RS56930B1 - Molekuli humanizovanih antitela specifični za il-31 - Google Patents

Molekuli humanizovanih antitela specifični za il-31

Info

Publication number
RS56930B1
RS56930B1 RS20180194A RSP20180194A RS56930B1 RS 56930 B1 RS56930 B1 RS 56930B1 RS 20180194 A RS20180194 A RS 20180194A RS P20180194 A RSP20180194 A RS P20180194A RS 56930 B1 RS56930 B1 RS 56930B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
amino acid
humanized
chain variable
variable domain
Prior art date
Application number
RS20180194A
Other languages
English (en)
Inventor
Kent Bondensgaard
Roland Beckmann
Original Assignee
Zymogenetics Inc
Merck Serono Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zymogenetics Inc, Merck Serono Sa filed Critical Zymogenetics Inc
Publication of RS56930B1 publication Critical patent/RS56930B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001136—Cytokines
    • A61K39/00114—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis predmetnog pronalaska
[0001] Utvrđeno je da IL-31, novo-identifikovani citokin, izaziva simptome slične dermatitisu kada postoji prekomerna ekspresija kod miševa. Videti, Dillon, i ostali, Nature Immunol. 5:752-760, 2004. Ovi simptomi mogu biti ublaženi primenom antagonista koji blokiraju, inhibiraju, redukuju, antagonizuju ili neutrališu aktivnost IL-31, i uključuju anti-IL-31 antitela. Takođe videti, američku patentnu prijavu serijskog broja 10/352,554, koja je podneta 21. januara 2003. (Objava američkog patenta sa brojem 2003-0224487), sada američki patenti sa serijskim brojevima 7,064,186, 7,425,325, i 7, 459,293.
[0002] Tehnologija monoklonskih antitela je obezbedila širok spektar terapija kao i dijagnostika za primenu u identifikovanju i lečenju bolesti. Opisani su brojni rekombinantni i biosintetički molekuli koji sadrže antigen-vezujuća mesta glodara. Posebno, opisani su molekuli koji imaju antigen-vezujuća mesta glodara koja su nadograđena direktno na humana antitela kalemljenjem samo vezujućeg mesta glodara, pre nego celog varijabilnog domena, u domene teškog i lakog lanca humanog imunoglobulina. Videti, npr., Riechmann i ostali (1988) Nature 332:323-327 i Verhoeyen i ostali (1988) Science 239:1534-1536. Molekuli koji imaju antigen-vezujuće mesto gde najmanje jedan od regiona koji određuju komplementarnost (complementarity determining regions - CDRs) varijabilnog domena je izveden iz mišjeg monoklonskog antitela i preostali delovi molekula izvedeni iz imunoglobulina su izvedeni iz humanog imunoglobulina su opisani u objavi britanskog patenta sa brojem GB 2,276,169, koji je objavljen 21. septembra 1994. Takođe je opisano nekoliko jednolančanih polipeptida antigen-vezujućeg mesta i jednolančani Fv (sFv) molekuli. Videti, npr., američke patente sa brojevima 5,132,405 i 5,091,513 Huston i ostali; i američki patent sa brojem 4,946,778 Ladner i ostali.
[0003] Mišja anti-humana IL-31 monoklonska antitela su opisana prethodno u američkoj patentnoj prijavi sa serijskim brojem 11/430,066, koja je podneta 8. maja 2006. (objava američkog patenta br. 2006-02752960) koja opisuje mišja monoklonska antitela koja prepoznaju humani IL-31 i mogu biti upotrebljena za generisanje himernih antitela. Ipak, himerna antitela mogu izazvati imunogenost i humanizovana mišja- anti humana IL-31 antitela su poželjna. Humanizovana antitela uopšteno imaju najmanje tri potencijalne prednosti nad mišjim ili u nekim slučajevima himernim antitelima za primenu u humanom lečenju: (1) Zato što je efektorski deo čovek, on može intereagovati bolje sa drugim delovima humanog imunog sistema (npr., uništava ciljane ćelije efikasnije pomoću komplement zavisne citotoksičnosti (complement-dependent cytotoxicity - CDC) ili ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (antibody-dependent cellular cytotoxicity - ADCC)); (2) Humani imuni sistem neće prepoznati okvirni ili konstantni region humanizovanog antitela kao strani, i stoga odgovor antitela prema ovakvom injektiranom antitelu treba da bude manji nego prema celokupno stranom mišjem antitelu ili delimično stranom himernom antitelu; i (3) Prijavljeno je da injektirana mišja antitela imaju polu-život u humanoj cirkulaciji mnogo kraći nego što je polu-život normalnih antitela (D. Shaw i ostali, J. Immunol., 138, 4534-4538 (1987)). Injektirana humanizovana antitela će verovatno imati polu-život sličniji prirodno prisutnim humanim antitelima, dozvoljavajući da se daju manje i ređe doze.
[0004] Tako, postoji potreba za molekulima koji obezbeđuju sekvence amino kiselina humanizovanog varijabilnog regiona za mišja anti-humani IL-31 antitela za lečenje inflamacije posredovane IL-om-31.
[0005] WO 2006/122079 opisuje IL-31 monoklonska antitela i metode primene.
REZIME PREDMETNOG PRONALASKA
[0006] Predmetni pronalazak se odnosi na izolovano antitelo koje se vezuje za humani IL-31, kao što je definisano u patentnim zahtevima. Izolovano antitelo sadrži: a) humanizovani varijabilni domen teškog lanca koji sadrži CDR koji se sastoje od aminokiselinskih sekvenci sa SEK ID BROJEM: 1, 2 i 3 redom; i b) humanizovani varijabilni domen lakog lanca koji sadrži CDR koji se sastoje od aminokiselinskih sekvenci sa SEK ID BROJEM: 5, 6 i 7. U antitelima predmetnog pronalaska: a) navedeni humanizovani varijabilni domen teškog lanca sadrži okvirne regione FR1, FR2, FR3 i FR4 koji imaju aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinskoj sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od: aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 12 (FR1), 13(FR2), 14 (FR3) i 15 (FR4) redom; i b) navedeni humanizovani varijabilni domen lakog lanca sadrži okvirne regione FR5, FR6, FR7, i FR8 koji imaju aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinskoj sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od: 1) aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 17 (FR5), 18 (FR6), 19 (FR7) i 20 (FR8) redom. U jednom tehničkom rešenju, navedena identičnost je najmanje 95%, još poželjnije najmanje 98%, najpoželjnije najmanje 99%.
[0007] U izolovanom antitelu predmetnog pronalaska, aminokiselina na poziciji 29 u FR1 teškog lanca je leucin i aminokiselina na poziciji 32 u FR3 teškog lanca je fenilalanin. U izolovanom antitelu predmetnog pronalaska, aminokiselina na poziciji 8 u FR3 teškog lanca je lizin i aminokiselina na poziciji 15 u FR7 lakog lanca je tirozin.
[0008] U jednom aspektu, predmetna objava se odnosi na izolovano antitelo koje se vezuje za humani IL-31, koji sadrži: a) humanizovani varijabilni domen teškog lanca koji sadrži CDR1 i CDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 1 i 3 redom i CDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu sa AIYPGDGDTRYSXaa1Xaa2FXaa3G (SEK ID BR: 22) gde Xaa1 je glutamin ili prolin, Xaa2 je serin ili lizin i Xaa3 je glutamin ili lizin; navedeni humanizovani varijabilni domen teškog lanca koji sadrži okvirne regione FR1, FR2, FR3 i FR4 koji imaju aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinskoj sekvenci sa: SEK ID BR: 8, 9, 10 i 11 redom, ili SEK ID BR: 12, 13, 14 i 15 redom, ili SEK ID BR: 12, 13, 16 i 15 redom; i pod uslovom da aminokiselina na poziciji 29 u FR1 je leucin i aminokiselina na poziciji 32 u FR3 je fenilalanin; b) humanizovani varijabilni domen lakog lanca koji sadrži CDR regione koji se sastoje od aminokiselinskih sekvenci sa SEK ID BROJEM: 5, 6 i 7 navedenog humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji sadrži okvirne regione FR5, FR6, FR7 i FR8 koji imaju aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinskoj sekvenci sa SEK ID BROJEM: 17, 18, 19 i 20 redom, ili najmanje 90% identičnu aminokiselinskoj sekvenci sa SEK ID BROJEM: 17, 18, 21 i 20 redom. U jednom aspektu predmetne objave, navedeni identitet je najmanje 95%, još poželjnije najmanje 98%, najpoželjnije najmanje 99%. U drugom aspektu, predmetna objava se odnosi na izolovano antitelo kao što je ovde opisano gde aminokiselina na poziciji 8 u FR3 teškog lanca je lizin i aminokiselina na poziciji 15 u FR7 lakog lanca je tirozin. U drugom aspektu, predmetna objava se odnosi na izolovano antitelo kao što je ovde opisano gde: aminokiselina Xaa1 je glutamin, Xaa2 je lizin i Xaa3 je lizin; aminokiselina Xaa1 je prolin, Xaa2 je serin i Xaa3 je glutamin; ili aminokiselina Xaa1 je glutamin, Xaa2 je lizin i Xaa3 je glutamin.
[0009] U drugom aspektu predmetna objava se odnosi na izolovano antitelo kao što je ovde opisano gde se CDR varijabilnog domena teškog lanca sastoje od SEK ID BR: 1, 4 i 3 redom, CDR varijabilnog domena lakog lanca sastoje od SEK ID BR: 5, 6 i 7 redom, okvirni regioni varijabilnog domena teškog lanca sastoje od SEK ID BR: 8, 9, 10 i 11 redom, i okvirni regioni varijabilnog domena lakog lanca sastoje od SEK ID BR: 17, 18, 19 i 20 redom.
[0010] U drugom aspektu predmetni pronalazak se odnosi na izolovano antitelo kao što je ovde opisano gde se CDR varijabilnog domena teškog lanca sastoje od SEK ID BR: 1, 2 i 3 redom, CDR varijabilnog domena lakog lanca sastoje od SEK ID BR: 5, 6 i 7 redom, okvirni regioni varijabilnog domena teškog lanca sastoje od SEK ID BR: 12, 13, 14 i 15 redom, i okvirni regioni varijabilnog domena lakog lanca sastoje od SEK ID BR: 17, 18, 19 i 20 redom.
[0011] U drugom aspektu predmetna objava se odnosi na izolovano antitelo kao što je ovde opisano gde se CDR varijabilnog domena teškog lanca sastoje od SEK ID BR: 1, 2 i 3 redom, CDR varijabilnog domena lakog lanca sastoje od SEK ID BR: 5, 6 i 7 redom, okvirni regioni varijabilnog domena teškog lanca sastoje od SEK ID BR: 12, 13, 16 i 15 redom, i okvirni regioni varijabilnog domena lakog lanca sastoje od SEK ID BR: 17, 18, 21 i 20 redom.
[0012] Kao što će biti prikazano u Primerima i učenjima ovde, prisustvo oba i leucina na poziciji 29 u FR1 i fenilalanina na poziciji 32 u FR3 ovde opisanih humanizovanih antitela, ima pozitivan uticaj u smislu afiniteta i potencije navedenih antitela. Kao što je pokazano na primer u Biacore testu, vezujući afinitet humanizovanih antitela koja nose oba i leucin na poziciji 29 u FR1 i fenilalanina na poziciji 32 u FR3 je bolji u poređenju sa humanizovanim antitelima koja nose drugu aminokiselinu na ovim pozicijama (uporediti na primer klonove sa brojevima 7, 10, 13 i 14 u Tabeli 2 Primera 3). Pozitivan uticaj ovih aminokiselina na poziciji 29 FR-a1 i 94 FR-a3 teškog lanca, oba u smislu afiniteta i potencije, je takođe potvrđen pomoću dva druga biološka testa (videti Primere 4 i 5).
[0013] U jednom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, antitelo definisano u patentnim zahtevima sadrži konstantni domen teškog lanca imunoglobulina odabran iz grupe koja se sastoji od konstantnog regiona α, γ, µ, δ ili ε teškog lanca humanog imunoglobulina. U jednom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, antitelo definisano u patentnim zahtevima sadrži konstantni domen teškog lanca imunoglobulina odabran iz grupe koja se sastoji od konstantnog domena humanog IgG1; konstantnog domena humanog IgG2; konstantnog domena humanog IgG3; konstantnog domena humanog IgG4; konstantnog domena humanog IgM; konstantnog domena humanog IgE i konstantnog domena humanog IgA. U jednom tehničkom rešenju, konstantni domen humanog IgG4 je mutirana forma stabilna u rastvoru i sa malo ili bez aktivnosti aktivacije komplementa. U jednom tehničkom rešenju, domen konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina je konstantni domen humanog IgG4 sa mutacijom Ser u Pro na poziciji 241 (Kabat numerisanje).
[0014] U jednom tehničkom rešenju, domen konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina je odabran iz grupe koja se sastoji od konstantnog regiona κ ili λ lakog lanca humanog imunoglobulina. Poželjno, domen konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina je konstantni region κ lakog lanca humanog imunoglobulina.
DETALJNI OPIS PREDMETNOG PRONALASKA
[0015] Pre detaljnog predstavljanja predmetnog pronalaska, može pomoći u njegovom razumevanju definisanje sledećih termina:
[0016] Kao što je ovde upotrebljeno, termin "antitela" uključuje poliklonska antitela, poliklonska antitela prečišćenog afiniteta, monoklonska antitela, i antigen-vezujuće fragmente, kao što su F(ab')2, Fab proteolitične fragmente, i fragmente varijabilnog regiona pojedinačnog lanca (single chain variable region fragments - scFvs). Genetski konstruisana netaknuta antitela ili fragmenti, kao što su himerna antitela, Fv fragmenti, jednolančana antitela i slično, kao i sintetski antigen-vezujući peptidi i polipeptidi, su takođe uključeni. Nehumana antitela mogu biti humanizovana kalemljenjem ne-humanog CDR-a na humane okvirne i konstantne regione, ili inkorporacijom celih ne-humanih varijabilnih domena (po izboru njihovim "pokrivanjem" sa površinom sličnom humanoj zamenom izloženih ostataka, gde se dobija "obloženo" antitelo). U nekim slučajevima, humanizovana antitela mogu zadržati ne-humane ostatke u okviru humanih okvirnih domena varijabilnog regiona da bi povećali sopstvene vezujuće karakteristike. Kroz humanizovanje antitela, biološki polu-život može da se poveća, i potencijal za štetne imune reakcije nakon administracije kod ljudi je smanjen.
[0017] Termin "himerno antitelo" ili "himerna antitela" se odnosi na antitela čiji su geni lakog i teškog lanca kontruisani, tipično genetskim inženjeringom, iz gena varijabilnog i konstantnog regiona imunoglobulina koji pripadaju različitim vrstama. Na primer, varijabilni segmenti gena iz mišjeg monoklonskog antitela mogu biti pridruženi humanim konstantnim segmentima, kao što su gama 1 i gama 3. Tipično terapijsko himerno antitelo je takav hibridni protein sastavljen od varijabilnog ili antigen-vezujućeg domena iz mišjeg antitela i konstantnog domena iz humanog antitela, iako druge vrste sisara mogu biti upotrebljene.
[0018] Kao što je ovde upotrebljeno, termin "imunoglobulin" se odnosi na protein koji se sastoji od jednog ili više polipeptida suštinski kodiranih imunoglobulinskim genima. Jedna forma imunoglobulina predstavlja osnovnu strukturnu jedinicu antitela. Ova forma je tetramer i sastoji se od dva identična para lanaca imunoglobulina, svaki par ima jedan lak i jedan težak lanac. U svakom lancu, varijabilni regioni lakog i teškog lanca su zajedno odgovorni za vezivanje za antigen, i konstantni regioni su odgovorni za efektorske funkcije antitela.
[0019] Celi imunoglobulinski "laki lanci" (oko 25 Kd ili 214 aminokiselina) su kodirani genom varijabilnog regiona na NH2-kraju (oko 110 aminokiselina) i genom kapa ili lambda konstantnog regiona na COOH--kraju. Celi imunoglobulinski "teški lanci" (oko 50 Kd ili 446 aminokiselina), su slično kodirani genom varijabilnog regiona (oko 116 aminokiselina) i jednim od ostalih gore pomenutih gena konstantnog regiona (oko 330 aminokiselina). Teški lanci su klasifikovani kao gama, mu, alfa, delta, ili epsilon, i definišu izotip antitela kao IgG, IgM, IgA, IgD i IgE, redom. U okviru lakih i teških lanaca, varijabilni i konstantni regioni su vezani "J" regionom od oko 12 ili više aminokiselina, sa teškim lancem koji takođe uključuje "D" region od oko 10 više aminokiselina. (Videti generalno, Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2. izdanje. Raven Press, Nju Jork, 1989), Poglavlje 7.
[0020] Varijabilni region lakog ili teškog lanca imunoglobulina se sastoji od "okvirnog" (framework) regiona isprekidanog sa tri hipervarijabilna regiona. Tako, termin "hipervarijabilni region" se odnosi na aminokiselinske ostatke antitela koji su odgovorni za vezivanje antigena. Hipervarijabilni region obuhvata aminokiselinske ostatke iz "regiona koji određuje komplementarnost" ili "CDR" (tj., ostatke 24-34 (L1), 50-56 (L2) i 89-97 (L3) u varijabilnom domenu lakog lanca i 31-35 (H1), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) u varijabilnom domenu teškog lanca (Kabat i ostali, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izdanje Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) i/ili one ostatke iz "hipervarijabilne petlje" (tj., ostatke 26-32 (L1), 50-52 (L2) i 91-96 (L3) u varijabilnom domenu lakog lanca i 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) varijabilnom domenu teškog lanca; Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol.196: 901-917). Ostaci "okvirnog regiona" ili "FR" ostaci su oni ostaci varijabilnog domena drugačiji od ostataka hipervarijabilnog domena kao što je ovde definisano. Sekvence okvirnih regiona različitih lakih i teških lanaca su relativno sačuvane unutar vrste. Tako, "humani okvirni region" je okvirni region koji je suštinski identičan (oko 85% ili više, obično 90-95% ili više) okvirnom regionu prirodno prisutnog humanog imunoglobulina. Okvirni region antitela, koji je kombinacija okvirnih regiona sastavnih lakih i teških lanaca, služi za pozicioniranje i poravnanje CDR regiona. CDR regioni su prvenstveno odgovorni za vezivanje za epitop antigena.
[0021] U skladu sa tim, termin "humanizovan" imunoglobulin se odnosi na imnoglobulin koji sadrži humani okvirni region i jedan ili više CDR iz ne-humanog (obično mišjeg ili od pacova) imunoglobulina. Ne-humani imunoglobulin koji obezbeđuje CDR se naziva "donor" i humani imunoglobulin koji obezbeđuje okvirni region se naziva "akceptor". Nije obavezno prisustvo konstantnih regiona, ali ukoliko jesu, oni moraju biti suštinski identični konstantnim regionima humanog imunoglobulina, tj., najmanje oko 85-90%, poželjno oko 95% ili više identično. Stoga, svi delovi humanizovanog imunoglobulina, sem moguće CDR, su suštinski identični odgovarajućim delovima prirodnih humanih imunoglobulinskih sekvenci. "Humanizovano antitelo" je antitelo koje sadrži humanizovani laki lanac i humanizovani teški lanac imunoglobulina. Na primer, humanizovano antitelo neće obuhvatiti tipično himerno antitelo kao što je definisano iznad u tekstu, npr., zato što je ceo varijabilni region himernog antitela ne-human.
[0022] Termin "rekombinantna antitela" označava antitela gde aminokiselinska sekvenca varira od one u prirodnom antitelu. Zbog relevantnosti tehnika rekombinantne DNK u generisanju antitela, ne treba se ograničiti na sekvence aminokiselina koje su pronađene u prirodnim antitelima; antitela mogu biti redizajnirana da bi se dobile željene karakteristike. Moguće varijacije su brojne i kreću se od menjanja samo jedne ili nekoliko aminokiselina do potpunog redizajna, na primer, varijabilnog ili konstantnog regiona. Promene u konstantnom regionu će, uopšteno, biti napravljene da bi se poboljšale ili promenile karakteristike, kao što su fiksiranje komplementa, interakcija sa membranama i druge efektorske funkcije. Promene u varijabilnom regionu će biti napravljene da bi se poboljšale antigen vezujuće karakteristike.
[0023] Pored antitela, imunoglobulini mogu postojati u raznolikosti drugih formi uključujući, na primer, pojedinačni lanac ili Fv, Fab, i (Fab')2, kao i diatela, linearna antitela, multivalentna ili multispecifična hibridna antitela (kao što je opisano u tekstu iznad i u detaljima u: Lanzavecchia i ostali, Eur. J. Immunol.17, 105 (1987)) i u jednostrukim lancima (npr., Huston i ostali, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5879-5883 (1988) i Bird i ostali, Science, 242, 423-426 (1988)). (Videti, generalno, Hood i ostali, "Immunology", Benjamin, Nju Jork, 2. izdanje (1984), i Hunkapiller and Hood, Nature, 323, 15-16 (1986)).
[0024] Kao što je ovde upotrebljeno, termini "jednolančani Fv," "jeddnolančana antitela," "Fv" ili "scFv" se odnose na fragmente antitela koji obuhvataju varijabilne regione i teških i lakih lanaca, bez konstantnih regiona, ali u okviru jednog polipeptidnog lanca. Generalno, antitelo sa jednim lancem dalje sadrži polipeptidni veznik između VH i VL domena koji mu omogućava da se formira željena struktura koja bi omogućila vezivanje antigena. Jednolančana antitela detaljno su razmatrana od strane Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, tom 113, Rosenburg and Moore urednici Springer-Verlag, Nju Jork, str. 269-315 (1994); Videti takođe objavu međnarodne patentne prijave sa brojem WO 88/01649 i američke patente sa brojevima 4,946,778 i 5,260,203. U posebnim tehničkim rešenjima, jednolančana antitela mogu takođe biti bi-specifična i/ili humanizovana.
[0025] "Fab fragment" se sastoji od jednog lakog lanca i CH1i varijabilnih regiona jednog teškog lanca. Težak lanac Fab molekula ne može da formira disulfidnu vezu sa drugim molekulom teškog lanca.
[0026] "Fab' fragment" sadrži jedan lak lanac i jedan težak lanac koji sadrži više od konstantnog regiona, između CH1i CH2domena, tako da se međulančana disulfidna veza može formirati između dva teška lanca da se formira F(ab')2molekul.
[0027] "F(ab')2fragment" sadrži dva laka lanca i dva teška lanca koji sadrže deo konstantnog regiona između CH1i CH2domena, tako da se međulančana disulfidna veza formira između dva teška lanca.
[0028] Molekulske mase i dužine polimera koje su odrđene nepreciznim analitičkim metodama (npr., gel elektroforeza) treba shvatiti kao približne vrednosti. Kada je ovakva vrednost izražena sa "oko " X ili "približno" X, navedenu vrednost X treba shvatiti da bude tačno ±10%.
[0029] .
[0030] Predmetni pronalazak se zasniva na otkriću sekvenci antitela humanizovanog mišjeg anti-humanog IL-31 varijabilnog regiona, kao što je definisano u patentnim zahtevima. Primena ovih antitela kao antagonista IL-a 31 može inhibirati inflamaciju uopšteno, i simptome dermatitisa i pruritičkih bolesti specifično. Predmetni pronalazak obezbeđuje primenu humanizovanih regiona lakog lanca i teškog lanca antitela koji prepoznaju, vezuju, i/ili neutrališu IL-31 polipeptid, kao što je definisano u patentnim zahtevima. Ovakvi humanizovani regioni lakog i teškog lanca mogu biti spojeni za konstantni region imunoglobulina, kao što je na primer, IgG4 ili IgG1, i ispoljeni u raznim ćelijama domaćina. Sekvence humanizovanog anti-IL-31 varjiabilnog regiona koje su ovde opisane su generisane primenom aminokiselinskih sekvenci mišjih anti-humanih IL-31 varijabilnih regiona lakog lanca i teškog lanca monoklonskih antitela koji su prethodno opisani u američkoj patentnoj prijavi sa serijskim brojem 11/430,066, podnetoj 8. maja 2006. (Objava američkog patenta br.
2006-02752960).
[0031] Antitela mogu obuhvatiti antitela ili fragmente antitela, koji sadrže ili su sastavljeni od varijabilnog regiona lakog lanca i varijabilnog regiona teškog lanca, i mogu biti himerni, humanizovani, ili fragmenti antitela koji neutrališu, inhibiraju, redukuju, sprečavaju ili minimiziraju efekte IL-a 31 na njegov receptor. Klinički ishodi antitela ili fragmenata antitela mogu biti redukcija u zapaljenskim i autoimunim bolestima, kao što su dermatitis, posebno atopijski dermatitis, i pruritičke bolesti i Kronova bolest, kao što je dalje ovde opisano. U jednom tehničkom rešenju, dermatitis je atopijski dermatitis. U drugom tehničkom rešenju dermatitis je prurigo nodularis. U drugom tehničkom rešenju, dermatitis je ekcem. Redukcija može takođe biti redukcija svraba, grebanja, ili gubitka kose.
[0032] IL-31 je novo otkriveni T ćelijski citokin koji, kada je prekomerno eksprimiran kod miševa, izaziva simtome slične dermatitisu. Videti, Dillon, i ostali, Nature Immunol. 5:752-760, 2004. IL-31 je HUGO naziv za citokin koji je prethodno opisan kao Zcyto17rlig u američkoj patentnoj prijavi sa serijskim brojem 10/352,554, podnetoj 21. januara 2003. (Objava američkog patenta br. 2003-0224487), sada američki patent sa serijskim brojem 7,064,186, Sprecher, Cindy i ostali, 2003). Videti takođe, Dillon, i ostali, Nature Immunol., supra. Aminokiselinska sekvenca humanog IL-31 je prikazana u SEK ID BR: 24. Analize tkiva su otkrile da je ekspresija mišjeg IL-31 utvrđena u testisima, mozgu, CD90+ ćelijama, ćelijama prostate, pljuvačnoj žlezdi i koži.
[0033] Heterodimerni receptor za IL-31 je opisan u objavi američkog patenta br.
20030224487 kao zcytor17 (HUGO naziv, IL-31RA) koji formira heterodimer sa OnkostatinM receptorom beta (OSMRbeta). IL-31 je izolovan iz biblioteke cDNK generisane iz aktiviranih ćelija humane periferne krvi (human peripheral blood cells - hPBCs), koje su odabrane za CD3. CD3 je površinski marker ćelije jedinstven za ćelije limfoidnog porekla, naročito T ćelije.
[0034] Inhibicija, neutralizacija, ili blokiranje signalne transdukcije pomoću molekula koji sadrže humanizovani mišji anti-humani varijabilni domen lakog lanca i / ili humanizovani mišji anti-humani varijabilni domen teškog lanca, nazvani "IL-31 antigen vezujući molekuli" ili "IL-31 antagonisti" ovde, može biti izmerena pomoću brojnih testova poznatih prosečnom poznavaocu oblasti. Na primer, testovi u kojima se meri redukcija proliferacije uključuju testove reudukcije boje kao što je AlamarBlue™ (AccuMed International, Inc. Vestlejk,
1
Ohajo), 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolijum bromid (Mosman, J. Immunol. Meth. 65: 55-63, 1983); 3,(4,5 dimetil tiazol-2il)-5-3-karboksimetoksifenil-2H-tetrazolijum; 2,3-bis(2-metoksi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-[(fenilamino)karbonil]-2H-tetrazolijum hidroksid; i cijanoditolil-tetrazolijum hlorid (koji su komercijalno dostupni od Polysciences, Inc., Vorington, PA); testove mitogeneze, kao što je merenje inkorporacije<3>H-timidina; testove isključivanja boje primenom, na primer, naftalen crne ili tripan plave; korišćenje boje primenom diacetil fluoresceina; i oslobađanje hromijuma. Videti, generalno, Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 3. izdanje, Wiley-Liss, 1994. Kao dodatak gore navedenom u tekstu, videti objavljenu američku patentnu objavu sa brojem 20030224487, (Sprecher, Cindy i ostali, 2003) za primer BaF3 ćelija koje eksprimiraju IL-31RA i OSMRbeta potpune dužine ili kao što je prikazano u primerima aktivnosti koji su ovde opisani.
[0035] Metode za pripremu polinukleotida koji kodiraju antitela koja su ovde opisana (uključujući DNK i RNK) su dobro poznate prosečnim poznavaocima oblasti. Ukupna RNK može biti pripremljena primenom ekstrakcije gvanidinijum izotiocijanata nakon čega primenom izolacije pomoću centrifugiranja u gradijentu CsCl-a (Chirgwin i ostali, Biochemistry 18:52-94, 1979). Poli (A)<+>RNK se priprema od ukupne RNK primenom metode Aviv-a i Leder-a (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1408-12, 1972). Komplementarna DNK (cDNK) se priprema iz poli(A)<+>RNK primenom poznatih metoda. Alternativno, genomska DNK može biti izolovana. Polinukleotidi koji kodiraju IL-31 antitela se potom identifikuju i izoluju, na primer, hibridizacijom ili PCR-om.
[0036] Predmetna objava takođe uključuje humanizovane IL-31 antigen vezujuće molekule ili IL-31 antagoniste koji vezuju funkcionalne fragmente IL-31 polipeptida i molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju ovakve funkcionalne fragmente. "Funkcionalni" IL-31 ili njegov fragment kao što je ovde definisano je okarakterisan njegovom proliferativnom ili diferencirajućom aktivnošću, njegovom sposobnošću da indukuje ili inhibira specijalizovane ćelijske funkcije, ili njegovom sposobnošću da se veže posebno za anti- IL-31 antitelo ili IL-31RA/OSMRbeta heterodimere ovih receptora (bilo rastvorljive bilo imobilisane). Tako, predmetna objava dalje obezbeđuje humanizovane IL-31 antigen vezujuće molekule ili IL-31 antagoniste koji vezuju polipeptidne molekule koji sadrže jedan ili više IL-31 funkcionalnih fragmenata.
[0037] Predmetna objava takođe obezbeđuje humanizovane IL-31 antigen vezujuće molekule ili IL-31 antagoniste koji se vezuju za polipeptidne fragmente ili peptide koji sadrže epitopnoseći deo IL-31 polipeptida ili imunogenski epitop ili antigenski epitop. Vezivanje antitela za ove epitope izaziva inhibiciju, blokiranje, neutralizaciju, i/ili redukciju transdukcije signala IL-a31 na njegov srodni receptor.
[0038] Mišja anti-humana IL-31 monoklonska antitela su prethodno opisana u američkoj patentnoj prijavi u postupku sa serijskim brojem 11/430,066, podnetoj 8. maja 2006. (Objava američkog patenta br. 2006-02752960). Aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona mišjeg anti-humanog IL-31 antitela su opisane u američkoj patentnoj prijavi koja je u postupku sa serijskim brojem 11/850,006, podnetoj 4. septembra 2007. i suvlasničkoj PCT američkoj prijavi 07/77555, podnetoj 4. septembra 2007. Ove sekvence aminokiselina se primenjuju kao polazni materijal za humanizovane sekvence koje su ovde opisane. Posebno, sekvenca mišjeg anti-humanog IL-31 antitela je iz hibridoma sa brojem klona 292.12.3.1.
[0039] Aktivnost antitela kao što je ovde opisano može biti merena njihovom sposobnošću da inhibiraju, ili smanje proliferaciju primenom raznih testova koji mere proliferaciju i/ili vezivanje za ćelije koje eksprimiraju IL-31RA receptor. Od posebnog interesa su promene u IL-31-zavisnim ćelijama. Pogodne ćelijske linije koje bi mogle biti projektovane da budu IL-31-zavisne uključuju IL-3-zavisnu BaF3 ćelijsku liniju (Palacios i Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot i ostali, Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986), FDC-P1 (Hapel i ostali, Blood 64: 786-790, 1984), i MO7e (Kiss i ostali, Leukemia 7: 235-240, 1993). Ćelijske linije zavisne od faktora rasta mogu biti uspostavljene u skladu sa objavljenim metodama (npr. Greenberger i ostali, Leukemia Res. 8: 363-375, 1984; Dexter i ostali, u Baum i ostali izdanjima, Experimental Hematology Today, 8th Ann. Mtg. Int. Soc. Exp. Hematol. 1979, 145-156, 1980). Aktivnost humanizovanog anti-IL-31 antitela ili antagonista se može meriti u BaF3 testu proliferacije, Biacore testu, ili NHK testovima ovde opisanim.
[0040] U jednom tehničkom rešenju, domen konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina je odabran iz grupe koja se sastoji od konstantnog regiona α, γ, µ, δ ili ε teškog lanca humanog imunoglobulina. Navedeni konstantni region može biti konstantni region γ1, γ2, γ3 ili γ4 teškog lanca humanog imunoglobulina.
[0041] U drugom tehničkom rešenju, domen konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina je odabran iz grupe koja se sastoji od konstantnog regiona κ ili λ lakog lanca humanog imunoglobulina.
[0042] U drugom tehničkom rešenju, težak konstantni lanac je humani γ4, koji je stabilan u rastvoru i ima malo ili nema aktivnost aktivacije komplementa. U drugom tehničkom rešenju, težak konstantni lanac je humani γ1.
[0043] Imunoglobulin može biti odabran iz bilo koje od velikih klasa imunoglobulina, uključujući IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, i bilo koje podklase ili izotopa, npr. IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4; IgA-1 i IgA-2.
[0044] Inhibirajuća aktivnost IL-a31 može da se meri brojnim testovima. Dodatno testovima koji su ovde stavljeni na uvid javnosti, uzorci mogu biti testirani na inhibiciju IL-31 aktivnosti u okviru raznih testova dizajniranih za merenje vezivanja za receptor, stimulacije/inhibicije IL-31-zavisnih ćelijskih odgovora ili proliferacije IL-31RA receptoreksprimirajućih ćelija.
[0045] IL-31-vezujući polipeptid, uključujući IL-31 antigen vezujuće molekule ili IL-31 antagoniste može takođe biti upotrebljen za prečišćavanje liganda. Polipeptid je imobilisan na čvrstu podlogu, kao što su perle agaroze, unakrsno-povezana agaroza, staklo, celulozne smole, smole na bazi silikona, polistiren, unakrsno-povezan poliakrilamid, ili kao materijali koji su stabilni pod uslovima primene. Metode za vezivanje polipeptida za čvrste podloge su poznate prosečnim poznavaocima oblasti, i uključuju hemiju amina, aktivaciju cijanogen bromida, aktivaciju N-hidroksisukcinimida, epoksid aktivaciju, sulfhidril aktivaciju, i hidrazid aktivaciju. Dobijeni medijum će generalno biti konfigurisan u formi kolone, i tečnosti koje sadrže ligand se propuštaju kroz kolonu jedan put ili više puta da bi se omogućilo ligandu da se veže za polipeptid receptora. Ligand se potom eluira primenom promena u koncentraciji soli, haotropnih agenasa (gvanidin HCl), ili pH da se prekine ligandreceptor vezivanje.
[0046] Humanizovani IL-31 antigen vezujući molekuli ili IL-31 antagonisti se smatraju da su posebno vezujući ukoliko: 1) pokazuju granični nivo vezujuće aktivnosti, i 2) oni značajno unakrsno ne reaguju sa odgovarajućim polipeptidnim molekulima. Granični nivo vezivanja je određen ako se IL-31 antigen vezujući molekuli ili IL-31 antagonisti ovde vezuju za IL-31 polipeptid, peptid ili epitop sa afinitetom najmanje 10-puta većim od vezujućeg afiniteta za kontrolni (ne-IL-31) polipeptid. Poželjno je da antitela pokažu vezujući afinitet (Ka) od 10<6>M<-1>ili veći, poželjno 10<7>M<-1>ili veći, poželjnije 10<8>M<-1>ili veći, i najpoželjnije 10<9>M<-1>ili veći. Afinitet vezivanja humanizovanih IL-31 antigen vezujućih molekula ili IL-31 antagonista može biti lako određen od strane prosečnog poznavaoca oblasti, na primer, Scatchard analizom (Scatchard, G., Ann. NY Acad. Sci.51: 660-672, 1949).
1
[0047] Da IL-31 antigen vezujući molekuli ili IL-31 antagonisti značajno ne reaguju unakrsno sa odgovarajućim polipeptidnim molekulima pokazano je, na primer, pomoću IL-31 antigen vezujućih molekula ili IL-31 antagonista koji detektuju IL-31 polipeptide ali nepoznate odgovarajuće polipeptide primenom standardnih Western blot analiza (Ausubel i ostali, ibid.). Ispitivanje takođe može da se obavi primenom ne-humanih IL-31, i IL-31 mutantskih polipeptida. Dodatno, IL-31 antigen vezujući molekuli ili IL-31 antagonisti mogu biti "ispitani na" poznate odgovarajuće polipeptide, da bi se izolovala populacija koja se specifično vezuje za IL-31 polipeptide. Na primer, IL-31 antigen vezujući molekuli ili IL-31 antagonisti su adsorbovani na odgovarajuće polipeptide koji su pričvršćeni za nerastvoran matriks; IL-31 antigen vezujući molekuli ili IL-31 antagonisti specifični za IL-31 će teći kroz matriks pod odgovarajućim puferskim uslovima. Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow i Lane (urednici), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan, i ostali (urednici), National Institutes of Health, John Wiley i Sons, Inc., 1995.
[0048] Humanizovani IL-31 antigen vezujući molekuli ili IL-31 antagonisti su okarakterisani njihovom sposobnošću da blokiraju, inhibiraju, spreče, ili redukuju vezivanje za receptor kada se gaje u prisustvu prečišćenih rekombinantnih proteina humanog IL-31. Na primer, humanizovani IL-31 antigen vezujući molekuli ili IL-31 antagonisti mogu biti okarakterisani na više načina uključujući “binning” (testiranje/karakterizaciju i sortiranje) (tj, određivanje da li svako antitelo može da inhibira vezivanje bilo kog drugog vezivanja), relativni afinitet, i neutralizaciju.
[0049] HumanizovanI IL-31 antigen vezujućI molekuli ili IL-31 antagonisti predmetnog pronalaska su prikazani u Tabeli 1, ispod, i na Slici 1.
[0050] U Tabeli 1, ispod, za klonove sa oznakom "12VH1" (tj., klonove 7, 9, 10, 13-18, i 26-36): Termin "fback" znači LC(back) HC(fback); Termin "LC(back)" znači LC(G66R, G68E, D70Q, F71Y, T72S); i termin "HC(back)" znači HC(F29L, M69L, R71A, T73K, V78A, R94F). Slično, u Tabeli 1, ispod klonova sa oznakom "12VH5" (tj., klonova 8, 11 i 21-24): termin "fback" znači LC(back) HC(fback); termin "LC(back)" znači LC(G66R, G68E, D70Q, F71Y, T72S); i termin "HC(back)" znači HC(G24A, S28T, F29L, I69L, S70T, R94F).
Tabela 1: Humanizovani 292.12.3.1 konstrukti
1
[0051] Antitela ovde stavljena na uvid javnosti mogu biti proizvedena tehnikama poznatim per se u oblasti, kao što su rekombinantne tehnologije, hemijska sinteza, kloniranje, vezivanje, ili njihove kombinacije. U jednom tehničkom rešenju, antitela predmetnog pronalaska su proizvedena rekombinantnim tehnologijama, npr., eksprimiranjem odgovarajuće nukleinske kiseline u pogodnoj ćeliji domaćina. Proizvedeni polipeptid može biti glikoziliran ili ne, ili može sadržati druge post-translacione modifikacije koje zavise od tipa upotrebljene ćelije domaćina. Mnogi udžbenici i pregledi obezbeđuju učenja kako klonirati i proizvesti rekombinantne proteine primenom vektora i prokariotskih ili eukariotskih ćelija domaćina, kao što su neki naslovi u serijama "A Practical Approach" objavljeni u Oksfordskoj univerzitetskoj štampi ("DNA Cloning 2: Expression Systems", 1995; "DNA Cloning 4: Mammalian Systems", 1996; "Protein Expression", 1999; "Protein Purification Techniques", 2001).
[0052] Dalji cilj predmetne objave je prema tome izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira bilo koje od antitela koja su opisana u tekstu iznad i ispod, ili komplementarni niz ili
1
njihova degenerisana sekvenca. U vezi za ovim, termin "molekul nukleinske kiseline" obuhvata sve različite tipove nukleinskih kiselina, uključujući bez ograničenja dezoksiribonukleinske kiseline (npr., DNK, cDNK, gDNK, sintetička DNK, itd.), ribonukleinske kiseline (npr., RNK, iRNK, itd.) i peptid-nukleinske kiseline (PNA). U poželjnom tehničkom rešenju, molekul nukleinske kiseline je DNK molekul, kao što je DNK molekul dvostrukog niza ili cDNK molekul. Termin "izolovan" se odnosi na molekule nukleinskih kiselina koji su identifikovani i odvojeni od najmanje jednog kontaminirajućeg molekula nukleinske kiseline sa kojim su obično u vezi u prirodnom izvoru. Izolovan molekul nukleinske kiseline je drugačije forme i pojave od one koja je primećena u prirodi. Izolovani molekuli nukleinske kiseline se stoga razlikuju od specifičnog molekula nukleinske kiseline koji postoji u prirodnim ćelijama. Degenerativna sekvenca označava bilo koju nukleotidnu sekvencu koja kodira istu aminokiselinsku sekvencu kao naznačena nukleotidna sekvenca, ali koja sadrži posebnu nukleotidnu sekvencu kao rezultat degeneracije genetičkog koda.
[0053] Dalji cilj ove predmetne objave je vektor koji sadrži DNK koji kodira bilo koje od antitela koja su opisana u tekstu iznad i ispod. Vektor može biti bilo koji vektor za kloniranje ili eksprimiranje, integrativne ili samostalne replikacije, funkcionalan u bilo kojoj prokariotskoj ili eukariotskoj ćeliji. Posebno, vektor može biti plazmid, kozmid, virus, fag, epizom, veštački hromozom, i slično. Vektor može sadržati kodirajuće sekvence i za težak i lak lanac, ili kodirajuće sekvence bilo za lak bilo za težak lanac. Kada vektor sadrži sekvence i za teške i lake lance, svaki od teških i lakih lanaca može biti operativno vezan za promotera. Promoter može biti isti ili različit za težak i lak lanac. Težak i lak lanac mogu takođe biti operativno vezani za jedan zaseban promoter, u ovom slučaju kodirajuće sekvence za težak i lak lanac mogu poželjno biti razdvojene sa unutrašnjim ribozomalnim ulaznim mestom (internal ribosomal entry site - IRES). Pogodni promoteri za eksprimiranje eukariotskih gena su, na primer, promoteri izvedeni iz virusnih gena kao što su mišji ili humani citomegalovirus (CMV) promoter ili promoter Rausovog virusa sarkoma (rous sarcoma virus - RSV), koji su dobro poznati prosečnim poznavaocima oblasti. Vektor može sadržati regulatorne elemente, kao što su promoter, terminator, pojačivač, marker selekcije, poreklo replikacije, itd. Posebni primeri ovakvih vektora uključuju prokariotske plazmide, kao što su pBR, pUC ili pcDNK plazmidi; virusne vektore, uključujući retrovirusne, adenovirusne ili adeno asociranog virusa (adeno-associated virus – AAV) vektore; bakteriofage; bakuloviruse; bakterijski veštački hromozom (bacterial artificial chromosome - BAC) ili veštački hromozom kvasca (yeast
1
artificial chromosome - YAC), itd., kao što će biti razmatrano u tekstu ispod. Odgovarajuća sekvenca nukleinske kiseline može biti insertovana unutar vektora raznim procedurama. Uopšteno, DNK se insertuje unutar odgovarajućeg/odgovarajućih mesta restrikcione endonukleaze primenom tehnika poznatih u oblasti. U izgradnji pogodnih vektora koji sadrže jednu ili više ovih komponenti se koriste standarde tehnike vezivanja koje su poznate prosečnom poznavaocu oblasti.
[0054] Sledeći aspekt predmetne objave je rekombinantna ćelija domaćina, gde navedena ćelija sadrži molekul nukleinske kiseline ili vektor kao što je u tekstu iznad definisano. Ćelija domaćina može biti prokariotska ili eukariotska ćelija. Primeri prokariotskih ćelija uključuju bakterije, kao što je E.coli. Primeri eukariotskih ćelija su ćelije kvasca, ćelije biljaka, ćelije sisara i ćelije insekata uključujući bilo koju primarnu ćelijsku kulturu ili utvrđenu ćelijsku liniju (npr., 3T3, Véro, HEK293, TN5, itd.). Pogodne ćelije domaćina za eksprimiranje glikoziliranih proteina su izvedene iz multićelijskih organizama. Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije insekata kao što su Drozofila S2 i Spodoptera Sf9, kao i ćelije biljaka. Primeri primenljivih ćelijskih linija sisara uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (Chinese hamster ovary - CHO) i COS ćelije. Specifičniji primeri uključuju CV1 liniju bubrega majmuna transformisanu pomoću SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); liniju bubrega humanog embriona (293 ili 293 ćelije subklonirane za rast u suspenzionoj kulturi, Graham i ostali, J. Gen Virol., 36:59 (1977)); ćelije jajnika kineskog hrčka/-DHFR (CHO, Urlaub i Chasin, Proc. Natl, Acad. Sci. Sjedinjene Američke Države, 77:4216 (1980)); mišje sertolijeve ćelije (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); humane ćelije pluća (W138, ATCC CCL 75); humane ćelije jetre (Hep G2, HB 8065); i mišji tumor dojke (MMT 060562, ATCC CCL51). Posebno poželjne ćelije sisara predmetne objave su CHO ćelije. Dalje posebno poželjne ćelije sisara pogodne za eksprimiranje antitela predmetnog pronalaska su mišje ćelije, kao što su ćelije mišjeg mijeloma (NS0).
[0055] Kao što je ovde u tekstu iznad stavljeno na uvid javnosti, antitela predmetnog pronalaska mogu biti proizvedena bilo kojom tehnikom poznatom per se u oblasti, kao što su rekombinantne tehnologije, hemijska sinteza, kloniranje, ligacije, ili njihove kombinacije. U posebnom tehničkom rešenju, rastvorljivi receptori se proizvode rekombinantnim tehnologijama, npr., eksprimiranjem odgovarajuće nukleinske kiseline u pogodnoj ćeliji domaćina. Drugi cilj ove predmetne objave je stoga metoda proizvodnje antitela predmetnog pronalaska, metoda koja obuhvata kultivaciju rekombinantne ćelije domaćina predmetne objave pod uslovima koji omogućavaju eksprimiranje molekula nukleinske kiseline, i
1
prečišćavanje dobijenog polipeptida. Metoda proizvodnje predmetne objave može dalje obuhvatati korak formulacije polipeptida unutar farmaceutske kompozicije. Proizveden polipeptid može biti glikozilovan ili ne, ili može sadržati druge post-translacione modifikacije koje zavise od upotrebljenog tipa ćelije domaćina. Mnogi udžbenici i pregledi obezbeđuju učenja kako klonirati i proizvesti rekombinantne proteine primenom vektora i prokariotskih ili eukariotskih ćelija domaćina, kao što su neki naslovi u serijama "A Practical Approach" objavljeni od strane Oxford Univeristy Press ("DNA Cloning 2: Expression Systems", 1995; "DNA Cloning 4: Mammalian Systems", 1996; "Protein Expression", 1999; "Protein Purification Techniques", 2001).
[0056] Vektori koji se koriste u metodi proizvodnje antitela u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu biti epizomalni ili ne-/homologno integrišući vektori, koji mogu biti uvedeni u odgovarajuće ćelije domaćina bilo kojim pogodnim načinima (transformacijom, transfekcijom, konjugacijom, fuzijom protoplasta, elektroporacijom, taloženjem kalcijum fosfata, direktnim mikroinjektiranjem, itd.). Važni faktori u odabiru određenog plazmida, virusnog ili retrovirusnog vektora uključuju: lakoću sa kojom ćelije primaoca koje sadrže vektor mogu biti prepoznate i odabrane od onih ćelija primaoca koje ne sadrže vektor; broj kopija vektora koji je poželjan kod određenog domaćina; i da li je poželjno da bude sposoban da “prebaci” vektor između ćelija domaćina različitih vrsta. Vektori treba da dozvole eksprimiranje polipeptida ili fuzionih proteina predmetne objave u prokariotskim ili eukariotskim ćelijama domaćina, pod kontrolom odgovarajućih regulatornih sekvenci transkripcijske inicijacije / terminacije, koji su odabrani da budu konstitutivno aktivni ili inducibilni u navedenoj ćeliji. Ćelijska linija suštinski obogaćena ovakvim ćelijama može biti potom izolovana da bi se obezbedila pogodna ćelijska linija.
[0057] Ćelije domaćina su transfektovane ili transformisane sa vektorima za eksprimiranje ili kloniranje koji su ovde opisani za proizvodnju proteina i kultivisani u konvencionalnom hranljivom medijumu modifikovanom da bude pogodan za induciranje promotera, odabir transformanata, ili pojačavanje gena koji kodiraju željene sekvence. Uslovi kultivisanja, kao što su medijum, temperatura, pH i slično, mogu biti odabrani od strane prosečnog poznavaoca oblasti bez nepotrebnog eksperimentisanja. Uopšteno, principi, protokoli, i praktične tehnike za maksimizaciju produktivnosti ćelijskih kultura mogu se naći u Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) i Sambrook i ostali, iznad.
1
[0058] Za eukariotske ćelije domaćina (npr. kvasci, ćelije insekata ili sisara), različite transkripcione i translacione regulatorne sekvence mogu biti upotrebljene, zavisno od prirode domaćina. Oni mogu biti izvedeni iz virusnog izvora, kao što su adenovirus, papiloma virus, Simijan virus ili slično, gde su regulatorni signali udruženi sa određenim genom koji ima visok nivo eksprimiranja. Primeri su TK promoter Herpes virusa, SV40 rani promoter, kvaščev gal4 gen promoter, itd. Regulatorni signali transkripcione inicijacije mogu biti odabrani da se omogući represija i aktivacija, tako da eksprimiranje gena može biti podešeno. Ćelije koje su stabilno transformisane uvedenom DNK mogu biti odabrane takođe uvođenjem jednog ili više markera što omogućava odabir ćelija domaćina koje sadrže vektor za eksprimiranje. Marker može takođe da obezbedi fototrofiju auksotrofnom domaćinu, otpornost na biocide, npr. antibiotike, ili teške metale kao što je bakar, ili slično. Selektibilno markiran gen može biti ili direktno vezan za DNK sekvence da bi bio eksprimiran (npr., na isti vektor), ili uveden unutar iste ćelije ko-transfekcijom. Dodatni elementi mogu takođe biti potrebni za optimalnu sintezu proteina.
[0059] Pogodne prokariotske ćelije uključuju bakterije (kao što su Bacillus subtilis ili E. coli) transformisane rekombinantnim bakteriofagom, plazmid ili kozmid DNK eksprimirajući vektor. Ovakve ćelije tipično proizvode proteine koji sadrže N-terminalni metionin ostatak. Poželjne ćelije za primenu u predmetnoj objavi su eukariotske ćelije domaćina, npr. ćelije sisara, kao što su humane, majmunske, mišje, i ćelije ovarijuma kineskog hrčka (CHO), jer one obezbeđuju post-translacione modifikacije proteinskih molekula, uključujući ispravno savijanje ili glikolizaciju na pravim mestima. Primeri pogodnih ćelija domaćina sisara uključuju bubrežne ćelije afričkog zelenog majmuna (Vero; ATCC CRL 1587), bubrežne ćelije humanog embriona (293-HEK; ATCC CRL 1573), bubrežne ćelije bebe hrčka (BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), bubrežne ćelije pasa (MDCK; ATCC CCL 34), ćelije ovarijuma kineskog hrčka (CHO-K1; ATCC CCL61; CHO DG44 (Chasin i ostali, Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986)), ćelije hipofize pacova (GH1; ATCC CCL82), HeLa S3 ćelije (ATCC CCL2.2), ćelije hepatoma pacova (H-4-II-E; ATCC CRL 1548), SV40-transformisane bubrežne ćelije majmuna (COS-1; ATCC CRL 1650), Bowes-ov melanom i humani hepatocelularni karcinom (na primer Hep G2), mišje embrionske ćelije (NIH-3T3; ATCC CRL 1658) i brojne druge linije ćelija. Alternativne eukariotske ćelije domaćina su ćelije kvasca (npr., Saccharomyces, Kluyveromyces, itd.) transformisane sa eksprimirajućim vektorima kvasca. Takođe ćelije kvasca mogu izvršiti post-translacione peptidne modifikacije uključujući glikozilaciju. Postoji nekoliko strategija rekombinantne
2
DNK koje koriste jake promoterske sekvence i visok broj kopija plazmida koji mogu biti upotrebljeni za proizvodnju željenih proteina u kvascu. Ćelije kvasca prepoznaju vodeće sekvence u kloniranim proizvodima gena sisara i izlučuju polipeptide koji nose vodeće sekvence (tj., pre-peptide).
[0060] Dugoročno, poželjna je proizvodnja sa visokim prinosom rekombinantnog polipeptida, stabilnog eksprimiranja. Na primer, ćelijske linije koje stabilno eksprimiraju polipeptid od interesa mogu biti transformisane primenom eksprimirajućih vektora koji mogu sadržati replikaciju virusnog porekla i/ili endogene ekspresione elemente i selektibilno markiran gen na istom ili na odvojenom vektoru. Nakon uvodjenja vektora, ćelijama je dozvoljeno da rastu tokom 1-2 dana u obogaćenom medijumu pre nego što se prebace na selektivni medijum. Svrha selektibilnog markera je da pruži otpor selekciji, i njegovo prisustvo dopušta rast i prečišćenje ćelija koje uspešno eksprimiraju uvedene sekvence. Otporni klonovi stabilno transformisanih ćelija mogu biti umnoženi primenom tehnika za tkivne kulture koje odgovaraju tipu ćelije. Ćelijska linija suštinski obogaćena ovakvim ćelijama može biti potom izolovana da bi se obezbedila pogodna ćelijska linija.
[0061] Posebno poželjna metoda proizvodnje visokog prinosa rekombinantnog polipeptida je preko primene pojačanja dihidrofolat reduktaze (DHFR) u DHFR-deficijentnim CHO ćelijama, primenom sukcesivno rastućih nivoa metotreksata ako što je opisano u US 4,889,803. Dobijeni polipeptid može biti u glikozilovanoj formi.
[0062] Antitela ovde stavljena na uvid javnosti mogu takođe biti eksprimirana u drugim eukariotskim ćelijama, kao što su ćelije ptica, gljivica, insekata, kvascat, ili biljaka. Bakulovirus sistem obezbeđuje efikasne načine za uvođenje kloniranih gena unutar ćelija insekta. Materijali za eksprimirajuće sisteme bakulovirusa / ćelija insekta su komercijalno dostupni u obliku kita (kompleta) od, između ostalog, Invitrogena.
[0063] Dodatno tehnologijama, rekombinantne DNK, antitela ovog predmetnog pronalaska mogu biti pripremljena tehnologijama hemijske sinteze. Primeri tehnologija hemijske sinteze su sinteza čvrste faze i sinteza tečne faze. Kao sinteza čvrse faze, na primer, aminokiselina koja odgovara karboksilnom kraju polipeptida koji se sintetiše je vezana za podlogu koja je nerastvorna u organskim rastvaračima i, alternativnim ponavljanjem reakcija (npr., sekvencijalnom kondenzacijom aminokiselina sa njihovim amino grupama i funkcionalnim grupama bočnog lanca koje su zaštićene sa odgovarajućim zaštitnim grupama), polipeptidni lanac se produžava. Metode sinteze čvrste faze su široko klasifikovane tBoc metodom i Fmoc metodom, koje zavise od tipa upotrebljene zaštitne grupe. Potpuno sintetički proteini su stavljeni na uvid javnosti u literaturi (Brown A i ostali, 1996).
[0064] Antitela predmetnog pronalaska mogu biti proizvedena, formulisana, administrirana, ili generički primenjena u drugim alternativnim formama koje mogu biti poželjne u skladu sa željenom metodom primene i/ili proizvodnje. Proteini predmetne objave mogu biti posttranslaciono modifikovani, na primer glikolizacijom. Polipeptidi ili proteini predmetne objave mogu biti obezbeđeni u izolovanoj (ili prečišćenoj) biološko aktivnoj formi, ili kao prekursori, derivati i/ili njihove soli.
[0065] Korisni konjugati ili kompleksi mogu takođe biti generisani za poboljšanje agenasa u smislu efikasnosti isporuke leka. U ovu svrhu, antitela koja su ovde opisana mogu biti u formi aktivnih konjugata ili kompleksa sa molekulima kao što su polietilen glikol i drugi prirodni ili sintetski polimeri (Harris JM i Chess RB, 2003; Greenwald RB i ostali, 2003; Pillai O i Panchagnula R, 2001). U vezi sa ovim, predmetna objava razmatra hemijski modifikovana antitela kao što je ovde stavljeno na uvid javnosti, u kojima je antitelo vezano za polimer. Tipično, polimer je rastvorljiv u vodi tako da se konjugat ne taloži u vodenoj sredini, kao što je fiziološka sredina. Primer pogodnog polimera je onaj koji je modifikovan da ima jednu reaktivnu grupu, kao što je aktivni estar za acilaciju, ili aldehid za alkilaciju. Na ovaj način, stepen polimerizacije može biti kontrolisan. Primer reaktivnog aldehida je polietilen glikol propionaldehid, ormono- (C1-C10) alkoksi, ili njihovi ariloksi derivati (videti, na primer, Harris, i ostali, Američki patent sa brojem 5,252, 714). Polimer može biti razgranat ili nerazgranat. Pored toga, smeša polimera može biti primenjena za proizvodnju konjugata. Konjugati primenjeni za lečenje mogu sadržati farmaceutski prihvatljive u vodi rastvorljive polimerne delove. Pogodni u vodi rastvorni polimeri uključuju polietilen glikol (PEG), monometoksi-PEG, mono- (C1-C10) alkoksi-PEG, ariloksi- PEG, poli- (N-vinil pirolidon) PEG, tresyl monometoksi PEG, PEG propionaldehid, bis-sukcinimidil karbonat PEG, homopolimeri propilen glikola, ko-polimer polipropilenoksida/etilen oksida, polioksietilovani polioli (npr., glicerol), polivinil alkohol, dekstran, celuloza, ili drugi polimeri zasnovani na karbohidratu. Pogodan PEG može imati molekulsku masu od oko 600 do oko 60,000, uključujući, na primer, 5,000, 12,000, 20,000 i 25,000. Konjugat može takođe da sadrži smešu ovakvih u vodi rastvorljivih polimera.
[0066] Primeri konjugata obuhvataju bilo koje antitelo stavljeno na uvid javnosti ovde iznad i polialcil oksid deo vezan za N-kraj navedenog rastvorljivog receptora. PEG je jedan pogodan polialkil oksid. Kao ilustracija, bilo koje antitelo ovde stavljeno na uvid javnosti može biti modifikovano sa PEG-om, proces poznat kao "PEGilacija." PEGilacija može biti sprovedena bilo kojom od reakcija PEGilacije koje su poznate u oblasti (videti, na primer, EP 0154 316, Delgado i ostali, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249 (1992), Duncan i Spreafico, Clin.Pharmacokinet. 27: 290 (1994), i Francis i ostali, Int J Hematol 68: 1 (1998)). Na primer, PEGilacija može biti izvedena reakcijom acilacije ili reakcijom alkilacije sa reaktivnim molekulom polietilen glikola. U alternativnom pristupu, konjugati se formiraju kondenzacijom aktiviranog PEGa, u kome se terminalna hidroksilna ili amino grupa PEGa menja sa aktiviranim veznikom (videti, na primer, Karasiewicz i ostali, Američki patent sa brojem 5,382, 657). Poželjno, sve ove modifikacije ne utiču značajno na sposobnost antitela da vezuje humani IL-31.
[0067] Antitela koja su ovde opisana mogu sadržati dodatni N-terminalni aminokiselinski ostatak, poželjno metionin. Zaista, zavisno od sistema ekspresije i uslova, polipeptidi mogu biti eksprimirani u rekombinantnoj ćeliji domaćina sa početnim metioninom. Ova dodatna aminokiselina može potom biti bilo zadržana u dobijenom rekombinantnom proteinu, ili eliminisana pomoću egzopeptidaze, kao što je metionin aminopeptidaza, u skladu sa metodama stavljenim na uvid javnosti uliteraturi (Van Valkenburgh HA i Kahn RA, Methods Enzymol. (2002) 344:186-93; Ben-Bassat A, Bioprocess Technol. (1991) 12:147-59).
[0068] Kao što će biti prikazano u delu sa primerima predmetnog dokumenta, mišja antihumana anti-IL-31 antitela mogu uključiti potencijalna mesta glikozilacije u njihovim varijabilnim domenima. Na primer, klon 292.12.3.1 nosi mesto glikozilacije u okvirnom regionu FR1 varijabilnog domena teškog lanca. Pronalazači predmetnog pronalaska su sada otkrili da navedeno mesto glikozilacije nije neophodno da bi se zadržala dobra vezujuća sposobnost za humani IL-31. Pored toga, ukidanje ovog mesta glikozilacije (npr. mutacijom) ima pozitivan efekat na termostabilnost antitela. Prema tome u jednom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, antitela kao što je ovde stavljeno na uvid javnosti nemaju mesto glikozilacije u njihovim varijabilnim domenima.
[0069] IL-31 antigen vezujući molekuli ili IL-31 antagonisti generisani metodama koje su ovde opisane mogu biti testirani na neutralizaciju raznim metodama. Na primer luciferazni test kao što je opisano u objavljenoj američkoj patentnoj prijavi (Videti izdanje sa brojem 20030224487, Sprecher, Cindy i ostali, 2003) se može primeniti. Dodatno neutralizacija se može testirati merenjem smanjenja proizvodnje pro-inflamatornih hemokina kao što su TARC i MDC iz keratinocitnih kultura u prisustvu liganda i monoklonskog antitela. Neutralizacija takođe može biti izmerena in vivo i in vitro testovima koji su ovde opisani.
2
[0070] Redukcija TARCa i MDCa kao odgovor na humanizovana anti-IL-31 antitela i antagoniste koji su ovde opisani može biti izmerena u AD mišjem modelu kao što sledi:
Metoda I) Mužjaci NC/Nga miševa (CRL Japan) stari šest nedelja su senzitizovani intradermalno sa 50µg ekstrakta grinja (D. pteronyssinus, Indoor Biotechnologies) tri puta nedeljno na leđima i kao rezultat su se pojavile lezije slične ADu. Nakon 5 nedelja senzitizacije miševi su eutanizovani i uklonjeno im je desno uho i stavljeno u pojedinačne bunariće suda za kulture koji ima 48 bunarića (Corning) oboganenog sa RPMI+2%FBS (GIBCO Invitrogen). Ploče su postavljene u inkubatore sa kontrolisanom vlažnošću sa 5% CO2. Supernatanti su prikupljeni nakon 24 sata i zamrznuti na -20 °C do daljih analiza.
Metoda II) Ženke NC/Nga miševa (CRL Japan) stare dvanaest nedelja su senzitizovane intradermalno sa 10µg SEB (Toxin Technology) u uvo i na leđima tri puta nedeljno. Kod miševa su se kao rezultat pojavile lezije slične ADu. Nakon 5 nedelja senzitizacije miševi su eutanizovani i po 6mm uzorka biopsije je uzeto iz injektiranog uha svakog miša i stavljeno u pojedinačne bunarčiće posude za zasejavanje kulture koja ima 48 bunarčića koji su dopunjeni sa RPMI+2%FBS. Ploče su postavljene u inkubatore sa kontrolisanom vlažnošću sa 5% CO2. Supernatanti su prikupljeni nakon 24 sata i zamrznuti na -20 °C do daljih analiza.
[0071] Grupe miševa u obe studije su tretirane sa humanizovanim IL-31 antigen vezujućim molekulima ili humanizovanim IL-31 antitelima ili antagonistima intraperitonealno dva puta svake nedelje sa početkom 1 do 2 nedelje posle senzitizacije. TARC i MDC koncentracije u 24-oročasovnim uzorcima supernatanta je merena konvencionalnom ELISA (R&D Systems).
[0072] U jednom tehničkom rešenju, humanizovani IL-31 antigen vezujući molekuli ili IL-31 antagonisti predmetnog pronalaska (kao što je definisano u patentnim zahtevima) uključuju, ali nisu ograničeni na, Fab, Fab' i F(ab')2, Fd, jednolančani Fvs (scFv), jednolančana antitela, disulfidno-vezani Fvs (sdFv) i fragmente koji sadrže bilo VL bilo VH domen. Antigenvezujući fragmenti antitela, uključujući jednolančana antitela, mogu sadržati varijabilni region(e) (tj., SEK ID BReva: 25-45) samostalno ili u kombinaciji sa celokupnim ili delom sledećih: zglobni region, CH1, CH2, i CH3domeni. Takođe uključeni u predmetni pronalazak su antigen-vezujući fragmenti (kao što je definisano u patentnim zahtevima) koji takođe sadrže bilo koju kombinaciju varijabilnog(ih) regiona sa zglobnim regionom, CH1, CH2, i CH3domenima. U jednom tehničkom rešenju predmetne objave, varijabilni region teškog lanca bilo koje od SEK ID BROJEVA: 25; 27; 29; 30; 31; 35; 36; 38; 39; 40; 41; 42; 43; 44, i 45 može biti kombinovan sa varijabilnim regionom lakog lanca bilo koje od SEK ID BROJEVA: 26; 28; 32; 33; 34; i 37.
[0073] U drugom tehničkom rešenju, predmetna objava obezbeđuje izolovano antitelo ili fragment antitela koji se vezuje za humani IL-31, koji sadrži humanizovani varijabilni domen teškog lanca i humanizovani varijabilni domen lakog lanca gde su humanizovani varijabilni domen teškog lanca i humanizovani varijabilni domen lakog lanca odabrani iz grupe koja se sastoji od: a) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 25 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 26; b) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 27 i humanizovani varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM:26; c) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 25 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 28; d) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 29 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 26; e) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 27 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 28; f) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 30 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 26; g) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 31 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 26; h) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 25 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 32; i) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 25 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 33; j) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 25 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 34; k) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku
2
sekvencu sa SEK ID BROJEM: 35 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 26; 1) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 27 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 32; m) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 27 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 33; n) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 27 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 34; o) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 36 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 37; p) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 25 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 37; q) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 38 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 37; r) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 39 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 37; s) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 40 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 37; t) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 41 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 37; u) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 42 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 37; v) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 43 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 37; w) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 44 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 26; x)
2
humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 36 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 28; y) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 36 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 28; i z) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 45 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BROJEM: 37.
[0074] U drugom tehničkom rešenju, predmetna objava obezbeđuje izolovano antitelo ili fragment antitela koji se vezuje za humani IL-31, koji sadrži humanizovani varijabilni domen teškog lanca i humanizovani varijabilni domen lakog lanca gde su humanizovani varijabilni domen teškog lanca i humanizovani varijabilni domen lakog lanca odabrani iz grupe koja se sastoji od: a) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 25 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 26; b) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 27 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 26; c) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 25 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 28; d) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 29 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 26; e) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 27 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 28; f) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 30 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 26; g) humanizovanog varijabilnog domena
2
teškog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 31 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 26; h) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 25 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 32; i) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 25 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 33; j) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 25 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 34; k) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 35 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 26; l) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 27 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 32; m) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 27 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 33; n) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 27 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 34; o) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 36 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 37; p) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 25 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji sadrži aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM:
2
37; q) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji sadrži aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 38 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji sadrži aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 37; r) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji sadrži aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 39 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji sadrži aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 37; s) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 40 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 37; t) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 41 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 37; u) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 42 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 37; v) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 43 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 37; w) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 44 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 26; x) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 36 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 28; y) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 36 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 28; i z) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 45 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% identiteta sekvence od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 37.
2
[0075] U jednom aspektu predmetne objave koja obezbeđuje izolovano antitelo odabrano iz grupe koja sa sastoji od: a) antitela koje sadrži lak lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 46 i težak lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 47; b) antitela koje sadrži lak lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 48 i težak lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 49; i c) antitela koje sadrži lak lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 50 i težak lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BROJEM: 51.
[0076] Predmetna objava takođe uključuje rekombinantne humanizovane IL-31 antigen vezujuće molekule ili IL-31 antagoniste koji su funkcionalno ekvivalentni onima koji su u tekstu iznad opisani. Modifikovani humanizovani IL-31 antigen vezujući molekuli ili IL-31 antagonisti koji obezbeđuju poboljšanu stabilnost i/ili terapijsku efikasnost su takođe uključeni. Primeri modifikovanih antitela uključuju one sa konzervativnim supstitucijama aminokiselinskih ostataka, i jednom ili više delecija ili adicija aminokiselina koja značajno štetno ne menjaju korisnost za vezivanje antigena. Supstitucije mogu varirati od menjanja ili modifikovanja jednog ili više aminokiselinskih ostataka do potpunog redizajna regiona sve dok je očuvana terapijska korisnost. Humanizovani IL-31 antigen vezujući molekuli ili IL-31 antagonisti predmetnog pronalaska mogu biti modifikovani post-translaciono (npr., acetilacijom, i fosforilacijom) ili mogu biti modifikovani sintetički (npr., vezivanjem obeležavajuće grupe). Smatra se da humanizovani IL-31 antigen vezujući molekuli ili IL-31 antagonisti dizajnirani predmetnom metodom mogu imati dodatne konzervativne supetitucije aminokiselina što nema suštinski efekat na antigen vezujuće ili druge imunoglobulinske funkcije.
[0077] Humanizovani IL-31 antigen vezujući molekuli ili IL-31 antagonisti predmetnog pronalaska (kao što je definisano u patentnim zahtevima) uključuju derivate koji su modifikovani, na primer, ali bez ograničenja, derivate koji uključuju humanizovane IL-31 antigen vezujuće molekule ili IL-31 antagoniste koji su bili modifikovani, npr., glikozilacijom, acetilacijom, pegilacijom, fosfilacijom, amidacijom, derivatizacijom poznatim zaštitnim/blokirajućim grupama, proteolitičkim cepanjem, vezivanjem za ćelijski ligand ili drugi protein, itd. Bilo koja od brojnih hemijskih modifikacija može biti izvedena poznatim tehnikama, koje uključuju, ali bez ograničenja specifično hemijsko cepanje, acetilaciju, formilaciju, metaboličku sintezu tunikamicina, itd. Dodatno, derivati mogu sadržati jednu ili više ne-klasičnih aminokiselina.
[0078] Humanizovani IL-31 antigen vezujući molekuli ili IL-31 antagonisti sadrže CDR mišjeg donorskog imunoglobulina i okvirne regione teškog lanca i lakog lanca humanog akceptorskog immunoglobulina. Metode pravljenja humanizovanog antitela su stavljene na uvid javnosti u američkim patentima sa brojevima 5,301,101; 5,585,089; 5,693,762; i 6,180,370. CDR ovih antitela potom može biti graftovan za bilo koji od odabranih humanih okvirnih regiona, koji su poznati u oblasti, da bi se napravilo željeno humanizovano antitelo.
[0079] Predmetna objava takođe obezbeđuje humanizovane IL-31 antigen vezujuće molekule ili IL-31 antagoniste koji kompetitivno inhibiraju vezivanje monoklonskog antitela koje je ovde opisano za humani IL-31. Kompetitivna inhibicija može biti određena bilo kojom metodom poznatom u oblasti, na primer, primenom testova kompetitivnog vezivanja koji su ovde opisani. U poželjnim tehničkim rešenjima, antitelo kompetitivno inhibira vezivanje monoklonskog antitela predmetnog pronalska za najmanje 90%, najmanje 80%, najmanje 70%, najmanje 60%, ili najmanje 50% za polipeptid.
[0080] Predmetna objava takođe obezbeđuje humanizovane IL-31 antigen vezujuće molekule ili IL-31 antagoniste koji kompetitivno inhibiraju vezivanje antitela za epitop ovde stavljen na uvid javnosti kao što je određeno bilo kojom metodom poznatom u oblasti za određivanje kompetitivnog veztivanja, na primer, imunološki testovi koji su ovde opisanit. U poželjnim tehničkim rešenjima, antitelo kompetitivno inhibira vezivanje za epitop za najmanje 90%, najmanje 80%, najmanje 70%, najmanje 60%, ili najmanje 50%.
[0081] In vivo polu-životi humanizovanih IL-31 antigen vezujućih molekula ili IL-31 antagonista mogu biti povećani modifikacijom (npr., zamenom, uklanjanjem ili dodavanjem) aminokiselinskih ostataka koji su identifikovani kao uključeni u interakciju između Fc domena i FcRn receptora (videti, npr., međunarodne objave sa brojevima WO 97/34631 i WO 02/060919), ili vezivanjem molekula polimera kao što je polietilenglikol (PEG) visoke molekulske mase. PEG može biti vezan sa ili bez multifunkcionalnog veznika bilo preko konjugacije specifične za mesto PEG-a za N- ili C-kraj navedenih antitela ili fragmenata antitela bilo preko epsilon-amino grupa prisutnih na lizin ostacima. Derivatizacija linearnog ili razgranatog polimera koja rezultira minimalnim gubitkom biološke aktivnosti će biti primenjena. Stepen konjugacije se detaljno prati pomoću SDS-PAGE i masene spektrometrije da bi se obezbedila odgovarajuća konjugacija molekula PEGa za antitela. Neizreagovani PEG može biti odvojen iz konjugata antitelo-PEG pomoću, npr., ekskluzione ili jonoizmenjivačke hromatografije.
1
[0082] Predmetna objava uključuje kriterijume po kojima je ograničen broj aminokiselina u okvirnom regionu humanizovanog imunoglobulinskog lanca izabran da bude isti kao što su aminokiseline na tim pozicijama kod donora pre nego kod primaoca, da bi se povećao afinitet antitela koje sadrži humanizovani imunoglobulinski lanac.
[0083] Dodatno humanizovanim imunoglobulinima koji su posebno ovde opisani, drugi "suštinski homologni" modifikovani imunoglobulini u odnosu na prirodne sekvence mogu biti lako dizajnirani i proizvedeni primenom raznih rekombinantnih DNK tehnika koje su dobro poznate prosečnim poznavaocima oblasti. Razni različiti humani okvirni regioni mogu biti primenjeni pojedinačno ili u kombinaciji kao osnova za humanizovane imunoglobuline predmetnog pronalaska. Uopšteno, modifikacije gena mogu biti lako postignute raznim dobro poznatim tehnikama, kao što je dirigovana mutageneza (videti, Gillman i Smith, Gene, 8, 81-97 (1979) i S. Roberts i ostali, Nature, 328, 731-734 (1987)).
[0084] Humanizovana antitela predmetnog pronalaska uključuju fragmente (kao što je definisano u patentnim zahtevima) kao i intaktna antitela. Tipično, ovi fragmenti se takmiče sa intaktnim antitelom iz koga su dobijeni za vezivanje antigena. Fragmenti se tipično vezuju sa afinitetom od najmanje 10<7>M.<-1>, i tipičnije 10<8>ili 10<9>M.<-1>(tj., u okviru istih opsega kao i antitelo u celosti). Fragmenti humanizovanog antitela uključuju odvojene teške lance, Fab lakih lanaca, Fab' F(ab')2, i Fv. Fragmenti se proizvode tehnikama rekombinantne DNK, ili enzimskim ili hemijskim razdvajanjem intaktnih imunoglobulina.
[0085] Za detalje u humanizovanju antitela, videti evropske patente sa brojevima EP 239,400, EP 592,106, i EP 519,596; međunarodne objave br. WO 91/09967 i WO 93/17105; američki patent sa brojevima 5,225,539, 5,530,101, 5,565,332, 5,585,089, 5,766,886, i 6,407,213; i Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5): 489 498; Studnicka i ostali, 1994, Protein Engineering 7(6): 805814; Roguska i ostali, 1994, PNAS 91: 969973; Tan i ostali, 2002, J. Immunol. 169: 111925; Caldas i ostali, 2000, Protein Eng.13: 35360; Morea i ostali, 2000, Methods 20: 267 79; Baca i ostali, 1997, J. Biol. Chem. 272: 10678 84; Roguska i ostali, 1996, Protein Eng. 9: 895904; Couto i ostali, 1995, Cancer Res.55 (23 Supp): 5973s 5977s; Couto i ostali, 1995, Cancer Res. 55: 1717 22; Sihu, 1994, Gene 150: 409 10; Pedersen i ostali, 1994, J. Mol. Biol.235: 95973; Jones i ostali, 1986, Nature 321: 522-525; Reichmann i ostali, 1988, Nature 332: 323-329; i Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol.2: 593-596.
[0086] Razne tehnike su razvijene za proizvodnju fragmenata antitela. Ovi fragmenti mogu biti izvedeni pomoću proteolitičke digestije intaktnih antitela (videti, npr., Morimoto i ostali, Journal of Biochemical i Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) i Brennan i ostali,
2
Science, 229:81 (1985)), ili proizvedeni direktno od rekombinantnih ćelija domaćina. Na primer, fragmenti antitela mogu biti izolovani iz biblioteka antitela faga o kojima je diskutovano u tekstu iznad. Alternativno, Fab'-SH fragmenti mogu biti direktno prečišćeni iz E. coli i hemijski spojeni čime se formiraju F(ab')2fragmenti (Carter i ostali, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). U skladu sa dugim pristupom, F(ab')2fragmenti mogu biti direktno izolovani iz rekombinantne ćelijske kulture domaćina. Druge tehnike za proizvodnju fragmenata antitela su očigledne prosečnom poznavaocu oblasti. Dalje, primeri tehnika koje mogu biti primenjene za proizvodnju jefnolančanih Fvs i antitela uključuju one koje su opisane u amerikom patentu 4,946,778 i 5,258,498; Huston i ostali, Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu i ostali, PNAS 90:7995-7999 (1993); i Skerra i ostali, Science 240:1038-1040 (1988).
[0087] Predmetna objava obuhvata antitela rekombinantno spojena ili hemijski konjugovana (uključujući i kovalentne i nekovalentne konjugacije) za polipeptid (ili njegov deo, poželjno najmanje 10, 20 ili 50 aminokiselina polipeptida) čime se stvaraju fuzioni proteini. Tako, predmetna objava se takođe odnosi na imunokonjugate koji sadrže ovde opisano antitelo konjugovane za citotoksični agens kao što je hemoterapijski agens, toksin (npr. enzimski aktivan toksin bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla, ili njihove fragmente), ili radioaktivni izotop (tj., radiokonjugat).
[0088] Predmetna objava dalje uključuje kompozicije koje sadrže polipeptide predmetne objave (npr., one koje sadrže imunogeni ili antigeni epitop) spojene ili konjugovane za heterologne peptidne sekvence (npr., domene antitela različite od varijabilnih regiona). Na primer, polipeptidi predmetne objave mogu biti spojeni ili konjugovani za Fc region antitela, ili njegov deo. Na primer, polipeptidi predmetne objave (uključujući njihove fragmente ili varijante), mogu biti spojeni sa konstantnim domenom imunoglobulina (IgA, IgE, IgG, IgM), njihovim delovima (CH1, CH2, CH3, ili bilo kojom njihovom kombinacijom i njihovim delovima, čime se dobijaju himerni polipeptidi. Deo antitela koji je spojen za polipeptid predmetne objave može sadržati konstantni region, zglobni region, CH1domen, CH2domen, i CH3domen ili bilo koju kombinaciju celih domena ili njihovih delova. Polipeptidi mogu takođe biti spojeni ili konjugovani sa gore pomenutim delovima antitela čime se formiraju multimeri. Na primer, Fc delovi spojeni sa polipeptidima predmetne objave mogu da formiraju dimere putem disulfidnog vezivanja između Fc delova. Više multimerne forme mogu biti napravljene spajanjem polipeptida sa delovima IgA i IgM. Metode za spajanje ili konjugaciju polipeptida predmetne objave sa delovima antitela su poznate u oblasti. Videti, npr., američke patente sa brojevima 5,336,603; 5,622,929; 5,359,046; 5,349,053; 5,447,851; 5,112,946; EP 307,434; EP 367,166; PCT izdanja WO 96/04388; WO 91/06570; Ashkenazi i ostali, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539 (1991); Zheng i ostali, J. Immunol.
154:5590-5600 (1995); i Vil i ostali, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341(1992). U drugom neograničavajućem primeru, polipeptidi i/ili antitela predmetne objave (uključujući njihove fragmente ili varijante) mogu biti spojeni sa albuminom (koji uključuje ali nije ograničen na rekombinantni humani serumski albumin ili njegove fragmente ili varijante (videti, npr., američki patent sa brojem 5,876,969, objavljen 2. marta 1999, EP patent 0413 622, i američki patent sa brojem 5,766,883, objavljen 16. juna 1998)). Polipeptidi ovde stavljeni na uvid javnosti i/ili antitela predmetnog pronalaska (uključujući njihove fragmente ili varijante) mogu biti spojeni bilo sa N- bilo sa C-krajem heterolognog proteina (npr., imunoglobulinskog Fc polipeptida ili humanog serumskog albuminskog polipeptida). Polinukleotidi koji kodiraju fuzione proteine su takođe ovde stavljeni na uvid javnosti.
[0089] Kao što je razmatrano u tekstu iznad, polipeptidi predmetne objave mogu biti spojeni ili konjugovani sa gore pomenutim delovima antitela da bi se povećao in vivo polu život polipeptida ili za primenu u imunološkim testovima koji koriste metode poznate u oblasti. Dalje, polipeptidi predmetne objave mogu biti spojeni ili konjugovani sa gore pomenutim delovima antitela da bi se olakšalo prečišćavanje. Jedan prijavljen primer opisuje himerne proteine koji se sastoje od prva dva domena humanog CD4-polipeptida i raznih domena konstantnih regiona teških ili lakih lanaca imunoglobulina sisara. (Videti, npr., EP 394,827; Traunecker i ostali, Nature 331:84-86 (1988)). Poboljšana isporuka antigena preko epitelijalne barijere imunom sistemu je demonstrirana za antigene (npr., insulin) konjugovane sa FcRn vezujućim partnerom kao što su fragmenti IgG-a ili Fc-a (videti, npr., PCT izdanja WO 96/22024 i WO 99/04813). Polipeptidi predmetne objave spojeni ili konjugovani sa antitelom koje ima disulfidno-vezane dimerne strukture (zbog IgG) mogu takođe biti efikasniji u vezivanju i neutralizaciji drugih molekula, nego monomerni izlučeni protein ili sam proteinski fragment. (Fountoulakis i ostali, J. Biochem. 270:3958-3964 (1995)). U mnogim slučajevima, Fc deo u fuzionom proteinu je korisan u lečenju i dijagnozi, i tako može rezultirati, na primer, poboljšanjem farmakokinetičkih osobina. (EP A 232,262). Alternativno, brisanje Fc dala nakon što je fuzioni protein eksprimovan, uočen, i prečišćen, bi bilo poželjno. Na primer, Fc deo može ometati lečenje i dijagnozu ako je fuzioni protein primenjen kao antigen za imunizacije. U otkrivanju lekova, na primer, humani proteini, kao što je hIL-5, se spajaju sa Fc delovima u svrhu testova visokopropusnog skrininga da bi se
4
identifikovali antagonisti hIL-5. (Videti, D. Bennett i ostali, J. Molecular Recognition 8:52-58 (1995); K. Johanson i ostali, J. Biol. Chem. 270:9459-9471 (1995)0. Ovakve tehnike takođe uključuju, ali nisu ograničene na, primenu bifunkcionalnih konjugacionih agenasa (videti npr., američke patente sa brojevima 5,756,065; 5,714,631; 5,696,239; 5,652,361; 5,505,931; 5,489,425; 5,435,990; 5,428,139; 5,342,604; 5,274,119; 4,994,560; i 5,808,003).
[0090] Osim toga, polipeptidi stavljeni ovde na uvid javnosti (npr., antitela ili njihovi fragmenti predmetnog pronalaska) mogu biti spojeni sa sekvencama za markiranje, kao što je peptid koji olakšava njihovo prečišćavanje. U daljem tehničkom rešenju, nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptide predmetne objave (uključujući, ali bez ograničenja na nukleinske kiseline koje kodiraju imunogenske i/ili antigenske epitope) mogu takođe biti rekombinovane sa genom od interesa kao epitopska oznaka (npr., hemaglutinin oznaka ("HA") ili “flag oznaka”) da bi se pomoglo u detekciji i prečišćavanju eksprimiranog polipeptida. U poželjnim tehničkim rešenjima, marker aminokiselinska sekvenca je heksa-histidin peptid, kao što je oznaka obezbeđena u pQE vektoru (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Kalifornija, 91311), među ostalima, od kojih su mnogi komercijalno dostupni. Kao što je opisano u Gentz i ostali, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989), na primer, heksa-histidin obezbeđuje pogodno prečišćavanje fuzionog proteina. Druge peptidne oznake korisneza prečišćavanje uključuju, ali nisu ograničene na, "HA" oznaku, koji odgovara epitopu koji je izveden iz hemaglutinin proteina influence (Wilson i ostali, Cell 37:767 (1984)) I "flag" ozmaku.
[0091] Predmetna objava dalje obuhvata humanizovane IL-31 antigen vezujuće molekule ili IL-31 antagoniste konjugovane sa dijagnostičkim ili terapijskim agensom. IL-31 antigen vezujući molekuli ili IL-31 antagonisti mogu biti primenjeni dijagnostički da se, na primer, prati razvoj ili progresija pruritičke bolesti kao deo postupka kliničkog ispitivanja da se, npr., odredi efikasnost datog režima za lečenje, dijagnozu, otkrivanje, i/ili prevenciju. Otkrivanje može biti olakšano spajanjem antitela za uočljivu supstancu. Primeri uočljivih supstanci uključuju razne enzime, prostetične grupe, fluorescentne materijale, luminescentne materijale, bioluminescentne materijale, radioaktivne materijale, pozitron emitujuće metale primenjujući razne pozitron emisione tomografije, i neradioaktivne paramagnetske metalne jone. Videti, na primer, američki patent sa brojem 4,741,900 za metalne jone koji mogu biti konjugovani sa antitelima za dijagnostičku primenu u skladu sa predmetnom objavom. Primeri pogodnih enzima uključuju ren peroksidaze, alkalnu fosfatazu, beta-galaktozidazu, ili acetilholinesterazu; primeri pogodnih kompleksa prostetične grupe uključuju streptavidin/biotin i avidin/biotin; primeri pogodnih fluorescentnih materjiala uključuju umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, danzil hlorid ili fikoeritrin; primer luminescentnog materijala uključuje luminol; primeri bioluminescentnih materijala uključuju luciferazu, luciferin, i aekvorin; i primeri pogodnog radioaktivnog materijala uključuju<125>I,<131>I,<111>In ili<99>Tc.
[0092] Dalje, humanizovani IL-31 antigen vezujući molekuli ili IL-31 antagonisti mogu biti konjugovani sa terapijskim delom kao što je citotoksin, npr., citostatski ili citocidni agens, terapijski agens ili radioaktivni metalni jon. Citotoksin ili citotoksični agens uključuje bilo koji agens koji je štetan za ćelije. Primeri uključuju paklitaksol, citohalazin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracin dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoidi, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol, i puromicin i njihovi analozi ili homolozi. Terapijski agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, antimetabolite (npr., metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tiogvanin, citarabin, 5-fluorouracil dekarbazin), alkilirajući agensi (npr., mehloretamin, tioepa hlorambucil, melfalan, karmustin (BSNU) i lomustin (CCNU), ciklotosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomicin C, i cis-dihlorodiamin platinum (II) (DDP) cisplatin), antraciklini (npr., daunorubicin (ranije daunomicin) i doksorubicin), antitela (npr., daktinomicin (ranije aktinomicin), bleomicin, mitramicin, i antramicin (AMC)), i anti-mitotičke agense (npr., vinkristin i vinblastin).
[0093] Konjugati predmetne objave mogu biti primenjeni za modifikovanje datog biološkog odgovora, terapijski agens ili deo leka ne treba da se smatraju ograničenim na klasične terapijske agense. Na primer, deo leka može biti protein ili polipeptid koji ima poželjnu biološku aktivnost. Ovakvi proteini mogu uključiti, na primer, toksin kao što je abrin, ricin A, egzotoksin pseudomonasa, ili toksin difterije; protein kao što je faktor nekroze tumora, ainterferon, .beta.-interferon, faktor rasta nervnih ćelija, faktor rasta izveden iz trombocita, tkivni aktivator plazminogena, trombotički agens ili anti-angiogeni agens, npr., angiostatin ili endostatin; ili, modifikatori biološkog odgovora kao što su, na primer, limfokini, interleukin-1 ("IL-1"), interleukin-2 ("IL-2"), interleukin-6 ("IL-6"), faktor stimulacije kolonija granulocita i makrofaga (granulocyte macrophase colony stimulating factor - "GM-CSF"), faktor stimulacije kolonija granulocita (granulocyte colony stimulating factor - "G-CSF"), ili drugi faktori rasta.
[0094] Humanizovani IL-31 antigen vezujući molekuli ili IL-31 antagonisti mogu takođe biti vezani za čvrste podloge, koje su posebno korisni za imunološke testove ili prečišćavanje ciljnog antigena. Ovakve čvrste podloge uključuju, ali nisu ograničene na, staklo, celulozu, poliakrilamid, najlon, polistiren, polivinil hlorid ili polipropilen.
[0095] Tehnike za konjugaciju ovakvog terapijskog dela sa antitelima su dobro poznate, videti, npr., Arnon i ostali, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld i ostali (urednici), str. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom i ostali, "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (drugo izdanje), Robinson i ostali (urednici), str.623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera i ostali (urednici), str. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin i ostali (urednici), str. 303-16 (Academic Press 1985), i Thorpe i ostali, "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev.62:119-58 (1982).
[0096] Alternativno, humanizovani IL-31 antigen vezujuće molekuli ili IL-31 antagonisti mogu biti konjugovani sa drugim antitelom čime se formira heterokonjugat antitela kao što je opisano od strane Segal-a u američkom patentu sa brojem 4,676,980.
[0097] Humanizovani IL-31 antigen vezujući molekuli ili IL-31 antagonisti, sa ili bez konjugovanog terapijskog dela, administrirani zasebno ili u kombinaciji sa citotoksičnim faktorom(faktorima) i/ili citokinom(citokinima) mogu biti primenjeni kao terapija.
[0098] Humanizovani IL-31 antigen vezujući molekuli ili IL-31 antagonisti mogu biti primenjeni za označavanje ćelija koje eksprimiraju IL-31; za izolovanje IL-31 afinitetnim prečišćavanjem; za dijagnostičke testove za određivanje cirkulišućih nivoa IL-31 polipeptida; za uočavanje ili kvatifikaciju rastvorljivog IL-31 kao markera osnovne patologije ili bolesti; u analitičkim metodama koje koriste FACS; za ispitivanje eksprimirajućih biblioteka; za generisanje anti-idiotipskih antitela; i kao neutralizujuća antitela ili kao antagonisti za blokiranje IL-31 aktivnosti in vitro i in vivo. Pogodni direktni tagovi ili oznake uključuju radionuklide, enzime, supstrate, kofaktore, inhibitore, fluorescentne markere, hemiluminescentne markere, magnetne čestice i slično; indirektne oznake ili znakovi mogu istaći upotrebu biotin-avidina ili drugih komplement/anti-komplement parova kao intermedijera. Antitela ovde mogu taođe biti direktno ili indirektno konjugovana sa lekovima, toksinima, radionuklidima i slično, i ovi konjugati primenjeni za in vivo dijagnostiku ili terapijsku primenu. Pored toga, antitela na IL-31 ili njihovi fragmenti mogu biti primenjeni in vitro da bi se uočili denaturisani IL-31 ili njegovi fragmenti u testovima, na primer, Western Blotovima ili drugim testovima poznatim u oblasti.
[0099] Pogodni uočljivi molekuli mogu biti direktno ili indirektno vezani za polipeptid ili antitelo, i uključuju radionuklide, enzime, supstrate, kofaktore, inhibitore, fluorescentne markere, hemiluminescentne markere, magnetne čestice i slično. Pogodni citotoksični molekuli mogu biti direktno ili indirektno vezani za polipeptid ili antitelo, i uključuju bakterijske ili biljne toksine (na primer, toksin difterije, saporin, Pseudomonas egzotoksin, ricin, abrin i slično), kao i terapijski radionuklidi, kao što je jod-131, renijum-188 ili itrijum-90 (bilo direktno vezan za polipeptid ili antitelo, bilo indirektno vezan preko helirajućeg dela, na primer). Polipeptidi ili antitela mogu takođe biti konjugovani sa citotoksičnim lekovima, kao što je adriamicin. Za indirektno vezivanje detektabilnog ili citotoksičnog molekula, detektabilan ili citotoksičan molekul može biti konjugovan sa članom komplementarno/antikomplementarnog para, gde je drugi član vezan za polipeptid ili deo antitela. U ove svrhe, biotin/streptavidin je komplementarno/ antikomplementarni par za primer.
[0100] Za IL-31 antigen vezujuće molekule ili IL-31 antagoniste ovde stavljene na uvid javnosti mogu se meriti sposobnost da inhibiraju, blokiraju, ili neutrališu IL-31 ligand kao što je određeno raznim in vivo modelima poznatim u oblasti i ovde opisanim, uključujući ali bez ograničenja na NC/Nga model, Ova epikutani model, model hronične preosetljivosti, i hronični haptenski model.
[0101] I T ćelije koje migriraju(“homing”) ka koži i epidermalni keratinociti učestvuju u patologiji kožnih bolesti kod ljudi. IL-31 iRNK i eksprimiranje proteina je ograničeno na CLA+ populaciju T ćelija koje migriraju ka koži kod ljudi. Videti američku patentnu prijavu sa brojem 11/353,427, podnetu 14. februara 2006, (Objava američkog patenta br. 2006-0188499) i američku patentnu prijavu sa brojem 11/353,454, podnetu 14. februara 2006, (Objava američkog patenta br. 2006-0188500). Kao takav, antagonist IL-31, koji uključuje antitelo ili antagonist receptora će biti korisan u lečenju kožnih i epidermalnih bolesti koje imaju ekspresiju CLA T ćelija. Ovakve bolesti uključuju, na primer, atopijski dermatitis, kontaktni dermatitis, lekom izazvane alergijske reakcije, kožne tropske viruse i pruritus u vezi sa virusima, vitiligo, kutani T ćelijski limfom, alopecia aerata, acne rosacea, acne vulgaris, prurigo nodularis, i bulozni pemfigoid. Hemokinski markeri kao što su TARC i MDC su korisni u merenju efekta neutrališućeg monoklonskog antitela na IL-31. Inhibitorni efekti lečenja sa humanizovanim IL-31 antigen vezujućim molekulima ili IL-31 antagonistima koji su ovde opisani se mogu izmeriti praćenjem TARC i MDC nivoa.
Kontaktni dermatitis
[0102] Alergijski kontaktni dermatitis je definisan kao imuna reakcija posredovana T ćelijama na antigen koji dolazi u kontakt sa kožom. Smatra se da je CLA+ T ćelijska populacija uključena u započinjanje dermatitisa pošto su alergen zavisni odgovori T ćelija uglavnom ograničeni na CLA+ populaciju ćelija (videti Santamaria-Babi, L.F., i ostali, J Exp Med:181, 1935, (1995)). Skorašnji podaci su otkrili da samo memorijske (CD45RO+) CD4+ CLA+ i ne CD8+ T ćelije proliferišu i proizvode i tip-1 (IFN-) i tip-2 (IL-5) citokina u odgovoru na nikal, uobičajeni kontaktni alergen koji izaziva preosetljivost. Pored toga, ćelije koje eksprimiraju CLA u kombinaciji sa CD4, CD45RO (memorijske) ili CD69 se povećavaju nakon specifične stimulacije pomoću nikla i eksprimiraju hemokinske receptore CXCR3, CCR4, CCR10 ali ne CCR6. Videti Moed H., i ostali, Br J Dermatol:51, 32, (2004).
[0103] U životinjskim modelima, pokazano je da je alergijski kontaktni dermatitis zavistan od T- ćelija i da T ćelije kao odgovor na alergiju migriraju na mesto primene alergena. Videti uopšteno: Engeman T.M., i ostali, J Immunol: 164, 5207, (2000); Ferguson T.A. & Kustrer T.S. J Immunol: 150, 1172, (1993); i Gorbachev A.V. & Fairchild R.L. Crit Rev Immunol: 21, 451(2001). S obzirom da CLA+ T ćelije proizvode IL-31 i da stimulacija kožnih keratinocita pomoću IL-31 može indukovati pro-inflamatorne hemokine, kao što su TARC i MDC, IL-31 može biti uključen u patofiziologiju kontaktnog dermatitisa. Primenom neutralizujućeg IL-31 antitela u mišjem modelu kontaktne preosetljivosti.
[0104] Tako, neutralizacija IL-31 humanizovanim IL-31 antigen vezujućim molekulima ili IL-31 antagonistima koji su ovde opisani može biti primenjena da se poboljša klinički ishod kontaktne preosetljivosti putem inhibicije, redukcije, neutralizacije, sprečavanja ili blokiranja inflamacije i/ili češanja koje je u vezi sa bolešću.
Atopijski dermatitis
[0105] Atopijski dermatitis (AD) je hronično ponavljajuća inflamatorna kožna bolest sa dramatičnim povećanjem učestalosti tokom poslednjih dekada. AD se klinički opisuje visoko pruritičnim često oljuštenim ljuspama i papulama koje pokazuju hronični ponavljajući tok. Dijagnoza ADa je uglavnom zasnovana na većim i manjim kliničkim nalazima. Videti Hanifin J.M., Arch Dermatol: 135, 1551 (1999). Histopatologija otkriva spongiozu, hiper i fokalnu parakeratozu u akutnim lezijama, gde su markirana epidermalna hiperplazija sa hiper i parakeratozom, akantozom/hipergranulozom i perivaskularnom infiltracijom dermisa sa limfocitima i obiljem mast ćelija znak hromnih lezija.
[0106] T ćelije igraju centralnu ulogu u započinjanju lokalnih imunih odgovora u tkivima i dokazi ukazuju da naročito T ćelije koje se infiltriraju u kožu, mogu igrati ključnu ulogu u započinjanju i održavanju neregulisanih imunih odgovora u koži. Približno 90% od infiltrirajućih T ćelija u kutanim inflamatornim mestima eksprimira kutani sa limfocitom u vezi Ag (CLA+) koji vezuje E-selektin, inducibilan adhezioni molekul na endotel (prikazano u Santamaria-Babi L.F., i ostali, Eur J Dermatol: 14, 13, (2004)). Zabeležen je značajan porast cirkulišućih CLA+ T ćelija među pacijentima sa ADom u poređenju sa kontrolnim pojedincima (videti Teraki Y., i ostali, Br J Dermatol: 143, 373 (2000), dok su drugi eksprimirali da memorijske CLA+ T ćelije kod pacijenata sa ADom prvenstveno odgovaraju na ekstrakt alergena u poređenju sa CLA- populacijom (videti Santamaria-Babi, L.F., i ostali, J Exp Mend:181, 1935, (1995)). Kod ljudi, patogeneza atopičnih poremećaja kože je povezana sa porastom CLA+ T ćelija koje eksprimiraju povećane nivoe citokina Th-2-tipa kao što su IL-5 i IL-139, 10. Videti Akdis M., i ostali, Eur J Immunol: 30, 3533 (2000); i Hamid Q., i ostali, J Allergy Clin Immunol: 98, 225 (1996).
[0107] NC/Nga miševi spontano razvijaju ADu-slične lezije koje su slične humanom ADu u više aspekata, uključujući klinički tok i znake, histopatologiju i imunopatologiju kada su čuvani u nespecifičnim uslovima bez patogena (non-specific pathogen free - non-SPF) i starosti od približno 6-8 nedelja. Suprotno, kod NC/Nga miševa koji su držani pod SPF uslovima se ne razvijaju kožne lezije. Ipak, pojava spontanih kožnih lezija i češanje mogu biti sinhronizovani kod NC/Nga miševa čuvanih u SPF prostoru intradermalanom injekcijom sirovog antigena grinja na nedeljnom nivou. Videti Matsuoka H., i ostali, Allergy: 58, 139 (2003). Stoga, razvoj Ada kod NC/Nga je korisan model za procenu novih terapija za lečenje ADa.
[0108] Dodatno NC/Nga modelu spontanog ADa, epikutana senzitizacija miševa koja primenjuje OVA može takođe biti primenjena kao model za izazivanje antigen-zavisnog
4
epidermalnog i dermalnog zadebljanja sa mononuklearnim infiltratom u koži senzibilisanih miševa. Ovo se obično poklapa sa povišenim serumskim nivoima ukupnog i specifičnog IgE, ipak se normalno ne pojavljuju disfunkcija kožne barijere ili pruritus u ovom modelu. Videti Spergel J.M., i ostali, J Clin Invest, 101: 1614, (1998). Ovaj protokol može biti modifikovan kako bi se izazvali disregulacija kožne barijere i pruritus senzibilizacijom DO11.10 OVA TCR transgenih miševa sa OVA. Povećanje broja antigen-specifičnih T ćelija koje mogu da prepoznaju senzibilišući antigen može povećati nivo inflamacije u koži da bi se započelo vidljivo češanje i lihenifikacija/perutanje kože.
[0109] I NC/Nga model spontanog ADa i OVA epikutani DO11.10 model se primenjuju da bi se procenila sposobnost humanizovanih IL-31 antigen vezujućih molekula ili IL-31 antagonista koji su ovde opisani da inhibiraju, redukuju, ili neutralizuju efekte IL-31. Administracija humanizovanih IL-31 antigen vezujućih molekula ili IL-31 antagonista može dovesti do smanjenja češanja što može biti efikasno u lečenju pruritičkih bolesti koje uključuju, ali nisu ograničene na, atopijski dermatitis, prurigo nodularis, i ekcem, pošto će prekid češanja zaustaviti progresiju dermatitisa, čiji razvoj zavisi od češanja.
[0110] Dodatni modeli za merenje inhibitornih efekata humanizovanih IL-31 antigen vezujućih molekula ili IL-31 antagonista koji su ovde opisani su opisani od strane Umeuchi, H. i ostalih, European Journal of Pharmacology, 518: 133-139, 2005; i od strane Yoo, J. i ostalih, J. Experimental Medicine, 202:541-549, 2005.
[0111] Tako, neutralizacija IL-31 humanizovanim IL-31 antigen vezujućim molekulima ili IL-31 antagonistima koji su ovde opisani mogu biti primenjeni da bi se poboljšao klinički ishod dermatitisa i pruritičkih bolesti koje ukjučuju atopijski dermatitis, prurigo nodularis, i ekcem inhibicijom, redukcijom, sprečavanjem ili blokiranjem inflamacije i/ili češanja koje je udruženo sa bolešću.
[0112] Metode merenja sposobnosti humanizovanog anti-IL-31 antitela i antagonista da inhibiraju, redukuju, ili neutrališu odgovor u vidu svraba uključuju sledeće testove i modele:
I) Kapsaicin tretman IL-31 tretiranih miševa
[0113] Deset nedelja stare BALB/c životinje (CRL) su anestezirane i injektiran im je dugodelujući analgetski agens, bupranorfin hidrohlorid, subkutano 0.1 mg/kg pre injekcije od 0.25 ml 4 mg/ml rastvora kapsaicina u 10% etanola 10% Tween-80 u fiziološkom rastvoru subkutano u vrat. Životinje su održavane u anesteziranom stanju tokom najmanje 30 min nakon tretmana neurotoksinom. Četrdeset osam sati kasnije, 14-odnevne osmotske pumpe su subkutano implantirane da bi se kontinuirano isporučivalo 20 ug/dan IL-31 tokom 14 dana. Miševi su praćeni svakodnevno tokom 6 dana na pojavu alopecije i pruritusa primenom sledećih kriterijuma: 0 = nema češanja, životinja izgleda normalno, 1 = istanjivanje sloja na malim površinama, uočeno češanje, 2 = manji gubitak dlake (mali pečati), češanje, 3 = umereni gubitak dlake, češanje, i 4 = ozbiljan gubitak dlake, prekomerno češanje.
[0114] Neutralizacija, inhibicija, ili redukcija IL-31 pomoću humanizovanih IL-31 antigen vezujućih molekula ili IL-31 antagonistima može smanjiti učestalost i intenzitet svraba, i prema tome dermatitisa, kod pacijenata koji pate od kožnih poremećaja koji uključuju svrab.
II) Eksprimiranje Tac1 gena
[0115] Miševi koji su homozigoti bez Tac1 gena ne eksprimiraju uočljivu supstancu P ili neurokinin A. Ovi miševi imaju značajno redukovane odgovore na nociceptivni bol na umerene i intenzivne stimuluse i stoga su korisno sredstvo za ispitivanje doprinosa tahikininskih peptida za analizu bola/svraba i stanja inflamatornih bolesti. Dvanaest nedelja starim, Tac1 nokaut miševima su implantirane 14-odnevne osmotske pumpe koje isporučuju 1ug/dan IL-31 proteina i posmatrani su svakodnevno na pojavu alopecije i pruriutusa primenom sledećih kriterijuma: 0 = nema češanja, životinja izgleda normalno, 1 = istanjivanje sloja na malim površinama, uočeno češanje, 2 = manji gubitak dlake (mali pečati), češanje, 3 = umereni gubitak dlake, češanje, i 4 = ozbiljan gubitak dlake, prekomerno češanje.
[0116] Rezultati ove studije pokazuju da su Tac1 deficijentni miševi manje podložni pojavi češanja/gubitka kose koji su izazvani IL-31 u poređenju sa u prirodi prisutnim tipom kontrolnih miševa. Dok je 100% (10/10) miševa tipa koji je prisutan u prirodi razvilo dokaze češanja i gubitka kose do šestog dana lečenja IL-31, samo 33.3 % (2/6) Tac1 deficijentnih miševa je pokazalo znake češanja i gubita kose u istoj vremenskoj tačci. Prema tome, neutralizacija, inhibicija ili redukcija IL-31 humanizovanim IL-31 antigen vezujućim molekulima ili IL-31 antagonistima može smanjiti učestalost i jačinu češanja u kontekstu dermatitisa.
III) Administracija IL-31 neutralizujućeg antitela
[0117] Normalnim ženkama BALB/c miševa (CRL) približno starim 8 do 12 nedelja mogu biti implantirane 14-odnevne osmotske pumpe (Alzet, #2002) koje isporučuju 1ug/dan mILa-31. Grupe miševa primaju intraperitonealne (i.p.) injekcije anti-mišjeg IL-31 monoklonskog antitela pacova 10mg/kg (200ug/miš) dva puta nedeljno sa početkom 1 nedelju pre isporuke IL-31. Kontrolne grupe miševa primaju i.p. injekcije nosača (PBS/0.1%BSA) sa identičnim rasporedom doziranja. Miševi se prate svakodnevno na pojavu alopecije i pruritusa primenom sledećih kriterijuma: 0 = nema češanja, životinja normalno izgleda, 1 = istanjivanje sloja na malim površinama, uočeno češanje, 2 = manji gubitak dlake (mali pečati), 3 = umereni gubitak dlake, češanje, i 4 = ozbiljan gubitak dlake, prekomerno češanje.
[0118] Prema tome, neutralizacija, redukcija ili inhibicija IL-31 pomoću IL-31 antigen vezujućih molekula ili IL-31 antagonista može odložiti nastupanje češanja/gubitka kose kao odgovora koji je izazvan pomoću IL-31.
[0119] Efekti humanizovanih IL-31 antigen vezujućih molekula ili IL-31 antagonista se mere inhibicijom češanja, svraba, dermatitisa, redukcijom eksprimiranja IL-31RA u keratinocitima, i/ili redukcijom pojavljivanja alopecije i pruritusa.
Lekom izazvan odložen tip kožnih alergijskih reakcija
[0120] Lekom izazvan odložen tip kožnih alergijskih reakcija je veoma heterogen i može odražavati mnoge različite patofiziološke događaje. Videti Brockow K., i ostali, Allergy: 57, 45 (2002). Imunološki mehanizmi uključeni u ove reakcije su prikazani bilo kao posredovani antitelom bilo kao ćelijski posredovani. U neposrednoj alergiji na lek reakcija posredovana IgE-antitelom se može predstaviti pozitivnim kožnim “prick” i/ili intradermalnim testom nakon 20 min, dok se kasne reakcije na lekove mogu primetiti nakon više od jednog sata od poslednjeg uzimanja leka i često su posredovane T ćelijama. Kasni T-ćelijski posredovan odložen tip reakcija se može primetiti kod pacijenata sa neželjenim reakcijama na lek na primer na peniciline. Pokazalo se da su proliferativni T ćelijski odgovori na peniciline ograničeni na memorijsku (CD45RO+) CLA+ subpopulaciju T ćelija kod pacijenata alergičnih na penicilin dok CD45RO+ CLA- podset ne pokazuje proliferativan odgovor. Videti Blanca M., Leyva L., i ostali, Blood Cells Mol Dis:31, 75 (2003). Odložen tip reakcija
4
preosetljivosti (Delayed-type hypersensitivity - DTH) može biti veštački reprodukovan kod miševa, dozvoljavajući procenu faktora koji mogu biti uključeni u započinjanje i održavanje DTH odgovora. Humanizovani IL-31 antigen vezujući molekuli ili IL-31 antagonisti mogu biti efikasni u ograničavanju, redukciji, inhibiranju odloženog tipa reakcije preosetljivosti.
[0121] Toksična epidermalna nekroliza (TEN) je veoma retka ali ekstremno ozbiljna reakcija na lek koja se karakteriše široko rasprostranjenom apoptozom epidermisa sa rasprostranjenim plikovima. Studije su pokazale da su limfociti koji se infiltriraju u plikove CLA+ T ćelije i mogu pokazati citotoksičnost prema epidermalnim keratinocitima. Videti Leyva L., i ostali, J Allergy Clin Immunol: 105, 157 (2000); i Nassif A., Bensussan A., i ostali, J Allergy Clin Immunol:114, 1209 2004). Transgeni mišji sistem, pri čemu je OVA eksprimiran pod kontrolom keratin-5 (K5) promotera u mišjim epidermalnim i keratinocitima folikula dlake, je generisan da bi se uspostavio životinjski model za TEN. OVA specifične CD8+ T ćelije, kada se adoptivno prenesu u K5-OVA miševe, podležu aktivaciji i proliferaciji u limfnim čvorovima za dreniranje kože i ciljaju kožu K5-OVA miševa, što dovodi do razvoja kožnih lezija koje podsećaju na TEN. Videti Azukizawa H., i ostali, Eur J Immunol: 33, 1879 (2003).
[0122] Tako, neutralizacija IL-31 pomoću humanizovanih IL-31 antigen vezujućih molekula ili IL-31 antagonista koja je ovde opisana može biti primenjena da se poboljša klinički ishod TENa inhibicijom, redukcijom, sprečavanjem ili blokiranjem inflamacije i/ili češanja koje je udruženo sa bolešću.
Bulozni pemfigoid
[0123] Bulozni pemfigoid je subepidermalni poremećaj koji se manifestuje subepidermalnim plikovima sa dermalnim infiltratom neutrofila i eozinofila. Dijagnoza se karakteriše prisustvom antigen-specifičnih antitela protiv specifičnih adhezionih proteina epidermisa i dermalno-epidermalnog spoja. Videti Jordon R.E., i ostali, JAMA: 200, 751 (1967). Studije koje ispituju ulogu T ćelija u patogenezi buloznog pemfigoida analizom PBLa i T ćelija plika kože su otkrile predominaciju CLA+ T ćelija koje eksprimiraju povećane nivoe Th2-citokina kao što su IL-4 i IL-13. Videti Teraki Y., i ostali, J Invest Dermatol: 117, 1097 (2001). Kod pacijenata sa buloznim pemfigoidom koji slede terapiju sistemskim kortikosteroidima, učestalost CLA+, ali ne i CLA-, interleukin-13-produkujućih ćelija je značajno smanjena.
Smanjenja CLA+ ćelija nakon kortikosteroidnog lečenja su udružena sa kliničkim poboljšanjem. Videti Teraki, ibid.
[0124] Tako, neutralizacija IL-31 humanizovanim IL-31 antigen vezujućim molekulima ili IL-31 antagonistima koji su ovde opisani može biti primenjena da se poboljša klinički ishod buloznog pemfigoida inhibicijom, redukcijom, sprečavanjem ili blokiranjem inflamacije i/ili češanja udruženog sa bolešću.
Alopecia areata
[0125] Alopecia areata (AA) se smatra tkivno-ograničenom autoimunom bolešću folikula dlake u kojoj je aktivnost folikula zaustavljena zbog kontinuirane aktivnosti limfocitnih infiltrata. AA kao rezultat ima pečate totalnog nedostatka dlake bilo gde na telu, iako se ne javlja stvarni gubitak folikula dlake, čak ni u lezijama bez dlake. Iako klinički znaci inflamacije nisu prisutni, biopsije kože na mestima aktivne bolesti pokazuju perifolikularnu limfocitnu inflamaciju prvenstveno CD4+ ćelija, uporedo sa CD8+ intrafolikularnim infiltratom. Videti Kalish R.S. & Gilhar A. J Investig Dermatol Symp Proc: 8, 164 (2003).
[0126] Studije su pokazale da koža temena glave infiltrirana sa CD4+ ili CD8+ limfocitima eksprimira CLA i, u perifernoj krvi pojedinaca sa AA, procenat CLA+ CD4+ ili CD8+ limfocita je značajno veći nego kod normalnih kontrola. Pored toga, pacijenti sa ozbiljnom ili progresivnom AA pokazuju mnogo višu CLA-pozitivnost u poređenju sa pacijentima koji se oporavljaju od bolesti i smanjenje procenta CLA+ ćelija se podudara sa dobrim kliničkim tokom. Videti Yano S., i ostali, Acta Derm Venereol: 82, 82 (2002). Ove studije stoga ukazuju da CLA+ limfociti mogu igrati važnu ulogu u AA. Ksenograft modeli pokazuju da aktivirane T ćelije verovatno igraju ulogu u patogenezi AA. Lezionalni skalp od pacijenata sa AA graftovan na gole miševe dovodi do ponovnog rasta dlake što se poklapa sa gubitkom infiltrirajućih limfocita iz grafta i, prenošenje aktiviranih lezionih T ćelija na SCID miševe može preneti gubitak dlake humanim eksplantatima skalpa na SCID miševima. Videti Kalish R.S. & Gilhar A. J Investig Dermatol Symp Proc: 8, 164 (2003).
[0127] Razne imunomodulirajuće terapije su deo uobičajenog tretmana ovog poremećaja ali ipak ni jedan od ovih tretmana nije bio dosledan u svojoj efikasnosti. Videti Tang L., i ostali, J Invest Dermatol: 120, 400 (2003); Tang L., i ostali, (2004); i Tang L., i ostali, J Am Acad Dermatol: 49, 1013 (2003). Uprkos tome, njihova primena u odgovarajućim životinjskim
4
modelima obezbeđuje sredstvo za izdvajanje molekulskih mehanizama terapijskih efekata. Videti Shapiro J., i ostali, J Investig Dermatol Symp Proc: 4, 239 (1999); Tang L., i ostali, Old wine in new bottles: reviving old therapies for alopecia areata using rodent models (2003); i Verma D.D., i ostali, Eur J Dermatol:14, 332 (2004).
[0128] Stoga, neutralizacija IL-31 humanizovanim IL-31 antigen vezujućim molekulima ili IL-31 antagonistima koji su ovde opisani može biti primenjena da se poboljša klinički ishod za alopecia areata inhibicijom, redukcijom, sprečavanjem ili blokiranjem inflamacije i/ili češanja koje je udruženo sa bolešću.
Acne rosacea/Acne vulgaris
[0129] Acne vulgaris, poremećaj pilosebacealnog aparata, je najčešći problem kože kod adolescenata. Smatra se da abnormalnosti u folikularnoj keratinizaciji stvaraju aknoznu leziju. Acne rosacea se razlikuje od acne vulagaris po prisustvu crvenih papula, pustula, cista i rasprostranjenih talangiektazija, ali odsustvu komedogena (bele glave). Povećana sekrecija sebuma iz lojnih žlezda je glavni faktor u patofiziologiji acne vulgaris. Ostale funkcije lojnih žlezda su takođe u vezi sa razvojem akni, uključujući lojne proinflamatorne lipide; različite citokine koji se stvaraju lokalno; periglandularne peptide i neuropeptide, kao što je kortikotropin-oslobađajući hormon, koga proizvode sebociti; i substancu P, koja se eksprimira u nervnim završecima u blizini žlezda zdravog izgleda kod pacijenata sa aknama. Videti Zouboulis C.C. Clin Dermatol: 22, 360 (2004).
[0130] Iako patofiziologija acne vulgaris i acne rosacea ostaje nepoznata, klinička posmatranja i histopatološke studije ukazuju da inflamacija pilosebacealnog folikula može biti glavna u patogenezi rosacea i acne vulgaris. Rane studije na analizi podsetova T ćelija koje infiltriraju rosacea promene (“legije”) su ukazale da većina T ćelija eksprimira CD4. Videti Rufli T. & Buchner S.A. Dermatologica: 169, 1 (1984).
[0131] CD4+ T ćelije proizvode IL-31 i IHC analiza kože na ekprimiranje IL-31 ukazuje da se IL-31 eksprimira u lojnim i znojnim žlezdama. IL-31 stimulacija epidermalnih keratinocita započinje eksprimiranje hemokina koji verovatno dovode do ćelijske infiltracije čime se ukazuje da IL-31 može doprineti pro-inflamatornom odgovoru u koži. Videti Dillon S.R., i ostali, Nat Immunol: 5, 752 (2004). IL-31 stoga može doprineti patofiziologiji acne rosacea i acne vulgaris.
4
[0132] Tako, neutralizacija IL-31 humanizovanim IL-31 antigen vezujućim molekulima ili IL-31 antagonistima koji su ovde opisani može biti primejena da bi se poboljšao klinički ishod za acne vulgaris inhibicijom, redukcijom, sprečavanjem ili blokiranjem inflamacije i/ili češanja koje je udruženo sa bolešću.
Prurigo nodularis
[0133] Prurigo nodularis je erupcija lihenifikovanih ili oguljenih čvorića koji je izazvan upornim pruritusom koji je teško lečiti. Dok hronično trljanje dovodi do lihenifikacije, i češanje do linearnih ogrebotina, pojedinaca koji raščešavaju mesto svraba, iritirana koža ima tendenciju ka stvaranju značajno zgusnutih papula poznatih kao prurigo čvorići. Iako prurigo nodularis nije specifičan za atopijski dermatitis, mnogi pacijenti sa ovim čvorićima takođe imaju atopijsku reakciju, koja se manifestuje kao alergijski rinitis, astma, ili alergija na hranu. T ćelije predstavljaju većinu infiltrirajućih ćelija u prurigo lezijama i ove lezije često predstavljaju najviše pruritičnu kožnu leziju kod pacijenata sa atopijom.
[0134] Dokazano je da je površinsko lečenje prurigo nodularis sa kapsaicinom, antipruritičkim alkaloidom koji interferira sa percepcijom pruritusa i bola smanjenjem neuropeptida kao što je supstanca P u malim senzornim nervima u koži, efikasan i bezbedan režim koji dovodi do čišćenja kožnih lezija. Videti Stier S., i ostali, J Am Acad Dermatol: 44, 471 (2001). Studije odgovora na svrab kod NC/Nga miševa primenom kapsaicin tretmana su pokazale da je spontani razvoj lezija dermatitisa skoro potpuno sprečen. Pored toga, porast nivoa IgE u serumu je značajno suzbijen i redukovani su infiltrirajući eozinofili i broj mast ćelija u koži sa lezijama kod miševa lečenih kapsaicinom. Videti Mihara K., i ostali, Br J Dermatol: 151, 335 (2004). Posmatranja u ovoj grupi ukazuju da češanje može doprineti razvoju dermatitisa pojačavanjem raznih imunoloških odgovora, prema tome podrazumeva da prevencija osećaja svraba i/ili svraba koji je u vezi sa češanjem može biti efikasni tretman za AD. Videti Mihara K., i ostali, Br J Dermatol: 151, 335 (2004). Prema tome, humanizovana anti-IL-31 antitela koja su ovde opisana će biti korisna u minimiziranju efekata ADa, prurigo nodularis, i drugih pruritičkih bolesti kao što je ovde pokazano da redukuju obim češanja kod NC/Nga miševa.
[0135] Hronična isporuka IL-31 izaziva pruritus i alopeciju kod miševa što je praćeno razvojem kožnih lezija koje liče na dermatitis ukazujući da IL-31 može izazvati svrab. Videti
4
Dillon S.R., i ostali, Nat Immunol: 5, 752 (2004). Učešće IL-31 u izazivanju odgovora na svrab može biti izmereno, na primer, pomoću dve metode (i) kapsaicin tretmanom IL-31-tretiranih miševa; i (ii) tretman IL-31 Tac1 nokaut miševa, koji imaju značajno redukovane odgovore na nociceptivni bol zbog izostanka eksprimiranja neuropeptida. Dodatno, da neutralizacija IL-31 kod IL-31 tretiranih miševa sa humanizovanim IL-31 antigen vezujućim molekulima ili IL-31 antagonistima može da spreči pruritus i alopeciju može biti testirano u ovim modelima.
[0136] Stoga, neutralizacija IL-31 pomoću humanizovanih IL-31 antigen vezujućih molekula ili IL-31 antagonista koji su ovde opisani može biti primenjena da se poboljša klinički ishod za prurigo nodularis inhibicijom, redukcijom, sprečavanjem ili blokiranjem inflamacije i/ili češanja koje je udruženo sa bolešću.
Kožni tropski virusi i pruritus povezan sa virusima
[0137] Herpes Simplex Virus (HSV)-specifične CD8+ T ćelije u perifernoj krvi i HV-specifične CD8+ T ćelije prečišćene iz herpetičnih lezija eksprimiraju visoke nivoe CLA gde kao ne-kožni-tropski herpes virus-specifične CD8+ T ćelije nemaju CLA eksprimiranje. Videti Koelle D.M., i ostali, J Clin Invest: 110, 537 (2002). HSV-2 reaktivni CD4+ T limfociti takođe eksprimiraju CLA, ali u nižim nivoima od onih koji su prethodno primećeni za CD8+ T limfocite. Videti Gonzalez J.C., i ostali, J Infect Dis: 191, 243 (2005). Pruritus je takođe povezan sa herpes virusnom infekcijom (Videti Hung K.Y., i ostali, Blood Purif: 16, 147 (1998). iako su druge virusne bolesti, kao HIV, takođe povezane sa pruritičkim kožnim lezijama. Ozbiljan, uporan pruritus, često udružen sa eritematopapularnim kožnim lezijama i hipereozinofilijom, je stanje koje je primećeno kod nekih neatopijskih, HIV-inficiranih pacijenata 36. Videti Singh F. & Rudikoff D, Am J Clin Dermatol; 4, 177 (2003); i Milazzo F., Piconi S., i ostali, Allergy: 54, 266 (1999).
[0138] Veza kožnih-tropskih virusa sa pruritusom i CLA+ T ćelijama ukazuje da T ćelije koje proizvode IL-31 mogu biti uključene u patofiziologiju virusnih infekcija.
[0139] Stoga, neutralizacija IL-31 pomoću humanizovanih IL-31 antigen vezujućih molekula ili IL-31 antagonistima koji su ovde opisani može biti primenjena da se poboljša klinički ishod pruritusa koji je povezan sa kožnim-tropskim virusima putem inhibicije, redukcije, sprečavanja ili blokiranja inflamacije i/ili češanja koje je udruženo sa bolešću.
4
[0140] Pored toga, inflamacija je zaštitni odgovor organizma kojim se brani od invazivnog agensa. Inflamacija je kaskadni događaj koji uključuje mnoge ćelijske i humoralne medijatore. Sʼ jedne strane, suzbijanje inflamatornih odgovora može učiniti domaćina imunokompromitovanim; ipak, ukoliko nije uočena, inflamacija može voditi do ozbiljnih komplikacija koje uključuju hronične inflamatorne bolesti (npr., reumatoidni artritis, multiplu sklerozu, inflamatornu bolest creva i slično), septički šok i višestruku insuficijenciju organa. Važno, ova različita stanja bolesti dele zajedničke inflamatorne medijatore. Kolektivne bolesti koje su okarakterisane inflamacijom imaju veliki uticaj na humani morbiditet i mortalitet. Stoga je jasno da anti-inflamatorna antitela i vezujući polipeptidi, kao što su anti-IL-31 antitela i vezujući polipeptidi koji su ovde opisani, mogu imati krucijalni terapijski potencijal za veliki broj humanih i životinjskih bolesti, od astme i alergije do autoimunosti i septičkog šoka. Kao takva, primena anti-inflamatornih anti IL-31 antitela i vezujućih polipeptida koji su ovde opisani može biti upotrebljena terapijski poput IL-31 antagonista koji su ovde opisani, posebno u bolestima kao što su artritis, endotoksemija, inflamatorna bolest creva, psorijaza, povezana bolest i slično.
1. Artritis
[0141] Artritis, uključujući osteoartritis, reumatoidni artritis, artritičke zglobove kao rezultat povrede, i slično, su uobičajena inflamatorna stanja koja imaju korist od terapijske primene anti-inflamatornih antitela i vezujućih polipeptida, kao što su anti-IL-31 antitela i vezujući polipeptidi predmetnog pronalaska. Na primer, reumatoidni artritis (RA) je sistemska bolest koja utiče na celo telo i jedna je od najčešćih formi artritisa. Okarakterisan je inflamacijom membrane koja oblaže zglob, što izaziva bol, ukočenost, toplotu, crvenilo i oticanje. Inflamatorne ćelije oslobađaju enzime koji mogu razgraditi kost i hrskavicu. Kao rezultat reumatoidnog artritisa, inflamirana opna zgloba, sinovija, može napasti i oštetiti kost i hrskavicu što vodi do propadanja zgloba i ozbiljnog bola pored ostalih fizioloških efekata. Pomenuti zglob može izgubiti svoj oblik i pravac, što dovodi do bola i gubitka kretanja.
[0142] Reumatoidni artritis (RA) je imunološki-posredovana bolest koja je posebno okarakterisana inflamacijom i sledstvenim oštećenjem tkiva koje vodi do ozbiljnog invaliditeta i povećanog mortaliteta. Razni citokini se stvaraju lokalno u zglobovima koji su zahvaćeni reumatizmom. Brojne studije su pokazale da IL-1 i TNF-alfa, dva prototipska pro-
4
inflamatorna citokina, igraju važnu ulogu u mehanizmima koji su uključeni u sinovijalnu inflamaciju i u progresivno uništenje zgloba. Zaista, administracija TNF-alfa i IL-1 inhibitora kod pacijenata sa RAom vodi ka dramatičnom poboljšanju kliničkih i bioloških znaka inflamacije i redukciji radioloških znaka erozije kosti i uništenja hrskavice. Ipak, uprkos ovim ohrabrujućim rezultatima, značajan procenat pacijenata ne daju odgovor na ove agense, što ukazuje da su drugi medijatori takođe uključeni u patofiziologiju artritisa (Gabay, Expert. Opin. Biol. Ther. 2(2):135-149, 2002). Jedan od ovih medijatora može biti IL-31, i molekul koji vezuje ili inhibira IL-31, kao što su anti IL-31 antitela ili vezujući učesnici, može da služi kao dragocen lek za redukciju inflamacije u reumatoidnom artritisu, i drugih artritičkih bolesti.
[0143] Postoji nekoliko životinjskih modela reumatoidnog artritisa koji su poznati u oblasti. Na primer, u modelu artritisa koji je indukovan kolagenom (collagen-induced arthritis - CIA), kod miševa se razvija hronični inflamatorni artritis koji veoma liči na humani reumatoidni artritis. S obzirom da CIA deli slične imunološke i patološke karakteristike sa RA, to ga čini idealnim modelom za ispitivanje potencijalnih humanih anti-inflamatornih jedinjenja. CIA model je dobro poznat model kod miševa koji zavisi od oba i imunog odgovora, i inflamatornog odgovora, da bi se pojavio. Imuni odgovor obuhvata interakciju B-ćelija i CD4+ T-ćelija u odgovoru na kolagen, koji se daje kao antigen, i vodi ka stvaranju antikolagenskih antitela. Inflamatorna faza je rezultat tkivnih odgovora medijatora inflamacije, kao posledica nekih od ovih antitela koja ukršteno reaguju na mišji prirodni kolagen čime se aktivira komplement kaskada. Prednost u primeni CIA modela je što su osnovni mehanizmi patogeneze poznati. Uočeni su relevantni T-ćelijski i B-ćelijski epitopi na kolagen tipa II, i razni imunološki (npr., odloženi-tip preosetljivosti i anti-kolagen antitelo) i inflamatorni (npr., citokini, hemokini, i enzimi koji degradiraju matriks) parameteri koji se odnose na imunološki posredovan artritis su određeni, i kao takvi se mogu primeniti da bi se procenila efikasnost test jedinjenja u CIA modelu (Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3:407-20, 1999; Williams i ostali, Immunol. 89:9784-788, 1992; Myers i ostali, Life Sci. 61:1861-78, 1997; i Wang i ostali, Immunol.92:8955-959, 1995).
[0144] Kao molekul koji podešava imuni i inflamatorni odgovor, IL-31 može izazvati stvaranje SAA, što je obuhvaćeno u patogenezi reumatoidnog artritisa. Humanizovani IL-31 antigen vezujući molekuli ili IL-31 antagonisti mogu redukovati SAA aktivnost in vitro i in vivo, sistemska ili lokalna administracija IL-31 antigen vezujućih molekula ili IL-31 antagonista može potencijalno suzbiti inflamatorni odgovor u RA-u.
2. Endotoksemija
[0145] Endotoksemija je ozbiljno stanje koje je najčešće rezultat infektivnih agenasa kao što su bakterije i drugi agensi infektivnih bolesti, sepse, toksičnog šok sindroma, ili kod imunokompromitovanih pacijenata koji su izloženi oportunističkim infekcijama, i slično. Terapijski korisna anti-inflamatorna antitela i vezujući polipeptidi, kao što su anti-IL-31 antitela i vezujući polipeptidi predmetnog pronalaska, mogu pomoći u sprečavanju i lečenju endotoksemije kod ljudi i životinja. Drugi potencijalni lekovi uključuju IL-31RA polipeptide, rastvorljive heterodimerne i multimerne receptorske polipeptide, ili anti IL-31 antitela ili vezujuće učesnike predmetnog pronalaska, i slično, mogu služiti kao dragoceni lek za redukciju inflamacije i patoloških efekata u endotoksemiji.
[0146] Lipopolisaharidima (LPS) indukovana endotoksemija angažuje mnoge od proinflamatornih medijatora koji dovode do patoloških efekata u infektivnim bolestima i LPS indukovana endotoksemija kod pacova je široko primenjivan i prihvatljiv model za ispitivanje farmakoloških efekata potencijalnih pro-inflamatornih ili imunomodulirajućih agenasa. LPS, koji se stvara u gram-negativnim bakterijama, je glavni uzročni agens u patogenezi septičnog šoka (Glausner i ostali, Lancet 338:732, 1991). Stanje slično šoku može zaista biti eksperimantalno indukovano davanjem jedne injekcije LPSa životinjama. Molekuli koje stvaraju ćelije koje odgovraju na LPS mogu ciljati patogene direktno ili indirektno. Iako ovi biološki odgovori štite domaćina od napadajućih patogena, oni takođe mogu izazvati štetu. Tako, masivna stimulacija urođenog imuniteta, koja se javlja kao rezultat ozbiljne gram-negativne bakterijske infekcije, vodi prekomernom stvaranju citokina i drugih molekula, i razvoju fatalnog sindroma, septičkog šok sindroma, koji se karakteriše groznicom, hipotenzijom, diseminovanom vaskularnom koagulacijom, i višestrukom insuficijencijom organa (Dumitru i ostali Cell 103:1071-1083, 2000).
[0147] Ovi toksični efekti LPS-a su uglavnom povezani sa aktivacijom makrofaga koja vodi ka oslobađanju višestrukih inflamatornih medijatora. Među ovim medijatorima, TNF izgleda da igra krucijalnu ulogu, kao indikovan za prevenciju toksičnosti LPS-a pomoću administracije neutralizujućih anti-TNF antitela (Beutler i ostali, Science 229:869, 1985). Dobro je ustanovljeno da će 1ug injekcije E. coli LPSa u C57Bl/6 mišu dovesti do značajnog povećanja cirkulišućih IL-6, TNF-alfa, IL-1, i proteina akutne faze (na primer, SAA)
1
približno 2 sata nakon injekcije. Toksičnost LPS-a koja je izgleda posredovana ovim citokinima kao pasivna imunizacija prema ovim medijatorima može dovesti do smanjenja mortaliteta (Beutler i ostali, Science 229:869, 1985). Potencijalne strategije imunointervencije za prevenciju i/ili lečenje septičnog šoka uključuju anti-TNF mAb, antagonist receptora za IL-1, LIF, IL-10, i G-CSF. Sʼobzirom da LPS izaziva stvaranje proinflamatornih faktora koji eventualno doprinose patologiji endotoksemije, neutralizacija IL-31 aktivnosti, SAA ili drugih pro- inflamatornih faktora pomoću antagonišućeg IL-31 polipeptida može biti primenjena da bi se redukovali simptomi endotoksemije, kao što se viđa u endotoksičnom šoku. Drugi potencijalni lekovi uključuju humanizovane IL-31 antigen vezujuće molekule ili IL-31 antagoniste.
3. Inflamatorna bolest creva (inflammatory bowel disease – IBD)
[0148] Inflamatorna bolest creva (IBD) može uticati bilo na kolon i rektum (Ulcerativni kolitis) bilo na oba, tanko i debelo crevo (Kronova bolest). Patogeneza ovih bolesti je nejasna, ali one uključuju hroničnu inflamaciju pogođenih tkiva. Potencijalni lekovi uključuju IL-31RA polipeptide, rastvorljive heterodimerne i multimerne receptorske polipeptide, ili anti-IL-31 antitela ili vezujuće učesnike predmetnog pronalaska, i slično., mogu služiti kao dragocen lek za redukciju inflamacije i patoloških efekata kod IBD i povezanih bolesti.
[0149] Hronična inflamacija i ulceracija u Kronovoj bolesti obično počinje bilo opstrukcijom tankog creva bilo abdominalnim bolom koji može imitirati akutnu upalu slepog creva; druge prezentacije mogu se odnositi na njene komplikacije. Tok bolesti je hroničan, i mogu se pojaviti pogoršanja i remisije uprkos terapiji. Početak je obično u ranom zrelom dobu, sa početkom oko polovine svih slučajeva između 20 i 30 godina starosti i 90 % između 10 i 40 godina. Muškarci su neznatno više pogođeni od žena.
[0150] Mikroskopija odražava “gross” pojave (pojave uočene golim okom). Učešće inflamacije je diskontinuirano: ono je fokalno ili nejednako. Grupe limfocita i plazma ćelija su nađene uglavnom u mukozi i submukozi ali obično utiču na sve slojeve (transmuralna inflamacija). Klasična mikroskopska karakteristika Kronove bolesti je prisustvo zrnastih ćelija koje su okružene linijom limfocita. Učestalost idiopatskih inflamatornih bolesti creva pokazuje značajnu geografsku varijaciju. Ove bolesti imaju mnogo veću učestalost u severnoj Evropi i Sjedinjenim Američkim Državama nego u zemljama južne Evrope, Afrike, južne
2
Amerike i Azije, iako povećana urbanizacija i napredak vode većoj učestalosti u delovima južne Evrope i Japana (General i Systematic Pathology, Churchill Livingstone, 3. izdanje 2000, JCE Underwood, Ed.).
[0151] U Kronovoj bolesti, klinički postoje dve glavne grupe, prva koja obuhvata pacijente čija bolest ide u trajnu remisiju u toku tri godine od početka, drugu koja obuhvata pacijente sa bolešću koja traje više od tri godine.
[0152] Bilo koja da je etiologija, postoji dokaz o perzistiranju i neodgovarajućoj aktivaciji T-ćelija i makrofaga u Kronovoj bolesti sa povećanim stvaranjem pro-inflamatornih citokina, naročito interleukina (IL) 1, 2, 6 i 8, Interferona (IFN)- i faktora nekroze tumora (Tumor Nekrozis Factor - TNF). Kronova bolest se karakteriše neprekidnom (hroničnom) inflamacijom praćenom fibrozom. Proces proliferacije fibroblasta i depozicije kolagena može biti posredovan transformirajućim faktorom rasta, koji ima određena anti-inflamatorna dejstva, naime povlačenje fibroblasta, sinteza matriksa i negativna regulacija inflamatornih ćelija, ali je verovatno da će mnogi drugi medijatori biti uključeni.
[0153] Ulcerativni kolitis (UC) je inflamatorna bolest debelog creva, obično zvanog kolon, okarakterisana inflamacijom i ulceracijom sluzokože ili unutrašnje opne kolona. Ova inflamacija izaziva često pražnjenje kolona, što dovodi do dijareje. Simptomi uključuju razmekšanu stolicu i udružene abdominalne grčeve, groznicu i gubitak težine. Iako tačan uzrok UC-a nije poznat, skora istraživanja ukazuju da prirodna odbrana organizma deluje protiv proteina u telu za koje telo misli da su strani ("autoimuna reakcija"). Verovatno zato što oni liče na bakterijske proteine u crevima, ovi proteini mogu bilo podsticati bilo stimulisati inflamatorni proces koji počinje da uništava oblogu kolona. Pošto je obloga kolona uništena, iz čireva se otpušta sluz, gnoj i krv. Bolest obično počinje u rektalnoj oblasti i može se na kraju proširiti duž čitavog debelog creva. Ponavljane epizode inflamacije vode zadebljanju zida tankog creva i rektuma sa ožiljnim tkivom. Nekroza tkiva kolona ili sepsa se mogu javiti sa ozbiljnom bolešću. Simptomi ulcerativnog kolitisa variraju u ozbiljnosti i njihov početak može biti postepen ili iznenadan. Napadi mogu biti isprovocirani mnogim faktorima, uključujući respiratorne infekcije ili stres.
[0154] Iako do danas nema dostupnog leka za UC, lečenja se fokusiraju na suzbijanju abnormalnog inflamatornog procesa u oblozi kolona. Lečenja koja uključuju kortikosteroidne imunosupresive (npr. azatioprin, merkaptopurin, i metotreksat) i aminosalicilati su dostupni za lečenje bolesti. Ipak, dugotrajna primena imunosupresiva kao što su kortikosteroidi i azatioprin mogu dovesti do ozbiljnih propratnih efekata uključujući smanjenje gustine kostiju, kataraktu, infekciju, i efekata jetre i koštane srži. Kod pacijenata kod kojih trenutne terapije nisu uspešne, operacija je opcija. Operacija uključuje uklanjanje celokupnog kolona i rektuma.
[0155] Postoji nekoliko životinjskih modela koji mogu delimično da imitiraju hronični ulcerativni kolitis. Najšire primenjivan model je model kolitisa indukovan 2,4,6-trinitrobenzensulfonskom kiselinom/etanol (TNBS), koji indukuje hroničnu inflamaciju i ulceraciju u kolonu. Kada se TNBS uvede u kolon osetljivih miševa putem intra-rektalne instilacije, on izaziva T-ćelijski posredovan imuni odgovor u sluzokoži kolona, koji u ovom slučaju vodi do masivne mukozne inflamacije koju karakteriše gusta infiltracija T-ćelija i makrožfaga duž čitavog zida debelog creva. Pored toga, ova histopatološka slika je praćena kliničkom slikom progresivnog gubitka težine (atrofija), krvavom dijarejom, rektalnim prolapsom, i velikim zadebljanjem zida creva (Neurath i ostali Intern. Rev. Immunol. 19:51-62, 2000).
[0156] Drugi model kolitisa primenjuje dekstran natrijum sulfat (dextran sulfate sodium -DSS), koji izaziva akutni kolitis koji se manifestuje krvavim dijarejama, gubitkom težine, skraćenjem kolona i mukoznom ulceracijom sa infiltracijom neutrofila. Kolitis koji je indukovan DSS-om je histološki opisan infiltracijom inflamatornih ćelija unutar lamina propria, sa limfoidnom hiperplazijom, fokalnim oštećenjem kripti, i epitelijalnom ulceracijom. Smatra se da se ove promene razvijaju usled toksičnog efekta DSS-a na epitel i fagocitozom ćelija lamina propria i proizvodnjom TNFa-alfa i IFNa-gama. Uprkos njegovoj uobičajenoj primeni, nekoliko problema vezanih za mehanizme DSS-a u vezi relevantnosti za humanu bolest ostaje nerešeno. DSS se smatra modelom koji nije zavisan od T ćelija jer se posmatra kod životinja koje su deficijentne u T ćelijama kao što su SCID miševi.
[0157] Administracija humanizovanih IL-31 antigen vezujućih molekula ili IL-31 antagonista u ovim TNBS ili DSS modelima se može primeniti da se proceni primena IL-31 antagonista za poboljšanje simptoma i promenu toka gastrointestinalne bolesti. IL-31 može igrati ulogu u inflamatornom odgovoru kod kolitisa, i neutralizacija aktivnosti IL-31 administracijom humanizovanih IL-31 antigen vezujućih molekula ili IL-31 antagonista je potencijalni terapijski pristup za IBD.
4. Psorijaza
4
[0158] Psorijaza je hronično stanje kože koje pogađa više od sedam miliona Amerikanaca. Psorijaza se javlja kada nove ćelije kože rastu abnormalno, što dovodi do upaljenih, natečenih, i ljuspastih pečata na koži gde se stara koža nije skinula dovoljno brzo. Psorijazni plak - Plaque psoriasis, najčešći oblik, se karakteriše upaljenim pečatima kože ("lezijama") prekrivenim srebrno belim ljuspama. Psorijaza može biti ograničena na nekoliko plakova ili ukčljučuje umerene do široke površine kože, koje se najčešće pojavljuju na temenu, kolenima, laktovima i trupu. Iako je veoma uočljiva, psorijaza nije zarazna bolest. Patogeneza bolesti uključuje hroničnu inflamaciju pogođenih tkiva. Humanizovani IL-31 antigen vezujući molekuli ili IL-31 antagonisti mogu služiti kao dragoceni lek za redukciju inflamacije i patoloških efekata kod psorijaze, drugih inflamatornih kožnih bolesti, alergija kože i sluzokože, i povezanih bolesti.
[0159] Psorijaza je T-ćelijama posredovan inflamatorni poremećaj kože koji može izazvati značajnu neprijatnost. To je bolest za koju ne postoji lek i ona pogađa ljude svih uzrasta. Psorijaza pogađa približno dva procenta populacije u Evropi i Severnoj Americi. Iako pojedinci sa blagom psorijazom mogu često da kontrolišu svoju bolest površinskim agensima, za više od jedan milion pacijenata širom sveta je potrebna ultravioletna ili sistemska imunosupresivna terapija. Nažalost, neprijatnost i rizici od ultravioletnog zračenja i toksičnosti mnogih terapija ograničavaju njihovu dugotrajnu primenu. Pored toga, pacijenti obično imaju recidiv psorijaze.
[0160] IL-31 je izolovan iz tkiva za koje se zna da ima važnu imunološku funkciju i koje sadrži ćelije koje igraju ulogu u imunom sistemu. IL-31 je eksprimiran u CD3+ odabranim, aktiviranim ćelijama periferne krvi, i pokazano je da se eksprimiranje IL-31 povećava nakon aktivacije T ćelija. Pored toga, humanizovani IL-31 antigen vezujući molekuli ili IL-31 antagonisti imaju efekat na rast/širenje monocita/makrofaga, T-ćelija, B-ćelija, NK ćelija i/ili diferencijalno stanje monocita/makrofaga, T-ćelija, B-ćelija, NK ćelija ili progenitora ovih ćelija. Faktori koji i stimulišu proliferaciju hematopoetskih progenitora i aktiviraju zrele ćelije su uopšteno poznati, mada, proliferacija i aktivacija mogu takođe zahtevati dodatne faktore rasta. Na primer, pokazano je da su IL-7 i Steel faktor (c-kit ligand) bili potrebni za formiranje kolonije NK progenitora. IL-15 IL-2 u kombinaciji sa IL-7 i Steel faktorom su bili efikasniji (Mrózek i ostali, Blood 87:2632-2640, 1996). Ipak, nedefinisani citokini mogu biti neophodni za proliferaciju specifičnih podsetova NK ćelija i/ili NK progenitora (Robertson i ostali, Blood 76:2451-2438, 1990). Slično, IL-31 može delovati samostalno ili zajedno ili u sinergiji sa ostalim citokinima da bi se povećao rast, širenje proliferacije i modifikacija diferencijacije monocita/makrofaga, T-ćelija, B-ćelija ili NK ćelija.
[0161] Predmetna objava je usmerena ka primeni humanizovanih IL-31 antigen vezujućih molekula ili IL-31 antagonista kao antagonista u inflamatornim i imunološkim bolestima ili stanjima kao što su atopijski dermatitis, pruritičke bolesti, pankreatitis, dijabetes tipa I (IDDM), kancer pankreasa, pankreatitis, Gravesova bolest, inflamatorna bolest creva (IBD), Kronova bolest, kancer kolona i intestinalni kancer, divertikuloza, autoimuna bolest, sepsa, transplantacija organa ili koštane srži; inflamacija usled traume, operacija ili infekcija; amiloidoza; splenomegalija; bolest grafta prema domaćinu; i gde su prisutni inhibicija inflamacije, imunološka supresija, redukcija proliferacije hematopoetskih, imunih, inflamatornih ili limfoidnih ćelija, makrofaga, T-ćelija (koje uključuju Th1 i Th2 ćelije, CD4+ i CD8+ ćelije), suzbijanje imunog odgovora na patogen ili antigen. Pored toga prisustvo eksprimiranja IL-31RA u aktiviranim imunim ćelijama kao što su aktivirane CD4+ i CD19+ ćelije je pokazalo da IL-31RA receptor može biti uključen u imunološke odbrambene reakcije tela prema stranim napadačima: kao što su mikroorganizmi i ćelijski ostaci, i može igrati ulogu u imunološkim odgovorima tokom inflamacije i formiranja kancera. Kao takvi, antitela i vezujući učesnici predmetne objave koji su agonistički ili antagonistički prema IL-31RA receptorskoj funkciji, kao što je IL-31, mogu biti primenjena da bi se modifikovali imunološki odgovor i inflamacija.
[0162] Humanizovani IL-31 antigen vezujući molekuli ili IL-31 antagonisti mogu takođe biti primenjeni u okviru dijagnostičkih didtema za otkrivanje cirkulišućih nivoa IL-31. U okviru povezanog tehničkog rešenja, antitela ili drugi agensi koji se specifično vezuju za IL-31 polipeptide mogu biti primenjeni da se otkriju cirkulišući IL-31 polipeptidi. Povišeni ili sniženi nivoi vezujućih polipeptida mogu biti naznaka patoloških stanja, uključujući kancer. IL-31 polipeptidi mogu doprineti patološkim procesima i mogu biti indirektni marker osnovne bolesti.
[0163] U aterosklerotskim lezijama, jedna od prvih abnormalnosti je lokalizacija monocita/makrofaga u endotelnim ćelijama. Ove lezije se mogu sprečiti primenom antagonista na IL-31. Humanizovani IL-31 antigen vezujući molekuli ili IL-31 antagonisti se mogu primeniti kao antagonisti IL-31 u aterosklerotskim lezijama. Pored toga, monoblastična leukemija je povezana sa raznim kliničkim abnormalnostima koje odražavaju oslobađanje bioloških proizvoda makrofaga, primeri uključuju visoke nivoe lizozima u serumu i urinu i visoke temperature. Pored toga, takve leukemije pokazuju abnormalni porast monocitnih ćelija. Ovi efekti bi verovatno mogli biti sprečeni pomoću antagonista na IL-31, kao što su oni koji su ovde opisani. Pored toga, humanizovani IL-31 antigen vezujući molekuli ili IL-31 antagonisti mogu biti konjugovani sa molekulima kao što su toksični delovi i citokini, kao što je ovde opisano da bi se regulisalo ubijanje leukemijskih monocitnih ćelija.
[0164] Pokazano je da je IL-31 eksprimiran u aktiviranim mononuklearnim ćelijama, i može biti uključen u regulaciju inflamacije. Kao takvi, polipeptidi predmetne objave mogu biti testirani i primenjeni zbog njihove sposobnosti da modifikuju inflamaciju, ili mogu biti primenjeni kao marker inflamacije. Metode za određivanje proinflamatornih i antiinflamatornih osobina IL-31 su poznate u oblasti i ovde su razmatrane. Pored toga, može biti uključen u pozitivnu regulaciju stvaranja reaktanata akutne faze, kao što su serumski amiloid A (SAA), α1-antihimotripsin, i haptoglobin, i eksprimiranje liganda IL-31RA receptora može biti povećano nakon injekcije lipopolisaharida (LPS) in vivo koji su uključeni u inflamatorni odgovor (Dumoutier, L. i ostali, Proc. Nat'l. Acad. Sci. 97:10144-10149, 2000). Stvaranje proteina akutne faze, kao što je SAA, se smatra kratkoročnim mehanizmom preživljavanja gde je inflamacija korisna; ipak, održavanje proteina akutne faze u dužem periodu doprinosi hroničnoj inflamaciji i može biti štetno za humano zdravlje. Za pregled, videti Uhlar, CM i Whitehead, AS, Eur. J. Biochem. 265:501-523, 1999, i Baumann H. i Gauldie, J. Immunology Today 15:74-80, 1994. Pored toga, protein akutne faze SAA je uključen u patogenezu nekoliko hroničnih inflamatornih bolesti, uključen je u aterosklerozu i reumatoidni artritis, i prekursor je amiloid A proteina deponovanog u amiloidozi (Uhlar, CM i Whitehead, supra.). Prema tome, da je ligand kao što je IL-31 koji deluje kao proinflamatorni molekul i izaziva stvaranje SAA, humanizovani IL-31 antigen vezujući molekuli ili IL-31 antagonisti bi bili korisni u lečenju inflamatorne bolesti i drugih bolesti koje su u vezi sa proteinima akutne faze odgovora indukovanih ligandom. Na primer, metoda redukovanja inflamacije obuhvata administriranje sisarima sa inflamacijom ili svrabom količine kompozicije humanizovanih IL-31 antigen vezujućih molekula ili IL-31 antagonista koja je dovoljna da se reukuje inflamacija ili svrab. Pored toga, metoda suzbijanja inflamatornog odgovora kod sisara sa inflamacijom može obuhvatiti: (1) određivanje nivoa serumskog amiloid A proteina; (2) administriranje kompozicije koja sadrži humanizovane IL-31 antigen vezujuće molekule ili IL-31 antagoniste kao što je ovde opisano u prihvatljivom faramceutskom nosaču; (3) određivanje nivoa serumskog amiloid A proteina nakon administracije; (4) upoređivanje nivoa serumskog amiloid A proteina u koraku (1) sa nivoom serumskog amiloid A proteina u koraku (3), gde izostanak povećanja ili samanjenja nivoa serumskog amiloid A proteina ukazuje na suzbijanje inflamatornog odgovora.
[0165] Tkivna raspodela iRNK koja odgovara njenom IL-31RA receptoru cDNK pokazuje da je nivo iRNK najviši u monocitima i ćelijama prostate, i da je povišen u aktiviranim monocitima, i aktiviranim CD4+, aktiviranim CD8+, i aktiviranim CD3+ ćelijama. Stoga, IL-31RA receptor je takođe uključen u izazivanje inflamatornog i imunog odgovora. Tako, posebna tehnička rešenja predmetne objave su usmerena ka primeni humanizovanih IL-31 antigen vezujućih molekula ili IL-31 antagonista u inflamatornim i imunološkim bolestima ili stanjima kao što su, pankreatitis, tip I dijabetesa (IDDM), kancer pankreasa, pankreatitis, Gravesova bolest, inflamatorna bolest creva (IBD), Kronova bolest, kancer kolona i intestinalni kancer, divertikuloza, autoimuna bolest, sepsa, transplantacija organa ili koštane srži; inflamacija usled traume, operacija ili infekcija; amiloidoza; splenomegalija; bolest grafta prema domaćinu; i gde su prisutni inhibicija inflamacije, imuna supresija, redukcija proliferacije hematopoetskih, imunih, inflamatornih ili limfoidnih ćelija, makrofaga, T-ćelija (koje uključuju Th1 i Th2 ćelije, CD4+ i CD8+ ćelije), suzbijanje imunog odgovora na patogen ili antigen. Pored toga prisustvo IL-31RA receptora i eksprimiranje IL-31 u aktiviranim imunim ćelijama kao što su aktivirani CD3+, monociti, CD4+ i CD19+ ćelije pokazuje da IL-31RA receptor može biti uključen u imunološke odbrambene reakcije tela prema stranim napadačima: kao što su mikroorganizmi i ćelijski ostaci, i može igrati ulogu u imunološkim odgovorima tokom inflamacije i formiranja kancera. Kao takvi, humanizovani IL-31 antigen vezujući molekuli ili IL-31 antagonisti predmetne objave koji su agonistički ili antagonistički prema IL-31RA receptorskoj funkciji, mogu biti primenjeni da bi se modifikovali imunološki odgovor i inflamacija.
[0166] Humanizovani IL-31 antigen vezujući molekuli ili IL-31 antagonisti su pogodni da:
1) Antagonizuju ili blokiraju signalizaciju putem IL-31RA-koji sadrži receptore u lečenju akutne inflamacije, inflamacije kao posledice traume, tkivne povrede, operacije, sepse ili infekcije, i hroničnih inflamatornih bolesti kao što su astma, inflamatorna bolest creva (IBD), hronični kolitis, splenomegalija, reumatoidni artritis, rekurentne akutne inflamatorne epizode (npr., tuberkuloza), i lečenju amiloidoze, i ateroskleroze, Kastlemanove bolesti, astme, i drugih bolesti koje su u vezi sa izazivanjem odgovora akutne faze; i
2) Antagonizuju ili blokiraju signalizaciju putem receptora IL-31RA receptora u lečenju autoimunih bolesti kao što su IDDM, multipla skleroza (MS), sistemski eritemski lupus (SLE), mijastenija gravis, reumatoidni artritis, i IBD da bi sprečili ili inhibirali signalizaciju u imunim ćelijama (npr. limfociti, monociti, leukociti) putem IL-31RA receptora (Hughes C i ostali, J. Immunol 153: 3319-3325, 1994). Alternativna antitela, kao što su monoklonska antitela (MAb) na IL-31, se takođe mogu primeniti kao antagonist za depleciju neželjenih imunih ćelija za lečenje autoimune bolesti. Astma, alergija i druge atopijske bolesti mogu biti lečene sa MAb za na primer, anti-IL-31 antitela, rastvorljive receptore rastvorljivih IL-31RA receptora ili IL-31RA/CRF2-4 heterodimera, da bi se inhibirao imuni odgovor ili da bi se iscrpele oštećujuće ćelije. Blokiranje ili inhibicija signalizacije putem IL-31RA, primenom polipeptida i antitela predmetnog pronalaska, može takođe biti od koristi kod oboljenja pankreasa, bubrega, ćelija hipofize i neurona. IDDM, NIDDM, pankreatitis, i karcinom pankreasa mogu imati korist. IL-31RA može služiti kao meta za MAb terapiju kancera gde antagonizujući MAb inhibira rast kancera i cilja imunološki posredovano ubijanje. (Holliger P, i Hoogenboom, H: Nature Biotech.16: 1015-1016, 1998). Mabs na rastvorljive IL-31RA receptorske monomere, homodimere, heterodimere i multimere mogu takođe biti korisni za lečenje nefropatija kao što su glomeruloskleroza, membranska nefropatija, amiloidoza (koja takođe pogađa bubreg pored ostalih tkiva), renalna arterioskleroza, glomerulonefritis različitog porekla, fibroproliferativne bolesti bubrega, kao i bubrežna disfunkcija koja je povezana sa SLE, IDDM, dijabetesom tipa II (NIDDM), renalnim tumorima i drugim bolestima.
[0167] Uopšteno, doza administriranih humanizovanih IL-31 antigen vezujućih molekula ili IL-31 antagonista će varirati zavisno od takvih faktora kao što su starost pacijenta, masa, visina, pol, opšte zdravstveno stanje i prethodne istorije bolesti. Tipično, poželjno je da se primaocu obezbedi doza IL-31 polipeptida koja je u opsegu od oko 1 pg/kg do 10 mg/kg (količina agensa/telesna masa pacijenta), iako niže ili više doze takođe mogu biti administrirane kao što diktiraju uslovi. Prosečni poznavalac oblasti može lako odrediti ovakve doze, i njihove korekcije, primenom metoda koje su poznate u oblasti.
[0168] Administriranje humanizovanog IL-31 antigen vezujućeg molekula ili IL-31 antagonista subjektu može biti topikalno, inhalirao, intravensko, intraarterijalno, intraperitonealno, intramuskularno, subkutano, intrapleuralno, intratekalno, perfuzijom kroz regionalni kateter ili direktnim intralezijskim injekcijama. Prilikom administriranja terapisjkih proteina injekcijom, administracija može biti kontinualna infuzija ili pojedinačni ili višestruki bolusi.
[0169] Dodatni putevi administracije uključuju oralni, mukozno-membranski, pulmonalni, i transkutani. Oralna isporuka je pogodna za poliestarske mikrosfere, kukuruzne mikrosfere, proteinoidne mikrosfere, policijanoakrilne mikrosfere, i sisteme na bazi lipida (videti, na primer, DiBase i Morrel, "Oral Delivery of Microencapsulated Proteins," in Protein Delivery: Physical Systems, Siers i Hendren (urednici), strane 255-288 (Plenum Press 1997)). Izvodljivost intranazalne isporuke je predstavljena takvim modelom administracije insulina (videti, na primer, Hinchcliffe i Illum, Adv. Drug Deliv. Rev. 35:199 (1999)). Suve ili tečne čestice koje sadrže IL-31 mogu se pripremiti i inhalirati uz pomoć dispenzera suvog praha, tečnih aerosol generatora, ili raspršivača (npr., Pettit i Gombotz, TIBTECH 16:343 (1998); Patton i ostali, Adv. Drug Deliv. Rev. 35:235 (1999)). Ovaj pristup je ilustrovan pomoću AERX sistema upravljanja dijabetesom, koji je ručni elektronski inhalator koji isporučuje aerosolizovan insulin u pluća. Studije su pokazale da su proteini veličine 48,000 kDa isporučeni preko kožehave been delivered u terapijskim koncentracijama uz pomoć ultrazvuka niske frekvence, što ilustruje izvodljivost transkutane administracije (Mitragotri i ostali, Science 269:850 (1995)). Transdermalna isporuka koja primenjuje elektroporaciju obezbeđuje drugi način za administriranje molekula koji ima IL-31 vezujuću aktivnost (Potts i ostali, Pharm. Biotechnol.10:213 (1997)).
[0170] Farmaceutska kompozicija koja sadrži humanizovane IL-31 antigen vezujuće molekule ili IL-31 antagoniste koji imaju IL-31 vezujuću aktivnost može biti formulisana u skladu sa poznatim metodama za pripremu farmaceutski primenljivih kompozicija, pri čemu su terapijski proteini kombinovani u smešu sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Za kompoziciju se smatra da je "farmaceutski prihvatljiv nosač" ukoliko njena administracija može biti tolerisana od strane pacijenta primaoca. Sterilni fiziološki rastvor puferovan fosfatom je jedan primer farmaceutski prihvatljivog nosača. Drugi pogodni nosači su dobro poznati prosečnim poznavaocima oblasti. Videti, na primer, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19. izdanje (Mack Publishing Company 1995).
[0171] U svrhu lečenja, molekuli koji imaju IL-31 vezujuću aktivnost i farmaceutski prihvatljiv nosač su administrirani pacijentu u terapijski efikasnoj količini. Kombinacija proteina, polipeptida, ili peptida koja ima IL-31 vezujuću aktivnost i farmaceutski prihvatljiv nosač se smatra da je administrirana u "terapijski efikasnoj količini" ukoliko je administrirana količina fiziološki značajna. Agens je fiziološki značajan ukoliko njegovo prisustvo dovodi do uočljive promene u fiziologiji pacijenta primaoca. Na primer, agens primenjen za lečenje inflamacije je fiziološki značajan ukoliko njegovo prisustvo ublažava najmanje deo inflamatornog odgovora.
[0172] Farmaceutska kompozicija koja sadrži humanizovane IL-31 antigen vezujuće molekule ili IL-31 antagoniste može biti u tečnoj formi, u aerosolu, ili u čvrstoj formi. Tečne forme, su ilustrovane pomoću injekcionih rastvora, aerosola, kapljica, topoloških rastvora i oralnih suspenzija. Tipični primeri čvrstih formi uključuju kapsule, tablete, i oblike sa kontrolisanim otpuštanjem. Druga forma je ilustrovana pomoću miniosmotskih pumpi i implantata (Bremer i ostali, Pharm. Biotechnol. 10:239 (1997); Ranade, "Implants in Drug Delivery," in Drug Delivery Systems, Ranade i Hollinger (urednici), strane 95-123 (CRC Press 1995); Bremer i ostali, "Protein Delivery with Infusion Pumps," in Protein Delivery: Physical Systems, Siers i Hendren (urednici), strane 239-254 (Plenum Press 1997); Yewey i ostali, "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant," in Protein Delivery: Physical Systems, Siers i Hendren (urednici), strane 93-117 (Plenum Press 1997)). Druge čvrste forme uključuju kreme, paste, druge topološke aplikacije, i slično.
[0173] Humanizovani IL-31 antigen vezujući molekuli ili IL-31 antagonisti koji su ovde stavljeni na uvid javnosti mogu takođe biti formulisani kao imunolipozomi. Lipozomi koji sadrže antitelo se pripremaju metodama koje su poznate u oblasti, kao što je opisano u Epstein i ostali, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang i ostali, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); i američkim patentima sa brojevima 4,485,045 i 4,544,545. Lipozomi sa poboljšanim vremenom cirkulacije su stavljeni na uvid javnosti u američkom patentu sa brojem 5,013,556.
[0174] Lipozomi obezbeđuju jedan način da se isporuče terapijski polipeptidi primaocu intravenski, intraperitonealno, intratekalno, intramuskularno, subkutano, ili putem oralne administracije, inhalacije, ili intranazalne administracije. Lipozomi su mikroskopske vezikule koje se sastoje od jednog ili više lipidnih dvosloja koji okružuju vodene odeljke (videti, uopšteno, Bakker-Woudenberg i ostali, Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl.1):S61 (1993), Kim, Drugs 46:618 (1993), i Ranade, "Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers," in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (urednici), strane 3-24 (CRC Press 1995)). Lipozomi su slični u sastavu ćelijskim membranama i kao rezultat, lipozomi mogu biti bezbedno administrirani i oni su biorazgradivi. Zavisno od metode pripreme, lipozomi mogu biti unilamelarni ili multilamelarni, i lipozomi mogu varirati u veličini sa prečnicima koji se kreću u opsegu od 0.02 µm do više od 10 µm. Različiti agensi mogu biti
1
inkapsulirani u lipozomima: hidrofobni agensi u dvoslojima i hidrofilni agensi unutar unutrašnjeg/ih vodenog/ih prostora (videti, na primer, Machy i ostali, Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987), i Ostro i ostali, American J. Hosp. Pharm.
46:1576 (1989)). Pored toga, moguće je kontrolisati terapijsku raspoloživost inkapsuliranog agensa promenom veličine lipozoma, broja dvoslojeva, lipidnog sastava, kao i naelektrisanja i površinskih osobinama lipozoma.
[0175] Posebno korisni lipozomi mogu biti generisani pomoću metode isparavanja reverzne faze sa lipidnom kompozicijom koja sadrži fosfatidilholin, holesterol i PEGom-derivatizovan fosfatidiletanolamin (PEG-PE). Lipozomi su istisnuti-kroz filtere sa porama definisane veličine da bi se dobili lipozomi željenog prečnika. Fab' fragmenti antitela predmetnog pronalaska mogu biti konjugovani sa lipozomima kao što je opisano u Martin i ostali J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) putem reakcije disulfidne razmene. Hemoterapijski agens (kao što je Doksorubicin) je po izboru sadržan unutar lipozoma. Videti Gabizon i ostali J. National Cancer Inst.81(19) 1484 (1989).
[0176] Terapijske formulacije humanizovanih IL-31 antigen vezujućih molekula ili IL-31 antagonisti se pripremaju za čuvanje mešanjem antitela koje ima željeni stepen čistoće sa izbornim fiziološki prihvatljivim nosačima, ekscipijensima ili stabilizatorima (Remington's Pharmaceutical Sciences 16. izdanje, Osol, A. Ed. (1980)), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Prihvatljivi nosači, ekscipijensi, ili stabilizatori su netoksični za primaoce u primenjenim dozama i koncentracijama, i uključuju pufere kao što su fosfatne, limunske, i drugih organskih kiselina; antioksidanse koji uključuju askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što su oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene kao što su metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide niske molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što su serumski albumin, želatin, ili imunoglobulini; hidrofilne polimere kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin, ili lizin; monosaharide, disaharide, i druge karbohidrate koji uključuju glukozu, manozu, ili dekstrine; helirajuće agense kao što je EDTA; šećere kao što su sukroza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontra-joni koji formiraju so kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. Znprotein komplekses; i/ili nejonske surfaktante kao što su Tween.TM., Pluronics.TM. ili polietilen glikol (PEG).
2
[0177] Formulacija ovde može takođe sadržati više od jednog aktivnog jedinjenja ukoliko je neophodno za posebne indikacije koje se tretiraju, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču štetno jedna na drugu. Na primer, može biti poželjno da se dalje obezbede antitela koja se vezuju za IL-31 u jednoj formulaciji. Alternativno, ili dodatno, kompozicija može sadržati hemoterapijski agens ili citokin. Takvi molekuli su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za namenjenu svrhu.
[0178] Polipeptidi koji imaju IL-31 vezujuću aktivnost mogu biti inkapsulirani unutar lipozoma primenom standardnih tehnika proteinskog mikrokapsuliranja (videti, na primer, Anderson i ostali, Infect. Immun. 31:1099 (1981), Anderson i ostali, Cancer Res. 50:1853 (1990), i Cohen i ostali, Biochim. Biophys. Acta 1063:95 (1991), Alving i ostali "Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies," in Liposome Technology, 2. izdanje, tom III, Gregoriadis (ed.), strana 317 (CRC Press 1993), Wassef i ostali, Meth. Enzymol.149:124 (1987)). Kao što je naznačeno u tekstu iznad, terapijski korisni lipozomi mogu sadržati različite komponente. Na primer, lipozomi mogu sadržati lipidne derivate poli(etilen glikola) (Allen ostali, Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)).
[0179] Formulacije za primenu u in vivo administraciji moraju biti sterilne. Ovo se lako postiže filtracijom kroz sterilne membrane za filtraciju.
[0180] Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju semipermeabilne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže antitelo, čije su matrice u formi oblikovanih artikala, npr. filmova, ili mikrokapsula. Primeri matrica sa produženim oslobađanjem uključuju poliestre, hidrogelove (na primer, poli(2-hidroksietil-metakrilat), ili poli(vinilalkohol)), polilaktide (američki patent sa brojem 3,773,919), kopolimere L-glutaminske kiseline i .gama. etil-L-glutamat, nerazgradljiv etilen-vinil acetat, razgradljive kopolimere mlečne kiseline-glikolne kiseline kisele kopolimere glikolne kiseline kao što je Lupron Depot.TM. (injektibilne mikrosfere sastavljene od kopolimera mlečne kiseline-glikolne kiseline i kiselog kopolimera i leuprolid acetata), i poli-D-(-)-3-hidroksibutirne kisele. Dok polimeri kao što su etilen-vinil acetat i mlečna kiselina-glikolna kiselina omogućavaju oslobađanje molekula tokom 100 dana, određeni hidrogelovi oslobađaju proteine za kraće vremenske periode. Kada inkapsulirana antitela ostanu u telu tokom dugog vremena, oni se mogu denaturisati ili nagomilati kao rezultat izlaganja vlazi na 37°C., što dovodi do gubitka biološke aktivnosti i mogućih promena u imunogenosti. Racionalne strategije mogu biti osmišljene za stabilizaciju zavisno od uključenog mehanizma. Na primer, ukoliko je otkriveno da je mehanizam nagomilavanja formiranje intermolekularne S--S veze preko tio-disulfidne zamene, stabilizacija može biti postignuta modifikacijom sulfhidril ostataka, liofilizacijom iz kiselih rastvora, kontrolisanjem sadržaja vlage, primenom odgovarajućih dodataka, i razvijanjem specifičnih polimernih kompozicija matriksa.
[0181] Druge dozne forme mogu biti osmišljene od strane poznavaoca oblasti, kao što su pokazali, na primer, Ansel i Popović, Pharmaceutical Dosage Forms i Drug Delivery Systems, 5. izdanje (Lea & Febiger 1990), Gennaro (urednik), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19. izdanje (Mack Publishing Company 1995), i Ranade i Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996).
[0182] Kao ilustracija, farmaceutske kompozicije mogu biti obezbeđene kao kit koji sadrži posudu koja sadrži humanizovani IL-31 antigen vezujući molekul ili IL-31 antagonist (npr., antitelo ili fragment antitela koji vezuje IL-31 polipeptid). Terapijski polipeptidi mogu biti obezbeđeni u formi injektabilnog rastvora za pojedinačnu ili višestruke doze, ili kao sterilan prah koji će biti rekonstituisan pre injektiranja. Alternativno, ovakav kit može uključiti disperzer suvog praha, generator tečnog aerosola, ili raspršivač za administraciju terapijskog polipeptida.
[0183] Predmetni pronalazak je dalje ilustrovan sledećim neograničavajućim primerima.
PRIMERI
Primer 1
Određivanje sekvenci humanizovanog varijabilnog regiona
[0184] Mišja anti-humana IL-31 monoklonska antitela su opisana u američkoj patentnoj prijavi u postupku sa serijskim brojem 11/430,066, podnetoj 08. maja 2006 (Objava američkog patenta br. 2006-02752960). Aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona mišjih anti-humanih IL-31 antitela opisanih u američkoj patentnoj prijavi u postupku sa serijskim brojem 11/850,006, podnetoj 04. septembra 2007 i suvlasničkoj PCT prijavi US07/77555, podnetoj 04. septembra 2007. Ove sekvence aminokiselina su primenjene kao polazni materijal za humanizovane sekvence kao što je ovde opisano. Specifično sekvenca mišjeg anti-humanog IL-31 antitela je iz hibridoma sa brojem klona 292.12.3.1.
[0185] Nukleotidi koji kodiraju CDR regione klonova 292.12.3.1 su klonirani unutar cDNK vektora koja kodira humani IgG tako da se generisana himerna antitela sastoje od humanog
4
IgG okvirnog regiona koji čuva mišje CDR regione. Pojedinačne aminokiseline u himernom antitelu su optimizovane da bi se dobile karakteristike monoklonskog antitela visokog kvaliteta (vezujući afinitet, stabilnost, i homogenost). Trodimenzionalni modeli svakog antitela su generisani i određeni su humanizovani varijabilni regioni i CDR regioni.
[0186] Konstrukcije koje sadrže varijabilne regione teškog i lakog lanca humanizovanog mišjeg anti-humanog IL-31 su spojeni sa konstantnim regionom humanog IgG4 sa mutacijom Ser u Pro na poziciji 241 (numerisanje po Kabatu) da bi se inhibiralo formiranje polovine antitela. Konstrukti su eksprimirani u HEK2923 ćelijama i prečišćeni na proteinskoj A koloni nakon čega se menja pufer u PBS. Vezujući afinitet je meren pomoću Biacore. Potentnost je merena u testu BAF proliferacije i testu NHK stat3 fosforilacije. Bifizičke karekteristike kao što su homogenost, nagomilavanje, i stabilnost savijanja su procenjene.
Primer 2
Eksprimiranje humanizovanih IL-31 antigen vezujućih molekula u HEK293 ćelijama
[0187] Sve eksperimentalne procedure su sprovedene u skladu sa uputstvima proizvođača. cDNK anti IL-31 antitela je naručena od Geneart (http://www.Geneart.com) i podklonirana unutar eksprimirajućeg plazmida pTT5. Laki lanac (LC) i težak lanac (HC) antitela su čuvani na nezavisnim plazmidima. pTT5 je licenciran od Yves Durocher (Biotechnology Research Institute, National Research Council Canada). pTT5 plazmid je opisan u sledećim izdanjima; Durocher i ostali NAR 2002; i Pham i ostali Biotechn. Bioeng. 2003.
[0188] Da bi se dobio plazmid za HEK293-6E transfekciju, plazmidi koji su kodirani anti IL-31 antitelom su hemijski transformisani unutar TOP10 E. coli ćelija (kataloški broj C4040-06, Invitrogen, Taastrup, Denmark) i izolovani pomoću kolona za prečišćavanje plazmida (kataloški broj 27144, Qiagen, Ballerup, Danska). Mestom-regulisana razmena aminokiselina se izvodi pomoću PCR, sa prajmerima iz DNK tehnologije (http://www.DNK-technology.dk), i Dpn1 digest (kataloški broj 200518, Clontech via Medinova Scientific A/S, Glostrup, Danska). Plazmidi su sekvencirani na MWG-biotech (http://www.mwgbiotech.com/html/all/index.ph).
[0189] HEK293-6E ćelije su transfektovane kao što je opisano u 293Fectin protokolu (kataloški broj 12347019, Invitrogen, Taastrup, Danska). Ukratko, 15 µg LCa i 15 µg HCa plazmida je razblaženo u 1 ml Opti-MEMa (kataloški broj 31985-062, Gibco/Invitrogen, Taastrup, Danska) i pomešan sa 40 µl 293Fectin-a takođe razblaženog u 1 ml Opti-MEMa. Za standardnu transfekciju 30 miliona HEK293-6E ćelija je peletirano i resuspendovano u 28 ml Freestyle medijuma (kataloški broj 12338, Gibco/Invitrogen, Taastrup, Danska) i potom je dodano 2 ml smeše plazmida. Ćelije su od tog momenta na dalje inkubirane pri 37° C, 8% CO2, uz ljuljanje (125 rpm) tokom 6 dana pre peletiranja i uzorkovanja supernatanta.
Primer 3
Vezujući afinitet humanizovanih IL-31 antigen vezujućih molekula meren pomoću Biacore Uvod
[0190] Proteinske interakcije mogu biti praćene u realno vreme primenom analize površinske plazmonske rezonance (SPR). U ovoj studiji izvodimo SRP analizu na Biacore 3000 i Biacore T100 instrumentima, da bi opisali anti-IL-31 monoklonska antitela u odnosu na afinitet prema rekombinantnom humanom IL-31 (hIL-31).
[0191] Ispitivanja afiniteta su izvedena primenom procedure direktnog vezivanja, sa monoklonskim antitelom koje je kovalentno vezano preko slobodnih amino grupa za karboksimetilovanu memdranu dekstrana (CM5) na površini senzornog čipa. Rekombinantni hIL-31 je injektiran u raznim koncentracijama, nakon čega nastupa period disocijacije sa konstantnim protokom pufera preko površine senzornog čipa. Primenom eksperimentalnog plana, vezivanje hIL-31 za imobilisano monoklonsko antitelo se može posmatrati kao 1:1 vezivanje, sa jednim hIL-31 molekulom koji se vezuje za jedno vezujuće mesto antitela. Kinetički parametri za interakciju mogu biti izračunati primenom 1:1 interakcionog Langmuir modela fitovanja.
Metoda
[0192] Prečišćena monoklonska antitela su imobilisana u pojedinačnim protočnim ćelijama na senzornom čipu CM5 tipa. Imobilizacije su izvedene primenom standardne procedure vezivanja amina, čiji je cilj imobilizacioni nivo od 500 rezonantnih jedinica (Resonance Units - RU). Antitela su razblažena do 1-5 ug/ml u 10 mM NaAc-a pH 4.5.
[0193] HPS-EP pH 7.4 (10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA i 0,005% Polisorbat P20) je primenjen kao “running” pufer, i razblaživači za rekombinantni hIL-31 (hIL-31, BHK proizveden, A1277F, zcytor17lig CEE). hIL-31 je testiran u 3-strukom razblaženju serija od 333.3 nM do 1.4 nM. Period asocijacije (injekcija) je bio 4 min., nakon čega je period disocijacije (pranja) 20 min. Brzina protoka je bila 50 ul/min. Eksperimenti su izvedeni na 25OC. Regeneracija površine je postignuta pulsnim ubrizgavanjem od 30 sek. 10mM Glicin-HCl-a pH 1.8 ili 1M mravlje kiseline, pri brzini protoka od 30 ul/min. Istovremeno otkrivanje u svim protočnim ćelijama. Protočna ćelija #1 ne sadrži imobilisano antitelo, i primenjena je za oduzimanje pozadine i glavnog dela. Svi eksperimenti su izvedeni u triplikatima.
[0194] Osnovno mišje monoklonsko antitelo je uključeno u sve eksperimente za interno poređenje dobijenih kinetičkih parametara.
[0195] Kinetički parametri se računaju opštim prilagođavanjem podataka primenom 1:1 Langmuir-ovog modela vezivanja. Podaci su ispitani za ograničenja transporta mase pre računanja kinetičkih parametara. U nekim eksperimentima Rmax je lokalno podešen, i RI konstantan na 0.
[0196] Eksperimenti su izvedeni na Biacore 3000 i T100 instrumentima. Podaci su procenjeni primenom Biaeval 4.1 i Biacore T100 kompjuterskog programa za procenu. Podaci su prikazani u Tabeli 2 i niže. Nekoliko klonova je pokazalo afinitet sličan osnovnoj vrsti u ovom testu.
Tabela 2:
Primer 4
Potentnost humanizovanih IL-31 antigen vezujućih molekula meren testom BAF proliferacije A. Medijumi i puferi
[0197] Medijum za kultivaciju:RPMI 1640 sa Glutamax-om (SKN, NN), 10% toplotom inaktivisan FBS, 1% P/S (BioWhitaker Cat.No. DE17-602E), 0.5 mg/ml Geneticin (GIBCO kataloški broj 10131-019), 100 µg/ml Zeocin (Invitrogen 45-0430), 1 ng/ml mišji IL3 (TriChem ApS kataloški broj 213-13), 2ug/ml Piromicin (Sigma-Aldrich P7255) .
[0198] Test medijum: RPMI 1640 sa Glutamax-om (SKN, NN), 10% toplotom inaktivisan FBS, 1% P/S (BioWhitaker kataloški broj DE17-602E), 0.5 mg/ml Geneticin (GIBCO kataloški broj 10131-019), 100 µg/ml Zeocin (Invitrogen 45-0430), 2ug/ml Piromicin (Sigma-Aldrich P7255).
[0199] alamarBlue boja (BioScource, Dal1100) je primenjena da bi se procenila proliferacija.
B. Antitela, ćelije i citokini
[0200] Humana anti-IL-31 monoklonska antitela su proizvedena u Novo Nordisku i prečišćena u Novo Nordisku (Kopenhagen, Danska). BAF-3(hIL-31R) ćelije primljene od ZymoGenetics-a, Inc. (Sijetl, Vašington) kao KZS134-BAF3 ćelijska linija transfektovana sa genima za hIL-31Rα i hOSMRB. Rekombinantni humani IL-31 (C108S, opisan u amerikoj patentnoj objavi sa brojem 2006-0228329), proizveden u E.Coli od strane ZymoGenetics-a, Inc.). MW 18 kDa
C. Test proliferacije
1. Test stimulacije
[0201] BAF-3(hIL-31R) ćelije su detaljno isprane u test medijumu da bi se oslobodile preostalog ILa3. Ćelije su potom zasejane unutar 96-bunarčića mikrotitarskih ploča (ploča sa bunarčićima ravnog dna Packard kataloškiS00190) sa 10<4>ćelija po bunarčiću. Serijska razblaženja hIL-31 (10<-9>M do 10<-15>M) su dodata u bunarčiće i dodatni bunarčići sa ćelijama ali bez hIL-31 služe kao negativna kontrola. Ćelije su kultivisane tokom tri dana u 5% CO2 pri 37°C. Tokom poslednjih 6 sati perioda kultivacije, 10µl alamarBlue je dodano u svaki bunarčić. Ćelije su analizirane na intenzitet fluorescencije na spektrofluorometru (bmg POLARstar+ Galaxy) pri ekscitaciji 555-12nm i emisiji 590nm. Za analizu inhibicije, konstantna koncentracija hIL-31 je primenjena da stimuliše ćelije. Ova koncentracija je odabrana na osnovu približno 90% maksimalne stimulacije u testu proliferacije što pod našom odgovornošću znači 10<-10>M hIL20.
2. Test inhibicije.
[0202] 10 X 10<4>ćelija po bunarčiću ispranih BAF-3(hIL-31R) ćelija je zasejano unutar mikrotitarskih bunarčića u test medijumu. 10-10M (konačna koncentracija) hIL-31 je dodato u svaki bunarčić (izuzev nekih bunarčića koji su primenjeni kao negativna kontrola koji sadrže samo ćelije. Serijska razblaženja antitela (tj.100µg i 2- puta) su dodana u bunarčiće koji već sadrže ćelije i citokine (izuzev bunarčića koji su primenjeni za pozitivne kontrole koji bi trebalo da sadrže samo ćelije hIL-31). Smeša ćelija, citokin i antitelo su inkubirani u 100µl/w tokom 72 sata u 5% CO2 pri 37°C. Poslednjih 6 sati inkubacije uključuje 10µl/w alamarBlue. Ploče su analizirane na intenzitet fluorescencije na spektrofluorometru (bmg POLARstar+ Galaxy) pri ekscitaciji 555-12nm i emisiji 590nm. Krive su i potentnost (IC50) je računata primenom Prism 4(GraphPad PRISM kompjuterskog programa Inc.). Podaci su prikazani u Tabeli 3 i ispod. Nekoliko klonova je pokazalo potenciju sličnu osnovnoj u ovom testu.
Tabela 3: Potentnost (nM) humanizovanih mAbs pri 1E-10M hIL-31
1
Primer 5
2 Potentnost humanizovanih IL-31 antigen vezujućih molekula mereno putem testa fosforilacije NHK stat3
[0203] Kultura normalnih humanih keratinocita i test STAT3 fosforilacije:
[0204] Normalni humani keratinociti (NHKs) iz kože abdomena su dobijeni od Biopredic Int. (Ren, Francuska) i gajeni su u Epilife medijumu dopunjenim HKGS kitom od Cascade Biologics (Portland, Oregon). Detach Kit koji sadrži HBSS, tripsin-EDTA i tripsin neutrališući reagens je primenjen da se prikupe ćelije i dobijen je od Promocell-a (Hajdelberg, Nemačka). NHKs su stimulisane tokom 15 minuta sa rekombinantnim humanim IL-31 u pločama sa 96-bunarčića ravnog dna (Nunc, Roskilde, Danska) da bi se izmerila STAT3 fosforilacija i odredila EC50 citokina. NHK lizati su testirani u PathScan Phospho-STAT3 Siwich ELISA Kitu iz Cell Signaling Technology (Danvers, Masačusets) u skladu sa proizvođačkim uputstvima. IC50 svakog neutralizujućeg antitela je potom određen dodavanjem serije razblaženja antitela u NHKs pre stimulacije tokom 15 minuta sa EC80 rekombinantnog humanog IL-31. Mišji IgG1 (R&D Systems, Mineapolis, Minesoti) i humani IgG4 (Sigma-Aldrich, Sent Luis, Misuri) su primenjeni kao izotipična kontrolna antitela.
Potencije antitela usmerene protiv humanog IL-31
[0205] Za svako antitelo usmereno protiv humanog IL-31, IC50 vrednosti (nM) su prikazane u Tabeli 4. Za svaki eksperiment, dat je Z' faktor kao što je određeno XL Fit kompjuterskim programom. Prikazan je indeks stimulacije koji je dobijen sa EC80 rekombinantnog humanog IL-31. Nekoliko klonova je pokazalo potenciju sličnu osnovnoj ili prihvatljivoj potenciji u ovom testu.
Tabela 4
4
KLAUZULE
[0206]
Izolovano antitelo ili fragment antitela koji se vezuje za humani IL-31, koji sadrži:
a) humanizovani varijabilni domen teškog lanca koji sadrži CDR1, CDR2, i CDR3 koji se sastoji od aminokiselinskih sekvenci sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 1, 2 i 3, redom ili se sastoji od aminokiselinskih sekvenci sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 1, 4 i 3, redom; i
b) humanizovani varijabilni domen lakog lanca koji sadrži CDR1, CDR2, i CDR3 koji se sastoje od aminokiselinskih sekvenci sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 5, 6 i 7, redom.
Antitelo ili fragment antitela u skladu sa klauzulom 1, gde
a) navedeni humanizovani varijabilni domen teškog lanca sadrži okvirne regione FR1, FR2, FR3 i FR4 koji imaju aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinskoj sekvenci odabranoj iz grupe koja sa sastoji od:
i) aminokiselinske sekvence sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 8 (FR1), 9 (FR2), 10 (FR3) i 11 (FR4), redom;
ii) aminokiselinske sekvence sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 12 (FR1), 13(FR2), 14 (FR3) i 15 (FR4), redom;
iii) aminokiselinske sekvence sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 12 (FR1), 13 (FR2), 16 (FR3) i 15 (FR4), redom; i
b) navedeni humanizovani varijabilni domen lakog lanca sadrži okvirne regione FR5, FR6, FR7, i FR8 koji imaju aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinskoj sekvenci odabranoj iz grupe koja sa sastoji od:
i) aminokiselinske sekvence sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 17 (FR5), 18 (FR6), 19 (FR7) i 20 (FR8), redom; i
ii) aminokiselinske sekvence sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 17 (FR5), 18 (FR6), 21 (FR7) i 20 (FR8), redom.
3. Antitelo ili fragment antitela u skladu sa klauzulom 2, gde humanizovani varijabilni domen teškog lanca sadrži okvirne regione FR1, FR2, FR3 i FR4 koji se sastoje od aminokiselinske sekvence sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 8 (FR1), 9 (FR2), 10 (FR3) i 11 (FR4), redom; i gde humanizovani varijabilni domen lakog lanca sadrži okvirne regione FR5, FR6, FR7, i FR8 koji se sastoje od aminokiselinske sekvence sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 17 (FR5), 18 (FR6), 19 (FR7) i 20 (FR8), redom.
4. Antitelo ili fragment antitela u skladu sa klauzulom 2, gde humanizovani varijabilni domen teškog lanca sadrži okvirne regione FR1, FR2, FR3 i FR4 koji se sastoje od aminokiselinske sekvence sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 12 (FR1), 13 (FR2), 14 (FR3) i 15 (FR4), redom; i gde humanizovani varijabilni domen lakog lanca sadrži okvirne regione FR5, FR6, FR7, i FR8 koji se sastoje od aminokiselinske sekvence sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 17 (FR5), 18 (FR6), 19 (FR7) i 20 (FR8), redom.
5. Antitelo ili fragment antitela u skladu sa klauzulom 2, gde humanizovani varijabilni domen teškog lanca sadrži okvirne regione FR1, FR2, FR3 i FR4 koji se sastoje od aminokiselinske sekvence sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 12 (FR1), 13 (FR2), 14 (FR3) i 15 (FR4), redom; i gde humanizovani varijabilni domen lakog lanca sadrži okvirne regione FR5, FR6, FR7, i FR8 koji se sastoje od aminokiselinske sekvence sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 17 (FR5), 18 (FR6), 21 (FR7) i 20 (FR8), redom.
6. Antitelo ili fragment antitela u skladu sa bilo kojom od klauzula 2-5, gde aminokiselina na poziciji 29 u FR1 (sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 8 ili sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 12) je leucin i aminokiselina na poziciji 32 u FR3 (sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 14 ili sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 16) je fenilalanin.
7. Antitelo ili fragment antitela u skladu sa klauzulom 6, gde aminokiselina na poziciji 15 u FR7 (sa SEKVENCIONIM ID BROJEM:19 ili sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 21) je tirozin.
8. Antitelo ili fragment antitela u skladu sa klauzulom 7, gde aminokiselina na poziciji 8 u FR3 (sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 14 ili sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 16) je lizin.
9. Antitelo ili fragment antitela u skladu sa klauzulom 6, gde aminokiselina na poziciji 8 u FR3 (sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 14 ili sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 16) je lizin.
10. Antitelo ili fragment antitela u skladu sa bilo kojom od prethodnih klauzula, gde antitelo sadrži konstantni domen teškog lanca imunoglobulina odabran iz grupe koja sa sastoji od:
a) konstantnog domena humanog IgGI;
b) konstantnog domena humanog IgG2;
c) konstantnog domena humanog IgG3;
d) konstantnog domena humanog IgG4;
e) konstantnog domena humanog IgM;
f) konstantnog domena humanog IgE; i
g) konstantnog domena humanog IgA.
11. Fragment antitela u skladu sa bilo kojom od prethodnih klauzula, gde je navedeni fragment odabran iz grupe koja sa sastoji od: Fab, Fab', F(ab')2, Fv fragmenata; diatela; linearnih antitela; molekula jednolančanih antitela; monotela; i multispecifičnih antitela formiranih iz fragmenata antitela.
12. Antitelo ili fragment antitela u skladu sa bilo kojom od prethodnih klauzula, gde navedeno antitelo ili fragment antitela sadrži PEG.
13. Farmaceutska kompozicija koji sadrži antitelo ili fragment antitela u skladu sa bilo kojom od prethodnih klauzula.
14. Izolovano antitelo odabrano iz grupe koja sa sastoji od:
a) antitela koje sadrži lak lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 46 i težak lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 47;
b) antitela koje sadrži lak lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 48 i težak lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 49; i
c) antitela koje sadrži lak lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 50 i težak lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 51.
15. Izolovano antitelo ili fragment antitela koji se vezuje za humani IL-31, koji sadrži:
a) humanizovani varijabilni domen teškog lanca koji sadrži CDR1 i CDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 1 i 3 redom i CDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu AIYPGDGDTRYSXaa1Xaa2FXaa3G (sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 22) gde Xaa1 je glutamin ili prolin, Xaa2 je serin ili lizin i Xaa3 je glutamin ili lizin, i gde navedeni humanizovani varijabilni domen teškog lanca sadrži okvirne regione FR1, FR2, FR3 i FR4 koji imaju aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinskoj sekvenci odabranoj iz grupe koja sa sastoji od:
1) aminokiselinske sekvence sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 8 (FR1), 9 (FR2), 10 (FR3) i 11 (FR4) redom;
2) aminokiselinske sekvence sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 12 (FR1), 13 (FR2), 14 (FR3) i 15 (FR4) redom; i
3) aminokiselinske sekvence sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 12 (FR1), 13 (FR2), 16 (FR3) i 15 (FR4) redom;
i gde aminokiselina na poziciji 29 u FR1 (sa SEKVENCIONIM ID BROJEM:8 ili sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 12) je leucin i aminokiselina na poziciji 32 u FR3 (sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 14 ili sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 16) je fenilalanin; i
b) humanizovani varijabilni domen lakog lanca koji sadrži CDR1, CDR2, i CDR3 koji se sastoje od aminokiselinskih sekvenci sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 5 (CDR1), 6 (CDR2) i 7 (CDR3), redom navedeni humanizovani varijabilni domen lakog lanca koji sadrži okvirne regione FR5, FR6, FR7 i FR8 koji imaju aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinskoj sekvenci sa SEKVENCIONIM ID BROJEMOJEM: 17, 18, 19 i 20 redom, ili najmanje 90% identičnu aminokiselinskoj sekvenci sa SEKVENCIONIM ID BROJEMOJEM: 17, 18, 21 i 20 redom;
i gde aminokiselina na poziciji 15 u FR7 (sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 19 ili sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 21) je tirozin.
16. Antitelo ili fragment antitela u skladu sa klauzulom 15, gde su Xaa1, Xaa2, i Xaa3 SEKVENCE SA ID BROJEM: 22 odabrani iz grupe koja sa sastoji od:
a) Xaa1 glutamin, Xaa2 je lizin, i Xaa3 je lizin;
b) Xaa1 je prolin, Xaa2 je serin, i Xaa3 je glutamin; i
c) Xaa1 je glutamin, Xaa2 je lizin, i Xaa3 je glutamin.
17. Antitelo ili fragment antitela u skladu sa klauzulom 15, gde aminokiselina na poziciji 8 u FR3 (sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 14 ili sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 16) je leucin.
18. Antitelo ili fragment antitela u skladu sa bilo kojom od klauzula 15-17, gde antitelo sadrži konstantni domen teškog lanca imunoglobulina odabran iz grupe koja sa sastoji od:
a) konstantnog domena humanog IgGI;
b) konstantnog domena humanog IgG2;
c) konstantnog domena humanog IgG3;
d) konstantnog domena humanog IgG4;
e) konstantnog domena humanog IgM;
f) konstantnog domena humanog IgE; i
g) konstantnog domena humanog IgA.
19. Fragment antitela u skladu sa bilo kojom od klauzula 15-18, gde je navedeni fragment odabran iz grupe koja sa sastoji od: Fab, Fab', F(ab')2, Fv fragmenata; diatela; linearnih antitela; molekula jednolančanih antitela; monotela; i multispecifičnih antitela formiranih iz fragmenata antitela.
20. Antitelo ili fragment antitela u skladu sa bilo kojom od klauzula 15-19, gde navedeno antitelo ili fragment antitela sadrži PEG.
21. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo ili fragment antitela bilo koje od klauzula 15-20.
22. Metoda lečenja inflamacije kod sisara, koja obuhvata administriranje antitela ili fragmenta antitela koje se vezuje za humani IL-31, gde navedeno antitelo ili fragment antitela sadrži
a) humanizovani varijabilni domen teškog lanca koji sadrži CDR1, CDR2, i CDR3 koji se sastoje od aminokiselinskih sekvenci sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 1, 2 i 3 redom ili se sastoje od aminokiselinskih sekvenci sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 1, 4 i 3 redom; i
b) humanizovani varijabilni domen lakog lanca koji sadrži CDR1, CDR2, i CDR3 koji se sastoje od aminokiselinskih sekvenci sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 5, 6 i 7.
23. Metoda lečenja pruritusa kod sisara, koja obuhvata administriranje antitela ili fragmenta antitela koje se vezuje za humani IL-31, gde navedeno antitelo ili fragment antitela sadrži a) humanizovani varijabilni domen teškog lanca koji sadrži CDR1, CDR2, i CDR3 koji se sastoje od aminokiselinskih sekvenci sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 1, 2 i 3 redom ili se sastoje od aminokiselinskih sekvenci sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 1, 4 i 3 redom; i
b) humanizovani varijabilni domen lakog lanca koji sadrži CDR1, CDR2, i CDR3 koji se sastoje od aminokiselinskih sekvenci sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 5, 6 i 7.
24. Izolovano antitelo ili fragment antitela koje se vezuje za humani IL-31, koje sadrži humanizovani varijabilni domen teškog lanca i humanizovani varijabilni domen lakog lanca koji su odabrani iz grupe koja sa sastoji od:
a) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 25 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 26;
b) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 27 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 26;
c) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 25 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 28;
d) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 29 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje
1
90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 26;
e) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 27 i humanizovani varijabilni domen lakog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 28;
f) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 30 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 26;
g) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 31 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 26;
h) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 25 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 32;
i) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 25 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 33;
j) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 25 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 34;
2
k) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 35 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 26;
l) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 27 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 32;
m) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 27 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 33;
n) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 27 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 34;
o) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 36 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 37;
p) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 25 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji sadrži aminokiselinske sekvence sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 37;
q) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji sadrži aminokiselinske sekvence sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 38 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji sadrži aminokiselinske sekvence sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 37;
r) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji sadrži aminokiselinske sekvence sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 39 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji sadrži aminokiselinske sekvence sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 37;
s) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 40 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 37;
t) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 41 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 37;
u) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 42 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 37;
v) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 43 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 37;
w) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 44 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 26;
4
x) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 36 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 28;
y) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 36 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 28; i
z) humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 45 i humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji ima najmanje 90% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 37.
25. Antitelo ili fragment antitela u skladu sa klauzulom 24, gde antitelo sadrži konstantni domen teškog lanca imunoglobulina odabran iz grupe koja sa sastoji od:
a) konstantnog domena humanog IgGI;
b) konstantnog domena humanog IgG2;
c) konstantnog domena humanog IgG3;
d) konstantnog domena humanog IgG4;
e) konstantnog domena humanog IgM;
f) konstantnog domena humanog IgE; i
g) konstantnog domena humanog IgA.
26. Fragment antitela u skladu sa klauzulom 24 ili 25, gde je navedeni fragment odabran iz grupe koja sa sastoji od: Fab, Fab', F(ab')2, Fv fragmenata; diatela; linearnih antitela; molekula jednolančanih antitela; monotela; i multispecifičnih antitela formiranih iz fragmenata antitela.
27. Antitelo ili fragment antitela u skladu sa bilo kojom od klauzula 24-26, gde navedeno antitelo ili fragment antitela sadrži PEG.
28. Primena antitela ili fragmenta antitela koje se vezuje za humani IL-31 u proizvodnji leka za lečenje inflamacije kod sisara, gde navedeno antitelo ili fragment antitela sadrži
a) humanizovani varijabilni domen teškog lanca koji sadrži CDR1, CDR2, i CDR3 koji se sastoje od aminokiselinskih sekvenci sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 1, 2 i 3 redom ili se sastoje od aminokiselinskih sekvenci sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 1, 4 i 3 redom; i
b) humanizovani varijabilni domen lakog lanca koji sadrži CDR1, CDR2, i CDR3 koji se sastoje od aminokiselinskih sekvenci sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 5, 6 i 7.
29. Primena antitela ili fragmenta antitela koje se vezuje za humani IL-31 u proizvodnji leka za lečenje pruritusa kod sisara, gde navedeno antitelo ili fragment antitela sadrži
a) humanizovani varijabilni domen teškog lanca koji sadrži CDR1, CDR2, i CDR3 koji se sastoje od aminokiselinskih sekvenci sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 1, 2 i 3 redom ili se sastoje od aminokiselinskih sekvenci sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 1, 4 i 3 redom; i
b) humanizovani varijabilni domen lakog lanca koji sadrži CDR1, CDR2, i CDR3 koji se sastoje od aminokiselinskih sekvenci sa SEKVENCIONIM ID BROJEM: 5, 6 i 7.
LISTA SEKVENCI
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
�

Claims (8)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Izolovano monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za humani IL-31 koji sadrži humanizovani varijabilni domen teškog lanca i humanizovani varijabilni domen lakog lanca,
gde humanizovani varijabilni domen teškog lanca sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 koji se sastoje od aminokiselinskih sekvenci sa SEK ID BROJEVIMA: 1, 2 i 3, redom, i okvirne regione FR1, FR2, FR3, i FR4 koji imaju aminokiselinsku sekvencu koja je barem 90% identična aminokiselinskoj sekvenci sa SEK ID BROJEM:12 (FR1), SEK ID BROJEM:13 (FR2), SEK ID BROJEM:14 (FR3) i SEK ID BROJEM:15 (FR4) redom; i
gde humanizovani varijabilni domen lakog lanca sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 koji se sastoje od aminokiselinskih sekvenci sa SEK ID BROJEVIMA: 5, 6 i 7, redom, i okvirne regione FR5, FR6, FR7, i FR8 koji imaju aminokiselinsku sekvencu koja je barem 90% identična aminokiselinskoj sekvenci sa SEK ID BROJEM:17 (FR5), SEK ID BROJEM:18 (FR6), SEK ID BROJEM:19 (FR7) i SEK ID BROJEM:20 (FR8) redom;
gde aminokiselinski ostatak na poziciji 29 SEKVENCE SA ID BROJEM:12 (FR1) je leucin, aminokiselinski ostatak na poziciji 8 SEKVENCE SA ID BROJEM:14 (FR3) je lizin, aminokiselinski ostatak na poziciji 32 SEKVENCE SA ID BROJEM:14 (FR3) je fenilalanin i aminokiselinski ostatak na poziciji 15 SEKVENCE SA ID BROJEM:19 (FR7) je tirozin.
2. Izolovani monoklonski antigen-vezujući fragment u skladu sa patentnim zahtevom 1, gde antigen-vezujući fragment dalje sadrži Fcdomen.
3. Izolovano monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2, gde antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži konstantni domen teškog lanca imunoglobulina odabran iz grupe koja se sastoji od: a) humanog IgG1 konstantnog domena;
b) humanog IgG2 konstantnog domena;
c) humanog IgG3 konstantnog domena; i
d) humanog IgG4 konstantnog domena.
4. Izolovano monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u skladu sa patentnim zahtevom 3, gde konstantni domen teškog lanca imunoglobulina je humani IgG4 konstantni domen.
5. Izolovano monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u skladu sa patentnim zahtevom 4, gde humani IgG4 konstantni domen ima mutaciju serina u prolin na poziciji 241 kao što je utvrdio Kabat.
6. Primena izolovanog monoklonskog antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-5, za proizvodnju leka za lečenje atopijskog dermatitisa, dermatitisa, prurigo nodularis, ekcema, pruritusa, vitiliga, alopecia aerata, acne rosacea, acne vulgaris, buloznog pemfigoida ili kontaktnog dermatitisa.
7. Izolovano monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-5 za primenu u lečenju atopijskog dermatitisa, dermatitisa, prurigo nodularis, ekcema, pruritusa, vitiliga, alopecia aerata, acne rosacea, acne vulgaris, buloznog pemfigoida ili kontaktnog dermatitisa.
8. Primena u skladu sa patentnim zahtevom 6, ili izolovanog monoklonskog antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 7, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.
RS20180194A 2007-12-07 2008-12-08 Molekuli humanizovanih antitela specifični za il-31 RS56930B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US1236207P 2007-12-07 2007-12-07
EP14175301.2A EP2796466B1 (en) 2007-12-07 2008-12-08 Humanized antibody molecules specific for IL-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS56930B1 true RS56930B1 (sr) 2018-05-31

Family

ID=40347963

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20180194A RS56930B1 (sr) 2007-12-07 2008-12-08 Molekuli humanizovanih antitela specifični za il-31

Country Status (24)

Country Link
US (8) US8470979B2 (sr)
EP (3) EP2471817B1 (sr)
JP (2) JP5744522B2 (sr)
KR (1) KR101603109B1 (sr)
CN (1) CN101970488B (sr)
AU (1) AU2008333131B2 (sr)
BR (1) BRPI0820099A2 (sr)
CA (1) CA2708251C (sr)
CY (1) CY1120412T1 (sr)
DK (1) DK2796466T3 (sr)
EA (1) EA020457B1 (sr)
ES (2) ES2660036T3 (sr)
HR (1) HRP20180252T1 (sr)
HU (1) HUE036548T2 (sr)
IL (1) IL206147A (sr)
LT (1) LT2796466T (sr)
ME (1) ME03057B (sr)
NO (1) NO2796466T3 (sr)
PL (1) PL2796466T3 (sr)
PT (1) PT2796466T (sr)
RS (1) RS56930B1 (sr)
SI (1) SI2796466T1 (sr)
TR (1) TR201802202T4 (sr)
WO (1) WO2009071696A2 (sr)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2490276C2 (ru) 2002-01-18 2013-08-20 Займоджинетикс, Инк. Новый лиганд рецептора цитокина zcytor17
JP4927762B2 (ja) * 2005-02-14 2012-05-09 ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド Ｉｌ−３１アンタゴニストに対するアトピー性皮膚炎の治療応答を予測する方法
US20130216542A1 (en) 2005-05-06 2013-08-22 Zymogenetics, Inc. Variable region sequences of il-31 monoclonal antibodies and methods of use
CN101198624B (zh) 2005-05-06 2012-10-10 津莫吉尼蒂克斯公司 Il-31单克隆抗体及使用方法
US8101183B2 (en) 2005-05-06 2012-01-24 Zymogentics, Inc. Variable region sequences of IL-31 monoclonal antibodies
EP2001906A2 (en) 2006-01-10 2008-12-17 Zymogenetics, Inc. Methods of treating pain and inflammation in neuronal tissue using il-31ra and osmrb antagonists
EP2061811A2 (en) 2006-09-01 2009-05-27 ZymoGenetics, Inc. Variable region sequences of il-31 monoclonal antibodies and methods of use
SI2796466T1 (en) 2007-12-07 2018-01-31 Zymogenetics, Inc. Molecules of Humanized Specifics Specifiable for IL-31
US8790651B2 (en) * 2011-07-21 2014-07-29 Zoetis Llc Interleukin-31 monoclonal antibody
WO2014057003A1 (en) * 2012-10-11 2014-04-17 Nerre Therapeutics Limited Novel uses
HUE056580T2 (hu) 2013-05-30 2022-02-28 Kiniksa Pharmaceuticals Ltd Onkosztatin-M-receptor antigénjét kötõ fehérjék
AR099625A1 (es) * 2014-03-21 2016-08-03 Lilly Co Eli Anticuerpos de il-21
AR102333A1 (es) 2014-08-19 2017-02-22 Regeneron Pharma Selectividad eficiente de proteínas recombinadas
FI3284480T3 (fi) * 2015-04-14 2025-09-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd IL-31-antagonistia vaikuttavana ainesosana sisältävä farmaseuttinen koostumus atooppisen ihottuman ehkäisemiseksi ja/tai hoitamiseksi
US9862760B2 (en) 2015-09-16 2018-01-09 Novartis Ag Polyomavirus neutralizing antibodies
ES2823173T3 (es) 2016-01-27 2021-05-06 Just Biotherapeutics Inc Promotor híbrido y usos del mismo
US11098310B2 (en) 2016-01-27 2021-08-24 Just-Evotec Biologics, Inc. Expression from transposon-based vectors and uses
US11261462B2 (en) 2016-01-27 2022-03-01 Just-Evotec Biologics, Inc. Inducible expression from transposon-based vectors and uses
US10093731B2 (en) 2017-02-24 2018-10-09 Kindred Biosciences, Inc. Anti-IL31 antibodies for veterinary use
CN111417651B (zh) 2017-12-01 2023-09-29 诺华股份有限公司 多瘤病毒中和抗体
CA3093709C (en) 2018-03-16 2024-03-26 Zoetis Services Llc Peptide vaccines against interleukin-31
JP7449234B2 (ja) 2018-03-16 2024-03-13 ゾエティス・サービシーズ・エルエルシー 獣医学使用のためのインターロイキン３１モノクローナル抗体
FR3084365B1 (fr) * 2018-07-27 2020-10-23 Cisbio Bioassays Anticorps a domaine unique qui se lient a la proteine g alpha
JP7671275B2 (ja) 2019-08-29 2025-05-01 エランコ・ユーエス・インコーポレイテッド 動物用の抗ｉｌ３１抗体
WO2021100794A1 (ja) * 2019-11-20 2021-05-27 中外製薬株式会社 抗体含有製剤
CA3189847A1 (en) 2020-09-01 2022-03-10 Naoki Fukazawa Pharmaceutical composition for prevention and/or treatment of dialysis pruritus containing il-31 antagonist as active ingredient
JP2023550628A (ja) * 2020-11-23 2023-12-04 スカウト バイオ， インコーポレイテッド 抗原結合分子およびその使用
EP4267614A1 (en) * 2020-12-23 2023-11-01 Numab Therapeutics AG Antibody variable domains that bind il-31
EP4019546A1 (en) * 2020-12-23 2022-06-29 Numab Therapeutics AG Antibody variable domains that bind il-31
WO2025226834A1 (en) 2024-04-23 2025-10-30 Attovia Therapeutics, Inc. Il31-binding polypeptides and uses thereof
CN121362250A (zh) * 2024-07-19 2026-01-20 普米斯生物技术(珠海)有限公司 抗il-31抗体、其药物组合物及用途
WO2026032397A1 (en) * 2024-08-09 2026-02-12 Zai Lab (Shanghai) Co., Ltd. Binding molecules with an interleukin-31 receptor subunit alpha-antigen-binding domain and uses thereof
WO2026055142A1 (en) 2024-09-03 2026-03-12 Attovia Therapeutics, Inc. Il13 and il31 bispecific polypeptides and uses thereof

Family Cites Families (97)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US459293A (en) 1891-09-08 Horse-checking device
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4054646A (en) 1973-07-30 1977-10-18 General Electric Method and apparatus for detection of antibodies and antigens
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4741900A (en) 1982-11-16 1988-05-03 Cytogen Corporation Antibody-metal ion complexes
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
IL71691A (en) 1984-04-27 1991-04-15 Yeda Res & Dev Production of interferon-ypsilon
WO1987001130A1 (en) 1985-08-15 1987-02-26 Stauffer Chemical Company Tryptophan producing microorganism
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
EP0281604B1 (en) 1986-09-02 1993-03-31 Enzon Labs Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5489425A (en) 1987-06-24 1996-02-06 The Dow Chemical Company Functionalized polyamine chelants
US4994560A (en) 1987-06-24 1991-02-19 The Dow Chemical Company Functionalized polyamine chelants and radioactive rhodium complexes thereof for conjugation to antibodies
US5336603A (en) 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
US5756065A (en) 1988-06-24 1998-05-26 The Dow Chemical Company Macrocyclic tetraazacyclododecane conjugates and their use as diagnostic and therapeutic agents
CN1033030C (zh) 1988-06-24 1996-10-16 唐化学原料公司 大环双官能螯合剂及其配合物和抗体共轭物的制备方法
EP0353450B1 (en) 1988-06-24 1995-03-29 The Dow Chemical Company Macrocyclic bifunctional chelants, complexes thereof and their antibody conjugates
US5274119A (en) 1988-07-01 1993-12-28 The Dow Chemical Company Vicinal diols
US5078997A (en) 1988-07-13 1992-01-07 Cetus Corporation Pharmaceutical composition for interleukin-2 containing physiologically compatible stabilizers
US5696239A (en) 1988-10-31 1997-12-09 The Dow Chemical Company Conjugates possessing ortho ligating functionality and complexes thereof
KR900005995A (ko) 1988-10-31 1990-05-07 우메모또 요시마사 변형 인터류킨-2 및 그의 제조방법
US5342604A (en) 1988-10-31 1994-08-30 The Dow Chemical Company Complexes possessing ortho ligating functionality
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
EP0394827A1 (en) 1989-04-26 1990-10-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Chimaeric CD4-immunoglobulin polypeptides
US5766883A (en) 1989-04-29 1998-06-16 Delta Biotechnology Limited Polypeptides
US5808003A (en) 1989-05-26 1998-09-15 Perimmune Holdings, Inc. Polyaminocarboxylate chelators
US5112946A (en) 1989-07-06 1992-05-12 Repligen Corporation Modified pf4 compositions and methods of use
FR2650598B1 (fr) 1989-08-03 1994-06-03 Rhone Poulenc Sante Derives de l'albumine a fonction therapeutique
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
WO1991006570A1 (en) 1989-10-25 1991-05-16 The University Of Melbourne HYBRID Fc RECEPTOR MOLECULES
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5349053A (en) 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
EP0462815B1 (en) 1990-06-21 1996-09-25 Honeywell Inc. Receding horizon based adaptive control having means for minimizing operating costs
GB2276169A (en) 1990-07-05 1994-09-21 Celltech Ltd Antibodies specific for carcinoembryonic antigen
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
ATE145428T1 (de) 1990-12-14 1996-12-15 Cell Genesys Inc Chimärische ketten zur transduktion von rezeptorverbundenen signalwegen
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
EP0590058B1 (en) 1991-06-14 2003-11-26 Genentech, Inc. HUMANIZED Heregulin ANTIBODy
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5428139A (en) 1991-12-10 1995-06-27 The Dow Chemical Company Bicyclopolyazamacrocyclophosphonic acid complexes for use as radiopharmaceuticals
WO1993011794A1 (en) 1991-12-13 1993-06-24 Xoma Corporation Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
GB9203459D0 (en) 1992-02-19 1992-04-08 Scotgen Ltd Antibodies with germ-line variable regions
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
US5505931A (en) 1993-03-04 1996-04-09 The Dow Chemical Company Acid cleavable compounds, their preparation and use as bifunctional acid-labile crosslinking agents
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5492841A (en) 1994-02-18 1996-02-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Quaternary ammonium immunogenic conjugates and immunoassay reagents
US5783672A (en) 1994-05-26 1998-07-21 Immunex Corporation Receptor for oncostatin M
CZ25697A3 (en) 1994-07-29 1997-09-17 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
US6086874A (en) 1994-12-29 2000-07-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antitumor agent effect enhancer containing IL-6 antagonist
US6030613A (en) 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
EP1658772A3 (en) 1995-01-17 2007-01-17 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US6074849A (en) 1995-07-19 2000-06-13 Genetics Institute, Inc. Polynucleotides encoding human CTLA-8 related proteins
CA2249195A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
US5792850A (en) 1996-05-23 1998-08-11 Zymogenetics, Inc. Hematopoietic cytokine receptor
DE19623207A1 (de) * 1996-06-11 1997-12-18 Bayer Ag Imidazolderivate
WO2002008288A2 (en) 2000-07-20 2002-01-31 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20020034507A1 (en) 1997-02-28 2002-03-21 Yasuo Koishihara Inhibitor of lymphocyte activation
DK1188830T3 (da) 1999-06-02 2010-04-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Nyt hæmopoietinreceptorprotein NR10
AU6531101A (en) 2000-06-02 2001-12-17 Genentech Inc Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
EP2075253A1 (en) 2000-06-23 2009-07-01 Genentech, Inc. Compositions and methds for the diagnosis and treatment of disorders involving angiogensis
US20030096339A1 (en) 2000-06-26 2003-05-22 Sprecher Cindy A. Cytokine receptor zcytor17
EP1325115B1 (en) 2000-06-26 2016-07-27 ZymoGenetics, Inc. Cytokine receptor zcytor17
US20030059871A1 (en) 2000-10-06 2003-03-27 Cosman David J. Hematopoietin receptors HPR1 and HPR2
EP1355919B1 (en) 2000-12-12 2010-11-24 MedImmune, LLC Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
WO2002077230A1 (fr) 2001-03-26 2002-10-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Variants d'epissage nr10
JP4723810B2 (ja) * 2001-12-03 2011-07-13 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド ハイブリッド抗体
WO2004003140A2 (en) 2002-01-18 2004-01-08 Zymogenetics, Inc. Cytokine receptor zcytor17 multimers
RU2490276C2 (ru) 2002-01-18 2013-08-20 Займоджинетикс, Инк. Новый лиганд рецептора цитокина zcytor17
US7303896B2 (en) 2002-02-25 2007-12-04 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding novel type-1 cytokine receptor GLM-R
US7723084B2 (en) * 2002-06-18 2010-05-25 The University Of Akron Fibrous protein-immobilization systems
GB0303337D0 (en) 2003-02-13 2003-03-19 Celltech R&D Ltd Biological products
JP4808157B2 (ja) 2003-08-07 2011-11-02 ザイモジェネティクス リミテッド ライアビリティ カンパニー Ｉｌ−２８およびｉｌ−２９の均一な調製物
CA2578131A1 (en) 2004-09-10 2006-03-23 Wyeth Humanized anti-5t4 antibodies and anti-5t4 antibody/calicheamicin conjugates
AR051836A1 (es) 2004-11-30 2007-02-14 Centocor Inc Antagonistas de receptor 3 simil toll metodos y usos
ES2579758T3 (es) 2005-01-28 2016-08-16 Zymogenetics, Inc. Preparaciones homogéneas de IL-31
JP4927762B2 (ja) 2005-02-14 2012-05-09 ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド Ｉｌ−３１アンタゴニストに対するアトピー性皮膚炎の治療応答を予測する方法
EP1858924A1 (en) 2005-02-14 2007-11-28 ZymoGenetics, Inc. Methods of treating skin disorders using an il-31ra antagonist
CN101198624B (zh) 2005-05-06 2012-10-10 津莫吉尼蒂克斯公司 Il-31单克隆抗体及使用方法
US8101183B2 (en) * 2005-05-06 2012-01-24 Zymogentics, Inc. Variable region sequences of IL-31 monoclonal antibodies
US20130216542A1 (en) 2005-05-06 2013-08-22 Zymogenetics, Inc. Variable region sequences of il-31 monoclonal antibodies and methods of use
EP2001906A2 (en) 2006-01-10 2008-12-17 Zymogenetics, Inc. Methods of treating pain and inflammation in neuronal tissue using il-31ra and osmrb antagonists
EP2061811A2 (en) 2006-09-01 2009-05-27 ZymoGenetics, Inc. Variable region sequences of il-31 monoclonal antibodies and methods of use
AU2008204823A1 (en) 2007-01-10 2008-07-17 Zymogenetics, Inc Methods of using IL-31 to treat airway hyper-responsiveness and asthma
SI2796466T1 (en) 2007-12-07 2018-01-31 Zymogenetics, Inc. Molecules of Humanized Specifics Specifiable for IL-31
US8790651B2 (en) * 2011-07-21 2014-07-29 Zoetis Llc Interleukin-31 monoclonal antibody

Also Published As

Publication number Publication date
CA2708251C (en) 2016-04-12
EP2471817B1 (en) 2016-03-16
ES2570853T3 (es) 2016-05-20
CN101970488B (zh) 2014-06-18
EP2215120A2 (en) 2010-08-11
WO2009071696A3 (en) 2009-09-03
PT2796466T (pt) 2018-02-23
EA020457B1 (ru) 2014-11-28
US20170313768A1 (en) 2017-11-02
CN101970488A (zh) 2011-02-09
SI2796466T1 (en) 2018-01-31
US20150183868A1 (en) 2015-07-02
JP5744522B2 (ja) 2015-07-08
AU2008333131B2 (en) 2013-10-24
ME03057B (me) 2019-01-20
DK2796466T3 (en) 2018-02-05
HUE036548T2 (hu) 2018-08-28
US20200262913A1 (en) 2020-08-20
IL206147A (en) 2013-10-31
EP2796466A3 (en) 2015-03-04
CY1120412T1 (el) 2019-07-10
US20160311898A1 (en) 2016-10-27
IL206147A0 (en) 2010-12-30
KR101603109B1 (ko) 2016-03-25
AU2008333131A1 (en) 2009-06-11
EA201070695A1 (ru) 2010-12-30
EP2471817A3 (en) 2012-08-29
JP2015070843A (ja) 2015-04-16
LT2796466T (lt) 2018-02-26
EP2471817A2 (en) 2012-07-04
KR20100100860A (ko) 2010-09-15
US8685669B2 (en) 2014-04-01
US9982044B2 (en) 2018-05-29
US11542327B2 (en) 2023-01-03
US20130295611A1 (en) 2013-11-07
US8470979B2 (en) 2013-06-25
BRPI0820099A2 (pt) 2020-11-24
US9005921B2 (en) 2015-04-14
US10640559B2 (en) 2020-05-05
JP5852210B2 (ja) 2016-02-03
US20180305448A1 (en) 2018-10-25
CA2708251A1 (en) 2009-06-11
TR201802202T4 (tr) 2018-03-21
HRP20180252T1 (hr) 2018-03-09
NO2796466T3 (sr) 2018-04-21
US20140186891A1 (en) 2014-07-03
PL2796466T3 (pl) 2018-04-30
EP2796466B1 (en) 2017-11-22
JP2011506302A (ja) 2011-03-03
US9416184B2 (en) 2016-08-16
US20090208494A1 (en) 2009-08-20
HK1154020A1 (en) 2012-04-13
US9738715B2 (en) 2017-08-22
EP2796466A2 (en) 2014-10-29
WO2009071696A2 (en) 2009-06-11
ES2660036T3 (es) 2018-03-20
HK1169127A1 (en) 2013-01-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11542327B2 (en) Methods of treating pruritic disease with IL-31 monoclonal antibodies
EP2594586B1 (en) IL-31 monoclonal antibodies and methods of use
EP3029070A1 (en) Therapeutic dll4 binding proteins
HK1169127B (en) Humanized antibody molecules specific for il-31
HK1154020B (en) Humanized antibody molecules specific for il-31