RS57701B1 - Obloga đubriva koja sadrži mikroelemente - Google Patents

Description

VEŠTAĆK3 PEPITDI KOJI IMAJU POVRŠINSKU AKTIVNOST I NJIHOVA

UPOTREBA U PRIPREMI VEŠTAČKOG SURFAKTANTA

Oblast pronalaska

Predmetni pronalazak obezbeđuje nove veštačke peptide koji imaju površinsku aktivnost. Posebno, predmetni pronalazak obezbeđuje SP-C analoge koji su, kada se kombmuju sa odgovarajućim lrpiđima, posebno delotvorni u smanjivanju površinskog napona na spoju vazduh - tečnost.

Na taj način, peptidi predmetnog pronalaska mogu da se koriste u kombinaciji sa lipidima, a po želji u kombinaciji sa SP-B ili sa njegovim aktivnim analogom ili zamenom za SP-B, za pripremanje veštačkog surfaktanta korisnog u lečenju sindroma respiratornog distresa (RDS). drugim nedostacima ili disfunkcijama surfaktanta, povezanim plućnim bolestima kao što su pneumonija, bronhitis, astma, sindrom aspiracije mekomjuma, a takođe i drugih bolesti, kao što je serozna upala srednjeg uva.

Pozadina pronalaska

Plućni surfaktant smanjuje površinski napon na spoju vazduh - tečnost alveolarne obloge, sprečavajući pluća da kolabiraju na kraju ekspiracije. Nedostatak surfaktanta je uobičajeni poremećaj kod prevremeno rođene dece i uzrokuje sindrom respiratornog distresa (RDS), koji može delotvorno da se leci sa prirodnim surfaktantom ekstrahovanim iz životinjskih pluća (Fujivvara. T. and Robertson, B. (1992)In:Robertson, B., van Golde, L.M.G. i Batenburg, B. (eds) Pulmonary Surfactant: From Molecular Biology to Cl ini cal Practise Amsterdam, Elsevier, pp. 561-592). Glavni sastojci ovih preparata surfaktanta su fosfolipidi kao što su 1.2-dipalmitoil-5«-glicero-3-fosfoholin (DPPC), fosfatidilglicerol (PG) i hidrofobni surfaktant proteini B i C (SP-B i SP-C). Hiđrofilni surfaktant proteini SP-A i SP-D koji su kolageni lektini tipa C (Ca^<2->zavisni) i za koje se smatra da deluju prvenstveno u sistemu odbrane domaćina, normalno nisu uključeni u preparate surfaktanta zbog procedura ekstrakcije organskim rastvaračima koje se primenjuju.

1

SP-B i SP-C sačinjavaju samo oko 1-2% mase surfaktanta:ali su i tako sposobni da izazovu dramatična poboljšanja u površinskoj aktivnosti u odnosu na preparate čistih lipida (Curstedt. T. et al. (1987) Eur. J. Biochem. 168. 255-262: Takahashi, A.rNemoto, T and Fujiwara, T. (1994) Acta Paediatr. Jap 36, 613-618) Određene su primarne i sekundarne strukture SP-B i SP-C i tercijarna staiktura SP-C u rastvoru (vidi 4). SP-B je sastavljen od dva identična pohpeptidna lanca od 79 amino-kiselina, povezanih sa međulančanim disulfidnim mostom (Curstedt. T. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 87, 2985-2989; Johansson. I, Curstedt, T and Jomvall, H. (1991) Biochemistrv 30, 6917-6921) Svaki monomerni lanac ima tri međulančana disulfidna mosta i najmanje četiri amfipatična heliksa prikazujući jedno polarno i jedno nepolarno lice kroz koje SP-B može da interaguje sa dva lipidna dvosloja i da ih dovodi u neposrednu blizinu. (Andersson. M. et al. (1995) FEBS Lett. 362. 328-332). SP-C je lipoprotem sastavljen od 35 amino-kiselinskih ostataka sa a-heliksnim domenom između ostataka 9-34 (Johansson. J. Et al. (1994) Biochemistrv 33, 6015-6023). Heliks je sastavljen uglavnom od vahl ostataka i uronjen je u lipiđni dvosloj. a onjentisan je paralelno sa lipidnim acil lancima (Vandenbussche, et al. (1992)Eur. J. Biochem. 203, 201-209). Dve palmitoil grupe su kovaientno povezane sa cisteinskim ostacima na poziciji 5 i 6 na N-terminalnom kraju pepuda (Curstedt, T. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 87, 2985-2989). Dva konzervisana ostatka pozitivnog naelektrisanja, arginm i lizin, na poziciji 11 i 12, verovatno reaguju sa negativno naelektnsanim glavama grupa lipidne membrane, povećavajući tako njenu čvrstinu. Čvrstina lipidno - peptidne interakcije može biti smanjena prema C-terminalnom kraju, jer on sadrži samo male ili hiđrofobne ostatke, čineći ovaj deo potencijalno pokretnijim u fosfolipidnom dvosloju. Smatra se da SP-C utiče na debljinu i fluidnest okolnih lipida putem ekstremno stabilnog polil-valil heliksa (Johansson, J. And Curstedt. T. (1997) Eur. J. Biochem. 224, 675-693).

Stanje tehnike

Pošto preparati surfaktanta dobijem iz životinjskih tkiva pokazuju neke nepogodnosti, kao što su njihova dostupnost u ograničenim količinama i mogućnost da sadrže infektivne agense i da indukuju imunološke reakcije, učinjeni su pokušaji da se naprave veštački surfaktanti (Johansson, J. and Curstedt, T. (1997) Eur. J. Biochem. 244. 675-693; Johansson, J et al (1996) Acta Paediatr. 85. 643-646), obično iz sintetičkih lipida i hidrofobnih proteina.

Prethodni rad je pokazao da sintetički SP-C može da se ne savije kao prirodni peptid u a-heliksnu konformaciju potrebnu za optimalnu površinsku aktivnost (Johansson, J. et al.

(1995) Biochem. J. 307, 535-541) i zbog toga da ne reaguje na odgovarajući način sa Hpidima surfaktanta.

Posledično, sintetički SP-C analozi se ne savijaiu kao prirodni peptid i ne reaguju na odgovarajući način sa lipidima surfaktanta Da bi se prevazišao ovaj problem, načinjeno je nekoliko pokušaja da se izmeni sekvenca. na primer zamenom svih heliksnih Val ostataka u prirodnom SP-C sa Leu, koji jako favorizuje a-heliksnu konfomaciju. Odgovarajući transmembranski analog, SP-C(Leu) je pokazao dobro širenje na spoju vazduh - tečnost kada je kombinovan sa DPPC:PG:PA (68:22:9) (w/'w/w). Međutim, maksimalna vrednost povTšmskog napona tokom ciklične površinske kompresije (ymax) je bila značajno veća od one kod prirodnog surfaktanta. Dalje, nije bilo moguće da se pripremi smeša lipida i peptida koncentracije koja je viša od oko 20 mg/mL, verovatno zbog stvaranja oligomera peptida (Nilsson. G. et al. (1998) Eur. J. Biochem. 255. 116-124). Drugi su sintetisali bioaktivne polileucm SP-C analoge različite dužine (Takei, T. et al. (1996) Biol. Pharm. Buli. 19, 1550-1555). U daljim studijama, m samo-oligomenzacija niti problemi u proizvodnji uzoraka visoke lipidne koncentracije nisu bili prijavljeni.

Različiti objavljeni patenti se bave problemom dobijanja peptidnih analoga prirodnih surfaktantmh peptida, dajući nekoliko različitih rešenja. Među njima, objavljeni patenti . W093 21225, EP 733 645, W096 17872, u ime firme Tokvo Tanabe, opisuju peptidne analoge prirodnog SP-C, koji se generalno razlikuju od prirodnog peptida prema sekvenci N-terminalnog kraja.

Patentne prijave W089 06657 i W092 22315, podnete od strane Scripps Research Institute, opisuju SP-B analoge koji imaju naizmenično hidrofobne i hidrofilne amino-kiselmske ostatke. Između ostalih, zatražena je zaštita i peptida sa naizmemčnim leucinskim i lizmskim ostacima (KL4).

Clercx A. et al., Eur. J. Biochem. 229. 465-72, 1995 opisuju peptide različite dužine koji se odnose na N-teiminal svinjskog SP-C i hibridne peptide izvedene iz svinjskog SP-C i baktenorodopsina.

Johansson J. et al. Biochem. J. 307, 535.41, 1995 opisuju sintetičke peptide koji se razlikuju od prirodnog svinjskog SP-C po supstituci ji nekih annno-kiselina.

VVO89/04326 u ime firme Cahfornia Biotechnoiogy - Byk Gulden, i WO91/18015 u ime firme Califomia Biotechnologv - Scios Nova opisuju SP-C analoge koji sadrže početnu N-temiinalnu sekvencu u ko|oj su dva Cvs prirodnog SP-C zamenjena sa dva Ser.

Opis pronalaska

Otkriveno je da SP-C analogni peptidi koji imaju sledeće osobine: i) Val ostatke supstituisane drugim neutralnim i hidrofobnim ostacima; ii) Cvs ostatke supstituisane Ser ostacima; ili) neke od neutralnih ammo-kiselinskih ostataka zamenjene masivnim ili polarnim ostacima, pokazuju posebno pogodne osobine za smanjenje površinskog napona. Posebno je otkriveno da poslednja osobina, zahvaljujući pozitivnom naelaktrisanju usled polarnih ostataka, ili zahvaljujući prostornim smetnjama usled masivnih supstituenata, omogućuje da se izbegne samo-oligomenzacija.

Kao što sledi, prema prvom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje SP-C analoge koji, koristeći označavanje amino-kiselina pomoću jednog slova, imaju sledeću opštu formulu

(I):

naznačene time što:

X je amino-kiselina izabrana izgrupe koja se sastoji od V, I, L, Nle (norleucm);

Bje amino-kiselma izabrana izgrupe koja se sastoji od ornitma, K, I, W, F, Y, Q, N;

Z je amino-kiselina izabrana iz grupe koja se sastoji od S, C, F, naznačenih time što su sermski ili cisteinski ostaci opciono vezani preko estarske i li tioestarske veze sa acil grupama koje sadrže 12-22 povezanih ugljenikovih atoma;

a je ceo broj od 1 do 19

b je ceo broj od 1 do 19

c je ceo broj od 1 do 21

d je ceo broj od 0 do 20

e je 0 ili 1

f je 0 ili 1

nje 0 ili 1

m je 0 ili 1

uz us love:

- n + m > 0,

- f> e; - (XaB),,(>v'bB)I1(XcB)niXd je sekvenca koja ima maksimalno 22 amino-kiseline. poželjno od 10 do 22.

Poželjni peptidi Formule (I) imaju sledeće sekvence:

Među sekvencama (Ia) - (Ie), poželjne su one kod kojih je B = Lvs ili Phe i X = Leu: II e ihNle.

Prema poželjnim realizacijama, peptidi formule (Ia) - (If) imaju sledeće sekvence, respektivno:

U poželjnijoj realizaciji predmetnog pronalaska, Ser ostaci su vezani kovalentmm vezama za acil grupe koje sadrže od 12 do 22 ugljenikova atoma.

Peptidi formule (I) se mogu pripremiti sintetičkim postupcima ili rekombinantnim tehnikama.

Konvencionalni sintetički postupci su, na primer, opisani u Schroeder et al., "The peptides". vol. 1, Acađemic Press, 1965: Bodanszkv et al., "Peptide svnthesis", Interscience Publisher. 1996: Baramv ? Merrifield, "The peptides: Analvsis. Svnthesis, Biologv", vol. 2, chapterl, Acađemic Press, 1980. Navedene tehnike uključuju sintezu peptida u Čvrstoj fazi, u rastvoru, zatim sintetičke postupke organske hernije ili bilo koju kombinaciju navedenih.

Poželjno je da se S- ili O- acilovani peptidi sintetišu tretiranjem neacilovanih peptida acil hlondima u čistoj trifluorosirćetnoj kiselini, kao što je opisano u Yousefi-Salakdeh et al. Biochem. L 1999, 343, 557-562. Nakon sinteze i prečišćavanja, izvršena je biohennjska i biofizička karaktenzacija sintetičkih peptida, kao što je prikazano u sleđećem odeljku "Primen"

Dejstvo peptida predmetnog pronalaska u smanjivanju površinskog napona je ocenjeno u kombinaciji sa lipi dima i fosfolipidima, SP-B-om, anal o zima SP-B ili supstituentrma SP-B. Posebno, peptidi su kombmovani sa DPPC (1.2-diplamitoil-.w-glicero-3-fosfoholin) / PG (fosfatidilglicerol) / PA (palmitinska kiselina) sa ili bez SP-B, njegovim aktivnim analozima i pohmiksimma

Rezultati testova površinske aktivnosti pulsiraiućim mehurom jasno pokazuju da sintetički peptidi predmetnog pronalaska značajno smanjuju minimalni i maksimalni površinski napon tokom ciklične površinske kompresije r/rnjniYmax) do vrednosti uporedivih sa onim dobijenim korišćenjem surfaktanata iz prirodnih izvora.

Dodavanje SP-B ili njegovih aktivnih analoga smeši peptidTipidi-fosfolipidi dalo je posebno povoljne rezultate. Iznenađujuće, otkriveno je da se polimiksim, a posebno polimiksm B, ponašaju kao supstituenti SP-B i njihovo dodavanje je dalo rezultate uporedive sa onima ostvarenim upotrebom SP-B.

Prema drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje sintetičke surfaktante koji se sastoje od jednog ili više peptida fonnule (I), sa primesama lipida i/ili fosfolipida i opciono SP-B, njegovog aktivnog derivata ili polimiksina. Odgovarajući lipidi/fosfolipidi se mogu izabrati iz grupe koja se sastoji od fosfatidilholma (poželjno DPPC), PG, PA, triacilglicerola, sfmgomielina.

U još poželjnijoj realizaciji predmetnog pronalaska, potrebno je koristiti surfaktantske smeše koje sadrže peptide u kojima su palmitoilski lanci kovalentno preko kiseonika vezani za Ser ostatke. Otkriveno je da smeše surfaktanata koje sadrže dipalmitoilovani oblik referentnog peptida (SP-C(Leu)) pokazuju veću stabilnost površinskog filma i veći površinski lipidni rezervoar, u poređenju sa smešama koje sadrže odgovarajući ne-palmitoilovani peptid, što je lzmereno sistemom sa zarobljenim mehurom. U uzorcima koji su sadržali 5% drpalmitoilovanog peptida, yinil, je bio ispod 1,5 mN/m i filmovi su bili veoma stabilni, kako se površinski napon povećao za manje od 0,5 mN/m tokom 10 minuta pri konstantnoj zapremini mehura. Nasuprot tome. yrlliliza ne-palmitoilovani peptid je bio oko 5 mN/m i filmovi su bili manje stabilni što je uočeno čestim pucketanjem mehurova pri manjim površinskim naponima. Štaviše, posle potfaznog osiromašivanja, kod uzoraka koji su sadržali ne-palmitoilovani peptid, mogućnost za postizanje stabilnog površinskog napona bliskog nuli se izgubila nakon nekoliko adsorpcionih koraka, dok kod dipalmitoilovanog peptida, kvalitet filma nije oslabio ni posle 10 ekspanzionih koraka i uključivanja materijala iz rezervoara, ekvivalentnom više od dva monosloja. Poboljšana površinska aktivnost đipalmitoiiovamh peptida je takođe pokazana pomoću surfaktometra sa pulsirajućim mehurom. Uz to, otkriveno je da prisustvo acil grupa dodatno sman]U)e tendenciju stvaranja oligomera. Ovo otkriće je veoma važno, pošto je otkriveno da prilikom pripremanja veštačkih surfaktanata oligomenzacija peptida ometa pripremu smeša pn koncentracijama većim od 20 mg/ml fNilssonet al Eur. J. Biochem. 1998, 255, 116-124).

Sintetički surfaktanti se mogu pripremiti mešanjem rastvora ili suspenzija peptida i lipida, a zatim sušenjem tih smeša.

Prema potrebi, suva smeša se može suspendovati, dispergovati ili već kao takva dati subjektima kojima je potreban tretman usled nedostatka surfaktanata.

Poželjno je da se sintetički surfaktant primenjuje endotrahealno ili putem aerosola. Ovaj potonji oblik primene zahteva kombmovanje malih čestica surfaktanta sa odgovarajućim inertnim potisnim gasom Drugi oblici primene, kao što su nebulizacija ili rasprskavanje stabilnih rastvora/suspenzija surfaktanta su takođe uključeni u obim zaštite predmetnog pronalaska.

Prema dodatnom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu opisanih peptida za pripremu surfaktantnog agensa radi upotrebe u svim slučajevima adultnog ili neonatalnog nedostatka ili disfunkcije surfaktanta, povezanih plućnih bolesti kao što su upala pluća, bronhitis, astma, sindrom aspiracije mekomjuma i takođe druge bolesti, kao što je serozna upala srednjeg uva.

Tipično, surfaktantni agens će se koristiti, pre svega endotrahealnom primenoin, u . iečenju sindroma respiratornog distresa koji često pogađa prevremeno rođenu decu.

Sledeći prnneri detaljnije ilustruju predmetni pronalazak:

Pnmer 1

Sinteza i prečišćavanje peptida

Analog SP-C, SP-C(LKS) (Slika 1) je smtetisan konšćenjem postupne tehnologije u čvrstoj fazi i hernije terc-butiloksikarbonila (Kent. S.B.H. (1988) Annu. Rev. Biochem. 57, 957-989) u instrumentu .Applied Biosvstems 430A. Cepanje veze smola-peptid i uklanjame zaštite bočnih lanaca je izvršeno u smeši anhidrovani fluorovodonik/metoksibenzen /dimetilsulfid, 101:1 (v/v/v) tokom 1,5 časa na 0 °C. Zaštitne grupe i aditivi su uklonjeni uzastopnom ekstrakcijom pomoću dietil etra i peptid je zatim izdvojen iz smole pomoću smeše đihlorometan/trifluoro sirćetne kiseline (TFA) 3:1 (v/v/v). praćeno rotacionim isparavanjem. Ekstrakt sirovog peptida je ponovo rastvoren pri koncentraciji od 100 mg/ml u sineši hloroform/metanol 11 (v/v) koja je sadržala 5% H>0. Količina od 10 mg je pnmenjena na Sephadex LH-60 koloni (40 x 1 cm) u istom rastvoru (Curstedt. T. et ni (1987) Eur. J. Biochem. 168. 255-262). Uzeti su uzorci od 2.5 ml ilzmerene su absorbancije na 214 nm i 280 nm. Identifikacija i kvantizacija je obavljena pomoću analize amino-kiselina.

Radi acilovanja. prečišćeni peptid (tipično oko 5 mg) se osuši, rastvori u destilovanom TFA (100 ul) i doda se acil hlorid (10-20 ekvivalenata u poređenju sa količinom peptida) Posle 10 minuta, reakcija se zaustavlja pomoću 80% vodenog rastvora etanola (1,9 ml). Prečišćavanje acil peptida se vrši pomoću hromatografije na Lipidex 5000 u sineši etilen hlonđ/metanol 1:4 (v/v), što je praćeno postupkom HPLC reverzne faze na Cl8 kolom, korišćenjem linearnog gradijenta 2-propanol/0t 1 % TFA do 60% vodenog rastvora metanol/0,1% TFA ili 75% vodenog rastvora etanol/0,1% TFA.

Primer 2

Biohemijska karakterizacija

Čistoća peptida je proverena elektroforezom na poliakrilamidnom gelu (PAGE) sa natrijum-dodeci 1 sulfatom (SDS) (Phast-svstem, Pharmacia, Švedska) i postupkom HPLC reverzne faze. korišćenjem Cl8 kolone i linearnog gradijenta 60% vodenog rastvora metanol/0,1 % TFA i izopropanol/0,1 % TFA (Gustafsson, M. et al. (1997) Biochem. J. 326, 799-806).

Molekularne mase su određene putem masene spektromenje sa matnčno-asistiranom laserskom desorpcionom ionizacijom sa vremenom preleta (MALDI-TOF - matrix-assisted laser desorptionlonisation-time-of-flight) (Lasennat 2000, Finmsan MAT) kalibnsane vazoaktivnim crevnim peptidom (Mr 3326.8).

Sekundama struktura peptida je ispitivana korišćenjem CD (cirkularni dihroizam) spektroskopije f.Tasco-720 Jasco. Japan). Posle rastvaranja u trifluoroetanolu (TFE), spektri su mereni od 260 nm do 184 nm, brzinom skeniranja od 20 nm/min i sa rezolucijom od 2 tačke/nm. Izračunata je rezidualna mol ama eliptičnost i izražena u kdeg x cm"<'dmol. Molame eliptičnosli na 208 nm i 222 nm su korišćene za procenu sadržaja heliksne strukture (Barro\v.

C J. et al. (1992) J. Mol. Biol.225, 1075-1093)

Ispitivanja sekundarne strukture SP-C(LKS) korišćenjem CD spektroskopije su pokazala spektar tipičan za ct-helikoidne peptide i a-helikoidni sadržaj je procenjen na oko 75% na osnovu minimuma na 208 nm i 222 nm. Sekundarna struktura je ostala stabilna i posle postepenog razblaživanja vodom do 12% TFA, pri čemu je na početku peptid bio rastvoren u čistom TFE

SDS-PAGE na SP-C(LKS) je pokazala jednu traku sličnu prirodnom SP-C. dok SP-CfLeu), koji nema Lys u heliksnom delu, formira ohgomere. Nasuprot našem iskustvu sa smešama SP-C(Leu)/lipid, koje je teško rastvoriti u koncentracijama većim od 20 mg'ml (Nilsson. G. et al. (1998) Eur. J. Biochem. 255, 116-124). bilo je moguće najiraviti smešu SP-C(LKS)/lipid sa koncentracijom lipida od 80 mg/ml i odnosom pol ipeptid/lipid od 0.03

Pnmer 3

Priprema peptid/Iipidsmeša

DPPC, PG i PA su kupljene od Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Lipidi, rastvoreni u smeši hloroform/metanol 98:2 (v/v), smešam su u odnosu DPPC:PG:PA 68:22:9 (v,7\v/vv) ili DPPC/PG 7 3 (w/w). Preparati surfaktanta su pripremljeni dodavanjem samo SP-C(LKS) ili SP-C(LKS) i SP-B, u obe lipidne smeše, pri ukupnom masenom odnosu polipeptidTipid od 0 do 0,05. Smeše su isparene u azotu i ponovo suspendovane u 150 mmol/1 NaCl ili u 10 mmol/1 Hepes pufera pH 6,9 koji sadrži 140 mmol/1 NaCl i 2 mmol/1 CaCl2, pri koncentracijama lipida od 10 - 80 mg/ml. Uzastopna smrzavanja i izlagania ultrazvuku (50 W, 48 kHz) su vTŠena sve dok se nisu dobile homogene suspenzije. U nekim slučajevima, đobijene suspenzije su bile u inkubaciji na 45°C tokom jednog časa.

Preparati surfaktanta suspendovani u 150 mmol/1 NaCl imaju pH vrednost od 3,5 do 5.5. Niže pH vređnosti od 3,5 - 4,5 su uočene u preparatima koji sadrže SP-B. Kako je prirodni SP-B prečišćavan korišćenjem zakiseljenih organskih rastvarača (Curstedt, T. et al.

(1987) Eur. J. Biochem. 168, 255-262), manje količine kiseline su se mogle zadržati u preparatima. Vrednost pH, bliska fiziološkoj pH vređnosti. je dobijena suspendovanjem preparata surfaktanta u Flepes puferu pH 6,9 koji sadrži 140 mmol/1 NaCl i 2 mmol/1 CaCk

(Tablela 1). Upoređenju sa odgovarajućim preparatima u nepuferovanoj slanoj vodi, nije bilo promene ymaxi - ;„ m kada je konšćena lipi dna smeša DPPC/PG 7:3 (maseno). Sa drage strane, kada je PA uključena u lipidnu smešu, i ymaxiYniinsu porasli pri većim vređnostima pH (Tabele 1 i 2).

Pnmer 4

Priprema smeša fosfolipida sa SP-C(LKS) i polimiksinom B

DPPC i PG su kupljeni od Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) Fosfohpidi. rastvoreni u smeši hloroform/metanol 98:2 (v/v), pomešani su u odnosu DPPC/PG 7 3 (w/'w). SP-C(LKS) je dodat fosfolipidnoj smeši pri ukupnom masenom odnosu polipeptid /fosfolipid od 0,03. Smeše su isparene u azotu i ponovo suspendovane na sobnoj temperaturi u 10 mmol/1 Hepes pufera pH 6,9 koji sadrži 140 mmol/1 NaCl i 2.0 mmol/1 CaCL ili u istom putem koji sadrži 0,01 % polimiksina B (PxB) (Sigma Chemical Co., St. Louis. MO). Uzastopna smrzavanja i izlaganja ultrazvuku (50 W, 48 kHz) su vršena sve dok se nisu dobile homogene suspenzije Konačna koncentracija fosfolipida u oba preparata je bila 10 mg/ml. Dodavanjem PxB smanjeni su i ymaxi yniini postignuta je optimalna površinska aktivnost (Tabela 3).

Primer .5

Biofizička karakterizacija

Kinetika površinskog širenja je merena na 34-37 °C sa \Viihelniy površinskom ravnotežom (Biegler. Vienna, Austna) Površinski napon je posmatran tokom 10 minuta korišćenjem platinske pioče povezane na merač naprezanja i zaronjene 1 mm u hipofizu od 20 ml 150 mmol.'l NaCl u teflonskom kanalu. Suspenzije su dodate u vidu kapljica, ukupno 1 mg lipida, na hipofazu, 4 cm od platinske pločice.

Kinetička merenja 3% SP-C (LKS) (maseni procenti) u DPPC/PG, 7:3 (vv/w), korišćenjem IVilhelmv ravnoteže, pokazala su brzo širenje sa površinskim naponom od 28 mN/m nakon 3 s (Slika 2). Sirenje je bilo nešto sporije pri konšćenju 1% SP-C (LKS) (maseni procenti) u istoj lipidnoj smeši (podaci nisu prikazani). Dodavanje 2% SP-B (maseni procenti) nije značajno promenilo brzmu širenja ni ravnotežni površinski napon (Slika 2). Poboljšanja nisu uočena ni nakon inkubacije smeše tokom jednog sata na 45 °C (podaci nisu prikazani). Slični rezultati su dobijem sa hpiđnom smešom DPPCPGPA, 68 22:9 (vv/w/w) (podaci nisu prikazani).

Dinamički površinski napon je zabeležen konšćeniem surfaktometra sa pulsirajućim mehurom (Surfactometer International, Toronto, Canada) na 37 °C tokom 50% cikličke kompresije površine mehura i pri frekvenciji od 40 ciklusa po minutu. Sva merenja su vršena tokom 5 minuta i pri koncentraciji lipida od 10 mg/ml. Gradijenti pritiska duž zida mehura su mereni u određenim vremenskim intervalima i korišćem za izračunavanje površinskog napona pri minimalnoj (jmin) i maksimalnoj (<y>max) veličini mehura.

U surfaktometra sa pulsirajućim mehurom 3% SP-C (LKS) (maseni procenti) u DPPC:PG:PA. 68.22:9 (vv/vv/vv), proizveo je površinski napon manji od 1 mN/m pri minimalnom poluprečniku mehura (yinin), dok je ylllinod 9-14 mN-'m uočena kod 3% SP-C (LKS) (maseni procenti) u DPPC:PG, 7:3 (vv/vv) (Tabela 1). Površinski napon pri maksimalnom poluprečniku mehura (ymax) je bio oko 40 mN/m u oba slučaja. Dodavanje 2% SP-B (maseni procenti) dalo je vređnosti ymaxod 31-33 mN/m i yniinod 0-2 mN/m za oba lipidna preparata. Ove vređnosti su veoma slične onima dobijenim sa preparatima surfaktanta izolovanim iz prirodnih izvora (Robertson. B. Et al. (1990) Prog. Respir. Res 25. 237-246). Inkubacija preparata na 45 °C tokom jednog časa nije imala značajniji efekat na površinsku aktivnost (Tabela 1). Smanjivanje količine SP-B do 0.5 masenih procenata u 3% SP-C (LKS)

(maseni procenti) u DPPC:PG 7:3 (vv/vv) dovodilo je do povećanja ynuniako rezultati nisu dostigli statistički značaj (Tabela 1). Nasuprot SP-B, dodavanje 2 masena procenta Kl.., (Oochrane, CG. and Revak. S. D. (1991) Science 254,566- 56$)u 3% SP-C (LKS) (maseni procenti) u DPPC.PG.PA. 68 22:9 AvAvAv), nije smanjilo ym;ixkoje je zadržalo relativno veliku vrednost od 41-42 mN/m.

Primer 6

Poređenje smeša koje sadrže dipalmitoilovane i ne-palmitoilovane referentne

peptide

Preparati surfaktanta su pripremeljeni dodavanjem3%SP-C (Leu) (maseni procenti) ili dipalmitoilovanog SP-C(Leu) svakoj od lipidnih smeša sastavljenih od DPPC/PG/PA 68:22:9 (vvAv/vv). Smeše su isparene u azotu i ponovo suspendovane u 150 mmol/1 NaCl, pri koncentraciji lipida od 10 mg/ml. LTuzorcima ukojimaje korišćen SP-B supstituent, dodat je 1 maseni procenat polnniksina B. Smeše koje sadrže dipalmitoilovani SP-C(Leu), sa ili bez polimiksina B. pokazuju značajno poboljšanje, posebno u smanjivanju yRiaxna 5 minuta i yniin u kraćim vremenskim intervalima.

Tabela 4: Površinske osobine

Površinski napon smeša je dobijen pomoću surfaktometra sa pulsirajućim mehurom. Nakon dva minuta za uspostavljanje ravnoteže. Čitanja su vršena u različitim vremenskim intervalima, na 37 °C, pri 50° o kompresiji površine i frekvenciji od 40 ciklusa u minuti.

P rimer 7

Jn vivo determinacija

E tek at terapne surfaktantom na mehaničke osobine nezrelih pluća je ocenjivan na 9 prevremeno rođenih zečeva gestacione starosti od 27 dana Životinje su neposredno po rođenju podvrgnute traheotomiji. a pet od njih je putem trahealne kanile primilo dva doze od po 2.5 ml kg veštačkog surfaktanta koji je sadržao DPPC, PG i SP-C(LKS), sa ili bez polrmiksina B. u gore navedenoj razmen. Ukupna koncentracija fosfolipida egzogenog surfaktanta je bila 40 mg/ml. Dve životinje koje su služile kao negativna kontrolna grupa, nisu primile nikakav materijal putem trahealne cevi, dok su druge dve životinje, u svojstvu pozitivne kontrolne grupe, tretirane istom količinom modifikovanog prirodnog surfaktanta (Curosurf, Chiesi Farmaceutici Spa, Parma, Italija), razblaženog do 40 mg/ml. Jedna životinja je tretirana smešom DPPC i PG u slanoj vodi (iste koncentracije kao što je gore navedeno), u dozi od 2,5 ml/kg. Sve životinje su držane u odeljcima za telesnu pletizmografiju na temperaturi od 37 °C i istovremeno su ventilirane tokom 60 minuta sa 100% kiseonikom, korišćenjem Servo Ventilator 900B (Siemens-Elema, Solna, Švedska) podešenog na frekvenciju od 40 u minuti i na 50% vremena inspiracije. Volumen vazduha mirnog disanja su izmereni pomoću pneumotahografa povezanog sa svakim ođeljkom za pletizmografiju. Životinje su ventilirane standardnim volumenom mirnog disanja od S-10 ml/kg i bez pozitivnog pritiska na kraju ekspirijuma (PEEP). Plućno - toraksna popustljivost je bila đefinisana kao odnos između volumena mirnog disanja i maksimalnog pritiska pri inspinjumu i izražen u ml/cm FFO kg.

U poređenju sa netretiranim životinjama kontrolne grupe, popustljivost je značajno poboljšana kod životinja tretiranih veštačkim surfaktantom, posebno kod životinja koje su primile surfaktant koji sadrži polumksin B. Pnmetno je da se poboljšanja čine većim nego kod onih uočenih pri tretiranju sličnim dozama modifikovanog prirodnog surfaktanta (Slika 3).

Kratak opis slika.

Slika 1. Sekvence amino-kisiclina i prezentacija heliksnih krugova SP-C i njegovih analoga.

Sekvenca humanog SP-C je preuzeta iz Johansson, J. et al. (1988) FEBS Lett. 232, 61-64. a sekvenca SP-C(Leu) iz Nilsson, G., et al. (1998) Eur. J. Biochem. 255, 116-124. SP-1

C(LKS) je zasnovan na primarnoj strukturi SP-C, pri čemu su svi Val ostaci na pozicijama 16-28, sa izuzetkom pozicije 17, zamenjeni Leu ostacima, Lvs ostaci su dovedeni na pozicije 17. 22 i 27, a palmitoilovani Cvs na pozicijama 5 i 6 je zamenjen sa Ser.

Slika 2. Sirenje površine preparata sintetičkih surfaktanata.

Kinetika širenja 3% SP-C(LKS) (maseni %) (puni kvadrati, puna linija) i 3% SP-C(LKS) (maseni %) sa dodatkom 2% SP-B (maseni %) (prazni trouglovi. isprekidana linija). Svi preparati su ispitivani pri koncentraciji od 10 mg</>ml DPPG/PG, 7:3 (w/w) u 150 mmol/1 NaCl. Čitanja su dobijena pomoću Wiihelmy ravnoteže i svaki podatak je srednja vrednost tri različita merenja.

Slika 3. In vivo rezultati

Plućno - toraksna popustljivost kod 5 prevremeno rođenih zečeva (gestacione starosti od 27 dana) ventiliranih standardnim volumenom mirnog disanja od 8-10 ml/kg i bez pozitivnog pritiska na kraju ekspiracje (PEEP) Popustljivost je značajno poboljšana kod tretiranih životinja. Čini se da dodavanje polimiksma B (PxB) pojačava efekat veštačkog surfaktanta. Koncentracija fosfolipida je ista u svim preparatima surfaktanata, t.j. 40 mg'ml.

Claims (16)

1 SP-C analozi koji. koristeći označavanie amino-kiselina pomoćuleđnog slova, tmaiu opštu formulu (I): naznačeni time što: X je amino-kiselina izabrana izgrupe koja se sastoji od I. L, Nle (norleucina), B je amino-kiselina izabrana iz grupe koja se sastoji od K, W. F. Y, ornitma, Z je S i može opciono biti vezan preko estarske ili tioestarske veze sa acil grupama koje sadrže 12-22 ugljemkova atoma, a je ceo broj od 1 do 19, b je ceo broj od 1 do 19, c |e ceo broj od 1 do 21, d je ceo broj od 0 do 20, e je 0 ili 1,<f>je Oilil, n je 0 ili 1, m je 0 ili 1, uz sledeće us love: n -h m > 0, fAe; (Xi,B)(XbB)„(XcB)nXriJe sekvenca koja ima maksimalno 22 amino-kiseline. poželjno od ludo 22 amin-kiselmc.

2. SP-C analozi prema zahtevu 1, naznačeni time Što imaju formulu (Ia): (Ia) FGIPSSPVffl,KRX4BX4BXiBXGALLMGL

3. SP-C analozi prema zahtevu 1, naznačeni time što imaju formulu (lb): (Ib)FGIPSSPVmKRXJBX5BX4G.ALLMGL

4 SP-C analozi prema zahtevu 1. naznačeni tune što imaju formulu (Ic): (Ic) FGIPSSP Y1TLKRX,BX, tG ALLMGL

5 SP-C analozi prema zahtevu 1, naznačeni time što imaju formulu (IdV (Td) FGIPSSPVTILKRX8BX7GALLMGI.

6. SP-C analozi prema zahtevu 1, naznačeni time što imaju formulu (Te): (Ie) F GJJP S S P VHLKRX i i BX4 GAL LM GL

7. SP-C analozi prema zahtevima 1 - 6, naznačeni time što su Ser ostaci acilovani prvenstveno palmitoil grupama.

8. SP-C analozi prema zahtevima 1 - 7. naznačeni time što B je lizin ili fenilalanm i X je leucm, izoleucin ili norleucin .

9. SP-C analozi prema zahtevu 8, naznačeni time što su izabrani iz grupe koja se sastoji od:

10. Sintetički surfaktant naznačen time što sadrži bar jedan od SP-C analoga formule (I) umešan sa lipidima i fosfohpidima.

11. Sintetički surfaktant prema zahtevu 10. naznačen time što smeša lipidi/fosfolipidi sadrži DPPG, PG PA

12. Sintetički surfaktant prema zahtevima 10 - 11, naznačen time što dodatno još sadrži SP-B ili njegov aktivni derivat ili polimiksin.

13. Sintetički surfaktant prema zahtevima 10 - 12, naznačen tune što je u obliku rastvora, disperzije, suspenzije, suvog praška

14 Upotreba SP-C analoga iz zahteva 1 - 7, naznačena time što služi za pripremanje, sintetičkog surfaktanta koji se koristi u svim slučaievima nedostataka surfaktanta

15. Upotreba polimiksina, pre svega polimiksina B, naznačena time što služi za pripremanje veštačkog surfaktanta prema zahtevima 10 - 13, koji se koristi za tretiranje svih slučajeva nedostataka ili disfunkcija surfaktanta ili serozne upale srednjeg uva.

16. Upotreba prema zahtevima 14 i 15, naznačena time što nedostatak surfaktanta je sindrom respiratornog distresa.