RS57530B1 - Postupak dobijanja fruktoze - Google Patents

Description

Predmetni pronalazak se odnosi na postupak za dobijanje D-fruktoze od D-glukoze.

Za industrijsku proizvodnju D-fruktoze, konvencionalno je korišćen dvostepeni postupak u kojem se D-glukoza dobija hidrolizom polisaharida, npr. skrob, pripremljen, a zatim se izvodi izomerizacija ovako dobijene D-glukoze u D-fruktozu. Izomerizacijom D-glukoze može se dobiti 42% D-fruktoze, 50% D-glukoze i oko 8% rezidualnih polisaharida. Problem s tim je što izolovanje čiste D-fruktoze iz ove smeše zahteva složene i skupe tehnike prečišćavanja.

Alternativa dobijanja D-fruktoze izomerizacijom D-glukoze je postupak u kojem se D-glukoza pretvara u D-fruktozu u jednom enzimskom i jednom hemijskom koraku.

Sve u svemu, poznat je veliki broj različitih metoda za proizvodnju D-fruktoze iz D-glukoze.

Recimo, poznata je redukcija D-glukozona u D-fruktozu, koja je u većini slučajeva izvedena hemijski, kako je opisano na primer u EP1048672. U ovom postupku, D-fruktoza je dobijena katalitičkim hidrogenizacijom rastvora glukozona sa visokim sadržajem suve materije, primenom specifičnih pritiska i temperature.

U U.S. Pat. br.4,321,324, opisano je dobijanje D-glukozona iz D-glukoze u enzimskom koraku, gde je D-glukoza oksidovana u D-glukozon preko piranoza-2-oksidaze i nascentni vodonik peroksid je odvojen pomoću semipermeabilne membrane.

Redukcija D-glukozona u D-fruktozu enzimskom reduktazom je opisana npr. u knjizi " Microbial Transformation of non-steroid cyclic compounds" by Kieslich, Georg Thieme Publishers, Stuttgart 1976, i u Biochem J.1997 Sep.15; 326 683-92, opisano je da ksiloza reduktaza iz Candida tenuis može da redukuje D-glukozon u D-fruktozu.

Proizvodnja D-fruktoze izomerizacijom D-glukoze u dva koraka (enzimski i hemijski) opisana je npr. u US4246347. Prema opisanom postupku, D-glukoza je prvo enzimski konvertovana D-glukozon dejstvom piranoza-2-oksidaze. Dobijen vodonik peroksid je odvojen i ponovo upotrebljen ili razložen katalazom. U drugom koraku je pretvoren D-glukozon hidrogenizacijom u D-fruktozu. U ovom postupku, iskorišćeno je 2% glukoze i izvode se dva koraka odvojeno. Problemi koji prate ove procedure su visok pritisak i visoke temperature kao i niske koncentracije supstrata.

Poznati postupci za dobijanje/izomerizaciju D-fruktoze iz D-glukoze obično imaju različite nedostatke. Na primer, efikasna konverzija supstrata sa visokom selektivnošću obično je moguća samo uz primenu visokih pritisaka i temperatura i ne može se lako izbeći obrazovanje kontaminiranih sporednih proizvoda, koji se teško odvajaju.

Neočekivano je pronađen postupak koji omogućava efikasnu konverziju supstrata sa visokom selektivnošću i bez upotrebe visokih pritisaka i temperatura, pri čemu se u velikoj meri se izbegava formiranje kontaminiranih sporednih proizvoda, tako da nije neophodno odvajanje substrata od proizvoda i može se izbeći upotreba složenih i skupih tehnika prečišćavanja.

U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za dobijanje D-fruktoze iz D-glukoze koji je okarakterisan time što se reakcija odvija u jednom balonu (one-pot synthesis)

a) D-glukoza je oksidovana dejstvom piranoza-2-oksidaze u D-glukozon i

b) D-glukozon je enzimom reduktazom redukovan u D-fruktozu, gde se posebno u koraku b) koristi redoks kofaktor.

Postupak opisan predmetnim pronalaskom se navodi kao postupak prema predmetnom pronalasku.

Prema tome, predmetni pronalazak se odnosi na postupak za dobijanje D-fruktoze iz D-glukoze u reakciji koja se dobija u jednom balonu u dva enzimska koraka:

Enzimska oksidacija D-glukoze u D-glukozon, praćeno enzimskom redukcijom D-glukozona u D-fruktozu, koja se odvija prema reakcionoj shemi 1

Postupak prema predmetnom pronalasku obezbeđuje novu mogućnost enzimskog odbijanja D-fruktoze bez potrebe za odvojenjem i prečišćavanjem rezidualne D-glukoze. U poređenju sa trenutno korišćenim tehnikama, ovaj pronalazak predstavlja značajno poboljšanje postupka proizvodnje D-fruktoze iz D-glukoze. Za razliku od postojećih procesa, jedinjenja su oba enzimski oksidovana i enzimski redukovana bez potrebe za izolovanjem intermedijarnog proizvoda. Istovremeno se mogu koristiti znatno veće koncentracije supstrata, a može se postići i veća konverzija nego što je to moguće u prethodno primenjivanim postupcima.

Pogodni izvori D-glukoze u postupku prema predmetnom pronalasku su, na primer, enzimski ili ne-enzimski hidrolizati skroba, posebno kukuruznog skroba, enzimskih ili ne-enzimskih hidrolizata saharoze ili enzimskih ili neenzimskih hidrolizata celuloze. Celuloza koja se može upotrebiti u postupku predmetnog pronalaska može se dobiti, na primer, iz biomase, poželjno iz lignocelulozne biomase, kao što su drvo, slama, kao što je slama pšenice, slama od kukuruza, bagase, sisal, energetske kulture/trave. Za enzimsku hidrolizu kukuruznog skroba, kogu se koristiti B. amilaze. Za enzimsko cepanje saharoze mogu se koristiti B. invertaze. Za enzimsko cepanje celuloze mogu se koristiti B celulaze. Na primer, cepanje katalizovano kiselinama pogodno je za neenzimsko cepanje pomenutih višestrukih šećera.

Postupak prema predmetnom pronalasku, poželjno se izvodi u vodenom sistemu. Takođe je moguće dodati pufer (sistem) u vodeni sistem. Poznati puferi (sistemi) su poznati i uključuju konvencionalne pufere (sisteme), na primer, acetat, kalijum fosfat, Tris-HCl i puferi glicina. Poželjno, pufer koji se koristi u postupku predmetnog pronalaska ima pH od 5 do 10,5, poželjno od 6 do 9,5. Za stabilizaciju enzima, u vodeni sistem mogu se dodati stabilizatori, npr. konvencionalni stabilizatori, kao što su joni, npr. Mg<2+>ili drugi aditivi, npr. dodaju se konvencionalni aditivi, kao što je glicerol.

U postupku prema predmetnogm pronalasku, potreban je kiseonik za oksidaciju D-glukoze u D-glukozon. Ovaj kiseonik se može uvesti kao i obično i npr. obezbediti kontaktom sa ambijentalnim vazduhom ili povećanim dotokom kiseonika, na primer komprimovanim vazduhom ili uvođenjem čistog kiseonika.

Ovde opisan postupak izvodi se na odgovarajućim temperaturama, npr. mogu zavisiti od upotrebljenih enzima. Pogodne temperature uključuju 10°C do 70°C, poželjno 20°C do 50°C, npr.20°C do 45°C. Postupak u kojem se reakcija oksidacije i reakcija redukcije odvija u jednom sudu bez izolovanja intermedijera, posebno kada su u formiranje proizvoda uključene dve enzimske redoks reakcije i enzimskim sistem kao kofaktor regeneracije može se izvesti u jednoj reakcionoj seriji bez izolovanja intermedijarnog proizvoda, a koji se ovde označava kao “sinteza u jednom balonu” (one-pot synthesis). U ovom slučaju, ili se istovremeno dodaju svi potrebni enzimi ili se prvo doda samo porcija enzima, na primer enzim (a) za korak a) i, u vremenskom zaostatku, drugi deo enzima, npr. enzim(i)za korak b). Pre dodavnja druge porcije enzima, enzimi koji su već prisutni u reakcionoj smeši, mogu biti inaktivirani, na primer, konvencionalnom metodom, npr. povećanjrm temperaturr, na primer do 65°C tokom 10 minuta.

U određenom aspektu, postupak prema predmetnom pronalasku okarakterisan je time što se proces izvodi bez izolovanja intermedijera. Oksidacija D-glukoze u D-glukazon u postupku prema predmetnom pronalasku će biti izvedena enzimski, odnosno enzimskom katalizom, a može se izvesti prema poznatom postupku. Korak oksidacije prema pronalasku se vrši katalizom sa oksidazom, posebno piranoza-2-oksidazom. Piranoza-2-oksidaze su poznate i uključuju oksidaze kao što su Coriolus sp., Aspergillus sp. ili Poliporus obtusus.

Tokom reakcije piranoze-2-oksidaze dolazi do izdvajanja H2O2, koji se uklanja iz reakcione smeše. Uklanjanje H2O2može se izvesti konvencionalnim postupcima i poželjno se izvodi enzimski, npr. uz pomoć katalaze. Na primer, katalaza se dodaje u reakcionu smešu.

Poseban izvođenje postupka prema predmetnom pronalasku je okarakterisano time što se nascentni H2O2uklanja pomoću katalaze.

Pogodne katalaze su poznate i dostupne su, na primer, iz Aspergillus sp., Corinebacterium glutamicum ili iz jetre goveda. Reakciju enzimske redukcije D-glukozona u D-fruktozu u postupku prema predmetnom pronalasku, može se izvesti odgovarajućom metodom, npr. konvencionalnom metodom ili kako je ovde opisano.

Kao enzimi koji su pogodni za redukciju substrata mogu se koristiti kao wnzimi za redukciju. Pogodni enzimi uključuju, na primer, reduktaze, posebno reduktaze ksiloze. Pogodne kiloza reduktaze su poznate i dostupne, na primer, od Candida tropicalis, Candida parapsilosis ili Debariomices hansenii. Posebna realizacija postupka prema predmetnom pronalasku je okarakterisana time što se ksiloza reduktaza koristi za redukcije D-glukozona u D-fruktozu.

U postupku prema predmetnom pronalasku, redoks-kofaktor, poželjno se koristi naročito NAD(P)/NADH(P)<+>, odnosno NAD(P)H, posebno kao redoks kofaktor za redukciju D-glukozona u D-fruktozu. U tom smislu, NAD označava oksidovani oblik i NADH označava redukovani oblik nikotinamid adenin dinukleotida, dok NADP+ je oksidovani oblik, a NADPH redukovani oblik nikotinamid adenin dinukleotid fosfata. Koristeći ćelijski lizat mikroorganizma koji eksprimiraju uključene enzime, npr. E. coli, kao što je E. coli BL21 (DE 3), koji sadrži potrebni NAD(P), u nekim slučajevima može se izbeći dodavanje skupog kofaktora. Ako su tokom konverzije D-glukoze u D-fruktozu dodati redoks kofaktori NAD(P)+ i/ili NAD(P)H, dodata koncentracija obično iznosi od 0,001 mM do 10 mM, poželjno od 0.01mM do 1mM, u postupku prema predmetnogm pronalasku.

Posebna izvođenja postupka prema predmetnom pronalasku su okarakterisana time, što se tokom redukcije D-glukozona koriste redoks kofaktori, naročito NAD(P)H, a posebno da se koristi enzim koji se koristi u koraku b) koji je NADP(H)-zavisan.

Redoks kofaktori se mogu regenerisati pomoću odgovarajućeg sistema regeneracije kofaktora, naime mogu se podvrgnut reciklovanju, pri čemu su kofaktori konvertovani nazad u prvobitno oblik.

Poseban način izvođenja postupka prema predmetnom pronalasku okarakterisan je time što se korišćeni redoks kofaktori podvrgavaju recikliranju, posebno odgovarajući sistemom regeneracije kofaktora.

Regeneracija redoks kofaktora generalno zahteva prisustvo odgovarajućeg ko-supstrata koji se koristi tokom regeneracije redoks kofaktora. Ko-supstrati koji se mogu koristiti, na primer, ako se koristi ko-faktori NAD(P)H/NAD(P uključuju, npr. alkohole kao što je izopropil alkohol (2-propanol, IPA), mlečna kiselina i njene soli, piruvinska kiselina i njene soli, kiseonik, vodonik i/ili mravlja kiselina i njene soli.

U određenom aspektu, postupak predmetnog pronalaska je okarakterisan time što je redoks kofaktor u upotrebi kofaktora NAD(P)H/NAD(P , posebno u redukciji D-glukozona, koristeći ko-supstrat, posebno odabran od alkohola, mlečne kiseline i njegovih soli, piruvinske kiseline i njegovih soli, kiseonika, vodonika i / ili mravlje kiseline i njihovih soli.

Posebna realizacija postupka prema predmetnom pronalasku je okarakterisana time pto se korist ko-substrat za regeneraciju redoks kofaktora, posebno za redukciju D-glukozona u D-fruktozu.

Za regeneraciju redoks kofaktora koristi se redoks enzim. Redoks enzimi koji se uzimaju u obzir kao redoks kofaktori ako se koriste NAD(P)H/NAD(P)+ uključuju na primer, dehidrogenaze, npr. alkohol dehidrogenazu, laktat dehidrogenazu, format dehidrogenazu, a poželjno alkohol dehidrogenaze. Odgovarajuće alkohol dehidrogenaze se mogu dobiti od Lactobacillus kefira.

U daljem posebnom aspektu postupka predmetnog pronalaska, redoks kofaktor je regenerisan pomoću redoks enzima, a naročito dejstvom alkohol dehidrogenaze.

Upostupku prema predmetnom pronalasku, se mogu upotrebiti enzimi kao tkavi, po izboru u obliku ćelijskih lizata, opciono kao rekombinantno prekomerno eksprimirani proteini, na primer kao rekombinantno prekomerno eksprimirani proteini u E. coli, gde se prvenstveno mogu upotrebiti odgovarajući ćelijski lizati, bez dodatnog prečišćavanja. U zavisnosti od enzima koji se proizvedi, drugi mikroorganizmi se mogu koristiti za ekspresiju, npr mikroorganizmi poznati stručnjacima. U postupku prema predmetnom pronalasku, čvrste komponente odgovarajućih mikroorganizama, se mogu odvojiti ili upotrebiti u reakciji (npr, celo-ćelijski biokatalizatori). Takođe se mogu upotrebiti supernatanti kulture ili lizata dobijeni od mikroorganizama, koji već ispolajvaju dovoljnu enzimsku aktivnost bez tehnologije rekombinantne DNK. Tako, enzimska jedinica 1 U odgovara količini enzimakoja je potrebna za reakciju .mu.mol supstrata u min.

U postupku prema predmetnom pronalasku, jedan ili više enzima, i jedan ili više redoks kofaktor može se upotrebiti (a) u konverziju D-glukoze u D-fruktozu bilo u rastvoronom obliku ili imobilisani na nosačima (čvrsti).

U narednom aspektu, postupak prema predmetnom pronalasku okarakterisan je time što se odvija prema reakcionoj shemi 2 :

u kojoj LkADH označava alkohol dehidrogenazu, posebno alkohol dehidrogenazu iz Lactobacillus kefira, koja je NADP(H)-zavisna.

D-fruktoza koja je dobijena prema predmetnom pronalasku može se izolovati iz reakcione smeše, npr. konvencionalnom metodom, npr, kristalizacijom.

D-fruktoza je važan početni materijal za dalju obradu u hemijskoj industriji. Na primer, poznato je da D-fruktoza može biti dalje procesuirana u derivate furana, npr. hidroksimetilfurfural (HMF) formule

Hidroksimetilfurfural je poznat kao početni materijal za proizvodnju 2,5-furandikarboksilne kiseline (FDCA) formule

Hydroxymethylfurfural is known to be a starting product for the production of 2,5-furandicarboxylic acid (FDCA) of formula

za koje je poznato da su pogodni kao monomeri za sobijanje polimera kao što je polietilen furanoat (PEF). PEF se može koristiti slično, kao polietilen tereftalat (PET), na primer za proizvodnju šupljih oblika, posebno bočica, kao npr. Boca za piće, bočice za kozmetiku ili bočice za sredstva za čišćenje. Sa istovremenom upotrebom etilen glikola iz regenerativnih izvora i FDCA, koji je dostupan od HMF proizvedenog u postupku predmetnog pronalaska, može se dobiti PEF koji se sastoji isključivo od obnovljivih izvora sirovog materijala.

U konkretnom izvođenju postupka prema predmetnom pronalasku, proizvedena fruktoza dalje je konvertovana u derivate furana, npr. hidroksimetilfurfural (HMF) formule

U primerima koji slede, svi podaci o temperaturama su dati u stepenima Celzijusa (º C.). Enzimska jedinica "1 U" odgovara količini enzima koja je potrebna za reakciju 1 µmolof substrata u minuti.

Korišćene su sledeće skraćenice:

1

PRIMER 1

Biokonverzija D-glukoze u D-glukozu pomoću piranoza oksidaza koristeći katalazu za uklanjanje dobijenog H2O2

Serija od 0,5 ml sadrži 2,5% (t/z) D-glukoze i 1 U piranoza-2-oksidaze (Sigma Aldrich). Za konverziju H2O2dobijenog u ovoj reakciji, koristi se 50 U katalaza (Sigma Aldrich), koja konvertuje dobijeni H2O2u H2O 1⁄2 O2. Reakcija se vrši u Tris-HCl puferu (50 mM, pH 7,0) na 30°C uz neprekidno mućkanje (850 rpm). Otvoren sistem se koristi za obezbeđivanje dovoljnog dotoka kiseonika. Nakon 48 sati, 99% D-glukoze je pretvoreno u D-glukozon.

PRIMER 2

Biokonverzija D-glukozona u D-fruktozu pomožu kiloza-reduktaze korišćenjem sistema regeneracije alkohol dehidrogenaza-zavisnog kofaktora

0,5 ml smeše 2.5% (t/z) D-glukozona i 10 U rekombinantne ksiloza reduktaze iz Candida tropicalis (prekomerno eksprimirane u E. coli BL21 (DE3)). Za regeneraciju NADPH korišćeno je 10 U rekombinantne alkohol dehidrogenaze iz Lactobacillus kefira se (prekomerno eksprimirane u E. coli BL21 (DE3)) i u početku i 5% (t/z) 2-propanol. Reakcija se izovid bez dodatka NADPH-a.NA raspolaganju je kofaktor iz ćelijskog ekstrakta E. coli korišćenog za ekspresiju ksiloza reduktaze i alkohol dehidrogenaze BL21 (DE3. Reakcija se izvodi u Tris-HCl puferu (50 mM, pH 7,0) na 30°C uz konstantno mućkanje (850 rpm). Otvoren sistem se koristi da bi se omogućilo isparavanje acetona i pomeranje reakcije ka dobijanju D-fruktoze. Posle 6h dodato je još 2.5% h (t/z) IPA, zatim posle 18h još 5% IPA (t/z) i posle 24 sati još 2,5% (t/z) IPA. Nakon 48 h, 90% D-glukozona je konvertovano u D-fruktozu.

PRIMER 3

Biokonverzija D-glukoze u D-glukozon i dalje u D-fruktozu reakcijom u jednom balonu (dva uzastopna koraka bez izdvajanja intermedijer), koristeći sistem regeneracije alkohol dehidrogenaza -zavisnog kofakora

0,5 ml smeše 2.5% (t/z) D-glukoze i 1 U piranoza-2-oksidaze (Sigma Aldrich). Za konverziju H2O2dobijenog u ovoj reakciji, upotrebljeno je 50 U katalaze, koja konvertuje dobijeni H2O2u H2O 1⁄2 O2. Reakcija se vrši u Tris-HCl puferu (50 mM, pH 7,0) na 30°C uz neprekidno mušćkanje (850 rpm). Dalje, otvoren sistem se koristi za obezbeđivanje dovoljnog dotoka kiseonika. Nakon 24 sata, reakciona smeša je zagrevana na 65°C tokom 10 minuta u cilju deaktiviranja enzima. Zatim je u reakcionu smešu dodato 10 U rekombinantne ksiloza reduktaze iz Candida tropicalis (prekomerno eksprimirana u E. coli BL21 (DE3)). Za regeneraciju NADPH korišćeno je 10 U rekombinantne alkohol dehidrogenaze iz Lactobacillus kefira (prekomerno eksprimirana u E. coli BL21 (DE3)) i u početku 5% (t/z) 2-propanol. Reakcija se izvodi bez dodatka NADPH-a. Kofaktor je iz ćelijskog ekstrakta E. coli BL21 (DE3) upotrebljen za ekspresiju rekombinantne ksiloza reduktaze i rekombinantne alkohol dehidrogenaze. Reakcija se izvodi na 30°C uz neprekidno mućkanje (850 obrtaja u minuti). Otvoren sistem se koristi da bi se omogućilo isparavanje acetona i pomerila reakcija ka dobijanju D-fruktoze. Posle 6h dodato je još 2,5% (t/z) IPA, zatim posle 18h još 5% (t/z) IPA i posle 24h jos 2,5% (t/z) IPA. Posle 48 sati, 91% upotrebljene D-glukoze pretvoreno je u D-fruktozu.

Claims (11)

1. Patentni zahtevi 1. Postupak za dobijanje D-fruktoze od D-glukoze, naznačen time, što je to sinteza u jednom balonu, gde a) D-glukoza je enzimski oksidovana u D-glukozon dejstvom piranoza-2-oksidaze i b) D-glukozon je enzimski redukovan u D-fruktozu dejstvom reduktaze, pri čemu, će posebno u koraku b), biti upotrebljen redoks kofaktor.
2. 2. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time, što se izvodi bez izolovanja intermedijera.
3. 3. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time, što je nascentni H2O2uklonjen bez pomoći katalaze.
4. 4. Postupak prema jednom od zahteva 1 do 3, naznačen time, što je ksiloza reduktaza upotrebljena za redukciju D-glukozona u D-fruktozu.
5. 5. Postupak prema jednom od zahteva 1 do 4, naznačen time, što se tokom redukcije D-glukozona u D-fruktozu, koriste redoks kofactori, a posebno NAD(P)H, pri čemu je u koraku b) upotrebljen NADP(H) – zavisni enzim.
6. 6. Postupak prema jednom od zahteva 1 do 5, naznačen time, što su u reakciju D-glukoze u D-fruktozu dodati redoks kofaktori NAD(P)<+>i/ili NAD(P)H.
7. 7. Postupak prema jednom od zahteva 5 ili 6, naznačen time, što su upotrebljeni redoks kofaktori podvrgnuti reciklizaciji, posebno pogodnim sistemom regeneracije kofaktora.
8. 8. Postupak prema jednom od zahteva 5 do 7, naznačen time, što je redoks kofaktor regenerisan ukoliko se koriste kofaktori NAD(P)H/NAD(P)<+>, posebno za redukciju D-glukozona u D-fruktozu, iskorišćavajući kosubstrat, naročito odabran od alkohola, mlečne kiseline ili njenih soli, piruvinske kiseline i njenih, kiseonika, vodonika i/ili mravlje kiseline i njenih soli.
9. 9. Postupak prema jednom od zahteva 5 do 8, naznačen time, što je redoks kofaktor regenerisan dejstvom redoks enzima, posebno alkohol dehidrogenaze.
10. 10. Postupak prema jednom od zahteva 1 do 9, naznačen time, što se odvija prema sledećoj reakcionoj shemi 2

    gde LkADH označava alkohol dehidrogenazu, posebno alkohol dehidrogenazu iz Lactobacillus kefir, koja je NADP(H)-zavisna.
11. 11. Postupak prema jednom od zahteva 1 do 10, naznačen time, što je dobijena D-fruktoza dalje konvertovana u derivate furana. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5