RS57506B1 - Protransducin b-pojačivač transfera gena - Google Patents

Description

Predmetna prijava se odnosi na peptid, na lek koji sadrži navedeni peptid, na navedeni peptid za upotrebu u genskoj terapiji, na postupak za pojačanje infekcije ćelije pomoću virusnog konstrukta dobijenog genetskim inžinjeringom, kao i na upotrebu navedenog peptida za pojačanje infekcije ćelije virusom.

Značaj genetskog inžinjeringa porastao je tokom poslednjih godina, usled ogromnog napretka primenjenih postupaka, jer se predviđa da će za terapiju brojnih bolesti biti veoma relevantna ne samo proizvodnja proteinskih/peptidnih aktivnih supstanci, već i transfekcija ćelija stabilnim genima, kao laboratorijski instrument i konačno, uvođenje gena u ćeliju kao lek za genske defekte.

Uvođenje genetskog materijala za izmenu specifičnih ćelijskih funkcija postalo je nezamenljiv instrument u fundamentalnom i primenjenom istraživanju u biomedicinskim naukama, od kloniranja prvih ljudskih gena i rekombinantne proizvodnje, budući da postupci genskog transfera stalno napreduju i postaju sve efikasniji. Brojni postupci uvođenja gena doveli su do optimizacije. Kroz mnogo godina istorije, koja se na početku odvijala veoma sporo, sakupljen je veliki broj odgovarajućih iskustava.

Čak i pre nego što je tačno razjašnjena funkcija dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) 1953. godine istraživanjem F. Krika i Dž. Votsona, F. Grifit je, krajem 20-ih godina XX veka uspeo u svojim eksperimentima da transformiše apatogene sojeve roda Pneumococcus u patogene. Ova transformacija je bila posledica srećnih okolnosti, jer su pneumokoke pokazivale retku prirodnu sposobnost asimilacije (usvajanja) DNK. Specifično uvođenje DNK u prokariote postigli su J. Lederberg, M. Delbrik i S. Luria, među ostalima, pomoću faga, što predstavlja takozvanu transdukciju. Sa uspostavljanjem gajenja ćelija u kulturi, tj. gajenja eukariotskih ćelija in vitro, razvijen je veći broj fizičkih i hemijskih postupaka za transfekciju. Fizički postupci, koji se češće koriste, ali zahtevaju skuplju opremu, obuhvataju elektroporaciju i mikroinjekciju; oni se takmiče sa hemijskim postupcima koji su jednostaviniji za primenu, kao što su postupak precipitacije kalcijum fosfatom koji je bio uobičajen 80-ih godina XX veka i koji se koristi i danas, ili postupci koji su bili široko rasprostranjeni ranih 1990-ih godina, a koji su bili zasnovani na katjonskim lipidima ili katjonskim polimerima. Međutim, upotreba ovih postupaka uvek je zavisila od ćelija ili DNK. Takođe, DNK koja je uvođena u ćelije generalno je bila ekstrahomozomska (prolazna transfekcija) te se stoga nije prenosila na ćelije potomke. Međutim, za fage (npr. lamda fag) je bilo poznato da su u stanju da integrišu sopstveni DNK u genom ćelije domaćina (profag, put lizogene infekcije). Odatle je put do ideje upotrebe retrovirusa kao genskih vektora bio veoma kratak (1981/1982) ("Establishing of retroviruses as gene vectors", Doehmer et al., & Tabin et al.) Virusi su species-specifični i specifični za određene organe i(li) tkiva, što je razlog zašto ne inficiraju svi virusi sve (eukariotske) ćelije. Smatra se da razlike u virusnom omotaču (razmena glikoproteina, tzv. pseudotipični virusi) i dodavanje uglavnom katjonskih peptida unapređuju efikasnost transdukcije.

Prvi pojačivači unosa virusa u ćelije privukli su pažnju prilikom proučavanja HIV-a. U toku analize in vitro infekcije pomoću specifičnog ćelijskog testa, uočeno je da peptidi iz krvnog filtrata inhibiraju fuziju HIV-a (Münch et al., VIRIP).

Pokazano je da ovi fragmenti proteina, koji se, što je iznenađujuće, javljaju u prirodi, grade fibrozne strukture koje služe kao pojačivači funkcije ljudske sperme, "Semen-derived Enhancer of Virus Infection" (pojačivači virusnih infekcija dobijeni iz sperme, SEVI) koji se karakterišu kao amiloidni fibrili. Ovi nanofibrili pospešuju pričvršćavanje virusa za ciljne ćelije, čime povećavaju stopu virusne infekcije nekoliko desetina puta.

Ovo je iskorišćeno za unapređenje transfera retrovirusnih gena za potrebe fundamentalnih istraživanja, kao i za moguće buduće terapeutske primene. Tako je bilo moguće pokazati da letivirusni i gama-retrovirusni vektori, koji se koriste za gensku terapiju, pokazuju mnogostruko veću stopu transfera gena u prisustvu SEVI proteina kod različitih tipova ćelija, kao što su humane T ćelije, ćelije karcinoma grlića materice, ćelije leukemije, hematopojetične matične ćelije i embrionalne matične ćelije (Wurm et al., J. Gene Med.2010, 12, 137-46; Wurm et al., Biol. Chem.2011, 392, 887-95).

Istraživanja koja su se bavila razvojem daljih pojačivača, kao što su SEVI i seminogelin, dovela su do pretpostavke da peptidi iz proteina virusnih omotača takođe mogu da budu pogodni kao pojačivači transfekcije, što je dovelo do iznenađujućeg, neočekivano velikog uspeha (Maral Yolamanova, Nature Nanotechnology, tom 8, br.2, str.130-136). Tako je pokazano, na primer, da virusi HIV-a prethodno inkubirani sa različitim koncentracijama (1-100 µg/ml) protransducina A (sinonim: EF-C) pokazuju nekoliko desetina puta veću stopu infekcija reporterskih ćelija. Što se tiče mehanizma dejstva, pretpostavljeno je da EF-C formira fibrilarne strukture koje su u stanjju da se vežu i da koncentruju viruse, te shodno tome da amplifikuju njihov ulazak u ćelije. Uz infekcije virusnim česticama, EF-C pojačava transdukciju lentovirusnih i retrovirusnih ćelija sa visokom efikasnošću, u širok spektar vrsta humanih ćelija (T ćelije, glije, fibroblasti, hematopojetičke matične ćelije) koje se primenjuju u genskoj terapiji (Jan Münch et al., Nature Nanotechnology, tom 8, br 2, str. 130-136). EP 2 452 947 A1 se takođe odnosi na protransducin A.

Zbog sve većeg značaja genetičke tehnologije, koja je prethodno opisana, poželjni su delotvorniji pojačivači genskog transfera. Cilj predmetnog pronalaska je da obebedi poboljšan pojačivač genskog transfera.

Pronađeno je, što je predstavljalo iznenađenje, da peptid sa sekvencom

X-Glu-Cys-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln (sekv. sa ID br.: 1),

u kome grupa X-Glu predstavlja piroglutaminsku kiselinu

postiže cilj predmetnog pronalaska.

Pronađeno je, što je predstavljalo iznenađenje, da upravo modifikacija N-terminalnog kraja piroglutaminskom kiselinom in vitro (bez ćelijskih uticaja, posebno prisustva enzima) dovodi do ogromnog povećanja stabilnosti protransducina u vodenom rastvoru. Ovo je jasno iz rezultata prikazanih na slici 1.

U levoj koloni na slici 1 (HPLC hromatogram), dati su rezultati za protransducin A nakon 0-13 dana čuvanja na �20 °C i na 4 °C (13 dana), upoređeni sa rezultatima za protransducin B pod istim uslovima. Jasno je da se protransducin A degradira skoro do polovine početne količine na 4 °C u toku 13 dana, dok se protransducin B skoro uopšte ne degradira pod istim uslovima čuvanja (visina maksimuma odgovara koncentraciji sastojaka sadržanih u uzorku).

U publikaciji Journal of Biological Chemistry, tom 286, br. 45, str. 38825-38832, S. Jawhar et al. su objavili istraživanje o stanju tehnike u vezi sa amiloidnim peptidima, posebno amiloidnim polipeptidima modifikovanim piroglutamatom. Takvi amiloidni polipeptidi imaju veliki broj aminokiselina i suštinski se ne mogu porediti sa kratkolančanim peptidima, kojima pripadaju i peptidi prema predmetnom pronalasku. Slučajno, ovaj kratki pregled odnosi se na ćelijske događaje koji se odvijaju u in vivo uslovima u prisustvu enzima, što nije ni na koji način uporedivo sa uslovima u kojima je stabilnost protransducina poboljšana u skladu sa predmetnim pronalaskom, tj. u in vitro uslovima.

Peptid prema predmetnom pronalasku takođe može da se koristi kao lek. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na upotrebu peptida prema predmetnom pronalasku u genskoj terapiji za lečenje bolesti koje se mogu lečiti genskom terapijom.

Predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupak za pojačanje infekcije ćelije virusom koji podrazumeva korake:

- obezbeđenja peptida prema patentnom zahtevu 1 rastvorenog u organskom rastvaraču;

- dodavanja peptida u vodeni rastvor kako bi se dobili nerastvorni agregati datog peptida;

- mešanja rastvora iz prethodnog koraka; i

- gajenja ćelija u kulturi.

Predmetni pronalazak se takođe odnosi na upotrebu peptida prema predmetnom pronalasku za unapređenje infekcije ćelije virusom. Konačno, takođe se traži zaštita za komplet koji sadrži peptid prema predmetnom pronalasku.

Peptid prema predmetnom pronalasku (protransducin B) može da se dobije, na primer, u postupku u skladu sa Merifildovom sintezom sa Fmoc-zaštićenim aminokiselinama.

Ovaj postupak podrazumeva korišćenje Fmoc-zaštićenih derivata, tj. (9-fluorenilmetoksikarbonil)-zaštićenih aminokiselina, u sintezi na čvrstoj fazi u koracima u skladu sa Merifildovim principima, posebno na Vang smoli na koju je prethodno nanesen Fmoc-L-glutamin (0,59 mmol/g, mreža 100-200) kao čvrstoj podlozi za sintetizator ABI-433.

Aktivacija F-moc aminokiselina, koje su obično korišćene u desetostrukom molarnom višku izvodi se uz pomoć (1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronijum heksafluorfosfata (HBTU, 100 mmol/l) uz dodatak 0,5 M 1-hidroxibenzotriazola (HOBt) i 2 M diizopropiletilamina (DIEA) u N-metil-2-pirolidinonu (NMP) na sobnoj temperaturi.

Pojedinačne reakcije acilovanja traju 45 minuta, a uklanjanje Fmoc zaštitne grupe 20% piperidinom traje 15 minuta.

Za sintezu se koriste sledeći derivati aminokiselina i srodne ortogonalne zaštitne grupe za bočne lance koje je moguće hidrolitički ukloniti kiselinom:

Fmoc-L-Asn(Trt), Fmoc-L-Cys(Trt), L-pGlu, Fmoc-L-Gln(Trt), Fmoc-L-Ile, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-L-Met i Fmoc-L-Trp(Boc).

Nakon hidrolitičkog razdvajanja oslonca (baze) od peptidilne smole pomoću 94% trifluorsirćetne kiseline (TFA), 3% etanditiola (EDT) i 3% demineralizovane vode, sirovi peptid precipitira pomoću hladnog terc-butil metil etra, potom se sirovi peptid odvaja centrifugiranjem u vidu taloga a supernatant se odbacuje.

Hromatografsko prečišćavanje sirovog peptida koje sledi se izvodi preparativnom hromatografijom uz gradijentnu eluciju.

Razlika između protransducina A iz EP 2452947 A1 i protransducina B leži u činjenici da je umesto sintetskog L-glutamina (Gln) u protransducin B uvedena sintetska L-piroglutaminska kiselina (pGlu) na N-terminalnom kraju. Originalni glutamin modifikovan je zatvaranjem prstena, gradeći laktam.

Prečišćavanje:

Preparativno razdvajanje: prečišćavanje se izvodi pomoću HPLC proizvođača Gilson. UV/Vis detektor je proizvođača Kronwald a razdvajanje se detektuje na talasnoj dužini od 230 nm. Brzina protoka je 40 ml/min.

Kolona je sa punjenjem Waters Prep-Pak C18 (47 x 300 mm).

Eluent A: 0,1% TFA u demineralizovanoj vodi; eluent B: 0,1% TFA u 80% acetonitrila i 20% demineralizovane vode.

Gradijent za protransducin B je 35-55% eluenta B za 40 minuta, odnosno 0,5% eluenta B u minutu.

Protransducin B se eluira na 40% eluenta B i sakuplja u nekoliko frakcija od 0,5 do 1 min. Analitički čiste frakcije se spajaju i liofilizuju.

Obrada za potrebe primene:

Liofilizacija:

Jedinica Epsilon 1/45 proizvođača Christ, čije su tehničke karakteristike date u nastavku, koristi se za liofilizaciju: površina police 3,78 m<2>; kapacitet za led oko 60 kg; učinak kondenzatora leda maksimalno 45 kg/24 h; konačan parcijalni pritisak vakuum pumpe 1 x 10<�3>/10<�4>mbar sa/bez gasnog balasta; podaci o liofilizaciji (jedinicom se upravlja ručno, sa gasnim balastom): konačni parcijalni pritisak 1 x 10<�2>mbar; temperatura kondenzatora za led �50 °C; temperatura police 15 °C; operativna tačka zagrevanja police 0,5 mbar; vreme liofilizacije do 3 dana.

Transdukcija ćelija protransducinom B

Rastvoriti 0,5 mg protransducina B u 50 µl DMSO. Potom dodati 450 µl PBS-a u taj rastvor, vlakna će se formirati u roku od 3 minuta. Dodati ovaj štok rastvor (1 mg/ml) u vektore kako bi se dobila koncentracija protransducina B od 25 µg/ml. Izmešati rastvor na vorteksu tokom 1 minuta, potom centrifugirati na 5000 g 5 minuta. Supernatant se odbacuje a talog se suspenduje u maloj količini PBS-a i dodaje u ćelije. Ćelije se inkubiraju u inkubatoru 2 dana.

Brzina transdukcije je značajno povećana u prisustvu transducina B. Moguće je izvršiti transdukciju u do 96% ćelija pomoću transducina B.

Spisak sekvenci:

<110> Pharis Biotec GmbH

<120> Protransducin B, pojačivač genskog transfera

<130> 140997wo

<150> EP13166266.0

<151> 2013-05-02

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> veštački peptid

<220>

<223> N-terminal blokiran

<400> 1

Glu Cys Lys Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln

1 5 10

Claims (6)

Patentni zahtevi

1. Peptid naznačen time što ima sekvencu

X-Glu-Cys-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln,

u kojoj je grupa X-Glu piroglutaminska kiselina.

2. Lek naznačen time što sadrži peptid iz patentnog zahteva 1.

3. Peptid prema patentnom zahtevu 1 za upotrebu u genskoj terapiji za lečenje bolesti koje se mogu lečiti genskom terapijom.

4. Postupak za pojačanje infekcije ćelije virusom naznačen time što podrazumeva korake:

- obezbeđenja peptida iz patentnog zahteva 1 rastvorenog u organskom rastvaraču; - dodavanja peptida u vodeni rastvor kako bi se dobili nerastvorni agregati datog peptida;

- mešanja rastvora iz prethodnog koraka; i

- gajenja ćelija u kulturi.

5. Upotreba peptida iz patentog zahteva 1 in vitro za unapređenje infekcije ćelije virusom.

6. Komplet naznačen time što sadrži peptid iz patentnog zahteva 1.