RS56876B1 - Novo antitelo protiv humanog ngf - Google Patents

Description

Opis

[Tehnička oblast]

[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na novo antitelo protiv humanog NGF. Određenije, ovaj pronalazak odnosi se na Fab' fragment antitela protiv humanog NGF.

[Stanje Tehnike]

[0002] Faktor rasta nerava (NGF) je jedan od humoralnih faktora koji se generalno nazivaju "neurotrofični faktori", i igra značajnu ulogu u generisanju i diferencijaciji neurona i u održavanju funkcija neurona u telu. Kao NGF receptori, poznati su receptori visokog afiniteta trkA (receptorska vrsta tirozin kinaze) i niskog afiniteta p75NTR. Opisano je da se među njima, p75NTR vezuje za sve neurotrofične faktore i uključen je u apoptozu u procesu neuronskog generisanja. Međutim, uloga p75NTR još uvek nije dovoljno objašnjena. Sa druge strane, poznato je da NGF nokaut miševi i trkA receptor eksprimiraju isti fenotip (Ne-patentni dokument 1), i smatra se da je fiziološka aktivnost NGF eksprimiana uglavnom putem trkA receptora.

[0003] 1993, postojao je izveštaj u kojem se pominje da davanje NGF pacovima izaziva bol (Ne-patentni dokument 2), i od tada, prijavljeno je da intravenozno davanje NGF ljudima indukuje sistemcku mijalgiju, a da topikalno davanje NGF ispoljava sistemski efekat i indukuje hiperpatiju i alodiniju na mestu injektovanja (Ne-patentni dokument 3). Pored toga, prijavljeno je da nokaut miš trkA receptora pokazuje analgeziju (Ne-patentni dokument 4), tako da se smatra da NGF predstavlja molekul koji je veoma uključen u ekspresiju bola. U vezi korelacije između NGF i patološkog stanja ljudskog bola, pokazano je da se eskpresija NGF/trkA ubrzava u zglobnim hrskavicama sa osteoartritisom (OA) (Ne-patentni dokument 6), a da se nivo NGF povećava kod pacijenata sa reumatoidnim artritisom (Ne-patentni dokument 7) ili intersticijalnim cistitisom (Ne-patentni dokument 8).

[0004] Iz prethodnih činjenica, očekuje se da, ukoliko je moguće razviti monoklonalno antitelo koje se specifično vezuje za NGF i ima inhibitornu aktivnost protiv aktivnosti NGF, ono može biti veoma korisno za lečenje, prevenciju, i dijagnostikovanje raznih bolesti koje uključuju bol povezan sa NGF.

[0005] Kao antitela protiv humanog NGF koja su klinički razvijena do sada, prijavljeni su tanezumab (Patentni dokument 1) i PG110 (Patentni dokument 2) kao humanizovana antitela protiv humanog NGF, i REGN475 (Patentni dokument 3), fulranumab (Patentni dokument 4), i MEDI-578 (Patentni dokument 5) kao potpuno humana antitela protiv humanog NGF. Među njima, tanezumab je iz nužnosti najbrže razvijen, a prijavljeno je da prema rezultatima kliničkih ispitivanja, ovo antitelo ispoljava potentan i širok analgetički efekat na bol kao što je artralgija praćena osteoartritisom, hronični leđni bol, i cistalgija praćena intersticijalnim cistitisom (Ne-patentni dokumenti 9 to 11).

[0006] Generalno, kao glavni faktori koji određuje efektivnu dozu antitela u leku, kao primer data su neutrališuća aktivnost antitela protiv anitgena i količina antigena prisutna u telu. Poboljšavajući neutrališuću aktivnost dolazi se do smanjenja doze, a shodno tome, to se može navesti kao veoma korisno ublažavanje koje vodi ka snižavanju finansijskog tereta pacijenata i medicinskih troškova.

Ukoliko se može realizovati smanjenje doze, takođe se može izvesti i subkutano davanje. Subkutano davanje ima glavnu prednost u tome što pacijent može sam izvesti samoinjektovanje kod kuće ukoliko su zadovoljeni određeni kriterijumi. Pored toga, dok se antitelo u leku već neko vreme uobičajeno daje ukapavanjem već, u mnogim slučajevima kod intravenoznog davanja, ovaj lek se može dati kao bolus subkutanim davanjem, što predstavlja još jednu prednost. I lekar i pacijent mogu odabrati preparat za intravenozno davanje i preparat za subkutano davanje, a to je poželjan faktor. Međutim, kod subkutanog davanja, doza koja se može dati po davanju je mala poput 1 mL generalno, tako da dovoljna količina antitela treba da bude uključena u dozu kako bi se ispoljila efikasnost leka. Štaviše, za razliku od intravenoznog davanja, kod subkutanog davanja mora da se uzme u obzir biodostupnost. To jest, kako bi se realizovao preparat za subkutano davanje, potrebno je pripremiti antitelo koje pokazuje odličnu rastvorljivost i pokazuje dovoljnu efikasnost leka čak i pri maloj dozi. Shodno tome, ukoliko bi se obezbedilo antitelo koje ima veću neutrališuću aktivnost prema NGF u poređenju sa antitelima iz povezanog stanja tehnike, ono bi bilo veoma korisno za lečenje bolesti povezanih sa NGF i za poboljšanje pogodnosti tretmana.

[0007] Kako je prethodno opisano, iako je NGF važan faktor za rast neurona, izvođenje dovoljnog ispitivanja u smislu bezbednosti neophodno je u razvoju medicinskih lekova koji inhibiraju funkciju NGF. Određenije, kao jedan od aspekata koji bi trebalo da se ispita u smislu bezbednosti, kao primer su dati efekti na fetus. Do sada, u pogledu funkcionalne inhibicije NGF, prijavljeno je da je NGF mutacija uzrok kogenitalne analgezije (Ne-patentni dokument 5), i da u životinjskim eksperimentima, kada je kod trudnog morskog praseta izazvana proizvodnja autoantitela prema NGF kako bi inhibiralo NGF u telu, novorođeno morsko prase pokazivalo je simptome analgezije (Ne-patentni dokument 12). Štaviše, u testu u kojem su korišćeni NGF- ili trkA-deficijentni miševi, pokazano je da deficijencija NGF aktivnosti inhibira rast neurona senzornih nerava i simpatetičkih nerava embriona (Ne-patentni dokumenti 4 i 13). Iz ovih rezultata, zaključuje se da je NGF esencijalni faktor neurorazvoja u ranom stadijumu razvoja. NGF-povezane bolesti takođe uključuju bolesti od kojih u velikom broju boluju žene u godinama za rađanje, kao što je intersticijalni cistitis (polovina ili više pacijenata su 44 godina stari ili mlađi, a 90% pacijenata su žene (Ne-patentni dokument 14)), hronični leđni bol (prosečna starost od 40 do 50, a preko 50% pacijenata su žene (Ne-patentni dokumenti 15 do 17)), i migrena (vrhunac starosti početka kreće se od 15 do 40 godina, a 80% pacijenata su žene (Ne-patentni dokument 18)). U ovoj situaciji, u razvoju antitela protiv NGF kao medicinskog leka, veoma je važno ublažiti rizik od sporednih efekata na fetus kod trudnih žena.

[0008] Kao primer još jednog faktora rizika u slučaju razvoja antitela protiv NGF kao medicinskog leka, navodi se formiranje imunokompleksa (IC). Imunokompleks koji je kombinacija antigena i antitela generalno se obrađuje u retikuloendotelijalnom sistemu kao što je slezina ili jetra. Međutim, prijavljeno je da kada je izazvano neko patološko stanje kao što je imunološka abnormalnost ili kada je veličina formiranog IC velika, IC gubi rastvorljivost, što je povezano sa povećanjem rizika od formiranja trombova i sa početkom nefritisa izazvanog glomerularnim nagomilavanjem IC. Iako je IgG bivalentno antitelo, kada je antigen polivalentan, IC može imati razne veličina usled rešetskaste formacije. Veličina IC zavisi od količine antitela i antigena i njihovog međusobnog odnosa, afiniteta antitela, i slično. Na primer, antitelo bevacizumab protiv VEGF (product name: Avastin) je IgG1 antitelo, i prijavljeno je da to antitelo formira IC vezivanjem za dimer VEGF i indukuje formiranje trombova. Specifično, kada se Avastin i VEGF daju humanom FcγRIIα receptor Tg mišu, primećeno je formiranje tromba u plućnoj arteriji (Ne-patentni dokument 19). Pored toga, prijavljeno je da se arterijalni tromb formira brže kod pacijenata sa metastatičnim kancerom koji primaju hemoterapiju sa Avastin lečenjem, u poređenju sa placebo grupom koja je primala samo hemoterapiju (Ne-patentni dokument 20). Kako NGF takođe formira dimer u telu kako bi ispoljio fiziološku aktivnost, poželjno je dalje poboljšati bezbednost kako bi se zaobišao rizik od IC formiranja u razvoju medicinksog leka antitela protiv NGF.

[0009] Iz gornjih razloga, za lečenje ili prevenciju raznih NGF-povezanih bolesti, veoma je važno obezbediti antitelo protiv NGF koje je odlično po pitanju bezbednosti redukovanjem rizika od sporednih efekata kao što su efekti na fetus i formiranje tromba održavajući visoku neutrališuću aktivnost.

[Povezano stanje tehnike]

[Patentni dokument]

[0010]

[Patentni dokument 1] WO2004/058184

[Patentni dokument 2] WO2005/061540

[Patentni dokument 3] WO2009/023540

[Patentni dokument 4] WO2005/019266

[Patentni dokument 5] WO2006/077441

[Ne-patentni dokument]

[0011]

[Ne-patentni dokument 1] Conover JC, et al, Rev Neurosci.1997, 8:13-27.

[Ne-patentni dokument 2] Lewin GR, et al, J Neurosci.1993, 13:2136-48.

[Ne-patentni dokument 3] Petty BG, et al, Ann Neurol.1994, 36:244-6.

[Ne-patentni dokument 4] Smeyne RJ, et al, Nature.1994,368:246-9.

[Ne-patentni dokument 5] Indo Y, et al, Nat Genet.1996, 13:485-8.

[Ne-patentni dokument 6] Iannone F, et al, Rheumatology 2002, 41:1413-8.

[Ne-patentni dokument 7] Aloe L, et al, Clin Exp Rheumatol.1997,15:433-8.

[Ne-patentni dokument 8] Lowe EM, et al, Br J Urol.1997, 79:572-7.

[Ne-patentni dokument 9] Lane NE, et al, N Engl J Med.2010, 363:1521-31.

[Ne-patentni dokument 10] Evans RJ, et al, J Urol.2011, 185:1716-21.

[Ne-patentni dokument 11] Katz N, et al, Pain.2011, in press

[Ne-patentni dokument 12] Johnson EM Jr, et al, Science.1980, 210:916-8.

[Ne-patentni dokument 13] Crowley C, et al, Cell.1994, 76:1001-11.

[Ne-patentni dokument 14] Payne CK, et al, J Urol.2007, 177:2042-9.

[Ne-patentni dokument 15] Manchikanti L, et al, Pain Physician.2010, 13:E279-92.

[Ne-patentni dokument 16] Wilkens P, et al, JAMA.2010, 304:45-52.

[Ne-patentni dokument 17] Buynak R, et al, Expert Opin Pharmacother.2010, 11:1787-804.

[Ne-patentni dokument 18] Sakai F, et al, Cephalalgia.1997, 17:15-22.

[Ne-patentni dokument 19] Meyer T, et al, J Thromb Haemost.2009,7:171-81.

[Ne-patentni dokument 20] Scappaticci FA, et al, J Natl Cancer Inst.2007, 99:1232-9.

[Suština pronalaska]

[Tehnički problem]

[0012] Predmet ovog pronalaska je da obezbedi antitelo protiv humanog NGF ili njegov antigen-vezujući fragment koji je izvanredan po pitanju bezbednosti redukovanjem rizika od sporednih efekata kao što su efekti na fetus i formiranje tromba održavajući visoku neutrališuću aktivnost. Ovaj pronalazak definisan je patentnim zahtevima.

[Rešenje ovog problema]

[0013] Ovo otkriće uključuje sledeće aspekte kao medicinski ili industrijski korisne supstance ili postupci.

[1] Fab’ fragment antitela protiv humanog NGF koji obuhvata:

varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane od SEQ ID NO:6; i

varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane od SEQ ID NO:4 [2] Fab’ fragment prema [1], u kojem konstantan region teškog lanca Fab’ fragmenta predstavlja humani Igγ1 konstantan region.

[3] Fab’ fragment prema [1], u kojem konstantan region lakog lanca Fab’ fragmenta predstavlja humani Igκ konstantan region.

[4] Fab’ fragment prema [1], u kojem konstantan region teškog lanca Fab’ fragmenta predstavlja humani Igγ1 konstantan region, a konstantan region lakog lanca Fab’ fragmenta predstavlja humani Igκ konstantan region.

[5] Fab’ fragment prema [1], koji obuhvata:

fragment teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane od SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:14, ili SEQ ID NO:16; i

laki lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane od SEQ ID NO: 12.

[6] Fab’ fragment prema bilo kom od [1] do [5], pri čemu je Fab' fragment konjugovan sa polietilen glikolom.

[7] Polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira fragment teškog lanca Fab’ fragmenta prema bilo kom od [1] do [6].

[8] Polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira laki lanac Fab’ fragmenta prema bilo kom od [1] do [6].

[9] Ekspresioni vektor koji obuhvata polinukleotid prema [7] i/ili [8].

[10] Ćelija domaćin transformisana ekspresionim vektorom prema [9].

[11] Ćelija domaćin prema [10], koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od sledećih (a) i (b), (a) ćelija domaćin transformisana ekspresionim vektorom koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira fragment teškog lanca Fab’ fragmenta prema bilo kom od [1] do [6] i polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira laki lanac Fab’ fragmenta; i (b) ćelija domaćin transformisana ekspresionim vektorom koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira fragment teškog lanca Fab’ fragmenta prema bilo kom od [1] do [6] i ekspresionim vektorom koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira laki lanac Fab’ fragmenta.

[12] Postupak za proizvodnju Fab’ fragmenta antitela protiv humanog NGF prema bilo kom od [1] do [6], koji obuhvata eksprimiranje Fab’ fragmenta antitela protiv humanog NGF uzgajanjem ćelije domaćina prema [10] ili [11].

[13] Agens za lečenje bola, koji obuhvata Fab’ fragment prema bilo kom od [1] do [6].

[14] Agens za lečenje bola prema [13], pri čemu je bol osteoartritisni bol.

[15] Postupak za prevenciju ili lečenje bola, koji obuhvata davanje Fab’ fragmenta prema bilo kom od [1] do [6].

[16] Postupak prema [15], pri čemu je bol osteoartritisni bol.

[17] Fab’ fragment prema bilo kom od [1] do [6] za upotrebu u prevenciji ili lečenja bola.

[18] Fab’ fragment prema [17], pri čemu je bol osteoartritisni bol.

[Prednosti ovog pronalska]

[0014] Fab’ fragment pegilovan antitelom protiv humanog NGF ovog pronalaska koristan je za prevenciju ili lečenje raznih bolesti kod kojih je humani NGF uključen u formiranje patološkog stanja. Zbog svoje visoke neutrališuće aktivnosti, Fab’ fragment pegilovan antitelom protiv humanog NGF ovog pronalaska donosi odlično poboljšanje u kliničkim primenama, kao što je snižavanje doze, proširivanje intervala davanja, i poboljšanje postupka davanja (na primer, subkutana injekcija). Štaviše, u redukovanju rizika od sporednih efekata kao što su efekti na fetus i formiranje trombova, Fab’ fragment antitela protiv humanog NGF ovog pronalaska značajno je odličan u smislu bezbednosti i veoma doprinosi prevenciji i lečenju raznih bolesti kod kojih je humani NGF uključen u formiranje patološkog stanja.

[Kratak opis crteža]

[0015] [Fig.1] Fig.1 prikazuje vremensku promenu u količini antitela zadržanog u tabanu u kolagenom indukovanom artritičnom mišjem modelu.

[Opis primera izvođenja]

[0016] Pronaazači su ponovili kreativno ispitivanje kako bi pripremili antitelo protiv humanog NGF ili njegov antigen-vezujući fragment. Kao rezultat, uspeli su u pripremanju Fab’ fragmenta antitela protiv humanog NGF koji je odličan po pitanju bezbednosti redukovanjem rizika od sporednih efekata kao što su efekti na fetus i formiranje tromba održavajući visoku neutrališuću aktivnost.

[0017] Osnovna struktura molekula antitela je uobičajena među respektivnim klasama antitela i konstituisana je sa teškim lancem molekularne mase od 50000 do 70000 i lakim lancem molekularne mase od 20000 do 30000. Teški lanac generalno se sastoji od polipeptidnog lanca koji uključuje oko 440 aminokiselina, a svaka klasa ima svoju karakterističnu strukturu. Teški lanci nazivaju se γ, µ, α, δ, i ε lanci koji odgovaraju IgG, IgM, IgA, IgD, i IgE. Dalje, IgG ima podklase kao što su IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4, i ovi lanci nazivaju se γ1, γ2, γ3, i γ4 respektivno. Laki lanac generalno se sastoji od polipeptidnog lanca koji uključuje oko 220 aminokiselina, a poznate su dve vrste lakog lanca koje uključuju L-vrstu i K-vrstu lakih lanaca, koje se nazivaju λ i κ lanci respektivno. Što se tiče peptidnog konstituisanja osnovne strukure molekula antitela, dva homologna teška lanca i dva homologna laka lanca vezana su disulfidnim vezama (S-S veze) i ne-kovalentnim vezama, i njihova molekulska masa je 150000 do 190000. Ove dve vrste lakih lanaca može se upariti sa bilo kojim teškim lancem. Svaki molekul antitela uvek se sastoji od dva identična laka lanca i dva identična teška lanca.

[0018] Postoji četiri međulančane S-S veze u teškom lancu (pet veza za µ i ε lance) i dve u lakom lancu. Jedna petlja forima se na 100 prema 110 aminokiselinkih ostataka, a ova sterična struktura slična je među respektivnim petljama i naziva se strukturalna jedinica ili domen. I za teške lance i za lake lance, aminokiselinska sekvenca domena pozicionirana na njegovom N-terminalu nije konstantna čak i u odnosu na standard iz istih klasa (potklasa) istih životinjskih vrsta, a taj domen naziva se varijabilni region. Svaki od tih domena naziva se varijabilni region teškog lanca (VH) i varijabilni region lakog lanca (VL) respektivno. Kako je aminokiselinska sekvenca C-terminalne strane od domena skoro konstantna u svakoj klasi ili potklasi, ovaj region naziva se konstantan region, a svaki od domena opisan je kao CH1, CH2, CH3 i CL, respektivno.

[0019] Antigenska determinantna lokacija antitela konstituisana je sa VHi VL, a vezujuća specifičnost zavisi od aminokiselinske sekvence te lokacije. Sa druge strane, biološke aktivnosti kao što je vezivanje za komplemente ili razne ćelije oražavaju razlike u strukturi konstantnog regiona među različitim klasama Ig. Poznato je da je varijabilnost u varijabilnim regionima teškog lanca i lakog lanca uglavnom ograničena na tri mala hipervarijabilna regiona prisutna u oba lanca, a ovi regioni nazivaju se regioni koji određuju komplementarnost (CDR-ovi; CDR1, CDR2 i CDR3 počevši od N-terminalne strane). Preostali deo varijabilnog regiona naziva se region okvira (FR) i relativno je konstantan.

[0020] Region između CHdomena i CH2 domena konstantnog regiona teškog lanca antitela naziva se region spojnice. Ovaj region uključuje mnoštvo prolinskih ostataka i ima više među-lančanih S-S veza koje povezuju dva teška lanca. Na primer, svaki region spojnice humanog IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4 uključuje 2, 4, 11, i 2 cisteinskih ostataka koji respektivno konstituišu među-teške lančane S-S veze. Region spojnice je region veoma osetljiv na proteolitički enzim kao što je papain ili pepsin. Kada se antitelo vari papainom, njegov teški lanac cepa se na položaju bližem N-terminalnoj strani ka međuteško lančanoj S-S vezi regiona spojnice, čime se to antitelo cepa na dva Fab fragmenta i jedan Fc fragment. Fab fragment je konstituisan sa lakim lancem i fragmentom teškog lanca koji uključuje varijabilni region teškog lanca (VH), CH1 domen, i deo regiona spojnice. Kada se antitelo vari pepsinom, njegov teški lanac cepa se napoložaju bližem C-terminalnoj strani nego među-teško lančanoj S-S vezi regiona spojnice, čime se generišu F(ab')2fragmenti. F(ab')2fragment je fragment sa dimernom strukturom u kojoj se dva Fab' fragmenta vezuju jedan za drugi putem među-teško lančane S-S veze u regionu spojnice. Fab’ fragment je konstituisan sa lakim lancem i fragmentom teškog lanca koji uključuje varijabilni region teškog lanca (VH), CH1 domen, i deo regiona spojnice. Cisteinski ostatci koji konstituišu među-teško lančanu S-S vezu uključeni su u deo regiona spojnice. Svi Fab fragment, F(ab')2fragment, i Fab' fragment uključuju varijabilni region i imaju antigen-vezujuću aktivnost.

[0021] Fab’ fragment antitela protiv humanog NGF koje su pronalazači uspešno pripremili je Fab' fragment sa sledećim karakteristikama.

[0022] Fab’ fragment antitela protiv humanog NGF obuhvata varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane od SEQ ID NO:6 i varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane od SEQ ID NO:4.

[0023] Specifično, pronalazači su konstruisali antitela primenom razvojne tehnologije humanog monoklonalnog antitela, "VelocImmune " miš [VelocImmune antibody technology; Regeneron Inc. (U.S. Patent Br.6596541)], i skrinovali ta antitela primenom testova za razne biološke aktivnosti i fizičke osobine, čime su uspeli u identifikovanju Fab’ fragment antitela protiv humanog NGF ovog pronalaska: In the VelocImmune tehnologiji, transgeni miševi u kojima su endogeni imunoglobulinski varijabilni regioni teškog i lakog lanca zamenjeni odgovarajućim humanim varijabilnim regionima, čelendžovani su sa antigenom od interesa (na primer, humani βNGF), i limfatične ćelije dobijene su iz miševa koji su eksprimirali ta antitela. Limfatične ćelije su fuzionisane sa mišjim mijeloma ćelijama kako bi se pripremili hibridomi. Ćelije hibridoma skrinovane su radi identifikovanja ćelija hibridoma koje proizvode antitela koja se specifično vezuju za antigen od interesa. Antitela koja su ovde proizvedena su antitela sa varijabilnim regionima humanih antitela i konstantni regioni mišjih antitela (koja se takođe nazivaju himerna antitela). Zatim, ukoliko je identifikovano antitelo koje se vezuje specifično za antigen od interesa i ima željenu neutrališuću aktivnost, DNK koje kodiraju varijabilne regione teškog lanca i lakog lanca antitela su izolovani iz ćelija hibridoma i povezane sa DNK koje kodiraju konstantne regione teškog lanca i lakog lanca željene klase humanog antitela. Rezultujući gen koji kodira teški lanac i laki lanac antitela eksprimiran je u ćelijama (npr., CHO ćelije) kako bi se proizveo molekul antitela. Teški lanac i laki lanac antitela proizvedeno gornjim postupkom su teški lanac i laki lanac "potpuno humanog" antitela izvedenog iz humanog imunoglobulinskog gena.

[0024] Fab’ fragment pegilovan antitelom protiv humanog NGF ovog pronalaska stručnjak iz ove oblasti može lako pripremiti na osnovu sekvencionih informacija o njihovom ovde opisanom varijabilnom regionu teškog lanca i varijabilnom regionu lakog lanca, primenom postupka koji je uobičajen u ovoj oblasti. Poželjno, Fab’ fragment antitela protiv humanog NGF može se pripremiti kao Fab' fragment potpuno humanog antitela vezivanjem njihovog varijabilnog regiona teškog lanca i varijabilnog regiona lakog lanca za deo konstantnog regiona teškog lanca (koji uključuje CH1 domen i deo regiona spojnice koji uključuje cisteinski region spojnice) i konstantnog regiona lakog lanca humanog antitela, respektivno. Specifično, pripremljeni su genski fragment varijabilnog regiona teškog lanca sa osnovnom sekvencom koja kodira aminokiselinu varijabilnog regiona teškog lanca Fab’ fragmenta ovog pronalaska (SEQ ID NO:6), i genski fragment varijabilnog regiona lakog lanca sa osnovnom sekvencom koja kodira aminokiselinu varijabilnog regiona lakog lanca Fab’ fragmenta ovog pronalaska (SEQ ID NO:4). Zatim, geni varijabilnih regiona teškog lanca i lakog lanca povezani su sa svakim genom dela konstantnog regiona teškog lanca i konstantnog regiona lakog lanca u odgovarajućoj klasi humanog antitela kako bi se pripremio gens Fab' fragmenta potpuno humanog antitela. Sledeće, ovaj gen povezan je sa odgovarajućim ekspresionim vektorom i uveden u uzgajanu ćeliju. Konačno, uzgajana ćelija je uzgajana, čime se monoklonalni Fab' fragment može dobiti iz supenatanta kulture.

[0025] Genski fragmenti koji kodiraju aminokiseline varijabilnog regiona teškog lanca i lakog lanca Fab’ fragmenta mogu se sintetizovati primenom postupka za sitezu gena koji je poznat u struci, na osnovu, na primer, osnovne sekvence konstruisane na osnovu aminokiselinskih sekvenci varijabilnog regiona teškog lanca i varijabilnog regiona lakog lanca. Primeri ovog postupka genske sinteze uključuju razne postupke poznate stručnjacima iz ove oblasti, kao što je postupak sinteze gena antitela opisan u WO90/07861.

[0026] Zatim, prethodno opisani genski fragmenti varijabilnog regiona povezani su sa genom konstantnog regiona humanog antitela kako bi se pripremio potpuno human gen Fab' fragmenta. Iako se bilo koja potklasa konstantnog regiona (na primer, konstantan region teškog lanca kao što je γ1, γ2, γ3 ili γ4 lanac, ili konstantan region lakog lanca kao što je λ ili κ lanac) može izabrati kao konstantan region humanog antitela, humani Igγ1 kao konstantan region teškog lanca, i humani Igκ kao konstantan region lakog lanca, poželjno se mogu koristiti.

[0027] Nakon pripremanja ovakvog gena Fab’ fragmenta potpuno humanog antitela, uvođenje ovog gena u ekspresioni vektor, uvođenje ekspresionog vektora u kultivisane ćelije, kultivisane kultivisanih ćelija, prečišćavanje Fab’ fragmenta i slično može se izvesti primenom raznih postupaka poznatih u struci.

[0028] Primeri ekspresionog vektora koji je povezan sa ovako dobijenim genom uključuju GS vektor pEE6.4 ili pEE12.4 (Lonza Biologies), ali nisu specifično ograničeni, dokle god mogu da eksprimiraju takav

1

gen antitela. Takođe, može se koristiti ekspresioni vektor koji već ima gen humanog Ig konstantnog regiona kao što je AG-γ1 ili AG-κ (na primer, videti WO94/20632).

[0029] Prethodno opisani ekspresioni vektor uvodi se u kultivisane ćelije pomoću, na primer, kalcijum fosfatnim postupkom ili postupkom elektroporacije i slično.

[0030] Primeri kultivisanih ćelija u koje se uvodi ekspresioni vektor, uključuju kultivisane ćelije kao što su CHO-K1SV ćelije, CHO-DG44 ćelije i 293 ćelije, a ove ćelije mogu se kultivisati konvencionalnim postupkom.

[0031] Fab’ fragment akumuliran u supernatantu kulture nakon prethodno opisanog kultivisanja, može se prečistiti raznim vrstama hromatografije na koloni. Na primer, moguće je koristiti hromatografiju na koloni primenom KapaSelect ili slično.

[0032] Fab’ fragment može se pripremiti primenom rekombinantnog ekspresionog postupka kako je prethodno opisano. Međutim, Fab’ fragment može se pripremiti izvođenjem pepsin varenja prvo nakon pripremanja antitela pune dužine, i tretiranja dobijenog F(ab')2fragmenta reduktantnom kao što je 2-merkaptoetanol.

[0033] Poželjno, Fab’ fragment antitela protiv humanog NGF lako se može dobiti sintetizovanjem DNK koja obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca prikazana od SEQ ID NO:6 i DNK koja obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca prikazane od SEQ ID NO:4, i povezivanjem tih DNK sa odgovarajućom klasom gena konstantnog regiona humanog antitela, poželjno gen konstantnog regiona humanog Igγ1 za teški lanac i gen konstantnog regiona humanog Igκ za laki lanac, kako bi se konstruisao gen Fab' fragment a potpuno humanog antitela primenom postupka poznatog u struci, i uvođenjem tog gena u ekspresioni vektor, uvođenjem tog ekspresionog vektora u kultivisanu ćeliju, kultivisanjem te kulitivisane ćelije, i prečišćavanjem Fab' fragmenta sakupljenog iz te kultivisane ćelije primenom raznih postupaka poznatih u struci. Poželjno, DNK koja obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca prikazane od SEQ ID NO:6 obuhvata osnovne sekvence prikazane od SEQ ID NO:5. Poželjno, DNK koja obuhvata osnovnu sekvenca koja kodira aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca prikazane od SEQ ID NO:4 obuhvata osnovne sekvence prikazane od SEQ ID NO:3.

[0034] U ovom opisu, "Fab' fragment" odnosi se na fragment monovalentnog antitela konstituisan sa fragmentom lakog lanca i teškog lanca koji uključuju varijabilni region teškog lanca (VH), CH1 domen, i deo regiona spojnice. U delu regiona spojnice, uključen je najmanje jedan cisteinski ostatak (koji se takođe naziva "cistein regiona spojnice" u ovom opisu) koji pored cisteinskih ostataka konstituiše S-S vezu između teškog lanca i lakog lanca. Cistein regiona spojnice može se koristiti kao mesto modifikacije polietilen glikola opisano kasnije. Broj cisteina regiona spojnice u Fab’ fragmentu je varijabilan unutar opsega od 1 do nekoliko cisteinskih ostataka u zavisnosti od klase antitela koja se koristi, a lako se podešava od strane stručnjaka iz ove oblasti. Na primer, kada se priprema Fab' fragment humane IgG1 klase (generalno sa dva cisteina regiona spojnice u regionu spojnice), zaustavni kodon umeće se između mesta kodiranja prvog cisteina regiona spojnice i mesta kodiranja drugog cisteina regiona spojnice u regionu spojnice teškog lanca, dok se Fab' fragment sa jednim cisteinom regiona spojnice može pripremiti u regionu spojnice. Pored toga, ukoliko se zaustavni kodon umetne nakon mesta kodiranja drugog cisteina regiona spojnice, može se pripremiti Fab' fragment sa dva cisteina regiona spojnice u regionu spojnice.

[0035] Poželjan fragment teškog lanca Fab’ fragmenta antitela protiv humanog NGF koji obuhvata varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane od SEQ ID NO:6 i deo konstantnog regiona humanog Igγ1, predstavlja fragment teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane od SEQ ID NO:10, SEQ ID NO: 14, ili SEQ ID NO:16. Poželjno, DNK koja obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira fragment teškog lanca Fab’ fragmenta antitela protiv humanog NGF koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane od SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:14, ili SEQ ID NO:16 obuhvata osnovnu sekvencu prikazanu od SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:13, ili SEQ ID NO:15. Poželjan laki lanac Fab’ fragmenta antitela protiv humanog NGF koji obuhvata varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane od SEQ ID NO:4 i kosntantan region humanog Igκ, predstavlja laki lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane od SEQ ID NO: 12. Poželjno, DNK koja obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira laki lanac Fab’ fragmenta antitela protiv humanog NGF koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane od SEQ ID NO:12 obuhvata osnovnu sekvencu prikazanu od SEQ ID NO:11.

[0036] Kao poželjan Fab’ fragment pegilovan antitelom protiv humanog NGF ovog pronalaska koji obuhvata fragment teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane od SEQ ID NO:10 i laki lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane od SEQ ID NO:12, kao primer je dat Fab' fragment potpuno humanog 1-15(N52D) antitela opisan kasnije u primerima. Kao poželjan Fab’ fragment pegilovan antitelom protiv humanog NGF ovog pronalaska koji obuhvata fragment teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane od SEQ ID NO:14 i laki lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane od SEQ ID NO:12, kao primer je dat Fab' fragment potpuno humanog 1-15(N52D-A) antitela opisan kasnije u primerima. Kao poželjan Fab’ fragment pegilovan antitelom protiv humanog NGF ovog pronalaska koji obuhvata fragment teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane od SEQ ID NO:16 i laki lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane od SEQ ID NO:12, kao primer je dat Fab' fragment potpuno humanog 1-15(N52D-P) antitela opisan kasnije u primerima.

[0037] Takođe je opisan Fab’ fragment antitela protiv humanog NGF koji obuhvata varijabilni region teškog lanca koji obuhvata CDR1 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na položaju od 31 do 35 od SEQ ID NO: 6, CDR2 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na položaju od 50 do 65 od SEQ ID NO: 6, i CDR3 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na položaju od 98 do 110 od SEQ ID NO: 6, i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata CDR1 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na položaju od 24 do 39 od SEQ ID NO: 4, CDR2 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na položaju od 55 do 61 od SEQ ID NO: 4, i CDR3 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na položaju od 94 do 102 od SEQ ID NO: 4. Stručnjak takođe može pripremiti Fab’ fragment procedurama kao što su one koje su prethodno opisane.

[0038] Fab’ fragment antitela protiv humanog NGF ovog pronalaska modifikovan je konjugovanjem sa polietilen glikolom (PEG) putem njegoog citeina regiona spojnice. PEG-om se može konjugovati Fab’ fragment primenom postupaka poznatih u struci (na primer, EP0948544). U ovom pronalasku, koristan je ravni ili razgranati PEG sa arbitratnom prosečnom molekulskom masom ili njegov derivat, koji stručnjak iz ove oblasti lako može da odabere u skladu sa namenjenom upotrebom. Na primer, u tkivu tumora ili tokom zapaljenskog odgovora, vaskularna propustljivost je značajno ojačana u poređenju sa normalnim tkivom, tako da supstance koje se kreću ka tom tkivu mogu da iscure iz krvnih sudova i akumuliraju se u tumoru ili zapaljenskom tkivu (EPR efekat). Takođe je poznato da se supstanca male molekulske mase lako reapsorbuju u krvnim sudovima, a da se supstanca velike molekulske mase ne reapsornuje lako. Prema tome, kako bi se poboljšalo zadržavanje Fab’ fragmenta u lezionalnom tkivu, PEG-om koji ima veliku prosečnu molekulsku masu (na primer, oko 40000 Da) može se konjugovati ovaj fragment. Kada je poželjno da se Fab’ fragment brzo izluči iz tela, PEG-om koji ima malu prosečnu molekulsku masu (na primer, oko 10000 Da) može se konjugovati ovaj fragment. Štaviše, kako bi se olakšalo vezivanje PEG-a za cistein regiona spojnice, može se koristiti derivat PEG-a. Na primer, kako je kasnije opisano u primerima, moguće je koristiti derivat PEG-a za koji je vezana tiol-reaktivna grupa kao što je maleimid i vezati tiol grupu cisteina regiona spojnice sa maleimid grupom kovalentnom vezom. Generalno, prosečna molekulska masa PEG-a kreće se od oko 500 Da do oko 50000 Da, poželjno kreće se od oko 5000 Da do oko 40000 Da i poželjnije kreće se od oko 10000 Da do oko 40000 Da.

1

[0039] Kao postupak merenja aktivnosti vezivanja dobijenog Fab’ fragmenta antitela protiv humanog NGF za humani NGF, postoji postupak kao što je ELISA ili FACS. Na primer, kada se koristi ELISA, humani βNGF se imobilišeu ELISA ploči, Fab’ fragment se u to dodaje kako bi izazvao reakciju, a zatim se sekundarno antitelo kao što je anti-kapa antitelo obeleženo enzimom kao što je peroksidaza rena (HRP) ostavlja da uđe u reakciju sa reakcionom mešavinom. Kada se ploča opere, aktivnost se meri primenom reagensa (na primer, TMB hromogeni reagens u slučaju HRP obeležavanja) koji detektuje aktivnost, čime se identifikuje vezivanje sekundarnog antitela. Pored toga, Fab’ fragment antitela protiv humanog NGF takođe uključuje Fab' fragment koji se vezuje za NGF izveden iz druge životinje (na primer, mišji NGF) kao i humani NGF, tako da se aktivnost vezivanja u odnosu na takav protein može izmeriti.

[0040] Fab’ fragment pegilovan antitelom protiv humanog NGF ovog pronalaska ima neutrališuću aktivnost u odnosu na humani NGF. Kada se koristi u ovom opisu, izraz "neutrališuća aktivnost" Fab’ fragmenta antitela protiv humanog NGF odnosi se na aktivnost koja inhibira bilo koju biološku aktivnost koja je rezultat NGF vezivanjem za NGF, a ta neutrališuća aktivnost može se proceniti primenom jedne ili više bioloških aktivnosti NGF kao indeks. Primeri takve neutrališuće aktivnosti uključuju inhibitornu aktivnost protiv vezivanja NGF za trkA koji je NGF receptor, inhibitornu aktivnost protiv intracelularnog kalcijumovog influksa posredovan NGF-trkA signalom, i inhibitornu aktivnost protiv NGF-zavisnog signaliziranja ćelijskog preživljavanja. Neutrališuća aktivnost može se proceniti primenom postupaka opisanim kasnije u primerima.

[0041] Kako bi se određenije procenio efekat Fab’ fragmenta antitela protiv humanog NGF ovog pronalaska, može se izvesti in vivo test. Na primer, kako je kasnije opisano u primerima, in vivo efikasnos supstance Fab’ fragmenta može se proceniti testom analgetičkog efekta ili slično gde se koristi model artritisa kod miševa. Takođe je moguće proceniti efekat zadržavanja u lezionalnom tkivu primenom testa za svojstvo distribucije u leziji.

[0042] Dalje, Fab’ fragment antitela protiv humanog NGF ovog pronalaska takođe se može proceniti u smislu rizika od sporenih efekata. Na primer, kako je kasnije opisano u primerima, upotrebom testa transfera preko placente izvedenom nakon primene Fab’ fragmenta na trudnim životinjama, moguće je proceniti mogućnost da Fab’ fragment pegilovan antitelom protiv humanog NGF može ispoljiti efekte na fetus. Pored toga, kako je kasnije opisano u primerima, veličina imunokompleksa (IC) formiranog između Fab’ fragmenta antitela protiv humanog NGF ovog pronalaska i NGF meri se primenom testa za formiranje IC sa NGF, pri čemu se mogućnost indukovanja formiranja tromba može proceniti.

[0043] Pored toga, kao postupak procenjivanja raznih vrsta stabilnosti (na primer, toplotne stabilnosti, stabilnosti tokom dužeg skladištenja, i stabilnosti visoke koncentracije) Fab’ fragmenta antitela protiv humanog NGF ovog pronalaska, kao primer dati su postupak upotrebe diferencijalne skenirajuće kaliometrije i postupak merenja obrazovanja agregata tokom sklaištenja.

[0044] Fab’ fragment pegilovan antitelom protiv humanog NGF ovog pronalaska opciono se prečišćava, a zatim obrazuje u skladu sa uobičajenim postupcima, i može se koristiti za lečenje bola kao što je osteoartritisni bol (OA bol), reumatoidni bol, bol izazvan kancerom, neuropatski bol, hronični bol leđa, postoperativni bol, postherpetična neuralgija, bolna dijabetska neuropatija, bol usled preloma, i sindrom bolne bešike i bolesti kod kojih je NGF uključen u formiranje patološkog stanja, kao što je intersticijalni cistitis, akutni pankreatitis, hronični pankreatitis, i endometrioza.

[0045] Fab’ fragment pegilovan antitelom protiv humanog NGF ovog pronalaska poželjno se može koristiti kao agens za tretiranje bola i poželjnije kao agens za lečenje osteoartritisnog bola. Primeri formulacije ovakvog agensa za tretiranje i sličnih uključuju parenteralne formulacije kao što su injektabilni agensi i infuzioni gaensi, koji se poželjno daju intravenoznim davanjem, subkutanim davanjem i slično. U procesu formulisanja, nosioci ili aditivi koji odgovaraju ovim formulacijama mogu se koristiti unutar farmaceutski prihvatljivog opsega.

[0046] Količina novog Fab’ fragmenta pegilovanog antitelom protiv humanog NGF dodata u prethodno opisanu formulaciju varira od ozbiljnosti simptoma pacijenta ili starosti, doznog oblika formulacije koja se koristi ili vezujućeg titra antitela i slično; na primer, može e koristiti oko 0.001 mg/kg do 100 mg/kg antitela.

[0047] Ovo otkriće tako obezbeđuje polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira Fab’ fragment antitela protiv humanog NGF ovog pronalaska, i ekspresioni vektor koji ga obuhvata. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca Fab’ fragmenta antitela protiv humanog NGF ovog pronalaska, i polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca Fab’ fragmenta antitela protiv humanog NGF ovog pronalaska, i ekspresioni vektor koji obuhvata bilo koji od njih ili oba. Ekspresioni vektor prema ovom pronalasku nije specifično ograničen, dokle god može da ispolji gen koji kodira Fab’ fragment ovog pronalaska ili njegov varijabilni region teškog lanca i/ili varijabilni region lakog lanca u raznim ćelijama domaćinima prokariotskih ćelija i/ili eukariotskih ćelija, i proizvodi ove polipeptide. Njegovi primeri uključuju plazmidne vektore, virusne vektore (na primer, adenovirus, retrovirus) i slično. Poželjno, ekspresioni

1

vektor obuhvata polinukleotid koji obuhvata ili sekvencu koja kodira fragment teškog lanca ili fragment lakog lanca prethodno opisanog Fab' fragmenta ovog pronalaska, ili oba i polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira fragment teškog lanca Fab’ fragmenta ovog pronalaska i polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira fragment lakog lanca Fab’ fragmenta ovog pronalaska.

[0048] Ekspresioni vektor može da obuhvata gen koji kodira Fab’ fragment antitela protiv humanog NGF ovog pronalaska, ili gene koja kodira varijabilni region teškog lanca i/ili varijabilni region lakog lanca Fab’ fragmenta antitela protiv humanog NGF ovog pronalaska, i promoter koji je funkcionalno povezan sa tim genom. Primeri promotera za eksprimiranje gena koji kodira Fab’ fragment ovog pronalaska ili njegov varijabilni region teškog lanca i/ili varijabilni region lakog lanca u bakteriji uključuju Trp promoter, lac promoter, recA promoter, λPL promoter, lpp promoter, tac promoter i slično, kada je domaćin bakterija roda Escherichia. Primeri promotera za ekspresiju u kvascu uključuju PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter i ADH promoter, a neki primeri promotera za ekspresiju u rodu Bacillus uključuju SL01 promoter, SP02 promoter, penP promoter i slično. Kada je domaćin eukariotska ćelija kao što je ćelija sisara, primeri promotera uključuju SV40-izvedeni promoter, retrovirusni promoter, promoter termičkog šoka i slično.

[0049] Kada se bakterija, određenije Escherichia coli, koristi kao ćelija domaćin, ekspresioni vektor ovog pronalaska može dalje da obuhvata inicijacioni kodon, zaustavni kodon, region prekida i ponovljivu jedinicu. Kada se kvasac, životinjska ćelija ili ćelija insekta koristi kao domaćin, ekspresioni vektor ovog pronalaska može da obuhvati inicijacioni kodon i zaustavni kodon. U tom slučaju, on može da obuhvata pojačivačku sekvencu, nekodirajuće regione na 5' strani i 3' strani gena koji kodira Fab’ fragment ovog pronalaska ili njegov varijabilni region teškog lanca ili varijabilni region lakog lanca, sekvencu sekrecionog signala, spojni čvor, poliadenilacioni region, ponavljajuću jedinicu ili slično. Takođe, može da obuhvata selekcioni marker koji se uobičajeno koristi (na primer, tetraciklin-rezistentni gen, ampicilin-rezistentan gen, kanamicin-rezistentan gen, neomicin-rezistentan gen, gen reduktaze dihidrofolne kiseline) prema namenjenoj upotrebi.

[0050] Ovo otkriće takođe obezbeđuje transformant uveden u gen koji kodira Fab’ fragment antitela protiv humanog NGF ovog pronalaska ili gen koja kodira varijabilni region teškog lanca i/ili varijabilni region lakog lanca Fab’ fragmenta antitela protiv humanog NGF ovog pronalaska. Takav transformant može se pripremiti, na primer, transformisanjem ćelija domaćina ekspresionim vektorom ovog pronalaska. Ćelija domaćin koja se koristi da pripremi transformant nije specifično ograničena, dokle god je pogodna za gore pomenuti ekspresioni vektor i dokle god se može transformisati; njihovi primeri uključuju razne ćelije kao što su prirodne ćelije ili veštački utvrđene linije ćelija koje se uobičajeno

1

koriste u tehničkoj oblasti ovog pronalaska (na primer, bakterija (bakterija roda Escherichia, bakterija roda Bacillus), kvasci (roda Saccharomyces, roda Pichia i slično), životinjske ćelije ili ćelije insekata (na primer, Sf9) i slično. Transformacija se može izvesti bilo kojim poznatim postupkom per se.

[0051] Poželjno, ovaj transformant je ili ćelija domaćin transformisana ekspresionim vektorom koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca Fab’ fragmenta ovog pronalaska i polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca Fab’ fragmenta, ili ćelija domaćin transformisana ekspresionim vektorom koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca Fab’ fragmenta ovog pronalaska i ekspresioni vektor koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca Fab’ fragmenta. Poželjnije, taj transformant je ili ćelija domaćin transformisana ekspresionim vektorom koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira fragment teškog lanca prethodno opisanog Fab' fragmenta ovog pronalaska i polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira laki lanac Fab’ fragmenta, ili ćelija domaćin transformisana ekspresionim vektorom koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira fragment teškog lanca prethodno pomenutog Fab'-a ovog pronalaska i ekspresioni vektor koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira laki lanac Fab’ fragmenta.

[0052] Ovo otkriće takođe obezbeđuje postupak za proizvodnju Fab’ fragmenta antitela protiv humanog NGF ovog pronalaska, koji obuhvata eksprimiranje u ćeliji domaćinu gena koji kodira Fab’ fragment antitela protiv humanog NGF ovog pronalaska ili gena koji kodira varijabilni region teškog lanca i/ili varijabilni region lakog lanca Fab’ fragmenta antitela protiv humanog NGF ovog pronalaska, to jest, upotrebom takvog transformanta. Poželjno, ćelija domaćin koja se koristi u gore pomenutom postupku je ćelija domaćin transformisana sa prethodno opisanim ekspresionim vektorom ovog pronalaska, i može odvojeno ili jednovremeno da obuhvata polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca Fab’ fragmenta ovog pronalaska i polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca Fab’ fragmenta.

[0053] Kada se proizvodi Fab’ fragment antitela protiv humanog NGF ovog pronalaska, transformant se može kultivisati u hranljivom medijumu. Taj hranljivi medijum poželjno sadrži izvor ugljenika i neorganski izvor azota ili organski izvor azota, koji su potrebni za rast transformanta. Primeri izvora ugljenika uključuju glukozu, dekstran, rastvorljivi skrob, saharozu i slično; primeri neorganskog izvora azota ili organskog izvora azota uključuju amonijumove soli, nitrate, aminokiseline, kukuruznu vodicu, pepton, kazein, ekstrakt mesa, sojin kolač, ekstrakt krompira i slično. Ukoliko je poželjno, mogu biti sadržani drugi nurtijenti (na primer, neorganske soli (na primer, kalcijum hlorid, natrijum dihidrogen fosfat,

1

magnezijum hlorid), vitamini, antibiotici (na primer, tetraciklin, neomicin, ampicillin, kanamicin i slično) i slično).

[0054] Kultivisanje transformanta izvodi se postupkom poznatim per se. Uslovi kultivisanja, na primer, temperatura, pH medijuma, i vreme kultivisanja pogodno se mogu odabrati. Na primer, kada je domaćin životinjska ćelija, MEM medijum koji sadrži oko 5% do 20% fetalnog goveđeg seruma (Science, Vol.122, p.501, 1952), DMEM medijum (Virology, Vol.8, p.396, 1959), RPMI1640 medijum (J. Am. Med. Assoc., Vol.199, p.519, 1967), 199 medijum (Proc. Soc. Exp. Biol. Med., Vol.73, p.1, 1950) i slično mogu se koristiti kao medijum. pH medijuma poželjno je oko 6 do 8, kultivisanje se obično izvodi na oko 30°C do 40°C tokom oko 15 do 72 sata, a aeracija ili umešavanje mogu se izvesti ukoliko je neophodno. Kada je domaćin ćelija insektal, na primer, Grejsov medijum koji obuhvata fetalni goveđi serum (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.82, p.8404, 1985) i slično mogu se pomenuti, a njegova pH poželjno je oko 5 do 8. Kultivisanje se obično izvodi na oko 20°C do 40°C tokom 15 do 100 sati, a aeracija ili umešavanje mogu se izvesti ukoliko je potrebno. Kada je domaćin bakterija, actinomici, kvasac, ili filamentozne gljive, na primer, pogodan je tečni medijum koji obuhvata prethodno opisane hranljive izvore. Medijum sa pH od 5 do 8 je poželjan. Kada je domaćin E. coli, poželjni primeri medijuma uključuju LB medijum, M9 medijum (Miller et al., Exp. Mol. Genet, Cold Spring Harbor Laboratory, p.431, 1972) i slično. U ovom slučaju, kultivisanje se normalno može izvesti na 14°C do 43°C tokom oko 3 do 24 sati, a aeracija ili umešavanje mogu se primeniti ukoliko je potrebno. Kada je domaćin bakterija roda Bacillus, kultivisanje se normalno može izvesti na 30°C do 40°C tokom oko 16 do 96 sati, dok se aeracija ili umešavanje mogu izvesti ukoliko je to potrebno. Kada je domaćin kvasac, primeri medijuma uključuju Burkholder-ov minimalni medijum (Bostian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.77, p.4505, 1980), a pH medijuma poželjno je 5 do 8. Kultivisanje se normalno izvodi na oko 20°C do 35°C tokom oko 14 do 144 sati, a aeracija ili umešavanje mogu se pogodno izvesti ako je potrebno.

[0055] Fab’ fragment antitela protiv humanog NGF može se dobiti, poželjno izolovati i prečistiti, iz kultivisanog transformanta kakav je prethodno opisan. Primeri postupka izolovanja i prečišćavanja uključuju postupke na bazi razlika u rastvorljivosti, kao što je uklanjanje soli i i taloženje rastvora; postupke na bazi razlika u molekulskoj masi, kao što je dijaliza, ultrafiltracija, filtracija na gelu, i natrijum dodecil sulfat-poliacrilamid gel elektroforeza; postupke na bazi razlika u električnom naelektrisanju, kao što je izmenjivačka hromatografija i hidroksil apatitna hromatografija; postupke na bazi specifičnog afiniteta, kao što je afinitetna hromatografija; postupke na bazi razlika u hidrofobičnosti, kao što je reverzno fazna tečna hromatografija visokih performansi; postupke na bazi razlika u izoelektričnoj tački kao što je izoelektrično fokusiranje; i slično.

1

[0056] Iako je ovaj pronalazak prethodno generalno opisan, specifični primeri su obezbeđeni samo radi boljeg razumevanja ovog pronalaska. Ovi primeri su samo u svrsi ilustracije i ne ograničavaju obim ovog pronalaska.

Primeri

[0057] U fazama koje koriste komercijalno dostupni komplet ili reagens, eksperimenti su izvedeni u skladu sa priloženim protokolima ukoliko nije drugačije naznačeno.

(Primer 1: Imunizacija VelocImmune miša)

[0058] Antitelo protiv humanog NGF dobijeno je imunizovanjem VelocImmune miševa. Kako bi se povećala raznolikost dobijenog antitela, pronalazači su ispitali višestruke postupke imunizacije, putanje davanja, adjuvanasa, imunizacionih perioda, i slično. Upotrebom humanog βNGF (R&D Systems, Inc.) kao imunogena, pronalazači su ispitali postupak imunizacije u kojem se humani βNGF koristi za imunizaciju njegovim umešavanjem sa adjuvasom nakon rastvaranja, i postupak imunizacije kod koje je korišćen humani βNGF njegovim umešavanjem sa adjuvansom nakon termičkog denaturisanja (tretiranje na 80°C tokom 10 minuta u 0.5% SDS rastvoru). Kao putanja davanja, ispitano je davanje preko stopala i intraperitonealnono davanje. Kao adjuvans, ispitani su TiterMax Gold (CytRx Corporation), kompletan Freundov Adjuvans (Sigma), nekompletan Freundov Adjuvans (Sigma), i RIBI Adjuvans (Corixa Corporation). Kao imunoaktivator koji se dodaje, ispitani su CpG oligonukleotid i Aluminijum Fosfatni Gel (BRENNTAG). Kao imunizacioni period, ispitane su 3 do 14 nedelja. Nakon što su životinje imunizovane nekoliko puta, krv je sakupljena iz kaudalne vene miševa, i praćen je titar. Na ovaj način, odabrani su VelocImmune miševi koji proizvode antitelo koje se vezuje sa humanim NGF.

[0059] Titar je izmeren primenom sledećeg standardnog ELISA postupka. Humani βNGF dodat je u Maxisorp 384 ploču (Nunc) pri 10 ng/bazenčić i imobilisan inkubisanjem tokom noći na 4°C. Sledeći dan, ploča je jednom oprana rastvorom za pranje (TBST: tris pufer (TBS) koji sadrži 0.05% Tween-20), blokirajući agens (TBST koji sadrži 20% Blocking One (Nacalai Tesque, Inc..)) dodat je u to, i ploča je ostavljena da miruje na sobnoj temperaturi tokom sata. Nakon što je ploča jednom oprana TBST rastvorom za pranje, sakupljena krv serijski je razblažena i dodata u ploču. Nakon jednog sata inkubacije na sobnoj temperaturi, ploča je oprana tri puta TBST rastvorom za pranje, i HRP-kozje anti-mišji Ig antitelo (Zymed) koje je 2000-puta razblaženo TBST rastvorom za pranje koji sadrži 5% Blocking One dodato je u to. Nakon jednog sata inkubacije na sobnoj temperaturi, ploča je oprana tri puta TBST rastvorom za pranje. Ploča je dopunjena TMB hromogenim reagensom (SUMITOMO BAKELITE CO., LTD)

1

i ostavljena da miruje na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta, zaustavni rastvor (2 mol/L sumporna kiselina) dodat je u to kako bi se zaustavila reakcija, i izmerena je apsorbancija na 450 nm.

(Primer 2: Pripremanje hibridoma koji proizvodi antitelo protiv humanog NGF)

[0060] Miševi su odabrani usklađivanjem povećanja u titru antitela konačno su imunizovani (intravenozno ili intraperitonealno davanje antigena). Slezina, limfni čvor, ili slično imunizovanih miševa ekstraktovan je prema normalnom postupkom kako bi se sakupili limfociti, a ti limfociti fuzionisani su mišjim mijeloma ćelijama SP2/0, čime je pripremljen hibridom. Hibridom je podvrgnut ograničenom razblaživanju i monokloniranju, a antitelo je prečišćeno od supernatanta upotrebom kolone proteina A ili proteina G (GE Healthcare Japan).

(Primer 3: Evaluacija NGF-trkA vezujuće inhibicije)

[0061] Humani βNGF (R&D Systems, Inc.) ostavljen je da uđe u reakciju sa EZ-LINK 5-(biotinamido)pentilamin (Pierce) na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta na tamnom mestu kako bi se izvelo biotinsko obeležavanje, i višak biotina uklonjen je primenom kolone za uklanjanje soli, čime je dobijen biotinom obeležen humani βNGF. U sledećim Primerima 6 i 7, kod pripremljenog biotinom obeležeog humanog βNGF potvrđeno je postojanje iste biološke aktivnosti kao ona kao i kod originalnog humanog βNGF.

[0062] Inhibitorna aktivnost izmerena je sledećim postupkom. Humani trkA (R&D Systems, Inc.) dodat je u belu Maxisorp 384 ploču (Nunc) pri 60 ng/bazenčić i imobilisan inkubisanjem tokom noći na 4°C. Sledeći dan, ploča je jednom oprana TBST rastvorom za pranje, blokirajući agens (TBST koji sadrži 20% Blocking One (Nacalai Tesque, Inc.)) dodat je u to, i ploča je ostavljena da miruje na sobnoj temperaturi tokom sata. Nakon toga, mešavina dobijena mešanjem sa biotinom obeleženim humanim βNGF (0.2 µg/ml) pripremljenim kako je prethodno opisano sa antitelom pripremljen u Primeru 2 dodat je u trkA-imobilisanu ploča sa blokiranjem koje je u toku. Nakon jednog sata inkubacije na sobnoj temperaturi, ploča je oprana tri puta TBST rastvorom za pranje, i streptavidin obeležen alkalnom fosfatazom (Pierce) dodat je u to. Nakon jednog sata inkubacije na sobnoj temperaturi, ploča je oprana tri puta TBST rastvorom za pranje, a zatim dopunjena sa APU4 (BioFx) koji je ragens koji detektuje hemiluminescenciju, a količina hemiluminescencije izmerena je EnVision brojačem (PerkinElmer Co., Ltd.).

(Primer 4: Evaluacija unakrsne reaktivnosti vrsta)

[0063] Kada antitelo ima unakrsnu reaktivnost u odnosu na mišji βNGF, moguće je izvesti evaluaciju efikasnosti leka u mišjem patološkom modelu upotrebom antitela. Shodno tome, biotinom obeležen

2

mišji βNGF pripremljen je u postupku Primera 3 upotrebom mišjeg βNGF (R&D Systems, Inc.), čime se procenjuje unakrsna reaktivnost antitela ka mišjem βNGF.

(Primer 5: Evaluacija specifičnosti vezivanja)

[0064] Specifičnost vezivanja antitela sa NGF procenjena je upotrebom ELISA postupka opisan u Primeru 1. Specifično, upotrebljen je NT-3 kao molekul familije pokazuje najveću homologiju ka NGF. Humani NT-3 (PeproTech) dodat je u ploču u postupku Primera 1 pri 20 ng/bazenčić i imobilisan u ploči, čime je omogućeno izvođenje evaluacije.

(Primer 6: Evaluacija inhibicije NGF-trkA signaliziranja)

[0065] Procenjena je inhibitorna aktivnost antitela protiv NGF-trkA signaliziranja. NGF povećava koncentraciju intraćelijskog kalcijuma (Ca<2+>) putem trkA kao NGF receptora. Generalno, promena u Ca<2+>koncentraciji može se proceniti u prisustvu kalcijumskog indikatora upotrebom sistema za merenje koncentracije intraćelijskog kalcijuma (Ca<2+>) (FLIPR; Molecular Devices, LLC.).

[0066] Inhibitorna aktivnost izmerena je sledećim postupkom. HEK293 ćelije (WO2009/054468) izazvane da stabilno eksprimiraju humani trkA dispergovane su u ploču sa 96-bazenčića obloženi poli-D-lizinom (Becton, Dickinson i Company, Japan) pri 2×10<4>ćelije/bazenčić dan pre eksperimenta i uzgajane su preko noći. Sledeći dan, medijum kulture zamenjen je DMEM medijumom kulture (koji sadrži 3.6 mM natrijum hidroksid (NaOH) i 2.5 mM probenecid (Sigma)) koji sadrži kalcijumski indikator (Fluo4-AM; Dojindo) i ostavljen da miruje na 37°C tokom 30 minuta. Posle toga, ćelije su oprane dva puta rastvorom za pranje (Hank-ov balansiran slani rastvor) (HBSS) (20 mM 2-[4-(2-hidroksietil)-1-piperazinil]etan sulfonska kiselina (HEPES), 3.6 mM natrijum hidroksida, 2.5 mM probenecida (Sigma), i 0.1% albumin u goveđem serumu), i medijum kulture zamenjen je ovim rastvorom za pranje pri 150 µl/bazenčić. Ćelija sa pločama podešena je u FLIPR. Upravljanjem FLIPR, umešani rastvor antitela dobijen u Primeru 2 i NGF dodat je u ploču pri 50 µl/bazenčić (finalna NGF koncentracija od 100 ng/ml), i izmerena je promena u koncentraciji intraćelijskog Ca<2+>. Razlika između maksimalnih i minimalnih vrednosti promena u koncentraciji intraćelijskog Ca<2+>izračunata je i sačuvana kao podaci merenja.

(Primer 7: Evaluacija inhibiranja signalizacije NGF-zavisnog ćelijskog preživljavanja)

[0067] Kada su PC 12 ćelije koje prirodno eksprimiraju trkA i p75 receptori kultivisani u ulsovima bez seruma, NGF omogućava ćelijama da prežive nekoliko dana. Sledećim postupkom, procenjena je inhibitorna aktivnost antitela protiv NGF-zavisnog ćelijskog preživljavanja.

[0068] PC 12 ćelije su zasejane u ploču sa 96-bazenčića obložene kolagenom (ASAHI TECHNO CO., LTD.) pri 1×10<4>ćelije/bazenčić i inkubisane preko noći u F12K medijumu kulture (Invitrogen) koji sadrži 2.5% fetalni goveđi serum i 15% inaktivirani konjski serum (Invitrogen) pri 37°C pod 5% CO2. Sledeći dan, medijum kulture zamenjen je samo sa F12K u uslovima bez seruma. Nakon jednog sata, antitelo i humani βNGF (finalna koncentracija od 50 ng/ml) u to su dodati, praćeno uzgajanjem tokom 72 sata. Nakon toga, rastvor kulture uklonjen je aspiratorom, a ćelijska vijabilnost izmerena je primenom ragensa (CellTiter Glo; Promega Corporation) koja kvantifikuje endogeni ATP ćelija.

(Primer 8: Pripremanje Fab fragmenta)

[0069] Gel vezan enzimom varenja papaina dodat je u 1 mg/ml antitela upotrebom kompleta za pripremanje Fab-a (Pierce), praćeno tretiranjem na 37°C tokom 3 sata. Tretirani reakcioni rastvor dodat je u kolonu sa proteinom G (GE Healthcare Japan), pocepani Fc i nereagovani IgG uklonjeni su apsorbovanjem na koloni, i sakupljena je eluirana frakcija, čime su dobijeni Fab fragmenti. Dobijeni Fab fragmenti procenjeni su testovima opisanim u Primerima 3, 6, i 7.

[0070] Kao rezultat evaluacije Primera 3 do 8, potvrđeno je da je antitelo nazvano 1-15 (himerno antitelo) imalo visoku neutrališuću aktivnost, unakrsnu reaktivnost vrsta, i specifičnost vezivanja i da je održalo visoku neutrališuću aktivnost čak iako je ovo antitelo u obliku fragmenta monovalentog antitela.

(Primer 9: Određivanje sekvence gena antitela)

[0071] Za identifikovanje antitela 1-15, pronalazači su klonirali gene koji kodiraju teške lance i lake lance antitela iz hibridoma. Specifično, klon hibridoma pripremljen jeu količini od 1×10<5>ili većoj i suspendovan u RLT puferu koji je uključen u RNeasy Mini Komplet (QIAGEN), a zatim su ćelije razbijene sa QIAshredder (QIAGEN). Nakon toga, RNK je ekstraktovana prema protokolu, i upotrebom ekstraktovane RNK kao šablon, cDNK sintetizovana je primenom kompleta za amplifikaciju DNK (SMARTer RACE cDNA Amplification Kit; Clontech). PCR je izveden primenom dobijene cDNK, čime se produžava i amplifikuje varijabilni region teških lanaca i lakih lanaca. Analiza sekvenci izvedena je direktno na PCR proizvodima upotrebom sekvencera (ABI PRISM 3100; Applied Biosystems). Pored toga, PCR proizvodi rekombinovani su podklonizirajućim vektorom PCR proizvoda kao što je pCR3.1-TOPO (Invitrogen), praćeno analizom sekvence gena, čime se odredila sekvenca.

[0072] Određena osnovna sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca antitela 1-15 prikazana je sa SEQ ID NO:1, a njegova aminokiselinska sekvenca prikazana je sa SEQ ID NO:2. Štaviše, osnovna sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca antitela prikazana je sa SEQ ID NO:3, a njegova aminokiselinska sekvenca prikazana je sa SEQ ID NO:4. CDR1, CDR2 i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca antitela 1-15 je region položaja od 31 do 35, 50 do 65, i 95 do 102 varijabilnog regiona teškog lanca bazirano na Kabat numerisanju, respektivno, koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na položaju od 31 do 35, 50 do 65, i 98 do 110 od SEQ ID NO:2, respektivno. CDR1, CDR2 i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca antitela 1-15 je region položaja od 24 do 34, 50 do 56, i 89 do 97 varijabilnog regiona lakog lanca bazirano na Kabat numerisanju, respektivno, koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na položaju od 24 do 39,55 do 61, i 94 do 102 od SEQ ID NO:4, respektivno.

(Primer 10: Pripremanje mutanta mesta glikolizacije varijabilnog regiona)

[0073] Aminokiselina (SEQ ID NO:2) varijabilnog regiona teškog lanca antitela 1-15 opisana gore uključuje N-vrstu glikolizacionu motiv sekvencu kao N-X-(T/S). Specifično, u varijabilnom regionu teškog lanca prikazan sa SEQ ID NO:2, Asn (N52) na položaju 52 baziran na Kabat numerisanju odgovara mestu glikolizacije. Poznato je da iako se glikolizacija antitela javlja tokom kultivisanja ćelija ukoliko antitelo ima mesto glikolizacije, glikolizacija zavisi od uslova kultivisanja ili domaćina koji eksprimira antitelo. Drugim rečima, čak i među istim utvrđenim ćelijama koje proizvode antitelo, stepen glikolizacije verovatno varira sa uslovima kultivisanja (kao što je medijum kulture i gustina ćelija), što vodi ka mogućnošću da može biti teško dobiti lek sa antitelom koji ima uniforman kvalitet. Prema tome, pronalazači su pripremili 1-15(N52D) koji je dobijen uvođenjem muatcije u N52 u varijabilnom regionu teškog lanca antitela 1-15.

[0074] Osnovna sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca pripremljenog 1-15(N52D) prikazana je sa SEQ ID NO:5, a njegova aminokiselinska sekvenca prikazana je sa SEQ ID NO:6. CDR1, CDR2 i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca antitela 1-15(N52D) je region položaja od 31 do 35, 50 do 65, i 95 do 102 varijabilnog regiona teškog lanca bazirano na Kabat numerisanju, respektivno, koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na položaju od 31 do 35, 50 do 65, i 98 do 110 od SEQ ID NO:6, respektivno.

(Primer 11: Pripremanje Fab’ fragmenta potpuno humanog antitela)

[0075] Upotrebom varijabilnih regiona teškog lanca 1-15 i 1-15(N52D) opisana gore i varijabilnog regiona lakog lanca 1-15, pripremljeni su respektivni Fab' fragmenti potpuno humanog antitela.

[0076] Signalna sekvenca povezana je za 5' strane respektivnih gena varijabilnog regiona teškog lanca 1-15 i 1-15(N52D), gen konstantnog regiona humanog Igγ1 (Man Sung Co. et al., (1992) J Immunol. Vol. 148(4):1149-1154) povezan je za njegove 3' strane respektivno. Ovaj gen fragmenta teškog lanca umetnut je u GS vektor pEE6.4 (Lonza Biologies). U tom trenutku, kako bi se eksprimirali geni kao Fab' fragment, zaustavni kodon umetnut je nakon kodona Cys na položaju 226 (koji odgovara Cys na položaju 230 u aminokiselinskoj sekvenci od SEQ ID NO:8 i SEQ ID NO:10 opisana kasnije) na osnovu EU indeksa u genu konstantnog regiona teškog lanca. Pored toga, signalna sekvenca povezana je za 5' stranu gena

2

varijabilnog regiona lakog lanca 1-15, gen konstantnog regiona humanog κ lanca (Man Sung Co. et al., opisana gore) povezan je za njegovu 3' stranu respektivno. Ovaj gen lakog lanca umetnut je u GS vektor pEE12.4 (Lonza Biologics).

[0077] Fab’ fragment eksprimiran je na dva načina koji uključuju tranzijentnu ekspresiju i konstantnu ekspresiju. U tranzijentnoj ekspresiji, FreeStyle 293 ćelije (Invitrogen) kultivisane u FreeStyle 293 Ekspresionom Medijumu (Invitrogen) na oko 1,000,000 ćelije/mL transfektovane su sa prethodno opisanim GS vektorima fragmenta teškog lanca i lakog lanca upotrebom 293fektina (Invitrogen), praćeno uzgajanjem tokom nekoliko dana. U konstantnoj ekspresiji, oba gore opisana GS vektora pocepani su restrikcionim enzimima NotI i PvuI, praćeno ligacijom upotrebom kompleta za ligaciju DNK (TAKARA BIO INC), čime se konstruiše GS vektor u koji se geni oba fragmenta teškog lanca i lakog lanca umetnuti. Ovaj ekspresioni vektor kodira fragment teškog lanca, lakog lanca, i glutaminske sintetaze i eksprimiran je tako što je transfektovan na CHO-K1-SV ćelijama. Nakon što su vektori eksprimirani na respektivan način, supernatant kulture je prečišćen upotrebom KapaSelect (GE Healthcare Japan), čime su dobijeni respektivni Fab' fragmenti.

[0078] Osnovna sekvenca fragmenta teškog lanca pripremljenog Fab' fragmenta potpuno humanog 1-15 antitela (takođe označeno kao 1-15-Fab') prikazana je sa SEQ ID NO:7, a njegova aminokiselinska sekvenca prikazana je sa SEQ ID NO:8 respektivno.

[0079] Osnovna sekvenca fragmenta teškog lanca pripremljenog Fab' fragmenta potpuno humanog 1-15(N52D) antitela (takođe označeno kao 1-15(N52D)-Fab') prikazana je sa SEQ ID NO:9, a njegova aminokiselinska sekvenca prikazana je sa SEQ ID NO:10 respektivno.

[0080] Laki lanac respektivnih Fab' fragmenata su isti, a njihova osnovna sekvenca prikazana je sa SEQ ID NO:11, a njegova amino sekvenca prikazana je sa SEQ ID NO: 12 respektivno.

(Primer 12: Evaluacija neutrališuće aktivnosti i ekspresioni nivo Fab’ fragmenta potpuno humanog antitela)

[0081] 1-15-Fab' i 1-15(N52D)-Fab' dobijeni u Primeru 11 procenjeni su testovima opisanim u Primerima 3 i 6. U testu Primera 3, IC50 od 1-15-Fab' i 1-15(N52D)-Fab' iznosio je 0.17 µg/ml i 0.18 µg/ml respektivno. U testu Primera 6, IC50 od 1-15-Fab' i 1-15(N52D)-Fab' iznosio je 0.021 µg/ml i 0.018 µg/ml respektivno. Iz ovih rezultata, potvrđeno je da je neutrališuća aktivnost 1-15(N52D)-Fab' održavana je do skoro istog stepena kao i nemodifikovan 1-15-Fab', i da neutrališuća aktivnost nije pod uticajem čak iako je mutacija uvedena.

[0082] Pored toga, respektivni Fab' fragmenti eksprimirani su konstantnom ekspresijom, i izmerena je količina antitela proizvedena u supernatantu kulture stabilne količine ekspresionih ćelija. Kao rezultat, koncentracije respektivnih supernatanata kulture 1-15-Fab' i 1-15(N52D)-Fab' bile su 86 mg/L i 106 mg/L respektivno, što je pokazalo da je 1-15(N52D)-Fab' antitelo proizvedeno u većoj količini od nemodifikovanog 1-15-Fab'.

(Primer 13: Pripremanje pegilovanog Fab' fragmenta i evaluacija neutrališuće aktivnosti)

[0083] Dalje, pronalazači su uveli PEG u 1-15(N52D)-Fab'. Pošto je prečišćen pomoću KapaSelect, Fab’ fragment je podvrgnut reakcijom redukcije upotrebom TCEP hidrohlorida (Tris(2-karboksietil)fosfin HCl), pri čemu je Fab’ fragment izrađen u PEGilirajućoj strukturi.

[0084] Specifično, TCEP dodat je u rastvor Fab' fragmenta čija je koncentracija podešena na 1.2 mg/ml upotrebom 20 mM natrijum fosfatnog pufera (pH 6.8), tako da je TCEP postao 1 mM, praćeno reakcijom na 37°C tokom 2 sata, a zatim je dobijeni proizvod razblažen sa 20 mM natrijum acetatnim puferom (pH 5.0) rado podešavanja pH. Ovaj rastvor je apsorbovan na katjonskoj izmenjivačkoj smoli (SP-5PW;

TOSOH CORPORATION) i podvrgnut NaCl gradijentnom eluiranju, i sakupljen je glavni pik. Dobijeni Fab' fragment razblažen je sa 20 mM natrijum fosfatnim puferom (pH 6.8) kako bi dao 1 mg/ml, pH je podešena na 6.8, i zatim je rastvor ostavljen da miruje na 4°C preko noći ili duže kako bi se prirodno oksidizovao.40 kDa PEG (SUNBRIGHT GL2-400MA; NOF CORPORATION) dodat je u rastvor kako bi dao finalnu koncentraciju od 0.1 mM, i rastvor je ostavljen da miruje na sobnoj temperaturi tokom 2 sata, a zatim na 4°C preko noći. Sa maleimid grupom na njegovom kraju, ovaj PEG rapidno ulazi u reakciju sa Cys (C226 na osnovu EU indeksa; Cys na položaju 230 od SEQ ID NO:10) karboksilnog kraja fragmenta teškog lanca. Rastvor je razblažen sa 20 mM natrijum acetatnim puferom (pH 4.5) kako bi se podesila pH, a zatim ponovo apsorbovan na katjon izmenjivačkoj smoli (SP-5PW; TOSOH CORPORATION), dobijeni proizvod podvrgnut je NaCl gradijentnom eluiranju, a glavni pik je sakupljen. Dobijeni pegilovan Fab' fragment je prečišćen. Ovaj pegilovan 1-15(N52D)-Fab' takođe se naziva 1-15(N52D)-Fab'-PEG

[0085] Neutrališuća aktivnost ne-pegilovanog i pegilovanog 1-15(N52D)-Fab'-a procenjena je postupkom prikazanom u Primeru 3. Kao rezultat, dok je IC50 za 1-15(N52D)-Fab' iznosio 0.15 µg/ml, IC50 za 1-15(N52D)-Fab'-PEG bio je 0.12 µg/ml (u smislu koncentracije Fab' fragmenta), pri čemu je potvrđeno da neutrališuća aktivnost 1-15(N52D)-Fab' nije pod uticajem čak i kada je dodat PEG.

[0086] Pored toga, upotrebom postupka Primera 6, 1-15(N52D)-Fab'-PEG upoređen je sa antitelom protiv humanog NGF tanezumabom iz stanja tehnike, u smislu neutrališuće aktivnosti u odnosu na

2

humane i mišje NGF. Kao rezultat, dok je IC50 za 1-15(N52D)-Fab'-PEG iznosio 0.051 µg/ml za humani NGF i 0.069 µg/ml za mišji NGF, IC50 za tanezumab bio je 0.17 µg/ml za humani NGF i 0.23 µg/ml za mišji NGF. Prema tome, potvrđeno je da je neutrališuća aktivnost 1-15(N52D)-Fab'-PEG bila oko 3.3 puta jača od tanezumaba, u odnosu na bilo koji humani ili mišji NGF.

(Primer 14: Testiranje analgetičkog efekta primenom mišjeg modela adjuvansom indukovanog artritisa)

[0087] Pronalazači su procenili analgetički efekat gornjeg 1-15(N52D)-Fab'-PEG na mišjem modelu adjuvansom indukovanog artritisa.

[0088] 1-15(N52D)-Fab'-PEG intravenozno je dat (0.03 mg/kg, 0.1 mg/kg, i 0.3 mg/kg; doza je iznosila 10 mL/kg) miševima, i 1 mg/mL Freundov kompletni adjuvans (Sigma) dat je u količini od 25 µL u stopalu zadnjeg uda kako bi se indukovao bol.24 sata nakon indukovanja bola, izmereno je ponašanje negovanja tokom 20 minuta. Specifično, upotrebom SUPERMEX sistema za praćenje spontane aktivnosti (Muromachi Kikai Co., Ltd.), broj spontane nege miševa automatski je izmereno tokom 20 minuta upotrebom senzora infracrvenih zraka (Matson et al., JPET 320:194-201, 2007). Kao komparativna kontrola, korišćeno je antitelo iz stanja tehnike tanezumab. Kao rezultat, dok je intravenozno davanje tanezumaba proizvelo je analgetički efekat od ED50=0.27 mg/kg, 1-15(N52D)-Fab'-PEG proizveo je analgetički efekat od ED50=0.11 mg/kg što pokazuje efektivnost veću za oko 3 puta.

(Primer 15: Ispitivanje transfera preko placente kod pacova)

[0089] 1-15(N52D)-Fab'-PEG ili tanezumab intravenozno je dat (100 mg/kg, doza je iznosila 10 mL/kg) ženkama pacova 17tog dana trudnoće. Tri dana kasnije, izmerena je koncentracija antitela u krvi majke i fetusa.

[0090] Koncentracija antitela izmerena je na sledeći način. Humani βNGF (R&D Systems, Inc.) dodat je u MULTI-ARRAY Ploču (Standard) 96 ploče (Meso Scale Discovery) pri 25 ng/bazenčić i imobilisan tako što je ostavljena da miruje na sobnoj temperaturi tokom jednog sata. Ploča je oprana tri puta TBST rastvorom za pranje, a blokirajući agens (1% kazein TBS; Thermo Fisher) dodat je u to i ostavljen da miruje na sobnoj temperaturi tokom jednog sata. Nakon toga, uzorak krvi dobijen razređivanjem krvi sakupljene vremenom dodat je u ploču imobilisanu sa humanim βNGF, kod koje je u toku bilo blokiranje. Nakon što je mešavina reagovana na sobnoj temperaturi tokom 60 minuta pod umešavanjem, ploča je oprana tri puta TBST rastvorom za pranje, a zatim je biotinom obeleženo anti-humano Kapa antitelo (Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd.) dodato u to. Nakon što je mešavina reagovana tokom 60 minuta na sobnoj temperaturi pod umešavanjem, ploča je oprana tri puta TBST rastvorom za pranje, i

2

streptavidin obeležen SULFO-TAG (Meso Scale Discovery) dodat je u to. Nakon što je mešavina reagovana tokom 60 minuta na sobnoj temperaturi pod umešavanjem, ploča je oprana tri puta TBST rastvorom za pranje, Read Pufer T (Meso Scale Discovery) dodat je u to, a količina elektrohemijske luminescencije izmerena je sa SECTOR Imager 6000 (Meso Scale Discovery).

[0091] Ovaj test izveden je na tri majke pacova. Tri dana kasnije, koncentracija antitela 1-15(N52D)-Fab'-PEG i tanezumab u krvi majki pacova iznosila je 12.1 µg/ml i 7.1 µg/ml u proseku respektivno. Za to vreme, što se tiče koncentracije antitela u krvi 3 fetusa ekstraktovane iz svake majke pacova (9 fetusa ukupno), dok je koncentracija 1-15(N52D)-Fab'-PEG u krvi bila 0.01 µg/ml (ograničenje kvantifikacije) ili manje kod fetusa, koncentracija tanezumaba u krvi bila je 5.39 µg/ml u proseku. To jest, dok je tanezumab transferovan na fetus pri stopi od 75.9%, 1-15(N52D)-Fab'-PEG transferovan je na fetus pri stopi od 0.08% (detekciono ograničenje) ili manje. Ovi rezultati sugerišu da je 1-15(N52D)-Fab'-PEG medicinski agens koji je odličan po pitanju bezbednosti zaobilaženjem rizika od sporednih efekata izazvanim u fetusu usled inhibicije NGF.

(Primer 16: Formiranje imunokompleksa (IC))

[0092] Procenjeno je da li 1-15(N52D)-Fab'-PEG formira ili ne neki IC, ili kolika je veličina formiranog IC. Specifično, 1 mg/ml za 1-15(N52D)-Fab'-PEG umešan je sa humanim βNGF (R&D Systems, Inc.) pri molarnom odnosu od 1:1, praćeno inkubisanjem na sobnoj temperaturi tokom 3 sata, čime je formiran IC. Veličina čestice i distribucija IC u ovom reakcionom rastvoru izmereni su primenom Zetasizer Nano (Malvern) kao instrumenta koji meri dinamično rasipanje svetlosti. Za analizu, korišćen je Zetasizer v6.01 (Malvern), a veličina čestice indikovana je po vrednosti (d. nm) analizirane u smislu inteziteta (%).

[0093] Izmerene veličine čestica prikazane su u sledećoj Tabeli 1. U ovom eksperimentu, veličina čestice samo za NGF bila je 6.2 nm u proseku. U slučaju samo tanezumaba, prikazan je veličina pika pri 11.7 nm. Kada je izmeren IC formiran inkubisanjem tanezumaba i NGF, veličina pika pomerena je na 91.3 nm. Sa druge strane, kada je primenjeno antitelo koje se ne vezuje sa NGF kao kontrolno antitelo, veličina pika i dalje je bila 11.7 nm. Uzimajući u obzir širinu pomeranja, pretpostavlja se da su svaki tanezumab i NGF postali makromolekul kao kombinacija više molekula, čime je formiran IC veće veličine. Nasuprot tome, kada je izmereno IC formiranje za 1-15(N52D)-Fab'-PEG i NGF, veličina pika je pomerena sa 18.1 nm na 24.4 nm. Uzimajući u obzir širinu pomeranja, ovaj rezultat uticao je samo na jedan-na-jedan vezivanje i nagovestio da do rešetkastog formiranja nije došlo kod 1-15(N52D)-Fab'-PEG

[Tabela 1]

2

(Primer 17: Distribuciona karakteristika na lezionalnom tkivu)

[0094] Emulzija koja uključuje kolagen (tip 2 kolagena izveden iz goveđeg zgloba, 10 mg/mL; Collagen technique workshop) i kompletni Freundov adjuvans (0.5 mg/mL; DIFCO) u odnosu od 1:1 subkutano je dat u skočni zglob mužijaka DBA/1 miševa, čime su pripremljeni kolagenom indukovani artritis modeli. Četiri nedelje nakon indukovanja artritisa, ta emulzija je data kako bi izazvala artritis. Stepen razvoja (ocena i veličina oticanja) artritisa u zadnjim udovima primećena je u grupi miševa. Fluorescentno obeležavanje izvedeno je na 1 mg/mL PBS rastvorima 1-15(N52D)-Fab'-PEG i tanezumaba upotrebom SAIVI™ kompleta za brzo obeležavanje antitela, Alexa Fluor (registrovani žig) 680 (Life Technologies Corporation). Svaki rastvor dat je u kaudalnu venu pri 2 mg/kg (N=4). Fluorescencija akumulirana u oteklom stopalu analizirana je 50 sati jedan sat nakon davanja upotrebom IVIS Spectrum (Caliper/Xenogen), a intezitet fluorescencije indikovan je numeričkim vrednostima.

[0095] Fig.1 pokazuje vremensku promenu količine antitela zadržane tabanu.1-15(N52D)-Fab'-PEG jasnije je pokazao efekat zadržavanja u lezionalnom tkivu u poređenju sa tanezumabom, a ovaj efekat trajao je 48 sati. Iz ovih rezultata, smatra se da 1-15(N52D)-Fab'-PEG efikasno ispoljava analgetički efekat, i smatra se da bi ovo antitelo moglo da ispolji analgetički efekat jednak ili veći od jačine efikasnosti leka pri nižoj dozi. Takođe se očekuje da 1-15(N52D)-Fab'-PEG može biti odličan medicinski agens u smislu bezbednosti budući da se ovo antitelo selektivno akumulira na mestu lezija.

(Primer 18: Pripremanje aminokiselinskog adukta Fab' fragmenta)

[0096] Kako bi se poboljšala efikasnost PEG uvođenja u 1-15(N52D)-Fab', pronalazači su pripremili Fab' fragmente koji su dobijeni dodavanjem dva alanina (A) ili prolina (P) nakon Cys ostatka u karboksilnom kraju fragmenta teškog lanca i izveli ekspresiju i prečišćavanje. Isti postupak kao u Primeru 11 korišćen je kako bi se pripremili ovi Fab' fragmenti. U ovom postupku, kodon dva alanina ili prolina insertovani su

2

nakon kodona Cys ostatka karboksil kraja fragmenta teškog lanca 1-15(N52D)-Fab', a zaustavni kodon umetnut je nakon ovog kodona.

[0097] Osnovna sekvenca fragmenta teškog lanca alanin-dodatog 1-15(N52D)-Fab' (Fab' fragment potpuno humanog 1-15(N52D-A) antitela; takođe označen kao 1-15(N52D-A)-Fab') prikazana je sa SEQ ID NO:13, a njegova aminokiselinska sekvenca prikazana je sa SEQ ID NO: 14 respektivno. Osnovna sekvenca fragmenta teškog lanca prolin-dodatog 1-15(N52D)-Fab' (Fab' fragment potpuno humanog 1-15(N52D-P) antitela; takođe označeno kao 1-15(N52D-P)-Fab') prikazana je sa SEQ ID NO:15, a njegova aminokiselinska sekvenca prikazana je sa SEQ ID NO:16 respektivno. Laki lanac respektivnih Fab' fragmenata isti je kao i laki lanac 1-15(N52D)-Fab', a njegova osnovna sekvenca i aminokiselinska sekvenca prikazane su sa SEQ ID NO: 11 i SEQ ID NO:12 respektivno.

(Primer 19: Pripremanje pegilovanog 1-15(N52D-A)-Fab' i evaluacija neutrališuće aktivnosti i farmakološka evaluacija)

[0098] 40 kDa PEG-om konjugovan je 1-15(N52D-A)-Fab' na isti način kao u Primeru 13, čime je dobijen pegilovan 1-15(N52D-A)-Fab' (nadalje, takođe označen kao 1-15(N52D-A)-Fab'-PEG).

[0099] Neutrališuća aktivnost 1-15(N52D-A)-Fab'-PEG procenjena je u postupku opisanom u Primeru 3. Kao rezultat, dok je IC50 za 1-15(N52D)-Fab'-PEG bila 0.081±0.034 µg/ml, IC50 za 1-15(N52D-A)-Fab'-PEG bila je 0.074±0.021 µg/ml. Pored toga, IC50 tanezumaba u tom trenutku bila je 0.410±0.099 µg/ml.

[0100] Dalje, neutrališuća aktivnost upoređena je primenom postupka opisanog u Primeru 6. Kao rezultat, dok je IC50 za 1-15(N52D)-Fab'-PEG bila 0.061±0.011 µg/ml za humani NGF, IC50 za 1-15(N52D-A)-Fab'-PEG bila je 0.064±0.028 µg/ml.

[0101] Štaviše, analgetički efekat u adjuvansom indukovanom artritis modelu procenjen je primenom postupka opisanom u Primeru 14. Kao rezultat, 1-15(N52D-A)-Fab'-PEG pokazao je analgetički efekat u odnosu na artritis model.

[0102] Iz gornjih rezultata, potvrđeno je da čak i kada su data dva alanina nakon Cys ostatka karboksil kraja, nije uticano na neutrališuću aktivnost i farmakološku aktivnost.

(Primer 20: Evaluacija vezujućeg afiniteta za 1-15(N52D-A)-Fab'-PEG)

[0103] Termodinamike vezivanja 1-15(N52D-A)-Fab'-PEG i tanezumaba za NGF antigen procenjeno je izotermalnom titracionom kaliometrijom (ITC) (Scappaticci FA, J Natl Cancer Inst.2007, 99:1232-9.

2

Velazquez-Compoy, A., et al, Curr Protoc Cell Biol.2004, Chapter 17, Unit 17-18). Ukupno merenje izvedeno je primenom Auto-iTC 200 proizvedeno od strane GE healthcare. Tokom ovog eksperimenta, izveden je test pri sledećoj koncentraciji kako bi se procenilo vezivanje monovalentnog Fab' fragmenta za jedan molekul antigena, a ukupan test izveden je u PBS rastvoru. Specifično, 44 µM humanog βNGF (R&D Systems, Inc.) sadržano u špricu titrovano je u kaliometrijske ćelije ispunjene uzorkom antitela (3 µM 1-15(N52D-A)-Fab'-PEG ili 1.5 µM tanezumaba) pri 1.4 µL 30 puta, i detektovana je količina toplote proizvedena na taj način. Dobijeni podaci analizirani su modelom jednog vezivajućeg mesta upotrebom softvera vezanog za instrument, čime su procenjeni vezujući afinitet (Kd), vezujući odnos (n), vezujući slobodna energija (ΔG), vezujuća entalpija (ΔH), i vezujuća entropija (-TΔS) povezani sa vezivanjem antigen-antitelo. Rezultati su prikazani u Tabeli 2.

[0104] Kao rezultat, dok je vrednost Kd tanezumaba bila 20.41 nM, vrednost Kd za 1-15(N52D-A)-Fab'-PEG bila je 1.49 nM, što pokazuje da je vezujući afinitet za 1-15(N52D-A)-Fab'-PEG bio jači 10 puta ili više od onog za tanezumab (Tabela 2).

[Tabela 2]

(Primer 21: Pripremanje pegilovanog 1-15(N52D-A)-Fab' sa raznih veličinama PEG-a i evaluacija neutrališuće aktivnosti)

[0105] 1-15(N52D-A)-Fab' pripremljen u Primeru 18 konjugovan je sa 5 kDa PEG ili 10 kDa PEG upotrebom slične procedure kao u Primeru 13. Specifično, Fab' fragment rastvor pripremljen upotrebom 20 mM Tris-HCl pufera (pH 7.4) podvrgnut je tretmanu redukcije primenom TCEP. Zatim, Fab' fragment sakupljen je upotrebom kolone za uklanjanje soli. PEG (SUNBRIGHT GL2-50MA ili SUNBRIGHT GL2-100MA; NOF CORPORATION) je dodat u dobijeni Fab' fragment, a rastvor je ostavljen da miruje na 4°C preko noći.1-15(N52D-A)-Fab' fragmenti konjugovani sa 5 kDa PEG ili sa 10 kDa PEG koji su dobijeni na ovaj način nazivaju se 1-15(N52D-A)-Fab'-5kPEG i 1-15(N52D-A)-Fab'-10kPEG, respektivno.

[0106] Posle toga, upotrebom postupka prikazanog u Primeru 6, respektivni pegilovani Fab' fragmenti upoređeni su jedan sa drugim u smislu neutrališuće aktivnosti. Kao komparativna kontrola, korišćen je 1-15(N52D-A)-Fab'-PEG (konjugovan sa 40 kDa PEG; nadalje, takođe označen kao 1-15(N52D-A)-Fab'-40kPEG) pripremljen u Primeru 19. U tom trenutku, test je izveden pri finalnoj NGF koncentraciji od 50 ng/ml. Kao rezultat, IC50 za 1-15(N52D-A)-Fab'-5kPEG, 1-15(N52D-A)-Fab'-10kPEG, i 1-15(N52D-A)-Fab'40kPEG bili su 0.030 µg/ml, 0.028 µg/ml, i 0.023 µg/ml, respektivno. Iz ovih rezultata, podrazumeva se da veličina PEG-a koja se kreće od 5 kDa do 40 kDa ne utiče na neutrališuću aktivnost Fab' fragmenata.

(Primer 22: Evaluacija PK kod miševa za pegilovan 1-15(N52D-A)-Fab' raznih PEG veličina)

[0107] Evaluacija PK kod miševa izvedena za razne vrste pegilovanog 1-15(N52D-A)-Fab'. Specifično, 0.3 mg/kg raznih vrsta pegilovanih 1-15(N52D-A)-Fab' dato je intravenozno, a krv je sakupljena 1, 4, 8,12, 24, 48, 72, 96, i 168 sati nakon davanja. Količina testiranog antitela u dobijenoj krvi izmerena je upotrebom senvič ELISA. Specifičnotestirano antitelo dodatu je u MSD ploču (Meso Scale Discovery) čiji NGFje bio imobilisan. Antitelo vezano za ploču prepoznato je biotinom obeleženim anti-humanim Kapa antitelom, koje je zatim detektovano SULFO-TAG-obeleženim streptavidinom. Koncentracija antitela u krvi izračunata je kreiranjem kalibracione krive upotrebom respektivnih standarda. Iz izračunate koncentracije antitela u krvi, izračunat je poluživot antitela u krvi (T1/2: sat). Kao rezultat, T1/2 za 1-15(N52D-A)-Fab'-5kPEG, 1-15(N52D-A)-Fab'-10kPEG, i 1-15(N52D-A)-Fab'-40kPEG iznosili su 13.8±2.2 sati, 17.7±0.4 sati, i 39.2±3.7 sati, respektivno.

(Primer 23: Analgetički efekat test primenom pacovskog modela zasecanja tabana)

[0108] Upotrebom modela bola kod pacova nakon zasecanja tabana (Brennan et al, Current Protocols in Pharmacology 2004; 5.34.1-5.34.8) što se smatra da reflektuje postoperativni bol u kliničkoj praksi, procenjen je analgetički efekat 1-15(N52D-A)-Fab'-5kPEG i 1-15(N52D-A)-Fab'-10kPEG na postoperativni bol.

[0109] Specifično, 8 pacova određeno je u svakoj grupi, a 1-15(N52D-A)-Fab'-5kPEG ili -10kPEG intravenozno je dat pacovima (0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, i 1 mg/kg, doza je iznosila 1 mL/kg). Posle toga, u tabanu desnog zadnjeg uda, izveden je ravan rez koji se pružao 10 mm ka prstu od početne tačke na položaju udaljenom 5 mm od kraja pete, a odmah zatim je zašiven najlonskim koncem na dva mesta, čime se indukuje bol. Pragovi bola oko operacionog mesta mereni su nakon 5 sati i prvi, drugi, treći, četvrti, i peti dan nakon indukovanja bola. Za to merenje, korišćen je dinamički plantarni anesteziometar proizveden od strane Ugo Basile za merenje pritiska pri kojem su pacovi pokazali izbegavanje kada je pritisak nanet na taban. Kao komparativna kontrola, korišćeno je antitelo iz stanja tehnike tanezumab.

[0110] Kao rezultat, dok je intravenozno davanje tanezumaba rezultiralo kao analgetički efekat ED50 = 0.26 mg/kg postoperativnog dana 1, i 1-15(N52D-A)-Fab'-5kPEG i -10kPEG pokazali su analgetički efekat od ED50 = 0.15 mg/kg koji je bio približno dva puta efikasniji. Pored toga, značajan analgetički efekat 1-15(N52D-A)-Fab'-5kPEG i -10kPEG i dalje je primećen dana 3 i 4, respektivno.

1

(Primer 24: Evaluacija stabilnosti agregacije)

[0111] 1-15(N52D-A)-Fab'-40kPEG rastvoren je pri 1 mg/ml i 10 mg/ml pod uslovima pH 5, pH 6, pH 7.4, i pH 9. Svaki od ovih rastvora smešten je pod uslove od 50°C kako bi se procenila stabilnost agregacije primećena nakon 2 nedelje. Kako bi se procenilo svojstvo agregacije, izvedena je ekskluziona hromatografija po veličini upotrebom Agilent 1100 proizvedenog od strane Agilent. Kao uslovi merenja, korišćeni su 0.1 M natrijum fosfat koji sadrži 0.2 M arginin (pH 6.8) kao pufer mobilne faze, i TSK gel Super Sw3000 (TOSOH, 2.0 mm ID×300 mm) kao kolona. Talasna dužina detekcije iznosila je 280 nm. U testu pri 1 mg/ml, tanezumab je upotrebljen kao komparativno antitelo, a rezultati su prikazani u Tabeli 3. U testu pri 10 mg/ml, tanezumab i REGN 475 upotrebljeni su kao komarativna antitela, a rezultati su prikazani u Tabeli 4.

[0112] Kao rezultat, za tanezumab i REGN 475, primećeno je primetno povećanje u količini proizvedenih agregata nakon dve nedelje. Nasuprot tome, za 1-15(N52D-A)-Fab'-40kPEG, agregati skoro da nisu detektovani. Ovaj rezultat nagoveštava da je pegilovan 1-15(N52D-A)-Fab' veoma moguće podoban za lek sa odličnom stabilnošću tokom skladištenja.

[Tabela 3]

2

[Tabela 4]

[Industrijska primenjivost]

[0113] Antitelo protiv humanog NGF, određenije, Fab’ fragment antitela protiv humanog NGF koristan je za prevenciju ili lečenje raznih bolesti kod kojih je humani NGF uključen u formiranje patološkog stanja.

LISTA SEKVENCI

[0114]

4

4

4

�

Claims (6)

Patentni zahtevi

1. Fab’ fragment antitela protiv humanog NGF, koji obuhvata:

fragment teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane od SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:14, ili SEQ ID NO:16; i

laki lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane od SEQ ID NO:12, pri čemu je Fab' fragment konjugovan sa polietilen glikolom.

2. Fab’ fragment prema zahtevu 1, koji obuhvata:

fragment teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane od SEQ ID NO:14; i laki lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane od SEQ ID NO:12, pri čemu je Fab' fragment konjugovan sa polietilen glikolom.

3. Postupak za proizvodnju Fab’ fragmenta antitela protiv humanog NGF, koji obuhvata eksprimiranje Fab’ fragmenta antitela protiv humanog NGF uzgajanjem ćelije domaćina odabrane iz grupe koja se sastoji od sledećih (a) i (b),

(a) ćelija domaćin transformisana ekspresionim vektorom koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira fragment teškog lanca Fab’ fragmenta prema zahtevu 1 i polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira laki lanac Fab’ fragmenta prema zahtevu 1; i

(b) ćelija domaćin transformisana ekspresionim vektorom koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira fragment teškog lanca Fab’ fragmenta prema zahtevu 1 i ekspresionim vektorom koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira laki lanac Fab’ fragmenta prema zahtevu 1, i

konjugovanje Fab’ fragmenta antitela protiv humanog NGF sa polietilen glikolom.

4. Postupak za proizvodnju Fab’ fragmenta antitela protiv humanog NGF, koji obuhvata eksprimiranje Fab’ fragmenta antitela protiv humanog NGF uzgajanjem ćelije domaćina odabrane iz grupe koja se sastoji od sledećih (a) i (b),

(a) ćelija domaćin transformisana ekspresionim vektorom koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira fragment teškog lanca Fab’ fragmenta prema zahtevu 2 i polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira laki lanac Fab’ fragmenta prema zahtevu 2; i

(b) ćelija domaćin transformisana ekspresionim vektorom koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira fragment teškog lanca Fab’ fragmenta prema zahtevu 2 i ekspresionim vektorom

4

koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira laki lanac Fab’ fragmenta prema zahtevu 2, i

konjugovanje Fab’ fragmenta antitela protiv humanog NGF sa polietilen glikolom.

5. Fab’ fragment antitela protiv humanog NGF proizveden postupkom prema zahtevu 3.

6. Fab’ fragment antitela protiv humanog NGF proizveden postupkom prema zahtevu 4.

4