RS57105B1 - Kombinovana upotreba cry1ca i cry1fa proteina za upravljanje rezistencijom kod insekta - Google Patents

Description

Stanje tehnike

[0001] Ljudi gaje kukuruz za primenu u ishrani i dobijanju energije. Ljudi takoÿe gaje mnogo drugih useva, uključujući soju i pamuk. Insekti se hrane biljkama i oštećuju ih i na taj način otežavaju ove ljudske napore. Svake godine se troše milijarde dolara kako bi se kontrolisale štete od insekata, a dodatne milijarde su izgubljene u efektima štete koju nanose. Insekticidi sintetisani uz pomoć organske hemije bili su primarni alati za kontrolu štetnih insekata, ali biološki insekticidi, kao što su insekticidni proteini dobijeni iz Bacillus thuringiensis (Bt), odigrali su važnu ulogu u nekim područjima. Sposobnost da se proizvedu biljke otporne na insekte kroz transformaciju sa Bt genom za insekticidni protein donela je revoluciju u postupcima poljoprivrede i povećala značaj i vrednost insekticidnih proteina i njihovih gena.

[0002] Nekoliko Bt proteina korišćeno je za stvaranje transgenskih biljaka otpornih na insekte koji su do danas uspešno registrovani i komercijalizovani. To uključuje Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1F i Cry3Bb u kukuruzu, Cry1Ac i Cry2Ab u pamuku i Cry3A u krompiru.

[0003] Komercijalni proizvodi koji eksprimiraju ove proteine eksprimiraju jedan protein, osim u slučajevima kada je poželjan kombinovani insekticidni spektar od 2 proteina (na pr. Cry1Ab i Cry3Bb u kukuruzu su kombinovani da bi se obezbedila otpornost na štetočine od leptirastih štetočina i zlatice) ili gde nezavisno delovanje proteina ih čini korisnim kao sredstvo za odlaganje razvoja rezistencije u osetljivim populacijama insekata (na pr. Cry1Ac i Cry2Ab u pamuku koji su kombinovani kako bi se obezbedila otpornost prema Heliothis virescens).

[0004] ýinjenica je da neke od osobina transgenskih biljaka otpornih na insekte, koje su dovele do brzog i široko rasprostranjenog usvajanja ove tehnologije, takoÿe dovode do zabrinutosti da će populacije štetočina razviti rezistenciju na insekticidne proteine koje proizvode ove biljke. Predloženo je nekoliko strategija za očuvanje korisnosti osobina otpornosti na insekte zasnovanih na Bt-u, koje obuhvataju primenu proteina u visokoj dozi u kombinaciji sa površinskim pojasom zaštite i alternacijama sa ili u saradnji sa različitim toksinima (McGaughey i sar. (1998), "B.t. Resistance Management," Nature Biotechnol. 16:144-146).

[0005] Proteini odabrani za upotrebu u IRM (Insect Resistance Management) moraju samostalno vršiti insekticidni efekat, tako da rezistencija koja je razvijena za jedan protein nije prisutna za drugi protein (tj. nema unakrsne rezistencije na proteine). Ako je, na primer, odabrana populacija štetočina rezistentna na "Protein A", a osetljiva na "Protein B", zaključLćemo da nema unakrsne rezistencije i da bi kombinacija proteina A i proteina B bila efikasna u odlaganju pojavljivanja rezistencije na sam Protein A.

[0006] U odsustvu rezistentnih populacija insekata, mogu biti izvedene procene na osnovu drugih karakteristika za koje je pretpostavljeno da mogu biti povezane sa mehanizmom delovanja i potencijalom unakrsne rezistencije. Predloženo je korišćenje receptoromposredovano vezivanje u identifikaciji insekticidnih proteina koji verovatno ne pokazuju unakrsnu rezistenciju (van Mellaert i sar., 1999). Ključni pokazatelj za pretpostavljeni nedostatak unakrsne rezistencije koji je inherentan u ovom pristupu jeste to što se insekticidni proteini ne nadmeću za receptore kod senzitivne vrste insekata.

[0007] U slučaju da se dva Bt toksina nadmeću za isti receptor, onda ako taj receptor mutira u tom insektu tako da se jedan od toksina više ne vezuje za taj receptor i stoga više nije insekticidan za dati insekt, možda bi bio slučaj da će insekt biti rezistentan i na drugi toksin (koji se konkurentno vezuje za isti receptor). Odnosno, može se reći da je insekt unakrsno rezistentan na oba Bt toksina. Meÿutim, ako se dva toksina vezuju za dva različita receptora, to može biti indikacija da insekt ne bi bio istovremeno otporan na oba toksina.

[0008] Cry1Fa je koristan u kontroli mnogih vrsta lepidopteranskih štetočina, uključujući evropski kukuruzni plamenac (ECB; Ostrinia nubilalis (Hćbner)) i gusenica malih sovica (FAW; Spodoptera frugiperda), i aktivan je protiv moljca šećerne trske (SCB; Diatraea saccharalis).

[0009] Cry1Fa protein, koji je proizveden u biljkama kukuruza koje sadrže TC1507, odgovoran je za vodeću osobinu otpornosti na insekte u kontroli FAW-a. Cry1Fa se dalje koristi u proizvodima Herculex®, SmartStax™ i WideStrike™.

[0010] Sposobnost za sprovoÿenje istraživanja vezivanja za receptore (kompetitivnih ili homolognih) korišćenjem Cry1Fa proteina je ograničena jer najčešća tehnika, dostupna za obeležavanje proteina detekcije u testovima vezivanja receptora, inaktivira insekticidnu aktivnost Cry1Fa proteina.

[0011] Dodatni Cry toksini navedeni su na zvaničnom sajtu odbora za B.t. nomenklaturu (Crickmore i sar.; lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). Videti Dodatak A, koji je priložen. Trenutno je gotovo 60 glavnih grupa "Cry" toksina (Cry1-Cry59), sa dodatnim Cyt toksinama i VIP toksinama i slično. Mnoge od svake numeričke grupe imaju podgrupe označene velikim slovom, a podgrupe označene sa velikim slovom imaju pod-podgrupe označene sa malim slovom. (Cry1 ima A-L, a Cry1A ima a-i, na primer).

KRATAK PREGLED PRONALASKA

[0012] Predmetni pronalazak delimično se odnosi na iznenaÿujuće otkriće da populacija jesenjih gusenica malih sovica (Spodoptera frugiperda; FAW) odabrana za ispitivanje rezistentnosti na insekticidnu aktivnost Cry1Fa proteina, nije rezistentna na insekticidnu aktivnost Cry1Ca proteina. Kao što će stručnjak u tehnici prepoznati korist ovog otkrića, biljke koje eksprimiraju ova dva insekticidna proteina ili njihove insekticidne delove, biće korisne u odlaganju ili sprečavanju razvoja rezistentnosti na bilo koji od ovih pojedinačnih insekticidnih proteina.

[0013] Predmetni pronalazak je takoÿe podržan otkrićem da se Cry1Fa i Cry1Ca ne nadmeću meÿusobno za vezujuće receptore crevnih ćelija iz FAW-a (ili iz Diatraea saccharalis (moljca šećerne trske)).

[0014] Predmetni pronalazak se takoÿe delimično odnosi na trostruke štapove ili "piramide" od tri (ili više) toksina, pri čemu su Cry1Fa i Cry1C toksini osnovni par. Jedna poželjna piramida obezbeÿuje najmanje dva proteina koja pružaju aktivnost ne-unakrsne rezistencije prema dvema vrstama štetočina - FAW i ECB (evropski kukuruzni plamenac Ostrinia nubilalis): Cry1Fa plus Cry1Ca plus jedan ili više toksina protiv ECB, kao što je Cry1Ab. U nekim poželjnim varijantama piramide, odabrani toksini imaju tri različita načina delovanja prema FAW-u. Poželjne kombinacije piramida su Cry1Fa plus Cry1Ca plus drugi toksin/gen izabran iz grupe koju čine Vip3Ab, Cry1D, Cry1Be i Cry1E. Biljke (i površine koje su posejane takvim biljem) koje proizvode ova tri toksina su uključene u okvire predmetnog pronalaska. Dodatni toksini/geni takoÿe mogu biti dodati, ali posebno ovi trojni toksini bi, prema predmetnom pronalasku, povoljno i iznenaÿujuće pružali tri načina delovanja protiv FAW-a. Ovo može pomoći u smanjenju ili eliminaciji zahteva za površinskim pojasom zaštite. Predmetni pronalazak se takoÿe odnosi uopšteno na upotrebu tri insekticidna proteina (Cry proteini u nekim poželjnim izvoÿenjima) koji se meÿusobno ne nadmeću u delovanju protiv jedne ciljane štetočine.

KRATAK OPIS SLIKA

[0015]

Slika 1: Procena oštećenja kukuruznih listova izazvanih in vitro pri izlaganju novonastalim larvama malih sovica (FAW) i gusenicama malih sovica rezistentnih na na Cry1F (rFAW). Transgenske T0 biljke odabrane nakon transformacije sa pDAS5162 su podeljene u dve grupe pomoću imunoblot skrininga korišćenjem antitela DIG152RPC1: biljke koje ne proizvode DIG-109 (na levoj strani slike), i one koje imaju detektabilne nivoe DIG-109 (u centru slike). DIG-109 pozitivne biljke su rangirane po nivou ekspresije (od leve na desno, najniže do najviše). HP analiza za DSM2 je završena na 36 transformiranih pDAS5162 linija. Jednostavan dogaÿaj integracije, definisan kao 1-2 kopije gena, detektovan je u 95% uzoraka. Rezultati bioloških eseja iz pozitivnih i negativnih kontrolnih biljaka prikazani su sa desne strane slike.

Slika 2: Kompeticija Cry1Fa jezgra toksina, Cry1Ca jezgra toksina i 125I-označenog Cry1Ca jezgra toksina za vezivanje na Spodoptera frugiperda BBMV.

KRATAK OPIS SEKVENCI

[0016]

SEK ID BR.:1 Cry1Ca osnovna/Cry1Ab protoksin himerni protein 1164 aa (DIG-152) (verzija za pMYC2547)

SEK ID BR.:2 druga Cry1Ca osnovna/Cry1Ab protoksin himerni protein 1164 aa (DIG-109) (verzija za kukuruz)

SEK ID BR.:3 optimizovana za kukuruz CDS koji kodira za DIG-1093492 bp

SEK ID BR.:4 je Cry1Fa osnovni toksin.

SEK ID BR.:5 je Cry1Ca osnovni toksin.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0017] Kao što je ovde objavljeno, Cry1Ca toksin koji je proizveden u transgenskom kukuruzu i drugim biljkama (na primer, pamuk i soja) veoma je efikasan u kontroli gusenica malih sovica (FAW; Spodoptera frugiperda) koje su razvile otpornost na aktivnost Cry1Fa. Prema tome, predmetni pronalazak se delimično odnosi na iznenaÿujuće otkriće da su gusenice malih sovica otporne na Cry1Fa osetljive (tj. nisu unakrsno rezistentne) na Cry1Ca.

[0018] Predmetni pronalazak delimično se odnosi i na iznenaÿujuće otkriće da je Cry1Ca toksin efikasan u zaštiti biljaka (kao što su kukuruzne biljke) od oštećenja od strane Cry1Faotpornih gusenica malih sovica. Za diskusiju o ovoj štetočini videti na pr. Tabashnik, PNAS (2008), vol.105 no.49, 19029-19030.

[0019] Predmetni pronalazak obuhvata upotrebu Cry1Ca toksina za zaštitu kukuruza i drugih ekonomski važnih biljnih vrsta od oštećenja i gubitka prinosa uzrokovanih ishranom gusenica malih sovica ili za smanjenje populacije gusenica malih sovica koje su razvile otpornost na Cry1Fa.

[0020] Predmetni pronalazak tako upućuje IRM grupe na sprečavanje ili ublažavanje efekta razvoja rezistentnosti kod gusenica malih sovica na Cry1Fa i/ili Cry1Ca.

[0021] Predmetni pronalazak obezbeÿuje kompozicije za kontrolu štetočina lepidoptera, koje sadrže ćelije koje proizvode Cry1Fa osnovni protein koji sadrži toksin i Cry1Ca osnovni protein koji sadrži toksin.

[0022] Pronalazak dalje obuhvata domaćina koji se transformiše tako da proizvedi i Cry1Fa osnovni protein koji sadrži toksin i Cry1Ca osnovni protein koji sadrži toksin, pri čemu navedeni domaćin je mikroorganizam ili biljka. Predmetni polinuklotid(i) su poželjni u genetskom konstruktu pod kontrolom (operativno povezan sa / sadrži) promotera koji nije Bacillus thuringiensis. Predmetni polinukleotidi mogu da sadrže upotrebu kodona za poboljšanu ekspresiju u biljci.

[0023] Dodatno je namera da pronalazak obezbedi metod za kontrolu štetočina lepidoptera koji obuhvata kontakt navedenih štetočina ili okoline navedenih štetočina sa efektivnom količinom preparata koji sadrži Cry1Fa osnovni protein koji sadrži toksin i dalje sadrži Cry1Ca osnovni protein koji sadrži toksin.

[004] Jedna varijanta ovog pronalaska obuhvata biljku kukuruza (i druge biljke - na primer, pamuk i soju) koja sadrži gen koji se može eksprimirati u biljci a koji kodira za Cry1Ca osnovni protein koji sadrži toksin i gen koji se može eksprimirati u biljci a koji kodira za Cry1Fa osnovni toksin koji sadrži protein, i seme takve biljke.

[0025] Sledeća varijanta pronalaska obuhvata biljku kukuruza (i druge biljke - na primer, pamuk i soju) gde gen koji se može eksprimirati u biljci, a koji kodira Cry1Ca osnovni protein koji sadrži toksin i gen koji se može eksprimirati u biljci a koji kodira Cry1Fa osnovni toksin koji sadrži protein, su uvedeni u pomenutu biljku kukuruza i u seme takve biljke.

[0026] (Za pregled Cry1C kao potencijalnog bioinsekticida u biljkama, videti Avisar i sar. 2009). Avisar D, Eilenberg H, Keller M, Reznik N, Segal M, Sneh B, Zilberstein A (2009) The Bacillus thuringiensis delta-endotoxin Cry1C as a potential bioinsecticide in plants. Plant Science 176:315-324.)

[0027] Receptori insekata. Kao što je opisano u Primerima, istraživanja kompetitivno vezujućih mesta na receptoru, korišćenjem radioaktivno označenog Cry1Ca osnovnog toksina proteina, pokazuju da se Cry1Fa osnovni toksin protein ne nadmeće za mesto na visoko afinitetnom vezujućem mestu, koje je prisutno u tkivima FAW insekata, a na koje se vezuje Cry1Ca. Ovi rezultati ukazuju na to da je kombinacija Cry1Fa i Cry1Ca proteina efektivno sredstvo za ublažavanje razvoja rezistencije na Cry1Fa (i isto tako, razvoj rezistencije na Cry1Ca) kod FAW populacija i verovatno bi povećao nivo otpornosti na ove štetočine u biljkama kukuruza koje eksprimiraju oba proteina.

[0028] Prema tome, delom zasnovano na gore navedenim podacima i na drugim mestima ovde, smatra se da se koprodukcija (slaganje) Cry1Ca i Cry1Fa proteina može koristiti za proizvodnju visoko dozne IRM grupe za FAW. U ovu kombinaciju se mogu dodati i drugi proteini kako bi se proširio spektar kontrole insekata. Na primer, u kukuruzu, dodatak Cry1Ab bi kreirao IRM grupu za kontrolu evropskog kukuruznog plamenca.

[0029] Druga mogućnost primene bi bila korišćenje jednog ili oba Cry1Fa i Cry1Ca proteina u kombinaciji sa Cry1Ab proteinom kako bi se ublažio razvoj otpornosti. Prema tome, druga mogućnost primene predmetnog pronalaska bila bi da se koristi jedan ili oba Cry1Fa i Cry1Ca proteina u područjima u kojima se gaje usevi, gde je primena Cry1Ab proteina postala neefikasna u kontrolisanju moljca šećerne trske zbog razvoja rezistentnih populacija. Shodno tome, poželjna kombinacija "trostrukih štapova" ili "piramide" za upotrebu prema predmetnom pronalasku je Cry1F plus Cry1C plus Cry1Ab.

[0030] Predmetni pronalazak takoÿe se delimično odnosi na trostruke štapove ili "piramide" od tri (ili više) toksina, pri čemu Cry1Fa i Cry1C toksini čine osnovni par. Jedna poželjna piramida obezbeÿuje najmanje dva proteina koja obezbeÿuju ne-unakrsnu rezistenciju protiv dve vrste štetočina - FAW i ECB (evropski kukuruzni plamenac, Ostrinia nubilalis): Cry1Fa plus Cry1Da plus jedan ili više ECB toksina, kao što je Cry1Ab (vidi US 20080311096 ), jer je Cry1F aktivan protiv oba insekata. Ostali ECB toksini uključuju Cry1Be (vidi USSN 61/284,290, podneta 16. decembra 2009. godine), Cry1I (videti USSN 61/284,278, podneta 16. decembra 2009. godine), Cry2Aa (videti USSN 61/284,278, podneta 16. decembra 2009.) i DIG -3 (videti US 201000269223). U nekim poželjnim varijantama piramide, odabrani toksini imaju tri odvojena načina delovanja prema FAW-u; ove poželjne kombinacije piramida su Cry1Fa plus Cry1Ca plus drugi toksin/gen odabran iz grupe koja se sastoji od Vip3Ab, Cry1D (videti USSN 61/284,252, podneta 16. decembra 2009), Cry1Be i Cry1E (videti USSN 61/284,278; podneta 16. decembra 2009). Biljke (i površine koje su posejane takvim biljkama) koje proizvode ova tri toksina su uključene u okvire predmetnog pronalaska. Dodatni toksini/geni takoÿe mogu biti dodati, ali ovi trojni štapovi bi, prema predmetnom pronalasku, povoljno i iznenaÿujuće pružali tri načina delovanja protiv FAW-a. Ovo može pomoći u smanjenju ili eliminaciji zahteva za površinskim pojasom zaštite. Polje obraÿeno na ovaj način, koje obuhvata preko 10 hektara je obuhvaćeno predmetnim pronalaskom.

[0031] Drugi Vip3 toksini, na primer, navedeni su u priloženom dodatku A. Ovi GENBANK brojevi se takoÿe mogu koristiti za dobijanje sekvenci za bilo koji od gena i proteina koji su opisani ili navedeni ovde.

[0032] U.S. Patent br.5,188,960 i U.S. Patent br.5,827,514 opisuju Cry1Fa osnovne proteine koji sadrže toksin pogodne za primenu ovog pronalaska. U.S. Patent br.6,218,188 opisuje DNK sekvencu koja je optimizovana za biljku, a koja kodira Cry1Fa osnovne proteine koji sadrže toksin a koje su pogodne za upotrebu u predmetnom pronalasku.

[0033] Kombinacije toksina opisanih u predmetnom pronalasku mogu se koristiti za kontrolu lepidopteranskih štetočina. Odrasli lepidopterani, na primer, leptiri i moljci, prvenstveno se hrane cvetnim nektarima i značajni su efektori polinacije. Skoro sve lepidopteranske larve, tj. gusenice, se hrane biljkom, a mnogi su ozbiljne štetočine. Gusenice se hrane na ili unutar lišća ili na korenu ili stabljici biljke, lišavajući biljku hranjivim materijama i često uništavajući strukturu fizičke podrške biljaka. Pored toga, gusenice se hrane na voću, tkaninama i uskladištenom zrnu i brašnu, uništavajući ove proizvode spremne za prodaju ili ozbiljno umanjujući njihovu vrednost. Kao što je ovde korišćeno, upućivanje na lepidopteranske štetočine, odnosi se na različite životne faze štetočina, uključujući i larvalne faze.

[0034] Neki himerni toksini predmetnog pronalaska obuhvataju potpuni N-terminalni osnovni deo toksina iz Bt toksina i, u nekom trenutku prolazeći kraj dela osnovnog toksina, protein ima tranziciju u heterolognu protoksinsku sekvencu. N-terminalni, insekticidno aktivan, toksinski deo Bt toksina naziva se "osnovni" toksin. Prelazak iz segmenta osnovnog toksina u heterologni segment protoksina može se javiti približno na spoju toksin/protoksin ili, alternativno, deo nativnog protoksina (koji se proteže nakon dela osnovnog toksina) može se zadržati, uz prelazak na heterologni deo protoksina koji se nadalje javlja.

[0035] Kao primer, jedan himerni toksin predmetnog pronalaska je deo potpunog osnovnog toksina CriyFa (aminokiseline od 1 do 601) i heterologni protoksin (aminokiseline 602 do C-terminalnog dela). U jednom poželjnom izvoÿenju, deo himernog toksina koji sadrži protoksin izveden je iz toksina proteina Cry1Ab. Kao drugi primer, drugi himerni toksin predmetnog pronalaska, kao što je opisano u SEK ID BR.:1, ima deo potpunog osnovnog toksina Cry1Ca (aminokiseline 1 do 619) i heterologni protoksin (aminokiseline 620 do C-terminalnog dela). U poželjnom izvoÿenju, deo himernog toksina koji sadrži protoksin izveden je iz toksina proteina Cry1Ab.

[0036] Osoba stručna u ovom stanju tehnike će ceniti da Bt toksini, čak i unutar odreÿene klase kao što je Cry1F, će varirati do neke mere u dužini i preciznom položaju tranzicije sa dela osnovnog toksina na deo protoksina. Tipično, toksini Cry1Ca i Cry1Fa su dužine od oko 1150 do oko 1200 amino kiselina. Tranzicija sa dela osnovnog toksina u deo protoksina obično se javlja izmeÿu oko 50% do oko 60% od toksina sa celokupnom dužinom. Himerni toksin iz predmetnog pronalaska uključLće puno proširenje ovog dela N-terminalnog dela osnovnog toksina. Prema tome, himerni toksin će sadržati najmanje oko 50% celokupne dužine proteina Cry1Fa Bt toksina ili najmanje oko 50% celokupne dužine Cry1Ca Bt toksina proteina. Ovo će obično biti najmanje oko 590 aminokiselina. Što se tiče protoksinskog dela, puno proširenje Cry1Ab protoksinskog dela proteže se od kraja dela osnovnog toksina do C-terminalnog dela molekula.

[0037] Geni i toksini. Geni i toksini korisni prema predmetnom pronalasku uključuju ne samo ovde opisane sekvence pune dužine, već i fragmente ovih sekvenci, varijante, mutante i fuzione proteine koji zadržavaju karakterističnu pesticidnu aktivnost toksina posebno ovde prikazanih. Kako se ovde koristi, termini "varijante" ili "varijacije" gena se odnose na nukleotidne sekvence koje kodiraju iste toksine ili koje kodiraju ekvivalentne toksine koji imaju pesticidnu aktivnost. Kao što se ovde koristi, termin "ekvivalentni toksini" odnosi se na toksine koji imaju istu ili u suštini istu biološku aktivnost protiv ciljanih štetočina kao toksini iz patentnih zahteva.

[0038] Kao što je ovde korišćeno, granice predstavljaju približno 95% (od Cry1Fa i 1Ca), 78% (od Cry1F i Cry1C) i 45% (od Cry1) identiteta sekvence, prema "Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins," N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, and D.H. Dean.

Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813. Ovi preseci se takoÿe mogu primeniti samo na osnovne toksine (za Cry1F i Cry1C toksine).

[0039] Trebalo bi biti očigledno osobi stručnoj u ovoj tehnici da geni koji kodiraju aktivne toksine mogu biti identifikovani i dobijeni na više načina. Specifični geni ili delovi gena koji su ovde prikazani, mogu se dobiti od izolata deponovanih u depozitorijumu kultura. Ovi geni, ili njihovi delovi ili varijante, takoÿe mogu biti sintetički konstruisani, na primer, upotrebom sintetizatora gena. Varijacije gena mogu se lako konstruisati koristeći standardne tehnike za pravljenje tačkastih mutacija. Takoÿe, fragmenti ovih gena mogu se napraviti korišćenjem komercijalno dostupnih egzonukleaza ili endonukleaza prema standardnim procedurama. Na primer, enzimi kao što je Bal31 ili mutageneza usmerena na lokaciju, mogu se koristiti za sistematsko presecanje nukleotida sa krajeva ovih gena. Geni koji kodiraju aktivne fragmente mogu se takoÿe dobiti korišćenjem različitih restrikcionih enzima. Proteaze se mogu koristiti za direktno dobijanje aktivnih fragmenata ovih proteina toksina.

[0040] Fragmenti i ekvivalenti koji zadržavaju pesticidnu aktivnost prikazanih toksina bi bili u okviru predmetnog pronalaska. Takoÿe, zbog redundantnosti genetičkog koda, varijacije različitih sekvenci DNK mogu kodirati sekvence aminokiselina koje su ovde prikazane.

Dobro je poznato osobama stručnim u tehnici da kreiraju ove alternativne DNK sekvence koje kodiraju iste ili u suštini iste toksine. Ove varijantne DNK sekvence su u okviru predmetnog pronalaska. Kao što je ovde korišćeno, upućivanje na "u suštini istu" sekvencu odnosi se na sekvence koje imaju aminokiselinske supstitucije, delecije, dodatke ili insercije koje ne utiču znatno na pesticidnu aktivnost. Fragmenti gena koji kodiraju proteine koji zadržavaju pesticidnu aktivnost takoÿe su uključeni u ovu definiciju.

[0041] Dalji metod za identifikaciju gena koji kodiraju toksine i delove gena koji su korisni prema predmetnom pronalasku je upotreba oligonukleotidnih proba. Ove probe su detektibilne nukleotidne sekvence. Ove sekvence mogu se detektovati na osnovu odgovarajućeg obeležavanja ili mogu biti zapravo fluorescentne, kako je opisano u meÿunarodnoj prijavi br. WO93/16094. Kao što je dobro poznato u stanju tehnike, ako se molekul probe i uzorak nukleinske kiseline hibridiziraju formiranjem jake veze izmeÿu dva molekula, može se razumno pretpostaviti da sonda i proba imaju značajnu homologiju.

Poželjno, hibridizacija se odvija pod strogim uslovima pomoću tehnika poznatih u stanju

1

tehnike, kao što je opisano, na primer, u Keller, G. H., M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp.169-170. Neki primeri koncentracije soli i kombinacija temperature su kako sledi (prema porastu stringencije): 2X SSPE ili SSC na sobnoj temperaturi; 1X SSPE ili SSC na 42° C; 0,1X SSPE ili SSC na 42° C; 0,1X SSPE ili SSC na 65° C. Detekcija probe obezbeÿuje način za utvrÿivanje, na poznat način, da li je došlo do hibridizacije. Ovakva analiza uzorka obezbeÿuje brz metod za identifikaciju gena koji kodiraju za toksin predmetnog pronalaska. Segmenti nukleotida koji se koriste kao probe prema pronalasku mogu se sintetisati koristeći DNK sintezator i standardne procedure. Ove nukleotidne sekvence mogu se takoÿe koristiti kao PCR prajmeri za amplifikaciju gena predmetnog pronalaska.

[0042] Varijantni toksini. Odreÿeni toksini predmetnog pronalaska su ovde posebno naznačeni. Pošto su ovi toksini samo primeri toksina predmetnog pronalaska, treba biti jasno da predmetni pronalazak sadrži varijante ili ekvivalentne toksine (i nukleotidne sekvence koje kodiraju ekvivalentne toksine) koje imaju istu ili sličnu pesticidnu aktivnost toksina koji je opisan kao primer. Ekvivalentni toksini će imati homologiju aminokiselina sa toksinom opisanim kao primer. Ova homologija aminokiselina će obično biti veća od 75%, poželjno će biti veća od 90%, a najpoželjnije će biti veća od 95%. Homologija aminokiselina će biti najveća u kritičnim regionima toksina koji su odgovorni za biološku aktivnost ili su uključeni u odreÿivanje trodimenzionalne konfiguracije koja je na kraju odgovorna za biološku aktivnost. U tom smislu, odreÿene supstitucije amino kiselina su prihvatljive i mogu se Rčekivati ako su ove supstitucije u oblastima koje nisu kritične za aktivnost ili su konzervativne supstitucije aminokiselina koje ne utiču na trodimenzionalnu konfiguraciju molekula. Na primer, aminokiseline se mogu postaviti u sledeće klase: nepolarne, nenaelektrisane polarne, bazne i kisele. Konzervativne supstitucije u kojima se jedna aminokiselina jedne klase zamenjuje sa drugom aminokiselinom istog tipa pada u opseg predmetnog pronalaska sve dok supstitucija ne utiče bitno na biološku aktivnost jedinjenja. Tabela 1 prikazuje listu primera aminokiselina koje pripadaju svakoj klasi.

[0043] U nekim slučajevima, mogu se vršiti i ne konzervativne zamene. Kritični faktor je da ove supstitucije ne smeju značajno umanjiti biološku aktivnost toksina.

[0044] Rekombinantni domaćini. Geni koji kodiraju toksine iz predmetnog pronalaska mogu se uneti u širok spektar mikrobioloških ili biljnih domaćina. Ekspresija gena toksina dovodi do, direktno ili indirektno, intracelularne proizvodnje i održavanja pesticida. Konjugacioni transfer i rekombinantni transfer može se koristiti za stvaranje Bt sojeva koji eksprimiraju oba toksina predmetnog pronalaska. Drugi organizmi domaćina mogu se takoÿe transformisati sa jednim ili oba gena toksina, a zatim se koristiti za postizanje sinergističkog efekta. Sa pogodnim mikrobiološkim domaćinima, na pr. Pseudomonas, mikroorganizmi se mogu primeniti na mestu štetočina, gde će se razmnožavati i biti ingestirani. Rezultat je kontrola štetočina. Alternativno, mikroorganizam koji je domaćin za gen toksina može da se tretira pod uslovima koji produžavaju aktivnost toksina i stabilizuju ćeliju. Tretirana ćelija, koja zadržava toksičnu aktivnost, može se primeniti u okolini ciljanog štetočine.

[0045] Tamo gde se Bt gen toksina uvodi preko vektora u pogodnog mikrobiološkog domaćina i navedeni domaćin se primjenjuje u životnoj sredini u živom stanju, bitno je da se koriste odreÿeni mikrobiološki domaćini. Kao mikroorganizmi domaćini odabrani su oni za koje je poznato da zauzimaju "fitosferu" (filoplanum, filosferu, rizosferu i/ili rizoplanum) jedne ili više useva od interesa. Ovi mikroorganizmi se biraju tako da budu sposobni da uspešno konkurišu u odreÿenom okruženju (useva i drugih staništa insekata) mikroorganizmima divljeg tipa, obezbeÿujući stabilno održavanje i ekspresiju gena koji eksprimira polipeptidni pesticid i, poželjno, obezbeÿujući poboljšanu zaštitu pesticida od degradacije i inaktivacije u životnoj sredini.

[0046] Za veliki broj mikroorganizama je poznato da naseljavaju filoplanum (površinu listova biljaka) i/ili rizosferu (zemlja koja okružuje koren biljke) širokog spektra važnih useva. Ovi mikroorganizmi uključuju bakterije, alge i gljivice. Od posebnog interesa su mikroorganizmi, kao što su bakterije, na pr., rodova Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacte-num, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, i Alcaligenes; gljivice, posebno kvasci, na pr., rodova Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, i Aureobasidium. Od posebnog interesa su takve vrste fitosfernih bakterija kao što su Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobactenium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, i Azotobacter vinlandii; i fitosfernih vrsta kvasaca kao što su Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae, i Aureobasidium pollulans. Od posebnog interesa su pigmentirani mikroorganizmi.

[0047] Dostupno je mnoštvo metoda za uvoÿenje Bt gena koji kodira toksin u domaćine mikroorganizme pod uslovima koji omogućavaju stabilno održavanje i ekspresiju gena. Ove metode su dobro poznate stručnjacima i opisane su, na primer, u US Pat. Br.5135867.

[0048] Tretiranje ćelija. Bacillus thuringiensis ili rekombinantne ćelije koje izražavaju Bt toksine mogu se tretirati kako bi se produžila aktivnost toksina i stabilizovala ćelija.

Mikrokapsule pesticida koje su formirane sadrže Bt toksin ili toksine unutar ćelijske strukture koja je stabilizovana i štiti toksin kada se mikrokapsula primeni na okolinu ciljne štetočine. Pogodne ćelije domaćina mogu uključivati ili prokariote ili eukariote, koji se obično ograničavaju na one ćelije koje ne proizvode supstance koje su toksične za više organizme, kao što su sisari. Meÿutim, mogu se koristiti organizmi koji proizvode supstance koje su toksične za više organizme, gde su toksične supstance nestabilne ili je nivo primene dovoljno nizak, kako bi se izbegla eventualna mogućnost toksičnosti za sisara domaćina. Kao domaćini, od posebnog interesa će biti prokariote i niži eukarioti, kao što su gljive.

[0049] ûelija je obično intaktna i bitno je da je u proliferativnom obliku kada se tretira, umesto u sporogenom obliku, iako u nekim slučajevima se mogu primeniti i spore.

[0050] Tretman mikrobne ćelije, na pr., mikroorganizma koji sadrži gen ili gene B.t. toksina, može biti hemijskim ili fizičkim sredstvima ili kombinacijom hemijskih i/ili fizičkih sredstava, sve dok tehnika ne utiče štetno na svojstva toksina, niti smanjuje ćelijsku sposobnost da zaštiti toksin. Primeri hemijskih reagensa su sredstva za halogenovanje, naročito halogeni sa atomskim brojem 17-80. Posebno, jod se može koristiti pod blagim uslovima i uz dovoljno vremena za postizanje željenih rezultata. Ostale pogodne tehnike uključuju tretman sa aldehidima, kao što je glutaraldehid; antiinfektivima, kao što su zefiran hlorid i cetilpiridinijum hlorid; alkoholima, kao što su izopropil i etanol; raznim histološkim fiksativima, kao što su jod po Lugolu, Bouin-ov fiksativ, razne kiseline i Helijev fiksativ (videti: Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman and Company, 1967); ili kombinacije fizičkih (toplotnih) i hemijskih agenasa koji čuvaju i produžavaju aktivnost toksina proizvedenog u ćeliji kada se ćelija primenadministrira u okolinu domaćina.

1

Primeri fizičkih sredstava su zračenja kratka talasne dužine, kao što su gama zračenje i X-zračenje, zamrzavanje, UV zračenje, liofilizacija i slično. Postupci za tretman mikrobnih ćelija su opisani u U.S. patentu br.4,695,455 i 4,695,462.

[0051] ûelije će uglavnom imati poboljšanu strukturnu stabilnost koja će povećati otpornost na uslove okoline. Gde je pesticid u proformi, metod tretmana ćelija treba odabrati tako da ne inhibira procesiranje proforme do aktivne forme pesticida od strane ciljnog patogena štetočine. Na primer, formaldehid će ukrstiti proteine i može inhibirati obradu proforme polipeptidnog pesticida. Način tretiranja treba da zadrži bar značajan deo bio-dostupnosti ili bioaktivnosti toksina.

[0052] Karakteristike od posebnog interesa u izboru ćelije domaćina u svrhu proizvodnje uključuju jednostavnost uvoÿenja jednog ili više gena B.t. gena u domaćina, dostupnost ekspresionih sistema, efikasnost ekspresije, stabilnost pesticida u domaćinu i prisustvo pomoćnih genetskih sposobnosti. Karakteristike od interesa za upotrebu kao pesticidne mikrokapsule uključuju osobine zaštite pesticida, kao što su debeli ćelijski zidovi, pigmentacija i intracelularno pakovanje ili formiranje inkluzionih tela; opstanak u vodenoj sredini; nedostatak toksičnosti za sisare; atraktivnost za štetočine radi ingestije; lakoća ubijanja i fiksiranja bez oštećenja toksina; i slično. Druga razmatranja uključuju lakoću formulacije i rukovanja, ekonomičnost, stabilnost skladištenja i slično.

[0053] Rast ćelija. ûelijski domaćin koji sadrži B.t. insekticidni gen ili gene može se gajiti u bilo kom prikladnom hranljivom medijumu, pri čemu DNK konstrukt pruža selektivnu prednost, obezbeÿenu za selektivni medijum tako da u suštini sve ili sve ćelije zadržavaju B.t. gen. Ove ćelije se zatim mogu sakupljati u skladu sa konvencionalnim načinima.

Alternativno, ćelije se mogu tretirati pre sakupljanja.

[0054] ûelije koje proizvode B.t. toksine iz pronalaska mogu se kultivisati koristeći standardne medijume za gajenje i tehnike fermentacije. Po završetku ciklusa fermentacije, bakterije se mogu prikupiti prvo razdvajanjem B.t. spora i kristala iz fermentacionog bujona načinima koji su dobro poznati u struci. Prikupljene B.t. spore i kristali mogu se formulisati u obliku vlažećeg praha, tečnog koncentrata, granula ili drugih formulacija dodavanjem površinski aktivnih materija, disperzanata, inertnih nosača i drugih komponenata radi lakšeg rukovanja i primene za odreÿene ciljne štetočine. Ove formulacije i procedure primene su dobro poznate u struci.

[0055] Formulacije. Formulisane granule mamaca koje sadrže atraktant i spore, kristale i toksine iz B.t. izolata ili rekombinantnih ćelija mikroorganizama koje sadrže gene koje se mogu dobiti iz B.t. izolata opisanih ovde, mogu se primeniti na zemljištu. Formulisani proizvod se takoÿe može primeniti u tretmanu semena u vidu omotača ili u tretmanu korena ili u tretmanu celih biljaka u kasnijim fazama rasta useva. Za tretman biljaka i zemljišta, B.t. ćelije se mogu koristiti u vidu vlažećih prahova, granula ili prašine, mešanjem sa različitim inertnim materijalima, kao što su neorganski minerali (filosilikat, karbonati, sulfati, fosfati i slično) ili botanički materijali (sprašeni kukuruzni klipovi, ljuske pirinča, ljuske oraha i slično). Formulacije mogu uključivati sredstva za raspršivanje, sredstva za stabilizaciju, druge pesticidne aditive ili surfaktante. Tečne formulacije mogu biti vodene ili ne-vodene i upotrebljavaju se u vidu pene, gela, suspenzija, emulgujućih koncentrata ili slično. Sastojci mogu uključivati reološka sredstva, surfaktante, emulgatore, disperzante ili polimere.

[0056] Kao što bi se prepoznalo od strane stručnjaka u tehnici, pesticidna koncentracija će se u velikoj meri razlikovati u zavisnosti od prirode odreÿene formulacije, posebno ako je koncentrat ili ako se direktno koristi. Pesticid će biti prisutan u najmanje 1% težinski i može biti 100% težinski. Suve formulacije će imati od oko 1-95% težinski pesticida, dok će tečne formulacije uglavnom biti od oko 1-60% težinskih čvrstih materija u tečnoj fazi. Formulacije će generalno imati od oko 10<2>do oko 10<4>ćelija/mg. Ove formulacije će se davati od oko 50 mg (tečne ili suve) do 1 kg ili više po hektaru.

[0057] Formulacije se mogu primeniti u okolini lepidopteranskih štetočina, na pr. na lišću ili na zemljištu, prskanjem, prašenjem, polivanjem ili slično.

[0058] Transformacija biljaka. Poželjni rekombinantni domaćin za proizvodnju insekticidnih proteina predmetnog pronalaska je transformisana biljka. Geni koji kodiraju Bt proteine toksina, kao što je ovde opisano, mogu biti ubačeni u biljne ćelije korišćenjem različitih tehnika koje su dobro poznate u struci. Na primer, veliki broj vektora kloniranja koji sadrže sistem replikacije u Escherichia coli i marker koji dozvoljava selekciju transformisanih ćelija su dostupni za pripremu za insertovanje stranih gena u više biljke. Vektori obuhvataju, na primer, pBR322, serije pUC, serije M13mp, pACIC184, izmeÿu ostalog. Shodno tome, DNK fragment koji ima sekvencu koja kodira za Bt protein toksina može se insertovati u vektor na odgovarajućem restrikcionom mestu. Dobijeni plazmid se koristi za transformaciju u E. coli. ûelije E. coli se kultivišu u odgovarajućem hranjivom medijumu, a zatim se sakupljaju i liziraju. Plazmid se prikuplja. Analize sekvenci, restrikcione analze, elektroforeza i druge

1

biohemijske-molekularne biološke metode se generalno sprovode kao metode analize. Posle svake manipulacije, korišćena DNK sekvenca može se razdvojiti i pridružiti sledećoj sekvenci DNK. Svaka plazmidna sekvenca može biti klonirana u istim ili drugim plazmidima. U zavisnosti od načina insertovanja željenih gena u biljku, možda će biti potrebne i druge sekvence DNK. Ako se, na primer, Ti ili Ri plazmid koristi za transformaciju biljne ćelije, onda barem desna granica, ali često desna i leva granica Ti ili Ri plazmidne T-DNK, mora se pridružiti kao bočni region gena koji se insertuju. Korišćenje T-DNK za transformaciju biljnih ćelija intenzivno je istraženo i dovoljno opisano u EP 120516, Lee i Gelvin (2008), Hoekema (1985), Fraley i sar. (1986) i An i sar., (1985), i dobro je uspostavljeno u tehnici.

[0059] Jednom kada je insertovana DNK integrisana u biljni genom, relativno je stabilna. Transformacioni vektor obično sadrži selektivni marker koji daje rezistentnost biljnih ćelija na biocid ili antibiotik, kao što su Bialafos, Kanamicin, G418, Bleomicin ili Higromicin, izmeÿu ostalog. Pojedinačno korišćeni marker bi prema tome trebalo da dozvoli selekciju transformisanih ćelija, a ne ćelija koje ne sadrže insertovanu DNK.

[0060] Dostupan je veliki broj tehnika za insertovanje DNK u biljnu ćeliju domaćina. Te tehnike uključuju transformaciju sa T-DNK koristeći Agrobacterium tumefaciens ili Agrobacterium rhizogenes kao sredstvo za transformaciju, fuziju, injektovanje, biolistiku (bombardovanje mikročesticama) ili elektroporaciju, kao i druge moguće metode. Ako se Agro-bakterije koriste za transformaciju, DNK koju treba ubaciti mora biti klonirana u specijalne plazmide, odnosno bilo u intermedijerni vektor ili u binarni vektor. Intermedijerni vektori mogu se integrisati u Ti ili Ri plazmid homolognom rekombinacijom zahvaljujući sekvencama koje su homologne sekvencama u T-DNK. Ti ili Ri plazmid takoÿe sadrži vir region koji je potreban za prenos T-DNK. Intermedijerni vektori se ne mogu replicirati u Agrobacterijama. Intermedijerni vektor može se preneti u Agrobacterium tumefaciens pomoću helper plazmida (konjugacija). Binarni vektori se mogu replicirati i u E. coli i u Agrobacterijama. Oni sadrže selekcioni marker gen i linker ili polilinker koji su uokvireni graničnim regijama desne i leve T-DNA. Mogu se transformisati direktno u Agrobacterijama (Holsters i sar., 1978). Agrobacterium koji se koristi kao ćelija domaćin se sastoji od plazmida koji nosi vir region. Vir region je neophodan za prenos T-DNK u biljnu ćeliju. Dodatna T-DNK može biti prisutna. Tako transformisana bakterija se koristi za transformaciju biljnih ćelija. Biljni eksplanti se mogu pogodno gajiti sa Agrobacterium tumefaciens ili Agrobacterium rhizogenes za prenos DNK u biljnu ćeliju. Cela biljka se zatim

1

može regenerisati iz inficiranog biljnog materijala (na primer, delovi listova, segmenti stabljika, korena, ali i protoplasta ili u suspenziji gajene ćelije) u odgovarajućem medijumu, koji mogu sadržati antibiotike ili biocide za selekciju. Tako dobijena biljka se zatim može testirati na prisustvo ubačene DNK. Nisu napravljeni posebni zahtevi za plazmide u slučaju injektovanja i elektroporacije. Moguće je koristiti obične plazmide, kao što su, na primer, derivati pUC.

[0061] Transformisane ćelije rastu u biljkama na uobičajen način. One mogu da formiraju klice i da prenose transformisanu osobinu(e) na potomstvo biljaka. Takva biljka se može gajiti na normalan način i biti ukršatana sa biljkama koje imaju iste transformisane nasledne faktore ili druge nasledne faktore. Dobijeni hibridni pojedinci imaju odgovarajuća fenotipska svojstva.

[0062] U poželjnom izvoÿenju predmetnog pronalaska, biljke će se transformisati genima kod kojih je upotreba kodona optimizovana za biljke. Videti, na primer, US patent br.

5380831. Dok su ovde kao primer, prikazani neki skraćeni toksini, dobro je poznato u Bt tehnici da toksini od 130 kDa (pune dužine) imaju N-terminalnu polovinu koja je osnovni toksin, dok je C-terminala polovina protoksinski "rep". Prema tome, odgovarajući "repovi" mogu se koristiti sa skraćenim/osnovnim toksinima predmetnog pronalaska. Videti na pr. US patent br.6218188 i US patent br.6673990. Pored toga, u tehnici su poznate metode za stvaranje sintetičkih Bt gena za upotrebu u biljkama (Stewart i Burgin, 2007). Jedan neograničavajući primer preferirane transformisane biljke je fertilna biljka kukuruza koja sadrži biljni ekspresivni gen koji kodira Cry1Fa protein, i dalje sadrži drugi biljni ekspresivni gen koji kodira Cry1Ca protein.

[0063] Transfer (ili introgresija) Cry1Fa- i Cry1Ca-utvrÿene osobine u postojeće linije kukuruza može se postići rekurentnim selekcionim gajenjem, na pr. bek-krosingom. U ovom slučaju, željeni rekurentni roditelj se najpre ukršta sa postojećim donorom (ne-rekurentni roditelj) koji nosi odgovarajući gen(e) za Cry1F- i Cry1C-utvrÿene osobine. Potomstvo ovog ukrštanja se onda vraća unazad do rekurentnog roditelja, nakon čega sledi selekcija u dobijenom potomstvu za željenu osobinu(e) koja se prenosi iz nerekurentnog roditelja. Posle tri, poželjno četiri, poželjnije pet ili više generacija bek-krosinga sa rekurentnim roditeljima sa selekcijom za željenu osobinu(e), potomstvo će biti heterozigotno za lokuse koji kontrolišu osobinu(e) koje se prenose, ali će biti kao rekurentni roditelj za većinu ili gotovo sve druge

1

gene (videti, na primer, Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4th Ed., 172-175; Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, Vol.1: Theory and Technique, 360-376).

[0064] Strategije za upravljanje rezistentnošću insekata (IRM). Roush i sar., na primer, opisuju dvo-toksinske strategije, takoÿe nazvane "piramidiranje" ili "slaganje", za upravljanje insekticidnim transgenskim kulturama. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786).

[0065] Na svojoj web stranici, Agencija za zaštitu životne sredine Sjedinjenih Država (epa.gov/oppbppd1/biopesti-cides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm) objavljuje sledeće uslove za obezbeÿenje ne-transgenskih (tj. ne-Bt) površinskih pojaseva zaštite (deo ili blok sa ne-Bt kulturama/kukuruzom) za upotrebu sa transgenskim usevima koji proizvode jedan Bt protein aktivan protiv ciljnih štetočina.

Specifični strukturisani zahtevi za proizvode kukuruza Bt (CriyAb ili CriyF) zaštićenog od kukuruznog plamenca su sledeći:

"Strukturisani površinski pojas zaštite: 20% ne-Lepidopteranski Bt kukuruz zaštićen u kukuruznom pojasu; 50% ne-Lepidopteranski Bt zaštićen u pamučnom pojasu

Blokovi

Interni (tj., unutar Bt polja)

Eksterni (tj. odvojena polja unutar 1⁄2 milje (1⁄2 milje ako je moguće) od polja Bt da bi se maksimizovalo nasumično parenje)

Unutar trake polja

Trake moraju biti najmanje 4 reda široke (poželjno 6 redova) da bi se smanjili efekti larvalnog kretanja"

[0066] Pored toga, Nacionalna asocijacija za proizvoÿDče kukuruza, na svojoj veb stranici: (ncga.com/insect-resistance-manage-ment-fact-sheet-bt-corn)

[0067] takoÿe pruža slične smernice u vezi sa zahtevima za pojasevima zaštite. Na primer:

"Zahtevi IRM za kukuruzni plamenac:

- Posejati najmanje 20% vaših kukuruznih površina do hibrida za zaštitu

- U regionima proizvodnje pamuka, zaštita mora biti 50%

- Mora se posaditi unutar 1/2 milje od hibrida zaštite

- Zaštita se može saditi kao traka unutar Bt polja; trake za zaštitu moraju biti najmanje 4 reda široke

1

- Pojas zaštite se može tretirati konvencionalnim pesticidima samo ako se postignu ekonomski pragovi za ciljne insekte

- Bt rasprskavajući insekticidi se ne mogu koristiti na kukuruzu iz površinskog sloja zaštite - Odgovarajuća površina zaštite mora biti postavljena na svakoj farmi sa Bt kukuruzom"

[0068] Kao što je navedeno od Roush i sar. (na stranicama 1780 i 1784, desna kolona, na primer), povezivanje ili piramidiranje dva različita proteina, od kojih je svaki efikasan protiv ciljnih štetočina i sa malo ili bez unakrsne rezistentnosi, može dozvoliti korišćenje manjeg pojasa površinske zaštite. Roush sugeriše da za uspešnu piramidu, veličina zaštitnog pojasa manja od 10% pojasa zaštite, može obezbediti uporedivo upravljanje rezistencijom na oko 50% zaštite za pojedniačnu (ne-piramidalnu) osobinu. Za trenutno dostupne piramidirane proizvode od Bt kukuruza, Agencija za zaštitu životne sredine zahteva značajno manje (uglavnom 5%) strukturisano pojase zaštite od Bt kukuruza koji se moraju zasaditi u odnosu na proizvode sa pojedinačnim osobinama (uglavnom 20%).

[0069] Postoje različiti načini obezbeÿivanja IRM efekata pojasa zaštite, uključujući različite geometrijske forme zasada u poljima (kao što je već pomenuto) i mešavine semena u vrećici, o čemu je dalje diskutovano u Roush i sar. (supra) i US patentu broj 6,551,962.

[0070] Gore navedeni procenti ili slični odnosi pojasa zaštite mogu se koristiti za podložne dvostruke ili trostruke nizove ili piramide.

Za trostruke piramide sa tri načina delovanja protiv jednog ciljnog štetočina, cilj bi bio nula pojasa zaštite (ili manje od 5% pojasa zaštite, na primer). Ovo je posebno važno za komercijalne površine - na primer preko 10 hektara.

[0071] Slede primeri koji ilustruju procedure za praktikovanje pronalaska. Ove primere ne treba smatrati ograničavajućim. Svi procenti su iskazani kao težinski i sve proporcije smeše rastvarača su izražene kao zapremine, osim ako nije drugačije naznačeno. Sve temperature su u stepenima Celzijusa.

[0072] Ukoliko nije posebno naznačeno ili implicitno, izrazi koji se ovde koriste "a", "an" i "the" označavaju "najmanje jedan".

PRIMER 1

Konstrukcija himernih Cry1Ca osnovnih toksina i Cry1Ab protoksina

1

[0073] Himerni toksini. Himerni proteini koji koriste domen osnovnog toksina jednog Cry toksina koji je fuzionisan sa protoksinskim segmentom drugog Cry toksina ranije su objavljeni, na primer, u US patentu br.5593881 i US patentu br.5932209. Cry1Ca3 delta endotoksinska proteinska sekvenca je deponovana kao GenBank pristupni broj AAA22343 pod zastarelom terminologijom CryIC (b).

[0074] Varijante Cry1Ca himernog proteina ovog pronalaska obuhvataju himerne toksine koji sadrže N-terminalni segment osnovnog toksina izvedenog iz insekticidnog toksina Cry1Ca3 koji je fuzionisan na segment heterolognog delta endotoksinskog protoksina koji u nekom trenutku prolazi kraj segmenta osnovnog toksina. Prelazak sa osnovnog toksina u heterologni protoksinski segment može se javiti otprilike na spoju prirodnog baznog toksina/protoksina ili, alternativno, deo nativnog protoksina (koji se proteže iza segmenta osnovnog toksina) može se zadržati, uz tranziciju heterolognog protoksina koja se javlja nadalje. Prema varijantama, osnovni toksin i protoksinski segmenti mogu sadržati tačnu aminokiselinsku sekvencu nativnog toksina iz kojeg su izvedeni, ili mogu uključivati dodavanje aminokiselina, delecije ili supstitucije koje ne umanjuju, i mogu poboljšati, biološku funkciju segmenata kada su spojeni jedni sa drugima.

[0075] Na primer, himerni toksin predmetnog pronalaska sadrži segment osnovnog toksina koji je izveden iz Cry1Ca3 i heterologni protoksin. U poželjnom izvoÿenju pronalaska, segment osnovnog toksina koji je izveden iz Cry1Ca3 (619 amino kiselina) je spojen sa heterolognim segmentom koji sadrži protoksinski segment izveden iz Cry1Ab deltaendotoksina (545 amino kiselina).1164 aminokiselinska sekvenca himernog proteina, ovde označena kao DIG-152, opisana je kao SEK ID BR.1. Drugo poželjno izvoÿenje pronalaska obuhvata hemerni protein u kome se Cry1Ca segment osnovnog toksina (619 aminokiselina) pridružuje drugom 545 aminokiselinskom protoksinskom segmentu izvedenom iz Cry1Ab. 1164 aminokiselinske sekvence drugog himernog proteina, koji se naziva DIG-109, opisan je kao SEK ID BR: 2 (optimizovan za kukuruz). Treba razumeti da su druge himerne fuzije koje sadrže Cry1Ca osnovne toksinske varijante i protoksine izvedene iz Cra1Ab u okviru predmeta ovog pronalaska.

[0076] Zapaženo je da su DIG-152 i DIG-109 himerni proteini u suštini funkcionalni ekvivalenti jedan drugog, različiti u sekvenci samo u jednoj poziciji (aminokiselina 620, koja pridružuje Cry1Ca segment osnovnog toksina, segmentu Cra1Ab protoksina).

PRIMER 2

2

Konstrukcija ekspresionih plazmida koji kodiraju himerne proteine Cry1Ca osnovni/Cry1Ab protoksin i ekspresija u ćelijama soja Pseudomonas

[0077] Standardne metode kloniranja (kao što je opisano, na primer u Sambrook i sar., (1989) i Ausubel i sar., (1995) i njihovim novijim radovima) korišćene su u konstrukciji Pseudomonas fluorescens (Pf) ekspresionog konstrukta pMYC2547 dizajniranog za proizvodnju DIG-152 himernog proteina u punoj dužini (kao što je opisano u SEK ID BR:1). Proizvodnja proteina izvedena je u Pseudomonas fluorescens soju MB214 (derivat soja MB101, P. fluorescens biovar I), koji ima inserciju modifikovanog lac operona kao što je opisano u US patentu br.5169760. Osnovna strategija kloniranja podrazumeva subkloniranje fragmenta DNK koji kodira za DIG-152 u plazmidne vektore, pri čemu se nalazi pod kontrolom ekspresije Ptac promotera i rrnBT1T2 terminatora iz plazmida pKK223-3 (PL Pharmacia, Milwaukee, WI). Jedan takav plazmid nazvan je pMYC2547, a izolat MB214 koji sakuplja ovaj plazmid nazvan je Dpf108.

[0078] Analiza rasta i ekspresije u sistemima sa orbitalnim šejkiranjem. Proizvodnja proteina DIG-152 za karakterizaciju i bioanalize insekata izvršena je pomoću P. fluorescens soja Dpf108 koji je gajen u sistemu sa orbitalnim mešanjem. Proizvodnja proteina DIG-152, voÿena Ptac promoterom, sprovedena je kao što je prethodno opisano u US patentu broj 5527883. Detalji o mikrobiološkim manipulacijama dostupni su u Squires i sar., (2004), US patentnoj prijavi 20060008877, US patentnoj prijavi 20080193974 i US patentnoj prijavi 20080058262. Ekspresija je indukovana dodavanjem izopropil-E-D-1-tiogalaktopiranozida (IPTG) nakon inicijalne inkubacije 24 sata na 30° uz šejkiranje. Kulture su uzorkovane u vreme indukcije i u različitim vremenima posle indukcije. Gustina ćelija je merena optičkom gustinom na 600 nm (OD600).

[0079] Frakcionisanje ćelija i SDS-PAGE analiza šejkiranih uzoraka. U svakom vremenu uzorkovanja, gustina ćelija uzoraka je podešena na OD600= 20, a alikvoti od 1 mL su centrifugirani na 14000 x g tokom pet minuta. ûelijski peleti su zamrznute na -80°. Rastvorne i nerastvorne frakcije iz zamrznutih uzoraka šejkiranih ćelija su generisane pomoću EasyLyse™ Bacterial Protein Extraction Solution (EPICENTRE® Biotechnologies, Madison, WI). Svaki ćelijski pelet je resuspendovan u 1 mL EasyLyse™ rastvora i dalje razblaživan 1: 4 u puferu za liziranje, i inkubiran uz orbitalno mešanje, na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Lizat je centrifugiran na 14000 rpm tokom 20 minuta na 4° i dobijen je supernatant kao rastvorna frakcija. Pelet (nerastvorna frakcija) je zatim resuspendovan u jednakoj zapremini fiziološkog fosfatnog pufera (PBS; 11,9 mM Na2HPO4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, pH7,4).

[0080] Uzorci su mešani 1:1 sa 2X Laemli puferom za uzorke koji sadrži E-merkaptoetanol (Sambrook i sar., supra.) i kuvani 5 minuta pre nego što su ubačeni na Criterion XT Bis-Tris 12% gel (Bio-Rad Inc., Hercules, CA). Elektroforeza je izvedena u preporučenom XT MOPS puferu. Gelovi su obojeni sa Bio-Safe Coomassie Stain, prema proizvoÿDčkom (Bio-Rad) protokolu i prikazani pomoću sistema Alpha Innotech Imaging (San Leandro, CA).

[0081] Priprema inkluzionih tela. Priprema inkluzionih tela proteina DIG-152 je izvedena na ćelijama P. fluorescens iz fermentacije, koje su proizvele nerastvorni Bt insekticidni protein, što se dokazuje sa SDS-PAGE i MALDI-MS (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry). Peleti iz fermentacij sa P. fluorescens su odleÿeni u vodenom kupatilu na 37°. ûelije su resuspendovane u 25% w/v u puferu za liziranje [50 mM Tris, pH 7,5, 200 mM NaCl, 20 mM EDTA dinatrijumove soli (etilendiamintetrasirćetna kiselina), 1% Triton X-100 i 5 mM ditiotreitol (DTT); 5 mL/L koktela inhibitora bakterijske proteaze (katalog # P8465; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) su dodati neposredno pre upotrebe]. ûelije su suspendovane korišćenjem ručnog homogenizatora na najnižem nivou (Tissue Tearor, BioSpec Products, Inc., Bartlesville, OK). Lizozim (25 mg Sigma L7651, od belanca pilećeg jajeta) dodat je u suspenziju ćelija mešanjem sa metalnom lopaticom, a suspenzija je inkubirana na sobnoj temperaturi tokom jednog sata. Suspenzija je hlaÿena na ledu 15 minuta, a zatim je sonicirana pomoću Branson Sonifier 250 (dve 1-minutne sesije, 50% radnog ciklusa, 30% output). Liza ćelija je kontrolisana mikroskopijom. Po potrebi je dodato dodatnih 25 mg lizozima, a inkubacija i sonikacija su ponovljene. Nakon potvrÿivanja ćelijske lize mikroskopijom, lizat je centrifugiran na 11500 x g u trajanju od 25 minuta (4°) kako bi se formirali IB peleti, a supernatant je odbačen. IB peleti su resuspendovani sa 100 ml pufera za liziranje, homogenizovani sa ručnim mešačem i centrifugirani kao što je gore navedeno. IB peleti su više puta oprani resuspendiranjem (u 50 mL pufera za liziranje), homogenizirani, sonicirani i centrifugirani sve dok supernatant ne postane bezbojan a IB peleti ne postanu čvrsti i sivo bele boje. Za završno ispiranje, IB peleti su resuspendovani u sterilno filtriranoj (0,22 Pm) destilovanoj vodi koja sadrži 2 mM EDTA i centrifugirani. Konačni peleti su resuspendovani u sterilno filtriranoj destilovanoj vodi koja sadrži 2 mM EDTA i čuvani u alikvotu od 1 mL na -80°.

[0082] SDS-PAGE analiza i kvantifikacija proteina u IB preparacijama izvršena je otapanjem 1 mL alikvota IB peleta i razblaženjem 1:20 sa sterilno filtriranom destilovanom vodom. Razblaženi uzorak je zatim kuvan sa 4X redukcionim puferom za uzorke [250 mM Tris, pH6,8, 40% glicerol (v/v), 0,4% bromfenol plavo (w/v), 8% SDS (w/v) i 8% E-merkaptoetanol (v/v)] i ubacuje se na Novex® 4-20% Tris-Glicin, 12 2 gelove (Invitrogen) koji se pokreće sa 1X Tris/Glicin/SDS puferom (BioRad). Gel je proticao 60 min na 200 volti, a zatim je obojen sa Coomassie Blue (50% G-250/50% R-250 u 45% metanolu, 10% sirćetne kiseline) i obezbojen sa 7% sirćetne kiseline, 5% metanola u destilovanoj vodi.

Kvantifikacija ciljnih traka vršena je uporeÿivanjem denzitometrijskih vrednosti za trake standardnih uzoraka Bovine Serum Albumin (BSA) na istom gelu radi stvaranja standardne krive.

[0083] Solubilizacija inkluzionih tela. Šest mL suspenzije DIG-152 inkluzionih tela iz Pf klona DPf108 je centrifugirano na najvišoj postavci mikrocentrifuge Eppendorf model 5415C (približno 14000 x g) radi peletiranja inkluzija. Supernatant pufera za čuvanje je uklonjen i zamenjen sa 25 mL 100 mM natrijum karbonatnog pufera, pH11, u 50 mL konusnoj tubi. Inkluzije su resuspendovane pomoću pipete i vorteksa kako bi se izvršilo temeljno mešanje. Tuba je postavljena na platformu sa blagim okretanjem na 4° preko noći kako bi se ekstrahovao ciljani protein. Ekstrakt je centrifugiran na 30000 x g tokom 30 min na 4°, a dobijeni supernatant je koncentrovan 5 puta korišćenjem ureÿaja za centrifugalno filtriranje Amicon Ultra-15 sa regenerisanom celulozom (30,000 Molecular Weight Cutoff; Millipore). Pufer za uzorke je zatim zamenjen sa 10 mM CAPS [3-(cikloheksamino)1-propansulfonska kiselina] pH 10, korišćenjem jednokratnih PD-10 kolona (GE Healthcare, Pis-cataway, NJ).

[0084] Solubilizacija i aktivacija proteina inkluzionih tela tripsinom. U nekim slučajevima, suspenzija DIG-152 inkluzionih tela iz Pf klona DPf108 je centrifugirana na najvišoj postavci mikrocentrifuge Eppendorf model 5415C (približno 14000 x g) kako bi se izvršilo peletiranje incluzija. Supernatant pufera za čuvanje je uklonjen i zamenjen sa 100 mM CAPS, pH 11 da bi se dobila koncentracija proteina od oko 50 mg/mL. Tuba je okretana na sobnoj temperaturi u trajanju od tri sata kako bi se protein potpuno solubilizovao. Tripsin je dodat u količini od 5% do 10% (w:w, na osnovu inicijalne težine IB praha), a digestija je izvršena inkubacijom uz okretanje, tokom noći na 4° ili okretanjem 90-120 minuta na sobnoj temperaturi.

Nerastvorni materijal je uklonjen centrifugiranjem na 10000 x g tokom 15 minuta, a supernatant je primenjen na MonoQ anjonsku izmenjivačku kolonu (10 mm x 10 cm).

Aktivirani DIG-152 protein je eluiran (kao što je odreÿeno sa SDS-PAGE, videti dole) sa 0%

2

do 100% 1 M NaCl gradijentom preko 25 kolonskih zapremina. Frakcije koje sadrže aktivirani protein su objedinjene i, kada je potrebno, koncentrisane do manje od 10 mL korišćenjem centrifugalnog filtracionog ureÿaja Amicon Ultra-15 sa regenerisanom celulozom, kao što je gore navedeno. Materijal je zatim prošao kroz kolonu Superdex 200 (16 mm x 60 cm) u puferu koji sadrži 100 mM NaCl, 10% glicerola, 0,5% Tween-20 i 1 mM EDTA. Odreÿeno je SDS-PAGE analizom da aktivirani (enzimski skraćeni) protein eluira na 65 do 70 ml. Frakcije koje sadrže aktivirani protein se objedinjuju i koncentrišu koristeći centrifugalni koncentrator kao što je gore opisano.

[0085] Gel elektroforeza. Koncentrovani proteinski preparati su pripremljeni za elektroforezu razblaživanjem 1:50 u NuPAGE® LDS puferu za uzorke (Invitrogen) koji sadrži 5 mM DTT kao redukcioni agens i zagrevani su na 95° 4 minuta. Uzorak je ubačen u duple trake od 4-12% NuPAGE® gela zajedno sa pet BSA standarda u rasponu od 0,2 Pg do 2 Pg po liniji (za generisanje standardne krive). Napon je podešen na 200 V korišćenjem MOPS SDS mobilnog pufera (Invitrogen) sve dok boja za praćenje ne doÿe do dna gela. Gel je obojen sa 0,2% Coomassie Blue G-250 u 45% metanolu, 10% sirćetne kiseline i obezbojen, prvo kratko sa 45% metanola, 10% sirćetne kiseline, a zatim po dužini sa 7% sirćetne kiseline, 5% metanola dok se pozadina ne obezboji. Nakon obezbojavanja, gel je skeniran sa BioRad Fluor-S MultiImager. Instrumentalni Quantity One Software v.4.5.2 je korišćen za dobijanje sa pozadine izdvojenih volumena obojenih proteinskih traka i za generisanje BSA standardne krive koja je korišćena za izračunavanje koncentracije himernog DIG-152 proteina u osnovnom rastvoru.

PRIMER 3

Insekticidna aktivnost proteina DIG-152 proizvedenog u ćelijama Pseudomonas fluorescens [0086] Insekticidna aktivnost proteina DIG-152 demonstrirana je na larvama malih sovica (FAW, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith)) i na FAW (rFAW) larvama rezistentnim na Cry1F.

[0087] Priprema uzorka i biološki testovi. Preparati inkluzionih tela (prirodni protein pune dužine ili tripsin aktivirani proteini) preneti su u 10 mM CAPS pufera, pH10, putem metoda razmene kao što su dijaliza ili PD-10 kolone. Uzorci su zatim razblaženi na odgovarajući način u 10 mM CAPS pH 10, a svi biološki testovi sadržali su kontrolni tretman koji se sastojao od ovog pufera, koji je služio kao pozadinska provera smrtnosti ili inhibicije rasta.

[0088] Koncentracije proteina u puferu za biološka ispitivanja su procenjene pomoću gel elektroforeze pomoću korišćenjem BSA za generisanje standardne krive za gel denzitometriju, koja je merena pomoću BioRad Imaging sistema, kao što je gore navedeno. Proteini u gel matriksu su obojeni bojom Coomassie Blue i obezbojeni pre čitanja.

[0089] Prečišćeni proteini su testirani na insekticidnu aktivnost u biološkim ispitivanjima sprovedenim sa neonatalnim larvama Lepidopterana na veštačkoj ishrani insekata. Larve FAW-a su se izlegle iz jaja dobijenih iz kolonije koja je održavana u komercijalnom insektaru (Benzon Research Inc., Carlisle, PA). Larve rFAW su se izlegle iz jaja koje su prikupljane iz nekomercijalne kolonije (Dow AgroSciences, Indianapolis, IN).

[0090] Biološki testovi su sprovedeni u plastičnim pločama sa 128 bunara, specijalno dizajniranim za biottestove sa insektima (C-D International, Pitman, NJ). Svaki bunar sadrži 1,0 mL dijetetske ishrane Lepidoptera (Southland Products, Lake Village, AR). Alikvot uzorka proteina od 40 PL isporučen je pipetom na površinu sa hranom od 1,5 cm<2>u svakom bunarčLću (tj.26,7 PL/cm<2>). Koncentracije ishrane su izračunate kao količina (ng) DIG-152 proteina po kvadratnom centimetru površine u bunaru. Obraÿena ležišta su držana u kapeli dok tečnost na površini hrane nije isparila ili se apsorbovala u hranu.

[0091] U toku nekoliko sati eklozije, individualne larve su pokupljene vlažnom četkicom sa kamiljom dlakom i položene na tretiranu hranu, jedna larva po bunaru. Inficirani bunari su potom zatvoreni pomoću adhezivnih prevlaka od prozirne plastike, ventilisani da bi se omogućila razmena gasova (C-D International). Ploče bioloških testova su držane pod kontrolisanim uslovima okoline [28°, približno 40% relativne vlažnosti (RH), 16 sati:8 sati (svetlo: tamno)] tokom 5 dana, nakon čega je zabeležen ukupan broj insekata izloženih svakom uzorku proteina, broj mrtvih insekata i težina preživelih insekata.

Procenat mortaliteta i procenat inhibicija rasta su izračunati za svaki tretman. Procenat inhibicije rasta (GI) izračunat je na sledeći način:

%GI = [1 - (TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)] x 100

gde je TWIT ukupna težina insekata u tretmanu,

TNIT je ukupan broj insekata u tretmanu

TWIBC je ukupna težina insekata u pozadinskom čekiranju (puferna kontrola),

i TNIBC je ukupan broj insekata u pozadinskom čekiranju (puferna kontrola).

2

[0092] Kao GI50je odreÿena kao vrednost koncentracije himernog DIG-152 proteina u ishrani pri kojoj je vrednost % GI bila 50. LC50(50% letalna koncentracija) je zabeležena kao koncentracija DIG-152 proteina u ishrani, pri čemu je 50 % testirnih insekata ubijeno.

Statistička analiza (One-way ANOVA) obavljena je pomoću JMP softvera (SAS, Cary, NC).

[0093] Tabela 2 prikazuje rezultate biološke analize uticaja ingestije DIG-152 proteina na larve malih sovica.

Tabela 2. Vrednosti GI50i LC50(u ng/cm<2>) izračunate iz ishrane insekata sa DIG-152 proteinom

[0094] Karakteristika DIG-152 proteina iz predmetnog pronalaska je da je inhibiran rast neonatalnih larvi malih sovica (Spodoptera frugiperda) nakon unošenja DIG-152 proteina. Pored toga, larve malih sovica koje su otporne na intoksikaciju od strane Cry1Fa su podložne aktivnosti DIG-152, kao što su i larve divljih vrsta malih sovica. Značaj osetljivosti ovih Cry1Fa rezistentnih insekata na Cry1Ca je detaljnije razmatrano ranije.

PRIMER 4

Dizajniranje kukuruz-kodon optimizovanje sekvence koja kodira DIG-109 protein

[0095] Stručne osobe u oblasti molekularne biologije će razumeti da se multiple DNK sekvence mogu dizajnirati za kodiranje pojedinačne aminokiselinske sekvence. Uobičajeni način za povećanje ekspresije kodirajućih regiona za protein koji je od interesa, je da se kodirajući region prilagoÿava na takav način da njegov kodonski sastav podseća na ukupni kodonski sastav domaćina u kojem je gen namenjen da bude eksprimiran. Uputstva u vezi s dizajnom i proizvodnjom sintetičkih gena mogu se naći u, na primer WO 1997/13402 i US patentu br.5380831.

[0096] DNK sekvenca koja ima sklonost za kukuruz kodon je dizajnirana i sintetizovana da bi se proizveo DIG-109 himerni insekticidni protein u transgenskim monokotnim biljkama. Tabela korišćenja kodona za kukuruz (Zea mais L.) izračunata je iz 706 sekvenci za kodiranje proteina dobijenih iz sekvenci deponovanih u GenBank (vvv.ncbi.nlm.nih.gov). Prosečan ponderisani set kodona za kukuruz izračunat je nakon što se izostavlja bilo koji redundantni

2

kodon koji se koristi manje od oko 10% od ukupno upotrebljenih kodona za datu aminokiselinu. Ponderisano prosečno predstavljanje za svaki kodon izračunato je korišćenjem formule:

Ponderisani prosečni % C1 = 1/(%C1 % C2 % C3 itd.) x % C1 x 100

gde je C1 kodon od značaja i % C2, % C3, itd. predstavljaju prosečne % vrednosti korišćenja preostalih sinonimnih kodona.

[0097] Da bi se dobila DNK sekvenca koja je optimizovana za kukuruz, koja kodira za DIG-109 protein od 1164 aminokiselina SEK ID BR:2, napravljena je supstitucija kodona kod nativne cryICa DNK sekvence koja kodira Cry1Ca segment osnovnog toksina, tako da rezultirajuća DNK sekvenca ima celokupan kodonski sastav za kukuruz optimizovanih kodona iz baze podataka. Na sličan način, supstitucije kodona kod nativne crylAb DNK sekvence koja kodira Cry1Ab segment protoksina napravljena je tako da rezultirajuća DNK sekvenca ima ukupan kodonski sastav za kukuruz optimizovanih kodona iz baze podataka. Dalja poboljšanja sekvenci su učinjena kako bi se eliminisala nepoželjna mesta prepoznavanja restrikcionim enzimima, potencijalne biljne intronske veznice, dugi tragovi ostataka A/T ili C/G i drugi motivi koji mogu ometati stabilnost RNK, transkripciju ili translaciju kodnog regiona u biljnim ćelijama. Druge promene su uraÿene kako bi se uvela željena mesta prepoznavanja restrikcionim enzimima i eliminisali dugi unutrašnji otvoreni okviri čitanja (okviri različiti od 1). Ove promene su učinjene u okviru ograničenja zadržavanja približne kompozicije kodona optimizovonog za kukuruz. Kompletna sekvenca optimizovana za kukuruzni kodon (koja kodira DIG-109 protein) je opisana kao SEK ID BR.:3. Sinteza DNK fragmenta izvršena je komercijalni izvršilac (DNA2.0, Menlo Park, CA).

PRIMER 5

Konstrukcija vektora transformacije biljaka koji sadrže ekspresibilne gene koji se eksprimiraju u biljkama a koje kodiraju za DIG-109 proteine

[0098] Agrobacterium superbinari sistem (Japan Tobacco, Tokyo, JP) je pogodan u korišćenju za transformaciju monokotnih biljaka domaćina. Superbinari sistem koristi pSB11 vektorski plazmid koji sadrži sekvence za Right T-DNA border repeat (RB) i Left T-DNA border repeat (LB) koji su odvojeni multiplim mestima kloniranja. Derivat iz pSB11 (nazvan pDAB7691) je pripremljen standardnim metodama kloniranja DNK. Plazmid pDAB7691 sadrži za kukuruz optimizovanu sekvencu za kodiranje DIG-109 (CDS, tj. SEK ID BR.:3)

2

koja je pod kontrolom transkripcije promotera kukuruza ubikuitin1 sa pridruženim intronom 1 (US patent br.5510474) i kukuruzni Per53 'Untranslated Region (3'UTR) (US patent br.

7179902). Pored toga, pDAB7691 sadrži biljni selekcioni marker gen koji se sastoji od Dow AgroSciences DSM2 CDS (WO 2008/070845 A2) pod transkripcionom kontrolom promotera rice actin1 sa pridruženim intronom1 (US patent br.5641876) i kukuruzne lipaze 3' UTR (US patent br.7179902).

Fizički raspored komponenata t-regiona u pDAB7691 je pogodno ilustrovan kao:

RB>kukuruzni Ubi1 promoter:DIG-109 CDS:kukuruzni Per53’UTR>rice Act1 promoter:DSM2 CDS:kukuruzni Lip 3’UTR>LB

[0099] Drugi derivat pSB11 (nazvan pDAB100276) je pripremljen standardnim metodama kloniranja DNK. Plazmid pDAB100276 koji sadrži za kukuruz optimizovanu kodirajuću sekvencu DIG-109 (CDS, tj. SEK ID BR:3) pod transkripcionom kontrolom promotera kukuruznog ubikuitin1 sa pridruženim intron1 i kukuruznim Per53 'UTR. Pored toga, pDAB100276 sadrži biljni selekcioni marker gen koja se sastoji od Dow AgroSciences AAD1 CDS (US patentna prijava br.20090093366), pod transkripcionom kontrolom promotera kukuruznog ubikitin1 sa pridruženim intronom1 i kukuruznom lipazom 3 'UTR.

Fizički raspored komponenata pDAB100276 T-regiona je pogodno ilustrovan kao:

RB>kukuruzni Ubi1 promoter:DIG-109 CDS: kukuruzni Per53’ UTR> kukuruzni Ubi1 promoter:AAD-1 CDS: kukuruzni Lip 3’ UTR>LB

[0100] Za pripremu Agrobacterium transformacije, ćelije kloniranog soja Escherichia coli DH5Į sa koji nakuplja plazmid pDAB7691 ili plazmid pDAB100276 su gajene na 37° preko noći na LB agarnom medijumu (g/L: Bacto Triptone, 10; Bacto Yeast Extract, 5; NaCl, 10; agar, 15) koji sadrži Spektinomicin (100 mg/mL). ûelije soja DH5Į koje sadrže konjugaciono mobilizirajući plazmid pRK2013 su gajene na LB agaru koji sadrži Kanamicin (50 mg/mL). Nakon inkubacije, ploče su postavljene na 4° da bi se čekala dostupnost soja Agrobacterium tumefaciens LBA4404 koja sadrži plazmid pSB1.

PRIMER 6

Agrobacerium transformacija za generisanje superbinarnih vektora

[0101] Agrobacterium superbinari sistem, koji koristi Agrobacterium tumefaciens soj LBA4404 koji sadrži plazmid pSB1, pogodno je korišćen za transformaciju monokotnih

2

biljaka domaćina. Metodologije za konstrukciju i validaciju superbinarnih vektora su dobro uspostavljene kao što je navedeno u uputstvu za upotrebu pSB1 (Japan Tobacco). Standardne mikrobiološke i molekularne biološke metode korišćene su za generisanje i validaciju superbinarnog plazmida pDAS5162, koji je kointegrantni plazmid koji sadrži plazmide pSB1 i pDAB7691 i superbinarni plazmid pDAS5848, koji je kointegrantni plazmid koji sadrži plazmide pSB1 i pDAB100276.

PRIMER 7

Proizvodnja proteina DIG-109 u kukuruznoj biljci

[0102] Transformacija semena kukuruza posredovana sa Agrobacterium. Seme iz Hi-II F1 hibrida (Armstrong i sar., 1991) posejana su u 5-galonske posude koje sadrže smešu od 95% Metro-Mix 360 zemljanog medijuma za rast (Sun Gro Horticulture, Bellevue, WA) i 5% glinaste/ilovačaste zemlje. Biljke su rasle u stakleniku koristeći kombinaciju natrijumovih i metalhalidnih lampi visokog pritiska sa fotoperiodom od 16 sati svetlo:8 sati mraka.

Kontrolisane sib-polinacije su izvedene kako bi se dobili nezreli F2 embrioni za transformaciju. Uzgoj kukuruza je sakupljen na približno 8-10 dana nakon oprašivanja kada su nezreli embrioni bili izmeÿu 1,0 mm i 2,0 mm u veličini.

[0103] Infekcija i ko-kultivacija. Kukuruzni usev je oljušten i površno sterilisan trljanjem tečnim sapunom, potapanjem u 20% komercijalnog izbeljivača (koji sadrži 5% natrijum hipohlorita) oko 20 minuta, a zatim ispiranjem tri puta sa sterilnom vodom. Suspenzija Agrobacterium tumefaciens ćelija koje sadrže pDAS5162, superbinarni vektor koji sadrži gen koji kodira za DIG-109 protein i koji sadrži biljni selektibilni marker gen DSM2 pripremljena je prenošenjem 1 ili 2 eze bakterija [uzgajanih 2-3 dana na 28° na YEP čvrstom medijumu (g/L: Bacto Yeast Extract, 10; Bacto Peptone, 10; NaCl, 5; agar, 15) koji sadrži 100 mg/L spektinomicina, 10 mg /L tetraciklina i 250 mg/L streptomicina] na 5 mL tečnog infekcionog medijuma [LS Basal Medium (Linsmaier and Skoog, 1965), vitamini N6 (Chu i sar., 1975), 1,5 mg/L 2,4-dihlorfenoksisirćetne kiseline (2,4-D), 68,5 g/L saharoze, 36,0 g/L glukoze, 6 mM L-prolina, pH 5,2] koji sadrži 100 mM acetosiringona.

[0104] Alternativno, suspenzija Agrobacterium tumefaciens ćelija koje sadrže pDAS5848, superbinarni vektor koji sakuplja gen koji kodira za DIG-109 protein i koji sadrži biljni selekcioni marker gen AAD-1, pripremljena je prenošenjem 1 ili 2 eze bakterija koje su gajene kao gore, u 5 mL infekcionog medijuma koji sadrži 100 do 200 mM acetosiringona.

2

[0105] U oba slučaja, rastvor je vorteksiran dok se ne postigne uniformna suspenzija, a koncentracija je prilagoÿena do konačne gustine od 200 Klet jedinica koristeći Klett-Summerson kolorimetar sa ljubičastim filterom (za pDAS5162 transformacije) ili do optičke gustine od 1,2 na 550 nm (za pDAS5848 transformacije). Nezreli embrioni su izolovani direktno u tubu za mikrocentrifugu koja sadrži 2 mL infekcionog medijuma. Medijum je uklonjen i zamenjen sa 1 mL rastvora Agrobacterium, a rastvor Agrobacterium/embrion je inkubiran tokom 5 do 10 minuta na sobnoj temperaturi. Embrioni su zatim prebačeni u medijum za ko-kultivaciju [LS Basal Medium, N6 vitamini, 1,5 mg/L 2,4-D, 30,0 g/L saharoze, 6 mM L-prolina, 0,85 mg/L AgNO3, 2,8 g/L Gelan guma (PhytoTechnology Laboratories, Lenexa, KS), pH 5,8], koji sadrži 100 mM acetoziringona (za pDAS5162 transformante) ili koji sadrži 100 do 200 mM acetoziringona (za pDAS5848 transformante), i uzgajani 3-4 dana na 20° u mraku.

[0106] Nakon kokultivacije, embrioni su preneseni u medijum za odmaranje koji sadrži MS soli i vitamine, 6 mM L-prolina, 100 mg/L mio-inozitola, 500 mg/L MES, 30 g/L saharoze, 1,5 mg/L 2,4-D, 0,85 mg/L AgNO3, 250 mg/L Cefotaksima, 2,8 g/L Gelan gume, pH 5,8. Otprilike 7 dana kasnije, embrioni su preneti na isti medijum dopunjen sa 3mg/L bialofosa (za pDAS5162 transformante) ili dopunjen sa 100 nM haloksifopa (za pDAS5848 transformante) (selekcioni medijum). Transformisani izolati su identifikovani nakon približno 8 nedelja i upakovani su prenošenjem na sveži selekcioni medijum u intervalima od 2 sedmice za regeneraciju i analizu.

[0107] Regeneracija i proizvodnja semena. Za regeneraciju, kulture su prenesene na indukcioni medijum "28" (MS soli i vitamini, 30 g/L saharoze, 5 mg/L benzilaminopurina, 0,25 mg/L 2,4-D, 250 mg/L cefotaksima, 2,5 g/L gelan gume, pH 5,7), dopunjen sa 3 mg/L bialafosa (za pDAS5162 transformante) ili dopunjen sa 100 nM haloksifopoma (za pDAS5848 transformante). Inkubacija je trajala 1 nedelju pod uslovima slabog osvetljenja (14 mEm<-2>s<-1>), a zatim 1 nedelju pod uslovima visokog osvetljenja (približno 89 mEm<-2>s<-1>). Tkiva su naknadno prebačena u "36" regeneracioni edijum (isto kao i indukcioni medijum, osim što su izostavljeni induktori rasta biljaka). Kada su biljke bile dužine 3-5 cm, prenete su u staklene tube za kultivaciju koje sadrže SHGA medijum [(Schenk and Hildebrandt (1972) soli i vitamine; PhytoTechnologies Labr.), 1,0 g/L mio-inozitola, 10 g/L saharoze i 2,0 g/L gelan gume, pH 5,8], kako bi se omogućio dalji rast i razvoj izdanaka i korena. Biljke su presaÿene u istu mešavinu zemljišta kao što je ranije opisano i rasle do cvetanja u stakleniku. Sprovedene su kontrolisane polinacije za proizvodnju semena. Oni koji su u struci transformacije kukuruza razumeće da su na raspolaganju druge metode za transformaciju kukuruza i za selekciju transformisanih biljaka kada se koriste drugi gena za označavanje selebela markera (na pr. Geni tolerancije herbicida).

[0108] Oni koji su stručni u tehnici transformacije kukuruza razumeće da su na raspolaganju druge metode za transformaciju kukuruza i za selekciju transformisanih biljaka kada se koriste drugi eksprimirajući selektibilni marker geni (na pr. geni tolerancije na herbicide).

PRIMER 8

Biohemijske analize i biološke analize sa insekatima za kukuruzne biljke koje proizvode DIG-109 protein

[0109] Proizvodnja DIG-109 proteina u transgenskim biljkama kukuruza ispitana je u proteinima ekstrahovanim iz lišća mladih biljaka (generacija T0). Dva diska lista kukuruza prečnika 6 mm su postavljena u tubu za uzorak u kasetnoj kutiji sa 96 dubokih bunara (Costar Cat# 3957) i zamrznuta na -80° do dana analize. Tada su u svaku (zamrznutu) epruvetu dodata dva 4,5 mm cinkom-obojena Daisy™ BB’s, zajedno sa 200 mL pufera za ekstrakciju koji sadrži PBS (Phosphate Buffered Saline; Fisher Cat# BP665-1) plus 0,05% Tween 20. Svaka tuba je zatvorena, a kutija je postavljena u mlin za mlevenje (Kleco ™ 4-96 Pulverizer, Garcia Manufacturing, Visalia, CA) pri maksimalnom podešavanju od tri minuta.

Pulverizovani uzorci su centrifugirani 5 minuta na 2500 x g, a supernatant koji sadrži rastvorljive proteine korišćen je u imunološkim ispitivanjima.

[0110] Imunobloting analize ekstrahovanih proteina listova kukuruza otkrili su da poliklonsko antitelo DIG152RPC1 (pripremljeno iz zečeva imuniziranih sa Cry1Ca osnovnim toksin proteinom aktiviranim tripsinom) unakrsno ne reaguje sa proteinima ekstrahovanim iz lišća netransgenskih biljaka. U ekstraktima biljaka transformisanih sa pDAS5162, detektovano je nekoliko proteinskih vrsta pomoću DIG152PRC1 antitela.

[0111] 2čigledno je da, iako transgeni koji su uvedeni u kukuruz putem transformacije sa pDAS5162 koji kodira za DIG-109 protein pune dužine, proteolitička aktivnost unutar ćelija kukuruza procesira nascentni protein do obilja stabilnih vrsta manje molekulske mase.

[0112] Toksičnost prema insektima od strane lišća sakupljenog iz nezavisno izolovanih transgenskih kukuruznih biljaka, transformisanih sa pDAS5162 konstruktom testirana je in vitro korišćenjem neonatnih larvi malih sovica (FAW, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith)) i rezistentnih FAW (rFAW) larvi koje su rezistentne na Cry1F. FAW jaja su dobijena iz

1

komercijalnih insektarijuma (Benzon), a rFAW jaja dolazila su iz nekomercijalne populacije (Dow AgroSciences). Uzorci segmenta listova uzeti su za biološke testove sa insektima iz biljaka T0 raslih u staklenicima oko 2 nedelje nakon što su bilje transplantovane iz laboratorije u staklenik. Dva dela lista iz svake biljke (svaka oko 6.5 kvadratnih cm) postavljena su u odvojene bunare u posudi sa 32 bunara (CD International) na površinu od oko 3 mL očvršćenog 2% agara. Jaja su se izlegla pri ishrani za višestruke Lepidopteran vrste (Southland Products), a neonatalne larve starosti manje od 24 sata su odabrane. Otprilike 10 larvi po segmentu lista su pažljivo postavljene u svaki bunar pomoću četkice od kamilje dlake. Inficirane pločice su zapečDćene perforiranim poklopcima koji su isporučeni sa pločama, a zatim držane na 28°, 40% RH, 16 sati u svetlosti:8 sati u mraku tokom tri dana. Procenat štete (% DAM) za svaki listni deo je zabeležen na kraju testa. Procene oštećenja su uprosečene i korišćene za odreÿivanje koje biljke imaju najmanje oštećenja od svake vrste insekata korišćenih u testu. Testovi su ponovljeni nekoliko puta za sve insekte.

[0113] Podaci su analizirani pomoću statističkog softvera JMP (SAS, Cary, NC), u kojem se procenjuju % DAM ocene za svaku biljku, za svaki tip insekata. Model " Fit Y by X " je korišćen za one way ANOVA analizu. Tukey-Kramer separacija srednjh vrednosti je korišćena, ako je potrebno, za analizu značajnosti razlike meÿu srednjim vrednostima % DAM za svaki tretman. Komparacija je izvedena za % DAM ocene dobijene za kontrolne biljke slične starosti. Biljke pozitivne kontrole su uzgajane iz semena komercijalnog Herculex I™ hibrida, koji proizvodi Cry1Fa B.t. toksin. Biljke negativne kontrole (tj. netransformisane biljke) bile su predstavljene linijama Hi II i B104, a Herculex I™ Isoline (roditelj Herculex I™ hibrida koji ne sadrži Cry).

[0114] Slika 1 sumira rezultate dobijene u takvim testovima biološke analize sa insektima. Iznenaÿujuć je zaključak da postoji pozitivna korelacija izmeÿu proizvodnje DIG-109 u transgenskim listovima i ocene % DAM. Za FAW, F = 35,3; d.f. = 1,33; P <0,0001; r<2>= 0,52, i za rFAW, F = 25,3; d.f. = 1,33; P <0,0001; r<2>= 0,43. To je još iznenaÿujuće i najnovije otkriće da su larve malih sovica, koje su rezistentne na intoksikaciju od strane Cry1Fa B.t. toksina, ipak inhibirane ihranom sa DIG-109 B.t. toksinom.

[0115] Podrazumeva se da se drugi slični insekti štetočine kukuruza mogu testirati na sličan način. Ove štetočine uključuju, ali nisu ograničeni na: Agromyza parvicornis (corn blot leafminer), Agrotis ipsilon (black cutworm), Anticarsia gemmatalis (vel-vetbean caterpillar), Diatraea grandiosella (southwestern corn borer), Diatraea saccharalis (sugarcane borer),

2

Elas-mopalpus lignosellus (lesser cornstalk borer), Helicoverpa zea (corn earworm), Heliothis virescens, (tobacco budworm), Ostrinia nubilalis (European corn borer), Cry1F-rezistentni O. nubilalis, Plutella xylostella (diamondback moth), Cry1-rezistentni P. xylostella, Spodoptera exigua (beet armyworm), i Trichoplusia ni (cabbage looper).

[0116] Transgenske biljke kukuruza transformisane sa pDAS5848 (T0 generacija) takoÿe su ispitivane pomoću bioloških analiza sa insektima i imunoanalizama. Količina DIG-109 proteina u ekstraktima listova kvantifikovana je korišćenjem komercijalno dostupnog Cry1C ELISA kompleta za detekciju (Envirologix™, Portland, MA; Cat# AP007), a nivo detektovanog DIG-109 proteina je izražen kao deo na milion (ppm; 1 ppm predstavlja 1 ng DIG-109 proteina po mg ukupnog rastvorljivog proteina u ekstraktu).

[0117] Oštećenje nastalo ishranom FAW i rFAW je bilo kodirano na sledeći način: 0 = bez oštećenja ili nekoliko znakova ishrane, 1 = 25% do 50% listova je pojedeno, a 2 = većina svih listova je konzumirana ili nema preostalog lišća. Zaštićena biljka je ona čija je procena štete 0,67 ili niža.

[0118] Podaci u tabeli 3 pokazuju da postoji pozitivna korelacija izmeÿu prisustva DIG-109 proteinskih vrsta detektovanih sa ELISA u biljkama T0 i kontrole oštećenja od ishrane larvi malih sovica u in vitro biološkim ispitivanjima. Biljka sa najvišim detektovanim nivoom DIG-109 proteina (biljka 5848-005.4) imala je najnižu ocenu oštećenja od ishrane. Listovi iz biljaka sa nižim nivoom detekcije DIG-109 proteina u opsegu od 190 do 230 ppm takoÿe su pretrpele manja oštećenja ishranom nego što se moglo videte na lišću iz biljaka negativne kontrole (tj. netransformisane kontrole B104 i Hi II), koje su imale srednju ocenu oštećenja od 1,7 i 1,8. U svim ispitivanim pDAS5848 listovima, dominantne DIG-109 proteinske vrste obuhvataju dublete peptida približne veličine od 60kDa i 55kDa.

Tabela 3. Nivoi DIG-109 proteina u pDAS5848-transformisanim transgenskim ekstraktima listova kukuruza i smanjenje oštećenja zbog ishrane malih sovica.

[0119] Stoga je karakteristika predmetnog pronalaska da DIG-109 protein, kada se proizvodi u biljkama, čini biljke otpornim na oštećenja od ishrane štetnih larvi malih sovica i larvi malih sovica koje su rezistentne na Cry1F.

PRIMER 9

Eksperimenti kompetitivnog vezivanja Cry1Fa i Cry1Ca osnovnih proteina toksina sa izolovanim graničnim vezivnim membranskim vezikulama iz Spodoptera frugiperda

[0120] Sledeći primeri procenjuju kompetitivno vezivanje Cry1 osnovnih proteina toksina na putativne receptore u intestinalnim tkivima insekata. Pokazano je da se Cry1Ca osnovni protein toksina obeležen sa 125I vezuje sa visokim afinitetom na granične vezivne membranske vezikule (Brush Border Membrane Vesicles; BBMV) dobijene iz Spodoptera frugiperda (malie sovice) i da se Cry1Fa osnovni protein toksin ne nadmeće sa ovim vezivanjem.

[0121] Prečišćavanje Cry proteina. Gen koji kodira himerni protein koji obuhvata Cry1Ca osnovni toksin i Cry1Ab protoksin je eksprimiran u Pseudomonas fluorescens ekspresionom soju kao što je opisano u primeru 2. Na sličan način, gen koji kodira himerni protein, koji obuhvata Cra1Fa osnovni toksin (603 aminokiselina) i Cry1Ab protoksin (545 aminokiselina) je eksprimiran u Pf sistemu. Proteini su prečišćeni metodama iz primera 2 i izvedena je digestija tripsinom za proizvodnju aktiviranih osnovnih toksina iz proteina pune dužine a proizvodi su prečišćeni metodama iz primera 2. Preparati osnovnih proteina toksina (aktiviranih osnovnih toksina) bili su > 95% čistoće i imali su molekulsku masu otprilike od oko 65 kDa, kako je eksperimentalno utvrÿeno sa SDS-PAGE.

[0122] Standardne metode kvantifikacije proteina i SDS-poliakrilamidne gel elektroforeze su korišćene kao što je opisano, na primer, u Sambrook i sar. (1989) i Ausubel i sar. (1995), i novijim radovima istih.

4

[0123] Priprema i frakcionisanje solubilizovanih BBMV. Posljednji instar Spodoptera frugiperda larve je bio bez ishrane preko noći, a zatim je diseciran nakon hlaÿenja na ledu 15 minuta. Tkivo srednjeg creva uklonjeno je iz telesne šupljine, ostavljajući zadnji deo creva pričvršćen za poveznicu. Srednje crevo je postavljeno u 9X zapremine na ledu ohlaÿenog homogenizacionog pufera (300 mM manitola, 5 mM EGTA, 17 mM Tris baze, pH7,5), koji je dopunjen sa koktelom proteaza inhibitora (Sigma-Aldrich P-2714) koji je razblažen prema preporuci dobavljača. Tkivo je homogenizovano sa 15 udaraca staklenog homogenizatora tkiva. BBMV su pripremljeni metodom precipitacije MgCl2po Volfersbergeru (1993).

Ukratko, jednaka zapremina 24 mM MgCl2rastvora u 300 mM manitola se pomeša sa homogenatom srednjeg creva, meša 5 minuta i ostavi na ledu 15 minuta. Rastvor se centrifugira na 2500 x g 15 min na 4°. Supernatant se čuva a peleti se suspenduju do prvobitne zapremine 0,5X razblaženog pufera za homogenizaciju i ponovo centrifugira. Dva supernatanta su kombinovana i centrifugirana na 27000 x g tokom 30 min na 4° da bi se formirala BBMV frakcija. Pelet je suspendovan u BBMV puffer za čuvanje (10 mM HEPES, 130 mM KCl, 10% glicerol, pH7,4) do koncentracije proteina od oko 3 mg/mL.

Koncentracija proteina odreÿena je korišćenjem Bovine Serum Albumin-a (BSA) kao standarda. Odreÿivanje alkalne fosfataze (marker enzim za BBMV frakciju) napravljen je pre zamrzavanja uzoraka pomoću QuantiChrom™ DALP-250 test kita za alkalnu fosfatazu (Gentaur Molecular Products, Kampen-hout, BE) prema uputstvima proizvoÿDča. Specifična aktivnost ovog enzima obično je povećana 7 puta u odnosu na onu koja se nalazi u početnoj frakciji homogenata srednjeg creva. BBMV su alikvotirani u 250 ml uzoraka, zamrznuti u tečnom azotu i uskladišteni na -80°.

[0124] Elektroforeza. Analiza proteina pomoću SDS-PAGE je sprovedena pod redukcionim (tj. u 5% E-merkaptoetanola, BME) i denaturišućim (tj. zagrevana 5 minuta na 90° u prisustvu 2% SDS) uslovima. Proteini su ubačeni u bunare od 4% do 20% Tris-Glicin poliakrilamidnog gela (BioRad, Hercules, CA) i odvojeni pri 200 volti u trajanju od 60 minuta. Proteinske trake su detektovane bojenjem sa Coomassie Brilliant Blue R-250 (BioRad) tokom jednog sata i obezbojene sa rastvorom 5% metanola u 7% sirćetnoj kiselini. Gelovi su snimljeni i analizirani koristeći BioRad Fluro-S Multi Imager ™. Relativne molekulske mase proteinskih traka odreÿene su poreÿenjem pokretljivosti proteina poznatih molekulskih masa koji se mogu naći u uzorku BenchMark ™ Protein Ladder-a (Life Technologies, Rockville, MD) koji je ubačen u jedan bunar gela.

[0125] Jodiranje Cry1Ca osnovnog proteina toksina. Prečišćeni Cry1Ca osnovni protein toksina je jodiran korišćenjem Pierce Iodination Beads (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). Ukratko, dve jodirajuće perle su dva puta isprane sa 500 mL PBS (20 mM natrijum fosfata, 0,15 M NaCl, pH7,5) i smeštene u tubu za centrifugiranje od 1,5 mL sa 100 mL PBS. Dodato je 0,5 mCi natrijum jodida obeleženog sa 125I, komponentama je bilo dozvoljeno da reaguju tokom 5 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim je u rastvor dodat 1 mg Cry1Ca osnovnog proteina toksina i ostavljeno je da reaguje još 3 do 5 minuta. Reakcija je terminirana pipetiranjem rastvora iz jodiranih perlica i nanošenjem na Zeba™ spinsku kolonu (Invitrogen) uravnoteženu sa 50 mM CAPS, pH10,0, 1 mM DTT (ditiotreitol), 1 mM EDTA i 5% glicerola. Jodne kuglice su isprane dvaput sa 10 mL PBS, a rastvor za pranje takoÿe je primenjen na Zeba™ desalinirajuću kolonu. Radioaktivni rastvor je eluiran kroz spin kolonu, centrifugiranjem na 1000 x g u trajanju od 2 min.125I-označeni Cry1Ca osnovni protein toksin je zatim dijalizovan protiv 50 mM CAPS, pH10,0, 1 mM DTT, 1 mM EDTA i 5% glicerola.

[0126] Vizualizacija. Radio-čistoća jodiranog Cry1Ca osnovnog proteina toksina utvrÿena je sa SDS-PAGE i fosforvizualizaciju. Ukratko, SDS-PAGE gelovi su osušeni pomoću ureÿaja za sušenje gela BioRad prema uputstvima proizvoÿDča. Osušeni gelovi su vizualizovani omotavanjem u Mylar film (debljine 12 mm) i izlaganjem pod ekran na Molecular Dynamics storage phosphor screen (35 cm x 43 cm) u trajanju od 1 sata. Ploče su razvijene pomoću molekularnog Molecular Dynamics Storm 820 phosphorimager i slika je analizirana pomoću softvera ImageQuant™.

PRIMER 10

Vezivanje 125I-označenog Cry1 osnovnog proteina toksina na BBMV iz Spodoptera frugiperda.

[0127] Kriva zasićenja je generisana pomoću 125I-označenog Cry1Ac osnovnog proteina toksina kako bi se odredila optimalna količina BBMV proteina za korišćenje u testovima vezivanja sa Cra1Ca i Cra1Fa osnovnim proteinima toksina.0,5 nM 125I-radioobeleženog Cry1Ac osnovnog proteina toksina je inkubirano tokom 1 sata na 28° u puferu za vezivanje (8 mM NaHPO4, 2 mM KH2PO4, 150 mM NaCl, 0,1% BSA, pH7,4) sa količinama BBMV proteina u rasponu od 0 mg/mL do 500 mg/mL (ukupna zapremina 0,5 mL).125I-obeleženi Cry1Ac osnovni protein toksin koji je vezan za BBMV proteine je odvojen od nevezane frakcije uzimanjem 150 mL reakcione smeše u triplikatu, u zasebne epruvete centrifuge od 1,5 mL i centrifugiranjem uzoraka na 14000 xk g tokom 8 minuta na sobnoj temperaturi. Supernatant je lagano uklonjen i pelet je ispran tri puta sa na ledu ohlaÿenim puferom za vezivanje. Dno centrifugalne epruvete koja sadrži pelet je odsečeno, stavljeno u staklenu epruvetu za kultivaciju 13 x 75 mm i uzorci su brojani na 5 minuta u gama brojaču. Dobijene vrednosti CPM (broj po minuti) minus pozadinski CPM (reakcija bez BBMV proteina) su prikazane u grafikonu u odnou na koncetraciju BBMV proteina. U skladu sa drugim rezultatima, optimalna koncentracija BBMV proteina odreÿena da se koristi u testovima vezivanja je 150 mg/mL.

PRIMER 11

Testovi kompetitivnog vezivanja za BBMV iz S. frugiperda sa osnovnim proteinima toksina Cry1Ca i Cry1Fa

[0128] Homologni i heterologni testovi kompetitivnog vezivanja su sprovedeni koristeći 150 mg/mL BBMV proteina i 0,5 nM 125I-označenog Cry1Ca osnovnog proteina toksina.

Koncentracije konkurentskog radiološki neobeleženog Cra1Fa osnovnog proteina toksina koji je dodat u reakcionu smešu kretale su se od 0,045 nM do 1000 nM i dodate su u isto vreme kada i radiološki obeležen Cry1Ca osnovni protein toksina, kako bi se osigurala istinska kompeticija vezivanja. Inkubacije su sprovedene 1 sat na 28° i količina 125I-označenog Cry1Ca osnovnog proteina toksina koji se vezao za BBMV (specifično vezivanje) izmerena je kako je gore opisano. Nespecifično vezivanje je predstavljeno brojem dobijenim u prisustvu 1000 nM radiološki neobeleženog Cry1Ca osnovnog proteina toksina. Pod sto posto ukupnog vezivanja smatrala se količina vezivanja u odsustvu bilo kojeg konkurentskog Cry1Fa osnovnog proteina toksina.

[0129] Testovi vezivanja receptora koristeći 125I-označeni Cry1Ca osnovni protein toksina odreÿuju sposobnost Cry1Fa osnovnog proteina toksina da izmesti ovaj radiološki označeni ligand sa mesta vezivanja na BBMV iz S. frugiperda. Rezultati (Slika 2) pokazuju da Cry1Fa osnovni protein toksina nije izmestio vezani Cry1Ca osnovni protein toksina sa njegovih receptorskih proteina u koncentracijama do 300 nM (600 puta više od koncentracije radiološkog vezujućeg liganda). Kao što se i očekivalo, neobeleženi Cry1Ca osnovni protein toksina uspeo je da izmesti radiološki označeni protein Cry1Ca osnovni protein toksina iz njegovog vezujućeg proteina, pokazujući sigmoidalnu krivu reagovanja na dozu sa 50% pomeranja koje se javlja pri 5 nM.

[0130] Na taj način je naznačeno da Cry1Ca osnovni protein toksina stupa u interakciju sa vezujućim mestom u BBMV iz S. frugiperda koje ne vezuje Cry1Fa osnovni protein toksina.

[0131] Videti Slika 2: Kompeticija za vezivanje na BBMV iz Spodoptera frugiperda za Cry1Fa osnovni toksin, Cry1Ca osnovni toksin i 125I-označeni Cry1Ca osnovni toksin.

PRIMER 12

Kompetitivno vezivanje Cry1Ca osnovnog proteina toksina i sa biotinom obeleženog Cry1Fa osnovnog proteina toksina na BBMV iz Diatraea saccharalis

[0132] Sledeći primeri procenjuju vezivanje Cry1 osnovnih proteina toksina za putativne receptore u tkivima creva insekata. Pokazano je da sa biotinom obeleženi Cry1Fa osnovni protein toksina se vezuje sa visokim afinitetom na Brush Border Membrane Vesicles (BBMV) dobijene iz Diatraea saccharalis (moljca šećerne trske) i da Cry1Ca osnovni protein toksina ne konkuriše ovom vezivanju.

[0133] Priprema i frakcija solubilizovanih BBMV. Poslednji instar D. saccharalis larve su bile bez ishrane preko noći, a zatim su disecirane nakon hlaÿenja na ledu 15 minuta. Preparati BBMV su napravljeni prema postupcima opisanim u Primeru 10.

[0134] Rezultati analize kompetitivnog vezivanja koristeći 125I-obeleženi Cry1Fa osnovni protein toksina mogu imati ograničenu biološku važnost, jer jodiranje Cry1Fa proteina čini protein neaktivnim u biološkim analizama hranjenja insekata. Nasuprot tome, otkriveno je da biotinilovani protein Cry1Fa osnovni toksin zadržava svoju toksičnost protiv insekata. Dalje, moguće je izmeriti interakciju ovog (biotinilovanog) proteina sa receptorima u prisustvu nebiotinilovanih (konkurentnih) Cry osnovnih proteina toksina. Takav eksperiment kompeticije može otkriti vezivanje biotin obeleženog Cry1Fa osnovnog proteina toksina sa receptorom kod D. saccharalis BBMV, nakon elektroforeze BBMV proteina i prenošenja celog uzorka u PVDF (poliviniliden fluorid) membranu. Avidin konjugovan sa peroksidazom rena, u kombinaciji sa pojačanim hemijskim luminescencnim reagensom, koristi se za vizuelizaciju biotin označenog Cry1Fa osnovnog proteina toksina.

[0135] Cry1Fa osnovni protein toksina je označen biotinom pomoću Pierce EZ-Link® Sulfo-NHS-LC Biotinylation Kit (Thermo Fisher Scientific). Ukratko, u 500 mL Cry1Fa osnovnog proteina toksina (2,0 mg/mL) u 0,1 M natrijum fosfatnom puferu, pH7,2 dodato je 40 mL sulfo-NHS-LC-biotina (10 mg/mL u dimetil sulfoksidu). Reakcija je inkubirana na 4° preko noći, a nereagovani Sulfo-NHS-LC-biotin je uklonjen korišćenjem Zeba™ desalinacione kolone. Uključivanje biotina u Cry1Fa osnovni protein toksina izmereno je korišćenjem Pierce HABA-avidin displacement assay (Thermo Fisher Scientific), kako je opisao proizvoÿDč.

[0136] Biotinom označen Cry1Fa osnovni protein toksinski (2,5 nM) je inkubiran 1 sat. na 28° sa 0,2 mg BBMV pripremljenog iz D. saccharalis [u ukupnoj zapremini od 1,0 mL] u prisustvu ili odsustvu 500-puta u višku neoznačenog Cry1Fa ili Cry1Ca osnovnih proteina toksina. Nevezani biotinom obeleženi Cry1Fa osnovni protein toksina, uklonjen je centrifugiranjem na 16000 x g tokom 10 min, a dobijeni pelet je 3 puta ispran pomoću, na ledu ohlaÿenog pufera za vezivanje. Pelet je suspendovan u 15 mL 4X Laemli pufera za uzorke, vorteksovan i soniciran da bi se obezbedila potpuna solubilizacija i zagrevan na 90° u trajanju od 3 min. Kompletan uzorak je ubačen u 4-20% Tris glicin gel, odvojen sa SDS-PAGE, i elektro prenesen na PVDF membranu prema preporukama instrukcija dobavljača (BioRad). 1,000 ng Cry1Fa osnovnog proteina toksina i Cry1Ca osnovni protein toksina takoÿe su vizalizovani na gelu kao negativne kontrole. Biotinom označeni Cry1Fa osnovni protein toksina je vizualizovan sa avidin-konjugovanom peroksidazom rena u rastvoru 1:15,000 uz pojačanu hemiluminiscenciju korišćenjem smeše SuperSignal® Vest Pico Peroxide Solution sa Luminal Enhancer Solution (Thermo Fisher Scientific, Kataloški brojevi 1859674 i 1859675). Trake su snimljene pomoću programa Biorad Fluor-S MultiImager sa softverom Quantity One v.4.5.2.

[0137] Rezultati su pokazali detekciju vezivanja biotinom označenog Cry1Fa osnovnog proteina toksina, vezanim za receptore u D. saccharalis BBMV, i dalje su pokazali da nebiotinilovani Cry1Fa osnovni protein toksina, pri 500-puta prekomernoj koncentraciji, potpuno izmešta vezani biotinilovani Cry1Fa osnovni protein toksina iz svog(jih) receptora. Nasuprot tome, 500-puta veća koncentracija Cry1Ca osnovnog proteina toksina nije bila u mogućnosti da izmesti vezani biotinilovani Cry1Fa osnovni protein toksina, što ukazuje na to da se Cry1Ca osnovni protein toksina ne nadmeće za vezujuće mesto(a) Cry1Fa osnovnog proteina toksina u D. saccharalis BBMV. Na taj način je naznačeno da, analogno rezultatima dobijenim sa BBMV iz S. frugiperda, Cry1Fa osnovni protein toksina i Cy1Ca osnovni protein toksina se vezuju za odvojena vezujuća mesta u D. saccharalis BBMV.

Reference

[0138]

Finney, D.J.1971. Probit analysis. Cambridge University Press, England.

Hua, G., L. Masson, J. L. Jurat-Fuentes, G. Schwab, and M. J. Adang. Binding analyses of Bacillus thuringiensis Cry d-endotoxins using brush border membrane vesicles of Ostrinia nubilalis. Applied and Environmental Microbiology 67[2], 872-879. 2001.

LeOra Software.1987. POLO-PC. A user’s guide to probit and logit analysis. Berkeley, CA. McGaughey, W. H., F. Gould, and W. Gelernter. Bt resistance management. Nature Biotechnology 16[2], 144-146.1998

Marçon, P.R.G.C., L.J. Young, K. Steffey, and B.D. Siegfried.1999. Baseline susceptibility of the European corn borer, Ostrinia nubilalis (Hćbner) (Lepidoptera: Pyralidae) to Bacillus thuringiensis toxins. J. Econ. Entomol. 92 (2): 280-285.

Robertson, L.J. and H.K. Preisler.1992. Pesticide bioassays with arthropods. CRC Press, Boca Ranton, FL.

SAS Institute Inc.1988. SAS procedures guide, Release 6.03 edition. SAS Institute Inc, Cary, NC.

Stone, B.F.1968. A formula for determining degree of dominance in cases of monofactorial inheritance of resistance to chemicals. Bull. WHO 38:325-329.

Van Mellaert, H., J. Botterman, J. Van Rie, and H. Joos. Transgenic plants for the prevention of development of insects resistant to Bacillus thuringiensis toxins. (Plant Genetic Systems N.V., Belg.89-401499[400246], 57-19901205. EP.5-31-1989

4

Prilog A

Lista delta-endotoksina - prema Crickmore i sar. webstranici (citirano u aplikaciji)

[0139] Broj pristupa je za NCBI unos (ako je dostupan)

Ime Pristupni br. Autori Godina Izvorni soj Komentar

Cry1Aa1 AAA22353 Schnepf et al 1985 Bt kurstaki HD1

Cry1Aa2 AAA22552 Shibano et al 1985 Bt sotto

Cry1Aa3 BAA00257 Shimizu et al 1988 Bt aizawai IPL7

Cry1Aa4 CAA31886 Masson et al 1989 Bt entomocidus

Cry1Aa5 BAA04468 Udayasuriyan et al 1994 Bt Fu-2-7

Cry1Aa6 AAA86265 Masson et al 1994 Bt kurstaki NRD-12

Cry1Aa7 AAD46139 Osman et al 1999 Bt C12

Cry1Aa8 126149 Liu 1996 Samo DNK sekvenca Cry1Aa9 BAA77213 Nagamatsu et al 1999 Bt dendrolimus T84A1

Cry1Aa10 AAD55382 Hou and Chen 1999 Bt kurstaki HD-1-02

Cry1Aa11 CAA70856 Tounsi et al 1999 Bt kurstaki

Cry1Aa12 AAP80146 Yao et al 2001 Bt Ly30

Cry1Aa13 AAM44305 Zhong et al 2002 Bt sotto

Cry1Aa14 AAP40639 Ren et al 2002 nepublikovan

Cry1Aa15 AAY66993 Sauka et al 2005 Bt INTA Mol-12

Cry1Ab1 AAA22330 Wabiko et al 1986 Bt berliner 1715

Cry1Ab2 AAA22613 Thorne et al 1986 Bt kurstaki

Cry1Ab3 AAA22561 Geiser et al 1986 Bt kurstaki HD1

Cry1Ab4 BAA00071 Kondo et al 1987 Bt kurstaki HD1

Cry1Ab5 CAA28405 Hofte et a I 1986 Bt berliner 1715

Cry1Ab6 AAA22420 Hefford et al 1987 Bt kurstaki NRD-12

Cry1Ab7 CAA31620 Haider & Ellar 1988 Bt aizawai IC1

Cry1Ab8 AAA22551 Oeda et al 1987 Bt aizawai IPL7

Cry1Ab9 CAA38701 Chak & Jen 1993 Bt aizawai HD133

Cry1Ab10 A29125 Fischhoff et al 1987 Bt kurstaki HD1

Cry1Ab11 112419 Ely & Tippett 1995 Bt A20 Samo DNK sekvenca Cry1Ab12 AAC64003 Silva-Werneck et al 1998 Bt kurstaki S93

Cry1Ab13 AAN76494 Tan et al 2002 Bt c005

Cry1Aa14 AAG16877 Meza-Basso & Theoduloz 2000 Nativni čileanski Bt

Cry1Ab15 AA013302 Li et al 2001 Bt B-Hm-16

Cry1Ab16 AAK55546 Yu et al 2002 Bt AC-11

Cry1Ab17 AAT46415 Huang et al 2004 Bt WB9

Cry1Ab18 AAQ88259 Stobdan et al 2004 Bt

Cry1Ab19 AAW31761 Zhong et al 2005 Bt X-2

Cry1Ab20 ABB72460 Liu et al 2006 BtC008

Cry1Ab21 ABS18384 Swiecicka et al 2007 Bt IS5056

Cry1Ab22 ABW87320 Wu and Feng 2008 BtS2491Ab

Cry1Ab-like AAK14336 Nagarathinam et al 2001 Bt kunthala RX24 nepouzdana sekvenca Cry1Ab-like AAK14337 Nagarathinam et al 2001 Bt kunthala RX28 nepouzdana sekvenca Cry1Ab-like AAK14338 Nagarathinam et al 2001 Bt kunthala RX27 nepouzdana sekvenca (nastavak)

Ime Pristupni br. Autori Godina Izvorni soj Komentar

Cry1 Ab-like ABG88858 Lin et al 2006 Bt Iy4a3 Nedovoljna sekvenca CrylAd AAA22331 Adang et al 1985 Bt kurstaki HD73

Cry1Ac2 AAA22338 Von Tersch et al 1991 Bt kenyae

Cry1Ac3 CAA38098 Dardenne et al 1990 Bt BTS89 A

Cry1Ac4 AAA73077 Feitelson 1991 Bt kurstaki PS85A 1

Cry1Ac5 AAA22339 Feitelson 1992 Bt kurstaki PS81G G

Cry1Ac6 AAA86266 Masson et al 1994 Bt kurstaki NRD-12

Cry1Ac7 AAB46989 Herrera et al 1994 Bt kurstaki HD73

Cry1Ac8 AAC44841 Omolo et al 1997 Bt kurstaki HD73

Cry1Ac9 AAB49768 Gleave et al 1992 Bt DSIR732

Cry1Ac10 CAA05505 Sun 1997 Bt kurstaki YBT-1520

CrylAd 1 CAA10270 Makhdoom & 1998

Riazuddin

Cry1Ac12 112418 Ely & Tippett 1995 Bt A20 Samo DNK sekvenca Cry1Ac13 AAD38701 Qiao et al 1999 Bt kurstaki HD1

Cry1Ac14 AAQ06607 Yao et al 2002 Bt Ly30

Cry1Ac15 AAN07788 Tzeng et al 2001 Bt sa Tajvana

Cry1Ac16 AAU87037 Zhao et al 2005 Bt H3

Cry1Ac17 AAX18704 Hire et al 2005 Bt kenyae HD549

Cry1Ac18 AAY88347 Kaur & Allam 2005 Bt SK-729

Cry1Ac19 ABD37053 Gao et al 2005 Bt C-33

Cry1Ac20 ABB89046 Tan et al 2005

Cry1Ac21 AAY66992 Sauka et al 2005 INTA Mol-12

Cry1Ac22 ABZ01836 Zhang & Fang 2008 Bt W015-1

Cry1Ac23 CAQ30431 Kashyap et al 2008 Bt

Cry1Ac24 ABL01535 Arango et al 2008 Bt 146-158-01

Cry1Ac25 FJ513324 Guan Peng et al 2008 Bt Tm37-6 Nema NCBI linka Jula 09 Cry1Ac26 FJ617446 Guan Peng et al 2009 Bt Tm41-4 Nema NCBI linka Jula 09 Cry1Ac27 FJ617447 Guan Peng et al 2009 Bt Tm44-1B Nema NCBI linka Jula 09 Cry1Ac28 ACM90319 Li et al 2009 Bt Q-12

Cry1Ad1 AAA22340 Feitelson 1993 Bt aizawai PS81I

Cry1Ad2 CAA01880 Anonymous 1995 Bt PS81R R1

Cry1Ae1 AAA22410 Lee & Aronson 1991 Bt alesti

Cry1Af1 AAB82749 Kang et al 1997 Bt NT0423

Cry1Ag1 AAD46137 Mustafa 1999

Cry 1 AM AAQ14326 Tan et al 2000

Cry1Ah2 ABB76664 Qi et al 2005 Bt alesti

Cry1Ai1 AA039719 Wang et al 2002

Cry1A-like AAK14339 Nagarathinam et al 2001 Bt kunthalanags3 nepouzdana sekvenca Cry1Ba1 CAA29898 Brizzard & Whiteley 1988 Bt thuringiensis HD2

Cry1Ba2 CAA65003 Soetaert 1996 Bt entomocidus HD110

Cry1Ba3 AAK63251 Zhang et al 2001

Cry1Ba4 AAK51084 Nathan et al 2001 Bt entomocidus HD9

Cry1Ba5 ABO20894 Song et al 2007 Bt sfw-12

Cry1Ba6 ABL60921 Martins et al 2006 Bt S601

Cry1Bb1 AAA22344 Donovan et al 1994 Bt EG5847

Cry1Bc1 CAA86568 Bishop et al 1994 Bt morrisoni

Cry1Bd1 AAD10292 Kuo et al 2000 Bt wuhanensis HD525

(nastavak)

Ime Pristupni br. Autori Godina Izvorni soj Komentar Cry1Bd2 AAM93496 Isakova et al 2002 Bt 834

Cry1Be1 AAC32850 Payne et al 1998 Bt PS158C 2

Cry1Be2 AAQ52387 Baum et al 2003

Cry1Be3 FJ716102 Xiaodong Sun et al 2009 Bt Nema NCBI linka Jula 09 Cry1Bf1 CAC50778 Arnaut et al 2001

Cry1 Bf2 AAQ52380 Baum et al 2003

Cry1Bf1 AAO39720 Wang et al 2002

Cry1Ca1 CAA30396 Honee et al 1988 Bt entomocidus 60.5

Cry1Ca2 CAA31951 Sanchis et al 1989 Bt aizawai 7.29

Cry1Ca3 AAA22343 Feitelson 1993 Bt aizawai PS81I

Cry1Ca4 CAA01886 Van Mellaert et al 1990 Bt entomocidus HD110

CrylCa5 CAA65457 Strizhov 1996 Bt aizawai 7.29

Cry1Ca6 AAF37224 Yu et al 2000 Bt AF-2

Cry1Ca7 AAG50438 Aixing et al 2000 Bt J8

Cry1Ca8 AAM00264 Chen et al 2001 Bt c002

Cry1Ca9 AAL79362 Kao et al 2003 Bt G10-01A

Cry1Ca10 AAN16462 Lin et al 2003 Bt E05-20a

Cry1Ca11 AAX53094 Cai et al 2005 Bt C-33

Cry1Cb1 M97880 Kalman et al 1993 Bt galleria e HD29 Samo DNK sekvenca Cry1Cb2 AAG35409 Song et al 2000 Bt c001

Cry1Cb3 ACD50894 Huang et al 2008 Bt 087

Cry1Cb-like AAX63901 Thammasittiro ng et al 2005 Bt TA476-1 Nedovoljna sekvenca Cry1Da1 CAA38099 Hofte et al 1990 Bt aizawai HD68

Cry1Da2 176415 Payne & Sick 1997 Samo DNK sekvenca

Cry1Db1 CAA80234 Lambert 1993 Bt BTS00349A

Cry1Db2 AAK48937 Li et al 2001 Bt B-Pr-88

Cry1Dc1 ABK35074 Lertwiriyawon g et al 2006 Bt JC291

Cry1Ea1 CAA37933 Visser et al 1990 Bt kenyae 4F1

Cry1Ea2 CAA39609 Bosse et al 1990 Bt kenyae

Cry1Ea3 AAA22345 Feitelson 1991 Bt kenyae PS81F

Cry1Ea4 AAD04732 Barboza-Corona et al 1998 Bt kenyae LBIT-147

Cry1Ea5 A15535 Botterman et al 1994 Samo DNK sekvenca Cry1Ea6 AAL50330 Sun et al 1999 Bt YBT-032

Cry1Ea7 AAW72936 Huehne et al 2005 Bt JC190

Cry1Ea8 ABX11258 Huang et al 2007 Bt HZM2

Cry1Eb1 AAA22346 Feitelson 1993 Bt aizawai PS81A 2

Cry1Fa1 AAA22348 Chambers et al 1991 Bt aizawai EG6346

Cry1Fa2 AAA22347 Feitelson 1993 Bt aizawai PS81I

Cry1Fb1 CAA80235 Lambert 1993 Bt BTSOO 349A

Cry1Fb2 BAA25298 Masuda & Asano 1998 Bt morriso ni INA67

Cry1Fb3 AAF21767 Song et al 1998 Bt morriso ni

Cry1Fb4 AAC10641 Payne et al 1997

Cry1Fb5 AA013295 Li et al 2001 Bt B-Pr-88

Cry1Fb6 ACD50892 Huang et al 2008 Bt 012

Cry1Fb7 ACD50893 Huang et al 2008 Bt 087

Cry1Ga1 CAA80233 Lambert 1993 Bt BTS0349A

Cry1Ga2 CAA70506 Shevelev et al 1997 Bt wuhanensis

Cry1Gb1 AAD10291 Kuo & Chak 1999 Bt wuhanensis HD525

4

(nastavak)

Ime Pristupni br. Autori Godina Izvorni soj Komentar

Cry1Gb2 AA013756 Li et al 2000 Bt B-Pr-88

CrylGc AAQ52381 Baum et al 2003

Cry1Ha1 CAA80236 Lambert 1993 Bt BTS02069AA

Cry1Hb1 AAA79694 Koo et al 1995 Bt morriso ni BF190

Cry1 H-like AAF01213 Srifah et al 1999 Bt JC291 Nedovoljna sekvenca Cry1la1 CAA44633 Tailor et al 1992 Bt kurstaki

Cry1la2 AAA22354 Gleave et al 1993 Bt kurstaki

Cry1la3 AAC36999 Shin et al 1995 Bt kurstaki HD1

Cry1la4 AAB00958 Kostichka et al 1996 Bt AB88

Cry1la5 CAA70124 Selvapandiyan 1996 Bt 61

Cry1la6 AAC26910 Zhong et al 1998 Bt kurstaki S101

Cry1la7 AAM73516 Porcar et al 2000 Bt

Cry1la8 AAK66742 Song et al 2001

Cry1la9 AAQ08616 Yao et al 2002 Bt Ly30

Cry1la10 AAP86782 Espindola et al 2003 Bt thuringiensis

Cry1la11 CAC85964 Tounsi et al 2003 Bt kurstaki BNS3

Cry1la12 AAV53390 Grossi de Sa et al 2005 Bt

Cry1la13 ABF83202 Martins et al 2006 Bt

Cry1la14 ACG63871 Liu & Guo 2008 Bt11

Cry1la15 FJ617445 Guan Peng et al 2009 Bt E-1B Nema NCBI linka Jula 09

Cry1la16 FJ617448 Guan Peng et al 2009 Bt E-1A Nema NCBI linka Jula 09 Cry1lb1 AAA82114 Shin et al 1995 Bt entomocidus BP465

Cry1lb2 ABW88019 Guan et al 2007 Bt PP61

Cry1lb3 ACD75515 Liu & Guo 2008 Bt GS8

Crylld AAC62933 Osman et al 1998 Bt C 18

Cry1lc2 AAE71691 Osman et al 2001

Cry1ld1 AAD44366 Choi 2000

Cry1le1 AAG43526 Song et al 2000 Bt BTCOO 7

Cry1 If1 AAQ52382 Baum et al 2003

Cry1 l-like AAC31094 Payne et al 1998 Nedovoljna sekvenca

Cry1 l-like ABG88859 Lin & Fang 2006 Bt 1y4a3 Nedovoljna sekvenca CryUal AAA22341 Donovan 1994 Bt EG5847

CryUbl AAA98959 Von Tersch & Gonzalez 1994 Bt EG5092

CryUd AAC31092 Payne et al 1998

CryUc2 AAQ52372 Baum et al 2003

CryUdl CAC50779 Arnaut et al 2001 Bt

Cry1Ka1 AAB00376 Koo et al 1995 Bt morrisoni BF190

Cry1La1 AAS60191 Je et al 2004 Bt kurstaki K1

Cryl-like AAC31091 Payne et al 1998 Nedovoljna sekvenca Cry2Aa1 AAA22335 Donovan et al 1989 Bt kurstaki

Cry2Aa2 AAA83516 Widner & Whiteley 1989 Bt kurstaki HD1

Cry2Aa3 D86064 Sasaki et al 1997 Bt sotto Samo DNK sekvenca (nastavak)

Ime Pristupni br. Autori Godina Izvorni soj Komentar Cry2Aa4 AAC04867 Misra et al 1998 Bt kenyae HD549

Cry2Aa5 CAA10671 Yu & Pang 1999 Bt SL39

Cry2Aa6 CAA10672 Yu & Pang 1999 Bt YZ71

Cry2Aa7 CAA10670 Yu & Pang 1999 Bt CY29

Cry2Aa8 AA01373 Wei et al 2000 Bt Dongbe i 66

Cry2Aa9 AA013750 Zhang et al 2000

Cry2Aa10 AAQ04263 Yao et al 2001

Cry2Aa11 AAQ52384 Baum et al 2003

Cry2Aa12 ABI83671 Tan et al 2006 Bt Rpp39

Cry2Aa13 ABL01536 Arango et al 2008 Bt 146-158-01

Cry2Aa14 ACF04939 Hire et al 2008 Bt HD-550

Cry2Ab1 AAA22342 Widner & Whiteley 1989 Bt kurstaki HD1

Cry2Ab2 CAA39075 Dankocsik et al 1990 Bt kurstaki HD1

Cry2Ab3 AAG36762 Chen et al 1999 Bt BTCOO 2

Cry2Ab4 AA013296 Li et al 2001 Bt B-Pr-88

Cry2Ab5 AAQ04609 Yao et al 2001 Bt Iy30

Cry2Ab6 AAP59457 Wang et al 2003 Bt WZ-7

Cry2Ab7 AAZ66347 Udayasuriyan et al 2005 Bt 14-1

Cry2Ab8 ABC95996 Huang et al 2006 Bt WB2

Cry2Ab9 ABC74968 Zhang et al 2005 Bt LLB6

Cry2Ab10 EF157306 Lin et al 2006 Bt LyD

Cry2Ab11 CAM84575 Saleem et al 2007 Bt CMBL-BT1

Cry2Ab12 ABM21764 Lin et al 2007 Bt LyD

Cry2Ab13 ACG76120 Zhu et al 2008 Bt ywc5-4

Cry2Ab14 ACG76121 Zhu et al 2008 Bt Bts

Cry2Ac1 CAA40536 Aronson 1991 Bt shangha i S1

Cry2Ac2 AAG35410 Song et al 2000

Cry2Ac3 AAQ52385 Baum et al 2003

Cry2Ac4 ABC95997 Huang et al 2006 Bt WB9

Cry2Ac5 ABC74969 Zhang et al 2005

Cry2Ac6 ABC74793 Xia et al 2006 Bt wuhanensis

Cry2Ac7 CAL18690 Saleem et al 2008 Bt SBSBT -1

Cry2Ac8 CAM09325 Saleem et al 2007 Bt CMBL-BT1

Cry2Ac9 CAM09326 Saleem et al 2007 Bt CMBL-BT2

Cry2Ac10 ABN15104 Bai et al 2007 Bt QCL-1

Cry2Ac11 CAM83895 Saleem et al 2007 Bt HD29

Cry2Ac12 CAM83896 Saleem et al 2007 Bt CMBL-BT3

Cry2Ad1 AAF09583 Choi et al 1999 Bt BR30

Cry2Ad2 ABC86927 Huang et al 2006 Bt WB10

Cry2Ad3 CAK29504 Saleem et al 2006 Bt 5_2AcT (1)

Cry2Ad4 CAM32331 Saleem et al 2007 Bt CMBL-BT2

Cry2Ad5 CA078739 Saleem et al 2007 Bt HD29

Cry2Ae1 AAQ52362 Baum et al 2003

Cry2Af1 ABO30519 Beard et al 2007 Bt C81

Cry2Ag ACH91610 Zhu et al 2008 Bt JF19-2

Cry2Ah EU939453 Zhang et al 2008 Bt Nema NCBI linka Jula 09 Cry2Ah2 ACL80665 Zhang et al 2009 Bt BRC-ZQL3

Cry2Ai FJ788388 Udayasuriyan et al 2009 Bt Nema NCBI linka Jula 09 Cry3Aa1 AAA22336 Herrnstadt et al 1987 Bt sandiego

Cry3Aa2 AAA22541 Sekar et al 1987 Bt tenebrionis

4

(nastavak)

Ime Pristupni br. Autori Godina Izvorni soj Komentar Cry3Aa3 CAA68482 Hofte et al 1987

Cry3Aa4 AAA22542 McPherson i sar 1988 Bt tenebrionis

Cry3Aa5 AAA50255 Donovan i sar 1988 Bt morrisoni EG2158

Cry3Aa6 AAC43266 Adams i sar 1994 Bt tenebrionis

Cry3Aa7 CAB41411 Zhang i sar 1999 Bt 22

Cry3Aa8 AAS79487 Gao and Cai 2004 Bt YM-03

Cry3Aa9 AAW05659 Bulla and Candas 2004 Bt UTD-001

Cry3Aa10 AAU29411 Chen i sar 2004 Bt 886

Cry3Aa11 AAW82872 Kurt i sar 2005 Bt tenebrionis Mm2

Cry3Aa12 ABY49136 Sezen i sar 2008 Bt tenebrionis

Cry3Ba1 CAA34983 Sick i sar 1990 Bt tolworthi 43F

Cry3Ba2 CAA00645 Peferoen i sar 1990 Bt PGSI208

Cry3Bb1 AAA22334 Donovan i sar 1992 Bt EG4961

Cry3Bb2 AAA74198 Donovan i sar 1995 Bt EG5144

Cry3Bb3 115475 Peferoen i sar 1995 Samo DNK sekvenca Cry3Ca1 CAA42469 Lambert i sar 1992 Bt kurstaki BtI109 P

Cry4Aa1 CAA68485 Ward & Ellar 1987 Bt israelensis

Cry4Aa2 BAA00179 Sen i sar 1988 Bt israelensis HD522

Cry4Aa3 CAD30148 Berry i sar 2002 Bt israelensis

Cry4A-like AAY96321 Mahalakshmi i sar 2005 Bt LDC-9 Nedovoljna sekvenca

Cry4Ba1 CAA30312 Chungjatpornc hai i sar 1988 Bt israelensis 4Q2-72

Cry4Ba2 CAA30114 Tungpradubku 1 i sar 1988 Bt israelensis

Cry4Ba3 AAA22337 Yamamoto i sar 1988 Bt israelensis

Cry4Ba4 BAA00178 Sen i sar 1988 Bt israelensis HD522

Cry4Ba5 CAD30095 Berry i sar 2002 Bt israelensis

Cry4Ba-like ABC47686 Mahalakshmi i sar 2005 Bt LDC-9 Nedovoljna sekvenca Cry4Ca1 EU646202 Shu i sar 2008 Nema NCBI linka Jula 09 Cry4Cb1 FJ403208 Jun & Furong 2008 Bt HS18-1 Nema NCBI linka Jula 09 Cry4Cb2 FJ597622 Jun & Furong 2008 Bt Ywc2-8 Nema NCBI linka Jula 09 Cry4Cc1 FJ403207 Jun & Furong 2008 Bt MC28 Nema NCBI linka Jula 09 Cry5Aa1 AAA67694 Narva i sar 1994 Bt darmstadiensis PS17

Cry5Ab1 AAA67693 Narva i sar 1991 Bt darmstadiensis PS17

Cry5Ac1 I34543 Payne i sar 1997 Samo DNK sekvenca Cry 5 Ad1 ABQ82087 Lenane i sar 2007 Bt L366

Cry5Ba1 AAA68598 Foncerrada & Narva 1997 Bt PS86Q 3

Cry5Ba2 ABW88932 Guo i sar 2008 YBT 1518

Cry6Aa1 AAA22357 Narva i sar 1993 Bt PS52A 1

Cry6Aa2 AAM46849 Bai i sar 2001 YBT 1518

Cry6Aa3 ABH03377 Jia i sar 2006 Bt 96418

Cry6Ba1 AAA22358 Narva i sar 1991 Bt PS69D 1

Cry7Aa1 AAA22351 Lambert i sar 1992 Bt galleriae PGSI245

Cry7Ab1 AAA21120 Narva & Fu 1994 Bt dakota HD511

Cry7Ab2 AAA21121 Narva & Fu 1994 Bt kumamotoensis 867

Cry7Ab3 ABX24522 Song i sar 2008 Bt WZ-9

4

(nastavak)

Ime Pristupni br. Autori Godina Izvorni soj Komentar Cry7Ab4 EU380678 Shu i sar 2008 Bt Nema NCBI linka Jula 09 Cry7Ab5 ABX79555 Aguirre-Arzola i sar 2008 Bt monterr ey GM-33

Cry7Ab6 ACI44005 Deng i sar 2008 Bt HQ122

Cry7Ab7 FJ940776 Wang i sar 2009 Nema NCBI linka Jula 09 Cry7Ab8 GU145299 Feng Jing 2009 Nema NCBI linka Jula 09 Cry7Ba1 ABB70817 Zhang i sar 2006 Bt huazho ngensis

Cry7Ca1 ABR67863 Gao i sar 2007 Bt BTH-13

Cry7Da1 ACQ99547 Yi i sar 2009 Bt LH-2

Cry8Aa1 AAA21117 Narva & Fu 1992 Bt kumam otoensis

Cry8Ab1 EU044830 Cheng i sar 2007 Bt B-JJX Nema NCBI linka Jula 09 Cry8Ba1 AAA21118 Narva & Fu 1993 Bt kumam otoensis

Cry8Bb1 CAD57542 Abad i sar 2002

Cry8Bc1 CAD57543 Abad i sar 2002

Cry8Ca1 AAA21119 Sato i sar. 1995 Bt japonensis Buibui

Cry8Ca2 AAR98783 Shu i sar 2004 Bt HBF-1

Cry8Ca3 EU625349 Du i sar 2008 Bt FTL-23 Nema NCBI linka Jula 09 Cry8Da1 BAC07226 Asano i sar 2002 Bt galleriae

Cry8Da2 BD133574 Asano i sar 2002 Bt Samo DNK sekvenca Cry8Da3 BD133575 Asano i sar 2002 Bt Samo DNK sekvenca Cry8Db1 BAF93483 Yamaguchi i sar 2007 Bt BBT2-5

Cry8Ea1 AAQ73470 Fuping i sar 2003 Bt 185

Cry8Ea2 EU047597 Liu i sar 2007 Bt B-DLL Nema NCBI linka Jula 09 Cry8Fa1 AAT48690 Shu i sar 2004 Bt 185 takoÿe AAW81032 Cry8Ga1 AAT46073 Shu i sar 2004 Bt HBF-18

Cry8Ga2 ABC42043 Yan i sar 2008 Bt 145

Cry8Ga3 FJ198072 Xiaodong i sar 2008 Bt FCD114 Nema NCBI linka Jula 09 Cry8Ha1 EF465532 Fuping i sar 2006 Bt 185 Nema NCBI linka Jula 09 Cry8la1 EU381044 Yan i sar 2008 Bt su4 Nema NCBI linka Jula 09 Cry8Ja1 EU625348 Du i sar 2008 BtFPT-2 Nema NCBI linka Jula 09 Cry8Ka1 FJ422558 Quezado i sar 2008 Nema NCBI linka Jula 09 Cry8Ka2 ACN87262 Noguera & Ibarra 2009 Bt kenyae

Cry8-like FJ770571 Noguera & Ibarra 2009 Bt canadensis Samo DNK sekvenca Cry8-like ABS53003 Mangena i sar 2007 Bt

Cry9Aa1 CAA41122 Shevelev i sar 1991 Bt galleriae

Cry9Aa2 CAA41425 Gleave i sar 1992 Bt DSIR517

Cry9Aa3 GQ249293 Su i sar 2009 Bt SC5(D2 No ) Nema NCBI linka Jula 09 Cry9Aa4 GQ249294 Su i sar 2009 Bt T03C001 Nema NCBI linka Jula 09 Cry9Aa like AAQ52376 Baum i sar 2003 Nekompletna sekvenca

Cry9Ba1 CAA52927 Shevelev i sar 1993 Bt galleriae

Cry9Bb1 AAV28716 Silva-Werneck i sar 2004 Bt japonensis

Cry9Ca1 CAA85764 Lambert i sar 1996 Bt tolworthi

Cry9Ca2 AAQ52375 Baum i sar 2003

Cry9Da1 BAA19948 Asano 1997 Bt japonensis N141

Cry9Da2 AAB97923 Wasano & Ohba 1998 Bt japonensis

Cry9Da3 GQ249295 Su i sar 2009 Bt T03B001 Nema NCBI linka Jula 09 Cry9Da4 GQ249297 Su i sar 2009 Bt T03B001 Nema NCBI linka Jula 09 Cry9Db1 AAX78439 Flannagan & Abad 2005 Bt kurstaki DP1019

Cry9Ea1 BAA34908 Midoh & Oyama 1998 Bt aizawai SSK-10

Cry9Ea2 AA012908 Li i sar 2001 Bt B-Bt B-Hm-16

4

(nastavak)

Ime Pristupni br. Autori Godina Izvorni soj Komentar Cry9Ea3 ABM21765 Lin i sar 2006 Bt lyA

Cry9Ea4 ACE88267 Zhu i sar 2008 Bt ywc5-4

Cry9Ea5 ACF04743 Zhu i sar 2008 Bts

Cry9Ea6 ACG63872 Liu & Guo 2008 Bt 11

Cry9Ea7 FJ380927 Sun i sar 2008 Nema NCBI linka Jula 09 Cry9Ea8 GQ249292 Su i sar 2009 GQ249292 Nema NCBI linka Jula 09 Cry9Eb1 CAC50780 Arnaut i sar 2001

Cry9Eb2 GQ249298 Su i sar 2009 Bt T03B00 No 1 NCBI link Jula 09 Cry9Ec1 AAC63366 Wasano i sar 2003 Bt galleriae

Cry9Ed1 AAX78440 Flannagan & Abad 2005 Bt kurstaki DP1019

Cry9Ee1 GQ249296 Su i sar 2009 Bt T03B00 No 1 NCBI link Avg 09 Cry9-like AAC63366 Wasano i sar 1998 Bt galleriae Nedovoljna sekvenca

Cry10Aa1 AAA22614 Thorne i sar 1986 Bt israelensis

Cry10Aa2 E00614 Aran & Toomasu 1996 Bt israelensis ONR-60A Samo DNK sekvenca

Cry10Aa3 CAD30098 Berry i sar 2002 Bt israelensis

Cry10A-like DQ167578 Mahalakshmi i sar 2006 Bt LDC-9 Nekompletna sekvenca

Cry11Aa1 AAA22352 Donovan i sar 1988 Bt israelensis

Cry11Aa2 AAA22611 Adams i sar 1989 Bt israelensis

Cry11Aa3 CAD30081 Berry i sar 2002 Bt israelensis

Cry11Aa-like DQ166531 Mahalakshmi i sar 2007 Bt LDC-9 Nekompletna sekvenca

Cry11Ba1 CAA60504 Delecluse i sar 1995 Bt jegathesan 367

Cry11Bb1 AAC97162 Orduz i sar 1998 Bt medellin

Cry12Aa1 AAA22355 Narva i sar 1991 Bt PS33F2

Cry13Aa1 AAA22356 Narva i sar 1992 Bt PS63B

Cry14Aa1 AAA21516 Narva i sar 1994 Bt sotto PS80JJ 1

Cry15Aa1 AAA22333 Brown & Whiteley 1992 Bt thompsoni

Cry16Aa1 CAA63860 Barloy i sar 1996 Cb malaysia CH18

Cry17Aa1 CAA67841 Barloy i sar 1998 Cb malaysia CH18

Cry18Aa1 CAA67506 Zhang i sar 1997 Paenibacillus popilliae

Cry18Ba1 AAF89667 Patel i sar 1999 Paenibacillus popilliae

Cry18Ca1 AAF89668 Patel i sar 1999 Paenibacillus popilliae

Cry19Aa1 CAA68875 Rosso & Delecluse 1996 Bt jegathesan 367

Cry19Ba1 BAA32397 Hwang i sar 1998 Bt higo

Cry20Aa1 AAB93476 Lee & Gill 1997 Bt fukuokaensis

Cry20Ba1 ACS93601 Noguera & Ibarra 2009 Bt higo LBIT-976

Cry20-like GQ144333 Yi i sar 2009 Bt Y-5 Samo DNK sekvenca Cry21Aa1 I32932 Payne i sar 1996 Samo DNK sekvenca Cry21Aa2 I66477 Feitelson 1997 Samo DNK sekvenca Cry21Ba1 BAC06484 Sato & Asano 2002 Bt roskildiensis

Cry22Aa1 I34547 Payne i sar 1997 Samo DNK sekvenca Cry22Aa2 CAD43579 Isaac i sar 2002 Bt

Cry22Aa3 ACD93211 Du i sar 2008 Bt FZ-4

Cry22Ab1 AAK50456 Baum i sar 2000 Bt EG4140

Cry22Ab2 CAD43577 Isaac i sar 2002 Bt

4

(nastavak)

Ime Pristupni br. Autori Godina Izvorni soj Komentar Cry22Ba1 CAD43578 Isaac i sar 2002 Bt

Cry23Aa1 AAF76375 Donovan i sar 2000 Bt Binarna sa Cry37Aa1 Cry24Aa1 AAC61891 Kawalek and Gill 1998 Bt jegathesan

Cry24Ba1 BAD32657 Ohgushi i sar 2004 Bt sotto

Cry24Ca1 CAJ43600 Beron & Salerno 2005 Bt FCC-41

Cry25Aa1 AAC61892 Kawalek and Gill 1998 Bt jegathesan

Cry26Aa1 AAD25075 Wojciechowsk a i sar c1999 Bt finitimus B-1166

Cry27Aa1 BAA82796 Saitoh 1999 Bt higo

Cry28Aa1 AAD24189 Wojciechowsk a i sar 1999 Bt finitimus B-1161

Cry28Aa2 AAG00235 Moore and Debro 2000 Bt finitimus

Cry29Aa1 CAC80985 Delecluse i sar 2000 Bt medellin

Cry30Aa1 CAC80986 Delecluse i sar 2000 Bt medellin

Cry30Ba1 BAD00052 Ito i sar 2003 Bt entomocidus

Cry30Ca1 BAD67157 Ohgushi i sar 2004 Bt sotto

Cry30Ca2 ACU24781 Sun and Park 2009 Bt jegathesan 367

Cry30Da1 EF095955 Shu i sar 2006 Bt Y41 Nema NCBI linka jula 09 Cry30Db1 BAE80088 Kishida i sar 2006 Bt aizawai BUN1-14

Cry30Ea1 ACC95445 Fang i sar 2007 Bt S2160-1

Cry30Ea2 FJ499389 Jun i sar 2008 Bt Ywc2-8 Nema NCBI linka jula 09 Cry30Fa1 ACI22625 Tan i sar 2008 Bt MC28

Cry30Ga1 ACG60020 Zhu i sar 2008 Bt HS18-1

Cry31Aa1 BAB11757 Saitoh & Mizuki 2000 Bt 84-HS-1-11

Cry31Aa2 AAL87458 Jung and Cote 2000 Bt M15

Cry31Aa3 BAE79808 Uemori i sar 2006 Bt B0195

Cry31Aa4 BAF32571 Yasutake i sar 2006 Bt 79-25

Cry31Aa5 BAF32572 Yasutake i sar 2006 Bt 92-10

Cry31Ab1 BAE79809 Uemori i sar 2006 Bt B0195

Cry31Ab2 BAF32570 Yasutake i sar 2006 Bt 31-5

Cry31Ac1 BAF34368 Yasutake i sar 2006 Bt 87-29

Cry32Aa1 AAG36711 Balasubramanian i sar 2001 Bt yunnanensis

Cry32Ba1 BAB78601 Takebe i sar 2001 Bt

Cry32Ca1 BAB78602 Takebe i sar 2001 Bt

Cry32Da1 BAB78603 Takebe i sar 2001 Bt

Cry33Aa1 AAL26871 Kim i sar 2001 Bt dakota

Cry34Aa1 AAG50341 Ellis i sar 2001 Bt PS80JJ 1 Binarna sa Cry35Aa1

Cry34Aa2 AAK64560 Rupar i sar 2001 Bt EG5899 Binarna sa Cry35Aa2 Cry34Aa3 AAT29032 Schnepf i sar 2004 Bt PS69Q Binarna sa Cry35Aa3 Cry34Aa4 AAT29030 Schnepf i sar 2004 Bt PS185 GG Binarna sa Cry35Aa4 Cry34Ab1 AAG41671 Moellenbeck i sar 2001 Bt PS149B 1 Binarna sa Cry35Ab1 Cry34Ac1 AAG50118 Ellis i sar 2001 Bt PS167 H2 Binarna sa Cry35Ac1

4

(nastavak)

Ime Pristupni br. Autori Godina Izvorni soj Komentar

Cry34Ac2 AAK64562 Rupar i sar 2001 Bt EG9444 Binarna sa Cry35Ab2

Cry34Ac3 AAT29029 Schnepf i sar 2004 Bt KR1369 Binarna sa Cry35Ab3 Cry34Ba1 AAK64565 Rupar i sar 2001 Bt EG4851 Binarna sa Cry35Ba1 Cry34Ba2 AAT29033 Schnepf i sar 2004 Bt PS201L 3 Binarna sa Cry35Ba2 Cry34Ba3 AAT29031 Schnepf i sar 2004 Bt PS201 HH2 Binarna sa Cry35Ba3

Cry35Aa1 AAG50342 Ellis i sar 2001 Bt PS80JJ 1 Binarna sa Cry34Aa1 Cry35Aa2 AAK64561 Rupar i sar 2001 Bt EG5899 Binarna sa Cry34Aa2 Cry35Aa3 AAT29028 Schnepf i sar 2004 Bt pS69Q Binarna sa Cry34Aa3 Cry35Aa4 AAT29025 Schnepf i sar 2004 Bt PS185 GG Binarna sa Cry34Aa4 Cry35Ab1 AAG41672 Moellenbeck i sar 2001 Bt PS149B Binarna sa Cry34Ab11 Cry35Ab2 AAK64563 Rupar i sar 2001 Bt EG9444 Binarna sa Cry34Ac2 Cry35Ab3 AY536891 AAT29024 2004 Bt KR1369 Binarna sa Cry34Ab3 Cry35Ac1 AAG50117 Ellis i sar 2001 Bt PS167 H2 Binarna sa Cry34Ac1 Cry35Ba1 AAK64566 Rupar i sar 2001 Bt EG4851 Binarna sa Cry34Ba1 Cry35Ba2 AAT29027 Schnepf i sar 2004 Bt PS201L 3 Binarna sa Cry34Ba2 Cry35Ba3 AAT29026 Schnepf i sar 2004 Bt PS201 HH2 Binarna sa Cry34Ba3 Cry36Aa1 AAK64558 Rupar i sar 2001 Bt

Cry37Aa1 AAF76376 Donovan i sar 2000 Bt Binarna sa Cry23Aa Cry38Aa1 AAK64559 Rupar i sar 2000 Bt

Cry39Aa1 BAB72016 Ito i sar 2001 Bt aizawai

Cry40Aa1 BAB72018 Ito i sar 2001 Bt aizawai

Cry40Ba1 BAC77648 Ito i sar 2003 Bunl-14

Cry40Ca1 EU381045 Shu i sar 2008 Bt Y41 Nema NCBI linka jula 09 Cry40Da1 ACF15199 Zhang i sar 2008 Bt S2096-2

Cry41Aa1 BAD35157 Yamashita i sar 2003 Bt A1462

Cry41Ab1 BAD35163 Yamashita i sar 2003 Bt A1462

Cry42Aa1 BAD35166 Yamashita i sar 2003 Bt A1462

Cry43Aa1 BAD15301 Yokoyama and Tanaka 2003 P. lentimorbussemadara

Cry43Aa2 BAD95474 Nozawa 2004 P. popilliaepopilliae

Cry43Ba1 BAD15303 Yokoyama and Tanaka 2003 P. lentimorbussemadara

Cry43-like BAD15305 Yokoyama and Tanaka 2003 P. lentimorbussemadara

(nastavak)

Ime Pristupni br. Autori Godina Izvorni soj Komentar Cry44Aa BAD08532 Ito i sar 2004 Bt entomocidus INA288

Cry45Aa BAD22577 Okumura i sar 2004 Bt 89-T-34-22

Cry46Aa BAC79010 Ito i sar 2004 Bt dakota

Cry46Aa2 BAG68906 Ishikawa i sar 2008 Bt A1470

Cry46Ab BAD35170 Yamagiwa i sar 2004

Cry47Aa AAY24695 Kongsuwan i sar 2005 Bt CAA890

Cry48Aa CAJ18351 Jones and Berry 2005 Bs IAB59 Binarna sa 49Aa Cry48Aa2 CAJ86545 Jones and Berry 2006 Bs 47-6B Binarna sa 49Aa2 Cry48Aa3 CAJ86546 Jones and Berry 2006 Bs NHA15 b Binarna sa 49Aa3 Cry48Ab CAJ86548 Jones and Berry 2006 Bs LP1G Binarna sa 49Ab1 Cry48Ab2 CAJ86549 Jones and Berry 2006 Bs 2173 Binarna sa 49Aa4 Cry49Aa CAH56541 Jones and Berry 2005 Bs IAB59 Binarna sa 48Aa Cry49Aa2 CAJ86541 Jones and Berry 2006 Bs 47-6B Binarna sa 48Aa2 Cry49Aa3 CAJ86543 Jones and Berry 2006 BsNHA 15b Binarna sa 48Aa3 Cry49Aa4 CAJ86544 Jones and Berry 2006 Bs 2173 Binarna sa 48Ab2 Cry49Ab1 CAJ86542 Jones and Berry 2006 Bs LP1G Binarna sa 48Ab1 Cry50Aa1 BAE86999 Ohgushi i sar 2006 Bt sotto

Cry51Aa1 ABM 444^ Meng i sar 2006 Bt F14-1

Cry52Aa1 EF613489 Song i sar 2007 Bt Y41 Nema NCBI linka jula 09 Cry52Ba1 FJ36176C Jun i sar 2008 Bt BM59-2 Nema NCBI linka jula 09 Cry53Aa1 EF633476 Song i sar 2007 Bt Y41 Nema NCBI linka jula 09 Cry53Ab1 FJ36175E Jun i sar 2008 Bt MC28 Nema NCBI linka jula 09 Cry54Aa1 ACA52194 Tan i sar 2009 Bt MC28

Cry55Aa1 ABW88931 Guo i sar 2008 YBT 1518

Cry55Aa2 AAE33526 Bradfisch i sar 2000 BT Y41

Cry56Aa1 FJ59762' Jun & Furong 2008 Bt Ywc2-8 Nema NCBI linka jula 09 Cry56Aa2 GQ483512 Guan Peng i sar 2009 Bt G7-1 Nema NCBI linka Avg 09 Cry57Aa1 ANC87261 Noguera & Ibarra 2009 Bt kim

Cry58Aa1 ANC87260 Noguera & Ibarra 2009 Bt entomocidus

Cry59Aa1 ACR43758 Noguera & Ibarra 2009 Bt kim LBIT-980

1

(nastavak)

2 (nastavak)

LISTA SEKVENCI

4

�

�

4

1

�

�

Claims (8)

Patentni zahtevi

1. Transgenska biljka ili biljna ćelija koja sadrži DNK koja kodira Cry1Ca insekticidni protein i DNK koja kodira CrylFa insekticidni protein.

2. Seme biljke prema zahtevu 1, gde pomenuto seme sadrži DNK koja kodira insekticidni protein Cry1Ca i DNK koja kodira Cry1Fa insekticidni protein.

3. Mešavina semena koja obuhvata seme za zaštitni pojas od ne-Bt biljaka za zaštitu i mnoštvo semena prema zahtevu 2, gde pomenuta semena za zaštitu obuhvataju manje od 40% svih semena u mešavini.

4. Transgenska biljka prema zahtevu 1, pomenuta biljka dalje sadrži DNK koja kodira Cry1Ab osnovni protein koji sadrži toksin.

5. Kompozicija za kontrolu štetočina lepidoptera koja obuhvata biljne ćelije koje eksprimiraju delotvorne količine i Cry1Fa osnovnog proteina koji sadrži toksin i Cry1Ca osnovnog proteina koji sadrži toksin.

6. Kompozicija prema zahtevu 5, koja obuhvata domaćina koji je transformisan tako da eksprimira i Cry1Fa osnovni protein koji sadrži toksin i Cry1Ca osnovni protein koji sadrži toksin, gde je navedeni domaćin mikroorganizam ili biljna ćelija.

7. Postupak za kontrolu štetočina iz grupe lepidoptera koji obuhvata prezentovanje pomenutim štetočinama ili okolini pomenutih štetočina, delotvorne količine kompozicije prema zahtevu 5.

8. Transgenska biljka koja proizvodi Cry1Fa protein plus Cry1Ca protein plus treći protein izabran iz grupe koja se sastoji od Vip3A, Cry1D, CrylBe i Cry1E proteina.