RS56975B1 - Metode za lečenje hcv-a - Google Patents

Metode za lečenje hcv-a

Info

Publication number
RS56975B1
RS56975B1 RS20180222A RSP20180222A RS56975B1 RS 56975 B1 RS56975 B1 RS 56975B1 RS 20180222 A RS20180222 A RS 20180222A RS P20180222 A RSP20180222 A RS P20180222A RS 56975 B1 RS56975 B1 RS 56975B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
compound
mmol
hcv
added
mixture
Prior art date
Application number
RS20180222A
Other languages
English (en)
Inventor
Adrian S Ray
William J Watkins
John O Link
David W Oldach
Iv William E Delaney
Original Assignee
Gilead Pharmasset Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=46970425&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS56975(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Gilead Pharmasset Llc filed Critical Gilead Pharmasset Llc
Publication of RS56975B1 publication Critical patent/RS56975B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A61K31/7072—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid having two oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. uridine, uridylic acid, thymidine, zidovudine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/38—Heterocyclic compounds having sulfur as a ring hetero atom
    • A61K31/381—Heterocyclic compounds having sulfur as a ring hetero atom having five-membered rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4184—1,3-Diazoles condensed with carbocyclic rings, e.g. benzimidazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4196—1,2,4-Triazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/7056—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing five-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/06—Tripeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/212—IFN-alpha
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Treating Waste Gases (AREA)
  • Exhaust Gas After Treatment (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Opis pronalaska
OBLAST TEHNIKE NA KOJU SE PRONALAZAK ODNOSI
[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na kombinacije terapijskih molekula korisnih za lečenje infekcije virusom hepatitisa C.
STANJE TEHNIKE PREDMETNOG PRONALASKA
[0002] Hepatitis je bolest koja se javlja širom sveta. Hepatitis je generalno virusne prirode, iako, ako se smatra stanjem hroničnog zapaljenja jetre, postoje i drugi poznati, neinfektivni uzroci. Virusni hepatitis je daleko najčešći oblik hepatitisa. Američki centar za kontrolu bolesti procenjuju da najmanje 1.8% populacije u SAD ima serološki dokaz o HCV infekciji, u većini slučajeva povezanih sa hroničnom aktivnom infekcijom. HCV je virus koji ima pozitivan lanac RNK koji pripada porodici Flaviviridae i ima najbližu vezu sa pestivirusima koji uključuju svinjski virus kolere i virus goveđe virusne dijareje.
[0003] HCV genom je jednolančana, pozitivna RNK od oko 9,600 bp koja kodira poliprotein od 3009-3030 amino kiselina, koji je iscepan ko- i post-translaciono pomoću ćelijskih i dve virusne proteinaze u zrele virusne proteine (jezgro, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B). Veruje se da su strukturni proteini, E1 i E2, ugrađeni u virusni lipidni omotač i formiraju stabilne heterodimere. Veruje se da strukturni protein jezgra stupa u interakciju sa virusnim RNK genomom kako bi se formirao nukleokapsid. Nestrukturni proteini označeni NS2 do NS5 uključuju proteine sa enzimskim funkcijama uključene u replikaciju virusa i obrađivanje proteina uključujući polimerazu, proteazu i helikazu. HCV se replikuje kroz proizvodnju šablona komplementarne negativne RNK.
[0004] HCV je genetski raznovrstan virus. U okviru jednog inficiranog pacijenta, mogu se identifikovati mnoge varijante virusa, što dovodi do opisa 'virusne grupe' ili virusnih kvazivrsta. U okviru globalne ljudske populacije, HCV je takođe genetički raznovrstan, sa najmanje 6 glavnih 'genotipova' koji su identifikovani (Genotipovi 1-6) i brojnim podtipovima (tj., HCV Genotip 1a i 1b). HCV genotipovi su definisani genomskom filogenetskom analizom i dijagnostikovani (kod datog pacijenta) pomoću dijagnostičkih testova za HCV zasnovanih na RNK sekvenci.
[0005] Glavni put infekcije sa HCV-om je izloženost krvi. Opseg HCV infekcije kao zdravstveni problem ilustrovana je prevalencom među visoko rizičnim grupama. Na primer, u nekim istraživanjima, 60% do 90% hemofiličara i više od 80% osoba koje intravenski zloupotrebljavaju droge u zapadnim zemljama imalo je hroničnu HCV infekciju. Za osobe koje intravenski zloupotrebljavaju droge, prevalenca varira od oko 28% do 80% u zavisnosti od ispitane populacije. Udeo novih HCV infekcija povezanih sa transfuzijom krvi ili produkata krvi značajno je smanjena zbog farmaceutskih napredovanja i širokog korišćenja osetljivih seroloških i testova detekcije RNK koji se koriste za proveru donatora krvi, međutim, velika kohorta starijih, hronično zaraženih osoba je već utvrđena.
[0006] Jedan dostupni tretman HCV infekcije je pegilovani interferon- α (PEG-IFN α1a ili PEG-IFN α1b), koji je, prema trenutnim uputstvima za lečenje, administriran nedeljno subkutanim injekcijama u trajanju od 24 do 48 nedelja, u zavisnosti od HCV viralnog genotipa koji se leči. Iako se očekuje da preko 50% pacijenata sa genotipom 1 HCV infekcije ima supresiju HCV viremije nakon završetka terapije od 48 nedelja, značajan procenat ovih pacijenata će imati relaps virusa. Shodno tome, stabilan virološki odgovor (Sustained Virologic Response - SVR, definisan kao negativan rezultat za HCV RNK 24 nedelje nakon prestanka lečenja, i koji se smatra jednak 'izlečenju'), postiže se samo kod 30-40% infekcija HCV-om genotipa 1 tretiranih samo sa PEG-IFN-om. Osim toga, tretman sa PEG-IFN RBV se ne toleriše dobro, sa profilom neželjenih događaja koji uključuje simptome slične gripu, trombocitopeniju, anemiju i teške psihijatrijske propratne efekte. Iako je tretman sa sadašnjim standardom nege suboptimalan, mnogi pacijenti su onemogućeni da započnu terapiju usled komorbiditeta čestih u populacijama koje su inficirane HCV-om, uključujući psihijatrijske poremećaje, uznapredovalu bolest jetre i zloupotrebu supstanci.
[0007] Ribavirin je nukleozidni analogni antivirusni lek. Ribavirin se obično uzima oralno (ustima) dva puta dnevno. Tačan mehanizam za ribavirin nije poznat. Međutim, veruje se da kada ribavirin ulazi u ćeliju ona je fosforilisana; zatim deluje kao inhibitor inozin 5'-monofosfat dehidrogenaze (IMPDH). IMPDH inhibitori, kao što je ribavirin, smanjuju intraćelijsku sintezu i skladištenje guanina, nukleotidnog "gradivnog bloka" neophodnog za proizvodnju DNK i RNK, tako inhibirajući virusnu replikaciju. IMPDH inhibitori takođe ometaju reprodukciju ćelija koje bržo proliferišu i ćelija sa visokom stopom prometa proteina. Lečenje sa monoterapijom ribavirina ima mali uticaj na nivoe HCV RNK, ali je povezano sa smanjenjem serumske alanin transferaze (ALT). Ovo zapažanje sugeriše da ribavirin možda ne deluje kao antivirusni agens, već kao modulator funkcije imunog sistema. Ribavirin se odobrava samo za upotrebu, za HCV infekciju, u kombinaciji sa IFN.
[0008] Tretman sa kombinacijom PEG-IFN plus ribavirin poboljšava SVR stope preko onih koje su primećene samo sa PEG-IFN-om, u velikoj meri zbog smanjenja učestalosti viralnog relapsa nakon prestanka terapije. SVR stope velikih kliničkih studija za pacijente koji su tretirani sa PEG-IFN/ribavirinom sa HCV infekcijom Genotipa 1 su se kretale od 40-55%. U današnjem vremenu, terapija PEG-IFN/ribavirinom se smatra tretmanom "standard nege" za hroničnu HCV infekciju. Međutim, očekuje se da se standard nege ubrzo promeni u bliskoj budućnosti uz odobrenje direktnih antivirusnih agenasa koji će se, u početku, koristiti u kombinaciji sa PEG-IFN/ribavirinom.
[0009] Nažalost, različiti genotipovi HCV-a različito reaguju na terapiju PEG-IFN/ribavirinom; Na primer, HCV genotip 1 je otporniji na terapiju nego tipovi 2 i 3. Pored toga, mnogi postojeći tretmani za HCV proizvode neželjene propratne efekte. Dakle, trenutno postoji potreba za novim anti-virusnim terapijama. Posebno postoji potreba za novim antivirusnim terapijama koje proizvode manje neželjenih propratnih efekata, koji su efikasniji protiv niza HCV genotipova, ili onih koji imaju manje komplikovane rasporede doziranja, tj. koji zahtevaju administarciju leka manje puta tokom dana.
[0010] Lawitz E.J., et al., Journal of Hepatology, 2012, tom 57, str24-31 prijavljuje da jedinjenje GS-5885 (koje odgovara Jedinjenju 6 ovde, inhibitoru HCV NS5A polimeraze) ima antiviralnu aktivnost kod pacijenata inficiranih genotipom 1a i 2b HCV-a.
[0011] Lam A.M., et al., Antimicrob. Agents Chemother., 2010, tom 54, str3187-3196 prijavljuje da je jedinjenje (koje odgovara Jedinjenju 10 ovde, nukleozidnom inhibitoru HCV NS5B polimeraze) pan-genotipski inhibitor HCV replikacije.
REZIME PREDMETNOG PRONALASKA
[0012] Predmetni pronalazak obezbeđuje kompozicije i njihovu upotrebu u terapijskim postupcima koji su korisni za lečenje virusnih infekcija (npr. HCV). Određene kompozicije predmetnog pronalaska proizvode manje neželjenih propratnih efekata, efikasnije su protiv niza HCV genotipova, smanjuju potencijal za povratak virusa usled selekcije rezistentnosti i imaju skraćene manje složene dozne rasporede nego trenutno dostupne terapije.
[0013] Prema tome, u jednom tehničkom rešenju pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži: 1) Jedinjenje 10
ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i 2) Jedinjenje 6
ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.
[0014] U drugom tehničkom rešenju pronalazak obezbeđuje kompoziciju iznad koja dalje sadrži Jedinjenje 5
ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.
[0015] U drugim tehničkim rešenjima, kompozicija kao što je definisano iznad dalje sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatljivih razblaživača ili nosača. Gore navedena kompozicija može se formulisati kao jedinični dozni oblik za administraciju jednom dnevno i/ili formulisati za oralnu administraciju, opciono kao tableta.
[0016] U još jednom tehničkom rešenju, pronalazak obezbeđuje kompoziciju kao što je opisano iznad za primenu u medicinskoj terapiji.
[0017] U još jednom tehničkom rešenju, pronalazak obezbeđuje kompoziciju kao što je opisano iznad za primenu u profilaktičkom ili terapijskom lečenu HCV infekcije. U jednom tehničkom rešenju, kompozicija za gornju primenu nije za administraciju sa interferonom. U još jednom tehničkom rešenju, kompozicija za gore pomenutu primenu je za administraciju sa ribavirinom.
[0018] Kompozicije i njihova upotreba prema predmetnom pronalasku mogu obezbediti "sinergiju" i "sinergijske efekte", tj. efekat koji se postiže kada se aktivni sastojci (uključujući dva ili više kombinovanih jedinjenja) koriste zajedno je veći od sume efekata koji rezultiraju od korišćenja jedinjenja posebno.
[0019] Kompozicije i njihova upotreba prema predmetnom pronalasku su korisne jer obezbeđuju tretmane za širok spektar HCV genotipova i zato što uzrokuju manje ili u manjem stepenu ozbiljne propratne efekte od trenutnih terapija HCV-a (npr. tretmani koji uključuju administraciju interferona). Pored toga, određene kombinacije jedinjenja (npr. Jedinjenja 10 i 6 i jedinjenja 10, 5 i 6) mogu da obezbede stabilan virološki odgovor (SVR) koji je znatno viši od onog koji je postignut putem trenutnih terapija (npr. HCV terapije). Na primer, neke kombinacije jedinjenja mogu da obezbede SVR koji je najmanje oko 70% ili najmanje oko 80%.
DETALJAN OPIS PREDMETNOG PRONALASKA
Definicije
[0020] Ukoliko nije drugačije naznačeno, sledeći termini i fraze kao što su ovde korišćeni bi trebalo da imaju sledeća značenja. Činjenica da određeni termin ili fraza nije posebno definisan ne bi trebalo da bude u korelaciji sa neodređenošću ili nedovoljnom jasnoćom, već se radije ovde koriste termini u okviru njihovog običnog značenja. Kada se ovde koriste trgovačka imena, prijavioci nameravaju da nezavisno uključe trgovački naziv proizvoda i aktivni farmaceutski sastojak(sastojke) proizvoda sa trgovačkim nazivom.
[0021] Kao što je ovde korišćeno termin "Kombinovana jedinjenja" odnosi se na Jedinjenje 10 i Jedinjenje 6, i, ukoliko je prisutno ili primenjeno, Jedinjenje 1, Jedinjenje 2, Jedinjenje 3, Jedinjenje 4, Jedinjenje 5, Jedinjenje 7, Jedinjenje 9, Jedinjenje 11, Jedinjenje 12, Jedinjenje 13, Jedinjenje 14, Jedinjenje 15 i Jedinjenje 16.
[0022] Kao što je ovde korišćeno, Jedinjenje 1 je:
Jedinjenje 1 može se takođe nazvati 5-((6-(2,4-bis(trifluorometil)fenil)piridazin-3-il)metil)-2-(2-fluorofenil)-5H-imidazo[4,5-c]piridin ili 5H-imidazo[4,5-c]piridin, 5-[[6-[2,4-bis(trifluorometil)fenil]piridazin-3-il]metil]-2-(2-fluorofenil).
[0023] Kao što je ovde korišćeno, Jedinjenje 2 je:
Jedinjenje 2 može se takođe nazvati (2R,6S,13aR,14aS,16aS)-2-(8-hloro-2-(2-(izopropilamino)tiazol-4-il)-7-metoksihinolin-4-iloksi)-6-(ciklopentiloksikarbonilamino)-5,16-dioksooktadekahidrociklopropa[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazaciklopentadecin-14a-il(2,6-diflurobenzil)fosfinska kiselina.
[0024] Kao što je ovde korišćeno, Jedinjenje 3 je:
[0025] Kao što je ovde korišćeno, Jedinjenje 4 je:
[0026] Kao što je ovde korišćeno, Jedinjenje 5 je:
[0027] Kao što je ovde korišćeno, Jedinjenje 6 je:
[0028] Kao što je ovde korišćeno, Jedinjenje 7 je:
[0029] Kao što je ovde korišćeno, Jedinjenje 8 je:
[0030] Kao što je ovde korišćeno Jedinjenje 9 (diastereomer na P) je:
[0031] Što se tiče Jedinjenja 9, upućuje se na US 7,964,580 i US 2010/0298257, što se tiče proizvodnje i prečišćavanja Jedinjenja 9.
[0032] Kao što je ovde korišćeno, Jedinjenje 10 (S-izomer Jedinjenja 9) je:
[0033] Što se tiče Jedinjenja 10, upućuje se na US 7,964,580 i US 2010/0298257, što se tiče proizvodnje i prečišćavanja Jedinjenja 10.
[0034] Kao što je ovde korišćeno, Jedinjenje 11 je:
[0035] Što se tiče Jedinjenja 11, upućuje se na US 2010/0081628 što se tiče proizvodnje i prečišćavanja Jedinjenja 11.
[0036] Kao što je ovde korišćeno, Jedinjenje 12 (diastereomer na P) je:
[0037] Što se tiče Jedinjenja 12, upućuje se na US 20110015146 što se tiče proizvodnje i prečišćavanja Jedinjenja 12.
[0038] Kao što je ovde korišćeno, Jedinjenje 13 (S-diastereomer Jedinjenja 12 na P) je:
[0039] Što se tiče Jedinjenja 13, upućuje se na US 20110015146 što se tiče proizvodnje i prečišćavanja Jedinjenja 13.
[0040] Kao što je ovde korišćeno, Jedinjenje 14 je:
[0041] Što se tiče Jedinjenja 14, upućuje se na US 7,964,580 što se tiče proizvodnje i prečišćavanja Jedinjenja 14.
[0042] Kao što je ovde korišćeno, Jedinjenje 15 je:
[0043] Što se tiče Jedinjenja 15, upućuje se na US 7,964,580 što se tiče proizvodnje i prečišćavanja Jedinjenja 15.
[0044] Kao što je ovde korišćeno, Jedinjenje 16 je:
[0045] Što se tiče Jedinjenja 16, upućuje se na US 7,429,572 što se tiče proizvodnje i prečišćavanja Jedinjenja 16.
[0046] Što se tiče ribavirin, upućuje se na EP 0 093 401 B1, što se tiče procesa proizvodnje kao i nomenklature koja se odnosi na ribavirin. Kao što je ovde korišćeno, ribavirin se odnosi na:
[0047] Ribavirin je takođe nazvan 1-β-D-ribofuranozil-1H-1,2,4-Triazol-3-karboksamid, 1-β-D-ribofuranozil-1,2,4-triazol-3-karboksiamid; 1-β-D-Ribofuranozil-1,2,4-triazol-3-karboksamid; COPEGUS (Roche); DRG-0028; HSDB 6513; ICN 1229; MegaRibavirin (npr. u formulacijama od 100 mg ribavirina/mL); NSC 163039; RAVANEX (BioPartners); REBETOL (Schering-Plough; Aesca; Bayer Schering Pharma; Essex; Pfizer; Trading Pharma; Zuellig Pharma); Ribamid; RIBAMIDIL (Biopharma, Rusija); RIBASPHERE (Three Rivers Pharmaceuticals); Ribavarin; Ribavirina; Tribavirin; VILONA (Valeant Pharmaceuticals; ICN Pharmaceuticals); VIRAMID (ICN Pharmaceuticals ; Alfa Wassermann); VIRAZOL (Valeant Pharmaceuticals); i VIRIZADOL (Uci-farma, Sao Bernardo do Campo, Sao Paulo, Brazil). Dodatno, kao što je ovde korišćeno ribavirin uključuje analoge ribavirina, uključujući taribavirin (VIRAMIDINE, ICN 3142).
[0048] Termin "interferon" uključuje 1) interferone, npr., pegilovani rIFN-alfa 2b (PEG-Intron, Merck & Co., Inc.), pegilovani rIFN-alfa 2a (PEGASYS, Hoffmann-La Roche Inc.), rIFN-alfa 2b (INTRON® A, Merck & Co., Inc.), rIFN-alfa 2a (Roferon®-A, Hoffmann-La Roche Inc.), interferon alfa (MULTIFERON® Viranative AB Corporation, OPC-18, Alfaferone, Alfanative, subalin), interferon alfakon-1 (Valeant), interferon alfa-n1 (Wellferon™, Glaxo Wellcome), interferon alfa-n3 (ALFERON®-Hemispherx Biopharma, Inc.), interferon-beta-1a (AVONEX® Biogen Idec, DL-8234 Daiichi Pharmaceutical Co. Ltd), interferon-omega (omega DUROS®, Alza Corporation, Intarcia Therapeutics, Inc.; Biomed 510, Intarcia Therapeutics, Inc.), albinterferon alfa-2b (ALBUFERON®, Human Genome Sciences, INC.), IFN alfa-2b XL, BLX-883 (LOCTERON®, Biolex Therapeutics, INC.), DA-3021, glikozilovani interferon alfa-2b (AVI-005), PEG-INFERGEN®, Amgen, Inc., Pegilovani interferon lambda-1(type III) (Pegilovani IL-29), i BELEROFON®, Nautilus Biotech.
[0049] Termin "kombinovana terapija"označava kompozicije ili metode ili primene ili slično koje uključuju dva ili više kombinovanih jedinjenja. Kombinovana terapija može takođe da uključi druge aktivne sastojke dodatno uz dva ili više kombinovanih jedinjenja uključujući, ali bez ograničenja: ribavirin, interferon, inhibitor alfa-glukozidaze 1, hepatoprotektant, agonist Toll-sličnog receptora (TLR)-7, inhibitor ciklofilina, inhibitor HCV viralnog ulaza, inhibitor sazrevanja HCV-a, i HCV IRES inhibitor.
[0050] Termin "aktivni sastojak" označava komponentu kombinovane terapije koja vrši ili može da vrši farmaceutski efekat uključujući bilo koje od kombinovanih jedinjenja, ribavirin, interferon, inhibitor alfa-glukozidaze 1, hepatoprotektant, TLR-7 agonist, inhibitor ciklofilina, inhibitor viralnog ulaza HCV, inhibitor sazrevanja HCV i HCV IRES inhibitor.
[0051] Termin "lečenje" i gramatički ekvivalenti istog, kada se koriste u kontekstu lečenja bolesti, podrazumeva usporavanje ili zaustavljanje progresije bolesti, ili poboljšanje bar jednog simptoma bolesti, poželjnije ublažavanje više od jednog simptoma bolesti. Na primer, HCV pacijent može doživeti poboljšanje u jednom ili svim sledećim simptomima koji mogu biti povezani sa HCV infekcijom: povećanje nivoa alanin aminotransferaze (ALT), groznica, glavobolja, bolovi u mišićima, žutica, umor, gubitak apetita, mučnina, povraćanje i dijareja. Tretman infekcije virusom hepatitisa C može uključiti smanjenje opterećenja HCV virusom u ljudskom biću koje je inficirano HCV-om.
[0052] Određena jedinjenja koja su ovde opisana sadrže jedan ili više hiralnih centara, ili mogu inače biti u stanju da postoje kao višestruki stereoizomeri. Obim predmetnog pronalaska obuhvata smeše stereoizomera kao i prečišćenih enantiomera ili enantiomerno/ diastereomerno obogaćene smeše. Takođe obuhvaćeni u okviru predmetnog pronalaska su pojedinačni izomeri jedinjenja predstavljenih formulama prikazanim ovde, kao i bilo koje potpuno ili delimično ekvilibrisane njihove smeše. Predmetni pronalazak takođe uključuje pojedinačne izomere jedinjenja predstavljenih ovde prikazanom formulom kao smeše sa njegovim izomerima u kojima su jedan ili više hiralnih centara obrnuti. Stereohemijske definicije i konvencije koje se ovde koriste uopšteno prate S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, Njujork; i Eliel, E. i Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., Njujork.
[0053] Mnoga organska jedinjenja postoje u optički aktivnim oblicima, t.j., ona imaju mogućnost da rotiraju ravan linearno polarizovanog svetla. U opisivanju optički aktivnog jedinjenja, prefiksi D i L ili R i S se koriste da označe apsolutnu konfiguraciju molekula oko njegovog hiralnog centra(centara). Prefiksi d i l ili (+) i (-) koriste se za označavanje znaka rotacije linearno polarizovanog svetla pomoću jedinjenja, sa (-) ili l značenjem da je jedinjenje levorotirajuće. Jedinjenje sa prefiksom (+) ili d je desnorotirajuće.
[0054] Specifični stereoizomer se takođe može nazvati enantiomer, i smeša takvih izomera često se naziva enantiomerna smeša. Mešavina enantiomera 50:50 se naziva racemskom smešom ili racematom, koja može nastati tamo gde nije bilo stereoselekcije ili stereospecifičnosti u hemijskoj reakciji ili procesu. Termini "racemska smeša" i "racemat" odnose se na ekvimolarnu mešavinu dve enantiomerne vrste, lišene optičke aktivnosti.
Kombinacije
[0055] Predmetni pronalazak obuhvata kombinacije dva ili više kombinovanih jedinjenja. Tabela I koja prikazuje moguće dvočlane (Kombinacija 17), tročlane (Kombinacije 32-55), četvoročlane (Kombinacije 62-91) i petočlane (Kombinacije 94-113) kombinacije Jedinjenja 1, Jedinjenja 2, Jedinjenja 3, Jedinjenja 5, Jedinjenja 6, Jedinjenja 7, i Jedinjenja 10 je obezbeđena ispod. Jedinjenje 4, Jedinjenje 9, Jedinjenje 10, Jedinjenje 11, Jedinjenje 12, Jedinjenje 13, Jedinjenje 14, Jedinjenje 15 i Jedinjenje 16 su nukleozidni inhibitori HCV NS5b polimeraze i kombinacije kombinovanih jedinjenja će najčešće uključiti samo jedno od Jedinjenja 4, Jedinjenja 9, Jedinjenja 10, Jedinjenja 11, Jedinjenja 12, Jedinjenja 13, Jedinjenja 14, Jedinjenja 15 i Jedinjenja 16 (Jedinjenja 10 – videti kolonu 6 iz Tabele I).
TABELA I
Kompozicije
[0056] Jedan aspekt predmetnog pronalaska uključuje kompoziciju, npr. farmaceutsku kompoziciju, kompoziciju koja sadrži Jedinjenje 6 i dalje koja sadrži Jedinjenje 10.
[0057] Još jedan aspekt predmetnog pronalaska uključuje kompoziciju, npr. farmaceutsku kompoziciju, kompoziciju koja sadrži Jedinjenje 6 i dalje koja sadrži Jedinjenje 5 i Jedinjenje 10.
Soli
[0058] Kombinovana jedinjenja i drugi aktivni sastojci mogu biti u obliku soli. Tipično, ali ne i apsolutno, soli kombinovanih jedinjenja i drugi aktivni sastojci su farmaceutski prihvatljive soli. Soli obuhvaćene pojmom "farmaceutski prihvatljive soli" odnose se na netoksične soli kombinovanih jedinjenja i/ili druge aktivne sastojake. Primeri pogodnih farmaceutski prihvatljivih soli uključuju neorganske adicione soli kiseline kao što su hlorid, bromid, sulfat, fosfat i nitrat; organske kisele adicione soli kao što su acetat, galaktarat, propionat, sukcinat, laktat, glikolat, malat, tartarat, citrat, maleat, fumarat, metansulfonat, p-toluensulfonat i askorbat; soli sa kiselom amino kiselinom kao što su aspartat i glutamat; soli alkalnih metala kao što su natrijumova so i kalijumova so; soli zemnoalkalnih metala kao što su magnezijumova so i kalcijumova so; amonijum so; organske bazne soli kao što su so trimetilamina, so trietilamina, so piridina, so pikolina, so dicikloheksilamina i so N, N'dibenziletilendiamina; i soli sa baznom aminokiselinom kao što je so lizina i so arginina. Soli mogu u nekim slučajevima biti hidrati ili solvati etanola.
Farmaceutske formulacije
[0059] Kombinovana jedinjenja i/ili drugi aktivni sastojci mogu biti formulisani sa konvencionalnim nosačima ili ekscipijensima, koji se mogu odabrati u skladu sa uobičajenom praksom.
[0060] Tablete obično sadrže ekscipijense, glidante, punila, veziva i slično. Vodene formulacije mogu se pripremati u sterilnom obliku, a kada su namenjene za isporuku osim za oralnu administraciju, generalno će biti izotonične. Sve formulacije će opciono sadržati ekscipijense kao što su oni navedeni u Priručniku za farmaceutske ekscipijense - the Handbook of Pharmaceutical Excipients (1986). Pomoćne supstance uključuju askorbinsku kiselinu i druge antioksidante, helirajuće agense kao što je EDTA, ugljene hidrate kao što je dekstrin, hidroksialkilceluloza, hidroksialkilmetilceluloza, stearina kiselina i slično.
[0061] pH formulacija je u opsegu od oko 3 do oko 11, ali je uobičajeno 7 do 10.
[0062] Iako je moguće da se aktivni sastojak administrira sam može biti poželjno da se jedan ili više aktivnih sastojaka predstave kao farmaceutske formulacije. Formulacije predmetnog pronalaska, kako za veterinarsku, tako i za ljudsku upotrebu, sadrže najmanje jedan aktivni sastojak, zajedno sa jednim ili više prihvatljivih nosača i opciono drugim terapijskim sastojcima. Nosilac (nosioci) moraju biti "prihvatljivi" u smislu da budu kompatibilni sa ostalim sastojcima formulacije i fiziološki neškodljivi za njegovog primaoca.
[0063] Formulacije uključuju one puteve pogodne za administracije koji su navedeni u nastavku. Formulacije se mogu pogodno prikazati u jediničnoj doznoj formi i mogu se pripremiti bilo kojom od metoda koje su dobro poznati u farmacuetskoj oblasti. Tehnike i formulacije generalno se mogu naći u Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, Pa.). Takve metode uključuju korak dovođenja u vezu aktivnog sastojka sa nosačem koji čini jedan ili više pomoćnih sastojaka. Generalno se formulacije mogu pripremati ravnomerno i blisko dovodeći u vezu jedan ili više aktivnih sastojaka sa tečnim nosačima ili fino podeljenim čvrstim nosačima ili oba, a zatim, po potrebi, oblikovanjem proizvoda.
[0064] Formulacije predmetnog pronalaska pogodne za oralnu administraciju mogu biti predstavljene kao podeljene jedinice kao što su kapsule, kesice ili tablete, od kojih svaka sadrži prethodno određenu količinu aktivnog sastojka; kao prah ili granule; kao rastvor ili suspenzija u vodenoj ili ne-vodenoj tečnosti; ili kao tečna emulzija ulja u vodi ili tečna emulzija vode u ulju. Aktivni sastojak se takođe može administrirati kao bolus, elektuarijum ili pasta.
[0065] Tableta se može napraviti kompresijom ili oblikovanjem, opciono sa jednim ili više pomoćnih sastojaka. Kompresovane tablete mogu biti pripremljene kompresovanjem u odgovarajućoj mašini aktivnog sastojka u slobodno-protočnom obliku, kao što je prah ili granule, opciono pomešanog sa vezivom, lubrikantom, inertnim razblaživačem, konzervansom, površinski aktivnim ili sredstvom za dispergovanje. Oblikovane tablete mogu se napraviti kalupljenjem u odgovarajućoj mašini smeše aktivnog sastojka u prahu navlažene inertnim tečnim razblaživačem. Tablete mogu opciono da budu premazane ili zarezane i opciono se mogu formulisati tako da obezbede sporo ili kontrolisano oslobađanje aktivnog sastojka.
[0066] Za administraciju u oko ili druga spoljna tkiva npr. usta i koža, formulacije se mogu poželjno primeniti kao topikalna mast ili krema koja sadrži aktivni sastojak (aktivne sastojke) u količini od 0.075 do 20% m/m (uključujući aktivni sastojak (aktivne sastojke) u opsegu između 0.1% i 20% u koracima od 0.1% m/m, kao što su 0.6% m/m, 0,7% m/m itd.), poželjno 0.2 do 15% m/m i najpoželjnije 0.5 do 10% m/m. Kada se formuliše u masti, aktivni sastojak može biti upotrebljen bilo sa parafinskom ili sa masnom bazom koja se može mešati sa vodom. Alternativno, aktivni sastojak može biti formulisan u kremi sa bazom kreme ulje u vodi.
[0067] Ako je poželjno, vodena faza baze kreme može uključivati, na primer, najmanje 30% m/m polihidričnog alkohola, tj. alkohola koji ima dve ili više hidroksilnih grupa kao što su propilen glikol, butan 1,3-diol, manitol, sorbitol, glicerol i polietilen glikol (uključujući PEG 400) i njihove smeše. Topikalne formulacije mogu poželjno uključiti jedinjenje koje poboljšava apsorpciju ili penetraciju aktivnog sastojka kroz kožu ili druge pogođene oblasti. Primeri takvih poboljšivača penetracije uključuju dimetil sulfoksid i srodne analoge.
[0068] Uljana faza emulzija kombinovanih jedinjenja i/ili drugih aktivnih sastojaka može biti sastavljena od poznatih sastojaka na poznati način. Dok faza može sadržati samo emulgator (inače poznat kao emulgent), poželjno je da sadrži smešu najmanje jednog emulgatora sa masti ili uljem ili i sa mastima i sa uljem. Poželjno, hidrofilni emulgator je uključen zajedno sa lipofilnim emulgatorom koji deluje kao stabilizator. Takođe je poželjno uključiti i ulje i mast. Emulgator zajedno sa ili bez stabilizatora čini takozvani emulgujući vosak, a vosak zajedno sa uljem i mašću čini tzv. emulgujuću masnu bazu koja formira uljanu dispergovanu fazu formulacija kreme.
[0069] Emulgatori ili stabilizatori emulzije pogodni za primenu u formulaciji predmetnog pronalaska uključuju Tween® 60 (ICI Americas Inc.), Span 80, cetostearil alkohol, benzil alkohol, miristil alkohol, gliceril mono-stearat i natrijum lauril sulfat.
[0070] Izbor pogodnih ulja ili masti za formulaciju zasniva se na postizanju željenih kozmetičkih svojstava. Krema treba poželjno da bude nemasna, da ne ostavlja fleke, i da može da se opere sa odgovarajućom konzistencijom kako bi se izbeglo curenje iz tuba ili drugih posuda. Ravni ili razgranati lanac, mono- ili dibazni alkil estri kao što su di-izoadipat, izocetil stearat, propilen glikol diestar kokosovih masnih kiselina, izopropil miristat, decil oleat, izopropil palmitat, butil stearat, 2-etilheksil palmitat ili mešavina estara razgranatog lanca poznatih kao Krodamol - Crodamol CAP, mogu se koristiti, a poslednja tri su poželjni estri. Oni se mogu koristiti sami ili u kombinaciji u zavisnosti od potrebnih svojstava. Alternativno, mogu se koristiti lipidi visoke tačke topljenja, kao što su beli mekani parafin i/ili tečni parafin ili druga mineralna ulja.
[0071] Farmaceutske formulacije prema predmetnom pronalasku sadrže jedan ili više aktivnih sastojaka zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača ili ekscipijenasa i opciono druge terapijske agense. Farmaceutske formulacije koje sadrže aktivne sastojke mogu biti u bilo kom obliku pogodnom za predvidjeni metod administracije. Kada se koriste za oralnu upotrebu, na primer, mogu se pripremati tablete, pilule, pastile, vodene ili uljane suspenzije, disperzibilni prahovi ili granule, emulzije, tvrde ili meke kapsule, sirupi ili eliksiri. Kompozicije namenjene za oralnu upotrebu mogu biti pripremljene prema bilo kojoj metodi poznatoj u oblasti za proizvodnju farmaceutskih kompozicija i takve kompozicije mogu da sadrže jedan ili više agensa uključujući zaslađivače, arome, boje i konzervanse, kako bi se obezbedio ukusan preparat. Tablete koje sadrže aktivni sastojak u mešavini sa netoksičnim farmaceutskim prihvatljivim ekscipijensom koje su pogodne za proizvodnju tableta su prihvatljive. Ovi ekscipijensi mogu biti, na primer, inertni razblaživači, kao što su kalcijum ili natrijum karbonat, laktoza, laktoza monohidrat, natrijum kroskarmeloza, povidon, kalcijum ili natrijum fosfat; sredstva za granulaciju i raspadanje, kao što je kukuruzni skrob, ili alginska kiselina; vezujući agensi, kao što su celuloza, mikrokristalna celuloza, skrob, želatin ili akacija; i lubrikantni agensi, kao što su magnezijum stearat, stearinska kiselina ili talk. Tablete mogu biti bez premaza ili mogu biti obložene poznatim tehnikama uključujući mikroenkapsulaciju da bi se odložilo raspadanje i adsorpcija u gastrointestinalnom traktu i na taj način obezbedilo produženo delovanje u dužem periodu. Na primer, može se koristiti materijal koji odlaže vreme, kao što je gliceril monostearat ili gliceril distearat, ili sa voskom.
[0072] Formulacije za oralnu primenu mogu se takođe predstaviti kao tvrde želatinske kapsule u kojima se aktivni sastojak(sastojci) pomeša sa inertnim čvrstim razblaživačem, na primer kalcijum fosfatom ili kaolinom, ili kao meke želatinske kapsule gde se aktivni sastojak pomeša sa vodom ili uljanim medijumom, kao što je ulje od kikirikija, tečni parafin ili maslinovo ulje.
[0073] Vodene suspenzije predmetnog pronalaska sadrže aktivne sirovine u smeši sa ekscipijensima pogodnim za proizvodnju vodenih suspenzija. Takvi ekscipijensi obuhvataju sredstvo za suspendovanje, kao što je natrijum karboksimetilceluloza, metilceluloza, hidroksipropil metilceloza, natrijum alginat, polivinilpirolidon, tragakant guma i guma akacija, i dispergujući ili agensi za vlaženje kao što je prirodni fosfatid (npr., lecitin), proizvod kondenzacije alkilen oksida sa masnom kiselinom (npr., polioksietilen stearat), proizvod kondenzacije etilen oksida sa alifatičnim alkoholom dugog lanca (npr. heptadekaetilenoksicetanol), proizvod kondenzacije etilen oksida sa delimičnim estrom izvedenim iz masne kiseline i heksitol anhidrid (npr., polioksietilen sorbitan monooleat). Vodena suspenzija može takođe sadržati jedan ili više konzervanasa kao što su etil ili n-propil p-hidroksi-benzoat, jedno ili više sredstava za bojenje, jedno ili više sredstava za aromatizaciju i jedan ili više zaslađivača, kao što su sukroza ili saharin.
[0074] Uljane suspenzije se mogu formulisati suspendovanjem aktivnog sastojka u biljnom ulju, kao što je ulje kikirikija, maslinovo ulje, susamovo ulje ili kokosovo ulje, ili u mineralnom ulju kao što je tečni parafin. Oralne suspenzije mogu sadržati sredstva za zgušnjavanje, kao što je pčelinji vosak, tvrdi parafin ili cetil alkohol. Zaslađivači, kao što su ovde navedeni, i arome mogu se dodati da bi se obezbedio prijatan oralni preparat. Ove kompozicije se mogu konzervisati dodavanjem antioksidansa kao što je askorbinska kiselina.
[0075] Disperzibilni praškovi i granule predmetnog pronalaska pogodni za pripremu vodene suspenzije dodavanjem vode obezbeđuju aktivni sastojak u mešavini sa sredstvom za raspršivanje ili vlaženje, suspendujućim sredstvom i jednim ili više konzervanasa. Pogodna sredstva za dispergovanje ili vlaženje i sredstva za suspendovanje su predstavljeni primerima pomoću onih koji su stavljenih na uvid javnosti u tekstu iznad. Dodatni ekscipijensi, na primer zaslađivači, arome i boje, takođe mogu biti prisutni.
[0076] Farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu takođe biti u obliku emulzija ulje-u-vodi. Uljana faza može biti biljno ulje, kao što je maslinovog ulje ili ulje kikirikija, mineralno ulje, kao što je tečni parafin, ili mešavina ovih. Pogodni emulgatori obuhvataju prirodne gume, kao što su akacija guma i tragakant guma, prirodni fosfatidi, kao što su lecitin soje, estri ili parcijalni estri dobijeni iz masnih kiselina i anhidrida heksitola, kao što je sorbitan monooleat, i proizvodi kondenzacije ovih parcijalnih estara sa etilen oksidom, kao što je polioksietilen sorbitan monooleat. Emulzija može takođe sadržati zaslađivače i arome. Sirupi i eliksiri mogu biti formulisani sa zaslađivačima, kao što su glicerol, sorbitol ili saharoza. Takve formulacije mogu takođe sadržati demulcent, konzervans, aromu ili boju.
[0077] Farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti u obliku sterilnog preparata za injektiranje, kao što je sterilna injekciona vodena ili uljana suspenzija. Ova suspenzija se može formulisati u skladu sa poznatom oblašću upotrebom odgovarajućih sredstava za dispergovanje ili vlaženje i suspendujućih sredstava koja su ovde pomenuta. Sterilni preparat za injektiranje može takođe biti sterilni injekcioni rastvor ili suspenzija u netoksičnom parenteralno prihvatljivom razblaživaču ili rastvaraču, kao što je rastvor u 1,3-butan-diolu ili pripremljen kao liofilizovani prah. Među prihvatljivim nosačima i rastvaračima koji se mogu koristiti su voda, Ringerov rastvor i izotonični rastvor natrijum hlorida. Dodatno, sterilna fiksna ulja se konvencionalno mogu koristiti kao rastvarač ili suspendujući medijum. Za ovu svrhu mogu se koristiti bilo koje blago fiksno ulje, uključujući sintetičke mono- ili digliceride. Dodatno, masne kiseline, kao što je oleinska kiselina, takođe mogu biti korišćene za pripremu injektibilnih preparata.
[0078] Količina aktivnog sastojka koji se može kombinovati sa sirovinom nosača za proizvodnju pojedinačnog doznog oblika varira u zavisnosti od tretiranog domaćina i određenog načina administracije. Na primer, formulacija za vremensko oslobađanje namenjena za oralnu administraciju ljudima može sadržati približno 1 do 1000 mg aktivne sirovine koji je sjedinjen sa odgovarajućom i pogodnom količinom sirovine nosača koji može da varira od oko 5 do oko 95% ukupne kompozicije (masa:masa). Farmaceutska kompozicija može biti pripremljena da obezbedi lako merljive količine za administraciju. Na primer, vodeni rastvor namenjen za intravensku infuziju može sadržati od oko 3 do 500 µg aktivnog sastojka po mililitru rastvora, kako bi se mogla sprovesti infuzija odgovarajuće zapremine brzinom od oko 30 mL/h.
[0079] Formulacije pogodne za administraciju u oko uključuju kapi za oči u kojima se aktivni sastojak rastvara ili suspenduje u pogodnom nosaču, posebno vodenom rastvaraču za aktivni sastojak. Aktivni sastojak je poželjno prisutan u takvim formulacijama u koncentraciji od 0.5 do 20%, povoljno 0.5 do 10%, posebno oko 1.5% m/m.
[0080] Formulacije pogodne za topikalnu administraciju u usta uključuju pastile koje sadrže aktivni sastojak u aromatizovanoj bazi, obično saharozi i akaciji ili tragakanti; pastile koje sadrže aktivni sastojak u inertnoj bazi kao što su želatin i glicerin, ili saharoza i akacija; i vodice za ispiranje usta koje sadrže aktivni sastojak u odgovarajućem tečnom nosaču.
Formulacije za rektalnu administraciju mogu biti predstavljene kao supozitorija sa pogodnom bazom koja sadrži, na primer, kakao buter ili salicilat.
[0081] Formulacije pogodne za intraplućnu ili nazalnu administraciju imaju veličinu čestica na primer u rasponu od 0.1 do 500 µm (uključujući veličinu čestica u opsegu između 0.1 do 500 µm u povećanjima kao što su 0.5 µm, 1 µm, 30 µm, 35 µm itd.), koji se administrira brzom inhalacijom kroz nosni prolaz ili inhalacijom kroz usta kako bi stigao do alveolarnih kesa. Pogodne formulacije uključuju vodene ili uljane rastvore aktivnog sastojka. Formulacije koje su pogodne za administraciju aerosola ili suvog praha mogu se pripremiti prema konvencionalnim metodama i mogu se isporučivati sa drugim terapijskim agensima kao što su jedinjenja prethodno korišćena u lečenju ili profilaksi infekcija kao što je ovde opisano.
[0082] Formulacije koje su pogodne za vaginalnu administraciju mogu se predstaviti kao fomrulacije u vidu pesarija, tampona, krema, gelova, pasti, pena ili sprejeva koji sadrže dodatno aktivnom sastojku takve nosače, koji su u oblasti poznati kao odgovarajući.
[0083] Formulacije koje su pogodne za parenteralnu administraciju uključuju vodene i nevodene sterilne injekcione rastvore koji mogu sadržati anti-oksidante, pufere, bakteriostatike i supstance koje se rastvaraju koji čine formulaciju izotoničnom sa krvlju nameravanog primaoca; i vodene i ne-vodene sterilne suspenzije koje mogu uključivati sredstva za suspendovanje i sredstva za zgušnjavanje. Formulacije mogu biti prisutne u kontejnerima sa jediničnom dozom ili više doza, na primer zatvorenim ampulama i bočicama, i mogu se čuvati u zamrzavanjem osušenom stanju (liofiliziranom) koje zahteva samo dodavanje sterilnog tečnog nosača, na primer vode za injektiranje, neposredno pre upotrebe. Rastvori za injektiranje koji nisu spremni i suspenzije za ubrizgavanje mogu biti pripremljeni od sterilnih prahova, granula i tableta vrsti opisanih u prethodnom tekstu. Poželjne jedinične dozne formulacije mogu biti one koje sadrže dnevnu dozu ili jediničnu dnevnu poddozu, kao što je ovde navedeno u tekstu iznad, ili njihovu odgovarajuću frakciju aktivnog sastojka.
[0084] Trebalo bi da je razumljivo da dodatno sastojcima koji su posebno pomenuti iznad u tekstu formulacije kombinovanih jedinjenja i/ili drugih aktivnih sastojaka mogu uključivati i druge agense konvencionalne u oblasti imajući u vidu vrstu formulacije o kojoj je reč, na primer one pogodne za oralnu administraciju mogu uključivati arome.
[0085] Kombinovana jedinjenja i drugi aktivni sastojci takođe mogu biti formulisani da obezbede kontrolisano oslobađanje aktivnog sastojka da bi omogućili manje često doziranje ili poboljšali farmakokinetički ili profil toksičnosti aktivnog sastojka. Prema tome, pronalazak takođe obezbeđuje kompozicije koje sadrže dve ili više kombinovanih jedinjenja formulisanih za produženo ili kontrolisano oslobađanje.
Doze
[0086] Efikasna doza aktivnog sastojka zavisi najmanje od prirode stanja koje se tretira, toksičnosti, bilo da se jedinjenje koristi profilaktički (niže doze) ili protiv aktivne bolesti ili stanja, metode isporuke i farmaceutske formulacije, i može se odrediti od strane kliničara koristeći studije eskalacije konvencionalne doze.
[0087] Kao primer, kompozicije predmetnog pronalaska (npr. tablete) mogu biti formulisane da obezbede efikasne doze. Na primer, uzimajući u obzir Jedinjenje 1, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, kompozicija može da sadrži od 1.0 mg do 100 mg, od 5 mg do 40 mg, od 30 mg do 50 mg, ili 20 mg ili 40 mg i može biti adaptirana da se administrira jedan ili više puta dnevno ljudskom biću kod koga postoji takva potreba u kombinaciji sa bilo kojim ili više od Jedinjenja 2, Jedinjenja 3, Jedinjenja 6, Jedinjenja 4, Jedinjenja 5, Jedinjenja 7, Jedinjenja 9, Jedinjenja 10, Jedinjenja 11, Jedinjenja 12, Jedinjenja 13, Jedinjenja 14, Jedinjenja 15 i Jedinjenja 16. Uzimajući u obzir Jedinjenje 2 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, kompozicija može da sadrži od 25 mg do 800 mg, od 50 mg do 400 mg, ili od 60 mg do 300 mg ili od 70 mg do 200 mg ili može biti 150 mg i može biti adaptirana da se administrira jedan ili više puta dnevno ljudskom biću kog koga postoji takva potreba u kombinaciji sa bilo kojim ili više od Jedinjenja 1, Jedinjenja 3, Jedinjenja 6, Jedinjenja 4, Jedinjenja 5, Jedinjenja 7, Jedinjenja 9, Jedinjenja 10, Jedinjenja 11, Jedinjenja 12, Jedinjenja 13, Jedinjenja 14, Jedinjenja 15 i Jedinjenja 16. Uzimajući u obzir Jedinjenje 3, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, kompozicija može da sadrži od 10 mg do 1000 mg, ili 50 do 400 mg, ili 100mg do 400mg ili 200 mg do 400 mg i može biti adaptirana da se administrira jedan ili više puta dnevno ljudskom biću kog koga postoji takva potreba u kombinaciji sa bilo kojim ili više od Jedinjenja 1, Jedinjenja 2, Jedinjenja 6, Jedinjenja 4, Jedinjenja 5, Jedinjenja 7, Jedinjenja 9, Jedinjenja 10, Jedinjenja 11, Jedinjenja 12, Jedinjenja 13, Jedinjenja 14, Jedinjenja 15 i Jedinjenja 16. Uzimajući u obzir Jedinjenje 4, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, kompozicija može da sadrži od 25mg do 400mg ili od 25mg do 200mg može biti adaptirana da se administrira jedan ili više puta dnevno ljudskom biću kog koga postoji takva potreba u kombinaciji sa bilo kojim ili više od Jedinjenja 1, Jedinjenja 2, Jedinjenja 3, Jedinjenja 6, Jedinjenja 5 i Jedinjenja 7. Uzimajući u obzir Jedinjenje 5, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, kompozicija može da sadrži od 50mg do 1000mg ili 100mg do 750mg može biti adaptirana da se administrira jedan ili više puta dnevno ljudskom biću kog koga postoji takva potreba u kombinaciji sa bilo kojim ili više od Jedinjenja 1, Jedinjenja 2, Jedinjenja 3, Jedinjenja 6, Jedinjenja 4, Jedinjenja 7, Jedinjenja 9, Jedinjenja 10, Jedinjenja 11, Jedinjenja 12, Jedinjenja 13, Jedinjenja 14, Jedinjenja 15 i Jedinjenja 16. Uzimajući u obzir Jedinjenje 6, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, kompozicija može da sadrži od 1mg do 500mg ili od 3 mg do 300 mg ili od 3 mg do 200mg ili od 3 mg do 100 mg ili od 10 mg do 90 mg ili od 30 mg do 90 mg može biti adaptirana da se administrira jedan ili više puta dnevno ljudskom biću kog koga postoji takva potreba u kombinaciji sa bilo kojim ili više od Jedinjenja 1, Jedinjenja 2, Jedinjenja 3, Jedinjenja 4, Jedinjenja 5, Jedinjenja 7, Jedinjenja 9, Jedinjenja 10, Jedinjenja 11, Jedinjenja 12, Jedinjenja 13, Jedinjenja 14, Jedinjenja 15 i Jedinjenja 16. Uzimajući u obzir Jedinjenje 7, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, kompozicija može da sadrži od 100 mikrograma do 3000mg, od 25mg do 2000mg, ili od 50mg do 1000mg i može biti adaptirana da se administrira jedan ili više puta dnevno (npr. četiri puta dnevno) ljudskom biću kog koga postoji takva potreba u kombinaciji sa bilo kojim ili više od Jedinjenja 1, Jedinjenja 2, Jedinjenja 3, Jedinjenja 4, Jedinjenja 5, Jedinjenja 6, Jedinjenja 9, Jedinjenja 10, Jedinjenja 11, Jedinjenja 12, Jedinjenja 13, Jedinjenja 14, Jedinjenja 15 i Jedinjenja 16. Uzimajući u obzir Jedinjenja 9 i 10, ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, kompozicija može da sadrži 10 mg do 1000mg po danu (prema US 2010/0298257). Uzimajući u obzir Jedinjenje 11, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, kompozicija može da sadrži 1mg do 1000mg po danu (prema US 2010/0081628). Doze za Jedinjenja 1-7 koje se istovremeno administriraju možda treba da se prilagode kako bi se uzele u obzir potencijalne međusobne interakcije lekova. Na primer, iako ne izgleda da Jedinjenje 1 deluje na sisteme metabolisanja lekova, Jedinjenje 2 izgleda da ima efekat povećanja prisustva Jedinjenja 1 približno 2-3X. Stoga, redukcija doze (npr. 2x-3x) Jedinjenja 1 bi bila očekivana kada je Jedinjenje 1 kombinovano sa Jedinjenjem 2. U kombinaciji sa Jedinjenjem 16, Jedinjenje 2 deluje da ima efekat povećanja prisustva Jedinjenja 6 približno 5x, tako bi redukcija doze (npr. 3x-5x) Jedinjenja 16 bila očekivana kada Jedinjenje 16 je dozirano sa Jedinjenjem 2. Stoga, doza od 10 mg Jedinjenja 6 kada je istovremeno administrirano sa Jedinjenjem 2 približno odgovara dozi od 30 mg.
[0088] Dva ili više kombinovanih jedinjenja mogu biti administrirana zajedno sa Ribavirinom u količinama od oko 800mg, 1000mg ili 1200mg po danu u jednoj ili višestrukim dozama (npr. oko 400mg, 500mg ili 600mg dva puta dnevno).
Primena kombinacija predmetnog pronalaska
[0089] U praksi ovog aspekta predmetnog pronalaska, kombinovana jedinjenja se mogu koristiti u dozama koje su navedene iznad u tekstu.
[0090] Drugi aspekt predmetnog pronalaska uključuje Jedinjenje 10 za primenu u postupku lečenja HCV infekcija, gde se Jedinjenje 10 koristi u kombinaciji sa Jedinjenjem 6.
[0091] Drugi aspekt predmetnog pronalaska uključuje Jedinjenje 10 za primenu u postupku lečenja HCV infekcija, pri čemu se Jedinjenje 10 koristi u kombinaciji sa Jedinjenjem 5 i Jedinjenjem 6.
Putevi i načini administracije
[0092] Dva ili više od Jedinjenja 1, Jedinjenja 2, Jedinjenja 3, Jedinjenja 4, Jedinjenja 5, Jedinjenja 6, Jedinjenja 7, Jedinjenja 9, Jedinjenja 10, Jedinjenja 11, Jedinjenja 12, Jedinjenja 13, Jedinjenja 14, Jedinjenja 15 i Jedinjenja 16 i bilo koje druge komponente kombinovane terapije mogu biti adaptirane da se administriraju bilo kojim putem koji je odgovarajući za stanje koje se leči. Pogodni putevi uključuju oralni, rektalni, nazalni, topikalni (uključujući bukalni i sublingvalni), vaginalni i parenteralni (uključujući subkutani, intramuskularni, intravenski, intradermalni, intratekalni i epiduralni) i slično. Biće cenjeno da poželjni put može da varira sa, na primer, stanjem primaoca.
[0093] Sinergistički efekat se može postići kada su aktivni sastojci: (1) koformulisani (npr. u jediničnom doznom obliku) i administrirani ili isporučeni istovremeno u kombinovanoj formulaciji; (2) isporučeni naizmenično ili paralelno kao posebne formulacije; ili (3) nekim drugim režimom. Kada se isporučuju u naizmeničnoj terapiji, sinergistički efekat se može postići kada se jedinjenja administriraju ili dostavljaju sekvencijalno, npr., u odvojenim tabletama, pilulama ili kapsulama, ili različitim injekcijama u odvojenim špricevima. Uopšteno, tokom naizmenične terapije, efikasna doza svakog aktivnog sastojka se administrira sekvencijalno, tj. serijski, dok se u kombinovanoj terapiji efikasne doze dva ili više aktivnih sastojaka zajedno administriraju.
[0094] Istovremeno administriranje Kombinovanog jedinjenja sa jednim ili više kombinovanih jedinjenja generalno se odnosi na istovremenu ili sekvencijalnu primenu jednog ili više kombinovanih jedinjenja, tako da su terapijski efikasne količine dva ili više kombinovanih jedinjenja prisutne u telu pacijenta. U nekim slučajevima, kombinovana jedinjenja (npr. dva, tri ili četiri kombinovanih Jedinjenja) će biti formulisana tako da se dozvoli administraciju u isto vreme. U nekim slučajevima, koformulisana kombinovana jedinjenja mogu se istovremeno administrirati sa jednim ili više dodatnih kombinovanih jedinjenja.
[0095] Istovremena administracija takođe uključuje administraciju jediničnih doza kombinovanih jedinjenja pre ili posle administracije jediničnih doza jednog ili više drugih aktivnih sastojaka, na primer, administriranje dva ili više kombinovanih jedinjenja u okviru sekundi, minuta ili sati administracije jednog ili više drugih aktivnih sastojaka. Na primer, jedinična doza kombinovanog jedinjenja se može administrirati prvo, praćeno u okviru sekundi ili minuta administracijom jedinične doze drugog kombinovanog Jedinjenja, praćeno u okviru sekundi ili minuta administracijom jedinične doze jednog ili više drugih aktivnih sastojaka. Alternativno, jedinična doza jednog ili više drugih aktivnih sastojaka može prvo da se administrira, praćeno u okviru sekundi ili minuta administriranjem jedinične doze kombinovanog Jedinjenja, praćeno u okviru sekundi ili minuta administriranjem jedinične doze drugog kombinovanog Jedinjenja. U nekim slučajevima može biti poželjno da se prvo administrira jedinična doza kombinovanog Jedinjenja, što je praćeno, nakon vremenskog perioda (npr. 1-12 sati), administriranjem jedinične doze drugog kombinovanog Jedinjenja, što je praćeno, nakon vremenskog perioda (npr., 1-12 sati), administriranjem jedinične doze jednog ili više drugih aktivnih sastojaka. U drugim slučajevima, može biti poželjno da se administrira jedinična doza jednog ili više drugih aktivnih sastojaka prvo, što je praćeno nakon vremenskog perioda (npr. 1-12 sati), administracijom jedinične doze kombinovanog Jedinjenja, što je praćeno, nakon vremenskog perioda (npr., 1-12 sati), administriranjem jedinične doze drugog kombinovanog Jedinjenja. Gde su tri ili više kombinovanih jedinjenja administrirana sa jednim ili više dodatnih aktivnih sastojaka, kombinovana jedinjenja mogu biti administrirana jedno za drugim u sekundama, minutima, ili satima (npr. 1-12 sati) međusobno i jedan ili više dodatnih aktivnih sastojaka mogu biti administrirani pre, tokom ili posle administracije kombinovanih jedinjenja. Gde su kombinovana jedinjenja koformulisana ona mogu biti administrirana istovremeno, ili pre ili posle administarcije jednog ili više dodatnih aktivnih sastojaka.
[0096] Osim ako nije drugačije naznačeno, kombinovana terapija može biti administrirana kao odvojeni dozni oblici sa svakim aktivnim sastojkom, administrirani zajedno ili odvojeno, sekvencijalno ili istovremeno, i blizu vremenski ili udaljeni vremenski jedno u odnosu na drugo.
[0097] Tok lečenja može biti produžen, na primer, od oko 12 nedelja do oko 48 nedelja, ili duže, na primer, od oko 12 nedelja do oko 24 nedelja.
[0098] Predmetni pronalazak uključuje kombinaciju terapijski efikasnih komponenata za ublažavanje barem jednog simptoma HCV infekcije kod čoveka, uključujući, ali bez ograničenja, mučninu, povraćanje, gubitak apetita, zamor, žuticu, povraćanje, dijareju, dehidrataciju, abdominalni bol, ciroza jetre. Dodatno, kod nekih HCV zaraženih osoba upotreba kombinovane terapije je efikasna za smanjenje virusnog opterećenja HCV virusnih čestica prisutnih u telu zaražene osobe statistički značajnom količinom. Virusno opterećenje se može meriti, na primer, merenjem nivoa HCV RNK u plazmi korišćenjem, na primer, COBAS TaqMan HCV testa (Roche Molecular Systems). Tipično, osoba zaražena HCV-om koja je tretirana kombinovanim jedinjenjima u skladu sa predmetnim pronalaskom doživljava poboljšanje jednog ili svih simptoma povezanih sa HCV infekcijom.
Kombinacije dva ili više kombinovanih jedinjenja sa ribavirinom ali ne interferonom
[0099] Kao što je razmotreno u tekstu iznad, neka trenutna lečenja HCV uključuju administraciju interferona, ali ovo lečenje obično proizvodi neželjene nuspojave. Stoga bi bilo poželjno pronaći efikasna lečenja HCV-a koja ne zahtevaju administraciju interferona.
[0100] Jedan aspekt predmetnog pronalaska obezbeđuje kompozicije, primene i slično za lečenje HCV-a koje sadrže administriranje dva ili više Kombinovanih jedinjenja ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli i ribavirina, bez administriranja jednog ili više interferona. Ovaj aspekt predmetnog pronalaska može biti naročito koristan jer omogućava efikasno lečenje HCV bez propratnih efekata povezanih sa administracijom jednog ili više interferona.
[0101] U jednom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, kombinovana količina ribavirina i Kombinovanih jedinjenja ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli, opciono sa jednim ili više dodatnih agenasa, je efikasna za lečenje HCV infekcije.
[0102] Još jedan aspekt predmetnog pronalaska uključuje primenu u metodi za ublažavanje jednog ili više simptoma HCV infekcije kod čoveka koja obuhvata: administriranje dva ili više Kombinovanih jedinjenja ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli i ribavirina, bez istovremene administracije jednog ili više interferona. U tom smislu, predmetni pronalazak ne poništava potencijal za doziranje jednog ili više interferona. U većem stepenu, predmetni pronalazak može se koristiti zajedno sa drugom terapijom koja, u stvari, uključuje jedan ili više interferona. Jedan aspekt predmetnog pronalaska uključuje efikasan tretman HCV-a sa ribavirinom bez potrebe za jednim ili više interferona.
[0103] Drugi aspekt predmetnog pronalaska uključuje primenu u metodi za smanjenje virusnog opterećenja kod čoveka dijagnostikovanog sa HCV-om koja obuhvata: administriranje dva ili više Kombinovanih Jedinjenja ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli i ribavirina, ali ne jednog ili više interferona.
[0104] Drugi aspekt predmetnog pronalaska uključuje primenu u metodi za lečenje HCV-a kod čoveka koja se satoji uglavnom od administracije ribavirina zajedno sa dva ili više Kombinovanih Jedinjenja ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli.
[0105] Još jedan aspekt predmetnog pronalaska uključuje primenu u metodi za smanjenje pojave HCV kvazivrsta sa otpornošću na koadministrirane oralne antivirusne agense, koja obuhvata: administriranje dva ili više Kombinovanih Jedinjenja ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli i ribavirina, bez istovremene administracije jednog ili više interferona.
[0106] Slično, još jedan aspekt predmetnog pronalaska uključuje kompoziciju, npr. farmaceutsku kompoziciju za poboljšanje jednog ili više simptoma HCV infekcije kod čoveka koja sadrži dva ili više Kombinovanih Jedinjenja ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli i ribavirina bez jednog ili više interferona. Još jedan aspekt predmetnog pronalaska uključuje kompoziciju za smanjenje virusnog opterećenja kod čoveka kod koga je dijagnostifikovan HCV koja sadrži dva ili više Kombinovanih Jedinjenja ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli i ribavirin, ali bez jednog ili više interferona. Još jedan aspekt predmetnog pronalaska uključuje kompoziciju za lečenje HCV kod čoveka koja se sastoji u suštini od ribavirina zajedno sa dva ili više Kombinovanih Jedinjenja ili njegovih farmaceutski prihvatljivih soli. Još jedan aspekt predmetnog pronalaska uključuje kompoziciju za HCV terapiju baziranu na ribavirinu koja sadrži dva ili više Kombinovanih Jedinjenja ili njihovih farmaceutskih soli, pod uslovom da navedena kompozicija ne uključuje jedan ili više interferona. Još jedan aspekt predmetnog pronalaska uključuje kompoziciju za smanjenje pojave HCV kvazivrsta sa otpornošću na koadministrirane oralne antivirusne agense koja sadrži dva ili više Kombinovanih Jedinjenja ili njihovih farmaceutskih soli i ribavirina, bez jednog ili više interferona.
[0107] Slično, još jedan aspekt predmetnog pronalaska uključuje primenu: dva ili više Kombinovanih Jedinjenja ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli i ribavirina, bez jednog ili više interferona, u proizvodnji leka za ublažavanje jednog ili više simptoma HCV infekcije kod čoveka; kao i primenu: dva ili više Kombinovanih Jedinjenja ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli i ribavirina, ali ne jednog ili više interferona, u proizvodnji leka za smanjivanje virusnog opterećenja kod čoveka kod koga je dijagnostifikovan HCV; kao i primenu ribavirina zajedno sa dva ili više Kombinovanih Jedinjenja ili njegovih farmaceutski prihvatljivih soli u proizvodnji leka za lečenje HCV kod čoveka, gde navedena primena ne uključuje primenu jednog ili više interferona; kao i primenu dva ili više Kombinovanih Jedinjenja ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli, u proizvodnji leka za terapiju HCV-a na bazi ribavirina, gde navedena primena izbegava primenu jednog ili više interferona; kao i primenu dva ili više Kombinovanih Jedinjenja ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli i ribavirina, bez jednog ili više interferona u proizvodnji leka za smanjenje pojave HCV kvazivrsta sa otpornošću na koadministrirane oralne antivirusne agense.
[0108] Još jedan aspekt predmetnog pronalaska uključuje kombinaciju koja sadrži ribavirin i dva ili više Kombinovanih Jedinjenja ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli, čija kombinacija je suštinski bez jednog ili više interferona. U jednom tehničkom rešenju, kombinacija se može pojaviti kao odvojeni dozni oblici sa svakim aktivnim sastojkom, administrirani zajedno ili odvojeno, uzastopno ili istovremeno, i vremenski blizu ili udaljeni jedno u odnosu na drugo.
[0109] Još jedan aspekt predmetnog pronalaska uključuje komplet koji sadrži: ribavirin, dva ili više Kombinovanih jedinjenja i uputstvo u vezi sa režimom lečenja za lečenje, smanjenje virusnog opterećenja, ili odlaganje početka ili progresije HCV-a, gde režim lečenja uključuje administraciju dva ili više Kombinovanih jedinjenja i ribavirina bez administracije jednog ili više interferona. U jednom tehničkom rešenju, takav komplet može uključivati i pakovanje, kao što je blister pakovanje. Alternativno, takav komplet može da obezbedi individualni recept i doziranje svake komponente kao zasebno upakovane farmaceutske supstance, ali kada se kombinuje sa uputstvom u vezi sa režimom lečenja za lečenje, smanjenje virusnog opterećenja, ili odlaganje početka ili progresije HCV-a, namera je da ostane u okviru obima predmetnog pronalaska.
[0110] Još jedan aspekt predmetnog pronalaska uključuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži: ribavirin; dva ili više Kombinovanih Jedinjenja ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača. U jednom tehničkom rešenju, farmaceutska kompozicija može biti jedinični dozni oblik.
[0111] Osim ako nije drugačije naznačeno, kombinovana terapija sa Ribavirinom može biti administrirana kao odvojeni dozni oblici sa svakim aktivnim sastojkom koji se administrira (uključujući Kombinovana jedinjenja), može se administrirati zajedno (npr. u obliku jedinične doze, kao što je tableta) ili odvojeno, uzastopno ili istovremeno, i blizu ili udaljeni vremenski jedan u odnosu na drugi. Ako se zasebno administriraju, svako jedinjenje može biti istovremeno administrirano sa drugim(a), ili bilo pre ili posle takve administracije drugog(ih). Aktivni sastojci se mogu svakodnevno administrirati. U jednom tehničkom rešenju, dnevna doza aktivnih sastojaka se administrira u odvojenim poddozama, kao što su jedan, dva, tri ili četiri puta na dan. Povoljno, dnevna doza Kombinovanih jedinjenja ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli i ribavirina može biti administrirana jednom dnevno.
[0112] Iako predmetni pronalazak uključuje kompozicije, primene i slično za lečenje HCV-a koje obuhvata administriranje dva ili više Kombinovanaih jedinjenja ili njihove farmaceutski prihvatljive soli; i ribavirin, ali ne jedan ili više interferona, predmetni pronalazak ne isključuje mogućnost za doziranje jednog ili više interferona kod ljudi. Radije, predmetni pronalazak može se koristiti zajedno sa drugom terapijom za još jednu indikaciju koja, u stvari, uključuje jedan ili više interferona.
Kombinacije dva ili više kombinovanih jedinjenja sa ribavirinom i interferonom
[0113] Još jedan aspekt predmetnog pronalaska obezbeđuje kompozicije, primene i slično koje obuhvataju administriranje dva ili više Kombinovanih Jedinjenja ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli i ribavirina, i jednog ili više interferona za lečenje HCV-a. Administracija više interferona može biti u vremenskom odnosu sa administracijom Kombinovanih jedinjenja i ribavirina.
[0114] Još jedan aspekt predmetnog pronalaska uključuje primenu u metodi za ublažavanje jednog ili više simptoma HCV infekcije kod čoveka koja obuhvata administriranje dva ili više Kombinovanih Jedinjenja ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli, ribavirina i jednog ili više interferona. Još jedan aspekt predmetnog pronalaska uključuje primenu u metodi za smanjenje virusnog opterećenja kod čoveka kod koga je dijagnostifikovan HCV koja obuhvata: administriranje dva ili više Kombinovanih Jedinjenja ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli uz ribavirin i jedan ili više interferona.
[0115] Još jedan aspekt predmetnog pronalaska uključuje primenu u metodi za HCV terapiju na bazi ribavirina koja obuhvata administriranje dva ili više Kombinovanih Jedinjenja ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli uz ribavirin i jedan ili više interferona.
[0116] Još jedan aspekt predmetnog pronalaska uključuje primenu u metodi za smanjenje pojave HCV kvazivrsta sa otpornošću na koadministrirane oralne antivirusne agense koja obuhvata: administriranje dva ili više Kombinovanih Jedinjenja ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli uz ribavirin i jedan ili više interferona.
[0117] Još jedan aspekt predmetnog pronalaska uključuje primenu dva ili više Kombinovanih Jedinjenja ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli ribavirina, i jednog ili više interferona u proizvodnji leka za ublažavanje jednog ili više simptoma HCV infekcije kod čoveka. Još jedan aspekt predmetnog pronalaska uključuje upotrebu dva ili više Kombinovanih Jedinjenja ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli zajedno sa ribavirinom i jednim ili više interferona, u proizvodnji leka za smanjivanje virusnog opterećenja kod čoveka kod koga je dijagnostifikovan HCV. Još jedan aspekt predmetnog pronalaska uključuje primenu ribavirina zajedno sa dva ili više Kombinovanih Jedinjenja ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli u proizvodnji leka za lečenje HCV kod čoveka, pri čemu navedena primena uključuje primenu jednog ili više interferona. Još jedan aspekt predmetnog pronalaska uključuje primenu dva ili više Kombinovanih Jedinjenja ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli, u proizvodnji leka za HCV terapiju baziranu na ribavirinu, gde pomenuta primena uključuje administraciju jednog ili više interferona. Još jedan aspekt predmetnog pronalaska uključuje primenu dva ili više Kombinovanih Jedinjenja ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli, ribavirina, i jednog ili više interferona u proizvodnji leka za smanjenje pojave HCV kvazivrsta sa otpornošću na koadministrirane oralne antivirusne agense.
[0118] Još jedan aspekt predmetnog pronalaska uključuje kombinaciju koja sadrži ribavirin i dva ili više Kombinovanih Jedinjenja ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli, čija kombinacija uključuje jedan ili više interferona.
[0119] Još jedan aspekt predmetnog pronalaska uključuje komplet koji sadrži: ribavirin, dva ili više Kombinovanih jedinjenja i jedan ili više interferona; i uputstva u vezi sa režimom lečenja za lečenje, smanjenje virusnog opterećenja, ili odlaganje početka ili progresije HCV-a gde režim lečenja uključuje administraciju dva ili više Kombinovanih jedinjenja i ribavirina i administraciju jednog ili više interferona. U jednom tehničkom rešenju takav komplet može uključivati i pakovanje, kao što je blister pakovanje. Alternativno, takav komplet može da obezbedi individualni recept i doziranje svake komponente kao zasebno upakovane farmaceutske supstance, ali kada se kombinuje sa uputstvom u vezi sa režimom lečenja za lečenje, smanjivanje virusnog opterećenja, ili odlaganje početka ili progresije HCV, trebalo bi da bude u okviru obima predmetnog pronalaska.
[0120] Još jedan aspekt predmetnog pronalaska uključuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži: dva ili više Kombinovanih Jedinjenja ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, ribavirin i jedan ili više interferona; i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača. U jednom tehničkom rešenju, farmaceutska kompozicija može biti jedinični dozni oblik.
[0121] Osim ako nije drugačije naznačeno, kombinovana terapija sa Ribavirinom i jednim ili više interferona može biti administrirana kao odvojeni dozni oblici sa jednim ili više interferona koji se administriraju pacijentu i svaki od preostalih aktivnih sastojaka koji se koriste u kombinovanoj terapiji (uključujući Kombinovana jedinjenja) se zajedno administriraju (npr. u obliku jedinične doze, kao što je tableta) ili odvojeno, uzastopno ili istovremeno, i blizu ili udaljeni vremenski jedan u odnosu na drugi. Ako se zasebno administrira, svaki aktivni sastojak može biti administriran sa drugim(a) istovremeno, ili bilo pre ili nakon takve administracije drugog(ih). Aktivni sastojci se mogu svakodnevno administrirati. U jednom tehničkom rešenju, dnevna doza se administrira u odvojenim poddozama, kao što su jedan, dva, tri ili četiri puta na dan.
Kombinovana terapija, uključujući dodatne terapeutike
[0122] U još jednom tehničkom rešenju, ne-ograničavajući primeri pogodnih kombinacija obuhvataju kombinacije dva ili više Kombinovanih jedinjenja sa jednim ili više dodatnih aktivnih sastojaka uključujući inhibitore HCV NS3 proteaze, inhibitorr alfa-glukozidaze 1, hepatoprotektante, nukleozidne ili nukleotidne inhibitore HCV NS5B polimeraze, nenukleozidne inhibitore HCV NS5B polimeraze, HCV NS5A inhibitore, TLR-7 agoniste, inhibitore ciklofilina, inhibitore HCV IRES-a, inhibitore ulaska HCV-a, inhibitore sazrevanja HCV-a, inhibitore sjedinjenja HCV-a, inhibitore HCV infektivnosti i farmakokinetičke pojačivače, kao i druge lekove za lečenje HCV-a. Konkretnije, dva ili više Kombinovanih Jedinjenja predmetnog pronalaska mogu biti kombinovana sa jednim ili više jedinjenja odabranih iz grupe koja se sastoji od:
(i) inhibitora HCV NS3 proteaze, npr., boceprevir (SCH-503034, SCH-7), telaprevir (VX-950), TMC-435 (IUPAC N-[(2R,3aR,10Z,11aS,12aR,14aR)-2-[2-(4-Izopropiltiazol-2-il)-7-metoksi-8-metilhinolin-4-iloksi]-5-metil-4,14-diokso-1,2,3,3a,4,5,6,7,8,9,11a,12,12a,13,14,14aheksadekahidrociklopenta[c]ciklopropa[g][1,6]diazaciklotetradecin-12ailkarbonil]ciklopropansulfonamid], ABT-450, ACH-1625, ACH-2684, BI-201335, BI-1230, MK-5172, MK-7009, SCH-900518, VBY-376, VX-500, GS-9256, GS-9451, BMS-605339, PHX-1766, AS-101, YH-5258, YH-5530, YH-5531, i ITMN-191 (R-7227);
(ii) inhibitora alfa-glukozidaze 1, npr., celgosivir (MX-3253), UT-231B, Miglitol; (iii) hepatoprotektanta, npr., emericasan (IDN-6556), ME-3738, silibilin, i MitoQ; (iv) nukleozidnih ili nukleotidnih inhibitora HCV NS5B polimeraze, npr., ., R1626, R7128 (R4048), IDX184, IDX-102, PSI-661, PSI-938, PSI-7851, PSI-7977, BCX-4678, valopicitabin (NM-283), MK-0608 i TMC649128;
(v) ne-nukleozidnih inhibitora HCV NS5B polimeraze, npr., filibuvir (PF-868554), ABT-333, ABT-072, BI-207127, VCH-759, VCH-916, JTK-652, MK-3281, VBY-708, VCH-222, A848837, ANA-598, GL60667, GL59728, A-63890, A-48773, A-48547, BC-2329, VCH-796 (nesbuvir), GSK625433, BILN-1941, i XTL-2125;
(vi) HCV NS5A inhibitora, npr., ACH-2928, AZD-2836 (A-831), AZD-7295 (A-689), BMS-766, BMS-790052, BMS-824393, i PPI-461;
(vii) TLR-7 agonista, npr., imikvimod, 852A, ANA-773, ANA-975, AZD-8848 (DSP-3025), PF-04878691, i SM-360320 i Jedinjenje 8;
(viii) inhibitora ciklofilina, npr., DEBIO-025, SCY-635, i NIM811;
(ix) inhibitora HCV IRES-a, npr., MCI-067;
(x) farmakokinetičkih pojačivača, npr. roksitromicin, BAS-100, SPI-452, PF-4194477, TMC-41629;
(xi) inhibitora ulaska HCV-a
(xii) inhibitora sjedinjenja HCV-a;
(xiii) inhibitora sazrevanja HCV-a;
(xiv) inhibitora HCV infektivnosti; i
(xv) drugih lekova za lečenje HCV-a, npr., timozin alfa 1 (Zadaxin), nitazoksanid (Alinea, NTZ), BIVN-401 (virostat), PYN-17 (altirex), KPE02003002, actilon (CPG-10101), KRN-7000, civacir, GI-5005, XTL-6865, BIT225, PTX-111, ITX2865, TT-033i, ANA 971, NOV-205, tarvacin, EHC-18, VGX-410C, EMZ-702, AVI 4065, BMS-650032, BMS-791325, Bavituksimab, MDX-1106 (ONO-4538), Oglufanid, FK-788, i VX-497 (merimepodib)..
Sintetički primeri
[0123] Sintetički protokoli za pripremanje Jedinjenja 1, 2, 3, 6, 7, i 8 su poznati u literaturi. Dodatno, sintetički protokol za pripremanje svakog od Kombinovanih Jedinjenja je obezbeđen u Primerima navedenim ispod u tekstu.
[0124] Jedinjenje 1 može biti pripremljeno korišćenjem sintetičke metode i intermedijera kao onih koji su opisani u US 7,754,720. Jedinjenje 1 takođe može biti pripremljeno kao što je opisano u sledećem Primeru.
Primer 1: 5-({6-[2,4-bis(trifluorometil)fenil]piridazin-3-il}metil)-2-(2-fluorofenil)-5H-imidazo[4,5-c]piridin 1.
[0125]
[0126] Jedinjenje 103 je rastvoreno u dimetoksietanu (DME). U ovaj rastvor je dodata 2,4-bis(triflurometil)fenilboronska kiselina 105 i 2N vod. Na2CO3rastvor. U dobijenu bifaznu smešu je dodat Pd(PPh3)4i reakcija je zatim zagrejana na 80°C tokom 72 sata. Reakcija je ohlađena do sobne temperature i filtrirana kroz Celite i Celite je ispran sa EtOAc. Filtrat je koncentrovan u vakuumu. Ostatak je prečišćen na 6g SiO2korišćenjem MeOH/CH2Cl2da se eluira jedinjenje. Jedinjenje tako dobijeno je kontaminirano sa PPh3(O). Proizvod je ponovo prečišćen na 1 mm Chromatotron ploči sa 0 do 5% MeOH/CH2Cl2u 1% koraka. Čiste frakcije su kombinovane i koncentrovane u vakuumu, zatim osušene na visokom vakuumu tokom 12 sati. 11.8 mg slobodne baze Jedinjenja 1 je dobijeno bez PPh3kontaminacije.<1>H NMR (300MHz,CD3OD) δ 6.20 (s, 2), 7.32 (m, 3), 7.52 (m, 1), 7.78 (d, 1), 7.89 (d, 1), 7.95 (s, 2), 8.15 (m, 3), 8.35 (d, 1), 9.12 (s, 1); LC/MS M+H = 518.
[0127] Intermedijerno jedinjenje 104 je pripremljeno kao što sledi.
a. Pripremanje jedinjenja 102.
[0128]
[0129] Rastvoru komercijalno dostupnog početnog materijala 101 u CHCl3-u, trihloroizocijanurna kiselina (TCCA) je dodata na 60°C. Zatim je rastvor mešan tokom 1.5 h, ohlađen, i filtriran sa HiFlo-Celite. Filtrat je koncentrovan i osušen sa vakuumom. Prinos je bio 5.037 g Jedinjenja 102.
b. Pripremanje jedinjenja 104.
[0130]
[0131] Rastvoru Jedinjenja 103 u DMF-u (dimetilformamid), dodat je NaOH. Jedinjenje 102 je rastvoreno u DMF-u (20 mL) i dodato u rastvor polako. Reakcija je mešana tokom 3 h, razblažena je sa vodom i ektrahovana sa EtOAc. Organski sloj je osušen sa Na2SO4. Rastvarač je uklonjen i proizvod je ponovo kristalisao sa dihlormetanom. Prinos je bio 5.7 g Jedinjenja 103.
[0132] Jedinjenje 2 može biti pripremljeno korišćenjem sintetičkih metoda i intermedijera kao što su oni koji su opisani u USSN 12/202319 (US 20100051763 A1). Jedinjenje 2 može takođe biti pripremljeno kako je opisano u sledećem Primeru.
Primer 2: Pripremanje jedinjenja 2.
[0133]
[0134] Fosfinat estar 206 (23.7 g, 24.05 mmol) je rastvoren u CH3CN-u (240 mL) i ohlađen do 0°C. Dodat je jodotrimetilsilan (17.4 mL, 122.3 mmol) u kapima brzim tempom nakon čega, posle 10 min, 2,6-lutidin (17.0 mL, 146.4 mmol). Reakciona smeša je polako zagrejana do sobne temperature i mešana tokom 1 h zatim ohlađena ponovo do 0°C i dodati su 2,6-lutidin (11.1 mL, 95.6 mmol) i potom MeOH (24 mL). Rastvor je koncentrovan u vakuumu i sirov ostatak je prečišćen pomoću HPLC da se dobije 12.68 g Jedinjenja 2 u 55% prinosu.<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.35 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 8.28 (s, 1H), 7.85 (s, 1H), 7.64 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.35-7.22 (m, 1H), 7.02-6.89 (m, 2H), 5.85 (bs, 1H), 4.82-4.71 (m, 2H), 4.33 (bs, 1H), 4.28-3.99 (m, 3H), 4.16 (s, 3H), 3.57-3.28 (m, 2H), 2.90-2.78m, 1H), 2.63-2.50 (m, 1H), 2.08-1.91 (m, 1H), 1.91-170 (m, 2H), 1.70-1.13 (m, 22H), 1.37 (d, J = 6.9 Hz, 6H); 31P NMR (121.4 MHz, CD3OD) δ 42.4; LCMS (M+1): 957.35. g.
[0135] Intermedijerno jedinjenje 206 je pripremljeno kao što sledi.
a. Pripremanje jedinjenja 203.
[0137] Jedinjenje 201 (17.42 g, 28.30 mmol) je rastvoreno u THF-u (136 mL) i ohlađeno do 0°C. U rastvor je dodat N-metilmorfolin (4.7 mL, 42.7 mmol). Posle 10 min na 0°C, ibutilhloroformat (4.05 mL, 30.96 mmol) je dodat u kapima. Posle dodatnih 1 h, (etil estar 1-amino-2-vinil-ciklopropil)-(2,6-difluoro-benzil)-fosfinske kiseline 202 (8.94 g, 29.70 mmol) je polako dodat kao rastvor u THF-u (20 mL). Suspenzija je zagrejana do sobne temperature i nakon 2 h je podeljena između H2O (400 mL) i etilacetata (200 mL). Vodeni sloj je ektrahovan sa etilacetatom (200 mL x 2) i kombinovani organski slojevi su isprani sa HCI (1N, 225 mL) i H2O (200 mL). Rezultati ispiranja kiselinom i vodom su kombinovani i ponovo ektrahovani sa etilacetatom (175 mL x 2, 100 mL x 2). Kombinovani organski slojevi su isprani sa slanim rastvorom (400 mL), osušeni preko Na2SO4, i koncentrovani u vakuumu obezbeđujući 25.06 g diena 203 u 98.5% sirovog prinosa. LCMS (M 1): 898.06.
b. Pripremanje jedinjenja 204.
[0138]
[0139] Jedinjenje 203 (12.91 g, 14.36 mmol) je rastvoreno u CH2Cl2-u (1440 mL) i rastvor je degaziran tokom 30 minuta. Rastvor je zagrejan do 40°C i Grubss-ov G1 katalizator (2.95 g, 3.59 mmol) je dodat. Reakcija je refluksovana tokom 17 h posle čega su dodati trishidroksimetilfosfin (22.3 g, 18.0 mmol), TEA (50 mL, 35.9 mmol), i H2O (400 mL) i reakciona smeša je zagrejana do refluksa tokom dodatnih 16 sati. Reakciona smeša je ohlađena do sobne temperature i dva sloja su izdvojena. Organski sloj je ispran sa H2O (400 mL) i slanim rastvorom (300 mL), osušen preko MgSO4, i koncentrovan. Sirov ostatak je prečišćen silika gel hromatografijom da se dobije 8.30 g makrocikličnog olefina 204 u 66% prinosu. LCMS (M 1): 870.09.
c. Pripremanje jedinjenja 205.
[0140]
[0141] Makrociklični olefin 204 (7.34 g, 8.42 mmol) je rastvoren u etilacetatu (105 mL) i dodat je rodijum na alumini (5% mas, 2.945 g, 0.40 mas %). Sistem je ispražnjen i ispran sa H2-om (1 atm, 3x). U sistem, posle 3 h, je dodato još rodijuma na alumini (5% mas, 842 mg, 0.10 mas %) i ispražnjen je i ispran sa H2(1 atm, 3x). Posle dodatnih 1 h suspenzija je filtrirana i koncentrovana u vakuumu obezbeđujući 6.49 g redukovanog makrociklusa 205 u 88% sirovog prinosa. LCMS (M 1): 872.04.
d. Pripremanje jedinjenja 206.
[0142]
[0143] Brosilat makrociklus 205 (6.49 g, 7.67 mmol) je rastvoren u N-metilpirolidinonu (25.0 mL) i dodati su 8-hloro-2-(2-izopropilamino-tiazol-4-il)-7-metoksi-hinolin-4-ol 207 (2.564 g, 7.33 mmol) nakon čega Cs2CO3(4.40 g, 13.50 mmol). Smeša je zagrejana do 65°C tokom 6 h zatim razblažena sa etilacetatom (200 mL) i isprana sa LiCI-om (5%, 250 mL). Vodeni sloj je ektrahovan sa etilacetatom (100 mL x 2) i kombinovani organski slojevi su isprani slanim rastvorom (150 mL), osušeni preko Na2SO4/MgSO4, i koncentrovani u vakuumu. Sirov ostatak je prečišćeno silika gel hromatografijom (etilacetat-metanol) dajući 4.39 g aminotiazola 206 u 58% prinosu. LCMS (M 1): 985.28.
[0144] Intermedijerno jedinjenje 201 može biti pripremljeno kao što sledi.
e. Pripremanje jedinjenja 209.
[0145] Jedinjenje 208 (7.00 g, 28.55 mmol) i DABCO (5.13 g,45.94 mmol) su rastvoreni u toluenu (30 mL). Toluenski (11 mL) rastvor brosilhlorida (10.22 g, 40.01 mmol) je dodat. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Reakcija je razblažena sa EtOAc-om (210 mL) i dodat je 0.5N HCI (200 mL). Dva sloja su izdvojena i vodeni sloj je ektrahovan sa EtOAc (2 x 200 mL). Kombinovani organski slojevi su isprani sa slanim rastvorom (200 mL), osušeni sa Na2SO4, filtrirani, i koncentrovani. Sirov proizvod je prečišćen kombi-flešom (combi-flash) da se dobije 12.23 g Jedinjenja 209 u 92% prinous.
f. Pripremanje jedinjenja 210 i 212.
[0146] Jedinjenje 209 (12.2 g, 26.3 mmol) je tretirano sa 4 N HCl/1,4-dioksanom (60 mL) i mešano tokom 1 sata. Reakciona smeša je koncentrovana i osušena pod vakuumom tokom 20 minuta. Sirova amin HCI so Jedinjenja 210 je rastvorena u DMF-u (150 mL) i kiselina 211 (14.2 g, 52.6 mmol) je dodata. HATU (20.0 g, 52.6 mmol) i NMM (13.5 g, 131.5 mmol) su dodati. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Reakcija je razblažena sa EtOAc-om (300 mL), isprana sa 1 N HCI-om(200 mL), zasićenim NaHCO3-om, slanim rastvorom, osušena sa Na2SO4-om, i koncentrovana. Sirov proizvod je prečišćen kombiflešom da se dobije 15.1 g Jedinjenja 212 u 93% prinosu.
g. Pripremanje jedinjenja 213.
[0147] Rastvoru 212 (12.8 g, 20.7 mmol) u CH2Cl2-u (50 mL) je dodata 4 N HCI u 1,4-dioksanu (50 mL, 200 mmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata, koncentrovana, osušena pod vakuumom tokom 20 minuta, i zatim rastvorena u CH3CN-u (50 mL). Zasićeni NaHCO3u H20 (50 mL) je dodat i mešan tokom 5 minuta. Sveže napravljen ciklopentilhloroformat u THF-u (50mL) je dodat. Reakcija je završena u okviru 1 h. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom i ostatak je razblažen sa EtOAc-om. Smeša je dovedena do pH = 2 sa 1 N HCl-a i dva sloja su izdvojena. Organski slojevi su isprani slanim rastvorom, osušeni sa Na2SO4, filtrirani, i koncentrovani da se dobije sirovo jedinjenje 213 (3.18 g).
h. Pripremanje jedinjenja 201.
[0148] Sirov estar 213 (3.18 g, 5.07 mmol) je rastvoren u THF-u (25 mL), H2O (25 mL), i zatim MeOH (6 mL) i LiOH (660 mg, 25.4 mmol) su dodati. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1h i razblažena sa EtOAc-om. Reakciona smeša je zakiseljena do pH 2 sa 1 N HCl-a i dva sloja su izdvojena. Vodeni sloj je ektrahovan sa EtOAc-om (2 x). Kombinovani organski slojevi su isprani slanim rastvorom, osušeni sa Na2SO4koncentrovani i osušen pod vakuumom da se dobije 3.09 g kiseline 201.
[0149] Intermedijer 8-hloro-2-(2-izopropilamino-tiazol-4-il)-7-metoksi-hinolin-4-ol 207 može biti pripremljen kao što sledi.
i. Pripremanje 8-hloro-4-hidroksi-7-metoksihinolin-2-karboksilne kiseline 215.
[0150] Rastvoru metil 8-hloro-4-hidroksi-7-metoksihinolin-2-karboksilata 214 (36.5g, 0.145 mol) u smeši MeOH: THF u odnosu 1:1 (160 mL ukupno) je dodat rastvor LiOH-a (30.5 g, 0.725 mol) u H20 (80 mL). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom jednog sata kada je LCMS analiza pokazala kompletnu konverziju u karboksilnu kiselinu. Reakcija je izvedena uklanjanjem isparljivih supstanci i podešavanjem pH rastvora do 6 korišćenjem vodenog 6N HCl-a. Dobijeni gumasti ostatak je filtriran i osušen na liofilizatoru tokom 2 dana da se obezbedi 34.4 g (99.6 %) Jedinjenja 215 kao bele čvrste supstancae EI MS (mlz) 253.9 [M+H].
j. Pripremanje 2-(2-diazo-1-okso)-8-hloro-7-metoksihinolin-4-il izobutil karbonata 216.
[0151] Rastvoru 8-hloro-4-hidroksi-7-metoksihinolin-2-karboksilne kiseline 215 (10.2 g, 0.04 mol) u THF-u (400 mL) je dodat trietil amin (12.3 mL, 0.088 mol) i i-Butilhloroformat (11.6 mL, 0.088 mol) na 0°C pod atmosferom argona. Smeša je mešana na 0°C tokom 1 sata kada je LCMS analiza pokazala završetak reakcije da bi se obezbedio željeni mešoviti anhidrid. EI MS (m/z) 454.0 [M+H]. U reakcionu smešu anhidrida je dodat 1M rastvor diazometana (121 mL, 0.121 mol) u dietil etru putem plastičnog levka na 0°C. Ovoj smeši je dozvoljeno da se meša dok je zagrevana do sobne temperature tokom dodatna 2 sata. Analiza smeše pomoću LCMS je pokazala završetak reakcije. Pregrada je uklonjena i reakcija je mešana tokom dodatnih 20 minuta pre uklanjanja rastvarača. Ostatak je osušen dalje pod visokim vakuumom da se obezbedi jedinjenje 216, koje je prenešeno u sledeći korak. EI MS (m/z) 377.9 [M+H].
k. Pripremanje 8-hloro-2-(2-(izopropilamino)tiazol-4-il)-7-metoksihinoiin-4-ola 207.
[0152] U ohlađen rastvor 2-(2-diazo-I-okso)-8-hloro-7-metoksihinolin-4-il izobutil karbonata 216 (15.2 g, 0.040 mol) na 0°C u THF-u (268 mL) je dodat 48% HBr (23 mL, 0.201 mol) polako tokom 15 minuta. Rastvor je mešan na 0°C tokom dodatnih 40 minuta kada je LCMS analiza pokazala kompletnu reakciju. Reakcija je izvedena dodavanjem vodenog 1N NaOH (180 mL) na 0° C da se podesi pH vodenog sloja do 9. Slojevi su odvojeni i vodeni sloj je ispran sa EtOAc-om (2 x 200 mL). Kombinovani organski ekstrakti su isprani sa slanim rastvorom i osušeni preko MgS04. Rastvarač je uklonjen u vakuumu da se obezbedi 17.7 g žute čvrste supstance. EI MS (m/z) 4<31>.9 [M+H].
[0153] Rastvor bromoketona dobijenog iz prethodne reakcije je suspendovan u i-propanolu (270 mL) i izopropilizourei (9.4 g, 0.080 mol). Reakciona smeša je zagrevana na 72 °C tokom 32 sata. LCMS analiza rekacije pokazala je kompletnu konverziju u željeni proizvod. Reakcija je ostavljena da se ohladi do sobne temperature da se dozvoli proizvodu da precipitira iz rastvora. Reakcija je dalje ohlađena do 0°C tokom 12 sati pre filtracije. Filtrat je ispran sa etrom i osušen na liofilizatoru da se obezbedi 8.03 g Jedinjenja 207 kao narandžasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 8.21 (d, J= 9 Hz, 1H), 7.74 (s, 1H), 7.44 (d, J= 10Hz), 1H), 7.07 (s, 1H), 4.05 (s, 3H), 3.92 (pentet, J=6 Hz, 1H), 1.25 (d, J= 7 Hz, 6H): EI MS (m/z) 350.0 [M+H].
[0154] Jedinjenje 3 može biti pripremljeno primenom sintetičkih metoda i intermedijera kao što su oni koji su opisani u USSN 12/215,605 (US 20090257978 A1). Jedinjenje 3 može takođe biti pripremljeno kako je opisano u sledećem Primeru.
Primer 3: Pripremanje jedinjenja 3
[0155]
[0156] Jedinjenje 315 (12 g, 13 mmol) je rastvoreno u THF-u (200 ml), LiOH (11g, 260 mmol) u H2O (200 ml) je dodat, nakon čega i MeOH (200 ml). Smeša je nastavljena da se meša na sobnoj temperaturi tokom 20 sati. Po završetku reakcije, 4 N HCI u H2O je dodat da se podesi pH do 7 na 0 °C. Smeša je ektrahovana sa EtOAc-om (2 x 400 ml). Kombinovani organski sloj je ispran slanim rastvorom, osušen (Na2SO4) i koncentrovan u vakuumu da se dobije jedinjenje 3 kao žuta čvrsta supstanca (11 g, 93%). LC/MS = 911.52(M<+>+1).<1>H NMR (300MHz, CD3OD) δ 7.95 (d, 1H), 7.90 (s, 1H), 7.48 (s, 1H), 7.31 (d, 1H), 5.42 (s, 1H), 4.37 (dd, 1H), 4.20 (m, 2H), 3.83-3.56 (m, 7H), 3.50 (m, 2H), 3.39 (m, 2H), 2.45 (m, 1H), 2.27(m, 1H), 1.62 (m, 2H), 1.50 (m, 1H), 1.33 (m, 2H), 1.18 (m, 1H), 1.05 (m, 8H), 0.90 (m, 3H), 0.76 (m, 11H), 0.14-0.04 (m, 2H)
[0157] Intermedijerno jedinjenje 315 je pripremljeno kao što sledi.
a. Pripremanje jedinjenja 301.
[0158] U suv, argonom pročišćen sud sa tri grla i okruglim dnom (1000 mL) su dodati anhidrovan dihlormetan (100 mL) i Et2Zn (28 mL, 273 mmol) na 0 °C. (OPREZ: Izvor argona ne može biti iz igle. Koristiti samo odgovarajući stakleni adapter. Drugi uređaj za mehuriće može takođe biti prikačen za sud kako bi se sprečilo prekomerno podizanje pritiska.) Ciklopenten-3-ol (10.0 mL, 119 mmol) je zatim dodat u kapima (velika količina gasa etana je proizvedena) u sud i reakciona smeša je ostavljena da se meša dok razvijanje gasa nije prestalo. Dijodmetan (22 mL, 242 mmol) je zatim dodat u kapima tokom perioda od 30 minuta. Reakcija je ostavljena da se zagreje do sobne temperature i nastavljena da se meša preko noći pod pozitivnim protokom argona, u toj tački je TLC analiza pokazala kompletan nestanak početnog alkohola. Reakcija je zatim razblažena sa CH2Cl2-om i kvenčovana sa 2M HCI-om (beli precipitat bi trebalo da je kompletno rastvoren). Bifazna smeša je sipana u levak za separaciju i organski sloj je sakupljen. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom dok nije ostalo 100 mL materijala koji sadrži koji sadrži jedinjenje 301.
b. Pripremanje jedinjenja 302.
[0159] Anhidrovan dihlormetan (525 mL) je dodat u sud nakon čega je u kapima dodavan trietilamin (34 mL, 245 mmol). Reakcija je nastavljena da se meša na sobnoj temperaturi pod pozitivnim protokom azota u toj tački, disukcinimidilkarbonat (40.7 g, 159 mmol) je dodat u sud u porcijama. Reakcija je ostavljena da se meša dok TLC analiza nije pokazala kompletan nestanak početnog materijala (2-3 dana). Po završetku, reakciona smeša je kvenčovana sa 1M HCl (200 mL x 2) i isprana sa H20 (200 mL x 2). Željeni materijal je ektrahovan korišćenjem CH2Cl2-om i kombinovani organski slojevi su osušeni korišćenjem anhidrovanog MgSO4i prošli su kroz silika čep. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom i sirov materijal je prečišćen korišćenjem fleš hromatografije (Rf= 0.33, 1:1 Hex/EtOAc) da se obezbedi jedinjenje 302 (22 g, 75%):<1>H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 5. 24 (t, 1H), 3.82 (s, 4H), 2.24 (m, 2H), 2.03 (d, 2H), 1.38 (m, 2H), 0.48 (m, 1H), 0.40 (m, 1H).
c. Pripremanje jedinjenja 304.
[0160] N-t-Boc-cis-4-Hidroksi-L-Prolin metil estar 303 (100.0 g, 407.7 mmol) i DABCO (1.5ekv, 68.6g, 611.6 mmol) su rastvoreni u anhidrovanom toluenu (200 mL) u sudu sa okruglim dnom sa 3 grla od 2 L sa mehaničkom mešalicom i levkom za dodavanje. Posle hlađenja rastvora do 0 °C pod N2, rastvor 4-Bromo-benzensulfonil hlorida (1.3ekv, 135.6g, 530.0 mmol) u 300 mL toluena je dodat preko levka za dodavanje tokom 60 minuta. Reakciona smeša je mešana i zagrevana do sobne temperature preko noći (16 sati). Smeša je polako sipana u 2L 1M Na2CO3-a (vod.), i proizvod je ektrahovan sa EtOAc-om (2L). Nakon što je organska faza isprana sa 0.5 N HCI (2L), H2O (1L), i slanim rastvorom (1L), on je osušen (MgSO4), koncentrovan da bi se dobilo 195.45 g žutog uljanog brosilat proizvoda.
[0161] Rastvoru gornjeg brosilata (407.7 mmol) u dihlormetanu (300 mL) je polako dodat 4.0 M HCI u dioksanu (500 mL, 5ekv) i dobijeni rastvor je ostavljen da se meša na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Posle je etar (500mL) dodat u reakcionu smešu, smeša je mešana tokom 15 minuta i beli talog je sakupljen filtracijom. Čvrsta supstanca je isprana sa etrom i heksanom i zatim osušena pod vakuumom preko noći da se dobije 153.0 g HCI amin soli Jedinjenja 304, 381.8 mmol, u 94% prinosu za dva koraka.
d. Pripremanje jedinjenja 305.
[0162] Rastvoru Boc-terc-butil-glicina (97.0g, 420.0 mmol) u DMF-u (200mL) i metilen hloridu (200mL) su dodati HATU (217.76g, 572.7 mmol) i Hunigova baza (126 mL, 1145.4 mmol) na sobnoj temperaturi. Nakon što je smeša mešana tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi, rastvor prethodne HCI soli (153.0 g, 381.8 mmol) i Hunigove baze (126 mL, 1145.4 mmol) u DMF-u (200mL) i dihlormetanu (200mL) je dodat u gornju kiselu smešu u jednoj porciji. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 3h, praćenjem sa LCMS. Reakciona smeša je koncentrovana da se ukloni dihlormetan pod sniženim pritiskom i bela čvrsta supstanca koja je formirana je isfiltirirana. Preostali DMF rastvor je razblažen sa etil acetatom (1L), ispran sukcesivno sa 3% LiCI (vod) (3x650mL), zasićenim NH4Cl (2x500mL), 0.5N HCI (vod) (2x600mL), slanim rastvorom (500mL), zasićenim NaHCO3(3x500mL), i slanim rastvorom (500mL). Dobijena organska frakcija je osušena (MgSO4) i koncentrovana da se dobije jedinjenje 305 (111g).
e. Pripremanje jedinjenja 306.
[0163] Rastvoru metil estra 305 (120 g, 207.8 mmol) u THF-u (300 mL), MeOH-u (75 mL) dodat je rastvor LiOH (26.18 g, 623.4 mmol) u H2O (150 mL). Rastvor je ostavljen da se meša na sobnoj temperaturi 4 sata. Smeša je ohlađena u ledenom kupatilu dok je zakišeljavana sa 3N HCI do pH oko 5.5, mešana tokom 10 minuta, i dobijene bele čvrste supstance su sakupljene filtracijom. Čvrste supsatnce su isprane sa još vode, etra i heksana. Čvrste supstance su osušene pod vakuumom na 40°C preko noći da se dobije 95.78g (82%) kiseline 306.
f. Pripremanje jedinjenja 307.
[0164] Rastvoru karboksilne kiseline 306 (81.4 g, 144.27 mmol) u DMF-u (200mL) i dihlormetanu (200mL) je dodat HATU (82.3g, 216.4 mmol) i Hunigova baza (47.5 mL, 432.8 mmol) na sobnoj temperaturi. Nakon što je smeša mešana tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi, rastvor amina (158.7 mmol) i Hunigove baze (47.5 mL, 1145.4 mmol) u DMF-u (200mL) i dihlormetanu (200mL) je dodat u gornju kiselu smešu u jednoj porciji. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 3 sata i praćena je pomoću LCMS. Nakon što je smeša koncentrovana pod sniženim pritiskom da se ukloni dihlormetan, bele čvrste supstance koje su formirane su isfiltrirane. Preostali DMF rastvor je razblažen sa etil acetatom (600mL) i sekcesivno ispran sa 3% LiCI (vod) (2x550mL), zasićenim NH4Cl (500mL), 1N HCl (vod) (500mL), zasićenim NaHCO3(500mL), i slanim rastvorom (300mL). Dobijena organska frakcija je osušena (Na2SO4) i koncentrovana da se dobije jedinjenje 307 (111g).
g. Pripremanje jedinjenja 308.
[0165] Jedinjenje 307 je rastvoreno u 4N HCI u dioksanu (300 mL) na sobnoj temperaturi i mešano je tokom 2 sata. Zatim je koncentrovano pod vakuumom, i ko-evaporisalo je sa dihlormetanom (2 x 200mL) do suva. Ostatak je rastvoren u EtOAc-u (600mL) i zasićenom vod. NaHCO3-u (1L). Mešano je energično. Posle 10 minuta, biciklo[3.1.0]heks-3-il estar 2,5-diokso-pirolidin-1-il estar ugljene kiseline 302 (41.4 g, 173.1 mmol) je dodat u jednoj porciji. Nakon što je dobijena smeša mešana tokom još 30 minuta, organski sloj je sakupljen i ispran sa slanim rastvorom (500mL), osušen (Na2SO4), i koncentrovan. Sirov proizvod je prečišćen pomoću fleš hromatografije na silika gelu sa etil acetatom/heksanom da se dobije 94.44 g (92%) Jedinjenja 308.
h. Pripremanje jedinjenja 310.
[0166] 1-(2-Amino-3-hloro-4-hidroksi-fenil)-etanon 309 (70.7 g, 354 mmol) je mešan u 48% vod. HBr (500 mL) na 110 °C tokom 72 sata. Nakon što je smeša ohlađena do 0 °C mešanjem, čvrste supstance su filtrirane i isprane sa vodom. Dobijene čvrste supstance su triturisane sa zasićenim NaHCO3rastvorom (-350 mL), filtrirane, isprane sa vodom, i osušene pod vakuumom da se dobije ∼ 40 g (61%) sirovog 310 kao tamno braon čvrsta supstanca. LC/MS = 186 (M<+>+1).
i. Pripremanje jedinjenja 311.
[0167] 1-(2-Amino-3-hloro-4-hidroksi-fenil)-etanon 310 (40 g, 215 mmol) je rastvoren u DMF-u (360 ml). Cezijum karbonat (140 g, 430 mmol) je dodat, nakon čega i bromoacetaldehid dimetil acetal (54.5 g, 323 mmol). Smeša je zatim energično mešana na 65 °C tokom 24 sata. Po hlađenju do sobne temperature, EtOAc (1 L) i H2O (1 L) su dodati u smešu. Organski sloj je ektrahovan sa EtOAc-om (1 x 400 ml). Kombinovani organski sloj je ispran sa vodenim 3% LiCI rastvorom (2 x 1L), slanim rastvorom, osušeni (Na2SO4) i koncentrovani u vakuumu. Ostatak je prečišćen silika gel hromatografijom da se dobije jedinjenje 311 kao bela čvrsta supstanca (39 g, 67%).
j. Pripremanje jedinjenja 312.
[0168] U smešu 1-[2-Amino-3-hloro-4-(2,2-dimetoksi-etoksi)-fenil]-etanona 311 ( 13 g, 47.5 mmol) i hidrobromida izopropilaminotiazol-4-karboksilne kiseline (12.64 g, 47.5 mmol) u piridinu (150 ml) je polako dodat fosfor oksihlorid (9.47 g, 61.8 mmol) na -40 °C. Smeša je zatim mešana na 0 °C 4 sata. Po završetku reakcije, H2O (30 ml) je dodata u kapima u smešu. Smeša je zatim mešana na 0 °C tokom sledećih 15 minuta. Smeša je koncentrovana u vakuumu. Ostatak je razblažen sa EtOAc-om, ispran sa zas. NaHCO3vodenim rastvorom. Organski sloj je osušen (Na2SO4) i koncentrovan u vakuumu. Ostatak je rastvoren u CH2Cl2, heksani su dodati polako u rastvor, i žuta čvrsta supstanca je počela da se usitnjava. Još heksana je dodato dok nije preostalo puno proizvoda u matičnoj tečnosti da se obezbedi jedinjenje 312 (18 g, 85%).
k. Pripremanje jedinjenja 313.
[0169] [6-acetil-2-hloro-3-(2,2-dimetoksi-etoksi)-fenil]-amid 2-Izopropilamino-tiazol-4-karboksilne kiseline 312 (18 g, 40.7 mmol) je suspendovan u toluenu (400 ml). NaH (2.4 g, 61 mmol) je dodat u energično mešanu smešu dok je praćena evolucija H2. Smeša je postala bistar ratsvor tokom zagrevanja do refluksa. Reakcija je završena posle refluksovanja tokom 3 sata. Smeša je ohlađena do sobne temperature. Rastvor AcOH (69.2 mmol) u H2O (3 vol) je dodat u smešu. Posle energične agitacije tokom 1 sata na 0 °C, čvrste supstance su sakupljene filtracijom, isprane dalje sa H2O. Vlažan komad je osušen pod visokim vakuumom do kontantne mase da se obezbedi jedinjenje 313 (15 g, 86%).
l. Pripremanje jedinjenja 314.
[0170] U smešu brosilat intermedijera 303 (15 g, 35 mmol) i Jedinjenja 313 (27.5 g, 38.5 mmol) u NMP-u (200 ml) je dodat cezijum karbonat (25.1 g, 77 mmol). Smeša je mešana na 65 °C tokom 5 sati. Reakcija je ohlađena do sobne temperature i EtOAc (600 ml) i vodeni rastvor 3% LiCI (600 ml) su dodati u smešu. Organski sloj je ispran sa vodenim 3% LiCI (1 x 600 ml), slanim rastvorom, osušen (Na2SO4) i koncentrovan u vakuumu. Ostatak je prečišćen silika gel hromatografijom da se dobije željeni metil estar kao žuta čvrsta supstanca (23.6 g, 75%). LC/MS = 900.13(M<+>+1).
m. Pripremanje jedinjenja 315.
[0171] Metil estar 314 (23.6 g, 26 mmol) je rastvoren u glacijalnoj sirćetnoj kiselini (200 ml), 1.4 N HCI u H2O (75 ml) je dodat u rastvor. Smeša je mešana na 60 °C tokom 1 sata. Po završetku reakcije, smeša je koncentrovan da se uklone rastvarači, koevaporisala je sa toluenom (x 2) da se ukloni preostala sirćetna kiselina. Ostatak je zatim rastvoren u EtOAc-u (500 ml) i zas. NaHCO3vodenom rastvoru (dovoljan da se neutrališe smeša) dok je praćena CO2evolucija. Organski sloj je ispran slanim rastvorom, osušen (Na2SO4) i koncentrovan u vakuumu. Ostatak je dalje osušen pod visokim vakuumom tokom 1 h i korišćen kao takav za sledeći korak. Sirov je rastvoren u CH2Cl2-u (360 ml), morfolin (3.4 g, 39 mmol) i natrijum triacetoksiborohidrid (7.2 g, 34 mmol) su dodati u smešu na 0 °C. Zatim glacijalna sirćetna kiselina (0.47 g, 7.8 mmol) je dodata u kapima u smešu. Reakcija je završena za 10 minuta na 0 °C. Zas. NaHCO3vodeni rastvor je dodat da se kvenčuje reakcija. Nakon mešanja tokom još 20 minuta, organski sloj je ispran slanim rastvorom, osušen (Na2SO4) i koncentrovan u vakuumu. Ostatak je prečišćen silika gel hromatografijom da se dobije željeni aminski proizvod 315 kao žuta čvrsta supstanca (12 g, 50%). LC/MS = 924.63(M<+>+1).
[0172] Jedinjenje 4 može biti pripremljeno kako je opisano u sledećem Primeru.
Primer 4: Pripremanje jedinjenja 4.
[0173]
[0174] Diastereomerna smeša 414 je rastvorena u heptanu i izopropanolu (70%:30%, 230 mg u 4.5 mL izmešanih rastvarača) i podvrgnuta separaciji na hiralnoj koloni pod sledećim uslovima:
Kolona: Chiralcel OD-H, 2 x 25 cm
Sistem rastvarača: 70% heptan i 30% izopropanol
Brzina protoka: 6 mL/min.
Zapremina punjenja po izvođenju: 2.5 mL
[0175] Jedinjenje 4 imalo je retenciono vreme od 20 minuta.<1>H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.00 (s, 1H), 7.1-7.3 (m, 5H), 6.83 (d, 1H), 6.71 (d, 1H), 6.09 (brs, 2H), 5.95 (s, 1H), 5.04 (m, 2H), 4.67 (q, 1H), 4.35-4.52 (m, 2H), 4.00 (m, 2H), 2.74 (m, 1H), 1.40 (d, 3H), 1.2-1.3 (12H), 0.98 (s, 3H).<31>P NMR (121.4 MHz, CDCl3): δ 2.72 (s). Jedinjenje 4 je zatim ponovo kristalisalo iz MTBE da bi se dobili kristali pogodnog kvaliteta za studije x-zracima.
[0176] Jedinjenje 4a imalo je retenciono vreme 50 min.<1>H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.98 (s, 1H), 7.1-7.3 (m, 5H), 6.83 (d, 1H), 6.73 (d, 1H), 6.02 (brs, 2H), 5.95 (s, 1H), 5.08 (d, 1H), 5.00 (m, 1H), 4.68 (q, 1H), 4.38-4.56 (m, 2H), 3.98 (m, 2H), 2.74 (m, 1H), 1.40 (d, 3H), 1.2-1.3 (12H), 0.99 (s, 3H).<31>P NMR (121.4 MHz, CDCl3): δ 2.61 (s).
[0177] Intermedijerna diastereomerna smeša 414 je pripremljena kao što sledi.
a. Pripremanje jedinjenja 402.
[0178]
[0179] Rastvoru Jedinjenja 401 (22.0 g, 54.9 mmol, pripremljenom u skladu sa procedurama opisanim u J.O.C., 2004, 6257) u metanolu (300 mL) je u kapima dodat acetil hlorid (22 mL) na 0 °C korišćenjem levka za kapanje tokom perioda od 30 minuta i zatim je mešan na sobnoj temperaturi tokom 16 sati. Smeša je koncentrovana, ponovo rastvorena u etil acetatu (400 mL), isprana sa ledeno hladnim 2 N NaOH, i koncentrovana do suva, dajući sirov metil etar 402 kao ulje. MS = 437.2 (M Na<+>).
b. Pripremanje jedinjenja 403.
[0180]
[0181] Rastvoru Jedinjenja 402 u metanolu (300 mL) je dodan 0.5 M natrijum metoksid rastvor u metanolu (20 mL, 10 mmol), i mešan je tokom 16 sati na sobnoj temperaturi. Reakcija je kvenčovana sa 4.0 N HCI rastvorom u dioksanu (2.5 mL, 10 mmol). Smeša je zatim koncentrovana, dajući sirovo jedinjenje 403. MS = 201.0 (M Na<+>).
c. Pripremanje jedinjenja 404.
[0182]
[0183] Smeša Jedinjenja 403, Tritron X-405 (70% u vodi, 6.0 g), 50% KOH (u vodi, 85 g) u toluenu (500 mL) je zagrejana do refluksa priključenim Dean-Stark trap aparatom. Posle 1 sata sakupljanja 25 mL vode, benzil hlorid (33 g, 260 mmol) je dodat i nastavljeno je sa refluksom uz mešanje tokom 16 sati. Smeša je zatim ohlađena i podeljena između etil acetata (400 mL) i vode (300mL). Organski sloj je ispran sa vodom (300 mL), i koncentrovan. Ostatak je prečišćen silika gel hromatografijom na koloni (20% EtOAc / heksani), što je dalo metil etar 404 kao ulje (22.0 g, 89% u tri koraka).<1>H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.3 (m, 15H), 4.5 - 4.9 (m, 7H), 4.37 (m, 1H), 3.87 (d, 1H), 3.56 (m, 2H), 3.52 (s, 3H), 1.40 (s, 3H). d. Pripremanje jedinjenja 405.
[0185] Rastvoru 404 (22.0 g, 49.0 mmol) u sirćetnoj kiselini (110 mL) je dodata 3 M sumporna kiselina (pripremljena mešanjem 4.8 g koncentrovane sumporne kiseline sa 24 mL vode) i mešan je na 70 °C tokom 8 sati. Smeša je koncentrovana do zapremine od 20 mL, i podeljena je između etil acetata i ledeno hladnog 2N NaOH. Etil acetatni sloj je koncentrovan, i prečišćen silika gel kolonskom hromatografijom (-35% EtOAc / heksani), dajući jedinjenje 405 kao ulje (17.0 g, 80%). MS = 457.2 (M Na<+>).
e. Pripremanje jedinjenja 406.
[0186]
[0187] Rastvoru Jedinjenja 405 (45 g, 104 mmol) u DMSO-u (135 mL) je u kapima dodat anhidrid sirćetne kseline (90 mL, 815 mmol) na sobnoj temperaturi pod argonom. Smeša je mešana tokom 16 sati na sobnoj temperaturi, i zatim sipana u ledenu vodu (1 L) uz mešanje. Nakon što je led kompletno istopljen (30 minuta), etil acetat (500 mL) je dodat. Organski sloj je izdvojen. Ovaj proces ekstrakcije je ponovljen tri puta (3x500 mL). Organski ekstrakti su kombinovani i koncentrovani. Ostatak je prečišćen silika gel kolonskom hromatografijom (20% EtOAc / heksani), dajući jedinjenje 406 kao ulje (39 g, 88%).<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 7.3 (m, 15H), 4.4 - 4.8 (m, 7H), 4.08 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 3.75 (dd, J = 2,4, 11.4 Hz, 1H), 3.64 (dd, J = 5.4, 11.4 Hz, 1H), 1.51 (s, 3H).
f. Pripremanje jedinjenja 407.
[0189] U suv, argonom pročišćen sud sa okruglim dnom (100 mL) su dodati 7-bromopirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-ilamin (234 mg, 1.10 mmol) (pripremljen prema WO2007056170) i anhidrovan THF (1.5 mL). TMSCI (276 µL, 2.2 mmol) je zatim dodat i reakciona smeša je mešana tokom 2 sata. Sud je postavljen u kupatilo sa suvim ledom/acetonom (-78 °C) i BuLi (2.5 mL, 4.0 mmol, 1.6M u heksanima) je dodat u kapima. Posle 1 sata, rastvor Jedinjenja 406 (432.5 mg, 1.0 mmol) u THF-u je ohlađen do 0 °C i zatim dodat u reakcioni sud u kapima. Posle 1 sata mešanja na -78 °C, sud je zagrejan do 0 °C i zas. NH4Cl (5 mL) je dodat da se kvenčuje reakcija. Organski slojevi su ektrahovain korišćenjem EtOAc (3 x 10 mL) i kombinovani organski slojevi su osušeni korišćenjem MgSO4. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom i sirov materijal je prečišćen korišćenjem fleš hromatografije (heksani / EtOAc).560 mg (90 %) Jedinjenja 407 je izolovano kao smeša dva anomera. LC/MS = 567.2 (M H<+>).<1>H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.85 (m, 1H), 7.27 (m, 15H), 7.01 (m, 1H), 6.51 (m, 1H), 4.66 (m, 8H), 4.40 (m, 2H), 3.79 (m, 3H), 1.62 (s, 2'-CH3iz jednoga anomera), 1.18 (s, 2'-CH3iz drugog anomera).
g. Pripremanje jedinjenja 408.
[0190]
[0191] Rastvoru Jedinjenja 407 (1 g, 1.77 mmol) u CH2Cl2-u (20 mL) na 0° C je dodat TMSCN (1.4 mL, 10.5 mmol) i BF3-Et2O (1 mL, 8.1 mmol). Reakciona smeša je mešana na 0 °C tokom 0.5 sati, zatim na sobnoj temperaturi tokom dodatnih 0.5 sati. Reakcija je kvenčovana sa NaHCO3na 0 °C, i razblažena sa CH3CO2Et-om. Organska faza je izdvojena, isprana slanim rastvorom, osušena preko Na2SO4, filtrirana i koncentrovana. Ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu, eluirana sa CH3CO2Et-heksanima (1:1 to 2:1), da se dobije jedinjenje 408 (620 mg, 61%) kao izomerna smeša. MS = 576.1 (M H<+>).
h. Pripremanje jedinjenja 409.
[0192]
[0193] Rastvoru Jedinjenja 408 (150 mg, 0.26 mmol) u CH2Cl2-u (4 mL) na -78 °C je dodat BCl3(2 mL, 1M in CH2Cl2). Reakciona smeša je mešana na -78 °C tokom 1 sata. Reakcija je kvenčovana na -78 °C pomoću dodavanja u kapima TEA (2 mL) i MeOH (5 mL). Smeša je ostavljena da se zagreje do sobne temperature, evaporisana, i ko-evaporisana sa MeOH-om nekoliko puta. Ostatak je tretiran sa NaHCO3(1 g in 10 mL H2O), koncentrovan i prečišćen pomoću HPLC da se dobije željeni proizvod jedinjenje 409 (48 mg, 60%).<1>H NMR (300 MHz, D2O): δ 7.74 (s 1H), 6.76 (d, J = 5 Hz, 1H), 6.73 (d, J = 5 Hz, 1H), 4.1 (m, 1H), 3.9 (m, 1H), 3.8 (m, 2H), 0.84 (s, 3H). MS = 305.9 (M H<+>). Drugi alfa-anomer je takođe dobijen (9 mg, 11%):<1>H NMR (300 MHz, D2O): δ 7.70 (s 1H), 6.8 (d, J = 5 Hz, 1H), 6.7 (d, J = 5 Hz, 1H), 4.25 (d, J = 9 Hz, 1H), 4.07 (m, 1H), 3.85 (m, 1H), 3.7 (m, 1H), 1.6 (s, 3H). MS = 306.1 (M H<+>).
i. Pripremanje jedinjenja 412.
[0194]
[0195] Jedinjenje 410 (komercijalno dostupno, 4.99 g, 23.8 mmol) je rastvoreno u dihlormetanu (100 mL) i alanin izopropil estar hidrohlorid 411 (3.98 g, 23.8 mmol) je dodat. Dobijeni bistar rastvor je ohlađen -78 °C tokom 30 min. Trietilamin (6.63 mL, 47.5 mmol) je dodavan u kapima tokom 15 minuta. Smeša je zatim ostavljena da se ugreje do sobne temperature. Posle 16 sati, rastvarač je uklonjen strujom argona. Ostatak je ponovo rastvoren u MTBE (25 mL) i nerastvoren deo je uklonjen filtracijom pod argonom. Filtrat je kondenzovan strujom argona i sirov proizvod 412 je korišćen za sledeću reakciju bez daljeg prečišćavanja.<1>H NMR (300 MHz, CDCl3): 7.1-7.4 (m, 5H), 5.1 (m, 1H), 4.35 (m, 1H), 4.15 (m, 1H), 1.5 (d, 3H), 1.2 (m, 6H).<31>P NMR (121.4 MHz, CDCl3): δ 7.8 i 8.4 (2s).
j. Pripremanje jedinjenja 413.
[0196]
[0197] Rastvoru Jedinjenja 409 (1.03 g, 3.37 mmol) u trimetil fosfatu (2.0 mL) i THF-u (20 mL) je dodat N-metil imidazol (1.5 g, 18.3 mmol) na 0 °C. Rastvor Jedinjenja 412 (2.5 g, 8.18 mmol) je u kapima dodavan u THF (3 mL). Dobijena smeša je ostavljena da se zagreje do sobne temperature tokom 1.5 sata. Smeša je podeljena između etil acetata i vode. Etil acetatni sloj je koncentrovan i ostatak je prečišćen silika gel hromatografijom (etil acetat do 10% etanol / etil acetat), dajući 1.15 g (59%) Jedinjenja 413 kao 1:1 diastereomernu smešu na fosforu.<1>H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.02 (s, 1H), 7.1-7.4 (m, 5H), 6.8 (2d, 1H), 6.7 (2d, 1H), 6.08 (brs, 2H), 5.03 (m, 1H), 4.6 (m, 1H), 4.4 (m, 2H), 3.9-4.1 (m, 3H), 1.31 (d, 3H), 1.2 (m, 6H), 0.83 (s, 3H).<31>P NMR (121.4 MHz, CDCl3): δ 2.78 (s). MS = 575.1 (M H<+>). k. Pripremanje jedinjenja 414.
[0198]
[0199] Rastvoru Jedinjenja 413 (175 mg, 0.305 mmol) u acetonitrilu (2 mL) je dodat N,N-dimetilformamid dimetil acetal (41 µL, 0.34 mmol, 1.1 ekv.) i mešan je na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Reakcija je završena (pomoću LCMS). Smeša je zatim koncentrovana do suva. U ostatak su dodati DCC (250 mg, 1.21 mmol, 4 ekv.), acetonitril (5 mL) i izobuterna kiselina (55 mg, 58 µL, 2 ekv.). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 48 sati. Voda (0.2 mL) i trifluorosirćetna kiselina (0.1 mL) su dodati na 0 °C i mešana je na sobnoj temperaturi tokom 64 sata. Natrijum bikarbonat (500 mg) je dodat na 0 °C. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 0.5 sati i filtrirana. Filtrat je koncentrovan i ostatak je prečišćen silika gel kolonskom hromatografijom (5% metanol / dihlormetan), dajući 144 mg (73%) Jedinjenja 414 kao 1:1 diastereomernu smešu na fosforu.<1>H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.00 (s, 1H), 7.1-7.4 (m, 5H), 6.83 (d, 1H), 6.71 (2d, 1H), 5.97 (brs, 2H), 5.94 (d, 1H), 5.07 (2d, 1H), 5.01 (m, 1H), 4.68 (m, 1H), 4.4 (m, 2H), 4.0 (m, 2H), 2.74 (m, 1H), 1.4 (2d, 3H), 1.2-1.3 (12H), 0.98 i 0.99 (2s, 3H).<31>P NMR (121.4 MHz, CDCl3): δ 2.56 i 2.65 (2s). MS = 645.1 (M H<+>).
[0200] Jedinjenje 5 može biti pripremljeno kako je opisano u sledećem Primeru.
Primer 5: Pripremanje 5: 5-(3,3-dimetilbut-1-in-1-il)-3-[(cis-4-hidroksi-4-{[(3S)-tetrahidrofuran-3-iloksi]metil}cikloheksil){[(1R)-4-metilcikloheks-3-en-1-il]karbonil}amino]tiofen-2-karboksilna kiselina 5.
[0201]
[0202] Metil estar 5-(3,3-dimetil-but-1-inil)-3-[((1R)-4-metil-cikloheks-3-enkarbonil)-(1-oksa-spiro[2.5]okt-6-il)-amino]-tiofen-2-karboksilne kiseline 508 (132 mg, 0.28 mmol) i (S)-tetrahidro-furan-3-ol 509 (247 mg, 2.8 mmol) u 1-metil-pirolidin-2-onu (3 mL) su tretirani sa kalijum terc-butoksidom (251 mg, 2.24 mmol) , zatvoreni i zagrejani do 40 °C tokom 16 sati. Posle hlađenja smeša je tretirana sa 2 M HCI do pH 3, podeljena između etil acetata i vode i odvojena. Organski sloj je ispran sa 5% rastvorom litijum hlorida, vodom, slanim rastvorom, i osušen preko natrijum sulfata. Posle filtracije i koncentracije ostatak je prečišćen pomoću HPLC sa CH3CN (0.1% TFA)/H2O(0.1% TFA) da se dobije 107 mg (70% prinos) Jedinjenja 5 kao beli prah: MS (m/z): 544.0 [M+H]+; HPLC retenciono vreme 4.22 min (2-98% acetonitril: voda sa 0.05% trifluorosirćetnom kiselinom).
[0203] Intermedijerno jedinjenje 508 je pripremljeno kao što sledi.
a. Pripremanje jedinjenja 502.
[0204] (S)-3-hidroksi-4,4-dimetildihidrofuran-2(3H)-on (2.60 g, 20 mmol) i diizopropiletilamin (5.2 mL, 30 mmol) u dihlormetanu (25 mL) je ohlađen do -10 °C i tretiran u kapima sa akriloil hloridom (2.03 mL, 25 mmol) i mešan je tokom 2 h.1M HCI (20 mL) je dodat i organski sloj je ispran sa natrijum bikarbonat i vodom. Organski sloj je osušen preko natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan. Fleš hromatografija (10-40% EtOAc, heksani) je dala 2.09 g (57% prinos) željenog (S)-4,4-dimetil-2-oksotetrahidrofuran-3-il akrilata 501 kao čisto ulje.
[0205] (S)-4,4-dimetil-2-oksotetrahidrofuran-3-il akrilat 501 (2.05 g, 11.1 mmol) u dihlormetanu (17.5 mL) i heksanima (2.5 mL) je ohlađen do -10 °C i tretiran sa titanijum tetrahloridom (2.2 mL, 1 M u dihlormetanu, 2.2 mmol). Žuti rastvor je mešan tokom 15 minuta i tretiran sa izoprenom (1.67 mL, 16.7 mmol) u kapima preko 5 minuta. Posle mešanja tokom 2 sata, dodatna porcija izoprena (1.67 mL, 16.7 mmol) je dodata i reakciona smeša je mešana na -10 do 0 °C tokom 3.5 sata. Reakciona smeša je kvenčovana sa amonijum hloridom (zas. vod.). Voda i etil acetat: heksani (1:1) su dodati. Organski sloj je odvojen i vodeni sloj je ektrahovan ponovo sa etil acetatom:heksanima (1:1). Kombinovani organski slojevi su osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani i koncentrovani. Ostatak je prečišćen pomoću fleš hromatografije (10-50% EtOAc:Heks, 80 g kolona) da se dobije 1.30 g (46% prinos) (R)-((S)-4,4-dimetil-2-oksotetrahidrofuran-3-il) 4-metilcikloheks-3-enkarboksilata 502 kao čistog ulja.
b. Pripremanje jedinjenja 503.
[0206] (R)-((S)-4,4-dimetil-2-oksotetrahidrofuran-3-il) 4-metilcikloheks-3-enekarboksilat 502 (1.30 g, 5.15 mmol) u THF-u (10 mL), vodi (1 mL) i metanolu (1 mL) je tretiran sa litijum hidroksid monohidratom (2.16 g, 51.5 mmol) i zagrejan do 50 °C uz mešanje. Posle 1 sata, reakciona smeša tretirana je sa 1M HCI. Smeša je ektrahovana sa heksanima:THF-om (10:1), osušena preko natrijum sulfata, filtrirana i koncentrovana do 0.738 g (kvantitativni prinos) (R)-4-metilcikloheks-3-enkarboksilne kiseline 503 kao belog praha.
c. Pripremanje jedinjenja 504.
[0207]
[0208] (R)-4-metilcikloheks-3-enkarboksilna kiselina 503 (371 mg, 2.65 mmol), azeotropno osušena evaporacijom iz toluena, je tretirana sa trobaznim kalijum fosfatom (1.13 g, 7.94 mmol), suspendovana u dihlormetanu (7.6 mL) i tretirana sa dimetilformamidom (4 kapi). Reakciona smeša je ohlađena do 0 °C i tretirana u kapima sa oksalil hloridom (0.75 mL, 7.9 mmol). Reakciona smeša je ostavljena da se zagreje do ambijentalne temperature uz mešanje tokom 2 sata. Posle filtriranja čvrste supstance, rastvor je koncentrovan, tretiran sa heksanima i koncentrovan ponovo da se dobije (R)-4-metilcikloheks-3-enkarbonil hlorid 504 kao svetlo žuto ulje koje je korišćeno odmah u sledećem koraku.
d. Pripremanje jedinjenja 506.
[0209]
[0210] (R)-4-metilcikloheks-3-enkarbonil hlorid 504 (2.65 mmol), metil estar 5-(3,3-dimetilbut-1-inil)-3-(1,4-dioksa-spiro[4.5]dec-8-ilamino)-tiofen-2-karboksilne kiseline 505 (250 mg, 0.66 mmol) i trobazni kalijum fosfat (562 mg, 2.65 mmol) su suspendovani u dihloroetanu (1.7 mL), zatvoreni poklopcem i zagrejani do 90 °C. Posle 16 sati, reakciona smeša je ohlađena i podeljena između etil acetata i vode. Organski sloj je odvojen i vodeni delovi ektrahovani ponovo sa etil acetatom. Kombinovani organski slojevi su osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani i koncentrovani. Fleš hromatografija (10-40% EtOAc:Heksani) je dala 220 mg (67% prinos) željenog metil estra 5-(3,3-dimetil-but-1-inil)-3-[(1,4-dioksa-spiro[4.5]dec-8-il)-((1R)-4-metil-cikloheks-3-enkarbonil)-amino]-tiofen-2-karboksilne kiseline 506 kao bež pene.
e. Pripremanje jedinjenja 507.
[0211]
[0212] metil estar 5-(3,3-Dimetil-but-1-inil)-3-[(1,4-dioksa-spiro[4.5]dec-8-il)-((1R)-4-metilcikloheks-3-enkarbonil)-amino]-tiofen-2-karboksilne kiseline 506 (219 mg, 0.438 mmol) je rastvoren u THF-u (3.5 mL) i tretirana sa 4M HCI (1.75 mL, 7.01 mmol). Reakciona smeša je zagrejana do 45 °C i mešana 2 h. Etil acetat je dodat i organski sloj je odvojen zatim ispran sa vodom, natrijum bikarbonatom (zas vod), vodom, i slanim rastvorom. Organski sloj je osušen preko natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan do 0.190 g (95% prinos) željenog metil estra 5-(3,3-dimetil-but-1-inil)-3-[((1R)-4-metil-cikloheks-3-enkarbonil)-(4-okso-cikloheksil)-amino]-tiofen-2-karboksilne kiseline 507 kao bele pene.
f. Pripremanje jedinjenja 508.
[0213]
[0214] Trimetilsulfoksonijum hlorid (79 mg, 0.62 mmol) u DMSO-u (1.5 mL) je tretiran sa natrijum hidridom (21 mg, 60% uljana disperzija, 0.53 mmol) i mešan je na ambijentalnoj temperaturi tokom 10 min. Metil estar 5-(3,3-Dimetil-but-1-inil)-3-[((1R)-4-metil-cikloheks-3-enkarbonil)-(4-okso-cikloheksil)-amino]-tiofen-2-karboksilne kiseline 507 u THF-u (1 mL 0.5 mL) je dodavan u kapima i reakciona smeša je mešana tokom 45 min. Narandžasti rastvor je tretiran sa 5% limunskom kiselinom do pH 3 i podeljen je između vode i etil acetata. Organski sloj je odvojen i vodeni je ektrahovan ponovo sa etil acetatom. Kombinovane organske supstance su isprane sa 5% LiCI, vodom i slanim rastvorom, i osušene preko natrijum sulfata. Posle filtracije i koncentracije, ostatak je prečišćen pomoću fleš hromatografije (20-75% EtOAc:heksani) da se dobije 0.134 g metil estra (70% prinos) 5(3,3-dimetil-but-1-inil)-3-[((1R)-4-metil-cikloheks-3-enkarbonil)-(1-oksa-spiro[2.5]oct-6-il)-amino]-tiofen-2-karboksilne kiseline 508 kao belog praha.
[0215] Jedinjenje 6 može biti pripremljeno korišćenjem sintetičke metode i intermedijeri kao oni koji su opisani u USSN 12/779,023 (US 20100310512 A1). Jedinjenje 6 može takođe biti pripremljeno kako je opisano u sledećem Primeru.
Primer 6: Pripremanje metil estra (1-{3-[6-(9,9-Difluoro-7-{2-[5-(2-metoksikarbonilamino-3-metil-butiril)-5-aza-spiro[2.4]hept-6-il]-3H-imidazol-4-il}-9H-fluoren-2-il)-1H-benzoimidazol-2-il]-2-aza-biciklo[2.2.1]heptan-2-karbonil}-2-metil-propil)-karbaminske kiseline 6.
[0216]
[0217] terc-Butil estar 3-[6-(9,9-difluoro-7-{2-[5-(2-metoksikarbonilamino-3-metil-butiril)-5-aza-spiro[2.4]hept-6-il]-3H-imidazol-4-il}-9H-fluoren-2-il)-1H-benzoimidazol-2-il]-2-azabiciklo[2.2.1]heptan-2-karboksilne kiseline 614 (115 mg, 0.138 mmol) je rastvoren u metilen hloridu (2 mL) i HCI u dioksanu (4M, 2 mL) je dodat i mešanje na sobnoj temperaturi je nastavljeno. Posle 20 minuta, sve isparljive supstance su uklonjene u vakuumu. Sirov materijal je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. Sirov materijal je rastvoren u DMF-u (1.5 mL) i DIEA (53.4 mg, 0.414 mmol) je dodat. Rastvor 2- (L) metoksikarbonilamino-3-metil-buterne kiseline 611 (24.2 mg, 0.138 mmol), HATU (52.4 mg, 0.138 mmol) i DIEA (17.8 mg, 0.138 mmol) u DMF-u (1 mL) su dodati. Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi. Posle 20 minuta, reakcija je razblažena sa EtOAc-om i isprana je sa vodenim bikarbonatnim rastvorom, vodenim LiCI rastvorom (5%), slanim rastvorom, i osušena je preko natrijum sulfata. Filtracija i uklanjanje rastvarača u vakuumu dalo je sirov materijal, koji je prečišćen pomoću RF-HPLC (eluent: voda / MeCN sa 0.1% TFA) da se dobije jedinjenje 6 (76 mg). LCMS-ESI<+>: izračunato za C49H54F2N8O6: 888.9 (M<+>); Pronađeno: 890.0 (M+H<+>).<1>H-NMR: 300 MHz, (dmso-d6) δ: 8.20-7.99 (m, 8H), 7.73 (s, 2H), 7.37 - 7.27 (m, 2H), 5.25 (dd, J = 7.2 Hz, 1H), 4.78 (s, 1H) 4.54 (s, 1H), 4.16 (m, 1H), 4.02 (m, 1H), 3.87 (m, 1H), 3.74 (m, 1H), 3.55 (s, 3H), 3.53 (s, 3H), 2.75 (m, 1H), 2.25 (m, 2H), 2.09 - 2.04 (m, 2H), 1.88 - 1.79 (m, 2H), 1.54 (m, 1H), 0.94 - 0.77 (m, 15H) 0.63 (m, 4H) ppm.<19>F-NMR: 282 MHz, (dmso-d6) δ: -109.1 ppm [-74.8 ppm TFA].
[0218] Intermedijerno jedinjenje 614 je pripremljeno kao što sledi.
a. Pripremanje jedinjenja 1-benzil estar 2-metil estar 4-metilen-pirolidin-1,2-dikarboksilne kiseline 602.
[0219] 1-terc-Butil estar 4-metilen-pirolidin-1,2-dikarboksilne kiseline 601 (10.0 g, 44 mmol) je rastvoren u MeOH-u (75 mL) na sobnoj temperaturi i HCI (4M u dioksanu, 75 mL) je dodat. Mešanje na sobnoj temperaturi je nastavljeno tokom 4 sata. Sve isparljive supstance su uklonjene u vakuumu i bež čvrsta supstanca je dobijena. Sirov materijal je suspendovan u metilen hloridu (100 mL) i N-Metil morfolin (13.3 g, 132 mmol) je dodat. Smeša je ohlađena do 0 °C i benzil hloroformat (8.26 g, 48.4 mmol) je dodat uz mešanje. Posle 30 minuta, reakcija je zagrejana do sobne temperature i rastvor je ispran sa vodom i vodenim HCI (1M). Rastvor je osušen preko natrijum sulfata. Filtracija i evaporacija rastvarača dale su sirov proizvod, koji je prečišćen silika gel hromatografijom (eluent: EtOAc / heksani) da se dobije jedinjenje 602 (10.2 g). LCMS-ESI<+>: izračunato za C15H17NO4: 275.3 (M<+>); Pronađeno: 276.4 (M+H<+>).
b. Pripremanje smeše Jedinjenja 603 i 604.
[0220] Sud sa okruglim dnom sa 3 grla koji je osušen u rerni je opremljen sa ulaznim adapterom za azot i levkom za dodavanje od 250 mL. Treće grlo je zatvoreno sa septumom. Sud sa šipkom za mešanje je napunjen sa dihlorormetanom (120 mL) i dietil cinkom (1.0 M u heksanu, 118 mL, 118 mmol) zatim ohlađen do 0 °C u ledenom kupatilu. Levak za dodavanje je napunjen sa dihlormetanom (40 mL) i trifluorosirćetnom kiselinom (9.1 mL, 118 mmol). Nakon što je rastvor dietil cinka ohlađen do 0 °C (oko 25 minuta), rastvor trifluorosirćetne kiseline je dodavan u kapima preko 20 min u promešanu reakcionu smešu. Posle mešanja tokom još 20 min na 0 °C, dijodometan (9.5 mL, 118 mmol) je dodavan polako tokom 4 minuta. Posle još 20 min, 1-benzil estar 2-metil estar 4-metilen-pirolidin-1,2-dikarboksilne kiseline 602 (8.10 g, 29.4 mmol) je dodat u 30 mL dihlormetana kanilom. Sud koji sadrži 1-benzil estar 2-metil estar 4-metilen-pirolidin-1,2-dikarboksilne kiseline je zatim ispran sa još 10 mL dihlormetana i ovaj rastvor je takođe prebačen u reakcionu smešu pomoću kanile. Reakciona smeša je ostavljena da se zagreje do sobne temperature i mešana je tokom 110 h (oko 5 dana) posle čega su reagensi kvenčovani sa zasićenim vodenim amonijum hloridom (∼150 mL). Sadržaji suda su polako sipani u levak za separaciju od 2 L koji sadrži zasićeni vodeni natrijum bikarbonat (800 mL). Vodena faza je ektrahovana tri puta sa 300 mL etil acetata. Kombinovane organske supstance su osušene preko magnezijum sulfata i koncentrovane da se obezbedi smeša Jedinjenja 603 i 604.
c. Pripremanje Jedinjenja 603.
[0221] Sirov materijal iz pod-dela b je rastvoren u 3:1:1 THF/voda/aceton-u (165 mL) zatim tretiran sa N-metilmorfolin-N-oksidom (3.45 g, 29.4 mmol) i osmijum tetroksidom (4 mas% u vodi, 5 mL, 0.818 mmol). Posle mešanja na sobnoj temperaturi tokom 7 h, reagensi su kvenčovani sa 1 M vodenim natrijum tiosulfatom (∼100 mL). Sadržaji suda su zatim sipani u sep. levak od 1 L koji sadrži vodu (∼300 mL). Vodena faza je ektrahovana tri puta sa 300 mL dihlormetana. Kombinovane organske supstance su osušene preko magnezijum sulfata i koncentrovane. Sirov ostatak je prečišćen silika kolonskom hromatografijom (5% do 45% EtOAc/heksan) da se obezbedi 5-benzil estar 6-metil estar 5-aza-spiro[2.4]heptan-5,6-dikarboksilne kiseline 603 kao bistro ulje (5.54g, 19.15 mmol, 65%).<1>H NMR (CDCl3) δ 7.36-7.29 (m, 5H), 5.21-5.04 (m, 2H), 4.56-4.47 (m, 1H), 3.75 (s, 1.5H), 3.60 (m, 1.5H), 03.51-3.37 (m, 2H), 2.32-2.25 (m, 1H), 1.87-1.80 (m, 1H), 0.64-0.51 (m, 4H).
d. Pripremanje 5-benzil estra 5-Aza-spiro[2.4]heptan-5,6-dikarboksilne kiseline 606.
[0222] 5-benzil estar 6-metil estar 5-Aza-spiro[2.4]heptan-5,6-dikarboksilne kiseline 603 (244 mg, 0.840 mmol) je rastvoren u THF (2.0 mL) / MeOH-u (1.5 mL). Vodeni rastvor LiOH (35.5 mg, 0.84 mmol) je dodat i mešanje na sobnoj temperaturi je nastavljeno. Posle 3 sata, reakcija je neutralisana sa vodenim HCI (1M) i organski rastvarači su uklonjeni u vakuumu. Sirova smeša je razblažena sa vodom i EtOAc-om i organski sloj je sakupljen. Sve isparljive supstance su uklonjene u vakuumu i sirova kiselina 606 je korišćena bez daljeg prečišćavanja. LCMS-ESI<+>: izračunato za C15H17NO4: 275.3 (M<+>); Pronađeno: 276.3 (M+H<+>).
e. Pripremanje 2,7-Dibromo-9,9-difluoro-9H-fluorena 608.
[0223] 2,7-Dibromo-fluoren-9-on 607 (4.0 g, 11.8 mmol) je suspendovan u deoksofluoru (12 mL) na sobnoj temperaturi i EtOH (4 kapi) je dodat. Izmešana suspenzija je zagrejana na T = 90° C tokom 24 sata (OPREZ: Upotreba deoksofluora na povišenim temperaturama, kao što je opisano iznad, je upozorenje jer brze i energične egzotermne reakcije mogu da se dese). Reakcija je ohlađena do sobne temperature i sipana na led koji sadrži natrijum bikarbonat. Čvrsta supstanac je formirana i sakupljena filtracijom. Sirov materijal je stavljen u EtOAc i ispran je sa vodenim HCI-om (1M) i slanim rastvorom. Rastvor je osušen preko natrijum sulfata. Filtracija i evaporacija rastvarača dali su sirov proizvod, koji je je prečišćen silika gel hromatografijom (eluent: EtOAc / heksani) da se dobije 608 (3.2 g).<19>F-NMR: 282 MHz, (dmso-d6) δ: -111.6 ppm. Pre korišćenja materijala u sledećem koraku, izložen je uglju kao rastvor u EtOAc-u.
f. Pripremanje 5-benzil estra 6-[2-(7-bromo-9,9-difluoro-9H-fluoren-2-il)-2-okso-etil] estar 5-Aza-spiro[2.4]heptan-5,6-dikarboksilne kiseline 609.
[0224] 2,7-Dibromo-9,9-difluoro-9H-fluoren 608 (372 mg, 1.04 mmol), Pd(PPh3)4(30.0 mg, 0.026 mmol), PdCl2(PPh3)2(18.2 mg, 0.026 mmol), As(PPh3)3(5.0 mg) su rastvoreni u dioksanu (10 mL) pod atmosferom argona. Etoksivinil-tributil kalaj (376.4 mg, 1.04 mmol) je dodat. Smeša je zagrejana tokom 140 minuta na 85 °C (uljano kupatilo). Reakcija je ohlađena do sobne temperature. N-bromo sukcinimid (177 mg, 1.0 mmol) je dodat nakon čega i voda (2 mL). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 3 sata, posle čega je veći deo dioksana uklonjen u vakuumu. Sirova reakciona smeša je razblažena sa EtOAc-om i isprana je sa vodom. Sve isparljive supstance su uklonjene u vakuumu. Toluen je dodat i sve isparljive supstance su uklonjene u vakuumu po drugi put. Sirov materijal je rastvoren u DMF / MeCN-u (2 mL, 1:1) na sobnoj temperaturi. Rastvor N-Cbz-4-ciklopropil (L) prolina 606 (0.84 mmol) i DIEA (268 mg, 2.08 mmol) u MeCN-u (2 mL) su dodati i mešanje na sobnoj temperaturi je nastavljeno. Posle 14 sati, većina MeCN je uklonjena u vakuumu i sirova reakciona smeša je razblažena sa EtOAc-om. Smeša je isprana sa vodenim HCI (1M), vodenim LiCI rastvorom (5%), slanim rastvorom, i osušena je preko natrijum sulfata. Filtracija i evaporacija rastvarača dale su sirov reakcioni proizvod, koji je prečišćen silika gel hromatografijom (eluent: EtOAc / heksani) da se dobije jedinjenje 609 (176 mg). LCMS-ESI<+>: izračunato za C30H24BrF2NO5: 596.4 (M<+>); Pronađeno: 595.2 / 597.2 (M+H<+>).
g. Pripremanje benzil estra 6-[5-(7-Bromo-9,9-difluoro-9H-fluoren-2-il)-1H-imidazol-2-il]-5-aza-spiro[2.4]heptan-5-karboksilne kiseline 610.
[0225] 5-benzil estar 6-[2-(7-bromo-9,9-difluoro-9H-fluoren-2-il)-2-okso-etil) estar 5-Azaspiro[2.4]heptan-5,6-dikarboksilne kiseline (172 mg, 0.293 mmol) je rastvoren u m-ksilenima (6.0 mL). Amonijum acetat (226 mg, 2.93 mmol) je dodat i reakcija je mešana na 140 °C tokom 60 minuta pod mikrotalasnim uslovima. Reakcija je ohlađena do sobne temperature i sve isparljive supstance su uklonjene u vakuumu. Sirov materijal je prečišćen silika gel hromatografijom (eluent: EtOAc / heksani) da se dobije jedinjenje 610 (80.3 mg). LCMS-ESI<+>: izračunato za C30H24BrF2N3O2: 576.4 (M<+>); Pronađeno: 575.2 / 577.2 (M+H<+>).
h. Pripremanje metil estra (1-{6-[5-(7-Bromo-9,9-difluoro-9H-fluoren-2-il)-1H-imidazol-2-il]-5-aza-spiro[2.4]heptan-5-karbonil}-2-metil-propil)-karbaminske kiseline 612.
[0226] benzil estar 6-[5-(7-Bromo-9,9-difluoro-9H-fluoren-2-il)-1H-imidazol-2-il]-5-azaspiro[2.4]heptan-5-karboksilne kiseline 610 (800 mg, 1.38 mmol) je rastvoren u metilen hloridu (15 mL) i HBr u AcOH-u (37%, 2 mL) je dodat i mešanje na sobnoj temperaturi je nastavljeno. Posle 180 minuta, suspenzija je razblažena sa heksanima i čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i isprana je sa heksanima i podvrgnuta vakuumu. Sirov materijal je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. Sirov materijal je rastvoren u DMF-u (4.0 mL) i DIEA (356 mg, 2.76 mmol) je dodat. Rastvor 2-(L)-Metoksikarbonilamino-3-metil-buterne kiseline 611 (242 mg, 1.38 mmol), HATU (524 mg, 1.38 mmol) i DIEA (178 mg, 1.38 mmol) u DMF-u (1 mL) su dodati. Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi. Posle 50 minuta, reakcija je razblažena sa EtOAc-om i isprana je sa vodenim bikarbonatnim rastvorom, vodenim LiCI rastvorom (5%), slanim rastvorom, i osušena je preko natrijum sulfata. Filtracija i uklanjanje rastvarača u vakuumu dala je sirov materijal, koji je prečišćen silika gel hromatografijom (eluent: EtOAc / heksani) da se dobije blago nečisto jedinjenje 612 (878 mg). LCMS-ESI<+>: izračunato za C29H29BrF2N4O3: 599.5 (M<+>); Pronađeno: 598.5 / 600.5 (M+H<+>).
i. Pripremanje terc-butil estra 3-[6-(9,9-Difluoro-7-{2-[5-(2-metoksikarbonilamino-3-metilbutiril)-5-aza-spiro[2.4]hept-6-il]-3H-imidazol-4-il}-9H-fluoren-2-il)-1H-benzoimidazol-2-il]-2-aza-biciklo[2.2.1]heptan-2-karboksilne kiseline 614.
[0227] Metil estar (1-{6-[5-(7-bromo-9,9-difluoro-9H-fluoren-2-il)-1H-imidazol-2-il]-5-azaspiro[2.4]heptan-5-karbonil}-2-metil-propil)-karbaminske kiseline 612 (840 mg, 1.4 mmol), terc-butil estar 3-[6-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioksaborolan-2-il)-1H-benzoimidazol-2-il]-2-aza-biciklo[2.2.1]heptan-2-karboksilne kiseline 613 (615 mg, 1.4 mmol), Pd(PPh3)4(161 mg, 0.14 mmol), K2CO3(579 mg, 4.2 mmol), su rastvoreni u DME (15 mL) / vodi(3 mL) pod atmosferom argona. Smeša je zagrevana tokom 120 minuta na 85 - 90 °C (uljano kupatilo). Posle 120 minuta dodatni estar boronske kiseline (61 mg, 0.14 mmol) je dodat i zagrevanje je nastavljeno. Posle 3 sata, reakcija je ohlađena do sobne temperature. Većina DME je uklonjena u vakuumu i sirova reakciona smeša je razblažena sa EtOAc-om. Smeša je isprana sa slanim rastvorom i osušena je preko natrijum sulfata. Filtracija i evaporacija rastvarača dale su sirov reakcioni proizvod, koji je prečišćen silika gel hromatografijom (eluent: EtOAc / heksani) da se dobije jedinjenje 614 (878 mg). LCMS-ESI<+>: izračunato za C47H51F2N7O5: 831.9 (M<+>); Pronađeno: 832.7 (M+H<+>).
[0228] Intermedijerno jedinjenje 613 može biti pripremljeno kao što sledi
j. Pripremanje terc-butil estra 3-(2-Amino-4-bromo-fenilkarbamoil)-2-azabiciklo[2.2.1]heptan-2-karboksilne kiseline 617.
[0229] Rastvoru 2-terc-butil estra 2-aza-biciklo[2.2.1]heptan-2,3-dikarboksilne kiseline 616 (0.327 g, 1.36 mmol, 1 ekv.), 4-Bromo-benzen-1,2-diamina 615 (0.507 g, 2.71 mmol, 2 ekv.) i 4-metilmorfolina (0.299 mL, 2 ekv.) u 10 mL DMF-u je dodat HATU (0.543g, 1.05 ekv.). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata zatim koncentrovana. Reakciona smeša je razblažena sa etil acetatom i isprana sa razblaženim NaHCO3vodenim rastvorom i slanim rastvorom. Organski sloj je koncentrovan prečišćen pomoću fleš hromatografije na koloni (silika gel, 20 do 80% etil acetat/heksan) da se dobije smeša regioizomera terc-butil estra 3-(2-Amino-4-bromo-fenilkarbamoil)-2-azabiciklo[2.2.1]heptan-2-karboksilne kiseline 617.
k. Pripremanje terc-butil estra 3-(6-Bromo-1H-benzoimidazol-2-il)-2-azabiciklo[2.2.1]heptan-2-karboksilne kiseline 618.
[0230] Gornja smeša regioizomera terc-butil estra 3-(2-Amino-4-bromo-fenilkarbamoil)-2-aza-biciklo[2.2.1]heptan-2-karboksilne kiseline 617 je rastvorena u etanolu i zagrevana do 130°C u zatvorenoj epruveti preko noći i nastavljena je da se zagreva do 170°C tokom 3 dana. LC-MS je pokazala željeni proizvod i Boc iscepan proizvod (oko 1:1 odnos). Smeša je koncentrovana i rastvorena HCL. Di-terc-butil dikarbonat (0.6 ekv.) je dodat i reakcija je mešana preko noći na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je koncentrovana prečišćena fleš kolonskom hromatografijom (silika gel, 20 do 80% etil acetat/heksan) da se dobije terc-butil estar 3-(6-Bromo-1H-benzoimidazol-2-il)-2-aza-biciklo[2.2.1]heptan-2-karboksilne kiseline 618 (0.383 g, 72%) kao narandžasta pena.
I. Pripremanje jedinjenja 613.
[0231] Smeša terc-butil estra 3-(6-Bromo-1H-benzoimidazol-2-il)-2-azabiciklo[2.2.1]heptan-2-karboksilne kiseline 618 (264 mg, 0.673 mmol), dipinokal estra benzen-1,4-diboronske kiseline (5 ekv., 3.36 g, 6.95 mmol), tetrakis(trifenilfosfin)paladijuma (5%, 39 mg) i 2M vodenog rastvora kalijum karbonata (3 ekv., 1.01 mL) u 5 mL DME je zagrejana do 90°C pod Ar tokom 4 sata. Reakciona smeša je ohlađena i razblažena u etil acetatu i isprana sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata. Organski sloj je osušen (MgSO4), koncentrovan i prečišćen fleš kolonskom hromatografijom (silika gel, 20 do 60% etil acetat/heksan) da se dobije terc-butil estar 3-{6-[4-(4,4,5,5-Tetrametil-[1,3,2]dioksaborolan-2-il)-fenil]-1H-benzoimidazol-2-il}-2-aza-biciklo[2.2.1]heptan-2-karboksilne kiseline 613 (295 mg, prinos 85%). LCMS-ESI-: izračunato za C30H38BN3O4: 515.45; Pronađeno: 516.1 (M+H<+>).
[0232] Jedinjenje 7 može biti pripremljeno korišćenjem sintetičke metode i intermedijera kao onih koji su opisani u US 7,429,572. Jedinjenje 7 može takođe biti pripremljeno kako je opisano u sledećem Primeru.
Primer 7: Pripremanje jedinjenja 7.
[0233]
[0234] U ledeno hladnu suspenziju Jedinjenja 701 (970 g, 3.74 mol) i DMAP (50 g, 0.412 mol) u THF-u (10 L) je dodat TEA (2.3 kg, 16.5 mol) i voda (7 L) koja proizvodi bistar rastvor. Izobutiril hlorid (3 ekvivalenta) je dodat polako u mešovitu smešu dok je temperatura održavana na oko 0° C. Dodatnih 1.2 zatim 0.7 ekvivalenta izobutil hlorida je dodato dok HPLC nije pokazala da je reakcija nastavljena u suštini do kraja (ukupno oko 1.95 kg). Reakciona smeša je zakiseljena sa koncentrovanom HCI do pH od oko 6.4 i organska faza je isprana sa EtOAc-om (2 x 10 L). Kombinovani ekstrakti su isprani sa vodom (1 x 15 L). Organska faza je filtrirana i koncentrovana u vakuumu. Ostatak je rastvoren u IPA-u (oko 20 kg) i heptan (14.2 kg) je dodat. Rastvor je zagrejan do oko 74-75°C da se proizvede bistar rastvor, zatim oko 5L je uklonjeno destilacijom. Dobijeni rastvor je ohlađen polako do sobne temperature. Talog je formiran na oko 42-43° C. Hlađenje je nastavljeno polako do 5°C zatim mešanje preko noći. Dobijena čvrsta supstanca je filtrirana i filtrat je ispran sa smešom IPA/heptan (1:8) (13.4 kg), i osušen pod vakuumom na oko 60- 70°C da se dobije 1.295 kg (86.65%) Jedinjenja 7 koje je 99.45% čisto pomoću HPLC.
[0235] Intermedijerno jedinjenje 706 može biti pripremljeno kao što sledi.
a. Pripremanje jedinjenja 701.
[0236] U suspenziju citidina (100 g, 0.411 mol) u DMF-u (2.06 L) je dodat anhidrid benzoeve kiseline (102.4 g, 0.452 mol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 20 sati. DMF je uklonjen u vakuumu i ostatak je triturisan sa dietil etrom. Dobijena čvrsta supstanca je sakupljena sukcionom filtracijom i isprana sa dietil etrom (2 x 200 mL). Dalje sušenje u vakuumu na sobnoj temperaturi dalo je N<4>benzamid (140.6 g, 98.3%). Deo ovog materijala (139.3 g, 0.401 mol) je rastvoren u anhidrovanom piridinu (1.2 L) i tretiran je sa 1,3-dihloro-1,1,3,3-tetraizopropil-disiloksanom (141.4 mL, 0.441 mol) na sobnoj temperaturi. Rastvor je mešan na sobnoj temperaturi preko noći. Smeša je koncentrovana skoro do suva u vakuumu i koevaporisana u toluenu (3 x 200 mL). Ostatak je tretiran sa EtOAc-om (1.8 L) i ispran sa HCI-om (2 x 200 mL, 0.05 N), NaHCO3-om (5 %, 2 x 400 mL). Organski sloj je ispran osušen (Na2SO4), filtriran, i evaporisan do suva. Jedinjenje 701 (256.5 g, >100%) je izolovano kao bela pena i korišćeno bez daljeg prečišćavanja.
b. Pripremanje jedinjenja 702.
[0237] Jedinjenje 701 (236.5 g, 0.40 mol) je rastvoreno u suvom THF-u (1.22 L). Anhidrovani DMSO (180.8 mL, 2.1 mol) je dodat i dobijeni rastvor je ohlađen do između -20°C i -15°C. Anhidrid trifluorosirćetne kiseline (90.6 mL, 0.64 mol) je dodavan u kapima tokom 45 minuta i rastvor je mešan između -20°C i -15 °C tokom 2 h posle čega je anhidrovan trietilamin (223.5 mL, 1.6 mol) dodavan tokom 20 minuta. Sirova reakcija koja sadrži keton 702 je rastvorena u EtOAc-u (500 mL), i dobijeni rastvor je ispran sa H2O (3 x 400 mL), osušen (Na2SO4) i rastvarači su uklonjeni u vakuumu da se dobije žuta čvrsta supstanca koja je prečišćena na silika gel koloni eluiranjem sa postepenim gradijentom Et2O (0-60%) u heksanu praćeno sa postepenim gradijentom EtOAc (50-100%) u heksanu. Sirov keton tako dobijen (∼192 g) je kristalisao iz petrolej etra da bi se dobio keton 702 (138.91 g, 57.5% iz citidina) kao bela čvrsta supstanca u 22 g neizreagovanog početnog materijala, 701, kao žute čvrste supstance.
c. Pripremanje jedinjenja 703.
[0238] Jedinjenje 702 (48.57 g, 8.26 mmol) je rastvoreno u anhidrovanom toluenu (∼400 mL) i rastvarač je uklonjen u vakuumu sa isključenjem vlage. Ostatak je zatim dalje osušen u vakuumu (uljana pumpa) tokom još 2 sata. Sa striktnim isključenjem vlage, preostala pena je je rastvorena u anhidrovanom dietil etru (1.03 L) pod argonom. Dobijeni rastvor je ohlađen do -78°C pod argonom i MeLi (1.6 M, 258.0 mL, 0.413 mol) je dodavan u kapima pomoću levka za dodavanje. Nakon što je dodavanje završeno, smeša je mešana tokom 2 sata na -78°C. Vodeni 1 M NH4Cl (500 mL) je dodat polako. Posle zagrevanja do sobne temperature, smeša je isprana sa H2O (2 x 500 mL), osušena (Na2SO4), i zatim koncentrovana do suva da se dobije braon pena (∼60 g, >100%).
[0239] Reakcija je izvedena još dva puta korišćenjem 37.62 g i 56.4 g Jedinjenja 702. Kombinovani sirovi proizvodi (128.0 g, 0.212 mol) su rastvoreni u THF-u (1.28 L) i tretirani sa konc. HOAc (23 mL, 0.402 mol). U rastvor je dodat TBAF (384.0 mL, 1 M u THF-u). Rastvor je mešan na sobnoj temperaturi 0.75 sati i smeša je tretirani sa silika gelom (750 g) i koncentrovana do suva. Prah je postavljen na kolonu sa silika gelom pakovanu sa CH2Cl2. Elucija sa 1:7 EtOH-CH2Cl2dala je tamnu voskastu čvrstu supstancu koja je prethodno adsorbovana na silika gel (300 g) i povrgnuta hromatografiji kao ranije. Jedinjenje 703 (46.4 g, 53.0 % iz 702) je izolovano kao prljavo bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (DMSO-d6): δ 1.20 (s, 3H, CH3), 3.62-3.69 (m, 2H,), 3.73-3.78 (m, 2H,), 5.19 (t, 1H, J = 5.4 Hz, OH-5'), 5.25 (s, 1H, OH-2'), 5.52 (d, 1H, J = 5.0 Hz, OH-3'), 5.99 (s, 1H, H-1'), 7.32 (d, 1H, J = 5.8 Hz), 7.50 (Ψt, 2H, J =7.7 Hz), 7.62 (Ψ, 1H, J =7.3 Hz), 8.00 (d, 2H, J =7.3 Hz), 8.14 (d, 1H, J =6.9 Hz), 11.22 (s, 1H, NH). Anal. Izračunato za C17H19N3O6• 0.5 H2O: C, 55.13; H, 5.44; N, 11.35. Pronađeno: C, 55.21; H, 5.47; N, 11.33.
d. Pripremanje jedinjenja 704.
[0240] Jedinjenje 703 (46.0 g, 0.13 mol) je rastvoreno u anhidrovanom piridinu i koncentrovano do suva u vakuumu. Dobijeni sirup je rastvoren u anhidrovanom piridiun pod argonom i ohlađen do 0°C uz mešanje. Braon rastvor je tretiran sa benzoil hloridom (30mL, 0.250 mol) u kapima preko 10 minuta. Ledeno kupatilo je uklonjeno i mešanje je nastavljeno tokom 1.5 sata pri čemu TLC nije pokazala preostali početni materijal. Smeša je kvenčovana dodavanjem vode (5 mL) i koncentrovana do suva. Ostatak je rastvoren u minimalnoj količini CH2Cl2i ispran sa zasićenim NaHCO3(1 x 500 mL) i H2O (1 x 500 mL). Organska faza je osušena (Na2SO4) i filtrirana, koncentrovana do suva i podvrgnuta hromatografiji na silika gelu eluiranjem sa postepenim gradijentom EtOAc-heksana (25-60%) da se obezbedi jedinjenje 704 kao žuta pena (48.5 g, 67%).<1>H NMR (CDCl3): δ 1.64 (s, 3H, CH3), 4.50 (m, 1H, H-4), 4.78-4.85 (m, 2H, H-5',5a'), 5.50 (d, 1H, J =3.4 Hz, H-3'), 6.42 (s, 1H, H-1'), 7.44-7.54 (m, 7H, Ar), 7.57-7.66 (m, 3H, Ar), 7.94 (d, 2H, J =7.8 Hz), 8.05-8.09 (m, 4H, Ar), 8.21 (d, 1H, J = 7.3 Hz). Anal. Izračunato za C31H27NO8: C, 65.37; H, 4.78; N, 7.38. Pronađeno: C, 65.59; H, 4.79; N, 7.16.
e. Pripremanje jedinjenja 705.
[0241] Jedinjenje 704 (7.50 g, 0.013 mol) je rastvoreno u anhidrovanom toluenu (150 mL) pod argonom i ohlađeno do -20°C. DAST (2.5 mL, 18.9 mmol) je dodat polako i kupatilo za hlađenje je uklonjeno nakon što je dodavanje završeno. Mešanje je nastavljeno tokom 1 sata i smeša je sipana u zasić. NaHCO3(100 mL) i isprana dok nije prekinuta evolucija gasa. Organska faza je osušena (Na2SO4), koncentrovana, i prečišćena silika gel hromatografijom eluiranjem sa 1:1 EtOAc-heksanima. Dobilo se 1.22 g (16.3%) čistog 705 kao bela čvrsta supstanca. mp 241 °C (CH2Cl2-heksani);<1>H NMR (CDCl3)): δ 1.49 (d, 3H, J =22.4 Hz, CH3), 4.64 (dd, 1H, J = 3.44, 12.9 Hz, H-5'), 4.73 (d, 1H, J = 9.5 Hz, H-4'), 4.90 (dd, 1H, J = 2.4, 12.7 Hz, H-5a'), 5.56 (dd, 1H, J = 8.6, 20.7 Hz, H-3'), 6.52 (d, 1H, J = 18.0 Hz, H-1'), 7.47-7.57 (m, 7H, Ar), 7.62-7.71 (m, 3H, Ar), 7.89 (d, 2H, J = 6.9 Hz), 8.07-8.11 (m, 5H, Ar), 8.67 (bs, 1H, NH).<19>F NMR (CDCl3)): δ 3.3 (m). Anal. Izračunato za C31H26FN3O7• 0.7 H20: C, 63.74; H, 4.72; N, 7.20. Pronađeno: C, 63.71; H, 4.54; N, 7.20.
f. Pripremanje jedinjenja 706.
[0242] Jedinjenje 705 (6.30 g, 0.011 mol) je suspendovano u metanolskom amonijaku (ca 7 N, 150 mL) i mešano je na sobnoj temperaturi preko noći. Rastvarač je uklonjen u vakuumu, ko-evaporisan sa metanolom (1 x 20 mL), i prethodno-adsorbovan na silika gel. Beli prah je postavljen na silika gel kolonu (pakovan u CHCl3) i kolona je eluirana sa 9% EtOH-om u CHCl3-u), zatim 17% EtOH-om i konačno 25% EtOH-om u CH Cl3-u). Koncentracija frakcija koje sadrže proizvod, filtracija kroz disk od 0.4 µm, i liofilizacija iz vode dala je jedinjenje 706,2.18 g (76%).<1>H NMR (DMSO-d6;): δ 1.17 (d, 3H, J = 22.3 Hz, CH3), 3.63 (dd, 1H, J =2.7, 13.7 Hz, H-5'), 3.70-3.84 (m, 3H, H-3', H-4', H-5a'), 5.24 (app s, 1H, OH-3'), 5.60 (d, 1H, J = 5.4 Hz, H-5'), 5.74 (d, 1H, J = 7.71 Hz, H-5), 6.07 (d, 1H, J = 18.9 Hz, H-1'), 7.31 (s, 1H, NH2), 7.42 (s, 1H, NH2), 7.90 (d, 1H, J = 7.3 Hz, H-6).<19>F NMR (DMSO-d6;): δ 2.60 (m). Anal. Izračunato za C10H14FN3O4• 1.4 H2O: C, 44.22; H, 5.95; N, 14.77. Pronađeno: C, 42.24; H, 5.63; N, 14.54. Jedinjenje 706 (0.10 g, 0.386 mmol) je konvertovano u hidrohloridnu so rastvaranjem u vodi (2 mL) i podešavanjem pH do približno 3.0 sa 1 M HCI. Voda je uklonjena u vakuumu i ostatak je kristalisao iz vodenog EtOH da se dobije Jedinjenje 706 kao hidrohloridna so (71.0 mg). mp 243°C (dec);<1>H NMR (DMSO-d6;): δ 1.29 (d, 3H, J =22.6 Hz, CH3), 3.65 (dd, 1H, J =2.3, 12.7 Hz, H-5'), 3.76-3.90 (m, 3H, H-3', H-4', H-5a'), 5.96 (d, 1H, J = 17.3 Hz, H-1 '),6.15 (d, 1H, J= 7.9 Hz, H-5), 8.33 (d, 1H, J =7.9 Hz, H-6), 8.69 (s, 1.5H, NH), 9.78 (s, 1.5H, NH).<19>F NMR (DMSO-d6;): δ 1.69 (m). Anal. Izračunato za C10H14FN3O4• HCl: C, 40.62; H, 5.11; N, 14.21. Pronađeno: C, 40.80; H, 5.09; N, 14.23.
[0243] Jedinjenje 8 može biti pripremljeno korišćenjem sintetičke metode i intermedijera kao onih koji su opisani u USSN 12/632,194. Jedinjenje 8 može takođe biti pripremljeno kako je opisano u sledećem Primeru.
Primer 8: Pripremanje 4-amino-2-n-butoksi-8-[3'-(pirolidin-1"-ilmetil)-benzil]-5,6,7,8-tetrahidropteridin-6-ona 8. (R = n-butil)
[0244]
[0245] Rastvoru nitro jedinjenje 807 (730 mg, 1.5 mmol) u MeOH-u (10 mL) je dodat Raney Nikal (-200 µL, kaša u H2O). Reakcioni sud je ispran sa H2i zatim mešan pod H2atmosferom tokom 1.5 sata. Smeša je filtrirana kroz Celit sa CH2Cl2-om i MeOH-om (1:1). Filtrat je koncentrovan pod vakuumom i ostavljen na liofilizatoru preko noći. Slobodna baza Jedinjenja 8 je dobijena kao bela čvrsta supstanca. Da se dobije HCl so od 8, u uzorak filtrata iznad je zakišeljen sa 1.0 M HCI do pH = 1-2 i liofilizovan.<1>H NMR (CD3OD, 300 MHz): δ 7.65 (s, 1H), 7.50 (m, 3H), 4.96 (s, 2H), 4.44 (t, J = 7 Hz, 2H), 4.40 (s, 2H), 4.16 (s, 2H), 3.48 (m, 2H), 3.19 (m, 2H), 2.02-2.17 (m, 4H), 1.74 (m, 2H), 1.45 (m, 2H), 0.94 (t, J = 7 Hz, 3H) - [HCI salt]. LCMS-ESI<+>: izračunato za C22H31N6O2: 411.5 (M+H<+>); Pronađeno: 411.3 (M+H<+>).
[0246] Intermedijerno jedinjenje 807 je pripremljeno kao što sledi.
a. Pripremanje jedinjenja 802.
[0247] Rastvoru Jedinjenja 801 (2.46 g, 10.2 mmol) u THF-u (34 mL) na -20 °C je dodat Et3N (3.14 mL, 22.5 mmol) nakon čega rastvor NH3(2.0 M u MeOH, 5.4 mL, 11 mmol). Smeša je mešana dok je zagrevana do 0 °C tokom 1.5 h (LC/MS pokazala je potrošnju polaznih materijala). Reakciona smeša koja sadrži jedinjenje 802 je prenešena dalje bez manipulacije.
b. Pripremanje jedinjenja 803.
[0248]
[0249] Rastvoru 3-((1-pirolidinilmetil)fenil)metanamina 806 (1.95 g, 10.2 mmol) u THF-u (34 mL) na 0 °C je dodat Et3N (3.14 mmol, 22.5 mmol) nakon čega metil bromoacetat (1.04 mL, 22.3 mmol) u kapima. Reakciona smeša je mešana dok LC/MS nije pokazala potrošnju polaznih materijala, približno 2 sata. Smeša koja sadrži jedinjenje 803 je je prenešena dalje bez manipulacije.
c. Pripremanje jedinjenja 804.
[0250] Reakciona smeša koja sadrži jedinjenje 803 je dodata u reakcionu smešu koja sadrži jedinjenje 802 na 0 °C. Reakciona smeša je mešana dok LC/MS nije pokazala potrošnju Jedinjenja 802, približno 45 minuta. Zasićeni rastvor NH4Cl (50 mL) je dodat. Slojevi su odvojeni, i vodeni sloj je ektrahovan sa EtOAc-om (2 x 30 mL). Kombinovani organski slojevi su osušeni preko MgSO4, filtrirani, i koncentrovani pod vakuumom. Prečišćavanje silika gel hromatografijom dalo je 2.11 g Jedinjenja 804.<1>H NMR (CD3OD, 300 MHz): δ (ppm) 7.32-7.16 (m, 4H), 4.69 (s, 2H), 4.19 (q, J = 7 Hz, 2H), 4.07 (s, 2H), 3.60 (s, 2H), 2.49 (m, 4H), 2.40 (s, 3H), 1.78 (m, 4H), 1.23 (t, 3 H, J = 7 Hz). LCMS-ESI<+>: izračunato za C21H29N6O4S: 461.2 (M+H<+>); Pronađeno: 461.0 (M+H<+>).
d. Pripremanje Etil-Nα-[4-amino-2-metansulfonil-5-nitropirimidin-6-il],Nα-[3'-(pirolidin-1"-ilmetil)-benzil]-glicinata 805.
[0251]
[0252] Rastvoru suspenzije sulfida 804 (3.68 g, 8.00 mmol) u EtOH-u (40 mL) na 0 °C su dodati natrijum tungstat dihidrat (792 mg, 2.40 mmol), sirćetna kiselina (4.6 mL, 80 mmol), i vodonik peroksid (3.4 mL, -40 mmol, 35% m/m in H2O) sekvencijalno. Posle 3 sata, dodatna sirćetna kiselina (4.6 mL) i vodonik peroksid (3.4 mL) su dodati. Reakcija je održavana na 0 °C tokom 16 sati. Zasićeni rastvor Na2SO3(50 mL) je dodat pažljivo u isto vreme na 0 °C što je praćeno sa CH2Cl2(75 mL). Slojevi su odvojeni, i vodeni sloj je ektrahovan sa CH2Cl2-om (4 x 50 mL). Kombinovani organski slojevi su osušeni preko MgSO4, filtrirani, i koncentrovani pod vakuumom da se obezbedi materijal koji sadrži jedinjenje 805 koje je korišćeno bez daljeg prečišćavanja.
e. Pripremanje jedinjenja 807. (R = n-butil)
[0253]
[0254] Rastvoru sulfona 805 (1.0 g, 2.0 mmol) u n-butanolu (10 mL) je dodat TFA (470 µL, 6.1 mmol). Reakcija je mešana na 100 °C tokom 1 sata. Reakciona smeša je sipana u zasićeni rastvor NaHCO3(20 mL) i CH2Cl2(30 mL). Slojevi su odvojeni, i vodeni sloj je ektrahovan sa CH2Cl2-om (30 mL). Kombinovani organski slojevi su osušeni preko MgSO4, filtrirani, i koncentrovani pod vakuumom. Prečišćavanje je sprovedeno silika gel hromatografijom (1 g supstrat/10 g SiO2) (2-15% MeOH/CH2Cl2) da se obezbedi jedinjenje 807.
Primer 9: Pripremanje jedinjenja 9 (iz US2010/0298257)
[0255]
Pripremanje izopropil estra (S)-2-{[(1R,4R,5R)-5-(2,4-Diokso-3,4-dihidro-2H-pyrimidin-1-il)-4-(R)-fluoro-3-hidroksi-4-metil-tetrahidro-furan-2-il-metoksi]-fenoksifosforilamino}-propionske kiseline (iz US2010/0298257 Primer 2)
[0256] Sinonim: 5'-O-(Izopropil-L-alanat, fenil fosforamidil)-2'-deoksi-2'-fluoro-2'-C-metiluridin diastereomerna smeša.
[0257] Sud sa 3 grla je opremljen sa mehaničkom mešalicom, ledenim kupatilom sa slanim rastvorom, unutrašnjim termometrom, i atmosferom azota. Sud je napunjen sa L-alanin izopropil estar hidrohloridom (82.0 g, 0.490 Mola) i anhidrovanim dihlormetanom (0.80 L). Dok je ovo mešano, fenil dihlorofosfat (85.0 g, 0.40 Mola) je dodat u jednoj seriji i promešan. Dok je unutrašnja temperatura održavana između -5 do 5 °C., rastvor N-metilimidazola (NMI, 250 g, 3.07 Mola) u dihlormetanu (250 mL) je dodat tokom perioda od pola sata. Rastvor je ostavljen da se meša tokom 1 h u ovom temperaturnom opsegu. 2'-Deoksi-2'-fluoro-2'-C-metil-uridin (3,80.0 g, 0.307 Mola) je dodat na 0° C. u jednoj porciji i zatim je reakcioni sud ostavljen da se zagreje polako u kupatilu sa slanim rastvorom. U 1 h, unutrašnja temperatura je bila do -2° C. TLC (5% Metanol u HCL-u) je u 1 h pokazao da je više od 50% nukleozida potrošeno. Kupatilo je uklonjeno i reakcioni sud je imao dostignutu ambijentalnu temperaturu tokom još 1 sata. TLC je posle 3 h i na 5 h ukupno pokazao da je 95% početnog nukleozida je potrošeno. Reakciona smeša je kvenčovana dodavanjem metanola (100 mL) i mešanjem reakcije 5 minuta.
[0258] Reakciona smeša je isprana sa 1N HCI-om (2x500 mL) što je praćeno sa zasićenim natrijum bikarbonatnim rastvorom (2x500 mL). Odvojen organski sloj je osušen preko anhidrovanog natrijum sulfata (50 g) i filtriran. Rastvor je evaporisan pod sniženim pritiskom i zatim pod visokim vakuumom do suva da se dobije sirov proizvod kao viskozno ulje (170 g). NMR-ovi sirovog proizvoda (<31>P i<1>H) su uzeti.<31>P-NMR je pokazao da je oko 1% ukupne integracije fosfora usled prisustva 3' izomera 5.
[0259] U sirov proizvod je dodat anhidrovan piridin (1700 mL). Rastvarač je evaporisan pod sniženim pritiskom i zatim pod visokim vakuumom u cilju da se smanji sadržaj vode u sirovoj smeši kroz ko-evaporaciju. Dobijeno ulje je ponovo rastvoreno u anhidrovanom piridinu (500 ml) i zatim je dodat višak t-butildimetilsilil hlorida (9.0 g, 60 mM). Reakcija je mešana na ambijentalnoj temperaturi. Progres reakcije je praćen pomoću UPLC/MS. Posle 3 sata, 3' nečistoća 5 nije više mogla biti detektovana i reakcija je kvenčovana dodavanjem metanola (50 mL).
[0260] Reakcija je evaporisana pod sniženim pritiskom do ulja. Ostatak je rastvoren u etil acetatu (1.5 L) i ispran sa 1N HCI-om (2x500 mL), što je praćeno sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata (2x500 mL). Organski sloj je osušen preko anhidrovan natrijum sulfata (50 g), filtriran i evaporisan pod sniženim pritiskom da se dobije sirov proizvod kao bledo žuto ulje.
[0261] Sirovo ulje je razblaženo istom zapreminom dihlormetana i naneto na 2.5 Kg silika gel kertridža n radijalni kompresioni modul pri vazdušnom pritisku od 100 psi. Korišćenjem gradijentne pumpe pri 60 psi i stopi protoka od 400 ml/min, kertridž je ispran sa metilen hloridom (4L) što je praćeno gradijentom 1-4% metanola u metilen hloridu (48 L). Većina glavnih nečistoća (di-(izopropilalanil) fenil fosfat, 3',5'-bis fosforamidat, 3'-fosforamidat-5'-TBDMS adukt (7)) eluirana je sa ∼3% gradijentom. Željeni proizvod je eluirao između 3 i 4% metanola. Frakcije koje sadrže proizvod su sortirane u dve serije. Prva je sadržala malu količinu gornjih nečistoća a druga je čist proizvod. Prvi set frakcija je sadržao male količine manje polarnih nečistoća (gornje nečistoće) kao što je 3',5'-bis fosforamidat i di-alanilfenil fosfat i uglavnom Rp diastereomer i zahtevao je drugo prečišćavanje kolonom. (Povezana terminologija, gornji u odnosu na donji se odnosi na eluciju na normalnoj fazi silika gel hromatografije, gde "gornji izomer" označava prvi eluirajući izomer.) Drugi set frakcija nije imao značajnu količinu nečistoća-samo preostali Rp i uglavnom Sp diasterereomere. On je kasnije rekombinovan sa frakcijama dva puta propuštenim kroz kolonu. Rastvarač je evaporisan pod sniženim pritiskom i dobijena bela pena je dalje osušena (0.20mmHg) tokom 1 h da se dobije 42 g nečiste serije (4:1 gornji u odnosu na donji izomer zasnovan na<31>P-NMR) i 38 g čiste serije (1:3 gornji u odnosu na donji izomer). Nečista serija je propuštena opet kroz kolonu na sličan način da se dobije 3.8 g 97% čistog gornjeg izomera (frakcija je stavljena na stranu) i 36 g čistog proizvoda u odnosu 4: 1. Dve glavne serije su rastvorene u HCL-u, kombinovane, evaporisane pod sniženim pritiskom i osušene (50° C., 0.2 mmHg, 24 h) da se dobije 74 g (45.7%) čistog proizvoda (Jedinjenja 9) sa diastereomernim odnosom od 48:51, kao bela pena, mp oko 75-85° C.
[0262] U cilju da se proizvede amorfna čvrsta supstanca diastereomerne smeše, 74 g bele pene je izmešano sa t-butil metil etrom (750 mL) dajući delimični ratsvor i gumasti čvrst ostatak. Dok se mešalo, heptani (750 mL) su dodavani polako i suspenzija je mehanički mešana tokom 1 sata dok veći deo gume nije konvertovan u belu čvrstu supstancu. Čvrsta supstanca je izgrebana sa spatulom i dobijena gusta masa je filtrirana. Čvrsta supstanca je isprana sa heptanima (4x50mL) i osušena pod vakuumom (50° C., 0.2mmHg, 24 h) da se dobije beo, amorfni prah (64 g) sa širokim opsegom topljenja od otprilike 70-80° C.<1>H i<31>P NMR je u skladu sa strukturom i HPLC je pokazao čistoću od 99.8% sa diastereomernim odnosom od 46:54 (takođe potvrđeno pomoću<31>P NMR).
[0263] Alternativna metoda za pravljenje čvsrte smeše Jedinjenja 9. Posle hromatografije, ostatak je ko-evaporisan sa dihlormetanom dva puta (5 mL/g) i osušen tokom 24 h na 35-40° C. na 35-45 mTorr-a. Ostatak pene je propušten kroz sito sa mrežom od 250 mikrona i dalje osušen pod istim uslovima dok preostali dihlormetan nije pao ispod 400 ppm kao što je izmereno pomoću „headspace“ GC (gasne hromatografije). Dobijeni fini prljavo beli do beli amorfni prah je imao temperaturni opseg staklenog prelaza od 53.7 do 63.5° C.
[0264] Karakterizacija Jedinjenja 9 (smeša izomera):
<1>H-NMR (CDCl3) 010.05 (brs, 1H, NH, Sp), 10.00 (brs, 1H, NH, Rp), 7.49 (d, 1H, C6-H, Sp), 7.36 (m, 5H, C6-H, Rp, aromatični), 7.23-7.14 (m, 6H, Rp/Sp, aromatični), 6.18 (br d, 2H, Cl'-H, Rp/Sp), 5.63 (d, 1H, C5-H, Sp), 5.58 (d, 1H, C5-H, Rp), 5.01 (m, 2H, CH-(CH3)2Rp/Sp), 4.46-4.33 (m, 8H, C-5'-H2, ala-NH, C3'-OH, Rp/Sp), 4.12 (m, 2H, ala-CHCH3, Rp/Sp), 4.01-3.85 (m, 4H, C3'-H, C4'-H, Rp/Sp), 1.391.22 (m, 12H, sav CH3, Rp/Sp).
<31>P-NMR (CDCl3) 03.60 (Rp), 3.20 Sp u odnosu na trifenilfosfat na -17.80 ppm. ES-MS M+1 530.2. Elementarna analiza: Izračunato % (uključujući 0.29% vode kao što je pronađeno pomoću Karl Fisher analize) C, 49.75; H, 5.54; N, 7.90, F, 3.58, P, 5.84. Pronađeno %: C, 49.50; H, 5.44; N, 7.85; F, 3.62; P, 6.05.
Pripremanje 2'-deoksi-2'-fluoro-2'-C-metiluridina (iz US2010/0298257 Primer 1)
[0265] U sud od 10 L, je dodat 3', 5'-O-dibenozil-2'deoksi-2'-fluoro-2'-C-metil-N4-benzoilcitidin (500 g, 0.874 mol) i 70% vodena sirćetna kiselina (7.5 L). Rastvor je zagrejan do refluksa (110° C.) tokom 20 h. TLC je pokazala kompletnu reakciju (RfO.6 u 5% metanola u dihlormetanu (HCL)). Smeša je ohlađena do ambijentalne temperature i razblažena sa vodom (2 L). Posle mešanja tokom 2 h, dobijeni precipitat je sakupljen pomoću filtracije i čvrsta supstanca je isprana sa vodom (5 L) i osušena u atmosferi na ambijentalnoj temperaturi tokom 12 h da se dobije 360 g (88%). Ovaj dibenzoiluridin intermedijer je korišćen direktno u sledećem koraku dodavanjem svega toga u sveže napravljen metanolski amonijak (5.4 L, približno 25%) na 0° C. Ova temperatura je održavana tokom 3 h i zatim ostavljena da se zagreje do 15° C. tokom 24 h. TLC pokazala je kompletnu reakciju (Rf 0.4 u 10% metanola u HCL-u). Reakciona smeša je filtrirana kroz komad Celite-a i koncentrovan pod sniženim pritiskom da se dobije sirov proizvod (216 g). Sirov proizvod je mešan sa etil acetatom (325 mL) tokom 3 h na ambijentalnoj temperaturi. Dobijena čvrsta supstanca je sakupljena pomoću filtracije i isprana sa etil acetatom (216 mL). Čvrsta supstanca je osušena pod vakuumom na ambijentalnoj temperaturi tokom 4 h da se dobije 160 g (78%) željenog proizvoda u 98.7% HPLC čistoće. 1H-NMR (DMSO-d6 ) 011.44 (br s, 1H, NH), 7.95 (d, 1H, C-6H), 5.97 (d, 1H, C-1'H), 5.64 (d, 1H, C-5H), 3.84-3.77 (m, 3H, C-5'-Ha, C-3'H. C-4'H), 3.63-3.60 (m, 1H, C5'-Hb), 1.23 (d, 3H, C-2'-CH3). ES-MS M-I 259.
Primer 10: Pripremanje jedinjenja 10 (iz US2010/0298257)
[0266]
[0267] Direktna precipitacija Jedinjenja 10 (iz US2010/0298257; Primer 4): U mešan rastvor L-alanine izopropil estar hidrohlorida (10.5 g, 61.5 mmol, azeotropno osušen, dva puta, sa 50 mL toluena svaki put) u dihlormetanu (100 mL) je dodat fenidihlorofosfat (7.5 mL, 50 mmol) na sobnoj temperaturi. Smeša je ohlađena do - 10° C. i zatim je dodat rastvor NMetilimidazola (30.5 mL, 384.3 mmol) u 30 mL dihlormetana tokom perioda od 30 min. Nakon završetka dodavanja, smeša je mešana između -10 i -15° C. tokom 1 h. U gornju smešu je dodat 2'-deoksi-2'-fluoro-2'-C-metiluridin (10 g, 38.4 mmol) (videti US2010/0298257 Primer 1) u jednoj količini i smeša je mešana ispod -10° C. tokom 3 h i zatim polako ostavljena da se zagreje do 20° C. (6 h). Smeša je mešana na ovoj temperaturi preko noći (15 h) i zatim je kvenčovana sa 10 mL metanola. Rastvarač je evaporisan i ostatak je ponovo rastvoren u EtOAc-u (200 mL). EtOAc-ni sloj je ispran sa vodom (100 mL), 1N HCl-om (3x75 mL), 2% vodenim NaHCO3rastvorom (50 mL) i slanim rastvorom (50 mL). Organski sloj je osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan. Ostatak je osušen pod visokim vakuumom tokom 2 h da se dobije bela pena (22 g).
[0268] Gornja pena je rastvorena u 33 mL HCI-a i zatim je dodato 65 mL izopropil etra da se dobije zasićeni rastvor. Rastvor je filtriran kroz mali uložak od Celite-a i filtrat je mešan sa zrncima Jedinjenja 10 tokom 72 h na ambijentalnoj temperaturi (oko 22° C.-uočiti da je hlađenje suspenzije na 0° C. dovelo do izdvajanja ulja iz sirovog proizvoda). Bela čvrsta supstanca je filtrirana, isprana sa izopropil etrom (20 mL) i osušena da se dobije 4.58 g (∼85:15 smeša Jedinjenja 10: R izomer na P redom kao što je određeno pomoću<31>P NMR) belog praha. Gornja čvrsta supstanca je suspendovana u 23 mL HCL-a i zatim refluksovana tokom 3 h. Smeša je ohlađena do sobne temperature i mešana tokom 15 h. Bela čvrsta supstanca je filtrirana, isprana sa 4.5 mL hladne HCI i osušena pod visokim vakuumom na 45° C. da se dobije čisto Jedinjenje 10, mp 93.9-104.7° C HPLC čistoće 99.74% (3.11 g, 15.2% iz uridin nukleozida).
[0269] Jedinjenje 10:<1>H-NMR (CDCl3) δ 8.63 (brs,<1>H, NH), 7.47 (d, 1H, C6-H), 7.30 (m, 2H, o-aromatični), 7.26-7.18 (m, 3H, m,p-aromatični), 6.18 (br d, IH, Cl'-H), 5.70 (d, IH, C5-H), 5.02 (sept, CH-(CH3)2), 4.53 (m, 2H, C-5'-H2), 4.11 (d, IH, C3'-H), 3.97 (m, 3H, C3'-OH, C4'-H, ala-CH-CH3), 3.77 (br s, IH, ala-NH), 1.39 (d, 3H,C2'- CH3), 1.37 (d, 3H, ala- CH3) 1.24 (d, 6H, CH-(CH3)2).
Primer 11: Pripremanje jedinjenja 11 (iz US 2010/0081628)
[0270]
Sinteza 6-Etoksi-9-((4aR,6R,7R,7aR)-7-f1uoro-2-izopropoksi-7-metil-2-okso-tetrahidro-2,5-furo[3,2-d][1 ,3,2]dioksafosfinin-6-il)-9H-purin-2-il-amina (Jedinjenje 11) (Jedinjenje 19, US 2010/0081628)
[0271] (2R,3R,4R,5R)-5-(2-Amino-6-etoksi-purin-9-il)-4-f1uoro-2-hidroksimetil-4-metiltetrahidrofuran-3-ol (150 mg, 0.46 mmol) je rastvoren u anhidrovanom piridinu (2 ml) na 0° C. Rastvor 0.45 M IH-tetrazola u acetonitrilu (2.55 mL) je dodat što je praćeno sa bis (N,N-diizopropilamino) izpropilfosforamiditom (0.16 mL, 0.55 mmol, 1.2 ekv). Smeša je ostavljena da se polako zagreje do ambijentalne temperature preko 3 h. TLC je pokazala kompletnu reakciju. Reakcija je kvenčovana nakon dodavanja vode (0.1 mL). Reakcioni rastvor je koncentrovan pod sniženim pritiskom i zatim je ostatak triturisan sa etil acetatom (5 mL). Dobijeni beli talog je uklonjen filtracijom i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom.
[0272] Dobijeni intermedijerni ciklični fosfitni ostatak je rastvoren u acetonitrilu (2 mL) i zatim tretiran sa t-butil hidroperoksidom (70% u vodi, 0.19 mL) tokom 5 h na ambijentalnoj temperaturi. TLC je pokazala kompletnu reakciju. Reakcioni rastvor je koncentrovan pod sniženim pritiskom i ostatak je prečišćen kolonskom hromatografijom (Analogix korišćenjem gradijenta od 0 do 5% IPA u HCL-u). Dva diastereomera (Jedinjenje 11 i R-izomer na P) su odvojivi. Frakcije koje sadrži svaki diastereomer su odvojeno kombinovane i koncentrovane pod sniženim pritiskom do belih čvrstih supstanci da se dobije 20 mg svakog diastereomera (kombinovan prinos 20%).
[0273] Jedinjenje 11
<31>P_NMR (162 MHz, DMSO): δ-6.49;
<1>H-NMR (400 MHz, DMSO): δ =8.17 (s, 1H), 6.47 (bs, 2H), 6.27 (d, J=21.2 Hz, 1H), 4.73-4.62 (m, 4H), 4.45 (q, J=7.0 Hz, 2H), 4.27-4.21 (m, 1H), 1.39-1.34 (m, 9H), 1.20 (d, J=22.8 Hz, 3H).
MS (ESI): m/z 432.4 [M+H]<+>
[0274] R-izomer na P
<31>P_NMR (162 MHz, DMSO): δ =-4.68;
<1>H -NMR (400 MHz, DMSO): δ =8.15 (s, 1H), 6.63 (s, 2H), 6.27 (d, J=21.2 Hz, 1H), 4.74-4.58 (m, 4H), 4.45 (q, J=6.4 Hz, 2H), 4.42-4.37 (m, 1H), 1.36 (t, J=7.2 Hz, 3H), 1.32 (d, J=3.6 Hz, 3H), 1.30 (d, J=3.6 Hz, 3H), 1.22 (d, J=22.8 Hz, 3H).
MS (ESI): m/z 432.4 [M+H]<+>
[0275] Strukture za Jedinjenje 11 i R-Izomer na P su predstavljene ispod.
Sinteza (2R,3R,4R,5R)-5-(2-amino-6-etoksi-9H-purin-9-il)-4-f1 uoro-2-(hidroksimetil)-4-metiltetrahidro-furan-3-ola (Jedinjenje 16, US 2010/0081628)
[0276] U suv sud sa okruglim dnom od 500 mL je napunjen (2R,3R,4R,5R)-5-(2-amino-6-hloro-9H-purin-9-il)-2-(benzoiloksimetil)-4-fluoro-4-metiltetrahidrofuran-3-il benzoat (11 g, 20.92 mmol). Anhidrovan apsolutni etanol (210 mL) je dodat i nakon njega anhidrovani K2CO3(28.91 g, 209.2 mmol). Suspenzija je mešana i zagrejana na 75° C pod azotom tokom 5.5 h. Sav početni materijal je potrošen u to vreme pomoću TLC testa. Smeša je ohlađena do sobne temperature i čvrsta supstanca je izfiltrirana. Filtrat je neutralisan dodavanjem glacijalne sirćetne kiseline (2.52 g) do pH∼7 i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je rastvoren u metanolu i pomešan sa silika gelom (15 g). Osušena smeša sirovog proizvoda i silika gela je prebačena u prazan kertridž i izdvojena putem kolonske hromatografije (Analogix 220 g, gradijent od 0 do 15% MeOH u DCM-u) da se dobije proizvod (5% MeOH u DCM-u) kao bela penasta čvrsta supstanca (3.73 g, 54.5%). Druga bela čvrsta supstanca je izolovana iz kolone (10% MeOH u DCM-u, 1.44 g) i to je smeša dva dimera nukleozida. Polarnija, treća bela čvrsta supstanca je sakupljena iz kolone (15% MeOH u DCM-u, 0.47 g) i to je smeša trimera nukleozida. HPLC čistoća proizvoda 99.94%.
[0277]<1>H-NMR (DMSO-d6): δ 8.16 (s, IH, 8-H), 6.55 (s, 2H, NH2), 6.04 (d, IH, C1'-H), 5.66 (d, IH, 3'-OH), 5.24 (m, IH, 5'-OH), 4.44 (q, 2H, 6-0CH2), 4.23-4.08 (m, IH, C3'-H), 3.913.82 (m, 2H, C4'-H i C5'-Ha,), 3.71-3.66 (m, IH, C5'-Hb), 1.36 (t, 3H, CH3of etil), 1.06 (d, 3H, C2'-CH3).
Sinteza (2R,3R,4R,5R)-5-(2-amino-6-hloro-9H-purin-9-il)-2-(benzoiloksimetil)-4-fluoro-4-metiltetrahidrofuran-3-il benzoata (Jedinjenje 12, US 2010/0081628)
[0278] Sud sa tri grla i okruglim dnom od 12 L je napunjen sa 6-hloro-2-aminopurinom (225.4 g, 1.329 mol). Anhidrovan terc-BuOH (4.5 L) je dodat i rastvor je mešan mehaničkom mešalicom na ambijentalnoj temperaturi. Kalijum terc-butoksid (solid, 151.6 g, 1.35 mol) je dodat u porcijama pod strujom azotnog gasa uz mešanje. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom dodatnih 30 min. U sud sa okruglim dnom od 5 L je sipan α-bromid (10, 197 g, 0.451 mol) i 3 L anhidrovanog acetonitrila na ambijentalnoj temperaturi. Bromidni rastvor je dodavan u suspenziju purinske baze preko 1 min na ambijentalnoj temperaturi. Sud od 5 L je ispran sa acetonitrilom (2x1 L) da bi se prebacio bromid kompletno u reakcionu smešu. Smeša je zagrejana postepeno do 50° C. preko 2 h sa grejačem i kontrolorom, i mešana je tokom 20 h. Reakcija je bila skoro kompletna kako je pokazano pomoću TLC beta (Rf0.28, 30% EtOAc u heksanima). Reakcija je kvenčovana dodavanjem zas. NH4CI (200 mL) da bi se formirala suspenzija. Suspendovana čvrsta supstanca je uklonjena filtracijom kroz uložak od Celite-a od 3 cm u 2.5 L porcelanskom Buchner levku. Čvrsta supstanca je isprana sa toluenom (3x100 mL). Kombinovan filtrat je neutralisan dodavanjem 6 N HCI rastvora do pH 7 (približno 220 mL). Smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Kada je zapremina smeše smanjena na oko jednu trećinu zapremine, dodatna istaložena čvrsta supstanca je uklonjena filtracijom na sličan način. Filtrat je dalje koncentrovan do zapremine od oko 800 mL. Ostatak se sipa na kolonu sa čepom (1.6 kg silika gel fleš klase u Buchner levku od sinterovanog stakla od 6 L) i eluiran (sukcijom) sa gradijentom od 10% etil acetata u heksanima (6 L) da se uklone ne-polarne nečistoće, 30% etil acetata u heksanima da se dobije mala količina laktola (6 L), i zatim 40%-45% etil acetata u heksanima (4 L) da se eluira glavna količina proizvoda. Frakciej koje sadrže proizvod su kombinovane, koncentrovane i pod sniženim pritiskom i osušene pod vakuumom (0.2 mmHg, 24 h, ambijentalne temp.) do bele penaste čvrste supstance (150.7 g, β/α=14:1 by NMR.<1>H-NMR. (CDCl3)beta: δ=1.33 (d, 22.4 Hz, 2'-C-CH3), alfa: 1.55 (d, 22 Hz, 2'-C-CH3).
[0279] Pena smeše proizvoda je rastvorena u metanolu (700 mL) na ambijentalnoj temperaturi. Nakon što je odstojala, čvrsta supstanca je polako formirana tokom 2 h. Suspenzija je ohlađena u zamrzivaču na -5° C. tokom 17 h. Dobijena bela čvrsta supstanca je sakupljena pomoću filtracije i isprana sa hladnim MeOH-om (-5° C 3x60 mL) i etil etrom (3x100 mL). Čvrsta supstanca je osušena pod vakuumom (0.2 mmHg, 24 h, ambijent temp.) da se dobije 110.5 g β-proizvoda sa odličnim de (β/α 99.8:1 pomoću HPLC). Filtrat je delimično koncentrovan (otrpilike 400 mL) i zatim razblažen sa još MeOH (400 mL) dok je zagrevan do 60° C. Rastvor je ohlađen do ambijentalne temperature, zasejan i ohlađen do -5° C. Drugi prinos je sakupljen, ispran i osušen na sličan način da se dobije više proizvoda kao bela čvrsta supstanca (12.26 g) sa sličnom diastereomernom čistoćom. Matična tečnost je koncentrovana do suva pod sniženim pritiskom (približno 25 g). Ostatak je smeša β i αizomera. Podvrgnut je automatskoj silika gel kolonskoj hromatografiji (Analogix, 240 g kertridža, 40% do 50% etil acetata u heksanima) da se dobije 14.52 g pene proizvoda koji je ponovo kristalisao iz MeOH-a, ispran i osušen na sličan način da se dobije dodatnih 8.46 g proizvoda velike čistoće.
[0280] Procenjeno je da tri čvrste supstance imaju sličnu čistoću i one su kombinovane da se dobije 131.2 g belog kristalog proizvoda, (55% iz bromošećera, 49% iz laktola). Mp 160.5-162.0° C. HPLC čistoća 99.5% uključujući 0.20% alfa.
<1>H-NMR (čist β-anomer, CDCl3): δ=8.03 (m, 2H, arom.), 7.93 (m, 2H, arom.), 7.88 (s, 1H, C8-H), 7.60 (m, 1H, arom.), 7.50 (m, 1H, arom.), 7.44 (m, 2H, arom.), 7.33 (m, 2H, arom.), 6.44 (dd, 1H, Cll'-H), 6.12 (d, 1H, C3'-H), 5.35 (s, 2H, NH2), 5.00 (dd, 1H, C5'-Ha), 4.76 (m, 1H, C4'-H), 4.59 (dd, 1H, C5'-Hb), 1.33 (d, 3H, CH3).
Primer 12: Pripremanje jedinjenja 12 (iz US20110015146)
[0281]
Sinteza (2S)-izopropil2-((((2R,3R,4R,5R)-5(2-amino-6-metoksi-9H-purin-9-il)-4-fluoro-3hidroksi-4-metiltetrahidrofuran-2-il)metoksi) (fenoksi) fosforilamino)propanoata [0282] U suv sud sa okruglim dnom od 250 mL su sipani fenil dihlorofosfat (2.66 g, 12.61 mmol) i anhidrovan dihlormetan (40 mL). So amino estra (2.60 g, 15.53 mmol) je dodata u rastvor i smeša je ohlađena do -5° C. N-Metil imidazol (7.7 mL, 97 mmol) je zatim dodat brzo putem suvog šprica na -5° C. i rastvor je mešan na -5° C. tokom 1 h. Nukleozid ((2R,3R,4R,5R)-5-(2-amino-6-metoksi-9H-purin-9-il)-4-fluoro-2-(hidroksimetil)-4-metiltetrahidrofuran-3-ol), 3.04 g, 9.7 mmol) je dodat iz bočice u jednoj porciji na -5° C. i čvrsta supstanca je polako rastvorena u 20 minuta. Reakciona temperatura je ostavljena da se podigne do ambijentalne temperature tokom 2 h. Posle 17 h, reakcija nije kompletna. Više reagenasa je napravljeno (iz fosfata (2.66 g), aminoestra (2.60 g), i N-Metil imidazola (3.8 mL, 48 mmol)) i dodati su u reakcionu smešu na -5° C. Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi još 2 sata. Reakcija je skoro kompletna kako je pokazano rezultatom TLC-a i razblažena je sa 70 mL dihlormetana. HCI rastvor (1 N, 70 mL) je dodat. Vodeni sloj je odvojen i ektrahovan sa dihlormetanom. Organski sloj je ispran sa zasićenim NaHCO3, vodom, slanim rastvorom i osušen preko MgSO4. Posle uklanjanja rastvarača pod sniženim pritiskom, lepljivi ostatak je prečišćen putem automatske kolonske hromatografije korišćenjem 240 g kertridža i gradijenta od 0-8% 2-PrOH u dihlormetanu da se dobije proizvod kao penasta čvrsta supstanca (4.16 g, 7.14mmol, 73% prinos). HPLC čistoća 97.4%. NMR spektar proizvoda pokazao je da je to smeša dva diastereoizomera sa odnosom od 1.2:1.
<1>H-NMR (DMSO-d6): δ=7.98 (1H, s, 8-H jednog izomera), 7.95 (1H, s, 8-H drugog izomera), 7.37-7.32 (2H, m, arom-H), 7.22-7.15 (3H, m, arom-H), 6.6 (2H, s, NH2), 6.11 (1H, d, Cl'-H jednog izomera), 6.09 (1H, d, Cl'-H drugog izomera), 6.09-5.98 (1H, m, amid NH), 5.88 (1H, d, 3'-OH jednog izomera), 5.81 (1H, d, 3'-H drugog izomera), 4.85-4.75 (1H, hepta, metin H izo-propila), 4.46-4.27 (2H, m, C4'-H, α-H amino estra), 4.15-4.07 (1H, m, C3'-H), 3.96 (3H, s, OCH3), 3.82-3.72 (2H, m, C5'-Hai C5'Hb), 1.23-1.06 (9H, m, CH3's amino estra), 1.03 (3H, d,C2'-CH3).
<31>P-NMR (DMSO-d6 ): 0=4.91 (jedan izomer), 4.72 (drugi izomer).
[0283] Alternativna metoda prečišćavanja je da se hemijski izmeni manji 3' fosforamidat sporedni proizvod da bi se pojednostavila hromatografska separacija. Sirov fosforamidat proizvod je rastvoren u anhidrovanom piridinu (5 mL/g), i tretiran je sa 0.5 molarnim ekvivalentima t-butildimetilsilil hlorida na ambijentalnoj temperaturi da bi reagovao selektivno sa slobodnim 5' primarnim hidroksilom 3' izomerne nečistoće. Progres reakcije može biti praćen pomoću LC/MS. Kada je 3' izomer konvertovan u 5'-tBDMS-3'-fosforamidatni derivat, reakcija se kvenčuje sa metanolom (3 ekv), koncentriše pod sniženim pritiskom, deli između etil acetata i 5% limunske kiseline i zatim se organski sloj koncentriše. Ostatak je zatim podvrgnut hromatografiji koja sada može biti odrađena uz brže nanošenje i brži gradijent i može se postići viša čistoća.
Primer 13: Pripremanje jedinjenja 13 (iz US20110015146)
[0284]
Primer 14: Pripremanje jedinjenja 14 (iz US 7,964,580, Primer 5)
[0285]
Pripremanje 2'-Deoksi-2'-fluoro-2'-C-metiluridin-5'-fenil metoksi-alanil fosfata)
[0286] Fenil metoksialaninil fosforohloridat (1 g, 6.5 ekv) rastvoren u 3 mL THF-a je dodat u smešu 2'-Deoksi-2'-fluoro-2'-C-metiluridina (0.15 g, 1 ekv) i N-metilimidazola (0.3 g, 8 ekv) u 3 mL THF-a uz energično mešanje na sobnoj temperaturi, zatim je reakcija mešana preko noći. Rastvarač je uklonjen pomoću sniženog pritiska. Dobijeni sirov proizvod je rastvoren u metanolu prečišćen pomoću prep-HPLC na YMC 25x30x2 mm koloni korišćenjem mobilne faze voda/acetonitril sa gradijentom elucije. Acetonitril i voda su uklonjeni pod sniženim pritiskom da se dobije željeni proizvod (50.1 mg, 15.6%).<1>H NMR (DMSO-d6 ) δ 1.20-1.27 (m, 6H), 3.58 (d, J=16.0 Hz, 3H), 3.75-3.92 (m, 2H), 4.015-4.379 (m, 2H), 5.54 (t, J=10.2 Hz, 1H), 5.83-5.91 (m, 1H), 6.00-616 (m, 1H), 7.18 (d, J=8.0 Hz, 2H), 7.22 (s, 1H), 7.35 (t, J=4.4 Hz, 2H), 7.55 (s, 1H), 11.52 (s, 1H); MS, m/e 502 (M+1)<+>. Primer 15: Pripremanje jedinjenja 15 (Primer 55, iz US 7,964,580)
[0288]<1>H NMR (DMSO-d6) δ> 1.20-1.44 (m, 12H), 1.60-1.71 (m, 4H), 3.75-4.02 (m, 2H), 3.94-4.02 (m, 1H), 4.19-4.26 (m, 2H), 4.59-4.61 (m, 1H), 5.57 (t, J = 8.4 Hz, 1H), 5.85-6.06 (m, 3H), 7.17-7.23 (m,4H), 7.54 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 11.50 (s, 1H); MS, m/e 587.92 (M 1)<+>
[0289] Opšta procedura za nukleozid fosforamidat derivate je prijavljena na koloni 461 iz US 7,964,580. Rastvor odgovarajućeg fosforohloridata (6.5 ekvivalenata) u anhidrovanom tetrahidrofuranu (THF) može biti dodat u smešu nukleozida (1 ekvivalent) i N-metilimidazola (8 ekvivalenti) u anhidrovanom THF-u uz snažno mešanje na sobnoj temperaturi sa sa mešanjem reakcione smeše preko noći. Rastvarač može biti uklonjen u vakuumu i sirov deo prečišćen kolonskom hromatografijom i/ili preparativnom tankoslojnom hromatografijom da bi se dobilo željeno jedinjenje.
Primer 16: Pripremanje jedinjenja 16 (iz US 7,429,572)
[0290]
Sinteza (2'R)-2'-Deoksi-2'-Fluoro-2'-C-Metilcitidina počevši od citidina
[0291] Korak 1: Suspenziji citidina (100 g, 0.411 mol) u DMF-u (2.06 L) je dodat anhidrid benzoeve kiseline (102.4 g, 0.452mol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 20 h. DMF je uklonjen u vakuumu i ostatak je triturisan sa dietil etrom. Dobijena čvrsta supstanca je sakupljena pomoću filtracije sukcijom i isprana je sa dietil etrom (2x200 mL). Dalje sušenje u vakuumu na sobnoj temperaturi dalo je N<4>benzamid (140.6 g, 98.3%). Porcija ovog materijala (139.3g, 0.401 mol) je rastvorena u anhidrovanom piridinu (1.2 L) i tretirana je sa 1,3-dihloro-1,1,3,3 -tetraizopropil-disiloksanom (141.4 mL, 0.441 mol) na sobnoj temperaturi. Rastvor je mešan na sobnoj temperaturi preko noći. Smeša je koncentrovana skoro do suva u vakuumu i koevaporisana sa toluenom (3x200 mL). Ostatak je tretiran sa EtOAc-om (1.8L) i ispran sa HCI (2x200 mL, 0.05 N), NaHCO3(5%, 2x400 mL). Organski sloj je ispran, osušen (Na2SO4), filtriran, i evaporisan do suva. Jedinjenje 16-1 (Jedinjenje 4-1 iz US 7,429,572) (256.5 g, >100%) je izolovano kao bela pena i korišćeno bez daljeg prečišćavanja.
[0292] Korak 2: Jedinjenje 16-1 (236.5 g, 0.40 mol) je rastvoreno u suvom THF-u (1.22 L). Anhidrovan DMSO (180.8 mL, 2.1 mol) je dodat i dobijeni rastvor je ohlađen do između -20°C. i -15° C. Anhidrid trifluorosirćetne kiseline (90.6 mL, 0.64 mol) je dodavan u kapima tokom 45 minuta i rastvor je mešan između -20° C i -15° C. tokom 2 sata posle čega je anhidrovan trietilamin (223.5 mL, 1.6 mol) dodavan tokom 20 min. Sirova reakcija koja sadrži keton 16-2 je rastvorena u EtOAc-u (500 mL), i dobijeni rastvor je ispran sa H2O (3x400 mL), osušen (Na2SO4) i rastvarači su uklonjeni u vakuumu da se dobije žuta čvrsta supstanca koja je prečišćena na silika gel koloni eluiranjem sa postepenim gradijentom Et2O (0-60%) u heksanima što je praćeno sa postepenim gradijentom EtOAc (50-100%) u heksanima. Sirov keton tako-dobijen (∼192 g) je kristalisao iz petrolej etra da bi se dobio keton 16-2 (Jedinjenje 4-2 iz US 7,429,572) (138.91 g, 57.5% iz citidina) kao bela čvrsta supstanca i 22 g neizreagovanog početnog materijala, 16-1, kao žuta čvrsta supstanca.
[0293] Korak 3: Jedinjenje 16-2 (48.57 g, 8.26 mmol) je rastvoreno u anhidrovanom toluenu (∼400 mL) i rastvarač je uklonjen u vakuumu sa isključenjem vlage. Ostatak je zatim dalje osušen u vakuumu (uljana pumpa) tokom još 2 sata. Sa striktnim isključenjem vlage, preostala pena je rastvorena u anhidrovanom dietil etru (1.03 L) pod argonom. Dobijeni rastvor je ohlađen do -78° C. pod argonom i MeLi (1.6 M, 258.0 mL, 0.413 mol) je dodavan u kapima pomoću levka za dodavanje. Nakon što je dodavanje završeno, smeša je mešana tokom 2 h na -78° C. Vodeni 1M NH4Cl (500 mL) je dodat polako. Posle zagrevanja do sobne temperature, smeša je isprana sa H2O (2x500 mL), osušena (Na2SO4), i zatim koncentrovana do suva da se dobije braon pena (∼60 g, >100%).
[0294] Reakcija je izvedena dva puta korišćenjem 37.62 g i 56.4 g Jedinjenja 16-2. Kombinovani sirovi proizvodi (128.0 g, 0.212 mol) su rastvoreni u THF-u (1.28 L) i tretirani sa konc. HOAc (23 mL, 0.402 mol). U rastvor je dodat TBAF (384.0 mL, 1 M u THF-u). Rastvor je mešan na sobnoj temperaturi tokom 0.75 h i smeša je tretirana sa silika gelom (750 g) i koncentrovana do suva. Prah je postavljen na silika gel kolonu pakovanu sa CH2Cl2. Elucija sa 1:7 EtOH-CH2Cl2dala je tamnu voskastu čvrstu supstancu koja je prethodno adsorbovana na silka gel (300 g) i podvrgnuta hromatografiji kao ranije. Jedinjenje 16-3 (Jedinjenje 4-3 iz US 7,429,572) (46.4 g, 53.0% from 16-2) je izolovano kao prljavo bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (DMSO-d6): δ 1.20 (s, 3H, CH3), 3.62-3.69 (m, 2H,), 3.73-3.78 (m, 2H,), 5.19 (t, 1H, J=5.4 Hz, OH-5'), 5.25 (s, 1H, OH-2'), 5.52 (d, 1H, J=5.0 Hz, OH-3'), 5.99 (s, 1H, H-1'), 7.32 (d, 1H, J=5.8 Hz), 7.05 (Ψt, 2H, J=7.7 Hz), 7.62 (Ψt, 1H, J=7.3 Hz), 8.00 (d, 2H, J=7.3 Hz), 8.14 (d, 1H, J=6.9 Hz), 11.22 (s, 1H, NH). Anal. Izračunato za C17H19N3O6.0.5 H2O: C, 55.13; H, 5.44; N, 11.35. Pronađeno: C, 55.21; H, 5.47; N, 11.33.
[0295] Korak 4: Jedinjenje 16-3 (46.0 g, 0.13 mol) je rastvoreno u anhidrovanom piridinu i koncentrovano do suva u vakuumu. Dobijeni sirup je rastvoren u anhidrovanom piridinu pod argonom i ohlađen do 0°C. uz mešanje. Braon rastvor je tretiran sa benzoil hloridom (30 mL, 0.250 mol) u kapima preko 10 min. Ledeno kupatilo je uklonjeno i mešanje je nastavljeno 1.5 h pri čemu je TLC pokazala da nije preostalo početnog materijala. Smeša je kvenčovana dodavanjem vode (5 mL) i koncentrovana je do suva. Ostatak je rastvoren u minimalnoj količini CH2Cl2i ispran sa zas.NaHCO3(1x500 mL) i H2O (1x500mL). Organska faza je osušena (Na2SO4) i filtrirana, koncentrovana do suva i podvrgnuta hromatografiji na silika gelu eluiranjem sa postepenim gradijentom EtOAc-heksani (25-60%) da se obezbedi jedinjenje 16-4 kao žuta pena (Jedinjenje 4-4 from US 7,429,572) (48.5 g, 67%).<1>H NMR (CDCl3): δ 1.64 (s, 3H, CH3), 4.50 (m, 1H, H-4), 4.78-4.85 (m, 2H, H-5',5a'), 5.50 (d, IH, J=3.4 Hz, H-3'), 6.42 (s, IH, H-1), 7.44-7.54 (m, 7H, Ar), 7.57-7.66 (m, 3H, Ar), 7.94 (d, 2H, J=7.8 Hz), 8.05-8.09 (m, 4H, Ar), 8.21 (d, 1H, J=7.3 Hz). Anal. Izračunato za C31H27N3O8: C, 65.37; H, 4.78; N, 7.38.
Pronađeno: C, 65.59; H, 4.79; N, 7.16.
[0296] Korak 5: Jedinjenje 16-4 (7.50 g, 0.013 mol) je rastvoreno u anhidrovanom toluenu (150 mL) pod argonom i ohlađeno je do -20° C. DAST (2.5 mL, 18.9 mmol) je dodat polako i kupatilo za hlađenje je uklonjeno nakon što je dodavanje završeno.
[0297] Mešanje je nastavljeno tokom 1 h i smeša je sipana u zas. NaHCO3(100 mL) i isprana dok nije pekinuta evolucija gasa. Organska faza je osušena (Na2SO4), koncentrovana, i prečišćena silika gel hromatografijom eluiranjem sa 1: 1 EtOAc-heksani. Prinos je 1.22 g (16.3%) čistog 16-5 (Jedinjenje 4-5 iz US 7,429,572 kao bela čvrsta supstanca. mp 241° C. (CH2Cl2-heksani);<1>H NMR (CDCl3): δ 1.49 (d, 3H, J=22.4 Hz, CH3), 4.64 (dd, 1H, J=3.44, 12.9 Hz, H-5'), 4.73 (d, 1H, J=9.5 Hz, H-4'), 4.90 (dd, 1H, J=2.4, 12.7 Hz, H-5a'), 5.56 (dd, 1H, J=8.6, 20.7 Hz, H-3'), 6.52 (d, 1H, J=18.0 Hz, H-1'), 7.47-7.57 (m, 7H, Ar), 7.62-7.71 (m, 3H, Ar), 7.89 (d, 2H, J=6.9 Hz), 8.07-8.11 (m, 5H, Ar), 8.67 (bs, 1H, NH).<19>F NMR (CDCl3): δ 3.3 (m). Anal. Izračunato za C31H26FN3O7.O.7 H2O: C, 63.74; H, 4.72; N, 7.20. Pronađeno: C, 63.71; H, 4.54; N, 7.20. Korak 6: Jedinjenje 16-5 (6.30 g, 0.011 mol) je suspendovano u metanolskom amonijaku (približno 7 N, 150 mnL) i mešano je na sobnoj temperaturi preko noći. Rastvarač je uklonjen u vakuumu, ko-evaporisan sa metanolom (1x20 mL), i prethodno adsorbovan na silika gelu. Beli prah je postavljen na silika gel kolonu (pakovanu sa CHCl3) i kolona je eluirana sa 9% EtOH u CHCl3-u, zatim 17% EtOH i konačno 25% EtOH u CHCl3-u. Koncentracija frakcija koje sadrže proizvod, filtracija kroz disk od 0.4 1 am, i liofilizacija iz vode dali su jedinjenje 16-6 (Jedinjenje 4-6 iz US 7,429,572), 2.18 g (76%).<1>H NMR (DMSO-d6): δ 1.17 (d, 3H, J=22.3 Hz, CH3), 3.63 (dd, 1H, J=2.7, 13.7 Hz, H-5'), 3.70-3.84 (m, 3H, H-3', H-4', H-5a'), 5.24 (app s, 1H, OH-3'), 5.60 (d, 1H, J=5.4 Hz, H-5'), 5.74 (d, 1H, J=7.71 Hz, H-5), 6.07 (d, 1H, J=18.9 Hz, H-1'), 7.31 (s, 1H, NH2), 7.42 (s, 1H, NH2), 7.90 (d, 1H, J=7.3 Hz, H-6).<19>F NMR (DMSO-d6): δ 2.60 (m). Anal. Izračunato za C10H14FN3O4.4.1.4 H20: C, 44.22; H, 5.95; N, 14.77. Pronađeno: C, 42.24; H, 5.63; N, 14.54. Jedinjenje 16-6 (0.10 g, 0.386 mmol) je konvertovano u hidrohloridnu so rastvaranjem u vodi (2 mL) i podešavanjem pH do približno 3.0 sa 1 M HCI. Voda je uklonjena u vakuumu i ostatak je kristalisao iz vodenog EtOH da se dobije 16-6 kao hidrohloridna so (71.0 mg). mp 243° C. (dec);<1>H NMR (DMSO-d6): δ 1.29 (d, 3H, J=22.6 Hz, CH3), 3.65 (dd, 1H, J=2.3, 12.7 Hz, H-5'), 3.76-3.90 (m, 3H, H-3', H-4', H-5a'), 5.96 (d, 1H, J=17.3 Hz, H-1'), 6.15 (d, 1H, J=7.9 Hz, H-5), 8.33 (d, 1H, J=7.9 Hz, H-6), 8.69 (s, 1.5H, NH), 9.78 (s, 1.5H, NH).<19>F NMR (DMSO-d4): δ 1.69 (m). Anal. Izračunato za C10H14FN3O4.HCl: C, 40.62; H, 5.11; N, 14.21. Pronađeno: C, 40.80; H, 5.09; N, 14.23.
BIOLOŠKI PRIMERI
Protokol testa
Replikon test visoke propusne moći (High throughput replicon assay - HTBS)
[0298] Ćelije replikona koje nose H77 (genotip 1a) ili Con1 (genotip 1b) HCV RNK i Renilla luciferazni reporter su zasađene u crne ploče sa 384 bunarića pri gustini od 1.6 × 103 ćelija po bunariću u 90 µl DMEM medijuma za kulture, isključujući G-418. Jedinjenja su serijski razblažena u 100% DMSO i dodata u ćelije u razblaženju 1:225, postižući finalnu koncentraciju od 0.44% DMSO u ukupnoj zapremini od 90 µL sa radnom stanicom Biotek µFlow Workstation. Ploče sa ćelijama su inkubirane na 37°C sa 5% CO2 tokom 3 dana, posle šega je medijum za kulturu uklonjen i ćelije su ispitane na aktivnost luciferaze kao marker za nivo replikacije. Ekspresija luciferaze je izmerena korišćenjem reagenasa za Dual-Glo luciferaznog testa (Promega, Madison, WI). Ukratko, 20 µL Dual-Glo luciferaznog pufera je dodato da se liziraju ćelije tokom 10 min i zatim 20 µL razblaženog Dual-Glo Stop & Glo supstrata (1:100) je dodato u svaki bunarić. Luminescentni signal je meren na Perkin Elmer Envision čitaču ploča posle inkubacije tokom 10 minuta. Nivoi luciferaze su konvertovani u procente u odnosu na netretirane kontrole (definisani kao 100%) i podaci su podešeni prema logističkoj jednačini doznog odgovora y = a/(1+(x/b)c) korišćenjem XLFit4 softvera (IDBS, Emeryville, CA). EC50vrednosti su izračunate iz rezultujućih jednačina. Alternativno, antivirusna aktivnost može biti analizirana pomoću određivanja IC50HCV NS3 Proteaze. HCV NS3 proteazna aktivnost je praćena korišćenjem depsipeptidnog supstrata fluorescentnog rezonantnog energetskog transfera (FRET) (RET S1, Anaspec, San Jose, CA) na osnovu metode od Taliani, Taliani M, Bianchi E, Narjes F, Fossatelli M, Urbani A, Steinkuhler C, et al. A continuous assay of hepatitis C virus protease based on resonance energy transfer depsipeptide supstrats. Anal. Biochem. 1996; 240 (1):60-7, što se tiče izvođenja takvog testa.
[0299] Ukratko, 2-10 nM prečišćenih NS3 proteaznih domena su prethodno inkubirani na 37°C tokom 10 minuta sa 20µM izogenim NS4A peptidnim kofaktorima (Sigma, St. Louis, MO), u 40% glicerol puferu sa 50 mM HEPES pH 7.5 i 10 mM DTT. Jedinjenja su razblažena serijski 1:3 u DMSO, inkubirana sa smešom enzim/kofaktor tokom 10 minuta i reakcije su počele dodavanjem 2 µM RET S1 supstrata (finalna koncentracija). Porast fluorescence je meren kontinualno tokom jednog sata korišćenjem Victor3 V fluorescentnog čitača ploča (Perkin Elmer, Waltham, MA). Početne brzine su izračunate za svaku koncentraciju inhibitora korišćenjem Workout 1.5 softvera (DAZDAQ, East Sussex, UK) sa algoritmom maksimalnog nagiba. Podaci za brzinu su konvertovani u procente u odnosu na netretiranu kontrolu (definisana kao 100%) i ne-linearna regresija je izvedena da se izračuna koncentracije koje uzrokuju 50% inhibicije (IC50vrednosti).
[0300] NS3 Enzimska potencija: Prečišćena NS3 proteaza je stavljena u kompleks sa NS4A peptidom i zatim inkubirana sa serijskim razblaženjima jedinjenja (DMSO je korišćen kao rastvarač). Reakcije su počele dodavanjem dvostruko obeleženih peptidnih supstrata i dobijeni kinetički porast u fluorescenciji je izmeren. Nelinearna regresija podataka za brzinu je izvedena da se izračunaju IC50vrednosti. Aktivnost je inicijalno testirana na proteazu genotipa 1b. U zavisnosti od potencije dobijene na genotip 1b, dodatni genotipovi (1a, 2a, 3) i ili enzimi rezistenti na inhibitor proteaze (D168Y, D168V, ili A156T mutanti) mogu biti testirani. BILN-2061 koristi kao kontrola tokom svih testova. Jedinjenja iz Primera su evaluirana u ovom testu i pronađeno je imaju IC50vrednosti manje od oko 1 µM.
[0301] Potencija replikona i citotoksičnost: Huh-luc ćelije (stabilno replikujući Bartenschlager-ov I389luc-ubi-neo/NS3-3'/ET replikon genotipa 1b) su tretirane sa serijskim razblaženjima Jedinjenja (DMSO se koristi kao rastvarač) tokom 72 sata. Broj kopija replikona se meri bioluminiscencijom i vrši se ne-linearna regresija za izračunavanje EC50vrednosti. Paralelne ploče tretirane sa istim razblaženjem leka se analiziraju za citotoksičnost korišćenjem testa vijabilnosti ćelija Promega CellTiter-Glo. U zavisnosti od postignute potencije na replikon 1b, jedinjenja mogu biti testirana na replikon genotipa 1a i/ili replikone resistentne na inhibitor koji kodiraju mutacije D168Y ili A156T. BILN-2061 se koristi kao kontrola tokom svih testova. Jedinjenja iz Primera su evaluirana u ovom testu i pronađeno je imaju EC50vrednosti manje od oko 5 µM.
Efekat serumskih proteina na potenciju replikona
[0302] Testiranja replikona se sprovode u medijumu za normalne ćelijske kulture (DMEM 10%FBS) obogaćenom sa fiziološkim koncentracijama humanog serumskog albumina (40 mg/mL) ili α-kiselim glikoproteinom (1 mg/mL). EC50vrednosti u prisustvu humanih serumskih proteina su upoređeni sa EC50u normalnom medijumu da se odredi stepen promene u potenciji.
[0303] Enzimatska selektivnost: Inhibicija sisarskih proteaza koje uključuju svinjsku pankreatičnu elastazu, humanu leukocitnu elastazu, proteazu 3, i katepsin D su izmerene pri Kmza odgovarajuće supstrate za svaki enzim. IC50za svaki enzim je upoređen sa IC50koji je dobijen sa NS31b proteazom da se izračuna selektivnost.
[0304] Citotoksičnost MT-4 ćelija: MT4 ćelije su tretirane serijskim razblaženjima jedinjenja tokom perioda od pet dana. Ćelijska vijabilnost je izmerena na kraju perioda tretiranja korišćenjem Promega CellTiter-Glo testa i ne-linearna regresija je izvedena da se izračuna CC50.
[0305] Koncentracija Jedinjenja povezana sa ćelijama na EC50: Huh-luc kulture su inkubirane sa jedinjenjem u koncentracijama jednakim EC50. Na više vremenskih tačaka (0 - 72 sati), ćelije su isprane 2X sa hladnim medijumom i ektrahovane sa 85% acetonitrilom; uzorak medijuma na svakoj tački u vremenu je takođe ektrahovan. Ekstrakti ćelija i medijuma su analizirani pomoću LC/MS/MS da se odredi molarna koncentracija jedinjenja u svakoj frakciji
[0306] Rastvorljivost i stabilnost: Rastvorljivost se određuje uzimanjem alikvota od 10 mM DMSO štok rastvora i pripremanjem jedinjenja u konačnoj koncentraciji od 100 µM u test rastvorima medijuma (PBS, pH 7.4 i 0.1 N HCI, pH 1.5) sa ukupnom DMSO koncentracijom od 1%. Test rastvori medijuma se inkubiraju na sobnoj temperaturi uz šejkiranje tokom 1 sata. Rastvori se zatim centrifugiraju i oporavljeni supernatanti se analiziraju na HPLC/UV. Rastvorljivost se može izračunati poređenjem količine jedinjenja detektovanog u definisanom test rastvoru u poređenju sa količinom koja je detektovana u DMSO u istoj koncentraciji. Određena je i stabilnost jedinjenja posle 1 sata inkubacije u testnom medijumu na 3 °C.
[0307] Stabilnost u krioprezerviranim humanim. pasjim i pacovskim hepatocitima: Svako jedinjenje je inkubirano do 1 sata u suspenzijama hepatocita (100 µl, 80,000 ćelija po bunariću) na 37°C. Krioprezervirani hepatociti su rekonstituisani u medijumu za inkubaciju bez seruma. Suspenzija je prebačena u ploče sa 96 bunarića (50 µL/bunariću). Jedinjenja su razblažena do 2 µM u medijumu za inkubaciju i zatim su dodata u suspenzije hepatocita da se započne inkubacija. Uzorci su uzeti na 0, 10, 30 i 60 minuta posle početka inkubacije i reakcija može biti kvenočovana sa smešom koja se sastoji od 0.3% mravlje kiseline u 90% acetonitrilu/10% vodi. Koncentracija jedinjenja u svakom uzorku se analizira korišćenjem LC/MS/MS. Poluvreme nestanka jedinjenja u suspenziji hepatocita određuje se podešavanjem podataka za koncentraciju-vreme sa monofaznom eksponencijalnom jednačinom. Podaci se takođe pojačavaju da bi predstavljali intrinzični hepatični klirens i/ili ukupni hepatični klirens.
[0308] Stabilnost u hepatičnoj S9 frakciji čoveka, psa, i pacova: Svako jedinjenje se inkubira do 1 sata u S9 suspenziji (500 µl, 3 mg proteina/mL) na 37 ° C (n = 3). Jedinjenja su dodata u S9 suspenziju da se započne inkubacija. Uzorci su uzeti na 0, 10, 30, i 60 minuta nakon početka inkubacije. Koncentracija jedinjenja u svakom uzorku se analizira korišćenjem LC/MS/MS. Poluvreme nestanka jedinjenja u S9 suspenziji je određeno podešavanjem podataka za koncentraciju-vreme sa monofaznom eksponencijalnom jednačinom.
[0309] Caco-2 Permeabilnost: I unapred usmerena (A-do-B) i reverzna (B-do-A) permeabilnost je izmerena. Caco-2 monoslojevi su gajeni do konfluencije na kolagenomobloženim, mikroporoznim, polikarbonatnim membranama u Costar Transwell® pločama sa 12 bunarića. Jedinjenja su dozirana na apikalnoj strani za unapred usmerenu permeabilnost (A-do-B), i dozirana su na bazolateralnoj strani za reverznu permeabilnost (B-do-A). Ćelije su inkubirane na 37°C sa 5% CO2u vlažnoj inkubatoru. Na početku inkubacije, na 1 h i 2 h posle inkubacije, alikvot od 200-µL je uzet iz prijemne komore i zamenjen sa svežim puferom za test. Koncentracija jedinjenja u svakom uzorku je određena sa LC/MS/MS. Očigledna permeabilnost, Papp, je izračunata.
[0310] Vezivanje proteina plazme: Vezivanje proteina plazme se meri pomoću ravnotežne dijalize. Svako jedinjenje se dodaje u blank plazmu u konačnoj koncentraciji od 2 µM. Takva plazma i fosfatni pufer se postavljaju na suprotne krajeve sklopljenih ćelija za dijalizu, a zatim se rotira polako u vodenom kupatilu od 37°C. Na kraju inkubacije određena je koncentracija jedinjenja u plazmi i fosfatnom puferu. Procenat neveznog je izračunato korišćenjem sledeće jednačine:
[0311] Gde Cfi Cbsu slobodne i vezane koncentracije određene kao koncentracije postdijaliznog pufera i plazme, redom.
[0312] CYP450 Profilisanje: Svako jedinjenje je inkubirano sa svakim od 5 rekombinantnih humanih CYP450 enzima, uključujući CYP1A2, CYP2C9, CYP3A4, CYP2D6 i CYP2C19 u prisustvu i odsustvu NADPH. Serijski uzorci mogu biti uzeti iz inkubacione smeše na početku inkubacije i na 5, 15, 30, 45 i 60 min posle početka inkubacije. Koncentracija jedinjenja u inkubacionoj smeša je određena pomoću LC/MS/MS. Procenat jedinjenja koje preostaje posle inkubacije u svakoj vremenskoj tački je izračunat poređenjem sa uzorkovanjem na početku inkubacije.
[0313] Stabilnost u plazmi pacova, psa, majmuna i čoveka: Jedinjenja su inkubirana do 2 sata u plazmi (pacov, pas, majmun, ili čovek) na 37°C. Jedinjenja su dodata u plazmu u finalnim koncentracijama od 1 i 10 µg/mL. Alikvoti su uzeti na 0, 5, 15, 30, 60, i 120 min posle dodavanja jedinjenja. Koncentracija jedinjenja i glavni metaboliti na svakoj vremenskoj tački su izmereni pomoću LC/MS/MS. Biološki podaci (antivirusna potencija [EC50] je određena korišćenjem HCV replikon reporter testa zasnovanog na Renilla luciferazi (RLuc) - HCV 1b RLuc).
Biološki Primer 7: Unakrsna rezistencija Jedinjenja 10 i Jedinjenja 6
[0314] Ova studija je sprovedena da se odrede in vitro profili unakrsne rezistencije Jedinjenja 10 i Jedinjenja 6. Panel HCV mutantnih replikona koji nose „signature“ NS5B nukleozid HCV S282T mutaciju rezistencije na lek ili najuobičajenije in vitro i in vivo NS5A HCV mutacije za rezistentnost na lek je ispitana putem replikon testa da se odredi da li unakrsna rezistencija postoji izmedju mutacija koje prenose smanjenu osetljivost na jedinjenje 10 ili jedinjenje 6. Nijedna unakrsna rezistencija nije primećena između ovih jedinjenja sa S282T mutantnim replikonima koji su ostali potpuno osetljivi na Jedinjenje 6 i NS5A mutanata koji ne pokazuju smanjenu osetljivost na Jedinjenje 10.
Materijali i Metode
Reagensi
Jedinjenja
[0315] Jedinjenje 6 i Jedinjenje 10 su sintetisani u Gilead Sciences, Inc. u Foster City-ju, Kalifornija
Ćelijske linije
[0316] Huh-lunet, Huh-7 klon koji je visoko prihvaćen za replikaciju HCV, je dobijen od ReBLikon GmbH (Mainz, Nemačka). Huh-lunet ćelije su održavane u Dulbeko modifikovan Igl medijumu - Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; GIBCO, Carlsbad, CA) obogaćenom sa 10% fetalnim goveđim serumom (FBS; Hyclone, Logan, UT). Ćelije su održavane na 37°C u vlažnim inkubatorima (85% vlažnost) i u 5% CO2atmosferi.
[0317] PI-hRluc, bicistronski replikon koji kodira gen Renilla luciferaze nizvodno od polio IRES i genotip 1b (Con-1 strain) HCV nestrukturnih gena (NS3 - NS5B) nizvodno od EMCV IRES, je korišćen za studije prolazne transfekcije. Plazmid pPI-hRluc je generisan od plazmida pFKI341 PI-Luc/NS3-3'/ET, koji kodira genotip 1b (Con-1 soj) subgenonski replikon i dobijen je od ReBLikon (Friebe et al., J Virol 2001;75 (24):12047-57). hRluc gen je amplifikovan PCR-om od pF9 CMV hRluc-neo Flexi(R) (Promega, Madison, WI) PCR-om korišćenjem Accuprime Super Mix I (Invitrogen, Carlsbad, CA) i prajmera PV_Rluc_Top i 3'-Rluc(Notl). Ova dva prajmera imaju sledeće sekvence i nose restrikciona mesta za kasnije kloniranje: PV_Rluc_Top: 5' ATC AGA CAA TTG TAT CAT AAT GGC TTC CAA GGT GTA CG 3' (SEK ID BR:3); 3'-Rluc(Notl): 5' ACG TCA CTA TCT ACG CGG CCG CTT ACT GCT CGT TCT TC3' (Notl mesto podvučeno) (SEK ID BR:4). T7 Promoter, 5'UTR i Polio Virus IRES su PCR amplfikovani od plazmida pFKI341 PI-Luc/NS3-3'/ET korišćenjem prajmera 5'-P7(Sbfl) i PV_Rluc_Bottom. Ova dva prajmera imaju sledeće sekvence i nose restrikciona mesta za kasnije kloniranje: 5'-P7(Sbfl): 5' CAA GCT AAG CTG CCT GCA GG T 3' (Sbfl site podlined) (SEK ID BR:5); PV_Rluc_Bottom: 5' CGT ACA CCT TGG AAG CCA TTA TGA TAC AAT TGT CTG AT (SEK ID BR:6). Sledeći PCR fragmenti iz dve gornje reakcije su udruženi zajedno korišćenjem preklapajućeg (overlapping) PCR-a i prajmera 5'- P7(Sbfl) i 3'-Rluc(Notl). Kompletni P7-5'UTR-Polio Virus IRES-hRluc amplifikacioni proizvod je subkloniran u pCR2.1-TOPO. Dobijeni plazmid je digeriran sa Sbfl i Notl, i izrezan fragment (P7-5'UTR-Polio Virus IRES-hRluc) su ligirani korišćenjem T4 DNK ligaze u pFKI341 PI-Luc/NS3-3'/ET digerirane sa istim enzimima. Dobijeni vektor, pPI-hRluc, je sekvenciran da se potvrdi ispravna orijentacija i sekvenca P75'UTR-Polio Virus IRES-hRluc regiona plazmida.
[0318] GT 1a i 2a replikoni koji sadrže hRluc su opisani prethodno (Robinson M, Yang H, Sun SC, Peng B, Tian Y, Pagratis N, et al. Novel HCV Reporter Replikon Cell Lines Enable Efficient Antiviral Screening na Genotip 1a. Antimicrob Agents Chemother 2010.)
[0319] PI-hRluc replikon je korišćen kao kičma za konstrukciju himere. Unutrašnja delecija je načinjena u NS5B čineći ga deficijentnim za replikaciju. Poslednjih 413 baznih parova (koji kodiraju poslednjih 137 NS5A amino kiselina) od1b-con-1 NS5A su sintetisani u okviru sa NS5B sekvencom iz genotipova 2b, 3a, 4a, 5a, i 6a (Genscript Inc. Piscataway NJ). Konsenzus NS5B sekvence za svaki od ovih genotipova su izvedene ravnanjem sekvenci deponovanih u Evropskoj HCV bazi podataka i ekstrakovanjem konsenzusa. Ove nove konsenzus sekvence za NS5B, kao i sekvence izvedene iz pojedinačnih kliničkih izolata (Herlihy et al., Antimicrob Agents Chemother 2008;52 (10):3523-31) su korišćene da se konstruišu NS5B himerni replikoni. Jedinstveno Xhol mesto je korišćeno na 5' kraju i jedinstveno Asel mesto na 3' kraju da se usmereno kloniraju u 1b-hRLuc/NeoR NS5B vektor putem standardnih molekularno bioloških tehnika.
[0320] NS5B S282T mutacije su uvele plazmide replikona korišćenjem QuikChange II XL kita za mutagenezu u skladu sa uputstvima proizvođača (Stratagene, La Jolla, CA). Celokupni mutirani replikon je sekvenciran da se potvrdi prisustvo S282T mutacije i odsustvo bilo koje mutacije sekundarnog mesta.
[0321] NS5A mutantni replikoni su kreirani sintetisanjem sekvence koja kodira prvih 149 amino kiselina od NS5A koji sadrži željenu mutaciju ograničenu pomoću 5' i 3' BsrGI iEcoRI mesta, redom (Genscript, Piscataway, NJ). Sintetisani fragmenti su zatim klonirani pomoću standardnih molekularno bioloških tehnika u 1a Rluc replikon plazmid modifikovan da se osposobi kloniranje u jedinstvena BsrGI i EcoRI restrikciona mesta. Mutacije su potvrđene sekvenciranjem DNK.
[0322] Replikoni su linearizovani korišćenjem sledećih enzima: Spe I (1b PI-Rluc-bazirani replikoni), Hpa I (1a-Rluc-bazirani replikoni), i Xbal/Hpal (2a Rluc replikon). RNK-e replikona su transkribovane in vitro iz plazmida koji kodiraju replikon korišćenjem T7 Ribomax kita za transkripciju in vitro (Promega; Madison, WI) praćeno prečišćavanjem korišćenjem RNAeasy kolone (Qiagen; Valencia, CA).
Testovi
Određivanje osetljivosti na lekove korišćenjem testa prolazne transfekcije replikona [0323] RNK je trasfektovana u Huh-lunet ćelije korišćenjem metode po Lohmann et al. (Lohmann et al., Science 1999;285 (5424):110-3) Ukratko, ćelije su tripsinizirane i isprane dva puta sa PBS. Suspenzija 4 x 10<6>ćelija u 400 µL PBS je pomešana sa 5 µg RNK i podvrgnuta elektoporaciji korišćenjem podešavanja od 960 µF i 270 V. Ćelije su prebačene u 40 mL prethodno zagrejanog medijuma za kulture i zatim zasađene u ploče sa 96 ili 384 bunarića. Jedinjenja su 3-struko razblažena u 100% DMSO i dodata su u ćelije da se postigne finalna DMSO koncentracija od 0.5%. Ćelije su tretirane tokom tri dana posle čega je medijum za kulture uklonjen, ćelije su lizirane i aktivnost Renilla luciferaze je kvantifikovana korišćenjem komercijalno dostupnih reagenasa (Promega) i Victor ili Envision instrumenta (Perkin Elmer, Waltham, MA).
Analiza podataka
[0324] Podaci su konvertovani u procente u odnosu na netretirane kontrole (definisano kao 100%), i EC50vrednosti su izračunate ne-linearnom regresijom dva seta podataka replikata korišćenjem GraphPad Prism softvera ili Pipeline Pilot. Stepeni promene rezistencije su izračunati kao odnos mutantnog prema EC50replikona divljeg tipa.
Rezultati
Aktivnost Jedinjenja 10 i Jedinjenja 6 na S282T
[0325] Prethodna in vitro rezistenciona selekcija sa Jedinjenjem 10 je dosledno identifikovala S282T u NS5B kao primarnu mutaciju u više genotipova (GT 1b, 1a i 2a). NS5B S282T mutacija je naknadno uneta u kompletne GT 1a, 1b, i 2a replikone i himerne replikone koji sadrže 2b, 3a, ili 4a NS5B sekvencu koja je klonirana u GT1b kičmu. Osetljivost na Jedinjenje 10, Jedinjenje 6, i ribavirin (RBV) je procenjena korišćenjem testa prolazne replikacije. S282T mutacija je pokazala smanjenu osetljivost na Jedinjenje 10 sa vrednošću u svih pet genotipova u rasponu od 117.1 nM do 346.1 nM. Povećanje porasta EC50za S282T bilo je u rasponu od 2.4 do 16.0 u poređenju sa divljim tipom iz odgovarajućih genotipova koji pokazuju smanjenu osetljivost replikona na Jedinjenje 10 kada je prisutna NS5B S282T mutacija.
[0326] Za replikon divljeg tipa, vrednosti EC50za RBV su takođe slične na pet testiranih genotipova sa najnižim EC50za GT 2b. Interesantno, EC50vrednosti za S282T replikone su 5-do 10-puta osetljivije na tretman sa RBV nego njihov odgovarajući divlji tip za svih pet genotipova. Nisu primećene značajne razlike u EC50vrednostima Jedinjenja 6 između replikona divljeg tipa i S282T replikona što pokazuje da ova mutacija ne menja osetljivost na Jedinjenje 6. U zaključku, dok je S282T replikon imao smanjenu osetljivost na Jedinjenje 10, mutantni replikon je pokazao osetljivost divljeg tipa na Jedinjenje 6 i povećanu osetljivost na inhibiciju pomoću RBV nad divljim tipom.
Table 7.1. Antivirusna aktivnost Jedinjenja 10 i RBV na divlji (wild-type) i S282T mutant GTlb, 2a, 2b, 3a i 4a
Aktivnost Jedinjenja 10 i Jedinjenje 6 na NS5A Mutantima
[0327] Da bi se utvrdilo da li su NS5A mutacije rezistencije leka unakrsno rezistentne na Jedinjenje 10, panel NS5A mutantnih replikona je testiran na osetljivost i na Jedinjenje 6 i na Jedinjenje 10. Svih sedam NS5A mutanata su pokazali smanjenu osetljivost na Jedinjenje 6 sa povećanjem EC50u rasponu od 25 do 3029 puta. Nasuprot tome, nije zabeležena značajna promena u EC50za NS5A mutante na Jedinjenje 10 ili na kontrolu RBV.
Tabela 7.2 In Vitro Aktivnost Jedinjenja 10 ili Jedinjenje 6 na NS5A Mutantima u Genotipu
1a
Zaključci
[0328] U ovom primeru, profili unakrsne rezistencije Jedinjenja 10 i Jedinjenja 6 su evaluisani korišćenjem prolaznih HCV replikona koji kodiraju mutacije rezistencije u NS5A i NS5B dajući smanjenu osetljivost na Jedinjenje 6 i Jedinjenje 10, redom. NS5B S282T replikoni su dali smanjenu osetljivost na Jedinjenje 10, dok nije bilo značajnih razlika u EC50vrednostima jedinjenja 6 koje su izmerene od replikona divljeg tipa i S282T replikona. Recipročno, mutacije koje daju smanjenu osetljivost na Jedinjenje 6 i dalje su osetljive na tretman sa Jedinjenjem 10.
[0329] Uopšte, ovi rezultati ukazuju na to da mutacije rezistentnosti za Jedinjenje 10 i Jedinjenje 6 ne pokazuju unakrsnu rezistenciju i podržavaju upotrebu ovih jedinjenja u budućoj kombinovanoj terapiji za lečenje HCV.
Biološki Primer 8: Kombinovana Aktivnost
[0330] Podaci proučavanja kombinacije Jedinjenja 10 sa NS5A inhibitorom Jedinjenje 6, nenukleozidnim inhibitorima Jedinjenje 1 ili Jedinjenje 5, proteaznim inhibitorom Jedinjenje 3, ili ribavirinom (RBV) su pokazani za in vitro replikon test koji ostaje kao standard za evaluaciju antivirusne aktivnosti bazirane na ćeliji HCV inhibitora. Ovi rezultati pokazuju da Jedinjenje 10 ima aditivnu antivirusnu aktivnost kada je kombinovano sa Jedinjenjem 6, Jedinjenjem 1, Jedinjenjem 5, ili Jedinjenjem 3. Dodatno, Jedinjenje 10 je pokazalo manju sinergiju u kombinaciji sa RBV in vitro.
Materijali i Metode
Ćelijska linija i ćelijska kultura
[0331] Ćelijska linija replikona HCV genotipa 1a korišćena u ovoj studiji kako je opisano prethodno (Robinson M, Yang H, Sun SC, Peng B, Tian Y, Pagratis N, et al. Novel HCV Reporter Replicon Cell Lines Enable Efficient Antiviral Screening against Genotype 1a. Antimicrob Agents Chemother 2010). Ćelije su gajene u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži Dulbekov modifikovani Igl medijum (DMEM) sa GlutaMAX (Gibco, Carlsbad, CA, Kat.br. 10569-044), obogaćen sa 10% FBS (HyClone, Logan, UT, Kat.br. SH30071.03), 100 jedinica/mL Penicilina, 100 µg/mL Streptomicina (Gibco, Carlsbad, CA, Kat.br.15140-122), i 0.1 mM ne-esencijalnih amino kiselina (Gibco, Carlsbad, CA, Kat.br.11140-050). Ćelije replikona su održavane u 0.5 mg/mL Geneticina (Invitrogen, Carlsbad, CA, Kat.br. 10131-035) da se spreči gubitak HCV replikona. Ćelije su pasažirane svaka 3-4 dana pre nego što su dostigle konfluentnost.
HCV Replikon test za određivanja EC50, CC50i studije kombinacija
[0332] Sva jedinjenja su isporučena u 100% DMSO. Serijska razblaženja jedinjenja su izvedena u 100% DMSO. Sva serijska razblaženja su izvedena u polipropilenskim pločama sa 384 bunarića (Thermo Scientific, Hudson, NH, Kat.br.4341) korišćenjem radne stanice Biomek FX Workstation. Za određivanja EC50i CC50, test jedinjenja su serijski razblažena u deset koraka u razblaženjima 1:3 u kolonama 3-20 ploča sa 384 bunarića. Za kombinacijske studije, jedno jedinjenje je serijski razblaženo u devet koraka u razblaženjima 1:2 dilutions u horizontalnom pravcu sa drugim jedinjenjem serijski razblaženim u sedam koraka razblaženja 1:2 u vertikalnom pravcu. Ovo je postiglo definisan set različitih koncentracija leka i odnosa. Za svaki pojedinačni lek, EC50vrednost je odabrana kao srednja tačka za testirani opseg koncentracija. Sva serijska razblaženja su izvedena u četiri replikata po jedinjenju u okviru iste ploče sa 384 bunarića. 100% DMSO je dodat u kolonu 1-2 svake ploče sa 384 bunarića sa serijskim razblaženjem. HCV proteazni inhibitor ITMN-191 pri 100 µM je dodat u kolonu 23 kao kontrola 100% inhibicije HCV replikacije dok je puromicin u 10 mM dodat u kolonu 24 kao kontrola 100% citotoksičnosti.
[0333] U svaki bunarić crne polistirenske ploče sa 384-bunarića (Greiner Bio-one, Monroe, NC, Kat.br.781086, tretirana ćelijska kultura), 90 µL medijuma za ćelijsku kulturu (bez geneticina) koji sadrži 2000 suspendovanih HCV replikon ćelija je dodat sa radnoms stanicom Biotek µFlow Workstation. Za transfer jedinejnja u ploče za ćelijske kulture, 0.4 µL rastvora Jedinjenja iz ploče sa serijskim razblaženjem jedinjenja je prebačeno u ploču za ćelijsku kulturu na radnoj stanici Biomek FX Workstation. DMSO koncentracija u finalnimtest bunarićima je 0.44%. Ploče su inkubirane tokom 3 dana na37 °C sa 5% CO2i 85% vlažnosti.
[0334] HCV replikon test je složen test koji može da proceni i citotoksičnost i antireplikonsku aktivnost iz istog bunarića. Prvo je izveden CC50test. Medijum je u ploči za ćelijsku kulturu sa 384 bunarića aspiriran i bunarići su isprani četiri puta sa 100 µL 1 X PBS svaki, korišćenjem Biotek ELX405 ispirača ploča. Zapremina od 50 µL rastvora koji sadrži 400 nM kalcein AM (Anaspec, Fremont, CA, Kat.br.25200-056) u 1 X PBS je dodat u svaki bunarić ploče pomoću radne stanice Biotek µFlow Workstation. Ploča je inkubirana tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi pre nego što je fluorescentni signal (ekscitacija 490 nm, emisija 520 nm) je izmeren pomoću Perkin Elmer Envision čitača ploča.
[0335] EC50tete je izveden u istim bunarićima kao CC50test. Kalcein-PBS rastvor u ploči za ćelijsku kulturu sa 384 bunarića je aspiriran pomoću Biotek ELX405 ispirača ploča. Zapremina od 20 µL Dual-Glo luciferaza pufera (Promega, Madison, WI, Kat.br.E298B) je dodata to each well of the plate pomoću radne stanice Biotek µFlow Workstation. Ploča je inkubirana tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi. Zapremina od 20 µL rastvora koji sadrži 1:100 smešu Dual-Glo Stop & Glo supstrat (Promega, Madison, WI, Kat.br.E313B) i Dual-Glo Stop & Glo buffer (Promega, Madison, WI, Kat.br.E314B) je zatim dodata u svaki bunarić ploče sa radnom stanicom Biotek µFlow Workstation. Ploča je inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta pre nego što je luminiscentni signal izmeren sa čitačem ploča Perkin Elmer Envision Plate Reader.
Analiza podataka
[0336] Efekat citotoksičnosti je određen kalcein AM konverzijom u fluorescentni proizvod. Procenat citotoksičnosti je izračunat pomoću jednačine 1:
gde XCje fluorescentni signal iz bunarića tretiranog jedinjenjem; MBje prosečni fluorescentni signal iz bunarića tretiranih puromicinom; MDje prosečni fluorescentni signal iz bunarića tretiranih sa DMSO. Anti-HCV replikaciona aktivnost je određena luminiscentnim signalom koji je generisan iz reporterske renilla luciferaze HCV replikona. Procenat inhibicije HCV replikona je izračunat korišćenjem jednačine 1, gde XCje luminescentni signal iz bunarića tretiranog jedinjenjem; MBje prosečni luminescentni signal iz bunarića tretiranih sa ITMN-191; MDje prosečni luminescentni signal iz bunarića tretiranih sa DMSO.
[0337] CC50vrednosti su određene kao koncentracija jedinjenja koje se testira koja uzrokuje smanjenje od 50% u ćelijskoj vijabilnosti. EC50vrednosti su određene kao koncentracija jedinjenja koje se testira koja uzrokuje smanjenje od 50% u replikaciji HCV. I CC50i EC50vrednosti su dobijene korišćenjem Pipeline Pilot 5.0 softverskog paketa (Accelrys, San Diego, CA) nelinearnim regresionim fitovanjem eksperimentalnih podataka sa jednačinom 2:
gde y je opaženi % inhibicije HCV replikona u x koncentraciji jedinjenja; d je procenjeni odgovor pri nultoj koncentraciji jedinjenja; a je procenjeni odgovor pri beskonačnoj koncentraciji jedinjenja; c je srednja koncentracija (CC50ili EC50); b je Hill-ov faktor nagiba.
[0338] Eksperimentalni podaci kombinacione studije su analizirani korišćenjem MacSinergija II programa razvijenog od strane Prichard i Shipman (Prichard MN, Aseltine KR, Shipman C, Jr. MacSinergyTM II, Verzija 1.0. University of Michigan, Ann Arbor, Michigan, 1993). Softver (MacSinergy™ II, University of Michigan, MI) izračunava teorijsku inhibiciju pretpostavljajući aditivnu interakciju između lekova (na osnovu Bliss Independence model-a) i kvantifikuje statistički značajne razlike između teorijskih i opaženih vrednosti inhibicije. Nanošenje ovih razlika u trodimenzionalne rezultate u površini gde elevacije u Z-ravni predstavljaju antivirusu sinergiju i depresije predstavljaju antivirusni antagonizam između jedinjenja. Izračunati volumeni površinskih devijacija su izražene u µM<2>%. Po Prichard-u i Shipman, kombinacioni efekti su definisani kao:
• Jaka sinergija: > 100 µM<2>%
• Umerena sinergija: > 50 i ≤ 100 µM<2>%
• Manja sinergija: > 25 i ≤ 50 µM<2>%
• Aditivnost: ≤ 25 i > -25 µM<2>%
• Manji antagonizam: ≤ -25 i > -50 µM<2>%
• Umereni antagonizam: ≤ -50 i > -100 µM<2>%
• Jak antagonizam: ≤ -100 µM<2>%
[0339] Za svaku kombinacionu studiju, tri nezavisna eksperimenta su izvedena sa četiri replikata u svakom eksperimentu.
Rezultati
Antiviralna Aktivnost i Citotoksičnost pojedinačnih jedinjenja u HCV Genotip 1a Replikon testu
[0340] Anti-HCV aktivnost i citotoksičnost Jedinjenja 10 kombinovanog sa drugim anti-HCV jedinjenjima su testirane u Huh-7 ćelijama koji nose replikon HCV genotipa 1a. Vrednosti EC50i CC50za sva jedinjenja su navedene u sledećoj tabeli. Ne postoji značajna citotoksičnost opažena za sva pojedinačna jedinjenja do najviših koncentracija testiranih u testu kobinacije.
Tabela 8.1. EC50i CC50Jedinjenja korišćenih u ovoj studiji na Replikonu HCV Genotipa 1a
Antivirusna aktivnost i citotoksičnost jedinjenja 10 u kombinaciji sa drugim klasama anti-HCV agenasa.
[0341] Antivirusni efekti Jedinjenja 10 u kombinaciji sa drugim anti-HCV jedinjenjima su evaluisani korišćenjem replikona HCV genotipa 1a. Rezultati su analizirani korišćenjem MacSinergy II, koji obezbeđuje površinski grafikon koji prikazuje značajna odstupanja od aditivnosti. Volumeni sinergije i antagonizma (µM<2>%) su izračunati iz devijacija od aditivne površine i sumirani su u sledećoj Tabeli. U intervalu poverljivosti od 95%, srednji volumeni sinergije i antagonizma sinergija su između 25 i -25 µM<2>% kada je Jedinjenje 10 kombinovano sa Jedinjenjem 6, Jedinjenjem 1, Jedinjenjem 5, ili Jedinjenjem 3 indikativno za aditivnu interakciju sa Jedinjenjem 10. Pored toga, Jedinjenje 10 pokazuje sinergijski volumen u opsegu od 25 do 50 µM<2>% kada je kombinovan sa RBV, što ukazuje na manju sinergističku interakciju. U studijama kombinacija korišćenjem direktno delujućih antiviralnih agenasa sa Jedinjenjem 10, ćelijska vijabilnost je veća od 93% pri najvišim koncentracijama kombinacija Jedinjenja koje su tetsirane dok su studije koje analiziraju kombinovan efekat Jedinjenja 10 i RBV pokazale ćelijsku vijabilnost veću od 85% pri najvišim koncentracijama kombinovanih lekova.
Tabela 8.2. Kvantifikacija antivirusne sinergije i antagonizma i interakcija lekova za kombinacije lekova sa Jedinjenjem 10
Tabela 8.3. Kvantifikacija citotoksičnosti u kombinacijama jedinjenja
Zaključci
[0342] Antivirusna aktivnost Jedinjenja 10 je testirana u kombinaciji sa Jedinjenjem 6, Jedinjenjem 1, Jedinjenjem 5, Jedinjenjem 3, ili RBV. Jedinjenje 10 je pokazalo aditivnu antivirusnu aktivnost u kombinaciji sa Jedinjenjem 6, Jedinjenjem 1, Jedinjenjem 5, ili Jedinjenjem 3, i manju sinergiju sa RBV.
[0343] Ukratko, ovi nalazi podržavaju potencijal Jedinjenja 10 da se koristi u kombinaciji sa Jedinjenjem 6, Jedinjenjem 1, Jedinjenjem 5, Jedinjenjem 3 ili RBV za postizanje poboljšane supresije virusa bez smanjenja efikasnosti bilo kog od pojedinačnih lekova.
[0344] Iako su specifična tehnička rešenja predmetnog pronalaska ovde ilustrovana i detaljno opisana, pronalazak nije ograničen na njih. Gorenavedeni detaljni opisi su dati kao primerni predmetnog pronalaska i ne bi se trebali tumačiti kao da predstavljaju bilo kakvo ograničenje predmetnog pronalaska.

Claims (9)

  1. PATENTNI ZAHTEVI 1. Kompozicija koja sadrži: 1) jedinjenje 10
    ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i 2) jedinjenje 6
    ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.
  2. 2. Kompozicija iz patentnog zahteva 1 koja dalje sadrži jedinjenje 5
    ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.
  3. 3. Kompozicija iz patentnog zahteva 1 ili 2 koja dalje sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatljivih razblaživača ili nosača.
  4. 4. Kompozicija iz patentnog zahteva 3 koja je formulisana kao jedinični dozni oblik za administraciju jednom dnevno.
  5. 5. Kompozicija iz patentnog zahteva 3 ili 4 koja je formulisana za oralnu administraciju; opciono, koja je formulisana kao tableta.
  6. 6. Kompozicija koja je opisana u bilo kom od patentnih zahteva 1-5 za primenu u medicinskoj terapiji.
  7. 7. Kompozicija koja je opisana u bilo kom od patentnih zahteva 1-5 za primenu u profilaktičkom ili terapijskom lečenju infekcije HCV-om.
  8. 8. Kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 7 koja nije za administraciju sa interferonom.
  9. 9. Kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 7 koja je za administraciju sa ribavirinom. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5
RS20180222A 2011-09-16 2012-09-14 Metode za lečenje hcv-a RS56975B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161535885P 2011-09-16 2011-09-16
US201161561753P 2011-11-18 2011-11-18
PCT/US2012/055621 WO2013040492A2 (en) 2011-09-16 2012-09-14 Methods for treating hcv
EP12768967.7A EP2709613B2 (en) 2011-09-16 2012-09-14 Methods for treating hcv

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS56975B1 true RS56975B1 (sr) 2018-05-31

Family

ID=46970425

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20180222A RS56975B1 (sr) 2011-09-16 2012-09-14 Metode za lečenje hcv-a

Country Status (38)

Country Link
US (3) US9393256B2 (sr)
EP (1) EP2709613B2 (sr)
JP (2) JP6073897B2 (sr)
KR (2) KR20190075142A (sr)
CN (2) CN106166160A (sr)
AP (1) AP2014007575A0 (sr)
AU (1) AU2012308295B2 (sr)
BR (1) BR112014006324B8 (sr)
CA (1) CA2840242C (sr)
CL (1) CL2014000630A1 (sr)
CO (1) CO6930366A2 (sr)
CR (1) CR20140177A (sr)
CY (1) CY1119896T1 (sr)
DE (2) DE202012013382U1 (sr)
DK (1) DK2709613T4 (sr)
EA (1) EA026667B9 (sr)
EC (1) ECSP14013312A (sr)
ES (1) ES2659216T5 (sr)
HK (1) HK1231378A1 (sr)
HR (1) HRP20180237T4 (sr)
HU (1) HUE036588T2 (sr)
IL (1) IL231515A (sr)
LT (1) LT2709613T (sr)
MD (1) MD4589C1 (sr)
ME (1) ME03009B (sr)
MX (2) MX336580B (sr)
NZ (1) NZ623396A (sr)
PE (1) PE20141056A1 (sr)
PH (1) PH12014500557A1 (sr)
PL (1) PL2709613T5 (sr)
PT (1) PT2709613T (sr)
RS (1) RS56975B1 (sr)
SG (2) SG11201400664WA (sr)
SI (1) SI2709613T2 (sr)
SM (1) SMT201800087T1 (sr)
TR (1) TR201802537T4 (sr)
UA (1) UA116087C2 (sr)
WO (1) WO2013040492A2 (sr)

Families Citing this family (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUE029877T2 (en) 2003-05-30 2017-04-28 Gilead Pharmasset Llc Modified fluorinated nucleoside analogues
RS53347B (sr) 2008-12-09 2014-10-31 Gilead Sciences, Inc. Modulatori toll-sličnih receptora
HUE030465T2 (hu) * 2009-05-13 2017-05-29 Antivirális vegyületek
MX2012003126A (es) 2009-09-21 2012-06-19 Gilead Sciences Inc Procesos e intermedios para la preparacion de analogos de 1'-carbonucleosidos sustituidos.
ES2524356T3 (es) 2010-07-22 2014-12-05 Gilead Sciences, Inc. Métodos y compuestos para tratar infecciones provocadas por virus Paramyxoviridae
US20130273005A1 (en) 2010-12-20 2013-10-17 Gilead Sciences, Inc. Methods for treating hcv
EP2709613B2 (en) 2011-09-16 2020-08-12 Gilead Pharmasset LLC Methods for treating hcv
AU2015200715A1 (en) * 2011-10-21 2015-03-05 Abbvie Ireland Unlimited Company Methods for treating HCV
US8466159B2 (en) 2011-10-21 2013-06-18 Abbvie Inc. Methods for treating HCV
DE202012012955U1 (de) * 2011-10-21 2014-07-14 Abbvie Inc. Eine Kombination aus mindestens zwei direkt wirkenden antiviralen Wirkstoffen (DAAs) für die Verwendung zur Behandlung von HCV
AU2015100285B4 (en) * 2011-10-21 2015-06-11 Abbvie Ireland Unlimited Company Methods for treating HCV
US8492386B2 (en) 2011-10-21 2013-07-23 Abbvie Inc. Methods for treating HCV
EP2583677A3 (en) 2011-10-21 2013-07-03 Abbvie Inc. Methods for treating HCV comprising at least two direct acting antiviral agent, ribavirin but not interferon.
EP2950786B1 (en) 2013-01-31 2019-11-27 Gilead Pharmasset LLC Combination formulation of two antiviral compounds
WO2014185995A1 (en) * 2013-05-16 2014-11-20 Gilead Pharmasset Llc Hepatitis c treatments with sofosbuvir
CN104211565A (zh) * 2013-05-31 2014-12-17 浙江九洲药业股份有限公司 一种抗丙型肝炎药物中间体的制备方法
PT3038601T (pt) 2013-08-27 2020-06-30 Gilead Pharmasset Llc Formulação combinada de dois compostos antivirais
JP6522732B2 (ja) 2014-07-11 2019-05-29 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド Ｈｉｖを治療するためのトール様受容体の調節因子
CN104130302B (zh) * 2014-08-08 2017-02-15 乳源东阳光药业有限公司 一种核苷药物的晶型及其制备方法
SG11201701520TA (en) 2014-09-16 2017-04-27 Gilead Sciences Inc Solid forms of a toll-like receptor modulator
TWI687432B (zh) 2014-10-29 2020-03-11 美商基利科學股份有限公司 絲狀病毒科病毒感染之治療
JP7381190B2 (ja) 2014-12-26 2023-11-15 エモリー・ユニバーシテイ Ｎ４－ヒドロキシシチジン及び誘導体並びにそれに関連する抗ウイルス用途
CN106138080A (zh) * 2015-04-03 2016-11-23 南开大学 核苷类化合物在制备治疗丙型肝炎病毒(hcv)感染疾病药物的应用
CN106146585B (zh) * 2015-04-10 2019-05-28 正大天晴药业集团股份有限公司 氘修饰的脲苷衍生物
DK3785717T3 (da) 2015-09-16 2022-03-21 Gilead Sciences Inc Fremgangsmåder til behandling af coronaviridae-infektioner
EA201892448A1 (ru) 2016-04-28 2019-06-28 Эмори Юниверсити Алкинсодержащие нуклеотидные и нуклеозидные терапевтические композиции и связанные с ними способы применения
WO2017195147A1 (en) * 2016-05-12 2017-11-16 Lupin Limited Process for the preparation of ledipasvir and intermediates thereof
CN105968040B (zh) * 2016-06-29 2019-02-05 爱斯特（成都）生物制药股份有限公司 一种雷迪帕韦中间体的制备方法
CN106432197B (zh) * 2016-09-07 2019-12-10 上海众强药业有限公司 一种雷迪帕韦中间体单对甲苯磺酸盐、其晶型及其制备方法
US10682368B2 (en) 2017-03-14 2020-06-16 Gilead Sciences, Inc. Methods of treating feline coronavirus infections
CA3059777C (en) * 2017-05-01 2023-02-21 Gilead Sciences, Inc. Crystalline forms of (s)-2-ethylbutyl 2-(((s)-(((2r,3s,4r,5r)-5-(4-aminopyrrolo[2,1-f] [1,2,4]triazin-7-yl)-5-cyano-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methoxy)(phenoxy) phosphoryl)amino)propanoate
WO2019014247A1 (en) 2017-07-11 2019-01-17 Gilead Sciences, Inc. COMPOSITIONS COMPRISING POLYMERASE RNA INHIBITOR AND CYCLODEXTRIN FOR THE TREATMENT OF VIRAL INFECTIONS
CN107629099B (zh) * 2017-07-26 2020-05-26 江苏科本药业有限公司 一种索非布韦中间体的制备工艺
AU2018335411B2 (en) * 2017-09-21 2024-06-27 Riboscience Llc 4'-fluoro-2'-methyl substituted nucleoside derivatives as inhibitors of HCV RNA replication
PT3706762T (pt) 2017-12-07 2024-12-05 Univ Emory N4-hidroxicitidina e derivados e utilizações antivirais relacionadas com os mesmos
CN109651472B (zh) * 2018-12-29 2020-08-18 湖南千金湘江药业股份有限公司 合成索非布韦关键中间体的方法
TWI810456B (zh) 2019-05-22 2023-08-01 美商基利科學股份有限公司 Tlr7調節化合物及hiv疫苗之組合
CN110531023B (zh) * 2019-10-08 2024-06-14 安徽理工大学 一种薄层色谱分析仪
CN111990544A (zh) * 2019-10-16 2020-11-27 长沙绿叶生物科技有限公司 一种用于阻断和干扰非洲猪瘟病毒与猪的特异受体结合的生物饲料及其应用
JP2023512656A (ja) 2020-01-27 2023-03-28 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２感染を治療するための方法
KR20250133471A (ko) 2020-02-18 2025-09-05 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 항바이러스 화합물
TWI775313B (zh) 2020-02-18 2022-08-21 美商基利科學股份有限公司 抗病毒化合物
TWI883391B (zh) 2020-02-18 2025-05-11 美商基利科學股份有限公司 抗病毒化合物
KR20220153619A (ko) 2020-03-12 2022-11-18 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 1'-시아노 뉴클레오사이드의 제조 방법
CA3172483A1 (en) 2020-04-06 2021-10-14 Scott Ellis Inhalation formulations of 1'-cyano substituted carbanucleoside analogs
TW202203941A (zh) 2020-05-29 2022-02-01 美商基利科學股份有限公司 瑞德西韋之治療方法
PE20230618A1 (es) 2020-06-24 2023-04-14 Gilead Sciences Inc Analogos de nucleosido de 1'-ciano y usos de los mismos
IL300453A (en) 2020-08-27 2023-04-01 Gilead Sciences Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF VIRAL INFECTIONS
US12558364B2 (en) 2021-01-20 2026-02-24 Regents Of The University Of Minnesota Next generation remdesivir antivirals
CA3216162A1 (en) 2021-04-16 2022-10-20 Gilead Sciences, Inc. Methods of preparing carbanucleosides using amides
US12497408B2 (en) 2021-05-21 2025-12-16 Gilead Sciences, Inc. Tetracyclic compounds and methods for the treatment of Zika virus infection
US12037340B2 (en) 2021-05-21 2024-07-16 Gilead Sciences, Inc. Pentacyclic derivatives as Zika virus inhibitors
AU2022328698B2 (en) 2021-08-18 2025-02-20 Gilead Sciences, Inc. Phospholipid compounds and methods of making and using the same
KR20240154647A (ko) 2022-03-02 2024-10-25 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 바이러스성 감염 치료를 위한 화합물 및 방법
US12357577B1 (en) 2024-02-02 2025-07-15 Gilead Sciences, Inc. Pharmaceutical formulations and uses thereof

Family Cites Families (327)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3798209A (en) 1971-06-01 1974-03-19 Icn Pharmaceuticals 1,2,4-triazole nucleosides
USRE29835E (en) 1971-06-01 1978-11-14 Icn Pharmaceuticals 1,2,4-Triazole nucleosides
JPS5238939A (en) 1975-09-23 1977-03-25 Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> Optical coupler
US4614719A (en) 1982-04-30 1986-09-30 Yamasa Shoyu Kabushiki Kaisha Process for producing ribavirin
US5223263A (en) 1988-07-07 1993-06-29 Vical, Inc. Liponucleotide-containing liposomes
US5194654A (en) 1989-11-22 1993-03-16 Vical, Inc. Lipid derivatives of phosphonoacids for liposomal incorporation and method of use
US5463092A (en) 1989-11-22 1995-10-31 Vestar, Inc. Lipid derivatives of phosphonacids for liposomal incorporation and method of use
US5026687A (en) 1990-01-03 1991-06-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Treatment of human retroviral infections with 2',3'-dideoxyinosine alone and in combination with other antiviral compounds
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
AU668873B2 (en) 1991-07-12 1996-05-23 Chimerix, Inc. Antiviral liponucleosides: treatment of hepatitis B
US5538848A (en) 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
US5703058A (en) 1995-01-27 1997-12-30 Emory University Compositions containing 5-fluoro-2',3'-didehydro-2',3'-dideoxycytidine or a mono-, di-, or triphosphate thereof and a second antiviral agent
US6391859B1 (en) 1995-01-27 2002-05-21 Emory University [5-Carboxamido or 5-fluoro]-[2′,3′-unsaturated or 3′-modified]-pyrimidine nucleosides
WO1996023506A1 (de) 1995-02-01 1996-08-08 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Verwendung von 5' substituierten nukleosiden zur hemmung von resistenzbildung bei der zytostatikabehandlung und arzneimittel, enthaltend diese nukleoside
GB9505025D0 (en) 1995-03-13 1995-05-03 Medical Res Council Chemical compounds
DE19514523A1 (de) 1995-04-12 1996-10-17 Schering Ag Neue Cytosin- und Cytidinderivate
US20080119427A1 (en) 1996-06-06 2008-05-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double Strand Compositions Comprising Differentially Modified Strands for Use in Gene Modulation
US5858389A (en) 1996-08-28 1999-01-12 Shaker H. Elsherbini Squalene is an antiviral compound for treating hepatitis C virus carriers
US6509320B1 (en) 1996-10-16 2003-01-21 Icn Pharmaceuticals, Inc. Purine L-nucleosides, analogs and uses thereof
ATE238328T1 (de) 1996-10-16 2003-05-15 Ribapharm Inc Monozyklische l-nukleoside, analoga und ihre anwendungen
BR9714349A (pt) 1996-10-16 2000-11-14 Icn Pharmaceuticals L-nucleosìdeos purina, seus análogos e utilizacões dos mesmos
ES2186660T3 (es) 1997-09-21 2003-05-16 Schering Corp Terapia de combinacion para erradicar hcv-rna detectable en pacientes con infeccion por hepatitis c cronica.
US6201262B1 (en) 1997-10-07 2001-03-13 Cree, Inc. Group III nitride photonic devices on silicon carbide substrates with conductive buffer interlay structure
US6703374B1 (en) 1997-10-30 2004-03-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Nucleosides for imaging and treatment applications
IL137164A0 (en) 1998-01-23 2001-07-24 Newbiotics Inc Enzyme catalyzed therapeutic agents
US7462605B2 (en) 1998-01-23 2008-12-09 Celmed Oncology (Usa), Inc. Phosphoramidate compounds and methods of use
WO1999043691A1 (en) 1998-02-25 1999-09-02 Emory University 2'-fluoronucleosides
US6787305B1 (en) 1998-03-13 2004-09-07 Invitrogen Corporation Compositions and methods for enhanced synthesis of nucleic acid molecules
US6475985B1 (en) 1998-03-27 2002-11-05 Regents Of The University Of Minnesota Nucleosides with antiviral and anticancer activity
AU766597B2 (en) 1998-05-15 2003-10-16 Schering Corporation Combination therapy comprising ribavirin and interferon alpha in antiviral treatment naive patients having chronic hepatitis C infection
DK1087778T3 (da) 1998-06-08 2005-12-19 Hoffmann La Roche Anvendelse af PEG-IFN-alfa og Ribavirin til behandling af kronisk hepatitis C
GB9816358D0 (en) 1998-07-27 1998-09-23 Angeletti P Ist Richerche Bio Enzyme inhibitors
PT2415776T (pt) 1998-08-10 2016-07-07 Novartis Ag Beta-l-2'-desoxi-nucleosidos para o tratamento da hepatite b
GB9821058D0 (en) 1998-09-28 1998-11-18 Univ Cardiff Chemical compound
WO2000037110A2 (en) 1998-12-18 2000-06-29 Schering Corporation Ribavirin-pegylated interferon alfa induction hcv combination therapy
US6923966B2 (en) 1999-04-08 2005-08-02 Schering Corporation Melanoma therapy
HK1053126A1 (zh) 1999-07-22 2003-10-10 新生物生物公司 酶催化的治疗活化
US7388370B2 (en) 2005-07-29 2008-06-17 Automotive Systems Laboratory Systems, Inc. Magnetic crash sensor
US6566365B1 (en) 1999-11-04 2003-05-20 Biochem Pharma Inc. Method for the treatment of Flaviviridea viral infection using nucleoside analogues
US6495677B1 (en) 2000-02-15 2002-12-17 Kanda S. Ramasamy Nucleoside compounds
KR20030005197A (ko) 2000-02-18 2003-01-17 샤이어 바이오켐 인코포레이티드 뉴클레오시드유도체를 이용한 플라비바이러스 감염의 치료또는 예방 방법
EP1964569A3 (en) 2000-04-13 2009-07-22 Pharmasset, Inc. 3'-or 2'-hydroxymethyl substituted nucleoside derivatives for treatment of viral infections
US6924270B2 (en) 2000-04-20 2005-08-02 Schering Corporation Ribavirin-interferon alfa combination therapy for eradicating detectable HCV-RNA in patients having chronic hepatitis C infection
MY164523A (en) 2000-05-23 2017-12-29 Univ Degli Studi Cagliari Methods and compositions for treating hepatitis c virus
EP1736478B1 (en) 2000-05-26 2015-07-22 IDENIX Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating flaviviruses and pestiviruses
US6787526B1 (en) 2000-05-26 2004-09-07 Idenix Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating hepatitis delta virus infection with β-L-2′-deoxy-nucleosides
EA005890B1 (ru) 2000-05-26 2005-06-30 Айденикс (Кайман) Лимитед СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ВИРУСОМ ГЕПАТИТА ДЕЛЬТА, С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ β-L-2'-ДЕЗОКСИНУКЛЕОЗИДОВ
MY141594A (en) 2000-06-15 2010-05-14 Novirio Pharmaceuticals Ltd 3'-PRODRUGS OF 2'-DEOXY-ß-L-NUCLEOSIDES
US6815542B2 (en) 2000-06-16 2004-11-09 Ribapharm, Inc. Nucleoside compounds and uses thereof
UA72612C2 (en) 2000-07-06 2005-03-15 Pyrido[2.3-d]pyrimidine and pyrimido[4.5-d]pyrimidine nucleoside analogues, prodrugs and method for inhibiting growth of neoplastic cells
US20020119443A1 (en) 2000-07-21 2002-08-29 Gilead Sciences, Inc. Prodrugs of phosphonate nucleotide analogues and methods for selecting and making same
AR029851A1 (es) 2000-07-21 2003-07-16 Dendreon Corp Nuevos peptidos como inhibidores de ns3-serina proteasa del virus de hepatitis c
AR039558A1 (es) 2000-08-21 2005-02-23 Inspire Pharmaceuticals Inc Composiciones y metodo para el tratamiento de glaucoma o hipertension ocular
US20030008841A1 (en) 2000-08-30 2003-01-09 Rene Devos Anti-HCV nucleoside derivatives
WO2002032920A2 (en) 2000-10-18 2002-04-25 Pharmasset Limited Modified nucleosides for treatment of viral infections and abnormal cellular proliferation
AU2002213343A1 (en) 2000-10-18 2002-04-29 Schering Corporation Ribavirin-pegylated interferon alfa HCV combination therapy
WO2002048165A2 (en) 2000-12-15 2002-06-20 Pharmasset Ltd. Antiviral agents for treatment of flaviviridae infections
SK286630B6 (sk) 2001-01-22 2009-02-05 Merck & Co., Inc. Nukleozidové deriváty, farmaceutický prostriedok s ich obsahom a ich použitie
US7105499B2 (en) 2001-01-22 2006-09-12 Merck & Co., Inc. Nucleoside derivatives as inhibitors of RNA-dependent RNA viral polymerase
GB0112617D0 (en) 2001-05-23 2001-07-18 Hoffmann La Roche Antiviral nucleoside derivatives
GB0114286D0 (en) 2001-06-12 2001-08-01 Hoffmann La Roche Nucleoside Derivatives
JP2004534830A (ja) 2001-06-21 2004-11-18 グラクソ　グループ　リミテッド Ｈｃｖにおけるヌクレオシド化合物
CA2449504A1 (en) 2001-07-11 2003-01-23 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Bridged bicyclic serine protease inhibitors
EP2335700A1 (en) 2001-07-25 2011-06-22 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. Hepatitis C virus polymerase inhibitors with a heterobicylic structure
WO2003024461A1 (en) 2001-09-20 2003-03-27 Schering Corporation Hcv combination therapy
EP1435974A4 (en) 2001-09-28 2006-09-06 Idenix Cayman Ltd METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF HEPATITIS C VIRUS USING 4 'MODIFIED NUCLEOSIDES
ES2289161T3 (es) 2001-11-02 2008-02-01 Glaxo Group Limited Derivados de 4-(heteroaril de 6 miembros)-acil pirrolidina como inhibidores de hcv.
AU2002365234B2 (en) 2001-12-14 2009-01-29 Pharmasset Inc N4-acylcytosine nucleosides for treatment of viral infections
WO2003051899A1 (en) 2001-12-17 2003-06-26 Ribapharm Inc. Deazapurine nucleoside libraries and compounds
AU2002364216A1 (en) 2001-12-21 2003-07-15 Micrologix Biotech Inc. Anti-viral 7-deaza l-nucleosides
WO2003062256A1 (en) 2002-01-17 2003-07-31 Ribapharm Inc. 2'-beta-modified-6-substituted adenosine analogs and their use as antiviral agents
US6642204B2 (en) 2002-02-01 2003-11-04 Boehringer Ingelheim International Gmbh Hepatitis C inhibitor tri-peptides
JP2005527499A (ja) 2002-02-13 2005-09-15 メルク　エンド　カムパニー　インコーポレーテッド ヌクレオシド化合物を用いてオルトポックスウイルスの複製を阻害する方法
WO2003072757A2 (en) 2002-02-28 2003-09-04 Biota, Inc. Nucleotide mimics and their prodrugs
JP2005524662A (ja) 2002-02-28 2005-08-18 ビオタ インコーポレーティッド ヌクレオシド５’−一リン酸模倣物およびこれらのプロドラッグ
AU2003241621A1 (en) 2002-05-24 2003-12-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having modified nucleoside units
US7449488B2 (en) 2002-06-04 2008-11-11 Schering Corporation Pyrazolopyrimidines as protein kinase inhibitors
WO2003105770A2 (en) 2002-06-17 2003-12-24 Merck & Co., Inc. Carbocyclic nucleoside derivatives as inhibitors of rna-dependent rna viral polymerase
AU2003248708A1 (en) 2002-06-17 2003-12-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds that include carbocyclic nucleosides and their use in gene modulation
WO2004000858A2 (en) 2002-06-21 2003-12-31 Merck & Co., Inc. Nucleoside derivatives as inhibitors of rna-dependent rna viral polymerase
EP1572945A2 (en) 2002-06-27 2005-09-14 Merck & Co., Inc. Nucleoside derivatives as inhibitors of rna-dependent rna viral polymerase
US7608600B2 (en) 2002-06-28 2009-10-27 Idenix Pharmaceuticals, Inc. Modified 2′ and 3′-nucleoside prodrugs for treating Flaviviridae infections
TW200500375A (en) 2002-06-28 2005-01-01 Idenix Cayman Ltd Modified 2' and 3'-nucleoside prodrugs for treating flaviviridae
PL374792A1 (en) 2002-06-28 2005-10-31 Idenix (Cayman) Limited 2' and 3'-nucleoside prodrugs for treating flaviviridae infections
CN1678326A (zh) 2002-06-28 2005-10-05 埃迪尼克斯(开曼)有限公司 用于治疗黄病毒感染的2'－c－甲基－3'－o－l－缬氨酸酯核糖呋喃基胞苷
JP2005531638A (ja) 2002-07-01 2005-10-20 ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー・エルエルシー Ｈｃｖｎｓ５ｂポリメラーゼ阻害剤
US6973905B2 (en) 2002-07-01 2005-12-13 Cinetic Automation Corporation Valve lash adjustment apparatus and method
WO2004002977A1 (en) 2002-07-01 2004-01-08 Pharmacia & Upjohn Company Llc Inhibitors of hcv ns5b polymerase
EP1556399A4 (en) 2002-07-16 2007-09-26 Merck & Co Inc Nucleoside derivatives as inhibitors of RNA-dependent viral RNA polymerase
WO2004009610A2 (en) 2002-07-24 2004-01-29 Ptc Therapeutics, Inc. Use of nucleoside compounds for nonsense suppression and the treatment of genetic diseases
WO2004009020A2 (en) 2002-07-24 2004-01-29 Merck & Co., Inc. Pyrrolopyrimidine thionucleoside analogs as antivirals
KR20050037559A (ko) 2002-07-25 2005-04-22 마이크로로직스 바이오테크, 인코포레이티드 항바이러스성 ７-데아자 ｄ-뉴클레오시드 및 그의 용도
TWI244393B (en) 2002-08-06 2005-12-01 Idenix Pharmaceuticals Inc Crystalline and amorphous forms of beta-L-2'-deoxythymidine
AU2003264038A1 (en) 2002-08-12 2004-02-25 Bristol-Myers Squibb Company Combination pharmaceutical agents as inhibitors of hcv replication
EP1572095B1 (en) 2002-09-13 2015-06-10 Novartis AG Beta-l-2'-deoxynucleosides for use in the treatment of resistant hbv strains
WO2004035571A1 (en) 2002-10-15 2004-04-29 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Substituted indoles and their use as hcv inhibitors
US20040229840A1 (en) 2002-10-29 2004-11-18 Balkrishen Bhat Nucleoside derivatives as inhibitors of RNA-dependent RNA viral polymerase
EA009943B1 (ru) 2002-11-01 2008-04-28 Вирофарма Инкорпорейтед Соединения бензофурана, композиции и способы лечения и профилактики инфекций, вызванных вирусом гепатита с, и связанных с ним заболеваний
WO2004041889A2 (en) 2002-11-05 2004-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
AU2003291755A1 (en) 2002-11-05 2004-06-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomers comprising modified bases for binding cytosine and uracil or thymine and their use
LT1576138T (lt) 2002-11-15 2017-06-26 Idenix Pharmaceuticals Llc 2`-šakoti nukleozidai derinyje su interferonu ir flaviviridae mutacija
TWI332507B (en) 2002-11-19 2010-11-01 Hoffmann La Roche Antiviral nucleoside derivatives
US7223785B2 (en) 2003-01-22 2007-05-29 Boehringer Ingelheim International Gmbh Viral polymerase inhibitors
WO2004080466A1 (en) 2003-03-07 2004-09-23 Ribapharm Inc. Cytidine analogs and methods of use
JP4733023B2 (ja) 2003-04-16 2011-07-27 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｃ型肝炎ウイルスの大環状イソキノリンペプチド阻害剤
US20050261237A1 (en) 2003-04-25 2005-11-24 Boojamra Constantine G Nucleoside phosphonate analogs
US7470724B2 (en) 2003-04-25 2008-12-30 Gilead Sciences, Inc. Phosphonate compounds having immuno-modulatory activity
WO2005002626A2 (en) 2003-04-25 2005-01-13 Gilead Sciences, Inc. Therapeutic phosphonate compounds
US7407965B2 (en) 2003-04-25 2008-08-05 Gilead Sciences, Inc. Phosphonate analogs for treating metabolic diseases
US7452901B2 (en) 2003-04-25 2008-11-18 Gilead Sciences, Inc. Anti-cancer phosphonate analogs
BRPI0409680A (pt) 2003-04-25 2006-04-18 Gilead Sciences Inc análogos de fosfonato anti-cáncer
EA014685B1 (ru) 2003-04-25 2010-12-30 Джилид Сайэнс, Инк. Фосфонатсодержащие антивирусные соединения (варианты) и фармацевтическая композиция на их основе
US20040259934A1 (en) 2003-05-01 2004-12-23 Olsen David B. Inhibiting Coronaviridae viral replication and treating Coronaviridae viral infection with nucleoside compounds
EP1656093A2 (en) 2003-05-14 2006-05-17 Idenix (Cayman) Limited Nucleosides for treatment of infection by corona viruses, toga viruses and picorna viruses
US20040229839A1 (en) 2003-05-14 2004-11-18 Biocryst Pharmaceuticals, Inc. Substituted nucleosides, preparation thereof and use as inhibitors of RNA viral polymerases
HUE029877T2 (en) 2003-05-30 2017-04-28 Gilead Pharmasset Llc Modified fluorinated nucleoside analogues
GB0317009D0 (en) 2003-07-21 2003-08-27 Univ Cardiff Chemical compounds
US20050075309A1 (en) 2003-07-25 2005-04-07 Richard Storer Purine nucleoside analogues for treating Flaviviridae including hepatitis C
NZ546055A (en) 2003-08-27 2010-05-28 Biota Scient Management Novel tricyclic nucleosides or nucleotides as therapeutic agents
CA2538252C (en) 2003-09-18 2014-02-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4'-thionucleosides and oligomeric compounds
EP1664091A1 (en) 2003-09-18 2006-06-07 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of serine proteases, particularly hcv ns3-ns4a protease
US20050148534A1 (en) 2003-09-22 2005-07-07 Castellino Angelo J. Small molecule compositions and methods for increasing drug efficiency using compositions thereof
WO2005036994A1 (en) 2003-10-14 2005-04-28 Lyco Manufacturing, Inc. High speed food product peeling or cleaning machine and method
JP2007509950A (ja) 2003-10-27 2007-04-19 バーテックス　ファーマシューティカルズ　インコーポレイテッド Ｈｃｖ処置の組合せ剤
US7026339B2 (en) 2003-11-07 2006-04-11 Fan Yang Inhibitors of HCV NS5B polymerase
TW200528459A (en) 2004-01-06 2005-09-01 Achillion Pharmaceuticals Inc Azabenzofuran substituted thioureas; inhibitors of viral replication
EP1718150A1 (en) 2004-02-25 2006-11-08 The Government of the United States of America, represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Methylation inhibitor compounds
US7820380B2 (en) 2004-05-07 2010-10-26 Celera Corporation Genetic polymorphisms associated with liver fibrosis
US8394947B2 (en) 2004-06-03 2013-03-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Positionally modified siRNA constructs
WO2005121634A1 (ja) 2004-06-08 2005-12-22 Tokyo Gas Co., Ltd. ガス吸着容器
CA2568379A1 (en) 2004-06-15 2005-12-29 Merck & Co., Inc. C-purine nucleoside analogs as inhibitors of rna-dependent rna viral polymerase
CA2571675A1 (en) 2004-06-23 2006-01-05 Idenix (Cayman) Limited 5-aza-7-deazapurine derivatives for treating infections with flaviviridae
CA2571079A1 (en) 2004-06-24 2006-02-02 Merck & Co., Inc. Nucleoside aryl phosphoramidates for the treatment of rna-dependent rna viral infection
CN101023094B (zh) 2004-07-21 2011-05-18 法莫赛特股份有限公司 烷基取代的2-脱氧-2-氟代-d-呋喃核糖基嘧啶和嘌呤及其衍生物的制备
EP2348029A1 (en) 2004-07-21 2011-07-27 Pharmasset, Inc. Preparation of alkyl-substituted 2-deoxy-2-fluoro-d-ribofuranosyl pyrimidines and purines and their derivatives
AU2005330489B2 (en) 2004-07-27 2011-08-25 Gilead Sciences, Inc. Nucleoside phosphonate conjugates as anti HIV agents
US7153848B2 (en) 2004-08-09 2006-12-26 Bristol-Myers Squibb Company Inhibitors of HCV replication
US7348425B2 (en) 2004-08-09 2008-03-25 Bristol-Myers Squibb Company Inhibitors of HCV replication
WO2006021341A1 (en) 2004-08-23 2006-03-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Antiviral 4’-azido-nucleosides
CA2577528A1 (en) 2004-08-23 2006-03-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Heterocyclic antiviral compounds
WO2006029081A2 (en) 2004-09-02 2006-03-16 Neopharm, Inc. Nucleoside-lipid conjugates, their method of preparation and uses thereof
US8492539B2 (en) 2004-09-14 2013-07-23 Gilead Pharmasset Llc Preparation of 2′-fluoro-2′-alkyl-substituted or other optionally substituted ribofuranosyl pyrimidines and purines and their derivatives
WO2006037028A2 (en) 2004-09-24 2006-04-06 Idenix (Cayman) Limited Methods and compositions for treating flaviviruses, pestiviruses and hepacivirus
KR20070058602A (ko) 2004-09-30 2007-06-08 티보텍 파마슈티칼즈 리미티드 Ｈｃｖ 저해 바이-사이클릭 피리미딘
EP1804812A4 (en) 2004-10-21 2009-09-02 Merck & Co Inc FLUORINATED PYRROLO [2,3-D] PYRIMIDIN NUCLEOSIDES FOR THE TREATMENT OF RNA-DEPENDENT RNA VIRUS INFECTIONS
AU2005302448B2 (en) 2004-10-29 2012-07-19 Biocryst Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic furopyrimidines and thienopyrimidines
US20060110724A1 (en) 2004-11-19 2006-05-25 Burkhardt William Iii Quantitative real-time assay for noroviruses and enteroviruses with built in quality control standard
EP1674104A1 (en) 2004-12-24 2006-06-28 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Uridine derivatives as antiviral drugs against a flaviviridae, especially HCV
WO2006093801A1 (en) 2005-02-25 2006-09-08 Abbott Laboratories Thiadiazine derivatives useful as anti-infective agents
AR058419A1 (es) 2005-02-28 2008-02-06 Gilead Sciences Inc Compuestos de nucleosidos triciclicos para tratar infecciones virales
US8030318B2 (en) 2005-03-25 2011-10-04 Tibotec Pharmaceuticals Ltd. Fused bicyclic inhibitors of HCV
US7405204B2 (en) 2005-04-25 2008-07-29 Genelabs Technologies, Inc. Nucleoside compounds for treating viral infections
WO2006121820A1 (en) 2005-05-05 2006-11-16 Valeant Research & Development Phosphoramidate prodrugs for treatment of viral infection
AR056347A1 (es) 2005-05-12 2007-10-03 Tibotec Pharm Ltd Uso de compuestos de pteridina para fabricar medicamentos y composiciones farmaceuticas
WO2006130627A2 (en) 2005-06-02 2006-12-07 Schering Corporation Methods for treating hepatitis c
US8143288B2 (en) 2005-06-06 2012-03-27 Bristol-Myers Squibb Company Inhibitors of HCV replication
US20060293752A1 (en) 2005-06-27 2006-12-28 Missoum Moumene Intervertebral disc prosthesis and associated methods
MX2008001166A (es) 2005-07-25 2008-03-18 Intermune Inc Nuevos inhibidores macrociclicos de la replicacion del virus de hepatitis c.
ES2373685T3 (es) 2005-07-29 2012-02-07 Tibotec Pharmaceuticals Inhibidores macrocíclicos del virus de la hepatitis c.
TWI393723B (zh) 2005-07-29 2013-04-21 Tibotec Pharm Ltd Ｃ型肝炎病毒之大環抑制劑（九）
CN101273042B (zh) 2005-07-29 2013-11-06 泰博特克药品有限公司 丙型肝炎病毒的大环抑制剂
PE20070211A1 (es) 2005-07-29 2007-05-12 Medivir Ab Compuestos macrociclicos como inhibidores del virus de hepatitis c
WO2007014922A1 (en) 2005-07-29 2007-02-08 Tibotec Pharmaceuticals Ltd. Macrocyclic inhibitors of hepatitis c virus
WO2007020193A2 (en) 2005-08-15 2007-02-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Antiviral phosphoramidates of 4 ' -substituted pronucleotides
EA200800932A1 (ru) 2005-09-26 2008-10-30 Фармассет, Инк. Модифицированные 4`-нуклеозиды в качестве противовирусных агентов
JP5116687B2 (ja) 2005-11-02 2013-01-09 バイエル・ファルマ・アクチェンゲゼルシャフト がんおよび他の過剰増殖性疾患の処置のためのピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−４−イルアミンＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤
CA2632626C (en) 2005-12-09 2011-10-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Ester prodrugs of 2'-fluoro-2'-alkyl-2'-deoxycytidines and their use in the treatment of hcv infection
CA2633541A1 (en) 2005-12-12 2007-06-21 Genelabs Technologies, Inc. N-(6-membered aromatic ring)-amido anti-viral compounds
EP1979349B1 (en) 2005-12-21 2010-07-28 Abbott Laboratories Anti-viral compounds
US7910595B2 (en) 2005-12-21 2011-03-22 Abbott Laboratories Anti-viral compounds
EP1987050A2 (en) 2006-02-14 2008-11-05 Merck & Co., Inc. Nucleoside aryl phosphoramidates for the treatment of rna-dependent rna viral infection
JP2009528989A (ja) 2006-02-17 2009-08-13 ファイザー・リミテッド Ｔｌｒ７変調剤としての３−デアザプリン誘導体
US8895531B2 (en) 2006-03-23 2014-11-25 Rfs Pharma Llc 2′-fluoronucleoside phosphonates as antiviral agents
US7521442B2 (en) 2006-05-25 2009-04-21 Bristol-Myers Squibb Company Cyclopropyl fused indolobenzazepine HCV NS5B inhibitors
US7456167B2 (en) 2006-05-25 2008-11-25 Bristol-Myers Squibb Company Cyclopropyl fused indolobenzazepine HCV NS5B inhibitors
US20080008682A1 (en) 2006-07-07 2008-01-10 Chong Lee S Modulators of toll-like receptor 7
PL2049506T5 (pl) 2006-07-07 2024-09-09 Gilead Sciences, Inc. Modulatory farmakokinetycznych właściwości leków
JP2009542698A (ja) 2006-07-07 2009-12-03 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド 抗ウイルスホスフィナート化合物
KR101143596B1 (ko) 2006-07-07 2012-05-11 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 신규의 피리다진 화합물 및 이의 용도
US8303944B2 (en) 2006-08-11 2012-11-06 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C virus inhibitors
US7659270B2 (en) 2006-08-11 2010-02-09 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C virus inhibitors
US8329159B2 (en) 2006-08-11 2012-12-11 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C virus inhibitors
US7759495B2 (en) 2006-08-11 2010-07-20 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C virus inhibitors
KR101057239B1 (ko) 2006-10-10 2011-08-16 에프. 호프만-라 로슈 아게 뉴클레오사이드 리보푸라노실 피리미딘의 제조
PL216525B1 (pl) 2006-10-17 2014-04-30 Ct Badań Molekularnych I Makromolekularnych Polskiej Akademii Nauk 5'-O-[(N-acylo)amidoditiofosforano] nukleozydy oraz sposób wytwarzania 5'-O-[(N-acylo)amidofosforano]-,5'-O-[(N-acylo)amidotiofosforano]-, 5'-O-[(N-acylo)amidoditiofosforano]nukleozydów
AU2007338899A1 (en) 2006-12-20 2008-07-03 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti S.P.A. Nucleoside cyclic phosphoramidates for the treatment of RNA-dependent RNA viral infection
US20080261913A1 (en) 2006-12-28 2008-10-23 Idenix Pharmaceuticals, Inc. Compounds and pharmaceutical compositions for the treatment of liver disorders
JP2010515680A (ja) 2007-01-05 2010-05-13 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション Ｒｎａ依存性ｒｎａウイルス感染症の治療用としてのヌクレオシドアリールホスホロアミデート
US7964580B2 (en) 2007-03-30 2011-06-21 Pharmasset, Inc. Nucleoside phosphoramidate prodrugs
EP2142215B1 (en) * 2007-05-04 2012-03-07 Vertex Pharmceuticals Incorporated Combination therapy for the treatment of hcv infection
US7741347B2 (en) 2007-05-17 2010-06-22 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C virus inhibitors
GB0709791D0 (en) 2007-05-22 2007-06-27 Angeletti P Ist Richerche Bio Antiviral agents
JPWO2008156094A1 (ja) 2007-06-19 2010-08-26 杏林製薬株式会社 ピリダジノン誘導体及びそれらを有効成分とするｐｄｅ阻害剤
CA2691444C (en) 2007-06-29 2016-06-14 Gilead Sciences, Inc. Purine derivatives and their use as modulators of toll-like receptor 7
WO2009005677A2 (en) 2007-06-29 2009-01-08 Gilead Sciences, Inc. Antiviral compounds
EA019749B1 (ru) 2007-06-29 2014-06-30 Джилид Сайэнс, Инк. Противовирусные соединения
UA99466C2 (en) 2007-07-06 2012-08-27 Гилиад Сайенсиз, Инк. Crystalline pyridazine compound
CN101108870A (zh) 2007-08-03 2008-01-23 冷一欣 核苷磷酸酯类化合物及制备方法和应用
US7728027B2 (en) 2007-08-08 2010-06-01 Bristol-Myers Squibb Company Process for synthesizing compounds useful for treating hepatitis C
US8629171B2 (en) 2007-08-08 2014-01-14 Bristol-Myers Squibb Company Crystalline form of methyl ((1S)-1-((25)-2-(5-(4'-(2-((25)-1((2S)-2-((methoxycarbonyl)amino)-3-methylbutanoyl)-2-pyrrolidinyl)-1H-imidazol-2-yl)-1-pyrrolidinyl)carbonyl)-2-methylpropyl)carbamate dihydrochloride salt
EP2489369A1 (en) 2007-09-14 2012-08-22 Merck Sharp & Dohme Corp. A method of treating Hepatitis C patients
JO2778B1 (en) 2007-10-16 2014-03-15 ايساي انك Certain Compounds, Compositions and Methods
DE102007052070A1 (de) 2007-10-30 2009-05-07 Tiefenbacher Pharmachemikalien Alfred E. Tiefenbacher Gmbh & Co. Kg Candesartancilexetil
JP5238939B2 (ja) 2007-11-07 2013-07-17 三菱化学株式会社 長繊維強化複合樹脂組成物および成形品
CA2710958A1 (en) 2008-01-11 2009-07-16 Antaria Limited Visibly transparent uv photoprotective compositions
DK2250163T3 (da) 2008-02-12 2012-07-16 Bristol Myers Squibb Co Hepatitis C-virusinhibitorer
WO2009102325A1 (en) 2008-02-13 2009-08-20 Bristol-Myers Squibb Company Imidazolyl biphenyl imidazoles as hepatitis c virus inhibitors
US7704992B2 (en) 2008-02-13 2010-04-27 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C virus inhibitors
US8147818B2 (en) 2008-02-13 2012-04-03 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C virus inhibitors
US8227431B2 (en) 2008-03-17 2012-07-24 Hetero Drugs Limited Nucleoside derivatives
US20110130440A1 (en) 2008-03-26 2011-06-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Non-natural ribonucleotides, and methods of use thereof
WO2009129120A2 (en) 2008-04-15 2009-10-22 Rfs Pharma, Llc Nucleoside derivatives for treatment of caliciviridae infections, including norovirus infections
EA201071034A1 (ru) 2008-04-15 2011-06-30 Интермьюн, Инк. Новые макроциклические ингибиторы репликаций вируса гепатита с
HUE025528T2 (en) 2008-04-23 2016-05-30 Gilead Sciences Inc 1'-substituted carba-nucleoside analogs for antiviral treatment
US8173621B2 (en) 2008-06-11 2012-05-08 Gilead Pharmasset Llc Nucleoside cyclicphosphates
AU2009269772A1 (en) 2008-07-10 2010-01-14 Prosidion Limited Piperidinyl GPCR agonists
US7906655B2 (en) 2008-08-07 2011-03-15 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C virus inhibitors
US7921612B2 (en) 2008-08-31 2011-04-12 United Construction Products, Inc. Method and device for supporting a structure
US8383094B2 (en) 2008-10-01 2013-02-26 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C virus inhibitors
DE102008057284A1 (de) 2008-11-14 2010-05-20 Ratiopharm Gmbh Tabletten enthaltend Lenalidomid und Adhäsionsverstärker
US8729077B2 (en) 2008-11-28 2014-05-20 Glaxosmithkline Llc Anti-viral compounds, compositions, and methods of use
WO2010065674A1 (en) 2008-12-03 2010-06-10 Presidio Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of hcv ns5a
CA2750577A1 (en) 2008-12-03 2010-06-10 Presidio Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of hcv ns5a
RS53347B (sr) 2008-12-09 2014-10-31 Gilead Sciences, Inc. Modulatori toll-sličnih receptora
NZ593649A (en) 2008-12-23 2013-11-29 Gilead Pharmasset Llc Nucleoside analogs
PA8855601A1 (es) 2008-12-23 2010-07-27 Forformidatos de nucleósidos
AU2009329872B2 (en) 2008-12-23 2016-07-07 Gilead Pharmasset Llc Synthesis of purine nucleosides
MX2011007194A (es) 2009-01-07 2013-07-12 Scynexis Inc Combinacion de un derivado ciclosporina y nucleosidos para tratar virus de hepatitis c (vhc).
US8759318B2 (en) 2009-01-09 2014-06-24 Inhibitex, Inc. Phosphoramidate derivatives of guanosine nucleoside compounds for treatment of viral infections
EP2393359A4 (en) 2009-02-09 2012-10-03 Enanta Pharm Inc COMPOUND DIBENZIMIDAZOLE DERIVATIVES
WO2010096462A1 (en) 2009-02-17 2010-08-26 Enanta Pharmaceuticals, Inc Linked diimidazole derivatives
TWI438200B (zh) 2009-02-17 2014-05-21 必治妥美雅史谷比公司 Ｃ型肝炎病毒抑制劑
WO2010094977A1 (en) 2009-02-23 2010-08-26 Arrow Therapeutics Limited Novel biphenyl compounds useful for the treatment of hepatitis c
US20120040977A1 (en) 2009-02-23 2012-02-16 Presidio Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of hcv ns5a
RU2544010C2 (ru) 2009-02-27 2015-03-10 Энанта Фармасьютикалс, Инк. Ингибиторы вируса гепатита с
JP2012521359A (ja) 2009-03-20 2012-09-13 アリオス バイオファーマ インク． 置換されたヌクレオシドアナログおよびヌクレオチドアナログ
SG174883A1 (en) 2009-03-27 2011-11-28 Presidio Pharmaceuticals Inc Fused ring inhibitors of hepatitis c
DK2410844T3 (en) 2009-03-27 2016-07-04 Merck Sharp & Dohme Inhibitors of hepatitis C virus replication
US8709999B2 (en) 2009-03-27 2014-04-29 Presidio Pharmaceuticals, Inc. Substituted bicyclic HCV inhibitors
TWI476190B (zh) 2009-03-30 2015-03-11 必治妥美雅史谷比公司 Ｃ型肝炎病毒抑制劑
US8796466B2 (en) 2009-03-30 2014-08-05 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C virus inhibitors
DE102009015702A1 (de) 2009-03-31 2010-10-07 Ratiopharm Gmbh Tabletten enthaltend Dapoxetin und Trockenverarbeitungsverfahren zu deren Herstellung
TW201038559A (en) 2009-04-09 2010-11-01 Bristol Myers Squibb Co Hepatitis C virus inhibitors
US8143414B2 (en) 2009-04-13 2012-03-27 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C virus inhibitors
US9278922B2 (en) 2009-04-15 2016-03-08 Abbvie Inc. Anti-viral compounds
MX2011011136A (es) 2009-04-24 2011-11-18 Tibotec Pharm Ltd Eteres diarilicos.
EP2430015B1 (en) 2009-05-12 2015-06-17 Merck Sharp & Dohme Corp. Fused tricyclic compounds useful for the treatment of viral diseases
HUE030465T2 (hu) 2009-05-13 2017-05-29 Antivirális vegyületek
US8618076B2 (en) 2009-05-20 2013-12-31 Gilead Pharmasset Llc Nucleoside phosphoramidates
TWI583692B (zh) * 2009-05-20 2017-05-21 基利法瑪席特有限責任公司 核苷磷醯胺
EP2435421A1 (en) 2009-05-29 2012-04-04 Schering Corporation Antiviral compounds composed of three aligned aryl moieties to treat diseases such as hepatitis c
JP2012528195A (ja) 2009-05-29 2012-11-12 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーション Ｃ型肝炎などの疾患を処置するための３つの結合アリール部分で構成された抗菌性化合物
US8138215B2 (en) 2009-05-29 2012-03-20 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C virus inhibitors
US8211928B2 (en) 2009-05-29 2012-07-03 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C virus inhibitors
EA020031B1 (ru) 2009-06-11 2014-08-29 Эббви Бахамаз Лтд. Противовирусные соединения
US8221737B2 (en) 2009-06-16 2012-07-17 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Hepatitis C virus inhibitors
WO2010148006A1 (en) 2009-06-16 2010-12-23 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Hepatitis c virus inhibitors
WO2011004276A1 (en) 2009-07-06 2011-01-13 Pfizer Limited Hepatitis c virus inhibitors
SG177516A1 (en) 2009-07-13 2012-02-28 Menicon Co Ltd Chitosan hydrogel derivatives as a coating agent with broad spectrum of antimicrobial activities
AU2010274001A1 (en) 2009-07-16 2012-02-23 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Benzimidazole analogues for the treatment or prevention of Flavivirus infections
EP2467144A1 (en) 2009-07-24 2012-06-27 ViroLogik GmbH Combination of proteasome inhibitors and anti-hepatitis medication for treating hepatitis
WO2011015658A1 (en) 2009-08-07 2011-02-10 Tibotec Pharmaceuticals Bis-benzimidazole derivatives as hepatitis c virus inhibitors
WO2011015657A1 (en) 2009-08-07 2011-02-10 Tibotec Pharmaceuticals Phenyl ethynyl derivatives as hepatitis c virus inhibitors
FR2949465B1 (fr) 2009-09-01 2011-08-12 Pf Medicament Derives chromones, leur procede de preparation et leurs applications therapeutiques
AU2010291215A1 (en) 2009-09-03 2012-02-23 Janssen Sciences Ireland Uc Bis-benzimidazole derivatives
CN102480971B (zh) 2009-09-04 2014-11-26 杨森制药公司 化合物
US9156818B2 (en) 2009-09-11 2015-10-13 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Hepatitis C virus inhibitors
WO2011031934A1 (en) 2009-09-11 2011-03-17 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Hepatitis c virus inhibitors
CN102596958A (zh) 2009-09-21 2012-07-18 吉里德科学公司 用于抗病毒治疗的2’-氟代carba-核苷类似物
US8415374B2 (en) 2009-10-12 2013-04-09 Bristol-Myers Squibb Company Combinations of hepatitis C virus inhibitors
WO2011050146A1 (en) 2009-10-23 2011-04-28 Glaxosmithkline Llc Chemical compounds
UA108211C2 (uk) 2009-11-04 2015-04-10 Янссен Рід Айрленд Бензімідазолімідазольні похідні
CN102055717B (zh) 2009-11-09 2014-08-13 华为技术有限公司 快速播放的方法、终端及服务器
US20110274648A1 (en) 2009-11-11 2011-11-10 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C Virus Inhibitors
US20110269956A1 (en) 2009-11-11 2011-11-03 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C Virus Inhibitors
US20110281910A1 (en) 2009-11-12 2011-11-17 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C Virus Inhibitors
EP2503881B1 (en) 2009-11-25 2015-05-13 Merck Sharp & Dohme Corp. Fused tricyclic compounds and derivatives thereof useful for the treatment of viral diseases
US20110137633A1 (en) 2009-12-03 2011-06-09 Abbott Laboratories Anti-viral compounds and methods of identifying the same
US8653070B2 (en) 2009-12-14 2014-02-18 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Hepatitis C virus inhibitors
US8377980B2 (en) 2009-12-16 2013-02-19 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C virus inhibitors
MX2012006877A (es) 2009-12-18 2012-08-31 Idenix Pharmaceuticals Inc Inhibidores de virus de hepatitis c de arileno o heteroarileno 5, 5 - fusionado.
PH12012501216A1 (en) * 2009-12-18 2012-11-05 Boehringer Ingelheim Int Hcv combination therapy
US20110152246A1 (en) 2009-12-18 2011-06-23 Intermune, Inc. Novel inhibitors of hepatitis c virus replication
AU2010341537A1 (en) 2009-12-22 2012-08-09 Merck Sharp & Dohme Corp. Fused Tricyclic Compounds and methods of use thereof for the treatment of viral diseases
MX2012007420A (es) 2009-12-24 2012-07-23 Vertex Pharma Analogos para el tratamiento o prevencion de infecciones de flavivirus.
US8362020B2 (en) 2009-12-30 2013-01-29 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C virus inhibitors
MX2012008211A (es) 2010-01-15 2012-08-08 Gilead Sciences Inc Inhibidores de virus flaviviridae.
WO2011091446A1 (en) 2010-01-22 2011-07-28 Glaxosmithkline Llc Chemical compounds
EP2545060B1 (en) 2010-03-09 2015-11-25 Merck Sharp & Dohme Corp. Fused tricyclic silyl compounds and methods of use thereof for the treatment of viral diseases
UY33310A (es) 2010-03-31 2011-10-31 Pharmasset Inc Sintesis estereoselectiva de activos que contienen fosforo
SG184324A1 (en) 2010-03-31 2012-11-29 Gilead Pharmasset Llc Nucleoside phosphoramidates
US8563530B2 (en) 2010-03-31 2013-10-22 Gilead Pharmassel LLC Purine nucleoside phosphoramidate
BR112012026124A2 (pt) 2010-04-13 2016-11-22 Hoffmann La Roche previsão de resposta virológica precoce no tratamento de hcv
US20110312996A1 (en) 2010-05-17 2011-12-22 Intermune, Inc. Novel inhibitors of hepatitis c virus replication
TW201201815A (en) 2010-05-28 2012-01-16 Gilead Sciences Inc 1'-substituted-carba-nucleoside prodrugs for antiviral treatment
WO2011156757A1 (en) 2010-06-10 2011-12-15 Gilead Sciences, Inc. Combination of anti-hcv compounds with ribavirin for the treatment of hcv
AU2011282241B2 (en) 2010-07-19 2015-07-30 Gilead Sciences, Inc. Methods for the preparation of diasteromerically pure phosphoramidate prodrugs
US8859595B2 (en) 2010-08-26 2014-10-14 Rfs Pharma, Llc Potent and selective inhibitors of hepatitis C virus
BR112013008017A2 (pt) 2010-09-20 2016-06-14 Gilead Sciences Inc análogos de carba-nucleosídeo 2-flúor substituídos para tratamento antiviral
EP2621931A4 (en) 2010-09-29 2014-03-19 Merck Sharp & Dohme TETRAZYCLIC INDOLE DERIVATIVES FOR THE TREATMENT OF HEPATITIS C VIRUS INFECTIONS
WO2012048421A1 (en) 2010-10-14 2012-04-19 Boehringer Ingelheim International Gmbh Hepatitis c inhibitor compounds
US20120107278A1 (en) 2010-10-29 2012-05-03 Pharmasset, Inc. Abbreviated hcv therapy for hcv infected patients with il28b c/c genotype
NZ710567A (en) 2010-11-17 2017-01-27 Gilead Sciences Inc Antiviral compounds
CA2818853A1 (en) 2010-11-30 2012-06-07 Gilead Pharmasset Llc 2'-spirocyclo-nucleosides for use in therapy of hcv or dengue virus
US20130273005A1 (en) * 2010-12-20 2013-10-17 Gilead Sciences, Inc. Methods for treating hcv
WO2012087976A2 (en) 2010-12-21 2012-06-28 Intermune, Inc. Novel inhibitors of hepatitis c virus replication
RU2013146234A (ru) 2011-03-31 2015-05-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Выбор терапии гепатита с
US8655250B2 (en) 2011-03-31 2014-02-18 Xerox Corporation Apparatus and method for marking material fix level control in a printing apparatus
JP2014520772A (ja) 2011-06-30 2014-08-25 ステラ・アンパルトセルスカブ Ｈｃｖ併用療法
EP2709613B2 (en) 2011-09-16 2020-08-12 Gilead Pharmasset LLC Methods for treating hcv
DE202012012955U1 (de) † 2011-10-21 2014-07-14 Abbvie Inc. Eine Kombination aus mindestens zwei direkt wirkenden antiviralen Wirkstoffen (DAAs) für die Verwendung zur Behandlung von HCV
US8466159B2 (en) 2011-10-21 2013-06-18 Abbvie Inc. Methods for treating HCV
US8492386B2 (en) 2011-10-21 2013-07-23 Abbvie Inc. Methods for treating HCV
EP2583677A3 (en) † 2011-10-21 2013-07-03 Abbvie Inc. Methods for treating HCV comprising at least two direct acting antiviral agent, ribavirin but not interferon.
BR112014010295A2 (pt) 2011-10-31 2017-04-18 Gilead Pharmassett Llc métodos e composições para o tratamento de vírus de hepatite c
US20130109647A1 (en) 2011-10-31 2013-05-02 Gilead Pharmasset Llc Methods and compositions for treating hepatitis c virus
CN105837584B (zh) 2011-11-16 2018-07-13 吉利德制药有限责任公司 作为抗病毒化合物的缩合的咪唑基咪唑
JP5899327B2 (ja) 2011-11-29 2016-04-06 ギリアド ファーマセット エルエルシー Ｃ型肝炎ウイルスを処置するための組成物および方法
US8889159B2 (en) 2011-11-29 2014-11-18 Gilead Pharmasset Llc Compositions and methods for treating hepatitis C virus
WO2013101550A1 (en) 2011-12-29 2013-07-04 Abbvie Inc. Solid compositions comprising an hcv inhibitor
US20150087045A1 (en) 2012-01-13 2015-03-26 Gilead Pharmassset Llc Crystal structure of hcv polymerase complexes and methods of use
US9056860B2 (en) 2012-06-05 2015-06-16 Gilead Pharmasset Llc Synthesis of antiviral compound
US8969588B2 (en) 2012-06-05 2015-03-03 Gilead Pharmasset Llc Solid forms of an antiviral compound
EP2950786B1 (en) 2013-01-31 2019-11-27 Gilead Pharmasset LLC Combination formulation of two antiviral compounds
TW201446286A (zh) 2013-01-31 2014-12-16 Gilead Pharmasset Llc 抗病毒化合物之固態分散調製劑
WO2014137929A1 (en) 2013-03-04 2014-09-12 Gilead Pharmasset Llc Methods for treating hepatitis c virus
WO2014185995A1 (en) 2013-05-16 2014-11-20 Gilead Pharmasset Llc Hepatitis c treatments with sofosbuvir

Also Published As

Publication number Publication date
KR20140096029A (ko) 2014-08-04
CR20140177A (es) 2014-08-18
JP2017057230A (ja) 2017-03-23
DK2709613T3 (en) 2018-02-26
LT2709613T (lt) 2018-02-12
KR20190075142A (ko) 2019-06-28
SI2709613T1 (en) 2018-01-31
DE202012013382U1 (de) 2016-08-23
EA201490588A1 (ru) 2015-01-30
AU2012308295B2 (en) 2017-10-26
SI2709613T2 (sl) 2020-12-31
PL2709613T5 (pl) 2020-12-14
DE202012013074U1 (de) 2014-10-29
EA026667B9 (ru) 2017-07-31
CA2840242A1 (en) 2013-03-21
MX2014003145A (es) 2014-04-30
KR101991298B1 (ko) 2019-06-21
HK1231378A1 (zh) 2017-12-22
CN104244945B (zh) 2016-08-31
ES2659216T5 (es) 2021-06-09
CA2840242C (en) 2019-03-26
US20130243726A1 (en) 2013-09-19
EA026667B1 (ru) 2017-05-31
DE202012013074U8 (de) 2015-02-19
BR112014006324B8 (pt) 2019-02-12
US9393256B2 (en) 2016-07-19
IL231515A0 (en) 2014-04-30
US20160354425A1 (en) 2016-12-08
ECSP14013312A (es) 2014-06-30
JP6073897B2 (ja) 2017-02-01
CO6930366A2 (es) 2014-04-28
EP2709613B1 (en) 2017-11-29
EP2709613A2 (en) 2014-03-26
UA116087C2 (uk) 2018-02-12
MX354958B (es) 2018-03-27
AU2012308295A1 (en) 2014-04-17
CL2014000630A1 (es) 2014-11-07
PH12014500557A1 (en) 2014-05-26
MD4589B1 (ro) 2018-08-31
JP2014526516A (ja) 2014-10-06
JP6220994B2 (ja) 2017-10-25
PE20141056A1 (es) 2014-09-05
ES2659216T3 (es) 2018-03-14
BR112014006324A2 (pt) 2016-06-07
US20170189439A1 (en) 2017-07-06
HRP20180237T4 (hr) 2020-12-11
PT2709613T (pt) 2018-02-16
ME03009B (me) 2018-10-20
PL2709613T3 (pl) 2018-05-30
MD4589C1 (ro) 2019-03-31
CN104244945A (zh) 2014-12-24
SG11201400664WA (en) 2014-04-28
SG10201602044WA (en) 2016-04-28
HRP20180237T1 (hr) 2018-03-09
AP2014007575A0 (en) 2012-04-30
SMT201800087T1 (it) 2018-03-08
CY1119896T1 (el) 2018-06-27
DK2709613T4 (da) 2020-11-16
MD20140035A2 (ro) 2014-08-31
NZ623396A (en) 2016-07-29
NZ720391A (en) 2017-10-27
IL231515A (en) 2017-05-29
WO2013040492A2 (en) 2013-03-21
MX336580B (es) 2016-01-22
TR201802537T4 (tr) 2018-03-21
HUE036588T2 (hu) 2018-07-30
EP2709613B2 (en) 2020-08-12
WO2013040492A3 (en) 2013-07-25
BR112014006324B1 (pt) 2018-12-26
CN106166160A (zh) 2016-11-30
US10456414B2 (en) 2019-10-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2709613B1 (en) Methods for treating hcv
JP6162206B2 (ja) Ｈｃｖを処置するための組合せ
WO2011156757A1 (en) Combination of anti-hcv compounds with ribavirin for the treatment of hcv
AU2011349844A1 (en) Combinations for treating HCV
EP2734515B1 (en) Thiophen-2-carboxylic acid derivatives useful as inhibitors of flaviviridae viruses
HK1194692A (en) Methods for treating hcv
HK1194692B (en) Methods for treating hcv
NZ720391B2 (en) Methods for treating HCV