RS57611B1 - Kompleksno mineralno đubrivo koje obuhvata mikroorganizam rhizobium leguminosarum, postupak za njegovu proizvodnju i njegove upotrebe - Google Patents

Description

Opis

Oblast tehnike pronalaska

[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na oblast đubriva na bazi mineralnih, organskih ili organo-mineralnih, azotnih, fosfatnih ili kalijumovih jedinjenja ili kompleksna đubriva, bilo da su ona NP, PK, NK ili NPK, koja su obložena sojevima vrste Rhizobium leguminosarum, koji deluju kao PGPR.

Pozadina pronalaska

[0002] Mineralna đubriva dobro su poznata u stanju tehnike kao poboljšivači rasta biljaka, a njihova upotreba je rasprostranjena među zemljoradnicima kako bi se povećao prinos velikog broja useva. Međutim, postoje zahtevi tržišta za sve efikasnijim đubrivima koja smanjuju rizik od zagađenja životne sredine, a u isto vreme postižu optimalne rezultate u usevima gde se koriste. Zbog ovog razloga, inovacija u ovoj oblasti je konstantna, pri čemu se kontinuirano traga za poboljšanjima u njihovom sastavu ili upotrebi, da bi se povećala efikasnost ove vrste jedinjenja.

[0003] Bakterijski rod Rhizobium i drugi slični rodovi (koje se uopšteno nazivaju rizobije) obično se koriste zbog njihove prirodne sposobnosti da fiksiraju azot za korenove mahunarki simbiozom kvržica. Proces je široko ispitivan od strane mnogih eksperata, a svaka od njegovih faza detaljno je opisana u mnogim knjigama i naučnim radovima (Jose Olivares Pascual, 2008). Zbog prednosti ove simbioze, inokulacija ove vrste mikroorganizma u semena mahunarki je rasprostranjena među zemljoradnicima koji uzgajaju mahunaste vrste kao što su pasulj, sočiva, leblebije, itd. Međutim, takođe je dokazano da u određenim uslovima, rizobije mogu da deluju kao promoteri (nazivaju se PGPR ili Rizobakterije koje promovišu biljni rast) razvoja žitarica i ostalih useva, povećavajući njihov prinos. PGPR su bakterije koje, u rizosfernoj ili endofitnoj asocijaciji sa biljkama, koriste usevima u pogledu rasta i zdravlja bilja.

Nedavno je navedeno da pomenuti blagotvoran efekat izazvan od strane PGPR, može da se kombinuje sa uobičajnim doziranjem đubriva kako bi se ostvario još veći porast prinosa useva (Adnan et al, 2014).

[0004] Međutim, zajednička primena Rhizobium sa đubrivom u jednoj kombinaciji podrazumeva serije problema i poteškoća koji i danas predstavljaju izazov koji se trenutnim tehnikama ne može prevazići. Do sada, Rhizobium se nikada nije primenjivao direktno na granule mineralnog đubriva, već se obično nanosio direktno na seme žitarice (Marks et al, 2013), jer su uslovi izazvani đubrivom u mnogim slučajevima smrtonosni za bakterije kada su one u direktnom kontaktu sa đubrivom. Granule đubriva uzrokuju uslove isušivanja unutar same granule, i jednom kada se nanesu u zemljište, uzrokuju visok salinitet u njenom neposrednom okruženju, uslove koji su uopšteno nekompatibilni sa opstankom bakterija. U samom đubrivu, jedinjenja se nalaze u posebno visokim koncentracijama, sa namerom širenja u okolinu granule. Zbog činjenice da su fiziohemijski uslovi nastali u okolini granule đubriva štetni za mikroorganizme, formulacije razvijene do danas samo su koristile sporogene mikroorganizme (US 8,097,280 B2).

[0005] FR2611698 A1 opisuje čvrsto đubrivo obloženo prahom mikro-inkapsuliranog inokuluma, gde se granulisano đubrivo umešava sa prahom mikro-inkapsuliranog inokuluma u bubnju sve dog mešavina ne postane homogena. Proizvod za oblaganje kao što je amin, prirodni vosak ili sintetički vosak može da se rasprši na granule đubriva.

[0006] EP 0083267 A1 opisuje postupak za pripremu inokuluma pripremanjem podloge za kulturu koja sadrži mikroorganizme roda Rhizobium i ksantan gumu i brašno rogača i sušenjem gela.

[0007] WO 2016/0074007460 A1 opisuje biološki-opterećeno suvo đubrivo koje uključuje granulu suvog đubriva i oblogu inokulisanu biološkim agensom i nanetu na granulu suvog đubriva. Biološka obloga je rastvor ili suspenzija koja obuhvata vodu ili ulje i najmanje jedan biološki agens, koji je biološka hemikalija, ekstrakt biljke, mikrobiološki agens, i/ili živ organizam.

[0008] Što se tiče koncentracije rizobija potrebnih da bi se dobili pozitivni rezultati za useve, ne postoje ispitivanja koja mogu da se ekstrapoliraju za razvoj pronalaska ove prijave. Među dostupnim približnim podacima, Hirsch, P.R.1996 spominju da doza rizobija potrebna da bi se zagarantovala nodulacija u mahunarkama predstavlja 10<4>rizobija/g zemljišta; Albareda et al.2009 navode da se, u ispitivanjima vršenim na soji, maksimalna proizvodnja postiže sa opsegom doze od 10<5>- 10<6>rizobija/seme; zauzvrat, Penna et al. tvrde da postoje određena odstupanja između autora u ustanovljenju doze Bradyrhizobia što odgovara maksimalnom broju kvržica,pri čemu je u nekim slučajevima 10<5>bakterija/seme, a u ostalim 10<6>bakterija/seme. Konačno, Herrmann et al. otkrivaju kako standardi kvaliteta inokulanata variraju od države do države, ali su uopšteno između 10<3>i 10<6>CFU/seme.

[0009] Iz ovog razloga pomenuta tehnika ima serije značajnih ograničenja čije su posledice u nekim slučajevima prilično ozbiljno, kao na primer primena ne može da se izvede u jednoj fazi, ili za usev koji koji je već nikao i koji je u njegovoj fazi rasta, ili za đubrenje zemljišta koje je namenjeno za naknadno sejanje useva. Drugi ograničavajući faktor je postupak nanošenja đubriva, pri čemu je njegov čvrsti oblik najpogodniji za željeni rezultat stimulisanja biljnog rasta, jer olakšava transport i njegovo naknadno nanošenje na useve. Prema tome, poželjno je da je poboljšivač rasta useva u čvrstom obliku, osim za mahunarke, a koji se može naneti samo jedanput, a što bi bilo ekonomski održivo, a u isto vreme bezbedno i korisno za biljke.

[0010] Ovaj pronalazak obezbeđuje efikasno rešenje ovih problema.

Suština

[0011] Uopšteno, ovaj pronalazak odnosi se na kombinaciju koja obuhvata đubrivo, poželjno mineralno đubrivo, a poželjnije kompleksno mineralno đubrivo, koje obuhvata rizosferni ili endofitni mikroorganizam sa svojstvima PGPR-a i zaštitnika da bi se osigurala vijabilnost mikroorganizama.

[0012] Tako, u prvom aspektu, ovaj pronalazak odnosi se na čvrstu kombinaciju đubriva koja obuhvata mineralno đubrivo, najmanje delimično obloženo sa rizosfernim mikroorganizmom sa sposobnošću da deluje kao PGPR koji je zaštićen najmanje jednim mikroorganizam-zaštitnim jedinjenjem da bi se omogućio njegov opstanak u fiziohemijskim uslovima tog đubriva kada se opstanak mikroorganizma ispituje prema Metodu najverovatnijeg broja, pri čemu mikroorganizam predstavlja vrste

roda Rhizobium. Tako, podrazumeva se da je "zaštitno jedinjenje" neko jedinjenje koje omogućava suštinski i/ili funkcionalni opstanak mikroorganizma u fiziohemijskim uslovima izazvanim od strane rastvorenog đubriva.

[0013] Određenije, ovaj pronalazak odnosi se na kombinaciju koja obuhvata kompleksno mineralno đubrivo, rizosferni ili endofitni mikroorganizam sa PGPR sposobnostima odabran od najmanje jednog od Rhizobium leguminosarum CECT 7685, CECT 8873, CECT 8874 ili CECT8875 sojeva deponovanih u Spanish Type Culture Collection, u bilo kojoj kombinaciji, i zaštitnik da bi se osigurala vijabilnost mikroorganizma u smislu i opstanka i funkcije, pri čemu je taj zaštitnik rogačeva guma.

[0014] U drugom aspektu, ovaj pronalazak odnosi se na postupak za proizvodnju kombinacije đubriva koji obuhvata faze:

a) uzgajanja soja na YMA čvrstoj podlozi;

b) inokulacije dobijene kulture iz faze (a) u YMB tečnoj podlozi;

c) dodavanja rogačeve gume kulturi iz faze (b); i

d) oblaganja granula mineralnog đubriva najmanje delimično kulturom iz faze (c).

[0015] U trećem aspektu, ovaj pronalazak odnosi se na postupak za poboljšanje rasta useva, koji obuhvata fazu prenošenja kombinacije opisane ovde na biljke useva.

[0016] I u četvrtom aspektu, ovaj pronalazak odnosi se na upotrebu kombinacije na ne-mahunaste useve ili na žitarice, naročito ječam i pšenicu.

Opis nacrta

[0017]

Fig.1: Primer 1: Vegetativni parametri tretmana ocenjenih na biljkama pšenice.

Fig.2: Primer 2: Sadržaj azota biomase u vazduhu biljki pšenice, 70 dana nakon setve.

Fig.3: Primer 2: Proizvodnja biomase biljki pšenice, 95 dana nakon setve.

Fig.4: Primer 3: Vegetativni parametri ocenjeni na biljkama ječma.

Fig.5: Primer 3: Sadržaj azota biljki ječma.

Fig.6: Primer 4: Prinos Core pšenice; procentualni podaci porasta prinosa zbog tretmana rizobijama u poređenju sa kontrolom, nađubrena sa 80%.

Fig.7: Primer 4: Prinos Arthur Nick pšenice; procentualni podaci porasta prinosa zbog tretmana rizobijama u poređenju sa kontrolom, nađubrena sa 80%.

Detaljan opis pronalaska

[0018] Predmet ovog pronalaska odnosi se na kombinaciju koja obuhvata đubrivo, rizosferni ili endofitni mikroorganizam sa PGPR sposobnostima, i zaštitnik da bi se osigurala vijabilnost mikroorganizma u smislu i opstanka i funkcije.

[0019] Pomenuta đubriva mogu da uključuju đubriva na bazi mineralnih, organskih ili organomineralnih, azotnih, fosfatnih ili kalijumovih jedinjenja ili kompleksna đubriva, bilo da su ona NP, PK, NK ili NPK.

[0020] Kompleksna organo-mineralna đubriva dobijaju se kombinovanjem neorganskih ili mineralnih đubriva sa organskim đubrivima. Prema tome, ona se karakterišu time što njihova kombinacija uključuje ne samo mineralne nutrijente već i organske nutrijente. Organski materijal sadržan u tom proizvodu, isključivo biljnog porekla, deluje tako što poboljšava fizičke uslove zemljišta, poboljšavajući njegovu teksturu, olakšavajući njegovu propustljivost, omogućavajući aeraciju, favorizujući mikrobiološku aktivnost (pod određenim uslovima) i povećavajući kapacitet zadržavanja vode i nutrijenata u glinahumus kompleksa. Najznačajniji efekat je taj da deluje obrazovanjem kompleksa nutrijenata đubriva, sprečavajući njihovo blokiranje u zemljištu, što čini njihovu asimilaciju od strane biljke efikasnijom.

[0021] Đubriva su proizvodi koja sadrže jedan, dva ili tri primarna nutrijenta; azot, fosfor i kalijum, a mogu takođe da sadrže sekundarne nutrijente i mikronutrijente. Koriste se radi balansa sadržaja nutrijenata zemljišta prema njihovom sadržaju, uzimajući u obzir potrebe useva koji će se posaditi i zavisno od prinosa koji se želi postići. U skladu sa potrebama useva i karakteristika zemljišta, najpogodnije đubrivo može da se odabere, sa mogućnošću da ne uključuje jedan ili više od tri osnovna elementa ukoliko to nije potrebno.

[0022] Đubriva, a naročito ona u čvrstom obliku, nanose se u dovoljno visokim koncentracijama da bi, kada se rastvore, dostigla optimalnu dozu za useve. Zbog toga, pre dostizanja optimalne doze, nastaju uslovi koji u nekim slučajevima mogu da budu toksični za mikroorganizme zbog visokih koncentracija jedinjenja i/ili visokog saliniteta koji mogu da izazovu. Uslovi koji nastaju na mestima blizu sveženanetog đubriva posebno su ekstremni, dostižući nivoe koji inicijalno sprečavaju opstanak nekih mikroorganizama.

[0023] Čvrsta đubriva čvrsto su ustanovljena za većinu useva, jer je njihov transport jednostavan a njihova ravnomerna distribucija je brza i efikasna. Iz ovog razloga, većina zemljoradnika poseduje mašine za distribuciju čvrstih đubriva. Nasuprot tome, tečna đubriva se samo koriste unutar radijusa od 200 do 300 km od fabrike đubriva, jer zahtevaju kamione cisterne za transport i specijalizovane mašine, i zbog toga što zahtevaju dodavanje vode, troškovi su značajno povećani.

[0024] Čvrsto đubrivo potpuno je ustanovljeno širom sveta, dok se u tečnom obliku samo koristi u određenim više lokalizovanim područjima. Čvrst oblik je uopšteno bogatiji od tečnog oblika. Đubriva navedena u ovoj prijavi mogu se slobodno nabaviti od kompanija specijalizovanih za ovu vrstu jedinjenja, pri čemu je njihova nabavka od strane javnosti relativno jednostavna.

[0025] Rizobakterije koje promovišu biljni rast (PGPR) su grupa bakterija koje uključuju rizobije uopšteno, a posebno Rhizobium rod, koje u rizosfernoj ili endofitnoj asocijaciji sa biljkama, imaju blagotvoran efekat na rast i zdravlje useva ne-mahunarki. Ovo se postiže širokim spektrom mehanizama: poboljšanje ishrane biljaka rastvaranjem nutrijenata koji se ne mogu apsorbovati iz zemljišta, povećanje površinske oblasti radikule, stimulisanje rasta proizvodnjom fitohormona, prevazilaženje situacija stresa zbog suše, saliniteta ili teških metala, i mnogih drugih nepovoljnih situacija.

[0026] Rhizobium rod, kao i ostali slični mikroorganizmi, nije poznat za njihovu otpornost na nepovoljne uslove, pri čemu je relativno osetljiv na okolne uslove. Kako je opisano u pozadini ove prijave, zbog činjenice da su fiziohemijski uslovi nastali u neposrednom okruženju granule đubriva štetni za mikroorganizme, formulacije razvijene do danas koriste samo sporogene mikroorganizme (US 8,097,280 B2). Zbog toga, zbog nedostatka specifičnih odbrambenih mehanizama (kao što su spore koje su karakteristika ostalih bakterijskih rodova) iznenađujuće je i a priori totalno neočekivano da su, kao rezultat podataka dobijenih u ispitivanjima, bakterije ovog roda preživele u uslovima ekstremnim kao što su oni izazvani đubrivima. Postoji mogućnost upotrebe ostalih bakterijskih vrsta sa PGPR svojstvima, čime se obezbeđuje da su blagotvorna na useve i da izdržavaju uslove izazvane od strane đubriva. Za kombinaciju, serije Rhizobium leguminosarum sojeva sa najboljim karakteristikama koje daju najbolje rezultate u ispitivanjima su odabrane:

[0027] Zbog ekstremnih uslova koncentracije jedinjenja i visokog saliniteta, primena neke vrste zaštitnog jedinjenja je preporučljiva, pri čemu njegova zaštitna funkcija osigurava opstanak Rhizobium. Pomenuto jedinjenje ne sme da menja bakterijske funkcije, već samo da očuva njihove funkcionalne sposobnosti i sposobnosti replikacije, bilo u Rhizobium leguminosarum vrsti ili bilo kojoj drugoj korišćenoj za istu svrhu.

[0028] Bakterije Rhizobium roda su bezopasne za ljude (García-Fraile et al.2012) i mogu da proizvode različite vrste polisaharida. Među polisaharidima rizobija, egzopolisaharidi (EPS) karakterišu ovaj rod, vudući da su jedinjenja formirana ugljenim hidratima izlučenim u podlogu kroz ćelijske zidove; oni zauzvrat mogu da budu kiseli ili neutralni. EPS pokazuju zaštitnu ulogu na bakterijsku ćeliju pod osmotskim uslovima i uslovima isušivanja opisanim ovde. Među jedinjenjima koja su egzogena za bakterije i koja ispunjavaju ovu istu aktivnost su nekoliko polisaharida povrća od kojih je rogačeva guma odabrana za ovu svrhu. Rogačeva guma formira se od polisaharida galaktomanana i to je ekstrakt dobijen iz endosperma semena rogačevog drveta (Ceratonia siliqua, L.) mehaničkom abrazijom ili nekim hemijskim procesom. Polisaharidi galaktomanana su oni koji se sastoje od lanca manoze vezanog za bočne grupe galaktoze u različitim proporcijama; proporcija rogačeve gume je manoza:galaktoza 4:1. Kod ove vrste jedinjenja rastvorljivost zavisi od sadržaja galaktoze i njene distribucije.

[0029] Primena rogačeve gume, kao što se može videti u ispitivanjama navedenim u odeljku Primeri ove prijave, ima zaštitnu ulogu protiv ekstremnih uslova koncentracije jedinjenja, isušivanja i visokog saliniteta, i takođe može da stimuliše proizvodnju polisaharida od strane istih bakterija, što zauzvrat pomaže u održavanju uslova potrebnih za život bakterija. Među polisaharidima rizobija, egzopolisaharidi (EPS) karakterišu Rhizobium rod, budući da su jedinjenja formirana ugljenim hidratima izlučenim u podlogu kroz ćelijske zidove; ovi zauzvrat mogu da budu kiseli ili neutralni. EPS pokazuju zaštitnu funkciju na bakterijsku ćeliju pod osmotskim uslovima i uslovima isušivanja, a, prema tome, pomažu u održavanju opstanka i vijabilnosti bakterija, zajedno sa rogačevom gumom. Prema tome, rogačeva guma ne samo da pomaže u zaštiti bakterija per se, već i poboljšava mehanizme proizvodnje bakterijskih EPS koji zauzvrat imaju zaštitnu ulogu protiv uslova đubriva.

[0030] Postupak za proizvodnju kombinacije sastoji se od sledećih faza:

a) uzgajanje soja mikroorganizma na YMA čvrstoj podlozi;

b) inokulacija dobijene kulture iz faze (a) u YMB tečnoj podlozi;

c) dodavanje rogačeve gume kulturi iz faze (b); i

d) oblaganje granula mineralnog đubriva najmanje delimično kulturom iz faze (c).

[0031] Čista kultura Rhizobium leguminosarum sojeva javlja se inicijalno na YMA (Yeast Mannitol Agar) čvrstoj podlozi (Vincent.1970) i naknadno se inokuliše u YMB (Yeast Mannitol Broth) tečnu podlogu da bi se dobila čista kultura. Temperatura inkubacije u svim slučajevima je 28ºC, a vreme inkubacije između 3 i 7 dana, poželjno 5 dana. Svojstvena karakteristika u poređenju sa ostalim standardnim podlogama za kulturu YM-tipa je da se između 0,25% i 0,5% rogačeve gume dodaje u podlogu za kulturu u kojoj se rizobije uzgajaju; pri čemu se dodavanje ovog zaštitnika javlja dva dana nakon inokulacije Rhizobium leguminosarum, da bi se poboljšala proizvodnja egzopolisaharida od strane bakterija. U poželjnom primeru izvođenja, koncentracija rogačeve gume je 0,25%, a u poželjnijem primeru izvođenja koncentracija će biti 0,5%, i u još poželjnijem primeru izvođenja koncentracija će biti 1,0%. Nakon 5-dnevne inkubacije, postiže se maksimalan rast (6 x 10<8>CFU/ml), što se podudara sa maksimalnom proizvodnjom egzopolisaharida. Oblaganje đubriva direktnim prskanjem zatim započinje, da bi se naknadno osušilo vazduhom.

[0032] Optimalne koncentracije rizobija dizajnirane su za upotrebu kao obloge za đubriva, dokazujući eksperimentalno da su efikasne dostignute koncentracije. Stvarne koncentracije primenjene na đubriva mogu da variraju između 1 x 10<8>i 6 x 10<8>CFU/ml, pri čemu je moguće da budu između 6 x 10<7>CFU/ml i 6 x 10<9>CFU/ml. Ova koncentracija podrazumeva konačnu dozu po semenu ili biljci useva od između 1 x 10<2>i 9 x 10<2>CFU. Efikasna funkcionalna koncentracija dostignuta po semenu ili biljci je najmanje 1 x 10<2>CFU. Minimalna funkcionalna koncentracija smatra se da je koncentracija rizobija po biljci koja je dovoljna za njen opstanak i za proizvodnju značajnog pozitivnog efekta na useve, bilo kod žitarica ili bilo kog drugog ne-mahunastog useva.

[0033] Korišćena kombinacija osigurava da je proizvodnja egzopolisaharida dovoljno obilna za opstanak rizobijuma kada je izložen ekstremnim uslovima đubriva.

Tabela 1. Kombinacija YMA podloge:

[0034] Efikasnost proizvoda dokazana je u biljkama pšenice i ječma u mikrokosmičkim ispitivanjima i u polju, u poređenju sa kontrolama bez rizobijum, kao što je prikazano u odeljku "Primeri".

[0035] Jedna od osobenosti ovog pronalaska je da je efikasna koncentracija rizobija potrebna da se osigura vijabilnost mikroorganizma značajno manja nego ona preporučena u literaturi najbližeg stanja tehnike za slučaj mahunarki (ne postoji bibliografija koja se bavi minimalnim koncentracijama za PGPR efekat). Smanjenje minimalne funkcionalne koncentracije je, a priori, neočekivana prednost, jer nije bilo moguće predvideti da u slučajevima gde je kombinacija naneta na svako seme ili biljku dostigla koncentraciju od između 1 x 10<2>i 9 x 10<2>CFU, rizobije mogu da opstanu i vrše njihov koristan efekat na useve. Po prvi put, pozitivan efekat je postignut u oblasti za mikrobiološke primene rizobija pri tako niskim koncentracijama. Naučna zajednica ustanovila je da su takve koncentracije mikroorganizama neefikasan u ovakvoj situaciji, nasuprot tome što se može očekivati ili obično prihvatiti. Glavne poteškoće i razlozi izneti napred, koji se prevazilaze u kombinacijama razvijenim, bila je nemogućnost opstanka rizobija pod tim uslovima i da one ne dostižu rizosfer biljke sa koncentracijom dovoljnom za izvođenje njihove PGPR aktivnosti.

[0036] Kombinacije opisane ovde se nanose na isti način kao što zemljoradnici nanose đubriva na njihove useve do danas, sa mašinom za nanošenje standardnog mineralnog đubriva. Ova jednostavnost primene takođe se smatra prednošću u odnosu na krajnje korisnike, jer mnogi zemljoradnici već poseduju ovaj tip mašina koje ravnomerno raspoređuju granule đubriva direktno na terenu. Mineralno đubrivo inkorporira mikroorganizme, ali poljoprivredni rad ostaje potpuno nepromenjen, mada je od suštinskog značaja da se pridržava roku trajanja i preporučenim uslovima čuvanja. Tako, primena kombinacija opisanih ovde može da se primeni u jednoj fazi, što olakšava posao zemljoradnicima dok smanjuje troškove zbog smanjenja kada su u pitanju potrebno vreme i resursi. Druga značajna prednost je da nije potrebno seme useva za direktno nanošenje kombinacije, kao što je slučaj nekih od stanja tehnike. U ovom slučaju, kombinacija može da se nanese kad god je poželjno, bilo na seme, u trenutku setve, ili kasnije u ciklusu rasta useva. Takođe postoji mogućnost da se nanese direktno u zemljište, bez bilo kakve potrebe za prisustvom useva, jer takođe doprinosi poboljšanju njegovih svojstva.

[0037] Primena kombinacija nije nužno ograničena na određenu vrstu, već se može primeniti na mnoge useve od interesa, pri čemu je kod žitarica dokazano značajno poboljšanje kada se koristi kombinacija razvijena od strane prijavioca. Međutim, da bi se zemljište obdarilo boljim svojstvima i nutrijentima za poljoprivrednu aktivnost, ovaj pronalazak može da se koristi za bilo koju vrstu useva, bilo ona za konzumiranje od strane ljudi ili ne, budući da će njen rast biti jasno poboljšan.

[0038] Kombinacije opisane ovde predstavljaju efikasno i efektivno rešenje za ograničenja i probleme koji su do danas ostali nerešeni stanjem tehnike. Do sada, direktnim kombinovanjem sojeva rizobija sa mineralnim đubrivom nije opisano kao postupak za primenu rizobija na biljke, zbog razloga prethodno opisanih. Do sada, najsličnija praksa podrazumevala je primenu rizobija na seme žitarice. Razlog zbog kog je ovo uvek bila procedura je dvostruki. Kao prvo, naučna zajednica utvrdila je da su fiziohemijski uslovi nastali u neposrednom okruženju granule đubriva letalni za ne-sporogene mikroorganizme kao što su rizobije. U takvim uslovima, rizobije ne opstaju a, prema tome, ne mogu da imaju PGPR efekat. Kao drugo, naučna zajednica je smatrala da je koncentracija dostignuta u okruženju semena useva, kada se primena izvodi oblaganjem granule đubriva, neefikasna za useve. Postoje podaci za efikasnost inokulanata za mahunarke koji postavljaju minimalnu efikasnu koncentraciju pri 10<5>CFU/ml (Herrmann i Lesueur, 2013), pri čemu ne postoje efikasna ispitivanja na različitim koncentracijama kada se primenjuju kao PGPR (zajedno sa đubrivom i u odsustvu simbioze kvržica). Nedostatak ispitivanja do danas otkriva da ovaj razvijeni pronalazak predstavlja jasan inventivni prodor koji poboljšava tehnike kultivisanja uspešnom upotrebom rizosfernih mikroorganizama u jednoj kombinaciji sa đubrivima.

Primeri

Primer 1: Ispitivanje opstanka Rhizobium leguminosarum u đubrivu u komori za uzgoj, i pozitivno uzajamno delovanje sa biljkama žitarica nakon njegovog nanošenja u zemljište.

[0039] Specifični ciljevi ovog ispitivanja bili su:

● Da bi se potvrdio opstanak bakterija na granuli đubriva i tokom postupka njenog rastvaranja, tako da oni dolaze u zemljište i mogu da se ponovo izoluju iz istog.

● Da bi se potvrdio efekat obloženog đubriva na razvoj biljaka pšenice.

[0040] eksperiment je izveden u komori za uzgoj na 25ºC danju / 14ºC noću i pri 10-časovnim svetlom i 14-časovnom tamom. Eksperimentalne jedinice bile su dacna dimenzija 32 x 21 x 7cm sa 2 reda od 15 biljaka sa razmakom između redova od 19cm i između biljaka od 0,9cm.

[0041] Tekstura korišćenog zemljišta bila je glina ilovača sa pH 8,5 i sadržajem organske materije od 1,66%. Doza semena pšenice (Rudo sorte) bila je 200kg / hektar, a doza đubriva bila je 50kg / hektar. Navodnjavanje je izvođeno svaka 4 dana, kako bi se zemljište podvrglo dinamikama vlaženja i sušenja.

[0042] Testirani tretmani bili su: kontrola nađubrena sa 15-35-0 Zn kompleksnim mineralnim đubrivom i kombinacije prema ovom pronalasku bazirane na 15-35-0 Zn đubrivu obloženom sa LBM1210 sojem Rhizobium leguminosarum.

[0043] Opstanak u zemljištu analiziran je 35 dana nakon đubrenja brojanjem rizobija u zemljištu primenom Metode najverovatnijeg broja (MPN) (Beck et al.1993) korišćenjem pasulja kao mamac biljke (Phaseolus vulgaris L.). Ova tehnika kotisti se jer je Rhizobium leguminosarum soj izolovan iz kvržica pasulja, a, prema tome, je infektivan za biljku. Prethodno je potvrđeno da nema nativnih rizobija u zemljištu da noduliraju pasulj.

[0044] Rezultati (Tabela 2) pokazuju kako tretman đubrenja kombinacijama u skladu sa ovim pronalaskom predstavlja 100 rizobija /g zemljišta u vreme uzorkovanja. Pomenute rizobije održavaju svoju aktivnost jer su sačuvale svoju sposobnost da inficiraju biljke pasulja, formirajući strukture kvržica u svojim korenima.

Tabela 2. Brojanje rizobija pomoću MPN.

[0045] Efekat na biljke pšenice potvrđen je analiziranjem parametara rasta 35 dana nakon setve.

[0046] Fig.1 prikazuje kako je đubrivo obloženo sa Rhizobium nadmašilo kontrolu nađubrenu sa neobloženim đubrivom u suvoj masi i u visini.

[0047] Đubrivo obloženo rizobijama poboljšalo je rezultate sveže i suve biomase nađubrene kontrole. LBM1210 soj od Rhizobium leguminosarum pokazuje jasnu tendenciju da poboljša efikasnost đubrenja na mikrokosmičkom nivou u komori za uzgoj, kada se primeni kao obloga mineralnog đubriva, što dovodi do veće proizvodnje biomase nego kod kontrole tretirane đubrivom bez oblaganja rizobijama.

Primer 2: Ispitivanje kombinacija ovog pronalaska primenjenih na žitaricu na mikrokosmičkom nivou. Mikrokosmos biljaka pšenice.

[0048] Specifični cilj bio je:

● Da se spozna efekat kombinacije na vegetativni razvoj pšenice.

[0049] Svaka eksperimentalna jedinica sastojala se od 5 saksija biljaka i ponovljena je 3 puta. U svakoj saksiji (19 x 14 x 14) 5 semena pšenice zasejano je sa razmakom od 0,9cm i na dubini od 1,5cm.

Eksperiment je izveden u stakleniku i supstrat se sastojao mešavine zemljišta ilovače sa pH 9,36 i 1,74% organske materije sa izljuspanim vermikulitom sa 50vol.%. Navodnjavanje je izvođeno svaka 4 dana sa 0,5L vode.

[0050] Doza semena pšenice (Rudo sorte) bila je 200kg / hektar, a doza 15-35-0 Zn đubriva bila je 50kg / hektar. Navodnjavanje je izvođeno svaka 4 dana, kako bi se zemljište podvrglo dinamikama vlaženja i sušenja.

[0051] Testirani tretmani bili su: kontrola nađubrena sa 15-35-0 Zn i kombinacije prema ovom pronalasku bazirane na 15-35-0 Zn đubrivu i LBM1210 soju Rhizobium leguminosarum.

[0052] Krajnja koncentracija rizobija po semenu bila je 1 x 10<2>CFU /seme.

[0053] Uzeta su dva uzorka: 70 dana nakon setve (DAS) da bi se analizirao sadržaj nutrijenata i 95 DAS da bi se analizirali vegetativni parametri

Tabela 3. Rezultati za mikrokosmos biljki pšenice

[0054] Tretman sa kombinacijama u skladu sa ovim pronalaskom (Tabela 3, Fig.2) pokazao je višu koncentraciju azota u biomasi i viši ukupan N sadržaj nego kontrola sa ne-inokulisanim đubrivom.

[0055] Tretman obložen ovim pronalaskom (Tabela 3, Fig.3) nadmašio je kontrolu sa ne- inokulisanim đubrivom i u svežoj i u suvoj biomasi. Prema tome, kombinacije ovog pronalaska poboljšavaju efikasnost đubrenja na mikrokosmičkom nivou u stakleniku, čak i u direktnom nadmetanju sa nativnim mikroorganizmima zemljišta.

Primer 3: Ispitivanje kombinacija ovog pronalaska primenjenih na žitaricu na mikrokosmičkom nivou. Mukrokosmos biljaka ječma.

[0056] Specifičan cilj bio je:

● Da se spozna efekat kombinacije na vegetativni razvoj ječma.

[0057] Kao i u prethodnom testu, svaka eksperimentalna jedinica sastojala se od 5 saksija biljaka i ponovljena je 3 puta. U svakoj saksiji (19 x 14 x 14) 5 semena ječma zasejano je sa razmakom od 0,9cm i na dubini od 1,5cm. Eksperiment je takođe izveden u stakleniku, ali korišćen supstrat bio je zemljište od gline ilovače sa pH od 8,69 i sadržajem organske materije od 1,54%. Doza semena ječma (Quinta sorte) bila je 200kg/hektar, a doza 15-35-0 Zn đubriva bila je 50kg / hektar. Navodnjavanje je izvođeno svaka 4 dana, kako bi se zemljište podvrglo dinamikama vlaženja i sušenja.

[0058] Ispitivani tretmani bili su: kontrola nađubrena sa 15-35-0 Zn kompleksnim mineralnim đubrivom i ovaj pronalazak bazirano na pomenutom đubrivu i LET4910, LBM1210, LCS2403 i LPZ2704 sojevima Rhizobium leguminosarum.

[0059] Koncentracija rizobija primenjenih sa đubrivom bila je 6 x 10<8>CFU/ml, što podrazumeva da je koncentracija bakterija koje dosežu do semena ili biljke bila 1,2 x 10<2>/CFU.

Tabela 4. Rezultati iz mikrokosmosa biljke ječma.

[0060] Svi tretmani sa kombinacijama u skladu sa ovim pronalaskom i za bilo koji od korišćenih sojeva poboljšali su suvu masu i parametre maksimalne visine (Tabela 4, Fig.4) i sadržaj azota u biljci (Tabela 5, Fig.5).

Tabela 5. Rezultati sadržaja azota u biomasi u vazduhu

Primer 4: Ispitivanje efekta kombinacija ovog pronalaska primenjenih na žitaricu u polju.

[0061] Specifičan cilj bio je:

● Da se ispita efekat kombinacije na polju useva žitarica u polju.

[0062] Eksperimentalni dizajn svake parcele uključivao je dve varijable: genotip i tretman, i sastojao se od nasumično odabranih kompletnih blokova, ponovljeno je četiri puta. Dimenzije svake parcele bile su 3m po širini sa 10m po dužini; prema tome, svaka parcela iznosila je 30m<2>, od čega je centralnih 15m<2>požnjeto.

[0063] Proizvodnja useva analizirana je u smislu prinosa.

[0064] Ogled sa Core pšenicom izveden je u zemljištu od gline-ilovače sa pH 7,6 i 1,41% organske materije, dok je ogled na Arthur Nick pšenici izveden u zemljištu od peskovite gline ilovače sa pH 8,2 i 1,08% organske materije.

Tabela 6. Lokacija ogleda u polju.

[0065] Testirani tretmani predstavljeni su u Tabeli 7. Kombinacija u skladu sa ovim pronalaskom primenjena je u osnovnom đubrenju. U slučaju Core pšenice, 18-46-0 đubrivo je korišćeno, a 8-15-15 za Arthur Nick pšenicu. Korišćene su tri kontrole, jedna bez đubriva, jedna sa 100% doze đubriva i jedna sa 80% doze. Tretmani sa kombinacijama u skladu sa ovim pronalaskom bazirali su se na odgovarajućem mineralnom đubrivu sa 80% i sojevima rizobije predstavljenim u Tabeli 7.

Tabela 7. Tratamientos y abonado de fondo.

[0066] Krajnja koncentracija rizobija koja dolazi u zemljište nakon nanošenja đubriva varira između 3 x 10<2>i 9 x 10<2>CFU /seme.

[0067] Gornje đubrenje dato je detaljno u Tabeli 8 i poloprivredni radovi izvedeni tokom ispitivanja na polju prikazani su u Tabeli 9.

Tabela 8. Gornje prelivanje u ispitivanjima na polju.

Tabela 9. Zadaci izvršeni na usevima u ispitivanjima na terenu.

[0068] Tretmani sa kombinacijama u skladu sa ovim pronalaskom dale su veći prinos žetve nego nađubreni tretmani (Fig.6 i Fig.7). U oba slučaja, kombinacija sa LET4910 sojem dala je dobre rezultate (Fig.6 i Fig.7).

[0069] Porasti prinosa nadmašili su 5%, povećanje koje se smatra da je agronomski i ekonomski održivo.

Zaključci

[0070] Rizobije opstaju na površini granula đubriva, i nakon postupka njegovog rastvaranja u zemljištu, dolaze u rizosferu biljaka u optimalnoj dozi i uslovima za ispoljavanje PGPR efekta, promovišući rast useva, i kod pšenice i kod ječma.

[0071] Granulisana mineralna đubriva obložena sa rizobijama dovode do porasta prinosa useva žitarica, u poređenju sa istim đubrivom bez mikroorganizama.

Depozit biološkog materijala

[0072] Rhizobium leguminosarum sojevi ove prijave deponovani su u Spanish Type Culture Collection (CECT), Univerzitet u Valensiji, Španija, u skladu sa propisima Budimpeštanskog sporazuma. Brojevi depozita i datumi istih su kao što sledi:

Bibliografija

[0073]

Jose Olivares Pascual. Fijación biológica de Nitrógeno, 2008.

(http://www.eez.csic.es/∼olivares/ciencia/fijacion/)

Adnan, M.2014. Integrated Effects of Rhizobial Inoculum and Inorganic Fertilizers on Wheat Yield and Yield Components. American Journal of Plant Sciences, 5.

García-Fraile, P., L. Carro, M. Robledo, M.H. Ramírez-Bahena, J.D. Flores-Félix, M.T. Fernández, P.F. Mateos, R. Rivas, J.M. Igual, E. Martinez-Molina, Á. Peix and E. Velázquez.2012. Rhizobium promotes non-legumes growth and quality in several production steps: towards a biofertilization of edible raw vegetables healthy for humans. PLoS One 7, 5, e38122 Marks, B.B., M. Megías, M.A. Nogueira and M. Hungria.2013. Biotechnological potential of rhizobial metabolites to enhance the performance of Bradyrhizobium spp. and Azospirillum brasilense inoculants with soybean and maize. AMB Express, 3: 21

Hirsch, P.R.1996. Population dynamics of indigenous and genetically modified rhizobia in the field. New Phytologist 133: 159-171.

Albareda, M., D.N. Rodríguez-Navarro and F.J. Temprano.2009. Soybean inoculation: Dose, N fertilizer supplementation and rhizobia persistence in soil. Field Crops Research 113: 352-356. Penna, C., R. Massa, F. Olivieri, G. Gutkind and F. Cassán.2011. A simple method to evaluate the number of bradyrhizobia on soybean seeds and its implication on inoculant quality control. AMB Express 1:21.

Herrmann, L. and D. Lesueur.2013. Challenges of formulation and quality of biofertilizers. Appl Microbiol Biotechnol.2013 Oct;97(20):8859-73

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Čvrsta kombinacija đubriva koja obuhvata granule mineralnog đubriva najmanje delimično obložene nekim rizosfernim mikroorganizmom sa sposobnošću da deluje kao PGPR koji je zaštićen najmanje jednim mikroorganizam-zaštitnim jedinjenjem da bi se omogućio njegov opstanak u fiziohemijskim uslovima đubriva kada se opstanak mikroorganizma ispituje prema Metodu najverovatnijeg broja, pri čemu mikroorganizam predstavlja vrste Rhizobium roda.

2. Kombinacija prema zahtevu 1, kod koje mikroorganizam predstavlja Rhizobium leguminosarum.

3. Kombinacija prema bilo kom od zahteva 1-2, kod koje mikroorganizam pripada najmanje jednom od CECT 7685, CECT 8873, CECT 8874, CECT 8875 sojeva od Rhizobium leguminosarum, sam ili u bilo kakvoj njihovoj kombinaciji.

4. Kombinacija prema bilo kom od prethodnih zahteva, kod koje je koncentracija mikroorganizama između 6 x 10<7>UFC/ml i 6 x 10<9>UFC/ml.

5. Kombinacija prema bilo kom od prethodnih zahteva, kod koje je mikroorganizam-zaštitno jedinjenje rogačeva guma.

6. Kombinacija prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu đubrivo predstavlja kompleksno mineralno đubrivo.

7. Kombinacija prema zahtevu 6, pri čemu je kompleksno mineralno đubrivo NPK, NP, NK ili PK kompleks.

8. Postupak za proizvodnju kombinacije đubriva prema bilo kom od zahteva 1 do 7, koji obuhvata faze:

a) uzgajanja soja mikroorganizma Rhizobium roda na YMA čvrstoj podlozi;

b) inokulacije kulture dobijene iz faze (a) u YMB tečnoj podlozi;

c) dodavanja rogačeve gume kulturi iz faze (b); i

d) oblaganja granula mineralnog đubriva najmanje delimično kulturom iz faze (c).

9. Postupak prema zahtevu 8, u kom se oblaganje đubriva mikroorganizmom izvodi između 3. i 7. dana uzgoja u fazi (b).

10. Postupak prema bilo kom od zahteva 8 ili 9, u kom je količina rogačeve gume korišćene u fazi (c) najmanje 0,25%.

11. Postupak prema bilo kom od zahteva 8 do 10, u kom je količina rogačeve gume korišćene u fazi (c) najmanje 1,0%.

12. Postupak za poboljšanje rasta useva, koji obuhvata fazu nanošenja kombinacije đubrive prema bilo kom od gornjih zahteva 1 do 7 na biljku u bilo kom od stadijuma njenog rasta, ili direktno u zemljište koje će se koristiti za usev.

13. Postupak prema zahtevu 12, u kom stadijum rasta biljke predstavlja sejanje biljke.

14. Postupak prema zahtevu 13, u kom je koncentracija mikroorganizama u kombinaciji u trenutku njenog nanošenja na seme najmanje 1 x 10<2>CFU.

15. Upotreba kombinacije prema bilo kom od zahteva 1-7 na ne-mahunaste useve ili na žitarice.