RS56915B1 - Materijali i postupci za modulaciju zarastanja tetiva - Google Patents

Materijali i postupci za modulaciju zarastanja tetiva

Info

Publication number
RS56915B1
RS56915B1 RS20180202A RSP20180202A RS56915B1 RS 56915 B1 RS56915 B1 RS 56915B1 RS 20180202 A RS20180202 A RS 20180202A RS P20180202 A RSP20180202 A RS P20180202A RS 56915 B1 RS56915 B1 RS 56915B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
mir
tendon
identity
therapeutic agent
sequence
Prior art date
Application number
RS20180202A
Other languages
English (en)
Inventor
Derek Stewart Gilchrist
Neal Lindsay Millar
Original Assignee
Univ Glasgow Court
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=50238941&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS56915(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Univ Glasgow Court filed Critical Univ Glasgow Court
Publication of RS56915B1 publication Critical patent/RS56915B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/712—Nucleic acids or oligonucleotides having modified sugars, i.e. other than ribose or 2'-deoxyribose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5176—Compounds of unknown constitution, e.g. material from plants or animals
    • A61K9/5184—Virus capsids or envelopes enclosing drugs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/333—Modified A
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/334—Modified C
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/335—Modified T or U
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/336—Modified G
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Description

Opis
Oblast pronalaska
[0001] Pronalazak se odnosi na primenu mikroRNK 29 i njenih prekursora i mimika za tretman povreda tetiva i modulaciju biomehaničkih svojstava tetive.
Stanje tehnike
[0002] Oporavak i upalu disregulisanog tkiva karakterišu mnoge uobičajene mišićno-skeletne patologije, uključujući poremećaje tetiva. Tendinopatije predstavljaju zajednički pad mišićno-skeletne konsultacije u primarnoj nezi i čine 30-50% svih sportskih povreda. Tendinopatija se odlikuje promenjenom proizvodnjom kolagena iz podtipa 1 do 3, što dovodi do smanjenja čvrstoće tetive, što može predstavljati prethoditi kliničko cepanje tetiva.
[0003] Upalni medijatori se smatraju presudnim za početak i produžavanje tendinopatije<5>. Eksprimiranje različitih citokina potvrđeno je u upalnim ćelijskim linijama i tenocitima što sugeriše da i infiltraciona i rezidentna populacija učestvuju u patologiji. Mehaničke osobine zarastanja tetiva kod miševa deficijentnih sa IL-6 su inferiorne u poređenju sa normalnim kontrolama<10>, dok blokada TNF poboljšava jačinu lečenja tetive-kosti kod modela povrede tetiva pacova. Iako ovi podaci povećavaju intrigantnu mogućnost da ciljanje citokina može ponuditi terapeutsku korisnost, trenutno ne postoji dovoljno mehaničkog razumevanje biologije citokina/matrica u bolestima tetiva kako bi se ova mogućnost manifestovala u praksi.
[0004] Interleukin 33 je član porodice citokina IL-1, koja za zauzvrat igra glavnu ulogu u urođenom imunom odgovoru. IL-33 se eksprimira u endotelnim ćelijama i fibroblastima, zajedno sa hromatinom u jezgru. IL-33 se oslobađa nakon ćelijskog oštećenja i biomehaničkog preopterećenja, pa se tako smatra „alarminom“. Impliciran je u raznim inflamatornim patologijama, uključujući plućne, kožne bolesti i bolesti zglobova. IL-33 funkcioniše preko svog kognatnog receptora ST2 koji postoji u membranskim vezama (mST2) ili rastvorljivom obliku (sST2) i signalima putem kanonske IL-1R kaskade signalizacije. Citokini su često regulisani na post-transkripcijskom nivou pomoću mikroRNK (miRNK) koja kontroliše eksprimiranje gena translacionom supresijom i destabilizacijom ciljanih mRNK<17>. mikroRNK mreže se pojavljuju kao ključni homeostatski regulatori oporavka tkiva sa osnovnim ulogama predloženim u biologiji matičnih ćelija, upali, hipoksiji i angiogenezi.
[0005] mikroRNK (miR) su male ne-kodirajuće RNK koje imaju značajan uticaj na ćelijsku funkciju kroz represiju translacije (bilo putem inhibicije translacije ili indukcije degradacije mRNK). MikroRNK potiču od primarnih RNK transkripta (pri-miRNK) sintetisanih sa RNK pol II, koji mogu biti nekoliko hiljada nukleotida u dužini. Jedan transkript pri-miRNK može dovesti do više aktivnih miRNK.
[0006] U jezgru, enzim RNKze tipa III Drosha obrađuje transkript pri-miRNK u miRNK prekursora (pre-miRNK) koja se sastoji od strukture stem-petlje ili šupljine, normalno oko 70 do 100 nukleotida dužine. PremiRNK se onda transportuje do citoplazme, gde ga dalje obrađuje RNaza Dicer, uklanjajući petlju i dajući zrelo dvolančani miRNK molekul, koji ima aktivan „vodič“ lanac (obično 15 do 25 nukleotida dužine) hibridiziran do potpuno ili delimično komplementarnog „putnik“ lanca.
[0007] Zrela dvolančana miRNK se zatim inkorporira u RNK-indukovan kompleks utišavanja, gde se vodič lanac hibridizuje na vezujuće mesto u ciljanoj mRNI.
[0008] Vodič lanac ne mora biti potpuno komplementaran sa ciljanim mesom vezivanja. Međutim, regija vodič lanca koja je označena za sekvencu „semena“ obično je u potpunosti komplementarna sa odgovarajućom sekvencom ciljanog mesta vezivanja. semenska sekvenca je tipično od 2 do 8 nukleotida dugačka i nalazi se na ili blizu (unutar jednog ili dva nukleotida) 5' kraja vodiča.
Smatra se da pojedinačni neupareni vodič lanci mogu takođe biti uključeni u RISC. Smatra se, takođe, da modifikacije putnik lanca (npr. za šećere, baze ili strukturu kičme) koje ometaju inkorporiranje putnik lanca u RISC mogu takođe povećati efikasnost inhibicije mete sa dvolančanom miRNK. Ogawa et al (2010) objavljuje da je miR-29b supresor kolagena tipa I na nivou mRNK i proteina putem direktnog vezivanja za CollA13'UTR, i na taj način je direktno uključen u regulaciju kolagena tipa I u hepatičkim stelatnim ćelijama. Maurer et al (2010) objavljuju da prekomerno eksprimiranje miR-29a direktno dovodi do povećanja nivoa mesindžer RNK i proteina za kolagene tipa I i tipa III u sistemskoj sklerozi. Kwiecinski et al (2011) objavljuju da se 3'-UTR kolagen-1 i -4 podtipova vezuje za miR-29 i na taj način prekomerno eksprimiranje miR-29a/b kod hepatičnih stelatnih ćelija dovodi do smanjenja kolagen-I i -IV sinteze. Yong et al (2013) se odnose na ulogu članova porodice miR-29 u fibrozi jetre, bubrežnoj fibrozi, plućnoj fibrozi i srčanoj fibrozi, i diskutuje o njegovom potencijalu kao terapeutskom pristupu za lečenje fibrozne bolesti. Čini se da su članovi porodice miR-29 česti regulator tkivne fibroze jer mogu podrivati sintezu kolagena putem direktnog vezivanja na 3'UTR u fibroblastima. WO2010/026213 se odnosi na postupke lečenja skleroderme koja uključuje povećanje količine miR-29. WO2010/148050 opisuje postupke modulacije funkcije i/ili eksprimiranja polinukleotida kolagenih gena u ćelijama pacijenata, ali se ne odnosi na miR-29. WO2013/142336 je usmeren na „kombinovanu terapiju za poboljšanje lečenja zglobova, tetiva i ligamenta“ promovisanjem mobilizacije vaskularnih progenitorskih ćelija izvedeni od endogene koštane srži (BM), senzibilizacije takvih ćelija i hemotakse na mestu povreda ili bolesti. Stoga nema mnogo reči o miR-29.
Sažetak pronalaska
[0009] Lečenje povrede tetive je često suboptimalno, barem delom zbog promene sinteze kolagena od tipa 1 do tipa 3 tokom tendinopatije. Kolagen tipa 3 mehanički je inferioran u odnosu na kolagen tipa 1, što rezultuje tetivom sa manjom čvrstoćom zatezanja. Biomehaničke karakteristike tetive bi se poboljšale ako bi se ravnoteža između podtipova kolagena mogla modulisati nazad prema kolagenu tipa 1. miR-29 je prethodno identifikovan kao regulator sinteze kolagena u različitim biološkim procesima, kao što su fibroza i skleroderma. Međutim, pronalazači su pronašli, po prvi put, da tenociti sadrže alternativno spojene oblike transkripata kolagena tipa 1. Pretežni transkripti za tip 1a1 i 1a2 kolagena imaju kratke 3' neprevedene regione (UTR) koji ne sadrže mesta vezivanja miR-29, dok je prisutan dominantni transkript kolagena tipa 3 dugačak miR-29 osetljiv oblik. Kao rezultat toga, sinteza kolagena tipa 1 u tenocitima u mnogo manjoj meri utiče miR-29 nego sinteza kolagena tipa 3. Iznenađujuće, onda, regulacijom na gore miR-29 aktivnosti, moguće je modulisati ravnotežu između podtipova kolagena u korist kolagena tipa 1, čime se ublažava ili ukida smanjenje čvrstoće zatezanja tetive i modulacija njenih biomehaničkih svojstava, kao što su snaga krajnjeg pucanja.
[0010] U najširem obliku, pronalazak se odnosi na upotrebu mikroRNK 29 (miR-29) i prekursora, imitacija i agonista za modulaciju lečenja tetiva i biomehanička svojstva tetive.
[0011] Prema tome, pronalazak pruža postupak za modulaciju lečenja tetiva, a postupak sadrži povećanje eksprimiranja ili aktivnosti miR-29 u ćeliji tetiva. Ovo se može postići direktnom isporukom miR-29 u ciljanu ćeliju, isporučivanje miR-29 mimika, ili isporukom molekula prekursora koji se obrađuje unutar ciljane ćelije na aktivni miR-29 ili miR-29 mimik.
[0012] Postupak može obuhvatiti korak isporučivanja miR-29, njegovog mimika, ili prekursora bilo kog od njih u ćeliju tetive.
[0013] MiR-29, mimik ili prekursor mogu se isporučiti u saradnji sa (na primer, kompleksirani ili inkapsulirani sa) odgovarajućim nosač molekulom, kao što su farmaceutski prihvatljiv lipid ili polimer.
[0014] Nosač molekul može dalje da sadrži agens za ciljanje sposoban za vezivanje na površinu ciljane ćelije.
[0015] Postupak može obuhvatiti korak isporučivanja nukleinske kiseline koja kodira miR-29, njegov mimik, ili prekursor bilo kog od njih, u ćeliju tetive, tako da se pomenuti miR-29, mimik ili prekursor eksprimiraju u ćeliji tetive.
[0016] Alternativno, postupak može obuhvatiti korak isporuke agonista sposobnog za regulisanje na gore endogene aktivnosti miR-29 u ćeliji tetive.
[0017] Bilo koji od opisanih postupaka može se izvesti in vitro, in vivo ili ex vivo. Najčešće se postupci izvode in vivo davanjem odgovarajućeg sastavi pacijentu.
[0018] Pronalazak takođe pruža miR-29, njegov mimik ili prekursor bilo kog od njih, za upotrebu u postupku modulacije zarastanja tetive.
[0019] Pronalazak takođe pruža upotrebu miR-29, njegov mimik ili prekursor bilo kog od njih, u proizvodnji medikamenta za modulaciju lečenja tetiva.
[0020] Pronalazak takođe pruža nukleinsku kiselinu koja kodira miR-29, njegov mimik ili prekursor bilo kog od njih, za upotrebu u postupku modulacije zarastanja tetive.
[0021] Pronalazak takođe pruža upotrebu nukleinske kiseline koja kodira miR-29, njegov mimik ili prekursor bilo kog od njih u proizvodnji medikamenta za modulaciju lečenja tetiva.
[0022] U bilo kom aspektu, miR-29 može biti miR-29a, miR-29b (b1 i/ili b2), miR-29c ili bilo koja njihova kombinacija. Može biti poželjno da miR-29 bude miR-29a ili kombinacija uključujući miR-29a.
[0023] Nukleinska kiselina koja kodira miR-96, mimik ili prekursor, može se isporučiti kao gola nukleinska kiselina. Alternativno se može isporučiti zajedno sa (npr. kompleksiranim ili inkapsuliranim) odgovarajućim molekulom nosačem, kao što je farmaceutski prihvatljiv lipid ili polimer ili njihova kombinacija. U svakom slučaju, nukleinska kiselina je tipično DNK.
[0024] Molekul nosač može dalje da sadrži agens za ciljanje sposoban za vezivanje na površinu ciljane ćelije.
[0025] Alternativno, nukleinska kiselina koja kodira miR-96, mimik ili prekursor, može se isporučiti putem virusnog vektora.
[0026] Moguće je primeniti bilo koji pogodan tip virusnog vektora, uključujući adenovirus, adenopridruženi virus (AAV), retrovirus (posebno lentivirus) i herpesvirus vektore. Adenovirus i lentivirus mogu biti posebno poželjni jer imaju sposobnost da postignu eksprimiranje gena koji se dostavljaju u ćelijama koje se ne aktivno dele.
miR-29 i njegovi prekursori
[0027] Tri glavna izoforma kod ljudi su miR-29a, miR-29bl, miR-29b2 i miR-29c.
[0028 Izraz „miR-29“ se koristi u ovoj specifikaciji da se odnosi na RNK oligonukleotid koji se sastoji od zrele sekvence „vodič lanac“ bilo kog od ova tri izoforma.
[0029] Zreli ljudski miR-29a („hsa-miR-29a“) ima sekvencu:
UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA.
[0030] Zreli miR-29b1 i miR-29b2 („hsa-miR-29b1“ i „hsa-miR-29b2“) su identični i imaju sekvencu:
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU.
[0031] Zreli ljudski miR-29c („hsa-miR-29c“) ima sekvencu:
UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA.
[0032] Konvencionalno je u imenovanju mikro-RNK da se uključi prefiks sa tri slova označavajući vrstu iz koje potiče mikro-RNK. Tako „hsa“ označava Homo sapiens. Ove zrele miR29 sekvence pronađene su identične kod većine sisara, uključujući i konja.
[0033] Sva četiri zrela vodič lanca imaju istu „semensku“ regiju, koji se vezuje za ciljanu mRNK i ima sekvencu:
AGCACCA.
[0034] Vodič lanac miR-29 oligonukleotid može biti jednolančani, ili može biti hibridizovan sa drugim RNK oligonukleotidom, koji se naziva „putnik lanac“. Vodič i putnik lanci protežu se anti-paralelno jedna u odnosu drugi u hibridizovanom kompleksu, koji se može nazvati „dvolančani miR-29“. (Vodič lanac, kada je prisutan u izolaciji, može se nazvati „jednolančani miR-29“.)
[0035] Putnik lanac i vodič lanac mogu sadržati niz pogrešnih uklapanja što rezultuje time da svi nukleotidi u jednom ili oba lanca ne hibridizuju do komplementarnih nukleotida u drugom lancu. Prema tome, dvostruki miR-96 može sadržati jedno ili više ispupčenje (ispupčenje je neupareni nukleotid ili mnoštvo uzastopnih neuparenih nukleotida, samo u jednom lancu) ili unutrašnjih petlji (suprotno neuparenim nukleotidima u oba lanca). Jedan ili više nukleotida na terminusima takođe mogu biti neupareni.
[0036] Putnik lanac može biti 100% komplementarn serijskoj sekvenci vodič lanca.
[0037] Prirodni ljudski putnik lanci imaju niz:
ACUGAUUUCUUUUGGUGUCAG (miR29a) GCUGGUUUCAUAUGGUGGUUUAGA (miR-29b1);
CUGGUUUCACAUGGUGGCUUAG (miR-29b2); i UGACCGAUUUCUCCUGGUGUUC (miR-29c).
[0038] Jedna ili obe ćelije dvolančanog miR-29 mogu sadržati 3' višak, npr. od 1, 2 ili 3 nukleotida. To znači da se jedan ili dva nukleotida na 3' terminusu lanca protežu preko najviše 5' nukleotida komplementarnog lanca (uključujući bilo koje neprilagođene terminalne nukleotide) i time nemaju odgovarajuće nukleotide u komplementarnom lancu. Na primer, oba lanca mogu sadržati 3' višak od 1, 2 ili 3 nukleotida. Alternativno, kompleks se može završiti na jednom ili oba kraja. U nekim otelotvorenjima, putnik lanac je u istoj dužini kao vodič lanac ili se razlikuje u dužini, npr. do pet nukleotida ili čak više, u zavisnosti od stepena neusklađenosti između dva lanca i dužine bilo kog 3' viška.
[0039] Prekursori miR-29 uključuju pre-mir-29 i pri-mir-29 bilo kom od tri izoforma, kao i fragmente i njihove varijante koji se mogu preraditi u zreo miR-29 (bilo jedno ili dvolančani) .
[0040] Izraz „pre-mir-29“ se koristi da se odnosi na RNK oligonukleotid koji se sastoji od bilo koje sisarske sekvence previr-29 pune dužine, ili njegov fragment ili varijantu koja sadrži zrelu miR-29 vodič sekvencu povezanu sa sekvencom petlje u odgovarajuću putnik sekvencu koja je u potpunosti ili delimično komplementarna vodič sekvenci i gde je oligonukleotid sposoban da formira strukturu stempetlje (ili „ukosnice“) u kojoj se vodič sekvenca i putnik sekvenca hibridizuju jedna sa drugom.
[0041] Pre-mir-29 je sposoban da deluje kao supstrat za dvolančanu RNK-specifičnu ribonukleazu (RNKza enzim III-tipa), čime se obrađuje do zrelog dvolančanog miR-29.
[0042] Sedeće sisarske sekvence pre-mir-29 pune dužine uključuju ljudske sekvence:
AUGACUGAUUUCUUUUGGUGUUCAGAGUCAAUAUAAUUUUCUAGCACCAUCUGAAAU CGGUUAU (hsa-premir-29a: alternativno (i));
Odgovarajuće sekvence zrelog vodič lanca su podvučene.
[0043] Pre-mir-29 može posedovati jednu ili više modifikacija izvan zrele sekvence, u poređenju sa prikazanim sekvencama.
[0044] Sekvenca uzvodno (5' ) od zrele sekvence može imati, na primer, barem 50% identičnosti, barem 55% identičnosti, barem 60% identičnosti, barem 65% identičnosti, barem 70% identičnosti, barem 75% identičnosti, barem 80% identičnosti, barem 85% identičnosti, barem 90% identičnosti, barem 91% identičnosti, barem 92% identičnosti, barem 93% identičnosti, barem 94% identičnosti, barem 95% identičnosti, barem 96% identičnosti, barem 97% identičnosti, barem 98% identičnosti ili barem 99% identičnosti sa odgovarajućim ljudskim sekvencom.
[0045] Na primer, sekvenca uzvodno (5' ) zrele sekvence miR-29a može se razlikovati po do 20 nukleotida iz odgovarajuće 5' ljudske sekvence kada je to optimalno poravnata sa njom , npr. sa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 nukleotida.
[0046] Sekvenca uzvodno od miR-29b1 ili b2 zrele sekvence može se razlikovati po do 25 nukleotida iz odgovarajuće 5' ljudske sekvence kada je to optimalno poravnata sa njom, npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ili 25 nukleotida.
[0047] Sekvenca uzvodno od miR-29c zrele sekvence može se razlikovati po do 25 nukleotida iz odgovarajuće 5' ljudske sekvence kada je to optimalno poravnata sa njom, npr. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ili 25 nukleotida.
[0048] Sekvenca nizvodno (3' ) od zrele sekvence može imati, na primer, barem 50% identičnosti, barem 55% identičnosti, barem 60% identičnosti, barem 65% identičnosti, barem 70% identičnosti, barem 75% identičnosti, barem 80% identičnosti, barem 85% identičnosti, barem 90% identičnosti, barem 91% identičnosti, barem 92% identičnosti, barem 93% identičnosti, barem 94% identičnosti, barem 95% identičnosti, barem 96% identičnosti, barem 97% identičnosti, barem 98% identičnosti ili barem 99% identičnosti sa odgovarajućim ljudskim sekvencom.
[0049] Sekvenca nizvodno (3' ) od zrele sekvence miR-29a može biti ista kao 3' ljudska sekvenca, ili može biti različita. Može biti različit nukleotid od onog koji se nalazi u kraćoj od dve sekvence prikazane iznad, tj. alternativa (i). Može biti duža od sekvence prikazane u alternativi (i). Na primer, može se razlikovati po do 6 nukleotida od odgovarajuće 3' sekvence alternative (ii) prikazane gore.
[0050] Sekvenca nizvodno (3' ) od miR-29b1 ili b2 zrele sekvence mogu se razlikovati po do 4 nukleotida od odgovarajuće 3' ljudske sekvence kada je to optimalno poravnata sa njom, npr. sa 1, 2, 3 ili 4 nukleotida.
[0051] Sekvenca nizvodno (3' ) zrele sekvence miR-29c može se razlikovati do 7 nukleotida iz odgovarajuće 3' ljudske sekvence kada je to optimalno poravnata sa njom, npr. sa 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7 nukleotida.
[0052] Izraz „pri-mir-29“ se koristi da se odnosi na RNK oligonukleotid koji se sastoji od bilo koje sisarske sekvence primir-29 pune dužine, ili njenog fragmenta ili varijante koja sadrži sekvencu premir-29 i sposobna je da se obradi u sekvencu pre-mir-29 pomoću dvolančane RNK specifične ribonukleaze (RNKza enzima tipa III) Drosha.
[0053] Pojedinačni transkript može biti sposoban da se obradi u dva ili više molekula mir-29, njihove mimike ili prekursore.
[0054] hsa-mir29a i mir29b1 su kodirani u poslednjem eksonu transkripta koji sadrži GenBank Accession Number EU154353 (EU154353.1 GI: 161324377). Regija koje kodira mir29a i mir29b1, plus krilna sekvenca, prikazani su ispod. (Hsa-mir29a je prikazan podebljanim velikim slovima uz podvučenu zrelu miR-29a sekvencu. Hsa-mir29b je prikazan velikim slovima, a miR-29b je podvučen.)
hsa-pri-miR29b2 i hsa-pri-mir29c su kodirani u jednom transkriptu koji je prikazan ispod. hsa-mir29b2 je prikazan velikim slovima, dok je zreli hsa-miR-29b2 podvučen. hsa-mir29c je prikazan podebljanim velikim slovima, dok je zreli hsa-miR-29c podvučen.
[0055] Prema tome, pri-mir-29 može sadržati više od jedne zrele miR-29 ili mimik sekvence. Na primer, on može sadržavati miR-29a i miR-29b1 ili njihove mimike, ili miR-29b2 i miR-29c ili njihove mimike.
[0056] Alternativno, pri-mir-29 može sadržati samo jednu zrelu miR-29 sekvencu svojih mimika.
[0057] pri-mir-29 može da ima barem 50% identičnosti, barem 55% identičnosti, barem 60% identičnosti, barem 65% identičnosti, barem 70% identičnosti, barem 75% identičnosti, barem 80% identičnosti, barem 85% identičnosti, barem 90% identičnosti, barem 91% identičnosti, barem 92% identičnosti, barem 93% identičnosti, barem 94% identičnosti, barem 95% identičnosti, barem 96% identičnosti, barem 97% identičnosti, barem 98% identičnosti, ili barem 99% identičnosti bilo sa primir-29 sekvencama prikazanim iznad, ili sa fragmentom jedne od tih sekvenci koji sadrži jednu od zrelih miR-29 sekvenci.
[0058] Pri-mir-29 može posedovati jednu ili više modifikacija izvan zrele sekvence ili izvan matične premir-29 sekvence, u poređenju sa prikazanim sekvencama.
[0059] Na primer, sekvenca uzvodno (5’) od zrele sekvence može da ima, na primer, barem 50% identičnosti, barem 55% identičnosti, barem 60% identičnosti, barem 65% identičnosti, barem 70% identičnosti, barem 75% identičnosti, barem 80% identičnosti, barem 85% identičnosti, barem 90% identičnosti, barem 91% identičnosti, barem 92% identičnosti, barem 93% identičnosti, barem 94% identičnosti, barem 95% identičnosti, barem 96% identičnosti, barem 97% identičnosti, barem 98% identičnosti, ili barem 99% identičnosti sa odgovarajućom ljudskom sekvencom.
[0060] Sekvenca uzvodno (5’) od pre-mir-29 sekvence može imati, na primer, barem 50% identičnosti, barem 55% identičnosti, barem 60% identičnosti, barem 65% identičnosti, barem 70% identičnosti, barem 75% identičnosti, barem 80% identičnosti, barem 85% identičnosti, barem 90% identičnosti, barem 91% identičnosti, barem 92% identičnosti, barem 93% identičnosti, barem 94% identičnosti, barem 95% identičnosti, barem 96% identičnosti, barem 97% identičnosti, barem 98% identičnosti, ili barem 99% identičnosti sa odgovarajućom ljudskom sekvencom.
[0061] Sekvenca nizvodno od zrele sekvence može da ima, na primer, barem 50% identičnosti, barem 55% identičnosti, barem 60% identičnosti, barem 65% identičnosti, barem 70% identičnosti, barem 75% identičnosti, barem 80% identičnosti, barem 85% identičnosti, barem 90% identičnosti, barem 91% identičnosti, barem 92% identičnosti, barem 93% identičnosti, barem 94% identičnosti, barem 95% identičnosti, barem 96% identičnosti, barem 97% identičnosti, barem 98% identičnosti, ili barem 99% identičnosti sa odgovarajućom ljudskom sekvencom.
[0062] Sekvenca nizvodno (3’) od matične pre-mir-29 sekvence može imati, na primer, barem 50% identičnosti, barem 55% identičnosti, barem 60% identičnosti, barem 65% identičnosti, barem 70% identičnosti, barem 75% identičnosti, barem 80% identičnosti, barem 85% identičnosti, barem 90% identičnosti, barem 91% identičnosti, barem 92% identičnosti, barem 93% identičnosti, barem 94% identičnosti, barem 95% identičnosti, barem 96% identičnosti, barem 97% identičnosti, barem 98% identičnosti, ili barem 99% identičnosti sa odgovarajućom ljudskom sekvencom.
[0063] Prekursor miR-29 može biti bilo koje pogodne dužina, sve dok se može obraditi za zrelim miR-29 (bilo jedno ili dvolančanim). Prema tome, miR-29a prekursor dugačak najmanje 23 nukleotida, miR29b prekursor je dugačak najmanje 24 nukleotida, i miR-29c prekursor je dugačak najmanje 25 nukleotida.
[0064] miR29 prekursor može biti dugačak barem 25, barem 30, barem 35, barem 40, barem 45, barem 50, barem 55, barem 60, barem 65, barem 70, barem 75, barem 80, barem 85, barem 90, barem 95, barem 100, barem 110, barem 120, barem 130, barem 140, barem 150, barem 200, barem 250, barem 300, barem 350, barem 400, barem 450, barem 500, barem 1000, barem 1500 ili barem 2000 nukleotida.
[0065] Alternativno, prekursor može biti dugačak najviše 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 1000, 1500, 2000 ili 2500 nukleotida, iako su duži prekursor transkripti mogući.
[0066] Treba napomenuti da izraz „oligonukleotid“ nije namenjen da implicira bilo koju određenu dužinu i jednostavno se koristi da se odnosi na bilo koji pojedinačni neprekidni lanac povezanih nukleotida.
MiR-29 mimci i njihovi prekursori
[0067] MiR-29 mimik je oligonukleotid koji ima jednu ili više modifikacija u strukturi ili sekvenci u poređenju sa prirodnim miR-29, ali zadržava sposobnost hibridizacije do mesta vezivanja miR-29 u mRNK regulisanoj sa miR-29, i da inhibiraju translaciju ili promoviše degradaciju takve mRNK, npr da inhibira proizvodnju proteina kodiranog sa tom mRNK. mRNK regulisani miR-29 uključuju kolagene tipa 3 (Col3a1).
[0068] Primeri mesta vezivanja miR-29 uključuju:
CCAUUUUAUACCAAAGGUGCUAC (iz Col1a1 mRNK);
UGUUCAUAAUACAAAGGUGCUAA (iz Col1a2 mRNK); i UUCAAAUGUCUCAAUGGUGCUA (iz col3a1 mRNK).
[0069] MiR-29 mimik oligonukleotid je tipično 15-35 nukleotida dugačak, npr.15 do 30, 15 do 25, 18 do 25, 20 do 25, npr.20 do 23, npr.20, 21, 22 ili 23 nukleotida dugačak.
[0070] MiR-29 mimik se može razlikovati u baznoj sekvenci, nukleotidnoj strukturi i/ili vezi kičme u odnosu na jednu od matičnih miR-29 zrelih sekvenci.
[0071] MiR-29 mimik sadrži semensku sekvencu koja može biti identična sa matičnom semenskom sekvencom:
AGCACCA
ili se može razlikovati od matične semenske sekvence na ne više od tri položaja, npr. na ne više od dva položaja, npr. na ne više od jednog položaja. Poželjno je semenska sekvenca identična onoj koja je prikazana.
[0072] miR-29 mimik može obuhvatiti ili se sastojati od oligonukleotida koji ima zrelu matičnu miR-29 vodiča sekvencu, kao što su:
UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA (hsa-miR-29a);
UAGGACCAUUUGAAAUCAGUGUU (hsa-miR-29b1 i 2); ili UAGCACCAQUUGAAAUCGGUUA (hsa-miR-29c);
(gde je semenska sekvenca podvučena u svakom slučaju);
ili koji se razlikuje od zrele matične sekvence na:
(i) ne više od tri položaja unutar semenske sekvence; i
(ii) ne više od pet položaja izvan semenske sekvence.
[0073] Prema tome, semenska sekvenca mimika razlikuje se od matične semenske sekvence na ne više od tri položaja, npr. na ne više od dva položaja, npr. na ne više od jednog položaja. Poželjno, semenska sekvenca je identična sa matičnom sekvencom semena.
[0074] Dodatno ili alternativno, mimik se razlikuje od matične sekvence van semenske sekvence na ne više od pet položaja, npr. na ne više od četiri položaja, ne više od tri položaja, ne više od dva položaja, npr. na ne više od jednog položaja.
[0075] MiR-29 mimik može biti hibridizovan u drugi oligonukleotid. Kao i kod matičnog miR-29, aktivni oligonukleotid se može nazvati „vodič lanac“ i pripadajući oligonukleotid kao „putnik lanac“. Hibridizovani kompleks se može nazvati dvolančanim miR-29 mimikom.
[0076] Sekvenca mimika putnik lanca može biti identična sekvenci matičnog putnik lanca ili se može razlikovati od matičnog putnike lanca na jednom ili više položaja. Na primer, sekvenca mimika putnik lanca se može razlikovati od one u matičnom putnik lanca na ne više od 10 položaja, ne više od 9 položaja, ne više od 8 položaja, ne više od 7 položaja, ne više od 6 položaja, ne više od 5 položaja, ne više od 4 položaja, ne više od 3 položaja, ne više od 2 položaja ili ne više od 1 položaja.
[0077] Jedan ili obe lanca dvolančanog miR-29 mimika mogu sadržati 3' višak od 1 ili 2 nukleotida. Na primer, oba lanca mogu sadržati 3' višak od 2 nukleotida. Alternativno, kompleks se može završiti na jednom ili oba kraja. U nekim otelotvorenjima, putnik lanac je iste dužine kao vodič lanac, ili se u dužini razlikuje za jedan ili dva nukleotida.
[0078] Prekursor miR-29 mimika je bilo koji molekul koji se može obraditi unutar ciljane ćelije do miR-29 mimika kao što je gore definisano, obično akcijom enzima Dicer ili sekvencijalnim dejstvom enzima Drosha i Dicer.
[0079] Prema tome, prekursor može imati dodatnu oligonukleotidnu sekvencu uzvodno (5' ) i/ili nizvodno (3') od mimik sekvence.
[0080] Prekursor može sadržati miR-29 mimik vodič sekvencu povezanu sekvencom petlje za odgovarajuću putnik sekvencu koja je u potpunosti ili delimično komplementarna vodič sekvenci, a pri čemu je oligonukleotid sposoban za formiranje strukture stem-petlje (ili „ukosnice“) u kojoj se sekvenca vodič i putnik sekvenca hibridizuju jedna sa drugom. Ovakav oligonukleotid se može smatrati kao premir-29 mimik i sposoban je da deluje kao supstrat za dvolančanu RNK-specifičnu ribonukleazu (RNKza enzim III-tipa) Dicer, pri čemu se obrađuje do dvolančanog miR- 29 mimika, koji sadrže odvojene vodič i putnik lance.
[0081] Sekvenca uzvodno (5’) od zrele sekvence može da ima, na primer, barem 50% identičnosti, barem 55% identičnosti, barem 60% identičnosti, barem 65% identičnosti, barem 70% identičnosti, barem 75% identičnosti, barem 80% identičnosti, barem 85% identičnosti, barem 90% identičnosti, barem 91% identičnosti, barem 92% identičnosti, barem 93% identičnosti, barem 94% identičnosti, barem 95% identičnosti, barem 96% identičnosti, barem 97% identičnosti, barem 98% identičnosti, ili barem 99% identičnosti sa odgovarajućom ljudskom sekvencom.
[0082] Sekvenca nizvodno (3’) od zrele sekvence može da ima, na primer, barem 50% identičnosti, barem 55% identičnosti, barem 60% identičnosti, barem 65% identičnosti, barem 70% identičnosti, barem 75% identičnosti, barem 80% identičnosti, barem 85% identičnosti, barem 90% identičnosti, barem 91% identičnosti, barem 92% identičnosti, barem 93% identičnosti, barem 94% identičnosti, barem 95% identičnosti, barem 96% identičnosti, barem 97% identičnosti, barem 98% identičnosti, ili barem 99% identičnosti sa odgovarajućom ljudskom sekvencom.
[0083] Alternativno, prekursor može biti pri-mir-29 mimik (tj. ima dodatnu oligonukleotidnu sekvencu uzvodno (5' ) i/ili nizvodno (3') od pre-mir-29 mimik sekvence) i biti sposoban da se obradi u pre-mir-29 mimik sekvencu pomoću dvolančane RNK-specifične ribonukleaze (RNKza enzim tipa III) Drosha.
[0084] Na primer, sekvenca uzvodno (5’) od zrele miR-29 mimik sekvence može imati, na primer, barem 50% identičnosti, barem 55% identičnosti, barem 60% identičnosti, barem 65% identičnosti, barem 70% identičnosti, barem 75% identičnosti, barem 80% identičnosti, barem 85% identičnosti, barem 90% identičnosti, barem 91% identičnosti, barem 92% identičnosti, barem 93% identičnosti, barem 94% identičnosti, barem 95% identičnosti, barem 96% identičnosti, barem 97% identičnosti, barem 98% identičnosti, ili barem 99% identičnosti sa odgovarajućom ljudskom sekvencom.
[0085] Sekvenca uzvodno (5’) od pre-mir-29 mimik sekvence može imati, na primer, barem 50% identičnosti, barem 55% identičnosti, barem 60% identičnosti, barem 65% identičnosti, barem 70% identičnosti, barem 75% identičnosti, barem 80% identičnosti, barem 85% identičnosti, barem 90% identičnosti, barem 91% identičnosti, barem 92% identičnosti, barem 93% identičnosti, barem 94% identičnosti, barem 95% identičnosti, barem 96% identičnosti, barem 97% identičnosti, barem 98% identičnosti, ili barem 99% identičnosti sa odgovarajućom ljudskom sekvencom.
[0086] Sekvenca nizvodno (3’) od zrele miR-29 mimik sekvence može imati, na primer, barem 50% identičnosti, barem 55% identičnosti, barem 60% identičnosti, barem 65% identičnosti, barem 70% identičnosti, barem 75% identičnosti, barem 80% identičnosti, barem 85% identičnosti, barem 90% identičnosti, barem 91% identičnosti, barem 92% identičnosti, barem 93% identičnosti, barem 94% identičnosti, barem 95% identičnosti, barem 96% identičnosti, barem 97% identičnosti, barem 98% identičnosti, ili barem 99% identičnosti sa odgovarajućom ljudskom sekvencom.
[0087] Sekvenca nizvodno (3’) od pre-mir-29 mimik sekvence može imati, na primer, barem 50% identičnosti, barem 55% identičnosti, barem 60% identičnosti, barem. 65% identičnosti, barem 70% identičnosti, barem 75% identičnosti, barem 80% identičnosti, barem. 85% identičnosti, barem 90% identičnosti, barem 91% identičnosti, barem 92% identičnosti, barem 93% identičnosti, barem 94% identičnosti, barem 95% identičnosti, barem 96% identičnosti, barem 97% identičnosti, barem 98% identičnosti, ili barem 99% identičnosti sa odgovarajućom ljudskom sekvencom.
[0088] miR-29 mimik prekursor može biti bilo koje odgovarajuće dužine, sve dok se može obraditi do zrelog miR-29 mimika (bilo jedno ili dvolančanog). Stoga prekursor je barem 23 nukleotida dugačak, i može biti barem 25, barem 30, barem 35, barem 40, barem 45, barem 50, barem 55, barem 60, barem 65, barem 70, barem 75, barem 80, barem 85, barem 90, barem 95, barem 100, barem 110, barem 120, barem 130, barem 140, barem 150, barem 200, barem 250, barem 300, barem 350, barem 400, barem 450, barem 500, barem 1000, barem 1500 ili barem 2000 nukleotida dugačak.
[0089] Alternativno, prekursor može biti najviše 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 1000, 1500, 2000 ili 2500 nukleotida dugačak.
Strukturne modifikacije
[0099] Pored ili kao alternativa modifikacijama sekvenci koje smo razmatrali gore, miR-29 mimik ili njegov prekursor može sadržati jednu ili više strukturnih modifikacija u poređenju sa RNK oligonukleotidom.
[0091] MiR-29 mimik ili prekursor može sadržati jedan ili više nukleotida koji sadrže modifikovani šećerni ostatak, tj. šećerni ostatak koji nije ostatak ribeze. Primeri takvih modifikovanih šećernih ostataka uključuju 2'-O-metil-ribozu, 2'-O-metoksietil-ribozu, 2'-fluoro-ribozu i 4-tio-ribozu, kao i biciklične šećere. Biciklični šećeri obično sadrže furanozilni prsten sa 2',4' mostom (npr. metilenskim mostom) koji ograničava prsten do C3' endo konfiguracije. Nukleotid koji sadrži biciklični šećer se često naziva ostatak zaključane nukleinske kiseline („LNA“).
[0092] MiR-29 mimik ili prekursor može nezavisno da sadrži jedan ili više od bilo koje ili sve ove vrste modifikovanih šećera. Na primer, mimik može sadržavati jedan, dva, tri, četiri, pet, do 10, do 15, do 20 ili više modifikovanih šećernih ostataka. U nekim otelotvorenjima, svi nukleotidi sadrže modifikovan šećerni ostatak.
[0093] Dodatno ili alternativno, miR-29 mimik ili prekursor može sadržati jednu ili više modifikacija kičme, npr. modifikovanu internukleozidnu vezu.
[0094] Prema tome, jedan ili više susednih nukleotida mogu biti spojeni preko alternativnog veznog dela umesto fosfatnog dela.
[0095] Posebno je poželjno da modifikovana internukleozidna veza bude prisutna na jednom ili oba kraja miR-29 mimika, tj. između 5' terminala nukleotida i susednog nukleotida i/ili između 3' terminala nukleotida i susednog nukleotid.
[0096] Delovi pogodni za upotrebu kao internukleozidne veze uključuju fosforotioat, morfolino i fosfonokarboksilatne grupe, kao i siloksan, sulfid, sulfoksid, sulfon, acetil, formacetil, tioformacetil, metilen formacetil, tioformacetil, alkenil, sulfamat, metilenimin, metilenhidrazino, sulfonat i sulfonamidne grupe.
[0097] U fosforotioatnom delu, ne-premošćujući atom kiseonika zamenjen je atomom sumpora. Fosforitioatne grupe mogu promovisati vezivanje proteina na serumu i na taj način mogu poboljšati in vivo distribuciju i bioraspoloživost mimika. Ovo bi moglo biti poželjno ako bi se mimik systemski primenio primaocu.
[0098] Dodatno ili alternativno, miR-29 mimik ili prekursor može sadržati jednu ili više modifikovanih baza kao alternativu prirodnom adeninu, citozinu, guaninu i uracilu. Takve modifikovane baze uključuju 5-metilcitozin (5-me-C), 5-hidroksimetil citozin, ksantin, hipoksantin, 2-aminoadenin, 6-metil i druge alkilne derivate adenina i gvanina, 2-propil i druge alkilne derivate adenina i gvanina, 2-tiouracil, 2-tiotimin i 2-tiocitozin, 5-halouracil i citozin, 5-propinil uracil i citozin i druge alkinilne derivate pirimidinskih baza, 6-azo uracil, citozin i timin, 5-uracil (pseuduracil), 4-tiouracil, 8-halo, a-amino, 8-tiol, 8-tioalkil, 8-hidroksil i druge 8-supstituisane adenine i guanine, 5-halo (uključujući 5-bromo, 5-trifluorometil i druge 5-supstituisane uracile i citozine), 7-metilgvanin i 7-metilladin, 2-F-adenin, 2-amino-adenin, 8-azaguanin i 8-azaadenin, 7-deazaguanin i 7-deazaadenin i 3-deazaguanin i 3-deazaadenin.
[0099] Predloženo je da, što je snažnije modifikovan putnik lanac, manje je verovatno da će biti ugrađen u RISC kompleks, i stoga će vodič lanac biti efikasniji. Dakle, čak i ako je vodič lanac matični miR-29, možda bi bilo poželjno da putnik lanac sadrži jednu ili više modifikacija, npr. jedan ili više modifikovan šećerni ostataa, jednu ili više modifikovanih inter-nukleozidnih veza i/ili jednu ili više modifikovanih baza.
[0100] Dodatno ili alternativno, miR-29 mimik ili prekursor može sadržati membranski tranzitni deo, kako bi se olakšao tranzit preko plazma membrane ciljane ćelije. Ovaj deo može biti pogodan lipid ili drugi masni deo, uključujući, ali ne ograničavajući se na holesterol i stearoil delove.
[0101] Ostali tranzitni membranski delovi uključuju ćelije koje penetriraju peptide („CPPs“, kao što su TAT i MPG iz HIV-1, penetratin, poliarginin) i fuzogene peptide (npr. derivati endodomina HIV-1 omotača (HGP) ili gripa, fuzogeni peptid (diINF-7)). Membranski tranzitni deo može biti konjugovan sa nosačnim molekulom koji je nekovalentno povezan sa miR-29 mimikom ili samim prekursorom. Alternativno, membranski tranzitni deo može biti konjugovan sa miR-29 mimikom ili samim prekursorom.
[0102] Tranzitni membranski deo može biti konjugovan ili sa vodič lancem ili sa putnik lancem, iako je poželjan putnik lanac, kako se ne bi ometala funkciju vodič lanca. Konjugacija bilo na 5' ili 3' terminusu može biti poželjna, iako je moguće i konjugacija na unutrašnjem ostatku.
[0103] Za izbegavanje sumnje, miR-29 molekul (tj. Koji inače ne poseduje bilo kakve strukturne ili sekvencijalne razlike od matičnog molekula) može se smatrati miR-29 mimikom ili prekursorom kada je povezan sa tranzitnom membranom.
[0104] Primer miR-29 mimika je vodič lanac:
5'- rUrArGrCrArCrCrArUrCrUrGrArArArUrCrGrGmUmumA -3'
gde „r“ označava ribozni šećer i „m“ označava 2'-O-metil-ribozu.
[0105] Vodič se može sastojati od dvolančanog miR-29 mimika u kombinaciji sa putnik lancem. Primeri pogodnih putnik lanaca su:
5'mAmCrCmGrAmUrUmUrCmArGmArUmGrGmCrGmCrUA-3'
i
5'-mAmCrCmGrAmUrUmUrCmArGmArUmGrGmUrGmCrUmAdG-3'
Isporuka miR-29, mimika i prekursora
[0106] Mogu biti pruženi sastavi u kojima su miR-29, mimici i prekursori udruženi sa (npr. kompleksovanim ili enkapsuliranim) odgovarajućim nosačem.
[0107] Pogodni nosači uključuju farmaceutski prihvatljive lipide i polimere i njihove kombinacije. Na primer, sastava može imati oblik lipozoma, lipidnih vezikula, lipidnih kompleksa ili kompleksa polimera.
[0108] Na primer, lipidi vezikule i lipozomi su čestice lipidnih dvoslojeva koje imaju vodeno jezgro koje sadrži oligonukleotidni paket.
[0109] Lipidni kompleksi (ili „lipopleksi“) i polimerni kompleksi („polipeksi“) obično sadrže pozitivno naelektrisane lipide ili polimere koji su u interakciji sa negativno naelektrisanim oligonukleotidima kako bi se formirali kompleksi.
[0110] Katjonski polimeri ili lipidi takođe mogu da komuniciraju sa negativno naelektrisanim molekulima na površini ciljanih ćelija. Odgovarajućim izborom lipida i glavnih grupa, kompleksi mogu biti prilagođeni da olakšaju fuziju sa plazemskom membranom ciljane ćelije ili sa izabranom unutrašnjom membranom (kao što je endozomalna membrana ili nuklearna membrana) kako bi se olakšala isporuka oligonukleotidnog paketa do odgovarajućeg sub-ćelijskog odeljka. Isporuka gena lipopeksima i polipeksima razmatra se, na primer, kod Tros de Ilarduya et al. in Eur. J. Pharm. Sci.40 (2010) 159-170.
[0111] Neutralne lipidne emulzije takođe mogu da se koriste kako bi se formirali kompleksi čestica sa miRNK koji imaju prečnike reda veličine nanometra.
[0112] Odgovarajuće lipidi može izabrati stručna osoba u zavisnosti od primene, tereta i ciljane ćelije. Mogu se koristiti pojedinačni lipidi ili, češće, kombinacije lipida.
[0113] Pogodni lipidi su opisani, na primer, u WO2011/088309 i referencama navedenim u njemu, i uključuju:
• neutralne lipidi i fosfolipide, kao što sfingomijelin, fosfatidilholin, fosfatidiletanolamin, fosfatidilserin, fosfatidilinozitola, fosfatidne kiseline, palmitoil fosfatidilholin, lizofosfatidilholin, lizofosfatidiletanolamin, dipalmitoilfosfatidilholin, dioleoilfosfatidilholin, distearoilfosfatidilholin, dilinoleoilfosfatidilholin, fosfatidilholin (PC), 1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-holin (DOPC), lekitin, fosfatidiletanolamin (PE), lizolekitin, lizofosfatidiletanolamin, sphinogomielin (SM), kardiolipin, fosfosfatidnu kiselinu, 1,2-Distearoil-sn-glicero-3-fosfoholin (DSPC), 1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (DPPE), 1-Palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoholin (POPC), 1,2-Dilauroil-sn-glicero-3-fosfoholin (DLPC) , 2-Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoholin (DMPC), 1,2-Dipalmitoilsn-glicero-3-fosfoholin (DPPC), 1,2-Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (DMPE) 2-dioleil-sn-glicerol-3 -fosfoetanolamin (DOPE), dipalmitoloeil-PE, difitanoil-PE, DSPE, dielaidoil-PE, dilinoleilSM i dilinoleil-PE; • sterole, npr. holesterol
• polimer-modifikovane lipidi, npr. lipide modifikovane polietilen glikolom (PEG), uključujući PEG-modifikovani fosfatidiletanolamin i fosfatidnu kiselinu, PEG-keramidn konjugate, PEG-modifikovane dialkilamine i PEG-modifikovane 1,2-diaciloksipropan-3-amine. Posebno su odgovarajući PEG-modifikovani diacilgliceroli i dialkilgliceroli, npr. PEGdidimistristil glicerol (PEG-DMG) PEG-distiril glicerol (PEG-DSG) i PEG-karbamoil-1,2-dimirristiloksipropilamin (PEG-cDMA);
• katjonske lipide, kao što su N, N-dioleil-N, N-dimetilamonijum hlorid („DODAC“); N- (2,3-dioliloksi) propil-N, N-N-trietilamonijum hlorid („DOTMA“); N,N-distearil-N, N-dimetilamoniumbromid („DDAB“); N-(2, 3-dioleoiloksi) propil) N,N,N-trimetilamonijum hlorid („DOTAP“); 1,2-dioliloksi-3-trimetilaminopropan hloridna so („DOTAP.Cl“); 3β-(N-(N’ , N’ -dimetilaminoetan)-karbamoil)holesterol („DC-Chol“), N-(l-(2,3-dioliloksi)propil)-N-2-(sperminkarboksamido)etil)-N,N-dimetilamonijum trifluoracetat („DOSPA“), dioktadecilamidoglicil karboksispermin („DOGS“), 1,2-dileoil-sn-3-fosfoetanolamin („DOPE“), 1,2-dioleoil-3-dimetilamonijum propan („DODAP“), N,N-dimetil-2,3-dioleiloksi)propilamin („DODMA“), N-(1,2-dimiristiloksiprop-3-il)-N,Ndimetil-N-hidroksietil amonijum bromid („DMRIE“), 1,2-dilinoleiloksi-3-dimetilaminopropan (DLinDMA) 1,2Dilinoleoil-3-dimetilaminopropan (DLinDAP), 1-Linoleoil-2-linoeiloksi-3-dimetilaminopropan (DLin-2DMAP), 1,2-Dilinoleilkarbamoiloksi-3-dimetilaminopropan (DLin-C-DAP), 1,2-Dilinoleiltio-3-dimetilaminopropan (DLin-S-DMA), i 2,2-Dilinoleil-4-10 dimetilaminometil-[1,3]-dioksolan (Dlin-K-DMA). Komercijalni preparati katjonskih lipida uključuju Lipofectin™ (koji sadrži DOTMA i DOPE, dostupan od Gibco/BRL) i Lipofectamin™ (koji sadrži DOSPA i DOPE, dostupan od Gibco/BRL).
• anjonske lipide, uključujući fosfatidilglicerol, kardiolipin, diacilfosfatidilserin, dijafilfosfatidnu kiselinu, N-dodecanoil fosfatidiletanolamin, N-sukcinilfosfatidiletanolamin, N-glutaril fosfatidiletanolamin i lizilfosfatidilglicerol.
[0114] WO/0071096 opisuje različite formulacije, kao što je DOTAP:holesterol ili formulacije derivata holesterola koje se mogu efikasno koristiti za isporuku oligonukleotida.
[0115] Komercijalno raspoloživi sastav koji može postići dobru isporuku miRNK u pluća je neutralna lipidna emulzija MaxSuppressor in vivo RNKLancerII (BIOO Scientific, Austin, TX) koja se sastoji od 1,2-dioleil-sn-glicerero-3-fosfoholina, skvalenovog ulja, polisorbata 20 i antioksidanta. U kompleksu sa sintetičkim miRNK, on formira nanočestice u rasponu nanometarskog prečnika.
[0116] Pogodni polimeri uključuju histone i protamin (i druge proteine koji vezuju DNK), poli (etilenimin) (PEI), katjonske dendrime kao što su dendrimi poliamidoamin (PAMAM), 2-dimetil (aminoetil) metakrilat (pDMAEM), poli(L-lizin) (PLL), polimeri zasnovani na ugljenim hidratima kao što je hitosan itd. Pogledati Tros de Ilarduya et al. in Eur. J. Pharm. Sci.40 (2010) 159-17 za pregled.
[0117] Takođe se mogu koristiti proteini i peptidi kao što je atelokolagen. Atelokolagen je oblik kolagena rastvorljiv u vodi, i koji se dobija tretmanom proteaze, naročito sa kolagenom tipa I koji se tretira sa pepsinom od telećeg dermisa.
[0118] Ciklodekstrini mogu takođe biti od koristi za isporuku.
Agensi za ciljanje
[0119] Molekuli nosača mogu takođe nositi agense za ciljanje sposobne za vezivanje na površinu ciljane ćelije. Na primer, agens za ciljanje može biti specifičan vezujući partner, sposoban da se specifično vezuje za molekul koji je eksprimiran na površini ciljane ćelije tetive. Pogodni vezivni partneri uključuju antitela i slično, usmerena protiv molekula ćelijske površine ili liganda ili receptora za takve molekule ćelijske površine. Površinski markeri koji mogu pomoći u usmeravanju na ćelije tetive uključuju Tenascin C, CD55 i tenomodulin.
[0120] Izraz „specifični vezivni par“ se koristi da opiše par molekula koji sadrže specifični vezujući član (sbm) i njegovog vezujućeg partnera (bp) koji imaju posebnu specifičnost jedan za drugog i koji se u normalnim uslovima vezuju jedni druge pre vezivanja za druge molekule. Primeri specifičnih vezivnih parova su antitela i njihovi srodni epitopi/antigeni, ligandi (kao što su hormoni, itd.) i receptori, avidin/streptavidin i biotin, lektini i ugljeni hidrati i komplementarne nukleotidne sekvence.
[0121] Dobro je poznato da fragmenti celog antitela mogu obavljati funkciju vezivnih antigena. Primeri funkcionalnih vezivnih fragmenata su (i) Fab fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena; (ii) Fd fragment koji se sastoji od VH i CH1 domena; (iii) Fv fragment koji se sastoji od VL i VH domena pojedinačnog antitela; (iv) fragment dAb (Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)) koji se sastoji od VH domena; (v) izolovane CDR regije; (vi) F(ab')2 fragmenta, dvovalentni fragment koji sadrži dva povezana Fab fragmenta (vii) jednolančani Fv molekuli (scFv), gde su VH domen i VL domen povezani peptidnim veznikom koji dozvoljava da se oba domena povežu i formiraju mesto vezivanja (Bird et al, Science, 242, 423-426, 1988; Huston et al, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988); (viii) bispecifični jednolančani Fv dimeri (PCT/US92/09965) i (ik) „dijatela“, multivalentni ili multispecifični fragmenti konstruisani fuzijom gena (WO94/13804; P. Holliger et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA 906444-6448, 1993).
[0122] Kako se antitela mogu modifikovati na više načina, izraz „antitelo“ treba stoga tumačiti kao da pokriva bilo koju specifičnu vezujuću supstancu koja ima vezujući domen sa potrebnom specifičnošću. Prema tome, ovaj izraz obuhvata fragmente antitela opisane iznad, kao i derivate, funkcionalne ekvivalente i homologe antitela, uključujući bilo koji polipeptid koji sadrži domen za vezivanje imunoglobulina, bilo da je prirodni ili sintetički. Zbog toga su uključeni himerni molekuli koji sadrže domen za vezivanje imunoglobulina, ili ekvivalent, spojen sa drugim polipeptidom. Kloniranje i eksprimiranje himernih antitela opisani su u EP-A-0120694 i EP-A-0125023.
[0123] Alternative antitelima su sve više dostupne. Takozvani „afinitetni proteini“ ili „konstruisane proteinske skele“ mogu rutinski biti prilagođeni afinitetu prema određenoj meti. Oni su obično na neimunoglobulinskom proteinu skele sa konformacijski stabilnim ili rigidnim jezgrom, koje je modifikovano da ima afinitet za metu. Modifikacija može obuhvatiti zamenu jednog ili više površinskih ostataka i/ili umetanje jednog ili više ostataka na površinu proteina skele. Na primer, peptid sa afinitetom za cilj može biti umetnut u površinsku petlju proteina skele ili može zameniti deo ili celu površinsku petlju proteina skele. Pogodne skele i njihovi sintetički ekvivalenti uključuju:
• BPTI, LAC-DI, ITI-D2 (Kunitz domene skele);
• ETI-II, AGRP (Knottin);
• tioroksin (peptid aptamer);
• Fn3 (AdNectin);
• lipokalin (BBP) (Anticalin);
• ponavljanje ankrina (DARPin);
• Z domena proteina A (Afitelo); - gama-B-kristalin/ubikvitin (Afilin);
• LDLR-A-domen (Avimer).
[0124] Pogledati, na primer, Gebauer, M and Skerra, A, Current Op. Chem. Biol. 2009, 13: 245-255, and Friedman, M and Stahl, S, Biotechnol. Appl. Biochem. (2009) 53: 1-29, i reference citirane tamo. Nukleinske kiseline koje kodiraju miR-29, mimike i prekursore
[0125] Kao alternativa isporučivanju miR-29 oligonukleotida, mimika i prekursora direktno u ciljanu ćeliju, moguće je isporučiti nukleinsku kiselinu koja kodira miR-29 oligonukleotid, njegov mimik ili prekursore bilo kog od njih, na ciljanu ćeliju, tako da se miR-29 oligonukleotid, mimik ili prekursor eksprimiraju unutar ciljane ćelije. Ovakav pristup se može smatrati „genskom terapijom“.
[0126] Biće jasno veštoj osobi da se nukleinske kiseline mogu koristiti samo za kodiranje miR-29, mimika i njihovih prekursora sastavljenih od RNK, odnosno sastavljenih od četiri prirodne nukleotidne komponente RNK, bez modifikovanih baza, šećera ili internukleozidne veze.
[0127] Nukleinska kiselina tipično sadrži konstrukt eksprimiranja, koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira miR-29 oligonukleotid, mimik ili prekursor, operativno povezan sa odgovarajućim regulatornim sekvencama radi olakšavanja eksprimiranja. Regulatorne sekvence mogu biti odabrane u zavisnosti od ciljane ćelije, ali će obično obuhvatiti odgovarajući promoter i opciono pojačivač koji direktno transkribuje sa RNK polimerazom II, kao i transkripcijski terminator (koji obično uključuje signal poliadenilacije).
[0128] Promoter može biti promoter specifičan za tkivo, koji vodi transkripciju poželjno ili isključivo u ciljanu ćeliju ili tkivo u odnosu na druge vrste ćelija ili tkiva.
[0129] Prema tome, promoter može biti promoter koji vodi transkripciju poželjno ili isključivo u ćelijama tetiva. Promoter kolagena 1a1 (col1a1) može biti pogodan promoter.
Isporuka nukleinskih kiselina do ciljanih ćelija
[0130] Nukleinske kiseline koje kodiraju miR-29, mimike i prekursore mogu se isporučivati bilo kojim pogodnim putem.
[0131] Postupci za isporuku nukleinske kiseline na ćelije in vitro obuhvataju taloženje kalcijum fosfata, DEAE-dekstran, elektroporaciju, mikroinjektiranje, lipozome opterećene sa DNK, sonikaciju i bombardovanje pomoću mikroprojektila obloženih nukleonskom kiselinom (npr. zlatnim ili volfram mikrozrnima). Razne tehnike su uspešno prilagođene za upotrebu in vivo ili ex vivo.
[0132] Na taj način nukleinska kiselina može da se primenjuje u golom obliku, koji je povezan sa (npr, kompleksiran ili inkapsulirana sa) pogodnim nosačem kao što su polimer ili lipid (kao što je opisano na drugim mestima u ovoj specifikaciji) ili prevučen na površinu čestice. U takvim otelotvorenjima, nukleinska kiselina je tipično DNK. Nukleinska kiselina ili nosač mogu takođe sadržati segment za ciljanje ili membranski transport kao što je opisano na drugim mestima u ovoj specifikaciji. Bilo koji od ovih postupaka može se takođe prilagoditi kako je prikladno za isporuku miR96, prekursora i samih mimika.
[0133] Nukleinska kiselina tipično uzima oblik vektora eksprimiranja. Vešta osoba će biti u stanju da dizajnira odgovarajuće vektore eksprimiranja nukleinske kiseline radi terapeutske upotrebe (kao i za druge načine opisane u ovoj specifikaciji). Vektori obično sadrže konstrukciju eksprimiranja koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira miR-29, mimik ili prekursor, u operativnoj vezi sa odgovarajućim regulatornim sekvencama, uključujući promoterske sekvence i sekvence završetka transkripcije, opciono kombinovane sa sekvencama poboljšivačima, markerskim genomima i drugim sekvencama u zavisnosti od konkretne primene. Vektori mogu biti namenjeni da se integrišu u hromozom ćelije domaćina, ili mogu postojati i replicirati se nezavisno od hromozoma domaćina kao epizom, npr. plazmid.
[0134] Alternativno, virusni vektor se može koristiti za isporuku nukleinske kiseline.
[0135] Bilo koji prikladni tip virusnog vektora može se koristiti kao nosač za isporuku gena. To uključuje adenovirus, adeno-povezan virus (AAV), retrovirus (posebno lentivirus) i herpesvirus vektore. Adenovirus i lentivirus mogu biti posebno poželjni jer imaju sposobnost da postignu eksprimiranje gena koji se dostavljaju u ćelijama koje se ne dele aktivno.
[0136] virusni vektor tipično sadrži virusne strukturne proteine i isporuku nukleinske kiseline koja sadrži željeni konstrukt eksprimiranja u obliku koji je funkcionalan da eksprimira gen u ciljanoj ćeliji ili tkivu. Tako je gen tipično operativno povezan sa promoterom i drugim odgovarajućim regulatornim signalima transkripcije.
[0137] U adenovirusnim vektorima, korisna nosivost nukleinske kiseline je obično molekul sa dvostrukom vezom (dsDNK). U retrovirusnim vektorima, to je tipično jednolančana RNK.
[0138] Isporuka nukleinske kiseline obično sadrži dodatne elemente koji su potrebni da se pakuju u nosač za isporuku gena i odgovarajuće se obrađuju u ciljanoj ćeliji ili tkivu.
[0139] Za adenovirusne vektore, ovo može uključivati sekvence invertnog adenovirusnog terminalnog ponavljanja (ITR) i odgovarajući signal za pakovanje.
[0140] Za retrovirusne vektore, ovo uključuje karakteristične terminalne sekvence (tzv. sekvence „R-U5“ i „U3-R“) i signal za pakovanje. Terminalne sekvence omogućavaju generisanje direktnih ponavljajućih sekvenci („duga terminalna ponavljanja“ ili „LTR“) na bilo kom kraju provirusa koji rezultuju iz reverzne transkripcije, koji zatim olakšavaju integraciju provirusa u genom domaćina ćelija i direktno naredno eksprimiranje.
[0141] Korisno opterećenje nukleinske kiseline može sadržati i selektivni marker, tj. gen koji kodira proizvod koji omogućava spremnu detekciju transdukcionih ćelija. Primeri uključuju gene za fluorescentne proteine (npr. GFP), enzime koji proizvode vidljiv reakcioni proizvod (npr. betagalaktozidaza, luciferaza) i geni otpornosti na antibiotike.
[0142] virusni vektor je tipično kompetentan za replikaciju. To znači da korisna nukleinska kiselina ne sadrži sve virusne gene (i druge genetske elemente) neophodne za replikaciju virusa. Virusni vektor će ipak sadržati sve strukturne proteine i enzimske aktivnosti potrebne za uvođenje korisnog opterećenja u ćeliju domaćina i za odgovarajuću obradu korisnog opterećenja tako da se kodirani miR-29, mimik ili prekursor mogu eksprimirati. Tamo gde oni nisu kodirani pomoću nukleinske kiseline, oni će se obično snabdevati linijom pakovanja. Obučena osoba će biti dobro upoznata sa odgovarajućim ćelijskim linijama koje se mogu koristiti za generisanje odgovarajućih nosača za isporuku virusa.
[0143] Prema tome, za adenovirusni vektor, korisna nosivost nukleinske kiseline obično nema jedan ili više funkcionalnih adenovirusnih gena iz regija E1, E2, E3 ili E4. Ovi geni mogu biti izbrisani ili na drugi način inaktivirani, npr. ubacivanjem jedinice transkripcije koja sadrži heterologni gen ili selektivni marker.
[0144] U nekim otelotvorenjima nukleinska kiselina ne sadrži nikakve funkcionalne virusne gene. Prema tome, za adenovirusni vektor, jedine prisutne virusne komponente mogu biti ITR i signal za pakovanje.
[0145] Nukleinske kiseline koje nemaju funkcionalne virusne gene mogu biti poželjne jer smanjuju rizik od imunog odgovora domaćina koji se razvija u odnosu na transdukovanu ciljanu ćeliju ili tkivo kao rezultat sinteze virusnog proteina.
[0146] Virusni vektori mogu biti konstruisani tako da poseduju modifikovane površinske proteine sposobne da se vezuju za markere na ciljanoj ćeliji, čime povećavaju šansu da se željena ciljana ćelija transdukuje, i smanjuju šansu za nespecifičnom transdukcijom druge ćelije ili vrste tkiva. Ovaj pristup se ponekad naziva pseudotipingom. Tako virusni vektor može sadržati površinski protein sposoban za vezivanje na površinski marker na ćeliji tetive. Površinski markeri koji mogu pomoći u usmeravanju na ćelije tetive uključuju Tenascin C i CD55.
Tetiva i oštećenje tetiva
[0147] Tetive su vezivno tkivo koje povezuje mišić sa kostima. Omogućavaju transdukciju sile od mišića koji se napreže na vezanu skeletnu strukturu na rastojanju od samog mišića<1>.
[0148] Tetive su kompleksno, sistematski organizovano tkivo i obuhvataju nekoliko različitih slojeva.
[0149] Sama tetiva je približno jednoosni kompozit koji sadrži oko 30% kolagena i 2% elastina (vlažna težina) ugrađene u vanćelijsku matricu koja sadrži različite vrste ćelija, a naročito tenocite.
[0150] Preovlađujući kolagen je kolagen tipa I, koji ima veliki prečnik (40-60nm) i povezuje se zajedno kako bi se formirao složeni sloj vlakana. Kolagen tipa 3 je takođe prisutan i manji je u prečniku (10-20nm), formirajući labave retikularne snopove.
[0151] Kolagen je organizovan (u rastućoj složenosti) u fibrile, vlakna, snopove i fascikle vlakana, okružene slojem slobodnog kolagena i matrice vezivnog tkiva bogate lipidom, poznate kao endotenon<4>. Jedan sloj istog materijala, nazvan epitenon, pokriva površinu cele tetive. Oko epitenona je vezivno tkivo nazvano paratenon koje sadrži fibrile kolagena tipa 1 i tipa 3, neke elastične fibrile i sloj sinovijalnih ćelija. Neke tetive su dodatno okružene tetivnim plaštom.
[0152] Najvažniji tipovi ćelija unutar tetive su tenociti i tenoblasti, oba su fibroblastične ćelije. Oba tipa ćelija su važna za održavanje zdravih tetiva, jer oba stvaraju kolagen i održavaju ekstracelularnu matricu<15>. Prema tome, izraz „ćelija tetive“, kad se koristi u ovoj specifikaciji, obuhvata i tenocite i tenoblaste.
[0153] Tenociti su ravne, zakrivljene ćelije, u obliku uzdužnog vretena, i stelati u poprečnom preseku, i detektuju se naizmenično u redovima između kolagenskih vlakana. Oni imaju elaborirane ćelijske procese koji formiraju trodimenzionalnu mrežu koja se proteže preko ekstracelularne matrice, komunicira preko ćelijskih procesa i može biti pokretna.
[0154] Tenoblasti su prekursori tenocita. Oni su vreteno oblikovane ili stelatne ćelije sa dugim, sužavajućim, eozinofilnim ravnim jezgrima. Oni su pokretni i veoma proliferativni.
[0155] Tokom embrionalnog razvoja, tenoblasti i samim tim tenociti potiču iz mezodermalnih kompartmenta, kao i skeletalni mioblasti, hondrociti i osteoblasti. Neke multipotentne mesenhimalne progenitorne ćelije koje proizilaze iz ovih odeljka eksprimiraju osnovnu spirala-petlja-spirala transkripcionu faktorsku scleraksu. Međutim, kada se posvete da postanu ćelije koje čine specifično tkivo, samo tenoblasti i tenociti zadržavaju sposobnost eksprimiranja skleraksa. Gene skleraksa su stoga prvi glavni geni za koji je ustanovljeno da su neophodne za uspostavljanje linije tetiva tokom razvoja. Tenomodulin je transmembranski glikoprotein tipa II indukovan u tetivama miša u kasnoj (embrionalni dan [E] 17,5) razvojnoj fazi, a takođe je primećen kod odraslih tetiva. Stoga skleraksa predstavlja marker i za tenoblaste i za tenocite, dok je tenomodulin površinski marker za zrele tenocit.
[0156] Oštećenje tetiva može biti uzrokovano ili povezano sa brojnim faktorima uključujući (ali ne ograničavajući se na) spoljnu traumu, mehanički stres (uključujući preveliku upotrebu), degeneraciju, upale i kombinacije ovih, često nazivaju „tendinopatija“.
[0157] Izraz „povreda tetive“ se generalno koristi da se odnosi na akutne povrede usled jednog traumatičnog događaja, uključujući spoljnu traumu i rupturu tetive (tj. potpuni prekid tetive).
[0158] Tendinopatija je multifaktorijalna, ima spektar od akutnog do hroničnog i često je povezana sa prevelikom upotrebom tetive, koja može biti trenutna ili u dužem vremenskom periodu. Tendinopatija može dovesti do degeneracije ili drugih vrsta mehaničkog oštećenja kolagena na mikroskopskom ili makroskopskom nivou (ponekad pod nazivom „tendinoza“), upale ili kombinacije oba (ponekad pod nazivom „tendinitis“).
[0159] Biomehanička svojstva tetive, naročito njena zatezna čvrstoća, odnose se na površinu poprečnog preseka (tj. debljinu), sadržaj kolagena i odnos između različitih tipova kolagena. Nakon akutne povrede, tokom tendinopatije i tokom lečenja oštećenja tetiva, dolazi do promene u sintezi kolagena, dalje od kolagena tipa 1 prema kolagenu tipa 3. Sinteza kolagena tipa 1 može se vratiti na normalne nivoe nakon inicijalnog pada, ali uporno povećanje sinteze tipa 3 dovodi do dugoročne neravnoteže u odnosu kolagen. Ovo ima značajan i štetan uticaj na biomehaničke karakteristike tetive. Konkretno, smanjuje se zatezna čvrstoća tetive, smanjivši njegovu krajnju snagu prekida i time ga čini sklonom na kasnije rupture.
[0160] Postupci pronalaska mogu se primeniti na bilo koju oštećenu tetivu. Glavne tetive pogođene tendinopatijom kod ljudi su Ahilova tetiva, supraspinatska tetiva, zajednička fleksorska tetiva i zajednička ekstenzorska tetiva. Glavna tetiva pogođena tendinopatijom kod konjskih subjekata je površinska fleksorska tetiva. One mogu predstavljati posebno značajne ciljeve za lečenje.
Terapeutska primena miR-29, mimika i prekursora
[0161] Pronalazači su otkrili da je povećanjem aktivnosti miR-29 u ćelijama tetiva moguće izmeniti kolagenski balans u korist sinteze kolagena tipa 1 i dalje od sinteze kolagena tipa 3.
[0162] Prema tome, pronalazak pruža postupke za modulaciju lečenja tetive terapeutskom primenom miR-29. Postupci opisani u ovoj specifikaciji mogu se smatrati postupcima za modulaciju relativnog sastava i/ili sinteze kolagena u tetivi, posebno relativnog sadržaja i sinteze kolagena tipa 1 i tipa 3 u tetivi. Veruje se da je ravnoteža modulisana u korist kolagena tipa 1, tj. povećanja sinteze kolagena 1 ili sadržaja unutar tetive u odnosu na kolagen tipa 3. Biće prihvaćeno da to ne mora nužno uključiti neto povećanje sinteze ili sadržaja kolagena tipa 1, jer miR-29 može inhibirati sintezu kolagena tipa 1. Međutim, sinteza kolagena tipa 3 je u većoj meri inhibirana nego kod kolagena tipa 1.
[0163] Na fiziološkom nivou, postupci opisani u ovoj specifikaciji mogu se smatrati postupcima za modulisanje biomehaničkih osobina tetive, poželjno poboljšavajući biomehaničke osobine tetive, npr. poboljšanje ili povećanje zatezne čvrstoće tetive.
[0164] Postupci pronalaska mogu se primeniti u bilo kojoj fazi tendinopatije ili u bilo kojoj fazi procesa zarastanja oštećene tetive. Na primer, postupci se mogu koristiti za modulaciju odnosa kolagena, a time i biomehaničkih svojstava tetive, tokom lečenja tendinopatije ili tokom lečenja akutne povrede tetive, kao što je pukotina tetive.
[0165] Prema tome, postupci iz ovog pronalaska mogu se podjednako posmatrati kao postupci za lečenje oštećenja tetiva, uključujući oštećenje nastalo povredom tetive i tendinopatijom.
[0166] IL-33 se može posmatrati u tetivi u kratkom periodu posle povrede iu ranim fazama tendinopatije. Bez želje da se veže nekom posebnom teorijom, IL-33 može biti uključen u prelazak sa sinteze kolagena tipa 1 do tipa 3. Međutim, veruje se da se neuravnoteženost sinteze kolagena održava nakon inicijalnog uključivanja IL-33. Postupci pronalaska nisu ograničeni na tretman u ranim stadijumima povrede tetiva, ali su podjednako primenjivi na povrede ili bolesti kasne faze, npr. hroničnu tendinopatiju.
[0167] Tako se tretman može davati u bilo kojoj fazi nakon pojave simptoma ili nakon traumatskog događaja koji uzrokuje oštećenje tetive. Na primer, lečenje se može davati 1 dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, 7 dana ili više nakon pojave simptoma ili traumatskog događaja. Može se primenjivati, 1 nedelju, 2 nedelje, 3 nedelje, 4 nedelje ili više nakon pojave simptoma ili traumatskog događaja. Može se primenjivati 1 mesec, 2 meseca, 3 meseca, 4 meseca, 5 meseci, 6 meseci ili više nakon pojave simptoma ili traumatskog događaja.
Pacijenti za lečenje
[0168] Iako će najčešći pacijenti za tretman biti ljudi, postupci iz ovog pronalaska mogu se proširiti na bilo kog drugog sisara, uključujući i druge primate (naročito velike majmune kao što su gorila, šimpanze i orangutan, ali i majmuni iz starog sveta i novog sveta), kao i glodari (uključujući miševe i pacove) i druge zajedničke laboratorijske, domaće i poljoprivredne životinje (uključujući, ali ne ograničavajući se na zečeve, pse, mačke, konje, krave, ovce, koze itd.).
[0169] Postupci mogu biti posebno primenljivi na konjske pacijente, tj. konje. Konji, a pogotovo čistokrvni konji poput trkačkih konja, posebno su skloni povredama tetiva. S obzirom na vrednost mnogih životinja, postoji dugotrajna potreba za efikasnim tretmanima.
Farmaceutski sastavi i postupci lečenja
[0170] Ovde opisani molekuli mogu se formulisati u farmaceutskim sastavima. Ovi sastojci mogu, pored jedne od gore navedenih supstanci, da sadrže farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, nosač, pufer, stabilizator ili druge materijale dobro poznate stručnjacima. Takvi materijali treba da budu netoksični i ne bi trebalo da ometaju efikasnost aktivnog sastojka. Precizna priroda nosača ili drugog materijala može zavisiti od načina primene, npr. oralni, intravenski, kožni ili potkožni, nazalni, intramuskularni i intraperitonealni načini primene. Primeri pogodnih sastava i metoda administracije su navedeni u Esseku i Adeieie (2011) i Van den Mooter G. (2006).
[0171] Farmaceutski sastavi za oralnu primenu mogu biti u tabletama, kapsulama, prahu ili tečnom obliku. Tableta može sadržati čvrsti nosač kao što su želatin ili adjuvant. Tečni farmaceutski sastavi uglavnom uključuju tečnost kao što su voda, nafta, životinjska ili biljna ulja, mineralno ulje ili sintetičko ulje. Mogu biti uključeni fiziološki fiziološki rastvor, rastvor dekstroze ili drugih saharida ili glikola kao što su etilen glikol, propilen glikol ili polietilen glikol.
[0172] Za intravenozno, kožno ili potkožno injektiranje ili injekciju na mestu povrede, aktivni sastojak će biti u obliku parenteralno prihvatljivog vodenog rastvora koji je bez pirogena i ima odgovarajući pH, izotoničnost i stabilnost. Relevantni stručnjaci sposobni su da pripreme odgovarajuća rešenja korišćenjem, na primer, izotoničnih nosača kao što je natrijum hlorid injekcija, Ringerova injekcija, laktirana Ringerova injekcija. U skladu sa zahtevima mogu biti uključeni konzervansi, stabilizatori, puferi, antioksidanti i/ili drugi aditivi.
[0173] S obzirom na lokalizovanu prirodu stanja za lečenje, administracija lokalnim injekcijama može biti posebno pogodna. Injekcija se može isporučiti u tetivu ili u neposrednoj blizini tetive.
[0174] Bez obzira na prirodu aktivnog sredstva koji se daje pojedincu (npr. ćelija, polipeptid, molekul nukleinske kiseline, drugi farmaceutski korisni agensi prema ovom pronalasku), primena je poželjno u „profilaktički efikasnoj količini“ ili „terapeutski efikasnoj količinu“ (u zavisnosti od slučaja, iako se profilaksa može smatrati terapijom), gde je ta količina dovoljna da pokaže koristi za pojedinca. Tačna količina koja se primenjuje, i stopa i vreme trajanja primene, zavisiće od prirode i težine pacijenta koji se leči. Prepisivanje terapije, npr. odluke o doziranju itd., u nadležnosti je lekara opšte prakse i drugih lekara i veterinara, a obično se uzima u obzir poremećaj koji treba lečiti, stanje pacijenta, mesto primene, način primene i drugi faktori poznati lekarima. Primeri navedenih tehnika i protokola mogu se naći u Remington’s Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins.
[0175] Pronalazak će sada biti detaljnije opisan, putem primera i bez ograničavanja, uzimajući u obzir priložene crteže i primere.
Opis crteža
[0176]
Slika 1: Eksprimiranje IL-33/ST2 u tetivi.
Eksprimiranje gena (A) IL-33, (B) rastvorljivog ST2 (sST2) i (C) membrane ST2 (mST2) u uzorcima tetiva. Razvijena promena eksprimiranja gena IL-33, rastvorljivi/membrana ST2 kao kontrola (n=10), pocepani supraspinatus i uzorci ljudske tetive subcapularis (n=17). Prikazane tačke podataka su relativni izrazi u poređenju sa domaćim genom 18S (sredina analize u duplikatu). Srednji 6 SD odražava upoređivanje populacije pacijenata t-testom. (D) Modifikovano Bonar bodovanje za uzorke tetive sa srednjim i prikazanim SEM. n=10 za kontrolnu tetivu (Ctl), n=17 za pocepanu tetivu i ranu tendinopatiju. Modifikovani Bonar sistem bodovanja prikazuje srednje vrednosti po uzorku na osnovu 10 polja visokog napona. 0=bez bojenja, 1=<10%, 2=10-20%, 3 => 20% ve bojenje ćelija po snažnom polju snage. (E) Prekidanje promene u eksprimiranju gena IL-33 i ST2, 24 časa posle inkubacije sa odgovarajućim dozama samog TNFα, samog IL-1β i u kombinaciji. Podaci prikazani kao srednja vrednost 6 SD triplikata i predstavljaju eksperimente na tri individualna uzorka pacijenta. *p<0,05, **p<0,01 u poređenju sa kontrolnim uzorcima. (F) Stepen promene u eksprimiranju gena col1 i col3 sa 50 i 100ηg/ml rhIL-33 24 časa nakon inkubacije. (G) Vremenski kurs za eksprimiranje gena col1 i col3 nakon inkubacije sa 100ηg/ml IL-33. (H) eksprimiranje proteina kolagena 1 i 3 24 sata posle inkubacije sa povećanjem koncentracije rhIL-33. Za F, G i H, podaci su prikazani kao srednja vrednost 6 SD triplikata i zauzvrat predstavljaju eksperimente na tri individualna uzorka pacijenta. *p<0,05, **p<0,01 u poređenju sa kontrolnim uzorcima.
Slika 2: Osa IL-33/ST2 u lečenju tetive in vivo.
(A, B) eksprimiranje gena IL-33 i eksprimiranje gena rastvorljivog ST2 na dan 1,3,7 i 21 posle povreda. Prikazani podaci su srednja promena 6 SD (zbirni podaci od 4 miša po grupi izvedeni u četiri sekvencijalne prilike stoga n=16 po stanju) *p<0,05, **p<0,01 kontrola u odnosu na povređene miševe. (C, D) col1 mRNK i nivoi kolagen 1 proteina u WT i ST2-/- nakon povrede na dane 1 i 3 posle povrede. (E, F) col3 mRNK i nivoa kolagen 3 proteina u WT i ST2-/- na dane 1 i 3 nakon povrede. Podaci prikazani su srednja vrednost 6 SD dupliranih uzoraka i predstavljaju eksperimente koji koriste četiri miša po stanju (n=16). *p<0,05, **p<0,01 kontrola u odnosu na povređene miševe. p<0,05, +p<0,01 WT povređeni u poređenju sa ST2-/-povređenim miševima. (G) procentualna promena u snazi tetive za WT i ST2-/- povređene i nepovređene tetive na dane 1 i 3 nakon povrede. Podaci su prikazani kao srednji 6 SD i reprezentativni su za eksperimente koji koriste četiri miša po stanju (n=16). *p<0,05, **p<0,01 kontrola u odnosu na povređene miševe. # p <0,05 ST2-/- povređeni u poređenju sa WT povređenim miševima.
Slika 3: IL-33 promoviše proizvodnju kolagena 3 i smanjuje snagu tetive, dok anti IL-33 smanjuje te promene kod oštećenja tetiva in vivo.
(A) col1 mRNK, (B) kolagen 1 protein, (C) col3 mRNK i (D) kolagen 3 kod WT i ST2-/- miševa tretiranih sa rhIL-33 na dan 1 nakon povrede. Podaci su prikazani kao srednji 6 SD dupliranih uzoraka i reprezentativni su za eksperimente koji koriste četiri miša po stanju (n=16). *p<0,05, **p<0,01, povređeni u poređenju sa nepovređenim miševima. p<0,05 WT u odnosu na ST2-/-miševe. (E) procentualna promena u čvrstoći tetive kod nepovređenih miševa na dane 1 i 3 posle tretmana sa rhIL-33. Podaci su prikazani kao srednji 6 SD i reprezentativni su za eksperimente koji koriste četiri miša po grupi (n=16). **p<0,01, povređeni u odnosu na nepovređene miševe. (F) col1 mRNK, (G) kolagen 1 protein, (H) col3 mRNK i (I) nivoi kolagen 3 proteina posle tretmana sa anti-IL-33 na dane 1 i 3 nakon povrede tetive kod WT miševa. (J) procentualna promena u snazi tetive kod anti IL-33 tretmana WT miševa na dane 1 i 3 nakon povrede. Podaci su prikazani kao srednji 6 SD i reprezentativni su za eksperimente koji koriste četiri miša po stanju (n=16). *p<0,05, **p<0,01, povređeni protiv nepovređenih miševa. A-J, Podaci su prikazani kao srednja 6 SD dupliranih uzoraka i reprezentativni su za eksperimente koji koriste četiri miša po stanju (n=16)
Slika 4: MikroRNK 29 direktno cilja soluble ST2 - implikacije na promene kolagene matrice kod tetivnih bolesti.
(A) Svi članovi porodice miR-29 (miR-29a, miR-29b i miR-29c) su eksprimirani u tendinopatskim tenocitima (n=6 pacijenata). Niže vrednosti ΔCt ukazuju na veće nivoe eksprimiranja. Eksprimiranje gena miR-29 porodice u kontroli, pocepan supraspinatus (pocepana tetiva) i uparena subkupularna tetiva (rana tendinopatija). Podaci prikazani kao srednji 6 SD dupliranih uzoraka i predstavljaju eksperimente na deset uzoraka pacijenata. *p<0,05, **p<0,01. (B) Vremenski tok miR-29a eksprimiranja nakon dodavanja 100ng/ml rhIL-33. (C&D) col1 i col3 mRNK i eksprimiranje kolagen 1 i 3 proteina nakon transfekcije sa maskiranim mimikom, miR-29a mimikom ili miR29a antagomirom. (E) nivoi kolagen 3 proteina nakon dodavanja miR-29a mimika/antagomira i 100ng rhIL-33. Za prikazane B-E podaci su srednje 6 SD duplikata i predstavljaju eksperimente na pet eksperimentalnih uzoraka. (n=5) p <0,05, **p<0,01 (F) aktivnost luciferaze u primarnim ljudskim tenocitima transfektovanim sa prekursorom miR-29a koji sadrži 3'UTR od Col 1a1, Col1a2 ili Col3a1. Aktivnost je određena u odnosu na kontrolu transfektovanu sa umešanim RNK, koja je definisana kao 100%. Ovo je ponovljeno u 3 nezavisna eksperimenta. *p<0,05, **p<0,01 nasuprot maskiranoj kontroli. (G) miR-29a mesta vezivanja i MRE na col3a1 i col1a1/col1a2 dugim/kratkim formatima ističući alternativne lokacije poliadenizacije. (H) procenat dugih/kratkih transkripta kolagena u tenocitima (T) posle transfekcije sa miR-29a. (I) col1a1, col1a2 i col3a1 mRNK posle transfekcije sa maskiranim mimikom i miR-29a antagomirom. Prikazani podaci su srednjih 6 SD dupliranih uzoraka i predstavljaju eksperimente na tri eksponenta eksplanta tetive. (n=3) p <0,05, **p<0,01
Slika 5: IL-33/ST2 reguliše miR-29 u lečenju tetive in vivo
(A) Kotransfekcija HEK 293 ćelija sa pre-miR-29a koji sadrže 3'UTR rastvorljivog ST2 zajedno sa miRNK regulatornim elementima (MRE) od 3'UTR rastvorljivog ST2 i rezultujućeg testa aktivnosti luciferaze. ***p<0,001 u odnosu na maskiranu kontrolu (n=3) (B) nivoi mRNK sST2 i membranskog ST2 nakon dodavanja membrane miR-29a mimika ili miR-29a antagomira (C) proizvodnja ljudskog sST2 proteina (ng/ml) nakon inkubacije sa miR29a mimikom/antagomirom. (n=5) p <0,05, **p<0,01.
(D) Kvantitativni PCR koji pokazuje značajniju promenu 6SD kod miR-29a kod WT povređeni u naspram nepovređenih životinja na dane 1 i 3 nakon povrede. (E) Kvantitativni PCR pokazuje značajniju promenu 6SD kod miR-29a kod WT i ST2-/- miševa kod povređenih naspram nepovređenih životinja nakon lečenja sa rhIL-33 ili PBS na dan nakon povrede. (F) miR29a nakon dodavanja anti IL-33 kod post-povređenih WT životinja na dane 1 i 3. Podaci su prikazani kao srednja promena 6 SD dupliranih uzoraka i reprezentativni su za eksperimente koji koriste četiri miša po grupi (n=16) p <0,05, **p<0,01.
Slika 6: Osa IL-33/miR-29 u patologiji tetiva.
Šematski dijagram koji ilustruje ulogu IL-33/miR-29a u patologiji tetiva. Povreda tetive ili ponavljajuće mikro cepanje koji uzrokuju stres koji preživljava ćelija tetive dovode do otpuštanja IL-33 i nizvodne fosforilacije NFκB koja zauzvrat potiskuje miR-29a uzrokujući povećanje proizvodnje kolagena tipa 3 i rastvorljivog ST2. Povećanje kolagena 3 smanjuje konstantnu zateznu čvrstoću tetiva, čime ga dovodi do ranog pucanja, dok rastvorljiv ST2 deluje autokrinski, što može na kraju biti zaštitni mehanizam kojim se višak IL-33 uklanja iz sistema.
Slika 7
(A) Slika koja prikazuje semenske regije dva ciljana skeniranja koja predviđaju miR-29a MRE mesta: 29-1 i 29-2 (B) aktivnost luciferaze u ćelijama HEK 293 transfektovanim sa prekursorom miR-29 a/b/c (pre-miR- 29) koji sadrži 3'UTR od Col 1 ili Col 3. Aktivnost je određena u odnosu na kontrole transfektovane sa umešanim RNK, koja je definisana kao 100%. Ovo je ponovljeno u 3 nezavisna eksperimenta. *p<0,05, **p<0,01 nasuprot maskiranoj kontroli. (C) Kotransfekcija HEK 293 ćelija sa pre-miR-29a,b,c koja sadrži 3'UTR rastvorljivog ST2 koji pokazuje miR-29a značajno smanjujući relativnu aktivnost luciferaze u poređenju sa maskiranim kontrolama RNK (n=3) ( D) Preostala lokacija za vezivanje miR-29 prisutna u kratkoj col3a13'UTR varijanti je testirana u testu luciferaze zbog svoje osetljivosti na miR-29a i utvrđeno je da je potpuno aktivna. (E) Sekvence proizvoda 3'RACE transkripata tenocitnog kolagena od čoveka i konja. Signali poliadenilacije su podvučeni. MiR29a MRE je prikazan kurzivom u ljudskom Col3a1 (kratki 3'UTR) transkripta i konjskog Col3a1 transkripta.
Slika 8
(A) Col3 mRNK, (B) kolagen 3 protein, (C) Col1 mRNK i (D) nivoi kolagen 1 proteina posle tretmana sa miR-29a mimikom nakon povrede tetiva kod WT miševa. Podaci za mRNK su ukupan broj kopija gena nasuprot 18S domaćinskog gena u duplim uzorcima. Podaci su srednja 6 SD dupliranih uzoraka, predstavljeno sa 6 miševa po grupi, *p<0,05, **p<0,01 nasuprot kontrole. (ANOVA)
Detaljan opis pronalaska.
Materijali i postupci
Ljudski model tendinopatije
[0177] Svi postupci i protokoli su odobreni od strane Etičkog komiteta pod ACEC br.99/101. Petnaest uzoraka supraspinatne tetive sakupljeni su od pacijenata sa cepanjem rotatorske manžete, podvrgnuti operacijama ramena (Tabela 1). Prosečna starost pacijenata sa pukotinom rotatorske manžete je bila 54 godine (opseg, 35-70 godina) - srednja veličina cepanja je bila 2,5 cm. Uzorci subkapularne tetive su takođe prikupljeni od istih pacijenata. Pacijenti su bili uključeni samo ako nije bilo klinički detektibilnih dokaza o podkopularnoj tendinopatiji na preoperativnom MRI skeniranju ili makroskopskom oštećenju subkupularne tetive u vreme artroskopije - ovim kriterijumima su predstavljali istinski predkliničku kohortu. Dobijena je nezavisna kontrolna grupa koja se sastojala od 10 uzoraka subkapularne tetive sakupljene od pacijenata koji su bili podvrgnuti artroskopskoj hirurgiji radi stabilizacije ramena bez cepanja rotatorske manžete. Odsustvo cepanja rotatorske manžete je potvrđeno artroskopskim ispitivanjem. Prosečna starost kontrolne grupe je bila 35 godina (opseg, 20-41 godina).
Sakupljanje i priprema tkiva
[0178] Artroskopsko popravljanje rotatorske manžete izveden je korišćenjem standardne tri-portalne tehnike kao što je prethodno opisano. Veličina poprečnog preseka cepanja rotatorske manžete procenjena je i snimljena kao što je prethodno opisano<39>. Subkapularna tetiva je bila arthroskopski obrađena sa superiornom granicom tetive 1 cm bočno do glenoidnog laburoma. Supraspinatska tetiva je sakupljena od 1,5 cm od ivice cepanja prije hirurške sanacije. Za imunohistohemijsko bojenje uzorci tkiva odmah su bili fiksirani u 10% (v/v) formalinu u trajanju od 4 do 6 sati, a potom ugrađeni u parafin. Sekcije su sečene do debljine 5mm pomoću mikrotoma Leica-LM (Leica Microsystems, Germany) i stavljene na staklene pločice Superfrost Ultra Plus (Gerhard Menzel, Germany). Parfin je uklonjen iz tkiva sa ksilenom, rehidriran u snažnom alkoholu i korišten za histološko i imunohistohemijsko bojenje po ranije ustanovljenim metodologijama<40>.
[0179] Ljudske ćelije izvedene iz tetiva su eksplantirane tkiva tetive kolena od 5 pacijenata (starosti od 18-30 godina) podvrgnutim rekonstrukciji ACL tetive kolena. Kulture su održavane na 37°C u vlažnoj atmosferi od 5% CO2u trajanju od 28 dana. Ćelije su subkultivisane i tripinizovane u subkonfluenciji, ćelije iz 3 i 4 prolaza korišćene su u normoksičnim uslovima.
Histologija i imunohistohemijske tehnike
[0180] Ljudske sekcije su obojene hematoksilinom i eozinom i toluidin plavom za određivanje stepena tendinopatije, kao što je procenjeno modifikovanom verzijom Bonar ocenjivanja ( stepen 4 = obeležena tendinopatija, stepen 3 = napredna tendinopatija, 2 = umerena degeneracija 1 = blaga degeneracija 0 = normalna tetiva). Ovo uključuje prisustvo ili odsustvo edema i degeneracije zajedno sa stepenom fibroblastne celularnosti i hondroidne metaplazije. Nakon toga, sekcije su obojene antitelima uperenim protiv sledećih markera: - IL-33 (Alexis, monoklonski mišji), ST2 (Sigma Aldrich, poliklonski zečji), IL-1RaCP (ProSci, poliklonski zečji) CD68 (pan makrofagi), CD3 T ćelije), CD4 (T helper ćelije), CD206 (M2 makrofagi) i triptaze mastocitnih ćelija (mast ćelije) (Vector Labs).
[0181] Endogena peroksidna aktivnost je ugašena sa 3% (v/v) H2O2, a nespecifična veziva antitela blokirana su sa 2,5% konjskog seruma u TBST puferu tokom 30 minuta. Uzimanje antigena nazad je izvršeno u 0,01M citratnom puferu tokom 20 minuta u mikrotalasnoj peći. Sekcije su inkubirane sa primarnim antitelima u 2,5% (v/v) konjskom serumu/ljudskom serumu/TBST na 4°C preko noći. Posle dva pranja, pločice su inkubirane pomoću Vector ImmPRESS reagensa, u skladu sa uputstvima, tokom 30 minuta. Pločice su isprane i inkubirani pomoću Vector ImmPACT DAB hromagenskog rastvora 2 minuta, nakon čega sledi opsežno pranje. Konačno, sekcije su kontra-obojene sa hematokilinom. Uključene su i pozitivne (ljudsko tkivo krajnika) i negativni kontrolni uzorci, pored hirurških uzoraka za svaku pojedinu tehniku za bojenje antitela. Propust primarnog antitela i upotreba izotipa negativne kontrole potvrdili su specifičnost bojenja.
[0182] Primenili smo sistem bodovanja baziran na prethodnim postupcima<42>za kvantifikaciju imunohistohemijskog bojenja. Deset slučajnih polja visoke snage (x400) su procenjena sa tri nezavisna procenjivača (NLM, JHR, ALC). U svakom polju je broj pozitivnih i negativno obojenih ćelija prebrojan, a procenat pozitivnih ćelija je izračunat, prateći sledeće polukvantitativno ocenjivanje; stepen 0 = bez mrlja, stepen 1 = <10% ćelija pozitivno obojeno, 2 = 10-20% ćelija pozitivno obojeno, stepen 3 => 20% ćelija pozitivno.
[0183] Sekcije miša obrađene su korišćenjem gore navedenog protokola sa antitelima usmerenim protiv sledećih markera: - IL-33 (R & D sistemi, monoklonalni miš), ST2 (Sigma Aldrich, poliklonski zečji), F4/80 (Serotec, monoklonski mišji) i AntiHistamine (Sigma Aldrich, poliklonski zečji).
Regulacija matrica
[0184] Tenociti su procenjeni za imunocitohemijsko bojenje kolagena 1 i kolagena 3 za procenu produkcije matrica (Abcam). Ukupan rastvorljiv kolagen je meren od supernatanta ćelijske kulture pomoću Sircol kompleta za analizu (Biocolor Ltd, Carrickfergus, Northern Ireland) prema protokolu proizvođača.1 ml reagensa za cirkulaciju boje je dato na 100 ml uzorka i pomešano 30 minuta na sobnoj temperaturi. Kompleks kolagena i boje je precipitiran centrifugiranjem na 10.0003 g tokom 10 min; i zatim opran dva puta sa 500 ml etanola. Pelet je rastvoren u 500 ml alkalnog reagensa. Apsorbancija je merena na 540 nm pomoću čitača mikroploča.
[0185] Kalibraciona kriva je postavljena na osnovu standarda kolagena koji je pružio proizvođač. Pored toga, koncentracija ljudskog i mišjeg kolagena 1 i 3 procenjena je korišćenjem ELISA sa promenom boje merenom na 450 nm čitaču mikroploča zajedno sa standardima datim od strane proizvođača (USCNK Life Science Inc).
Eksperimenti signalizacije
[0186] Status fosforilacije mitogen-aktiviranih proteinskih kinaza (MAPK), kinaza regulisanih ekstracelularnim signalom (ERK1/2), c-Jun N-terminalnih kinaza (JNKs) i p38 izoformi su evaluirani korišćenjem ljudsk Fospho-MAPK Array (R & D Systems Europe, UK) prema uputstvima proizvođača. ERK inhibitor (FR180204) je nabavljen od CalbioChem-a (Merck KGaA, Germany) i korišćen je na IC50= 10mM, koncentracija koja je prethodno bila određena da nudi optimalnu specifičnu inhibiciju u odnosu na efekte pored mete koji su prethodno korišteni u našoj laboratoriji.
[0187] Fosforilacija NFKβ p65 je procenjena pomoću ELISA instantona u ćelijskim lizatima od tretiranih i netretiranih tencocita. Apsorbancija je merena na 450 nm pomoću čitača mikroploča sa pozitivnim i negativnim kontrolama koje je isporučio proizvođač. Relativna apsorpcija stimulisanih naspram neistimulisanih ćelija korišćena je za procenu ukupnog ili fosforilisanog NFKβ p65 u svakom uzorku.
RNK ekstrakcija i kvantitativna PCR
[0188] Ćelije izolovane od normoksičnih i hipoksičnih eksperimenata Trizol pre ekstrakcije mRNK. QIAgen mini kolone (Qiagen Ltd, Crawley UK) su korišćene za čišćenje RNK sa inkorporiranim na koloni DNKaza koracima prema uputstvima proizvođača. cDNK je pripremljen od uzoraka RNK prema AffinityScript™ (Agilent Technologies, CA, USA) komplet za sintetizaciju cDNK višestruke temperature prema uputstvima proizvođača. PCR u realnom vremenu izvršen je korišćenjem SYBR green ili Taqman FastMix (Applied Biosystems, CA, USA) prema tome da li je sonda primenjena sa prajmerima. cDNK je razblažena 1 u 5 koristeći vodu bez RNazae. Svaki uzorak je analiziran u tri primerka. Prajmeri (Integrated DNK Technologies, Belgium) su sledeći: GAPDH, 5’-TCG ACA GTC AGC CGC ATC TTC TTT-3’ (f) i 5’ -ACC AAA TCC GTT GAC TCC GAC CTT-3’ (r); IL-33 ljudski GGA AGA ACA CAG CAA GCA AAG CCT (f) TAA GGC CAG AGC GGA GCT TCA TAA (r); IL-33 mišji GGA AGA ACA CAG CAA GCA AAG CCT (f) TAA GGC CAG AGC GGA GCT TCA TAA (r); Total ST2 ljudski ACA ACT GGA CAG CAC CTC TTG AGT (f) ACC TGC GTC CTC AGT CAT CAC ATT (r); sST2 mišji CCA ATG TCC CTT GTA GTC GG (f) CTT GTT CTC CCC GCA GTC (r), TCC CCA TCT CCT CAC CTC CCT TAA T (sonda) ; ST2L mišji TCT GCT ATT CTG GAT ACT GCT TTC, TCT GTG GAG TAC TTT GTT CAC C (r) AGA GAC CTG TTA CCT GGG CAA GAT G (sonda); ljudski ST2L ACA AAG TGC TCT ACA CGA CTG (f) TGT TCT GGA TTG AGG CCA C (r) ; CCC CAT CTG TAC TGG ATT TGT AGT TCC G (sonda); ljudski sST2 GAG ACC TGC CAC GAT TAC AC (f) TGTTAAACCCTGAGTTCCCAC (r),CCC CAC ACC CCT ATC CTT TCT CCT (sonda); Col 3A ljudski TTG GCA GCA ACG ACA CAG AAA CTG (f) TTG AGT GCA GGG TCA GCA CTA CTT (r) Col 3A mišji GCT TTG TGC AAA GTG GAA CCT GG (f) CAA GGT GGC TGC ATC CCA ATT CAT (r); COL 1A1 ljudski CCA TGC TGC CCT TTC TGC TCC TTT (f) CAC TTG GGT GTT TGA GCA TTG CCT (r) COL 1A1 mišji TTC TCC TGG CAA AGA CGG ACT CAA (f) GGA AGC TGA AGT CAT AAC CGC CA (r)
[0189] Izolovanje RNK i kvantitativna realna vremenska PCR analiza miRNK Total RNK izolovana je pomoću miRNeasy kompleta (Qiagen). MiScript Reverse Transcription Kit (Qiagen) je korišćen za pripremu cDNK. TaqMan mRNK testovi (Applied Biosystems) ili miScript praijmer testovi (Qiagen) su korišćeni za polkvantitativno određivanje eksprimiranja ljudskih miR-29a(MS (MS00001701) 29b (MS00006566) i c (MS00009303) i mišjih 29a (MS00003262), 29b(MS00005936) i c (MS00001379). Eksprimiranje U6B male nuklearne RNK ili beta-aktina korišćeni su kao endogene kontrole.
Kvantifikacija alternativnih poliadenilovanih kolagenskih transkripata
[0190] Apsolutni nivoi dugih i kratkih 3'UTR oblika transkripta tipa 1 i 3 su određeni pomoću k-PCR u odnosu na standarde. cDNK je generisana pomoću AffinityScript (Agilent) sa slučajnim heksamernim i oligo-dT prajmerima. SIBR green Quantitative-PCR je izvršen primenom sledećih prajmera: uzorci su normalizovani do GAPDH endogene kontrole. Col1a2_S FW 5’ GCCTGCCCTTCCTTGATATT 3’ Col1a2_S REV 5’TGAAACAGACTGGGCCAATG 3’ col1a2_FW 5’ TCAGATACTTGAAGAATGTTGATGG 3’ col1a2_L REV 5’ CACCACACGATACAACTCAATAC 3’ Col1a1_S FW 5’ CTTCACCTACAGCGTCACT 3’ Col1a1_S REV 5’ TTGTATTCAATCACTGTCTTGCC 3’ col1a1_T FW 5’ CCACGACAAAGCAGAAACATC 3’ col1a1_L REV 5’ GCAACACAGTTACACAAGGAAC 3’ COL3A1_S FW 5’ CTAT- GACATTGGTGGTCCTGAT 3’ COL3A1_S REV 5’ TGGGATTTCAGATAGAGTTTGGT 3’ COL3A1_L FW 5’ CCAC- CAAATACAATTCAAATGC 3’ COL3A1_L REV 5’ GATGGGCTAGGATTCAAAGA 3’
3'Rapidno produženje cDNK krajeva (RACE)
[0191] Za karakterizaciju ljudskih sekvenci, 3'RACE je izvršeno na cDNK koja je generisana iz ukupne RNK izolovane iz ljudskih tenocita pomoću MiRscript II kompleta reverzne transkriptaze (Qiagen). cDNK krajevi se pojačavaju pomoću PCR korišćenjem sledećih gena specifičnih prednjih prajmera navedenih ispod, zajedno sa Univerzalnim obrnutim prajmerom iz kompleta.
[0192] Ljudski 3'RACE genski specifični prednji prajmeri:
RACE-Col1a1-L FW 5’ GACAACTTCCCAAAGCACAAAG 3’
RACE-Collal-S FW 5’ CTTCCTGTAAACTCCCTCCATC 3’
RACE-Col1a2-L FW 5’ TCTTCTTCCATGGTTCCACAG 3’
RACE-Col1a2-S FW 5’ CCTTCCTTGATATTGCACCTTTG 3’
RACE-Col3a1-L FW 5’ CTATGACATTGGTGGTCCTGAT 3’
RACE-Col3a1-S FW 5’ GTGTGACAAAAGCAGCCCCATA 3’
[0193] Za karakterizaciju konjskih sekvenci, 3'UTRs transkripcija Col1a1, Col1a2 i Col3a1 eksprimiranih u konjskim tenocitima je pojačana korišćenjem 3'Rapidnog produženja cDNK krajeva (3'RACE). Ojačani fragmenti cDNK-a su sekvencirani i poli signal se identifikuje u skladu sa lokacijom AATAAA kanonskog polyA signala koji se nalazi na 10 i 30 nukleotida 5' do polyA repa.
[0194] Konjski 3'RACE prajmeri:
Konjski col1a1 GSP1 CCCTGGAAACAGACAAACAAC
Konjski collal GSP2 CAGACAAACAACCCAAACTGAA
Konjski col1a2 GSP1 GCTGACCAAGAATTCGGTTTG
Konjski cola2 GSP2 ACATTGGCCCAGTCTGTTT
Konjski col3a1 GSP1 AGGCCGTGAGACTACCTATT
Konjski col3a1 GSP2 CTATGATGTTGGTGGTCCTGAT
Konjski col1a1 q-PCR fw CAGACTGGCAACCTCAAGAA
Konjski col1a1 q-PCR rev TAGGTGACGCTGTAGGTGAA
Konjski colla2 q-PCR fw GGCAACAGCAGGTTCACTTAT
Konjski colla2 q-PCR Rev GCAGGCGAGATGGCTTATTT
Konjski col3a1 q-PCR fw CTGGAGGATGGTTGCACTAAA
Konjski col3a1 q-PCR rev CACCAACATCATAGGGAGCAATA
[0195] Dobijeni PCR proizvodi su klonirani u pCR2.1 TOPO (Invitrogen) i sekvencionisani.
Transfekcija iRNK
[0196] Ćelije su transfektovane sintetičkom zrelom miRNK za miR 29 a&b ili sa negativnom kontrolom (C. elegans miR67 mimik obeležen sa Dy547, Thermo Scientific Inc) u konačnoj koncentraciji od 20nM uz upotrebu Dharmacon® DharmaFECT® 3 siRNK transfekcionih reagensa (Thermo Scientific Inc).
48 sati posle transfekcije, ćelijski lizati su sakupljeni kako bi se analiziralo eksprimiranje željenih gena.
[0197] Efikasnost transfekcije je procenjena protočnom citometrijom pomoću označenog Dy547 mimika i potvrđena kvantitativnim PCR kontrolisanim mimikom i odgovarajućim mimikom miR29 porodice.
Analiza reportera luciferaze za ciljanje kolagena 1 i 3 i rastvorljivof ST2
[0198] Ljudsko 2 miRNK ciljano mesto generisano je kaljenjem oligozoma: za COL1 i 3 i rastvorljivi ST2 3'UTR' koji su bili klonirani u oba smisla i anti-sens orijentacije nizvodno od gena luciferaze u pMIR-REPORT vektoru luciferaze (Ambion). Ovi konstrukti su sekvencirani za potvrđivanje umtaka i nazvani pMIR-COL I/COL III/ sST2miR29a/b/c and pMIR(A/S) - COL I/COL III/ sST2-miR29a/b/c, i korišćeni za transfekciju HEK293 ćelija. HEK293 ćelije su kultivisane u 96-komoričnim pločama i transfektovane sa 0,1 mg bilo pMIR-COL I/COL III/ sST2-miR29a/b/c, pMIR(A/S)-COL I/COL III/ sST2-miR29a/b/ili or pMIR-REPORT, zajedno sa 0,01 mg pRL-TK vektora (Promega) koji sadrže renilnu luciferazu i 40 nM miR-155 ili maskiranu miRNK (Thermo Scientific Dharmacon®). Transfekcije su izvršene pomoću efektena (Qiagen) prema uputstvima proizvođača. Dvadeset četiri sata posle transfekcije aktivnost luciferaze je merena pomoću Dual-Luciferase Reporter Assay (Promega).
3'UTR ljudskog sST2 je amplificiran iz genomske DNK pomoću sledećih prajmera sST2fw 5’AGTTTAAACTGGCTTGAGAAGGCACACCGT3’ i sST2rev 5’AGTCGACGGGCCAAGAAAGGCTCCCTGG3', koji su stvorili PmeI i SalI mesta, respektivno. Ova mesta su korišćena za kloniranje PCR amplifikovanog proizvoda na istim lokacijama pmiRGLO (Promega). Semenske regije dva Targetskena predvidela su miR29a MRE mesta: 29-1 i 29-2 mutirani su pomoću QuickChange kompleta za mutagenezu usmerenu na mestu (Agilent). Svaki vektor zajedno sa miR29a ili maskirnaim kontrolnim mimikom transfektovani su u HEK293 ćelije koristeći Attactene (Qiagen) prema uputstvima proizvođača. Posle 24 sata aktivnost luciferaze je merena pomoću DualGlo testa luciferaze (Promega), i aktivnost luciferaze normalizovana je do Renilla. Normalizovana aktivnost luciferaze izražena je kao procenat maskirane kontrole za iste konstrukte.
Proizvodnja citokina
[0199] Test 25-Plex citokina kod ljudi procenio je in vitro kvantitativno određivanje 25 odvojenih ljudskih citokina korišćenjem Luminex tehnologije. Supernatanti (n = 3)
Patelarni model povrede tetive
[0200] U pripremi za hiruršku proceduru, miševi su anestezirani sa smešom izoflurana (3%) i kiseonikom (1%) i oba zadnja udova su im obrijana. Tokom hirurške procedure, anestezija je isporučena preko konusa nosa sa nivoom izoflurana smanjenim do 1% sa kiseonikom. Nakon zasecanja kože, dva reza, paralelna sa tetivom, napravljena su u retinakulumu sa svake strane, zatim je postavljen niz ravnih makaza ispod patelarne tetive. Sa oštricama makaza koji služe kao podrška, biopsijsko sečivo prečnika 0.75mm (World Precision Instruments) korišćeno je za stvaranje delimične transekcije debljine u desnoj patelarnoj tetivi. Leva patelarna tetiva je podvrgnuta lažnoj proceduri koja se sastojala samo od postavljanja plastične podloge ispod tetive bez stvaranja i povrede. Rane kože bile su zatvorene pomoću kožnih spajalica i miševi su žrtvovani na 1 dan, 3 dana i 7 i 21 dana posle operacije. Miševi su žrtvovani udisanjem CO2i odmah su ponderisani. Koriste se miševi iz dve grupe BALB/c kontrola (CTL) i ST2-/- BALB/c. Svaka grupa sadrži 16 miševa (n = 8 ST2-/- BALB/c i 8 BALB/c) po vremenskoj tački. Ovi eksperimenti su ponovljeni u 4 zasebne prilike.
[0201] Kako bi se testiralo da li je IL-33 indukovao poremećaj matrica tetive, uspostavljen je model injekcije citokina. IL-33 je testiran u prethodno opisanom modelu koji je prvobitno opisan za primenu IL-23 ili IL-2244-45. ST2-/- miševi (n = 4/grupa/tretman/eksperiment) su injektirani i.p. dnevno sa IL-33 (0,2 mg po mišu razblaženo u 100 mL PBS) na dane -3, -2, -1 i dan povrede.24 sata nakon finalne injekcije, miševi su odabrani prema protokolu. Kontrolni miševi slično su dobili jednaku količinu PBS. Takođe smo testirali neutralizujuća antitela na IL-33 (0,5mg/ml R & D sistem) injektiranjem i.p odmah nakon povrede kod WT i ST2-/- miševa sa IgG kontrolama ponovo sa 4/grupom/tretmanom/eksperimentom.
Biomehanička analiza
[0202] Za biomehaničku analizu patelarne tetive miševa iz svake grupe bile su povređene, i osam miševa žrtvovano je u jednoj od tri vremenske tačke za mehanička ispitivanja kao što su prethodno opisali Lin i et al. Ukratko, patelarne tetive su bile isečene i očišćene, ostavljajući samo patelu, patelarnu tetivu i tibiju kao jednu jedinicu. Širina i debljina tetive su zatim kvantifikovani i površina poprečnog preseka je izračunata kao proizvod njh dve. Tibija je ugrađena u Isopon p38 (High Build Cellulose Filler) u prilagođenom dizajniranom uređaju i osigurana u mestu u metalnoj stezaljki. Patela je držana na mestu pomoću stezaljki koje se koriste sa BOSE ElectroForce® 3200 test instrumentom. Svaki uzorak tetive prošao je sledeći protokol uronjen u 370C kupku slanog rastvora – opterećen na 0,02N, uanpred kondicioniran za 10 ciklusa od 0,02 do 0,04 sa brzinom od 0,1%/s (0,003mm/s) i držan tokom 10s.
Odmah nakon toga, eksperiment relaksacije stresa obavljen je izduženjem tetive do istezanja od 5% (.015mm) sa stopom od 25% (0.75mm/s), nakon čega je usledila relaksacija tokom 600s. Konačno, granica pucanja je primenjena brzinom od 0,1%/s (0,003 mm/s). Iz ovih testova utvrđena je maksimalno napetost i izračunati su moduli korišćenjem linearne regresije iz skoro linearnog područja krive naprezanja.
In vivo primena miR29a mimika
[0203] Pripremljen je transfekcioni kompleks koji sadrži 150ng/ml miR-29a mimike, 9mg/ml polietilenimin (PEI) i 5% glukozu. 50ml ovog kompleksa ubrizgano je u tetivu miševa odmah nakon operacije. Životinje su žrtvovane nakon 1 i 3 dana i colla1 i col3a1 mRNK i nivo proteina su mereni. Fluorescentno označeni miR-29a mimik je korišćen za procenu in vivo distribucije miR-29a mimika u tetivi imunofluorescencijom, koristeći kontrastne forme za faloidin (da pokaže citoskeletnu strukturu) i jezgre (DAPI).
[0204] MiR29a mimik je bio sledeći:
Putnik lanac:
mAmCrCmGrAmUrUmUrCmArGmArUmGrGmUrGmCrUmAdG
Vodič lanac:
/ 5Phos/rUrArGrCrArCrCrArUrCrUrGrArArArUrCrGrGmUmUmA
/ 5Phos/= 5' fosfat
mA = 2'O-metil adenozin ribonukleotid;
mC = 2'O-netil citozin ribonukleotid;
mG = 2 'O-metil-guanin ribonukleotid;
mU = 2 'O-metil uracil ribonukleotid;
rA = adenozin ribonukleotid;
rC = citosin ribonukleotid;
rG = guanin ribonukleotid;
rU = uracil ribonukleotid;
Statistička analiza
[0205] Svi rezultati su prikazani kao srednja /- standardna greška (SEM), a sve statističke analize izvršene su testom T test, ANOVA testom ili Mann Vhitnei testom, kao što je prikazano u legendama slika, koristeći softver Graph Pad Prism 5. Vrednost p <0.05 se smatra statistički značajnom.
Rezultati
IL-33 i ST2 eksprimiranje kod ljudske tendinopatije
[0206] Prvo smo istražili eksprimiranje IL-33 kod ljudskoj tendinopatiji koristeći naš ranije razvijen model. IL-33, rastvorljivi i membranski ST2 transkripti su značajno regulisani na gore u ranoj tendinopatiji u poređenju sa kontrolisanim biopsijama ili biopsijama iscepane tetive (Slika 1A-C). U ranim tendinopatskim tkivima primećeno je znatno veće bojenje za IL-33 i ST2 u poređenju sa iscepanom tetivom ili kontrolnim biopsijama (Slika 1D). Bojenje je bilo istaknuto u endotelijalnim ćelijama, posebno u fibroblastim ćelijama, tj. na tenocite koji se smatraju ključnim za regulaciju rane tendinopatije (podaci nisu prikazani). Paralelno, in vitro kultivisani tenociti su eksprimirali nuklearni IL-33 koji je bio regulisan na gore na nivoima mRNK i proteina nakon stimulacije od strane TNF i IL-1β (Slika 1E i podaci nisu prikazani). Suprotno tome, ST2 je konstitutivno eksprimiran i kod odmorenih i kod neostimulisanih tenocita (podaci nisu prikazani).
IL-33 reguliše matricu kolagena tenocita i sintezu proupalnih citokina
[0207] Disregulacija matrica prema eksprimiranju kolagena 3 je ključna rana fenotipska promena kod tendinopatije, čime se ubrzava popravak; kolagen 3 je međutim bioomehanički inferioran. IL-33 indukovana doza i vremenski zavisna regulacija na gore ukupnog proteina kolagena (podaci nisu prikazani), uzimajući u obzir povećano eksprimiranje tipa 1, ali naročito tipa 3 kolagena mRNK i proteina (Slika 1F, G). Nakon analize nizova (podaci nisu prikazani) i konzistentno sa prijavljenom signalizacijom IL-33, ovo je ukinuto ERK inhibicijom (podaci nisu prikazani). rhIL-33 takođe značajno povećava proizvodnju IL-6, IL-8 i MCP-1 (podaci nisu prikazani), što je regulisano inhibicijom NF-kB što ukazuje na to da IL-33 deluje u tenocitima putem kanonskog signalnog puta IL-1R (podaci nisu prikazani). Nasuprot tome, nismo uticali na proizvodnju drugih citokina u skladu sa prethodno prijavljenim profilima proizvodnje citokina indukovanim IL-33 u fibroblastima<20-23>.
Modeliranje IL-33/ST2 puta in vivo nakon povrede tetive
[0208] Ove opservacije smo proširili na dobro ustanovljen in vivo model povrede tetive. IL-33 mRNK je povišen na dane 1 i 3 nakon povrede tetive kod WT miševa (Slika 2A). Ovo je značajno smanjeno kod povređenih ST2-/- miševa što ukazuje na autokrinološku regulaciju. Rastvorljivi ST2 je značajno bio regulisan na gore u svim vremenskim tačkama nakon povrede kod WT miševa u poređenju sa nepovezanim kontrolama (Slika 2B), dok je mRNK membranskog ST2 povećana samo pomoću povrede trećeg dana (podaci nisu prikazani). Nije bilo značajnih promena u IL-33 ili ST2 transkriptu ili eksprimiranju proteina kod WT miševima na dane 7 ili 21 posle povrede, ili za IL-33 eksprimiranje kod miševima ST2-/-, što ukazuje na to da je uticaj eksprimiranja IL-33 manifestovan ranije, u skladu sa aktivnošću tipa „alarmin“ u povredi/popravku tetive.
[0209] Analiza sinteze kolagena otkrila je značajno veće eksprimiranje kolagena 3 u svim vremenskim tačkama posle povrede kod WT miševa u poređenju sa nepovezanim kontrolama ili povređenim ST2-/-miševima (Slike 2E, F i podaci nisu prikazani). Kolagen 1 je prvobitno bio regulisan na dole (dani 1, 3) na nivoima mRNK (Slika 2C) kod povređenih miševa WT, ali se vratio na nivo pre povreda na dane 7 i 21 (podaci nisu prikazani) sa sličnim trendom eksprimiranja kolagen 1 proteina (Slika 2D). Nasuprot tome, povređeni miševi ST2-/- pokazali su produženo smanjenje sinteze kolagena 1 (dani 1, 3 i 7), vraćajući se na početnu vrednost tek na dan 21 (podaci nisu prikazani). Najvažnije, povreda tetivi WT miševa rezultovala je značajnim smanjenjem biomehaničke jačine na dan nakon povrede u poređenju sa ST2-/- (Slika 2G) koja se oporavila do dana 7 i 21 (podaci nisu prikazani). Ovi podaci ukazuju na izmenjenu sintezu kolagene matrice kod ST2-/- miševa koji implicira IL-33/ST2 kao rani modulator kolagenskih promena u povredi tetive koja ima biomehanički značaj.
Manipulisanje IL-33 modifikuje kolagen 3 in vivo
[0210] Kako bismo potvrdili ovu mogućnost, pokušali smo direktno da modifikujemo biologiju efektora IL-33 in vivo. Primena rhIL-33 nije uticala na sintezu kolagena 1 (Slika 3A, B), ali je značajno povećala sintezu kolagena 3, posebno kod povređenih tetiva (Slika 3D, E i podaci nisu prikazani). Šta više, administracija rhIL-33 značajno je smanjila maksimalnu jačinu tetive u svim vremenskim tačkama nakon injekcije kod WT miševa (Slika 3E i podaci nisu prikazani) što ukazuje na to da su takve promene bile funkcionalne. Primena IL-33 nije uticala na sintetizaciju kolagene matrice ili na konačnu jačinu tetive ćelija zarastanja kod ST2-/- miševa potvrđujući da je IL-33 delovao putem ST2-zavisnog puta (podaci nisu prikazani).
[0211] Zatim smo direktno ciljali IL-33 in vivo. Neutralizujuća antitela na IL-33 su oslabile kolagen 1 do 3 na dane 1 i 3 nakon povrede kod povređenih WI miševa (Slika 3F-I), što je rezultovalo značajnim povećanjem biomehaničke jačine tetive WT miševa (Slika 3J). Ovaj efekat nije viđen na kasnijim vremenskim tačkama (podaci nisu prikazani). U kontrolnim eksperimentima nismo imali efekta na ST2-/- miševe (podaci nisu prikazani) koji dodatno potvrđuju doprinos endogenog IL-33 na tendinopatiju izazvanu povredama.
IL-33 promoviše diferencijalnu regulaciju kolagena 1/3 preko miR-29 kod tenocita
[0212] Nakon što smo ustanovili da IL-33 vodi diferencijalnu regulaciju kolagena 1 i 3 u tenocitima, postavili smo mehanističku ulogu za mrežu miRNK u ovom procesu. Prethodne studije su pokazale da miR-29 familija direktno cilja na brojne gene ekstracelularnih matrica, uključujući kolagene tipa 1 i 3 i uključena je u regulaciju urođenog i adaptivnog imuniteta<26>. Računarski algoritmi predviđaju da miR-29 može takođe da cilja sST2. Utvrdili smo da su svi članovi porodice miR-29 eksprimirani u biopsijama ljudskih tetiva i eksplantiranih tenocita (Slika 4A) sa miR29a koji pokazuju najviše izmenjeno eksprimiranje. Kod kulture tenocita, IL-33 je značajno smanjio eksprimiranje miR-29a na 6, 12 i 24 sata (Slika 4B), koja je delovala preko NFκB zavisnog signala, dok smo posmatrali nedosledne efekte na miR-29b i c (podaci nisu prikazani). S obzirom da su promene matrice posredovane sa IL-33, mogle biti regulisane sa miR-29a, analizirali smo funkcionalne efekte manipulacije miR-29a na sintezu kolagene matrice in vitro. Prvo, korišćenjem testova luciferaze, potvrdili smo da miR-29a direktno cilja cola 1a1 i 3a1 kao što je prethodno pokazano<27>(Slika 7B). Takođe smo primetili prethodno neprepoznatu interakciju sa transkriptom podjedinice col 1a2 (Slika 7). Kako bismo testirali da li miR-29a zaista reguliše nivoe kandidata ciljanih mRNK u relevantnim ćelijama koje su relevantne za bolesti, transfektovali smo tenocite sa miR-29a mimikom i antagomirom. miR-29a manipulacija selektivno reguliše kolagen 3, ali ne kolagena 1 mRNK i eksprimiranje proteina u primarnim tenocitima (Slika 4C, D). Šta više, prekomerno eksprimiranja miR-29a značajno je ukinulo IL-33 indukovanu kolagen 3 mRNK i sintezu proteina (Slika 4E). Pored toga, miR-29a inhibicija je rezultovala značajnim povećanjem eksprimiranja col 3a1 što pokazuje da miR-29a ne samo da aktivno reguliše ove transkripte u ljudskim tenocitima, već da je njegov gubitak važan faktor u povećanju proizvodnje kolagena tipa 3 koji je primećen kod tendinopatije. Za razliku od toga, nivoi transkripta col 1a1 su nepromenjeni (Slika 4I).
[0213] S obzirom na to da je miR-29a bio sposoban da potisne col 1a1 i 1a2 sa jednakom ili većom efikasnosti od kolagena 3 u testovima reportera luciferaze, malo je verovatno da je to rezultat miR-29a koji ima veći afinitet za svoje MRE u transkriptima tipa 3 (Slika 4F). Jedno dobro dokumentovano mehanističko objašnjenje transkripta kako bi modulisalo njihovu osetljivost na miRNK regulaciju je korišćenjem alternativnih poliadenilacionih signala (Slika 4G). Da bismo to testirali, uporedili smo nivoe transkripata sa punim dužinama (miR-29a) sa ukupnim nivoima pomoću q-PCR (Slika 4H) koji pokazuju da u tenocitima, manje od 5% transkripta col 1a1 i 1a2 koriste distalni signal poliadenilacije dok ga većina transkripta col 3a1 koristi.
[0214] To je potvrđeno zahvaljujući 3' rapidnoj amplifikaciji krajeva cDNK (RACE) (Slika 7E), što potvrđuje da col 1a1 i 1a2, ali ne i col 3a1, koriste prethodno neprepoznatljive signale poliadenilacije (Slika 4G). Dobijenim skraćenim 3'UTR nedostaju miR29a MRE. (Biće prihvaćeno da su sekvence prikazane na Slici 7E cDNK sekvence, odgovarajuće mRNK sekvence bi naravno sadržale U umesto T.) Ovi podaci sugerišu da u tenocitima miR-29a specifično reguliše col 3a1, dok su col 1a1 i col la2 neosetljivi na inhibiciju miR-29a usled korišćenja alternativnih poliadenilacionih signala. Na ovo korišćenje alternativnih poliadenilacionih signala nije uticalo prisustvo IL-33 (podaci nisu prikazani). Gubitak miR-29a po signalizaciji IL-33 rezultuje depresijom kolagena 3 koji verovatno doprinosi povećanjem ovog kolagena uočenim kod povređenih tetiva.
[0215] Rezultati 3'RACE iz ljudskih tenocita otkrili su dva col 3a1 UTR, od kojih kraći [označena kao Col3a1 (kratki 3'UTR) na Slici 7E] sadrži jedan miR-29a MRE, dok duži sadrži dva. Oba su regulisana sa miR-29a kao što je prikazano na slici 7D.
[0216] Karakterizacija 3'UTR transkripata Col1a1, Cola2 i Col3a1 izražena u tenocitima konja pokazala je da koriste iste konzervirane polyA signale koji se koriste u ortolognim transkriptima kolagena izraženim u ljudskim tenocitima. Kod col1a1 i cola2, upotreba ovih proksimalnih polyA signala dovodi do transkripta sa 3'UTRs koji su između 100 i 350 nukleotida dužine i koji ne sadrže mesta vezivanja miR-29 i stoga neosetljivi na regulaciju ovom miRNK. Nasuprot tome, oba col 3'UTRs sadrže mesta vezivanja miR-29 što ih čini osetljivim na regulaciju miR-29.
Rastvorljivi ST2 je direktna meta miR-29
[0217] Računarska analiza otkrila je da rastvorljivi ST2 može biti ciljan od strane miR-29a što ukazuje na izvodnu regulatornu ulogu u efektorskim funkcijama IL-33. Generisan je luciferazni reporter gen koji sadrži 3'UTR ljudskog sST2 koji je predviđen da poseduje dva potencijalna mesta vezivanja miR-29abc. Ko-transfekcija sST2-luciferaza reporter plazmida sa miR-29 mimicima rezultovala je značajnim smanjenjem aktivnosti luciferaze u odnosu na maskiranu kontrolu (Slika 7B) Dalje, aktivnost luciferaze je bila potpuno obnavljena kada su regioni semena oba miR-29 MRE u sST2 mutirani, demonstrirajući konačno da je sST2 direktna meta miR-29a (Slika 5A). Kako bi ispitali da li miR-29a zaista reguliše nivoe mRNK ciljane mRNK u tenocitima, ponovo smo transfektovali miR-29a mimik i antagomir u ljudske tenoceite. Rastvorljiva ST2 poruka je značajno (p <0,01) promenjena transfekcijom sa miR-29a mimik/antagomirom za približno 5 puta (Slika 5B) sa odgovarajućom značajnom promenom u rastvorljivom ST2 proteinu koja potvrđuje miR29a kao cilj za rastvorljiv ST2 (Slika 5C).
IL-33/sST2 reguliše eksprimiranje miR-29 u in vivo modelima lečenja tetiva
[0218] Na kraju, ispitivali smo eksprimiranje miR-29a u našem in vivo tendinopatskom modelu. Povreda tetiva kod WT miševa rezultovala je 22 puta smanjenjem miR29a na dan 1 koji se vratio na 6 puta smanjenje (u odnosu na početnu vrednost) do dana 3 (Slika 5D i podaci nisu prikazani) bez značajne razlike do dana 7. Ovaj efekat je značajno ukinuti kod ST2-/- miševa (podaci nisu prikazani). Pored toga, primena egzogenog rh-IL-33 je smanjila miR-29a eksprimiranje u nepovređenim tetivama u svim vremenskim tačkama u poređenju sa kontrolama injektiranim sa PBS (podaci nisu prikazani). Ovaj efekat je bio najdublji kod povređenih WT miševa, uz dodatak rhIL-33 koji posreduje za još 10 puta smanjenje miR-29a (Slika 5E). Dodavanje rhIL-33 kod ST2-/- miševa nije imalo značajnog uticaja na miR-29a eksprimiranje u povređenim ili nepovređenim tetivama, što ponovo ukazuje na to da miR-29a regulacija na dole delimično direktno posreduje zavisnom signalizacijom IL-33/ST2. Dodavanje neutralizujućeg antitela na IL-33 značajno je smanjilo efekat povrede na eksprimiranje miR-29a na dane 1 i 3 nakon povrede (Sl.5F).
In vivo primena miR29a mimika kod modela povrede patelarne tetiva
[0219] MiR-29a mimik je isporučen tenocitima u WT mišem patelarnim tetivama direktnim ubrizgavanjem kompleksa miR-29a/PEI. Imunofluorescentno bojenje mimika (crveno), kontrabojenje sa faloidinom (zeleno, za citoskeletnu strukturu) i DAPI (kako bi se pokazala jezgra) korišćeno je za vizualizaciju lokalizacije mimika oko tenocita u 24 sati nakon injekcije miR-29a mimika (nije prikazano). Kao što je prikazano na Slici 8, kolagen 3 mRNK i nivo proteina su značajno smanjeni u tetivama ubrizganim miR-29a mimikom u poređenju sa kontrolama. Za razliku od kolagena 1 nivoi su bili nepromenjeni.
Diskusija
[0220] MikroRNK su se pojavile kao moćni regulatori različitih ćelijskih procesa sa važnim ulogama u oboljenju i remodeliranju tkiva. Ove studije koje koriste tendinopatiju kao modelni sistem po prvi put otkrivaju sposobnost jedne mikroRNK (miR-29) da unakrsno reguliše upalnu funkciju citokin efektora i regulaciju ekstracelularnih matrica u složenim ranim biološkim procesima koji dovode do obnove tkiva.
[0221] Ovde smo dobili nove dokaze o ulozi IL-33 u inicijalnim koracima koji dovode do važnog kliničkog entiteta tendinopatije. IL-33 od skora postaje sve više povezan sa mišićno-skeletnim patologijama. Naši podaci pokazuju da je IL-33 bio prisutan u biopsijama ljudske tetive u ranoj fazi bolesti, dok biopsije endoskopa imaju značajno manje IL-33 eksprimiranje na nivou poruke i nivou proteina koji promoviše koncept IL-33 kao ranog tkivnog medijatora kod povrede tetiva i naknadnog remodeliranja tkiva. Po ćelijskim povredama signali endogenih opasnosti, tzv. molekularni obrasci povezani sa oštećenjem, oslobađaju nekrotične ćelije, uključujući proteine toplotnog šoka<28>, IMGB1<29>, mokraćnu kiselinu<30>i članove porodice IL1, uključujući IL-33. Ove signale opasnosti kasnije prepoznaju razne imune ćelije koje započinju upale i popravke. Naši podaci impliciraju IL-33 kao alarmin u ranoj tendinopatiji, i što je još važnije, naši biomehanički podaci sugerišu da takvo eksprimiranje ima patogenski relevantnu ulogu. Dodavanje rhIL-33 značajno je smanjilo opterećenje na pucanje kod WT miševa za oko 30% u ranim tačkama, verovatno kao posledica promena matrice kolagena 3 koji dovodi do mehanički inferiorne tetive<35>. Prema tome, jedan verovatan mehanizam za događaje koji posreduju u popravku rane tetive, koji je biomehanički inferioran, može biti da se nakon ponovljene mikro povrede IL-33 reguliše sa njegovim naknadnim oslobađanjem preko mehaničkog stresa/nekroze, što zauzvrat dovodi do degeneracije matrice i proizvodnje pro-upalnog citokina što pokreće tetivu prema patološkom stanju, kao što se vidi u biopsijama rane tendinopatije. Zanimljivo je da je dodavanje neutralizujućih antitela povređenim miševima preokrenulo fenotip kolagena 3, ali je u stanju samo da privremeno poboljša jačinu tetive na dan nakon povrede. Iako ovo može negirati blokiranje IL-33 u dugotrajnim sportskim povredama, repetitivna mikrotrauma povezana sa patološkim promenama tetiva može suprotno omogućiti neutralizaciju IL-33 da deluje kao provera dalje neželjene disregulacije matrice.
[0222] Novije studiju ističu miRNK kao ključnog regulatora funkcije leukocita i mreže citokina dok orkestriraju proliferaciju i diferencijaciju stromalnih linija koje određuju sastav ekstracelularne matrice. Novi zaključak o ulozi miR-29a u regulaciji efekata posredovanih sa IL-33 „alarminom“ pruža mehanički uvid u miRNK unakrsne regulatorne mreže koje uključuju upale i regulaciju matrica u obnovi tkiva. Naši podaci pružaju ubedljiv dokaz za funkcionalnu ulogu miR-29 kao posttranscriptionalnog regulatora kolagena kod mišjih i ljudskih povreda. Regulacija kolagena od strane porodice miR-29 je istaknuta u nekoliko prethodnih studija. Naši rezultati sada pokazuju da miR-29 deluje kao kritički represor koji reguliše kolagenski izraz u lečenju tetiva. Štaviše, njegovo smanjeno eksprimiranje u biopsijama ljudi sugeriše da njegovo funkcionalno smanjenje dozvoljava razvoj tendinopatije. Uprkos tome što se patologija tetiva karakteriše povećanjem količine kolagena 3, što dovodi do biomehaničke inferiornosti i degeneracije, molekularna premisa za ovaj prekid kolagena do sada nije poznata. Prvi put opisujemo da IL-33 indukovani deficit kod miR-29a rezultuje prevelikom produkcijom kolagena 3 dok istovremeno pokreće pokret, putem sST2 inhibicije IL-33, konačno rešenje ovog ranog procesa remonta. Suprotno očekivanjima u ljudskim tenocitima, miR-29 je jedino mogao da utiče na eksrpimiranje col 3a1, a ne kolagena tipa 1. Kasna karakterizacija 3'UTR kolagena tipa 1 i 3 otkrila je prethodno neprijavljen obrazac alternativne poliadenilacije u obe podjedinice tipa 1, što je rezultovalo transkriptima koji nemaju mesta vezivanja miR29a što ih čini neosetljivim za represiju od strane ove miRNK. Ovo nije slučaj kod transkripata kolagena tipa 3, koji zadržavaju obe lokacije za vezivanje miR-29a. U ljudskim tenocitima, kolagen 3 aktivno potiskuje miR-29a, što pokazuje sposobnost inhibitora miR-29a da značajno povećaju nivo kolagena 3, dok je dopunjavanje tenocita sa miR-29a u prisustvu IL-33 dovoljno da inhibira povećanje u proizvodnji kolagena 3. Važno je u našem modelu sistema miR-29a dodatno ciljati IL-33 mamac receptor sST2. Tako gubitak IL-33 eksprimiranja miR-29a rezultuje` istovremenom represijom kolagena 3 i sST2, uz naknadnu auto-regulatornu inhibiciju IL-33 koja promoviše rešenje neposrednog odgovora alarmina.
[0223] Na osnovu ovog rada predlažemo IL-33 kao uticajni alarmin u kliničkoj oblasti rane povrede tetiva i tendinopatije, koja ima nezadovoljene potrebe, što može biti važno u ravnoteži između obnavljanja i degeneracije. Otkrivena je nova uloga miR-29 kao posttranscriptionalnog regulatora matričnih/upalnih gena u lečenju tetive i tendinopatije. Jedno od velikih obećanja eksploatacije miRNK za terapeutske svrhe je potencijal jedne mikroRNK koja reguliše funkcionalno konvergentne ciljane gene. Naše otkriće pojedinačnog mikroRNK zavisnog regulatornog puta u ranom lečenju tkiva naglašava miR-29 zamensku terapiju kao obećavajuću terapeutsku opciju za tendinopatiju sa implikacijama na mnoge druge ljudske patologije u kojima je implicirana matrična disregulacija.
[0224] Iako je pronalazak opisan u vezi sa gore opisanim primerima otelotvorenja, mnoge ekvivalentne modifikacije i varijacije biće očigledne stručnjacima u ovoj oblasti kada se im se da ova objava. Shodno tome, primeri otelotvorenja iz ovog pronalaska se smatraju ilustrativnim, a ne ograničavajućim.
Reference
[0225]
Eming, S.A., Krieg, T. & Davidson, J.M. Inflammation in wound repair: molecular and cellular mechanisms. JInvest Dermatol 127, 514-525 (2007).
McCormick, A., Charlton, J. & Fleming, D. Assessing health needs in primary care. Morbidity study from generalpractice provides another source of information. Bm 310, 1534 (1995) .
Nakama, L.H., King, K.B., Abrahamsson, S. & Rempel, D.M. Evidence of tendon microtears due to cyclical loadingin an in vivo tendinopathy model. J Orthop Res 23, 1199-1205 (2005).
Sharma, P. & Maffulli, N. Tendon injury and tendinopathy: healing and repair. J Bone Joint Surg Am 87, 187-202 (2005).
Millar, N.L., Wei, A.Q., Molloy, T.J., Bonar, F. & Murrell, G.A. Cytokines and apoptosis in supraspinatus tendinopathy. J Bone Joint Surg Br 91, 417-424 (2009).
Pufe, T., Petersen, W., Tillmann, B. & Mentlein, R. The angiogenic peptide vascular endothelial growth factor isexpressed in foetal and ruptured tendons. Virchows Arch 439, 579-585 (2001). Tsuzaki, M., et al. IL-1 beta induces COX2, MMP-1, -3 and -13, ADAMTS-4, IL-1 beta and IL-6 in ljudsk tendoncells. J Orthop Res 21, 256-264 (2003).
Tohyama, H., Yasuda, K., Uchida, H. & Nishihira, J. The responses of extrinsic fibroblasts infiltrating the devitalisedpatellar tendon to IL-1beta are different from those of normal tendon fibroblasts. J Bone Joint Surg Br 89, 1261-1267 (2007).
John, T., et al. Effect of pro-inflammatory and immunoregulatory cytokines on ljudsk tenocytes. J Orthop Res28, 1071-1077 (2010).
Lin, T.W., Cardenas, L., Glaser, D.L. & Soslowsky, L.J. Tendon healing in interleukin-4 and interleukin-6 knockoutmice. J Biomech 39, 61-69 (2006).
Zhang, N. & Oppenheim, J.J. Crosstalk between chemokines and neuronal receptors bridges immune and nervous systems. J Leukoc Biol 78, 1210-1214 (2005).
Schmitz, J. , et al. IL-33, an interleukin-1-like cytokine that signals via the IL-1 receptor-related protein ST2 andinduces T helper type 2-associated cytokines. Immunity 23, 479-490 (2005) .
Gao, P., Wange, R.L., Zhang, N., Oppenheim, J.J. & Howard, O.M. Negative regulation of CXCR4-mediatedchemotaxis by the lipid phosphatase activity of tumor suppressor PTEN. Blood 106, 2619-2626 (2005).
Chen, X., Murakami, T., Oppenheim, J.J. & Howard, O.M. Triptolide, a constituent of immunosuppressive Chineseherbal medicine, is a potent suppressor of dendritic-cell maturation and trafficking. Blood 106, 2409-2416 (2005).
Lamkanfi, M. & Dixit, V.M. IL-33 raises alarm. Immunity 31, 5-7 (2009).
Liew, F.Y., Pitman, N.I. & McInnes, I.B. Disease-associated functions of IL-33: the new kid in the IL-1 family.
Nat Rev Immunol 10, 103-110.
Asirvatham, A.J., Magner, W.J. & Tomasi, T.B. miRNA regulation of cytokine genes. Cytokine 45, 58-69 (2009). 18. Pritchard, C.C., Cheng, H.H. & Tewari, M. microRNA profiling: approaches and considerations. Nat Rev Genet 13, 358-369 (2012).
Matthews, T.J., Hand, G.C., Rees, J.L., Athanasou, N.A. & Carr, A.J. Pathology of the torn rotator cuff tendon.Reduction in potential for repair as tear size increases. J Bone Joint Surg Br 88, 489-495 (2006).
Xu, D., et al. IL-33 exacerbates antigen-induced arthritis by activating mast cells. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 105, 10913-10918 (2008). Zaiss, M.M., et al. IL-33 shifts the balance from osteoclast to alternatively activated macrophage differentiationand protects from TNF-alpha-mediated bone loss. J Immunol 186, 6097-6105 (2011).
Rankin, A.L., et al. IL-33 induces IL-13-dependent cutaneous fibrosis. J Immunol 184, 1526-1535 (2010) .
Palmer, G. & Gabay, C. Interleukin-33 biology with potential insights into ljudsk diseases. Nat Rev Rheumatol7, 321-329.
Ogawa, T., et al. Suppression of type I collagen production by microRNA-29b in cultured ljudsk stellate cells. Biochem Biophys Res Commun 391, 316-321.
Bartel, D.P. microRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell 136, 215-233 (2009). Ma, F., et al. The microRNA miR-29 controls innate and adaptive immune responses to intracellular bacterialinfection by targeting interferon-gamma. Nature immunology 12, 861-869 (2011) .
Maurer, B., et al. microRNA-29, a key regulator of collagen expression in systemic sclerosis. Arthritis Rheum62, 1733-1743 (2010).
Basu, S., Binder, R.J., Suto, R., Anderson, K.M. & Srivastava, P.K. Necrotic but not apoptotic cell death releases heat shock proteins, which deliver a partial maturation signal to dendritic cells and activate the NF-kappa B pathway. Int Immunol 12, 1539-1546 (2000) .
Scaffidi, P., Misteli, T. & Bianchi, M.E. Release of chromatin protein HMGB1 by necrotic cells triggers inflammation. Nature 418, 191-195 (2002).
Shi, Y., Evans, J.E. & Rock, K.L. Molecular identification of a danger signal that alerts the immune system to dying cells. Nature 425, 516-521 (2003).
Chen, C.J., et al. Identification of a key pathway required for the sterile inflammatory response triggered by dyingcells. Nat Med 13, 851-856 (2007).
Eigenbrod, T., Park, J.H., Harder, J., Iwakura, Y. & Nunez, G. Cutting edge: critical role for mesothelial cells in necrosis-induced inflammation through the recognition of IL-1 alpha released from dying cells. J Immunol 181, 8194-8198 (2008) .
Moussion, C., Ortega, N. & Girard, J.P. The IL-1-like cytokine IL-33 is constitutively expressed in the nucleusof endothelial cells and epithelial cells in vivo: a novel ’alarmin’? PLoS One 3, e3331 (2008).
Cayrol, C. & Girard, J.P. The IL-1-like cytokine IL-33 is inactivated after maturation by caspase-1. Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 9021-9026 (2009).
James, R., Kesturu, G., Balian, G. & Chhabra, A.B. Tendon: biology, biomechanics, repair, growth factors, andevolving treatment options. J Hand Surg Am 33, 102-112 (2008).
Brown, B.D. & Naldini, L. Exploiting and antagonizing microRNA regulation for therapeutic and experimentalapplications. Nat Rev Genet 10, 578-585 (2009).
Roderburg, C., et al. Micro-RNA profiling reveals a role for miR-29 in ljudsk and murine liver fibrosis. Hepatology 53, 209-218 (2011).
Ogawa, T., et al. Suppression of type I collagen production by microRNA-29b in cultured ljudsk stellate cells.Biochem Biophys Res Commun 391, 316-321 (2010) .
Millar, N.L., Wu, X., Tantau, R., Silverstone, E. & Murrell, G.A. Open versus two forms of arthroscopic rotatorcuff repair. Clin Orthop Relat Res 467, 966-978 (2009).
McInnes, I.B., et al. Production of nitric oxide in the synovial membrane of rheumatoid and osteoarthritis patients.J Exp Med 184, 1519-1524 (1996).
Khan, K.M., Cook, J.L., Bonar, F., Harcourt, P. & Astrom, M. Histopathology of common tendinopathies. Update and implications for clinical management. Sports Med 27, 393-408 (1999) .
Millar, N.L., Wei, A.Q., Molloy, T.J., Bonar, F. & Murrell, G.A. Heat shock protein and apoptosis in supraspinatustendinopathy. Clin Orthop Relat Res 466, 1569-1576 (2008).
Kurowska-Stolarska, M., et al. IL-33 induces antigen-specific IL-5+ T cells and promotes allergic-induced airwayinflammation independent of IL-4. J Immunol 181, 4780-4790 (2008) . Zheng, Y., et al. Interleukin-22, a T(H)17 cytokine, mediates IL-23-induced dermal inflammation and acanthosis.Nature 445, 648-651 (2007).
Hedrick, M.N., et al. CCR6 is required for IL-23-induced psoriasis-like inflammation in mice. The Journal ofclinical investigation 119, 2317-2329 (2009).

Claims (17)

  1. Patentni zahtevi 1. Terapeutski agens za primenu u postupku tretmana oštećenja tetive ili povećanje snage zatezanja tetive, gde je terapeutski agens miR-29, njegov mimik, ili prekursor bilo kog od njih.
  2. 2. Terapeutski agens za primenu prema patentnom zahtevu 1 gde je terapeutski agens miR-29 mimik ili prekursor koji obuhvata: (i) jedan ili više modifikovan ostatak šećera; (ii) jednu ili više modifikovanih internukleozidnih veza; (iii) jednu ili više modifikovanu bazu; i/ili (iv) membranski tranzitni deo.
  3. 3. Terapeutski agens za primenu u postupku tretmana oštećenja tetive ili povećanje snage zatezanja tetive, gde je terapeutski agens nukleinska kiselina koja kodira miR-29, njen mimik, ili prekursor bilo kog od njih.
  4. 4. Terapeutski agens za primenu prema bilo kom patentnom zahtevu 1 do 3 u vezi sa (npr. kompleksiran ili inkapsuliran sa) nosačem.
  5. 5. Terapeutski agens za primenu prema patentnom zahtevu 4 gde nosač: (i) obuhvata farmaceutski prihvatljiv lipid ili polimer; i/ili (ii) obuhvata ciljajući agens sposoban za vezivanje na površini ciljane ćelije.
  6. 6. Terapeutski agens za primenu u postupku tretmana oštećenja tetive ili povećanje snage zatezanja tetive, gde je terapeutski agens virusni vektor koji se sastoji od nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 3.
  7. 7. Terapeutski agens prema patentnom zahtevu 6 gde je virusni vektor adenovirus, adeno-povezan virus (AAV), retrovirus ili herpesvirus vektor, npr. lentivirusni vektor.
  8. 8. Terapeutski agens za primenu prema bilo kom patentnom zahtevu 1 do 7 gde miR-29 je miR-29a, miR-29b1, miR29b2 ili miR-29c ili njihova kombinacija.
  9. 9. Terapeutski agens za primenu prema patentnom zahtevu 8 gde kombinacija obuhvata miR-29a.
  10. 10. Terapeutski agens za primenu prema bilo kom patentnom zahtevu 1 do 9 gde miR-29 ili njegov mimik obuhvata vodič lanac koji obuhvata semensku sekvencu AGCACCA.
  11. 11. Terapeutski agens za primenu prema patentnom zahtevu 10 gde vodič lanac obuhvata sekvencu: UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA (hsa-miR-29a) ; UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU (hsa-miR-29b1; hsa-miR-29b2); ili UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA (hsa-miR-29c) .
  12. 12. Terapeutski agens za primenu prema bilo kom patentnom zahtevu 1 do 11 gde je prekursor premir-29.
  13. 13. Terapeutski agens za primenu prema patentnom zahtevu 12 gde pre-mir-29 obuhvata sekvencu: AUGACUGAUUUCUUUUGGUGUUCAGAGUCAAUAUAAUUUUCUAGCACCAUCUG AAAUCGGUUAU (hsa-pre-mir-29a: alternativa (i)); AUGACUGAUUUCUUUUGGUGUUCAGAGUCAAUAUAAUUUUCUAGCACCAUCUG AAAUCGGUUAU AAUGAUUGGGG (hsa-pre-mir-29a: alternativa (ii));
    (gde su sekvence zrelog vodič lanca podvučene).
  14. 14. Terapeutski agens za primenu prema bilo kom patentnom zahtevu 1 do 13 gde miR-29 mimik obuhvata vodič lanac koji obuhvata sekvencu: UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA (hsa-miR-29a); UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU (hsa-miR-29b1 and 2); ili UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA (hsa-miR-29c) (gde je semenska sekvenca podvučena u svakom slučaju); ili koji se razlikuje od navedene sekvence po: (i) ne više od tri položaja unutar semenske sekvence; i (ii) ne više od pet položaja izvan semenske sekvence.
  15. 15. Terapeutski agens za primenu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva gde je tetiva pogođena povredom tetive ili tendiopatijom.
  16. 16. Terapeutski agens za primenu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva gde je pacijent na kom treba da se primenjuje agens čovek ili konj.
  17. 17. Terapeutski agens za primenu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva gde je pogođena tetivama Ahilova tetiva, supraspinatska tetiva, zajednička fleksorska tetiva, zajednička ekstenzorska tetiva ili površinska fleksorska tetiva.
RS20180202A 2014-01-14 2015-01-14 Materijali i postupci za modulaciju zarastanja tetiva RS56915B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB201400598A GB201400598D0 (en) 2014-01-14 2014-01-14 Materials and methods for modulation of tendon healing
PCT/GB2015/050066 WO2015107340A1 (en) 2014-01-14 2015-01-14 Materials and methods for modulation of tendon healing
EP15706497.3A EP3094727B1 (en) 2014-01-14 2015-01-14 Materials and methods for modulation of tendon healing

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS56915B1 true RS56915B1 (sr) 2018-05-31

Family

ID=50238941

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20180202A RS56915B1 (sr) 2014-01-14 2015-01-14 Materijali i postupci za modulaciju zarastanja tetiva

Country Status (21)

Country Link
US (2) US9932582B2 (sr)
EP (1) EP3094727B1 (sr)
JP (2) JP6665107B2 (sr)
CN (1) CN106062194A (sr)
AU (1) AU2015207351C1 (sr)
CA (1) CA2935623C (sr)
DK (1) DK3094727T3 (sr)
ES (1) ES2661111T3 (sr)
GB (1) GB201400598D0 (sr)
HK (1) HK1226093B (sr)
HR (1) HRP20180377T1 (sr)
HU (1) HUE036049T2 (sr)
NO (1) NO3094727T3 (sr)
PL (1) PL3094727T3 (sr)
PT (1) PT3094727T (sr)
RS (1) RS56915B1 (sr)
RU (1) RU2699706C2 (sr)
SA (1) SA516371485B1 (sr)
SI (1) SI3094727T1 (sr)
TR (1) TR201802656T4 (sr)
WO (1) WO2015107340A1 (sr)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201400598D0 (en) * 2014-01-14 2014-03-05 Univ Glasgow Materials and methods for modulation of tendon healing
CN107108685B (zh) * 2014-09-08 2020-10-20 米拉根医疗股份有限公司 miR-29模拟物及其用途
EP3271464A4 (en) * 2015-03-16 2018-10-31 Miragen Therapeutics, Inc. Mirna mimetics and their use in treating sensory conditions
WO2017181011A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Adeno-associated virus vector delivery of microrna-29 to treat muscular dystrophy
US11338045B2 (en) 2017-03-17 2022-05-24 Newcastle University Adeno-associated virus vector delivery of a fragment of micro-dystrophin to treat muscular dystrophy
WO2019078916A1 (en) 2017-10-18 2019-04-25 Research Institute At Nationwide Children's Hospital ADENO-ASSOCIATED VIRUS VECTOR ADMINISTRATION OF MUSCLE-SPECIFIC MICRO-DYSTROPHINE TO TREAT MUSCLE DYSTROPHY
IL324506A (en) 2018-06-18 2026-01-01 Res Inst Nationwide Childrens Hospital Adeno-associated virus vector for delivery of muscle-specific microdystrophin for the treatment of muscular dystrophy
EP4114938A4 (en) * 2020-03-04 2025-02-19 The Trustees of Indiana University Methods to re-engage a fetal wound healing pathway for adult skin repair
US11987793B2 (en) 2020-05-03 2024-05-21 Washington University Compositions and methods for prevention of bladder fibrosis
RU2743804C1 (ru) * 2020-08-03 2021-02-26 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Волгоградский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации ФГБОУ ВО ВолгГМУ МЗ РФ Способ моделирования тендинопатии
CN112080568A (zh) * 2020-09-27 2020-12-15 扬州大学 一种与湖羊肌肉细胞增殖相关的miRNA标志物及其检测引物和应用
GB202016863D0 (en) * 2020-10-23 2020-12-09 Causeway Therapeutics Ltd Microrna-29 compounds, compositions and uses in therapy
KR20230102595A (ko) * 2021-12-30 2023-07-07 주식회사 이노제닉스 포스파티딜이노시톨 3-키나아제 촉매 소단위 알파 유전자의 3'비번역 부위에 특이적으로 결합하는 핵산 절편 및 그 응용
AU2023445724A1 (en) 2023-04-28 2025-11-06 Causeway Therapeutics Limited Microrna-29 compounds, compositions and uses in therapy, and methods for evaluating tendinopathic lesions

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2056882T3 (da) 2006-08-01 2012-11-19 Univ Texas Identifikation af en mikro-rna, som aktiverer ekspression af en tung kæde med beta-myosin
JP2010516291A (ja) 2007-01-31 2010-05-20 ジ・オハイオ・ステイト・ユニバーシティ・リサーチ・ファウンデイション 急性骨髄性白血病（ａｍｌ）の診断、予後及び治療のためのマイクロｒｎａに基づく方法及び組成物
DK2182969T3 (en) 2007-07-31 2017-02-27 Univ Texas Micro-RNA family that modulates fibrosis and its applications
CA2694928A1 (en) 2007-07-31 2009-02-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Micro-rnas that control myosin expression and myofiber identity
US8247389B2 (en) 2008-09-04 2012-08-21 Universitat Zurich Prorektorat Mnw Treatment of scleroderma
DK2427472T3 (en) 2009-05-05 2016-09-12 Miragen Therapeutics Lipophilic polynukleotidkonjugater
MA33488B1 (fr) 2009-06-08 2012-08-01 Miragen Therapeutics Motifs de modification chimique pour des inhibiteurs et mimétiques de miarn
WO2010148050A2 (en) * 2009-06-16 2010-12-23 Curna, Inc. Treatment of collagen gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a collagen gene
US8846631B2 (en) 2010-01-14 2014-09-30 Regulus Therapeutics Inc. MicroRNA compositions and methods
CN103492569B (zh) 2010-11-05 2020-04-07 米拉根医疗公司 碱基经修饰的寡核苷酸
US9222085B2 (en) 2011-02-03 2015-12-29 Mirna Therapeutics, Inc. Synthetic mimics of MIR-124
AU2012212023B9 (en) 2011-02-03 2017-01-12 Mirna Therapeutics, Inc. Synthetic mimics of miR-34
US20150044296A1 (en) 2012-03-21 2015-02-12 Leonard B. Miller Combination therapy to improve joint, tendon, and ligament healing
US20140010801A1 (en) 2012-06-08 2014-01-09 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Compositions and Methods for Restoring or Rejuvenating Stem/Progenitor Cell Function
US9267139B2 (en) 2012-10-11 2016-02-23 Georgia Regents Research Institute, Inc. Compositions and methods for treating musculoskeletal diseases and disorders
GB201400598D0 (en) * 2014-01-14 2014-03-05 Univ Glasgow Materials and methods for modulation of tendon healing
CN107108685B (zh) 2014-09-08 2020-10-20 米拉根医疗股份有限公司 miR-29模拟物及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
RU2016131870A3 (sr) 2018-08-10
US10472631B2 (en) 2019-11-12
NZ721667A (en) 2023-02-24
CA2935623A1 (en) 2015-07-23
GB201400598D0 (en) 2014-03-05
US20160333345A1 (en) 2016-11-17
CN106062194A (zh) 2016-10-26
SI3094727T1 (en) 2018-03-30
RU2699706C2 (ru) 2019-09-09
AU2015207351B2 (en) 2021-01-07
EP3094727A1 (en) 2016-11-23
JP2020073480A (ja) 2020-05-14
US9932582B2 (en) 2018-04-03
CA2935623C (en) 2023-08-15
AU2015207351A1 (en) 2016-07-14
AU2015207351C1 (en) 2021-05-06
WO2015107340A1 (en) 2015-07-23
HUE036049T2 (hu) 2018-06-28
HRP20180377T1 (hr) 2018-04-06
HK1226093B (en) 2017-09-22
JP6665107B2 (ja) 2020-03-13
EP3094727B1 (en) 2017-12-13
NO3094727T3 (sr) 2018-05-12
TR201802656T4 (tr) 2018-03-21
PL3094727T3 (pl) 2018-06-29
JP6845589B2 (ja) 2021-03-17
DK3094727T3 (en) 2018-02-12
RU2016131870A (ru) 2018-02-20
ES2661111T3 (es) 2018-03-27
JP2017503859A (ja) 2017-02-02
SA516371485B1 (ar) 2019-06-24
US20180155724A1 (en) 2018-06-07
PT3094727T (pt) 2018-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10472631B2 (en) Materials and methods for modulation of tendon healing
HK1226093A1 (en) Materials and methods for modulation of tendon healing
RU2670486C9 (ru) Модулирование экспрессии рецептора андрогенов
ES2984631T3 (es) Composiciones y procedimientos para disminuir la expresión de tau
US11578107B2 (en) Compositions and methods for reprogramming somatic cells into induced vasculogenic cells
US20180064850A1 (en) Biocompatible implants for use in tendon therapy
US10870852B2 (en) Compositions and methods for treating diabetic retinopathy
CA2981960C (en) Compositions and methods for correcting limb girdle muscular dystrophy type 2c using exon skipping
US12286629B2 (en) Compositions and methods for treating endometriosis
WO2016180986A1 (en) Mirna compositions for the treatment of mature b-cell neoplasms
JP2016540049A (ja) 肺動脈性高血圧症の治療のための材料及び方法
PT1966368E (pt) Inibição do igf-1r mediada por arni para o tratamento da angiogénese ocular
EP4114938A1 (en) Methods to re-engage a fetal wound healing pathway for adult skin repair