RS57077B2 - Pegilovana l-asparaginaza - Google Patents

Pegilovana l-asparaginaza

Info

Publication number
RS57077B2
RS57077B2 RS20170778A RSP20170778A RS57077B2 RS 57077 B2 RS57077 B2 RS 57077B2 RS 20170778 A RS20170778 A RS 20170778A RS P20170778 A RSP20170778 A RS P20170778A RS 57077 B2 RS57077 B2 RS 57077B2
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
conjugate
asparaginase
peg
use according
protein
Prior art date
Application number
RS20170778A
Other languages
English (en)
Inventor
Thierry Abribat
Original Assignee
Jazz Pharmaceuticals Ii Sas
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=42670528&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS57077(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from PCT/EP2010/054156 external-priority patent/WO2011003633A1/en
Application filed by Jazz Pharmaceuticals Ii Sas filed Critical Jazz Pharmaceuticals Ii Sas
Publication of RS57077B1 publication Critical patent/RS57077B1/sr
Publication of RS57077B2 publication Critical patent/RS57077B2/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C12N9/82—Asparaginase (3.5.1.1)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis
Stanje tehnike pronalaska
Oblast pronalaska
[0001] Prikazani pronalazak se odnosi na konjugat proteina koji ima u suštini aktivnost L-asparagin aminohidrolaze i polietilen glikol, naročiko kada polietilen glikol ima molekulsku masu manju od ili jednaku oko 5000 Da, naročito konjugat u kome je protein L-asparaginaza iz Erwinia, i njegovu upotrebu u lečenju.
Stanje tehnike
[0002] Proteini koji imaju aktivnost L-asparagin aminohidrolaze, koji su opšte poznati kao L-asparaginaze, se uspešno već nekoliko godina koriste u lečenju akutne limfoblastne leukemije (ALL) kod dece. ALL je najuobičajeni malignitet u detinjstvu (Avramis and Panosyan, Clin. Pharmacokinet. (2005) 44:367-393).
[0003] L-asparaginaza je takođe korišćena u lečenju nehodžkinove bolesti, akutne mijelocitne leukemije, akutne mijelomonocitne leukemije, hronične limfocitne leukemije, limfosarkoma, retikulosarkoma, i melanosarkoma (Kotzia and Labrou, J. Biotechnol. 127 (2007) 657-669). Antitumorna aktivnost L-asparaginaze se veruje da je usled nemogućnosti ili smanjene sposobnosti izvesnih malignih ćelije da sintetizuju L-asparagin (Kotzia and Labrou, J. Biotechnol. 127 (2007) 657-669). Ove maligne ćelije se oslanjaju na ekstracelularno snabdevanje L-asparaginom. Međutim, enzimi L- asparaginaze katalizuju hidrolizu L-asparagina do asparaginske kiseline i amonijaka, na taj način trošeći količine L-asparagina iz krvotoka i ubijajući ćelije tumora koje ne mogu da sitnetišu proteine bez L-asparagina (Kotzia and Labrou, J. Biotechnol.127 (2007) 657-669).
[0004] L-asparaginaza iz E. coli je bio prvi enzimski lek koji je korišćen za terapiju ALL i na tržištu je kao Elspar® u USA ili kao Kidrolase® i L-asparaginaza Medac® u Evropi. L-asparaginaze su takođe bile izolovane iz drugih mikroorganizama, npr. L-asparaginazni protein iz Erwinia chrysanthemi, koji se zove krisantaspaza, koja je na tržištu kao Erwinase® (Wriston Jr., J.C. (1985) "L-asparaginase" Meth. Enzymol. 113, 608-618; Goward, C.R. et al. (1992) "Rapid large scale preparation of recombinant Erwinia chrysanthemi L-asparaginaza", Bioseparation 2, 335-341). Takođe su identifikovane L-asparaginaze iz drugih vrsta Erwinia, uključujući, na primer, Erwinia chrysanthemi 3937 (Genbank Accession #AAS67028), Erwinia chrysanthemi NCPPB 1125 (Genbank Accession #CAA31239), Erwinia carotovora (Genbank Accession #AAP92666), i Erwinia carotovora subsp. Astroseptica (Genbank Accession #AAS67027). Ove L-asparaginaze iz Erwinia chrysanthemi imaju jedna sa drugom oko 91-98% identične aminokiselinske sekvence, dok L-asparaginaze iz Erwinia carotovora su približno 75-77% identične sa aminokiselinskom sekvencom L-asparaginaza Erwinia chrysanthemi (Kotzia and Labrou, J. Biotechnol.127 (2007) 657-669).
[0005] L-asparaginaze bakterijskog porekla imaju visoku imunogenost i antigeni potencijal i često izazivaju neželjene reakcije koje se kreću od blagih alergija do anafilaktičkog šoka kod osetljivih pacijenata (Wang, B. et al. (2003) "Evaluation of immunologic cross reaction of anti-asparaginase antibodies in acute lymphoblastic leukemia (ALL and lymphoma patients), Leukemia 17, 1583-1588). L-asparaginaza E. coli je naročito imunogena, sa zabeleženim prisustvom anti-asparagin antitela na L-asparaginazu E. coli posle i.v. ili i.m. davanja koja dostižu nivo od 78% odraslih i 70% kod dece (Wang, B. et al. (2003) Leukemia 17, 1583-1588).
[0006] L-asparaginaze iz Escherichia coli i Erwinia chrysanthemi se razlikuju u njihovim farmakokinetičkim osobinama i imaju različite imunogene profile, respektivno (Klug Albertsen, B. et al. (2001) "Comparison of intramuscular therapy with Erwinia asparaginase and asparaginase Medac: pharmacokinetics. pharmacodynamics, formation of antibodies and influence on the coagulation system" Brit. J. Haematol. 115, 983-990). Pored toga, pokazano je da antitela koja se razviju posle lečenja sa L-asparaginazom iz E. coli ne reaguju unakrsno sa L-asparaginazom iz Erwinia (Wang, B. et al., Leukemia 17 (2003) 1583-1588). Prema tome, L-asparaginaza iz Erwinia (krisantaspaza) je korišćena za lečenje drugog izbora za ALL kod pacijenata koji reaguju na L-asparaginazu E. coli (Duval, M. et al. (2002) "Comparison of Escherichia coli-asparaginase with Erwinia-asparaginase in the treatment of childhood lymphoid malignancies: results of a randomized European Organisation for Research and Treatment of Cancer, Children’s Leukemia Group phase 3 trial" Blood 15, 2734-2739; Avramis and Panosyan, Clin. Pharmacokinet. (2005) 44:367-393).
[0007] U još jednom pokušaju da se smanji imunogenost u vezi sa davanjem mirobioloških L-asparaginaza, dobijena je L-asparaginaza iz E. coli koja je modifikovana sa metoksi-polietilen glikolom (mPEG). Ovaj postupak je opšte poznat kao "PEGilacija" i pokazano je da menja imunološke osobine proteina (Abuchowski, A. et al. (1977) "Alteration of Immunological Properties of Bovine Serum Albumin by Covalent Attachment of Polietilen glikol," J.Biol.Chem. 252 (11), 3578-3581). Ova takozvana mPEG-L-asparaginaza, ili pegaspargaza, na tržištu kao Oncaspar® (Enzon Inc., USA), je prvobitno odobrena u U.S. kao lečenje drugog izbora za ALL u 1994, i odobrena je kao terapija prvog izbora za ALL kod dece i odraslih od 2006. Oncaspar® ima produženi poluživot in vivo i smanjenu imunogenost/antigenost.
[0008] Oncaspar® je L-asparaginaza E. coli koja je modifikovana na višestrukim lizinskim ostacima pomoću 5 kDa mPEGsukcinimidil sukcinata (SS-PEG) (U.S. Patent No.4,179,337). SS-PEG je PEG reagens prve generacije koji sadrži nestabilnu estarsku vezu koja je osetljiva na enzimsku hidrolizu enzima ili blago alkalne pH vrednosti (U.S. Patent No.4,670,417; Makromol. Chem.1986, 187, 1131-1144). Ove osobine smanjuju i in vitro i in vivo stabilnosti i mogu smanjiti bezbednost leka.
[0009] Dalje, pokazano je da antitela koja su se razvila protiv L-asparaginaze iz E. coli će unakrso reagovati sa Oncaspar® (Wang, B. et al. (2003) "Evaluation of immunologic cross-reaction of antiasparaginase antibodies in acute lymphoblastic leukemia (ALL and lymphoma patients)," Leukemia 17, 1583-1588). Iako ova tela nisu neutralizovana, ovo otkriće jasno pokazuje visoki potencijal unakrsne preosetljivosti ili unakrsne inaktivacije in vivo. Zaista, u jednom izveštaju 30-41% dece koja su primila pegaspargazu je imalo alergijsku reakciju (Wang, B. et al. (2003) Leukemia 17, 1583-1588).
[0010] Pored spoljašnje alergijske reakcije, skoro je zabeležen problem "tihe preosetljivosti", gde pacijenti razvijaju anti-asparaginska antitela bez ispoljavanja bilo kojih kliničkih dokaz o reakciji preosetljivosti (Wang, B. et al. (2003) Leukemia 17, 1583-1588). Ova reakcija može dovesti do obrazovanja neutrališućih antitela na L-asparaginazu E. coli i pegaspargazu; međutim, ovi pacijenti nisu prebačeni na L-asparaginazu Erwinia jer nemaju spoljašnje znake preosetljivosti, i prema tome kod njih je kraće trajanje efikasnog lečenja (Holcenberg, J., J. Pediatr. Hematol. Oncol.26 (2004) 273-274).
[0011] Lečenje L-asparaginaze Erwinia chrysanthemi je često korišeno u slučaju preosetljivosti L-asparaginaze koje potiču iz E. coli. Međutim, primećeno da 30-50% pacijenata koji primaju L-asparaginazu Erwinia su pozitivni na antitela (Avramis and Panosyan, Clin. Pharmacokinet. (2005) 44:367-393). Pored toga, zbog toga što L-asparaginaza Erwinia chrysanthemi ima značajno kraći poluživot eliminacije od L-asparaginaza E. coli, mora se davati češće (Avramis and Panosyan, Clin. Pharmacokinet. (2005) 44:367-393). U ispitivanjeima izvedenim od strane Avramis et al., asparaginaza iz Erwinia je u vezi sa inferiornim farmakokinetičkim profilima (Avramis et al., J. Pediatr. Hematol. Oncol.29 (2007) 239-247). L-asparaginaza E. coli i pegaspargaza prema tome su prema tome poželjni lekovi prvog izbora za ALL u odnosu na L-asparaginazu Erwinia.
[0012] Brojni biofarmaceutici su uspešno PEGilovani i na tržištu su mnogo godina. U cilju kuplovanja PEG sa proteinom, PEG treba da je aktiviran na svom OH kraju. Aktivaciona grupa je izabrana na osnovu dostune reaktivne grupe na proteinu koji treba da se PEGiluje. U slučaju proteina, najvažnije aminokiselinske grupe su lizin, cistein, glutaminska kiselina, asparaginska kiselina, C-terminalna karboksilna kiselina i N-terminalna amino grupa. S obzirom na veoma raznovrsne reaktivne grupe u proteinu gotovo cela peptidna hemija treba da se primeni da bi se PEG deo aktivirao. Primeri za ove aktivirane PEG-reagense su aktivirani karbonati, npr., p-nitrofenil karbonat, sukcinimidil karbonat; aktivni estri, npr., sukcinimidil estar; i za specifična kuplovanja na mestu razvijeni su aldehidi i maleimidi (Harris, M., Adv. Drug Del. Rev.54 (2002), 459-476). Dostupnost različitih hemijskih postupaka za PEG modifikacije pokazuju da svaki novorazvijeni PEGilovani protein će biti posebno ispitivan. Pored hemije, molekulska masa PEG koji je vezan za protein ima jak uticaj na farmaceutske osobine PEGilovanog proteina. U većini slučajeva se očekuje da, što je veća moleksulska masa PEG, dođe do poboljšanja u farmaceutskim osobinama (Sherman, M. R., Adv. Drug Del. Rev.60 (2008), 59-68; Holtsberg, F.W., Journal of Controlled Release 80 (2002), 259-271). Na primer, Holtsberg et al. su ustanovili da, kada je PEG bio konjugovan sa arginin deaminazom, izolovan je drugi enzim za degradaciju aminokiselina iz mikrobiološkog izvora, funkcija farmakokinetike i farmakodinamike enzima je bila provećana jer je molekulska masa PEG privezanog dela povećana od 5000 Da do 20,000 Da (Holtsberg, F.W., Journal of Controlled Release 80 (2002), 259-271).
[0013] Međutim, u dosta slučajeva, PEGilovani biofarmaceutici pokazuju značajno smanjenu aktivnost u poređenju sa nemodifikovanim biofarmaceuticima (Fishburn, C.S. (2008) Review "The Pharmacology of PEGylation: Balancing PD with PK to Generate Novel Therapeutics" J. Pharm. Sci., 1-17). U slučaju L-asparaginaze iz Erwinia carotovora, primećeno je da PEGilacija smanjuje njegovu in vitro aktivnost na približno 57% (Kuchumova, A.V. et al. (2007) "Modification of Recombinant asparaginase from Erwinia carotovora with Polietilen glikol 5000" Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry, 1, 230-232). L-asparaginaza iz Erwinia carotovora je samo 75% homologa sa L-asparaginazom (krisantaspazom) Erwinia chrysanthemi. Za Oncaspar® takođe je poznato da je njegova in vitro aktivnost približno 50% u poređenju sa nemodifikovanom L-asparaginazom E. coli.
[0014] Trenutno dostupni preparati L-asparaginaze ne obezbeđuju alternativne ili komplementarne terapije, -- naročito terapije za lečenje s ALL—koje se karakterišu sa visokom katalitičkom aktivnošću i značajnim poboljšanjem farmakokinetičkih osobina, kao i smanjenom imunogenošću.
KRATKA SUŠTINA PRONALASKA
[0015] Prvi aspekt pronalaska obezbeđuje konjugat za upotrebu u terapiji, konjugat sadrži L-asparaginazu iz Erwinia chrysanthemi koja je bar 90% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:1 i polietilen glikol (PEG), gde PEG ima molekulsku masu manju od ili jednaku oko 5000 Da.
[0016] Prikazani pronalazak se odnosi na konjugat za upotrebu u terapiji proteina koji ima značajnu aktivnost L-asparagin aminohidrolaze i polietilen glikol, gde polietilen glikol ima moleksulsku masu manju od ili jednaku oko 5000 Da, naročito konjugat u kome protein je L-asparaginaza iz Erwinia chrysanthemi koja je bar 90% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:1. U jednom izvođenju, L-asparaginaza je bar oko 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:1. U nekim izvođenjima, PEG ima molekulsku masu od oko 5000 Da, 4000, Da, 3000 Da, 2500 Da, ili 2000 Da. U jednom izvođenju, konjugat ima in vitro aktivnost bar 60%, 65%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% u poređenju sa L-asparaginazom kada nije konjugovana sa PEG. U još jednom izvođenju, konjugat ima aktivnost trošenja L-asparagina od bar oko 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ili 100 puta jaču od Lasparaginaze koja nije konjugovana sa PEG. U još jednom izvođenju, konjugat iscrpljuje nivoe L-asparagina u plazmi do nivoa nemogućnosti detektovanja u toku bar oko 12, 24, 48, 96, 108, ili 120 sati.
[0017] U jednom izvođenju, konjugat ima duži poluživot in vivo u krvotoku u poređenju sa L-asparaginazom koja nije konjugovana sa PEG. U specifičnom izvođenju, konjugat ima duže t1/2od pegaspargaze (tj., PEG-konjugovana L-asparaginaza iz E. coli) davane u ekvivalentoj proteinskoj dozi (npr. mereno u μg/kg). U specifičnijem izvođenju, konjugat ima t1/2od bar oko 58 do oko 65 sati pri dozi od oko 50 μg/kg na osnovu sadržaja proteina, i t1/2od bar oko 34 do oko 40 sati pri dozi od oko 10 μg/kg na bazi sadržaja proteina. U još jednom specifičnom izvođenju, konjugat ima t1/2od bar oko 34 do oko 65 sati pri dozi u opsegu od oko 10,000 do oko 15,000 IU/m<2>(oko 20-30 mg proteina/m<2>). U jednom izvođenju, konjugat ima veću površinu ispod krive (area under the curve - AUC) u poređenju sa L-asparaginazom koja nije konjugovana sa PEG. U specifičnom izvođenju, konjugat ima srednju vrednost AUC koja je bar oko 3 puta veća od pegaspargaze pri ekvivalentoj dozi proteina.
[0018] U jednom izvođenju, PEG je kovalento vezan sa jednom ili više amino grupa (gde "amino grupe" obuhvataju ostatke lizina i/ili N-kraj) L-asparaginaze. U specifičnijem izvođenju, PEG je kovalento vezan za jednu ili više amino grupa sa amidnom vezom. U još jednom specifičnom izvođenju, PEG je kovalento vezan za bar od oko 40% do oko 100% dostupnih amino groupa (npr., ostataka lizina i/ili N-kraja proteina) ili bar od oko 40% do oko 90% ukupnih amino grupa (npr., ostataka lizina i/ili N-kraja proteina). U jednom izvođenju, konjugat ima formulu:
Asp-[NH-CO-(CH2)x-CO-NH-PEG]n
gde Asp je L-asparaginaza, NH je jedna ili više NH grupa ostataka lizina i/ili N-kraja Asp, PEG je polietilen glikolni deo, n je broj koji predstavlja bar oko 40% do oko 100% dostupnih amino grupa (npr., ostaci lizina i/ili N-kraj) u Asp, i x je ceo broj u opsegu od oko 1 do oko 8, određenije, od oko 2 do oko 5. U specifičnom izvođenju, PEG je monometoksi-polietilen glikol (mPEG).
[0019] Konjugat može biti obezbeđen kao farmaceutska kompozicija koja sadrži konjugat prema pronalasku.
[0020] U još jednom aspektu, pronalazak se odnosi na konjugat prema prvom aspektu ovog pronalaska za upotrebu u lečenju bolesti koje se leče trošenjem L-asparagina kod pacijenta. U jednom izvođenju, bolest je kancer. U jednom specifičnom izvođenju, kancer je ALL. U još jednom specifičnom izvođenju, konjugat je za davanje u količini od oko 5 U/kg telesne mase do oko 50 U/kg telesne mase. U još jednom specifičnom izvođenju, konjugat je za davanje u doznom opsegu od oko 10,000 do oko 15,000 IU/m<2>(oko 20-30 mg proteina/m<2>). U nekim izvođenjima, konjugat je za davanje intravensko ili intramuskularno davanje, koje može biti manje od jednom nedeljno (npr., jednom nedeljno ili jednom svake dve nedelje), jednom nedeljno, dva puta nedeljno, ili tri puta nedeljno. U još jednom specifičnom izvođenju, konjugat je za davanje kao monoterapija i određenije bez inhibitora asparagin sintetaze. U još jednom izvođenju, konjugat je za davanje kao deo kombinovane terapije (ali u nekim izvođenjima, kombinovana terapija ne sadrži inhibitor asparagin sintetaze). U još jednom specifičnom izvođenju, pacijent koji se leči je imao povraćaj bolesti, naročito povraćaj koji se javlja posle lečenja sa asparaginazom E. coli ili njenim PEGilovanim oblikom.
KRATAK OPIS NACRTA/SLIKA
[0021]
Slika 1: Elektroforeza na SDS-poliakrilamidnom gelu prečišćene rekombinantne L-asparaginaze Erwinia chrysanthemi. Prečišćena rekombinantna L-asparaginaza Erwinia chrysanthemi (r-krisantaspaza) je analizirana na SDS-PAGE. Trake proteina su bojene sa srebro nitratom. Linija 1: Marker molekulske mase (116, 66,2, 45, 35, 25, 18,4, i 14.4kDa), linija 2: prečišćena rekombinantna L-asparaginaza Erwinia chrysanthemi (r-krisantaspaza).
Slika 2: SDS-PAGE analiza konjugata mPEG-r-krisantaspaze.
Slika 3: Nivoi L-asparagina u plazmi posle jedne intravenske doze Erwinase® (5U/kg, 25U/kg, 125U/kg i 250U/kg telesne mase).
Slika 4: Nivoi L-asparagina u plazmi posle jedne intravenske injekcije konjugata mPEG-r-krisantaspaze u poređenju sa Erwinase® kod miševa. Brojevi "40%" i "100%" ukazuju na približan stepen PEGilacije, respektivno, oko 40-55% (delinično PEGilovan) i oko 100% (maksimalno PEGilovan) dostupnih amino grupa.
Slika 5: Površina ispod krivih (AUC) (zaostala enzimska aktivnost) izračunata iz profila L-asparaginaze posle jedne intravenske injekcije konjugata mPEG-r-krisantaspaze kod miša.
Slika 6: Nivoi L-asparagina u plazmi posle jedne intravenske doze kod miša 2 kDa-100% mPEG-rkrisantaspaze (5U/kg, 25U/kg i 50U/kg telesne mase) (Slika 6A), 5 kDa-100% mPEG-r-krisantaspaze (5U/kg, 25U/kg i 50U/kg telesne mase) (Slika 6B), ili 2 kDa-100% mPEG-r-krisantaspaze (5U/kg), 5 kDa-100% mPEG-r-krisantaspaze (5U/kg), i pegaspargaze (Oncaspar®) (1 U/kg) (Slika 6C). Davanje ekvivalentne količine proteina (10 μg/kg) ili 2 kDa-100% mPEG-r-krisantaspaze (5 U/kg), 5 kDa-100% mPEG-r-krisantaspaze (5 U/kg), ili pegaspargaze (Oncaspar®, 1 U/kg), dovelo je do sličnog trošenja L-asparagina u toku 72 sata.
Slika 7: Odnos doza-efekat 2 kDa-100% PEGilovane r-krisantaspaze u poređenju sa 5 kDa-100% PEGilovanom r-krisantaspazom. Slika 7A pokazuje zaostalu enzimsku aktivnost u plazmi posle jedne intravenske doze 2 kDa-100% PEGilovanog r-krisantaspae pri 5 U/kg (10 μg/kg na osnovu sadržaja proteina), 25 U/kg, i 50 U/kg. Slika 7B pokazuje zaostalu enzimsku aktivnost u plazmi posle jedne intravenske doze 5 kDa-100% PEGilovane r-krisantaspaze na 5 U/kg (10 μg/kg na osnovu sadržaja proteina), 25 U/kg, and 50 U/kg.
Slika 8: Odnos doza –odgovor 2 kDa-100% PEGilovan r-krisantaspaza u poređenu sa 5 kDa-100% PEGilovanim r-krisantaspaza. AUCs zaostale enzimske aktivnosti merene kod miša posle jedne intravenske doze 2 kDa100% ili 5 kDa-100% mPEG-konjugata. Sveukupno, kada su upoređivani na istom doznom nivou, AUCs mereni za 5 kDa-100% mPEG-r-krisantaspazu su bili viši od onih primećenih za 2-kDa-100% mPEG-r-krisantaspazu. Razlika od 31, 37, i 14% je primećena na 5, 25, i 50 U/kg dozama, respektivno.
Slika 9: Farmakokinetika konjugata mPEG-r-krisantaspaze vs. pegaspargaze (Oncaspar®) kod miševa. Slika 9A predstavlja zaostalu enzimsku aktivnost merenu kod miševa posle jedne intraveske doze 2 kDa-100% mPEG-r-krisantaspaze, 5 kDa-100% mPEG-r-krisantaspaze, ili pegaspargaze (Oncaspar®). Slika 9B predstavlja AUCs zaostalu enzimsku aktivnost merenu kod miševa posle jedne intravenske doze od 2 kDa-100% mPEG-rlrisantaspaze, 5 kDa-100% mPEG-r-krisantaspaze, ili pegaspargaze (Oncaspar®).
Slika 10: Nivoi u serumu anti-krisantaspazno specifičnih antitela posle lečenja sa konjugatima mPEG-rkrisantaspaze ili Erwinase®. Antitela su usmerena protiv krisantaspaze. Podaci su izraženi kao srednje vrednosti 6 SD (N=8).
Slika 11: Nivoi u serumu antitkonjugat specifičnih antitela posle lečenja sa maksimalno PEGilovanim konjugatima mPEG-r-krisantaspaze (100%). Slika 11A: Rezultati prikazani kao srednja vrednost 6 SD (n=8); Slika 11B: Rezultati prikazani kao procenti životinja sa vrednostima apsorbance > 0,5 u ELISA anti-konjugata.
DETALJNI OPIS PRONALASKA
[0022] U jednom aspektu, problem koji se rešava pronalaskom je dobijanje preparata L-asparaginaze sa:
- visokom in vitro biološkom aktivnošću;
- stabilnom vezom PEG-protein;
- produženim in vivo poluživotom ;
- značajno smanjenom imugenošću, što je potvrđeno, na primer smanjenjem ili eliminacijom antitela kao odgovora protiv preparata L-asparaginaze koji prati ponovljena davanja; i
- korisnošću kao terapije drugog izbora za pacijente koji su imali razvijenu osetljivost na terapije prvog izbora upotrebom npr. L-asparaginaza koje potiču iz E. coli.
[0023] Ovaj problem ne može biti rešen sa poznatim konjugatima L-asparaginaze, koji imaju ili značajnu unakrsnu reaktivnost sa modifikovanim preparatima L-asparaginaza (Wang, B. et al. (2003) Leukemia 17, 1583-1588), ili koji imaju znatno smanjenu in vitro aktivnost (Kuchumova, A.V. et al. (2007) Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry, 1, 230). Ovaj problem je rešen pomoću prikazanog pronalaska obezbeđivanjem konjugata L-asparaginaze Erwinia sa hidrofilnim polimerom, određenije, polietilen glikolom sa molekulskom masom 5000 Da ili nižom, postupkom za pripremanje takvog konjugata i upotrebom konjugata.
[0024] Ovde je opisana PEGilovana L-asparaginaza iz Erwinia sa poboljšanim farmakološkim osobinama u poređenju sa nemodifikovanim proteinom L-asparaginaze, kao u poređenju sa preparatima pegaspargaze iz E. coli. Konjugat PEGilovane L-asparaginaze koji je ovde opisan je takođe koristan kao terapeutsko sredstvo za upotrebu kod pacijenata koji imaju povraćaj bolesti, npr. povraćaj ALL, i koji su prethodno bili lečeni sa drugim oblikom asparaginaze, npr., sa L-asparaginazom ili PEGilovanom L-asparaginazom iz E. coli.
[0025] Kako je ovde detaljno opisano, konjugat prema pronalasku pokazuje neočekivano superiorne osobine u poređenu sa poznatim preparatima L-asparaginaze kao što je pegaspargaza. Na primer, nemodifikovana L-asparaginaza iz Erwinia chrysanthemi (krisantaspaza) ima značajno niži poluživot od nemodifikovane L-asparaginaze iz E. coli (Avramis and Panosyan, Clin. Pharmacokinet. (2005) 44:367-393). PEGilovani konjugat prema pronalasku ima poluživot koji je veći od PEGilovane L-asparaginaze iz E. coli pri ekvivalentoj proteinskoj dozi.
Definicije
[0026] Osim ukoliko nije eksplicitno drugačije navedeno, izrazi koji su ovde korišćeni će imati uobičajena značenja u ovoj oblasti tehnike.
[0027] Ovde korišćen izraz "obuhvata" označava "obuhvata, bez ograničenja," i izrazi korišćeni u jednini treba da uključuju množinu, i obratno, ukoliko kontekst ne sugreiše drugačije.
[0028] Ovde korišćen izraz "bolesti koje se leče trošenjem asparagina" odnose se na stanje ili poremećaj gde ćelije uključune u to stanje ili poremećaj ili nemaju ili imaju smanjenu sposobnost sinteze L-asparagina. Trošenje ili iscrpljivanje L-asparagina može biti delimično ili suštinski potpuno (npr., do nivoa koji su nedetektabilni pomoću postupaka i uređaja koji su poznati u ovoj oblasti).
[0029] Ovde korišćeni izraz "terapeutski efikasna količina" odnosi se na količnu proteina (npr., asparaginaze ili njen konjugat), potrebnu da izazove željeni terapeutski efekat. Konjugat/jedinjenje/kompozicija prema prikazanom pronalasku podrazumeva konjugat/jedinjenje/kompoziciju za upotrebu u terapiji prema prikazanom pronalasku.
Protein L-asparaginaze
[0030] Protein prema pronalasku je enzim sa aktivnošću L-asparagin aminohidrolaze, naime L-asparaginaze.
[0031] Mnogo proteina L-asparaginaze je identifikovano u ovoj oblasti, izolovano poznatim postupcima iz mikroorganizama. (Videti, npr., Savitri and Azmi, Indian J. Biotechnol 2 (2003) 184-194). Najčešće korišćene i komercijalno dostupne L-asparaginaze koje potiču iz E. coli ili iz Erwinia chrysanthemi, od kojih obe imaju 50% ili manje strukturne homologije. U okviru Erwinia vrsta, uglavnom je zabeležano 75-77% identične sekvence između enzima koji potiču iz Erwinia chrysanthemi i Erwinia carotovora, i približno 90% identične sekvence je nađeno između različitih podvrsta Erwinia chrysanthemi (Kotzia GA, Labrou E, Journal of Biotechnology (2007) 127:657-669). Neki predstavnici L-asparaginaza Erwinia obuhvataju, na primer, one date u tabeli 1:
Tabela 1
[0032] Sekvence Erwinia L-asparaginaza i GenBank pristupni brojevi u tabeli 1 su ovde uključeni kao referenca. Poželjne L-asparaginaze korišćene u terapiji su L-asparaginaze izolovane iz E. coli i iz Erwinia, naročito, Erwinia chrysanthemi.
[0033] L-asparaginaze mogu biti prirodni enzimi izolovani iz mikroorganizama. Oni mogu takođe biti dobijeni rekombinantnim enzimskim tehnologijama u dobijanju mikroorganizama kao što je E. coli. Kao primer, proteini korišćeni u konjugatu prema pronalasku mogu biti protein iz E. coli dobijen iz rekobinantnog soja E. coli za dobijanje, proteina iz Erwinia vrsta, naročito Erwinia chrysanthemi, dobijenih rekombinantim sojem E. coli za proizvodnju.
[0034] Enzimi mogu biti identifikovani njihovim specifičnim aktivnostima. Ova definicija obuhvata sve polipeptide koji imaju definisanu specifičnu aktivnost takođe prisutnu u drugim organizmima, određenije u drugim mikroorganizmima. Često enzimi sa sličnim aktivnostima mogu biti identifikovani njihovim grupisanjem u izvesne familije definisane kao PFAM ili COG. PFAM (baza podataka svrstavanja proteinskih familija i skriveni Markovi modeli; http://pfam.sanger.ac.uk/) predstavljaju velike kolekcije poravavanja sekvenci proteina. Svaki PFAM omogućava da se vizuelizuju višestruka poravnavanja, vide proteinski domeni, proceni raspoređenost između organizama, dobije pristup drugim bazama podataka, i vizuelizuju poznate proteinske strukture. COGs (Klasteri ortolognih grupa proteina; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/) su dobijeni upoređivanjem proteinskih sekvenci iz 43 potpuno sekvencirana genoma koji predstavljaju 30 glavnih filogentskih linija. Svaki COG je definisan sa bar tri linije, koje dozvoljavaju identififikaciju ranijih konzervisanih domena.
[0035] Sredstva za identifikaciju homologih sekvenci i njihove procentne homologije i/ili identičnost su dobro poznata osobama iz stuke i naročito obuhvataju BLAST programe, koji mogu biti korišćeni sa veb stranice http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi sa podrazumevajućim parametrima koji su naznačeni na veb stranici. Dobijene sekvence mogu biti eksploatisane (npr., poravnate) pomoću, na primer, programa CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html) or MULTALIN (http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html) sa podrazumevajućim parametrima na koje je ukazanona ovim veb stranicama. Korišćenjem referenci datih za GenBank za poznate gene, osobe iz struke će biti u stanju da odrede ekvivalentne gene u ostalim organizmima, bakterijskim sojevima, kvascu, gljivama, sisarima, biljkama itd. Ovaj rutinski posao se povoljno obavlja pomoću konsezusnih sekvenci koje mogu biti određene izvođenjem poravnavanja sekvenci sa genima koji potiču iz drugih mikroorganizama, i projektovanjem degenerativnih proba da bi se klonirao odgovarajući gen u drugom organizmu. Ovi rutinski postupci molekularne biologije su dobro poznati osobama iz struke, i opisani su, na primer, u Sambrook et al. (1989 MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL.2nd ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York).
[0036] Zaista, osoba iz struke će znati kako da odabere i projektuje homologe proteine koje u suštini zadržavaju aktivnost L-asparaginaze. Tipično, Neslerov test se koristi za određivanje aktivnosti L-asparaginaze prema postupku opisanom u Mashburn and Wriston (Mashburn, L., and Wriston, J. (1963) "Tumor Inhibitory Effect of L-asparaginaza," Biochem Biophys Res Commun 12, 50)
[0037] U određenim izvođenjima konjugata prema pronalasku, protein L-asparaginaza je bar 90% homologa ili identična sa proteinom koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:1, određenije bar oko 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% homologa ili identična sa proteinom koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:1. SEQ ID NO:1 je kao što sledi:
[0038] Izraz "sadrži sekvencu SEQ ID NO:1" označava da aminokiselinska sekvenca proteina može biti striktno ograničena na SEQ ID NO:1 ali može sadržati dodatne aminokiseline.
[0039] U određenom izvođenju, protein je L-asparaginaza Erwinia chrysanthemi koja ima sekvencu SEQ ID NO:1. U još jednom izvođenju, L-asparaginaza je iz Erwinia chrysanthemi NCPPB 1066 (Genbank Accession No. CAA32884), ili sa ili bez signalnih peptida i/ili vodećih sekvenci.
[0040] Fragmenti proteina SEQ ID NO:1 su takođe obuhvaćeni sa definicijom proteina korišćenog u konjugatu prema pronalasku. Izraz " fragment SEQ ID NO:1" označava da sekvenca polipeptida može obuhvatati manje aminokiselina nego SEQ ID N01 ali još uvek dovoljno aminokiselina da ima aktivnost L-aminohidrolaze.
[0041] Dobro je poznato u stanju tehnike da polipeptidi mogu biti modifikovani supstitucijom, umetanjem, brisanjem i/ili adicijom jedne ili više aminokiselina dok je zadržana enzimska aktivnost. Na primer, uobičajena je zamena aminokiseline u datom položaju sa hemijski ekvivalentnom amino kiselinom koja ne utiče na funkcionalne osobine proteina. Supstitucije mogu biti definisane kao izmene u okviru jedne od sledećih grupa:
• mali alifatički, nepolarni ili balgo polarni ostaci : Ala, Ser, Thr, Pro, Gly
• polarni, negativno naelektrisani ostaci i njihovi amidi : Asp, Asn, Glu, Gln
• polarni, pozitivno naelektrisani ostaci: His, Arg, Lys
• veliki alifatični, nepolarni ostaci : Met, Leu, Ile, Val, Cys
• veliki aromatični ostaci : Phe, Tyr, Trp.
[0042] Prema tome, promene koje dovode do supstitucije jednog negativno naelektrisanog ostatka sa drugim (kao što je glutaminska kiselina za asparaginsku kiselinu) ili jednog pozitivno naelektrisanog
1
ostatka sa drugim (kao što je lizin za arginin) može se očekivati da daju funkcionalno ekvivalentne proizvode.
[0043] Položaji u kojima su amikokiseline modifikovane i broj aminokiselina podložnih modifikaciji u aminokiselinskoj sekvenci nisu posebno ograničeni. Stručnjak iz ove oblasti je u stanju da prepozna modifikacije koje mogu biti izvršene bez da se utiče na aktivnost proteina. Na primer, može se očekivati da modifikacije na N-ili C-terminalnom delu proteina ne menjaju aktivnost proteina pod izvesnim okolnostima. U vezi sa asparaginazama, posebno je učinjeno puno karakterizacija, naročito u vezi sa sekvencama, strukturama i ostacima koji obrazuju aktivno katalitičko mesto. Ovo pruža smernice u odnosu na ostatke koji mogu biti modifikovani bez uticaja na aktivnost enzima. Sve poznate L-asparaginaze iz bakterijskih izvora imaju uobičajene strukturne. Svi su homotetrameri sa četiri aktivna mesta između N- i C-terminalnih domena dva susedna monomera (Aghaipour et al., Biochemistry 40 (2001) 5655-5664). Svi imaju visok stepen sličnosti u njihovim tercijarnim i kvaternarnim strukturama (Papageorgiou et al., FEBS J. 275 (2008) 4306-4316). Sekvence katalitičkih mesta L-asparaginaze su vioko konzervativna između Erwinia chrysanthemi, Erwinia carotovora, i E. coli L-asparaginaza II (Papageorgiou et al., FEBS J. 275 (2008) 4306-4316). Fleksibilna petlja aktivnog mesta sadrži aminokiselinske ostatke 14-33, i strukturna analiza pokazuje da Thr15, Thr95, Ser62, Glu63, Asp96, i Ala120 dodiruju ligand (Papageorgiou et al., FEBS J. 275 (2008) 4306-4316).Aghaipouret al. su izveli detaljne analize četiri aktivna mesta L-asparaginaza Erwinia chrysanthemi ispitivanjem kristalnih struktura u visokoj rezoluciji enzima kompleksiranih sa njegovim supstratima (Aghaipour et al., Biochemistry 40 (2001) 5655-5664). Kotzia et al. obezbeđuju sekvence L-asparaginaza iz nekoliko vrsta i podvrsta Erwinia i, mada proteini imaju samo oko 75-77% identičnosti između Erwinia chrysanthemi i Erwinia carotovora, svaki od njih još uvek ima aktivnost L-asparaginaze (Kotzia et al., J. Biotechnol.
127 (2007) 657-669). Moola et al. su izveli ispitivanja mapiranja epitopa L-asparaginaze Erwinia chrysanthemi 3937 i bili su u stanju da zadrže enzimsku aktivnost čak posle mutiranja različitih antigenih sekvenci u pokušaju smanjenja imunogenosti asparaginaze (Moola et al., Biochem. J. 302 (1994) 921-927). Svaki od gore navedenih članaka je ovde uključen kao referenca u potpunosti. S obzirom na obimne karakterizacije koje su izvedene na L-asparaginazama, osoba iz struke može da odredi kako da napravi supstitucije fragmenata i/ili sekvenci ali uz zadržavanje enzimske aktivnosti .
Polimeri za upotrebu u konjugatu
[0044] Polimeri su odabrani iz grupe koju čine netoksični vodorastvorni polimeri kao što su polisahardi, npr. hidroksietilni skrob, poliaminokiseline, npr. polilizin, poliestar, npr., polimlečna kiselina, i poli alkilen oksidi, npr., polietilen glikol (PEG).
[0045] Polietilen glikol (PEG) ili mono-metoksi-polietilenglikol (mPEG) je dobro poznat u ovoj oblasti i sadrži linearne i razgranate polimere. Primeri nekih polimera, naročito PEG, su dati u sledećim prijavama:
US Pat. No. 5,672,662; US Pat. No. 4,179,337; US Pat. No. 5,252,714; US Pat. Appl. Publ. No.
2003/0114647; US Pat. No.6,113,906; US Pat. No.7,419,600; i PCT Publ. No. WO2004/083258.
[0046] Kvalitet takvih polimera je karakterisan indeksom polidisperziteta (PDI). PDI odražava raspored molekulskih masa u datom polimernom uzorku i izračunava se iz izmerene prosečne molekulske mase podeljene sa brojem prosečne molekulske mase. Ukazuje na raspored pojedinačnih molekulskih masa u partiji polimera. PDI ima vrednsot uvek veću od 1, ali kada se polimerni lanci približavaju idealnoj Gausovoj raspodeli (= monodisperzitet), PDI se približava 1.
[0047] Polietilen glikol ima poželjno molekulsku masu koja se nalazi u opsegu oko 500 Da do oko 9,000 Da. Određenije, polietilen glikol (npr, mPEG) ima molekulsku masu izabranu iz grupe koju čine polietilen glikoli 2000 Da, 2500 Da, 3000 Da, 3500 Da, 4000 Da, 4500 Da, i 5000 Da. U određenom izvođenju, polietilen glikol (npr., mPEG) ima molekulsku masu od 5000 Da.
Postupak za dobijanje konjugata
[0048] Za naknadno kuplovanje polimera za proteine sa L-asparagin aminohidrolaznom aktivnošću, polimerni deo sadrži aktiviranu funkcionalnu grupu koja poželjno reaguje sa amino grupama proteina. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak dobijanja konjugata, postupak obuhvatai spajanje količine polietilen glikola (PEG) sa količinom L-asparaginaze u puferovanom rastvoru u toku vremenskog perioda koji je dovoljan da se kovalentno veže PEG za L-asparaginazu. U posebnom izvođenju, L-asparaginaza je iz vrsta Erwinia, određenije Erwinia chrysanthemi, i još određenije, L-asparaginaza sadrži sekvencu SEQ ID NO:1. U jednom izvođenju, PEG je monometoksi-polietilen glikol (mPEG).
[0049] Ujednom izvođenju, reakcija između polietilen glikola i L-asparaginaze je izvedena u puferovanom rastvoru . U nekim izvođenjima, pH vrednost puferovanog rastvora je u opsezima između oko 7,0 i oko 9,0. Najpoželjniji opsezi pH vrednsoti su između oko 7,5 i oko 8,5, npr., pH vrednosti oko 7,5, 7,6,7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, ili 8,5. U određenom izvođenju, L-asparaginaza je iz vrsta Erwinia, određenije Erwinia chrysanthemi, i još određenije, L-asparaginaza sadrži sekvencu SEQ ID NO:1.
[0050] Pored toga, PEGilacija L-asparaginaze je izvedena pri koncentracijama proteina između oko 0,5 i oko 25 mg/mL, određenije između oko 2 i oko 20 mg/mL i najodređenije između oko 3 i oko 15 mg/mL. Na primer, koncentracija proteina je oko 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 mg/mL. U posebnom izvođenju, PEGilacija L-asparaginaze pri ovim proteinskim koncentracijama je iz vrsta Erwinia, određenije Erwinia chrysanthemi, i određenije, L-asparaginaza sadrži sekvencu SEQ ID NO:1.
[0051] Pri povećanim koncentracijama proteina većim od 2 mg/mL reakcija PEGilacije brzo napreduje, u toku manje od 2 sata. Pored toga, primenjen je molarni višak polimera u odnosu na amino grupe u L-asparaginazi manji od oko 20:1. Na primer, molarni višak je manji od oko 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7.5:1, 7:1, 6.5:1, 6:1, 5.5:1, 5:1, 4.5:1, 4:1, 3.5:1, 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.5:1, ili 1:1. U specifičnim izvođenjima molarni višak je manji od oko 10:1 i u određenijem izvođenju, molarni višak je manji od oko 8:1. U naročitom izvođenju, L-asparaginaza je iz vrsta Erwinia, određenije Erwinia chrysanthemi, i određenije, L-asparaginaza sadrži sekvencu SEQ ID NO:1.
[0052] Broj PEG delova koji mogu biti kuplovani sa proteinom zavisi od broja slobodnih amino grupa i, čak više od pristupačnosti amino grupa za reakciju PEGilacije. U posebnom izvođenju, stepen PEGilacije (tj., broj PEG delova kuplovanih sa amino grupama na L-asparaginazi) je u okviru opsega od oko 10% do oko 100% slobodnih i/ili dostupnih amino grupa (npr., oko 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ili 100%).100% PEGilacija pristupačnih amino grupa (npr., lizinskog ostatka i/ili N-kraja proteina) se takođe ovde naziva "maksimalno PEGilovan." Jedan postupak za određivanje modifikovanih amino grupa u konjugatima mPEG-r-krisantaspaze (stepen PEGilacije) je postupak opisan u Habeeb (A.F.S.A. Habeeb, "Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzensulfonic acid", Anal. Biochem. 14 (1966), p. 328). U jednom izvođenju, PEG delovi su kuplovani sa jednom ili više amino grupa (gde amino grupe obuhvataju ostatke lizina i/ili N-kraj) L-asparaginaze. U određenim izvođenjima, stepen PEGilacije je u okviru opsega od oko 10% do oko 100% ukupnih ili dostupnih amino grupa (npr., ostaci lizina i/ili N-kraj), npr., oko 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100%. U specifičnom izvođenju, oko 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% ukupnih amino grupa (npr., ostataka lizina i/ili N-kraja) su kuplovani sa PEG delom. U još jednom specifičnom izvođenju, oko 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% dostupnih amino grupa (npr., ostataka lizina i/ili N-kraj) su kuplovani sa PEG delom. U specifičnom izvođenju, 40-55% ili 100% dostupnih amino grupa (npr., ostataka lizina i/ili N-kraja) su kuplovane sa PEG delom. U nekim izvođenjima, PEG delovi su kuplovani sa L-asparaginazom kovalentom vezom. U određenom izvođenju, L-asparaginaza je iz vrsta Erwinia, određenije Erwinia chrysanthemi, i određenije, L-asparaginaza sadrži sekvencu SEQ ID NO:1.
[0053] U jednom izvođenju, konjugat prema pronalasku može biti predstavljen formulom
Asp-[NH-CO-(CH2)x-CO-NH-PEG]n
gde je Asp protein L-asparaginaze, NH je NH grupa ostatka lizina i/ili N-kraj proteina, PEG je polietilen glikol i n je broj bar 40% do oko 100% dostupnih amino grupa (npr., ostataka lizina i/ili N-kraja) u proteinu, sve definisane gore i dole u primerima, x je ceo broj u opsegu od 1 do 8 (npr., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8), poželjno 2 do 5 (npr., 2, 3, 4, 5). U posebnom izvođenju, L-asparaginaza je iz vrsta Erwinia, određenije Erwinia chrysanthemi, i određenije, L-asparaginaza sadrži sekvencu SEQ ID NO:1.
[0054] Drugi postupci PEGilacije koji mogu biti korišćeni da se obrazuju konjugati prema pronalasku su prikazani na primer u U.S. Pat. No. 4,179,337, U.S. Pat. No. 5,766,897, U.S. Pat. Appl. Publ. No. US 2002/0065397A1, i U.S. Pat. Appl. Publ. No. US 2009/0054590A1.
[0055] Specifična izvođenja obuhvataju proteine koji imaju u suštini aktivnost L-asparagin aminohidrolaze i polietilen glikol, izabrane iz grupe konjugata gde:
(A)
- protein ima bar 90% homologije u strukturi sa L-asparaginazom iz Erwinia chrysanthemi koja je data kao SEQ ID NO:1
- polietilen glikol ima molekulsku masu od oko 5000 Da,
- protein i polietilen glikolni delovi su kovalento vezani sa proteinom amidnim vezama, i
- oko 100% dostupnih amino grupa (npr., ostaci lizina i/ili N-kraj) ili oko 80-90%, naročito, oko 84%, ukupnih amino grupa (npr., ostaci lizina i/ili N-kraj) je vezano za polietilen glikolni deo.
1
(B)
- protein ima bar 90% homologije sa L-asparaginazom iz Erwinia chrysanthemi koja je data kao SEQ ID NO:1
- polietilen glikol ima molekulsku masu od oko 5000 Da,
- protein i polietilen glikolni delovi su kovalento vezani za protein amidnim vezama, i
-oko 40% do oko 45 %, i naročito oko 43% dostupnih amino grupa (npr., ostataka lizina i/ili N-kraja), ili oko 36% ukupnih amino grupa (npr., ostataka lizina i/ili N-kraj) je vezano za polietilen glikolni deo.
(C)
- protein ima 90% homologije sa L-asparaginazom iz Erwinia chrysanthemi koja je data kao SEQ ID NO:1
- polietilen glikol ima molekulsku masu od oko 2000 Da,
- protein i polietilen glikoni delovi su kovalentno vezani za protein amidnim vezama, i
-oko 100% dostupnih amino grupa (npr., jedan ili više ostataka lizina i/ili N-kraja) ili oko 80-90%, naročito, oko 84% ukupnih amino grupa (npr., ostaci lizina i/ili N-kraj) je vezano za polietilen glikolnim delom.
(D)
- protein ima bar 90% homologije sa L-asparaginazom iz Erwinia chrysanthemi koja je data kao SEQ ID NO:1
- polietilen glikol ima molekulsku masu od oko 2000 Da,
- protein i polietilen glikolni delovi su kovalentno vezani za protein amidnim vezama, i
- oko 50% do oko 60%, naročito oko 55% dostupnih amino grupa (npr., ostaci lizina i/ili N-kraj) ili oko 47% ukupnih amino grupa (npr., ostaci lizina i/ili N-kraj) je vezano za polietilen glikolni deo.
Konjugati L-asparaginaza-PEG
[0056] Konjugati prema pronalasku imaju izvesne prednosti i neočekivane osobine u poređenju sa nemodifikovanim L-asparaginazama, naročito u poređenju sa nemodifikovanim L-asparaginazama Erwinia, određenije u poređenju sa nemodifikovanom L-asparaginazom iz Erwinia chrysanthemi, i određenije u poređenju sa nemodifikovanom L-asparaginazom koja imaju sekvencu SEQ ID NO:1.
[0057] U nekim izvođenjima, konjugat prema pronalasku smanjuje nivoe L-asparagina u plazmi u toku vremenskog perioda od bar oko 12, 24, 48, 72, 96, ili 120 sati kada se daje u dozi od 5 U/kg telesne mase (tm) ili 10 μg/kg (na osnovu sadržaja proteina). U drugim izvođenjima, konjugat prema pronalasku smanjuje nivoe L-asparagina u plazmi do nedetektabilnih niova u toku vremenskog perioda od bar oko 12, 24, 48, 72, 96, 120, ili 144 sati kada se daju pri dozi od 25 U/kg tm ili 50 μg/kg (na osnovu sadržaja proteina). U drugim izvođenjima, konjugat prema pronalasku smanjuje nivoe L-asparagina u plazmi u toku vremenskog perioda od oko 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, ili 240 sati kada su davani pri dozi od 50 U/kg tm ili 100 μg/kg (na osnovu sadržaja proteina). U još jednom izvođenju, konjugat prema pronalasku smanjuje nivoe L-asparagina u plazmi do nedetektabilnih nivoa u toku vremenskog perioda od oko 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, ili 240 sati kada se daju pri dozi od oko 10000 do oko 15000 IU/m<2>(oko 20-30 mg protein/m<2>). U posebnom izvođenju, konjugat obuhvata L-asparaginazu iz vrsta Erwinia, određenije Erwinia chrysanthemi, i određenije, L-asparaginazu koja sadrži sekvencu SEQ ID NO:1. U posebnom izvođenju, konjugat sadrži PEG (npr., mPEG) koji ima molekulsku masu manju od ili jednaku oko 5000 Da. U još određenijem izvođenju, bar oko 40% do oko 100% dostupnih amino grupa (npr., ostataka lizina i/ili N-kraja) je PEGilovano.
[0058] U jednom izvođenju, konjugat ima odnos mol PEG/mol monomer od oko 4,5 do oko 8,5, naročito oko 6,5; specifičnu aktivnost 450 do oko 550 U/mg, naročito oko 501 U/mg; i relativnu aktivnost od oko 75% do oko 85%, naročito oko 81% u poređenju sa odgovarajućom nemodifikovanom L-asparaginazom. U specifičnom izvođenju, konjugat sa ovim osobinama sadrži L-asparaginazu iz vrsta Erwinia, određenije Erwinia chrysanthemi, i određenije, L-asparaginaza sadrži sekvencu SEQ ID NO:1, sa približno 40-55% PEGilovanim dostupnim amino grupama (npr., ostataka lizina i/ili N-kraja) sa 5000 Da mPEG.
[0059] U jednom izvođenju, konjugat ima odnos mol PEG/mol monomera od oko 12,0 do oko 18,0, naročito oko 15,1; specifičnu aktivnost od oko 450 do oko 550 U/mg, naročito oko 483 U/mg; i relativnu aktivnost od oko 75 do oko 85%, naročito oko 78% u poređenju sa odgovarajućom nemodifikovanom L-asparaginazom. U specifičnom izvođenju, konjugat sa ovim osobinama sadrži L-asparaginazu iz vrsta Erwinia, određenije Erwinia chrysanthemi, i određenije, L-asparaginaza sadrži sekvencu SEQ ID NO:1, sa približno 100% PEGilovanim dostupnim amino grupama (npr., ostataka lizina i/ili N-kraja) sa 5000 Da mPEG.
[0060] U jednom izvođenju, konjugat ima odnos mol PEG/mol monomer od oko 5,0 do oko 9,0, naročito oko 7,0; specifičnu aktivnost od oko 450 do oko 550 U/mg, naročito oko 501 U/mg; i relativnu aktivnost od oko 80 do oko 90%, naročito oko 87% u poređenju sa odgovarajućom nemodifikovanom L-asparaginazom. U specifičnom izvođenju, konjugat sa ovim osobinama sadrži L-asparaginazu iz vrsta Erwinia, određenije Erwinia chrysanthemi, i određenije, L-asparaginaza sadrži sekvencu SEQ ID NO:1, sa približno 40-55% PEGilovanim dostupnim amino grupama (npr., ostacima lizina i/ili N-kraja) sa 10,000 Da mPEG.
[0061] U jednom izvođenju, konjugat ima odnos mol PEG/mol monomer od oko 11,0 do oko 17,0, naročito oko 14,1; specifičnu aktivnost od oko 450 do oko 550 U/mg, naročito oko 541 U/mg; i relativnu aktivnost od oko 80 do oko 90%, naročito oko 87% u poređenju sa odgovarajućom nemodifikovanom L-asparaginazom. U specifičnom izvođenju, konjugat sa ovim osobinama sadrži L-asparaginazu iz vrsta Erwinia, određenije Erwinia chrysanthemi, i određenije, L-asparaginaza sadrži sekvencu SEQ ID NO:1, sa približno 100%PEGilovanim dostupnim amino grupama (npr., ostacima lizina i/ili N-kraja) sa 10,000 Da mPEG.
[0062] U jednom izvođenju, konjugat ima odnos mol PEG/mol monomer od oko 6,5 do oko 10,5, naročito oko 8,5; specifičnu aktivnost od oko 450 do oko 550 U/mg, naročito oko 524 U/mg; i relativnu aktivnost od oko 80 do oko 90%, naročito oko 84% u poređenju sa odgovarajućom nemodifikovanom L-asparaginazom. U specifičnom izvođenju, konjugat sa ovim osobinama sadrži L-asparaginazu iz vrsta Erwinia, određenije Erwinia chrysanthemi, i određenije, L-asparaginaza sadrži sekvencu SEQ ID NO:1, sa približno 40-55% PEGilovanim dostupnim amino grupama (npr.,ostacima lizina i/ili N-kraja) sah 2,000 Da mPEG.
1
[0063] U jednom izvođenju, konjugat sadrži odnos mol PEG/mol monomer od oko 12,5 do oko 18,5, naročito oko 15,5; specifičnu aktivnost od oko 450 do oko 550 U/mg, naročito oko 515 U/mg; i relativnu aktivnost od oko 80 do oko 90%, naročito oko 83% u poređenju sa odgovarajućom nemodifikovanom L-asparaginazom. U specifičnom izvođenju, konjugat sa ovim osobinama sadrži L-asparaginaza iz vrsta Erwinia, određenije Erwinia chrysanthemi, i određenije, L-asparaginaza sadrži sekvencu SEQ ID NO:1, sa približno 100% PEGilovanim dostupnim amino grupama (npr., ostacima lizina i/ili N-kraja) sa 2,000 Da mPEG.
[0064] U drugim izvođenjima, konjugat prema pronalasku ima povećano dejstvo od bar oko 10 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta, 60 puta, 70 puta, 80 puta, 90 puta, ili 100 puta posle jedne injekcije u poređenju sa odgovarajućom nemodifikovanom L-asparaginazom. U specifičnom izvođenju, konjugat sa ovim osobinama sadrži L-asparaginazu iz vrsta Erwinia, određenije Erwinia chrysanthemi, i određenije, L-asparaginaza sadrži sekvencu SEQ ID NO:1. U određenom izvođenju, konjugat sadrži PEG (npr., mPEG) koji ima molekulsku masu manju od ili jednaku oko 5000 Da. U određenim izvođenu, bar oko 40% do oko 100% dostupnih amino grupa (npr.,ostaci lizina i/ili N-kraj) je PEGilovano.
[0065] U jednom aspektu konjugat prema pronalasku ima farmakokinetički profil prema sledećim parametrima:
Vreme poluživota zaostale enzimske aktivnosti u plazmi se izvodi iz sledeće formule:
Srednja vrednost:
gde t1/2je poluživot, t je vremenska tačka, ctje zaostala aktivnost u plazmi u vremenskoj tački i c0zaostala aktivnost u plazmi na početku. Površina ispod krive (AUC) je izračunata pomoću softver progama za farmakokinetiku, npr., SigmaPlot Version11.
[0066] U jednom izvođenju, konjugat prema pronalasku ima jednodozni farmakokinetički profil prema sledećem, naročito kada konjugat sadrži mPEG sa molekulskom masom manjom od ili jednakom 2000 Da i L-asparaginazom iz vrsta Erwinia, određenije Erwinia chrysanthemi, i određenije, L-asparaginaza sadrži sekvencu SEQ ID NO:1:
Amax: oko 150 U/L do oko 250 U/L;
TAmax: oko 4h do oko 8h, naročito oko 6h;
dAmax: oko 220 h do oko 250 h, naročito, oko 238,5 h (iznad nula, iz oko 90 min do oko 240 h);
AUC: oko 12000 do oko 30000; i
t1/2: oko 50h do oko 90h.
1
[0067] U jednom izvođenju, konjugat prema pronalasku ima jednodozni farmakokinetički profil prema sledećem, naročito kada konjugat sadrži mPEG sa molekulskom masom manjom od ili jednakom 5000 Da i L-asparaginazom iz vrsta Erwinia species, određenije Erwinia chrysanthemi, i određenije, L-asparaginaza sadrži sekvencu SEQ ID NO:1:
Amax: oko 18 U/L do oko 250 U/L;
TAmax: oko 1h do oko 50h;
dAmax: oko 90 h do oko 250 h, naročito, oko 238,5 h (iznad nula, od oko 90 min do oko 240 h);
AUC: oko 500 do oko 35000; i
t1/2: oko 30h do oko 120 h.
[0068] U jednom izvođenju, konjugat prema pronalasku ima slične nivoe trošenja L-asparagina u toku vremenskog perioda (npr., 24, 48, ili 72 sati) posle jedne doze u poređenju sa ekvivalentom količinom proteina pegaspargaze. U specifičnom izvođenju, konjugat sadrži L-asparaginazu iz vrsta Erwinia, određenije Erwinia chrysanthemi, i određenije, L-asparaginaza sadrži sekvencu SEQ ID NO:1. U posebnom izvođenju, konjugat sadrži PEG (npr., mPEG) koji ima molekulsku masu manju od ili jednaku oko 5000 Da. U još određenijem izvođenju, bar oko 40% do oko 100% dostupnih amino grupa (npr., ostaka lizina i/ili N-kraja) je PEGilovano, posebno oko 40-55% ili 100%.
[0069] U jednom izvođenju, konjugat prema pronalasku ima duži t1/2od pegaspargaze date u ekvivalentnoj proteinskoj dozi. U specifičnom izvođenju, konjugat ima t1/2bar oko 50, 52, 54, 56, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, ili 65 sati pri dozi od oko 50 μg/kg (na osnovu sadržaja proteina). U još jednom specifičnom izvođenju, konjugat ima t1/2od bar oko 30, 32, 34, 36, 37, 38, 39, ili 40 sati pri dozi od oko 10 μg/kg (na osnovu sadržaja proteina). U još jednom specifičnom izvođenju, konjugat ima t1/2od bar oko 100 do oko 200 sati u doznom opseg od oko 10,000 do oko 15,000 IU/m<2>(oko 20-30 mg proteina/m<2>).
[0070] U jednom izvođenju, konjugat prema pronalasku ima srednju vrednost AUC koja je bar oko 2, 3, 4 ili 5 puta veća od pegaspargaze u ekvivalentnoj dozi proteina.
[0071] U jednom izvođenju, konjugat prema pronalasku ne izaziva značajan odgovor antitela u toku određenog vremenskog perioda posle davanja jedne doze, npr., veći od oko 1 nedelje, 2 nedelje, 3 nedelje, 4, nedelje, 5 nedelja, 6 nedelja, 7 nedelja, 8 nedelja, 9 nedelja, 10 nedelja, 11 nedelja, 12 nedelja, itd. U određenom izvođenju konjugat prema pronalasku ne izaziva značajan odgovor antitela u toku bar 8 nedelja. U jednom primeru, "ne izaziva značajan odgovor antitela" znači da je subjekat koji prima konjugat u okviru parametara koji su poznati u stanju tehnike identifikovan kao "negativan na antitela." Nivoi antitela mogu biti određeni poznatim postupcima u ovoj oblasti, na primer ELISA ili testovima rezonance površinskih plazmona (SPR-Biacore) (Zalewska-Szewczyk et al., Clin. Exp. Med. (2009) 9:113-116; Avramis et al., Anticancer Research 29 (2009) 299-302). Konjugati prema pronalsku mogu imati kombinacije ovih osobina.
Upotreba konjugata
[0072] Konjugati prema pronalasku mogu biti korišćeni u lečenju bolesti koje se leče trošenjem asparagina. Na primer, konjugat je koristan u lečenju ili proizvodnji lekova za upotrebu u lečenju aktutne limfoblastne leukemije (ALL) i kod odraslih i kod dece, kao i drugih stanja za koja se očekuje da će trošenje asparagina imati koristan efekat. Takva stanja obuhvataju, ali bez ograničenja sledeće:
1
malignitete, ili kancere, uključujući ali bez ograničenja hemataloške malignitete, nehodžkinov limfom, NK limfom, kancer pankreasa, Hodžkinovu bolest, akutnu mijelocitnu leukemiju, akutnu mijelomonocitnu leukemiju, hroničnu limfocitnu leukemiju, limfosarkom, retikulosarkom, i melanosarkom. Primeri nemalignih hematoloških bolesti koje reaguju na trošenje asparagina obuhvataju bolesti krvi posredovane imunim sistemom, npr., infektivne bolesti kao što su one izazvane HIV infekcijom (tj., AIDS-om). Nehematološke bolesti zavisne od asparagina obuhvataju autoimune bolesti, na primer reumatoidni artritis, SLE, autoimune, kolagene vaskularne bolesti, AIDS, itd. Druge autoimune bolesti obuhvataju osteoartritis, Isakov sindrom, psorijazu, šećernu bolest zavisnu od insulina, multiple sklerozu, sklerozirajući panencefalitis, sistemski eritemski lupus, reumatsku groznicu, zapaljenske bolesti creva (npr., ulcerozni kolitis i Kronovu bolest), primarnu bilijarnu cirozu, hronični aktivni hepatitis, glomerulonefritis, mijasteniu gravis, pemfigus vulgaris, i Gravesovu bolest. Ćelije za koje se sumnja da izazivaju bolest mogu biti testirane na zavisnost od asparagina u bilo kom pogodnom in vitro ili in vivo testu, npr., in vitro test u kome u medijumu za rast nedostaje asparagin. Prema tome, u jednom izvođenju trećeg aspekta prema pronalasku, konjugat je za upotrebu u lečenju ALL kod pacijenta. U posebnom izvođenju, konjugat za upotrebu u lečenju bolesti koje se leče trošenjem asparagina sadrži Lasparaginazu iz Erwinia chrysanthemi, i određenije, L-asparaginaza sadrži sekvencu SEQ ID NO:1. Konjugat sadrži PEG (npr., mPEG) koji ima molekulsku masu manju od ili jednaku oko 5000 Da. U još određenijem izvođenju, bar oko 40% do oko 100% dostupnih amino grupa (npr., ostataka lizina i/ili N-kraj) je PEGilovano, naročito oko 40-55% ili 100%.
[0073] U jednom izvođenju, konjugat prema pronalasku je za davanje kao terapija prvog izbora. U specifičnom izvođenju, konjugat prema pronalasku je korišćen u terapiji drugog izbora posle lečenja sa pegaspargazom. U određenijem izvođenju, konjugat za upotrebu u terapiji drugog izbora obuhvata L-asparaginazu iz Erwinia chrysanthemi, i određenije, L-asparaginazu koja sadrži sekvencu SEQ ID NO:1. Konjugat dalje sadrži PEG (npr., mPEG) koji ima molekulsku masu manju od ili jednaku oko 5000 Da, određenije oko 5000 Da. U određenijem izvođenju, bar oko 40% do oko 100% dostupnih amino grupa (npr., ostataka lizina i/ili N-kraj) su PEGilovani, naročito oko 40-55% ili 100%.
[0074] U još jednom aspektu, pronalazak se odnosi na konjugat prema prvom aspektu pronalaska za upotrebu u lečenju akutne limfoblasne leukemije. U specifičnom izvođenju, konjugat je za davanje u doznom opsegu od oko 1500 IU/m<2>do oko 15,000 IU/m<2>, tipično oko 10,000 do oko 15,000 IU/m<2>(oko 20-30 mg protein/m<2>), pri rasporedu koji je u opsegu od oko dva puta nedeljno do jednom mesečno, tipično jednom nedeljnom ili jednom svake druge nedelje, kao jedno sredstvo (npr., monoterapija) ili kao deo kombinovane hemoterapije lekovima, uključujući, ali bez ograničenja glukokortikoide, kortikosteroide, jedinjenja protiv kancera ili druga sredstva, uključujući ali bez ograničenja metotreksat, deksametazon, prednison, prednisolon, vinkristin, ciklofosfamid, i antraciklin. Kao primer, pacijentima sa ALL će biti davan konjugat prema pronalasku kao komponenta hemoterapije sa više sredstava u toku 3 faze hemoterapije uključujući indukciju, konsolidaciju ili intenzifikaciju, i održavanje. U specifičnom primeru, konjugat nije za davanje sa inhibitorom asparagin sintetaze (npr., kao što je prikazano u PCT Pub. No. WO 2007/103290). U još jednom specifičnom primeru, konjugat nije za davanje sa inhibitorom asparagin sintetaze, ali je za davanje sa drugim hemoterapeutskim lekovima. Konjugat može biti za davanje pre, posle ili istovremeno sa drugim jedinjenjima kao delom režima hemoterapije sa više sredstava. U posebnom izvođenju, konjugat sadrži L-asparaginazu iz Erwinia chrysanthemi, i određenije, L-asparaginaza sadrži sekvencu SEQ ID NO:1. Konjugat sadrži PEG (npr., mPEG) koji ima molekulsku masu manju od ili jednaku oko 5000 Da. U naročitom izvođenju, bar
1
oko 40% do oko 100% dostupnih amino grupa (npr.,ostataka lizina i/ili N-kraj) je PEGilovano, a naročito oko 40-55% ili 100%.
[0075] U specifičnom izvođenju, konjugat prema pronalasku je za davanje u količini od oko 1 U/kg do oko 25 U/kg (npr., oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ili 25 U/kg) ili u njegovoj ekvivalentoj količini (npr., na osnovu sadržaja proteina). U određenijem izvođenju, konjugat je za davanje u količini izabranoj iz grupe koju čine od oko 5, oko 10, i oko 25 U/kg. U još jednom specifičnom izvođenju, konjugat je za davanje u dozi koja je u opsegu od oko 1000 IU/m<2>do oko 20000 IU/m<2>(npr., 1000 IU/m<2>, 2000 IU/m<2>, 3000 IU/m<2>, 4000 IU/m<2>, 5000 IU/m<2>, 6000 IU/m<2>, 7000 IU/m<2>, 8000 IU/m<2>, 9000 IU/m<2>, 10000 IU/m<2>, 11000 IU/m<2>, 12000 IU/m<2>, 13000 IU/m<2>, 14000 IU/m<2>, 15000 IU/m<2>, 16000 IU/m<2>, 17000 IU/m<2>, 18000 IU/m<2>, 19000 IU/m<2>, ili 20000 IU/m<2>). U još jednom specifičnom izvođenju, konjugat je za davanje u dozi koja troši aktivnost L-asparaginaze nivoa koji se ne mogu detektovati pomoću postupaka i uređaja poznatih u ovoj oblasti u toku perioda od oko 3 dana do oko 10 dana (npr., 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 dana) za jednu dozu. U još jednom izvođenju, konjugat izaziva niži imunogeni odgovor kod pacijenata u poređenju sa nekonjugovanom L-asparaginazom. U još jednom izvođenju, konjugat ima duži in vivo poluživot u krvotoku posle jedne doze u poređenju sa nekonjugovanom L-asparaginazom. U jednom izvođenju, konjugat ima duži t1/2nego pegaspargaza davana u ekvivalentnoj dozi proteina . U specifičnom izvođenju, konjugat ima t1/2od bar oko 50, 52, 54, 56, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, ili 65 sati ukoliko se daje u dozi od oko 50 μg/kg (na osnovu sadržaja proteina). U još jednom specifičnom izvođenju, konjugat ima a t1/2od bar oko 30, 32, 34, 36, 37, 37, 39, ili 40 sati ukoliko se daje u dozi od oko 10 μg/kg (na osnovu sadržaja proteina). U još jednom specifičnom izvođenju, konjugat ima t1/2od bar oko 30 do oko 65 sati ukoliko se daje u dozi od oko 10,000 do oko 15,000 IU/m<2>(oko 20-30 mg protein/m<2>). U jednom izvođenju, konjugat ima srednju vrednost AUC koja je bar oko 2, 3, 4 ili 5 puta veća od pegaspargaze u ekvivalentnoj proteinskoj dozi. U još jednom izvođenju, konjugat ima veću AUC vrednost poslejedne doze u poređenju sa nekonjugovanom L-asparaginazom. U određenom izvođenju, konjugat sadrži L-asparaginazu iz Erwinia chrysanthemi, i određenije, L-asparaginaza sadrži sekvencu SEQ ID NO:1. Konjugat sadrži PEG (npr., mPEG) koji ima molekulsku masu manju od ili jednaku oko 5000 Da. U posebnom izvođenju, bar oko 40% do oko 100% pristupačnih amino grupa (npr., ostataka lizina i/ili N-kraj) je PEGilovano, naročito oko 40-55% ili 100%.
[0076] Učestalost povraćaja kod ALL pacijenata posle lečenja sa L-asparaginazom ostaje visoka, sa približno 10-25% pedijatrijskih ALL pacijenata koji imaju rani povraćaj (npr., neki u toku faze održavanja u 30-36 mesecu posle indukcije) (Avramis and Panosyan, Clin. Pharmacokinet. (2005) 44:367-393). Ukoliko su pacijenti lečeni sa L-asparaginazom koja potiče iz E. coli imali povraćaj, naknadno lečenje sa preparatima E. coli bi vodilo efekta "vakcinacije", gde preparat E. coli ima povećanu imunogenost u toku naknadnih davanja. U jednom izvođenju, konjugat prema pronalasku je za upotrebu u lečenju ALL pacijenata sa povaćajem koji su prethodno lečeni sa drugim preparatima, naročito onima koji su prethodno tretirani asparaginazama koje potiču iz E. coli.
[0077] U nekim izvođenjima, konjugat za upotrebu prema pronalsku ima osobine ili kombinacije osobina koje su ovde gore opisane (npr., u delu pod nazivom "konjugati L-asparaginaze i PEG ") ili dole.
Kompozicije, formulacije, i načini davanja
[0078] Opisana je farmaceutska kompozicija koja sadrži konjugat prema pronalasku. U specifičnom izvođenju farmaceutska kompozicija se nalazi u fioli kao liofilizovani prah koji se rekonstruiše u
1
rastvaraču, kao što su trenutno dostupne prirodne L-asparaginaze, bez obzira na bakteriski izvor korišćen za njihovo dobijanje (Kidrolase®, Elspar®, Erwinase®...). U još jednom izvođenju, farmaceutska kompozicija je rastvor "spreman za upotrebu ", kao što je pegaspargaza (Oncaspar®) spreman za dalju upotrebu davanjem, npr., intramuskularnim, intravenskim (infuzija i/ili bolus), intracerebroventrikularnim (icv), subkutanoznim putevima.
[0079] Konjugati prema pronalasku, uključujući kompozicije koje sadrže konjugate prema pronalasku (npr, farmaceutski kompoziciju) mogu biti davane pacijentu pomoću standardnih tehnika. Tehnike i formulacije genralno se mogu naći u Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990.
[0080] Pogodni dozni oblici, delom, zavise od upotrebe ili načina ulaska, na primer, oralni, transdermalni, transmukozni, ili injekcijom (parenteralno). Takvi dozni oblici treba da omoguće terapeutskom sredstvu da dođe do ciljne ćelije ili da na drugi način postigne željeni terapeutski efekat. Na primer, farmaceutske kompozicije injektovane u krvotok poželjno su rastvorne.
[0081] Konjugati i/ili farmaceutske kompozicije prema pronalasku mogu biti formulisane kao farmaceutski prihvatljve soli i njihovi kompleksi. Farmaceutski prihvatljvie soli su netoksične soli prisutne u količinama i koncentracijama u kojima se daju. Dobijanje takvih soli može olakšati farmaceutsku upotrebu menjanjem fizičkih karakteristika jedinjenja bez sprečavanja ispoljavanja fiziološkog efekta. Korisne izmene u fizičkim osobinama obuhvataju snižavanje tačke topljenja da bi se olakšalo transmukozno davanje i povećala rastvorljivost da bi se olakšalo davanje viših koncentracija leka. Farmaceutski prihvatljvia so asparaginaze može biti prisutna kao kompleks, što će ljudi iz struke znati.
[0082] Farmaceutski prihvatljive soli obuhvataju kisele adicione soli kao što su one koje sadrže sulfat, hlorodvodonik, fumarat, maleat, fosfat, sulfamat, acetat, citrat, laktat, tartrat, metanesulfonat, etansulfonat, benzensulfonat, p-toluensulfonat, cikloheksilsulfamat, i kinin. Farmaceutski prihvatljive soli mogu biti dobijene iz kiselina, uključujući hlorovodničnu kiselinu, maleinsku kiselinu, sumpornu kiselinu, fosfornu kiselinu, sulfamsku kiselinu, sirćetnu kiselinu, limunsku kiselinu, mlečnu kiselinu, vinsku kiselinu, malonsku kiselinu, metansulfonsku kiselinu, etansulfonsku kiselinu, benzensulfonsku kiselinu, p-toluensulfonsku kiselinu, cikloheksilsulfamsku kiselinu, fumarnu kiselinu, i hininska kiselina.
[0083] Farmaceutski prihvatljive soli takođe Pobuhvataju bazne adicione soli kao što su one koje sadrže benzatin, hloroprokain, holin, dietanolamin, etilendiamin, meglumin, prokain, aluminijum, kalcijum, litijum, magnezijum, kalijum, natrijum, amonijum, alkilamin, i cink, gde su prisutne kisele funkcionalne grupe, kao što su karboksilna kiselina ili fenol. Na primer, videti Remington’s Pharmaceutical Sciences, supra. Takve soli mogu biti pripremljene pomoću adekvtnih odgovarajućih baza.
[0084] Farmaceutski prihvatljivi nosači i/ili ekscipijenti mogu takođe biti uključeni u farmaceutske kompozicije prema pronalasku da se olakša davanje određene asparaginaze. Primeri nosača pogodnih za upotrebu u primeni pronalaska obuhvataju kalcijum karbonat, kalcijum fosfat, različite šećere kao što su laktoza, glukoza ili saharoza, ili tipove skroba, derivata celuloze, želatina, biljnih ulja, polietilen glikola i fiziološki kompatibilnih rastvarača. Primeri fiziološki kompatibilnih rastvarača obuhvataju sterilne rastvore vode za injekciju (water for injection - WFI), rastvore solii dekstrozu.
2
[0085] Farmaceutske kompozicije prema pronalasku mogu biti davane na različite načine, uključujući intravensko, intraperitonealno, subkutanozno, intramuskularno, oralno, lokalno (transdermalni), ili transmukozno davanje. Za sistemsko davanje, poželjeno je oralno davanje. Za oralno davanje, na primer, jedinjenja mogu biti formulsana u konvencionalne oralne dozne oblike kao što su kapsule, tablete, i tečni preparati kao što su sirupi, eliksiri i koncentrovane kapi.
[0086] Alternativno, može biti korišćena injekcija (parenteralno davanje), npr., intramuskularna, intravenska, intraperitoneana, i subkutanozna injekcija. Za injekciju, farmaceutske kompozicije su formulisana u tečnim rastvorima, poželjno u fiziološki kompatibilnim puferima ili rastvorima, kao što su rastvor soli, Hank-ov rastvorn, ili Ringerov rastvor. Pored toga, jedinjenja mogu biti formulisana u čvrstom obliku i ponovo rastvorena ili suspendovana neposredno pre upotrebe. Na primer, liofilizovani oblici mogu biti dobijeni. U specifičnom izvođenju, konjugat je davan intramuskularno. U još jednom specifičnom izvođenju, konjugat je davan intravenski.
[0087] Sistemsko davanje se može takođe postići transmukoznim ili transdermalnim putem. Za transmukozno ili trandermalno davanje, sredstva za pospešivanje prodiranja kroz barijeru su korišćena u formulaciji. Takva sredstva za prodiranje su dobro poznata u ovoj oblasti, i obuhvataju za transmukozno davanje na primer, žučne soli i fusidinsku kiselinu. Pored toga, mogu biti korišćeni deterdženti da olakšaju prodiranje. Transmukozno davanje, na primer, može biti pomoću nazalnog spreja, inhalatora (za plućno davanje), rektalnih supozitorija, ili vaginalnih supozitorija. Za lokalno davanje, jedinjenje mogu biti formulisana u masti, meleme, gelove, ili kreme, dobro poznate u stanju tehnike.
[0088] Količine konjugata koje se daju zavise od mnogo faktora, na primer, IC50, EC50, biološkog poluživota jedinjenja, godina, veličine, težine, i fiziološkog stanja pacijenta i bolesti ili poremećaja koji se leče. Važnost ovih i drugih faktora koji su uzeti u obzir su dobro poznati stručnjacima iz ove oblasti. Generalno, količina konjugata koja se daje je u opsegu od oko 10 internacionalnih jedinica po kvadratnom metru površne pacijentovog tela (IU/m<2>) do 50,000 IU/m<2>, u okviru doznog opsega od oko 1,000 IU/m<2>do oko 15,000 IU/m<2>koji je poželjan, i opsega od oko 6,000 IU/m<2>do oko 15,000 IU/m<2>koji je poželjan, i opsega od oko 10,000 do oko 15,000 IU/m<2>(oko 20-30 mg protein/m<2>) koji je naročito poželjan za lečenje malignih hematoloških bolesti, npr., leukemije. Tipično, ove doze su davane pomoću intramuskularne ili intravenske injekcije u intervalima od oko 3 puta nedeljno do oko jednom mesečno, tipično jednom nedeljno ili jednom svake druge nedelje u toku terapije. Naravno, druge doze i/ili režimi lečenja mogu biti korišćeni, kao što je određeno od strane nadležnog lekara.
[0089] U posebnim izvođenjima, konjugat i/ili farmaceutska kompozicija ili formulacija koje se daju su ovde opisane i sadrže L-asparaginazu iz vrsta Erwinia, određenije Erwinia chrysanthemi, i određenije, L-asparaginaza sadrži sekvencu SEQ ID NO:1. U posebnom izvođenju, konjugat sadrži L-asparaginazu iz vrste Erwinia, određenije Erwinia chrysanthemi, i određenije, Lasparaginaze sadrži sekvencu SEQ ID NO:1. U posebnom izvođenju, konjugat sadrži PEG (npr., mPEG) koji ima molekulsku masu manju od ili jednaku oko 5000 Da. U određenijem izvođenju, bar oko 40% do oko 100% amino grupa (npr.,ostaka lizina i/ili N-kraja) je PEGilovano.
Primeri
Primer 1: Dobijanje rekombinantne krisantaspaze
[0090] Rekombinantni bakterijski soj korišćen u proizvodnji golog rekombinantnog proteina L-asparaginaze Erwinia chrysanthemi (koji se takođe zove "r-krisantaspaza") je bio E. coli BL21 soj sa izbrisanim ansB genom (genom koji kodira endogeni tip E. coli II L-asparaginaze) da bi se izbegla potencijalna kontaminacija rekombinantne L-asparaginaze Erwinia chrysanthemi sa ovim enzimom. Brisanje ansB gena zavisi od homolognih rekombinacionih postupaka i transdukcije faga izvedenih na osnovu seledeća tri koraka: 1) bakterijski soj (NM1100) koji eksprimuje defektni lamda fag koji obezbeđuje funkcije koje štite i rekombiniraju elektroporisani linearni DNK supstrat u bakterijskoj ćeliji je transformisan sa linearnim plazmidom (kaseta kanamicina) koji sadrži kandamicin gen na krajevima sa FLP ciljanom sekvencom prepoznavanja (FRT). Rekombinacija koja se javlja zamenjuje ansB gen sa kasetom kanamicina u bakterijskom genomu, dovodeći do ΔansB soja; 2) transdukcija faga je korišćena za integraciju integrisanog regiona kasete kanamicina iz ΔansB NM1100 soja u ansB lokus u BL21 soju. Ovo dovodi do E. coli BL21 soja sa izbrisanim ansB genom i rezistentnim na kanamicin; 3) Ovaj soj je transformisan sa FLP-pomoćnim plazmidom da se ukloni gen kanamicina homolognim rekombinovanjem na FRT sekvenci. Genom krajnjeg soja (BL21 ΔansB soj) je sekvencioniran, čime je potvrđeno potpuno brisanje endogenog ansB gena.
[0091] E. coli-optimizirana DNK sekvenca koja kodira zrelu L-asparaginazu Erwinia chrysanthemi spojena je sa ENX signalnim peptidom iz Bacillus subtilis umetnuta u ekspresioni vektor. Ovaj vektor je omogućio ekspresiju rekombinantne L-asparaginaze Erwinia chrysanthemi pod kontrolom hibridnog T5/lac promotera indukovanog dodavanjem izopropil β-D-1-tiogalaktopiranozida (IPTG) i daje rezistentost na kanamicin.
[0092] BL21 ΔansB soj je transformisan sa ovim ekspresionim vektorom. Transformisane ćelije su korišćene za dobijanje r-krisantaspaze napajanjem partije sa fermentisanom glukozom u Reizenbergovom medijumu. Indukcija ćelija je izvršena u toku 16h na 23°C sa IPTG kao induktorom. Posle sakupljanja ćelija i lize homogenizacijom u 10mM natrijum fosfatnom puferu pH65mM EDTA (Buffer A), rastvor proteina je izbistren centrifugiranjem dva puta na 15000g, a zatim koracima ceđenjem na 0,45µm i 0,22µmm. Rekombinantna L-asparaginaza Erwinia chrysanthemi je zatim prečišćena pomoću niza koraka hromatografije i koncentrovanja. Ukratko, teorijska izoelektrična tačka L-asparaginaze Erwinia chrysanthemi (7,23) omogućava da se rekombinantni enzim apsorbuje na katjonsku jonoizmenjivačku smolu na pH6. Prema tome, rekombinantni enzim je zarobljen na Capto S koloni (katjonska izmenjivačka hromatografija) i eluiran sa gradijentom soli u puferu A. Frakcije koje sadrže rekombinantni enzim su sakupljene. Sakupljeni rastvor je zatim prečišćen na Capto MMC koloni (katjonska izmenjivačka hromatografija ) u puferu A sa grafijentom soli.. Eluirane frakcije su sadržale L-asparaginazu Erwinia chrysanthemi su sakupljene i koncentrovane pre odvajanja proteina na Superdex 200pg eksluzionom hromatografijom prema veličini kao korakom prečišćavanja. Frakcije koje sadrže rekombinantme enzime su sakupljene, koncentrovane, i diafiltrirane naspram 100mM natrijum fosfatnog pufera pH8. Čistoća krajnje dobijene L-asparaginaze Erwinia chrysanthemi je procenjivana na SDS-PAGE (Slika 1) i RP-HPLC i bila je bar 90%. Integritet rekombinantog enzima je potvrđen N-terminalnim sekvencioniranjem i LC-MS. Enzimska aktivnost je merena na 37°C pomoću Neslerovog reagensa. Specifična aktivnost prečišćene L-asparaginaze Erwinia chrysanthemi je bila oko 600 U/mg. Jedna jedinica enzimske aktivnosti je definisana kao količina enzima koja oslobađa 1µmol amonijaka iz L-asparagina po minuti na 37°C.
Primer 2: Dobijanje konjugata 10 kDa mPEG-L-asparaginaza
[0093] Rastvor L-asparaginaze iz Erwinia chrysanthemi je mešan u 100 mM natrijum fosfatnom puferu na pH 8,0, na koncentraciji proteina između 2,5 i 4 mg/mL, u prisutvu 150 mg/mL ili 36 mg/mL 10 kDa mPEG-NHS, u toku 2 sata na 22°C. Dobijena sirova 10 kDa mPEG-L-asparaginaza je prečišćena ekskluzionom hromatografijom na osnovu veličine pomoću Superdex 200 pg kolone na Äkta sistemu UPC 100 za prečišćavanje. Frakcije koje su sadržale protein su sakupljene i koncentrovane da bi se dobila koncentracija proteina između 2 i 8 mg/mL. Dva konjugata 10 kDa mPEG-L-asparaginaza su dobijena na ovaj način, sa različitim stupnjem PEGilacije koji je određen sa TNBS testom sa nemodifikovanom L-asparaginazom kao referencom, jedan odovara potpuno PEGilovanim (100% dostupnih amino grupa (npr., ostaci lizina i/ili N-kraj) ostacima koji su konjugovani što odgovara PEGilaciji 78% ukupnih amino grupa (npr., ostaci lizina i/ili N-kraj)); drugi odgovara parcijalnoj PEGilaciji (39% ukupnih amino grupa (npr.,ostaci lizina i/ili N-kraj) ili oko 50% dostupnih amino grupa (npr.,ostaci lizina i/ili N-kraj)) . SDS-PAGE analiza konjugata je prikazana na slici 2. Dobijeni konjugati su se javili kao esencijalne homogene trake i nisu sadržale detektabilnu nemodifikovanu r-krisantaspazu.
Primer 3: Dobijanje konjugata 5 kDa mPEG-L-asparaginaze
[0094] Rastvor L-asparaginaze iz Erwinia chrysanthemi je mešan u 100 mM natrijum fosfatnog pufera na pH 8,0, pri koncentraciji proteina od 4 mg/mL, u prisustvu 150 mg/mL ili 22,5 mg/mL 5 kDa mPEG-NHS, u toku 2 sata na 22°C. Dobijena sirova 5 kDa mPEG-L-asparaginaza je prečišćena ekskluzionom hromatografijom na osnovu veličine pomoću Superdex 200 pg kolone na Äkta sistemu UPC 100 za prečišćavanje. Frakcije koje sadrže protein su sakupljene i koncentrovane do koncentracije proteina između 2 i 8 mg/mL. Dva konjugata 5 kDa mPEG-L-asparaginaze su pripremljena na ovaj način, sa različitim stupnjem PEGilacije koji je određen sa TNBS testom sa nemodifikovnom L-asparaginazom kao referencom, jedan odgovara potpunoj PEGilaciji (100% dostupnih amino grupa (npr., ostaka lizina i/ili N-kraja) koji su konjugovani da odgovaraju PEGilaciji od 84% ukupnih amino grupa (npr., ostaci lizina i/ili N-kraj)); drugi odgovara parcijalnoj PEGilaciji (36% ukupnih amino grupa (npr., ostaci lizina i/ili N-kraj) ili oko 43% dostupnih amino grupa (npr., ostaci lizina i/ili N-kraj)). SDSPAGE analiza konjugata je prikazana na slici 2. Dobijeni konjugati su se pojavili na suštinski homogenoj traci i nisu sadržali detektabilnu nemodifikovanu r-krisantaspazu.
Primer 4: Dobijanje konjugata 2 kDa mPEG-L-asparaginaze
[0095] Rastvor L-asparaginaze iz Erwinia chrysanthemi je mešan u 100 mM natrijum fosfatnom puferu pH 8,0 pri koncentraciji proteina od 4 mg/mL u prisustvu 150 mg/mL ili 22,5 mg/mL 2 kDa mPEG-NHS u toku 2 sata na 22°C. Dobijena sirova 2 kDa mPEG-L-asparaginaza je prečišćena eskluzionom hromatografijom pomoću Superdex 200 pg kolone na Äkta sistemu UPC 100 za prečišćavanje. Frakcije koje sadrže protein su sakupljene i koncentrovane da bi se dobila koncentracija proteina između 2 i 8 mg/mL. Dva konjugata 2 kDa mPEG-L-asparaginaze su pripremljena na ovaj način, sa različitim stepenom PEGilacije što je određeno sa TNBS testom sa nemodifikovanom L-asparaginazom kao referencom, jedan koji odgovara maksimalnoj PEGilaciji (100% dostupnih amino grupa (npr., ostaci lizina i/ili N-kraj) koji su konjugovani da odgovaraju PEGilaciji od 86% ukupnih amino grupa (npr., ostaci lizina i/ili N-kraj)); drugi odgovara parcijalnoj PEGilaciji (47% ukupnih amino grupa (npr.,ostaci lizina i/ili N-kraj) ili oko 55% dostupnih amino grupa (npr., ostaci lizina i/ili N-kraj)). SDSPAGE analiza konjugata je prikazana na slici 2. Dobijeni konjugati su se javili kao u suštini homogene trake i nisu sadržale detektabilnu nemodifikovanu r-krisantaspazu.
2
Primer 5: Aktivnost konjugata mPEG-r-krisantaspaze
[0096] Aminohidrolazna aktivnost L-asparaginaze svakog konjugata opisanog u prethodnim primerima je određena sa neslerizacijom amonijaka koji je oslobođen iz L-asparagina enzimskom aktivnošću. Ukratno, 50µL rastvora enzima je pomešano sa 20mM L-asparagina u 50 mM natrijum boratnom puferu pH 8,6 i inkubiranom u toku 10 min na 37°C. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 200µL Neslerovog reagensa. Apsorbanca ovog rastvora je merena na 450 nm. Aktivnost je izračunata iz kalibracione krive koja je dobijena iz amonijum sulfata kao reference. Rezultati su ukratko prikazani dole u tabeli 2:
Tabela 2: Aktivnost konjugata mPEG-r-krisantaspaze
[0097] Zaostala aktivnost konjugata mPEG-r-krisantaspaze je bila u opsegu 483 and 543 jedinica/mg. Ovo odgovara 78-87% aminohidrolazne aktivnosti L-asparagina nemodifikovanog enzima.
Primer 6: Efekat trošenja L-asparagina nemodifikovane krisantaspaze
[0098] Farmakodinamički profil Erwinase® je određen na B6D2F1-hibridima (imunološki kompetentne ženke), Charles River Germany. Erwinase® je komercijalno dostupna krisantaspaza (L-asparaginaza koja potiče od Erwinia chrysanthemi). Ukratko, 2 životinje po grupi su primile jednu i.v. injekciju 5, 25, 125, ili 250 jedinica/kg bw Erwinase®. Pre-doze -1 h i 6 h, 12h, 24 h, i 48 h posle doze, uzorci plazme su sakupljeni iz orbitalnog sinusa i analizirani na nivoe u plazmi L-asparagina u plazmi.
[0099] Nivoi amino kiseline u plazmi su određeni sa PICO-TAG Amino Acid Analysis Kit (Waters). Ukratko, uzorci plazme su deproteinizirani taloženjem sa metanolom. Slobodne amino kiseline u supernatantu su derivatizovane sa fenilizotiocijanatom i kvantifikovane sa RP-HPLC.
[0100] Kao što je prikazano na slici 3, doze od 5 i 25 U/kg nisu efikasne u trošenju nivoa L-asparagina kod miša posle iv davanja. Samo 250 U/kg doza izaziva kompletno trošenje u toku 48 h.
[0101] Ovaj rezultat prikazuje klinička ograničenja Erwinase®, nemodifikovane krisantaspaze, koja mora da bude davana do 3 puta nedeljno kao bolna injekcija pacijentima koji pate od ALL, i pri visokim dozama koje dovode do čestih alergijskih reakcija i imunogenosti.
Primer 7: Efekat trošenja L-asparagina i aktivnost L-asparaginaze u plazmi posle jednog davanja šest konjugata mPEG-r-krisantaspaze
[0102] Farmakodinamički i farmakokinetički profili 6 različitih konjugata mPEG-r-krisantaspaze su određeni na B6D2F1-hibridima (imuno kompetentne, ženke), Charles River Germany. Šest konjugata različite molekulske mase PEG (2, 5 ili 10 kDa) i stepena PEGilacije (maksimala vs. parcijalna PEGilacija) je testirano. Nemodifikovana krisantaspaza (Erwinase®) je korišćena kao referenca. Ukratko, 4 životinje po grupi su primale jednu i.v. injekciju 5 jedinica/kg tm konjugata vs. 250 jedinica/kg bw Erwinase®. Pre-doziranja -1 h i 6 h, 24 h, 48 h, 96 h i 192 h posle injekcije, sakupljeni su uzorci plazme iz orbitalnog sinusa svake životinje i analizirani na nivoe L-asparagina u plazmi i zaostalu enzimsku aktivnost, respektivno.
[0103] Nivoi aminokiselina u plazmi su određeni sa PICO-TAG kitom za analizu aminokiselina (Waters). Ukratko, uzorci u plazmi su deproteinizovani taloženjem sa metanolom. Slobodne aminokiseline u supernatantu su derivatizovane sa fenilizotiocijanatom i kvantifikvoane sa RP-HPLC.
[0104] Enzimska aktivnost u plazmi je određena hromogenskim testom. L-asparagin ß-hidroksamat (AHA) je korišćen kao supstrat. Enzimi koji hidrolizuju AHA u L-Asp i hidroksilamin, koji je određen na 710 nm posle kondenzacije sa 8-hidroksihinolinom i oksidacijom do indooksina. (Analytical Biochemistry 309 (2002): 117-126).
[0105] Kao što je prikazano na slici 4, konjugati davani pri 5U/kg su pokazali sposobnost trošenja L-asparagina bar tako dobru kao Erwinase® 250 U/kg, sugerišući da PEGilacija povećava efikasnost proteina bar 50 puta. Svi konjugati koji pokazuju sličnu efikasnost, troše nivoe u plazmi L-asparagina u toku 2 dana, osim 5 kDa-100% konjugat koji je pokazao duže trajanje dejstva (96h = 4 dana u poređenju sa 48h = 2 dana za druge konjugate).
[0106] Prema tome, povećavanjem veličine PEG konjugovanih za r-krisantaspazu iz 2 kDa do 5 kDa dovelo je do povećane efikasnosti i trajanja dejstva. Međutim, iznenađujuće, povećavanjem veličine PEG na 10 kDa nije dalje poboljšalo efikasnost i trajanje dejstva konjugata, čak je dovelo do pada u poređenju sa 5 kDa maksimalno PEGilovanim konjugatom.
[0107] Enzimska aktivnost je konzistentna sa trošenjem L-asparagina. Kao što je prikazano na slici 5, 5 kDa-100% konjugat pokazuje najveći AUC, što dovodi do dužeg poluživota. Niži AUCs su primećeni sa PEG-40% (parcijalno PEGilovani) vs. PEG-100% (maksimalno PEGilovanim) konjugatima za 2 kDa i 5 kDa kandidate i nisu primećene razlike za 10 kDa kandidate.
[0108] Konzistentno sa podacima trošenja L-asparagina, povećanje molekulske veličine konjugovanih PEG za r-krisantaspazu od 2 kDa do 5 kDa dovelo je do duže aktivnosti L-asparaginaze u krvotoku. Međutim, iznenađujuće, povećanjem veličine PEG do 10 kDa nije dalje poboljšalo in vivo enzimsku aktivnost konjugata, nego je čak dovelo do pada kada se poredi sa 5 kDa maksimalno PEGilovanim konjugatom. Takođe, naročito, kada je r-krisantaspaza bila N-terminalno monoPEGilovana sa mPEG velike molekulske mase (tj., 40 kDa), nije bilo značajnog uticaja na in vitro stabilnost enzima u odnosu na proteolizu (podaci nisu prikazani).
2
Primer 8: Efekti opsega doza dva konjugata mPEG-r-krisantaspaze na nivoe L-asparagina u plazmi
[0109] Farmakodinamički profil konjugata 2 mPEG-r-krisantaspaze poređen sa pegaspargazom (Oncaspar®) je određen na B6D2F1-hibridima (imuno kompetentne, ženke), Charles River Germany. Testirani konjugati su bili maksimalno 2 kDa (100%) PEGilovna r-krisantaspaza i 5 kDa maksimalno (100%) PEGilovana r-krisantaspaza u 3 doze. Ukratno, 8 životinja po grupi je primilo jednu i.v. injekciju 5, 25 ili 50 jedinica/kg tm konjugata r-krisantaspaze, koji odgovara 10, 50 ili 100 μg proteina/kg. Kao komparativna grana, Oncaspar® je testiran pri 1 jedinici/kg, koja odgovara 10 μg proteina/kg. Pre doze -1 h i 90 min, 6 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h, 144 h, 192 h i 240 h posle doze uzorci plazme su sakupljani iz orbitalnog sinusa i analizirani na nivoe L-asparagina u plazmi.
[0110] Nivoi aminokiselina u plazmi su određeni sa PICO-TAG kitom za analizu aminokisleina (Waters). Ukratko, uzorci plazme su deproteinizirani taloženjem sa metanolom. Slobodne aminokiseline u supernatantu su derivatizovane sa fenilizotiocijanatom i kvantifikovane sa RP-HPLC.
[0111] Efekti povezani sa dozom konjugata na nivoe L-asparagina u plazmi su prikazani na slici 6. Kao što je prikazano na slikama 6A i 6B, oba konjugata su visoko efikasna u trošenju L-asparagina u krvotoku. Za 2 kDa 100% konjugat, ukupno trošenje je praćenou toku 3, 6 i bar 10 dana pri 5U, 25U i 50U/kg dozama, respektivno. Za 5 kDa 100% konjugat, praćeno je ukupno trošenje u toku 3, 10 i 10 dana pri 5U, 25U i 50U/kg dozama, respektivno. Za oba testirana konjugata, 5, 25 i 50 U/kg testirane doze odgovaraju 10, 50 i 100 μg/kg na osnovu sadržaja proteina, što je veoma niska količina proteina u poređenju sa drugim dostupnim preparatima L-asparaginaze. Zaista, 250 U/kg Erwinase® odgovara približno 520 μg/kg, i 1 U/kg Oncaspar® odgovara približno 10 μg/kg (na osnovu sadržaja proteina). Slika 6C pokazuje davanje ekvivalentne količine proteina (10 μg/kg) ili 2 kDa-100% konjugata, 5 kDa-100% konjugata ili Oncaspar® što dovodi do sličnog trošenja L-asparagine u toku 72 h.
Primer 9: Farmakokinetički profili dva konjugata mPEG-r-krisantaspaze
[0112] Farmakokinetički profil konjugata mPEG-r-krisantaspaze je određen na B6D2F1-hibridima (imuno kompetentne ženke, ženke), Charles River Germany. Testirani konjugati su bili 2 kDa maksimalno (100%) PEGilovana rkrisantaspaza i 5 kDa maksimalno (100%) potpuno PEGilovana rkrisantaspaza u 3 doze. Nemodifikovana krisantaspaza (Erwinase®) od 250 U/kg i Oncaspar® od 1 U/kg su takođe testirane kao kontrole. Ukratko, 8 životinja po grupi je primailo jednu i.v. injekciju od 5, 25 ili 50 jedinica/kg tm svakog konjugata mPEG-r-krisantaspaze u poređnju sa Erwinase® i Oncaspar®. Predoziranja -1 h i 90 min, 6 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h, 144 h, 192 h i 240 h posle doze sakupljani su uzorci plazme iz orbitalnog sinusa i analizirani na nivo zaostale enzimske aktivnosti u plazmi.
[0113] Enzimska aktivnost je određena sa hromogenim testom. L-aspartam ß-hidroksamat (AHA) je korišćen kao supstrat. Enzimi hidrolizuju AHA do L-Asp i hidroksilamina, koji je određen na 710 nm posle kondenzacije sa 8-hidroksihinolinom i oksidacijom do indooksina. (Analytical Biochemistry 309 (2002): 117-126).
[0114] Izračunavanje vremena poluživota, eksponecijalnih linija najboljeg uklapanja odgovarajućih zaostalih aktivnosti u plazmi je izvedeno pomoću MS-excel funkcionog alata. Vrednosti negativnih aktivnosti su isključene iz izračunavanja.
2
[0115] Poluživot zaostale enzimske aktivnosti u plazmi je izveden iz sledeće formule pomoću MS-excel funkcionog alata i odgovarajuće formule eksponencionalnih linija najboljeg uklapanja:
Srednja vrednost:
gde t1/2je poluživot, t je vremenska tačka, ctje zaostala aktivnost u plazmi u vremenskoj tački i c0je zaostala aktivnost u plazmi na početku.
[0116] Površine ispod krive (AUC) su izračunate pomoću SigmaPlot Version11. Farmakokinetički podaci su ukratko dole prikazani u tabelama 3 i 4, i slikama 7-9.
Tabela 3: Primarne farmakokinetike jednog tretmana sa 250 U/kg tm Erwinase®, 1 U/kg tm Pegaspargaze (Oncaspar®), ili 2 kDa mPEG-r-krisantaspaze 100% konjugata (zaostala enzimska aktivnost u plazmi)
2
Tabela 4: Primarne farmakokinetike jednog tretmana sa 250 U/kg tm Erwinase®, 1 U/kg tm Pegaspargaze (Oncaspar®), ili 5 kDa mPEG-r-krisantaspaze 100% konjugatima (zaostala enzimska aktivnost u plazmi)
[0117] Podaci pokazuju da PEGilacija r-krisantaspaze značajno produžava poluživot u poređenju sa sa nemodifikovanom krisantaspazom, na dozno-zavistan način (tabele 3 i 4, slike 7-9). Dodatno, kada se poređe sa istim doznim nivoom, AUCs merene za 5 kDa-100% su bili više od onih primećenih za 2-kDa-100% konjugate. Razlike od 21%, 37% i 14% su bile konzistentno nađene u korist 5 kDa-100% konjugata, pri 5, 25 i 50 U/kg dozama, respektivno (slika 8). Ustanovljeno je da 5 kDa-100% konjugat takođe ima duži poluživot od samog Oncaspar® kada je testiran u istim dozama na bazi sadržaja proteina, kako je prikazano na slici 9 i u izvedenim farmakokinetičkim parametrima prikazanim u tabeli 4. Superiorni farmakokinetički profili za konjugate Erwinia su iznenađujući, s obzirom da L-asparaginaza koja potiče iz E. coli je poznato da ima duži poluživot kod ljudi i kod životinja od L-asparaginaze Erwinia chrysanthemi (krisantaspaze). Prema tome, duži poluživot će logički biti predviđen za PEGilovanu E. coli Lasparaginazu (pegaspargazu) u poređenju sa PEGilovanom r-krisantaspazom. Međutim, neočekivano i poželjno, PEGilovana r-krisantaspaza ima duži poluživot od pegaspargaze.
[0118] Tabela 5, ispod, ukratko daje farmakokinetičke i farmakodinamičke podatke koji su sakupljeni iz nekoliko eksperimenata, uključujući one opisane u ovim primerima 7-9, koji pokazuje da: 1) oba 2 kDa-100% i 5 kDa-100% konjugata su jako efikasna u povećanju jačine i trajanja dejstva krisantaspaze, što je prikazano uočljivim razlikama primećenim u poređenju sa Erwinase®; 2) 5 kDa-100% konjugat duže deluje i od 2 kDa-100% konjugata i od Oncaspar®, kao što je pokazano dužim poluživotom primećenim pri svim testiranim dozama. U vezi sa iznenađujuće inferiornim rezultatima dobijenim sa 10 kDa-100% konjugatom ovi podaci sugerišu da korist PEGilacije raste sa veličinom PEG dela prikačenog na krisantaspazu do 5 kDa. Viša molekulska masa PEG ne daje dalje prednosti, i , čak u slučaju 10 kDa, može biti štetna. Ovo je neočekivano i suprotno rezultatima koji su viđeni npr., kada su Holtsberg et al. konjugovali PEG različite molekulske mase sa arginin deaminazom, još jednim amino degradirajućim enzimom izolovanim iz mikrobiološkog izvora. U tim ispitivanjima farmakokinetička i farmakodinamička funkcija enzima arginin deaminaze je rasla sa veličinom molekulske mase PEG prikačenog dela od 5000 Da do 20,000 Da (Holtsberg, F.W., Journal of Controlled Release 80 (2002), 259-271).
2
Tabela 5
[0119] Pored toga, kao što se dole može detaljnije videti, podaci o imunogenosti pokazuju da 10 kDa-100% pokazuje neprihvatljiv profil imunogenosti, glavni nedostatak kada se razmatra davanje jedinjenja pacijentima koji su alergični na E. coli L-asparaginazu ili imaju razvijena anti-L-asparaginazna antitela. U ovom pogledu, 10 kDa100% konjugat stvarno nije pogodan.2 kDa-100% i 5 kDa-100% su poželjni, a 5 kDa-100% konjugat je naročito poželjan.
Primer 10: Imunogenost
[0120] Imunogenost konjugata mPEG-r-krisantaspaze je određena na B6D2F1-hibridima (imuno kompetentne, ženke), Charles River Germany. Životinje su tretirane dva puta nedeljno u toku nedelja 1, 2, 3, 4, 8 i.v. injekcijom 250 U/kg tm za Erwinase® i 5 U/kg tm za sve konjugate r-krisantaspaze. Uzorci seruma su sakupljeni pri -1h pre doziranja i posle 1n, 2n, 4n, 6n i 8n iz orbitalnih sinusa. Nivoi antikrisantaspaze ili anti-mPEG-r-krisantaspaznog antitela u serumu su određeni ELISA. Rezultati su ukratko prikazani na slikama 10 i 11.
[0121] Visoki titri antitela anti-krisantaspaze su primećeni za Erwinase® polazeći od 2. nedelje i održavani su u toku celog perioda ispitivanja. Nasuprot tome, nisu primećeni značajni nivoi antitela za konjugate r-krisantaspaze (slika10).
[0122] Kao što je pokazano na slici 11, proizvodnja antitela anti-konjugata je ostala na najmanjem intenzitetu i učestalosti za konjugate 2 kDa i 5 kDa mPEG-r-krisantaspaze, i rastu sa višim nivoima i učestalošću za konjugate 10 kDa mPEG-r-krisantaspaze. Nije primećena jasna razlika između potpuno i parcijalno PEGilovanih konjugata (nije prikazano).
[0123] Prema tome, ovi podaci pokazuju da strategija PEGilovanja koja je bila izabrana smanjuje imunogenost konjugata u poređenju sa nemodifikovanom L-asparaginazom, značajno smanjujući odgovor anti-krisantaspaznih antitela. Međutim, anti-konjugatna antitela su detektovana, naročito sa 10 kDa konjugatima, i sa manjim intenzitetom sa 2 kDa i 5 kDa konjugatima.
[0124] Kao zaključak, izgleda da, do 5 kDa, PEGilacija uspeva da poboljša farmakokinetički profil, jačinu i trajanje dejstva r-krisantaspaze, dok se smanjuje imunogenost u poređenju sa nemodifikovanim proteinom, sa jačinom i trajanjem dejstva koje raste sa veličinom korišćenog polimera, konjugat 5 kDa
2
mPEG-r-krisantaspaze je malo jači od onog konjugata 2 kDa mPEG-r-krisantaspaze. Međutim, dalje povećavanje veličine PEG na 10 kDa ne poboljšava dalje jačinu i trajanje dejstva, jer je konjugat 10 kDa mPEG-r-krisantaspaze manje efikasan in vivo od konjugata 5 kDa mPEG-r-krisantaspaze, uprkos slične in vitro efikasnosti. Pored toga, konjugati 10 kDa mPEG-r-krisantaspaze pokazuju neočekivani profil imunogenosti, neočekivani rezultat u odnosu na rezultate sa drugim proteinima.
LISTA SEKVENCI
�
�

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Konjugat za upotrebu u terapiji, pri čemu konjugat sadrži L-asparaginazu iz Erwinia chrysanthemi koja je bar 90% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 1 i polietilen glikol (PEG), gde PEG ima molekulsku masu manju ili jednaku oko 5000 Da.
2. Konjugat za upotrebu prema zahtevu 1, gde pomenuta L-asparaginaza je bar 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:1, ili je bar 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:1
3. Konjugat za upotrebu prema zahtevu 1, gde je pomenuta L-asparaginaza identična SEQ ID NO:1.
4. Konjugat za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 3, gde pomenuti PEG ima molekulsku masu u okviru opsega od bar 500 Da.
5. Konjugat za upotrebu prema zahtevu 3, gde pomenuti PEG ima molekulsku masu od oko 5000 Da, manju od oko 5000 Da, manju od oko 4000 Da, manju od oko 3000 Da, ili manju od oko 2500 Da.
6. Konjugat za upotrebu prema zahtevu 1, gde je pomenuta L-asparaginaza identična sa SEQ ID NO:1 i pomenuti PEG ima molekulsku masu od oko 5000 Da.
7. Konjugat za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 6 gde je PEG kovalentno vezan za jednu ili više amino grupa pomenute L-asparaginaze.
8. Konjugat za upotrebu prema zahtevu 7, gde je PEG kovalentno vezan za jednu ili više amino grupa amidnom vezom.
9. Konjugat za upotrebu prema zahtevu 7 ili 8, gde je PEG kovalentno vezan sa od 40% do 100% dostupnih amino grupa, naročito između 40% do oko 90% ukupnih amino grupa.
10. Konjugat za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 9 koji ima formulu:
Asp- [NH-CO(CH2)x-CO-NH-PEG ]n
gde Asp je L-asparaginaza, NH je jedna ili više NH grupa lizinskih ostataka i/ili N-kraj u Asp, PEG je polietilen glikolni deo, n je broj koji predstavlja bar 40% do oko 100% dostupnih amino grupa (npr. ostataka lizina i/ili N-kraja) u Asp, i x je celi broj od oko 1 do 8, posebno X je celi broj u opsegu od oko 2 do 5.
11. Konjugat za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 10, gde je pomenuti PEG monometoksipolietilen glikol.
12. Konjugat za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 10 za lečenje pacijenta od bolesti koji se leče trošenjem L-asparaginaze, opciono gde je pomenuta bolest hematološki malignitet i pacijentu se daje doza od 10000 internecionalnih jedinica po kvadratnom metru površine tela pacijenta (IU/m<2>) do 15000 IU/m<2>.
13. Konjugat za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 10 za lečenje pacijenta od bolesti koje se leče trošenjem L-asparaginaze, opciono gde je pomenuta bolest koja se leči trošenjem asparaginaze kancer, opciono gde je pomenuti kancer izabran iz grupe koju čine akutna limfoblastna leukemija (ALL), nehodžkinov limfom, NK limfom i kancer pankreasa.
14. Konjugat za upotrebu prema zahtevu 13, gde je pomenuti pomenuti kancer NK limfom.
15. Konjugat za upotrebu prema zahtevu 13, gde je pomenuti pacijent imao povraćaj bolesti, opciono gde se pomenuti povraćaj bolesti javlja posle lečenja sa L-asparaginazom E.coli ili njenim PEG-ilovanim oblikom.
4
RS20170778A 2009-07-06 2010-07-06 Pegilovana l-asparaginaza RS57077B2 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US22332009P 2009-07-06 2009-07-06
PCT/EP2010/054156 WO2011003633A1 (en) 2009-07-06 2010-03-30 Pegylated l-asparaginase
EP10730170.7A EP2451486B2 (en) 2009-07-06 2010-07-06 Pegylated l-asparaginase
PCT/EP2010/059599 WO2011003886A1 (en) 2009-07-06 2010-07-06 Pegylated l-asparaginase

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RS57077B1 RS57077B1 (sr) 2018-06-29
RS57077B2 true RS57077B2 (sr) 2023-06-30

Family

ID=42670528

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20170778A RS57077B2 (sr) 2009-07-06 2010-07-06 Pegilovana l-asparaginaza

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP2451486B2 (sr)
CY (1) CY1119779T1 (sr)
HR (1) HRP20171180T4 (sr)
ME (1) ME02945B (sr)
PL (1) PL2451486T5 (sr)
RS (1) RS57077B2 (sr)
SI (1) SI2451486T2 (sr)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11986451B1 (en) 2016-07-22 2024-05-21 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US12186296B1 (en) 2016-07-22 2025-01-07 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US12478604B1 (en) 2016-07-22 2025-11-25 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
UY37341A (es) 2016-07-22 2017-11-30 Flamel Ireland Ltd Formulaciones de gamma-hidroxibutirato de liberación modificada con farmacocinética mejorada
US11602512B1 (en) 2016-07-22 2023-03-14 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US11602513B1 (en) 2016-07-22 2023-03-14 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US11504347B1 (en) 2016-07-22 2022-11-22 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
JP7784804B2 (ja) * 2017-10-27 2025-12-12 フェネックス インク． 組み換えｅｒｗｉｎｉａアスパラギナーゼの製造のための方法
CN110684759B (zh) * 2018-07-06 2023-10-17 南京吉芮康生物科技研究院有限公司 重组l-门冬酰胺酶及其制备方法和用途
EP3930702A1 (en) 2019-03-01 2022-01-05 Flamel Ireland Limited Gamma-hydroxybutyrate compositions having improved pharmacokinetics in the fed state
GB201912020D0 (en) * 2019-08-21 2019-10-02 Porton Biopharma Ltd Therapeutic Conjugate
US11583510B1 (en) 2022-02-07 2023-02-21 Flamel Ireland Limited Methods of administering gamma hydroxybutyrate formulations after a high-fat meal
US11779557B1 (en) 2022-02-07 2023-10-10 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5672662A (en) * 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications

Also Published As

Publication number Publication date
EP2451486B1 (en) 2017-05-03
SI2451486T1 (en) 2018-01-31
ME02945B (me) 2018-04-20
SI2451486T2 (sl) 2023-05-31
EP2451486B2 (en) 2023-01-18
RS57077B1 (sr) 2018-06-29
HRP20171180T4 (hr) 2023-06-09
PL2451486T3 (pl) 2018-02-28
HRP20171180T1 (hr) 2018-01-26
PL2451486T5 (pl) 2023-05-15
CY1119779T1 (el) 2018-06-27
EP2451486A1 (en) 2012-05-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12441992B2 (en) Method of treating AML with PEGylated l-asparaginase
RS57077B2 (sr) Pegilovana l-asparaginaza
EP3642340B1 (en) Modified l-asparaginase
JP2024069234A (ja) アスパラギナーゼを用いた治療法
EP3418383A1 (en) Modified l-asparaginase
HK1173092B (en) Pegylated l-asparaginase
HK40090811A (en) Modified l-asparaginase
HK40029594A (en) Modified l-asparaginase
HK40029594B (en) Modified l-asparaginase