RS57029B1 - Protofibril-vezujuća antitela i njihova upotreba u terapeutskim i dijagnostičkim postupcima za parkinsonovu bolest, demenciju sa levi telima i drugim alfa-sinukleinopatijama - Google Patents

Protofibril-vezujuća antitela i njihova upotreba u terapeutskim i dijagnostičkim postupcima za parkinsonovu bolest, demenciju sa levi telima i drugim alfa-sinukleinopatijama

Info

Publication number
RS57029B1
RS57029B1 RS20180129A RSP20180129A RS57029B1 RS 57029 B1 RS57029 B1 RS 57029B1 RS 20180129 A RS20180129 A RS 20180129A RS P20180129 A RSP20180129 A RS P20180129A RS 57029 B1 RS57029 B1 RS 57029B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cdr
seq
synuclein
antibody
fragment
Prior art date
Application number
RS20180129A
Other languages
English (en)
Inventor
Eva Nordström
Alex Kasrayan
Monica Ekberg
Sundquist Valentina Screpanti
Lars Lannfelt
Mats Holmquist
Original Assignee
Bioartic Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bioartic Ab filed Critical Bioartic Ab
Publication of RS57029B1 publication Critical patent/RS57029B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1018—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2835—Movement disorders, e.g. Parkinson, Huntington, Tourette
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/30—Psychoses; Psychiatry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/30—Psychoses; Psychiatry
    • G01N2800/302—Schizophrenia
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/38—Pediatrics
    • G01N2800/385—Congenital anomalies
    • G01N2800/387—Down syndrome; Trisomy 18; Trisomy 13

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na antitela ili njihove fragmente sa visokim afinitetom ka humanim αsinuklein protofibrilima i niskim vezivanjem α-sinuklein monomera, pri čemu ta antitela ili fragmenti imaju specificirane sekvence regiona koji određuju komplementarnost (CDR). Ovaj pronalazak takođe se odnosi na kompozicije koje obuhvataju takvo antitelo ili fragment i na postupke detektovanja αsinuklein protofibrila upotrebom takvog antitela ili fragmenta. U daljim primerima izvođenja, pronalazak se odnosi na takvo antitelo ili fragment za upotrebu u tretiranju neurodegenerativnog poremećaja sa αsinuklein patologijom ili na upotrebu takvog antitela ili fragmenta u dijagnozi ili praćenju razvoja neurodegenerativnog poremećaja sa α-sinuklein patologijom.
POZADINA OVOG PRONALASKA
[0002] Parkinsonova bolest (PD) i demencija sa Levi telima (DLB) predstavjaju dva najpreovlađujuća primera neurodegenerativnih poremećaja sa α-sinuklein moždanom patologijom. PD je najčešći poremećaj pokreta i okarakterisan je krutošću, hipokinezijom, tremorom i posturalnom nestabilnošću. Smatra se da PD pogađa približno četiri do šest miliona ljudi širom sveta. DLB predstavlja 5-15 % svih demencija. Pored zaboravljanja i drugih dementnih simptoma koji često osciliraju, DLB pacijenti tipično pate od ponavljajućeg padanja i vizuelnih halucinacija.
[0003] Intraneuronska akumulacija α-sinukleina ili rezultira u formiranju Levi tela, okruglih eozinofilnih hijalinskih 10-20 µm velikih inkluzija, ili Levi neurita, izduženih končastih distrofičnih aksona i dendrita. U PD mozgu, taloženje Levi tela i Levi neurita uglavnom je ograničeno na neurone koji povezuju striatum sa crnom supstancom. Ove ćelije su krucijalne za izvršenje pomeranja i posturalnih funkcija, čime se objašnjava priroda PD simptoma. U DLB mozgu, široko rasprostranjenost taloga Levi tela i Levi neurita pronađena su i u srednjem mozgu i kortikalnim oblastima.
[0004] Alfa-sinuklein je protein koji se uglavnom nalazi unutar neurona. Unutar neurona, α-sinuklein je pre svega smešten presinaptički te se zbog toga smatra da ima ulogu u regulaciji sinaptičke aktivnosti. Identifikovane su tri glavne izoforme α-sinukleina, od kojih najduža i najčešća forma obuhvata 140 aminokiselina. Ova izoforma se koristi, a alfa-sinuklein (α-sinuklein) povezane karakteristike antitela prema ovom pronalasku odnose se na izoformu α-sinukleina.
[0005] Pored α-sinukleina, Levi tela se sastoje od širokog spektra molekula, od kojih jedan predstavlja 4-hidroksi-2-nonenal (HNE), α,β-nezasićeni hidroksialkenal (Qin et al., 2007). Pokazano je in vitro da HNE može modifikovati α-sinuklein i tako olakšati oligomerizaciju α-sinukleina. Određenije, pokazano je da HNE povećava i stabilizuje formiranje protofibrila, tj. rastvorljivih većih oligomernih oblika α-sinukleina (Qin et al., 2007; WO 2009/133521).
[0006] Oksidativni stres je uključen u brojnim neurodegenerativnim poremećajima okarakterisanim patološkom akumulacijom zloupotrebljenog α-sinukleina. Razne reaktivne kiseonične vrste mogu da indukuju peroksidaciju lipida kao što su ćelijske membrane ili lipopreoteini, a takođe mogu da rezultiraju u generisanju veoma reaktivnih aldehida iz poli-nezasićeni masnih kiselina (Yoritaka et al., 1996).
[0007] Moždani patološki pokazatelj Alchajmerove bolesti (AD), tj. amiloidni plakovi i neurofibrilarna klupka, primećeni su u približno 50% slučajeva sa DLB. Nejasno je da li postojanje paralelnih patologija podrazumeva dve različite bolesti ili samo predstavlja varijantu svakog respektivnog poremećaja.
Ponekad su slučajevi sa zajedničkom patologijom opisani kao varijanta AD sa Levi telima (Hansen et al., 1990).
[0008] Nedavna istraživanja ukazuju na ulogu α-sinukleina u AD i Daunovom sindromu, budući da je pokazano da se α-sinuklein protein akumulira u limbičkom regionu u ovim poremećajima (Crews et al., 2009).
[0009] HNE reaguje i modifikuje bočne lance cisteina, histidina i lizina, suštinski menjajući strukturu i fizička svojstva ovih bočnih lanaca. Tako, HNE može ili reagovati sa C-3 ugljenikom ili sa aldehidnom grupom ili njihovim kombinacijama. Tako, HNE može kovalentno modifikovati proteine, ili inter- ili intramolekularno.
Genetike Parkinsonove bolesti i Demencije sa Levi telima
[0010] Retki dominantno nasleđeni oblici PD i DLB mogu biti izazvani tačkastim mutacijama ili duplikacijama α-sinuklein gena. Opisano je da patogene mutacije A30P i A53T (Kruger et al., 1998) (Polimeropoulos et al., 1998) i duplikacije gena (Chartier-Harlin et al.2004) izazivaju porodičnu PD, dok je za neku drugu α-sinuklein mutaciju, E46K (Zarranz et al., 2004) kao i triplikaciju α-sinuklein gena (Singleton et al., 2003) prijavljeno da izazivaju ili PD ili DLB.
[0011] Patogene posledice α-sinuklein mutacija samo su delimično shvaćene. Međutim, in vitro podaci prikazuju da A30P i A53T mutacije povećavaju brzinu agregacije (Conway et al., 2000). Širok spektar različito sastavljenih α-sinuklein vrsta (monomeri, dimeri, oligomeri, uključujući protofibrile) uključene su u proces agregacije, od kojih svaka može imati različita toksična svojstva. Nije jasno koje molekulske vrste ispoljavaju toksične efekte na mozak. Međutim, nedavno istraživanje sugeriše da su oligomerni oblici α-sinukleina naročito neurotoksični. Dodatni dokaz za ulogu oligomera dat je zapažanjem da određene α-sinuklein mutacije (A30P i A53T) koje izazivaju naslednu Parkinsonovu bolest, vode ka povećanoj stopi oligomerizacije.
[0012] Nije potpuno jasno kako α-sinuklein agregaciona kaskada počinje. Verovatno je da izmenjena konformacija monomernog α-sinukleina inicira formiranje dimera i trimera, čime se nastavlja formiranje viših rastvorljivih oligomera, uključujući protofibrile, pre nego se ove vrste osrednje veličine natalože kao nerastvorljivi fibrili u Levi telima. Takođe je razumljivo da α-sinuklein oligomeri, od trenutka formiranja, mogu da vežu nove monomere i/ili manje multimere α-sinukleina i tako da ubrzaju proces formiranja fibrila. Takav efekat zasejavanja verovatno se takođe može dogoditi u ekstracelularnom prostoru budući da skoriji dokazi sugerišu da α-sinuklein patologija može da se propagira od neurona do neurona u obolelom mozgu.
[0013] Osim neuropatoloških promena u α-sinukleinopatijama, i nivoi α-sinuklein proteina generalno su povećani u regionima obolelog mozga (Klucken et al., 2006).
[0014] Glavna patologija kod α-sinukleinopatija je intraćelijska, što predstavlja izazov za prisutup imune terapije. Međutim, takođe je moguće da frakcija aktivno indukovanih ili pasivno primenjenih antitela može vezati njihove ciljane antigene intraneuronski. Štaviše, identifikacija α-sinukleina i u plazmi i u cerebrospinalnoj tečnosti (El-Agnaf et al., 2006) prikazuje da se taj protein ne nalazi ekskluzivno unutar neurona. Redukovanjem takvog ekstracelularnog α-sinukleina može se pomeriti ekvilibrijum između intraćelijskih i ekstraćelijskih proteinskih zaliha, a i rezultirati kao sniženi intraćelijski α-sinuklein. Dokaz sugeriše da α-sinuklein u rastvoru može da prodre u lipidne bislojeve u ćelijskim membranama i time postane internalizovan u ili eksportovan iz ćelije. Nedavna otkrića pokazala su da α-sinuklein ispoljava toksične efekte u ekstraćelijskom prostoru, čime se obezbeđuje verodostojno objašnjenje za to kako se α-sinuklein patologija širi kroz mozak u vidu progresa bolesti. Ispitivanja su pokazala da se Levi patologija prenosi na nakalemljene neurone kod PD pacijenata kod kojih je izvedena transplantacija (Li et al.2008). Dalje, α-sinuklein se prenosi putem endocitoze do susednih neurona, a prenos ćelija-do-ćelije αsinuklein agregata povezan je sa neuronskom ćelijskom smrću i patološkom progresijom kod PD i drugih α-sinukleinopatija (Desplats et al.2009).
Dijagnoza PD i DLB
[0015] Postoji potreba za poboljšanim dijagnostičkim sredstvima i postupcima kako bi se identifikovao rizik od neurodegenerativne bolesti sa α-sinuklein patologijom. Danas, ni jedan biohemijski postupak ne može pomoći lekaru u dijagnostikovanju kliničkih simptoma pacijenta u ranim fazama bolesti, pre nego što ne dođe do suštinskog oštećenja na mozgu.
[0016] Važnost tačnih dijagnostički ogleda postaje veća kako se pojavljuju nove terapeutske mogućnosti. Do danas, za PD pacijente dostupno je samo simptomatično lečenje (supstituisanjem gubitka aktivnog dopamina u mozgu). Za DLB, dostupno je još manje terapeutskih opcija. I pored toga, lekari često procenjuju moguće dobrobitne efekte na DLB pacijente sa strandardnim lečenjen za AD, tj. inhibitorima holinesteraze. U svakom slučaju, ni jedna od postojećih strategija lečenja α-sinukleinopatija nije usmerena protiv skrivenih procesa bolesti. Pored toga, takođe postoji potreba za praćenjem napredovanja bolesti i efekta tretiranja. Za pregled različitih pristupa usmerenih ka menjanju progresije Parkinsonove bolesti, videti George et al.2009.
[0017] U pogledu prethodno pomenutog učešća α-sinukleina u nekoliko neurodegenerativnih poremećaja, postoji potreba za novim lečenjima koja mogu da eliminišu ili redukuju efekte toksičnih αsinuklein vrsta, kao i potreba za dobrim biomarkerima kojima bi se pratile nove intervencije i kako bi se obezbedila dobra prognostična specifičnost.
SUŠTINA OVOG PRONALASKA
[0018] Ovaj pronalazak odnosi se na poboljšana antitela i njihove fragmente, kako je definisano u patentnim zahtevima, sa visokim afinitetom ka humanim α-sinuklein protofibrilima i niskim vezivanjem α-sinuklein monomera. Ovaj pronalazak takođe je usmeren na kompozicije koje obuhvataju takvo antitelo ili fragment i na postupke detektovanja α-sinuklein protofibrila koji koriste takvo antitelo ili fragment. U daljim primerima izvođenja, pronalazak je usmeren na takvo antitelo ili fragment za upotrebu u tretiranju neurodegenerativnog poremećaja sa α -sinuklein patologijom i za upotrebu takvog antitela ili fragmenta u in vitro dijagnozi ili praćenju razvoja neurodegenerativnog poremećaja sa αsinuklein patologijom, pri čemu je taj poremećaj sa α-sinuklein patologijom okarakterisan taloženjem Levi tela i Levi neurita.
[0019] U ovim primerima izvođenja, antitelo ili njegov fragment vezuje se za humane α-sinuklein protofibrile molekulske mase u opsegu od 1000 do 5000 kDa, pri čemu je vezivanje antitela ili fragmenta za svaki od α-sinuklein monomera i β-sinuklein monomera najmanje 100 puta manje od vezivanja tog antitela ili fragmenta za humane α-sinuklein protofibrile, i ima tri varijabilne teške (VH) CDR sekvence (VH-CDR-1, VH-CDR-2, i VH-CDR-3) i tri varijabilne lake (VL) CDR sekvence (VL-CDR-1, VL-CDR-2, i VL-CDR-3), pri čemu je šest CDR sekvencionih kombinacija tog antitela ili njegovog fragmenta odabrano iz sledećih kombinacija:
(a) VH CDR-1: SEQ ID NO: 22, VH CDR-2: SEQ ID NO: 28, VH CDR-3: SEQ ID NO: 35, VL CDR-1: SEQ ID NO: 41, VL CDR-2: SEQ ID NO: 47 i VL CDR-3: SEQ ID NO: 50,
(b) VH CDR-1: SEQ ID NO: 23, VH CDR-2: SEQ ID NO: 29, VH CDR-3: SEQ ID NO: 36, VL CDR-1: SEQ ID NO: 42, VL CDR-2: SEQ ID NO: 47 i VL CDR-3: SEQ ID NO: 50,
(c) VH CDR-1: SEQ ID NO: 24, VH CDR-2: SEQ ID NO: 30, VH CDR-3: SEQ ID NO: 37, VL CDR-1: SEQ ID NO: 43, VL CDR-2: SEQ ID NO: 48 i VL CDR-3: SEQ ID NO: 51,
(d) VH CDR-1: SEQ ID NO: 25, VH CDR-2: SEQ ID NO: 31, VH CDR-3: SEQ ID NO: 38, VL CDR-1: SEQ ID NO: 44, VL CDR-2: SEQ ID NO: 47 i VL CDR-3: SEQ ID NO: 52,
(e) VH CDR-1: SEQ ID NO: 26, VH CDR-2: SEQ ID NO: 32, VH CDR-3: SEQ ID NO: 39, VL CDR-1: SEQ ID NO: 45, VL CDR-2: SEQ ID NO: 47 i VL CDR-3: SEQ ID NO: 53,
(f) VH CDR-1: SEQ ID NO: 23, VH CDR-2: SEQ ID NO: 33, VH CDR-3: SEQ ID NO: 37, VL CDR-1: SEQ ID NO: 43, VL CDR-2: SEQ ID NO: 48 i VL CDR-3: SEQ ID NO: 54, i
(g) VH CDR-1: SEQ ID NO: 27, VH CDR-2: SEQ ID NO: 34, VH CDR-3: SEQ ID NO: 40, VL CDR-1: SEQ ID NO: 46, VL CDR-2: SEQ ID NO: 49 i VL CDR-3: SEQ ID NO: 55.
[0020] Antitela, fragmenti, kompozicije i postupci prema ovom pronalasku obezbeđuju poboljšanja u dijagnostikovanju, praćenju, prevenciji, odlaganju početka i/ili lečenju neurodegenerativnih poremećaja sa α-sinuklein patologijom kod pojedinaca koji imaju i/ili koji su u riziku od razvijanja takvih poremećaja.
[0021] Dodatni aspekti, primeri izvođenja i prednosti raznih primera izvođenja ovog pronalaska postaće jasniji iz detaljnog opisa.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0022] Detaljan opis biće jasniji pozivanjem na crteže na kojima:
Fig.1 prikazuje performansu protofibril specifičnih monoklonalnih antitela kako je određeno upotrebom kompeticione ELISA. Ogled je izveden HNE-stabilizovanim α-sinuklein protofibrilima kako je opisano u Primeru 4.
Fig.2A i 2B prikazuju performansu protofibril specifičnog antitela mAb49/G analizirano upotrebom kompeticione ELISA kako je opisano u Primeru 4. Fig.2A prikazuje protofibril specifično monoklonalno antitelo mAb49/G koje se vezuje sa visokim afinitetom sa humanim α-sinuklein protofibrilima stabilizovanim ili sa HNE ili sa ONE. Fig.2B prikazuje monoklonalno antitelo koje se takođe vezuje sa visokim afinitetom sa HNE-stabilizovanim protofibrilima humanih mutiranih oblika αsinukleina, A30P i A53T.
Fig.3A-3C prikazuju performansu protofibril specifičnih antitela analizirano upotrebom kompeticione ELISA kako je opisano u Primeru 4. Protofibril specifična monoklonalna antitela vezuju se sa visokim afinitetom za divlji tip humanih α-sinuklein protofibrila stabilizovani ili sa HNE (PF-HNE) ili sa ONE (PF-ONE). Monoklonalna antitela takođe se vezuju sa visokim afinitetom za HNE-stabilizovane protofibrile humanih mutiranih oblika α-sinukleina, A30P (A30P-HNE) i A53T (A30P-HNE).
Fig.4A i 4B usmerene su na kvantifikaciju α-sinuklein protofibrila upotrebom sendvič ELISA kako je opisano u Primeru 5. Fig.4A šematski prikazuje protofibril specifično antitelo mAb49/G koje se koristi i za hvatanje antitela i za detekciju antitela. Fig.4B prikazuje standardnu krivu generisanu sa HNE-stabilizovanim α-sinuklein protofibrilima. Performanse ogleda dostižu ograničenje kvantifikacije LOQ=9 pM.
Fig.5A i 5B prikazuju rezultate analize ekstrakata obolelog (DLB) i kontrolnog ljudskog mozga sa α-sinuklein protofibril specifičnom sendvič ELISA kako je opisano u Primeru 6.
Fig.6 prikazuje analizu ekstrakata mozga kontrolnih miševa (ntg, netransgeni) i 5 meseci starih miševa iz Khale transgenog (tg) mišjeg PD modela kako je opisano u Primeru 7. Moždano tkivo ekstraktovano je tris puferovanim slanim rastvorom (TBS) i TBS u prisustvu Tritona. Analiza je izvedena sa α-sinuklein protofibril sendvič ELISA kako je opisano u Primeru 5. Protofibril specifično antitelo mAb49/G upotrebljeno je i za hvatanje antitela i detektovanje antitela. Na grafikonu, y osa predstavlja apsorbanciju na OD450.
Fig.7A-7F prikazuju imunohistohemijsku (IHC) analizu tkiva kako je opisano u Primeru 8. Fig.7A prikazuje 38E2/7 vezivanje Levi tela i neurita u PD crnoj supstanci i pozitivnu α-α-sinuklein kontrolu. Fig. 7B prikazuje 38E2/7 vezivanje Levi tela i neurita u DLB korteksu i crnoj supstanci i pozitivnu α-α-sinuklein kontrolu. Fig.7C prikazuje razna antitela koja vezuju Levi tela i neurite u DLB korteksu i crnoj supstanci i negativnu kontrolu. Fig.7D prikazuje razna antitela koja vezuju Levi tela i neurite u PD crnoj supstanci i negativnu kontrolu. Fig.7E pokazuje nepostojanje vezivanja 38E2/7 u crnoj supstanci koja nije povezana sa bolešću i pozitivnu α-α-sinuklein kontrolu. Fig.7F prikazuje poređenje 38E2/7 vezivanja i pozitivnu α-Aβ kontrolu u korteksu pacijenta sa Alchajmerovom bolešću.
Fig.8A i 8B prikazuju imunotaloženje ekstrakata ljudskog mozga sa protofibril selektivnim monoklonalnim antitelom 38E2/7 upotrebom protokola za moždanu ekstrakciju kakav je opisan u Primeru 9.
Fig.9A i 9B prikazuju podatke fluorescencije izmerene primenom Axiovert200 mikroskopa opremljenog sa FITC epifluorescencionim filterom kako je opisano u Primeru 10. Fig.9A prikazuje tretirane ćelije dok Fig.9B prikazuje podatke izračunate kao relativni % smanjenja u intezitetu fluorescencije u poređenju sa antitelom netretiranim alfa-sinukleinom preko eksprimirajućih ćelija, koji je podešen na 100 %.
[0023] Različiti crteži biće potpunije shvaćeni u pogledu primera koji su navedeni u nastavku.
DETALJAN OPIS
[0024] Uprvom primeru izvođenja, ovaj pronalazak usmeren je na poboljšana antitela i njihove fragmente sa visokim afinitetom ka humanim α-sinuklein protofibrilima i niskim vezivanjem α-sinuklein monomera. U specifičnom primeru izvođenja, ta antitela su klase IgG ili njihove mutacije. U okviru ovog pronalaska, visok afinitet ka humanim α-sinuklein protofibrilima označava da ta antitela ili fragmenti eksprimiraju konstantu disocijacije Kdmanju od 10<-7>M za humane α-sinuklein protofibrile. Kao što je poznato u struci, protofibrili su rastvorljivi oligomeri α-sinukleina. Tipični protofibrili imaju molekulsku masu u opsegu od oko 1000 do oko 5000 kDa, pogodno izmereno primenom eksluzione hromatografije po veličini sa globularnim proteinima upotrebljenim kao reference, ali pronalazak nije ograničen na tako tipične protofibrile. Dodatno, u okviru ovog pronalaska, nisko vezivanje α-sinuklein monomera odnosi se na to da je vezivanje antitela ili fragmenta prema ovom pronalasku za α-sinuklein monomere najmanje 100 puta manje od onog za α-sinuklein protofibrile. U specifičnom primeru izvođenja, ovi afiniteti vezivanja mere se u skladu sa kompeticionom ELISA, na primer, kako je opisano u Primeru 4.
[0025] Pronalazak se dalje odnosi na takva antitela i fragmente za upotrebu u prevenciji, odlaganju početka, tretiranju, praćenju i/ili dijagnostikovanju neurodegenerativnih poremećaja sa α-sinuklein patologijom, uključujući, ali ne ograničavajući se na, Parkinsonovu bolest (PD), demenciju sa Levi telima (DLB), varijantu Alchajmerove bolesti sa Levi telima, multiple sistemsku atrofiju, psihozu, šizofreniju, i Creutzfeldt-Jakob bolest. Kod α-sinukleinopatija, nagomilan α-sinuklein kao Levi tela i Levi neuriti akumuliaju se u mozgu i, u nekim indikacijama, u drugim organima takođe.
[0026] Primeri antitela prema ovom pronalasku razvijeni su klasičnim tehnikama hibridoma. Antitela mogu biti poliklonalna ili monoklonalna. U specifičnom primeru izvođenja, antitela su monoklonalna. Dok se ovaj opis odnosi u većini slučajeva na antitela i njihove fragmente, radi boljeg razumevanja, izraz "antitelo" u ovom opisu uključuje i njegove fragmente, što znači njegove aktivne fragmente, tj. fragmente sa istim karakteristikama koje se koriste za definisanje antitela prema ovom pronalasku, određenije visok afinitet ka α-sinuklein oligomerima/protofibrilima i nisko vezivanje α-sinuklein monomera. Antitela i njihovi fragmenti pokazuju veliku efikasnost u klirensu patogenih oblika αsinukleina.
[0027] Nova antitela vezuju se za nagomilane oblike, određenije protofibrile, koji obuhvataju αsinuklein koji je ili nemofidikovan ili konjugovan, na primer, konjugovan 4-hidroksi-2-nonenalom (HNE) ili 4-okso-2-nonenalom (ONE), ili drugim α, β-nezasićenim hidroksialkenalima, ili poli-nezasićenim masnim kiselinama, koje stabilišu patogeni protofibrilni/oligomerni α-sinuklein epitop. Pomenuti epitop ili epitopi prisutni su na konformaciono izmenjenom ili modifikovanom α-sinukleinu, tj. α-sinuklein protofibrilima i oligomerima koji su prisutni u ljudskom mozgu pacijenata sa α-sinukleinopatijama, kao što su, ali bez ograničavanja, Parkinsonova bolest, DLB, itd. Ova nova antitela takođe se vezuju za patogene protofibrilne/oligomerne strukture obrazovane α-sinuklein mutantima, npr. A30P i A53T (Kruger et al., 1998) (Polimeropoulos et al., 1997) za koje je opisano da izazivaju porodičnu PD. Još jedan primer takvih meta za antitela ovog pronalaska predstavljaju protofibrile obrazovane mutant αsinukleinom E46K, koji izaziva PD ili DLB.
[0028] U jednom specifičnom primeru izvođenja ovog pronalaska, monoklonalna antitela obezbeđena su za diferencijaciju, dijagnostikovanje, identifikovanje rizika od razvijanja, i/ili tretiranje poremećaja povezanih sa α-sinukleinopatologijama, uključujući, ali ne ograničavajući se na, npr. Parkinsonovu bolest, demenciju sa Levi telima, varijantu Alchajmerove bolesti sa Levi telima, Alchajmerovu bolest, Daunov sindrom, multiple sistemsku atrofiju, psihozu, šizofreniju, Creutzfeldt-Jakob bolest i druge neurodegenerativne poremećaje.
[0029] Antitela i fragmenti ovog pronalaska obuhvataju definisane aminokiselinske sekvence CDR1-3 regiona na varijabilnim lakim (VL) i varijabilnim teškim (VH) lancima iz antitela sa visokim afinitetom ka rastvorljivim α-sinuklein protofibrilima koji sadrže "epitop PD i ili DLB bolesti." U specifičnim primerima izvođenja, CDR regioni su kombinovani sa modifikacijama Fc regiona kako bi se modulisale efektorske funkcije kao što su, ali bez ograničavanja, vezivanje Fc receptora, vezivanje komplementarnog faktora C1q, izvođenje polu-života, aktiviranje komplementa i zapaljenski procesi. Konstantan region antitela ima mnoge važne funkcije određenije vezivanje Fc-receptora i komplementnog faktora C1q. Poslednja funkcija može biti neaktivna kako bi se zaobišle zapaljenske reakcije.
[0030] Nova antitela i fragmenti sa visokim afinitetom ka α-sinuklein protofibrilima i niskim vezivanjem za α-sinuklein monomere imaju sledeće distinktivne prednosti u poređenju sa drugim poznatim modalitetima imunoterapeutskog lečenja:
1) Nova antitela i fragmenti ciljaju i inaktiviraju ili barem redukuju α-sinuklein protofibrile koji izazivaju bolest, npr. inhibiranjem oligomerizacije (videti Primer 10) ili drugim mehanizmima.
2) Visok afinitet ka α-sinuklein protofibrilima koji ispoljavaju nova antitela i fragmenti redukuje kliničku dozu potrebnu za efektivno lečenje.
3) Nova antitela i fragmenti obezbeđuju modalitet za tačno doziranje kod starijih pacijenata u poređenju sa strategijom aktivne imunuzacije, kao što je vakcina.
4) Nisko vezivanje sa α-sinuklein monomerima na periferiji/sistemski čime se obezbeđuje da je više antitela/fragmenata dostupno za vezivanje i eliminaciju α-sinuklein oligomernih oblika u mozgu. 5) Antitela i fragmenti redukuju rizik od zapaljenskih sporednih efekata, npr. meningioencefalitis, niskim ili bez vezivanja za komplementarni faktor C1q.
[0031] Jedan aspekat ovog pronalaska je otkriće aminokiselinskih sekvenci antitela CDR regiona koje igraju važnu ulogu u vezivanju humanih divljeg tipa i mutant α-sinuklein protofibrila. Antitela sa mestima vezivanja (CDR regioniMA) prema ovom pronalasku okarakterisana su visokim afinitetom ka divljeg tipa humanim α-sinuklein oligomerima/protofibrilima, za upotrebu kao terapeutska ili dijagnostiška sredstva.
[0032] Osnovna struktura imunoglobulinskog (IgG) molekula obuhvata dva identična laka lanca i dva identična teška lanca međusobno povezana disulfidnim mostovima. Laki lanac, koji je ili lambda ili kapa, ima varijabilni region (VL) i konstantan region (CL) od približno 110 aminokiselinskih ostataka svaki. Teški lanac ima varijabilni region (VH) od oko 110 aminokiselinskih ostataka, ali znatno veći konstantan region (CH) od 300-400 aminokiselinskih ostataka, koji obuhvata CHγ1, CHγ2 i CHγ3 regione ili domene.
[0033] Konstantan region (Fc) aktivira komplementni sistem i vezuje se za Fc receptore na makrofagama, mikroglijama i neutrofilima, koji uzimaju i uništavaju infektivne mikroorganizme ili strane/nesopstvene antigene. Ova funkcija je važna budući da je ona deo terapeutskog principa tog antitela, tj. Fc receptor posredovana mikroglijalna fagocitoza i klirens α-sinuklein protofibrila. Pokazan je klirens α-sinuklein oligomernih intermedijera preko putanje lizozomalnog raspadanja (Lee et al., 2004). Ovaj proces uključuje receptor-zavisne ili receptor-nezavisne endocitozne antitelo/protofibril komplekse, praćeno fuzijom sa lizozomima u kojima se α-sinuklein protofibrili raspadaju (Masliah et al., 2005). Receptori koji su predloženi za kontrolu ovog procesa uključuju Thy 1.1 receptor i lipoproteinski receptor-povezani protein (LPR).
[0034] Vrlo je verovatno da i drugi anti- α-sinuklein klirens mehanizmi funkcionišu dobro. Klirens rastvorljivih α-sinuklein protofibrila predstavlja centralni mehanizam tretiranja prema ovom pronalasku. α-sinuklein protofibrili smatraju se veoma neurotoksičnim, koji iniciraju i pogone proces bolesti. Klirens α-sinuklein protofibrila u mozgu ima značajnu kliničku vrednost. Pored klirensa α-sinuklein protofibrila, drugi α-sinuklein nagomilani oblici uključujući α-sinuklein fibrile, redukuju se indirektno putem uklanjanja prekursorskih oblika u α-sinuklein fibrile kao što su α-sinuklein protofibrili, dimeri, trimeri, tetrameri i viši oligomerni oblici. Različiti α-sinuklein oblici koji uključuju protofibrile i fibrile, su u ekvilibrijumu. Tretiranjem antitelom sa visokim afinitetom vezivanja za protofibrile i klirensom αsinuklein protofibrila od strane pomenutog antitela takođe će imati prednost da indirektno redukuje druge α-sinuklein nagomilane ili oligomerne oblike. Još jedan mehanizam aktivnosti antitela bio bi da blokiraju ili inhibiraju α-sinuklein toksičnost vezivanjem za toksične α-sinuklein vrste i sprečavaju njihove interakcije sa neuronima.
[0035] Respektivni varijabilni regioni teških i lakih lanaca sadrže tri hiper varijabilna regiona koji se nazivaju regioni koji određuju komplementarnost ili CDR-ovi. CDR regioni su kratka istegnuća od oko 7-23, npr.13-23, aminokiseline, smeštene u VL i VH regionima. Šest CDR regiona na jednom "kraku" tog antitela obrazuju "džep" koji vezuje antigen. Nekoliko definicija CDR-sekvenci koristi se u literaturi. SEQ ID NOS: 1-21 definišu nove CDR-sekvence primenom prvog identifikacionog sistema, a tako identifikovane CDR-sekvence prikazane su u VL i VH kod monoklonalnih antitela specifična za humani divlji tip i mutante α-sinuklein protofibrila u Tabeli 1 (videti Primer 2) pomoću podvučenih regiona. SEQ ID NOS: 22-55 identifikuju nove CDR-sekvence primenom poznatog Kabat sistema, a tako identifikovane Kabat CDR-sekvence prikazane su u VL i VH u antitelima specifičnim za humani divlji tip i mutant αsinuklein protofibrile u Tabeli 2 (videti Primer 2) pomoću podvučenih regiona. Identifikacije novih CDR-sekvenci prema Kabat-u (SEQ ID NOS: 22-55) koriste se u ovom opisu.
[0036] Na taj način, antitelo prema ovom pronalasku okarakterisano je time što ima šest CDR sekvenci (VH-CDR-1, VH-CDR-2, VH-CDR-3, VL-CDR-1, VL-CDR-2, i VL-CDR-3) odabrane iz svake od sledećih grupa CDR sekvenci u kombinacijama koje su prethodno specificirane.
VH CDR-1
GFTFNTYAM SEQ ID NO: 1 GFTFNTYAMN SEQ ID NO: 22 GFTFSNYAM SEQ ID NO: 2 GFTFSNYAMS SEQ ID NO: 23 GFTFSSYAM SEQ ID NO: 3 GFTFSSYAMS SEQ ID NO: 24 GDSFTSGYW SEQ ID NO: 4 GDSFTSGYWN SEQ ID NO: 25
GFSLTSYGVH SEQ ID NO: 26 GFTFTDYYMS SEQ ID NO: 27
VH CDR-2
RIRTKSNDYATYYADSVKG SEQ ID NO: 5
RIRTKSNDYATYYADSV SEQ ID NO: 28
TVTSGGSYTYYPDSVRG SEQ ID NO: 6
TVTSGGSYTYYPDSV SEQ ID NO: 29
TISNGGSYTYYPDSVKG SEQ ID NO: 7
TISNGGSYTYYPDSV SEQ ID NO: 30
YIRYSGNTYYNPSLKS SEQ ID NO: 8
YIRYSGNTYYNPSL SEQ ID NO: 31
VIWRGGSTDYSAAF SEQ ID NO: 32
TISTGGSYTYYPDSV SEQ ID NO: 33
FIRNKANGYTTEYSASV SEQ ID NO: 34
VH CDR-3
VGYRPYAMDY SEQ ID NO: 9 (SEQ ID NO: 35) QNFGSRGWYFDV SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 36) HSDYSGAWFAY SEQ ID NO: 11 (SEQ ID NO: 37) SYYDYDRAWFAY SEQ ID NO: 12 (SEQ ID NO: 38) LLRSVGGFAD SEQ ID NO: 39
DYGNYAMDY SEQ ID NO: 40
VL CDR-1
RSSQNIVHSNGNTYLE SEQ ID NO: 13 (SEQ ID NO: 41) RSSQSIVNSNGNTYLE SEQ ID NO: 14 (SEQ ID NO: 42) SASSSVSYMY SEQ ID NO: 15 (SEQ ID NO: 43) RSSQSLVHSNGNTYLH SEQ ID NO: 16 (SEQ ID NO: 44) RSSQTIVHNNGNTYLE SEQ ID NO: 45 KSSQSLLYSSNQKNYLA SEQ ID NO: 46
VL CDR-2
KVSNRFS SEQ ID NO: 17 (SEQ ID NO: 47)
RTSNLAS SEQ ID NO: 18 (SEQ ID NO: 48)
WASTRES SEQ ID NO: 49
VL CDR-3
FQGSHVPLT SEQ ID NO: 19 (SEQ ID NO: 50)
QQYHSYPYT SEQ ID NO: 20 (SEQ ID NO: 51)
SQSTHVPWT SEQ ID NO: 21 (SEQ ID NO: 52)
FQGSHVPFT SEQ ID NO: 53
QQFHSYPYT SEQ ID NO: 54
QQYYSYPYT SEQ ID NO: 55
[0037] Jedno od antitela koje je inicijalno odabrano zbog određenih interesantnih karakteristika odbačeno je jer nije u potpunosti zadovoljilo kriterijume definisane ovim pronalaskom. Značajan parametar za njegovo odacivanje bio je komparativno kratka VH CDR-3 sekvenca sa pet aminokiselina izloženih ovim antitelom. Prema tome, zaključuje se da VH CDR-3 sekvenca mora biti veća od 5 aminokiselina. U specifičnim primerima izvođenja, VH CDR-3 sekvenca je 9, 10, 11 ili 12 aminokiselina.
[0038] Kako je prethodno navedeno, α-sinuklein protofibril vezujuća antitela i fragmenti prema ovom pronalasku okarakterisani su visokim afinitetom ka cilju. Visok afinitet, izražen kao konstanta disocijacije Kd, manji je od 10<-7>M. U daljim primerima izvođenja, konstanta disocijacije Kdza humane α-sinuklein protofibrile manja je od 10<-8>M, manja od 10<-9>M, manja od 10<-10>M, ili čak manja od 10<-11>M. Ova antitela i fragmenti prednjače time što se mogu davati pri nižim dozama u odnosu na antitela sa afinitetima oko 10<-6>M ili višim. Ovo poseduje značajnu kliničku prednost budući da se ovakav visok afinitet antitela, koja se daju injektiranjem, mogu dati subkutano budući da je samo mala količina tog antitela potrebna da se postigne efikasnost. Modaliteti davanja nisu ograničeni na subkutane i intravenozne injekcije. Dodatno, niže doze potrebne za efikasnost redukovaće cenu robe za proizvodnju tog antitela.
[0039] Pored visokog afiniteta antitela ka α-sinuklein protofibrilima, ova antitela i fragmenti pokazuju nisko vezivanje sa α-sinuklein monomerima, i opciono nisko vezivanje sa α-sinuklein fibrilima. Kako je prethodno navedeno, nisko vezivanje sa α-sinuklein monomerima znači da je vezivanje antitela ili fragmenta prema ovom pronalasku sa α-sinuklein monomerima najmanje 100 puta manje od onog sa αsinuklein protofibrilima. U specifičnijim primerima izvođenja, vezivanje antitela ili fragmenta prema ovom pronalasku sa α-sinuklein protofibrilima je više od 500 puta ili čak više od 1000 puta veće od onog sa α-sinuklein monomerima.
[0040] U još jednom primeru izvođenja, ova antitela i fragmenti pokazuju nisko vezivanje sa α-sinuklein fibrilima. U specifičnijim primerima izvođenja, vezivanje antitela ili fragmenta prema ovom pronalasku sa α-sinuklein protofibrilima je više od 100 puta, više od 500 puta, ili čak više od 1000 puta veće od onog sa α-sinuklein fibrilima.
[0041] U još daljem primeru izvođenja ovog pronalaska, antitela i fragmenti pokazuju nisko vezivanje sa beta amiloid (Aβ) protofibrilima (npr. Kd>10<-5>M) i beta amiloid monomerima (npr. Kd>10<-5>M).
[0042] U još daljem primeru izvođenja ovog pronalaska, antitela i fragmenti pokazuju nisko vezivanje sa β-sinuklein monomerom, γ-sinuklein monomerom, IAPP (ostrvca amiloidnog polipeptida), i/ili Medin polipeptidom, npr. vezivanje antitela i fragmenata je najmanje 100 puta manje sa jednim ili više ovih peptida/proteina od onog onog sa humanim α-sinuklein protofibrilima.
[0043] Prema još jednom primeru izvođenja ovog pronalaska, antitelo ili fragment prema ovom pronalasku može se definisati vezivanjem u model sistemu za linearni epitop u α-sinukleinu unutar aminokiselinskog (aa) regiona 113-140, npr. aa region 113-131, sa aa 125-131, 121-124, 121-127, 121-131, 113-123 i 136-140 kao primeri specifičnih epitopa. U ovom model sistemu, koriste se 15-mer αsinuklein peptidi sa preklapanjem od 11 aminokiselinskih sekvenci (videti Primer 3 ispod).
[0044] Prema dodatnom primeru izvođenja ovog pronalaska, obezbeđeno je antitelo ili fragment, sa visokim afinitetom ka humanim α-sinuklein protofibrilima i niskim vezivanjem α-sinuklein monomera, a koje obuhvata CDR sekvencionu kombinaciju odabranu iz sledećih kombinacija:
(a) VH CDR-1: SEQ ID NO: 22, VH CDR-2: SEQ ID NO: 28, VH CDR-3: SEQ ID NO: 35, VL CDR-1: SEQ ID NO: 41, VL CDR-2: SEQ ID NO: 47 i VL CDR-3: SEQ ID NO: 50,
(b) VH CDR-1: SEQ ID NO: 23, VH CDR-2: SEQ ID NO: 29, VH CDR-3: SEQ ID NO: 36, VL CDR-1: SEQ ID NO: 42, VL CDR-2: SEQ ID NO: 47 i VL CDR-3: SEQ ID NO: 50,
(c) VH CDR-1: SEQ ID NO: 24, VH CDR-2: SEQ ID NO: 30, VH CDR-3: SEQ ID NO: 37, VL CDR-1: SEQ ID NO: 43, VL CDR-2: SEQ ID NO: 48 i VL CDR-3: SEQ ID NO: 51,
(d) VH CDR-1: SEQ ID NO: 25, VH CDR-2: SEQ ID NO: 31, VH CDR-3: SEQ ID NO: 38, VL CDR-1: SEQ ID NO: 44, VL CDR-2: SEQ ID NO: 47 i VL CDR-3: SEQ ID NO: 52,
(e) VH CDR-1: SEQ ID NO: 26, VH CDR-2: SEQ ID NO: 32, VH CDR-3: SEQ ID NO: 39, VL CDR-1: SEQ ID NO: 45, VL CDR-2: SEQ ID NO: 47 i VL CDR-3: SEQ ID NO: 53,
(f) VH CDR-1: SEQ ID NO: 23, VH CDR-2: SEQ ID NO: 33, VH CDR-3: SEQ ID NO: 37, VL CDR-1: SEQ ID NO: 43, VL CDR-2: SEQ ID NO: 48 i VL CDR-3: SEQ ID NO: 54, i
(g) VH CDR-1: SEQ ID NO: 27, VH CDR-2: SEQ ID NO: 34, VH CDR-3: SEQ ID NO: 40, VL CDR-1: SEQ ID NO: 46, VL CDR-2: SEQ ID NO: 49 i VL CDR-3: SEQ ID NO: 55.
[0045] Antitelo ili fragment vezuje se za epitop unutar aminokiselinskog (aa) regiona 113-140, npr. aa region 113-131, a određenije epitopi aa 125-131, 121-124, 121-127, 121-131, 113-123 ili 136-140, imobilizovanog linearnog α-sinukleina u model sistemu koji obuhvata 15-mer α-sinuklein peptide sa preklapanjem od 11 aminokiselina.
[0046] Prema još jednom specifičnom primeru izvođenja ovog pronalaska, visok afinitet α-sinuklein protofibril vezivajućih antitela može redukovati ili inhibirati α-sinuklein agregacijom, čime se redukuju nivoi rastvorljivih oligomernih α-sinuklein oblika u mozgu.
[0047] Prema još jednom specifičnom primeru izvođenja ovog pronalaska, visok afinitet α-sinuklein protofibril vezivajućih antitela može vezati α-sinuklein oligomere/protofibrile izvan CNS, čime se pomera ekvilibrijum pomenutih α-sinuklein oblika preko krvno moždane barijere na takav način da snižava CNS nivoe pomenutih α-sinuklein oblika (drenaža).
[0048] Prema još jednom specifičnom primeru izvođenja ovog pronalaska, antitela su IgG klase, pogodna za terapeutsku upotrebu koja mogu da prođu krvno moždanu barijeru. Visok afinitet αsinuklein protofibril vezujućih IgG antitela može se konstruisati radi redukovanja komplementnog faktora C1q koji se vezuje sa CH2 domenom od IgG1 i redukovanja komplementne aktivacije i rizika od zapaljenja. Ova modifikacija može se izvesti na nekoliko različitih načina. Jedan način je da se izvede himerno antitelo u kojem je CHγ2 domen IgG1 konstantnog regiona obrisan i zamenjen za odgovarajući domen iz IgG4 ili deo domena koji potvrđuje C1q vezivanje. Dobro je utvrđeno da IgG4 ne vezuje C1q i tako ne aktivira komplementnu kaskadu. Kako bi se to postiglo, konstantan region teškog lanca (CH) konstruiše se tako da kombinuje visok afinitet Fc-receptor domena (CHγ3) na IgG1 sa IgG4 domenom (CHγ2) koji vezuje komplementni faktor C1q. Ovo novo antitelo koje sadrži himerni konstantan teški lanac (IgG1:CHγ1, CHγ2:IgG4, CHγ3:IgG1) poseduje značajne osobine i efikasnog klirensa α-sinuklein protofibrila putem Fc-receptor posredovane fagocitoze i redukovan rizik od sporednih efekata, tj., zapaljenja kao što je meningioencefalitis.
[0049] Još jedan način redukovanja rizika od zapaljenja jeste da se izmeni oligosaharidna struktura tog antitela što će redukovati vezivanje komplementnog faktora C1q i komplementnu aktivaciju. Opisano je trideset različitih struktura kompleksnih biantenarnih oligosaharida na Asn-297 u humanom IgG1. Odsustvo CH2 povezanih ugljenih hidrata smatra se da izaziva konformacionu promenu u regionu "zakrivljenja" tog antitela, redukujući interakcione efikasnosti sa efektorskim molekulima i gubitak komplementne aktivacione funckije i C1q vezivanja.
[0050] Modifikacija humanog antitela sa visokim afinitetom vezivanja ka α-sinuklein protofibrilima, putem na mestu usmerene mutageneze Asn-297 u bilo koju drugu aminokiselinu, generiše antitelo zadržanog Fc-receptorskog vezivanja sa manje C1q vezivanja i tako redukovati rizik od zapaljenja, određenije u krvno moždanoj barijeri. Alternativa za modifikovanje glikolizacije na antitelu je eksprimiranje antitela u ćelijskoj vrsti u kojoj je enzimska N-acteilglukozaminil-transferaza I inaktivirana. To će dati antitelo sa izmenjenom ugljenohidratnom strukturom na Asn-297. Obrazuje se struktura Man5GlcNAc2, ali se ne ograničava na tu strukturu. Ova ugljenohidratna modifikacija redukovaće vezivanje komplementnog faktora C1q i inhibirati zapaljenje (Wright et al.1998). Alternativno, aglikozilirana protofibril vezujuća antitela mogu se postići uzgajanjem ćelija koje eksprimiraju antitela u prisustvu tunikamicina, koji inhibira glikozilaciju. Ova antitela imaće izmenjenu komplementnu aktivirajuću aktivnost kao i izmenjenu Fc-receptor funkciju (Leatherbarrow et al.1985). Skrining klonova koji eksprimiraju antitela sa niskom komplementnom aktivacijom i visokim Fc-receptor vezivanjem, generisaće protofibril vezivajuća antitela koja pokazuju visok Fc-posredovan klirens α-sinuklein protofibrila i nisko C1q vezivanje.
[0051] U još jednom primeru izvođenja, antitelo sa visokim afinitetom vezivanja ka humanom αsinuklein protofibrilu je IgG podklase, npr. IgG1 ili IgG4, gde je mesto vezivanja komplementnog faktora C1q modifikovano, tj. Pro331>Ser331 (Xu et al.1994), tako da redukuje ili inhibira vezivanje komplementnog faktora C1q. Takva antitela su naročito pogodna za davanje, tj., za tretiranje, prevenciju ili odlaganje početka neurodegenerativnog poremećaja sa α-sinuklein patologijom, kod pojedinca sa takvim poremećajem ili u riziku od razvoja takvog poremećaja, na primer, ali ne ograničavajući se na, pojedinca koji ima ili je u riziku od razvoja PD. Prolinski ostatak na položaju 331 u humanom IgG1 takođe se može promeniti u treonin ili glicin ili neku drugu polarnu aminokiselinu. Ova modifikacija se može postići standardnim molekularno biološkim tehnikama kao što su na mestu usmerena mutageneza ili DNK delecije.
[0052] Još jedan aspekt ovog pronalaska je upotreba antitela sa visokim afinitetom vezivanja ka humanom α-sinuklein protofibrilu kako bi se specifično odredili protofibril nivoi u ljudskom ili životinjskom tkivu, na primer, u cerebrospinalnoj tečnosti (CSF), krvi, urinu, pljuvački, ili moždanom tkivu, kao dijagnostički instrument ili biomarker, ili za praćenje, neurodegenerativnog poremećaja sa αsinuklein patologijom. Parkinsonova bolest (PD), demencija sa Levi telima (DLB), varijanta Alchajmerove bolesti sa Levi telima, multiple sistemska atrofija, psihoza, šizofrenija, i Creutzfeldt-Jakob bolest predstavljaju primere samo za neurodegenerativne poremećaje sa α-sinuklein patologijom. Na primer, nivoi humanih α-sinuklein protofibrila u CSF ili krvi PD pacijenta verovatno se razlikuju u odnosu na odgovarajuću stariju kontrolnu grupu koja nema Parkinsonovu bolest ili bilo koju drugu αsinukleinopatiju. Osoba kod koje se razvija Parkinsonova bolest ili neka druga α-sinukleinopatija verovatno ima izmenjene nivoe α-sinuklein protofibrilnih nivoa u CSF ili krvi u poređenju sa kontrolnim subjektima. Tako, određivanje nivoa α-sinuklein protofibrila u CSF ili krvi može obezbediti rano dijagnostikovanje bolesti. Ovo se može postići sa novim antitelom sa visokim afinitetom vezivanja za αsinuklein protofibrile, prema ovom pronalasku i, u specifičnom primeru izvođenja, može se postići u kombinaciji sa sendvič ELISA postupkom (videti Primer 5), u kojem su α-sinuklein protofibrili određeni do nivoa od 9 pM. Mešanje drugih α-sinuklein oblika, naročito α-sinuklein monomera, i opciono α-sinuklein fibrila i α-sinuklein fragmenata, u ogledu, je zanemarljivo.
[0053] Primeri pogodnih postupaka za određivanje α-sinuklein protofibrila u ovim tkivima kao i u ćelijskim kulturama upotrebom anti-α-sinuklein protofibril antitela obuhvata imunooglede kao što su ELISA, RIA, Western blot analizu ili tačkastu blot analizu. Ovi postupci su pogodni za praćenje efikasnosti lečenja budući da se mere protofibril redukcijom u kliničkim ispitivanjima i/ili kao dijagnostički test. Kako su nivoi α-sinuklein protofibrila veoma nisku u CSF i krvi, antitelo prema ovom pronalasku sa visokim afinitetom vezivanja prema α-sinuklein protofibrilu je poželjno za dijagnostički test, na primer, na osnovu ELISA postupka, kako bi se omogućilo merenje niskih nivoa α-sinuklein protofibrila.
[0054] Prema ovakvim postupcima, antitelo ili fragment prema ovom pronalasku dodaju se biološkom uzorku koji obuhvata ili se sumnja da obuhvata α-sinuklein protofibrile, i detektuje se prisustvo kompleksa formiranog između α-sinuklein protofibrila i antitela ili fragmenta. Taj kompleks može biti detektovan kvalitativno, tj., detektuje se prisustvo kompleksa, ili kvantitativno, tj., ukoliko je poželjno može se detektiovati koncentracija kompleksa ili prag koncentracije kompleksa.
[0055] U daljim primerima izvođenja, ovaj pronalazak uključuje upotrebu specifičnih antitela ili fragmenata sa visokim afinitetom prema protofibrilima u snimanju radi detekcije, lokalizacije i kvantifikacije α-sinuklein protofibrila u ljudskim i životinjskim tkivima. Ovo antitelo ili fragment mogu biti obeleženi detektabilnom oznakom, na primer, radioaktivnim veznikom kao što je I<131>, C<14>, H<3>ili Galijum<68>, ali ne ograničavajući se na ove radioizotope, i dovedeni u kontakt sa uzorkom ili primenjeni u svrhe detektovanja. Takvi postupci pogodni su kao dijagnostički instrument za neurodegenerativne poremećaje sa α-sinuklein patologijom, uključujući, ali ne ograničavajući se na, Parkinsonovu bolest, demenciju sa Levi telima i druge α-sinuklein povezane neurodegenerativne poremećaje. Takvi postupci mogu se sprovesti radi praćenja razvoja α-sinuklein povezane bolesti kod nekog subjekta bez ili pod terapijom ili nekim drugim mogućim tretmanom.
[0056] Tako, u jednom aspektu ovog pronalaska antitela su dodata biološkom uzorku koji obuhvata ili se sumnja da obuhvata α-sinuklein protofibrile, pri čemu se koncentracija kompleksa formiranog između pomenutog protofibrila i pomenutog antitela meri radi detektovanja i/ili kvantifikacije protofibrila u uzorku. U specifičnim primerima izvođenja, detekcioni postupci uključuju imunoogled i ogled blizine vezivanja. Biološki uzorak može biti in vitro uzorak uzet od subjekta. Alternativno, detekcioni postupak može se izvesti primenom in vivo zapremine tečnosti.
[0057] Još jedan aspekt ovog pronalaska je da se pripreme vrste antitela specifične za upotrebu u veterinarskoj medicini. Prethodno navedeni dijagnostički postupci takođe su pogodni za veterinarsku upotrebu.
[0058] Još jedan aspekt ovog pronalaska je humanizacija pomenutih antitela kako bi se zaobišli sporedni efekti, tj. kako bi se zaobišao imunoodgovor protiv antitela kod ljudi kada se koriste kao terapeutski ili dijagnostički agens. Takve tehnike humanizovanja su okviru sposobnosti stručnjaka iz ove oblasti.
[0059] Farmaceutske kompozicije prema ovom pronalasku obuhvataju antitelo ili fragment kakvi su ovde opisani, i farmaceutski prihvatljiv nosač. U specifičnom primeru izvođenja za terapeutsku upotrebu, kompozicije su fiziološki prihvatljive formulacije koje obuhvataju terapeutski aktivnu količinu antitela ili fragmenta prema ovom pronalasku u fiziološkom puferu, na primer, bez ograničavanja, PBS, pogodan za davanje ljudima i/ili životinjama. Antitelo ili fragment mogu se liofilizovati radi bolje stabilnosti. Ova liofilizovana formulacija može da sadrži bilo koji pogodan konvencionalni ekscipijens, uključujući stabilizatore, lioprotektante, pufere, i slično, kao što su, ali bez ograničavanja, manitol, za zaštitu i/ili stabilizovanje proizvoda tokom i/ili nakon liofilizovanja i/ili naknadnog skladištenja.
[0060] Opciono, formulacija antitela može da sadrži antibakterijski agens ili druge prezervative ili aditiv koji se ne meša sa funkcijom ili efikasnostšću protofibril vezujućeg antitela ili fragmenta.
PRIMERI
[0061] Sledeći primeri su obezbeđeni u svrhe ilustrovanja i nisu namenjeni da ograniče pronalazak na ove specifične primere.
Primer 1
α-sinuklein protofibril antitela
Imunizacija/Poliklonalna antitela
[0062] U imunizacionoj šemi, korišćeni su Balb/C miševi. Kao antigen, korišćeni su HNE stabilizovani αsinuklein protofibrili. Onu su proizvedeni kako je prethodno opisano (WO 2009/133521), sa sledećim izuzetkom: korišćen je odnos od 60:1 između HNE i α-sinukleina. Za imunizaciju, miševima su injektovani HNE stabilizovani α-sinuklein protofibrili i adjuvans (npr.3-6 puta). Jedna dopunska injekcija koja sadrži HNE-modifikovane α-sinuklein protofibrile izvedena je pre nego što su miševi žrtvovani. Krv iz imunizovanih miševa analizirana je na reaktivnost prema α-sinuklein protofibrilima i α-sinuklein monomerima. Specifičnost odgovora poliklonalnog antitela analizirana je upotrebom direktne ELISA. U tipičnom eksperimentu, visoko vezujuća polistirenska mikrotitarska ploča ravnog dna sa 96-bazenčića obložena je monomernim α-sinukleinom (nemodifikovan ili modifikovan sa HNE ili drugim aldehidima), protofibrilima/oligomernim α-sinukleinom (nemodifikovan ili modifikovan sa HNE ili drugim aldehidima) ili fibrilarnim α-sinukleinom, pri finalnoj koncentraciji od 400 ng/bazenčić. Bazenčići su blokirani sa 2% BSA, oprani 0.05% Tween-20/ PBS, a supernatanti ćelijskog medijuma (nerazblaženi ili razblaženi 1:1 sa fosfat-puferovanim slanim rastvorom) iz ispitanih poliklonalnih antitela dodati su bazenčićima kao primarna antitela. Alkalnom fosfatazom-konjugovano kozije anti-mišje mišje IgG/IgM antitelo (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) korišćeno je kao sekundarno antitelo pri razblaženju od 1/1000.
Imunoreaktivnost je vizualizovana primenom p-nitrofenil-fosfata (Sigma-Aldrich, MO, USA).
[0063] U serumu, detektovana su antitela koja specifično prepoznaju α-sinuklein protofibrile/oligomere. Pored toga, antitela koja prepoznaju α-sinuklein monomere mogu se pronaći. Negativna kontrola predstavlja neimunozovanog miša.
Hibridom/monoklonalna antitela
[0064] Mišji B-ćelijski hibridomi korišćeni su za proizvodnju monoklonalnih α-sinuklein protofibril vezujućih antitela. Ćelije slezine izolovane su i pohranjene u sterilni fosfat-puferovani slani rastvor (PBS) i centrifugovane pri 1200xg tokom 10 min kako bi se sakupio pelet bogat ćelijama. Ćelije su dalje oprane PBS i centrifugovane pri 1200xg tokom 10 min. Ćelijski pelet je resuspendovan u Dulbecco-ovom minimalnom esencijalnom medijumu (DMEM, Invitrogen, La Jolla, CA, USA) obogaćen sa 1% antibiotika.
Ćelije slezine umešane su u odnosu 1:1 sa Sp2/0 ćelijama (čelijska linija mišjeg mijeloma) u DMEM. Kako bi se olakšala ćelijska fuzija, 1 ml polietilen glikola (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) dodato je u ćelijsku mešavinu, a reakcija je zaustavljena dodavanjem DMEM-a. Ćelije su sakupljene, a peleti resuspendovani u DMEM obogaćenom sa 10% (v/v) fetalnim goveđim serumom (Cambrex, Charles City, IA, USA) a koji takođe sadrži 1% (v/v) natrijum piruvat (Cambrex, Charles City, IA, USA), 1% (v/v) antibiotika (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) i 1% (v/v) L-glutamina (Cambrex, Charles City, IA, USA), 5% (v/v) BM kondicionog medijuma (Roche Diagnostics Scandinavia, Bromma, Sweden) i 2% (v/v) HAT medijumskog suplementa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Ćelije su smeštene u ploče za ćelijsko kultivisanje sa 96 bazenčića i ostavljene da miruju i rastu tokom 2 nedelje.
[0065] Hibridom ćelijski supernatatni analizirani su u direktnoj ELISA. U tipičnom eksperimentu, polistirenska mikrotitarska ploča velikog vezivanja sa ravnim dnom i 96 bazenčića obložena je monomernim α-sinukleinom (nemodifikovan ili modifikovan sa HNE ili drugim aldehidima), oligomernim/protofibrilarnim α-sinukleinom (nemodifikovan ili modifikovan sa HNE ili drugim aldehidima) ili fibrilarnim α-sinukleinom. Bazenčići su blokirani sa 1% BSA, oprani PBS-Tween 20 (0.05%), a supernatanti ćelijskog medijuma (nerazblaženi ili razblaženi 1:2 ili 1:5 sa PBS-Tween 20 (0.05%)) iz ispitanog hibridoma dodati su u bazenčiće kao primarna antitela. Peroksidazom rena-konjugovano HRP-kuplovano kozije anti mišje Ig (Southern Biotechnology, proizvod Br.1010-05) korišćeno je kao sekundarno antitelo pri razblaženju od 1/5000. Imunoreaktivnost je vizualizovana primenom K-Plavo vodenog TMB supstrata (Neogen Corp. Proizvod Br.331177).
Primer 2
Aminokiselinska sekvenca varijabilnih regiona teškog lanca (VH) i lakog lanca (VL/Vkapa) monoklonalnih antitela specifičnih za α-sinuklein protofibrile
[0066] Aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona teškog lanca (VH) i lakog lanca (VL), uključujući CDR regione antitela, određene su RT PCR mRNK uzorkom, praćeno DNK sekvencionisanjem.
Aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i varijabilnog regiona lakog lanca (VL) za odabrana antitela prikazane su u Tabeli 1. Prikazani su i podvučeni položaji CDR regiona 1-3.
Aminokiselinske sekvence CDR regiona obrazuju strukturalnu bazu za vezivanje humanog divljeg tipa i mutanta α-sinuklein protofibrila koji konstituišu "patogeni epitop" α-sinuklein protofibrila.
[0067] Aminokiselinske sekvence CDR regiona 1-3 respektivnih VL i VH lanaca za protofibril specifična antitela prema ovom pronalasku prikazane su u Tabeli 1. U Tabeli 2 uključene su CDR-sekvence serija dodatnih antitela prema ovom pronalasku.
[0068] Kombinovane aminokiselinske sekvence CDR1-3 regiona VH i VL lanaca stvaraju molekulski "džep" koje vezuje humani α-sinuklein divlji tip protofibrila sa visokim afinitetom i specifičnošću. Ovaj "džep" formira strukturalnu bazu "PD/DLB epitopa". Varijacije u dužini CDR aminokiselinske sekvence primećene su i kod VH lanca i kod VL lanca i kompatibilne su sa vezivanjem za humane α-sinuklein protofibrile. Kraći CDR region obezbeđuje ograničeniju trodimenzionalnu strukturu vezujućeg džepa tog antitela, dok je duži CDR region fleksibilniji.
[0069] CDR sekvence kakve su prikazane u Tabelama 1 i 2 predstavljaju primere izvođenja ovog pronalaska, budući da su one aminokiselinske sekvence u regionima "mišjeg okvira" VH i VL lanaca, tj., izvan CDR regiona, kao i regionima VL i VH humanog okvira za protofibril specifična antitela kao, bez ograničavanja, takva.
[0070] Druge aminokiselinske supstitucije u CDR regionima pored onih prikazanih u Tabelama 1 i 2 su kompatibilne sa vezivanjem sa visokim afinitetom i visokom specifičnošću sa humanim α-sinuklein protofibrilima. Tamo gde je prisutna polarna aminokiselina u određenom položaju u CDR regionu u kojem ta određena aminokiselina može biti supstituisana nekom drugom polarnom aminokiselinom, sa zadržanim ili poboljšanim vezivanjem sa visokim afinitetom i specifičnošću sa α-sinuklein protofibrilima. Isto tako, ukoliko je nepolarna ili negativno ili pozitivno naelektrisana aminokiselina prisutna u određenom položaju, ta aminokiselina može biti supstituisana sličnom aminokiselinom iz grupe iste polarnosti.
[0071] Kako određena aminokiselina ili aminokiseline mogu menjati bilo koji položaj u CDR regionima sa funkcionalnim ekvivalentima koji dodeljuju suštinski istu funckiju i strukturu antitelu u pogledu afiniteta ka α-sinuklein protofibrilima, takvi konstrukti su naravno unutar obima ovog proalaska. U tom smislu, antitela i fragmenti koji imaju više od 70, 80, 90, 95 ili 98% sličnosti sa jednom od prethodno navedenih VH CDR i VL CDR sekvenci respektivnih grupa, sa održanim vezivanjem epitopa kako je ovde opisano, nalaze se unutar obima ovog pronalska.
Tabela 1. Aminokiselinska sekvenca varijabilnih regiona teškog lanca (VH) i lakog lanca (VL/Vkapa) iz četiri različita monoklonalna antitela specifična za humani divlji tip i mutant α-sinuklein protofibrile.
Položaji raznih CDR regiona (1-3) podvučeni su u VL i VH. Antitela BA1-BA4 su primeri specifičnih antitela prema ovom pronalasku sa visokim afinitetom prema protofibrilima.
Primer 3
Epitop mapiranje α-sinuklein protofibril specifičnih mnoklonalnih antitela
[0072] Epitop mapiranja antitela izvedena su imunoblot analizom na PepSpots membrani. Sintetički peptidi koji obuhvataju celu sekvencu (aminokiseline 1-140) humanog α-sinukleina sintetizovani su po meri od strane JPT Peptide Technologies (podružnica od Sigma Aldrich, UK) i imobilizovani na PepSpots membrani. 33 sintetizovana 15-mer peptida konstruisano je sa preklopom 11 aminokiselinskih sekvenci. Peptidi su kovalentno vezani za Whatman 50 celuloznu membranu (Whatman, England) C-terminusom i imaju obično acetilovani N-terminus zbog veće stabilnosti na raspadanje. Nenaelektrisana N-ac bolje predstavlja region u nativnom antigenu od naelektrisane NH3+-grupe. Rezultati su navedeni u Tabeli 3.
Tabela 3:
Humani α-sinuklein (SEQ ID NO: 80)
[0073]
[0074] Alternativno, epitop mapiranja antitela izvedena su imunoblot analizom na PepSpots membrani (Sigma Aldrich) kako sledi: Sintetički peptidi koji obuhvataju C-terminalnu sekvencu humanog αsinukleina iz aminokiseline 100 do 140 sintetizovani su po meri i imobilizovani na PepSpots membrani (Sigma Aldrich).30 sintetizovana 10-mer peptida konstruisano je sa preklopom 9 aminokiselina.
Rezultati su prikazani u Tabeli 4.
Tabela 4:
[0075] Shodno tome, dužina i precizan položaj epitopa zavisi od postupka upotrebljenog za određivanje.
Primer 4
Karakterizacija monoklonalnih antitela visokog afiniteta prema humanim α-sinuklein protofibrilima upotrebom kompeticione ELISA
[0076] Ovaj primer prikazuje četiri antitela (mAb49/G, mAb38E2/7, mAb38F11/2_8 i mAb48B11/8). Ova antitela pokazuju visok afinitet prema α-sinuklein protofibrilima i nisko unakrsno reagovanje (vezivanje) sa α-sinuklein monomerima, kako je mereno kompeticionim ELISA ogledom kako je opisano u nastavku. Ukratko, anti-α-sinuklein antitelo koje se testira ostavljeno je da reaguje u rastvoru sa α-sinuklein monomerima ili protofibrilima, a zatim je ta mešavina dodata u mikrotitarsku ploču koja je prethodno obložena sa α-sinuklein protofibrilima. Ukoliko se antitelo vezuje za antigen u pre-inkubacionoj fazi, manje antitela će se vezati za imobilizovani antigen na mikrotitarskoj ploči. Antitelo vezano za imobilizovani antigen detektuje se sekundarnim antitelom konjugovanim enzimina alkalnih fosfata (ALP). Konjugat je inkubisan sa ALP supstratom (pNPP) generišući žutu boju koja se može detektovati u čitaču mikrotitarskih ploča na 405 nm. Shodno tome, niska OD vrednost ukazuje na visok afinitet tog antitela ka antigenu u rastvoru.
[0077] Specifično, visoko-vezujuća ELISA mikrotitarska ploča obložena je sa 100 µl/bazenčić 1 µg/ml αsinuklein protofibrila, razblaženi u 1xPBS, zaptivena lepljivim zaptivačem i inkubisana preko noći na 4°C. Zatim, oblagajući rastvor je odbačen, a preostali kapacitet vezivanja ploče je blokiran dodavanjem 200 µl/bazenčić PBS-Tween 20 (0.05%). Zaptivena ploča inkubisana je tokom 60 min na sobnoj temperaturi (R.T.) protresanjem na 900 o/min.
[0078] Za to vreme, pripremljen je peptidni rastvor u 1x PBS-Tween 20 (0.05%) razblaživanjem αsinuklein monomera ili protofibrila do koncentracije od 140 nM.10-fazne serije 3x razređenja αsinuklein monomera i protofibrila izvedene su u zapremini od 50 µl u mikrototraskoj ploči ravnog dna sa niskim vezivanjem proteina. U ovaj rastvor, dodato je 50 µl testiranog antitela razblaženog u PBS-Tween 20 (0.05%) pri koncentraciji od 100 ng/ml i ostavljeno je da reaguje 60 min na R.T. protresanjem na 900 o/min. Naknadno, ovi prethodno inkubisani uzorci dodati su u opranu (3x pranja) obloženu visoko vezujuću ploču i ostavljeni da se inkubišu tokom 15 min na R.T. bez protresanja. ELISA ploča je zatim oprana kako bi se uklonila nevezana antitela. Vezana antitela detektovana su sa 100 µl ALP-kuplovano anti-mišje-IgG (Mabtech, Sweden 3310-4) u razblaženom 1/1000 u PBS-Tween 20 (0.05%) inkubisano tokom 60 min na R.T. protresanjem pri 900 o/min.
[0079] Konačno, ELISA ploča oprana je kako bi se uklonila nevezana antitela i 100 µl ALP-supstrata dodato je u svaki bazenčić. Ploča je održavana u mraku tokom inkubacije na R.T. dok nije razvijena žuta boja. Vrednosti apsorbancije izmerene su na kontinulani način pri talasnim dužinama od 405 nm svakih 15 minuta do 120 minuta. Merenja su korišćena za IC50 determinacije samo ukoliko je postajala linearnost između vremena i apsorbancije.
[0080] IC50 vrednosti izračunate su kao koncentracija ili monomera ili protofibrila potrebnih za gašenje pola signala u ELISA. Koncentracija ili α-sinuklein monomera ili protofibrila koja je korišćena u ovom postupku određena je upotrebom UV-SEC, primenom komercijalnog α-sinuklein standarda kao reference (kat. S-1001-1, rPeptide, USA, 0.5 mg kako je određeno sa BCA). Fig.1 prikazuje apsorbanciju na 450 nm za četiri protofibril specifična monoklonalna antitela kako je određeno upotrebom opisane kompeticione ELISA. Ogled je izveden sa HNE-stabilizovanim α-sinuklein protofibrilima.
[0081] Dalji ELISA eksperimenti pokazuju da antitela kandidati pokazuju afinitet ka humanim α-sinuklein protofibrilima stabilizovanim ili sa HNE ili sa ONE. Ova antitela takođe vezuju α-sinuklein protofibrile/agregate sastavljene od A30P ili A53T α-sinuklein mutanata stabilizovanim sa HNE kako je prikazano pomoću kompeticione ELISA.
[0082] Specifično, Fig.2A i 2B prikazuju rezultate protofibril specifičnog antitela mAb49/G analizirano pomoću kompeticione ELISA. Protofibril specifično monoklonalno antitelo mAb49/G vezuje se sa visokim afinitetom za humane α-sinuklein protofibrile stabilizovane ili sa HNE ili sa ONE (Fig.2A). Monoklonalno antitelo takođe se vezuje sa visokim afinitetom za HNE-stabilizovane protofibrile humanih mutiranih oblika α-sinukleina, A30P i A53T (Fig.2B). Agregacija α-sinuklein monomera sa ONE generiše dve distinktivne populacije kompleksa, kako je definisano ekskluzionom hromatografijom po veličini. Ova dva dinstiktivna pika odvojeno su eluirani i obeleženi kao FP-ONE_veliki i FP-ONE_mali.
[0083] Dodatno, Fig.3A-3C prikazuju rezultate dodatnih protofibril specifičnih antitela 38E2/7, 38F11/2_8 i 48B11/8, analiziranih kompeticionom ELISA. Protofibril specifična mnoklonalna antitela vezuju se sa visokim afinitetom za divlji tip humanih α-sinuklein protofibrila stabilizovanim ili sa HNE (PF-HNE) ili sa ONE (PF-ONE). Monoklonalna antitela takođe se vezuju sa visokim afinitetom za HNE-stabilizovane protofibrile humanih mutiranih oblika alfa sinukleina, A30P (A30P-HNE) i A53T (A30P-HNE).
Primer 5
Utvrđivanje α-sinuklein protofibril specifične sendvič ELISA
[0084] Kako bi se omogućila merenja α-sinuklein protofibrila u biološkim uzorcima, utvrđena je sendvič ELISA sa mAb49/G budući da da ono i hvata i detektuje antitela. Ovaj ogled meri α-sinuklein protofibrile sa ograničenjem kvantifikacije LOQ=9 pM (videti Fig.4B). Zbog nejasnoća koja se odnose na veličinu αsinuklein protofibrila koji se koriste u standardnoj krivi, koncentracija u pM bazirana je na molekulskoj masi jednog α-sinuklein monomera (14,000 g/mol). Kako je procenjeno da je molekulska masa protofibrila, ekskluzionom hromatografijom po veličini, najmanje 1,000,000 g/mol, ograničenje detektovanja izračunato kao da bi molarni α-sinuklein protofibrili mogli biti niski i do 0.13 pM.
[0085] α-sinuklein protofibrili stabilizovani sa HNE i monomerni α-sinuklein korišćeni su za procenu konformacione specifičnosti ELISA.
[0086] ELISA sastavljena od dva identična antitela zahteva najmanje dimer proteina kako bi proizvela signal. Međutim, veliki višak monomernog α-sinukleina, koji se može prirodno javiti u biološkim uzorcima, može da se umeša sa α-sinuklein protofibril analizom zauzimanjem mesta vezivanja obloge uhvaćenog antitela, čime se inhibiraju protofibrili od vezivanja. Ovaj problem ispitan je dodavanjem povećanog viška α-sinuklein monomera fiskiranoj koncentraciji α-sinuklein protofibrila (500 pM, izraženo kao monomerne jedinice) i analiziranjem sa mAb49/G ELISA.30000-struki molarni višak αsinuklein monomera (15 µM), u poređenju sa α-sinuklein protofibrilima (500 pM), nije poremetio merenja sa mAb49/G sendvič ELISA, kako je predviđeno budući da se α-sinuklein monomer slabo vezuje za uhvaćeno antitelo.
[0087] Fig.4A prikazuje šematsku ilustraciju ELISA vezivanja radi kvantifikovanja α-sinuklein protofibrila pomoću sendvič ELISA. Fig.4B prikazuje standardnu krivu generisanu sa HNE-stabilizovanim α-sinuklein protofibrilima. Performansa ogleda dostigla je granicu kvantifikacije, LOQ=9 pM.
Primer 6
Analiza ekstrakata obolelog i kontrolnog humanog mozga sa α-sinuklein protofibril specifičnom sendvič ELISA
[0088] Izveden je protokol ekstrakcije mozga primenom različitih deterdženata, generišući tri različita ekstrakta: TBS ekstrakt (Frig.5A, beli stubić) koji obuhvata ekstraćelijske i citozolne α-sinuklein vrste; Triton ekstrakt (Fig.5A, prugasti stubić) koji obuhvata membranom povezane α-sinuklein vrste; i SDS ekstrakt (Fig.5B, crni stubić), koji obuhvata SDS-rastvorljive α-sinuklein vrste. Ekstrakti mozga analizirani su iz pacijenta kojem je dijagnostikovana α-sinukleinopatijska demencija sa Levi telima (DLB). Analizirano je moždano tkivo iz korteksa i crne supstance. Kao kontrola, takođe je analizirano moždano tkivo iz korteksa subjekta bez detektabilne imunohistohemijske patologije Levi tela. Sendvič ELISA bazirana je na α-sinuklein protofibril specifičnim mAb49/G i za hvatanje antitela i detekciju antitela. Fig.5A i 5B pokazuju rezultate analize ekstrakata obolelog i kontrolnog ljudskog mozga sa α-sinuklein protofibril specifičnom sendvič ELISA. Ovaj ogled omogućava kvantifikaciju protofibrila na nivoima > 9 pM (granica kvantifikacije; LOQ=9 pM).
Primer 7
Merenje α-sinuklein protofibrila u ekstraktima mozga iz PD transgenog mišjeg modela
[0089] Predloženo je prisustvo α-sinuklein protofibrila u ćelijskim i mišjim modelima, iako do sada nije postojao postupak za direktno određivanje α-sinuklein protofibrila u biološkim uzorcima. mAb49/G sendvič ELISA tako obezbeđuje prvu priliku da se izmere nivoi α-sinuklein protofibrila u biološkim uzorcima i mišjim modelima α-sinukleinopatija, okarakterisane akumulacijom nagomilanog α-sinukleina.
[0090] Uzorci moždanih ekstrakata iz transgenih miševa koji prekomerno eksprimiraju α-sinuklein A53T mutant, upoređeni su sa uzorcima iz miševa divljeg tipa. Mozgovi su homogenizovani u TBS ili TBS+tween i centrifugirani pre analize kako bi se dobila rastvorljiva α-sinuklein frakcija. Merenja nivoa αsinuklein protofibrila u TBS-rastvorljivim frakcijama homogenata mozgova ne-transgenih miševa poređena su sa transgenim miševima (Kahle model) (Fig.6). Kako bi se obezbedilo da je sav α-sinuklein izmeren u ovom ogledu u rastvorljivom stanju, svi uzorci su centrifugirani tokom 5 min na 16000 x g pre analize. Nivoi α-sinuklein protofibrila izmereni su u mozgovima 5 meseci starih transgenih miševa sa αsinuklein patologijom.
[0091] Fig.6 prikazuje rezultate analize ekstrakata mozga kontrolih miševa (ntg, ne-transgenih) i 5 meseci starih miševa iz Khale transgenog (tg) mišjeg PD modela kod kojih y osa predstavlja apsorbanciju na OD450.
Primer 8
Imunohistohemijska (IHC) analiza humanog moždanog tkiva
[0092] Korteks i crna supstanca iz PD i DLB pacijenata upotrebljene su kako bi se izvela imunohistohemijska (IHC) analiza kako je opisano (Oinas et al.2010). Kao kontrola, upotrebljeni su korteks i crna supstanca iz neobolelih pacijenata iste starosti. Pozitivna kontrola antitela za α-sinuklein bilo je mišje anti-α-sinuklein mAb (BD 610787).
[0093] Vezivanje za Aβ plakove procenjeno je kako sledi: dva uzastopna isečka iz korteksa AD pacijenta, tretirana su kako bi pokazala antigene i inkubisana ili sa pozitivnim anti-Aβ □mAb (mAb158, BioArctic) ili sa svakim od antitela kandidata. Vezano antitelo primećeno je sekundarnim specifičnim antitelom antivrsta kuplovanim sa peroksidazom rena (HRP). Konjugat je zatim inkubisan sa HRP supstratom DAB, generišući obojeni talog koji se detektuje svetlosnom mikroskopijom. Region u kojem su Aβ plakovi primećeni obojenim talogom u pozitivnoj kontroli, analiziran je u zajedničkoj respektivnoj površini u isečcima tretiranim sa antitelom kandidatom. Nedostatak obojenog taloga procenjen je vizuelno i procenjen kao nedostatak vezivanja za Aβ plakove od strane antitela kandidata.
[0094] Fig.7A prikazuje 38E2/7 vezivanje Levi tela i neurita u PD crnoj supstanci i pozitivnu α-αsinuklein kontrolu. Fig.7B prikazuje 38E2/7 vezivanje Levi tela i neurita u DLB korteksu i crnoj supstanci i pozitivnu α-α-sinuklein kontrolu. Fig.7C prikazuje razna antitela koja vezuju Levi tela i neurite u DLB korteksu i crnoj supstanci i negativnu kontrolu. Fig.7D prikazuje razna antitela koja vezuju Levi tela i neurite u PD crnoj supstanci i negativnu kontrolu. Fig.7E pokazuje nepostojanje vezivanja 38E2/7 u crnoj supstanci koja nije povezana sa bolešću i pozitivnu α-α-sinuklein kontrolu. Fig.7F prikazuje poređenje 38E2/7 vezivanje i pozitivnu α-Aβ kontrolu u korteksu pacijenta koji je oboleo od Alchajmerove bolesti.
Primer 9
Analiza ekstrakta ljudskog mozga sa imunotaloženjem (IP) i western blotom
[0095] Imunotaloženje ekstrakta ljudskog mozga sa protofibril vezujućim monoklonalnim antitelom 38E2/7 sprovedeno je primenom western blota. Izveden je protokol ekstrakovanja mozga primenom različitih deterdženata, generišući četiri različita ekstrakta: TBS ekstrakt, koji obuhvata ekstraćelijske i citozolne α-sinuklein vrste; Triton ekstrakt, koji obuhvata membranom povezane α-sinuklein vrste, SDS ekstrakt, koji obuhvata SDS-rastvorljive α-sinuklein vrste i FA ekstrakt, koji obuhvata nerastvorljiv αsinuklein. Ovi ekstrakti su imunoistaloženi sa magnetnim perlicama, za koje je kuplovano antitelo 38E2/7 ili kontrolno antitelo 15P. Antitelo 15P može se vezati za α-sinuklein protofibrile i monomere jednako dobro i očekuje se da povlače sve prisutne vrste. Fig.8A prikazuje SDS ekstrakt crne supstance DLB pacijenta dok Fig.8B prikazuje Triton ekstrakt crne supstance DLB pacijenta. Kao što se može videti, na Fig.8A i 8B, mAb 38E2/7 hvata samo α-sinuklein protofibrile iz DLB crne supstance, i u Triton i u SDS ekstraktima, dok mAb15 hvata α-sinuklein monomere u svim ekstraktima.
Primer 10
Analiza α-sinuklein oligomerizacione inhibicije
[0096] Ovaj primer prikazuje antitelo mAb49/G koje inhibira oligomerizaciju α-sinuklein monomera primenom postupka in vitro u kojem se neuronske ćelije transfektuju sa 2 vektora, pri čemu oba sadrže jednu kopiju α-sinukleina (aa 1-140) fuzionisanog ili sa N-terminalnim ili C-terminalnim fragmentom GFP. Samo te ćelije, u kojima je α-sinuklein oligomerizovan, dovodeći oba fragmenta GFP zajedno, generišu zelenu fluorescentnu boju koja se može detektovati fluorescentnom mikroskopijom. Prisustvo antitela koje može da inhibira i/ili poremeti oligomerizaciju, može se proceniti poređenjem fluorescencije u ovim kulturama, u poređenju sa kontrolom kojoj nije dodato ni jedno antitelo.
[0097] Specifično, H4 neuroglioma ćelije transfektovane su sa ekvimolarnim odnosima DNK-konstrukata koji sadrže ili α-sinuklein (aa 1-140) fuzionisan sa N-terminalnim fragmentom zelenog fluorescentnog proteina (GFP) (aa 1-155) ili α-sinuklein (aa 1-140) fuzionisan sa C-terminalnim fragmentom GFP (aa 156-238) primenom FuGENE 6 transfekcionog reagensa (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland). Simultano, kontrolno anti-α-sinuklein monoklonalno antitelo (mAb5C2, Santa Cruz Bio) i mAb49/G ekstraćelijski su dodata ćelijama pri finalnoj koncentraciji od 1 µg/ml. Ćelije su inkubisane tokom 24 sata na 37 °C u 5% CO2. Nakon 24 sata, ćelije su pomerene na 30 °C radi potpunog rekonstitusanja GFP-flourofora i inkubisane tokom dodatnih 24 sata. Fluorescencija je izmerena primenom Axiovert200 mikroskopa opremljen sa FITC epifluorescencionim filterom. Svi podaci izračunati su kao relativan % inteziteta fluorescencije u poređenju sa antitelom netretiranim ćelijama koje prekomerno eksprimiraju αsinuklein, što je određeno kao 100 %.
[0098] Kao što se može videti na Fig.9A, tretiranje sa mAb49/G pokazalo je značajnu (*p< 0.05) redukciju (42 % smanjenje u intezitetu fluorescencije u poređenju sa netretiranim ćelijama) u α-sinuklein oligomerizaciji. Fig.9B prikazuje rezultate kao procenat inteziteta fluorescencije u poređenju sa netretiranim ćelijama koje preterano eksprimiraju α-sinuklein, što je određeno kao 100%.
[0099] Specifični primeri i primeri izvođenja opisani ovde su samo u svrhe primera i nisu namenjeni da ograniče ovaj pronalazak definisan patentnim zahtevima. Dalji primeri izvođenja i primeri, i njihove prednosti, jasne su stručnjaku iz ove oblasti u pogledu ove specifičnosti i nalaze se u okviru obima zaštićenog pronalaska.
REFERENCES
[0100]
Chartier-Harlin, MC., et al.2004. Alpha-synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson's disease. Lancet 1, 364,1167-1169.
Conway, K., et al., 2000. Acceleration of oligomerization, not fibrillization, is a shared property of both α-synuclein mutations linked to early-onset Parkinson's disease: Implications for pathogenesis and therapy. Proc Natl Acad Sci USA 97, 571-576.
Crews, L., et al., 2009. Role of synucleins in Alzheimer's disease. Neurotox Res.16, 306-317. Desplats, P., et al., 2009. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein. Proc Natl Acad Sci USA.4, 106, 13010-13015. Erratum in: Proc Natl Acad Sci USA.2009, 106, 17606. Comment in: Proc Natl Acad Sci U SA.2009, 106, 12571-12572.
El-Agnaf, O. M., et al., 2006. Detection of oligomeric forms of α-synuclein protein in human plasma as a potential biomarker for Parkinson's disease. Faseb J 20, 419-425.
George, J. L., et al.2009. Targeting the progression of Parkinson's disease. Curr Neuropharmacol.7, 9-36.
Hansen, L, et al., 1990. The Lewy body variant of Alzheimer's disease. A clinical and pathologic entity. Neurology 40, 1-8.
Klucken, J., et al., 2006. Clinical and biochemical correlates of insoluble α-synuclein in dementia with Lewy bodies. Acta Neuropathol (Berl) 111, 101-108.
Kruger, R., et al., 1998. Ala30Pro mutation in the gene encoding α-synuclein in Parkinson's disease. Nat Genet 18, 106-108.
Leatherbarrow, R.J., et al.1985. Effector functions of a monoclonal aglycosylated mouse IgG2a: binding and activation of complement component C1 and interaction with human monocyte Fc receptor. Mol Immunol 22, 407-415.
Lee, H-J., et al.2004. Clearance of a-synuclein oligomeric intermediates via the lysosomal degradation pathway. Journal of Neuroscience 24, 1888-1896.
Li,J.Y., et al Li et al.2008. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagationNature Med., 14, 501-503.
Masliah, E., et al.2005. Effects of alpha-synuclein immunization in a mouse model of Parkinson's disease. Neuron.46, 857-868.
Oinas, M., et al.2010. alpha-Synuclein pathology in the spinal cord autonomic nuclei associates with alpha-synuclein pathology in the brain: a population-based Vantaa 85+ study. Acta Neuropathol.
119, 715-722.
Polymeropoulos, M.H., et al., 1997. Mutation in the α-Synuclein Gene Identified inFamilies with Parkinson's Disease. Science 276, 2045-2047.
Qin, Z., et al., 2007. Effect of 4 -hydroxy-2-nonenal modification on α -synuclein aggregation. J Biol Chem 282, 5862-5870.
Singleton, AB., et al., 2003. alpha-Synuclein locus triplication causes Parkinson's disease. Science 302:841.
Wrigth, A., 1998. Effect of C2-associated carbohydrate structure on Ig effector function: studies with chimeric mouse-human IgG1 antibodies in glycosylation mutants of Chinese hamster ovary cells. J Immunol 160, 3393-3402.
Xu, Y., et al.1994. Residue at position 331 in the IgG1 and IgG4 CH2 domains contributes to their differential ability to bind and activate complement. J Biol Chem.269, 3469-3474.
Yoritaka, A., et al., 1996. Immunohistochemical detection of 4-hydroxynonenal protein adducts in Parkinson disease. Proc Natl Acad Sci USA 93, 2696-2701.
Zarranz, J., et al., 2004. The new mutation, E46K, of α-synuclein causes Parkinson and Lewy body dementia. Ann Neurol.55, 164-173.
LISTA SEKVENCI
[0101]

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za humane α-sinuklein protofibrile molekulske mase u opsegu od 1000 do 5000 kDa, pri čemu je vezivanje zag antitela ili fragmenta za svaki od α-sinuklein monomera i β-sinuklein monomera najmanje 100 puta manje od vezivanja tog antitela ili fragmenta za humane α-sinuklein protofibrile, gde to antitelo ili fragment imaju tri varijabilne teške (VH) CDR sekvence (VH-CDR-1, VH-CDR-2, i VH-CDR-3) i tri varijabilne lake (VL) CDR sekvence (VL-CDR-1, VL-CDR-2, i VL-CDR-3), i gde to antitelo ili njegov fragment ima CDR sekvencionu kombinaciju odabranu od sledećih kombinacija:
(a) VH-CDR-1: SEQ ID NO: 22, VH-CDR-2: SEQ ID NO: 28, VH-CDR-3: SEQ ID NO: 35, VL-CDR-1: SEQ ID NO: 41, VL-CDR-2: SEQ ID NO: 47 i VL-CDR-3: SEQ ID NO: 50,
(b) VH-CDR-1: SEQ ID NO: 23, VH-CDR-2: SEQ ID NO: 29, VH-CDR-3: SEQ ID NO: 36, VL-CDR-1: SEQ ID NO: 42, VL-CDR-2: SEQ ID NO: 47 i VL-CDR-3: SEQ ID NO: 50,
(c) VH-CDR-1: SEQ ID NO: 24, VH-CDR-2: SEQ ID NO: 30, VH-CDR-3: SEQ ID NO: 37, VL-CDR-1: SEQ ID NO: 43, VL-CDR-2: SEQ ID NO: 48 i VL-CDR-3: SEQ ID NO: 51,
(d) VH-CDR-1: SEQ ID NO: 25, VH-CDR-2: SEQ ID NO: 31, VH-CDR-3: SEQ ID NO: 38, VL-CDR-1: SEQ ID NO: 44, VL-CDR-2: SEQ ID NO: 47 i VL-CDR-3: SEQ ID NO: 52,
(e) VH-CDR-1: SEQ ID NO: 26, VH-CDR-2: SEQ ID NO: 32, VH-CDR-3: SEQ ID NO: 39, VL-CDR-1: SEQ ID NO: 45, VL-CDR-2: SEQ ID NO: 47 i VL-CDR-3: SEQ ID NO: 53,
(f) VH-CDR-1: SEQ ID NO: 23, VH-CDR-2: SEQ ID NO: 33, VH-CDR-3: SEQ ID NO: 37, VL-CDR-1: SEQ ID NO: 43, VL-CDR-2: SEQ ID NO: 48 i VL-CDR-3: SEQ ID NO: 54, i
(g) VH-CDR-1: SEQ ID NO: 27, VH-CDR-2: SEQ ID NO: 34, VH-CDR-3: SEQ ID NO: 40, VL-CDR-1: SEQ ID NO: 46, VL-CDR-2: SEQ ID NO: 49 i VL-CDR-3: SEQ ID NO: 55.
2. Antitelo ili njegov fragment prema zahtevu 1, kod kojeg šest CDR sekvenci tog antitela ili njegovog fragmenta imaju sekvence VH-CDR-1: SEQ ID NO: 22, VH-CDR-2: SEQ ID NO: 28, VH-CDR-3: SEQ ID NO: 35, VL-CDR-1: SEQ ID NO: 41, VL-CDR-2: SEQ ID NO: 47 i VL-CDR-3: SEQ ID NO: 50.
3. Antitelo ili njegov fragment prema zahtevu 1, kod kojeg šest CDR sekvenci tog antitela ili njegovog fragmenta imaju sekvence VH-CDR-1: SEQ ID NO: 23, VH-CDR-2: SEQ ID NO: 29, VH-CDR-3: SEQ ID NO: 36, VL-CDR-1: SEQ ID NO: 42, VL-CDR-2: SEQ ID NO: 47 i VL-CDR-3: SEQ ID NO: 50.
4. Antitelo ili njegov fragment prema zahtevu 1, kod kojeg šest CDR sekvenci tog antitela ili njegovog fragmenta imaju sekvence VH-CDR-1: SEQ ID NO: 24, VH-CDR-2: SEQ ID NO: 30, VH-CDR-3: SEQ ID NO: 37, VL-CDR-1: SEQ ID NO: 43, VL-CDR-2: SEQ ID NO: 48 i VL-CDR-3: SEQ ID NO: 51.
5. Antitelo ili njegov fragment prema zahtevu 1, kod kojeg šest CDR sekvenci tog antitela ili njegovog fragmenta imaju sekvence VH-CDR-1: SEQ ID NO: 25, VH-CDR-2: SEQ ID NO: 31, VH-CDR-3: SEQ ID NO: 38, VL-CDR-1: SEQ ID NO: 44, VL-CDR-2: SEQ ID NO: 47 i VL-CDR-3: SEQ ID NO: 52.
6. Antitelo ili njegov fragment prema zahtevu 1, kod kojeg šest CDR sekvenci tog antitela ili njegovog fragmenta imaju sekvence VH-CDR-1: SEQ ID NO: 26, VH-CDR-2: SEQ ID NO: 32, VH-CDR-3: SEQ ID NO: 39, VL-CDR-1: SEQ ID NO: 45, VL-CDR-2: SEQ ID NO: 47 i VL-CDR-3: SEQ ID NO: 53.
7. Antitelo ili njegov fragment prema zahtevu 1, kod kojeg šest CDR sekvenci tog antitela ili njegovog fragmenta imaju sekvence VH-CDR-1: SEQ ID NO: 23, VH-CDR-2: SEQ ID NO: 33, VH-CDR-3: SEQ ID NO: 37, VL-CDR-1: SEQ ID NO: 43, VL-CDR-2: SEQ ID NO: 48 i VL-CDR-3: SEQ ID NO: 54.
8. Antitelo ili njegov fragment prema zahtevu 1, kod kojeg šest CDR sekvenci tog antitela ili njegovog fragmenta imaju sekvence VH-CDR-1: SEQ ID NO: 27, VH-CDR-2: SEQ ID NO: 34, VH-CDR-3: SEQ ID NO: 40, VL-CDR-1: SEQ ID NO: 46, VL-CDR-2: SEQ ID NO: 49 i VL-CDR-3: SEQ ID NO: 55.
9. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata antitelo ili fragment prema bilo kom od zahteva 1-8, i farmaceutski prihvatljiv nosač.
10. Postupak in vitro detektovanja α-sinuklein protofibrila, koji obuhvata faze
- dodavanja antitela ili fragmenta prema bilo kom od zahteva 1-8 ili kompozicije prema zahtevu 9 biološkom uzorku koji obuhvata ili se pretpostavlja da obuhvata α-sinuklein protofibrile, i
- detektovanja prisustva kompleksa formiranog od α-sinuklein protofibrila i pomenutog antitela ili fragmenta.
11. Antitelo ili fragment prema bilo kom od zahteva 1-8 ili farmaceutska kompozicija koja obuhvata antitelo ili fragment prema bilo kom od zahteva 1-8 i farmaceutski prihvatljiv nosač za upotrebu u prevenciji, odlaganju početka ili tretiranju neurodegenerativnog poremećaja sa α-sinuklein patologijom kod pojedinca, pri čemu je taj poremećaj sa α-sinuklein patologijom okarakterisan taloženjem Levi tela i Levi neurita.
12. Antitelo, fragment ili kompozicija za upotrebu prema zahtevu 11, gde je neurodegenerativni poremećaj Parkinsonova bolest (PD), demencija sa Levi telima (DLB), varijanta Alchajmerove bolesti sa Levi telima, ili multiple sistemska atrofija.
13. Upotreba antitela ili fragmenta prema bilo kom od zahteva 1-8 ili kompozicije prema zahtevu 9 za in vitro dijagnozu ili praćenje razvoja neurodegenerativnog poremećaja sa α-sinuklein patologijom, pri čemu je taj poremećaj sa α-sinuklein patologijom okarakterisan taloženjem Levi tela i Levi neurita.
14. Upotreba prema zahtevu 13 za in vitro dijagnozu ili praćenje razvoja Parkinsonove bolesti (PD), demencije sa Levi telima (DLB), varijante Alchajmerove bolesti sa Levi telima, ili multiple sistemske atrofije.
15. Antitelo ili fragment prema bilo kom od zahteva 1-8 ili kompozicija prema zahtevu 9 za upotrebu u tretiranju α-sinukleinopatijskog poremećaja kod subjekta vezivanjem α-sinuklein protofibrila u mozgu tog subjekta.
RS20180129A 2010-02-26 2011-02-25 Protofibril-vezujuća antitela i njihova upotreba u terapeutskim i dijagnostičkim postupcima za parkinsonovu bolest, demenciju sa levi telima i drugim alfa-sinukleinopatijama RS57029B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US30863810P 2010-02-26 2010-02-26
US40626010P 2010-10-25 2010-10-25
PCT/IB2011/050826 WO2011104696A1 (en) 2010-02-26 2011-02-25 Protofibril-binding antibodies and their use in therapeutic and diagnostic methods for parkinson's disease, dementia with lewy bodies and other alpha-synucleinopathies
EP11713058.3A EP2539366B1 (en) 2010-02-26 2011-02-25 Protofibril-binding antibodies and their use in therapeutic and diagnostic methods for parkinson's disease, dementia with lewy bodies and other alpha-synucleinopathies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS57029B1 true RS57029B1 (sr) 2018-05-31

Family

ID=44227520

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20180129A RS57029B1 (sr) 2010-02-26 2011-02-25 Protofibril-vezujuća antitela i njihova upotreba u terapeutskim i dijagnostičkim postupcima za parkinsonovu bolest, demenciju sa levi telima i drugim alfa-sinukleinopatijama

Country Status (20)

Country Link
US (4) US8632776B2 (sr)
EP (1) EP2539366B1 (sr)
JP (1) JP5894939B2 (sr)
CN (3) CN110655573B (sr)
AU (1) AU2011219414B2 (sr)
CA (1) CA2789963C (sr)
CY (1) CY1120014T1 (sr)
DK (1) DK2539366T3 (sr)
ES (1) ES2661925T3 (sr)
HR (1) HRP20180230T8 (sr)
HU (1) HUE038313T2 (sr)
LT (1) LT2539366T (sr)
NO (1) NO2539366T3 (sr)
PL (1) PL2539366T3 (sr)
PT (1) PT2539366T (sr)
RS (1) RS57029B1 (sr)
RU (1) RU2555526C2 (sr)
SI (1) SI2539366T1 (sr)
SM (1) SMT201800044T1 (sr)
WO (1) WO2011104696A1 (sr)

Families Citing this family (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2709048T3 (es) 2008-04-29 2019-04-15 Bioarctic Ab Anticuerpos y vacunas para su uso en métodos terapéuticos y diagnósticos para trastornos relacionados con alfasinucleína
CN110655573B (zh) 2010-02-26 2023-07-18 生命北极神经科学公司 原细纤维结合抗体及其治疗和诊断帕金森氏症、路易体痴呆和其他α-共核蛋白病的应用
US10989718B2 (en) * 2014-09-11 2021-04-27 Amprion, Inc. Detection of misfolded alpha synuclein protein
EP3252076B1 (en) 2011-01-14 2019-09-04 The Regents Of The University Of California Diagnostic use of antibodies against ror-1 protein
BR112014017814A8 (pt) * 2012-01-20 2017-07-11 Genzyme Corp Anticorpos anti-cxcr3
US9534044B2 (en) 2013-02-28 2017-01-03 United Arab Emirates University Alpha-synuclein antibodies and uses thereof
LT3071597T (lt) 2013-11-21 2020-10-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Antikūnai prieš alfa-sunukleiną ir jų naudojimo būdai
CN106661103B (zh) * 2014-07-10 2020-11-03 生命北极神经科学公司 改进的Aβ初原纤维结合抗体
JP2017536102A (ja) 2014-10-16 2017-12-07 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗アルファ−シヌクレイン抗体及び使用方法
US10494425B2 (en) * 2015-02-24 2019-12-03 Rpeptide, Llc Anti-amyloid-beta antibodies
EP3091087A1 (en) 2015-05-08 2016-11-09 Fundació Institut d'Investigació en Ciències de la Salut Germans Trias i Pujol Method for in vitro diagnosis of synucleinopathies using alpha-synuclein gene transcripts
GB201512203D0 (en) 2015-07-13 2015-08-19 Lundbeck & Co As H Agents,uses and methods
EP3325506A1 (en) 2015-07-21 2018-05-30 BioArctic AB Method for treatment of traumatic brain injury targeting aggregated peptides
KR102964291B1 (ko) 2015-11-09 2026-05-13 더 유니버시티 오브 브리티쉬 콜롬비아 아밀로이드 베타 에피토프 및 이에 대한 항체
US10774120B2 (en) 2015-11-09 2020-09-15 The University Of British Columbia Anti-amyloid beta antibodies binding to a cyclic amyloid beta peptide
CA3004482A1 (en) 2015-11-09 2017-05-18 Neil R. Cashman N-terminal epitopes in amyloid beta and conformationally-selective antibodies thereto
MX2018010485A (es) 2016-03-04 2019-01-10 Jn Biosciences Llc Anticuerpos para inmunoreceptor de celulas t con dominios de ig e itim (tigit).
TW202309093A (zh) * 2016-06-02 2023-03-01 英商梅迪繆思有限公司 針對α-突觸核蛋白之抗體及其用途
CA3028035A1 (en) 2016-07-14 2018-01-18 Bioarctic Ab Brain delivery protein
KR102550991B1 (ko) 2016-07-18 2023-07-04 더 유니버시티 오브 브리티쉬 콜롬비아 아밀로이드 베타에 대한 항체
US20180125920A1 (en) 2016-11-09 2018-05-10 The University Of British Columbia Methods for preventing and treating A-beta oligomer-associated and/or -induced diseases and conditions
RU2019114679A (ru) 2016-11-15 2020-12-17 Х. Лундбекк А/С Средства, пути применения и способы лечения синуклеопатии
EP3555127B1 (en) 2016-12-16 2024-12-18 H. Lundbeck A/S Agents, uses and methods
US10364286B2 (en) * 2016-12-22 2019-07-30 H. Lundbeck A/S Monoclonal anti-alpha-synuclein antibodies for preventing tau aggregation
US12049493B2 (en) 2017-01-06 2024-07-30 Abl Bio Inc. Anti-alpha-synuclein antibodies and uses thereof
WO2018128454A1 (ko) * 2017-01-06 2018-07-12 에이비엘바이오 주식회사 항 α-SYN 항체 및 그 용도
JP7136790B2 (ja) 2017-02-17 2022-09-13 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー アルファ－シヌクレインに対する抗体およびその使用
AU2018255489B2 (en) * 2017-04-21 2024-06-13 Implicit Bioscience Limited CD 14 antagonist antibodies for treating neurodegenerative diseases
IL270361B2 (en) * 2017-05-01 2025-04-01 Univ Pennsylvania Monoclonal antibodies against alpha-synuclein fibrils
KR20200007945A (ko) 2017-05-16 2020-01-22 암프리온, 인코퍼레이티드 미스폴딩된 타우 단백질의 검출
US12286469B2 (en) 2017-07-18 2025-04-29 The University Of British Columbia Humanized antibodies binding to amyloid-beta (A-beta)
EP3661961A4 (en) 2017-08-02 2021-04-14 Stressmarq Biosciences Inc. ANTIBODIES BINDING TO ACTIVE ALPHA-SYNUCLEIN
EP3672635A4 (en) * 2017-08-23 2021-05-12 The Trustees of The University of Pennsylvania MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST PATHOLOGICAL ALPHA-SYNUCLEIN AND METHOD OF USING THEREOF
RU2657763C1 (ru) * 2017-09-12 2018-06-15 федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ диагностики болезни паркинсона
BR112020009707A2 (pt) * 2017-11-17 2020-10-13 Abl Bio Inc. anticorpos para a-sinucleína e usos dos mesmos
BR112020011875A2 (pt) 2017-12-14 2020-11-24 Abl Bio Inc. anticorpo biespecífico ao a-syn/igf1r e uso do mesmo
GB201720975D0 (en) * 2017-12-15 2018-01-31 Ucb Biopharma Sprl Anti-alpha synuclein antibodies
GB201720970D0 (en) * 2017-12-15 2018-01-31 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
EP3728567B1 (en) 2017-12-19 2023-07-05 Chase Therapeutics Corporation Method for assessing a synucleinopathy
JP7498663B2 (ja) * 2017-12-21 2024-06-12 ハー・ルンドベック・アクチエゼルスカベット アルファ－シヌクレイン病のアッセイ、方法、及び治療
CN109957547A (zh) * 2017-12-25 2019-07-02 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向cd317的嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN109957546A (zh) * 2017-12-25 2019-07-02 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向cd317的嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
US12583894B2 (en) 2018-04-04 2026-03-24 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Materials and methods for the treatment of Lewy body disorders
TW202003576A (zh) * 2018-05-10 2020-01-16 美商艾博視訊有限公司 活化cd40之單株抗體及其用途
WO2020009482A1 (ko) * 2018-07-03 2020-01-09 에이비엘바이오 주식회사 항 알파-시누클레인 항체 및 그 용도
WO2020023530A2 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Eisai R&D Management Co., Ltd. Methods of treatment and prevention of alzheimer's disease
BR112021006123A2 (pt) * 2018-10-19 2021-07-20 Janssen Vaccines & Prevention B.V. anticorpos anti-sinucleína
TW202039562A (zh) * 2018-12-12 2020-11-01 大陸商上海藥明生物技術有限公司 抗tim-3抗體及其用途
RU2703430C1 (ru) * 2018-12-13 2019-10-16 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр глазных болезней имени Гельмгольца" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ГБ им. Гельмгольца" Минздрава России) Способ прогнозирования развития нейродегенеративных заболеваний, в основе патогенеза которых лежит гамма-синуклеинопатия
TWI734279B (zh) * 2018-12-14 2021-07-21 美商美國禮來大藥廠 抗α-突觸核蛋白抗體及其用途
WO2020192754A1 (en) * 2019-03-28 2020-10-01 The Chinese University Of Hong Kong Sumo peptides for treating neurodegenerative diseases
US20220214360A1 (en) 2019-04-30 2022-07-07 Chase Therapeutics Corporation Alpha-synuclein assays
US20220291240A1 (en) * 2019-08-27 2022-09-15 The Johns Hopkins University Biomarkers for neurodegenerative disorders
PH12022551608A1 (en) 2019-12-31 2023-10-16 Chase Therapeutics Corp Kinases as biomarkers for neurodegenerative conditions
CN111171152B (zh) * 2020-01-15 2023-04-18 吉林医药学院 Pcsk9抗体及其制备方法和应用
NL2025332B1 (en) 2020-04-10 2021-10-26 Syngle Therapeutics B V Novel alpha-synuclein binding antibodies, or antigen binding portions thereof.
TW202210514A (zh) 2020-06-02 2022-03-16 美商阿克思生物科學有限公司 針對tigit的抗體
HRP20250812T1 (hr) * 2020-06-26 2025-09-12 Bioarctic Ab Antitijela koja vežu alfa-sinuklein protofibril
US20230365665A1 (en) 2020-09-17 2023-11-16 Qatar Foundation For Education, Science And Community Development ANTIBODY COMPOSITIONS TARGETING NON-PHOSPHORYLATED a-SYNUCLEIN AGGREGATES
KR20230157296A (ko) * 2020-12-16 2023-11-16 보이저 테라퓨틱스, 인크. 타우 결합 화합물
JP2024525559A (ja) 2021-07-09 2024-07-12 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 アルツハイマー病治療用バイオマーカー
CA3230148A1 (en) 2021-08-30 2023-03-09 Eisai R&D Management Co., Ltd. Subcutaneous formulations of anti-abeta protofibril antibody and methods of use thereof
KR20240142535A (ko) 2022-02-02 2024-09-30 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 P-tau181 수준을 사용한 치료 방법
JP2023132247A (ja) * 2022-03-10 2023-09-22 公立大学法人大阪 シヌクレイノパシー検出用バイオマーカー及びその利用
CN117430686B (zh) * 2022-07-22 2025-07-01 深圳市安群生物工程有限公司 α-突触核蛋白抗原表位肽及测定唾液中SNCA试剂盒和在帕金森病诊断中的应用
CN116589567B (zh) * 2022-11-30 2024-03-19 西南大学 马铃薯x病毒单克隆抗体pvx-2及其应用
WO2025245381A1 (en) 2024-05-23 2025-11-27 The Trustrees Of Dartmouth College Methods and compositions for enhancing the persistence of car expressing tregs in the cns and other tissues
CN119101159A (zh) * 2024-08-30 2024-12-10 山东大学 抗tim-3单克隆抗体及其制备方法和应用
WO2026068513A1 (en) 2024-09-24 2026-04-02 Bioarctic Ab Bispecific binding molecule

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000002053A2 (en) 1998-07-03 2000-01-13 Innogenetics N.V. Differential diagnosis of neurodegeneration
UA81216C2 (en) 1999-06-01 2007-12-25 Prevention and treatment of amyloid disease
AU2001268005A1 (en) 2000-07-07 2002-01-21 Lars Lannfelt Prevention and treatment of alzheimer's disease
US20060018918A1 (en) 2000-12-27 2006-01-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Production of stabilized conformational isomers of disease associated proteins
US20080014194A1 (en) 2003-10-31 2008-01-17 Elan Pharmaceuticals, Inc. Prevention and Treatment of Synucleinopathic and Amyloidogenic Disease
US8506959B2 (en) 2002-11-01 2013-08-13 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
TW200509968A (en) 2002-11-01 2005-03-16 Elan Pharm Inc Prevention and treatment of synucleinopathic disease
US7358331B2 (en) 2003-05-19 2008-04-15 Elan Pharmaceuticals, Inc. Truncated fragments of alpha-synuclein in Lewy body disease
UA93653C2 (ru) * 2003-11-07 2011-03-10 Иммунекс Корпорейшн Выделенное антитело, kotopoe специфически связывается c человеческим рецептором il-4 (il-4r)
WO2005047860A2 (en) 2003-11-08 2005-05-26 Elan Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to alpha-synuclein
US20050203010A1 (en) 2003-11-14 2005-09-15 Atgen Co., Ltd. Novel peptides conferring environmental stress resistance and fusion proteins including said peptides
SE0401601D0 (sv) 2004-06-21 2004-06-21 Bioarctic Neuroscience Ab Protofibril specific antibodies and uses thereof
JP2009525046A (ja) 2006-01-31 2009-07-09 エラン ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド アルファ−シヌクレインキナーゼ
MY169492A (en) 2006-03-23 2019-04-15 Bioarctic Neuroscience Ab Improved protofibril selective antibodies and the use thereof
US8147833B2 (en) 2007-02-23 2012-04-03 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
CN101161245B (zh) * 2007-11-29 2011-11-09 首都医科大学宣武医院 二苯乙烯苷及其衍生物抑制突触核蛋白过度表达的用途
ES2709048T3 (es) * 2008-04-29 2019-04-15 Bioarctic Ab Anticuerpos y vacunas para su uso en métodos terapéuticos y diagnósticos para trastornos relacionados con alfasinucleína
SI2448968T1 (sl) 2009-06-29 2021-07-30 Bioarctic Ab Protitelesa, selektivna za protofibrile/oligomere na N-koncu skrajšanega amiloida-beta
CN110655573B (zh) 2010-02-26 2023-07-18 生命北极神经科学公司 原细纤维结合抗体及其治疗和诊断帕金森氏症、路易体痴呆和其他α-共核蛋白病的应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP2539366A1 (en) 2013-01-02
US8632776B2 (en) 2014-01-21
RU2555526C2 (ru) 2015-07-10
CN110655573B (zh) 2023-07-18
LT2539366T (lt) 2018-04-25
US20120308572A1 (en) 2012-12-06
CN110655573A (zh) 2020-01-07
AU2011219414B2 (en) 2014-11-20
HRP20180230T1 (hr) 2018-03-09
CY1120014T1 (el) 2018-12-12
HUE038313T2 (hu) 2018-10-29
US9084832B2 (en) 2015-07-21
US20130309251A1 (en) 2013-11-21
CA2789963C (en) 2019-09-03
SI2539366T1 (en) 2018-05-31
JP5894939B2 (ja) 2016-03-30
HRP20180230T8 (hr) 2021-04-30
CN106397588A (zh) 2017-02-15
CN106397588B (zh) 2020-09-08
EP2539366B1 (en) 2017-11-08
CN102869680A (zh) 2013-01-09
DK2539366T3 (en) 2018-02-05
US20150139900A1 (en) 2015-05-21
NO2539366T3 (sr) 2018-04-07
CA2789963A1 (en) 2011-09-01
PT2539366T (pt) 2018-02-13
US8968734B2 (en) 2015-03-03
US8859501B2 (en) 2014-10-14
US20140363447A1 (en) 2014-12-11
PL2539366T3 (pl) 2018-06-29
ES2661925T3 (es) 2018-04-04
JP2013525266A (ja) 2013-06-20
SMT201800044T1 (it) 2018-05-02
AU2011219414A1 (en) 2012-09-06
CN102869680B (zh) 2016-10-05
RU2012140954A (ru) 2014-04-10
WO2011104696A1 (en) 2011-09-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8859501B2 (en) Protofibril-binding antibodies and their use in thereapeutic and diagnostic methods for parkinson&#39;s disease, dementia with lewy bodies and other alpha-synucleinopathies
US10208111B2 (en) Alpha-synuclein antibodies and uses thereof
US20260078176A1 (en) Anti-Abeta Antibodies
TW202434629A (zh) 以抗類澱粉β (ABETA)抗體治療神經病症之方法
JP2020515524A (ja) ベータアミロイドペプチドのプロトフィブリル形態に特異的な抗体の神経細胞保護作用
EA053271B1 (ru) Анти-aбета антитела