RS57410B1 - Jedinjenja za poboljšanje kognitivne funkcije - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj se pronalazak odnosi na derivate 2-okso-1-pirolidinil triazola, postupke za njihovo dobijanje, farmaceutske supstance koje ih sadrže i njihovu upotrebu kao lekove za poboljšanje kognitivne funkcije ili da se suprotstavi kognitivno propadanje kod sisara.

STANJE TEHNIKE

[0002] Kognitivni poremećaji, t.j. oštećenja procesa pamćenja i učenja, imaju značajno štetno dejstvo na kvalitet života obolelih pacijenata. Klinički prepoznati kognitivni poremećaji se razlikuju od blagog kognitivnog oštećenja sve do demencije različite ozbiljnosti. Kognitivni poremećaji mogu da budu povezani sa nekoliko bolesti i poremećaja kao što je šizofrenija, depresija ili Parkinsonova bolest.

[0003] Smatra se da je blago kognitivno oštećenje ("MCI") prelazni stadijum između kognitivnih promena normalnog starenja i ozbiljnijih problema prouzrokovanih Alchajmerovom bolešću. Demencija je klinički prepoznat sindrom koji za krajnju posledicu ima progresivan gubitak kognitivnih sposobnosti. Demencija može da bude jedan od velikog broja simptoma različitih neuroloških bolesti ili glavna nepravilnost povezana sa bolešću, kao što je slučaj kod Alchajmerove bolesti. Najčešći uzroci demencije obuhvataju cerebralnu atrofiju povezanu sa Alchajmerovom bolešću, bolest Levijevih tela, degeneraciju prednjeg dela temporalnog režnja, Pikova bolest, vaskularno suženje ili blokada u mozgu (t.j. vaskularna demencija takođe poznata kao demencija višestrukog infarkta), Hantingtonova bolest, Parkinsonova bolest, povrede glave, HIV infekcija ili Daunov sindrom.

[0004] Alchajmerova bolest (AD) je progresivna degenerativna bolest mozga primarno povezana sa starenjem. Alchajmerova bolest je jedan od nekoliko poremećaja koji prouzrokuju postepen gubitak moždanih ćelija i jedan je od i mogući vodeći uzrok demencije. Klinička prezentacija Alchajmerove bolesti je karakterisana gubitkom memorije, kognitivnih sposobnosti, zaključivanja, rasuđivanja, i orijentacije. Blago kognitivno oštećenje (MCI) je često prvi identifikovani stadijum AD. Kako bolest napreduje, motoričke, senzorne, i lingvističke sposobnosti takođe su pod uticajem sve dok ne postoji globalno oštećenje više kognitivnh funkcija. Ovi kognitivni gubici se postepeno događaju, ali obično vode do ozbiljnog oštećenja, i bolest na kraju dovede do smrti u opsegu od tri do dvadeset godina.

[0005] Za sada postoji samo nekoliko lekova koji su pokazali da omogućavaju u krajnjem slučaju najumereniju, uglavnom prelaznu korist pacijentima koji boluju od kognitivnog oštećenja. Inhibitori holinesteraze (antiholinesteraze), kao što je donepezil (Aricept®), galantamin (Razadin®, Razadin ER®, Reminil®, Nivalin®) i rivastigmin tartrat (Exelon®) se pokazao efikasnim kod blage do umerene demencije usled Alchajmerove bolesti. Exelon® je nedavno odobren za lečenje blage do umerene demencije povezane sa Parkinsonovom bolešću. Memantin, agonist NMDA receptora, je prvi odobren lek za Alchajmerovu bolest koji deluje na glutamatergijski sistem (Axura®, Akatinol®, Namenda®, Ebiksa®). Ovi lekovi međutim nisu samo pokazali ograničenu efikasnost već takođe značajna neželjena dejstva koja u nekim slučajevima vode do prekida terapije. Sa povećanjem životnog veka i opštim starenjem populacije postoji potreba da se razviju lekovi koji bi odložili ili ublažili kognitivnu disfunkciju kod pacijenata koji stare.

[0006] Kognitivno oštećenje povezano sa šizofrenijom (CIAS) je urođeni deo bolesti, koji utiče na većinu pacijenata, i često unapred datira svoj početak. Utiče na širok spektar kognitivnih funkcija, posebno pamćenje, pažnju, motoričke sposobnosti, izvršnu funkciju i socijalnu kogniciju kao posledica oštećenja fiziološkog regulatornog mehanizma (disregulacija) nekoliko sistema neurotransmitera. Za sada nema odobrene terapije za CIAS (O’Carroll, Advances in Psychiatric Treatment 6, 161-168 (2000); Millan et al., Nature Rev. Drug Discovery 11, 141-168 (2012)).

[0007] Levetiracetam ili (S)-(-)-alfa-etil-2-okso-1-pirolidin acetamid, je levorotatorno jedinjenje, opisano u evropskom patentu br. EP-162036 kao zaštitni agens za lečenje i sprečavanje agresija hipoksičkog i ishemijskog tipa centralnog nervnog sistema. Levetiracetam ima sledeću strukturu:

Levetiracetam je odobren, i reklamira se kao Keppra®, u velikom broju država uključujući Evropsku uniju i Sjedinjene Američke Države za lečenje različitih oblika epilepsije, terapijska indikacija za koju se pokazalo potpuno nepostojanje aktivnosti dekstrorotatornog enantiomera (R)-(+)-alfa-etil-2-okso-1-pirolidin acetamida (Gower et al., Eur. J. Pharmacol.222, 193-203 (1992)).

[0008] I dalje postoje izveštaji međutim da levetiracetam nema nikakvog uticaja na kognitivnu funkciju ni kod životinja ni kod ljudi (Lamberty et al, Epilepsy & Behavior 1, 333-342 (2000); Klitgaard et al. Epilepsy Research 50, 55-65 (2002); Shannon H & Love, P. Epilepsy & Behavior 7, 620-628 (2005); Higgins et al. Psychopharmacology 207, 513-527 (2010)).

[0009] Drugi lekovi tipa racetama obuhvataju piracetam, oksiracetam, aniracetam, pramiracetam i fenilpiracetam, koji su korišćeni za ljude i neki od njih su dostupni kao dodaci ishrani. Od ovih, oksiracetam i antiracetam više nisu u kliničkoj upotrebi. Pramiracetam je prema izveštajima poboljšao kognitivne nedostatke povezane sa traumatskim povredama. Iako piracetam nije ispoljio dugoročna poboljšanja za lečenje blagih kognitivnih oštećenja, nedavne studije su pokazale da njegov neurozaštitni efekat kada se koristi tokom zahvata bajpasa na srcu. Takođe je bio delotvoran za lečenje kognitivnih poremećaja moždanovaskularnog i traumatskog porekla; međutim, njegov ukupan učinak na snižavanje depresije i uznemirenosti je bio viši od poboljšanja pamćenja. Kao dodatna terapija, čini se da je koristan za pojedince sa mioklonusnom epilepsijom i tardivnom diskinezijom. Fenilpiracetam je jači od piracetama i koristi se za širi opseg indikacija. U kombinaciji sa vazodilatornim lekom, pokazao se da, piracetam ima dopunsko korisno dejstvo na različite kognitivne nedostatke.

[0010] Derivati pirolidona posebno za lečenje epilepsije su opisani u WO 2006/128693 i u WO 2006/128692:

U pomenutoj formuli

• R<3>može da bude - između ostalog - 1H-1,2,4-triazol-1-il i

• R<4>može da bude supstituisani ili nesupstituisani aril.

Jedno specifično jedinjenje triazol pirolidona koje ima sledeću formulu datu dole u tekstu je opisano u WO 2006/128693

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0011] Ovaj se pronalazak odnosi na jedinjenja, supstance i postupke za lečenje stanja povezanih sa pospešivanjem ili poboljšanjem kognitivne spostobnosti ili da deluje protiv kognitivnog pada. Dalje varijatno rešenje ovog pronalaska čine farmaceutske supstance koje sadrže jedinjenje koje je identifikovano u skladu sa gore iznetim postupkom i koji mogu da sadrže i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent. Dalja varijantna rešenja ovog pronalaska će postati očigledna iz detaljnog opisa.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0012] Jedinjenja i njihovi tautomeri, stereoizomeri i soli korisni za lečenje stanja povezanih sa pospešivanjem ili poboljšanjem kognitivne sposobnosti ili da neutrališe kognitivno oštećenje su ona iz formule (I)

pri čemu

R<1>je 3,4,5-trifluorofenil ili 3-cijanofenil deo;

R<2>je bilo cijano deo formule -CN ili atom hlora.

[0013] U jednom izvođenju R<1>grupa formule (I) je u 4R konfiguraciji. U drugom, je u 4S konfiguraciji.

[0014] U poželjnom izvođenju R<1>grupa je 3,4,5-trifluorofenil deo.

[0015] Specifična jedinjenja iz ovog pronalaska su ona izabrana iz grupe koja obuhvata:

• (4R)-1-[(5-hloro-1H-1,2,4-triazol-1-il)metil]-4-(3,4,5-trifluorofenil)pirolidin-2-on;

• 1-{[(4R)-2-okso-4-(3,4,5-trifluorofenil)pirolidin-1-il]metil}-1H-1,2,4-triazol-5-karbonitril;

• (+)-3-{1-[(5-hloro-1H-1,2,4-triazol-1-il)metil]-5-oksopirolidin-3-il}benzonitril.

[0016] Jedinjenja iz formule (I) u skladu sa ovim pronalaskom je moguće dobiti analogno uobičajenom postupcima kako to razume stručnjak u ovoj oblasti nauke sintetičke organske hemije.

[0017] Prema jednom izvođenju, jedinjenja imaju opštu formulu I moguće je dobiti nukleofilnom supstitucijom jedinjenja iz formule II putem triazola iz formule III prema jednačini:

pri čemu R<1>i R<2>imaju iste definicije kako je gore definisano za jedinjenja iz formule I.

[0018] Ovu reakciju je moguće izvesti na primer u tetrahidrofuranu ili toluenu u prisustvu baze kao što je natrijum hibrid, ili prema bilo kom postupku poznatom stručnjaku u ovoj oblasti.

[0019] Jedinjenja iz formule II moguće je pripremiti hlorisanjem jedinjenja iz formule IV, ili prema bilo kom postupku poznatom stručnjaku u ovoj oblasti.

pri čemu R<1>ima iste definicije kako je definisano gore u tekstu.

[0020] Ova reakcija može da bude izvedena na primer u dihlorometanu na 0°C u prisustvu oksalil hlorida, ili u skladu sa bilo kojim postupkom poznatim stručnjaku u ovoj oblasti.

[0021] Jedinjenja iz formule IV mogu biti pripremljena pomoću formulacije pirolidona formule V u skladu sa jednačinom:

pri čemu R<1>ima iste definicije kako je definisano gore.

[0022] Ovu reakciju je moguće izvesti na primer u tetrahidrofuranu na sobnoj temperaturi u prisustvu para- formaldehida i baze kao što je kalijum tert-butoksid, ili u skladu sa bilo kojim postupkom poznatim stručnjaku u ovoj oblasti.

[0023] Jedinjenja iz formule V moguće je pripremiti uklanjanjem zaštite jedinjenja iz formule VI u skladu sa ovom jednačinom:

pri čemu R<1>ima iste definicije kako je definisano gore.

[0024] Ovu reakciju moguće je izvesti na primer na sobnoj temperaturi u dihlorometanu u prisustvu kiseline kao što je trifluorosirćetnom kiselinom, ili prema bilo kom postupku poznatom stručnjaku u ovoj oblasti.

[0025] Sintezu jedinjenja formule VI moguće je izvesti korišćenjem postupaka opisanih u literaturi (na primer u WO 2006/128693) ili u skladu sa bilo kojim postupkom poznatim stručnjaku u ovoj oblasti.

[0026] U drugom izvođenju, ovaj pronalazak obuhvata sintezu sledećih intermedijara:

• (4R)-4-(3,4,5-trifluorofenil)pirolidin-2-on;

• (4R)-1-(hidroksimetil)-4-(3,4,5-trifluorofenil)pirolidin-2-on;

• (4R)-1-(hlorometil)-4-(3,4,5-trifluorofenil)pirolidin-2-on;

• tert-butil 4-(3-cijanofenil)-2-oksopirolidin-1-karboksilat;

• 3-(5-oksopirolidin-3-il)benzonitril;

• 3-[1-(hidroksimetil)-5-oksopirolidin-3-il]benzonitril; i

• 3-[1-(hlorometil)-5-oksopirolidin-3-il]benzonitril.

[0027] "Farmaceutski prihvatljive soli" prema ovom pronalasku obuhvata terapijski aktivne, netoksične oblike soli kiselina ili baza koji jedinjenja iz formule I mogu da se formiraju.

[0028] Oblik soli sa dodatkom kiseline jedinjenja formule I što se javlja u svom slobodnom obliku kao baza moguće ju je dobiti tretiranjem slobodne baze sa odgovarajućom kiselinom kao što je neorganska kiselina, na primer, hidrohalik kao što je hidrohlorna ili hidrobromna, sumporna, azotna, fosforna i slično; ili organska kiselina, kao što je, na primer, sirćetna, trifluorosirćetna, hidroksisirćetna, propanska, mlečna, piruvinska, malonska, sukcinska, maleinska, fumarna, jabučna, vinska, limunska, metansulfonska, etansulfonska, benzensulfonska, p-toluensulfonska, ciklaminska, salicilna, p-aminosalicilna, pamoinska i slične.

[0029] Jedinjenja iz formule I koja sadrže kiselinske protone moguće je pretvoriti u njihove terapijski aktivne, netoksične oblike soli sa dodatkom baze, npr. soli metala ili soli amina, obradom sa odgovarajućim organskim i neorganskim bazama. Odgovarajui oblici soli baze obuhvataju, na primer, soli amonijaka, alkalne soli i soli zemnoalkalnih metala, npr. soli litijuma, natrijuma, kalijuma, magnezijuma, kalcijuma i slično, soli sa organskim bazama, npr. N-metil-D-glukamin, soli hidrabamina, i soli sa amino kiselinama kao što je, na primer, arginin, lizin i slično.

[0030] Nasuprot tome pomenuti oblici soli mogu biti pretvoreni u slobodne oblike tretiranjem sa odgovarajućom bazom ili kiselinom.

[0031] Jedinjenja iz formule I i njihove soli mogu biti u obliku solvata, koji je uključen u obim ovog pronalaska. Takvi solvati obuhvataju na primer hidrate, alkoholate i slično.

[0032] Jedinjenja iz formule I i neki od njihovih intermedijara imaju barem jedan sterogenski centar u svojoj strukturi. Ovaj stereogenski centar može biti prisutan u R ili S konfiguraciji, pomenuta R i S notacija se koristi u skladu sa pravilima opisanim u Pure Appl. Chem.45, 11-30 (1976).

[0033] Ovaj se pronalazak takođe odnosi na sve enantiomerne oblike jedinjenja iz formule I ili njihove mešavine (uključujući sve moguće mešavine stereoizomera).

[0034] U vezi sa ovim pronalaskom upućivanje na jedinjenje ili jedinjenja predviđena da obuhvate to jedinjenje u svakom od njegovih mogućih izomernih oblika i mešavina, osim ako se ne upućuje posebno na specifičan izomerni oblik.

[0035] Izraz "enantiomerno čist" kako se ovde koristi se odnosi na jedinjenja koja imaju enantiomerni višak (ee) veći od 95%.

[0036] Takođe su obuhvaćena formulom (I) ona jedinjenja gde je dominantni izotop vodonik zamenjen deuterijumom ili tricijumom.

[0037] Jedinjenja prema ovom pronalasku mogu da postoje u različitim polimorfnim oblicima. Iako nije eksplicitno naznačeno u gornjoj formuli, takvi oblici su predviđeni da budu obuhvaćeni obimom ovog pronalaska.

[0038] Jedinjenja iz ovog pronalaska su za upotrebu kao lek, za lečenje stanja povezanih sa pospešivanjem ili poboljšanjem kognitivne sposobnosti ili da deluju protiv smanjene kognitivne sposobnosti.

[0039] Postupci iz ovog pronalaska obuhvataju isporuku sisaru (poželjno ljudskom biću) obolelom od gore pomenutih stanja ili poremećaja, jedinjenja prema ovom pronalasku u količini dovoljnoj da ublaži ili spreči poremećaj ili stanje.

[0040] Jedinjenje je prilično jednostavno isporučeno u obilo kom pogodnom obliku jedinične doze, uključujući ali ne ograničavajući se na ono koje obuhvata 0,1 do 2.000 mg, poželjno 0,1 do 1.000 mg, još poželjnije 0,1 do 500 mg aktivnog sastojka po jediničnom obliku doze.

[0041] Pojmovi "lečenje stanja poveznaih sa pospešivanjem ili poboljšanjem kognitivne sposobnosti" ili "da se deluje suprotno kognitivnom padu" ili "lečenju kognitivnog poremećaja" ili "poboljšanje kognitivne funkcije" ili "suzbijanje pada kognitivne funkcije" korišćeni u celom ovom spisu treba da znače poboljšanje kognitivne funkcije (koja utiče na oštećenu kognitivnu funkciju kod ispitanika tako da mnogo više liči na funkciju starosno-sličnom normalnom, neobolelom ispitaniku, uključujući stanja na koja se utiče kod kojih je kognitivna funkcija smanjena u poređenju sa normalnim ispitanikom) i očuvanje kognitivne funkcije (što utiče na normalnu ili oštećenu kognitivnu funkciju tako da ne opada ili ne spada ispod primećene kod ispitanika posle prvog ispoljavanja ili dijagnostikovanja, npr. do mere očekivanog smanjenja u odsustvu lečenja). Pogodnost jedinjenja prema ovom pronalasku povezanih sa pospešivanjem ili poboljšanjem kognitivne sposobnosti moguće je ispitati putem ogleda koji su dobro poznati stučnjaku u ovoj oblasti. Takvi ogledi obuhvataju specifično nove testove prepoznavanja predmeta iznete u Primeru 4 i 5, kao i test Y-laviritnta iznet u Primeru 6.

[0042] U jednom izvođenju ovog pronalaska, sisar ima normalnu kognitivnu funkciju koja je poboljšana.

[0043] U još jednom izvođenju sisar ispoljava kognitivno oštećenje povezano sa starenjem.

[0044] U još jednom izvođenju sisar je čovek sa kognitivnim oštećenjem povezanim sa bolešću ili poremećajem kao što je autizam, disleksija, hiperkinetički poremećaj, opsesivni kompulzivni poremećaji, psihoza, bipolarni poremećaji, depresija, Turetov sindrom i poremećaji učenja kod dece, adolescenata i odraslih, oštećenje pamćenja povezano sa starenjem, smanjenje kognitivne sposobnosti povezane sa godinama, Parkinsonova bolest, Daunov sindrom, Hantingtonova bolest traumatske povrede mozga, progresivna supranuklearna paraliza (PSP), HIV, moždani udar, vaskularne bolesti, Pikova bolest ili Krojcfeld-Jakobova bolest, multipla skleroza (MS), sa poremećajima bele materije i lekom indukovano kognitivno pogoršanje.

[0045] U još jednom izvođenju, oštećenje kognitivne funkcije je prouzrokovano, ili se pripisuje, Alchajmerovoj bolesti. U jednom drugom izvođenju, oštećenje kognitivne funkcije je prouzrokovano, ili se pripisuje, srednjem kognitivnom oštećenju (MCI). U još jednom izvođenju, oštećenje kognitivne funkcije je prouzrokovano, ili se pripisuje, šizofreniji.

[0046] Jedinjenja prema ovom pronalasku moguće je koristiti za proizvodnju farmaceutske supstance za lečenje kognitivnog poremećaja za poboljšanje kognitivne funkcije ili suzbijanje smanjenja kognitivne funkcije. Takve supstance obično sadrže aktivni farmaceutski sastojak i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent.

[0047] Pogodni razblaživači i nosači mogu imati širok dijapazon oblika zavisno od željene rute isporuke leka, npr., oralno, rektalno, parenteralno ili intranazalno.

[0048] Farmaceutske supstance koje obuhvataju jedinjenja prema ovom pronalasku mogu, na primer, biti isporučene oralno, parenteralno, t.j. intravenski, intramuskularno ili potkožno, intratekalno, transderamalno (flasteri), inhalacijom ili intranazalno.

[0049] Farmaceutske supstance pogodne za oralnu isporuku mogu biti čvrste supstance ili tečnosti i mogu, na primer, biti u obliku tableta, pilula, dražeja, želatinastih kapsula, rastvora, sirupa, guma za žvakanje i sličnog.

[0050] U svrhu ovog aktivni sastojak je moguće pomešati sa inertnim razblaživačem ili netoksičnim farmaceutski prihvatljivim nosačem kao što je skrob ili laktoza. Opciono, ove farmaceutske supstance mogu takođe da sadrže vezivač kao što je mikrokristalna celuloza, gum tragakant guma ili želatin, dezintegrans kao što je algininska kiselina, lubrikans kao što je magnezijum stearat glidans kao što je koloidni silikon dioksid, zaslađivač kao što je saharoza ili saharin, ili agensi za bojenje ili aromatizujući agensi kao što je pepermint ili metil salicilat.

[0051] Ovaj pronalazak takođe razmatra supstance koje mogu da otpuste aktivnu supstancu na kontrolisan način. Farmaceutske supstance koje je moguće koristiti za parenteralnu primenu su u uobičajenom obliku kao što su vodeni ili uljni rastvori ili suspenzije generalno sadržani u ampulama, špricevi za jednokratnu upotrebu, staklene ili plastične bočice ili infuzione posude.

[0052] Pored aktivnog sastojka, ovi rastvori ili suspenzije mogu opciono takođe da obuhvataju sterilni razblaživač kao što je voda za injekciju, fiziološki slani rastvor, ulja, polietilen glikole, glicerin, propilen glikol ili druge sintetičke rastvarače, antibakterijske agense kao što je benzil alkohol, antioksidansi kao što je askorbinska kiselina ili natrijum bisulfit, helirajuće agense kao što je etilen diamintetrasirćetna kiselina, puferska sredstva kao što su acetati, citrati ili fosfati i agensi za podešavanje osmolarnosti, kao što je natrijum hlorid ili dekstroza.

[0053] Takođe su sadržane u ovom pronalasku farmaceutske supstance koje sadrže jedinjenje iz ovog pronalaska u obliku farmaceutski prihvatljivog kokristala.

[0054] Takve farmaceutske supstance mogu još da obuhvataju poznate ili na tržištu dostupne terapijske agense korišćene za lečenje kognitivnih ili neuroloških poremećaja (AD) uključujući ali ne ograničavajući se na donepezil (Aricept®), galantamin (Razadin®, Razadin ER®, Reminil®, Nivalin®), rivastigmin tartrat (Exelon®), memantin (Aksura®, Akatinol®, Namenda®, Ebiksa®).

[0055] Prokognitivna aktivnost jedinjenja prema ovom pronalasku specifično iz formule I, ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, mogu biti određene različitim prekliničkim testovima i modelima poznatim stručnjaku u ovoj oblasti. Takvi testovi mogu da izazivaju efikasnost na više memorijskih faza i tipova. Nasuprot izazovu poseban tip memorije ili faze, kognitivni modeli ispituju sposobnost jedinjenja da spreči ili obrne nedostatak pamćenja u datoj putanji mozga, sistemu, ili funkciji.

[0056] Kod prekliničkih modela životinja, jedinjenja prema ovom pronalasku poboljšavaju holinergijski nedostatak pamćenja indukovan skopolaminom, antagonistom muskarinskog receptora. Oni takođe poboljšavaju nedostatak pamćenja indukovan beta-amiloidom ili subhroničnom primenom fenciklidina (PCP), nekonkurentnim NMDA antagonistom. Nedostaci pamćenja kod Alchajmerove bolesti mogu imati i holinergijsko poreklo kao posledicu specifične holinergijske degeneracije tokom napredovanja bolesti, i amiloidno poreklo kao posledicu povećanja beta-amiloida u mozgu. Kognitivni nedostaci kod šizofrenije nastaju kao rezultat iz poremećaja regulacije nekoliko sistema neurotransmitera, uključujući glutamat i dopamin, koji se oponašaju delovanjima NMDA antagonista kao što je fenciklidin. Dakle, veruje se da jedinjenja prema ovom pronalasku imaju jak potencijal da poboljšaju kognitivne nedostatke kod Alchajmerove bolesti i kognitivno oštećenje povezano sa šizofrenijom.

[0057] Neočekivano, jedinjenja prema ovom pronalasku pokazuju jake aktivnosti na in vivo modelima za spoznaju stvarnosti (kogniciju) (videti Primere 4, 5 i 6).

PRIMERI

[0058] Sledeći primeri ilustruju kako jedinjenja obuhvaćena formulom (I) mogu biti sintetisana. Ona su data u svrhu ilustacije samo i nisu predviđena, niti treba da budu tumačena, kao ograničenje ovog pronalaska na bilo koji način. Stručnjak u ovoj oblasti će razumeti da rutinske varijacije i modifikacije sledećih primera mogu biti izvedene bez prekoračenja duha ili obima ovog pronalaska.

[0059] NMR spektri su registrovani na BRUKER AVANCE 400 NMR spektrometru opremljenim sa Linux radnom stanicom koja radi na XWIN NMR 3.5 softveru i 5 mm inverznom 1H/BB glavom sonde, ili BRUKER DRX 400 NMR opremljen sa SG gorivom koji radi na XWIN NMR 2.6 softveru i 5 mm inverznoj geometriji 1H/13C/19F sondi sa tri glave. Ovo jedinjenje je projučavano u d6-dimetilsulfoksidnom (ili d3-hloroformnom) rastvoru na solution na temperaturi ogleda od 313 K ili 300 K i u koncentraciji od 10 mg/ml. Ovaj instrument je zaključan na signal deuterijuma od d6-dimetilsulfoksida (ili d3-hloroforma). Hemijske promene su date u ppm downfield pomeranjima što znači ka nižim vrednostima magnetnog polja iz TMS (tetrametilsilana) uzetog kao interni standard.

[0060] Merenja masenom spektrometrijom u LC/MS režimu su izvedena kao u nastavku:

HPLC uslovi

[0061] Analize se izvode korišćenjem WATERS Alliance HPLC sistema montiranog sa INERTSIL ODS 3, DP 5 µm, 250 X 4,6 mm kolone.

[0062] Gradijent iz 100 % rastvarača A (acetonitril, voda, trifluorosirćetna kiselina (10/90/0,1, v/v/v)) do 100 % rastvarač B (acetonitril, voda, trifluorosirćetna kiselina (90/10/0,1, v/v/v)) u 7 min sa držanjem na 100 % B od 4 min. Brzina protoka se postavi na 2,5 ml/min i deo od 1/25 se koristi neposredno pre API izvora.

MS uslovi

[0063] Uzorci se rastvore u acetonitrilu/vodi, 70/30, v/v u koncentraciji od oko 250 µg/ml. API spektri (+ ili -) se izvode korišćenjem masenog spektrometra FINNIGAN LCQ sa jonskim odvajačem. APCI izvor je radio na 450°C i kapilarni grejač na 160°C. ESI izvor je radio na 3,5 kV i kapilarni grejač na 210°C.

[0064] Pripremne hromatografske separacije su izvedene na silika gelu 60 Merck, veličina čestica 15-40 µm, referenca 1.15111.9025, korišćenjem Novasep aksijalnih kompresionih kolona (80 mm i.d.), brzine protoka između 70 i 150 ml/min. Količina mešavina silika gela i rastvarača kako je opisano u pojedinačnim postupcima. Separacije reverzne faze se izvode korišćenjem 500 g bilo Kromasil C1810 µm silika gela (kiselinski ili neutralni uslovi) ili Phenomenex Gemini C1810 µM (osnovni uslovi) u 8-cm ID kolibana sa brzinom protoka od 150 ml/min. Proizvodi se detektuju na 215 nm osim ako nije drugačije navedeno.

[0065] Pripremne hiralne hromatografske separacije se izvode na DAICEL Chiralpak IC 20 µm, 100*500 mm koloni korišćenjem interno ugrađenog instrumenta sa različitim mešavinama nižih alkohola i C5 do C8 linearnih, razgranatih ili cikličnih alkana na ± 350 ml/min. Mešavine rastvarača kako su opisane u pojedinačnim postupcima.

Primer 1: Sinteza (4R)-1-[(5-hloro-1H-1,2,4-triazol-1-il)metil]-4-(3,4,5-trifluorofenil)pirolidin-2-ona 7.

[0066]

1.1 Sinteza tert-butil 2-okso-4-(3,4,5-trifluorofenil)pirolidin-1-karboksilata 3 i enantiomera.

[0067] U rastvor tert-butil 2-okso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-karboksilata 1 (10 g, 1 ekv., 54,6 mmol) u dioksanu/vodi (100 ml/30 ml) su dodati na sobnoj temperaturi (3,4,5-trifluorofenil)boronska kiselina 2 (19,2 g, 2 ekv., 109,2 mmol), cezijum fluorid (24,9 g, 3 ekv., 163,8 mmol), (±)-2,2’-bis(difenilfosfino)-1,1’-binaftil (1,5 g, 4,5%, 2,5 mmol), kalijum karbonat (22,6 g, 3 ekv., 163,8 mmol) i hloro(1,5-ciklooktadien)rodium(I)dimer (0,82 g, 1,5%, 8,2 mmol). Mešavina se zagreva na 110°C tokom 2 sata. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom i ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu (eluent: CH2Cl2/MeOH/NH4OH 96/3,5/0,5 v/v/v) tda bi se dobio tertbutil 2-okso-4-(3,4,5-trifluorofe-nil)pirolidin-1-karboksilat 3. Enantiomeri su rešeni hiralnom hromatografijom (hiralpak IC, 150*4,6 mm, eluent: heptan/AcOEt/dietilamin 80/20/0.1 v/v/v) da bi se dobio tert-butil (4R)-2-okso-4-(3,4,5-trifluorofenil)pirolidin- 1-karboksilat 3A (drugi eluiran, 5,1 g), i njgov enantiomer tert-butil (4S)-2-okso-4-(3,4,5-trifluorofenil)pirolidin-1- karboksilat 3B (prvo eluirano, 5,2 g) kao čvrste supstance bele boje.

Jedinjenje 3A:

Prinos: 30%.

LC-MS (MH<+>): 316.

alfaD(MeOH, 25°C): -19,9.

1.2 Sinteza (4R)-4-(3,4,5-trifluorofenil)pirolidin-2-ona 4.

[0068] Na 0°C, TFA (20 ml, 261 mmol) je dodat u rastvor tert-butil (4R)-2-okso-4-(3,4,5-trifluorofenil)pirolidin- 1-karboksilata 3A (8 g, 1 ekv., 25,4 mmol) u dihlorometanu (100 ml). Mešavina je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Zatim, TFA i rastvarač su uklonjeni pod smanjenim pritiskom. Sirova mešavina je sipana u zasićeni rastvor vodenog rastvora NaHCO3(100 ml) i ekstrahovana sa AcOEt (3*200 ml). Kombinovani organski ekstrakti su osušeni iznad MgSO4i koncentrovani pod smanjenim pritiskom. Pretvaranje je totalno i isparavanje daje 5,5 g od (4R)-4-(3,4,5- trifluorofenil)pirolidin-2-ona 4, koji se koristi u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

LC-MS (MH+): 216; LC-MS (MH-): 214. alfaD(MeOH, 22°C): -20,1.

1.3 Sinteza (4R)-1-(hidroksimetil)-4-(3,4,5-trifluorofenil)pirolidin-2-ona 5.

[0069] U rastvor (4R)-4-(3,4,5-trifluorofenil)pirolidin-2-ona 4 (5,5 g, 1 ekv., 25,6 mmol) u THF (20 ml) su dodati kalijum tert-butoksid (0,049 g, 0,02 ekv., 0,44 mmol) i paraformaldehid (0,95 g, 1,2 ekv., 31,1 mmol) na sobnoj temperaturi. Posle mešanja tokom noći na 60°C, mešavina je ohlađena fiziološkim ratvorom (100 ml) i vodena faza je ekstrahovana sa AcOEt (2*100 ml). Kombinovani organski ekstrakti su osušeni iznad MgSO4i koncentrovani pod smanjenim pritiskom što je dalo prinos 4,7 g od (4R)-1-(hidroksimetil)-4-(3,4,5-trifluorofenil)pirolidin-2-ona 5, koji je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

LC-MS (MH+): 246.

<1>H NMR (DMSO) δ 7.34 (dd, J1=9.2 Hz, J2=6.8 Hz, 2 H), 5.87 (t, J=6.8 Hz, 1 H), 4.70 (m, 2 H), 3.78 (m, 1 H), 3.62 (m, 1 H), 3.40 (m, 1 H), 2.68 (m, 1 H), 2.43 (dd, J1=16.6 Hz, J2=8.6 Hz, 1 H).

1.4 Sinteza (4R)-1-[(5-hloro-1H-1,2,4-triazol-1-il)metil]-4-(3,4,5-trifluoro-fenil)pirolidin-2-ona 7.

[0070]

1) U hladni rastvor (0°C) od (4R)-1-(hidroksimetil)-4-(3,4,5-trifluorofenil)pirolidin-2-on 5 (4,7 g, 1 ekv., 19,4 mmol) u CH2Cl2(200 mL) je dodat oksalil hlorid (3,7 ml, 2 ekv., 38 mmol). Posle mešanja tokom 30 minuta na 0°C, reakciona mešavina je isparila u vakuumu dajući kao prinos (4R)-1-(hlorometil)-4-(3,4,5-trifluorofenil)pirolidin-2-on 6 koji je rastvoren u THF (100 ml) da bi se dobio Rastvor A.

2) U hladni rastvor (0°C) od 5-hloro-1H-1,2,4-triazola (3,0 g, 1,5 ekv., 29,1 mmol) u THF (100 ml) je dodat NaH 95% u mineralno ulje (0,9 g, 2 ekv., 38,7 mmol). Reakciona mešavina je mešana tokom 30 minuta na 0°C da bi se dobio Rastvor B.

3) Rastvor A je dodat u rastvor B na 0°C i reakciona mešavina je zadržana pod mešanjem tokom noći na sobnoj temperaturi. Ta mešavina je ohlađena vodom (100 ml) i ekstrahovana sa AcOEt (2*100 mL). Kombinovani organski ekstrakti su oprani sa fiziološkim rastvorom (100 ml), osušeni iznad MgSO4zatim su koncentrovani pod smanjenim pritiskom dajući kao prinos 7 g jedinjenja 7 kao sirove materije. Sirovi ostatak je prečišćen hromatografski na silika gelu (eluent: CH2Cl2/MeOH/NH4OH 95/5/0,5 v/v/v) i rekristalizovan iz iPr2O/EtOH što je dalo 1,6 g (4R)-1-[(5-hloro-1H-1,2,4-triazol-1-il)metil]-4-(3,4,5-trifluorofenil)pirolidin-2-ona 7 kao belu čvrstu supstancu. Prinos: 25%.

LC-MS (MH<+>): 331/333.

<1>H NMR (DMSO) δ 8.12 (s, 1 H), 7.32 (dd, J1=9.2 Hz, J2=6.9 Hz, 2 H), 5.63 (d, J=1.5 Hz, 2 H), 3.81 (t, J=8.6 Hz, 1H), 3.62 (t, J=8.4 Hz, 1 H), 3.39 (m, 1 H), 2.71 (dd, J1=16.7 Hz, J2=8.8 Hz, 1 H), 2.54 (d, J=9.1 Hz, 1 H).

alphaD(MeOH, 25°C): 9.2.

Primer 2: Sinteza 1-{[(4R)-2-okso-4-(3,4,5-trifluorofenil)pirolidin-1-il]-metil}-1H-1,2,4-triazol-5-karbonitrila 8

[0072] U hladni rastvor (0°C) 1H-1,2,4-triazol-5-karbonitrila (0,22 g, 1,5 ekv., 2,3 mmol) u toluenu (5 ml) je dodat NaH 95% u mineralnom ulju (0,074 g, 2 ekv., 3,1 mmol). Posle 1 sat mešanja na 0°C, (4R)-1-(hlorometil)-4-(3,4,5-trifluorofenil) pirolidin-2-on 6 (0,41 g, 1 ekv., 1,5 mmol) u toluenu (1 ml) je dodat i reakciona mešavina je održavana pod mešanjem tokom 60 sati na sobnoj temperaturi. Mešavina je ohlađena vodom (20 ml) i ekstrahovana sa AcOEt (2*10 ml). Kombinovani organski ekstrakti su oprani sa fiziološkim rastvorom (50 ml), osušeni iznad MgSO4zatim su koncentrovani pod smanjenim pritiskom što je dalo kao prinos 0,46 g jedinjenja 8 kao sirovog materijala. Sirovi ostatak je prečišćen hromatografijom na reverznoj fazi (Kromasil Eternity C18 kolona; gradijent: voda/CH3CN/NH4OH od 80/20/0,1 do 50/50/0,1 u 10 minuta) zatim hiralnom hromatografijom (pripremna Chiralpak IC 80*380 mm kolona; eluent: heptane/EtOH/dietilamin 50/50/0,1; izokratičan protok, 200 ml/min, 30°C) da bi se dobilo 0,04 g od 1-{[(4R)-2-okso-4-(3,4,5-trifluorofenil)pirolidin-1-il]metil}-1H-1,2,4-triazol-5-karbonitrila 8 kao bele čvrste supstance.

Prinos: 8%.

LC-MS (MH<+>): 322; LC-MS (MH-): 320.

<1>H NMR (DMSO) δ 8.41 (s, 1 H), 7.32 (m, 2 H), 5.79 (m, 2 H), 3.86 (t, J=8.6 Hz, 1 H), 3.63 (kvint, J=8.6 Hz, 1 H), 3.45 (m, 1 H), 2.71 (dd, J1=16.8 Hz, J2=8.6 Hz, 1 H), 2.51 (m, 1 H).

alfaD(MeOH, 25°C): -7,2.

Primer 3: Sinteza (+)-3-{1-[(5-hloro-1H-1,2,4-triazol-1-il)metil]-5-okso-pirolidin-3-il}benzonitrila 14.

[0073]

3.1 Sinteza tert-butil 4-(3-cijanofenil)-2-oksopirolidin-1-karboksilata 10.

[0074] U rastvor tert-butil 2-okso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-karboksilata 1 (18,3 g, 1 ekv., 100 mmol), (3-cijano-fenil)boronska kiselina 9 (29,4 g, 2 ekv., 200 mmol) i kalijum karbonata (0,69 g, 0,05 ekv., 5 mmol) u dioksanu/vodi (300 ml/5 ml) na refluksu su sukcesivno dodati (R)-2,2’-bis(difenil-fosfino)-1,1’-binaftil (1,6 g, 0,025 ekv., 2,5 mmol) i hloro(1,5-ciklooktadien)rodium(I) dimera (0,25 g, 0,005 ekv., 0,5 mmol). Mešavina je mešana na refluksu tokom 8 sati. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom, ostatak je tretiran vodom (150 ml) i ekstrahovan sa iPrOAc (250 ml). Lečenje organske faze sa zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3i ekstrakcija sa iPrOAc daje, posle koncentracije organske faze pod vakuumom, 33,9 g tert-butil 4-(3-cijanofenil)-2-oksopirolidin-1-karboksilat 10 kao braon ulje.

Prinos: 100%.

LC-MS (MH<+>): 287.

3.2 Sinteza (-)-3-(5-oksopirolidin-3-il)benzonitrila 11.

[0075] Tert-butil 4-(3-cijanofenil)-2-oksopirolidin-1-karboksilat 10 (33,9 g, 1 ekv., 100 mmol) u dihlorometanu (100 ml) je dodat ukapavanjem na 0°C u rastvor TFA (31,2 ml, 4 ekv., 400 mmol) u dihlorometanu (100 ml). Ta mešavina je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata zatim je ohlađena vodom (100 ml). Organska faza je izolovana i obrađena sa 5% vodenog rastvora NaHCO3i koncentrovana pod smanjenim pritiskom. Čvrsta supstanca braon boje dobijena kao rezultat je rekristalisana iz toluena dajući prinos 7,8 g od (-)-3-(5-oksopirolidin-3-il)benzonitril 11 kao čvrstu supstancu bež boje.

Prinos: 42%.

LC-MS (MH<+>): 187.

<1>H NMR (CDCl3) δ 7.52 (m, 4 H), 6.13 (s, 1 H), 3.84 (m, 1 H), 3.74 (m, 1 H), 3.42 (m, 1 H), 2.79 (m, 1 H), 2.46 (m, 1 H).

alphaD(MeOH, 25°C): -28,8.

3.3 Sinteza 3-[1-(hidroksimetil)-5-oksopirolidin-3-il]benzonitrila 12.

[0076] u rastvor (-)-3-(5-oksopirolidin-3-il)benzonitrila 11 (10 g, 1 ekv., 53,7 mmol) u THF (100 ml) su dodati kalijum tert-butoksid (0,1 g, 0,025 ekv., 1,34 mmol) i paraformaldehid (2 g, 1,2 ekv., 64,4 mmol) na sobnoj temperaturi. Posle 3 sata mešanja, na 60°C, mešavina je ohlađena sa fiziološkim rastvorom (100 ml) i vodena faza je ekstrahovana sa AcOEt (2*100 ml). Kombinovani organski ekstrakti su osušeni iznad MgSO4i koncentrovani pod smanjenim pritiskom dajući kao prinos 13,2 g 3-[1-(hidroksimetil)-5-oksopirolidin-3-il]benzonitrila 12, koji se koristi u sledećem koraku bez bilo kakvog daljeg prečišćavanja.

LC-MS (MH+): 217.

3.4 Sinteza (+)-3-{1-[(5-hloro-1H-1,2,4-triazol-1-il)metil]-5-oksopirolidin-3-il}benzonitrila 14.

[0077]

1) U hladni rastvor (0°C) 3-[1-(hidroksimetil)-5-oksopirolidin-3-il]benzonitrila 12 (5 g, 1 ekv., 23,1 mmol) u dihlorometanu (50 ml) je dodat oksalil hlorid (4,4 ml, 2 ekv., 46,2 mmol). Posle mešanja tokom 1 sat na 0°C, reakciona mešavina je isparavana pod vakuumom dala je kao prinos 3-[1-(hlorometil)-5-oksopirolidin-3-il]benzonitril 13 koji je rastvoren u THF (100 ml) da bi se dobio Rastvor A.

2) U hladan rastvor (0°C) 5-hloro-1 H-1,2,4-triazola (3,6 g, 1,5 ekv., 34,7 mmol) u THF (100 ml) je dodat NaH 95% u mineralnom ulju (1,1 g, 2 ekv., 46,2 mmol). Reakciona mešavina je mešana tokom 30 minuta na -20°C da bi se dobio Rastvor B.

3) Rastvor A je dodat u rastvor B na -20°C i reakciona mešavina je zadržana pod mešanjem tokom 1 sat na -20°C. Ta mešavina je ohlađena sa vodom (200 ml) i ekstrahovana sa AcOEt (2*100 ml). Kombinovani organski ekstrakti su osušeni iznad MgSO4i koncentrovani pod smanjenim pritiskom su dali kao prinos 8,2 g jedinjenja 14 kao sirov materijal. Sirovi ostatak je prečišćen hromatografijom na reverznoj fazi (LC/MS) (Kromasil Eternity C18 kolona; gradijent: voda/CH3CN/NH4OH od 80/20/0,1 do 50/50/0,1 tokom 10 minuta) da bi se dobio (+)-3-{1-[(5-hloro-1H-1,2,4-triazol-1-il)metil]-5-oksopirolidin-3-il}benzonitril 14 (drugi eluirani, 1,2 g) kao žuto ulje.

Prinos: 17%.

LC-MS (MH<+>): 302/304.

<1>H NMR (DMSO) δ 8.08 (s, 1 H), 7.77 (s, 1 H), 7.69 (d, J=7.6 Hz, 1 H), 7.62 (m, 1 H), 7.50 (t, J=7.7 Hz, 1 H), 5.62 (s, 2 H), 3.83 (t, J=8.7 Hz, 1 H), 3.65 (quint, J=8.4 Hz, 1 H), 3.40 (dd, J1=9.0 Hz, J2=7.9 Hz, 1 H), 2.73 (dd, J1=16.8 Hz, J2=8.8 Hz, 1 H), 2.51 (m, 1 H).

alfaD(MeOH, 25°C): 16,3.

Primer 4: In vivo model za procenu efikasnosti testiranog jedinjenja kod poremećaja učenja i pamćenja (novi test prepoznavanja predmeta; NOR)

[0078] Procena svojstava promnezije na modelu miša 2-struko ispitivanje prepoznavanja novog predmeta u situaciji gde je skopolaminom indukovan nedostatka pamćenja: paradgima dvostrukog ispitivanja prepoznavanja predmeta, početno razvijena od stane Ennaceur and Delacour (1988) kod pacova, može da se posmatra kao model pamćenja sličnog epizodnom. Ta paradigma učenja i pamćenja se zasniva na spontanoj eksplorativnoj aktivnosti glodara i ne obuhvata učenje ili učvršćenje pravila. Paradigma prepoznavanja predmeta je pokazala da je osetljiva na dejstva starenja i holinergijske disfunkcije (Scali et al, 1994; Bartolini et al, 1996). Ovaj model je prilagođen miševima i validiran korišćenjem farmakoloških agenasa (Bertaina-Anglade et al, 2003).

[0079] Svrha ove studije je procena sposobnosti jedinjenja koja se ispituju da se reverzira eksperimentalni nedostatak indukovan skopolaminom. Eksperimenti su izvedeni korišćenjem mužjaka C57BL/6J miševa (Centre d’Elevage R. Janvier, B.P.55, 53940 Le Genest-Saint-Isle, F.), teških 20-35 g (10-14 nedelja starosti) po svom dolasku oni treba da ispune kriterijume uključivanja opisane u eksperimentalnom postupku. Životinje su smeštene u grupe od 4-9 u polipropilenske kaveze (površina poda = 777 cm<2>) pod standarnim uslovima: sobna temperatura (22±2°C), svetlo/ciklus tame (12 sati/12 sati), voda i hrana (SAFE A04) bez ograničenja. Područje eksperimenta je kvadratna drvena kutija (40X40X40 cm) obojena u tamno plavu, sa 8 * 8 cm crno obojenim kvadratima pod providnim podom od pleksiglasa. Područje je postavljeno u tamnu prostoriju osvetljenu samo lampama koje daju ujednačeno prigušeno svetlo u kutiji (oko 60 luksa). Dan pre testiranja, miševi su se prilagodili na okruženje tokom maksimalno 30 minuta. Eksperimentalnog dana, miševi su prošli dva ispitivanja sa pauzom inercijalnog intervala od 60 min. Tokom prvog ispitivanja (ispitivanje za upoznavanje, T1), miševi su postavljeni u područje koja sadrži 2 identična predmeta i vreme potrebno svakoj životinji da upotpuni 20 s istraživanja predmeta je određeno sa vremenom pauze od 12 minuta. Istaživanjem se smatra usmeravanje nosa na rastojanju manjem od 2 cm od predmeta i/ili dodirivanje predmeta. Za drugo istraživanje (ispitivanje testiranja, T2), jedan od predmeta predstavljenih u prvom istaživanju je zamenjen nepoznatim predmetom (novi predmet), miševi su vraćeni nazad u područje na 5 minuta i određeno je istraživanje svakog predmeta zajedno sa lokomotornom aktivnošću. Kriterijum minimalnog nivoa istraživanja predmeta je korišćen u studiji da bi se isključile životinje sa prirodno niskim nivoima spontanog istaživanja: samo životinje koje imaju minimalni nivo istaživanja predmeta od 3 s tokom testiranog ispitivanja (Novo Poznato ≥ 3 s) su bile uključene u studiju. Izmereni su sledeći parametri: vreme potrebno da se dostigne 20 s istraživanja predmeta na T1 (s), lokomotorna aktivnost na T1 (izvestan broj ukrštenih linija), vreme provedeno u aktivnom istaživanju poznatog predmeta na T2 (s), vreme provedeno u aktivnom istraživanju novog predmeta na T2 (s), lokomotorna aktivnost na T2 (izvestan broj ukrštenih linija). Intraperitonealna ruta isporuke leka je korišćena da se procene dejstva promnezijanta. Pomoćno farmaceutsko sredstvo, ili jedinjenja iz formule I su isporučeni 40 min pre T1. Skopolamin je isporučen 30 min pre T1.

[0080] Jedinjenja iz formule (I) prema ovom pronalasku, ispitana prema gornjem protokolu, su pokazala uobičajenu aktivnost od 50 mg/kg ili manje.

Primer 5: In vivo model za procenu efikasnosti ispitanog jedinjenja za nedostatak pamćenja za prepoznavanje je indukovao intenzivnu isporuku skopolamina i ponovljeni podhronični fenciklidin (PCP) na zadatku prepoznavanja novog predmeta kod pacova.

[0081] Životinje su smeštene u grupe od 2-4 u polipropilenskim kavezima (površina poda = 1032 cm<2>) pod standardnim uslovima: temperatura prostorije (22±2°C), higrometrija (55±10%), ciklus svetla/tame (12 sati/12 sati), zamena vazduha (15-20 zapremina/sat), voda i hrana (SAFE A04) bez ograničenja. Pacovima je dozvoljeno da se aklimatizuju na uslove okoline tokom barem 5 dana pre eksperimenta.

[0082] Eksperimentalno područje je bila kvadratna drvena kutija (60x60x40 cm) obojena tamnoplavom bojuom, sa 15X15 cm crnoobojenim kvadratima pod providnim podom od pleksiglasa. Područje i predmeti su očišćeni korišćenjem vode između svakog ispitivanja da bi se izbegli tragovi mirisa koje su ostavili pacovi. Područje je postavljeno u tamnoj prostoriji osvetljenoj samo halogenim lampama orijentisanim prema plafonu i dala je ujednačeno prigušeno svetlo u kutiji (oko 60 luksa). Životinje koje je trebalo testirati su postavljene u eksperimentalno područje u prostoriju barem 30 min pre testiranja. Dan pre testiranja, pacovima je bilo dozvoljeno da slobodno istražuju kutiju za boravak.

[0083] Na dan eksperimenta, pacovi su prošli dva ispitivanja za istraživanje predmeta sa pauzom u vidu nekog vremenskog perioda između ispitivanja. Tokom prvog ispitivanja (ispitivanje za upoznavanje), pacovi su postavljeni u područje koja je sadržala 2 identična predmeta (poznati predmet) i vreme potrebno da se završi istraživanje predmeta je određeno unutar ograničenog vremenskog perioda (vreme prekida). Istraživanje je definisano kao usmeravanje nosa na rastojanju manjem od 2 cm od predmeta i/ili dodirivanje predmeta. Za drugo ispitivanje (ispitivanje pamćenja) jedan od predmeta predstavljenih u prvom ispitivanju je zamenjen nepoznatim predmetom (novi predmet), pacovi su vraćeni nazad u područje na 3 min i istraživanje svakog predmeta je izmereno. Lokomotorna aktivnost je procenjena tokom svakog ispitivanja putem broja linija ukrštenih po minutima. Kriterijum isključivanja je definisan za životinje sa prirodno niskim nivoima spontanog istraživanja, koje su istraživale nedovoljno tokom ispitivanja pamćenja. Sledeći parametri su izmereni: vreme potrebno da se postigne istaživanje predmeta tokom ispitivanja 1 (s), lokomotorna aktivnost tokom ispitivanja 1 (broj ukrštenih linija), vreme provedeno u aktivnom istraživanju poznatog predmeta tokom ispitivanja 2 (s), vreme provedeno u aktivnom istraživanju novog predmeta tokom ispitivanja 2 (s), lokomotorna aktivnost tokom ispitivanja 2 (broj ukrštenih linija).

[0084] Korišćena su dva modela nedostatka pamćenja: (A) akutna ip injekcija skopolamin hidrohlorida 30 min pre upoznavanja (ispitivanje 1) (0,3 mg/kg u fiziološkom rastvoru, u zapremini od 5 ml/kg) kod mužjaka laboratorijskog Sprag-Doli (Sprague Dawley) pacova (220-300 g (6-7 nedelja starosti) na početku eksperimenata); i (B) ponoviti podhronični subhronični fenciklidin (5 mg/kg ip deo u zapremini od 5 ml/kg) tokom 7 dana posle čega je usledilo 7 dana perioda ispiranja pre evolucije ponašanja kod mužjaka laboratorijskih (Long-Evans) pacova (160-220 g na početku eksperimenata). Jedinjenje je isporučeno po os 60 min pre upoznavanja u zapremini od 10 ml/kg na modelu skopolamina; i ip 40 min pre upoznavanja u količini od 5 ml/kg na podhroničnom PCP modelu. Pomoćno sredstvo je bilo 1% metilceluloze (w/v) 0,1 % Tween 80 (w/v), 0,1 % nepenušajućeg silikona 1510 US (w/v) u vodi. Eksperimentalni parametri novog prepoznavanja predmeta su prilagođeni svakom modelu i soju pacova. Ovi parametri su opisani u tabeli dole u tekstu.

[0085] Jedinjenja iz formule (I) prema pronalasku su prikazala obično aktivnost kod 1 mg/kg ili manje na modelu skopolamina i kod 3 mg/kg ili manje na podhroničnom PCP modelu.

Primer 6: Test sa lavirintom

[0086] Netransgenski model amiloidno indukovanog nedostatka pamćenja je korišćen i obuhvatio je: bolusnu intracerebralnu injekciju nagomilanog β25-35 amiloidnog peptida u bočnu komoru miša. Takva injekcija je indukovana 7-12 dana kasnije Kongo-crveno obojeni amiloidu slični talozi na hipokampusu i korteksu. Takođe je indukovan veliki broj nedostataka memorije primećen u spontanoj promeni, inhibitorno izbegavanje, ili zadatak Morisovog vodenog lavirinta.

[0087] Spontana promena kod pacova i miševa se odnosi na spontano ponašanje glodara da bi se promenilo u Y lavirintu ili T lavirintu. Spontano ponašanje promene je pripisano radu velikog broja raznovrsnih mehanizama, ali bez obzira na njegovu etološku funkciju, očigledno je da životinja mora da zapamti u koju ruku je unet u prethodnom slučaju da bi se omogućila promena njegovog izbora na sledećem ispitivanju. Samim tim, spontana promena je prihvaćena od strane bihejvioralnih farmakologa kao brz i relativno jednostavan test pamćenja lišenog straha, nagrade ili osnaživača (podsticaja).

[0088] Jedna unilateralna intracerebralna injekcija sa 9 nmole nagomilanog β25-35 amiloidnog peptida je isporučena u desnu bočnu komoru prema tehnici Maurice et al. (Brain Research.1996; 706:181-193).

[0089] Y lavirint je bio lavirint sa tri kraka jednake veličine (39 cm dug) napravljen od belog PVC. Kraci su usmereni na 60 uglova jedan od drugi. Test Y lavirinta je urađen 7-12 dana posle isporuke amiloida u uslovima umerenog osvetljenja (200 luks), sa umerenom muzikom u pozadini i blagim mirisom eukaliptusa. Jedinjenja su data intraperitonealno 40 min pre ispitivanja Y lavirinta.

[0090] Mladi mušjaci švajcarskog miša (Swiss mice) su počeli jedno ispitivanje na kraju jednog kraka, i bilo im je dozvoljeno da nesmetano istražuju Y lavirint tokom 8 min. Zabeležen je broj i redosled sekvenci poseta kraku. Promena je definisana kao "uzastopan ulaz u tri različita kraka". Procenat promene je izračunat sa sledećom formulom: "broj alternacija" podeljen sa "ukupnim brojem poseta kraku" minus 2.

[0091] Testirana jedinjenja su se pokazala obično aktivnost na 10 mg/kg ili manje.

Claims (8)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje iz formule (I) pri čemu

   R<1>je bilo 3,4,5-trifluorofenil ili 3-cijanofenil grupa; R<2>je bilo cijano ili hlorin. kao i njeni tautomeri, stereoizomeri i soli.
2. 2. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je R<1>grupa iz formule (I) u 4R konfiguraciji.
3. 3. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je R<1>grupa iz formule (I) je u 4S konfiguraciji.
4. 4. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, pri čemu R<1>grupa jeste 3,4,5-trifluorofenil deo.
5. 5. Jedinjenje prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, izabrano iz grupe koja obuhvata : (4R)-1-[(5-hloro-1H-1,2,4-triazol-1-il)metil]-4-(3,4,5-trifluorofenil)pirolidin-2-on; 1-{[(4R)-2-okso-4-(3,4,5-trifluorofenil)pirolidin-1-il]metil}-1H-1,2,4-triazol-5-karbonitril; (+)-3-{1-[(5-hloro-1H-1,2,4-triazol-1-il)metil]-5-oksopirolidin-3-il}benzonitril.
6. 6. Jedinjenje prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva za upotrebu kao lek.
7. 7. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, za upotrebu kao lek za lečenje kognitivnog poremećaja.
8. 8. Farmaceutska supstanca koja sadrži jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, kao pogodan farmaceutski prihvatljiv ekscipijent. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5