RS57480B1

RS57480B1 - Fuzioni protein koji sadrži interleukin 4 i interleukin 10

Info

Publication number: RS57480B1
Application number: RS20180904A
Authority: RS
Inventors: Roon Joel Adrianus Gijsbert Van; Sarita Aimee Yvonne Hartgring; Cornelis Erik Hack; Christina Louws; Floris Paulus Jacobus Gerardus Lafeber
Original assignee: Umc Utrecht Holding Bv
Priority date: 2011-11-08
Filing date: 2012-11-08
Publication date: 2018-10-31
Also published as: CN108129574A; US10981964B2; JP6527925B2; US20200147178A1; HRP20181210T1; JP2014533110A; WO2013070076A1; EP2776460A1; US20210261639A1; JP2018007693A; ES2683844T3; DK2776460T3; EP2776460B1; HUE038668T2; LT2776460T; CY1120493T1; US10851143B2; US20180094037A1; JP6284482B2; US20140314712A1

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Predmetni pronazak je iz oblasti imunologije i farmakologije, posebno za lečenje osteoartritisa, hroničnog bola, inflamatornih bolesti ili poremećaja i povezanih bolesti i poremećaja. Otkriće se posebno odnosi na nov fuzioni protein koji sadrži interleukin 4 (IL4) i interleukin 10 (IL10), po izboru fizički fuzionisan sa spojnicom (linkerom). Detaljnije, predmetni pronalazak obezbeđuje IL4-IL10 fuzioni protein kojem je dodeljena nadmoćna biološka aktivnost u odnosu na kombinaciju pojedinačnih citokina. Predmetno oktriće takođe obezbeđuje sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju dati fuzioni protein IL4-IL10, ekspresione vektore koji sadrže ove sekvence nukleinskih kiselina ili ćelije domaćine izmenjene tako da štiti sekvencu nukleinskih kiselina koja kodira sâm fuzioni protein IL4-IL10 i IL4-IL10. Oktriće dalje obezbeđuje postupke za proizvodnju fuzionog proteina IL4-IL10 od ćelije koja čuva ove sekvence nukleinskih kiselina. Transgeni ne-humani organixmi koji sadrže sekvencu nukleinskih kiselina pronalaska, takođe us opisa. Predmetni pronalzak se takođe odnosi na farmaceutske kompoziciji koje sadrže fuzioni protein IL4-IL10. Konačno, ovde je opisana upotreba fuzionog preteina IL4-IL10 kao leka, a posebno za prevenciju i/ili lečenje osteoartritisa i/ili stanja okarakterisanog lokalnom ili sitemskom inflamacijom, imunskom aktivacijom, limfoproliferacijom i/ili hroničnim bolom.

Stanje tehnike

[0002] Upalne bolesti i njihova srodna stanja, kao što su lokalna ili sistemska upala, imunska aktivacija, i/ili limfoproliferacija odabrana iz grupe koju čine sepsa, sindrom akutnog plućnog edema kod odraslih osoba (ARDS), alo- i ksenotransplantacija, dermatitis, upalna bolest creva, sarkoidoza, alergije, psorijaza, ankilozirajući spondiloartitis, autoimunske bolesti kao što je sistemski eritematozni lupus i reumatoidni artritis, glomerolonefritis, imuno kompleksi i drugi oblici vaskulitisa, multipla skleroza, Sjogren's-ova bolest, giht, limfoproliferativne bolesti kao što je ne-Hodgkin-ov limfom i hronična limfocita leukemija B ćelija, opekotine, multiple traume, moždani udar, infarkt miokarda, ateroskleroza, dijabetes melitus, ekstrakorporealna dijaliza i oksigenacija krvi, ishemijsko-reperfuzione povrede, toksičnost indukovan in vivo administracijom citokina ili terapeutska monoklonalna antitela, sindom hroničnog i neuropatskog i/ili inflamatornog bola, spadaju među najiscrpljujuća stanja u kliničkoj praksi. Proces upale je centralan za ova medicinska stanja, gde i pro-inflamatorni citokini i antiinflamatorni citokini igraju važne uloge kao posrednici zapaljenskih procesa.

[0003] Pro-inflamatorni citokini pospešuju lokalnu i sistemsku upalu. Među velikim grupama proinflmatornih citokina, posebno se ističu sledeća dva, tj. faktor nekroze tumoura (TNFα) i interleukin 1 (IL1β). Veliki napor je posvećen razvoju terapeutskih strategija usmerenih na inhibiciju TNFα i IL1β. Posebno, postignuto je smanjenje bioloških aktivnosti TNFα i IL1β pomoću nekoliko strategija kao što su neutrališuća antitela, solubilni receptori, antagonisti receptora i inhibitori proteaza koji konvertuju inaktivne prekursore u aktivne molekule. Na primer, inhibitori TNFα, kao što su Infliximab® (anti-TNFα antitelo), Humira® (potpuno humano anti-TNFα antitelo), Enbrel® (TNF-receptor-Fc-fuzioni protein), i Anakinra (Kineret®; interleukin-1 receptor antagonist, IL1ra) testirani su kliničkim ispitivanjima. Iako je blokiranje TNFα i/ili IL1β uspešno kod brojnih pacijanata obolelih od remuatoidnog artritisa i inflamatorne bolesti creva, ne reaguju svi pacijenti dobro na ovaj tip terapeutskih intervencija. Shodno tome, postoji velika potreba za alterintivnim i delotvornim terapeutskim strategijama za lečenje upalnih bolesti, hroničnog bola i srdonih stanja.

[0004] Osteoartritis (OA) je najčešće oboljenje zglobova i postoji dokaz da većina pojedinaca starosti od 65 godina naviše ima radiografni i/ili klinički dokaz o OA. Naješće pogođena mesta su ruke, kolena, kukovi i kičma.Važno je da su simptomi često povezani sa značajnim funkcionalnim oštećenjem, kao i znakovima i simptomima upale, uključujući bol, krutost i gubitak pokretljivosti. Karakteristične strukturne promene u OA uključuju progresivni gubitak artikularne hrskavice, povećanu debljinu subhondralne ploče, formiranje nove kosti na udruženim marginama (osteofiti) i razvoj subhondralnih kostnih cista. Pored toga, na raskrsnici artičnog hijalinskog hrskavica i susedne subhondralne kosti, u području tzv. Tidemark-a, nalazi se ostatak kalcifikovane hrskavice. Kako OA napreduje, postoje dokazi o vaskularnoj invaziji i napredovanju ove zone kalcifikovane hrskavice u zglobnu hrskavicu koja dodatno doprinosi smanjenju debljine zglobne hrskavice. Ove strukturne promene u zglobnoj hrskavici i periartikularnoj kosti mogu dovesti do modifikacije kontura susednih artikulacionih površina. Ove promene, kao i prateće izmene u subhondralnom remodeliranju kostiju i modula, mogu dalje doprineti razvoju neželjenog biomehaničkog okruženja i pozitivno uticati na napredovanje pogoršanja zglobnog hrskavca. Pokazano je da su mnogi faktori uticali na progresiju OA, uključujući prisustvo poliartikularnih bolesti, starenje, povezano intra-artikularno taloženje kristala, gojaznost, nestabilnost zgloba i / ili odstupanje, mišićnu slabost i perifernu neuropatiju. Ovi faktori mogu biti podeljeni u kategorije koje uključuju nasledne doprinose, mehaničke faktore i efekte starenja. Predložene su samo vrlo ograničene terapeutske intervencije za lečenje OA, a nekoliko dostupnih terapeutskih intervencija usmereno je na upravljanje bolovima, a ne na lečenje funkcionalnih oštećenja. Kombinacija IL4 i IL10 štiti od oštećenja hrskavice izazvane krvlju (van Meegeren et al. Osteoarthritis and Cartilage, vol 18, oktobar 2010, strane S102-S103, sažetak 219). Zbog toga postoji potreba za pružanjem jedinstvenog molekula za koji je klinički razvoj izvodljiv i koji se može koristiti za prevenciju ili lečenje OA, kao i hronični bol i za prevenciju ili lečenje stanja koje karakteriše lokalno ili sistemsko zapaljenje , imuno aktiviranje i / ili limfoproliferacija. Ovo bi omogućilo klinički razvoj jednog molekula za više bolesti ili poremećaja veoma različitih etiologija.

Opis pronalaska

[0005] U prvom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na fuzioni protein koji sadrži interleukin 4 (IL4) i interleukin 10 (IL10) za upotrebu u prevenciji ili lečenju osteoartritisa; hroničnog bola; ili stanja koje karakteriše lokalna ili sistemska upala, imunska aktivacija i / ili limfoproliferacija odabrana iz grupe koju čine: sepsa, sindrom akutnog plućnog edema kod odraslih osoba (ARDS), alo- i ksenotransplantacija, dermatitis, upalna bolest creva, sarkoidoza, alergije, psorijaza, osteoartritis, ankilozirajući spondiloartitis, autoimunske bolesti kao što je sistemski eritematozni lupus i reumatoidni artritis, glomerolonefritis, imuno kompleksi i drugi oblici vaskulitisa, multipla skleroza, Sjogren's-ova bolest, giht, limfoproliferativne bolesti kao što je ne-Hodgkin-ov limfom i hronična limfocita leukemija B ćelija, opekotine, multiple traume, moždani udar, infarkt miokarda, ateroskleroza, dijabetes melitus, ekstrakorporealna dijaliza i oksigenacija krvi, ishemijsko-reperfuzione povrede, toksičnost indukovan in vivo administracijom citokina ili terapeutskij monoklonalnih antitela, sindom hroničnog i neuropatskog i/ili inflamatornog bola.

[0006] U realizaciji, dati IL4 i dati IL10 su povezani linkerom.

[0007] U realizaciji, IL4 je fusionisan sa IL10 preko N-kraja.

[0008] U realizaciji, IL10 je fuzionisan sa IL4 preko N-kraja.

[0009] U realizaciji, fuzioni protein dalje sadrži jednu ili više hemijskih modifikacija. Ove hemijske modifikacije mogu da budu odabrane iz grupe koju čine glikozilovanje, fukozilovanje, sialilovanje i pegilovanje.

[0010] U realizaciji, IL10 je humani IL10.

[0011] U realizaciji, IL4 je humani IL4.

[0012] U drugom aspektu, predmetni pronalazak , se odnosi na molekul nukleinske kiseline koji sadrži polinukleotid koji kodira tu fuzioni protein, o kojem je reč.

[0013] U narednom aspektu, predmetni pronalazak odnosi se na vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline o kojim je reč.

[0014] U apsketu, predmetni pronalazak se odnosi na ćelju domaćina koja sadrži ovde opisan molekul nukleinske kiseline ili vektor.

[0015] U apsketu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za proizvodnju fuzionog proteina kao što je ovde predočeno, pomenuti postupak obuhvata korake: kultivisanje ćelije domaćina kao što je ovde opisano pod uslovima koji dozvoljavaju stvaranje fuzionog proteina kao što je ovde predočeno; i po izobru, regeneraciju fuzionog proteina.

[0016] U narednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži fuzioni protein kao što je ovde opisan, i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0017] Pronalazak se takođe odnosi na ovde opisan fuzioni protein za upotrebu kao lek, kao recimo za upotrebu u prevenciji ili lečenju stanja okarakterisanih lokalnom ili sistemskom upalom, imunskom aktivacijom, limfoproliferacijom i/ili bolom, odabranim iz grupe koju čine: sepsa, sindrom akutnog plućnog edema kod odraslih osoba (ARDS), alo- i ksenotransplantacija, dermatitis, upalna bolest creva, sarkoidoza, alergije, psorijaza, osteoartritis, ankilozirajući spondiloartitis, autoimunske bolesti kao što je sistemski eritematozni lupus i reumatoidni artritis, glomerolonefritis, imuno kompleksi i drugi oblici vaskulitisa, multipla skleroza, Sjogren's-ova bolest, giht, limfoproliferativne bolesti kao što je ne-Hodgkin-ov limfom i hronična limfocita leukemija B ćelija, opekotine, multiple traume, moždani udar, infarkt miokarda, ateroskleroza, dijabetes melitus, ekstrakorporealna dijaliza i oksigenacija krvi, ishemijsko-reperfuzione povrede, toksičnost indukovan in vivo administracijom citokina ili terapeutskoh monoklonalnih antitela, sindom hroničnog i neuropatskog i/ili inflamatornog bola.

[0018] U aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na fuzioni protein kao što je ovde opisano za upotrebu u prevenciji ili lečenju kliničkih stanja kod sisara, kao što je čovek, za koje je indikovan IL10.

[0019] Pronalazak se takođe odnosi na fuzioni proteino kako je ovde dato za upotrebu u prevenciji ili lečenju kliničkog stanja kod sisara, kao što je čovek, za koji je indikovan IL4.

[0020] Konačno,predmetni pronalazak odnosi se na vektor za upotrebu u prevenciji ili lečenju stanja okarakterisanih lokalnom ili sistemskom upalom, imunskom aktivacijom, limfoproliferacijom i/ili bolom, odabranim iz grupe koju čine: sepsa, sindrom akutnog plućnog edema kod odraslih osoba (ARDS), alo- i ksenotransplantacija, dermatitis, upalna bolest creva, sarkoidoza, alergije, psorijaza, osteoartritis, ankilozirajući spondiloartitis, autoimunske bolesti kao što je sistemski eritematozni lupus i reumatoidni artritis, glomerolonefritis, imuno kompleksi i drugi oblici vaskulitisa, multipla skleroza, Sjogren's-ova bolest, giht, limfoproliferativne bolesti kao što je ne-Hodgkin-ov limfom i hronična limfocita leukemija B ćelija, opekotine, multiple traume, moždani udar, infarkt miokarda, ateroskleroza, dijabetes melitus, ekstrakorporealna dijaliza i oksigenacija krvi, ishemijsko-reperfuzione povrede, toksičnost indukovan in vivo administracijom citokina ili terapeutskih monoklonalnih antitela, sindom hroničnog i neuropatskog i/ili inflamatornog bola.

Detaljan opis pronalaska

Opšte definicije

[0021] Izraz "molekul nukleinske kiseline" (ili "sekvenca nukleinskih kiselina", "polinukleotid", ili "nukleotidna sekvenca") odnosi se na molekul DNK ili RNK u jednolančanom ili dvolančanom obliku, naročito protein koji kodira DNK prema pronalasku. "Izolovana sekvenca nukleinskih kiselin " odnosi se na sekvencu nukleinskih kiselina koja više nije u svom prirodnom okruženju, već je izolovana, npr., sekvenca nukleinskih kiselina u bakterijskoj ćeliji domaćinu ili u biljnom jedarnom ili plastidnom genomu.

[0022] Izrazi "protein" ili "polipeptid" se koriste nazimenično i odnose se na molekule koji se sastoje od lanca amino kiselina, bez obzira na specifičan način delovanja, veličinu, 3 dimenzionalnu strukturu ili poreklo. "Izolovani protein" se koristi kad se odnosi na protein koji više nije u njegovom prirodnom okruženju, na primer in vitro ili u rekombinantnoj bakterijskoj ćeloiji domaćinu ili ćeliji domaćinu biljaka.

[0023] Izraz "fuzioni protein" odnosi se na protein ili polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izvedenu od dva ili više protein. Fuzioni protein takođe može da sadrži vezivne (linker) regione ili linker aminokiselina između delova amino kiselina izvedenih od odvojenih proteina.

[0024] Izraz "IL4-IL10 fuzioni protein" odnosi se na fuzioni polipeptid koji sadrži barem IL4 i IL10, po izboru povezane preko linkera. Fuzioni protein može da sadrži dodatne polipetidne sekvence, npr., signalnu sekvencu, Histidinski-tag, fragment Fc antitela i sl.

[0025] Kao što je ovde korišćeno, "linker" označava polipeptid upotrebljen da da poveže dva proteina ili polipeptida, in casu IL4 i IL10. Linker je tipično kratak lanac amino kiselina, npr. pretežno glicin i / ili serin. U jednom aspektu, linker je kratak lanac amino kiselina koji imaju dužinu do 100 nukleotida, kao što je od oko 2, 5, 7, 10, 15 aminokiselina do oko 15, 20, 25, 30, 35, 50 , 75 ili 100 amino kiselina, poželjno sadrži pretežno ostatke serina i glicina.

[0026] Kao što je ovde korišćen, "interleukin 10" (IL10) odnosi se na bilo koji IL10 sisara, kao što su humani IL10, mišji IL10. Kao što je ovde korišćen, "interleukin 4" (IL4) odnosi se na bilo koji IL4 sisara, kao što su humani IL4, mišji IL4. Kao što je ovde korišćen, izraz "dimeran" odnosi se na molekul gde su dva polipeptida vezani stabilnim kovalentnim ili nekovalentnim. Izraz "homodimeran" odnosi se na molekul gde su dva identična polipeptida povezana stabilno kovalentnim ili nekovalentnim interakcijama. U odgovarajućoj realizaciji, povezana su stabilnim nekovalentnim interakcijama.

[0027] "Funkcionalan", u vezi sa fuzionim proteinima predmetnog pronalaska, odnosi se na sposobnost da ispolje funkcionalnost i IL4 i IL10. Test funkcionalnosti IL4 IL10 je oslobađanje citokina indukvano lipopolisaharidom (LPS) (e.g. IL1, IL6, IL8, TNFα) u krvi

[0028] Izraz "gen" označava sekvencu DNK koja sadrži region (transkribovan region), koji je transkribovan u molekul RNK (npr. mRNK) u ćeliji, operativno vezan za odgovarajuće regulatorne regione (npr. promotor). Tako, gen može da sadrži nekoliko operativno povezanih sekvenci, kao što je promotor, 5' čeona sekvenca sadrži npr. sekvence uključene u inicijaciju translacije, (protein) kodirajući region (cDNK ili genomska DNK), introne, i 3'ne-translatovana sekvenca koja sadrži npr. mesta završetka transkripcije.

[0029] "3' UTR" ili "3' ne-tranlsatovana sekvenca" (takođe često označena i kao 3' netraslatovan region, ili 3' kraj) odnosi se na nukleinsku sekvencu koja se nalazi nishodno od kodirajuće sekvence gena, koja sadrži na primer mesto završetka transkripcije i (u većini ali ne sve eukariotske mRNK) signal poliadenilovanja l (kao što je npr. AAUAAA ili njegove varijante). Nakon završetka transkripcije, transkript mRNK se može razdvojiti nizvodno od signala poliadenilovanja i može se dodati poli (A) rep, koji je uključen u transport mRNK u citoplazmu (gde se i vrši translacija).

[0030] "Ekspresija gena" odnosi se na postupak gde je region DNK, koji je operativno vezan za odgovarajuće regulatrone regione, posebno promotor, transkribovan u RNK, koji je biološki aktivan, tj. koji je sposoban da se translatuje u biološki aktivan protein ili peptid (ili aktivan fragment peptida). "Eskpresija polipeptida" dodatno se odnosi na postupak gde je mRNK translatovana u proteinski proizvod, koji može ili ne da bude sekretovan.

[0031] "Sekvenca za regulaciju transkrpicije" je ovde definisana kao sekvenca nukleinskih kiselina koja može da reguliše brzinu transkripcije (kodiranja) sekvence koja je operativno vezana za sekvencu koja reguliše transkripciju. Sekvenca koja reguliše transkripciju kao što je ovde definisana će prema tome obuhvatiti sve elemente sekvence neophodne za inicijaciju transkripcije (promotor elemente), za održavanje i za regulaciju transkripcije, uključujući npr. atenuatore ili pojačivače. Iako se pretežno odnosi na uzvodne (5') transkripcione regulatorne sekvence u odnosu na kodirajuće sekvence, regulatorne sekvence nađene nizvodno (3') od kodirajućih sekvenci su takođe obuhvaćene ovom definicijom.

[0032] Kao što je ovde dat, izraz "promotor" odnosi se na fragment nukleinske kiseline koji funkcioniše kao kontrola transkripcije jednog ili više gena, lociran uzvodno u odnosu na smer transkripcije od mesta početka transkripcije gena, i strukturno je identifikovan prisustvom mesta vezivanja za DNK-zavisnu RNK polimerazu, mestima početka transkripcije i drugim sekvencama DNK, uključujući, ali ne isključivo, mesta vezivanja transkripcionog faktora, represora i mesta vezivanja aktivator proteina i druge nukleotidne sekvence poznate prosečnom stručnjaku koje direktno ili indirektno regulatišu količinu transkripcije od promotora. "Neregulisani" promotor je promotor koji je aktivan u većini tkiva pod najuobičajenim fiziološkim i razvojnim uslovima. "Induciblan" promotpr je promotor koji je regulisan fiziološki (npr. spoljnim dejstvom određenih jedinjenja) ili razvojno. Promotor "specifičan za tkiva " je aktivan samo u specifičnim vrstama tkiva ili ćelija.

[0033] Kao što je ovde dat, izraz "operativno vezan" odnosi se na vezivanje polinukleotidnih elemenata u funckionalnim odnosima. Nukleinska kiselina je "operativno vezana" kada je postavljena u funkcionalni odnos sa drugom sekvencom nukleinskih kiselina. Recimo, promotor, ili radije regulatorna sekvenca transkripcije, je operativno vezana za kodirajuću sekvencu ako utiče na transkripciju kodirajuće sekvence. Operativno vezan znači da su sekvence DNK tipično susedne.

[0034] "Konstrukt nukleinske kiseline " ili "vektor" ovde ima značenje kao veštački molekul nukleinske kilseline nastao upotrebom tehnologije rekombinantne DNK i koja se koristi za isporuku egzogene DNK u ćeliju domaćinaVEktori obično sadrže dodatne genetske elemente koji olakšavaju njihovu upotrebu kod molekularnog kloniranja, kao što su npr. selektivni markeri, više mesta kloniranja i slično (vidi u daljem tekstu)

[0035] "Strogi uslovi hibridizacije " može se koristiti za indetifikaciju nukelotidnih sekvenci, koje su suštinski identične datoj nukleotidnoj sekvenci. Strogi uslovi su zavisni od sekvenci i biće različiti pod različitim okolnostima. Generalno, strogi uslovi su odabrani da budu oko 5°C niži od termičke tačke topljenja (Tm) za specifične sekvence pri definisanom jonskom jačinom i pH. Tmje temperatura (pod različitim definisanim jonskim jačinama pH) na kojoj je 50% ciljane sekvence hibridizovano u savršeno uparene probe (sonde). Tipično strogi uslovi će biti odabrani u kojima koncetracija soli je oko 0.02 mola na pH 7 i temperatura je najmanje 60°C. Sniženje koncentracije soli i/ili povećanje temperature povećava strogost uslova. Strogi uslovi za RNK-DNK hibridizacije (Northern blots korišćenjem probe od npr. 100nt) su na primer oni koji uključuju barem jedno ispiranja u 0.2X SSC na 63°C tokom 20 min, ili ekvivalentne uslove. Strogi uslovi DNK-DNK hibridizacije (Southern blots korišćenjem probe od npr.

100nt) i na primer oni koji uključuju barem jedno ispiranje (obilno 2) u 0.2X SSC na temperaturi od najmanje 50°C, obično oko 55°C, tokom 20 min, ili ekvivalentni uslovi. Takođe videti Sambrook et al. (1989) i Sambrook and Russell (2001).

[0036] "Identitet sekvence " ili "sličnosti sekvence" može se odrediti poravnavanjem dva peptida ili dve nulleotidne sekvence primenom globalnih ili lokalnih algoritama poravnanja. Sekvence se mogu označiti i kao "suštinski identične" ili " u biti slične " kada dele (onda kada su optimalno poravnane na primer programima GAP ili BESTFIT primenom default parameters) najmanje izvstan minimalni procenat identiteta sekvence (kao što je definisano niže). GAP koristi Nidlemen-Vanšov algoritam za globalno poravnanje dve sekvence duže njihove cele dužine, maksimizirajući broj sličnosti i minimizirajući broj rupa. Generalno, korišćeni su osnovni GAP parametri, i to kazna za stvaranje rupe = 50 (nukleotida) / 8 (proteina) i kazna za produženje rupe = 3 (nukleotida) / 2 (proteina). Za nukleotide, kao osnovna matrica izračunavanja korišćena je nwsgapdna, a za proteine, kao osnovnia matrica izračunavanja korišćena je Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919). Poravnanje sekvenci i izračnavanja procenta identiteta sekenci mogu se odrediti primenom računarskih progama, kao što je GCG Wisconsin Package, Version 10.3, dostupan od Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 USA, ili EmbossWin version 2.10.0 (koristeći program "needle"). Alternativno procenat sličnosti ili identilnosti može se odrediti pretragom baza podataka, primenom algoritama kao što su FASTA, BLAST,itd. Poželjno, identitet sekvene odnosi se na identitet sekvence duž cele dužine sekvence.

[0037] "Ćelija domaćin" ili "rekombinantna ćelija domaćin" ili "transformisana ćelija" su izrazi koji se odnose na nove pojedinačne ćelije nastale kao rezultat najmanje jednog molekula nukleinske kiseline, posebno moelkul nukleinske kiseline koji kodira željeni protein. Ćelija domaćin je poželjno ćelija biljke ili bakterijska ćelija. Želija domaćin može da sadrži molekul nukleinske kiseline ili vektor predmetnog pronalaska kao ekstra-hromozomalno (epizomal) replicirajući molekul, ili bolje, sadrži molekul nunkleinske kiseline ili vektor predmetnog pronalaska koji je integrisan u genom ćelije domaćina.

[0038] Izraz "selektivni marker" je poznat poznatom stručnjaku i koristi se ovde da bi opisao bilo koji genetski entitet koji, kada se eksprimira, može da se koristi za odabir ćelije ili ćelija koje sadrže selektivni marker. Selektivni markeri genskih proizvoda dodeljuju osobine na primer otpornost na antibiotike ili nutricionističke zahteve.

[0039] Izraz "biološki poluživot" odnosi se na vreme koje je potrebno za količinu supstance, npr. proteina, u biološkom sistemu, npr. cirkulacija unutar životinje ili ljudskog tela, da se svede na polovinu svoje vrednosti biološkim procesima kao što su renalni klirens i razgradnja.

[0040] U ovom dokumentu i njegovim zahtevima, glagol "koji se sastoji / obuhvata" i njegove konjugacije koriste se u svom neograničavajućem smislu, znači da su stavke koje slijede riječi uključene, ali predmeti koji nisu posebno navedeni nisu isključeni. Takođe obuhvata ograničavajući glagol "koji se sastoji od". Pored toga, pozivanje na element neodređenog člana "a" ili "an" (u eengleskom) odnosno jedan, dati i sl, ne isključuje mogućnost da je prisutan više od jednog elementa, osim ako kontekst jasno ne zahteva da postoji jedan i samo jedan od elemenata. Neodređeni član (u engleskom tekstu) "a" ili "an" obično znači "bar jedan". Dalje, kada je ovde reč o "sekvencama", uopšteno govore o stvarnim fizičkim molekulima sa određenim nizom podjedinica (npr. aminokiselinama).

Proteini, sekvence nukleinskih kiselina, vektori i ćelije domaćini pronalaska

[0041] Pronalazači su sada osmislili novu "terapiju jednim molekulom". Konkretno, pronalazači otkrivaju fuzioni protein koji sadrži IL4 protein i IL10 protein, po izobru fizički fuzionisani zajedno pomoću linkera. Naročito, utvrđeno je da fuzioni protein iz ovog pronalaska ima superiornu biološku aktivnost (npr. Inhibira TNFa i IL1β) preko svojih pojedinačnih kopijs, tj. IL4 i IL10 odvojeno. Konkretno, utvrđeno je da je fuzioni protein predmetnog pronalaska značajno veći (~35 kD) nego pojedinačni citokini (oba <20 kD). Pronalazači su takođe neočekivano otkrili da sâm fuzioni protein formira dimere (preko IL10 dela fuzionog proteina), dajuči tako fuzioni protein sa još većom molekulskom težinom (~ 70 kD). Ovakvo povećanje molekulske težine, a time i molekularnog radijusa, ne samo značajno produžava biološki poluživot fuzionog proteina IL4-IL10 u cirkulaciji u poređenju sa pojedinačnim citokinima, već takođe povećava njegovu bioraspoloživost na mestu upale do rekordnog nivoa. Fuzioni protein predmetnog pronalaska takođe u velikoj meri produžava terapeutski vremenski prozor za sinergetske efekte između IL4 i IL10, jer fuzioni protein isporučuje oba citokina na mestu upale, gde mogu istovremeno ispoljavati svoja dejstva u jednakom vremenskom intervalu u međusobnom prisustvu. Pored toga, neočekivano je utvrđeno da fuzioni protein predmetnog pronalaska takođe vrši dvostruko terapeutsko dejstvo.

Konkretno, pokazano je da fuzioni protein IL4 -IL10 deluje kao antiinflamatorno sredstvo kada se daje sistematski, dok deluje kao anti-hiperalgezijski agens kada se daje intratekalno.

[0042] U jednom aspektu otkrivanja date su sekvence nukleinske kiseline i sekvence amino kiselina fuzionih proteina IL4-IL10. IL4-IL10 fuzioni proteini, kao i njihovi funkcionalni fragmenti i njihove varijante, prikazuju IL4 aktivnost kao i IL10 aktivnost.

[0043] U jednom aspektu, otkriven je fuzioni protein koji sadrži IL4 i IL10. Fuzioni protein sadrži protein. Protein IL4 je poželjno protein IL4 sisara, kao što je humani IL4 ili mišji IL4. Jedna amino kiselinska sekvenca IL4 je navedena u SEK ID NO: 1. Varijante IL4 uključuju, na primer, proteine koji imaju najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više, kao što je 100 %, identičnost amino kiselinske sekvence sa SEQ ID NO: 1, poželjno duž cele dužine. Identitet aminokiselinske sekvence je poželjno određen poravnavanjem parova pomoću Nidlman-Vunšovog algoritma i GAP-ova definisanih parametara kao što je prethodno definisano. Varijante takođe uključuju proteine koje imaju IL4 aktivnost, koje su izvedene pomoću jedne ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija ili insercija, iz polipeptida koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1. Poželjno, takvi proteini sadrže od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više do oko 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 25, 20, 15 aminokiselinskih supstitucija, delecija ili insercija.

[0044] Fuzioni protein dalje sadrži IL10 protein. IL10 protein je poželjno IL10 protein sisara, kao što je humani IL10 ili mišji IL10. Jedna amino kiselinska sekvenca koja predstavlja IL10 je navedena u SEQ ID NO: 2. Varijante IL10 uključuju, na primer, proteine koji imaju najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više, kao što je 100 %, identičnost amino kiselinske sekvence sa SEQ ID NO: 2, poželjno celom dužinom. Identitet aminokiselinske sekvence je poželjno određen poravnavanjem parova pomoću Nidlman-Vunšovog algoritma i GAP definisanih parametara kao što je prethodno definisano. Varijante takođe uključuju proteine koji imaju aktivnost IL10, koja su izvedene pomoću jedne ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija ili insercija, iz polipeptida koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2. Poželjno, takvi proteini sadrže od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više do oko 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 25, 20, 15 aminokiselinskih supstitucija, delecija ili insercija.

[0045] IL4 i IL10 u fuzionom proteinu mogu ili ne mogu da budu povezani linkerom. Dodatne aminokiselinske sekvence mogu biti prisutne na N- i / ili C-terminusu fuzionog proteina predmetnog pronalaska, npr., radi olakšavanja prečišćavanja. Na primer, histidinski-tag može biti prisutan na C-ili N-terminusu radi lakšeg prečišćavanja. Alternativno, fuzioni protein IL4-IL10 predmetnog pronalaska može opciono da sadrži dodatne proteinske ostatke, kao što su ostaci koji mogu da ciljaju, na pr., proteinski deo koji sadrži jedan ili više Fc regiona antitela.

[0046] IL4 može biti lociran N-terminal IL10, ili može biti lociran C-terminal IL10. U poželjnoj realizaciji, IL4 molekul je locira N-terminal IL10 molekula. Utvrđeno je da je drugi fuzioni protein pokazuje veću specifičnu aktivnost u odnosu na IL4-IL10 fuzioni protein u kome je molekul IL4 bio lociran C-terminal IL10 molekula (podaci nisu prikazani).

1

[0047] IL4-IL10 fuzioni protein može biti prisutan u svom monomernom obliku, u kom slučaju ima kDa od oko 35 kDa ili može biti dimeran IL4-IL10 fuzioni protein, tj. dva IL4-IL10 fuziona proteina mogu biti povezana jedan sa drugim ne-kovalentno, u tom slučaju ima kDa od oko 70 kDa.

[0048] U jednom izvođenju, fuzioni protein predmetnog pronalaska a se sastoji uglavnom od IL4 i IL10, po iboru povezani linkerom.

[0049] U jednom izvođenju, delovi IL4 i IL10 unutar fuzionog proteina premdetnopg pronalaska su aktivni i sposobni da signaliziraju ćelije da nishodno regulišu proizvodnju najmanje jednog inflamatornog citokina ili medijatora kao što je IL1b, IL6, IL8, TNFa . Poželjno je da su najmanje TNFa, IL6 i IL8 regulisani nishodno .

[0050] U jednom aspektu fuzioni protein inhibira stvaranje citokina kao što su TNFα, ILIb, IL6, IL8 i drugi inflamatorni citokini dok istovremeno izazivaju sekreciju inhibitornih molekula kao što je IL1 receptorski antagonist i solubilni receptori TNF od inflamatornih i drugih ćelija stimulisanih endotoksinom, drugi agonisti poput Toll-sličnog receptora (TLR), ili drugi stimulansi. U jednom aspektu, fuzioni protein predmetnog pronalaska inhibira ekspresiju adhezionih molekula inflamatornim, endotelijalnim i drugim ćelijama koje stimulišu agonisti uključujući endotoksin, druge TLR agoniste i drugo.

[0051] U jednom aspektu, fuzioni protein inhibira ekspresiju tkivnog faktora endotelnim, inflamatornim i drugim ćelijama koje stimulišu endotoksin, drugi TLR agonisti ili drugi stimulusi.

[0052] U jednom aspektu, fuzioni protein iz ovog pronalaska inhibira generisanje radikala kiseonika upalnim i drugim ćelijama koje stimulišu endotoksin, drugi TLR agonisti ili drugi stimulansi.

[0053] U jednom izvođenju, fuzioni protein inhibira aktivnost IFNy- i IL17 koji sekretuje Th1 i Th17 ćelije i indukuje ili održava supresivne T-ćelije (CD25 ) koje eksprimiraju FoxP3, TGFb-sekretujuće Th2, Tr1 i Th3 ćelije dobijene in vitro u prisustvo ili bez antigen-prezentujućih ćelija stimulisanih od samih ili nesamih antigena, superantigena uključujući Staphilococcus enterotoksin B (SEB) ili mitogene, uključujući CD3, CD28, fitohemaglutinin (PHA) ili forbol miristat acetat (PMA).

[0054] U jednom izvođenju, proteini fuzije inhibiraju ekspresiju aktiviranja Fcγ receptora dok indukuju ekspresiju inhibitora Fcγ receptora koji sprečavaju aktivaciju ćelija kao što su monociti, makrofage i dendritske ćelije imunim kolmpleksima koji sadrže IgG.

[0055] U pogodnoj realizaciji, fuzioni protein iz ovog pronalaska je prisutan u homodimernom obliku.

[0056] U jednoj realizaciji ima molekulsku težinu iznad 60 kDa.

[0057] Fuzioni protein predmetnog pronalaska može se pripremiti tehnikama koje su rutinske za proečnog stručnjaka. Na primer, ona se može pripremiti koristeći tehniku koja obezbeđuje proizvodnju rekombinantnih fuzionih proteina neprekidnim ćelijskim linijama u kulturi. Na primer, fuzioni proteini predmetnog pronalaska mogu se proizvoditi u transfektoma ćeliji domaćinu koristeći kombinaciju tehnika rekombinantne DNK i postupaka transfekcije gena.

[0058] Na primer, za ekspresiju fuzionih proteina predmetnog pronalaska, molekul nukleinske kiseline koji kodira fuzione proteine predmetnog pronalaska može se pripremiti standardnim molekularnim biološkim tehnikama. Molekul nukleinske kiseline prema pronalasku je poželjno operativno povezan sa regulatornim sekvencama transkripcije, kao što je promotor, i po izobru 3'netranslacioni region. Molekul nukleinske kiseline predmetnog pronalaska može biti ubačen u vektor, kao što je ekspresioni vektor, tako da su geni operativno povezani sa transkripcijskim i translacionim kontrolnim sekvencama. Vektor ekspresije i transkripcione regulatorne sekvence su odabrani tako da budu kompatibilni sa korišćenom ekspresionom ćelijom domaćinom. Molekul nukleinske kiseline koji kodira fuzioni protein predmetnog pronalaska može se rutinskim metodama umetnuti u ekspresioni vektor. Molekul nukleinske kiseline ili vektor predmetnog pronalaska može dalje uključiti nukleotidnu sekvencu koja kodira signalni peptid, što može omogućiti sekreciju fuzionog proteina iz ćelije domaćina. Data nukleotidna sekvenca koja kodira signalni peptid može se operativno povezati sa molekulom nukleinske kiseline predmetnog pronalaska. Poželjno, navedeni signalni peptid se nalazi na amino terminalnom kraju fuzionog proteina predmetnog pronalaska, i kao takav, nukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti signalni peptid može biti locirana kao 5 'molekula nukleinske kiseline koja kodira fuzioni protein predmetnog pronalaska. Signalni peptid može biti signalni peptid citokina ili signalni peptid iz proteina koji nije citokin. Promotor može biti konstitutivni ili inducibilan. Vektor može da sadrži selektivni marker za selekciju ćelije domaćine sa vektorom. Vektor može da ima poreklo replikacije kada je vektor, replikacioni vektor .

[0059] Fuzioni protein prema pronalasku može se sintetisati de novo hemijskom sintezom (koristeći npr. sintetizator peptida kao što je dostupno od Applied Biosystems) ili se može dobiti od rekombinantnih ćelija domaćina eksprimirajući sekvencu nukleinskih kiselina koja kodira fuzioni protein, fragment ili varijantu . Varijante i fragmenti su poželjno funkcionalni, tj. Imaju IL4 i / ili IL10 aktivnost, poželjno IL4 i IL10 aktivnost.

[0060] Anti-inflamatorna aktivnost, a time i funkcionalnost IL4 i IL10, kao i fuzionog proteina IL4-IL10 mogu se odrediti rutinskim metodama. Na primer, odgovarajući test za funkcionalnost IL4 i IL10, kao i fuzionog proteina IL4-IL10, je ligopolisaharidnom i(LPS) ndukvano oslobađanje citokina (IL1b, IL6, IL8, TNFα) u celoj krvi, npr. Kako je navedeno u Primeru 6.

[0061] U drugom aspektu, otkrivene su izolovane sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju bilo koji od prethodno navedenih fuzionih proteina, kao što su cDNK, genomska DNK i sekvence RNK. Zbog degeneracije genetičkog koda različite sekvence nukleinske kiseline mogu kodirati istu aminokiselinsku sekvencu. Svaka sekvenca nukleinske kiseline koja kodira fuzione proteine predmetnog pronalaska naziva se ovde " fuzioni protein IL4 -IL10 koji kodira sekvence nukleinskih kiselina". Otkrivane sekvence nukleinske kiseline uključuju rekombinantne, veštačke ili sintetičke sekvence nukleinskih kiselina.

Razumljivo je da kada se sekvence prikazuju kao DNK sekvence dok se navodi RNK, stvarna sekvenca baza molekula RNK je identična sa tom razlikom što je timin (T) zamennjen uracilom (U). Sekvence nukleinskih kiselina pronalaska su naročito korisne za ekspresiju fuzionog proteina IL4-IL10, bilo za proizvodnju ovih proteina ili za genske terapije.

[0062] Sekvenca nukleinske kiseline, posebno DNK sekvenca, koja kodira fuzioni protein IL4-IL10 pronalaska, može biti ubačena u ekspresione vektore za proizvodnju (velikih količina) fuzionog proteina IL4-IL10. Pogodni vektori uključuju, bez ograničenja, linearne nukleinske kiseline, plazmide, fagemide, kozmide, vektore RNK, virusne vektore i slično. Neograničavajući primeri virusnog vektora uključuju retrovirus, adenovirus i adeno-asocirani virus. Poželjne regulatorne sekvence za eksprimovanje ćelija domaćina sisara uključuju virusne elemente koji usmeravaju visoke nivoe ekspresije proteina u ćelije sisara, kao što su promotori i / ili pojačivači izvedeni iz citomegalovirusa (CMV), Simian Virusa 40 (SV40), adenovirusa (npr. adenovirus veliki kasni promotor (AdMLP)) i polioma.Alternativno, mogu se koristiti ne-viralne regulatorne sekvence, kao što je promotor ubikvitina. Pored molekula nukleinske kiseline koji kodiraju fuzione proteine IL4-IL10 i regulatorne sekvence, rekombinantni ekspresioni vektori pronalaska mogu nositi dodatne sekvence, kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćelijama domaćina (npr. ooreklo replikacije) i selektivni marker geni. Selektivni marker gen olakšava selekciju ćelija domaćina u koje je vektor uveden (videti npr. US 4,399,216, US 4,634,665 i SAD 5,179,017, svi Axel et al). Na primer, tipično selektivni gen marker pruža otpor lekovima, kao što je G418, higromicin ili metotreksat, u ćeliji domaćina u koju je vektor uveden. Poželjni selektivni marker geni uključuju gen dihidrofolat reduktazu (DHFR) (za upotrebu u ćelijama dhfr-domaćina sa selekcijom / amplifikacijom metotreksata) i neo gen (za selekciju G418).Konačno, rekombinantni ekspresioni vektor može sadržati gen koji kodira glikozil transferazu pored sekvence nukleinske kiseline koja kodira fuzione proteine predmetnog pronalaska. U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na ćeliju domaćinu koja sadrži sekvencu nukleinskih kiselina ili konstrukt nukleinskih kiselina ili vektor koji sadrži sekvencu nukleinskih kiselina predmetnog pronalaska. Ćelija domaćina može biti bilo koja ćelija domaćina. Ćelija domaćina može biti izabrana iz prokariotskih i eukariotskih ćelija. Ćelija domaćina može takođe biti ćelijska linija, kao što je prokariotska ili eukariotska ćelijska linija. Ćelija domaćina je poželjno ćelija ili ćelijska linija životinja, kao što je ćelija ili ćelijska linija sisara. U jednom izvođenju fuzioni proteini predmetnog pronalaska su eksprimirani u eukariotskim ćelijama, kao što su ćelije domaćina sisara.Prednost se daje ćelijama sisara koje eksprimiraju rekombinantni fuzioni protein IL4-IL10 predmetnog pronalaska uključujući CHO ćelije (uključujući dhfr-CHO ćelije, opisane u (Urlaub et al., 1980), korišćene sa DHFR selektivnim markerom, NS/0 ćelije mijeloma, COS ćelije, HEK293 ćelije i SP2.0 ćelije. Kada se rekombinantni vektori ekspresije koji sadrže sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju fuzione proteine IL4-IL10 se uvedu u ćelije domaćina sisara, fuzioni proteini predmetnog mogu se dobiti kultivacijom ćelija domaćina u određenom vremenskom periodu dovoljnom da omogući ekspresiju fuzionih proteina u ćelijama domaćina ili, bolje, sekreciju fuzionih proteina u medijumu za kulturu u kojem se gaje ćelije domaćina. Fuzioni proteini predmetnog pronalaska mogu se regenerisati iz

1

medijuma kulture u kome se ćelije domaćina uzgajaju i / ili mogu biti prečišćene iz medijuma za kulturu koristeći standardne metode prečišćavanja proteina. Alternativno sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju fuzione proteine pronalaska, mogu se eksprimovati i u drugim sistemima ekspresije, uključujući prokariotske ćelije, kao što su mikroorganizmi, npr. E. coli, alge, kao i ćelije insekata. Štaviše, fuzioni proteini predmetnog pronalaska mogu se proizvestiu transgenim ne-humanim životinjama, kao u mleku od ovaca i zečeva ili kokošijim jajima ili u transgenim biljkama.

[0063] Uvođenje sekvence nukleinskih kiselina predmetnog pronalaska u ćeliju domaćina može se izvesti bilo kojom standardnom tehnikom poznatom u tehnici. Za ekspresiju fuzionih proteina predmetnog pronalaska, ekspresioni vektor(i) koji kodira fuzioni protein može biti transfektovan u ćeliju domaćina standardnim tehnikama. Razni oblici izraza "transfekcija" imaju za cilj da obuhvate širok spektar tehnika koje se obično koriste za uvođenje egzogene DNK u prokariotsku ili eukariotsku ćeliju domaćina, npr. elektroporacija, precipitacija kalcijum-fosfatom, transfekcija DEAE-dekstrana, transfekcija lipofektamina i transfekcije metodom sušenja zamrzavanjem i slično. Ćelijske linije koje sekretuju fuzione proteine predmetnog pronalaska mogu se identifikovati nalizom supernatanata kulture na prisustvo fuzionog proteina. Poželjna procedura skrininga obuhvata dva uzastopna koraka, pri čemu se u prvom identifikuju ćelijske linije koje sekretuju fuzioni protein, a u drugom se određivanje kvalitet fuzionog proteina kao što je sposobnost fuzionog proteina da inhibira proizvodnju citokina pomoću ćelija krvi stimulisanih sa LPS ili drugim agonistima Toll-sličnog receptora, glikozilacijom i drugo.

[0064] Za optimalnu ekspresiju fuzionog proteina IL4-IL10 u ćeliji domaćina koji kodira DNK sekvence može biti kodon optimizovan prilagođavanjem upotrebe kodona na gene domaćina kojima se daje prednost. Nekoliko tehnika za modifikaciju upotrebe kodona koju preferiraju ćelije domaćina mogu se naći u patentnoj i naučnoj literaturi. Tačan metod modifikacije upotrebe kodona nije kritičan za predmetni pronalazak.

[0065] U sledećoj realizaciji predmetnog pronalaska, obezbeđeni su PCR prajmeri i / ili probe i kompleti za detekciju fuzionog proteina IL4-IL10 koji kodira sekvence DNK ili RNK. Mogu se sistetisati degeenrisani ili specifični parovi PCR prajmera za amplifikaciju fuzionog proteina IL4-IL10 koji kodira DNK iz uzoraka (videti: Dieffenbach and Dveksler (1995) PCR Prajmer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, and McPherson at al. (2000) PCR-Basics: From Background to Bench, First Edition, Springer Verlag, Germany). Na primer, bilo koji segment 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18 ili više susednih nukleotida fuzionog proteina IL4-IL10 koji kodira sekvencu nukleinskih kiselina (ili komplementarni niz) može se koristiti kao prajmer ili proba. Slično tome, DNK fragmenti fuzionog proteina IL4-IL10 koji kodiraju sekvencu nukleinskih kiselina mogu se koristiti kao hibridizacione probe. Komplet za detekciju fuzionog proteina IL4-IL10 koji kodira sekvencu nukleinskih kiselina može da sadrži prajmere specifične za fuzioni protein IL4-IL10 koji kodira sekvencu nukleinskih kiselina i / ili probe specifične za fuzioni protein IL4-IL10 koji kodira sekvence nukleinskih kiselina i prateći protokol za upotrebu prajmera ili proba da bi se specifilno detektovao fuzioni protein IL4-IL10 koji kodira sekvencu nukleinskih kiselina u uzorku. Takav komplet za deretkciju se, na primer, može koristiti da se utvrdi da li je ćelija domaćina transformisana specifičnim IL4 fuzionim proteinom -IL10 koji kodira sekvencu nukleinskih kiselina predmetnog pronalaska. Zbog degeneracije genetskog koda, neki kodoni aminokiselina mogu se zameniti drugim, bez promene aminokiselinske sekvence proteina.

[0066] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak za dobijanje fuzionog proteina IL4-IL10, gde navedeni postupak obuhvata korake: kultivisanje ćelije domaćina predmetnog pronalaska pod uslovima koji dozvoljavaju dobijanje fuzionog proteina IL4-IL10; i po izboru, regeneraciju fuzionog proteina. Prosečan stručnjak će biti u mogućnosti da rutinski odabere uslove koji omogućavaju proizvodnju fuzionih proteina IL4-IL10 predmetnog pronalaska.

Osim toga, prosečan stručnjak u stanju tehnike moći će da regeneriše fuzioni protein proizveden primenom rutinskih postupaka koji uključuju, bez ograničenja, hromatografske metode (uključujući, bez ograničenja, ekskluzionu hromatografiju, hromatografiju na osnovu hidrofobnih interakcija, jonoizmenjivačku hromatografiju, afintetnu hromatografiju, imunoafinitetnu hromatografiju, hromatografiju na osnovu vezivanja metala i slično), imunoprecipitaciju, HPLC, ultracentrifugiranje, taloženje i diferencijalna solubilizacija i ekstrakcija. Kao što je prethodno dato, regeneracija ili prečišćavanje fuzionih proteina predmetnog pronalaska može se izvesti dodavanjem, na primer, histidinskog-taga fuzionom proteinu.

Farmaceutske kompozicije

[0067] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži fuzioni protein predmetnog pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0068] Farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane sa farmaceutski prihvatljivim nosačima ili razblaživačima, kao i bilo kojim drugim poznatim adjuvansima i ekscipijensima u skladu sa konvencionalnim tehnikama (npr. Kao što je opisano u Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995).

[0069] Izraz "farmaceutski prihvatljiv nosač" odnosi se na nosače ili ekscipijenee, koji su po sebi netoksični i neterapeutski. Primeri ovakvih ekscipijenasa su, ali bez ograničenja, fiziološki rastvor, Ringerov rastvor, dekstroza, rastvor i Hankov rastvor. Mogu se koristiti i ne-vodeni ekscipijensi kao što su fiksna ulja i etil oleat. Prednost se daje ekscipijendu koji je 5% dekstroza u fiziološkom rastvoru.

Ekscipijens može da sadrži manje količine aditiva kao što su supstance koje povećavaju izotoničnost i hemijsku stabilnost, uključujući pufere i konzervanse.

[0070] Farmaceutska kompozicija može da se aprimeni bilo kojim odgovarajućim načinom i režimom. Kao što će ceniti prosečan stručnjak, način i / ili režim primene će se razlikovati u zavisnosti od željenih rezultata.

1

[0071] Farmaceutske kompozicije prema pronalasku mogu biti formulisane u skladu sa rutinskim procedurama za primenu bilo kojim režimima, kao što su oralni, topikalni, parenteralni, sublingvalni, transdermalni ili inhalacijom. Kompozicije mogu biti u obliku tableta, kapsula, praha, granula, pastila, krema ili tečnih preparata, kao što su oralni ili sterilni parenteralni rastvori ili suspenzije ili u obliku spreja, aerosola ili druge konvencionalne metode za inhalaciju.

[0072] Farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska obuhvataju one pogodne za oralnu, nazalnu, topikalnu (uključujući bukalnu i sublingvalnu), rektalnu, vaginalnu i / ili parenteralnu primenu.

[0073] U jednom izvođenju, farmaceutski preparat se daje parenteralno.

[0074] Izrazi "parenteralna primena" i "administrirani/davati parenteralno" kako se ovde koriste, podrazumevaju načine primene pored enteralne i topikalne primene, obično injekcijom i uključuju, bez ograničenja, intravenozne, intramuskularne, intraarterijske, intratekalne, intrakapsularne, intraorbitalne, intrakardijalne, intradermalne , intraperitonealne, transtrahealne, subkutane, subkutikularne, intraartikularne, subkapsularne, subarahnoidne, intraspinalne, epiduralne i intrasternalne injekcije i infuzije.

[0075] U jednom izvođenju farmaceutska kompozicija se data intravenskom ili subkutanom injekcijom ili infuzijom.

[0076] U jednom izvođenju fuzioni proteini pronalaska su date u kristalnom obliku subkutanom injekcijom.

[0077] Kako se ovde koristi, "farmaceutski prihvatljiv nosač" obuhvata bilo koji i sve rastvarače, disperzione medijume, obloge, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične agense, antioksidanse i sredstva za odlaganje apsorpcije i slične koji su fiziološki kompatibilni.

[0078] Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za ekstemporalno pripremanje sterilnih injektibilnih rastvora ili disperzija. Upotreba takvih medija i sredstava za farmaceutski aktivne supstance je dobro poznata u tehnici. Osim što bilo koji konvencionalni medijum ili agens nije kompatibilan sa aktivnim jedinjenjem, razmatra se njegova upotreba u farmaceutskoj kompoziciji pedmetnog pronalaska. Poželjno, nosač je pogodan za parenteralnu primenu, npr. intravenska ili subkutana injekcija ili infuzija.

[0079] Farmaceutske kompozicije obično moraju da budu sterilne i stabilne u uslovima proizvodnje i skladištenja. Kompozicija se može formulisati kao rastvor, mikroemulzija, lipozom ili druga uređena struktura pogodna za visoku koncentraciju leka. Primeri pogodnih vodenih i ne-vodenih nosača koji se mogu upotrebiti u farmaceutskim kompozicijama predmetnog pronalaska obuhvataju vodu, etanol, poliole (kao što su glicerol, propilen glikol, polietilen glikol i slični) i njihove odgovarajuće smeše, biljna ulja, kao što je maslinovo ulje i injekcioni organski estri, kao što je etil oleat. Odgovarajuća fluidnost se može održavati, na primer, korišćenjem materijala za oblaganje, kao što je lecitin, održavanjem tražene veličine čestica u slučaju disperzija i upotrebom površinski aktivnih materija.

1

[0080] Produžena apsorpcija injektibilnih kompozicija može se postići tako što se u sastav uključi sredstvo koje odlaže apsorpciju, na primer, monostearatne soli i želatin.

[0081] Sterilni injektabilni rastvori se mogu pripremiti inkorporiranjem aktivnog jedinjenja u traženoj količini u odgovarajući rastvarač sa jednim ili kombinacijom sastojaka, npr. kao što je navedeno gore, po potrebi, nakon čega sledi sterilizacija mikrofiltracijom. Generalno, disperzije se pripremaju inkorporiranjem aktivnog jedinjenja u sterilni nosač koje sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke, npr. odabranih od prethodno navedenih. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injektibilnih rastvora, poželjne metode pripreme su sušenje u vakuumu i liofilizacija, što daje prah aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz prethodno sterilno filtriranog rastvora.

[0082] U zavisnosti od načina primene, aktivno jedinjenje, tj. fuzioni proteini IL4-IL10, može biti obloženo materijalom kako bi ga zaštitio od dejstva kiselina i drugih prirodnih stanja koje mogu da inaktiviraju jedinjenje. Na primer, jedinjenje se može davati subjektu u odgovarajućem nosaču, na primer, lipozomima. Liposomi uključuju emulzije CGF vode u vodi, kao i konvencionalne liposome (Strejan et al., 1984).

[0083] Fuzioni proteini predmetnog pronalaska mogu se takođe pripremniti sa nosačima koji će ih zaštititi od brzog oslobađanja, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implante, transdermalne flastere i sisteme mikrokapsulirane distribucije. Mogu se koristiti biorazgradivi, biokompatibilni polimeri, kao što su etilen vinilacetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestar i polimlečna kiselina. Metode za pripremu takvih formulacija su opšte poznate prosečnim stručnjacima. Videti npr.: Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

[0084] Dozirni režimi se mogu prilagoditi tako bi obezbedi optimalni željeni odgovor (npr., terapijski odgovor). Na primer, može se primeniti jedan bolus, nekoliko podeljenih doza može da se primeni tokom vremena ili doza može biti srazmerno smanjena ili povećana, kao što je pokazano potrebama terapeutske situacije. Posebno je pogodno formulisati parenteralne kompozicije u jedinjeni;nom doznom obliku za lakšu primenu i uniformnost doziranja. Jedinični dozni oblik kao što se ovde koristi odnosi se na fizički diskretne jedinice koje su pogodne za jedinične doze za subjekte koji se tretiraju; svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu da bi proizvela željeni terapeutski efekat zajedno sa traženim farmaceutskim nosačem. Specifikacije jediničnih doznih oblika pronalaska diktiraju i direktno zavise od (a) jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i određenog terapijskog efekta koji treba postići, i (b) ograničenja koja su svojstvena veštini sdobijanja takvog aktivnog jedinjenja za tretman osetljivosti kod pojedinaca.

[0085] Aktuelni dozni nivoi fuzionih proteina IL4-IL10 u farmaceutskim kompozicijama predetnog pronalaska, mogu da variraju tako da se dobije količina fuzionog proteina IL4-IL10 koja je delotvorna ("efikasna/delotvorna količina") da bi se postigao željeni terapeutski odgovor kod određenog pacijenta,

1

sastav i način primene, bez toksičnosti za pacijenta. Odabrani dozni nivo zavisiće od različitih farmakokinetičkih faktora uključujući aktivnost određenih kompozicija predmetnog pronalaska, način primene, vreme primene, brzina sekrecije, trajanje terapije, drugih lekova, jedinjenja i/ili materijala koji se koriste u kombinaciji sa određenim upotrebljenim kompozicijama, starosnoj dobi, polom, težinom, stanjem, opštim zdravljem i prethodnom istorijom lečenja pacijenta koji se leči i kao faktori koji su poznati u medicini.

[0086] U jednoj realizaciji, fuzioni proteini IL4-IL10 predmetnog pronalaska mogu se davati kao intraveska injekcija ili kratka infuzija, u drugoj realizaciji, primenjuju se sporom kontinualnom infuzijom tokom dugog vremenskog perioda, kao što je više od 24 sata, kako bi da smanjili toksični neželjeni efekti.

[0087] U još jednom izvođenju, fuzioni proteini IL4-IL10 predmetnog pronalaska mogu se davati kao terapija održavanja, kao što je, npr., jednom nedeljno tokom perioda od 6 meseci ili duže.

1

Terapeutske upotrebe

[0088] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na fuzioni protein ili farmaceutsku kompoziciju koja sadrži fuzioni protein za upotrebu kao lek.

[0089] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na fuzioni protein predmetnog pronalaska ili farmaceutsku kompoziciju koja sadrži fuzioni protein za upotrebu u sprečavanju ili lečenju osteoartritisa. Naročito je utvrđeno da fuzioni protein predmetnog pronalaska ima aktivnost zaštite hrskavice. Zbog toga, fuzioni protein se može koristiti za prevenciju i tretman hronične kvarenja, naročito u OA. Pored toga, pronađeno je u modelu psećeg OA da psi koji primaju fuzioni protein predmetnog pronalaska imaju znatno manje bolove u odnosu na pse koje nisu dobile fuzioni protein predmetnog pronalaska. Kao takav, fuzioni protein pronalaska može biti naročito koristan za prevenciju ili tretman OA (prevencija ili tretman degradacije hrskavice) sa svojim pratećim hroničnim bolom.

[0090] U daljem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na fuzioni protein predmetnog pronalaska ili farmaceutski preparat koji sadrži fuzioni protein za primenu u prevenciji ili lečenju OA, hroničnog bola ili stanja koje karakteriše lokalno ili sistemsko zapaljenje, imunološka aktivacija, , i/ili limfoproliferacija odabrana iz grupe koju čine sepsa, sindrom akutnog plućnog edema kod odraslih osoba, alo- i ksenotransplantacija, dermatitis, upalna bolest creva, sarkoidoza, alergije, psorijaza, ankilozirajući spondiloartitis, autoimunske bolesti kao što je sistemski eritematozni lupus i reumatoidni artritis, glomerolonefritis, imuno kompleksi i drugi oblici vaskulitisa, multipla skleroza, Sjogren's-ova bolest, giht, limfoproliferativne bolesti kao što je ne-Hodgkin-ov limfom i hronična limfocita leukemija B ćelija, opekotine, multiple traume, moždani udar, infarkt miokarda, ateroskleroza, dijabetes melitus, ekstrakorporealna dijaliza i oksigenacija krvi, ishemijsko-reperfuzione povrede, toksičnost indukovan in vivo administracijom citokina ili terapeutskih monoklonalnih antitela, sindom hroničnog i neuropatskog i/ili inflamatornog bola.

[0091] U jednoj realizaciji, navedeno stanje se karakteriše bolom i može se izabrati od upalnih bolova i neuropatskog bola.

[0092] U još jednom aspektu, pronalazak je usmeren ka fuzionom proteinu za upotrebu u prevenciji ili lečenju kliničkog stanja kod sisara, kao što je čovek, za koji je naznačen IL10.

[0093] U sledećem aspektu, pronalazak je usmeren ka fuzionom proteinu za primenu u prevenciji ili lečenju kliničkog stanja kod sisara, kao što je čovek, za koje je indikovan IL4.

[0094] U jednom aspektu, fuzini polipeptid pronalaska se koristi za prevenciju ili lečenje bolesti ili poremećaja, pri čemu je blagotvotna inhibicija proizvodnje proinflamatornih citokina i drugih inflamatornih medijatora.

[0095] U još jednom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak prevencije ili lečenja bolesti ili poremećaja, pri čemu inhibicija proizvodnje proinflamatornih citokina i drugih inflamatornih medijatora

1

ima blagotvorno dejstvo, koje obuhvata korak administriranja subjektu kojem je to potrebno fuzioni protein predmetnog pronalaska u količini koja je efikasna za lečenje ili sprečavanje bolesti ili poremećaja.

[0096] U jednom aspektu takvo oboljenje ili poremećaj predstavlja inflamatorno oboljenje posredovano proizvodnjom proinflamatornih citokina kao što su TNF, IL1β, IL6, hemokini kao što je IL8 i drugi inflamatorni medijatori.

[0097] Prema jednom izvođenju, ovde opisani fuzioni proteini mogu da se koriste za inhibiciju proizvodnje i oslobađanja citokina i drugih inflamatornih medijatora od strane ćelija, kao što su makrofagi, monociti, T-limfociti i druge ćelije. Kao rezultat, fuzioni proteini predmetngo pronalaska mogu se koristiti za dobijanje medikamenta za ublažavanje inflamatornih reakcija inhibiranjem otpuštanja citokina i drugih inflamatornih medijatora od strane ovih ćelija in vivo. Fuzioni proteini predmetnog pronalaska mogu se koristiti kao samostalni lek ili u kombinaciji sa drugim lekovima.

[0098] Lečenje (profilaktičko ili terapijsko) može da se sastoji od administriranja fuzionog proteina predmetnog pronalaska parenteralno, poželjno intravenski, intramuskularno, intratekalno, epiduralno, spinalno ili subkutano. Međutim, takođe mogu biti korišćeni drugi putevi administriranja koji su prethodno navedeni a odnose se na farmaceutske kompozicije koje sadrže prethodno navedene fuzione proteine. Režim doziranja i administracije može zavisiti od stepena inhibicije proizvodnje i otpuštanja inflamatornih citokina na koje je usmereno. Tipično, količina datog fuzionog proteina će biti u opsegu od 0,5 mg do 1 mg na kg telesne težine. Doziranje se može odrediti ili prilagoditi merenjem količine citokina (IL10, IL4) u cirkulaciji nakon primene biološkom uzorku.

[0099] Za parenteralnu primenu, fuzioni protein je poželjno formulisan u obliku za injektiranje u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim parenteralnim vehikulumom. Ovi vehikulumi su dobro poznata u tehnici i primeri uključuju fiziološki rastvor, rastvor dekstroze, Ringerov rastvor i rastvore koji sadrže male količine humanog serumskog albumina. Tipično, fuzioni proteini predmetnog pronalaska mogu se formulisati u takvim vehikulumima u koncentraciji od oko 50 mg do oko 100 mg po ml. U jednom aspektu ovog pronalaska fuzioni protein se daje intravenskom injekcijom

[0100] Dalji podaci o administraciji su navedeni u prethodno odeljku koji se odnosi na farmaceutske kompozicije koje sadrže fuzioni protein iz ovog pronalaska

Genska terapija

[0101] Konstrukti nukleinskih kiselina ili vektori predmetnog pronalaska mogu se koristiti kao sredstva za gensku terapiju za lečenje prethodno navedenih stanja. U jednoj realizaciji pronalaska, adenoasocirani virusi se koriste kao vektori genskih terapija.

[0102] Kao takav, aspekt pronalaska je usmeren na vektor genske terapije kao što je prethodno opisano za upotrebu u sprečavanju ili lečenju OA, hroničnog bola, stanja koje karakteriše lokalna ili sistemska

2

inflamacija, imunska aktivacija i / ili limfoproliferacija, pri čemu navedeno stanje karakteriše lokalna ili sistemska upalazap, imunska aktivacija i/ili limfoproliferacija odabrana iz grupe koju čine sepsa, sindrom akutnog plućnog edema kod odraslih osoba, alo- i ksenotransplantacija, dermatitis, upalna bolest creva, sarkoidoza, alergije, psorijaza, ankilozirajući spondiloartitis, autoimunske bolesti kao što je sistemski eritematozni lupus i reumatoidni artritis, glomerolonefritis, imuno kompleksi i drugi oblici vaskulitisa, multipla skleroza, Sjogren's-ova bolest, giht, limfoproliferativne bolesti kao što je ne-Hodgkin-ov limfom i hronična limfocita leukemija B ćelija, opekotine, multiple traume, moždani udar, infarkt miokarda, ateroskleroza, dijabetes melitus, ekstrakorporealna dijaliza i oksigenacija krvi, ishemijsko-reperfuzione povrede, toksičnost indukovan in vivo administracijom citokina ili terapeutskih monoklonalnih antitela, sindom hroničnog i neuropatskog bola i/ili inflamatorni bol.

[0103] Predmetni pronalazak će se sada ilustrovati uzimajući u obzir sledeće primere, koji opisuju posebno pogodne varijante. Međutim, treba napomenuti da su ove realizacije ilustrativne i ne treba ih tumačiti tako da ograničavaju pronalazak na bilo koji način.

LISTING SEKVENCI

[0104]

SEQ ID NO:1 –aminokiselinska sekvenca IL4

SEQ ID NO:2 - aminokiselinska sekvenca IL10

SEQ ID NO:3 - aminokiselinska sekvenca linkera

GSGGGGSGT SEQ ID NO:4 - aminokiselinska sekvenca fuzionog proteina IL4-IL10 (sekvenca linkera je podvučena; IL4 je lociran kao N-terminal IL10)

Kratak opis slika koje se odnose na pronalazak

[0105]

Slika 1 pokazuje nivo fuzionog proteina IL4-IL10 dobijenog od HEK293 ćelija transfektovanih sa fuzionim proteinom IL4-IL10. Supernatant HEK293 ćelija, koje su transfektovane sa vektorom ekspresije pUPE koji nosi transgen za fuzioni protein IL4-IL10, testiran je u sendvič ELISA testovima za IL4 (A) i IL10 (B), prema uputstvima proizvođača. Rezultati su izraženi kao optička gustina (OD) u odnosu na razblaženje supernatanta kulture.

Slika 2 pokazuje imunohemijsku identifikaciju fuzionog proteina IL4-IL10 pomoću unakrsne ELISA.

Supernatant HEK293 ćelija, koje su transfektovane sa vektor ekspresije pUPE koji nosi transgeni za fuzioni protein IL4-IL10, testiran je u unakrsnom ELISA sa anti-IL4 (A) ili anti-IL10 monoklonskim antitelima (korišćena kao antitela za vezivanje) ( B) i biotinilinovanim anti-IL10 (A) ili anti-IL4 (B) monoklonskim antitelima (koristi se kao antitela za detekciju). Rekombinantni IL10 je testiran kao negativna kontrola.

Slika 3 pokazuje Western blot koji identifikuje fuzioni protein IL4-IL10 u supernatantu HEK293 ćelija. Količina od 10 mikrolitara supernatanta dobijena iz HEK293 ćelija, koje su transfektovane sa cDNK kodiranjem fuzionog proteina IL4 -IL10, rađena je na SDS-PAGE. Blotovi su razvijeni sa označenim anti-IL4 antitelima (A) ili sa označenim anti-IL10 antitelima (B). Kao kontrola korišćeni su rekombinantni IL4 i IL10. Traka 1 = molekularni marker, Traka 2 = neobrađeni IL4-IL10 fuzioni protein, traka 3 = deglikozilovani fuzioni protein IL4-IL10, traka 4 = IL4 i traka 5 = IL10.

Slika 4 prikazuje rezultate analize ekskluzionom hromatografijom visokih performansi, identifikujući polimerizaciju fuzionog proteina IL4-IL10. Uzorci fuzionog proteina IL4-IL10, rekombinantnog IL4 i rekombinantnog IL10 rade na sistemu tečne hromatografije visokih performansi (tečne hromatografije pod visokim pritiskom). Kolona je kalibrisana u odnosu na proteinsku mešavinu tiroglobulina, goveđeg serumskog albumina (66 KD, prva tačkasta linija sa leve strane), karbonska anhidraza (30KD, druga tačkasta linija sa leve strane), mioglobulin (18 KD, treća tačkasta linija sa leve strane) i ribonukleaza (13,7 KD, četvrta tačkasta linija sa leve strane). Koristeći ove markere, molekulska težina proteina u frakcijama procenjena je poređenjem retencionih vremena. Sadržaj IL4 i IL10 u frakcijama različitih analiza meren je ELISA i izražen kao ng po ml. IL4 je eluisan kao očitni monomer, IL10 kao očigledni dimer, dok je obrazac elucije IL4-IL10 fuzionog proteina otkrio očigledni dimer.

Slika 5 prikazuje da fuzioni protein IL4-IL10 inhibira oslobađanje citokina indukovano LPS-om u kulturama cele krvi. Heparizovana krv iz zdravih dobrovoljaca je razblažena 1:10 u kulturi medijuma i inkubirana je sa LPS u koncentraciji od 10 ng/ml u prisustvu različitih koncentracija fuzionog proteina IL4-IL10. TNFα u supernatantima je merena pomoću ELISA. Panel A pokazuje sposobnost fuzionog proteina IL4-IL10 da inhibira proizvodnju TNFα (rezultati izraženi kao % inhibicije). Napominjemo da nije zabeležena inhibicija proizvodnje TNF kada se testira sličan volumen medijuma kulture bez fuzionog proteina IL4-IL10. Panel B pokazuje inhibiciju LPS-indukovane TNFα (levi grafikon), IL6 (srednji grafikon) i IL8 (desni grafikon) (koncentracije TNFα, IL6 i IL8 izmerene iz supernatanta su date u Y osi). Fuzioni protein IL4-IL10 je testiran u koncentraciji od 100 ng/ml i upoređen sa efektom smeše rekombinantnog IL4 i IL10 u konačnoj koncentraciji od 50 ng/ml. Panel C pokazuje da je efekat fuzionog proteina IL4-IL10 na LPS-indukovanu proizvodnju IL6 u potpunosti ukinut kada su antitela koja blokiraju receptore protiv IL4 receptora (anti-IL4R) i IL10 receptora (anti-IL10R) dodata u odnosu na kada je dodat samo medijum (bez antitela). Napominjemo da je efekat fuzionog proteina IL4-IL10 samo delimično ukinut kada je dodato antitelo koje blokira receptore protiv IL4 receptora (anti-IL4R) ili IL10 receptora (anti-IL10R), ali ne i oba.

Slika 6 pokazuje snažnu inhibiciju proizvodnje Th1 i Th17 citokina fuzionim proteinom IL4-IL10 povezanim sa kontinuiranim regulatornim (FokP3 ) T-ćelijskim procentima u superantigenu Staphilococcus enterotoksinu B (SEB) -aktiviranih mononuklearnih ćelijskih kultura. Aktivacija mijeloidnih ćelija i B ćelija kritički zavisi od ravnoteže pro-inflamatornih Th1 i Th17 i regulatornih FokP3-ekspresivnih CD4 T ćelija. Da bi se procenili efekte fuzionog proteina IL4-IL10 na aktivaciju T ćelija, izolovane su mononuklearne ćelije iz periferne krvi (PBMC) od zdravih 5 donora. Aktivacija T ćelija indukovana je tretmanom PBMC (5.10 / ml) tokom 3 dana u prisustvu ili bez SEB (1 ng/ml) i / ili fuzionog proteina IL4-IL10. Nakon ove proliferacije prolaza (panel A), ekspresije FokP3 i proinflamatorne proizvodnje T-ćelijskog citokina (panel B). SEB je značajno indukovao proliferaciju (panel A) uz nadregulaciju ekspresije FokP3 (panel B). Izrazi proliferacije (panel A) i FokP3 ekspresije (panel B) teško su uticali na IL4-10 fuzioni protein. Nasuprot tome, Th1 i Th17 citokini IFNγ (levi grafikon, panel C), IL17 (srednji graf, panel C) i TNFα (desni graf, panel C) su svi snažno redukovani fuzionim proteinom IL4-IL10. Zajedno, to pokazuje da fuzioni protein IL4-IL10 snažno menja ravnotežu između supresivnih regulatornih CD4 T ćelija i proinflamatornih Th1 i Th17 ćelija.

Slika 7 pokazuje stabilizaciju ekspresije receptora za IgG na monocitima fuzionog proteina IL4-IL10 u Staphilococcus enterotoksinu B (SEB) -aktiviranim mononuklearnim ćelijskim kulturama. Balans između aktivacionih i inhibitornih receptora za IgG (FciRs) igra ključnu ulogu u imuno kompleksno-posredovanoj aktivaciji mijeloidnih i limfoidnih ćelija. Za procenu efekata fuzionog proteina IL4-IL10 na ekspresiju FcyR na monocite, mononuklearne ćelije iz periferne krvi (PBMC) izolovane su od zdravog donora. Aktivacija monocita zavisna od T-ćelija je indukovana dodatkom PBMC (5.10<5>/ml) tokom 2 dana u prisustvu ili bezsuperantigena SEB (0.1 ng/ml) i / ili fuzionog proteina IL4-IL10. Nakon ovog perioda gajenja, izmerena je ekspresija FcγRs. IL10 je regulisao ekspresiju naviše za FcγRI, FcγRIIa,i FcγRIII. Sâm IL4 je

2

pokazao blagi pad ekspresije ovih aktivirajućih FcγRs u poređenju sa ćelijama kultivisanim bez citokina. Kombinacija IL4 i IL10 i fuzionog proteina IL4-IL10 normalizovala je ekspresiju FcγRI i FcRγIIa. Blagi porast IL4 u kombinaciji sa IL10 ili fuzionim proteinom IL4-IL10 u ekspresiji FcγRIII je meren, iako zanemarljiv u poređenju sa indukovanom regulacijom naviše ovog receptora samo pomoću IL10. Sâm IL4 je pokazao blagi pad ekspresije FcγRIIb. Kombinacija IL4 sa IL10 i fuzionim proteinom IL4-IL10 nije promenila ekspresiju inhibitornog FcγRIIb. Zajedno, to pokazuje da fuzioni protein IL4-IL10 stabilizuje ekspresiju aktivacije FcγRs i samim tim može da inhibira imuno aktivaciju izazvanu imunokompleksom.

Slika 8 pokazuje efekat doza-odgovor fuzionog proteina IL4-IL10 na metabolizam proteoglikana u hrskavici. Eksplanti hrskavice 5 donors su izložene tokom 4 dana, 50vol.% krvi od 5 donora (n=5). Tokom izlaganja krvi fuzioni protein, IL4-IL10 je dodat u koncentraciji od 0,0001 do 100 ng/mL. Brzina sinteze proteoglikana (A), -oslobađanje B) i - sadržaj (C) određeni su nakon regeneracije tokom 12 dana. BRzina sinteze proteoglikana i sadržaj su značajno smanjeni zbog izloženosti krvi u poređenju sa kontrolnim hrskavicama, dok je povećanje proteoglikana povećano (označeno zvezdicom, p <0,05). Oznake tarabe (Hash-tag) ukazuju na statistički značajne razlike u odnosu na 50vol.% krvi (p <0,05), dok tačkasta linija u A i B naglašava sigmoidni izgled doza-odgovor. Prikazane su srednje vrednosti ± međukvartalnog opsega. Dodavanje fuzionog proteina IL4-IL10 u kulture hrskavice dovelo je do regeneracije brzine sinteze proteoglikana zavisne od doze; normalizacija oslobađanja proteoglikana i smanjenje sadržaja bilo je suzbijeno.

Slika 9 pokazuje da fuzioni protein IL4-IL10 sprečava oštećenje hrskavice izazvane krvlju. Eksplanti hrskavice 8 donatora su izložene tokom 4 dana 50vol.% krvi od 8 donatora. Tokom izlaganja krvi dodat je fuzioni protein IL4-IL10, kao i IL4, IL10 i kombinacija IL4 sa IL10 (svi 10 ng/mL). Brzina sinteze proteoglikana eksplantata hrskavice smanjena je za 76% zbog izloženosti krvi (A, p = 0.012). Fuzioni protein IL4-IL10 povećao je brzinu sinteze proteoglikana sa 241% u poređenju sa sâmim izlaganjem krvi. Hrskavica izložen krvi pokazala je povećanje od 59% oslobađanja proteoglikana (B, p = 0.017).

Dodavanje fuzionog proteina IL4-IL10 smanjilo je oslobađanje proteoglikana indukovano krvlju (p = 0.012) nazad na kontrolne vrednosti. Koža koja je izložena krvi pokazala je smanjenje od 10% u sadržaju proteoglikana u odnosu na kontrolu (C, p = 0.012). Fuzioni protein IL4-IL10 značajno je povećao sadržaj proteoglikana u poređenju sa izlaganjem krvi (p = 0,012). Simbol * pokazuje statistički značajnu razliku u odnosu na kontrolu, simbol # pokazuje statistički značajnu razliku u odnosu na 50vol.% krvi (p <0.05). Prikazane su srednje vrednosti ± međukvartalnog opsega.

Slika 10 pokazuje da fuzioni protein IL4-IL10 umanjuje bol u psećem Groove-ov modelu za osteoartritis. Osteoartritis (OA) je indukovan kod 4 psa, a intraartikularne injekcije od 1 ml fuzionog proteina IL4-IL10 davane su na 5 nedelja (1µg/ml) i na 7 nedelja (10µg/ml) nakon indukcije OA (vidi strelice). Analiza sile na podlogu(FPA) izvršena je na svake 2 nedelje počevši od 3 nedelje pre i na kraju perioda od 8 nedelja nakon indukcije, uz dodatni dnevni FPA nakon injekcija fuzionog proteina IL4-IL10. Opterećenje OA zgloba (eksperimentalni zglob i kontralateralni kontrolni zglob) gotovo je normalizovano u poređenju sa nivoom neposredno pre injekcije (2% nvs 9% inhibicije u poređenju sa pre-OA opterećenjem, respektivno), naznačeno skokom u sili stajanja. Ovaj efekat na opterećenje, koji ukazuje na oslobađanje bolova, postignut je tokom nekoliko dana nakon čega se opterećenje ponovo opadalo. Nakon druge injekcije u 7 nedelji, došlo je do promene u rasterećenju od -7% (u poređenju sa pre opterećenjem OA) do -2% u poređenju sa pre OA opterećenjem. Tako je ponovo utvrđen pozitivan efekat fuzionog proteina IL4-IL10 na šemi opterećenja pogođenog zgloba sa OA i gotovo je uspostavljena potpuna normalizacija. Simbol * označava p = 0.05 u odnosu na vrednost pre injekcije dok simbol # označava p <0.05 u odnosu na osnovnu vrijednost. Zakrivljena tačkasta linija pokazuje prirodni tok OA bol (rasterećenje) bez tretmana.

Slika 11 pokazuje vremenski tok termičke hiperalgezije indukovane karagenanom kod miševa tretiranih fuzionim proteinom IL4-IL10. Latencije povlačenja šape usled zagrevanja određene su prema Hargreavesovom testu. Miševi su primili intraplantarnu injekciju karagenana (pogledajte prvu strelicu s leva), a određeno je smanjenje latencije povlačenja šape usled zagrevanja. Intratekalna injekcija sa fuzionim proteinom IL4-IL10 (vidi drugu strelicu s leva) značajno je smanjila hiperalgezički odgovor na intraplantarni karagenan. Efekat fuzionog proteina IL4-IL10 bio je manje očigledan nakon 2 dana, iako je smanjenje latencije povlačenja šape usled zagrevanja kod miša tretiranog fuzionim proteinom IL4-IL10 i dalje značajno manje u poređenju sa miševima koji su bili tretirani fiziološkim rastvorom nakon 48 sati. Podaci su izraženi kao srednja ± SEM. Simbol * označava p <0.05; simbol ** označava p <0.001.

Slika 12 pokazuje latencije odmicanja šape usled zagrevanja određene Hargreavesovom testom. Miševi su primili intraplantarnu injekciju karagenana, i određeno je smanjenje latentnosti povlačenja šape usled zagrevanja. Intratekalne injekcije (vidi strelice) sa IL4 ilisa IL10 (A) ili sa fuzionim proteinom IL4-IL10 (B) date su 6 dana posle indukcije hiperalgezije. I IL4 i IL10 su blago smanjili hiperalgezni odgovor na intraplantarni bol na karagen, ali je efekat zanemarljiv u poređenju sa efektom fuzionog proteina IL4-IL10. Efekat odvojenog IL4 ili IL10 trajao je 1 dan, dok je efekat fuzionog proteina IL4-IL10 trajao mnogo duže, do dana 4. Podaci su izraženi kao srednja ± SEM. Simbol * označava p <0.05; Simbol ** označava p <0,001.

Slika 13 pokazuje da fuzioni protein IL4-IL10 inhibira oslobađanje citokina izazvano LPS-om u kulturama celeg krvi. Heparinizovana krv iz zdravih dobrovoljaca je razblažena 1:10 u hranljivom medijumu i

2

inkubirana je sa LPS u koncentraciji od 10 ng/ml u prisustvu različitih koncentracija pulova koji sadrže različite konstrukte fuzionog proteina IL4-IL10. TNFα u supernatantima je merena pomoću ELISA. Rezultati su izraženi kao% inhibicije. Proizvodnja TNF u odsustvu fuzionog proteina IL4-IL10 dovela je do inhibicije od 0%. Pulovi 2 i 4, gde je IL4 c-terminus povezan sa n-terminusom IL10, pokazao je najveću inhibiciju proizvodnje TNFα u sličnim koncentracijama u poređenju sa pulovima 1 i 3, gde je IL10 cterminus povezan sa n-terminusom IL4. Ovo ukazuje na to da funkcionalnost fuzionog proteina IL4-10 zavisi od načina na koji su odvojeni citokini povezani unutar fuzionog proteina IL4-IL10.

PRIMERI

Primer 1. Transfekcija HEK293 ćelija.

[0106] Metoda: HEK293 ćelije su prolazno transfektovane u skladu sa standardnim procedurama vektorom koji sadrži transgen (Y Derocher et al., Nucleic Acids Research 2002, vol 30, no 2, e9). Ukratko, insert fuzionog proteina IL4-IL10 je kloniran u pUPE ekspresionom vektoru, koji sadrži signalnu sekvencu cistatina. HEK293E ćelije su zatim transfektovane sa pUPE ekspresionim vektorom koji sadrži fuzioni protein IL4-IL10 predmetnog pronalaska. U isto vreme ćelije su kotransfektovane sa vektorom koji nosi transgen za beta-galaktozid alfa-2,3-sialiltransferazu 5 (SIAT 9) homo sapiens da bi se optimizovalo prekrivanje glikana sialičnom kiselinom. Ćelije su gajene u FreeStyle medijumu (Invitrogen) sa 0.9% primatona i ∼ 0.04 vol.% fetalnog goveđeg seruma. Pet dana posle transfekcije, kondicionirani medijum je sakupljen centrifugiranjem male brzine, posle čega je koncentrovan preko 10 kDa QuixStand filtera sa šupljim cevima (GE Healthcare) i diafiltriran od fosfatom puferovane solane (PBS).

Primer 2. ELISA testovi za imunohemijsku detekciju fuzionog proteina IL4-IL10, IL4 i IL10.

[0107] Metoda: Sadržaj IL4 i IL10 u kulturi supernatanta ili u hromatografskim frakcijama meren je sa ELISA (IL4 PeliPair ELISA Kit; Sanquin, Amsterdam, the Netherlands; Cat# M9314 ili IL10 PeliPair ELISA Kit; Sanquin; Cat# M9310) u skladu sa instrukcijama proizvođača. Ukratko, antitela za vezivanje za IL4 ili IL10 su razblažena 1:200 fosfatom puferovanom solanom, pH 7.4 (PBS) i obložena preko noći na ELISA ploču. Svi sledeći koraci su izvedeni u PBS kome je dodano 0.1%, w/v, Tween-20 (PBS-T). Testirana je kriva doza- dgovor koja se sastoji od serijskih razblaženja da bi se dobio raspon od 100 do 2 pg/ml rekombinantih IL4 ili IL10. Vezana antitela su detektovana sa streptavidin-poli-HRP (Sanquin) pa zatim sa inkubacijom sa TMB (3,3',5,5"-tetrametilbenzidin; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA; Cat# SB02). Reakcija je zaustavljena sa 1M sumpornom kiselinom (Chem Lab; Cat# CL05-2658-1000). Rezultati sa ELISA su poređeni sa onima referentnih krivih razblaženja rekombinantnih IL4 i IL10 koje su dali proizvođači.

[0108] Cross-ELISA koja posebno detektuje IL4-IL10 fuzioni protein je izvedena upotrebom anti-IL4 obloženih ploča i biotinilizovanog anti-IL10 monoklonalnog antitela za detekciju. Cross-ELISA je izvedena potpuno isto kao ELISA za IL10 osim toga što su upotreblje ploče obložene sa anti-IL4 umesto ploča

2

obloženih sa anti-IL10. Ploče obložene sa anti-IL4 su pripremljene potpuno isto kao što je opisano za IL4 ELISA. Kako nema standarda za ovaj test rezultati su dati kao OD. Fiksirana količina supernatanta, ekvivalentna 75 pg/ml kontrolnog rekombinantnog IL10 i IL4-IL10 fuzionog proteina testirana je cross -ELISA specifičnom za fuzioni protein IL4-L10.

[0109] Rezutati: Detekcija IL4-IL10 fuzionog proteina. Oba ELISA testa (videti Crteže 1 i 2) dala su dozaodgovornu krivu kulture supenatanta transfektovanih HEK293 ćelija, ukazujući na prisustvo IL4 i IL10 proteina, koji su imali strukturne konformacije koje su prepoznate monoklonalnim antitelima uptrebljenim u ELISA testovima (Crtež 1). ELISA (cross-Elisa) je tada modifikovana da specifično meri fuzioni protein IL4-IL10, a ne rekombinantne molekule citokina divljeg tipa (videti crtež 2A i B). Kad je količina ekvivalentna 75 pg/ml rekombinantnog IL10 i fuziononog proteina IL4-IL10 testirana u ovoj cross-ELISA, samo je fuzioni protein IL4 -IL10 dao signal, ali ne i IL10 (Crtež 2A i B). Prma tome ovi rezultati pokazuju da je samo supernatant dobijen od HEK293 ćelija transfektovanih sa sekvencom fuzionog proteina IL4-IL10 predmetnog pronalaska, sadržao protein u kome su IL4 i IL10 sekvence povezane jedna za drugu.

Primer 3. SDS-Page i Western Blotting.

[0110] Metoda: Uzorci su razblaženi 1:1 u puferu uzorka (Tris-HCI pH 6.8, 25%, w/v, glicerol, 2%, w/v, SDS, 0.01%, w/v, bromofenol plavo; BioRad, Richmond, VA, USA, Cat# 161-0737), koji sadrži 710 mM 2-merkaptoetanola i inkubirani tokom 10 minut na 100 °C. Potom, uzorci su stavljeni na 7.5%, w/v, poliakrilamid tris/glicin gel (Mini-PROTEAN TGX Precast gels bez SDS; BioRad, Cat# 456-1023). Markeri molekulske težine (WesternC Standard, 250-10 kD; BioRad; Cat# 161-0376) su ispitivani u posebnoj liniji. Elektroforeza je izvedena u redukcionim uslovima upotrebom pufera tris/glicin/SDS (BioRad; Cat# 161-0732). Da bi se identifikovao IL4-IL10 fuzioni protein, izveden je imunoblotting sa anti-IL4 ili anti-IL10 antitelima. Proteini su izdvojeni na SDS-PAGE kako je prethodno opisano, i zatim preneti na PVDF-membranu (BioRad; Cat# 161-0277) sa Western blottingom, upotrebom tris/glicin pufera (BioRad; Cat# 161-0734) na 100V tokom 1 sata.

[0111] Posle blottinga, membrana je inkubirana sa PBS-T koji sadrži 4%, w/v, mleka u prahu (Elk milk powder; Campina, Zaltbommel, the Netherlands) da bi se blokirala preostala mesta vezivanje. PVDF membrana je zatim isprana 3x u PBS-T i inkubirana sa primarnim antitelom (mišji IgG1 anti-humani IL4; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA; Cat# SC80093 ili mišji IgG1 anti-humani IL10; Santa Cruz; Cat#SC32815) u 1%, w/v, mleka (rastvorenog u PBST) tokom 1 sata. Posle drugog koraka ispiranja, blot je inkubiran tokom 1 sata sa sekundarnim antitelom (peroksidaza iz rena (HRP)-konjugovani kozji antimišji IgG; Santa Cruz; Cat SC2005) i sa WesternC Marker detektujućim antitelom (StrepTactin-HRP; BioRad; Cat# 161-0382) u PBST-1% mleka. ECL rastvor (GE Healthcare, Diegem, Belgium, Cat# RPN2132) je dodan ispranoj membrani posle čega je membrana prebačena u kasetu i razvijana tokom do 15

2

minuta upotrebom Kodak Imager aparata. Radi dalje karakterizacije IL4-IL10 fuzionog proteina, kultura supernatanta je takođe tretirana sa PNGaseF (Sigma Aldrich, cat# G5166) u skladu sa instrukcijama proizvođača, da bi se uklonio glisolat iz IL4-IL10 fuzionog proteina, i zatim analizirao na SDS-PAGE i immunoblotu kao što je prethodno opisano.

[0112] Rezultati: Oba IL4 i IL10 divljeg tipa, su migrirala sa relativnom migracijom (Mr) koja je konzistetna sa MV <20kD (trake 4 i 5 blota prikazanih na Slici 3A i B). Od supernatanta dobijenog od transfektovanog HEK293, fuzioni protein IL4-IL10 migrirao je kao dvostruka traka sa Mr lompatibilnim sa MV ~ 30-35 kD. Obe trakesu prepoznate pomoću anti-IL4 (Slika 3A) i anti-IL10 monoklonskih antitela (Slika 3B), te stoga oba predstavljaju varijante fuzionog proteina IL4-IL10, verovatno različiti glikooblici. Naime, nije bilo detektovanih traka koje su odgovarale Mr u opsegu rekombinantnih IL4 ili IL10 divljeg tipa (trake 2 na slikama 3A i 3B). Ovi rezultati potvrđuju da su u supernatantu transfektovanih HEK293 ćelija otkriven samo fuzioni protein IL4-IL10, a ne pojedinačni citokini (tj. IL4 i IL10). Da bi se potvrdilo da je dvostruki opseg opisan u traci 2 paneli 3A i 3B su glikooblici, supernatant koji sadrži fuzioni protein IL4-IL10 je tretiran sa PNGaseF za deglikozilovanje i u poređen je sa netretiranim supernatantom pomoću imunoblota.Rezultati pokazuju da se posle deglikozilacije detektovana samo jedna traka (videti trake 3 u oba blota prikazana na slikama 3A i 3B), što potvrđuje da je dvostruka traka opseg zapažena u traci 2 oba blota (slika 2A i B) zapravo fuzioni protein IL4- IL10 predmetnog pronalaska, ali u glikozilovanom obliku.

Primer 4. Gel fitracija fuzionog proteina IL4-IL10 ekskluzionom hromatogtafijom pod visokim pritiskom (SEC).

[0113] Metoda: Da bi se odredila molekulska težina fuzionog proteina IL4-IL10, izvršena je viosko afinitetna ekskluziona hromatografije (HP-SEC). Gel filtracija (BioSuite 1254 mm UHR SEC kolona;

Waters; Cat # 186002161) je izvedena na hromatografskom sistemu visokih performansi (Shimadzu) sa 50 mM fosfatnim puferom koji sadrži 0,5 M NaCl kao mobilnu fazu. Kolona je kalibrisana pre analize pomoću smeše proteina tiroglobulina, goveđeg serum albumina, karbonske anhidraze, mioglobulina i ribonukleaze. IL4-IL10 fuzioni protein prečišćen katjonskom razmenom dobijen je grupisanjem i koncentrovanjem hromatografskih frakcija sa najvišim sadržajem fuzionog proteina IL4-IL10 (2 ml sakupljenih frakcija koncentrovano je do 100 ml, koje sadrži 2 µg fuzionog proteina IL4-IL10) . Petdeset ml 20 µg/ml sakupljenog fuzionog proteina IL4-IL10 je injektirano i propušteno kroz kolonu pri brzini protoka od 0,35 ml/min i pod pritiskom od 35 bara. Frakcije od 175 µl su sakupljene i sadržaj IL4 i IL10 je meren u gore opisanoj IL4 i IL10 ELISA (1/500 razblaženje). Slični postupci sa rekombinantnim humanim IL4 (Sigma, Cat # I4269) i rekombinantnim humanim IL10 (Sigma, Cat # I9276) su izvedeni kako bi se uporedila molekulska veličina fuzionog proteina IL4-IL10 sa veličinom molekula citokina divljeg tipa.

2

[0114] Rezultati: Šema eluiranjja IL4 sa HP-SEC ukazuje na to da je IL4 prisutan kao monomer (∼15kD). Šema eluiranja IL10 ukazuje na to da je ovaj citokin prisutan u dimernom obliku (∼40kD), koji je oblik (Zdanov et al, Stucture 1995, 3:591-601) koji se nalazi u prirodi IL10. The pattern of fuzionog proteina IL4-IL10 ukazuje na to da je petežno prisutan u dimetnom obliku (-70 kD) (Slika 4).

Primer 5. Analaza merenja pro-inflamatornih citokina.

[0115] Metoda: Proizvodnja TNFα merena je komarcijalnim ELISA (TNF-α Pelipair ELISA Kit; Sanquin, Amsterdam, the Netherlands; Cat# M9323) prema uputstvima proizvođača. Ukratko, ploče su obložene sa anti-TNFa antitelom za vezivanje razblaženim 1 do 150 u karbonatnom/bi-karbonatnom puferu, pH 9.6, isprane 3 puta sa PBS-T, i inkubirane sa 2.5%, w/v, goveđim serum albuminom (BSA; Roche Applied Science, Mannheim, Germany, Cat# 10735108001) u PBS da blokira preostala mesta vezivanja na ploču. Nakon još jednog koraka ispiranja, ležišta su inkubirana uzorcima razblaženim u PBS-T. Standardna kriva rekombinantnog TNF-a pri koncentracijama od 200-1.56 pg/ml u PBS-T je testirana kao referenca. Rekombinatni TNF-a je dobijen u kompletu. Konačno, detektovan je vezan TNF-α inkubiranjem sa biotinilizovanim anti-TNF-a i streptavidin-poli-HRP (Sanquin; Cat# 2032), respektivno, u PBS-T. Vezani HRP obojen je dodatkom TMB (3,3'5,5"tetrametilbenzidinom; Invitrogen; Cat# SB02). U cilju završetka ELISA, dodato je 1M sumporna kiselina (Chem Lab; Cat# CL05-2658-1000). Rezultati upućuju na standardne krive rekombinantnog TNFα i izraženi su u pg/ml. Primenjene su slične ELISA procedure za merenje IL6 i IL8 (nabavljeni od Sanquin) i IFNγ i IL17 (nabavljeni od Biosource).

Primer 6. Analize za merenje aktivnosti IL4-IL10 fuzionog proteina, IL4 i IL10.

[0116] Metoda: Lipopolisaharidom – izazvani (LPS) oslobođeni citokini (IL6, IL8, TNFα) u celoj krvi su upotrebljeni kao funkcionalni test za IL4 i IL10. Heparinizovana krv čoveka je dobijena od zdravih dobrovoljaca i razblažena 1 prema 10 u RPMI 1640 medijumu kulture (Glutamax; Invitrogen, Cat# 61870010) kome je dodat Pen/Strep (PAA Laboratories, Pasching, Austria; Cat# P11-013). LPS (Lipopolysaccharide; Sigma; Cat# L4391) je dodat da bi se dobila krajnja koncentracija od 10 ng/ml. Fuzioni protein IL4-IL10 je dodat u krajnjoj koncentraciji od 100 ng/ml. Kao kontrola, dodati su rekombinantni humani IL4 (Sigma, Cat# I4269) i rekombinantni humani IL10 (Sigma, Cat# I9276) svaki sa krajnjom koncentracijom od 50 ng/ml. Da bi se verifikovala aktivnost IL10 i IL4, antitela koja blokiraju humani IL4-receptor (a-hIL4-R; R&D Systems; Minneapolis, MN, USA, Cat# MAB230) i humani IL10-receptor (a-IL10-R, BioLegend, San Diego, CA, USA, Cat# 308807) dodati su u krajnjoj koncentraciji od 10 µg/ml, odnosno 20 µg/ml. Kultura cele krvi je tada inkubirana tokom 18 sati na 37°C, posle čega je supernatant sakupljen, čuvan na -80°C dok nije testiran na citokine.

[0117] Rezultati: Nivoi TNFα prisutnog u supernatantima su mereni sa ELISA i izraženi kao % inhibicije TNFα (Slika 5A). Rezultati pokatuju da je stvaranje TNFα u odsustvu IL4-IL10 fuzionog proteina dovelo do

2

0% inhibicije (Slika 5A). Nije primećena inhibicija stvaranja TNFα kad je testirana slična zapremina IL4-IL10 fuzionog proteina bez pufera (Slika 5A). Inhibicija LPS-izazvanim TNFα, IL6, i stvaranje IL8 IL4 fuzionim proteinom -IL10, ili kombinacijom IL4 i IL10, takođe je merena ELISA testovima (Slika 5B). Koncentracije TNFα, IL6, i IL8 prisutne u supernatantu su date na Y-osi. IL4-IL10 fuzioni protein je testiran na 50 ng/ml, i upoređen sa efektom smeše rekombinantnog humanpg IL4 i IL10 svakog sa krajnjom koncentracijom od 25 ng/ml. Rezultati su pokazali da i fuzioni protein IL4-IL10 i kombinacija IL4 i IL10 značajno inhibira LPS-izazvano stvaranje TNF, IL6, i IL8 u odnosu na kontrolu (tj., medijum bez citokina). Delovanje fuzionog proteina IL4-IL10 na LPS-izazvano stvaranje IL6 je potpuno poništeno kad su oba antitela koja blokiraju humani IL4-receptor (a-hIL4-R) i humani IL-10-receptor (a-IL10-R) dodata kontroli (npr., samo medijumu). Međutim, delovanje fuzionog proteina IL4-IL10 na LPS-izazvano stvaranje IL6 je delimično poništeno kad su ili jedna ili dve grupe (tj. IL4 ili IL10) blokirana antitelom koje blokira humani IL4-receptor (a-hIL4-R) ili humani IL-10-receptor (a-IL10-R), u odnosu na kontrolnu (npr. samo na medijum).

Primer 7. Dejstvo fuzionog proteina IL4-IL10 na ravnotežu aktivnosti proinflamatornih (ćelija koje eksprimirajuTh1 i Th17 citokine) i regulatornih T-ćelija (CD4 T ćelija koje eksprimiraju FoxP3).

[0118] Metoda: Aktivacija mijeloidnih ćelija i B ćelija kritično zavisi od ravnoteže T ćelija proinflamatornih Th1 i Th17 i regulatornih CD4 T ćelija koje eksprimiraju FoxP3. Da bi se odredilo dejstvo fuzionog proteina IL4-IL10 na stvaranje citokina T-ćelija, mononuklearne ćelije iz periferne krvi (PBMC) su izolovane od zdravih donora. Ukratko, krv je razblažena 1:1 sa RPMI 1640 medijumom (Gibco BRL, Life Technologies, Merelbeke, Belgium) koji sadrži penicilin (100 U/ml, Yamanouchi, Leiderdorp, The Netherlands), streptomicin (100mg/ml, Fisiopharma, Milano, Italy), i glutamin (2mM, Gibco BRL). PBMCs su izolovani Ficoll-Paque centrifugiranjem u gradijentu gustine (Pharmacia, Uppsala, Sweden). PBMC (5.10<5>/ml) je gajen tokom 3 dana na 37°C u RPMI/glutamaks (Gibco BRL) sa dodatim penicilinom (100 U/ml), streptomicinom (100mg/ml), i 10% obedinjenog fetalnog telećeg seruma (FCS, Gibco BRL). PBMC je gajen u prisustvu ili odsustvu superantigena Staphylococcus enterotoksin B (SEB, 1 ng/ml) i/ili fuzionog proteina IL4-IL10. Posle ovog perioda gajenja sakupljen je supernatant, napravljen bez ćelija čuvan na -80°C dok nije testiran na IFNγ, IL17 i TNFα sa ELISA. Osim toga, merena je proliferacija ćelija inkorporacijom 3H-timidina.3H-timidin je dodat (5 mCi/ml, NEN Life Science Products, Amsterdam, The Netherlands) u svako ležište tokom poslednjih 18 sati trodnevnog gajenja ćelija. Posle ovog perioda gajenja ćelije su sakupljene i inkorporacija 3H-timidina je merena tečnim scintilacionim brojačem i izražena u otkucajima na minut (CPM). Takođe je izvedeno intracelularno bojenje FoxP3 korišćenjem seta za bojenje APC-konjugovanog pacovskog anti-humanog FoxP3 (eBioscience, San Diego, USA). Za intracelularno bojenje, upotrebljeno je APC-obeleženo pacovsko izotip kontrolno (eBioscience). Procenti pozitivnih/negativnih ćelija su određeni na osnovu postavljenih markera korišćenjem izotipskih kontrola.

Akvizicija ćelija je izvedena upotrebom FACScan protočnog citometra i podaci su analizirani programom FlowJo, verzija 7.5 (Tree Star Inc., Oregon, USA).

[0119] Takođe je testirano sinergistčko delovanje fuzionog proteina IL4-IL10 na ekspresiju inihibitornog Fcγ receptora (FcyRllb) na monocite. Ovo je upoređeno sa regulacijom aktivirajućeg FcyRI i FcγRIII.

PBMC (1.10<6>/ml) je gajen toko 4 dana na 37°C u RPMI/glutamaks (Gibco BRL) kome je dodat penicilin (100 U/ml), streptomicin (100mg/ml), i 10% kombinovani humani AB serum (Gibco BRL). PBMC je gajen u prisustvu ili odsustvu superantigena SEB (1 ng/ml) i/ili fuzionog proteina IL4-IL10. Posle ovog perioda gajenja, ekspresija FcyRs je određena FACS analizom. Za FACS anailzu monociti su inkubirani sa APC-označenim CD14 mAb, FITC-označenim anti-FcyRI i anti-FcgRIII mabs (Pharmingen), i FITC-označenim anti-FcgRllb mab (2B6, Genmab, Utrecht, Netherlands). Akvizicija ćelija je izvedena upotrebom FACScan protočnog citometra i podaci su analizirani programom FlowJo, verzija 7.5 (Tree Star Inc., Oregon, USA).

[0120] Rezultati: SEB je indukovao značajnu proliferaciju povezanu sa regulacijom naviše ekspresije FoxP3. Na proliferaciju i ekspresiju FoxP3 jedva da utiče fuzioni protein IL4-IL10 (Slika 6A odnosno B). Nasuprot ovome, Th1 i Th17 citokini IFNγ (levi grafik), IL-17 (srednji grafik), i TNFα (desni grafik) su jako smanjeni sa fuzionim proteinom IL4-IL10 i kombinacijom IL4 i IL10 (Slika 6C). Zajedno, ovo pokazuje da fuzioni protein IL4-10 značajno menja ravnotežu između supresivnih regulatornih CD4 T ćelija i proinflamatornih Th1 i Th17 ćelija.

Primer 8. Dejstvo fuzionog proteina IL4-IL10 na ravnotežu aktvacionog Fcγ receptora I i III i inhibitornog FcyRllb sa fuzionim proteinom IL4-IL10, IL4, IL10, i kombinacijom IL4 i IL10.

[0121] Metoda: Ravnoteža između aktivacionih i inhibitornih receptora za IgG (FcγRs) igra ključnu ulogu u imunskim kompleksom posredovanoj aktivaciji mijeloidnih i limfoidnih ćelija. Da bi se odredili efekti fuzionog proteina IL4-IL10 na ekspresiju FcγR na monocitima, mononuklearne ćelije iz periferne krvi (PBMC) su iizolovane od zdravog donora. Aktivacija monocita koja zavisi od T ćelija je izazvana tretiranjem sa PBMC (5.10<5>/ml) tokom 2 dana u prisustvu ili odsustvu superantigena Staphylococcus enterotoksin B (SEB) (0.1 ng/ml) i/ili fuzionog proteina IL4 -IL10. Posle ovog perioda gajenja, merena je ekspresija FcγR.

[0122] Rezultati: IL10 je regulisao naviše ekspresiju FcγRI, FcγRIIa, i FcγRIII (Slika 7), dok je IL4 pod ovim uslovima pokazao slabo smanjenje u ekspresiji ovih aktivacionih FcyRs u poređenju sa ćelijama gajenim u odsustvu citokina. Kombinacija IL4 i IL10 i fuzionog proteina IL4-IL10 normalizovala je ekspresiju FcγRI i FcRγIIa. Iako je primećeno malo povećanje u FcγRIII kombinacijom IL4 i IL10 i fuzionog proteina IL4-IL10, ono je bilo zanemarljivo u poređenju sa izazvanom apregulacijom ovog receptora samim IL10. Sam IL10 je pokazao malo povećanje u ekspresiji inhibitornog FcγRIIb, dok je sam IL4 pokazao malo smanjenje u ekspresiji ovog receptora. Kombinacija IL4 i IL10, i fuzionog proteina IL4-IL10 nije promenila ekspresiju inhibitornog FcγRIIb (Slika 7). Zajedno, ovo pokazuje da fuzioni protein IL4-IL10 stabilizuje ekspresiju

1

aktivacionog FcγRs i shodno tome može da inhibira imunskim kompleksom izazvanu aktivaciju imunskog odgovora.

Primer 9. Kulture hrskavica za oštećenje hrskavice indukovano krvlju

[0123] Metoda: Tkivo hrskavice zgloba zdravog čoveka je dobijeno post mortem od humeralnih glava tokom 24 sata posle smrti donora, odobreno mediicinskim etičkim pravilima Uuniverzitetskog medicinskog centra Utreht. Donori (n=8; srednja starost 69.8 ± 8.7 godina, 3 muškarca i 5 žena) nisu imali poznatu istoriju poremećaja zglobova. Isečci hrskavice pune debljine su aseptično izrezani sa humeralnih glava, isključujući kost koja se nalazi ispod njih, i držani u fosfatom puferovanom fiziološkom rastvoru (PBS, pH 7.4). U roku od 1 sata posle isecanja, isečci su sečeni u male kubne eksplantate pune debljine i izmereni aseptično (raspon 5-15 mg, tačnost ± 0.1 mg). Eksplantati su gajeni pojedinačno u mikrotitiarskoj ploči sa 96 ležišta sa okruglim dnom (sa 5% CO2u vazduhu, pH 7.4, 37°C, i 95% vlažnosti). Medijum kulture se sastojao od Dulbecco's Modified Eagle's Medijum (DMEM; Invitrogen) kome je dodat glutamin (2 mM), penicilin (100 IU/mL), streptomicin sulfat (100 µg/mL; svi PAA), askorbinska kiselina (85 µM; Sigma), i 10% toplotom deaktivirani kombinovani AB<+>serum muškarca (Gemini Bioproducts).

[0124] Za svaki eksperiment, izvučena je sveža krv od zdravih donora (n=8, srednja starost 28.0 ± 5.0 godina, 2 muškarca i 6 žena) u vakuumskoj epruveti (nr.367895; Becton Dickinson). Da bi se simuliralo krvarenje ljudskog zgloba, hrskavica je izložena 50% z/zpunoj krvi tokom 4 dana, što je smatrano kao prirodno vreme evakuacije krvi iz zglobne šupljine. Posle ovog izlaganja krvi, eksplantati hrskavice su isprani dva puta pod uslovima gajenja tokom 45 minuta da bi se uklonili svi aditivi i gajeni su tokom još 12 dana. Medijum je osvežavan svaka 4 dana. U prvoj postavci eksperimenta upotrebom hrskavice i krvi 5 od 8 donora, kriva odgovora na dozu fuzionog proteina IL4-IL10 je načinjena dodavanjem fuzionog proteina IL4-IL10 tokom izlaganja krvi u koncentraciji od 0.0001, 0.0003, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, i 100 ng/mL (n=5). U odvojenom eksperimentu, optimalna koncentracija od 10 ng/mL fuzionog proteina IL4-IL10 je upoređena sa sličnom koncentracijom kombinacije IL10 plus IL4, kao i pojedinačnih komponenata (svaka od njih 10 ng/mL, n=8).

[0125] Kao mera brzine sinteze proteoglikana, pri čemu je proteoglikan jedna od glavnih komponenta matriksa hrskavice, određena je brzina ugradnje sulfata u glikozaminogllikane (GAGs). Na kraju svakog eskperimenta dodato je 74 kBq Na2<35>SO4(NEX-041-H bez nosača; DuPont) po ležištu. Posle 4 sata pulsnog obeležavanja novo formiranih sulfatizovanih GAGs, uzorci hrskavice su isprani dva puta u hladnom PBS i čuvani na - 20°C. Otopljeni uzorci su digestirani tokom 2 sata na 65°C sa 2% papaina (Sigma). Brzina sinteze proteoglikana je određena taloženjem GAGs sa 0.3M heksadecilpiridinijum hlorid monohidrata (CPC; Sigma) u 0.2M NaCl. Talog je rastvoren u 3M NaCl i količina radioaktivnosti je merena tečnom sciintilacionom analizom. Radioaktvini otkucaji su normalizovani na specifičnu aktivnost

2

medijuma, vreme ozračivanja, i težinu mokre hrskavice Rezultati su izraženi u nanomolima sulfata ugrađenog po gramu težine mokrog tkiva hrskavice (nmol/h*g).

[0126] Sadržaj proteoglikana u svakom eksplantatu hrskavice i oslobađanje proteogliakana u medijumu kulture određeni si bojenjem i taloženjem GAGs sa Alcian Blue (Sigma) u papain digestu uzoraka hrskavice, odnosno u medijumu kulture. Bojenje je kvantifikoano apsorpciometrijom na 620 nm upotrebom hondroitin sulfata (Sigma) kao reference. Rezultati su izraženi kao mg GAG po masi mokrog tkiva hrskavice (mg/g) i mg GAG oslobođenog tokom 4 dana po masi mokrog tkiva (mg/g), za sadržaj, odnosno za oslobađanje. Zbog vrlo važnih fokalnih razlika u sastavu i bioaktivnosti hrskavice, parametri prometa proteoglikana su određeni za 10 ekplantata hrskavice od istog donora, koji su dobijeni nasumično i sa kojima je rukovano pojedinačno. Srednja vrednost ovih 10 uzoraka je uzeta kao reprezentativna vrednost za ovog donora hrskavice.

[0127] Rezultati: Izlaganje hrskavice 50vol.% krvi tokom 4 dana jako je smanjilo brzinu sinteze proteoglikana za 74% (Slika 8A; p=0.043). Dodavanje fuzionog protein IL4-IL10 a dovelo je do dozezavisnog regenracije brzine sinteze proteoglikana, tj., doze od 0.1 ng/mL fuzionog proteina IL4-IL10 i veće, značajno povećanje brzine sinteze proteoglikana je primećeno u poređenju sa izlaganjem krvi bez fuzionog proteina IL4-IL10 (svi p=0.043). Povećanje od 62% oslobađanja proteoglikana usled izlaganja krvi je bilo (statistički) značajno preokrenuto (ponovno uspostavljeno do nivoa kontrole) dodavanjem fuzionog proteina IL4-IL10 od 0.1 ng/mL i više. (Slika 8B, svi p=0.043, osim za 1 ng/mL, p=0.080). Ovo je dovelo do normalizacije oslobađanja proteoglikana koji više nje bio različit od kontrolnih kultura. Ukupni sadržaj proteoglikana je smanjen za 11% kad su eksplantati hrskavice bili izloženi krvi (Slika 8C; p=0.043). Smanjenje sadržaja usled izlaganja krvi je suzbijeno dodavanjem fuzionog proteina IL4-IL10 sa koncentracijama od 0.3 ng/mL i više (svi p=0.043, izuzev za 1 i 100 ng/ml, za oba p=0.080).

[0128] Da bi se uporedili efekti fuzionog proteina IL4-IL10 na kombinaciju citokina i pojedninačnih komponenata, fuzioni protein IL4-IL10, IL4, IL10, i kombinacija ova dva (svaki po 10 ng/mL) testirani su u istoj analizi. Brzina sinteze proteogliakana je smanjena za 76% usled izlaganja krvi (Slika 9A; p=0.012). Kako IL10 tako i IL4 su statistički značajno povećali brzinu sinteze u poređenju sa krvi (p=0.017, odnosno p=0.012). Fuzioni protein IL4-IL10 upotrebljen u istim koncentracijama takođe je povećao brzinu sinteze proteoglikana, i tako je bio jednako efikasan kao kombinacija dva pojedinačna citokina (241%, odnosnoi 245%, u poređenju sa izlaganhem krvi). Takođe je efekat fuzionog proteina IL4-IL10 bio statstički značajno bolji nego efekat samog IL10 (p=0.025). Brzina sinteze proteoglikana kultura sa fuzionim proteinom IL4-IL10, sa kombinacijom oba citokina, i sa samim IL4 nije bila značajno različita od kontrola. Dobijen je potpuni oporavak od inhibicije sinteze proteoglikana izazvane krvlju, odnosno normalizacija. Izlaganje hrskavice krvi povećalo je oslobađanje proteoglikana za 59% (Slika 9B; p=0.017). Dodavanje IL10 smanjilo je ovo pojačano oslobađanje (p=0.012 u poređenju sa krvi). IL4, kombinacija IL-4 i IL-10, i fuzioni protein IL4-IL10 smanjili su oslobađanje u većem stepenu u poređenju sa izlaganjem krvi (svi p=0.012). fuzioni protein IL4-IL10 je bio jači u poređenju sa samim IL10 (p=0.012), i jednako efikasan kao kombinacija pojedinačnih citokina (p=0.611).

[0129] Hrskavica izložena krvi pokazala je smanjenje sadržaja proteoglikana za 10% (Slika 9C; p=0.012). Pojedinačni citokini IL4 i IL10 nisu sprečili ovo smanjenje sadržaja (p=0.093, odnosno p=0.327, u poređenju sa izlaganjem krvi). Međutim, fuzioni protein IL4-IL10 (statistički) značajno je povećao sadržaj proteoglikana u poređenju sa izlaganjem krvi bez dodataka (p=0.012).

Primer 10. Pseći “groove” model (model žleba) za bol i osteoartritis.

[0130] Metoda: Dejstvo fuzionog proteina IL4-IL10 na bol i funkcionalnu sposobnost u psećem Groovemodelu za osteoartritis. Karakteristike “groove” modela odražavaju one humanog osteoartritisa (OA), čineći ga odgovarajućim modelom za ispitivanje humanog OA. “Groove” model je poseban po tome što su degenerativne promene hrskavice progresivne, što na kraju dovodi do osteoartritisa (OA), dok se sinovijalna inflamacija vremenom smanjuje. Zbog ovoga, na procenu direktnog efekta leka na degenraciju hrskavice i bol manje deluju mogući indirektni efekti na inflamaciju. Osim toga, model je poseban zato što nema permanentnog okidača koji izaziva oštećenje hrskavice, što čini model osetljivijim na tretman. Permanentni okidač za oštećenje hrskavice, kao što je nestabilnost zgloba upotrebljen u drugim (psečim) modelima za OA osujetiće moguće korisne efekte tretmana. Ukupno, “groove”-model je pogodan za testiranje terapijskog efekta fuzionog proteina IL4-IL10 na oštećenje hrskavice i bol izazvan invaliditetom usled OA. Bol i funkcionalna sposobnost se smatraju kao vrlo važni parametri u kliničkim istraživanjima osteoartritisa, pošto ovi parametri, pre nego strukturne promene, primoravaju pacijente da traže pomoć lekara. U psećim modelima, promene usporenosti, vertikalnog stava, i pokretanje sila reakcije podloge – indikatori bola i funkcionalne sposobnosti – mogu se proceniti metodom platforme sile (FPA). Na opterećivanje zgloba uticaće bol i funkcionalna sposobnost, u zavisnosti od faze procesa degeneracije zgloba. Prve dve nedelje posle indukcije OA nađeno je jasno smanjenje rasterećenja, najverovatnije izazvano bolom povezanim sa operacijom. Međutim, posle tri nedelje postoji trajnije rasterećenje povređenog uda kao rezultat bola povezanog sa OA.

[0131] Osteoartritis (OA) je indukovan kod 4 Mongrels psa (mešovita rasa, skeletnoi sazreli), u desno koleno, u skladu sa “groove” modelom. Deset uzdužnih i dijagonalnih žlebova, dubine 0.5 mm, načinjeno je na delovima femoralnih kondila koji nose težinu. Krvarenje i oštećenje mekog tkiva je sprečeno što je više moguće kako bi se sprečilo preovlađivanje inflamatorne komopnente nasuprot inflamatornim modelima i specifičnim artritičnim modelima. Posle operacije, sinovijum, fascija i koža su zašiveni. Kontralateralno neoperisano koleno je služilo kao kontrola. Intra-artikularna injekcija od 1ml fuzionog proteina IL4-IL10 (1ug/ml) data je 5 nedelja posle indukcije OA (videti prvu strelicu s leva). Dve nedelje posle prve injekcije (nedelja 7) data je druga injekcija sa većom dozom (10ug/ml)(videti drugu strelicu s leva).

4

[0132] Obrazac hoda po podlozi, uzet kao mera bola i funkcionalne sposobnosti, određen je pomoću platforme sile (FPA). U psećim modelima, promene usporenosti, vertikalnog stava, i pokretanje sila reakcije podloge (GRFs) mogu se odrediti za svaku nogu sa FPA. Platforma sile (FP), postavljena ravno sa površinom od 11 metara staze sakupljala je (100 Hz) pikove GRFs. Sile su normalizovane na telesnu masu i vreme, i izražene u N/kg. Jedan vodič je vodio pse povodcem preko FP, korakom, konstanttnom brzinom (1 ± 0.2 m/s). Uspešna proba sastojala se od uzastopnih, posebnih dodira desne prednje i zadnje šape, odnosno leve prednje i zadnje šape. Sakupljno je deset validnih proba za svaku stranu psa i određena je srednja vrednost GRFs za svaku od četiri noge. FPA je izvedena svake 2 nedelje počevši od 3 nedelje pre i završavajući se 8 nedelja posle indukcije. Dodatne dnevne FPA su izvedene posle injekcije sa fuzionim proteinom IL4-IL10 (nedelje 5 i 7).

[0133] Rezultati: Rezultati pokazuju da se posle prve injekcije fuzionog proteina IL4-IL10, opterećenje OA zgloba (eksperimentalni zglob vs. kontralateralni kontrolni zglob) skoro normalizovalo (2% inhibicije u poređenju sa opterećenjm pre OA) u poređenju sa nivoom neposredno pre injekcije (9% inhibicije u poređenju sa opterećenjm pre OA) kako je naznačeno pikom u sili stajanja (Slika 10). Efekat opterećenja, što je indikativno za oslobađanje od bola, dobijen je tokom dana posle kojih je opterećenje opet opalo. Posle druge injekcije u nedelji 7, pozitivni efekti fuzionog proteina IL4-IL10 su takođe primećeni na šemi opterećenja zgloba oštećenog sa OA. Ovo je prikazano promenom u rasterećenju od -7% (u poređenju sa opterećenjem pre OA) do -2% u poređenju sa opterećenjem pre OA, opet skoro potpunom normalizacijom. Fuzioni protein IL4-IL10 je prema tome mogao da smanji bol u ovom psećem modelu za OA.

Primer 11. Pseći model žleba (Groove-model) za bol i osteoartritis.

[0134] Metoda: Osteoartritis (OA) je indukovan kod 4 Mongrels psa (mešovita rasa, skeletno sazreli), u desno koleno, u skladu sa “groove” modelom. Deset uzdužnih i dijagonalnih žlebova, dubine 0.5 mm, načinjeno je na delovima femoralnih kondila koji nose težinu. Krvarenje i oštećenje mekog tkiva je sprečeno što je više moguće da bi se sprečilo preovlađivanje inflamatorne komopnente nasuprot inflamatornim modelima i specifičnim artritičnim modelima. Posle operacije, sinovijum, fascija i koža su zašiveni. Kontralateralno neoperisano koleno služi kao kontrola. Psi su podeljeni u dve grupe. Prva grupa je dobila intra-artikularnu injekciju fuzionog proteina IL4-IL105 nedelja posle izazivanja OA. Druga grupa je dobila intra-artikularnu injenciju i IL4 i IL10 ali u slobodnom obliku, 5 nedelja posle izazivanja OA. Dve nedelje posle prve injekcije (nedelja 7), druga injekcija veće doze je data prvoj grupi (10ug/ml fuzionog proteina IL4-IL10) i drugoj grupu (5 ug/ml IL4 i 5 ug/ml IL10).

[0135] Obrazac hoda po podlozi, uzet kao mera bola i funkcionalne sposobnosti, određen je pomoću platforme sile (FPA). U psećim modelima, promene usporenosti, vertikalnog stava, i pokretanje sila reakcije (GRFs) mogu se odrediti za svaku nogu sa FPA. Platforma sile (FP), postavljena ravno sa površinom od 11 metara staze sakupljala je (100 Hz) pikove GRFs. Sile su normalizovane na telesnu masu i vreme, i izražene u N/kg. Jedan vodič je vodio pse povodcem preko FP, korakom, konstantnom brzinom (1 ± 0.2 m/s). Uspešna proba sastojala se od uzastopnih, posebnih dodira desne prednje i zadnje šape, odnosno leve prednje i zadnje šape. Sakupljno je deset validnih proba za svaku stranu psa i određena je srednja vrednost GRFs za svaku od četiri noge. FPA je izvedena svake 2 nedelje počevši od 3 nedelje pre i završavajući se 8 nedelja posle indukcije. Dodatne dnevne FPA su izvedene posle injekcije sa fuzionim proteinom IL4-IL10 (grupa 1) i injekcije sa IL4 i IL10 u slobodnom obliku (grupa 2), nedelje 5 i nedelje 7. Rezultati: Rezultati pokazuju da posle obe injekcije (nedelja 5 i nedelja 7), tretmani bilo sa fuzionim proteinom IL4-IL10 (grupa 1) ili kombinacijom IL4 i IL10 u slobodnom obliku (grupa 2), daju pozitivne efekte na šemi opterečenja zgloba oštećenog zbog OA. Međutim, mnogo veće poboljšanje u šemi opterećenja zgloba oštećenog zbog OA primećeno je kao odgovor na tretiranje sa fuzionim proteinom IL4-IL10 u odnosu na tretiranje sa kombinacijom IL4 i IL10 u slobodnom obliku, i nedelje 5 i nedelje 7. Takođe je primećeno da efekti tretiranja sa fuzionim proteinom IL4-IL10 vremenski duže traju nego efekti tretiranja sa kombinacijom IL4 i IL10 u slobodnom obliku. Prema tome, fuzioni protein IL4-IL10 je mogao da smanji bol u ovom psećem modelu za OA u mnogo večoj meri nego što je to postignuto sa kombinacijom IL4 i IL10 u slobodnom obliku.

Primer 12. Mišji model hiperalgezije izazvane karageninom

[0136] Metoda: Hiperalgezija je izazvana kod ženki C57BL/6 miševa intraplantarnom injekcijom 5µl A-karagenina (2% w/v; Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA) razblaženog fiziološkog rastvora na dan 0 (videti prvu strelicu s leva na Sliku 11) u zadnju šapu. Intraplantarna injekcija sâmog fiziološkog rastvora nije izazvala hiperalgeziju koja se može detektovati. Odgovori na stimulus infracrvenom toplotom, mereni kao latencija odmicanja, određeni su upotrebom Hargreaves-ovog testa (IITC Life Science, Woodland Hills, CA). Intenzitet svetlosnog snopa je izabran da izazove vreme latencija odmicanja usled toplote od približno 8 sekundi u početnom stanju. Latencije odmicanja u početnom stanju su određene tri uzastopna dana. Kod miševa je razvijena hiperalgezija evidentirana smanjenjem latencije odmicanja koja je trajala najmanje 10 dana posle injekcije karagenina. Na dan 6 miševi su dobili jednu intratekalnu injekciju ili IL4 (100ng), IL10 (100ng), ili fuzionog proteina IL4-IL10 (40, 100, i 200 ng), ili vehikulum (fiziološki rastvor) (videti strelice na Slikama 11 i 12).

[0137] Rezultati: Miševi su pokazali hiperalgeziju, do 6 dana posle injekcije karagenina, prikazanu smanjenjem latencije odmicanja (Slika 11). Na dan 6 miševi su dobili jednu intratekalnu injekciju ili 100ng fuzionog proteina IL4-IL10 (n=4) ili fiziološki rastvor (n=4) kao kontrole, Posle injekcije fuzionog proteina IL4-IL10, hiperalgezija je inhibirana kako je utvđeno smanjenjem latencije odmicanja šape nazad do početnog stanja (Figure 11). Efekat jedne doze fuzionog proteina IL4-IL10 trajao je do 2 dana. Posle 48 sati efekat je bio smanjen, ali još uvek značajno različiti od % smanjenja u latenciji kod miševa tretiranih fiziološkim rastvorom.(Slika 11).

[0138] U komplementarnom eksperimenu koristeći istu metodologiju kao što je prethodno opisano, karrageninom izazvana toplotna hiperalgezija je takođe određena kod miševa tretiranih sa IL4, IL10, ili fuzionim proteinom IL4-IL10. Posebno, intratekalne injekcije sa ili IL4 ili IL10 (A) ili fuzionim proteinom IL4-IL10 (B) date su na dan 6 posle izazivanja hiperalgezije (Slika 12). Iako su i IL4 i IL10 malo smanjili hiperalgezijski odgovor na intraplantarni bol izazvan karageninom, ovaj efekat je zanemarljiv u poređenju sa efektom fuzionog proteina IL4-IL10 (Slika 12). Efekat odvojenog IL4 ili IL10 trajao je 1 dan, dok je efekat fuzionog proteina IL4-IL10 opstajao tokom mnogo dužeg perioda vremena, tj do dana 4 (Slika 12B).

Primer 13: Mišji model karageninom izazvane hiperalgezije.

[0139] Metoda: Hiperalgezija je izazvana kod ženki C57BL/6 miševa intraplantarnom injekcijom u zadnju šapu 5µl A-karagenina (2% w/v; Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA) razblaženog fiziološkog rastvora na dan 0 (videti prvu strelicu s leva na Slici 11). Intraplantarna injekcija sâmog fiziološkog rastvora nije izazvala hiperalgeziju koja se može detektovati. Odgovori na stimulus infracrvenom toplotom, mereni kao latencija u odmicanju šape, određeni su upotrebom Hargreaves-ovog testa (IITC Life Science, Woodland Hills, CA). Intenzitet svetlosnog snopa je izabran da izazove vreme latencija odmicanja usled toplote od približno 8 sekundi u početnom stanju. Latencije odmicanja u početnom stanju su određene tri uzastopna dana. Kod miševa je razvijena hiperalgezija koja je evidentirana smanjenjem latencije odmicanja koja je trajala najmanje 10 dana posle injekcije karagenina. Na dan 6 miševi su dobili jednu intratekalnu injekciju ili fuzionog proteina IL4-IL10 (40, 100, i 200 ng), ili rastvor koji sadrži kombinaciju IL4 (100 ng) i IL10 (100 ng) u slobodnom obliku, ili vehikulumu (fiziološkom rastvoru).

[0140] Rezultati: Rezultati pokazuju da, u odnosu na kontrolnu situaciju (tretiranje vehikulumom), tretiranje bilo sa fuzionim proteinom IL4-IL10 ili sa kombinacijom IL4 i IL10 u slobodnom obliku, proizvodi značajno smanjenje hiperalgezije. Međutim, primećeno je da tretiranje fuzionim proteinom IL4-IL10 ispoljava mnogo veće inhibitorsko dejstvo na hiperalgeziju nego tretiranje zasnovano na kombinaciji IL4 i IL10 u slobodnom obliku. Takođe je primećeno da jedno doziranje fuzionog proteina IL4-IL10 deluje na hiperalgeziju vremenski mnogo duže nego delovanje ekvivalentnog doziranja pojedinačnih citokina (tj., kombinacija IL4 i IL10 u slobodnom obliku).

Primer 14. Dejstvo IL4-IL10 fuzionog proteina na LPS-om izazvano stvaranje TNF u kulturi cele krvi.

[0141] Metoda: Lipopolisaharidom (LPS) izazvano oslobađanje citokina (TNFα) u celoj krvi je upotrebljeno kao funkcionalna analiza za delovanje fuzionog proteina IL4-IL10. Heparinizovana krv čoveka je dobijena od zdravih volontera i razblažena 1 prema 10 u RPMI 1640 medijumu kulture (Glutamax; Invitrogen, Cat# 61870010) kome je dodat Pen/Strep (PAA Laboratories, Pasching, Austria; Cat# P11-013). Dodat je LPS (Lipopolysaccharide; Sigma; Cat# L4391) kako bi se postigla krajnja koncentracija od 10 ng/ml. Testirana su četiri različita uzorka (pula) koji sadrže različite konstrukte fuzionog proteina IL4-IL10. Razlika između uzoraka leži u načinu na koji je IL4 vezan za IL10 (tj., IL4 cterminalni vezan za n-terminalni IL10 ili obrnuto). Različiti konstrukti su dodati sa krajnjom koncentracijom od 2, 10, 20, 30, 40, i 50 ng/ml. Kultura cele krvi je tada inkubirana tokom 18 sati na 37°C, posle čega je supernatant bio sakupljen, čuvan -80°C dok nije testiran na sadržaj TNFα, Nivoi TNFα u supernatantima su mereni upotrebom ELISA (kako je prethodno opisano u primerima 2 i 5).

[0142] Rezultati: Rezultati su prikazani kao % inhibicije stvaranja TNFα. U odsustvu fuzionog proteina IL4-IL10, nije primećena inhibicija stvaranja TNFα. Uzorci 2 i 4, gde je IL4 c-terminus vezan za n-terminus IL10, pokazali su najveću inhibiciju stvaranja TNFα u poređenju sa uzorcima 1 i 3, gde je IL10 c-terminus vezan za n-terminus IL4 (upotrebljeni u istoj koncentraciji). Ovi rezultati ukazuju da funkcionalnost fuzionog proteina IL4-IL10 zavisi od načina na koji su odvojeni citokini vezani u fuzionom proteinu IL4-IL10.

LISTING SEKVENCI

[0143]

4

Claims

Patentni zahtevi

1. Fuzioni protein koji sadrži interleukin 4 i interleukin 10 za upotrebu u prevenciji ili lečenju osteoartritisa; hroničnog bola ili stanja okarakterisana lokalnom ili sistemskom upalom, imunskom aktivacijom i/ili limfoproliferacijom odabranom iz grupe koju čine sepsa, sindrom akutnog plućnog edema kod odraslih osoba, alo- i ksenotransplantacija, dermatitis, upalna bolest creva, sarkoidoza, alergije, psorijaza, ankilozirajući spondiloartitis, autoimunske bolesti, glomerolonefritis, imuno kompleksi i drugi oblici vaskulitisa, multipla skleroza, Sjogren's-ova bolest, giht, limfoproliferativne bolesti kao što je ne-Hodgkin-ov limfom i hronična limfocita leukemija, opekotine, multiple traume, moždani udar, infarkt miokarda, ateroskleroza, dijabetes melitus, ekstrakorporealna dijaliza i oksigenacija krvi, ishemijsko-reperfuzione povrede, toksičnost indukovan in vivo administracijom citokina ili terapeutskim monoklonalnih antitela, sindom hroničnog i neuropatskog i/ili inflamatornog bola.

2. Fuzioni preotein za upotrebu prema zahtevu 1, koji sadrži još i polipeptidnu sekvencu odabranu iz grupe koju čine signalna sekvenca, Histidinski-tag i fragment Fc antitela.

3. Fuzioni preotein za upotrebu prema jednom od zahteva 1-2, gde je interleukin 4 je povezan za N-terminal interleukina 10, po izboru preko linkera.

4. Fuzioni protein za upotrebu prema jednom od zahteva 1-2, gde interleukin 10 je povezan za N-terminal interleukina 4, po izboru preko linkera.

5. Fuzioni protein za upotrebu prema jednom od zahteva 1-4, koji sadrži i jednu ili više hemijskih modifikacija odabranih iz grupe koju čine glikozilovanje, fukozilovanje, sialilovanje i pegilovanje.

6. Fuzioni protein za upotrebu prema jednom od prethodnih zahteva, gde dati interleukin 10 je humani interleukin 10.

7. Fuzioni protein za upotrebu prema jednom od prethodnih zahteva, gde dati interleukin 4 je humani interleukin 4.

8. Fuzioni protein za upotrebu prema jednom od zahteva 1-7, pri čemu fuzioni protein ulazi u sastav farmaceutske kompozicije koja sadrži fuzioni protein i farmaceutski prihvatljiv nosač.

4

9. Vektor genske terapije koji sadrži polinukleotid koji kodira fuzioni protein prema jedno od prethodnih zahteca za za upotrebu u prevenciji ili lečenju osteoartritisa; hroničnog bola ili stanja okarakterisana lokalnom ili sistemskom upalom, imunskom aktivacijom i/ili limfoproliferacijom odabranom iz grupe koju čine sepsa, sindrom akutnog plućnog edema kod odraslih osoba, alo- i ksenotransplantacija, dermatitis, upalna bolest creva, sarkoidoza, alergije, psorijaza, ankilozirajući spondiloartitis, autoimunske bolesti kao što je sistemski eritematozni luous i reumatoidni artritis, glomerolonefritis, imuno kompleksima-indukovan vaskulitis i drugi oblici vaskulitisa, multipla skleroza, Sjogren's-ova bolest, giht, limfoproliferativne bolesti kao što je ne-Hodgkin-ov limfom i hronična limfocita leukemija B ćelija, opekotine, multiple traume, moždani udar, infarkt miokarda, ateroskleroza, dijabetes melitus, ekstrakorporealna dijaliza i oksigenacija krvi, ishemijsko-reperfuzione povrede, toksičnost indukovan in vivo administracijom citokina ili terapeutskim monoklonalnih antitela, sindom hroničnog i neuropatskog i/ili inflamatornog bola.