RS56989B1

RS56989B1 - Lečenje pedijatrijske akutne limfoblastne leukemije

Info

Publication number: RS56989B1
Application number: RS20180309A
Authority: RS
Inventors: Gerhard Zugmaier
Original assignee: Amgen Res Munich Gmbh
Priority date: 2008-11-07
Filing date: 2009-11-06
Publication date: 2018-05-31
Also published as: HUE036922T2; PT3330293T; CN102209729A; RS59348B1; CY1122428T1; PL3330293T3; RU2677324C2; HRP20180426T1; RU2018144313A; SI3330293T1; DK2918604T3; CA2742242A1; PT2344539E; RU2736802C2; EP2344539A1; DK3330293T3; HUE025452T2; ES2535257T3; CN102209729B; CY1116160T1

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na konstrukte CD19xCD3 bispecifičnih jednolančanih antitela za upotrebu u postupku lečenja, poboljšanja ili eliminacije pedijatrijske akutne limfoblastne leukemije (ALL) kod pedijatrijskog ALL pacijenta kod koga postoji potreba za tim, pri čemu je pacijent pozitivan ili negativan za Filadelfija hromozom.

[0002] Sa aktuelnim tretmanom/lečenjem dečje ALL, stope preživljavanja bez događaja su oko 75%. Prema tome, relaps je i dalje čest. Problemi u rešavanju relapsa ALL su otpornost leukemijskih ćelija i smanjena tolerancija pacijenata na drugi krug lečenja nakon što je već primljena prva intenzivna terapija, što dovodi do manje brzine remisije kao i veće učestalosti naknadnog relapsa i slabijeg ukupnog ishoda. Intenzivna poli-hemoterapija je trenutno suštinska za indukciju druge potpune remisije. Zavisno od različitih prognostičkih faktora, remisija može da se održava hemoterapijom i kranijalnim zračenjem, pojedinačno ili uz intenziviranje tretmana transplantacijom matičnih ćelija (Henze G, von Stackelberg A, Relapsed acute lymphoblastic leukemia. In: Childhood Leukemias, C-H Pui ed. Cambridge: Cambridge University Press; 2006, p.473-486).

[0003] lako je postignut veliki uspeh u lečenju dece sa akutnom limfoblastnom leukemijom (ALL) (videti npr. Moricke et al., Blood 111 (2008), p. 4477; Moghrabi et al, Blood 109 (2007), p. 896), relapsiran ALL je i dalje četvrti najčešći pedijatrijski malignitet (Gaynon, Cancer 82 (1998), p. 1387). Posebno kod pacijenata sa ranim relapsom kostne srži u toku tri godine od dijagnoze, terapija za ove pacijente je nezadovoljavajuća i alogena transplantacija matičnih ćelija je jedini do sada poznat lekovit pristup. Hemorefraktorni relaps nakon transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija (HSCT) povezan je sa lošom prognozom, iako post-transplantacione infuzije limfocita donora (DLI) mogu da indukuju remisije kod nekoliko pacijenata preko indukcije efekta transplanta-protiv-leukemije (GvL) (Loren et al., BMT 41 (2008), p.483). Druga HSCT može da bude opcija i prijavljeni su neki pacijenti koji su imali dugotrajno preživljavanje. Međutim, status bolesti pre HSCT je prediktivan za posttransplantacioni ishod i poznato je da su pacijenti sa morfološkom bolešću ili doslednim nivoima MRD od >10<-4>leukemijskih blasta pod veoma visokim rizikom od relapsa i veoma lošeg ishoda (Baderet al., J Clin Oncol. 27 (2009), p. 377-84). U svetlu ovog, status bolesti pre druge HSCT je od najveće važnosti i potrebni su svi napori da bi se postigla sledeća remisija. Uprkos upotrebi nedavno uvedenih hemoterapeutskih agenasa za refraktornu leukemiju (Jeha, Semin Hematol. 46 (2009), 76-88), pacijenti sa relapsom posle HSCT često imaju hemorefraktornu bolest i ovi pacijenti su vrlo podložni toksičnosti od hemoterapije. Za takve pacijente ne-hemoterapeutske i manje toksične strategije su potrebne za indukciju remisija.

S obizrom na prethodno navedene nedostatke uobičajenih pedijatrijskih ALL terapija, i dalje postoji potreba za poboljašnim režimom lečenja.

Predmetni pronalazak se odnosi na konstrukte CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela za upotrebu u postupku lečenja, poboljšanja ili eliminacije pedijatrijske akutne limfoblastne leukemije (ALL), kod pedijatrijskih pacijenata sa ALL kod kojih postoji potreba za tim, pri čemu je navedeni pacijent pozitivan ili negativan za Filadelfija hromozom. Ovaj imunološki pristup primenom antitela koja aktiviraju T ćelije po prvi put obezbeđuju nehemoterapeutski i manje toksičan tretman za pedijatrijski ALL pozitivab ili negativan za Filadelfija hromozom.

Nedavno, faza I ispitivanja je pokazala značajnu kliničku aktivnost CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela (blinatumomaba) kog relapsiranog CD19-pozitivnog B-ćelijskog ne-Hodčkinovog limfoma (NHL) time što su zabeležene impresivne delimične i potpune regresije tumora (Bargou et at., Science 321 (2008): 974-7). Anderson et al. (Blood J. 80 (1992): 2826-34) opisuju bispecifičan heterokonjugat između anti-CD19 i anti-CD3 antitela za koji je navedeno da pokreće lizu akutnih limfoblastnih leukemijskih ćelija.

U sledećem, kliničkom ispitivanju koje je i dalje u toku, tretman sa prethodno navedenim CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom doveo je do eliminacije hemorefraktornih leukemijskih ćelija u netransplantiranim MRD-pozitivnim odraslim pacijentima sa CD19+ ALL.

Sada je neočekivano nađeno u dve upotrebe iz samilosti da navedeno CD19xCD3 bispecifično jednolančano antitelo nije samo pogodno za lečenje ALL kod odraslih pacijenta bez transplanta, već i za pedijatrijske (ili dečije) relapsirane ALL kod pacijenata pozitivnih ili negativnih za Filadelfija hromozom, otporne na standardnu terapiju za ALL, uključujući hemoterapiju i alogenu tranplantaciju hematopoetskih matičnih ćelija (HSCT).

Ovde, pronalazači su objavili snažan anti-leukemijski efekat CD19xCD3 bispecifičnog antitela kod dva deteta (nadalje označeni kao pacijent 1 i 2) sa B-prekursorskom akutnom limfoblastnom leukemijom (ALL), koja su imala hemorefraktorni relaps posle alogene transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija hematopoeze (HSCT) od odgovarajućih nesrodnih i haploidentičnih donora.

Pre tretmana sa CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom, pacijent 1 je prethodno tretiran alogenim HSCT i višestrukim hemoterapijama. Međutim, ove uobičajene pedijatrijske terapije ALL su neuspešne tako da se pacijentu više puta vraća bolest, što za posledicu ima izuzetno lošu prognozu. U daljem tekstu, pedijatrijski ALL pacijent je primao 15 mikrograma/m<2>/24 časa, CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela kao kontinuiranu infuziju tokom pet nedelja. Tokom lečenja antitelom, pacijent je imao ekspanziju CD8+ T-limfocita koji potiču od donora bez bilo kakvih znakova bolesti transplanta protiv domaćina (GvHD). Ova ekspanzija T-ćelija je povezana sa brzom eliminacijom pacijentovih leukemijskih blasta i 10 dana nakon početka tretmana antitelom, u kostnoj srži pacijenta nisu detektovani blasti preko nivoa 1 detekcije minimalne rezidualne bolesti (MRD) od ukupno 10000. Pacijent je ostao MRD-negativan tokom tretmana antitelom. Pacijent je podvrgnut drugoj transplantaciji matičnih ćelija od svoje haploidentične majke 2 nedelje nakon završetka tretmana sa CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom i od tada ostao MRD-negativan (status novembar 2009.).

[0004] Petnaestogodišnji pacijent 2 je dijagnostikovan sa Fildelfija hromozom pozitivnom i CD19-pozitivnim B-prekursorom ALL u aprilu 2001. Nakon hemoterapije, primio je HSCT od HLA-identičnog brata ili sestre u oktobru 2001. U 2002., dijagnostikovan je relaps kostne srži i postignuta je još jedna remisija sa matinibom i hemoterapijom. Zatim je primio drugi HSCT od HLA-identičnog nesrodnog donora u oktobru 2004. U martu 2008, dijagnostikovan je drugi relaps i tretiran je hemoterapijom u niskoj dozi i dasatinibom usled rezistencije na imatinib. Posle dodatne hemoterapije klofarabinom i citozinom/arabinozidom postigao je molekulsku remisiju i dobio treći alogeni HSCT od haploidentičnog oca koji ima 3 od 6 neodgovarajućih HLA-alela, zatim je obavljen post-transplantacioni tretman dasatinibom. Zbog gastrointestinalnog krvarenja i dilatativne kardiomiopatije, prekinuto je davanje dasatiniba u trajanju od 5 meseci posle transplantacije. U aprilu 2009., dijagnostikovan je kombinovan relaps centralnog nervnog sistema (CNS) sa 7x10<9>/L blasta u CNS-u i 3% blasta u kostnoj srži. Pacijent je zatim tretiran sa nilotinibom, intratekalnom hemoterapijom i frakcionim zračenjem CNS-a sa 18 Gy. Tri meseca nakon ovog tretmana, kostna srž pacijenta je ostala MRD-pozitivna u nivou od 1.1 x10<-3>, dok u CNS-u nema blasta. Analiza himerizima perferne krvi otrkila je potpunu hematopoezu poreklom od donora koja potiče od njegovog haploidentičnog oca.

Pacijent je zatim tretiran jednim agensom blinatumomabom od 15 µg/m<2>/dan tokom 4 nedelje, kontinuiranom infuzijom bez bilo kakvih sporednih efekata. Aspiracija kostne srži na kraju tretmana pokazala je potpunu remisiju sa nedetektabilnim MRD u kostnoj srži ispod <1x10<-4>. Kao pacijent 1, pacijent 2 nije pokazao bilo kakve znakove GvHD tokom ili posle tretmana blinatumomabom. Trenutno je dobro i ide u školu.

Ovi podaci pokazuju da bispecifična antitela koja aktiviraju T-ćelije mogu da indukuju snažan efekat transplanta-protiv-leukemije (GvL) u odsustvu GvHD kod pedijatrijskih pacijenata sa relapsom i terapijski-refraktornom B-prekursorskom ALL nakon alogene HSCT. Prema tome, poželjno je u ovde opisanom tretmanu pedijatrijskih pacijenata da konstrukt CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela indukuje efekat transplanta-protiv-leukemije (GvL). Dodatno, tretman su dobro podneli pedijatrijski pacijenti. U svetlu ovoga, postupci pronalaska obezbeđuju neočekivano poboljšanu opciju tretmana za pedijatrijsku akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL) pacijenata pozitivnih ili negativnih za Filadelfija hromozom, a posebno, za slučajeve u kojima pedijatrijska ALL kod pacijenata pozitivnih ili negativnih za Filadelfija hromozom je refraktorna na uobičajenu pedijatrijsku ALL terapiju, uključujući hemoterapiju i/ili alogeni HSCT. Shodno tome, i u narednim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, ovde korišćeni konstrukti bispecifičnog antitela koji aktivira T-ćelije (anti CD19xCD3) se takođe mogu primeniti kod pedijatrijskih pacijenata koji su podvrgnuti (alogenoj) transplantaciji hematopoetskih matičnih ćelija (HSCT). Kao što je ovde ilustrovano, čak i pedijatrijski pacijenti sa relapsom ALL posle HSCT od podudarnih nesrodnih i haploidentičnih donora i/ili pedijatrijski pacijenti koji su refraktorni za hemoterapiju, mogu se uspešno lečiti postupcima koji su ovde opisani. Primeri pacijenata kao što su ovde dokumentovani, pokazali su impresivan anti-leukemijski odgovor pomoću farmaceutske intervencije kao što je ovde opisana i postali su MRD negativni u odsustvu bilo kakvih znakova GvHD (bolest transplanta-protiv-domaćina). Iako je preživaljavanje dece sa ALL dramatično poboljšan tokom poslednjih dekada, relaps ALL je i dalje glavni uzrok neuspeha lečenja. Za pacijente u drugom relapsu, alogena HSCT je jedini kurativni pristup do sada. Jedan od glavnih anti-leukemijskih dejstava HSCT je indukcija GvL efekta. Nažalost, pojava GvL je često povezana sa GvHD, koji je i dalje glavni uzrok morbiditeta i mortaliteta posle HSCT. Prema tome, indukcija GvL u odsustvu GvHD je tema opsežnog istraživanja. Jedan pristup za indukciju efekta GvL je post-transplantaciona donorska limfocitna infuzija (DLI), koja se poželjno koristi za lečenje relapsa ALL posle HSCT. Dok je DLI veoma efikasna u lečenju CML (Kolb, Blood 76 (1990), 2462), manje je efikasna u post-transplantacionom lečenju relapsa ALL (Loren, BMT 41 (2008), 483) i često dovodi do pojave GvHD.

[0005] Farmaceutski i medicinski postupci predmetnog pronalaska obezbeđuju novi pristup za indukciju GvL bez GvHD. Ovaj pristup je in vivo aktivacija limfocita poreklom od donora posle HSCT upotrebom niskih doza CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela koje aktivira T ćelija, koje usmerava T-limfocite protiv blasta CD19+ ALL pacijenta. Ovo antitelo je pokazalo impresivnu aktivnost protiv limfoma i protiv leukemije u autolognoj situaciji, ali nikad nije testirano kod relapsa pedijatrijskog ALL posle HSCT. Dva pedijatrijska pacijenta koja su opisana u primerima koji slede imali su relaps svojih ALL posle HSCT od podudarnog nesrodnog donora ili haploidentičnog donora i bili su refraktorni za hemoterapiju. Pacijenti su pokazali impresivan anti-leukemijski odgovor posle početka tretmana i postali su MRD negativni u odsustvu bilo kojih znakova GvHD. Imunološko dejstvo CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela je nezavisno od prezentacije peptidnog antigena i ovo je najverovatnije razlog da uprkos opsežne in vivo ekspanzije T ćelija poreklom od donora, nije indukovan GvHD. Niske doze CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela su bile dovoljne da eliminišu blaste ALL u pacijentu iznad nivoa detekcije MRD. Na taj način, način delovanja ovog antitela tako što aktivira T ćelije se veoma razlikuje od uobičajenih antitela, koji zahtevaju mnogo veće doze i koji ne mogu da aktiviraju T-ćelije preko njihovog Fc dela molekula antitela usled nedostatka Fc receptora na T-ćelijama. Preko CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela, visoko efikasne efektorske T-ćelije mogu postati citotoksične prema ALL blastima bez indukovanja aloreaktivnog imunog odgovora koji dovodi do GvHD. Pronalazači su odlučili da izvedu drugi alogeni HSCT od haploidentičnog donora kod pacijenta 1 nakon što je postao MRD negativan. Do danas (novembar 2009), pacijent je i dalje MRD negativan.

[0006] Od polaznog kliničkog iskustva kod ova dva pacijenta sa hemorefraktornim relapsom ALL post-transplantata, zaključeno je da CD19xCD3 bispecifično jednolančano antitelo može da indukuje impresivne potpune remisije bez GvHD. Prema tome, tretman sa CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom u pre-transplantacionim okvirima za imunološku redukciju leukemijskog opterećenja i za tretman post-transplantacionih relapsa nude nove terapeutske šanse za pediatrijske pacijente sa uznapredovalom ALL kod pacijenata pozitivnih ili negativnih za Filadelfija hromozom.

[0007] Postupak predmetnog pronalaska obezbeđuje sledeće glavne prednosti:

1. Kao što je prikazano u primerima koji slede, primena CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela se može upotrebiti za terapiju pedijatrijske akutne limfoblaste leukemije (ALL) kod pacijenta pozitivnih ili negativnih za Filadelfija hromozom, koja je u relapsu ili je refraktorna. Ne samo da CD19xCD3 bispecifično jednolančano antitelo može da zameni uobičajene terapije pedijatrijske akutne limfoblastne leukemije (ALL) kod pacijenata pozitivnih ili negativnih za Filadelfija hromozom (kao što je hemoterapija) kod pedijatrijskih pacijenata koji nisu podobni za alogenu transplantaciju matičnih ćelija. Takođe se može upotrebiti za konverziju pedijatrijskih ALL pacijenta pozitivnih ili negativnih za Filadelfija hromozom podobnih za transplantaciju u MRD negativan-status. Ovaj aspekt pronalaska je važan zbog toga što MRD-negativni pacijenti imaju niži rizik od relapsa posle transplantacije od MRD-pozitivnih pacijenata. U najboljem slučaju, terapije pedijatrijske ALL kod pacijenata pozitivnih ili negativnih za Filadelfija hromozom sa CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom čini hemoterapiju i/ili HSCT suvišnom.

2. Pedijatrijski pacijenti sa morfološkom bolešću ili stalnim nivoima MRD od >10<-4>leukemijskih blasta poznati su po tome što imaju veoma visok rizik od relapsa i veoma loš ishod (Bader et aL, J Clin Oncol. 27 (2009), p. 377-84). Deca tretirana CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom pokazala su impresivan anti-leukemijski odgovor nakon početka tretmana i postala su MRD negativna tokom tretmana, bez bilo kakvih znakova GvHD. Farmaceutski postupci prema pronalasku prema tome obezbeđuju terapeutski pristup za lečenje, poboljšanje ili eliminaciju MRD kod pedijatrijske ALL kod pacijenata pozitivnih ili negativnih za Filadelfija hromozom, smanjujući ili čak eliminišući na taj način, rizik od repalsa za pacijenta. Kurativni potencijal alogenog HSCT zavisi od nivoa MRD pre transplantacije. Tretman sa CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom može se koristiti za konverziju navedenih visokorizičnih pedijatrijskih pacijenata u MRD-negativan status. Prema tome, MRD u refraktornom dečjem ALL kod pacijenata pozitivnih ili negativnih za Filadelfija hromozom može se tretirati CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom po prvi put.

3. Farmaceutski postupci prema pronalasku ne pokazuju samo snažan anti-leukemijski efekat, već su takođe manje toksični i izazivaju manje štetnih efekata od uobičajene terapije za pedijatrijsku ALL, uključujući hemoterapiju i/ili alogenu HSCT. Do sada nisu primećeni dugotrajni štetni efekti nakon tretmana sa CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom. Nasuprot tome, uobičajene terapije pedijatrijske ALL su veoma agresivne i shodno tome povezane sa značajnim zdravstvenim rizicima za pedijatrijske pacijente. Dodatno, kasni efekti su prijavljeni posle uobičajene terapije za ALL kod dece (videti npr. Hudson MM, Late complications after leukemia therapy. In: Childhood Leukemias, C-H Pui ed. Cambridge: Cambridge University Press; 2006, p. 750-773; Schmoll, Hoffken, Possinger: Kompendium Internistische Onkologie, S. 2660 ff.; 4. Auflage, Springer Medizin Verlag Heidelberg; htto://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/tretman/lateeffects/HealthProfessional). Ustvari, uobičajeni tretmani pedijatrijske ALL koriste još agresivnije režime tretiranja od terapeutskih pristupa koji se primenjuju za ALL kod odraslih. Međutim, kao što je evidentno iz 25% relapsa kod pedijatrijskih ALL, čak ni ove agresivne terapije nisu dovoljne da konačno izleče sve pacijente. U tom smislu, još je veće iznenađenje da tretman refraktornih i/ili relapsirajućih pedijatrijskih ALL pacijenta pozitivnih ili negativnih za Filadelfija hromozom, sa CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom može da status pacijenata prevede u MRD negativan status što nudi nove terapeutske šanse za takve visoko-rizične pacijente. Ovo je rezultat koji se ne bi mogao postići sa uobičajenom terapijom pedijatrijske ALL, kao što je hemoterapija i/ili HSCT.

4. Na primer, Ph+ ALL (bcr/abl) pediatrijski pacijenti nose veoma visok rizik od relapsa među svim pacijentima unutar svih podtipova ALL (videti u daljem tekstu). Iako se alogena HSCT trenutno smatra izabranim tretmanom kod pedijatrijskih Ph+ ALL, približno kod jedne trećine pacijenata sa transplantatom dolazi do relapsa. Osim toga, kao što će kasnije biti izneto detaljnije, bebe (<12 meseci) sa ALL su u većem riziku od neuspeha tretmana uobičajenim ili standardnim načinom za ALL, uz najslabiju prognozu za pacijente sa MLL (t(4;11)) rearanžmanom gena. Rezultati prikazani za pacijenta 2 u sledećim primerima i podaci dobijeni u gore navedenom kliničkom ispitivanju tretmana odraslih pacijenata sa (bez transplantata) ALL koje je u toku ukazuju da čak Ph+ ALL (bcr/abl) mogu biti uspešno tretirani primenom CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela. Primena CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela prema tome nudi novi terapeutski pristup za pedijatrijsku Ph+ ALL, naročito za pacijente sa pedijatrijskom ALL sa minimalnom rezidualnom bolešću (MRD). Ovo važi za minimalnu rezidualnu bolest (MRD) definisanu npr. sa PCR ili FACS analizom.

5. Usled veoma visoke citotoksične aktivnosti, samo niske doze CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela su dovoljne za uspešan tretman pedijatrijske ALL, što omogućava eliminaciju leukemijskih ćelija čak u kostnoj srži.

6. Kraće trajanje tretmana sa CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antiteom u poređenju sa uobičajenom terapijom pedijatrijske ALL. Uobičajena hemoterapija pedijatrijske ALL traje obično 2 do 3 godine, dok veoma brz odgovor na CD19xCD3 bispecifično jednolančano antitelo bi se mogao zabeležiti kod pedijatrijskih pacijenata pozitivnih ili negativnih za Filadelfija hromozom prikazanim u sledećim primerima. Pored toga, odgovor je dugotrajan: Pacijent 1 je ostao MRD-negativan duže od 12 meseci posle transplantacije; videti sledeće primere.

7. Pedijatrijski ALL pacijenti sa relapsom često imaju hemorefraktornu bolest i ovi pacijenti su veoma podložni toksičnosti povezanoj sa hemoterapijom. Za ove pacijente, tretman sa CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom obezbeđuje po prvi put nehemoterapeutsku i manje toksičnu strategiju za indukovanje remisija kod takvih pacijenata.

8. Kao što je zabeleženo u gore opisanom kliničkom ispitivanju ALL na odraslim pacijentima koja su u toku, tretman sa CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom doveo je do eliminacije hemorefraktornih leukemijskih ćelija kod ne transplantiranih MRD-pozitivnih odraslih pacijenata sa CD19+ ALL. Dok su kod ovih pacijenata aktivirane citotoksične T-ćelije poreklom od pacijenta, do sada ne postoje podaci o upotrebi CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela nakon alogene HSCT u postavkama u kojima aktivirane T-ćelije vode poreklo od donora. Ovde, pronalazači su po prvi put objavili snažnu indukciju GvL efekta bez GvHD idukovanog CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom koje aktivira T-ćelije koje vode poreklo od donora kod dva pedijatrijska pacijenta sa hemorefraktornim relapsom CD19+ALL posle alogene HSCT.

[0008] Ukratko, tretman sa CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom obezbeđuje novu i poboljšanu trapiju za pedijatrijsku ALL kod pacijenata pozitivnih ili negativnih za Filadelfija hromozom, posebno za refraktornu i/ili relapsiranu pedijatrijsku ALL.

[0009] U poželjnom primeru izvođenja farmaceutskih postupaka pronalaska, pedijatrijska ili dečija akutna limfoblastna leumkemija (ALL) kod pacijenata pozitivnih ili negativnih za Filadelfija hromozom je pedijatrijska ALL B-ćelijske linije, poželjno pedijatrijska B-prekursorska akutna limfoblastna leukemija ALL, poželjnije pedijatrijska pro-B ALL, pre-B ALL, ili uobičajena ALL (cALL). Čak poželjnije, pedijatrijska B-prekursorska ALL je uobičajena ALL (cALL).

[0010] Velika većina slučajeva pedijatrijske ili dečije ALL (>85%) su B prekursorskog ćelijskog fenotipa (Schultz et al., Blood 109 (2007): 926-935). Budući da je ovde opisano CD19xCD3 bispecifično jednolančano antitelo usmereno protiv markera povezanog za B ćeliju CD19, navedeno antitelo je posebno pogodno kao terapeutski agens za pedijatrijsku akutnu limfoblastnu leukemiju B linije, poželjnije za pediatrijsku B-prekusorsku ALL. Pediatrijska B-prekursorska ALL se može dalje podeliti na pedijatrijsku pro-B ALL, pre-B ALL i uobičajenu ALL (cALL) (videti npr. Behm F.G., lmmunophenotyping. In: Childhood Leukemias, C-H Pui ed. Cambridge: Cambridge University Press; 2006, p. 150-209). Pedijatrijska akutna limfoblasta leukemija (ALL), uključujući pedijatrijsku B-prekursorsku akutnu limfoblastnu leukemiju i druge tipove pedijatrijske ALL B (ćelijske) linije, i njihovi tretmani su prikazani npr. u Pui CH, Clin Adv Hematol Oncol. 4 (2006): 884-6: Pui CH, Evans WE, N Engl J Med 354 (2006): 166-178; Pui CH et al., Lancet 371 (2008): 1030-1043; Pui CH, Jeha S, Nat Rev Drug Discov 6 (2007): 149-165). Dodatne informacije o pedijatrijskoj ALL takođe se mogu naći npr.. pod http://www.cancer.gov ili http://www.leukemialymphoma.org.

[0011] Sa istorijske tačke gledišta, Pediatric Oncology Group (POG) i Children's Cancer Group (CCG) su prihvatili zajednički set kriterijuma rizika na međunarodnoj konferenciji podržanoj od strane National Cancer Institute (Smith M, et a.„ J Clin Oncol 14 (1996), 18-24), 1993. godine. Kriterijumi NCI su bazirani na faktorima koji su međunarodno priznati i koji su ponovljivi; starost, početan broj leukocita (WBC), i prisustvo ekstramedularne bolesti pri dijagnozi. Za dalje usavršavanje terapije, i POG i CCG su takođe koristili dodatne faktore rizika za koje je pokazano da imaju uticaja na ishode kod pacijenata (npr. ploidija, kariotip blasta i rani morfološki odgovor). 2000. godine, CCG i POG su zajedno formirali Children's Oncology Group (COG). Ovo spajanje je omogućilo analizu kliničkih, bioloških podataka, i podataka o ranim odgovorima prediktivnim za preživljavanje bez događaja (EFS) kod akutne limfoblastne leukemije (ALL) da bi se razvio novi sistem klasifikacije i algoritam tretmana. Od 11 779 dece (starosi 1 do 21.99 godina) sa novo-dijagnostifikovanom B-prekursorskom ALL koja su uzastopno uključivana od strane CCG (decembar 1988. do avgusta 1995., n = 4986) i POG (januar 1986. do novembar 1999., n = 6793), ispitivanja su retroaktivno analizirala 6238 pacijenata (CCG, 1182; POG, 5056) sa informativnim citogenetičkim podacima (Schultz et al., Blood 109 (2007): 926-935). Četiri rizične grupe su definisane kao visoko rizične grupe (VHR; 5-godina EFS, 45% ili manje), grupe nižeg rizika (5-godina EFS, najmanje 85%), i grupe standardnog i visokog rizika (one preostale u odgovarajućim grupama rizika pri National Cancer Institute [NCI]). VHR kriterijumi su uključivali ekstremnu hipodiploidiju (manje od 44 hromozoma), t(9;22) i/ili BCR/ABL, i neuspešna indukciju. Pacijenti pod nižim rizikom su bili grupa NCI pod standardim rizikom sa t(12;21) (TEL/AML1) ili istovremenom trizomijom hromozoma 4, 10 i 17. Čak i sa razlikama u tretmanu, postoji visoka saglasnot između CCG i POG analiza. Šema klasifikacije COG rizika je korišćena za podelu B-prekursorskog ALL u nisko- rizične grupe (27%), grupe standardnog rizika (32%), visoko rizične (37%), i veoma visoko (4%) rizične grupe na bazi starosti, broja leukocita (WBC), citogenetike, odgovora kostne srži na dan 14 i minimalne rezidualne bolesti (MRD) na kraju indukcije pomoću protočne citometrije u COG ispitivanjima.

[0012] Trenutno, primenjena je raspodela tremana bazirana na riziku za dečiju ili pedijatrijsku akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL). Ovaj pristup omogućava deci koji imaju istoriju dobrog ishoda da se tretiraju umerenom terapijom i da se poštede intenzivnijeg i toksičnog tretmana, dok se deci sa istorijski manjom verovatnoćom dugotrajnog preživljavanja omogućava da prime intenzivniju terapiju kojom se može povećati šansa njihovog izlečenja. Nađeno je da starija deca i adolescenti (≥10 godina) i bebe (<12 meseci) imaju manje povoljan ishod od dece starosi 1 do 9 godina pri dijagnozi, i agresivniji tretmani su obično primenjeni kod ovih pacijenata (Nachman J, Br J Haematol 130 (2005): 166-73). Tretman sa CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom obezbeđuje sada poboljšanu, manje toksičnu terapiju za takvu populaciju pedijatrijskih pacijenata, tj. stariju decu i adolescente (≥10 godina ) i bebe (<12 meseci), koji imaju manje povoljan ishod lečenja sa uobičajenom terapijom za lečenje ALL, kao što je hemoterapija i/ili HSCT. Uspešan tretman dece sa ALL zahteva kontrolu sistemske bolesti (npr., kostne srži, jetre i slezine, limfnih čvorova) kao i prevenciju ili tretman ekstramedularne bolesti, posebno u centralnom nervnom sistemu (CNS). Samo 3% pacijenata ima detektabilno učešće CNS, u nivou koji se može detektovati, pomoću uobičajenih kriterijuma pri dijagnozi (≥5 WBC/mikrolitru sa prisutnim limfoblastnim ćelijama). Osim ako je specifična terapija usmerena ka CNS-u, onda 50% do 70% ili više dece će na kraju razviti očiglednu leukemiju CNS-a. Prema tome, trenutno je preporučljivo da bi sva deca sa ALL trebalo da prime sistemsku kombinovanu hemotearpiju zajedno sa izvesnim oblikom profilakse CNS. Trenutno, većina grupa tretira pacijente sa dokumentovanom leukemijom CNS-a pri dijagnozi (>5 WBC/pl sa blastima; CNS3), i one sa T ćelijskim fenotipom i visokim brojem WBC pri dijagnozi, intratekalnom terapijom i naknadnim kranijalnim zračenjem. Shodno tome, tretman sa CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom se poželjno izvodi u kombinaciji sa profilaksom CNS, kao što je intratekalna terapija i/ili kranijalna radijacija.

[0013] Uobičajeni ili standardni tretman za decu sa ALL podeljen je u dva stadijuma: indukcija remisije, konsolidacija ili pojačanje, i održavanje (ili nastavak) terapije, sa terapijom CNS-a koja je obično obezbeđena u svakom stadijumu. Faza pojačanja terapije posle indukcije remisije je korišćena za sve pacijente. Intenzitet indukcione terapije i postindukcione terapije određen je pomoću kliničkih i bioloških prognostičkih faktora korišćenih za dodelu tretmana na bazi rizika ili procenu određenog tipa ranog odgovora. Ova procena može da obuhvata procenat blasta kostne srži na dan 7 i/ili dan 14, broj blasta periferne krvi na dan 8 i određivanja minimalne rezidualne bolesti u kostnoj srži i/ili perifernoj krvi ili na kraju indukcije (Pui CH, Evans WE, N Engl J Med 354 (2006): 166-78). Trajanje terapije za decu sa ALL je u opsegu između 2 i 3 godine. Nasuport tome, veoma brzi odgovor na tretman sa CD19xCD3 bispecifičnoim jednolančanim antitelom se može zabeležiti kod pedijatrijskih pacijenata, kao što je prikazano u sledećim primerima. Pored toga, pacijent 1 je MRD negativan do danas (novembar 2009.), što ukazuje na to da se može postići dugoročno izlečenje. Podgrupe pacijenata koji imaju loše prognoze sa trenutnom standardnom ili uobičajenom terapijom mogu da zahtevaju različit tretman. Na primer, bebe sa ALL su pod većim rizikom od neuspeha tretmana, sa najlošijom prognozom za one sa MLL rearanžmanima gena (Rubnitz JE, et al.; Blood 84 (1994): 570-3; Biondi A, et al., Blood 96 (2000): 24-33; Pui CH, et al. Lancet 359 (2002): 1909- 15; SHverman LB, et al.: Cancer 80 (1997): 2285-95). Ova deca su obično tretirana režimima koji su specifično dizajnirani za bebe (Silverman, et al., (1997), loc. cit., Chessells JM, et al., J Haematol 117 (2002): 306-14; Reaman GH, et al., J Clin Oncol 17(1999): 445-55; Pieters R, et al, Lancet 370 (2007): 240-50). Sadašnji režimi za bebe koriste pristupe pojačanih tretmana i mogu da ponude poboljšanu kontrolu bolesti u poređenju sa prethodnim manje intenzivnim pristupima, međutim duogorčni ishod i toksičnost nisu poznati (Reaman (1999), loc. cit.; Pieters (2007), loc. cit.; Kosaka Y, et al., Blood 104 (2004): 3527- 34; Hilden JM, et al., Blood 108 (2006): 441-51). Neka deca (starija od 1 godine) sa ALL mogu da imaju manje od 50% verovatnoće za dugoročnu remisiju sa sadašnjom terapijom (npr., t[9;22] Filadelfija hromozom pozitivni ALL, hipodiploidni pacijenti i oni sa neuspehom inicijalne indukcije). Za ove pacijente, razmatra se alogena transplantacija koste srži od sestre ili brata koji su podudarni za humani leukocitarni antigen (HLA), tokom prve remisije (Snyder DS, et al., Leukemia 13 (1999): 2053-8; Aricd M, et al., N Engl J Med 342 (2000): 998-1006; Schrauder A, et al., J Clin Oncol 24 (2006): 5742-9). HLA-podudarni transplant donora brata ili sestre, međutim, nije potvrđen kao koristan kod pacijenata definisanih kao visoko rizični isključivo prema broju WBC, polu i starosti (Ribera JM, et al, J Clin Oncol 25 (2007): 16-24).

Budući da su mijelosupresija i opšta imunosupresija unapred očekivane posledice leukemije i njenog tretmana hemoterapijom, pacijenti se moraju pažljivo pratiti tokom uobičajenog tretmana pedijatrijske ALL. Odgovarajući resursi moraju da budu trenutno dostupni za hematološku podršku i za tretman infekcija i drugih komplikacija tokom svih faza lečenja leukemije. Približno 1% pacijenata umre tokom indukcione terapije i još 1% do 3% umre tokom prve remisije od komplikacija povezanih sa tretmanom (Christensen MS, et al., Br J Haematol 131 (2005): 50-8).

Tretman sa CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom obezbeđuje alternativnu i manje toksičnu terapiju za pedijatrijske ALL, posebno za refraktornu i/ili relapsirajuću pedijatrijsku ALL. Navedeni tretman izbegava nedostatke uobičajenih terapija dečije ALL, kao što su neuspeh lečenja, toksičnost i dugotrajni štetni efekti. Prema tome, on je visoko efikasna, ali manje toksična i rizična za zadravlje alternativa hemoterapiji i/ili alogenoj HSCT.

[0014] Shodno ovome, u sledećem primeru izvođenja farmaceutskih postupaka pronalaska, navedena akutna limfoblastna leukemija (ALL) kod pacijenata pozitivnih ili negativnih za Filadelfija hromozom je refraktorna i/ili relapsirajuća ALL kod pacijenata pozitivnih ili negativnih za Filadelfija hromozom.

Pedijatrijska ALL kod pacijenata pozitivnih ili negativnih za Filadelfija hromozom može biti refraktorna na hemoterapiju ili alogenu transplantaciju hematopoetskih matičnih ćelija (HSCT) ili na hemoterapiju i alogenu transplantaciju hematopoetskih matičnih ćelija (HSCT). ALL kod pacijenata pozitivnih ili negativnih za Filadelfija hromozom može da bude relapsirana ALL kod pacijenata pozitivnih ili negativnih za Filadelfija hromozom ili relapsirana ALL kod pacijenata pozitivnih ili negativnih za Filadelfija hromozom refraktorna na uobičajenu terapiju za ALL, uključujući hemoterapiju i/ili alogenu transplantaciju hematopoetskih matičnih ćelija (HSCT). Međutim, takođe je pronalaskom obuhvaćeno i to da je ALL kod pacijenata pozitivnih ili negativnih za Filadelfija hromozom -novodijagnostifikovana ALL. U ovom slučaju, tretman sa CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom se može koristiti kao prva terapija, bilo pojedinačno ili u kombinaciji sa HSCT.

Izraz "refraktorna pedijatrijska ALL" kao što je ovde korišćen označava otpornost pedijatrijske ALL na uobičajenu ili standardnu terapiju pedijatrijske ALL, kao što su hemoterapija i/ili HSCT. Trenutno, stopa relapsa kod pedijatrijske ALL iznosi oko 25%. Drugim rečima: uobičajena ili standarna terapija pedijatrijske ALL nije u mogućnosti da na kraju izleči sve pedijatrijske pacijente.

[0015] Izraz "relapsirana pedijatrijska ALL" kao što je ovde korišćen označava povratak znakova i simptoma ALL bolesti nakon što je pedijatrijski pacijent imao remisiju. Na primer, posle uobičajenog tretmana ALL upotrebom hemoterapije i/ili HSCT, pedijatrijski ALL pacijent može da ode u remisiju bez znakova i simptoma ALL, ostane u remisiji nekoliko godina, ali zatim pretrpi relaps i mora opet da bude podvrgnut tretmanu za ALL.

Pedijatrijski ALL pacijenti sa relapsom često imaju hemorefraktornu bolest. Ovi pacijenti su veoma podložni toksičnosti povezanoj sa hemoterapijom koja se može izbeći tretmanom sa CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom.

Izraz "standardna terapija" ili "uobičajena terapija" kao što je ovde korišćen odnosi se na terapiju pedijatrijske ALL upotrebom hemoterapije i/ili HSCT. Pedijatrijska akutna limfoblastna leukemija (ALL), uključujući pedijatrijsku B-prekursorsku akutnu limfoblastnu leukemiju i druge vrste pedijatrijskih ALL B (ćelijske) linije i njihovi tretmani prikazani su npr. u Pui CH, Clin Adv Hematol Oncol. 4 (2006): 884- 6; Pui CH, Evans WE, N Engl J Med 354 (2006): 166-178; Pui CH et al, Lancet 371 (2008): 1030-1043; Pui CH, Jeha S, Nat Rev Drug Discov 6 (2007): 149-165); Henze G, von Stackelberg A, Relapsed acute lymphoblastic leukemia. In. Childhood Leukemias, C-H Pui ed. Cambridge: Cambridge University Press; 2006, p. 473-486). Dodatne informacije o pedijatrijskoj ALL takođe se mogu naći npr. pod http://www.cancer.gov ili http://www.leukemia-lymphoma.org.

[0016] Izraz "bispecifično jednolančano antitelo" ili "jednolančano bispecifično antitelo" ili srodni izrazi u skladu sa predmetnim pronalaskom označavaju konstrukte antitela koji su nastali spajanjem najmanje dva varijabilna regiona antitela u jedan polipeptidni lanac bez konstantnog i/ili Fc dela (delova) prisutnih u celim imunoglobulinima. Bispecifično jednolančano antitelo kao što je ovde dato je funkcionalno, tj. citotoksično aktivno, kao monomer i prema tome se jasno razlikuje od diatela ili tandaba opisanih u tehnici koja su funkcionalna samo kao dimeri ili multimeri. "Linker" kao što je ovde korišćen povezuje V domene iste specifičnosti, dok "spejser" kao što je ovde korišćen povezuje V domene različitih specifičnosti. Na primer, bispecifično jednolančano antitelo može da bude konstrukt sa ukupno dva varijabilna regiona antigena, na primer dva VH regiona od kojih je svaki sposoban da se specifično vezuje za poseban antigen i da se vezuju međusobno preko kratkog (obično manje od 10 aminokiselina) sintetičkog polipeptidnog spejsera tako da dva varijabilna regiona antitela sa ubačenim spejserom postoje kao jedan kontinuirani polipeptidni lanac. Sledeći primer bispecifičnog jednolančanog antitela može biti jedan polipeptidni lanac sa tri varijabilna regiona antitela. Ovde, dva varijabilna regona antitela, na primer jedan VH i jedan VL, mogu da naprave scFv, pri čemu su dva varijabilna regiona antitela međusobno povezani sintetičkim polipeptidnim linkerom, pri čemu je ovaj često dobijen genetičkim inženjeringom tako da je minimalno imunogen pri čemu je ostao maksimalno rezistentan na proteolizu. Ovaj scFv je sposoban da se specifično veže za određeni antigen, i vezan je za dodatni varijabilni region antitela, na primer VH region, sposoban za vezivanje za antigen različit od onog koji je vezan za scFv. Sledeći primer bispecifičnog jednolančanog antitela koje može da bude jednolačani polipeptid sa četiti varijabilna regiona antitela. Ovde, prva dva varijabilna regiona antitela, na primer VH region i VL region, mogu da formiraju jedan scFv koji je sposoban da se veže za jedan antigen, dok drugi VH region i VL region mogu da formiraju drugi scFv koji je sposoban da se veže za drugi antigen. Unutar jednog kontinuiranog polipeptidnog lanca, pojedinačni varijabilni regioni antitela jedne specifičnost mogu povoljno biti razdvojeni sintetičkim polipeptidnim linkerom kao što je prethodno opisan, dok se odgovarajući scFvs može povoljno razdvojiti kratkim polipeptidnim spejeserom kao što je prethodno opisano. Neograničavajući primeri bispecifičnih jednolančanih antitela kao i postupaka za njihovu proizvodnju prikazani su u WO 99/54440, WO 2004/106381, WO 2007/068354, Mack, J. Immunol. (1997), 158, 3965-70; Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-5; Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-7; Löffler, Blood, (2000), 95, 6, 2098-103; Brühl, J. Immunol., (2001), 166, 2420-2426.

[0017] Kao što je ovde korišćen, "CD3" označava antigen koji je eksprimiran na T ćelijama, poželjno humanim T ćelijama kao deo multimolekularnog kompleksa receptora T ćelija, CD3 se sastoji od pet različitih lanaca: CD3-epsilon, CD3-gama, CD3-delta, CD3-eta i CD3 zeta. Klasterovanje CD3 na T ćelijama npr. sa anti-CD3 antitelima dovodi do aktivacije T ćelija slično vezivanju antigena, ali nezavisno od klonalne specifičnosti podgrupe T ćelija. Na taj način, izraz "CD19xCD3 bispecifično jednolančano antitelo" kao što je ovde korišćen odnosi se na CD3-specifičan konstrukt sposoban da se vezuje za humani CD3 kompleks eksprimiran na humanim T ćelijama i sposoban da indukuje eliminaciju/lizu ciljnih ćelija, pri čemu takve ciljne ćelije nose/pokazuju antigen koji je vezan drugim, ne-CD3-vezujućim delom bispecifičnog jednolančanog antitela. Vezivanje CD3 compleksa sa CD3-specifičnim vezivnim molekulom (npr. bispecifično jednolančano antitelo kao što je primenjeno u skladu sa farmaceutskim postupcima pronalaska) vodi do aktivacije T ćelija kao što je poznato u tehnici; videti npr. WO 99/54440 ili WO 2007/068354. Prema tome, konstrukt koji je odgovarajuć za farmaceutske postupke pronalaska pogodno može da eliminiše/lizira ciljne ćelije in vivo i/ili in vitro. Odgovarajuće ciljne ćelije sadrže ćelije koje eksprimiraju tumorski antigen, kao što je CD19, koji se prepoznaje prema drugoj specifičnosti (tj. ne-CD3-vezujući deo bispecifičnog jednolančanog antitela) navedenog konstrukta. Poželjno, navedena druga specifičnost je za humani CD19 koji je već opisan u WO 99/54440, WO 2004/106381 ili WO 2007/068354. Prema ovom primeru izvođenja, svaki antigen-specifični deo bispecifičnog jednolančanog antitela sadrži VH region antitela i VL region antitela. Pogodna varijanta bispecifičnog jednolančanog antitela je od N- kraja do C- kraja:

VL(CD19)-VH(CD19)-VH(CD3)-VL(CD3).

[0018] Unutar značenja pronalaska, izraz "specifično vezujući" ili srodni izrazi kao što je "specifičnost" treba shvatiti kao da su okarakterisani prvenstveno sa dva parametra: kvalitativnim parametrom (vezujući epitop ili gde se vezuje antitelo) i kvantitativnim parametrom (afinitet vezivanja, ili koliko snažno se ovo antitelo vezuje za mesto gde se vezuje). Koji epitop je vezan antitelom može se pogodno odrediti sa npr. FACS metodologijom, ELISA, peptid-spot epitop mapiranjem ili masenom spektroskopijom. Jačina vezivanja antitela za određeni epitop može se pogodno odrediti npr. poznatim Biacore i/ili ELISA metodologijama. Kombinacija takvih tehnika omogućava izračunavanje odnosa signal:šum kao reprezentativne mere specifičnosti vezivanja. U takvom odnosu signal:šum, signal predstavlja jačinu vezivanja antitela za epitop od interesa, dok šum predstavlja jačinu vezivanja antitela za druge, nesrodne epitope koji se razlikuju od epitopa od interesa. Odnos signal:šum od, na primer najmanje 50, ali poželjno oko 80 za odgovarajući epitop od interesa kao što je određen npr. pomoću Biacore, ELISA ili FACS može se uzeti kao indikacija da procenjeno antitelo vezuje epitop od interesa na specifičan način, tj. da je "specifični vezujući molekul". Izraz "vezivanje za /inetrakcija sa" takođe može da se odnosi na konformacioni epitop, strukturni epitop ili diskontinuirani epitop koji se sastoji od dva ili čak više regiona humanih ciljnih molekula ili njihovih delova. Konformacioni epitop je definisan sa sve ili više posebne aminokiselinske sekvence odvojene u primarnoj sekvenci koje dolaze zajedno na površinu molekula kada se polipeptid savija u nativni protein (Sela, (1969) Science 166, 1365 and Laver, (1990) Cell 61, 553 - 6). Izraz "diskontinuirani epitop" označava nelinearne epitope koji su sklopljeni od ostataka sa udaljenih delova polipeptidnog lanca. Ovi ostaci zajedno dolaze na površinu molekula kada se polipeptidni lanac savija u trodimenzionalnu strukturu da bi stvorio konformacioni/strukturni epitop.

Izraz "tretman" kao što je ovde korišćen u najširem smislu označava medicinske postupke ili primene koji su namenjeni za olakšanje bolesti. U ovom slučaju, primena CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela (pripremljeno za primenu na pacijenta sa pedijatrijskom ALL pozitivnog ili negativnog za Filadelfija hromozom) kao što je ovde opisano, je za treman/lečenje, poboljšanje ili eliminaciju pedijatrijske ALL bolesti kod pacijenta pozitivnog ili negativnog za Filadelfija hromozom.

Izraz "poboljšanje" kao što je ovde korišćen je sinonim za unapređenje. Ako stanje pacijenta sa pedijatrijskom ALL pokazuje poboljšanje, pacijentu je očigledno bolje - postoji izvesno poboljšanje u njenom ili njegovom kliničkom stanju. Na primer, može doći do poboljšanja stanja pacijenta sa ALL, ako se može postići stabilizacija bolesti ALL, tj. bolest ALL više ne napreduje. Ovaj stadijum bolesti se takođe označava kao stabilna bolest. Poboljšanje takođe može da bude poboljšanje MRD statusa pacijenta sa pedijatrijskom ALL. Na primer, pre tretmana sa CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom, 100 leukemijskih ćelija na 10<4>ćelija kostne srži se može detektovati kod pacijenata sa pedijatrijskom ALL. Zahvaljujući tretmanu sa CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom, broj leukemijskih ćelija se može smanjiti na 10 leukemijskih ćelija ili čak i manje (npr. manje od jedne leukemijske ćelije) na 10<4>ćelija kostne srži u ovom slučaju datom kao primer.

Izraz "eliminacija" kao što je ovde korišćen označava uklanjanje leukemijskih ćelija iz tela pacijenta sa pedijatrijskom ALL. Kao što je prikazano u sledećem primeru, primena CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela može da konvertuje MRD pozitivnu akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL) u negativan MRD status, tj. status u kome se ne detektuje MRD (<10<-4>, tj. detektuje se manje od 1 leukemijske ćelije na 10<4>ćelija kostne srži). U ovom slučaju, postignuta je potpuna molekularna remisija.

[0019] Izraz "primena" kao što je ovde korišćen označava primenu terapeutski efikasne doze prethodno navedenog CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela (poželjno onog prikazanog u SEQ ID NO. 1) na individuu, humanog pedijatrijskog pacijenta. "Terapeutski efikasna količina" označava dozu koja proizvodi efekte za koje je primenjena, tj. dovoljna da ubije ćelije akutne limfoblastne leukemije. Poželjno, primenjena doza CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela dovodi do eliminacije svih ćelija akutne limfoblastne leukemije iz tela pedijatrijskog pacijenta, što dovodi do MRD-negativnog statusa ALL, kao što je ovde definisan. Tačna doza zavisiće od svrhe tretmana/lečenja i utvrdiće je stručnjak iz date oblasti tehnike upotrebom poznatih tehnika. Nadležni lekar i klinički faktori će odrediti režim doziranja. Kao što je dobro poznato u medicini, doze za bilo kog pedijatrijskog pacijenta zavise od brojnih faktora, uključujući veličinu pedijatrijskog pacijenta, površinu tela pacijenta, starost, telesna težinu, određeno jedinjenje koje se primenjuje, pol, vreme i način primene, opšte zdravstveno stanje i ostale lekove koji se istovremeno primenjuju.

Tipična doza može biti, na primer, u opsezima prethodno navedenim u primerima izvođenja postupaka pronalaska i pratećim primerima; međutim, predviđene su i doze ispod ili iznad ovog primera opsega, posebno uzimajući u razmatranje prethodno navedene faktore.

[0020] Izraz "kontinuirana infuzija" označava infuziju kojoj dopušteno da teče neprestano tokom vremenskog perioda, tj. bez prekida. "Kontinuirana infuzija" označava neprestano primenjivanu infuziju. Shodno tome, u kontekstu pronalaska, izrazi "stalan/permanentan" i "kontinuiran" koriste se kao sinonimi. U okviru značenja pronalaska, npr. izraz "primenjen kontinuiranom infuzijom u trajanju (od najmanje ) 4 nedelje" ili slično označava situaciju u kojoj CD19xCD3 bispecifično jednolančano antiteo upotrebljeno u farmaceutskim postupcima prema pronalasku je kontinuirano primenjivano u telo pedijatrijskog pacijenta pozitivnog ili negativnog za Filadelfija hromozom tokom perioda (od najmanje) 4 nedelje na produženi, konstantan način tokom celokupnog trajanja potrebnog u farmaceutskim postupcima pronalaska. Šeme kontinuirane primene CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela detaljnije su opisane u WO 2007/068354. lzbegnut je prekid uvođenja CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela, to jest prelaz iz stanja u kojem je ovo antitelo primenjivano na telo pedijatrijskog pacijenta pozitivnog ili negativnog za Filadelfija hromozom u stanje u kome ovo antitelo nije više primenjivano na telo pedijatrijskog pacijenta pozitivnog ili negativnog za Filadelfija hromozom, se ne odigrava ili se značajno ne odigrava tokom celokupnog trajanja primene potrebne za farmaceutske postupke pronalaska iz drugih razloga osim da se napune zalihe CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela koje se primenjuje ili medicinskih intervencija koje postaju neophodne i slično. Ukoliko ova neophodna dopuna dovodi do privremenog prekida uvođenja primenjivanog antitela, takva primena se i dalje smatra "neprekinuta" ili "stalna" u smislu farmaceutskih postupaka prema pronalasku. U većini slučajeva, takva dopuna će obično trajati kratko vreme tokom kojeg se antitelo ne uvodi u telo pedijatrijskog pacijenta pozitivnog ili negativnog za Filadelfija hromozom i biće zanemarijivo kratko u odnosu na vreme koje je planirano za ukupni režim primene prema farmaceutskim postupcima u skladu sa pronalaskom. U skladu sa pronalaskom, jedan ciklus tretmana može se razumeti kao kontinuirana infuzija CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela za pacijenta sa ALL pozitivnog ili negativnog za Filadelfija hromozom tokom perioda od (najmanje) 4 nedelje, nakon čega sledi interval od 2-nedelje bez tretmana. Izraz "najmanje" kao što je ovde korišćen znači da se kontinuirana infuzija može sprovesti tokom vremenskog perioda koji je duži od 4 nedelje, npr. tokom 5, 6, 7 ili 8 nedelja ili čak i duže, nakon čega sledi period bez tretmana u trajanju od 2 nedelje. Može se desiti da nakon MRD stadijuma tretiranog pedijatrijskog pacijenta (pacijenata) posle (najmanje) 4 nedelje kontinuirane primene (ili jednog ciklusa tretmana), može se postići minimalni ili delimični odgovor, ali se ne može postići negativnost MRD. Pod takvim okolnostima, kontinuirana primena se može produžiti za dodatni jedan, dva, tri, četiri, pet ili čak do deset ciklusa tretmana kako bi se postigao bolji terapeutski rezultat, npr. kompletan hematološki ili čak kompletan molekularni odgovor. Poželjno, navedeni kompletan molekularni odgovor je negativnost MRD (kao što je ovde definisana) što smanjuje rizik od ponovnog javljanja bolesti ALL. Na primer, nađeno je da MRD-negativnost ili niski nivoi MRD kod pedijatrijskih pacijenata sa ALL pre alogene HSCT smanjuju rizik od relapsa (Bader P, et al„ J Clin Oncol 27 (2009): 377-384). Kao što je prikazano u sledećim primerima, MRD negativnost može se postići tretmanom pedijatrijskih pacijenata sa ALL pozitivnih ili negativnih za Filadelfija hromozom sa CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom.

Prema tome, u jednom primeru izvođenja farmaceutskih postupaka pronalaska, jedan ili više ciklusa tretmana, u kojem je CD19xCD3 bispecifično jednolančano antitelo kontinuirano primenjivano na pedijatrijskog ALL pacijenta koji je pozitivan ili negativan za Filadelfija hromozom, je/su praćeni alogenom HSCT. Drugim rečima: u ovom poželjnom primeru izvođenja, postupak pronalaska se odvija pre alogene transplantacije matičnih ćelija (HSCT) da bi se konvertovao status MRD pozitivne ALL kod pacijenta pozitivnog ili negativnog za Filadelfija hromozom u MRD negativan status. Na ovaj način, rizik od relapsa je značajno smanjen.

U sledećem primeru izvođenja postupka pronalaska, postupak se izvodi posle alogene transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija (HSCT).

Postupak transplantacije može da prati jedan ili više dodatnih ciklusa tretmana sa CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom. Ovaj primer izvođenja je važan u slučajevima relapsirane pedijatrijske ALL kod pacijenta pozitivnog ili negativnog za Filadelfija hromozom, gde su pacijenti primili hemoterapiju i HSCT. Usled nespeha ovih uobičajenih terapija, može doći do relapsa bolesti i sada se može lečiti primenom navedenog antitela. Dodatno, tretman sa CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom se može koristiti kao konsolidaciona terapija posle HSCT da bi se izbegao još jedan relaps ALL bolesti kod pacijenta pozitivnog ili negativnog za Filadelfija hromozom.

Sledeći primeri obezbeđuju takođe podatke o upotrebi CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela posle alogene HSCT gde aktivirane T ćelije potiču od donora. Može se zabeležiti snažna indukcija efekta transplanta protiv leukemije (GvL) u odsustvu bolesti transplanta-protiv-domaćina (GvHD) indukovana tretmanom sa CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom kod dva pacijenta sa hemorefrakotornim relapsom CD19+ALL posle alogene hematopoetske HSCT. Prema tome, u sledećem poželjnom primeru izvođenja farmaceutskih postupaka pronalaska, pedijatrijski ALL pacijent pozitivan ili negativan za Filadelfija hromozom se može tretirati sa CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom nakon što je ona/on primio alogeni HSCT.

U najboljem slučaju, predviđeno je da tretman pedijatrijskih ALL pacijenata pozitivnih ili negativnih za Filadelfija hromozom sa CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom može da zameni uobičajenu terapiju pedijatrijske

[0021] ALL, kao što je hemoterapija i/ili alogena transplantaciju hematopoetskih matičnih ćelija (HSCT).

Kao što je prikazano u primerima koji slede, tretman pacijenta sa pedijatrijskom akutnom limfoblastnom leukemijom (ALL) sa CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom može da eliminiše ćelije limfoblastne akutne leukemije iz tela pacijenata ispod nivoa detekcije. Poželjno, glavni terapeutski cilj je primena CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela, bilo samog ili u kombinaciiji sa alogenom HSCT, na pedijatrijskog pacijenta sa ALL pozitivnog ili negativnog za Filadelfija hromozom je konverzija MRD-pozitivnog statusa u MRD-negativan status što dovodi do preživljavanje bez prisustva leukemije, kao što je u daljem tekstu definisano. Kao što je ovde pokazano, MRD-pozitivni pedijatrijski ALL pacijenti postali su MRD negativni nakon prvog ciklusa tretmana u kojem je CD19xCD3 bispecifično jednolančano antitelo kontinuirano primenjivano tokom pet nedelja (pacijent 1) ili četiri nedelje (pacijent 2). kod pacijenta 1, ciklus tretmana je praćen haploidnom HSCT. Od novembra 2009., ovaj pacijent je ostao u kompletnoj MRD-negativnoj remisiji, tj. bez tumora.

Nastavljajući neprkinutu primenu CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela na način prema farmaceutskim postupcima u skladu sa pronalaskom tokom dužih vremenskih perioda omogućava se povoljna aktivacija T ćelija navedena u primerima da bi se ispoljio efekat dovoljno dugo da povoljno očisti sve ćelije akutne limfoblastne leukemije pozitivne ili negativne za Filadelfija hromozom iz tela. Budući da je stopa neprekidno primenjivanog bispecifičnog jednolančanog antitela održavana na niskom nivou, primena terapeutskog agensa se može nastaviti duže vreme bez rizika od štetnih sporednih efekata za pacijenta. CD19xCD3 bispecifično jednolančano antitelo kao što je ovde korišćeno se pogodno može pripremiti u obliku farmaceutske kompozicije za primenu na humanog pedijatrijskog pacijenta kod kojeg je dijagnostifikovana akutna limfoblastna leukemija (ALL) pozitivna ili negativna za Filadelfija hromozom. Navedena ALL pozitivna ili negativna za Filadelfija hromozom može da bude novo-dijagnostifikovana ALL, ALL refraktorna na hemoterapiju i/ili alogenu transplantaciju hematopoetskih matičnih ćelija (HSCT), relapsirana ALL ili relapsirana ALL refraktorna na hemoterapiju i/ili alogenu transplantaciju hematopoetskih matičnih ćelija (HSCT).

[0022] U poželjnom primeru izvođenja farmaceutskih postupaka prema pronalasku, navedena pedijatrijska akutna limfoblastna leukemija (ALL) pozitivna ili negativna za Filadelfija hromozom je pedijatrijska akutna iimfoblastna leukemija (ALL) B-linije pozitivna ili negativna za Filadelfija hromozom, poželjno pedijatrijska akutna B-prekursorska akutna limfoblastna leukemija pozitivna ili negativna za Filadelfija hromozom. Velika većina slučajeva pedijatrijske ALL (>85%) su B prekursorskog ćelijskog fenotipa. Predloženo je nekoliko klasifikacija ALL B- linije (videti npr.. Schultz et al., Blood 109 (2007): 926-935). Da bi se modulirao intenzitet terapije u odnosu na pacijentov rizik od relapsa, pacijenti sa B prekursorskom ALL su trenutno podeljeni na grupe sa "niskim" rizikom, "standardnim", "visokim" ili "veoma visokim" rizikom upotrebom laboratorijskih i kliničkih parametara: starost pacijenta, pol, broj leukocita (WBC) pri ispoljavanju bolesti, i prisustvo ili odsustvo specifičnih citogenetičkih abnormaliteta. Genetički abnormaliteti sa visokom učestalošću vraćanja koji pomažu pri definisanju ovih grupa rizika obuhvataju, na primer: t(12;21)[TEL-AML1]; t(1;19;)[E2A-PBX]; t(4;11)[AF4-MLL]; t(9;22)[BCR-ABL]; hiperdiploidiju (ili trizomiju hromozoma 4, 10 i 17), i hipodiploidiju; videti npr.. Schultz et al.; Bader et al., loc. cit. Koristeći podatke iz različitih ispitivanja, razvijen je klasifikacioni sistem i implementiran kao COG AALL03B1 (Classification of Acute Lymphoblastic Leukemia) (Raetz et al., Personalized Med. 2 (2005), 349-361; Schultz et al., Blood 109 (2007): 926-935). Budući da je ovde opisano CD19xCD3 bispecifično jednolančano antitelo usmereno protiv markera CD19 povezanog za B ćelije, navedeno antitelo je naročito pogodno kao terapeutski agens za pedijatrijsku akutnu limfoblastnu leukemiju B-linije, poželjno za pedijatrijsku ALL B-prekursorsku ALL. Pedijatrijska B-prekursorska ALL sa dalje može podeliti na pedijatrijsku pro-B ALL, pre-B ALL i uobičajenu ALL (cALL). Kao što je prikazano u sledećim primerima, tretman prema postupcima pronalaska za sedmogodišnjeg pacijenta 1 sa uobičajenom ALL je refraktoran u odnosu na bilo koji tretman i prema tome sklon tome da bude fatalan, doveo je ne samo do potpune hematološke remisije već i do kompletne molekularne remisije. Drugim rečima: kod ovih pacijenata se više ne može detektovati minimalan ostatak bolesti posle tretmana sa CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom. Posebno poželjno, pedijatrijska akutna limfoblastna leukemija (ALL) pozitivna ili negativna za Filadelfija hromozom je B-prekursorska ALL pozitivna ili negativna za Filadelfija hromozom, poželjnije cALL pozitivna ili negativna za Filadelfija hromozom.

[0023] Važno je da je CD19xCD3 bispecifično jednolančano antitelo je sposobno ne samo da ubije ALL ćelije sa TCR ili imunoglobulinskim rearanžmanima, već i ALL ćelije sa različitim drugim citogenetičkim abnormalitetima: Na primer, nađeno je da kod pacijenta 2 opisanog u sledećim primerima kao i kod odraslih ALL pacijenata, ovo antitelo sposobno da leči ALL okarakterisanu imunoglobulinskim ili TCR rearanžmanima, t(4;11) translokacijima ili bcr/abl fuzionim transkritpima t(Ph+). Objavljeno je da je izuzetno teško lečiti Ph+ ALL i ALL sa t(4;11) translokacijama uobičajenom terapijom za ALL, ali može da bude uspešno lečena sa CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom. Navedeni podaci ukazuju na to da je CD19xCD3 bispecifično jednolančano antitelo sposobno da leči različite oblike ALL uključujući npr. ALL okrakterisane sa t(12;21 )[TEL-AML1]; t(1;19;)[E2A-PBX]; t(4;11)[AF4-MLL]; t(9;22)[BCR-ABL]; hiperdiploidijom (ili trizomijom hromozoma 4, 10, i 17), hipodiploidijom kao i imunoglobulinskim ili TCR rearanžmanima; takođe videti Tabelu 1.

[0024] Dijagnoza pedijatrijske ALL zasnovana je na morfološkim, citohemijskim i imunološkim osobinama ćelija, uključujući morfologiju limfoblasta na razmazima kostne srži bojene Wright-Giemsa metodom, pozitivno bojenje terminalne dezoksinukleotid transferaze (TdT), negativno bojenje mijeloperoksidaze, i ekspresiju na površini ćelija 2 ili više antigena limfoidne diferencijacije prekursora B-ćelija. Imunofenotipizaciju je opisao na primer Behm F.G. (lmmunophenotyping. In: Childhood Leukemias, C-H Pui ed. Cambridge: Cambridge University Press; 2006, p. 150-209), i može se izvesti npr. indirektnom imunofluorescencijom, imunohistohemijom i/ili protočnom citometrijom.

[0025] Izraz "pacijent" kao što je ovde korišćen odnosi se na humanog pacijenta. Izraz "pedijatrijska ALL" ili "pedijatrijski pacijent sa ALL" kao što je ovde dat označava decu starosti od jednog meseca do 18 godina. Naznačenu starost treba shvatiti kao starost deteta prilikom dijagnoze bolesti ALL. Deca se mogu specifičnije dalje podeliti u podgrupe beba (starosti 1 do 12 meseci), mlađa deca starosti 1 do 9 godina i starija deca i adolescenti (starosti ≥10 do 18 godina). Kao što je ovde korišćen, vremenski interval koji je definisan kao "X do Y" jednak je vremenskom intervalu koji je definisan kao "između X i Y". Oba vremenska intervala specifično uključuju gornju granicu kao i donju granicu. Ovo znači da, na primer, vremenski interval "od jednog meseca do 18 godina" uključuje "jedan mesec" i "18 godina". Poželjno, pacijent koji se leči prema pronalasku je najviše star 18 godina (uključujući pacijente starosti 18 godina).

[0026] Kao što je prikazano u sledećim primerima, pacijent 1 je imao sedam godina kada je tretiran CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom, sa dijagnozom ALL postavljenom kada je imao dve godine. Pacijent 1 je imao petnaest godina kada je tretiran CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom, sa dijagnozom ALL postavljenom 2001. godine.

[0027] Gore navedene definicije se primenjuju mutatis mutandis za izraz "pedijatrijska akutna limfoblastna leukemija (ALL)", "dečja ALL", ili slično. Na primer, pedijatrijsku ili dečju ALL treba shvatiti kao ALL dijagnostifikovanu kod pedijatrijskog pacijenata starosti između 1 meseca (uključujući 1 mesec) i 18 godina (uključujući 18 godina).

[0028] Dok CD19xCD3 bispecifično jednolančano antitelo kao što je ovde upotrebljeno može da se primenjuje per se, poželjna je primena u farmaceutski prihvatljvom nosaču. Primeri pogodnih nosača su dobro poznati u tehnici i uključuju rastvore natrijum fosfatnog pufera, vodu, lipozome, različite tipove agenasa za vlaženje, sterilne rastvore, itd. Kompozicije koje sadrže takve nosače mogu se formulisati pomoću dobro poznatih uobičajenih postupaka. Ove farmaceutske kompozicije mogu se primenjivati na pedijatrijskog pacijenta u odgovarajućoj dozi. Dozni režim će odrediti nadležni lekar i klinički faktori. Kao što je poznato u medicini, doze za bilo kog pedijatrijskog pacijenta zavise od brojnih faktora, uključujući veličinu pacijenta, površinu tela pacijenta, starost, telesnu težinu, određeno jedinjenje koje se primenjuje, pol, vreme i način primene, opšte zdravstveno stanje i ostale lekove koji se istovremeno primenjuju. Preparati za parenteralnu primenu uključuju sterilne vodene ili nevodene rastvore ili suspenzije. Primeri nevodenih rastvarača su propilen glikol, polietilen glikol, i injketabilni organski estri koji kao što je etil oleat. Vodeni nosači uključuju vodu, vodene ratvore ili suspenzije, uključujući fiziološki rastvor i puferovane medijume. Parenteralni nosači obuhvataju rastvor natrijum hlorida, Ringerov rastvor dekstroze, dekstroza i natrijum hlorid, ili Ringerov rastvor sa laktatom. Intravenski nosači obuhvataju tečnosti i hranljive dodaci, dopune za elektrolite (kao što su onde bazirane na Ringerovom rastvoru dekstroze), i slično. Takođe mogu da budu prisutni konzervansi i drugi aditivi kao što su, na primer, antimikrobna sredstva, anti-oksidansi, helatirajuća sredstva i inertni gasovi i slično. Dodatno, kompozicija može da sadrži proteinske nosače kao, npr., serum albumin ili imunoglobulin, poželjno humanog porekla. Predviđeno je da kompozicija može da sadrži, pored proteinskog bispecifičnog jednolančanog antitela i dodatne biološki aktivne agense, zavisno od namenjene upotrebe farmaceutske kompozicije. Ovi agensi mogu da budu agensi koji deluju kao citostatici, agensi za prevenciju hiperurikemije, agensi koji inhibiraju imune reakcije (npr. kortikosteroidi, FK506), lekovi koji deluju na cirkulatnorni sistem i/ili agensi kao što su T-ćelijski ko-stimulatorni molekuli ili citokini poznati u tehnici. Na primer, tretman sa CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom može se izvesti u kombinaciji sa intratekalnom hemoterapijom kao profilaksa za CNS, kortikoidi, i/ili alopurinol.

Poželjno, CD19xCD3 bispecifično jednolančano antitelo kao što je ovde definisano, formulisano je u puferu, stabilizatoru i surfaktantu. Pufer može da bude fosfatni, citratni, sukcinati ili acetatni pufer. Stabilizator može biti aminokiselina (aminokiseline) i/ili šećer. Surfaktantni mogu da budu deterdženti, PEG, ili slično. Poželjnije, CD19xCD3 bispecifično jednolančano antitelo kao što je ovde definisano formulisano je u citratu, lizinu, trehalozi i Tween 80. Kao razblaživač za farmaceutsku kompoziciju pronalaska, poželjan je izotoničan fiziološki rastvor i Tween 80.

[0029] Poželjno, u farmaceutskim postupcima pronalaska, farmaceutska kompozicija može se pripremiti za primenu na humanog pedijatrijskog pacijenta sa dijagnozom akutne limfoblastne leukemije (ALL), pri čemu je navedeni pacijent pozitivan ili negativan za Filadelfija hromozom.

[0030] Uspeh terapije CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom može se pratiti utvrđenim standardnim postupcima za odgovarajuće entitete bolesti:

za terapiju B ćelijske ALL, mogu se primenti fluorescentno-aktivirajuće sortiranje ćelija (FACS), aspiracija koste srži i različiti klinički hemijski parametri specifični za leukemiju i druge utvrđene standardne postupke poznate u tehnici. Postupci i sredstva za određivanje statusa minimalne rezidualne bolesti (MRD) su opisani ovde.

[0031] Citotokcična aktivnost CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela može se detektovati postupcima poznatim u tehnici i postupcima kao što su ilustrovani npr. u WO 99/54440, WO 2004/106381, WO 2007/068354.

[0032] U poželjnom primeru izvođenja farmaceutskih postupaka pronalaska, B-prekursorska ALL pozitivna ili negativna za Filadelfija hromozom pedijatrijskog pacijenta (pacijenata) je u relapsu i/ili refraktorna na tretman. Sa trenutno dostupnim lečenjima dečje ALL, stope preživljavanja bez događaja iznose oko 75%. Prema tome, 25% pacijenata je sa relapsom uprkos toksičnom tretmanu i tretmanu rizičnom po zdravlje pacijenta. Problemi u rešavanju relapsa ALL su otpornost leukemijskih ćelija i smanjena tolerancija pedijatrijskih pacijenata na drugi ciklus tretmana nakon već primljene intenzivne prve terapije, što dovodi do manje stope remisije kao i veće incidence naknadnog relapsa i slabijeg ukupnog ishoda. Intenzivirana polihemoterapija je tada esencijalna za indukciju druge potpune remisije (Henze G, von Stackelberg A, Relapsed acute lymphoblastic leukemia: In: Childhood Leukemias, C-H Pui ed. Cambridge: Cambridge University Press; 2006, p. 473- 486). Izraz "refraktorna na hemoterapiju i/ili alogenu transplantaciju matičnih ćelija" kao što je ovde korišćen označava da su pacijenti sa pedijatrijskom ALL otporni na ove terapije i prema tome u relapsu posle uobičajenih tretmana ALL. Takođe je predviđeno da pedijatrijski pacijenti sa relapsom posle tretmana sa CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom prime jedan ili više dodatnih ciklusa tretmana sa navedenim antitelom da bi tretrirana deca postala MRD negativna. Navedeni pacijenti mogu zatim na primer da prime drugu alogenu HSCT.

Kao što je prikazano u sledećim primerima, farmaceutski postupci pronalaska su naročito pogodni za lečenje pedijatrijskijih pacijenata pozitivnih ili negativnih za Filadelfija hromozom koji su rezistentni na uobičajene terapije ALL. lako su prikazani pedijatrijski pacijenti prethodno ozbiljno tretirani hemoterapijom i alogenom transplantacijom matičnih ćelija, pacijenti su bili u relapsu više puta. Prema tome, pacijenti su imali izuzetno lošu prognozu. Međutim, posle tretmana sa CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom, pacijenti su bili MRD negativni, tj. pokazali su potpunu molekularnu remisiju. Drugim rečima: tretman je eliminisao ćelija akutne limfoblastne leukemije iz tela pedijatrijskih pacijenata ispod nivoa detekcije. Najvažnije, kostna srž pedijatrijskih pacijenata je očišćena od leukemijskih ćelija.

[0033] U poželjnom primeru izvođenja farmaceutskih postupaka pronalaska, akutna limfoblastna leukemija (ALL) pozitivna ili negativna za Filadelfija hromozom kod pedijatrijskog pacijenta (pacijenata) je refraktorna na hemoterapiju i/ili alogenu HSCT u vezi sa MRD. Drugim rečima: MRD kod pacijenata sa pedijatrijskom ALL pozitivnih ili negativnih za Filadelfija hromozom je otporan na hemoterapiju i/ili alogenu HSCT.

Predviđeno je da su farmaceutski postupci pronalaska takođe pogodni za lečenje novodijagnostikovane pedijatrijske ALL pozitivne ili negativne za Filadelfija hromozom tako što obezbeđuju alternativu uobičajenim režimima lečenja pedijatrijske ALL, kao što je hemoterapija i/ili alogena HSCT.

U dodatnom poželjnom primeru izvođenja, navedena akutna limfoblastna leukemija (ALL) pozitivna ili negativna za Filadelfija hromozom je u relapsu u toku tri godine od dijagnoze, poželjno tokom dve godine od dijagnoze, ili poželjnije u toku godinu dana od dijagnoze. Poželjno, navedeni relaps je relaps kostne srži.

Izraz "hemoterapija" kao što je ovde korišćen označava hemoterapiju korišćenu za lečenje pedijatrijske akutne limfoblastne leukemije (ALL). Hemoterapija je početan tretman po izboru za pedijatrijsku ALL (videti npr. Pui CH, Jeha S, Nat Rev Drug Discov 6 (2007): 149-165; Schmiegelow K, Gustaffson G. Acute lymphoblastic leukemia. in: Cancer in Children: Clinical Management. Voute PA, BarretA, Stevens MCG, Caron HN (eds). London, UK, Oxford University Press, 2005, p. 138-170; Schmoll, Hoffken, Possinger, loc. cit.). Većina pacijenata sa pedijatrijskom ALL završava primajući kombinaciju različitih tretmana. U lečenju pedijatrijske ALL, ne postoji mogućnost operacije, zbog rasprostranjenosti malignih ćelija u telu. Generalno, citotoksična hemoterapija za pedijatrijski ALL kombinuje multiple antileukemijske lekove u različitim kombinacijama. Hemoterapija za pedijatrijsku ALL se sastoji iz tri faze: remisije, indukcije, intenziviranja i održavanja terapije. Hemoterapija je takođe indikovana za zaštitu centralnog nervnog sistema od leukemije. Cilj indukovanja remisije je brzo ubiti većinu tumorskih ćelija i dovesti pedijatrijskog pacijenta u kompletnu hematološku remisiju. Ovo je definisano kao prisustvo manje od 5% leukemijskih blasta u kostnoj srži (kao što je određeno svetlosnim mikroskopom), na primer, klofarabin, ciklofosfamid, VP16, amsakrin, prednizon, melfalan, ili citarabin, pojedinačno ili u kombinacije, koriste se za indukciju remisije. Intenziviranje koristi visoke doze intravenskih hemoterapija višestrukim lekovima za dodatno smanjenje opterećenja tumora. Tipični protokoli intenziviranja koriste vinkristin, ciklofosfamid, citarabin, daunorubicin, etoposid, tioguanin ili merkaptopurin koji su dati kao blokovi u različitim kombinacijama. Kako ćelije ALL ponekad prodiru u centralni nervni sistem (CNS), većina protokola obuhvataju isporuku hemoterapije u tečnost CNS obično poznatu kao intratekalna hemoterapija. Neki centri tumora isporučuju lek preko Ommaya rezervoara (uređaj koji je hirurški postavljen ispod sklapa i koristi se za isporuku lekova u tečnost CNS i da ekstrahuje tečnost CNS za različite testove). Ostali centri izvode višestruke lumbalne punkcije potrebne za testiranje i isporuku tretmana. Intratekalni metotreksat ili citarabin se obično koriste u ove svrhe. Cilj održavajuće terapije je da ubije svaku preostalu ćeliju koja nije ubijena indukcijom remisije i režimima intenziviranja. Iako je samo nekoliko ovih ćelija, one će izazvati relaps ukoliko nisu iskorenjene. U ove svrhe, dnevna oralna doza merkaptopurina, jednom nedeljno oralnog metotreksata, jednom mesečno tokom 5-dnevnog intravenskog vinkristina an. Dužina održavajuće terapije iznosi 3 godine za dečake, 2 godine za devojčice i odrasle. Relaps nervnog sistema je tretiran intratekalnom primenom hidrokrotizona, metotreksata, i citarabina. Kako režimi hemoterapije mogu da budu intenzivni i dugotrajni (često oko 2 godine u slučaju GMALL UKALL, HyperCVAD ili CALGB protokola; oko 3 godine za muškarce na COG protokolima), mnogi pacijenti imaju intravenski kateter umetnut u veliku venu (označen kao centralni venski kateter ili Hickman-ova linija), ili Portacath (konusno oblikovan port sa silikonskim ispustom koji se hirurški implantira pod kožu, obično u blizini ključne kosti). Međutim, hemoterapija ostaje visoko toksičan postupak, a posebno za pedijatrijske pacijente. Pacijenti mogu da dožive recidiv ALL posle inicijalne terapije i/ili da postanu refraktorni na hemoterapiju posle tretmana. Pedijatrijski ALL pacijenti koji su refraktorni na hemoterapiju imaju izrazito slabu prognoze. Naročito, prognoza za pedijatrijske pacijente sa Ph+ ALL ili ALL sa t(4;11) translokacijama tretiranih samo hemoterapijom je loša. Budući da je postupak pronalaska sposoban da obezbedi da su pedijatrijski ALL pacijenti pozitivni ili negativni za Filadelfija hromozom - MRD-negativni, posebno je korisan za lečenje ALL pacijenta pozitivnih ili negativnih za Filadelfija hromozom koji su refraktorni na hemoterapiju i/ili alogeni HSCT. U tom smislu, izraz "refkratoran na hemoterapiju i/ili alogeni HSCT" kao što je ovde korišćen označva otpornost ćelija akutne limfoblastne leukemije na hemoterapiju i/ili alogenu HSCT.

[0034] Izraz "alogena transplantacija hematopoetskih matičnih ćelija (HSCT)" kao što je ovde korišćen označava alogenu transplantaciju hematopoetskih matičnih ćelija (HSCT) ili transplantaciju kostne srži koja je medicinska procedura u oblasti hematologije i onkologije koja uključuje transplantaciju hematopoetskih matičnih ćelija (HSC). Najčešće se izvodi za pacijente sa bolestima krvi ili kostne srži ili određenih vrsta kancera, kao što je ALL. Većina recipijenata HSCTs su pacijenti oboleli od leukemije (npr. ALL) koji bi imali koristi od lečenja visokim dozama hemoterapije ili zračenja celog tela. Alogena HSCT kod dece sa ALL opisana je u npr. Schrauder A, et al. (Bone Marrow Transplantation 41 (2008): Suppl2 S71-74). Međutim, alogena transplantacija matičnih ćelija ostaje rizična procedura, posebno za pedijatrijske pacijente.

Izraz "podoban za alogenu transplantaciju hematopoetskih matičnih ćelija (HSCT)" kao što je ovde korišćen znači da je alogena transplantacija matičnih ćelija potrebna za terapiju pedijatrijskih pacijenata sa ALL. U slučajevima, gde je pedijatrijski ALL pacijent podoban za alogenu transplantaciju matičnih ćelija moguća su sledeća dva scenarija. Prvi, u jednom primeru izvođenja farmaceutskih postupaka pronalaska, primena CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela (pojedinačno ili poželjno kao farmaceutska kompozicija) se može koristiti za zamenu alogene transplantacije matičnih ćelija koja se koristi kao uobičajena terapija za pedijatrijske ALL pacijente pozitivne ili negativne za Filadelfija hromozom podobne za transplantaciju. Tako da se ovim postupkom pronalaska mogu izbeći zdravstveni rizici za pedijatrijske ALL pacijente povezane sa alogenom HSCT. U alternativnom primeru izvođenja, posle kontinuirane infuzije CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela na pedijatrijskog ALL pacijenta pozitivnog ili negativnog za Filadelfija hromozom može da sledi alogena transplantacija matičnih čelija. U ovom primeru izvođenja, primena farmaceutske kompozicije koja sadrži konstrukt CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela može se koristiti za konverziju pedijatrijskijih ALL pacijenata pozitivnih ili negativnih za Filadelfija hromozom koji su podobni za transplantaciju u MRD negativan-status pre nego što prime transplantat. Na ovaj način, postupak pronalaska se može koristiti da bi se eliminisao MRD, što dovodi do nižeg rizika od relapsa od tretmana transplantacijom kod MRD-pozitivnih pacijenata. Sledeći primeri predstavljaju pedijatrijskog pacijenta (pacijent 1) koji je prvo konvertovan u MRD-negativan status posle tretmana CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom, nakon čega je urađena alogena transplantacija. Do sada (novembar 2009.), ovaj pacijent je još uvek MRD-negativan.

[0035] Izraz "nepodoban za alogenu transplantaciju hematopoetskih matičnih ćelija (HSCT)" kao što je ovde korišćen označava one pedijatrijske pacijente za koje alogena transplantacija matičnih ćelija nije lečenje ALL po izboru, na primer, zbog medicinskih razloga. Takođe se može desiti da nema odgovarajućeg donora za alogenu transplantaciju matičnih ćelija.

[0036] Prema tome, u jednom primeru izvođenja, akutna limfoblastna leukemija (ALL) pozitivna ili negativna za Filadelfija hromozom je refraktorna na hemoterapiju i/ili alogenu HSCT kod pedijatrijskih pacijenata koji su nepodobni ili nisu više podobni za alogenu HSCT. Na primer, pedijatrijski pacijent može da bude u tako lošem kliničkom stanju da se iz medicinskih razloga ne može izvesti alogena transplantacija matičnih ćelija.

Pacijent 1 prikazan u sledećim primerima koji slede nije bio podoban za alogenu transplantaciju matičnih ćelija pre tretmana sa CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanom antitelom, zbog svog lošeg zdravstvenog stanja. U ovom slučaju, tretman CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom obezbeđuje novi terapeutski pristup za pedijatrijsku ALL pozitivnu ili negativnu za Filadelfija hromozom.

[0037] Do sada, ALL je značila smrtnu presudu za pedijatrijske pacijente koji su refraktorni na hemoterapiju i nepodobni za alogenu HSCT. Postupak pronalaska po prvi put obezbeđuje terapiju za ovu populaciju pedijatrijskih pacijenata pozitivnih ili negativnih za Filadelfija hromozom kojom se eliminiše minimalna rezidualna bolest (MRD) koja bi inače izazivala relaps i koja bi na kraju ubila navedene pacijente.

[0038] Unutar obima farmaceutskih postupaka pronalaska je i to da se konstrukt CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela primenjuje na pacijente sa pedijatrijskom ALL pozitivne ili negativne za Filadelfija hromozom koji su primili hemoterapiju, pojedinačno ili u kombinaciji sa alogenom transplantacijom matičnih ćelija i kod kojih je zatim došlo do relapsa.

[0039] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, postupak pronalaska je za lečenje, poboljšanje ili eliminaciju minimalne rezidualne bolesti (MRD) kod pedijatrijskog pacijenta sa akutnom limfoblastnom leukemijom (ALL) pozitivnom ili negativnom za Filadelfija hromozom.

[0040] Izraz "minimalna rezidulna bolest (MRD)" kao što je ovde definisan označava izraz koji se koristi nakon tretmana npr. sa hemoterapeuticima kada se leukemijske ćelije ne mogu naći u kostnoj srži upotrebom standardnih testova, kao što su mikroskopske metode. Radije, moraju se koristiti osetljiviji testovi kao što je protočna citometrija (metode bazirane na FACS) ili lančana reakcija polimeraze (PCR) da bi se našao dokaz da su leukemijske ćelije ostale u kostnoj srži pedijatrijskih ALL pacijenata. Specifičnije, prisustvo leukemijskih ćelija ispod citološkog nivoa detekcije (5% leukemijskih ćelija) je definisano kao minimalna rezidualna bolest (MRD). Ako se MRD ne može detektovati (<10<-4>, tj. može se detektovati manje od 1 leukemijske ćelije na 10<4>ćelija kostne srži), postignuta je potpuna molekularna remisija (negativnost MRD ili MRD negativan status). "MRD pozitivan status" kao što je ovde definisan označava signal koji je meren sa PCR ili FACS iznad granice detekcije ili kvantitativnog praga vrednosti. "MRD negativan status" kao što je ovde definisan označava ispod granice detekcije i/ili ispod kvantitativnog praga vrednosti, meren sa PCR ili FACS. Prognostička vrednost kvantitativnog određivanja minimalne rezidualne bolesti kod dečje ALL opisana je npr. u Bader et al. (J. Clin. Oncol. 27 (2009): 377-384) ili Eckert et al. (Lancet 358 (2001): 1239-41). MRD status može da se meri sa PCR ili FACS analizom tako da su kvantitativno detektovane individualne citogenetičke abnormalnosti koje su ovde navedene i/ili imunoglobulinski rearanžmani ili rearanžmani T-ćelijskih receptora (TCR). Na primer, PCR analiza može da detektuje fuzione transkripte kao što su bcr/abl ili t(4; 11) translokacije kao i individualni kolonalni rearanžmani gena imunoglobulina (IgH) i/ili T-ćelijskih receptora (TCR).

[0041] Kao što je prikazano u sledećim primerima, nakon tretmana sa CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom koje je ovde opisano, sve ćelije akutne limfoblastne leukemije bi mogle da se eliminišu iz tela pedijatrijskih ALL pacijenata tako da se može postići potpuna molekularna remisija (tj. MRD negativni status).

[0042] Povratne hromozomske abnormalnosti u malignim ćelijama pedijatrijskih i odraslih pacijenata sa akutnom limfoblastnom leukemijom su glavna obeležja ove bolesti (Harrison and Foroni, Rev. Clin. Exp. Hematol. 6 (2002), 91-113). Specifične aberacije koje su često indikativne za nepromenljive molekularne lezije mogu da pomognu ili čak uspostave dijagnozu i odrede optimalnu terapiju. Kod dečije ALL, identifikovane su brojne dobre i visokorizične citogenetičke podgrupe koje se redovno koriste za stratifikaciju pacijenata za određene terapije (Pui and Evans, N. Engl. J. Med.354 (2006), 166-178). Kod ALL odraslih, uloga citogenetike u vođenju pacijenata je uveliko centrirana na prisustvo Filadelfija (Ph) hromozoma koji obično nastaje od t(9;22)(q34;q11.2) i dovodi do fuzije BCR-ABL (Faderl et al., Blood 91 (1998), 3995-4019). Iako ukupna incidenca Ph+ ALL kod odraslih iznosi približno 25%, u korelaciji je sa godinama pacijenta i raste iznad 50% kod pacijenata koji su stariji od 55 godina (Appelbaum, American Society of Clinical Oncology 2005 education book. Alexandria: ASCO, 2005: 528- 532). Ostale citogenetičke translokacije povezane sa specifičnim molekularnim genetskim abnormalitetima kod akutne limfoblastne leukemije (ALL) prikazane su u Tabeli 1 i takođe opisane u Schultz et al. ili Bader et al., loc. cit.

Tabela 1

[0043] Citogenetika je sve više priznata kao važan alat za predviđanje ishoda ALL (Moormann et al., Blood 109 (2007), 3189-97).

Neki citogenetički podtipovi imaju lošije prognoze od drugih. Oni uključuiu npr.:

(i) Translokaciju između hromozoma 9 i 22, Filadelfija hromozom (Ph+) se javlja kod oko 20% odraslih i 5% pedijatrijskih slučajeva ALL.

(ii) Translokaciju između hromozoma 4 i 11 koja se javlja kod oko 4% slućajeva i najčešća je kod dece mlađe od 12 meseci.

[0044] Rearanžmani imunoglobulinskih gena ili rearanžmani T-ćelijskih receptora (TCR) i njihova uloga u ALL je opisana u stanju tehnike (videti npr., Szczepanski et al., Leukemia 12 (1998), 1081-1088).

[0045] U sledećem poželjnom primeru izvođenja farmaceutskih postupaka pronalaska, navedeni pedijatrijski ALL pacijent pozitivan ili negativan za Filadelfija hromozom je MRD-pozitivan u potpunoj hematološkoj remisiji.

Izraz "remisija" ili "potpuna hematološka remisija " kao što je ovde korišćen treba razumeti kao nedostatak dokaza za ALL bolest nakon standardnog tretmana, npr. posle hemoterapije i/ili transplantacije. Ovo znači da kostna srž sadrži manje od 5% ćelija blasta kao što je određeno svetlosnim mikroskopom, broj krvnih ćelija je u granicama normale i nema znakova ili simptoma ALL bolesti. Ipak, može se desiti da nisu sve leukemijske ćelije eliminisane iz tela. Takav pacijent, iako je u fazi remisije ili potpune hematološke remisije, je i dalje MRD pozitivan. Ove preostale tumorske ćelije mogu da izazovu povratnu leukemiju. Farmaceutski postupci pronalaska mogu se upotrebiti za ubijanje ovih preostalih tumorskih ćelija da bi se sprečio povratak leukemije koja potiče od skrivenih leukemijskih ćelija koje su preostale u telu posle primarne terapije. Na ovaj način, farmaceutska sredstva i postupci pomažu u prevenciji relapsa bolesti kod pedijatrijskih ALL pacijenata pozitivnih ili negativnih za Filadelfija hromozom.

Suprotno tome, "potpuna molekularna remisija" znači da ne postoji dokaz o prisustvu leukemijskih ćelija u biopsijama kostne srži, čak i kada se koriste veoma osetljivi testovi kao što su PCR ili FACS analize. Drugim rečima: ako se MRD ne može detektovati (<10<-4>, tj. manje od jedne leukemijske ćelije na 10<4>ćelija kostne srži), postignuta je potpuna molekularna remisija.

[0046] U sledećem poželjnom primeru izvođenja farmaceutskih postupaka pronalaska, primena navedene farmaceutske kompozicije konvertuje MRD-pozitivnu pedijatrijsku akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL) pozitivnu ili negativnu za Filadelfija hromozom u MRD negativan status.

[0047] U sledećem poželjnom primeru izvođenja farmaceutskih postupaka pronalaska, MRD je meren sa kvantitativnom detekcijom citogenetičke abnormalnosti

t(9;22)[BCR-ABL];

[0048] MRD je meren kvantitatvnim detektovanjem pojedinačnog citogenetičkog abnormaliteta t(9;22)[BCR-ABL]; navedena kvantitativna detekcija navedene citogenetičke abnormalnosti poželjno se izvodi upotrebom, na primer, PCR ili FACS analize. Postupak pronalaska obezbeđuje terapeutski pristup za lečenje, poboljšanje ili eliminaciju MRD, na taj način umanjujući ili čak poništavajući rizik od relapsa za pedijatrijskog ALL pacijenta pozitivnog ili negativnog za Filadelfija hromozom. Posebno, kurativni tretman MRD kod pedijatrijskih ALL pacijenata nije bio dostupan do sada.

[0049] U sledećem primeru izvođenja farmaceutskih postupaka pronalaska, navedeni pedijatrijski pacijent sa MRD koji je pozitivan ili negativan za Filadelfija hromozom pokazuje signal za citogenetičku abnormalnost iznad granice detekcije. Poželjno, MRD je detektovan pomoću PCR i/ili FACS analize.

Ovde navedena pojedinačna citogenetička abnormalnost je t(9;22)[BCR-ABL]; MRD predstavljen od strane ALL ćelija koje nose navedenu citogenetičku abnormalnost može se detektovati pomoću PCR ili FACS analize.

Na primer, izraz "iznad bcr/abl signala iznad granice detekcije" kao što je ovde korišćen označava da PCR ili FACS analiza vodi do signala bcr/abl koji se može detektovati. Slično, t(4;11) translokacioni signal označava da se navedena translokacija može detektovati pomoću PCR ili FACS. Ovo se odnosi mutatis mutandis na ostale citogenetičke abnormalnosti ili rearanžmane koji su ovde navedeni. Izraz "sa osetljivošću od ≥10<-4>" u kontekstu sa rearanžmanima označava da se najmanje jedna leukemijska ćelija ili više leukemijskih ćelija (sa navedenim TCR ili imunoglobulinski rearanžmanom) na 10<4>ćelija kostne srži može detektovati navedenim postupcima.

[0050] U sledećem poželjnom primeru izvođenja farmaceutskih postupaka pronalaska, vreme do molekularnog relapsa (koji se može detektovati prethodno opisanim analizama) je više od 6 meseci, poželjno više od 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 meseci, ili poželjnije 2, 3, 4, 5 ili više godina. Izraz "molekularni relaps" kao što je ovde korišćen označava da pedijatrijski pacijent pokazuje signal za citogenetičku abnormalnost iznad granice detekcije i/ili najmanje jedan marker sa rearanžmanima sa osetljivošću od ≥10<-4>, sa PCR i/ili FACS, kao što je prethodno navedeno.

[0051] U sledećem poželjnom primeru izvođenja farmaceutskih postupaka pronalaska, odgovarajući varijabilni regioni teškog lanca (VH) i odgovarajući varijabilni regioni lakog lanca (VL) u navedenom konstruktu CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela su organizovani, od N-kraja ka C-kraju, sledećim redosledom, VL(CD19)-VH(CD19)-VH(CD3)-VL(CD3).

Odgovarajući varijabilni regioni teškog lanca (VH) i odgovarajući varijabilni regioni lakog lanca (VL) u CD3 and CD19 vezujućim domenima CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela prikazani u SEQ ID NOs. 3 do 10, respektivno. Odgovarajući CDR regioni odgovarajućih VH i VL regiona navedenog CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela prikazani su u SEQ ID NOs.11 do 22.

[0052] U sledećem poželjnom primeru izvođenja farmaceutskih postupaka pronalaska, navedeni konstrukt CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO.1, ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, poželjno najmanje 95% identična sa SEQ ID NO.1.

Pronalazak opisuje molekul CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO. 1, kao i aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% ili poželjno 95 % identična, najpoželjnije najmanje 96, 97, 98, ili 99 % identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO. 1. Pronalazak opisuje takođe odgovarajuću sekvencu nukleinske kiseline kao što je prikazana u SEQ ID NO. 2 kao i sekvencu nukleinskih kiselina koja je najmanje 90%, poželjno 95 % identična, najpoželjnije najmanje 96, 97, 98, ili 99% identična sa sekvencom nukleinske kiseline prikazanom u SEQ ID NO. 2. Treba razumeti da je identičnost sekvence određena za celu nukleotidnu ili aminokiselinsku sekvencu. Pored toga, treba razumeti da molekul bispecifičnog jednolančanog antitela koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90 % ili poželjno 95 % identična, najpoželjnije najmanje 96, 97, 98, ili 99 % identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO. 1 sadrži sve CDR sekvence prikazane u SEQ ID NOs. 11 do 22. Za poravnanje sekvenci, na primer, mogu se koristiti programi Gap ili BestFit (Needleman and Wunsch J. Mol. Biol. 48 (1970).443-453; Smith and Waterman, Adv. Appl. Math 2 (1981), 482-489), koji je sadržan u GCG softverskom paketu (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991). To je rutinski postupak za stručnjaka iz date oblasti tehnike da odredi i identifikuje nukleotidnu ili aminokiselinsku sekvencu koja ima identičnost sekvence od npr. 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% sa nukleotidnim ili aminokiselinskim sekvencama CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela opisanog ovde. Na primer, prema hipotezi Crick's Wobble, 5' baza na antikodonu nije prostorno ograničena kao druge dve baze, i shodno tome može da ima nestandardno sparivanje baza. Drugim rečima: treći položaj u tripletu kodona može da varira tako da dva tripleta koji se razlikuju po ovom trećem položaju mogu da kodiraju isti aminokiselinski ostatak. Navedena hipoteza je dobro poznata stručnjaku iz date oblasti tehnike (videti npr. http://en.wikipedia.org/wiki/Wobble_Hypothesis; Crick, J Mol Biol 19 (1966): 548-55). Dalje je rutinski postupak za stručnjaka iz date oblasti tehnike da odredi citotoksičnu aktivnost takve aminokiselinske sekvence koja ima npr. 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa nukleotidnim ili aminokiselinskim sekvencama CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela koje je ovde opisano. Citotoksična aktivnost CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela ili konstrukta antitela koji ima npr. 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa aminokiselinskim sekvencama CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela može se odrediti prema postupcima kao što je ilustrovano npr. u WO 99/54440, WO 2004/106381, ili WO 2007/068354.

[0053] U sledećem poželjnom primeru izvođenja farmaceutskih postupaka pronalaska, farmaceutska kompozicija sadrži konstrukt CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela se primenjuje kontinuiranom infuzijom u trajanju od najmanje četiri nedelje, nakon čega sledi interval od 2

nedelje bez tretmana. Jedan ciklus tretmana treba razumeti kao kontinuiranu infuziju navedenog antitela u trajanju od najmanje četiri nedelje, nakon čega sledi interval bez tretmana u trajanju od 2-nedelje. Nakon ovog intervala s druge strane može da sledi jedan ili više ciklusa tretmana ili alogena HSCT. Poželjno, navedena primena kontinuiranom infuzijom CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela (tj. jedan ciklus tretmana) treba ponoviti najmanje dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet ili čak do deset puta, nakon određivanja MRD negativan status, za konsolidaciju.

[0054] U jednom primeru izvođenja farmaceutskih postupaka pronalaska, postupak se odvija pre alogene transplantacije matičnih ćelija za konverziju MRD pozitivne ALL pozitivne ili negativne za Filadelfija hromozom u MRD negativan status.

[0055] U sledećem primeru izvođenja farmaceutskih postupaka pronalaska, postupak se odvija posle alogene HSCT, na primer, u slučajevima gde je pedijatrijska ALL pozitivna ili negativna za Filadelfija hromozom u relapsu posle uobičajene ALL terapije upotrebom hemoterapije i/ili alogene transplantacije matičnih ćelija.

[0056] U sledećem primeru izvođenja farmaceutskih postupaka pronalaska, konstrukt CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela se primenjuje u dnevnoj dozi od 10 µg do 100 µg po kvadratnom metru površine tela pacijenta.

Kao što je ovde korišćen, opseg doza koji je definisan kao "X do Y" je jednak opsegu doza koji je definisan kao "između X i Y". Opseg obuhvata gornju granicu kao i donju granicu. Ovo znači da na primer dnevna doza od 10 µg do 100 µg po kvadratnom metru površine tela pacijenta uključuje i "10 µg" i "100 µg".

[0057] U sledećem primeru izvođenja farmaceutskih postupaka pronalaska, konstrukt CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela se primenjuje u dnevnoj dozi od 15 µg, 30 µg, 60 µg ili 90 µg po kvadratnom metru površine tela pacijenta. Poželjnije, navedeno antitelo se primenuje u dnevnoj dozi od 15 do 30 µg po kvadratnom metru površine tela pacijenta, a najpoželjnije u dnevnoj dozi od 15 ili 30 µg po kvadratnom metru površine tela pacijenta.

[0058] Prosečna površina tela pedijatrijskog pacijenta ovde se izračunava u kontekstu postupka ili upotrebe prema pronalasku tako da je u opsegu od oko 0,2 do 2,2 m<2>. Za izračunavanje videti npr. formule date u http://www.cato.eu/koerperoberflaeche-kinder.html.

[0059] U sledećem primeru izvođenja farmaceutskih postupaka pronalaska, pedijatrijska akutna limfoblastna leukemija (ALL) pozitivna ili negativna za Filadelfija hromozom je novodijagnostifikovana, refraktorna ili relapsirana pedijatrijska ALL pozitivna ili negativna za Filadelfija hromozom. Novo-dijagnostifikovana pedijatrijska ALL kao što je ovde korišćena označava da je ALL bolest dijagnostifikovana kod pedijatrijskog pacijenta po prvi put.

U sledećem primeru izvođenja farmaceutskih postupaka pronalaska, navedeni postupak je za pacijenta sa visokim rizikom od relapsa prema COGAALL03B1 klasifikaciji akutne limfoblastne leukemije.

Povoljno, farmaceutska kompozicija koja sadrži CD19xCD3 bispecifično jednolančano antitelo kao što je ovde opisano dodatno sadrži, po izboru (a) reakcioni pufer(e), rastvore za čuvanje i/ili preostae reagense ili materijale potrebne za navedeni postupak ili upotrebu. Pored toga, navedene komponente mogu biti pakovane pojedinačno u bočice ili flašice ili u kombinaciji u spremnike ili jedinice sa više spremnika.

Da bi se procenila bezbednost i tolerabilnost CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela kao što je ovde opisano, jedinjenje se primenjuje dugotrajnom kontinuiranom infuzijom. Nađeno je da se korisni i nečekivani efekti farmaceutskih postupaka pronalaska mogu dobiti primenom CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela u dnevnoj dozi od 10 mikrograma do 100 mikrograma po kvadratnom metru površine tela. Dnevna doza se može održavati konstantnom tokom perioda primene. Međutim, takođe je u granicama ovog primera izvođenja da za početni dan(e) perioda infuzije primenjuje niža doza CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela ("inicijalna doza") pre ovde opisanih farmaceutskih postupaka, dok se tokom preostalog perioda infuzije primenjuje viša doza ("doza održavanja"). Ova mera može da pomogne u prilagođavanju tela pacijenta tretmanu antitelom i/ili da bi se izbegli neželjeni sporedni efekti. Na primer, 5 mikrograma bispecifičnog jednolančanog antitela po kvadratnom metru površine tela može se primeniti kao inicijalna doza tokom prvog dana (jednog ili više) (npr. prvog dana ili prvog i drugog dana, ili prvog, drugog i trećeg dana, itd. sve do sedmog dana) perioda infuzije praćeno primenom 15 mikrograma po kvadratnom metru povrišine tela kao dnevna doza tokom preostalog perioda. Ili 5 mikrograma bispecifičnog jednolančanog antitela po kvadratnom metru površine tela se može primeniti kao incijalna doza prvog dana (jednog ili više) perioda infuzije praćeno primenom 30 ili 45 mikrograma po kvardatnom metru povrišine tela kao dnevna doza tokom preostalog perioda. Takođe je predviđeno da se 5 mikrograma CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela po kvadratnom metru površine tela može primeniti prvog dana (jednog ili više) perioda infuzije, praćeno primenom 15 mikrograma CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela po kvardatnom metru povrišine tela tokom preostalih dana (jednog ili više) perioda infuzije, praćeno primenom 30 ili 45 mikrograma po kvadratnom metru povrišine tela kao dnevna doza (doza održavanja) tokom preostalog perioda primene od ukupno najmanje 4 nedelje. Dve inicijalne doze mogu se primeniti tokom dana jedan, već takođe tokom 2, 3, 4, 5, 6 ili 7 dana ili čaki i duže. Prosečna površina tela pacijenta je ovde izračunata u kontekstu farmaceutskih postupaka prema pronalasku da iznosi od 0,2 do 2,2 m<2>. Neprekidna primena CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela može biti intravenska, parenteralna, subkutana, transdermalna, intraperitonealna, intramuskularna ili pulmonalna.

Intravenski način primene će u najvećem broju slučajeva biti režim po izboru neprekidne primene CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela i kao što može biti slučaj, za koprimenu farmaceutskog agensa kao dela režima ko-terapije. Kao takva, intraveneska primena je posebno poželjna. U ovom slučaju, može se izabrati odgovarajući merni uređaj kao što je multiterapijska infuziona pumpa model 6060 proizvođača Baxter. Koji god da je merni uređaj izabran, treba da bude tako dizajniran i konstruisan da svede na minimum ili bolje, spreči prekid primene terapeutskog agensa u slučaju zamene kertridža i/ili zamene baterije ili njenog punjenja. Ovo se može postići, na primer izborom uređaja sa sekundarnim rezervoarom rastvora CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela odvojenog od kertridža koji se menja tako da se može nastaviti kontinuirana infuzija iz ovog sekundarnog rezervoara u pedijatrijskog pacijenta čak i kada je prazan ili gotovo ispražnjen kertridž uklonjen i zamenjen novim.

[0060] Režim intravenske primene i, kao što može biti slučaj, ko-primena kao deo režima koterapije uključuje implantaciju pumpe u telo pedijatrijskog pacijenta za odmeravaje takve primene. Stručnjak iz date oblasti je upoznat sa takvim mernim pumpama, na primer modela 6060 proizvođača Baxter kao što je prethodno dato.

[0061] Kao neograničavajući primer, neprekidna, tj kontinuirana primena se može sprovesti malim sistemom pumpi koje padijatrijski pacijent nosi ili koji se implantirantira u telo pedijatrijskog pacijenta za merenje influksa terapeutskog agensa u telo pacijenta. Takvi sistemi pumpi su generalno poznati u tehnici, i obično se oslanjaju na periodičnu zamenu kertridža koji sadrže terapeutski agens za infuziju. Prilikom zamene kertridža u takvim sistemima pumpi, može doći do privremenog prekida inače neprekinutog protoka terapeutskog agensa u telo pedijatrijskog pacijenta. U takvom slučaju, faza primene pre zamene kertridža i faza primene posle zamene kertridža će se i dalje smatrati obuhvaćenim značenjem farmaceutskih postupaka pronalaska da zajedno čine jednu "neprekidnu primenu" takvog terapeutskog agensa. Isto se može primeniti za veoma duge primene u kojima je zamena kertrirdža potrebna više od jednog puta, ili u kojima baterija koja napaja pumpu zahteva zamenu, što dovodi do privremenog zaustavljanja protoka terapeutskog rastvora u telo pacijenta.

[0062] Takođe je potrebno preduzeti odgovarajuće mere za svođenje na minimum opasnosti od infekcije na mestu uboda kod primene u telo pacijenta, budući da su takve dugotrajne rane podložne takvoj infekciji. Prethodno se takođe odnosi na intramuskularnu primenu preko sličnog sistema za isporuku.

[0063] Kontinuirana primena može da bude transdermalna preko flastera koji se nosi na koži i koji se u određenim vremenskim intervalima menja. Stručnjak iz date oblasti je upoznat sa sistemima flastera za isporuku leka koji su pogodni za tu namenu. Treba napomenuti da je transdermalna primena posebno pogodna za neprekidnu primenu, kako se zamena prvog potrošenog flastera može izvesti istovremeno sa postavljanjem novog, drugog flastera, na primer na površinu kože neposredno pored mesta gde je bio postavljen prvi potrošeni flaster i odmah nakon uklanjanja prvog potrošenog flastera. Ovde se ne javljaju problemi sa prekidom protoka ili nestankom struje iz baterije.

[0064] Pored toga, pronalazak se odnosi na konstrukt CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela za lečenje, poboljšanje ili eliminaciju pedijatrijske akutne limfoblastne leukemije (ALL), gde se navedeno CD19xCD3 bispecifično jednolančano antitelo priprema za primenu na pedijatrijskog pacijenta.

Pronalazak se dalje odnosi na upotrebu konstrukta CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela za pripremu farmaceutske kompozicije za lečenje, poboljšanje ili eliminaciju pedijatrijske akutne limfoblastne leukemije (ALL). Prema tome, predmetni pronalazak se takođe odnosi na konstrukt CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela kao što je ovde definisan za lečenje, poboljšanje ili eliminaciju pedijatrijske akutne limfoblastne leukemije (ALL). Ovde dati primeri izvođenja u kontekstu farmaceutskih sredstava i postupaka odnose se ovde mutatis mutandis za primenu odgovarajuće farmaceutske kompozicije koja sadrži jednolančane konstrukte anti CD19xCD3 konstrukata za primenu na pedijatrijskog pacijenta, posebno za lečenje, poboljšanje ili eliminaciju pedijatrijske akutne limfoblastne leukemije (ALL).

[0065] Poželjno, navedena pedijatrijska akutna limfoblastna leukemija (ALL) je pedijatrijska akutna limfoblastna leukemija (ALL) B-linije, poželjno pedijatrijska B-prekursorska akutna limfoblastna leukemija ALL, poželjnije pedijatrijska pro-B ALL, pre-B ALL ili uobičajena ALL (cALL). Još poželjnije, ALL je cALL.

U poželjnom primeru izvođenja navedenih medicinskih upotreba, navedena B-prekursorska ALL je relapsirana i/ili refraktorna za uobičajene tretmane ALL, kao što je hemoterapija i/ili HSCT.

Poželjno, navedena akutna limfoblastna leukemija (ALL) je u relapsu u roku od oko tri nedelje od dijagnoze.

U sledećem poželjnom primeru izvođenja navedenih medicinskih upotreba, konstrukt CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela je za lečenje, poboljšanje ili eliminaciju sa novim, drugim flasterom, na primer na površini kože neposredno pored prvog ispražnjenog flastera i neposredno pre uklanjanja prvog ispražnjenog flastera. Problemi prekida protoka ili pražnjenja baterije se ne javljaju.

Pored toga, pronalazak se odnosi na konstrukt CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela za upotrebu u postupku za lečenje, poboljšanje ili eliminaciju pedijatrijske akutne limfoblastne leukemije (ALL) pozitivne ili negativne za Filadelfija hromozom, pri čemu se navedeno CD19xCD3 bispecifično jednolačano antitelo priprema za pripremu na pedijatrijskog pacijenta pozitivnog ili negativnog za Filadelfija hromozom.

Pronalazak se dalje odnosi na upotrebu konstrukta CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela za pripremu farmaceutske kompozicije za lečenje, poboljšanje ili eliminaciju pedijatrijske akutne limfoblastne leukemije (ALL) pozitivne ili negativne za Filadelfija hromozom. Prema tome, predmetni pronalazak se takođe odnosi na konstrukt CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela definisan ovde za lečenje, poboljšanje ili eliminaciju pedijatrijske akutne limfoblastne leukemije (ALL) pozitivne ili negativne za Filadelfija hromozom. Primeri izvođenja koji su navedeni ovde u kontekstu farmaceutskuih postupaka odnose se mutatis mutandis za pripremu odgovarajuće farmaceutske kompozicije koja sadrži jednolančane konstrukte anti CD19xCD3 konstrukata za primenu na pedijatrijskog pacijenta pozitivnog ili negativnog za Filadelfija hromozom, naročito za lečenje, poboljšanje ili eliminaciju pedijatrijske akutne limfoblastne leukemije (ALL) pozitivne ili negativne za Filadelfija hromozom.

Poželjno, navedena pedijatrijska akutna limfoblastna leukemija (ALL) pozitivna ili negativna za Filadelfija hromozom je pedijatrijska akutna limfoblastna leukemija B-linije (ALL), poželjno pedijatrijska B-prekursorska akutna limfoblastna leukemija ALL, poželjnije pedijatrijska pro-B ALL, pre-B ALL ili uobičajena ALL (cALL). Čak poželjnije, ALL je cALL.

U poželjnom primeru izvođenja navedenih medicinskih upotreba, navedena B-prekursorska ALL pozitivna ili negativna za Filadelfija hromozom je relapsirana i/ili refraktorna za uobičajeni tretman ALL, kao što je hemoterapija i/ili HSCT.

Poželjno, navedena akutna limfoblastna leukemija (ALL) pozitivna ili negativna za Filadelfija hromozom relapsira se u roku od oko tri godine od dijagnoze.

U sledećem poželjnom primeru izvođenja navedenih medicinskih upotreba, konstrukt CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela je za lečenje, poboljšanje ili eliminaciju minimalne rezidualne bolesti (MRD) kod pedijatrijskog pacijenta sa akutnom limfoblastnom leukemijom (ALL) pozitivnom ili negativnom za Filadelfija hromozom. Poželjno, navedeni pedijatrijski pacijent je MRD-pozitivan u potpunoj hematološkoj remisiji.

U sledećem poželjnom primeru izvođenja navedenih medicinskih upotreba, primena navedenog CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela konvertuje MRD pozitivnu pedijatrijsku akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL) pozitivnu ili negativnu za Filadelfija hromozom u MRD negativan status.

Poželjno, MRD je meren kvantitativnom detekcijom pojedinačne citogenetičke abnormalnosti, kao što je ovde definisana, primenom PCR i/ili FACS analize. Poželjnije, pedijatrijski ALL pacijent pozitivan ili negativan za Filadelfija hromozom pokazuje signal za citogenetičku abnormalnost iznad granice detekcije.

U sledećem poželjnom primeru izvođenja navedenih medicinskih upotreba, vreme za molekularni relaps koji se može detektovati naznačenim postupcima detekcije je duže od 6 meseci.

U sledećem poželjnom primeru izvođenja navedenih medicinskih upotreba, odgovarajući varijabilni regioni teškog lanca (VH) i odgovarajući varijabilni regioni lakog lanca (VL) u navedenom konstruktu CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela organizovani su od N-kraja do C-kraja, sledećim redosledom, VL(CD19)-VH(CD19)-VH(CD3)-VL(CD3). Poželjno, konstrukt CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO.1, ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, poželjno 95% identična sa SEQ ID NO.1.

U sledećem poželjnom primeru izvođenja navedenih medicinskih upotreba, jedan ciklus tretmana je kontinuirana infuzija u trajanju od najmanje četiri nedelje, nakon čega sledi interval bez terapije u trajanju od 2 nedelje.

Poželjno, navedena primena se ponavlja najmanje dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet od deset puta, nakon utvrđivanja MRD negativnog statusa.

U sledećem primeru izvođenja, primena je pre alogene transplantacije matičnih ćelija za konverziju MRD pozitivne ALL pozitivne ili negativne za Filadelfija hromozom u MRD negativan status.

U altemativnom primeru izvođenja, primena je posle alogene transplantacije matičnih ćelija.

[0066] U sledećem poželjnom primeru izvođenja navedenih medicinskih upotreba, konstrukt CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela se primenjuje u dnevnoj dozi od 10 µg do 100 µg po kvadratnom metru površine tela pacijenta.

Poželjno, konstrukt CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela se primenjuje u dnevnoj dozi od 15 µg do 30 µg po kvadratnom metru površine tela pacijenta.

U sledećem poželjnom primeru izvođenja navedenih medicinskih upotreba, primena konstrukta CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela zamenjuje alogenu transplantaciju matičnih ćelija kod pedijatrijskih pacijenata pozitivnih ili negativnih za Filadelfija hromozom koji su podobni za alogenu transplantaciju matičnih ćeliija.

[0067] Primeri izvođenja, definicije i objašenjenja dati za farmaceutske postupke pronalaska odnose se mutatis mutandis na medicinske upotrebe konstrukta CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela kao što je ovde opisan.

[0068] Slike prikazuju:

Slika 1: Način delovanja CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela (CD19xCD3 bscab). CD19xCD3 bispecifično jednolančano antitelo (SEQ ID NO. 1) preusmerava CD3-pozitivne citotoksične T ćelije da eliminišu ćelije humane akutne limfoblastne leukemije koje nose CD19 antigen.

Slika 2: Neuspeh uobičajene ALL terapije kod 7-godišnjeg pacijenta sa uobičajenom ALL. Godinu dana posle HSCT, pedijatrijski pacijent je doživeo drugi relaps kostne srži i primio sledeću hemoterapiju uključujući 1 ciklus klofarabinom/ciklofosfamidom/VP16, 2 ciklusa amsakrina, VP16, prednizona i 1 ciklus melfalana/citarabina. Uprkos ovoj agresivnoj hemoterapiji, pacijent je imao upornu morfološku bolest tokom tretmana, kao što je pokazano visokim nivoima MRD. Leva y-osa označava FACS-MRD %, desna y-osa označava PCR-MRD (od 10° do <10<-4>), x-osa označava dane od prve HSCT; videti Primer 4.

Slika 3: Uspešan tretman pedijatrijskog pacijenta primenom CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela (CD19xCD3 bscab; SEQ ID NO. 1), kao što je pokazano preko MRD pre, tokom i nakon tretmana navedenim antitelom. Posle neuspeha uobičajene ALL terapije, pacijent je tretiran kontinuiranom infuzijom od 15 µg/m<2>CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela (SEQ ID NO. 1) tokom 5 nedelja. Posle tretmana antitelom, može se postići negativan MRD status. U 10/2008., tj. 2 nedelje posle završetka terapije sa CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom (dan 0 na Slikama 3 do 5), pacijent je podvrgnut drugoj HSCT od svoje haploidentične majke primenom nemijeloablativnog preparativnog režima koji se sastoji od klofarabina, tiotepa i melfalana (Lang) naznačenog na histrogramu kao stub kondicioniranja. Leva y-osa označava FACS-MRD %, desna y-osa označava PCR-MRD (od 10° do <10<-4>), x-osa označava dane od prve HSCT, dan "0" označava dan druge HSCT (posle tretmana antitelom); videti Primer 4.

Slika 4: Temporalni razvoj broja blasta pre i posle tretmana sa CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom (CD19xCD3 bscab; SEQ ID NO. 1). Analiza kostne srži na dan 10 tretmana CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom otkrila je potpunu eliminaciju blasta kostne srži (MRD < 10<-4>) anitelom. Naredna BM analiza na kraju tretmana CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom na dan 35 potvrdila je potpuno odsustvo leukemijskih blasta iz kostne srži (MRD < 10<-4>). Leva y-osa označava broj blasta izmeren protočnom citometrijom u %, desna y-osa označava broj blasta izmeren mikroskopom u %, x-osa označava dane od HSCT, gde negativni dani označavaju dane od prve HSCT, dan "0" označava dan druge HSCT (posle tretmana antitelom) i pozitivni dani označavaju dane posle druge HSCT.

Slika 5: Sniženje nivoa MRD posle tretmana CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom (CD19xCD3 bscab; SEQ ID NO. 1). Posle tretmana antitelom, može se postići negativan MRD. Od 6/2009., pacijent je ostao u MRD-negativnoj potpunoj molekularnoj remisiji. Leva y-osa označava FACS-MRD %, desna y-osa označava PCR-MRD (od 10° do <10<-4>), x-osa označava dane od HSCT, gde negativni dani označavaju dane od prve HSCT i "0" označava dan druge HSCT i pozitivni dani označavaju dane od druge HSCT.

[0069] Pronalazak je dalje ilustrovan sledećim primerima:

Primeri:

1. CD19xCD3 bispecifično jednolančano antitelo

[0070] Stvaranje, eksprimiranje i citotoksična aktivnost CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela opisana je u WO 99/54440. Odgovarajuće aminokiselinske sekvence i sekvence nukleinskih kiselina CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela prikazane su u SEQ ID NOs. 1 i 2, respektivno. VH i VL regioni CD3 vezujućeg domena CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela prikazani su u SEQ ID NOs. 7 do 10, respektivno, dok su VH i VL regioni CD19 vezujućeg domena CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela prikazani u SEQ ID NOs 3 do 6.

2. Fenotipska analiza limfocita i analiza himerizma

[0071] Za fenotipsku analizu limfocita i analizu himerizma, uzorci krvi pacijenta su sakupljeni pre, tokom ili posle tretmana CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom koristeći epruvete za sakupljanje koje sadrže EDTA. Apsolutni broj limfocita u uzorcima krvi određen je preko diferecijalne analize krvi na Advia. Limfociti su obojeni upotrebom fluorescentno-obeleženih antitela koja su usmerena protiv CD3, CD4, CD8, CD19 i CD56 (svi dobijeni od Becton-Dickinson, Heideiberg, Germany). Analize obeleženih ćelija i sakupljanje podataka izvedeni su sa FACSCalibur (Becton-Dickinson).

3. Detekcija MRD

[0072] Za detekciju MRD, primenjena je analiza bazirana na lančanoj reakciji polimeraze (PCR) (Bader et al., loc. cit.) ili FACS analiza. Ukratko, DNK je izolovana pomoću DNeasy Blood&Tissue Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany). Nedavno je pokazano da su rearanžmani gena imunoglobulina i T-ćelijskog receptora stabilni markeri za praćenje MRD kod akutne limfoblastne leukemije posle transplantatcije matičnih ćelija (Kreyenberg, Leukemia, 2009).

4. Prikaz slučajeva

4.1 Prikaz slučaja: pacijent 1

[0073] Ovaj 7-godišnji pacijent je dijagnostifikovan sa visoko rizičnom CD10+ uobičajenom ALL (CD19-, CD34-pozitivna; CD45 redukovana; TCR rearanžman; CNS negativan) u 2004. godini. Posle tretmana, došlo do je relapsa kostne srži u junu 2006. i tretiran je prema ALL-REZ BFM ispitivanju u S3 grani. Posle dva ciklusa hemoterapije, pacijent je imao upornu bolest i postigao je kompletnu remisiju posle 3 ciklusa klofarabina. U 2007. godini, posle kondicioniranja zračenjem celog tela i etopozidom, primio je alogeni HSCT od nesrodnog donora sa kojim je imao 9 od deset odgovarajućih HLA-alela. Godinu dana posle HSCT, doživeo je relaps kostne srži i primio je sledeću hemoterapiju koja uključuje 1 ciklus klofarabina/ciklofosfamida/VP16 (Nobuko), 2 ciklusa amsakrina, VP16, prednizona (Hamburg) i 1 ciklus melfalana/citarabina; videti Sliku 2. Uprkos agresivnoj hemoterapiji, pacijent je imao upornu morfološku bolest tokom tretmana, kao što je očigledno iz visokih nivoa MRD na Slici 2. Zatim je tretiran pod upotrebom iz samilosti kontinuiranom infuzijom od 15 µg/m<2>CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela (blinatumomab; SEQ ID NO.

1) tokom 5 nedelja; videti Sliku 3. Serijska analiza limfocitne populacije pre (dan 0) i tokom tretmana navedenim antitelom pokazala je impresivnu ekspanziju CD8+ T-limfocita, dok nije zabeležena promena u CD4+ T-ćelijama i CD56+ NK ćelijama. Posle tretmana antitelom, može se postići negativan MRD. Analiza pratećeg himerizma pokazala je 100% himerizam donora. Kao što je prikazano na Slici 4, analize kostne srži na dan 10 tretmana CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom otkrila je potpunu eliminaciju blasta kostne srži (MRD < 10<-4>). Sledeća analiza BM na kraju tretmana CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom ponovo je pokazala potpuno odsustvo leukemijskih blasta iz kostne srži (MRD < 10<-4>). Serijska analza MRD pre, tokom i posle tretmana navedenim antitelom prikazana je na Slici 5. Pre tretmana antitelom, pedijatrijski pacijent je imao veom lošu prognozu i nije bio podoban za HSCT zbog lošeg kliničkog stanja. Posle tretmana antitelom, može se postići negativan MRD. Pored prolaznih diksretnih znakova ataksije, nisu zapaženi veći sporedni efekti i nisu uočeni znaci GvHD uprkos impresivnoj ekspanziji CD8+ T-limfocita poreklom od donora. U 10/2008., 2 nedelje posle kraja tretmana CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom (tj. dan 0 na Slikama 3 do 5), podvrgnut je drugoj HSCT od svoje haploidentične majke primenom nemijeloablativnog preparativnog režima koji se sastoji od klofarabina, tiotepa i melfalana (Lang). Od 11/2009., pacijent je ostao u MRD-negativnoj kompletnoj remisiji.

Prikaz slučaja: pacijent 2

[0074] Kod ovog petnaestogodišnjeg pacijenta dijanostifikovana je Filadelfija hromozom- i CD19-pozitivna B-prekursorska ALL u aprilu 2001. Posle hemoterapije, primio je HSCT od svog HLA-identičnog brata/sestre u oktobru 2001. posle kondicioniranja sa TBI od 12 Gy i etoposidom. U 2002., dijagnostifikovan je relaps kostne srži i postignuta je druga remisiju sa matinibom i hemoterapijom. Zatim je primio drugu HSCT od HLA-identičnog nesrodnog donora u oktobru 2004. U martu 2008., dijagnostifikovan je drugi relaps i tretiran je hemoterapijom u niskoj dozi i dasatinibom usled rezistencije na imatinib. Posle dodatne hemoterapije klofarabinom i citozinom/arabinozidom, postigao je molekularnu remisiju i primio treću alogenu HSCT od svog haploidentičnog oca sa 3 od ukupno 6 nepoklapajuća HLA-alela uz tretman posle transplantacije sa dasatinibom. Zbog gastrointestinalnog krvarenja i dilatativne kardiomiopatije, prekinut je tretman dasatinibom 5 meseci posle transplantacije. U aprilu 2009., dijagnostifikovan je kombinovani relaps centralnog nervnog sistema (CNS) sa 7x10<9>/L blasta u CNS-u i 3% blasta u kostnoj srži. Pacijent je zatim tretiran nilotinibom, intratekalnom hemoterapijom i frakcionim zračenjem CNS-a sa 18 Gy. Tri meseca nakon ovog tretmana, kostna srž pacijenta ostala je MRD-pozitivna u nivou od 1.1 x10<-3>, dok u CNS-u nije bilo blasta. Analiza himerizma periferne krvi otkrila je potpunu hematopoezu koja potiče od njegovog haploidentičnog oca.

[0075] Pacijent je zatim tretiran prema upotrebi iz samilosti jednim agensom blinatumomabom od 15 µg/m<2>/dan tokom 4 nedelje kontinuiranom infuzijom bez bilo kakvih štetnih efekata. Aspiracija kostne srži na kraju tretmana pokazala je potpunu remisiju sa nedetektabilnim MRD u kostnoj srži ispod <1x10<-4>. Kao i pacijent 1, i pacijent 2 nije pokazao nikakve znake GvHD tokom ili posle tretmana sa blinatumomabom. Dve nedelje posle završetka tretmana sa blinatumomabom, kod pacijenta se ispoljila prolazna hemolitička reakcija izazvana infekcijom. Pacijent 2 je trenutno bez relapsa četiri nedelje posle tretmana. On se oseća dobro i pohađa školu.

4.3 Rezime

[0076] Lekovi koji su do sada dostupni za lečenje ALL su niske specifičnosti i utiču na raznovrsne druge ćelije što dovodi do ozbiljnih štetnih efekata kao što je imunosupresija, aplazija kostne srži, mukozitis, neuropatija, kardiotoksičnost i alopecija. Stoga hitno su potrebni bolje ciljani pristupi sa manje štetnih efekata. Pored toga, kod nekih pacijenata, ALL klonovi su razvili potpunu rezistenciju na uobičajenu hemoterapiju, a posebno oni klonovi koji su nastali posle HSCT, tako da su poželjni lekovi sa posebnim načinom dejstva. Efikasnost citotoksičnosti zavisne od antitela preko Fc receptora NK ćelija i granulocita u kombinaciji sa hemoterapijom mogla bi se pokazati kod pedijatrijske ALL upotrebom monoklonskog himernog antitela rituksimaba. Trenutno, blinatumomab je jedino antitelo u kliničkim ispitivanjima koje omogućava aktivaciju citotokičnih T ćelija za ciljno delovanje na CD19 u B-ćelijskim ne-Hodgkin-ovim limfomima i limfatičkim leukemijama. Smatra se da T ćelije imaju veći citotoksični potencijal od imunih ćelija koje su aktivirane uobičajenim monoklonskim antitelima.

Efekat alogene GvL bi trebalo da bude jedan od glavnih razloga za anti-leukemijsku efikasnost HSCT. Nažalost, pojava GvL je često povezana sa GvHD, koji je i dalje glavni uzrok morbiditeta i mortaliteta posle alogene HSCT. Prema tome, indukcija GvL u odsustvu GvHD je predmet intenzivnog istraživanja. Jedan pristup za indukciju GvL efekta je donorska limfocitna infuzija (DLI). Dok je DLI veoma efikasna u lečenju CML, manje je efikasna u post-transplantacionom tretmanu relapsirane ALL i često dovodi do pojave hronične GvHD sa značajnim pogoršanjem kvaliteta života kod obolele dece.

Jedan mogući pristup indukciji GvL bez GvHD je in-vivo aktivacija T limfocita poreklom od donora posle HSCT upotrebom niskih doza antitela blinatumomaba koji aktivira T ćelije, a koje može da usmeri T-limfocite protiv pacijentovih CD19-pozitivnih ALL blasta. Ovo antitelo je pokazalo impresivnu anti-limfomsku i anti-leukemijsku aktivnost u autolognoj situaciji, ali nikad nije testirano kod relapsirane ALL posle HSCT ili kod dece. U autolognoj situaciji, molekularna remisija je indukovana kod 13 od ukupno 16 odraslih pacijenata sa MRD-pozitivnom ALL. Oba ovde opisana pedijatrijska pacijenta su pokazala impresivni antileukemijski odgovor nakon početka tretmana. U oba slučaja, MRD je pao ispod nivoa detekcije bez ikakvih znakova GvHD, uprkos obimne ekspanzije T ćelija poreklom od donora. Ovo može biti posledica činjenice da je dejstvo blinatumomaba nezavisno od regularne prezentacije peptida antigena i ne mora da obuhvata aktivaciju repertoara naivnih T ćelija.

Niski nivoi doza blinatumomaba kao 15 µg/m<2>na dan bili su dovoljni za indukciju ekspanzije T-limfocita poreklom od donora i za eliminaciju ALL blasta ispod nivoa detekcije MRD. Ovo ističe to da se aktivacija T-ćelije veoma razlikuje od načina dejstva uobičajenih monoklonskih antitela, što zahteva mnogo veće doze i ne može da aktiva citotoksične T-ćelije zbog toga što oni nemaju Fc receptore.

Blinatumomab se dobro podnosi kod oba pacijenta izazuvajući samo umor, blagu ataksiju i tremor CTCAE stepena 1-2, Kod pacijenta 2, nisu zapaženi sporedni efekti uprkos intenzivnim pre-tretmanima. Kontinuiranu i.v. infuziju tokom nekoliko nedelja dobro su podnela oba pedijatrijska pacijenta.

Iz ovog prvog kliničkog iskustva kod pedijatrijske ALL, pronalazači su zaključili da se blinatumomab dobro podnosi i da može brzo da indukuje potpune hematološke i MRD-negativne remisije kod dece sa terapijski-refraktornom bolešću posle višestrukih relapsa CD19-pozitivne B-prekursorske ALL post-alogene HSCT. Važno je da nijedan od pacijenata ne pokazuje nikakve znake GvHD uprkos ekspanziji T-limfocita poreklom od donora, čak i posle nepodudarne haploidentične transplantacije.

[0077] Ovi prvi rezultati ukazuju na to da lečenje pacijenata sa pedijatrijskom akutnom limfoblastnom leukemijom (ALL) sa CD19xCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom može potpuno da eliminiše ćelije akutne limfoblastne leukemije iz tela pedijatrijskih pacijenata. Važno je napomenuti, da je ovaj tretman doveo ne samo do potpune hematološke remisije, već i to potpune molekularne remisije u tome da je minimalna rezidualna bolest (MRD) pozitivne akutne limfoblastne leukemije (ALL) konvertovana u MRD negativan status. Treman se dobro podnosi. U tom smislu, primena ovde opisanog CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela obezbeđuje poboljšanu mogućnost lečenja za pedijatrijsku akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL) pozitivnu ili negativnu za Filadelfija hromozom, a posebno za ALL pozitivnu ili nagativnu za Filadelfija hromozom koja je refraktorna na hemoterapiju i/ili alogenu HSCT i/ili relapsiranu ALL pozitivnu ili negativnu za Filadelfija hromozom.

[0078] Rezultati mogu biti kratko rezimirani na sledeći način:

Dva pedijatrijska pacijenta su tretirana na bazi upotrebe iz samilosti Kontinuirani negativan MRD kod ovih pacijenata.

Nisu zapaženi veći štetni efekti (AEs).

Svi AEs su prolazni, nije potrebno prekidanje tretmana.

LISTING SEKVENCI [0079]

Claims

Patentni zahtevi

1. Konstrukt CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela za upotrebu u postupku za lečenje, poboljšanje ili eliminaciju pedijatrijske akutne limfoblastne leukemije (ALL) kod pedijatrijskog pacijenta sa ALL, pri čemu je navedeni pacijent pozitivan ili negativan za Filadelfija hromozom.

2. Konstrukt za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što konstrukt CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela se primenjuje na konstantnoj dnevnoj dozi od 10 mikrograma do 100 mikrograma po kvadratnom metru površine tela pacijenta tokom perioda primene.

3. Konstrukt za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 2, naznačen time što se tokom početnog dana (jednog ili više) perioda infuzije primenjuje niža dnevna doza manja od 10 mikrograma do 100 mikrograma po kvadratnom metru površine tela pacijenta konstrukta CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela, nakon čega sledi viša dnevna doza od 10 mikrograma do 100 mikrograma po kvadratnom metru površine tela pacijenta tokom preostalog perioda infuzije.

4. Konstrukt za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, naznačen time što 5 µg po kvadratnom metru površine tela pacijenta se primenjuje prvog dana (jednog ili više) perioda infuzije, nakon čega sledi primena od 15 µg po kvadratnom metru površine tela pacijenta kao dnevna doza tokom preostalog perioda.

5. Konstrukt za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, naznačen time što se 5 µg po kvadratnom metru površine tela pacijenta primenjuje prvog dana (jednog ili više) perioda infuzije, nakon čega sledi primena od 30 µg ili 45 µg po kvadratnom metru površine tela pacijenta kao dnevna doza tokom preostalog perioda.

6. Konstrukt za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 2, naznačen time što se konstrukt CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela primenjuje kontinuirano.

7. Konstrukt za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, naznačen time što se kontinuirana infuzija ostvaruje preko malog sistema pumpe koji može da se nosi ili da se implantira.

8. Konstrukt za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, naznačen time što primena je intravenska ili subkutana, parenteralna, transdermalna, intraperitonealna, intramuskularna ili pulmonalna.