa na dozno-zavisan način u odnosu na srednji rezultat ekspanzije mezangijalnog matriksa po grupi kod db/db miševa sa ne-insulin zavisnom šećernom bolešću (Grupa 2).

[0088] Da bi se ocenio efekat anti-VAP-1 antitela i referentnih SSAO inhibitora na bubrežnu fibrozu, korišćeni su drugi dobro ustanovljeni mišji modeli za dijabetesnu bolest bubrega 1) Streptozotocinindukovani dijabetesni mišji model 2) Jednostrana opstrukcija uretera, model bubrežne fibroze.

1) Streptozotocin-indukovani dijabetesni mišji model. Mužjaci miševa stari 6-7 nedelja (20-25 g telesne mase) izgladnjivani su tokom 6 h pre injekcije streptozotocina (STZ). Da bi se indukovao dijabetes, sveže umešan STZ (7mg/ml u puferu natrijum citrata) injektiran je intraperitonealno u svakog prethodno izgladnelog miša, sa 55 mg/kg. Da bi se završilo indukovanje bolesti, ovaj postupak je ponavljan tako da je svaki miš primio jednu STZ injekciju tokom pet uzastopnih dana. Jedne nedelje nakon poslednje STZ injekcije, neizgladnjivani miševi sa glukozom u krvi manjom od 280 mg/dL isključeni su iz eksperimenta jer se kod ovih miševa obično neće razviti značajan dijabetes koji uzrokuje značajno renalno oštećenje.

Svi miševi su dozirani sa nosačem ili testnom supstancom intraperitonealno svakog drugog dana tokom tri uzastopne nedelje u odgovarajućim zapreminama. Svim životinjama davana je uobičajena laboratorijska hrana i voda ad libitum.

Određeni su nivoi hemijskih supstanci u serumu enzimskim postupkom (Mutarotaza-GOD) iz uzoraka krvi. Renalno oštećenje ocenjeno je biohemijski, merenjem izlučivanja albumina urina i klirensa kreatinina, a dalje, histološki bojenjem Massonovim trihromom i perjodnom kiselinom po Schiffu.

2) Jednostrana opstrukcija uretera - bubrežna fibroza model. Svi miševi su dozirani sa nosačem ili testnom supstancom intraperitonealno pet dana preoperativno i 7 dana post-operativno. Inhibitor i nosač injektirani su svakog drugog dana u odgovarajućoj količini kako bi se inhibirala SSAO. Svim životinjama davana je uobičajena laboratorijska hrana i voda ad libitum.

[0089] Mužjaci miševa starosti 6-7 nedelja (20-25g telesne mase) anestezirani su udisanjem izoflurana (2-hloro-2-(difluorometoksi)-1, 1,1-trifluoro-etan) i subkutanom injekcijom 0,05-0,1 mg/kg buprenorfina preoperativno. Miševi su podvrgnuti jednostranoj opstrukciji uretera (UUO) ili lažnoj operaciji. Kod UUO operisanih miševa, levi ureter je podvezan sa 4-0 svilenom niti u dve tačke i isečen između ligatura kako bi se sprečila retrogradna infekcija urinarnog trakta. Miševi su žrtvovani 7 dana nakon operacije.

[0090] Renalno oštećenje ocenjeno je biohemijski, merenjem izlučivanja albumina urina i klirensa kreatinina, a dalje, histološki bojenjem Massonovim trihromom i perjodnom kiselinom po Schiffu.

[0091] Jednosmerna ANOVA i Dunnett-ovi testovi korišćeni su u svim studijama da bi se utvrdile značajne razlike između lečenih grupa i grupa sa nosačem. Razlike se smatraju značajnim pri *P<0,05.

[0092] Smanjenje u bubrežnoj fibrozi, kao što je dokazano statistički značajnim smanjenjima u ocenjivanju u poređenju sa kontrolama, može da se prikaže.

Primer 7. Anti-fibrozna terapija za dijabetesnu nefropatiju

[0093] Dijabetesna nefropatija je uobičajen uzrok bolesti bubrega krajnje faze, a fibroza, naročito intersticijska fibroza, je ključna patološka karakteristika dijabetesnog bubrega. Klinička studija može da odredi da li VAP-1 inhibitori mogu da smanje nefropatiju kod pacijenata sa dijabetesom tako da se produži funkcija bubrega.

[0094] Odrasli pacijenti sa dijabetesom tipa 1 ili 2 sa brzinom glomerularne filtracije (GFR) između 20-75 ml/min/1,73 m2, većom od 300 mg/danu proteinurije, i krvnim pritiskom manjim od ili jednakim 140/90 na inhibitor angiotenzin konvertujućeg enzima (ACE) ili angiotenzin receptor antagonist (ARA) uključeni su u studiju. Pacijenti su primali VAP-1 inhibitor na efikasnom nivou ili placebo tokom 1 godine sa pogodnim režimom doziranja koji može biti jednom dnevno, ili ređe. Pacijenti su nasumično dodeljeni u grupe sa placebo ili VAP-1 inhibitorom. Tokom studije, pacijenti su redovno praćeni za parametre kao što su nivo glukoze u krvi na prazan stomak i u urinu, krvni pritisak i klinička hemija. Dodatni uzorci krvi mogu se izvući radi merenja nivoa seruma VAP-1 SSAO koji može da bude povišen u dijabetesu i povezan sa progresijom bolesti. Dodatno, nivoi metilamina u uzorcima seruma mogu se oceniti. Povišen metilamin je biomarker za inhibiciju VAP-1 SSAO aktivnosti. Od pacijenata je traženo da redovno proveravaju svoj krvni pritisak i glukozu u krvi kod kuće i zapišu dobijene vrednosti radi praćena njihovog dijabetesnog stanja. Davanjem insulina u odgovarajućim količinama, može da se održava dobra kontrola dijabetesa pacijenata na ovaj način.

[0095] Pacijenti su održavani na trenutnom standardu brige za dijabetesnu nefropatiju, što može da uključuje tretman sa ACE inhibitorom i/ili ARA, antihipertenzivnu terapiju sa ciljanim krvnim pritiskom manjim od 130/80, i fiksnu glikemijsku kontrolu sa odgovarajuće postavljenim ciljevima za HbA1C.

[0096] Renalna funkcija ocenjena je pomoću GFR i primarna krajnja tačka studije može da bude promena u renalnoj funkciji od osnovne linije do kraja perioda studije. Sekundarne krajnje tačke mogu da uključuju procenat promene u izlučivanju albumina urina tokom perioda studije.

Referentni primer 8. VAP-1 kao dijagnostički marker za fibrozna stanja

[0097] Ovde je prikazano imunohistohemijom da se hepatična VAP-1 ekspresija povećava u cirozi sa veoma visokim nivoima u fibroznim pregradama (Fig.13-15). Višebojna konfokalna mikroskopija otkriva VAP-1 ekspresiju na hepatičnim stelatnim ćelijama i miofibroblastima jetre (Fig.16). Kultivisane humane hepatične stelatne ćelije (HSC) korišćene su za potvrdu ekspresije i lučenja sVAP-1 od strane HSC in vitro. Ovi rezultati ukazali su na potencijalnu ulogu za VAP-1 u fibrogenezi.

[0098] Serumski sVAP-1 nivoi izmereni su u dobro definisanoj kohorti od 138 pacijenata sa nealkoholnom masnom bolešću jetre (NAFLD) sa uparenom i razvrstanom histologijom jetre (Kleiner-ova klasifikacija). sVAP-1 nivoi ocenjeni su u odnosu na histologiju jetre (steatoza, zapaljenje i fibroza), metaboličke parametre i serološke markere oštećena jetre (Tabela 3).

Tabela 3. Sažetak demografskih podataka i parametara izmerenih kod 138 pacijenata sa histološki razvrstanom i klasifikovanom NAFLD

[0099] Univarijabilna korelaciona analiza potvrdila je značajnu korelaciju između sVAP-1 nivoa i histološkog stupnja fibroze (r = 0,43, p = 0,0000003) (Tabela 4) i na višestrukoj logističkoj regresiji sa eliminacijom unazad stupanj fibroze bio je najznačajniji nezavisan faktor koji doprinosi sVAP-1 nivou (Tabela 5).

Tabela 4. Faktori koji korelišu značajno sa sVAP-1 nivoima na univarijabilnoj analizi

Tabela 5. Faktori koji su nezavisno povezani sa sVAP-1 nivoem nakon višestruke regresije sa eliminacijom unazad

[0100] I univarijabilna i viševarijabilna analiza faktora povezanih sa značajnom fibrozom jetre (Stupnjevi F2-4) ukazali su da su sVAP-1 nivoi značajniji od standardnih biohemijskih markera oštećenja jetre kao što su enzimi jetre i AST/ALT odnos (Tabele 6 i 7).

Tabela 6. Faktori koji su povezani sa značajnom fibrozom (F2-4) na univarijabilnoj analizi

Tabela 7. Faktori koji su nezavisno povezani sa fibrozom nakon višestruke regresije sa eliminacijom unazad

[0101] U kohorti, ako se sVAP-1 nivo koristi kao jedini biomarker za predviđanje prisustva značajne fibroze jetre (Stupnjevi F2-4), nivo ≥ 1000ng/ml imao je pozitivnu vrednost predviđanja od 88,9%. Oblast ispod krive radne karakteristike prijemnika (AUROC) za predviđanje značajne fibroze (F2-4), napredne fibroze (F3-4) i ciroze (F4) bila je 0,71 (95% Cl 0,62-0,80), 0,68 (95% Cl 0,58-0,78) i 0,75 (95% Cl 0,58-0,92) respektivno (FIG.18).

[0102] Osim toga, rezultati pokazuju da postoji mogućnost da se poboljša profil osetljivosti i specifičnosti sVAP-1 radi predviđanja fibroze jetre njegovim kombinovanjem sa drugim kliničkim i biohemijskim parametrima. Rezultat fibroze (izračunat iz jednačine regresije) faktora nezavisno povezanih sa fibrozom jetre na viševarijabilnoj analizi (sVAP-1, status dijabetesa i AST/ALT odnos), imao je AUROC za predviđanje značajne fibroze (F2-4), napredne fibroze (F3-4) i ciroze (F4) od 0,79 (95% Cl 0,71-0,87), 0,80 (95% Cl 0,71-0,88) i 0,89 (95% Cl 0,74-1,02) (FIG.19).

[0103] VAP-1 protein ima aktivnost enzima monoamin oksidaze nazvanu SSAO (semikarbazid-osetljiva amin oksidaza). Zbog toga što SSAO enzimska aktivnost predstavlja integralni deo VAP-1 proteina, sledi da se nivoi sVAP-1 u telesnim fluidima mogu takođe odrediti merenjem količine SSAO aktivnosti u telesnom fluidu (kao što je serum ili plazma). SSAO je glavna aktivnost monoamin oksidaze u humanom serumu i plazmi koja deluje na SSAO supstrate kao što su benzilamin ili metilamin. Tako, SSAO aktivnost može da se koristi kao ekvivelentni marker fibroze jetre.

LISTA SEKVENCI

[0104]

Claims (9)

Patentni zahtevi

1. VAP-1 inhibitor, koji je

potpuno humano anti-VAP-1 antitelo koje obuhvata jednu do tri CDR konsenzusne sekvence odabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO 1 do 3 i/ili polipeptid lakog lanca koji obuhvata jednu do tri CDR konsenzusne sekvence odabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO 24 do 26

za upotrebu u lečenju fibroznog stanja.

2. VAP-1 inhibitor za upotrebu prema zahtevu 1, pri čemu pomenuto antitelo ima polipeptid teškog lanca koji obuhvata prvu CDR sekvencu odabranu od SEQ ID NO 4 do 8, drugu CDR sekvencu odabranu od SEQ ID NO 9 do 13, i treću CDR sekvencu odabranu od SEQ ID NO 14 do 18, i/ili polipeptid lakog lanca koji obuhvata prvu CDR sekvencu odabranu od SEQ ID NO 27 do 31, drugu CDR sekvencu odabranu od SEQ ID NO 32 do 36 i treću CDR sekvencu odabranu od SEQ ID NO 37 do 41.

3. VAP-1 inhibitor za upotrebu prema zahtevu 2, pri čemu pomenuto antitelo ima varijabilni region teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO 19 do 23, i odnosni varijabilni region lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO 42 do 46.

4. VAP-1 inhibitor za upotrebu prema zahtevu 1, pri čemu pomenuto antitelo predstavlja potpuno humano rekombinantno antitelo koje obuhvata polipeptid teškog lanca prikazan u SEQ ID NO 47 i polipeptid lakog lanca prikazan u SEQ ID NO 48.

5. VAP-1 inhibitor za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-4 za upotrebu u lečenju fibroznog stanja odabranog iz grupe koju čine fibroza jetre i zapaljenska stanja koja su mu predodređena tj. akutni i hronični hepatitis, bilijarna bolest i toksično oštećenje jetre.

6. VAP-1 inhibitor za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-4 za upotrebu u lečenju fibroznog stanja odabranog iz grupe koju čine plućna fibroza, bubrežna fibroza, uključujući ono koje potiče od dijabetesne nefropatije, mijelofibroza, fibroza pankreasa, skleroderma, bolesti vezivnog tkiva, ožiljci, fibroza kože, srčana fibroza, transplatacija organa, vaskularna stenoza, restenoza, fibroza arterija, artrofibroza, fibroza dojke, mišićna fibroza, retroperitonealna fibroza, tiroidna fibroza, fibroza limfnih čvorova, fibroza bešike, pleuralna fibroza i HOBP, bolest u kojoj su zidovi disajnih puteva fibrozni sa akumulacijom miofibroblasta i kolagena, i, kao i sva fibrozna tkiva, kontrahovani.

7. Upotreba VAP-1 inhibitora kako je definisan u bilo kom od zahteva 1-4 za proizvodnju leka za lečenje fibroznog stanja.

8. Upotreba prema zahtevu 7, gde je pomenuto fibrozno stanje odabrano iz grupe koju čine fibroza jetre i zapaljenska stanja koja su mu predodređena tj. akutni i hronični hepatitis, bilijarna bolest i toksično oštećenje jetre.

9. Upotreba prema zahtevu 7, gde je pomenuto fibrozno stanje odabrano iz grupe koju čine plućna fibroza, bubrežna fibroza, uključujući ono koje potiče od dijabetesne nefropatije, mijelofibroza, fibroza pankreasa, skleroderma, bolesti vezivnog tkiva, ožiljci, fibroza kože, srčana fibroza, transplatacija organa, vaskularna stenoza, restenoza, fibroza arterija, artrofibroza, fibroza dojke, mišićna fibroza, retroperitonealna fibroza, tiroidna fibroza, fibroza limfnih čvorova, fibroza bešike, pleuralna fibroza i HOBP, bolest u kojoj su zidovi disajnih puteva fibrozni sa akumulacijom miofibroblasta i kolagena, i, kao i sva fibrozna tkiva, kontrahovani.