RS57066B1 - Sa industrijskim farmaceutskim primenama kompatibilan skalabilan proizvodni sistem lentiviralnog vektora - Google Patents

Sa industrijskim farmaceutskim primenama kompatibilan skalabilan proizvodni sistem lentiviralnog vektora

Info

Publication number
RS57066B1
RS57066B1 RS20180365A RSP20180365A RS57066B1 RS 57066 B1 RS57066 B1 RS 57066B1 RS 20180365 A RS20180365 A RS 20180365A RS P20180365 A RSP20180365 A RS P20180365A RS 57066 B1 RS57066 B1 RS 57066B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cells
plasmid
transfection
production
lentiviral
Prior art date
Application number
RS20180365A
Other languages
English (en)
Inventor
Nicolas Marceau
Mehdi Gasmi
Original Assignee
Genethon
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=48469165&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS57066(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genethon filed Critical Genethon
Publication of RS57066B1 publication Critical patent/RS57066B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/02—Recovery or purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/10051—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16051—Methods of production or purification of viral material

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Opis
[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na industrijalizaciju proizvodnje rekombinantnih lentiviralnih vektora kako bi se proizvelo dovoljno materijala za terapeutske primene kao što je genska terapija i/ili DNK vakcinacija, za upotrebu u kliničkim ispitivanjima i/ili komercijalne svrhe.
POZADINA OVOG PRONALASKA
[0002] Prednosti u upotrebi rekombinantnih viralnih vektora za gensku terapiju i primena DNK vakcinacije stvorile su potrebu za masovnom proizvodnjom viralnih vektora kliničke čistoće za transfer genetskih materijala. Jedna takva familija viralnih vektora je rod lentivirusa unutar retrovirusne familije virusa.
[0003] Lentiviralni vektori koji se koriste u aplikacijama genske terapije, uobičajeno se proizvode kalcijum fosfatnom transfekcijom adherentnih ćelija gde je potreban goveđi fetalni serum u hranljivoj podlozi, sa DNK sistemom lentiviralnog konstrukta (Merten et al., 2011, Hum Gene Ther.22(3):343-56). Prisustvo komponente dobijene od ove životinje u kulturi čini bezbednosni rizik koji ograničava GMP usklađenost postupka. Dodatno ovaj postupak proizvodnje veoma je ograničen u smislu podizanja na viši nivo i nije prilagodljiv proizvodnji velikih količina čestica vektora potrebnih za terapeutske, komercijalne i/ili industrijske primene genske terapije. Na primer, trenutni uobičajeni postupak omogućava generisanje u jednoj seriji, i pre prečišćavanja, od 24 do 48 L suspenzije lentiviralnih vektora pri titru od približno 1x10<7>do 3x10<7>funkcionalnih čestica vektora po mL koja, sa standardnim prečišćavanjem prinosa od 20%, generiše najviše 3x10<11>čestica u krajnjem proizvodu. Poređenja radi, faza I kliničkog ispitivanja zahteva najmanje 5 x 10<11>funkcionalnih lentiviralnih čestica vektora (McGregor et al., 2001, Hum Gene Ther., 12:2028-2029). Prema tome danas postoji velika potreba za industrijskim procesima bioproizvodnje lentiviralnog vektora, koji mogu da se prilagođavaju potrebi za dovoljnim količinama terapeutskih vektora bilo kada je potrebna velika količina vektora za pacijenta, bilo kada se veliki broj pacijenata mora tretirati ili da bi se jednostavno troškovi održavali na razumnim nivoima i održala dobra usaglašenost prakse proizvodnje (GMP).
[0004] Jedan potencijalni pristup ka poboljšanju je upotreba ćelijskih kultura u suspenzionom uzgajanju u hemijski kondicioniranoj podlozi bez goveđeg fetalnog seruma (FBS) kako bi se zaobišao bezbednosti rizik povezan sa upotrebom FBS, ali i potreba za nosačima ćelijske kulture koji predstvaljaju glavnog krivca za manjak skalabilnosti uobičajenih postupaka. Na primer, nedavno je opisana proizvodnja viralnih vektora tranzijentnom transfekcijom u suspenzionim kulturama bez seruma. Određenije, Ansorge et al. predlažu postupak za proizvodnju lentivirusa tranzijentnom transfekcijom u suspenziji uzgajanih HEK293SF-3F6 ćelija u perfuzionim kulturama (Ansorge et al., 2009, J Gene Med, 11: 868-876). Međutim, predloženi postupak je i komplikovan i ograničen u količini proizvodnje. Zaista, postupak predložen od strane Ansorge et al. izvodi se u perfuzionim kulturama koje zahtevaju nekoliko faza sakupljanja i komplikovane kontrolne mere. Dodatno, proizvodnja predložena u toj studiji ograničena je na zapreminu od 3 litra. Segura et al. takođe predlažu postupak za proizvodnju lentiviralnih vektora tranzijentnom transfekcijom suspenzionih kultura (Segura et al., 2007, Biotechnology and Bioengineering, 98 (4): 789-799). Međutim, predloženi postupak je komplikovan jer zahteva nekoliko faza sakupljanja sa ukupnom zamenom podloge na dane 3, 4 i 5 posle transfekcije i kompleksne kontrolne mere. Dodatno, proizvodnja viralnog vektora ograničena je na zapreminu od 3 litra, a prijavljeno je da je samo proizvodnja rekombinantnog proteina, a ne i proizvodnja viralnog vektora, povećana na 60 L-skalu. Shodno tome, i pored ovih izveštaja, ostaje potreba za razvojem direktnog industrijskog postupak za proizvodnju lentiviralnog vektora iz suspenzione ćelijske kulture koja odgovara i na kvatitativna i kvalitativna pitanja koja se postavljaju nakon proizvodnje vakcine na bazi lentivirusa i/ili proizvoda genske terapije na komercijlanoj skali. Ovaj pronalazak odgovara na i ispunjava ove potrebe obuhvatajući optimizovan postupak proizvodnje ćelijske kulture i lentivirusa, što rezultira u poboljšanoj virusnoj produktivnosti.
SUŠTINA OVOG PRONALASKA
[0005] Ovaj pronalazak odnosi se na postupak za masovnu proizvodnju rekombinantnih lentiviralnih vektora farmaceutske čistoće. U nastavku prikazani rezultati pokazuju da su pronalazači uspeli da obezbede postupak koji je dobar kao ili bolji u smislu produktivnosti i kvaliteta od postojećih GMP postupaka proizvodnje, primenom adherentnih ćelija, ali koji imaju skalabilniji potencijal proizvodnje.
[0006] Tako, ovo otkriće obezbeđuje postupak za proizvodnju rekombinantnog lentiviralnog vektora, lentivirusa i pseudovirusa, koji obuhvata:
– kultivisanje, u suspenziji u podlozi bez seruma, ćelija sisara transfektovanih najmanje jednim plazmidom prilagođenim za proizvodnju lentiviralnog vektora, pri čemu se kultivisanje izvodi u zapremini od najmanje 5 L;
– sakupljanje proizvedenog rekombinantnog lentiviralnog vektora iz hranljive podloge.
[0007] U ovom pronalasku, ćelije sisara su humane embrionske bubrežne 293T ćelije (koje se takođe nazivaju HEK293T ćelije ili 293T ćelije) koje mogu da se uzgajaju u suspenziji pod uslovima bez seruma. Pronalazači su pokazali da su ove ćelije posebno pogodne za industrijalizaciju proizvodnje velikih količina rekombinantnog lentiviralnog vektora koji ispunjava i kvantitativne i kvalitativne zahteve za upotrebu u terapiji, određenije kliničkim ispitivanjima genske terapije i komercijalnim primenama.
[0008] U posebnom primeru izvođenja, lentiviralni vektori sakupljaju se između 36 sati i 72 sata posle transfekcije, poželjno nakon 48 sati. U ovom pronalasku, primenjuje se kultura u najmanje 50 L-skali, poželjno od najmanje 100 L, a naročito može biti prolagođena za industrijsku proizvodnju lentiviralnih vektora omogućavajući sakupljanje od najmanje 10<7>zaraznih genoma IG/mL. Postupak ovog pronalaska je prvi ikada koji omogućava industrijsku proizvodnju lentivirusa, a veoma visoki nivoi viralnih vektora postižu se kako je pokazano linearnošću u povećavanju od 100 mL do 50 L prisutnih u eksperimentalnom delu. Prema tome, veoma visoki nivoi viralnih vektora mogu se postići implementiranjem ovog postupka (na primer, na skali od 1000 L). U još jednom poželjnom primeru izvođenja, faza sakupljanja sastoji se od jednog sakupljanja lentivirusa. Koliko je pronalazačima poznato, ovo je prvo prijavljivanje proizvodnje lentiviralnih vektora na tako visokoj skali koja primenjuje jedno sakupljanje. Ovaj primer izvođenja ima prednost u tome što obezbeđuje direktan postupak koji zahteva svega nekoliko faza i omogućava kontrolu troškova.
[0009] Dodatno, ovaj pronalazak takođe se odnosi na gornji postupak u kojem transfekcija ćelija predstavlja tranzijentnu transfekciju, a faza sakupljanja sastoji se od jednog sakupljanja izvedenog između 48 i 72 sata posle transfekcije.
[0010] Ovaj pronalazak dalje obuhvata optimizaciju u transfekcionom postupku pre kultivisanja ćelija za proizvodnju lentivirusa. U posebnom primeru izvođenja, ćelije se transfektuju mešavinom polietilenimina (PEI) i plazmida. U specifičnom primeru izvođenja, gornji postupak obuhvata fazu transfekcije u kojoj se ćelije transfektuju takvom mešavinom PEI i plazmida. U posebnoj varijanti, transfekcija se izvodi sa ukupnom količinom DNK plazmida od najmanje 1.5 µg/10<6>ćelija. U još jednoj specifičnoj varijanti, PEI je 20 - 25 kD linearni PEI. U još jednom specifičnoj varijanti, optimizacija obezbeđena ovim pronalaskom takođe se odnosi na relativne količine svake komponente mešavine. Određenije, u specifičnoj varijanti ovog pronalaska PEI i plazmidi umešavaju se pre transfekcije u skladu sa N/P odnosom od manjim od 10, pri čemu se N/P odnosi na broj atoma azota u PEI po oligonukleotidnom fosfatu. U poželjnoj varijanti, N/P odnos je oko 6. U daljoj specifičnoj varijanti, takođe je ispitiano vreme kontakta između PEI i plazmida pre dodavanja ćelijskoj kulturi i idealno može biti između 5 i 30 minuta, pri čemu vreme kontakta određenije iznosi oko 10 minuta.
[0011] Postupak za proizvodnju ovog pronalaska poželjno se može optimizovati dodavanjem natrijum butirata ćelijskoj kulturi 24 sata posle transfekcije, bez menjanja podloge. Poželjno, natrijum butirat dodaje se kulturi do krajnje koncentracije od između 2 mM i 12 mM, određenije između 2 mM i 10 mM ili između 5 mM i 12 mM (na primer oko 5, 8 ili 12 mM), još određenije do krajnje koncentracije od 5 mM.
[0012] U daljem primeru izvođenja postupka ovog pronalaska, plazmidi transfektovani u ćelijama obuhvataju četiri plazmida, uključujući plazmid koji kodira proteine omotača (Env plazmid), koji mogu biti izvedeni iz lentivirusa o kojima je reč, ali takođe mogu biti izvedeni iz drugih virusa sa omotačem, plazmid koji kodira lentiviralni Gag i Pol proteine (Gag-Pol plazmid), plazmid koji kodira lentiviralni Rev protein (Rev plazmid) i plazmid koji obuhvata ekspresionu kasetu transgena od interesa (TOI) između lentiviralnog 3'-LTR i lentiviralnog 5'LTR (TOI plazmid).
[0013] U daljem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje uređaj za kultivisanje ćelija (ili biorekator), pri čemu pomenuti uređaj za kultivisanje sadrži zapreminu od najmanje 50 L hranljive podloge bez seruma koji obuhvata HEK293T ćelije transfektovane najmanje jednim plazmidom prilagođenim za proizvodnju lentiviralnog vektora, pri čemu se pomenute ćelije uzgajaju u suspenziji u pomenutom uređaju za kultivisanje.
[0014] U još jednom aspektu, ovaj pronalazak odnosi se na postupak za optimizovanje proizvodnje lentiviralnog vektora HEK293T ćelijom uzgajanom u suspenziji u podlozi bez seruma, transfektovane plazmidima potrebnim za pomenutu proizvodnju, koji obuhvata dodavanje natrijum butirata 24 sata posle transfekcije kulturi bez menjanja hranljive podloge. Poželjno, natrijum butirat dodaje se do krajnje koncentracije od 5 mM.
DETALJAN OPIS OVOG PRONALASKA
[0015] Ovaj pronalazak odnosi se na postupak za masovnu proizvodnju rekombinantnih lentiviralnih vektora farmaceutske čistoće. Proizvedeni vektori mogu biti korisni za tretiranje stanja kod životinjskog subjekta, određenije sisara, još određenije humanog subjekta kome je to potrebno.
Plazmidi za proizvodnju lentivirusa
[0016] Lentivirusi su egzogeni retrovirusi sisara i obrazuju jedan rod retroviridee. Lentiviralni vektori (LV) izvedeni su iz brojnih primatnih lentivirusa kao što je virus humane deficijencije (HIV)-1 ili -2, ili razni virusi simijan imunodeficijecije (SIV), ili iz neprimatnih lentivirusa kao što je virus konjske zarazne aneme (EIAV), virus mačije imunodeficijencije (FIV), ili koziji artritis-encefalitis virus (CAEV).
[0017] Lentiviralne komponente korisne za proizvodnju rekombinantnog lentiviralnog vektora poznate su u struci. Videti na primer Zufferey et al., 1997, Nat. Biotechnol.15:871-875 i Dull et al., 1998, J. Virol.
72(11):8463-8471. Sistem lentiviralnog vektora "druge generacije" odnosi se na sistem pakovanja kojem nedostaju funkcionalni dodatni geni, kao što je onaj iz kojih su dodatni geni vif, vpr, vpu i nef, obrisani ili inaktivirani (Zufferey et al., navedeno gore). Sistem lentiviralnih vektora "treće generacije" odnosi se na lentiviralni sistem pakovanja koji ima karakteristike vektorskog sistema druge generacije, a kojem i dalje nedostaje funkcionalni tat gen, kao što je onaj iz kojeg je tat gen obrisan ili intaktiviran. Tipično, gen koji kodira Rev obezbeđen je na odvojenom ekspresionom konstruktu (Videti, npr., Dull et al., navedeno gore). Za noviji rezime lentiviralnih vektornih sistema koji se mogu primeniti za proizvodnju rekombinantnog lenviralnog vektora, videti takođe Schweizer and Merten, 2010, Current Gene Therapy 10(6), 474-486, određenije deo 2.2 ("lentiviralni vektorski sistemi"). Schweizer and Merten opisuju postupke koji nisu podložni industrijalizaciji.
[0018] Različite funkcije potrebne za proizvodnju lentiviralnog vektora mogu biti obezbeđene u ćelijama bilo kojim brojem plazmida. Određenije, ove fukcije mogu se obezbediti sa najmanje jednim, dva, tri ili četiri plazmida. U posebnom primeru izvođenja ovog pronalaska, različite funkcije potrebne za proizvodnju lentiviralnog vektora obezbeđena su u 293T ćeliji (uzgajanjem u suspenziji pod uslovima bez seruma) pomoću transfekcije, određenije tranzijentne transfekcije, četiri plazmida prilagođena za proizvodnju lentiviralnih vektora, pri čemu jedan plazmid kodira proteine omotača (Env plazmid), jedan plazmid kodira lentiviralne Gag i Pol proteine (Gag-Pol plazmid), jedan plazmid kodira lentiviralni Rev protein (Rev plazmid) i jedan plazmid obuhvata ekspresionu kasetu transgena od interesa (TOI) između lentiviralnog 3'-LTR i lentiviralnog 5'LTR (TOI plazmid).
[0019] Svaka funckija (ili komponenta) može se izvesti iz bilo kog pogodnog lentivirusa. Međutim, u poželjnom primeru izvođenja, gag-pol, rev i lentiviralni genom (3'-LTR i 5'LTR) izvedeni su iz HIV virusa, određenije iz HIV-1 ili HIV-2.
[0020] Dodatno, rekombinantni lentiviralni vektor može biti pseudoklasifikovani vektor, koji obuhvata modifikovani protein omotača, koji protein omotača izveden je iz različitog virusa ili himernog proteina omotača. Shodno tome, na primer, Env plazmid može kodirati VSV-G Env protein, iako će stručnjak ceniti to što se i drugi env geni mogu primeniti.
[0021] Naravno, TOI upotrebljeni u plazmidu(ima) zavisi od specifične upotrebe namenjenje za lentiviralni vektor. Ilustrativni, neograničavajući primeri za TOI uključuju TOI koji kodira terapeutsku RNK (npr. TOI koji kodira antisens RNK komplementarnu ciljanoj RNK ili DNK sekvenci), TOI genske terapije koji kodira protein defektan ili odustan kod obolelog subjekta, i TOI u vakcini koji se koristi za DNK vakcinaciju, tj. koji kodira protein čija ekspresija indukuje vakcinaciju organizma primaoca protiv pomenutog proteina.
Suspenzione ćelije sisara
[0022] Ćelije sisara za proizvodnju lentivirusa poznate su u struci. Reprezentativni primeri takvih ćelija uključuju Humane embrionske bubrežne (HEK) 293 ćelije i njihove derivate (na primer 293SF-3F6 liniju) odabrane zbog njihove sposobnosti da rastu u suspenziji pod uslovima bez seruma i koje su idealno veoma transfektabilne. Druge ćelijske linije uključuju, ali nisu ograničene na, HeLa ćelije, A549 ćelije, KB ćelije, CKT1 ćelije, NIH/sT3 ćelije, Vero ćelije, Ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), ili bilo koja eukariotska ćelija koja podržava životni ciklus lentivirusa.
[0023] U ovom pronalasku, ćelije predstavljaju 293T ćelije, koje su dobro poznate u struci.293T komercijalno su dostupne od mnogih dobavljača. Ove ćelije odgovaraju ćelijskoj liniji izvedenoj iz humane embrionske bubrežne ćelije transformisane sa SV40 velikim-T antigenom kome je potreban goveđi fetalni serum za rast. Specifično, HEK 293 ćelijska linija originalno je izvedena iz humanih embrionskih bubrežnih ćelija transfektovanih fragmentima mehanički smaknutog humanog adenovirusa tipa 5 (Ad5) putem selekcije ćelija koje pokazuju mnoge karakteristike Ad transformacije.
Transformacioni region humanog adenovirusa sadrži rani region 1 (E1), koji se sastoji od dve transkripcione jedinice, E1a i E1b, čiji su proizvodi potrebni i dovoljni za transformaciju ćelija sisara putem Ads. Ove 293 ćelije predstavljaju podklon originalnih Frank Graham 293 ćelija koje se biraju za veći prinos virusa (verovatno adenovirusa) i bolji rast ćelija (Graham et al, 1977, J Gen Virol, 36, 59-74). Iz HEK 293 ćelije, 293T ćelijska linija konstruisana je u laboratoriji Michele Calos (Stanford University) transfekcijom genom koji kodira SV-40 T-antigen i neomicin rezistentan gen.
Adherentne 293T ćelije prethodno su korišćene za proizvodnju lentiviralnih vektora. Međutim, pronalazači ovog pronalaska prvi su predložili efikasan postupak za proizvodnju lentiviralnih vektora iz ovih ćelija prilagođenih za uslove uzgajanja u suspenziji bez seruma radi prilagođavanja za masovnu proizvodnju lentiviralnih vektora. Zaista, u primerima ove prijave, pronalazači po prvi put predstavljaju postupak za proizvodnju lentiviralnih vektora čije je povećanje linerano od 100 mL do 50 L. Prema tome, implementiranjem ovog postupka mogu se postići veoma visoki nivoi viralnih vektora (na primer, na skali 1000 L).
[0024] Ćelije se uzgajaju u podlozi bez seruma odabrana u odnosu na specifične ćelije koje se koriste i koja omogućava proizvodnju lentiviralnog vektora. Podloga bez seruma omogućava proizvodnju lentiviralnog vektora pogodnog za terapeutske primene. Za pregled podloge bez seruma, videti Poglavlje 9 (podloga bez seruma) iz Culture of Animal Cellse: A Manual of Basic Technique; Ed. Freshen, RI, 2000, Wiley-Lisps, pp.89-104 i 105-120. Uopšteno, podloga bez seruma manipuliše se radi pojačavanja rasta respektivne ćelijske linije u kulturi, sa potencijalom za inkluzijom bilo kojeg od sledećeg: selekcija izlučenih ćelijskih proteina, difuzivnih nutrijenata, aminokiselina, organskih i/ili neorganskih soli, vitamina, metala u tragovima, šećera, i lipida kao i verovatno drugih jedinjenja kao što su supstance za promovisanje rasta (npr., citokini). Takođe je poželjno da je takva podloga dopunjena glutaminom ili alternativom glutamina kao što je GlutaMAX™, kako je ovde opisano. Takve podloge komercijalno su dostupne, a daljim upoznavanjem sa ovim pronalaskom stručnjak će moći da odabere pogodnu u odnosu na ćelije sisara domaćina. Ta podloga može biti dopunjena aditivima kao što je nejonski surfaktant kao što je Pluronic® F68 (Invitrogen, kataloški Br.24040-032), koji se koristi za kontrolisanje sila smicanja u suspenzionim kulturama, agens protiv stvaranja grudvica (npr. od Invitrogen, kataloški Br.0010057AE) i L-glutamin ili alternativa L-glutaminu kao što je L-alanil-L-glutamin dipeptid, npr.
GlutaMAX™ (Invitrogen, kataloški Br.35050-038). Podloga i aditivi koji su korišćeni u ovom pronalasku poželjno su GMP kompatibilni. Na primer, reprezentativna komercijalno dostupna podloga bez seruma koja se može primeniti za uzgajanje 293T ćelija u suspenziji uključuje F17 medium® (Invitrogen) i Ex-Cell 293® (SAFC). Određenije, 293T ćelije mgu se uzgajati u prilagođenoj F17 medium® dopunjenoj sa aditivima koji sprečavaju obrazovanje ćelijskih agregata. Određenije, pokazano je da je postupak ovog pronalaska poboljšan kada je F17 medium® dopunjena sa Pluronic® F68 između 0,05% i 0,1% i još određenije sa 0,08%, , GIBCO® agens protiv zgrušnjavanja od između 0,01% i 0,1% i još određenije 0,01% i GlutaMAX™ između 2 i 6mM i još određenije pri krajnoj koncentraciji od 4 mM. Ovi aditivi koji se koriste u pomenutim količinama poželjni su jer omogućavaju optimalno sprečavanje 293T ćelijskih ageragata.
[0025] Poželjno, podloga i aditivi koji se koriste u ovom pronalasku su bez seruma i životinjskih komponenti, u skaldu sa GMP i time omogućavaju industrijsku proizvodnju lentiviralnih vektora za upotrebu u životinjskoj, određenije ljudskoj terapiji.
[0026] U posebnom primeru izvođenja, ćelije se mogu primeniti pri ćelijskoj gustini koja iznosi između 0.8 i 1.3x10<6>ćelija/mL.
Tranzijentna transfekcija
[0027] U postupku ovog pronalaska 293T ćelije kakve su prethodno opisane, transfektovane su sa jednim ili više plazmidima(ima) prilagođenim za proizvodnju lentiviralnog vektora. Poželjno, transfekcija je tranzijentna transfekcija.
[0028] Razne tehnike koje su poznate u struci mogu se koristiti za uvođenje molekula nukleinske kiseline u ćelije. Takve tehnike uključuju hemijski olakšanu transfekciju primenom jedinjenja kao što su kalcijum fosfat, katjonski lipidi, katjonski polimeri, lipozomima posredovana transfekcija, nehemijski postupci kao što je elektroporacija, bombardovanje česticama, ili mikroubrizgavanje, i zaražavanje virusom koji sadrži molekul nukleinske kiseline od interesa (ponekad nazvano "transdukcija").
[0029] Međutim, u skladu sa poželjnim primerom izvođenja ovog pronalaska, tranzijentna transfekcija izvodi se primenom polietilenemina (PEI) kao reagensa transfekcije. PEI poseduje aktivnost transfera gena u mnoge ćelijske linije pokazujući nisku citotoksičnost, povoljan je i prema tome kompatibilan sa primenama u masovnoj proizvodnji. Ovaj polimer dostupan je i kao linearni i razgranati izomer širokog spektra molekulske mase i polidisperziteta, koji fizičkohemijski parametrima su kritični za efikasnost aktivnosti transfera gena (Godbey W. T. et al., J. Control Release, 60,149160 (1999). U posebnom primeru izvođenja, PEI korišćen u ovom pronalasku je 20 - 25 kD linearni PEI. Na primer, u posebnom primeru izvođenja, PEI korišćen u ovom pronalasku je JetPEI® ili PEIPro® (oba dostupna od PolyPlus). JetPEI® i PEIPro® transfekcioni reagensi su linearni polietileniminski derivati, bez komponenti životinjskog porekla, koji obezbeđuju veoma efektivnu i reproduktivnu dostavu gena. Drugi PEI ili katjonski polimeri slični po strukturi za transfekcione ćelije opisani su u U.S. Patentu Br.6,013,240 i EP Patentu Br.0770140.
[0030] Plazmidi i PEI umešavaju se pre dodavanja u hranljivu podlogu.
[0031] N/P odnos predstavlja meru jonskog balansa kompleksa. U slučaju implementacije JetPEI® ili PEIPro®, odnosi se na broj ostataka azota od JetPEI® po oligonukleotidnom fosfatu. Poželjno, N/P odnos je ispod 10. U specifičnom primeru izvođenja, ovaj odnos je oko 6. Optimiziranjem ovog odnosa omogućava se optimalan prinos lentiviralnog vektora proizvedenog transfektovanim ćelijama povezanim sa ograničenom toksičnošću.
[0032] Vreme tokom kojeg su plazmidi i PEI u kontaktu pre faze transfekcije per se takođe je značajan parametar, u cilju pravilnog kompleksovanja plazmidne DNK u PEI molekulima. Pronalazači su uspeli da pokažu da dovođenje u kontakt plazmida sa PEI tokom 5 do 30 minuta rezultira kao mešavina sa veoma dobrim transfekcionim kapacitetom. Poželjno, vreme kontakta iznosiće oko 10 minuta kako bi se optimizovalo obrazovanje transfekcionog kompleksa.
[0033] Molarni odnos između različitih plazmida koji se koriste za proizvodnju lentivirusa, takođe se mogu prilagoditi za optimizovanje povećanja ove proizvodnje. Zahvaljujući ovde obezbeđenim rezultatima, stručnjak će biti u mogućnosti da prilagodi ovaj parametar specifičnim plazmidima koje koristi za proizvodnju lentivirusa od interesa. Na primer, pronalazači su pokazali da odnos od 1:1:2:1 (Env plazmid:Gag-Pol plazmid:Rev plazmid:TOI plazmid) vodi ka robusnijoj transfekciji i zadovoljavajućoj proizvodnji lentivirusa u odnosu na lentiviruse prikazane u primerima. Naravno, stručnjak može da prilagodi ovaj odnos specifičnim lentivirusima koji se zahtevaju. Taj odnos može se lako prilagoditi za svaku novu situaciju (npr. u odnosu na svaki specifični plazmidni vektor koji se koristi za transfekciju) na osnovu učenja ovog pronalaska (videti primere ispod) i opšteg znanja iz oblasti proizvodnje rekombinantnih lentivirusa. Određenije, molarni odnos plazmida uzima se u obzir radi optimizovanja kvantiteta svakog od ovih plazmida. Pojam da se koriste molarni odnosi umesto masenih odnosa nije očigledan u oblasti ovog pronalaska, pri čemu se maseni odnosi generalno koriste za određivanje kvantiteta svakog plazmida potrebnog za proizvodnju viralnog vektora.
[0034] Stručnjak može adaptirati postupak transfekcije određenoj ćelijskoj kulturi koja se primenjuje. Određenije, količina ukupne DNK (koja određenije obuhvata četiri plazmida potrebna za proizvodnju rekombinantnog lentivirusa) može varirati. Međutim, u specifičnom primeru izvođenja ovog pronalaska, ova količina biće najmanje 1.5 µg/10<6>ćelija. U posebnom primeru izvođenja, količina je najmanje 2 µg/10<6>ćelija, određenije najmanje 2.5 µg/10<6>ćelija. U poželjnom primeru izvođenja, količina ukupne DNK je oko 2 µg/10<6>ćelija.
Ćelijska kultura
[0035] Nakon transfekcije, na primer nakon dodavanja mešavine DNK i PEI ćelijskoj kulturi, ova ćelijska kultura ostavlja se da raste tokom nekog perioda koji može biti obuhvaćen između 36 i 72 sata posle transfekcije, određenije nakon 48 sati.
[0036] U posebnom primeru izvođenja, podloga koja se koristi za kultivisanje ćelija ista je kao i podloga koja se koristi za transfekciju pomenutih ćelija. Na primer, u slučaju transfekcije mešavinom PEI i plazmidom(ima), mešavina može biti pripremljena u F17 medium®, a ćelije se takođe mogu uzgajati u pomenutoj F17 medium® nakon transfekcije.
1
[0037] Uzgajanje se može izvesti u brojnim uređajima za kultivisanje kao što su bioreaktori prilagođeni kultivisanju ćelija u suspenziji. Bioreaktor može biti za jednokratnu upotrebu (jednokratan) ili ponovno upotrebljiv bioreaktor. Bioreaktor može na primer biti odabran od nosača kulture ili reaktora sa kesom i rezervoarom. Neograničavajući reprezentativni bioreaktori uključuju stakleni bioreaktor, jednokratne bioreaktore koji koriste umešavanje pokretima protresanja kao što je talasni bioreaktor, jednokratni bioreaktor sa rezervoarom mešalice (Cultibag STR® 50L, Sartorius), ili bioreaktor sa rezervoarom od nerđajućeg čelika. Uzgajanje se izvodi pod kontrolisanim uslovima (npr. pH=7,2, pO2=50%, 37°C i specifičnim umešavanjem u skladu sa sistemom, radi uzgajanja 293T ćelija kakve su prijavljene ovde u priloženim primerima).
[0038] U skladu sa određenim aspektom, ovaj pronalazak takođe se odnosi na uređaj za kultivisanje ćelija (tj. bioreaktor) koji sadrži zapreminu od najmanje 50 L hranljive podloge bez seruma, koji obuhvata HEK293T ćelije transfektovane sa najmanje jednim plazmidom prilagođenim za proizvodnju lentiviralnog vektora, pri čemu su pomenute ćelije prilagođene za rast u suspenziji u pomenutom uređaju za kultivisanje. U posebnom primeru izvođenja, uređaj za kultivisanje sadrži zapreminu od najmanje 100 L, najmanje 200 L ili najmanje 1000 L hranljive podloge bez seruma kakav je prethodno definisan. U drugim primerima izvođenja, podloga bez seruma, uslovi transfekcije, uslovi kultivisanja i ćelije su kao što je prethodno definisano.
[0039] Lentivirus zatim može biti ubran (ili sakupljen), jednom ili više faza sakupljanja. U poželjnom primeru izvođenja, izvodi se samo jedno sakupljanje lentivirusa prisutnih u ćelijskoj kulturi. Ovo je značajan napredak ovog pronalaska u odnosu na stanje tehnike, gde se u dostupnim opisima obično preporučuje nekoliko sakupljanja kulture sa brojnim menjanjem podloga. Ovde, poželjni primer izvođenja koji obuhvata jedno sakupljanje, bez menjanja hranljive podloge radi zasejavanja u bioreaktor do sakupljanja, predstavlja direktan, isplativ industrijski kompatibilan postupak. U određenijem primeru izvođenja, jedno sakupljanje izvodi se 48 sati posle transfekcije. Čestice lentivirusa proizvedene na ovaj način, mogu se sakupiti i prečistiti u skladu sa postupcima poznatim stručnjaku iz ove oblasti.
[0040] Kako je prethodno pomenuto, hranljivoj podlozi može se dodati 2 mM do 10 mM natrijum butirat, koji je poznat da indukuje proizvodnju lentivirusa u sistemima adherentnih ćelija u prisustvu seruma. Neočekivano po pitanju ovih uslova koji se ovde primenjuju (podloga bez seruma i suspenzija kulture), pronalazači su pokazali da se optimizovana proizvodnja u suspenziji kulture bez seruma može obezbediti kada se natrijum butirat dodaje hranljivoj podlozi 24 sata posle transfekcije, a naročito kada se koristi pri koncentraciji od 5 mM.
Dalji predmeti:
[0041] Ovaj pronalazak takođe se odnosi na postupak za masovnu proizvodnju rekombinantnog lentiviralnog vektora, koji obuhvata:
– tranzijentno transfekcione HEK293T ćelije koje mogu za se uzgajaju u suspenziji sa mešavinom PEI i plazmida pogodnih za proizvodnju rekombinantnog lentiviralnog vektora;
– kultivisanje transfektovanih ćelija u podlozi bez seruma u šarži kulture u zapremini od najmanje 50 L; i
– sakupljanje proizvedenog rekombinantnog lentiviralnog vektora iz hranljive podloge.
[0042] U posebnom primeru izvođenja ovog postupka, plazmidi uključuju plazmid koji kodira proteine omotača (Env plazmid), plazmid koji kodira lentiviralne Gag i Pol proteine (Gag-Pol plazmid), plazmid koji kodira lentiviralni Rev protein (Rev plazmid) i plazmid koji obuhvata ekspresionu kasetu transgena od interesa (TOI) između lentiviralnog 3'-LTR i lentiviralnog 5'LTR. U specifičnoj varijanti, transfekcija se izvodi ukupnom količinom DNK od najmanje 1.5 µg/10<6>ćelija. Dodatno, u posebnom primeru izvođenja, ćelije su transfektovane mešavinom polietilenimina (PEI) i DNK, u kojem PEI iznosi 20 - 25 kD linearni PEI. U specifičnoj varijanti, PEI i plazmidi umešavaju se pre transfekcije u skladu sa N/P odnosom manjim od 10 (npr. odnosom od oko 6), pri čemu se N/P odnosi na broj atoma azota u PEI po oligonukleotidnom fosfatu. Vreme kontakta između PEI i plazmida pre dodavanja ćelijskoj kulturi može biti prilagođeno, ali određenije iznosi između 5 i 30 minuta, na primer oko 10 minuta. Natrijum butirat može se dodati ćelijskoj kulturi, na primer 24 sata posle transfekcije bez menjanja podloge. Krajnja koncentracija natrijum butirata u kulturi može biti obuhvaćena između 2 mM i 10 mM. Sakupljanje ćelija može se izvesti kao jedno sakupljanje, određenije jedno sakupljanje između 48 sati i 72 sata posle transfekcije. Postupak ovog pronalaska može se izvesti na skali od najmanje 100 L, ili više. Ovaj postupak određenije može se odnositi na postupak za masovnu proizvodnju lentiviralnih vektora koji omogućava sakupljanje najmanje 10<7>zaraznih genoma/mL, poželjno najmanje 3x10<7>IG/mL.
[0043] Ovaj pronalazak dalje je prikazan neograničavajućim primerima koji slede.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0044]
Fig.1 je grafički prikaz četiri plazmida upotrebljena u ispitivanju koje je prisutno u primerima.
Fig.2 je grafikon koji prikazuje ispitivanje različitih uslova transfekcije u 100 mL spiner posudi sa HEK293F ćelijama i merenje GFP pozitivnih ćelija protočnom citometrijom
Fig.3 je grafikon koji prikazuje ispitivanje različitih uslova transfekcije u 100 mL spiner posudi sa HEK293F ćelijama i merenje količine od p24 HIV kapsid antigena p24 ELISA testiranjem..
Fig.4 je grafikon koji prikazuje ispitivanje različitih uslova transfekcije u 100 mL spiner posudi sa HEK293T i merenje GFP pozitivnih ćelija protočnom citometrijom.
Fig.5 je grafikon koji prikazuje ispitivanje različitih uslova transfekcije u 100 mL spiner posudi sa HEK293T ćelijama i merenje količine od p24 HIV kapsid antigena p24 ELISA testiranjem.
Fig.6 je grafikon koji prikazuje efekat na prinos proizvodnje za dve SFM podloge za generisanje transfekcionog kompleksa (F17 medium® i OptiProSFM®).
Fig.7 je grafikon koji pokazuje transfekciju pri optimalnom molarnom odnosu (1:1:2:1) plazmida na proizvodnju dva različita proizvoda (različiti TOI) različitih veličina. Ogled se izvodi u spiner posudama od 100 mL pod optimalnim uslovima transfekcije.
Fig.8 je grafikon koji pokazuje uticaj strategije dodavanja natrijum butirata na produktivnost, merenje p24 koncentracije u supernatantu
Fig.9 je grafikon koji pokazuje uticaj strategije dodavanja natrijum butirata na produktivnost, merenje koncentracije zaraznih genoma (IG) supernatantu.
Fig.10 je grafikon koji pokazuje uticaj strategije dodavanja natrijum butirata na produktivnost, merenje odnosa fizičkih čestica/zaraznih čestica (PP/IP) u supernatantu.
Fig.11 je grafikon koji prikazuje prosek 6 proizvodnji HIV-VSVG-WASp u spiner posudi od 100 mL uz dodavanje natrijum butirata 24 hpt pri krajnjoj koncentraciji u kulturi od 5 mM.
Fig.12 je grafikon koji pokazuje poređenje između suspenzivnih protokola na 100 mL sa HEK293T uzgajanim u suspenziji u podlozi bez seruma i standardnoj u 10 gomila Ćelijskih fabrika za proizvodnju HIV-VSVG-WASP lentiviralnog vektora, IG rezultate i PP/IP odnos u supernatantu 48 hpt.
Fig.13 je grafikon koji prikazuje procenu suspenzionog postupka ovog pronalaska na različitim skalama (100 mL do 50 L) u različitim uređajima za kultivisanje ćelija (spiner, talasni i kontejner za umešavanje) i poređenje sa konvencionalnim postupkom adherentnih ćelija koji koristi serum.
PRIMERI
[0045] Cilj ovog ispitivanja je da se proizvede lentiviralni vektor u količini kompatibilnoj sa industrijskim primenama, u bioreaktoru u suspenziji u podlozi bez seruma. Poželjno, postupak je razvijen do 50 L, a proizvodnja se lako prilagođava do reaktora od najmanje 100 L, 200L, ili čak najmanje 1000 L.
[0046] Za proizvodnju rekombinantnog lentivirusa, korišćeno je 4 plazmida (videti strategiju sa Fig.1).
Materijali i Postupci
Ćelijska kultura:
1
[0047] Sva proizvodnja vektora i uzgajanje ćelija izvedena su sa radnom bankom ćelija (WCB) za HEK293T uslovljene vazivanjem za podlogu, koje su prvenstveno uzgajane u prisustvu goveđeg fetalnog seruma koji je prilagođen za suspenzioni rast u podlozi bez seruma i ustanovljena je nova radna banka ćelija. Ćelije su kultivisanje u modifikovanoj F17 medium® dopunjena sa Pluronic® F68 (Invitrogen), GIBCO® agensom protiv zgrušavanja (Invitrogen) i 4 mM GlutaMAX™ (Invitrogen). Za opisani razvoj postupka, korišćene su različite posude za kultivisanje pod kontrolisanim uslovima:
– spiner posuda (Techne, UK) za 100mL skalu pod kontrolisanim uslovima (37°C, 120 o/min) – za veću skalu: stakleni bioreaktor (B-DCU® 2L-10L, Sartorius), talasni bioreaktor (Cultibag RM® 10L-25L, Sartorius), jednokratni bioreaktor sa rezervoarom za umešavanje (Cultibag STR® 50L, Sartorius) pod kontrolisanim uslovima (pH=7,2, pO2=50%, 37°C i specifično umešavanje u skladu sa sistemom)
Vektori i plazmidi:
[0048] W1.6-huWASP-WPRE vektor opisan u (Zanta-Boussif et al., 2009, Gene Ther.; 16(5):605-19), proizveden je tranzijentnom transfekcijom 293T ćelija pimenom 4 plazmida koji se sastoje od pCCL W1.6-huWASP-WPREmut6-K transfer plazmida kombinovani sa GagPol, VSV-G, Rev plazmidima koji respektivno kodiraju HIV-1 gag-pol, rev gene, i ne-povezani G glikoprotein vezikularnog stomatitis virusa. Svi plazmidi sadrže kanamicin rezistentan gen. Dalji detalji obezbeđeni su u Merten et al., navedeno gore.
[0049] HIV-VSVG-GFP vektor proizveden je primenom istog reagensa osim za transgeni plazmid koji je pRRLSINcPPT-PGK-eGFP-WPRE.
Natrijum butirat:
[0050] Natrijum butirat komercijalno je dostupan (natrijum butirat ≥98.5% (GC) | Sigma-Aldrich). Koncentrovani rastvor pripremljen je pri 500 mM u F17 medium® napravljenoj po porudžbini i 0,22 filtriranoj.
Podloga:
[0051] F17 medium® (Invitrogen) pripremljen je po pporudžbini dopunjavanjem sa Pluronic® F68 pri 0,08%, GIBCO® agens protiv zgrušavanja pri 0.01 %, i GlutaMAX™ pri krajnjoj koncentraciji od 4 mM.
Proizvodnja lentiviralnog vektora:
[0052] Suspenzivne posude ili kese za uzgajanje zasejana su pri 0,2x10<6>ćelija/mL. Transfekcija je izvedena 72h nakon zasađivanja. Gustina ćelija iznosila je između 0.8 i 1.3x10<6>ćelija/mL u vreme transfekcije.
Primer za WASp proizvodnju (najbolji način rada):
[0053] Četiri plazmida korišćena u ovom ispitivanju, prikazan su na Fig.1. Ispitivane su različite količine ukupne DNK. Ispitivane su različite koncentracije, ali u najoptimalnijim uslovima, ukupna DNK je korišćena pri količini od oko 2 µg/10<6>ćelija. Transfekcioni reagens koji je korišćen bio je JetPEI® (Polyplus product) sa N/P odnosom od oko 6. DNK i JetPEI® respektivno su razblaženi u hranljivoj podlozi pre nežnog umešavanja tokom približno 10 min. Ovo umešavanje dovodi do formiranja transfekcionog kompleksa, koji se direktno dodaje ćelijskoj kulturi. Dvadeset i četiri sata nakon transfekcije, natrijum butirat dodat je u krajnjoj koncentraciji od približno 5mM. Kondicionirane podloge koje sadrže čestice lentiviralnog vektora sakupljene su 72h nakon transfekcije u svrhe analize.
Titracija:
[0054] Proizvedene fizičke čestice izbrojane su merenjem količine od p24 (HIV kapsid protein) primenom specifičnog ELISA kompleta. Zarazne čestice titrirane su posle inficiranja ćelijske linije podložne inficiranju lentiviralnim vektorom primenom qPCR (TaqMan) kako je prethodno opisano u Merten et al. (gore).
Rezultati
A-Opis adaptiranja HEK293T ćelija suspenzionom uzgajanju u hemijski definisanim podlogama bez seruma
-Izvor HEK293T ćelijske linije:
[0055] Ćelije stižu iz bočice adherentne, GMP master (radne) 293T banke ćelija uzgajane u DMEM pri 10% FBS.
-Adaptacija suspenziji u podlozi bez seruma:
[0056] Ćelije su odmrznute u T75 bočici za uzgajanje tkiva (DMEM 10 % FBS). Nakon 2 pasaže i amplifikacije u T175 bočici za uzgajanje tkiva, izvedena je kompletna zamena podloge na adherentnima ćelijama menjajući DMEM sa modifikovanom F17 medium® (podloga bez seruma).48h nakon zamene podloge, sve ćelije su odvojene od podloge, a vijabilnost je i dalje iznosila oko 90%. Ćelije su kontinulano uzgajane u F17 u T175 bočici za uzgajanje tkiva. Nakon 3 pasaže u F17 i amplifikacije u T225 bočici za uzgajanje tkiva, ćelije su zasejane u spiner posudu od 50ml u suspenzionim uslovima (primenom jednokratne spiner posude, Corning). Banka ćelija 54 fiole (50x10<6>ćelije/fiola) 293T ćelija u suspenziji, generisana je na pasažu 8 (P8).
1
-Generisanje banke ćelija.
[0057] Formulacija za kriokonzervaciju bila je: 80% F17, 10% DMSO i 10% metilceluloza 1%.
B-Proizvodnja lentiviralnog vektora koji eskprimira zeleni fluorescentni protein u klasičnim HEK293F vs. HEK293T
[0058] Jedan od ciljeva rada pronalazača bio je da utvrdi postupak proizvodnje lentiviralnih vektora u suspenziji za uzgajanje bez seruma za industrijske primene.
[0059] Prvenstveno, eksperimenti su izvedeni sa HEK293F ćelijskom linijom, komercijalno dostupnom ćelijskom linijom prilagođena za suspenziono uzgajanje bez seruma.
[0060] Kako bi se generisali HIV-GFP lentiviralni vektori pomoću 4-plazmidnog transfekcionog sistema opisanog u (Zanta-Boussif et al., 2009, Gene Ther.; 16(5):605-19), HEK293F ćelije zasejane su u 100 mL spiner posude pri 1E+06 ćelija/mL. Ispitivani su različiti uslovi transfekcije na skali od 100 mL: Varijabilni parametri su: količina ukupne DNK iskorišćena za 1x10<6>ćelija, kao i molarni odnos između 4 plazmida/ 1E+06ćelija. Iako su moguće varijacije u ovim parametrima, vreme kontakta za formiranje kompleksa (10 min) sa transfekcionim reagensom (JetPEI®) i odnos DNK/PEI (N/P=6) bili su fiksni kao optimalni uslovi za proizvodnju lentivirusa.
[0061] DNK/PEI kompleks generisan je u 10mL OptiProSFM® (Invitrogen), hemijski definisanoj podlozi. Nakon 10 minuta kontakta, DNK/PEI kompleks miks dodat je direktno kulturi.
[0062] Kako bi se odredila efikasnost transfekcije, ćelijske kulture analizirane su protočnom citometrijom kako bi se izmerila ekspresija zelenog fluorescentnog proteina.
[0063] Dodatno, supernatanti ćelijske kulture podvrgnuti su p24 ELISA ispitivanju kako bi se izmerila koncentracija HIV p24 kapsid antigena koji je ukazatelj prisustva lentiviralnih čestica.
[0064] Rezultati su prikazani na Fig.2 i 3.
Efikasnost transfekcije 48h posle transfekcije:
[0065] Rezultati pokazuju da čak iako HEK293F mogu da se efikasno transfektuju pod određenim uslovima DNK koncentracije i odnosa (2.5µg, 1:1:1:1 i 1:1:1:2, respektivno), mogu se detekltovati veoma male količine (<50ng/mL) p24 antigena. Količina p24 iznad 150 ng/mL pokazatelj je efikasne proizvdonje lentivirusa dok je niža vrednost suštinski rezultat bez p24. Količina količina p24 može biti u korelaciji sa
1
količinom fizičkih čestica primenom ELISA kompleta (Alliance HIV-1 P24 ANTIGEN ELISA Komplet (480 Test), PerkinElmer) koji obezbeđuju ovu informaciju: 1 ng p24 = 1,2x10<7>PP
C-Proizvodnja HIV-GFP iz HEK293T
[0066] Proizvodnja lentiviralnog vektora HIV-GFP izvedena je u sličnim uslovima primenom HEK293T ćelija. Efikasnost transfekcije i koncentracija p24 antigena u supernatantima ćelijske kulture, određene su 48h posle transfekcije.
[0067] Rezultati su prisutni na Fig.4 i 5.
[0068] Rezultati pokazuju da su pri sličnoj efikasnošću transfekcije (∼90% pri 2 i 2.5µg DNK, odnos 1:1:2:1), HEK293T ćelije efikasnije od HEK293F u generisanju p24 antigena i prema tome HIV čestica lentiviralnog vektora (198 ng/mL i 314ng/mL).
[0069] Kao zaključak, ovi eksperimenti omogućili su određivanje efikasnih uslova za generisanje lentiviralnih vektora u HEK293T ćelijama na maloj skali. Ti uslovi dalje su ispitani radi procene izvodljivosti proizvodnje lentiviralnih vektora u suspenziji bez seruma na skali koja omogućava industrijske primene.
D-Optimizacija postupka proizvodnje lentiviralnog vektora u HEK293T ćelijama u suspenziji bez goveđeg fetalnog seruma
D1-Uklanjanje OptiProSFM® podloge radi generisanja PEI/DNK kompleksa.
[0070] Kako bi se pojednostavio postupak, ispitiana je mogućnost da se generiše PEI/DNK kompleks direktno u F17 medium® kako bi se zaobišla upotreba različitih podloga (OptiProSFM®.). Proizvodnja lentiviralnog vektora izvedena je na 100 mL-skali u spiner posudi primenom transfekcionih uslova određenih u prethodnim eksperimentima, tj., upotrebom HEK293T ćelija, molarnim odnosom plazmida od 1:1:2:1 i 2,5µg ukupne DNK /1x10<6>ćelija. Ćelije i supernatanti sakupljeni su rasi ispitivanja, a rezultati su prikazani na Fig.6.
[0071] Rezultati pokazuju da ne postoji glavna razlika u p24 koncetraciji ukoliko je generisan iz PEI/DNK kompleksovan u Optipro podlozi vs. F17. Upotreba samo F17 podloge kroz postupak, u odnosu na upotrebu dve različite vrste podloga, predstavlja glavno poboljšanje ka adaptiranju postupka na industrijsku skalu.
1
[0072] D2-Značaj upotrebe molarnog odnosa plazmida umesto masenog odnosa plazmida (DNK) u sistemu za proizvodnju – Fleksibilnost postupka zahvaljujući upotrebi molarnog odnosa:
Lentiviralni vektorski sistem proizvodnje korišćen u ovim eksperimentima uključuje 4 plazmida. Tri od njih (Gag-Pol plazmid, VSV-G plazmid i Rev plazmid) uobičajena su za sve lentiviralne vektore budući da kodiraju trans delujuće funkcije potrebne za formiranje samih lentiviralnih čestica, tj. strukturnih elemenata (vektorski kapsid, VSV-G omotač), enzimatičnih proteina (reverzna transkriptaza, integraza), i regulatornog faktora ekspresije (Rev protein). Jedini faktor koji varira je plazmid koji kodira vektorski genom. Kako transgen ekspresione kasete kodirane vektorskim genomskim plazmidom mogu doću u različitim veličinama (različiti promoteri, cDNKe), krajnja količina plazmida potrebnog za generisanje funkcionalnih čestica može varirati od vektora do vektora, i sa različitim ekspresionim kasetama.
[0073] Prema tome, uzimajući u obzir da je molarni odnos 1:1:2:1 (Env plazmid:Gag-Pol plazmid:Rev plazmid:TOI plazmid) dao najbolje rezultate, pronalazači su želeli da verifikuju da se zadržavanjem nepromenjenog molarnog odnosa, mogu održati reproducibilni proizvodni prinosi čak iako veličine plazmida variraju. Zahvaljujući ovom molarnom odnosu,koji održava nepromenjen broj molekula svakog plazmida nezavisno od njihove veličine u osnovnom paru (te prema tome i njihove mase), mogu se garantovati optimalni transfekcioni uslovi bez obzira na proizvod.
[0074] Fig.7 pokazuje primer u kojem se poredi lentiviralni vektor koji kodira cDNK GFP proteina (ukupna veličina plazmida = 7388 bp) sa lentiviralnim vektorom koji kodira cDNK Wiskott-Aldrich proteina (WASp) (ukupna veličina plazmida = 9780 bp).
[0075] Rezultati pokazuju da zadržavanjem odnosa plazmida jednakim u smislu broja molekula (što konverzno utiče na količinu upotrebljenog pojedinačnog plazmida), prinosi lentiviralnih vektora ostaju nepromenjeni. Ovi rezultati ukazuju da se postupak proizvodnje lentiviralnih vektora u HEK293T ćelijama, u suspenziji bez seruma sa ukupno 2.5µg/1E+06 ćelija pri molarnom odnosu od 1:1:2:1 može primeniti za različite vektore nezavisno od veličine. Naravno, iako optimalni, ovi uslovi mogu varirati počevši od ovih vrednosti tako da stručnjak može da prilagodi parametre određenim ćelijama i plazmidima koji se koriste za proizvodnju željenog lentiviralnog vektora
D3-Poboljšanje produktivnosti: upotreba natrijum butirata
[0076] Prijavljeno je da natrijum butirat pojačava proizvodnju lentiviralnih vektora u adherentnom ćelijskom sistemu.(Gasmi et al Mar.1999). Pronalazači su želeli da odrede da li natrijum butirat moga da bude koristan u takvim suspenzionim kulturama. Međutim, ukoliko je to slučaj, upotreba natrijum
1
butirata ne bi trebalo da postupak učini glomaznijim, pri čemu je prioritet da se postupak održi primenjivim u industrijskim primenama. Prema tome pronalazači su odlučili da testiraju da li dodavanje natrijum butirata posle transfekcije bez zamene podloge može da utiče pozitivno na prinose lentiviralnih vektora u prethodno utvrđenim uslovima (HEK293T, suspenziona kultura, bez seruma, 2.5µg/mL plazmid u odnosu od 1:1:2:1).
Eksperimenti su izvedeni u 100 mL-skali, u spiner posudama. Natrijum butirat pripremljen je u po narudžbini pripremljenoj F17 medium® i dodat posle transfekcije do krajnje koncentracije od 5mM. Efekat na proizvodnju lentiviralnog vektora procenjen je merenjem p24 antigena pomoću ELISA i merenjem koncentracije zaraznih čestica primenom qPCR (TaQman), Merenje oba parametra omogućava računanje PP/IP odnosa (ukupan broj čestica u odnosu na zarazne čestice) koji je pokazatelj kvaliteta pripreme lentiviralnog vektora. Kvalitet proizvodnje smatra se prihvatljivim kada je odnos PP/IP između 100-250 (rezultati su obično primećeni za GMP proizvodnju na GENETHON)
[0077] Inicijalno su testirane različite strategije za natrijum butirat dodat u 100 mL spiner posudu. Jedna strategija bila je njegovo dodavanje 6h posle transfekcije direktno kulturi. Još jedna strategija bila je da se izvede potpuna zamena podloge 24h posle transfekcije i doda natrijum butirat u svežu podlogu koja se koristila za resuspendovanje ćelija. Konačno, strategija koja je dala najbolje rezultate bila je da se natrijum butirat dodat direktno kulturi 24h posle transfekcije bez zamene podloge. Napomena: tokom zamene podloge, ćelije su centrifugirane 5min na 500g pre resuspendovanja u svežoj F17.
[0078] Izveden je eksperiment paralelno sa tri spinera kako bi se potvrdili prethodni eksperimenti, a rezultati su na Fig.8, 9 i 10.
[0079] Rezultati pokazuju da dodavanje natrijum butirata do krajnje koncentracije od 5mM, 24h posle transfekcije povećava produktivnost vektora između 3-4 puta u smislu zaraznih čestica i da takođe postoji povećanje količine proizvedenog p24.
[0080] Fig.10 prikazuje odnos PP/IP koji je primenjen za ovaj eksperiment.
[0081] Ovaj grafikon pokazuje da natrijum butirat omogućava ne samo povećanje produktivnosti, već i održava prihvatljiv kvalitet proizvodnje dajućui PP/IP odnos u prihvatljivom opsegu (100-250).
[0082] Glomaznost ove strategije procenjena je upotrebom 6 spinera sa istim protokolom, a rezultati su prikazani na Fig.11.
1
[0083] Ovi eksperimenti potvrđuju da je bolje vreme sakupljanja 48 hpt u skladu sa IG koncentracijom i kvalitetom proizvodnje u odnosu na PP/IP odnos 48 hpt.
E-Uvećanje.
[0084] E1- Demonstriranje da postupak proizvodnje lentiviralnog vektora u u suspenziji-uzgajanim ćelijama bez seruma daje slične razultate kao koncencionalni sistem za proizvodnju lentiviralnog vektora u adherentnim ćelijama u prisustvu seruma.
[0085] Obično, masovne proizvodnje lentiviralnih vektora za ispitivanja ili kliničke svrhe izvode se primenom transfekcije HEK293 adherentnih ćelija u prisustvu seruma. Zbog titara vektora, HEK293T su ćelije koje se najčešće koriste. Protokoli proizvodnje suštinski su bazirani na upotrebi ćelijskih fabrika od 2 gomile i 10 gomila ili ekvivalentnim višekasetnim sistemima. Videti Schweizer i Merten, 2010 Current Gene Therapy 10(6), 474-486, najodređenije do 2.3 ("postupak velike skale, koji uključuje tranzijentnu transfekciju")
[0086] Ovaj protok na bazi adherentnih ćelija poređen je sa prethodno opisanim optimalnim postupkom u kojima su HEK293T ćelije uzgajane u suspenziji bez seruma, i transfektovane sa 2.5µg DNA/1x10<6>ćelija sa molarnim odnosom plazmida od 1:1:2:1 sa natrijum butiratom dodatim pri 5 mM 24 hpt bez zamene podloge.
[0087] Fig.12 pokazuje poređenje između suspenzionog protokola u 100 mL sa HEK293T i standardnog u ćelijskim fabrikama sa 10 gomila za proizvodnju HIV-VSVG-WAS lentiviralnog vektora.
[0088] Rezultati pokazuju da suspenzioni sistem generiše lentiviralne vektore u sličnim prinosima i kvalitetu kao i sistem adherentnih ćelija.
[0089] E2-Demonstriranje da sistem za proizvodnju lentiviralnog vektora u suspenziji bez seruma prema ovom pronalasku može biti podignut i upotrebljen u industrijskim primenama.
[0090] Skalabilnost optimalnog postupka lentiviralne proizvodnje koji je prethodno opisan (HEK293T ćelije u suspenziji bez seruma sa 2.5µg/mL DNK/1e6 ćelije pri odnosom plazmida od 1:1:2:1 sa natrijum butiratom) procenjena je na raznim zapreminama kulture u smislu prinosa čestica (p24 ELISA) i zaraznih čestica (qPCR,TaqMan) u slučaju lentiviralnog vektora HIV-VSVG-WASp. Odnosi PP/IP kakvi su prethodno opisani, izračunati su za svaku skalu i iscrtani u histogramu prikazanom na Fig.13 u
2
poređenju sa rezultatima dobijenim konvencionalnim postupkom proizvodnje u adherentnim ćelijama u prisustvu seruma.
[0091] Rezultati pokazuju da se produktivnost vektora (broj inficirajućih genoma, IG) i kvalitet (PP/IP) novog sistema proizvodnje lentiviralnog vektora održava kroz široki spektar zapremina kultura i da se najpoželjnije porede sa onim dobijenim sa konvencionalnim postupkom proizvodnje koji primenjuje adherentne ćelije uzgajane u podlozi koja sadrži serum (isti kvalitet i produktivnost za sve skale i kompetitivan sa postupkom ćelijskih fabrika).
[0092] Ovi rezultati pokazuju da novi postupak proizvodnje lentiviralnog vektora u suspenziji kombinuje efikasnost sa praktičnošću i prema tome može se upotrebiti u primenama lentiviralnih vektora na industrijskoj skali.

Claims (14)

Patentni zahtevi
1. Postupak za proizvodnju rekombinantnog lentiviralnog vektora, koji obuhvata:
- kultivisanje, u suspenziji u podlozi bez seruma, HEK293T ćelija transfektovanih sa najmanje jednim plazmidom prilagođenim za proizvodnju lentiviralnog vektora, pri čemu se kultivisanje izvodi u zapremini od najmanje 50 L;
- sakupljanje proizvedenog rekombinantnog lentiviralnog vektora iz hranljive podloge.
2. Postupak prema zahtevu 1, u kojem se faza sakupljanja sastoji od jednog sakupljanja lentivirusa.
3. Postupak prema zahtevu 2, u kojem transfekcija predstavlja tranzijentnu transfekciju, a jedno sakupljanje realizuje se između 48 i 72 sata posle transfekcije.
4. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 3, koji obuhvata fazu transfekcije u kojoj se ćelije transfektuju mešavinom polietilenimina (PEI), kao što je 20-25 kD linearni PEI, i plazmida.
5. Postupak prema zahtevu 4, u kojem se transfekcija izvodi sa ukupnom količinom DNK od najmanje 1.5 µg/10<6>ćelija.
6. Postupak prema zahtevu 4 ili 5, u kojem se PEI i plazmidi umešavaju pre transfekcije u skladu sa N/P odnosom manjim od 10, kao što je oko 6, pri čemu se N/P odnosi na broj atoma azota u PEI po oligonukleotidnom fosfatu.
7. Postupak prema bilo kom od zahteva 4 do 6, u kojem vreme kontakta između PEI i plazmida pre dodavanja ćelijskoj kulturi iznosi između 5 i 30 minuta, pri čemu vreme kontakta određenije iznosi oko 10 minuta.
8. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 7, u kojem se natrijum butirat dodaje ćelijskoj kulturi 24 sata nakon transfekcije ćelija bez menjanja podloge, poželjno u kojem se natrijum butirat dodaje ćelijskoj kulturi do krajnje koncentracije u kulturi, koja iznosi između 2 mM i 12 mM, određenije između 2 mM i 10 mM, još određenije do krajnje koncentracije od 5 mM.
9. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 8, u kojoj se ćelije transfektuju sa četiri plazmida uključujući plazmid koji kodira proteine omotača (Env plazmid), plazmid koji kodira lentiviralne GagPol proteine (Gag-Pol plazmid), plazmid koji kodira lentiviralni Rev protein (Rev plazmid) i plazmid koji obuhvata transgen od interesa (TOI) između lentiviralnog 3'-LTR i lentiviralnog 5'LTR (TOI plazmid).
10. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 9, u kojem se proizvodi najmanje 10<7>zaraznih genoma /mL.
11. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 10, u kojem:
- ćelije predstavljaju 293T ćelije;
- transfekcija ćelija izvodi mešavinom PEI i potrebnog(ih) plazmida;
- natrijum butirat dodaje se 24 sata posle transfekcije bez menjanja hranljive podloge; i
- izvodi se jedno sakupljanje proizvedenih lentiviralnih vektora.
12. Uređaj za kultivisanje ćelija, gde pomenuti uređaj za kultivisanje ima zapreminu od najmanje 50 L hranljive podloge bez seruma koja obuhvata HEK 293T ćelije, transfektovane najmanje jednim plazmidom prilagođenim za proizvodnju lentiviralnog vektora, pri čemu se pomenute ćelije uzgajaju u suspenziji u pomenutom uređaju za kultivisanje.
13. Postupak za optimizovanje proizvodnje lentiviralnog vektora HEK 293T ćelijama uzgajanim u suspenziji u podlozi bez seruma, transfektovane plazmidima potrebnim za pomenutu proizvodnju, koji obuhvata dodavanje natrijum butirata 24 sata posle transfekcije ćelijskoj kulturi bez menjanja hranljive podloge.
14. Postupak prema zahtevu 13, u kojem se natrijum butirat dodaje do krajnje koncentracije od 5 mM.
RS20180365A 2011-11-24 2012-11-26 Sa industrijskim farmaceutskim primenama kompatibilan skalabilan proizvodni sistem lentiviralnog vektora RS57066B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161563566P 2011-11-24 2011-11-24
EP11306551 2011-11-24
PCT/EP2012/073645 WO2013076309A1 (en) 2011-11-24 2012-11-26 Scalable lentiviral vector production system compatible with industrial pharmaceutical applications
EP12795778.5A EP2782997B1 (en) 2011-11-24 2012-11-26 Scalable lentiviral vector production system compatible with industrial pharmaceutical applications

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS57066B1 true RS57066B1 (sr) 2018-06-29

Family

ID=48469165

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20180365A RS57066B1 (sr) 2011-11-24 2012-11-26 Sa industrijskim farmaceutskim primenama kompatibilan skalabilan proizvodni sistem lentiviralnog vektora

Country Status (20)

Country Link
US (3) US20140315294A1 (sr)
EP (2) EP3327119A1 (sr)
JP (2) JP6280869B2 (sr)
CN (2) CN104136605B (sr)
AU (1) AU2012342355B2 (sr)
BR (1) BR112014012600A2 (sr)
CA (1) CA2856455C (sr)
CY (1) CY1120103T1 (sr)
DK (1) DK2782997T3 (sr)
ES (1) ES2663815T3 (sr)
HR (1) HRP20180424T1 (sr)
HU (1) HUE036742T2 (sr)
LT (1) LT2782997T (sr)
PL (1) PL2782997T3 (sr)
PT (1) PT2782997T (sr)
RS (1) RS57066B1 (sr)
SG (1) SG11201402584RA (sr)
SI (1) SI2782997T1 (sr)
SM (1) SMT201800174T1 (sr)
WO (1) WO2013076309A1 (sr)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140315294A1 (en) 2011-11-24 2014-10-23 Genethon Scalable lentiviral vector production system compatible with industrial pharmaceutical applications
FR3010720B1 (fr) * 2013-09-16 2017-08-11 Genethon Procede de production de virus enveloppes
FR3014901B1 (fr) 2013-12-17 2017-06-09 Genethon Procede de purification de virus ou vecteurs viraux enveloppes
WO2015097650A1 (en) * 2013-12-23 2015-07-02 Theravectys Lyophilized lentiviral vector particles, compositions and methods
GB201417042D0 (en) * 2014-09-29 2014-11-12 Fkd Therapies Oy Method
PL3294893T3 (pl) 2015-05-13 2024-04-29 Csl Behring Gene Therapy, Inc. Bioprodukcja wektorów lentiwirusowych
CN105483092A (zh) * 2015-10-10 2016-04-13 和元生物技术（上海）股份有限公司 一种中试化生产重组腺相关病毒的新技术
JP2019509275A (ja) * 2016-02-23 2019-04-04 イミューン デザイン コーポレイション マルチゲノムレトロウイルスベクター調製物ならびにそれらを産生および使用するための方法およびシステム
CN116144500A (zh) 2016-04-14 2023-05-23 崔泽尔有限公司 具有恒流泵/管道系统的固定床生物反应器
EP3604547A1 (en) * 2016-04-14 2020-02-05 Trizell Ltd. Fixed-bed bioreactor with constant-flow pump/tubing system
JP7216641B2 (ja) * 2016-09-30 2023-02-01 ライフ テクノロジーズ コーポレイション レンチウイルス製造用無血清懸濁系
CN106867877A (zh) * 2017-02-15 2017-06-20 昆明医科大学第二附属医院 一种密闭式慢病毒载体培养装置和培养方法
JP7325884B2 (ja) 2017-10-31 2023-08-15 グローバル・ライフ・サイエンシズ・ソリューションズ・ユーエスエー・エルエルシー 可撓性バッグ
CA3082450A1 (en) 2017-11-21 2019-05-31 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of autosomal dominant retinitis pigmentosa
WO2019123430A1 (en) 2017-12-21 2019-06-27 Casebia Therapeutics Llp Materials and methods for treatment of usher syndrome type 2a and/or non-syndromic autosomal recessive retinitis pigmentosa (arrp)
AU2018393050A1 (en) 2017-12-21 2020-06-18 Bayer Healthcare Llc Materials and methods for treatment of Usher Syndrome Type 2A
CN110317832B (zh) 2018-03-28 2022-07-05 西比曼生物科技（香港）有限公司 Gmp级规模化制备重组慢病毒载体的纯化制剂的方法
CN110317791A (zh) * 2018-03-29 2019-10-11 西比曼生物科技（香港）有限公司 Gmp级无血清悬浮细胞大规模生产慢病毒的方法
CN108866013B (zh) * 2018-08-06 2021-03-23 武汉赛科成科技有限公司 一种大规模生产慢病毒的方法
JP7538531B2 (ja) * 2018-09-20 2024-08-22 国立大学法人 東京医科歯科大学 レンチウイルスベクター産生の増強方法
CN109401969B (zh) * 2018-12-13 2024-02-02 珠海西格膜生物技术有限公司 一种细胞工厂的管道连接系统及其使用方法
JP7333930B2 (ja) * 2019-01-07 2023-08-28 独立行政法人国立高等専門学校機構 ミミズ細胞の保存方法及びミミズ培養細胞の形質転換方法
WO2021041322A1 (en) 2019-08-23 2021-03-04 Lonza Walkersville, Inc. Methods and constructs for production of lentiviral vector
CN113122501B (zh) * 2019-12-30 2023-06-16 重庆精准生物技术有限公司 适合大规模临床级病毒载体制备的培养基及其应用
EP4150097A1 (en) * 2020-05-15 2023-03-22 Ivexsol, Inc. Compositions and methods for producing stable viral vector producer cells for cell and gene therapy
US20230220417A1 (en) * 2020-05-26 2023-07-13 Expression Therapeutics, Llc Lentiviral System
EP4273236A4 (en) * 2020-12-29 2025-01-08 Jiangsu Genscript Probio Biotech Co., Ltd. HEK293T CELL STRAIN WITH HIGH DISPERSIBILITY AND SCREENING METHODS THEREFOR
GB202100688D0 (en) * 2021-01-19 2021-03-03 Autolus Ltd Process
JP2024538792A (ja) * 2021-10-12 2024-10-23 チアンス、ジェンスクリプト、プロビオ、バイオテック、カンパニー、リミテッド 無血清浮遊培養に適したｈｅｋ２９３細胞株及びその応用
JP2024539033A (ja) * 2021-10-19 2024-10-28 アムジエン・インコーポレーテツド 組換えレンチウイルス産生のための組成物及び方法
AU2023254746A1 (en) * 2022-04-11 2024-10-10 Adverum Biotechnologies, Inc. OPTIMIZATION OF HEK293 SUSPENSION PLATFORM FOR IMPROVED rAAV TITERS

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2722506B1 (fr) 1994-07-13 1996-08-14 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucleiques, preparation et utilisations
US6210922B1 (en) 1998-11-30 2001-04-03 National Research Council Of Canada Serum free production of recombinant proteins and adenoviral vectors
US20030096414A1 (en) 2001-03-27 2003-05-22 Invitrogen Corporation Culture medium for cell growth and transfection
AU2002348151A1 (en) * 2001-11-05 2003-05-19 Genvec, Inc. Viral vector production methods and compositions
GB0702695D0 (en) * 2007-02-12 2007-03-21 Ark Therapeutics Ltd Production of vectors
DK2307551T3 (en) 2008-06-18 2017-03-20 Oxford Biomedica (Uk) Ltd CLEANING RETROVIRAL VECTORS
US20110008894A1 (en) 2009-07-07 2011-01-13 Cayla Lyophilized plasmid/dna transfection reagent carrier complex
US8580554B2 (en) 2009-07-31 2013-11-12 Baxter International Inc. Method of producing a polypeptide or virus of interest in a continuous cell culture
WO2011097447A2 (en) 2010-02-04 2011-08-11 Neurologix, Inc. Production of recombinant virus
BR112013017281A2 (pt) 2011-01-05 2016-09-20 Expression Therapeutics Llc método e sistema para cultura de células em suspensão
US20140315294A1 (en) * 2011-11-24 2014-10-23 Genethon Scalable lentiviral vector production system compatible with industrial pharmaceutical applications

Also Published As

Publication number Publication date
JP2014533516A (ja) 2014-12-15
SI2782997T1 (en) 2018-04-30
US20190211360A1 (en) 2019-07-11
US20140315294A1 (en) 2014-10-23
CN104136605A (zh) 2014-11-05
CY1120103T1 (el) 2018-12-12
CN104136605B (zh) 2018-08-14
LT2782997T (lt) 2018-05-25
BR112014012600A2 (pt) 2017-06-06
AU2012342355A1 (en) 2014-07-17
EP2782997B1 (en) 2018-01-10
ES2663815T3 (es) 2018-04-17
EP2782997A1 (en) 2014-10-01
HUE036742T2 (hu) 2018-07-30
WO2013076309A1 (en) 2013-05-30
SMT201800174T1 (it) 2018-07-17
PT2782997T (pt) 2018-04-09
EP3327119A1 (en) 2018-05-30
CN109097398A (zh) 2018-12-28
JP2018046828A (ja) 2018-03-29
JP6280869B2 (ja) 2018-02-14
HRP20180424T1 (hr) 2018-06-29
CA2856455C (en) 2022-08-23
PL2782997T3 (pl) 2018-06-29
SG11201402584RA (en) 2014-06-27
CA2856455A1 (en) 2013-05-30
US20220235371A1 (en) 2022-07-28
DK2782997T3 (en) 2018-04-16
AU2012342355B2 (en) 2017-10-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS57066B1 (sr) Sa industrijskim farmaceutskim primenama kompatibilan skalabilan proizvodni sistem lentiviralnog vektora
EP4143327A1 (en) Stabilization of polyethyleneimine-deoxyribonucleic acid complex size and activity
JP5778147B2 (ja) 遺伝子導入方法
US8852915B2 (en) Method of retrovirus storage
Williams-Fegredo Developing strategies to enhance transfection efficiency and mitigate auto-transduction in transient lentiviral vector bioprocessing
HK1255189A1 (en) Scalable lentiviral vector production system compatible with industrial pharmaceutical applications
CN115916987A (zh) 填充床生物反应器中的慢病毒载体制造方法
Accordino Lentiviral Vector Production at High Cell Density by Transient Transfection of Suspended Culture HEK Cells
Abdollahpour et al. Upstream insights for lentiviral vector production: cell platforms, culture parameters, and titer yields
US9228206B2 (en) Method for gene transfer
CN121950797A (zh) 一种t细胞偏好型启动子及其生物材料和应用
Park Optimizing Growth and Productivity of Mammalian Cells for Immunotherapeutic Applications
Guy Microscale characterisation of a manufacturing route for lentiviral vectors
HK1179656A (en) Gene introduction method