RS57791B1

RS57791B1 - Postupci dobijanja za kontrolu sadržaja c-terminalnog lizina, galaktoze i sijalinske kiseline u rekombinovanim proteinima

Info

Publication number: RS57791B1
Application number: RS20181228A
Authority: RS
Inventors: Marcel Flikweert; Charles Goochee; Francis Maslanka; Francisus Johannes Ignatius Nagel; James Ryland; Eugene Schafer
Original assignee: Janssen Biotech Inc; Janssen Biologics B V
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-07
Publication date: 2018-12-31
Also published as: US20140273092A1; AR124871A2; EA201591807A1; DK2970980T3; TWI630216B; PL2970980T3; SI2970980T1; WO2014149935A1; AU2020203864B2; EP2970980B1; ZA201507671B; AU2020203864A1; KR20150129025A; US20220089712A1; TW201441263A; CA2907140A1; LT2970980T; EP2970980B2; AR095660A1; BR112015022971B1

Description

Opis

STANJE TEHNIKE PRONALASKA

[0001] C-terminalni lizin (CTL) se brzo uklanja iz injektiranih antitela, uključujući infliksimab, endogenim cirkulišućim karboksipeptidazama u krvotoku (Cai, B. et al., "C-terminal Lysine Processing of Human Immunoglobulin G2 Heavy Chain in Vivo," Biotechnol. Bioeng.2011; 108:404-412) i, prema tome, veruje se da ima malo, ili da uopšte ima, uticaja na bezbednost i efikasnost proizvoda. Međutim, sadržaj CTL u rekombinovanim proteinima koji imaju CTL ostatke mogu da se koriste kao mera dobijanja konzistencije i homogenosti proizvoda.

[0002] WO 2013/009648 opisuje postupak ćelijske kulture. Luo et al. (2012) Biotechnology and Bioengineering 109(9):2306-2315 opisuje testiranje varijacije C-terminalnog lizina u proizvodnji rekombinovanog monoklonskog antitela. WO 2014/143184 opisuje modulaciju vrsta varijanti lizina kompozicija i postupaka za proizvodnju istih.

[0003] Suprotno sadržaju CTL, sadržaj sijalinske kiseline u rekombinovanim proteinima je u vezi sa mnogim fenomenima od fiziološkog značaja za ljude. Na primer, prisutvo sijalinske kiseline u glikoproteinima, kao što je eritropojetin, promoviše duži polu-život u cikulaciji, dok odsustvo sijalninske kiseline u eritropojetinu dovodi do brzog uklanjanja proteina iz cirkulacije. Dodatno, povećan sadržaj sijalinske kiseline u proteinima može da moduliše imunogenost proteina kod ljudi. Usled značaja sijalinske kiseline u bezbednosti proizvoda i efikasnosti, sadržaj sijalninske kiseline treba da se održi unutar opsega koji odgovara opsegu koji se koristi u klinici.

[0004] Prema tome, postoji potreba za razumevanjem i kontrolom faktora koji su u vezi sa CTL i koji utiču na CTL i sadržaj sijalinske kiseline u rekombinovanim proteinima, posebno rekombinovanim proteinima, kao što je REMICADE® (infliksimab) ili HUMIRA® (adalimumAt), koji se daju ljudima.

SUŠTINA PRONALASKA

[0005] Pronalazak obezbeđuje postupak za proizvodnju antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena koji ima sadržaj C terminalnog lizina od 20% do 70%, i sadržaj sijalinske kiseline od 1% do 20%, što postupak obuhvata:

gajenje u kulturi ćelije domaćina koja je osetljiva na cink koja je transfektovana sa DNK koji kodira antitelo u medijumu kulture koji sadržI 0,5 µM do 6,5 µM cinka; i

kontrolu koncentracije cinka u medijumu kulture, pri čemu se proizvodi antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena.

[0006] Pronalazak dalje obezbeđuje postupak za kontrolu:

a) sadržaja C-terminalnog lizina antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena koje ima sadržaj C-terminalnog lizina od 20% do 70%;

b) sadržaja sijalinske kiseline antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena koji ima sadržaj sijalinske kiseline od 1% do 20%;

c) sadržaj galaktoze u antitelu ili njegovom fragmentu za vezivanje antigena koji ima sadržaj galaktoze od 50% do 90%; i/ili

d) odnos sijalinske kiseline prema galaktozi u antitelu koje ima odnos sijalinske kiseline prema galaktozi od 0,05 do 0,20,

u postupku biosinteze antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena u medijumu kulture, pri čemu postupak obuhvata:

praćenje nivoa cinka u medijumu kulture tokom biosinteze antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena; i

regulaciju nivoa cinka u medijumu kulture tokom biosinteze antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena.

[0007] Prikazani su postupci za proizvodnju antitela, na primer, anti-tumorskog faktora nekroze alfa (TNFα) antitela, kao što je monoklonsko antitelo cA2 (ovde se takođe navodi kao infliksimab), koje ima željeni sadržaj C-terminalnog lizina (CTL), sadržaj sijalinske kiseline, sadržaj galaktoze i/ili odnos sijalinske kiseline prema galaktozi kontrolisanjem uslova u kulturi, uključujući koncentraciju cinka, koncentraciju etilendiamintetrasirćetne kiseline (EDTA) i vreme sakupljanja.

[0008] Jedno izvođenje pronalaska je postupak za proizvodnju antitela koje ima sadržaj C-terminalnog lizina od 20% do 70%, i sadržaj sijalinske kiseline od 1% do 20%, postupak obuhvata gajenje u kulturi ćelije domaćina koja je osetljiva na cink i u kojoj je izvršena transfekcija sa DNK koje kodira antitelo u medijumu kulture koji sadrži 0,5 µM do 6,5 µM cinka; i kontrolu koncentracije cinka u medijumu kulture, pri čemu se proizvodi antitelo. U nekim izvođenjima, sadržaj C-terminalnog lizina u antitelu je oko 40% do oko 70%, npr., oko 55% do oko 65%, npr., ili oko 60%. U nekim izvođenjima, sadržaj sijalinske kiseline antitela je oko 3% do oko 14%. U nekim izvođenjima, antitelo ima sadržaj galaktoze od oko 50% do oko 90%, ili oko 45% do oko 85%. U nekim izvođenjima, antitelo ima odnos sijalinske kiseline prema galaktozi od oko 0,05 do oko 0,20.

[0009] U nekim izvođenjima, antitelo je anti-TNFα antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena, gde pomenuto anti-TNFα antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena (i) kompetitivno inhibira vezivanje A2 (ATCC Pristupni Br. PTA-7045) za humani TNFα; i (ii) vezuje neutralizujući epitop humanog TNFα sa afinitetom od najmanje 1 x 10<8>litara/molu, mereno kao konstanta asocijacije (Ka). Anti-TNFa antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena može da bude, npr., himerno antitelo, humano antitelo, ili humanizovano antitelo. U nekim izvođenjima, anti-TNFα antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena može da bude imunoglobulin klase IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 ili IgM i, u nekim izvođenjima, sadrži konstantni region IgG1. U nekim izvođenjima, anti-TNFα antitleo ili njego fragment za vezivanje antigena se bira iz grupe koja se sastoji od FAt, FAt’, F(At’)2 i Fv.

[0010] U nekim izvođenjima, anti-TNFα antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena sadrži humani konstantni region i ne-humani varijabilni region, ili humani konstantni region i humani varijabilni region.

[0011] U nekim izvođenjima, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena sadrži najmanje jedan humani laki lanac i najmanje jedan humani teški lanac. U nekim izvođenjima, laki lanac sadrži sve antigen vezujuće regione lakog lanca A2 (ATCC Pristupni Br. PTA-7045). U nekim izvođenjima, teški lanac sadrži sve antigen vezujuće regione teškog lanca A2 (ATCC Pristupni Br. PTA-7045). U još drugim izvođenjima, laki lanac sadrži sve antigen vezujuće regione lakog lanca A2 (ATCC Pristupni Br. PTA-7045) i teški lanac sadrži sve antigen vezujuće regione teškog lanca A2 (ATCC Pristupni Br. PTA-7045).

[0012] U nekim izvođenjima, anti-TNFα antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena sadrži humani konstantni region IgG1 i ne-humani varijabilni region koji sadrži sekvencu aminokiselina koja se bira od grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3 i SEQ ID NO: 5, ili je kodirana sekvencom nukleinske kiseline koja se bira iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2 i SEQ ID NO: 4.

[0013] U nekim izvođenjima, anti-TNFα antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena ima epitopsku specifičnost identičnu sa monoklonskim antitelom cA2 i, u nekim izvođenjima, anti-TNFα antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena je monoklonsko antitelo cA2.

[0014] U nekim izvođenjima, koncentracija cinka u medijumu kulture je u opsegu od oko 0,6 µM do oko 6,5 µM, ili oko 0,6 µM do oko 1,1 µM.

[0015] U nekim izvođenjima, medijum kulture dalje sadrži EDTA u koncentracionom opsegu od oko 2,5 µM do oko 30 µM, ili oko 5 µM do oko 16 µM, i postupak alje obuhvata kontrolu koncentracije EDTA u medijumu kulture.

[0016] U nekim izvođenjima, postupka dalje sadrži oporavljanje antitela, na primer, kada ćelije domaćina koje su osetljive na cink u medijumu u kulturi dostignu gustinu ćelija od oko 1,5 miliona ćelija po mL do oko 11 miliona ćelija po mL, ili oko 3 miliona ćelija po mL do oko 11 miliona ćelija po mL. U nekim izvođenjima, koncentracija cinka se kontroliše sve dok se ne dobije antitelo, ili tokom eksponencijalne faze rasta ćelija domaćina koje su osetljive na cink.

[0017] U nekim izvođenjima pronalaska, kontrolisanje koncentracije cinka obuhvata praćenje koncentracije cinka u medijumu kulture, i regulaciju koncentracije cinka u medijumu kulture, tako da je koncentracija cinka u medijumu kulture najmanje 0,5 µM ili u opsegu od oko 0,6 µM do oko 6,5 µM.

[0018] U nekim izvođenjima pronalaska, ćelija domaćina koja je osetljiva na cink je SP2/0 ćelija.

[0019] Drugo izvođenje pronalaska je postupka za kontrolu sadržaja C-terminalnog lizina u antitelu koje ima sadržaj C-terminalnog lizina od 20% do 70%, u postupku biosinteze antitela u medijumu kulture, postupak obuhvata praćenje nivoa cinka u medijumu kulture tokom biosinteze antitela; i regulaciju nivoa cinka u medijumu kulture tokom biosinteze antitela.

[0020] Još drugo izvođenje pronalaska je postupak za kontrolu sadržaja sijalinske kiseline antitela koje ima sadržaj sijalinske kiseline 1% do 20% u postupku biosinteze antitela u medijumu kulture, postupak obuhvata praćenje nivoa cinka u medijumu kulture tokom biosinteze antitela; i regulaciju nivoa cinka u medijumu kulture tokom biosinteze antitela.

[0021] Još drugo izvođenje pronalaska je postupak za kontrolu sadržaja galaktoze antitela koje ima sadržaj galaktoze 50% do 90% u postupku biosinteze antitela u medijumu kulture, postupak obuhvata praćenje nivoa cinka u medijumu kulture tokom biosinteze antitela; i regulaciju nivoa cinka u medijumu kulture tokom biosinteze antitela.

[0022] Još drugo izvođenje pronalaska je postupak za kontrolu odnosa sijalinske kiseline prema galaktozi u antitelu koje ima odnos sijalinske kiseline prema galaktozi 0,05 do 0,20 u postupku biosinteze antitela u medijumu kulture, postupak obuhvata praćenje nivoa cinka u medijumu kulture tokom biosinteze antitela; i regulaciju nivoa cinka u medijumu kulture tokom biosinteze antitela.

[0023] U nekim izvođenjima postupak za kontrolu sadržaja CTL, sijalinske kiseline ili galaktoze, odnosa sijalinske kiseline prema galaktozi, antitelo je anti-TNFα antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena, i/ili antitelo se biosintetiše od SP2/0 ćelije.

[0024] U jednom izvođenju, antitelo je mAt koje se vezuje za aminokiseline epitopa TNF, koji je proizveden od hibridoma ili od rekombinovanog domaćina. U jednom izvođenju, antitelo je himerno antitelo koje prepoznaje epitop koji je prepoznat od A2. U drugom izvođenju, antitielo je himerno antitelo naznačeno kao himerno A2 (cA2) (tj., infliksimab).

[0025] Karakterizacija i postupci dobijanja i korišenja anti-TNF antitela su detaljno prikazani i opisani u, na primer, "Anti-TNF antibodies, compositions, methods and uses", George Heavner et al., U.S. Patent No. 7,250,165, podnet 1 avgusta, 2001, izdat 31 jula, 2007 i "Anti- TNF antibodies, compositions, methods and uses", Jill Giles-Komar et al., U.S. Application number 10/394,471, Publication number US 2004/0185047 A1, podnet 21 marta, 2003, i "Recombinant A2-specific TNFαspecific antibodies", Junming Le et al., U.S. Patent No. 7,252,823, podnet 6 februara, 2004, izdat 7 avgusta 2007.

[0026] U nekim izvođenjima, antitela uključuju mišje mAt A2, koje je proizvedeno od ćelijske linije naznačene c134A i himerno antitelo cA2, koje je proizvedeno od ćelijske linije naznačene c168A. Ćelijska linija c134A je skladištena u Janssen Research & Development, Welsh & McKean Road, Springhouse, PA. Ćelijska linija c168A se skladišti u Janssen Research & Development, 200 Great Valley Parkway, Malvern, Pennsylvania, 19355, Janssen Biologics BV, Leiden, The Netherlands.

[0027] Postupci koji su ovde prikazani mogu da se koriste za poboljšanje homogenosti serije u, na primer, komercijalnom postupku dobijanja, kao što je postupak dobijanja koji se koristi za proizvodnju infliksimaba, monoklonskog anti-TNFα antitela koje se koristi u lečenju, na primer, autoimunskih bolesti kod ljudi.

KRATAK OPIS SLIKA

[0028] Navedno će biti jasnije iz sledećeg detaljnijeg opisa primera izvođenja pronalaska, kao što je ilustrovano u pratećim slikama.

[0029] Patent ili dokument prijave sadrži najmanje jednu sliku u boji. Kopije ovog patenta ili objave patenta sa slikama u boji biće obezeđene od ureda po zahtevu i uplati neophodne takse.

SL.1 pokazuje elektroferogram kapilarnog izoelektričnog fokusiranja (cIEF) uzorka infliksimaba. SL.2 je podešen linijski grafik procenta des-lizina (% C-terminalnog lizina koji nedostaje, skraćeno des-Lys) iz reverzno faznog peptidnog mapiranja kao funkcija procenta cIEF Maksimalne vrednosti 1, i pokazuje korelaciju između sadržaja CTL (eksprimiran kao procenat des-Lys) i procenta Maksimalne vrednosti 1.

SL. 3 je grafik koji prikazuje uklanjanje CTL (eksprimirano kao procenat des-Lys i računato upotrebom cIEF postupka iz podataka Maksimalne vrednosti 1) kao funkcije starosti bioreaktora, i pokazuje efekat varirajućih koncentracija Zn+2 na uklanjanje CTL. Y-osa: % desl-Lys; X-osa: starost bioreaktora u danima.

SL. 4 je grafik koji prikazuje oligosaharide infliksimaba sa sijalinskom kiselinom, kao što se određuje WAX postupkom, kao funkcije starosti bioreaktora, i pokazuje efekat varirajućih koncentracija Zn+2 na procenat sijalinske kiseline. Y-osa: % sijalinske kiseline; X-osa: starost bioreaktora u danima.

SL. 5 je grafik koji prikazuje gustinu vijabilnih ćelija kao funkciju starosti bioreaktora, i pokazuje efekat varirajućih koncentracija Zn+2 na gustinu vijabilne ćelije. Y-osa: gustina vijabilnih ćelija (milioni vijabilnih ćelija/mL); X-osa: starost bioreaktora u danima.

SL.6 je grafik koji predstavlja procenat vijabilnih ćelija kao funkcije starosti bioreaktora, i pokazuje efekat varirajućih Zn+2 koncentracija na vijabilnost kulture. Y-osa: % vijabilnih ćelija, X-osa: starost bioreaktora u danima.

SL. 7 je grafik koji predstavlja koncentraciju infliksimaba kao funkciju starosti bioreaktora, i pokazuje efekat varirajućih Zn+2 koncentracija na koncentraciju infliksimaba. Kao što je naznačeno, koncentracija na y-osi u mg/mL sadrži tipografsku grešku. Koncentracija je mg/L. Y-osa: koncentracija infliksimaba (mg/L), X-osa: starost bioreaktora u danima.

SL.8A je grafik uklanjanja CTL (izražen kao procenat des-Lys i izračunan upotrebom cIEF postupka iz podataka Maksimalne vrednosti 1) kao funkcije starosti bioreaktora, i pokazuje efekat varirajućih EDTA koncentracija na uklanjanje CTL u prisustvu 0,76 µM Zn+2 početna koncentracija Zn+2 u bioreaktoru odgovara oznaci "Fe:5 Zn:1 EDTA: 10" je 6,3 µM, pre nego 0,76 µM; ciljana koncentracija 0,76 µM Zn+2 se uključuje od Dana 13 do kraja eksperimeta). Y-osa: % desl-Lys; X-osa: starost bioreaktora u danima.

SL.8B je grafik koji prikazuje uklanjanje CTL (izraženo kao procenat des-Lys i računato upotrebom cIEF postupka iz podataka Maksimalne vrednosti 1) kao funkcije starosti bioreaktora, i pokazuje efekat varirajućih EDTA koncentracija na uklanjanje CTL u prisutvu 1,7 µM Zn+2. Y-osa: % deslLys; X-osa: starost bioreaktora u danima.

SL. 9A je grafik koji prikazuje oligosaharide infliksimaba sa sijalinskom kiselinom, kao što se određuje WAX postupkom, kao funkcije starosti bioreaktora, i pokazuje efekat varirajućih koncentracija EDTA na procenat sijalinske kiseline u prisustvu 0,76 µM Zn+2 (početna koncentracija Zn+2 u bioreaktoru koja odgovara oznaci "Fe:5 Zn:1 EDTA: 10" je 6,3 µM, pre nego 0,76 µM; ciljana koncentracija od 0,76 µM Zn+2 se uključuje od Dana 13 do kraja eksperimenta). Y-osa: % sijalinske kiseline; X-osa: starost bioreaktora u danima.

SL. 9B je grafik koji prikazuje oligosaharide infliksimaba sa sijalinskom kiselinom, kao što se određuje WAX postupkom, kao funkcije starosti bioreaktora, i pokazuje efekat varirajućih koncentracija EDTA na sadržaj sijalinske kiseline u prisustvu 1,7 µM Zn+2. Y-osa: % sijalinske kiseline; X-osa: starost bioreaktora u danima.

SL.9C je grafik koji prikazuje procenat G0F (WAX Komponenta 1) kao funkcije starosti bioreaktora, i pokazuje efekat varirajućih koncentracija EDTA na procenat ne-galaktozilovanih vrsta u prisustvu 0,76 µM Zn+2 (početna koncentracija Zn+2 u bioreaktoru odgovara nivou prema naznaci "Fe:5 Zn:1 EDTA: 10" je 6,3 µM, pre nego 0,76 µM; ciljana koncentracija 0,76 µM Zn+2 se uključuje od Dana13 do kraja eksperimeta).

SL. 9D je grafik koji prikazuje procenat G0F (WAX Komponenta 1) kao funkcije starosti bioreaktora, i pokazuje efekat varirajućih koncentracija EDTA na procenat ne-galaktozilovanih vrsta u prisustvu 1,7 µM Zn+2.

SL. 10 je grafik koji prikazuje gustine vijabilnih ćelija kao funkcije starosti bioreaktora, i pokazuje efekat varirajućih EDTA koncentracija na gustinu vijabilnih ćelija u prisustvu 0,76 µM Zn+2 ili 1,7 µM Zn+2 (početna koncentracija Zn+2 u bioreaktoru koja odgovara prema naznaci "Fe:5 Zn:1 EDTA: 10" je 6,3 µM, pre nego 0,76 µM; ciljana koncentracija 0,76 µM Zn+2 se uključuje od dana 13 do kraja eksperimenta). Y-osa: gustina vijabilnih ćelija (milioni vijabilnih ćelija/mL); X-osa: starost bioreaktora u danima.

SL.11A je grafik koji prikazuje gustine vijabilnih ćelija kao funkcije starosti bioreaktora, i pokazuje efekat varirajućih EDTA koncentracija na vijabilnost kulture u prisustvu 0,76 µM Zn+2 ili 1,7 µM Zn+2 (početna koncentracija Zn+2 u bioreaktoru koja odgovara naznaci "Fe:5 Zn:1 EDTA:10" je 6,3 µM, pre nego 0,76 µM; ciljana koncentracija 0,76 µM Zn+2 se uključuje od Dana 13 do kraja eksperimenta). Y osa: % vijabilnih ćelija; X-osa: starost bioreaktora u danima.

SL. 11B je proširenje Dana 0-25 grafika koji je prikazan na SL. 11A. Y-osa: gustina vijabilnih ćelija (milioni vijabilnih ćelija/mL); X-osa: starost bioreaktora u danima.

SL. 12A je grafik koncentracije infliksimaba kao funkcije starosti bioreaktora, i varirajuće koncentracije EDTA na koncentracije infliksimaba u prisustvu 0,76 µM Zn+2 ili 1,7 µM Zn+2 (početna koncentracija Zn+2 u bioreaktoru koja odgovara prema oznaci "Fe:5 Zn:1 EDTA: 10" je 6,3 µM, pre nego 0,76 µM; ciljana koncentracija 0,76 µM Zn+2 je uključena od Dana 13 do kraja eksperimenta). Kako je naznačena koncentracija na y-osi u mg/mL sadrži tipografsku grešku. Koncentracija je mg/L. Y-osa: koncentracija infliksimba (mg/L), X-osa: starost bioreaktora u danima.

SL. 12B je proširenje u Danima 0-25 grafika koji je prikazan na SL. 12A. Kao što je navedena koncentracija na y-osi u mg/mL sadrži tipografsku grešku. Koncentracija je mg/L. Y-osa: koncentracija infliksimaba (mg/L), Xosa: starost bioreaktora u danima.

SL. 13A je grafik koji prikazuje uklanjanje CTL (izraženo kao procenat des-Lys i računato upotrebom cIEF postupka iz podataka Maksimalne vrednosti 1) kao funkcije starosti bioreaktora, i pokazuje efekat varirajućih koncentracija EDTA (µM) na uklanjanje CTL (rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost iz dva duplikata bioreaktora). Y-osa: % desl-Lys; X-osa: starost bioreaktora u danima.

SL. 13B je grafik koji prikazuje oligosaharide infliksimaba sa sijalinskom kiselinom, kao što se određuje WAX postupkom, kao funkcije starosti bioreaktora, i pokazuje efekat varirajuće koncentracije EDTA (µM) na sadržaj sijalinske kiseline (rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost iz dva duplikata bioreaktora). Y-osa: % sijalinske kiseline; X-osa: starost bioreaktora u danima.

SL. 13C je grafik gustina vijabilnih ćelija kao funkcije starosti bioreaktora, i pokazuje efekat varirajućih koncentracija EDTA (µM) na gustinu vijabilnih ćelija. Y-osa: gustina vijabilnih ćelija (milioni vijabilnih ćelija/mL); X-osa: starost bioreaktora u danima .

SL. 13D je grafik procenta vijabilnih ćelija predstavljenih kao funkcija starosti bioreaktora, i pokazuje efekat varirajućih koncentracija EDTA (µM) na vijabilnost kulture. Y-osa: % vijabilnih ćelija; X-osa: starost bioreaktora u danima.

SL. 13E je grafik koncentracije infliksimaba kao funkcije starosti bioreaktora, i pokazuje efekat varirajuće EDTA koncentracije (µM) na koncentraciju infliksimaba. Kao što je nazanačeno koncentracija na y-osi u mg/mL sadrži tipografsku grešku. Koncentracija je mg/L. Y-osa: koncentracija infliksimaba (mg/L), X-osa: starost bioreaktora u danima.

SL. 13F je proširenje u Danima 0-25 grafika koji je prikazan na SL. 13E. Kao što je nazanačeno koncentracija na y-osi u mg/mL sadrži tipografsku grešku. Koncentracija je mg/L. Y-osa: koncentracija infliksimaba (mg/L), Xosa: starost bioreaktora u danima.

SL. 13G je grafik koji prikazuje procenat G0F (WAX Komponenta 1) kao funkcija starosti bioreaktora, i pokazuje efekat varirajuće EDTA koncentracije (µM) na procenat oligosaharida infliksimaba kojima nedostaje galaktoza. X-osa: starost bioreaktora u danima.

SL.14A je grafik uklanjanja CTL (izražen kao procenat des-Lys i računat upotrebom cIEF postupka iz podataka Maksimalne vrednosti 1) kao funkcije starosti bioreaktora, i pokazuje efekat varirajuće EDTA koncentracije (µM) na uklanjanje CTL. X-osa: starost bioreaktora u danima.

SL. 14B je grafik koji prikazuje oligosaharide infliksimaba sa sijalinskom kiselinom, kao što se određuje WAX postupkom, kao funkcije starosti bioreaktora, i pokazuje efekat varirajuće koncentracije EDTA (µM) na sadržaj sijalinske kiseline.

SL.14Cje grafik koji prikazuje gustinu vijabilnih ćelija kao funkciju starosti bioreaktora, i pokazuje efekat varirajuće EDTA koncentracije (µM) na gustinu vijabilnih ćelija. Y-osa: gustina vijabilnih ćelija (milioni vijabilnih ćelija/mL); X-osa: starost bioreaktora u danima.

SL. 14D je grafik koji prikazuje procenat vijabilnih ćelija kao funkcije starosti bioreaktora, i pokazuje efekat varirajuće EDTA koncentracije (µM) na vijabilnost kulture. Y-osa: % viAtilnih ćelija; X-osa: starost bioreaktora u danima.

SL. 14E je grafik koji prikazuje koncentraciju infliksimaba kao funkciju starosti bioreaktora, i pokazuje efekat varirajuće EDTA koncentracije (µM) na koncentraciju infliksimaba. Kao što je nazanačeno koncentracija na y-osi u mg/mL sadrži tipografsku grešku. Koncentracija je mg/L. Y-osa: koncentracija infliksimaba (mg/L), X-osa: starost bioreaktora u danima.

SL. 14F je proširenje u Danima 0-25 grafika koji je prikazan na SL. 14E. Kao što je nazanačeno koncentracija na y-osi u mg/mL sadrži tipografsku grešku. Koncentracija je mg/L. Y-osa: koncentracija infliksimaba (mg/L), X osa: starost bioreaktora u danima.

SL. 15 je grafik koji prikazuje G0F (WAX Komponenta 1) kao funkciju starosti bioreaktora, i pokazuje efekat varirajuće EDTA koncentracije (µM) na procenat oligosaharida infliksimaba kojima nedostaje galaktoza.

SL.16 pokazuje biosintetski put najčešćih neutralnih oligosaharida infliksimaba, G0F, G1F i G2F, i biosintetski put iz neutralnih oligosaharida do sijalizovanih oblika.

SL. 17 je grafik koji prikazuje CTL uklanjanje (računato upotrebom cIEF postupka iz podataka Maksimalne vrednosti 1) kao funkcije koncentracije Zn+2, i pokazuje procenat uklanjanja CTL u Danu 20 za DOE3 i BSA Mešanje Br. 1 eksperimente (plave tačke podataka i linija predstavlja srednju vrednost).

SL. 18 je grafik koji prikazuje CTL uklanjanje (računato upotrebom cIEF postupka iz podataka Maksimalne vrednosti 1) kao funkcije koncentracije Zn+2, i pokazuje procenat uklanjanja CTL u Danu 13 za DOE3 ekperiment.

SL.19 je grafik koji prikazuje sadržaj sijalinske kiseline kao funkciju koncentracije Zn+2 i pokazuje procenat koncentracije sijalinske kiseline u Danu 20 za DOE3 i BSA Mešanje Br. 1 eksperimenta (linija predstavlja srednju vrednost).

SL. 20 je grafik koji predstavlja procenat WAX Komponente 1 (GOF) kao funkciju koncentracije Zn+2, i pokazuje procenat koncentracije oligosaharida infliksiamba kojima nedostaje galaktoza u Danu 20 za DOE3 i eksperimente BSA Mešanja Br.1.

SL.21 je grafik koji predstavlja procenu odnosa sijalinske kiseline prema galaktozi (procenjeno kao procenat sijalinske kiseline/(100 – procenat WAX Komponenta 1) kao funkcije koncentracije Zn+, i pokazuje procenjeni odnos sijalinske kiseline prema galaktozi u Danu 20 za DOE3 i eksperimente BSA Mešanja Br.1.

SL. 22 je grafik koji predstavlja uklanjanje CTL (računato upotrebom cIEF postupka iz podataka Maksimalne vrednosti 1) kao funkcija koncentracije EDTA, i pokazuje procenat uklanjanja CTL u prisustvu 1,1-1,2 µM Zn+2 u Danima 33-35 za experimente Mešanja Br.1 i Br.2.

SL. 23 je grafik koji predstavlja procenat sijalinske kiseline kao funkciju koncentracije EDTA, i pokazuje procenat sijalinske kiseline u prisustvu 1,1-1,2 µM Zn+2 u Danima 33-35 za eksperimente Mešanja Br.1 i Br.2.

SL. 24 je grafik koji predstavlja procenat WAX Komponente 1 kao funkciju koncentracije EDTA, i pokazuje procenat oligosaharida infliksimaba kojima nedostaje galaktoza u prisustvu 1,1-1,2 µM Zn+2 u Danima 33-35 za eksperimente Mešanja Br.1 i Br.2.

SL.25 je grafik koji prikazuje procenjeni odnos sijalinske kiseline prema galaktozi (procenjeno kao procenat sijalinske kiseline/(100 – procenat WAX Komponenta 1) kao funkcija koncentracije EDTA, i pokazuje procenjeni odnos sijalinske kiseline prema galaktozi u prisustvu 1,1-1.2 µM Zn+2 u Danima 33-35 za eksperimente Mešanja Br.1 i Br.2.

SL. 26 je grafik koji prikazuje procenat sijalinske kiseline (računato iz WAX Komponente 5) kao funkcije procenta G0F (računato iz WAX Komponente 1), prikazuje inverzni odnos između procenta sijalinske kiseline i WAX Komponente 1, indikator oligosaharida infliksimaba kojima nedostaje galaktoza, za DOE3 i BSA eksperimente Mešanja Br.1 i Br.2.

SL-e.27A i 27B obezbeđuju šematske dijagrame plazmida koji se koriste za ekspresiju himernih H (pA2HG1apgpt) i L (pA2HuKapgpt) lanaca himernog A2 antitela.

SL.28 je sekvenca aminokiselina humanog TNF kao SEQ ID NO:1.

SL-e. 29A-29B. SL. 29A je sekvenca nukleinske kiseline (SEQ ID NO:2) i odgovarajuća sekvenca aminokiseline (SEQ ID NO:3) kloniranog cA2 varijabilnog regiona lakog lanca. SL.29B je nukleinska sekvenca (SEQ ID NO:4) i odgovarajuća sekvenca aminokiselina (SEQ ID NO:5) kloniranog cA2 varijabilnog regiona teškog lanca.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

[0030] Sledi opis primera izvođenja pronalaska.

[0031] Jedno izvođenje obezbeđuje postupak za proizvodnju antitela koje ima sadržaj C-terminalnog lizina od 20% do 70%, i sadržaj sijalinske kiseline od 1% do 20%, koji obuhvata gajenje ćelije domaćina koja je osetljiva na cink u kulturi u kojoj je izvršena transfekcija DNK koje kodira antitelo u medijumu kulture koji sadrži 0,5 µM do 6 µM cinka; i kontrolisanje koncentracije cinka u medijumu kulture, pri čemu se proizvodi antitelo.

[0032] Sadržaj CTL sadržaj ovde je izražen kao procenat teških lanaca koji imaju C-terminalni lizin i može da se izračuna pomoću sledeće jednačine: Sadržaj CTL (%) = (broj teških lanaca koji imaju CTL)/(ukupan broj teških lanaca) x 100. Uklanjanje CTL je ovde izraženo kao procenat teških lanaca koji nemaju C-terminalni lizin (des-Lys). Prema tome, "80% Des-Lys" je ekvivalentno sa 20% CTL sadržajem. U nekim izvođenjima postupaka koji se ovde opisuju, CTL sadržaj antitela ili anti-TNFa antitela, ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena, je oko 40% do oko 70%, specifično, oko 55% do oko 65%, i specifičnije, oko 60%.

[0033] Sadržaj sijalinske kiseline ovde je eksprimiran kao procenat oligosaharida koji sadrže sijalinsku kiselinu, i može da se izračuna pomoću sledeće jednačine: sadržaj sijalinske kiseline (%) = (broj oligosaharida koji sadrže sijalinsku kiselinu)/(ukupan broj oligosaharida) x 100. Ova jednačina se nezavisno primenjuje na broj ostataka sijalinske kiseline u oligosaharidu. Drugim rečima, bez obzira na to da li su, na primer, jedan ili dva ostatka sijalinske kiseline u oligosaharidu, oligosaharid se računa samo jednom za svrhu računanja sadržaja sijalinske kiseline. U nekim izvođenjima postupaka koji se ovde opisuju, sadržaj sijalinske kiseline antitela ili anti-TNFα antitela, ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena, je oko 3% do oko 14%.

[0034] Sadržaj galaktoze je ovde eksprimiran kao procenat oligosaharida koji sadrže galaktozu, i može da se izračuna pomoću sledeće jednačine: sadržaj galaktoze (%) = (broj oligosaharida koji sadrže galaktozu)/( ukupan broj oligosaharida) x 100. Ova jednačina se nezavisno primenjuje na broj jedinica galaktoze u oligosaharidu. Drugim rečima, bez obzira na to da li su, na primer, jedan ili dva ostatka galaktoze u oligosaharidu, oligosaharid se računa samo jednom za svrhu računanja sadržaja galaktoze. U nekim izvođenjima postupaka koji se ovde opisuju, antitelo ili anti-TNFα antitelo, ili njegov fragment za vezivanje antigena, ima sadržaj galaktoze od oko 50% do oko 90% i specifično, od oko 45% do oko 85%.

[0035] Obično, oba teška lanca antitela, kao što je infliksimab, su glikozilovana. Međutim, u nekim slučajevima, neki od teških lanaca ostaju aglikozilovani. Na primer, u nekim izvođenjima, približno 94% molekula antitela je glikozilovano na oba lanca, približno 6% molekula antitela su poluglikozilovani, i približno 0,1% molekula antitela su potpuno aglikozilovani.

[0036] Odnos sijalinske kiseline prema galaktozi se računa iz molarnog odnosa sijalinske kiseline prema galaktozi u oligosaharidima infliksimaba. U nekim izvođenjima postupaka koji se ovde opisuju, antitelo ili anti-TNFα antitelo, ili njegov fragment za vezivanje antigena, ima odnos sijalinske kiseline prema galaktozi od oko 0,05 do oko 0,20.

[0037] "Ćelija domaćina koja je osetljiva na cink," kao što se ovde koristi, označava ćeliju domaćina koja reguje na promene u koncentraciji cinka u medijumu kulture. Reagovanje ćelije domaćina na promene u koncentraciji cinka može da se proceni, na primer, merenjem efekta varirajućih koncentracija cinka na sadržaj CTL, sadržaj sijalinske kiseline, sadržaj galaktoze, i odnos sijalinske kiseline prema galaktozi u antitelu koje je proizvela ćelija domaćina. Postupci za procenu sadržaja CTL, sadržaja sijalinske kiseline, sadržaja galaktoze, i odnosa sijalinske kiseline prema galaktozi u antitelu koje je proizvedeno od strane ćelija domaćina su opisani u Primerima.

[0038] Ovde je prikazan medijum kulture koji sadrži količinu cinka koja je veća od oko 0.5 µM. U nekim izvođenjima, koncentracija cinka u medijumu kulture je u opsegu od oko 0,6 µM do oko 6,5 µM i, poželjno, u opsegu od oko 0,6 µM do oko 1,1 µM. U nekim izvođenjima, količina ili koncentracija cinka u medijumu kulture nije toksična za ćelije domaćina koje reaguju na cink, na primer, ne smanjuju ili ne smanjuju značajno vijabilnost ćelija, rast ćelija ili proizvodnju antitela, posebno u prvih 20-25 dana kulture.

[0039] U nekim izvođenjima, medijum kulture dalje sadrži etilendiamintetrasirćetnu kiselinu (EDTA) ("EDTA" ili "ukupnu EDTA" kao što se ovde navodi) u opsegu koncentracija od oko 2,5 µM do oko 30 µM i, poželjno, u opsegu koncentracija od oko 5 µM do oko 16 µM. "EDTA bez gvožđa" kao što se ovde koristi, odnosi se na EDTA koji nije heliran sa (Fe+3). Količina ili koncentracija EDTA bez gvožđa (skraćeno [EDTA - Fe+3]) može da se izračuna oduzimanjem količine ili koncentracije Fe3+ iz količine ili koncentracije ukupnog EDTA. Jon Fe+3 ima najveći afinitet za EDTA od jona metala u medijumu kulture. Prema tome, Fe+3, kada je prisutan, preferencijalno vezuje EDTA u medijumu kulture ćeliija. Koncentracija EDTA bez gvožđa predstavlja EDTA koji je slobodan za vezivanje Zn+2 i drugih jona metala u medijumu kulture.

[0040] U nekim izvođenjima postupaka koji se ovde opisuju, količina ili koncentracija EDTA i/ili EDTA bez gvožđa u medijumu kulture nije toksična za ćelije domaćina koje reaguju na cink, na primer, ne smanjuje ili ne smanjuje značajno vijabilnost ćelija, rast ćelija ili proizvodnju antitela, posebno u prvih 20-25 dana kulture.

[0041] "Kontrolisanje," kao što se ovde koristi, označava proveru i/ili regulaciju. Kontrolisanje uključuje opažanje/merenje supstance koja se kontroliše (direktno ili indirektno) i korišćenje tih merenja da obezbedi povratni odgovor da se naprave korekcije prema željenom rezultatu. Kontrolisanje uključuje i praćenje i regulaciju, na primer, koncentracije cinka i/ili EDTA i/ili EDTA bez gvožđa u medijumu kulture. Obično, koncentracija cinka i/ili EDTA i/ili EDTA bez gvožđa je kontrolisana tokom trajanja kulture. U nekim izvođenjima postupaka koji se ovde opisuju, koncentracija cinka i/ili EDTA i/ili EDTA bez gvožđa je kontrolisana u eksponencijalnoj fazi rasta ćelija domaćina koje odgovaraju na cink, ili tokom prvih približno 10-25 dana kulture.

[0042] Koncentracija cinka i/ili EDTA i/ili EDTA bez gvožđa u medijumu kulture može da se kontroliše, na primer, praćenjem nivoa cinka i/ili EDTA i/ili EDTA bez gvožđa u medijumu kulture; i/ili EDTA i/ili EDTA bez gvožđa u medijumu kulture. Prema tome, u nekim izvođenjima postupaka koji se ovde opisuju, kontrolisanje koncentracije cinka obuhvata praćenje koncentracije cinka u medijumu kulture, i regulaciju koncentracije cinka u medijumu kulture, tako da je koncentracija cinka u mediumu kulture najmanje 0,5 µM, ili oko 0,6 µM do oko 6,5 µM.

[0043] Postupci praćenja nivoa cinka i/ili EDTA i/ili EDTA bez gvožđa su poznati stručnjacima iz oblasti tehnike. Na primer, koncentracija cinka i drugih jona metala može da se meri induktivno kuplovanom plazma masenom spektrometrijom (ICP-MS), dok koncentracija EDTA može da se meri HPLC postupkom.

[0044] "Regulacija," kao što se ovde koristi, označava stavljanje ili održavanje. Regulacija uključuje održavanje, na primer, koncentracije cinka i/ili EDTA u medijumu kulture, i podešavanje, na primer, koncentracije cinka i/ili EDTA u medijumu, po potrebi. Prema tome, cink (npr., ne-toksična količina cinka) može da bude uključena u medijumu kulture na početnoj koncentraciji od, na primer, više od oko 5 µM, zatim podešena do koncentracije od, na primer, 0,6 µM do oko 1,1 µM. Podešavanje može da bude, na primer, istovremeno sa ili odmah nakon tranzicije iz faze eksponencijalnog rasta do faze ravnotežnog rasta. Alternativno, koncentracija cinka može da se održi na koncentraciji, od na primer, 0,6 µM do oko 1,1 µM tokom trajanja kulture.

[0045] Regulacija nivoa cinka i/ili EDTA i/ili EDTA bez jona gvožđa može da se postigne, na primer, kroz direktno dodavanje cinka, gvožđa i/ili EDTA u medijum kulture; kroz mešanje sirovih materijala koji sadrže cink, gvožđe i/ili EDTA; kroz tretman sirovih materijala da se podese njihove koncentracije cinka, gvožđa i/ili EDTA; i/ili kroz modifikaciju postupka dobijanja sirovih materijala da se dostignu željeni nivoi cinka, gvožđa i/ili EDTA. Postupci regulacije komponenti medijuma kulture su dobro poznati stručnjacima iz oblasti tehnike.

[0046] Medijum kulture može da sadrži druge sastojke zajedno sa cinkom i/ili EDTA. Izbor pogodnog medijuma kulture nalazi se u okviru znanja stručnjaka iz oblasti tehnike. U nekim izvođenjima, medijum za kulturu je medijum koji se oslobođen od seruma.

[0047] Za proizvodnju antitela može da se koristi bilo koja ćelija domaćina koja je poznata u oblasti tehnike, uključujući sisarske ćelije, kao što su SP2/0 ćelije, npr., mišja SP2/0 ćelija (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, CRL-1581), Drugi primeri ćelija domaćina su NS0 (European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, UK, ECACC No. 85110503), FO (ATCC CRL-1646) i Ag653 (ATCC CRL-1580) mišje ćelijske linije. Primer humane ćelijske linije mijeloma je U266 (ATTC CRL-TIB-196). Druge korisne ćelijske linije uključuju one koje se dobijaju iz ćelija ovarijuma kineskog hrčka (CHO) kao što su CHO-K1SV (Lonza Biologics, Walkersville, MD), CHO-K1 (ATCC CRL-61) or DG44. Ćelije mogu da se gaje u kulturi u jednoćelijskoj suspenziji ili na način koji zavisi od sidrenja.

[0048] U oblasti tehnike su poznati različiti sistemi za gajenje ćelija u kulturi, uključujući balone, roler boce, i bioreaktore, npr., bioreaktore sa rotirajućim rezervoarom. Medijum u kulturi može da se dodaje u serijskom procesu, u kome se medijum u kulturi dodaje jednom ćelijama u jednoj seriji ili, poželjno, u „fed batch“ postupak, u kome se periodično dodaju male serije medijuma kulture. Ćelije domaćina mogu takođe da se gaje u kulturi u perfuzionoj kulturi, koja uključuje kontinualno uklanjanje zapremine medijuma iz kulture, i zamene uklonjenog medijuma sa uporedivom zapreminom svežeg medijuma. Obično, perfuzione kulture mogu da se koriste tako da se postigne veća gustina ćelija u odnosu na serijskoj kulturi zatvorenog tipa, i može da se održava u dužim vremenskim periodima. Perfuzione kulture takođe omogućavaju ponovljena sakupljanja.

[0049] Postupci za proizvodnju antitela mogu dalje da sadrže dobijanje antitela. U nekim izvođenjima, antitelo može da se dobije kada ćelija domaćina koja odgovara na cink u medijumu kulture dostiže gustinu ćelija od oko 1,5 miliona ćelija po mL do oko 11 miliona ćelija po mL i, poželjno, oko 3 miliona ćelija po mL do oko 11 miliona ćelija po mL. Antitelo može da se dobije, na primer, direktnim hvatanjem proizvoda (DPC). U nekim izvođenjima postupaka koji se ovde opisuju, koncentracija cinka se kontroliše dok se ne dobije antitelo.

[0050] Sadržaj CTL i sijalinske kiseline može da bude preciznije kontrolisan kontrolisanjem starosti ćelije u vremenu sakupljanja ili dobijanja proizvoda. Prema tome, u nekim izvođenjima postupaka koji se ovde opisuju, antitelo se dobija istovremeno sa ili odmah nakon prelaska iz eksponencijalne faze rasta u ravnotežnu fazu rasta. U drugim izvođenjima, antitelo se dobija do ravnotežnog stanja rasta u kulturi. U nekim izvođenjima, antitelo se dobija tokom prvih 25 dana kulture, na primer, u danima 10-25, danima 15-20, ili oko dana 20. U drugim izvođenjima, antitelo se dobija nakon prvih 25 dana kulture.

[0051] Ovde je takođe obezbeđen postupak za kontrolisanje sadržaja C-terminalnog lizina antitela koje ima sadržaj C-terminalnog lizina od oko 20% do oko 70%, u postupku biosinteze antitela u medijumu kulture, postupak obuhvata praćenje nivoa cinka u medijumu kulture tokom biosinteze antitela; i regulaciju nivoa cinka u medijumu kulture tokom biosinteze antitela.

[0052] Ovde je takođe obezbeđen postupak za kontrolisanje sadržaja sijalinske kiseline antitela koje ima sadržaj sijalinske kiseline od oko 1% do oko 20% u postupku biosinteze antitela u medijumu kulture, postupak obuhvata praćenje nivoa cinka u medijumu kulture tokom biosinteze antitela; i regulaciju nivoa cinka u medijumu kulture tokom biosinteze antitela.

[0053] Ovde je takođe obezbeđen postupak za kontrolisanje sadržaja galaktoze antitela koje ima sadržaj galaktoze od oko 50% do oko 90% u postupku biosinteze antitela u medijumu kulture, postupak obuhvata praćenje nivoa cinka u medijumu kulture tokom biosinteze antitela; i regulaciju nivoa cinka u medijumu kulture tokom biosinteze antitela.

[0054] Ovde je takođe obezbeđen postupak za kontrolisanje odnosa sijalinske kiseline prema galaktozi u antitelu koje ima odnos sijalinske kiseline prema galaktozi od oko 0,05 do oko 0,20 u postupu biosinteze antitela u medijumu kulture, postupak obuhvata praćenje nivoa cinka u medijumu kulture tokom biosinteze antitela; i regulaciju nivoa cinka u medijumu kulture tokom biosinteze antitela.

[0055] U nekim izvođenjima postupka za kontrolisanje sadržaja CTL, sijalinske kiseline ili galaktoze, odnosa sijalinske kiseline prema galaktozi, antitelo je anti-TNFα antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena, i/ili antitelo je biosintetiše SP2/0 ćelija ili CHO ćelija.

ANTITELA I NJIHOVI FRAGMENTI

[0056] Kao što se ovde koristi, "antitelo" uključuje celo antitelo i bilo koji njegov fragment za vezivanje antigena ili jednolančani fragment.

[0057] Antitela mogu da uključe najmanje jedan od konstantnog regiona teškog lanca (Hc), varijabilnog regiona teškog lanca (Hv), varijabilnog regiona lakog lanca (Lv) i konstantni region lakog lanca (Lc), gde poliklonsko At, monoklonsko At, fragment i/ili njihovi regioni uključuju najmanje jedan varijabilni region teškog lanca (Hv) ili varijabilni region lakog lanca (Lv) koji vezuje porciju antigena i inhibira i/ili neutralizuje najmanje jednu biološku aktivnost antigena.

[0058] Antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena može da sadrži region za vezivanje antigena koji sadrži najmanje jedan humani region koji određuje komplementarnost (CDR1, CDR2 i CDR3) ili varijantu najmanje jednog varijabilnog regiona teškog lanca i najmanje jedan humani region koji određuje komplementarnost (CDR1, CDR2 i CDR3) ili varijantu najmanje jednog varijabilnog regiona lakog lanca. Takva antitela mogu da se dobiju hemijskim spajanjem različitih porcija (npr., okvirnih regiona CDR-a) antitela pomoću konvencionalnih postupaka, pripremom i eksprimiranjem (npr., jednog ili više) molekula nukleinske kiseline koji kodira antitelo korišenjem konvencionalnih postupaka rekombinovane DNK tehnologije ili korišćenjem bilo kog drugog pogodnog postupka.

[0059] Antitelo može da se dobije od primata, sisara, miša, može da bude himerno, humanizovano, ili humano. Antitelo može da uključi, na primer, najmanje jedno od mišjih-humanih himernih antitela, mišjih antitela, humanih antitela ili bilo kojih njihovih porcija, koji imaju najmanje jedan fragment za vezivanje antigena ili region varijabilnog regiona imunoglobulina.

[0060] Himerna antitela su molekuli različitih porcija koji se dobijaju iz različitih životinjskih vrsta, kao što su oni koji imaju varijabilni region koji se dobija iz mišjeg mAt i konstantnog regiona humanog imunoglobulina. Na primer, oni mogu da sadrže najmanje jedan različit domen, obično varijabilni domen, iz jednih vrsta i ostatak iz drugih vrsta; npr., mišja-humana himerna antitela. Oni se primarno koriste da smanje imunogenost tokom davanja i da povećaju prinose u proizvodnji, na primer, gde mišja mAt-a imaju veće prinose od hibridoma ali imaju veću imunogenost kod ljudi , tako da se koriste humana/mišja himerna mAt-a. Himerna antitela i postupci za njihovu proizvodnju su poznati iz oblasti tehnike (CAtilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277 (1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984); Neuberger et al., Nature 314:268-270 (1985); and Harlow and Lane Antibodies: a LAtoratory Manual Cold Spring Harbor LAtoratory (1988)).

[0061] Kao što se ovde koristi, termin "himerno antitelo" uključuje monovalentne, divalentne ili polivalentne imunoglobuline. Monovalentno himerno antitelo je dimer (HL) koga obrazuje himerni H lanac koji je povezan disulfidnim vezama sa himernim L lancem. Divalentno himerno antitelo je tetramer (H2L2) koga obrazuju dva HL dimera koja su povezana najmanje jednim disulfidnim mostom. Polivalentno himerno antitelo može takođe da se proizvede, na primer, korišćenjem taloženog CH regiona (npr., iz IgM H lanca, ili µ lanca).

[0062] "Humanizovana" antitela (takođe poznata pod imenom CDR-graftovana antitela) proizvode se postupkom za smanjenje imunogenosti monoklonskih antitela (mAt-a) iz ksenogenih izvora (obično pacova) i poboljšava efektroske funkcije (npr., ADCC, aktivaciju komplementa, i/ili vezivanje C1q). Generalno, humanizovano antitelo ima jednu ili više ostataka aminokiselina iz izvora koji nije humani, na primer, ali bez ograničenja na, mišji, pacovski, zečji, ne-humanog primata ili drugog sisara. Inženjerizovano mAt može da se inženjerizuje korišćenjem molekularno bioloških postupaka. Jednostavno CDR-graftovanje pacovskih regiona koji određuju komplementarnost (CDRs) u sekvenci humanih okvirnih regiona često dovodi do gubitka afiniteta vezivanja i/ili specifičnosti originalnog mAt. Da bi se antitelo humanizovalo, dizajn humanizovanog antitela može da uključi varijacije kao što su konzervativne supstitucije aminokiselina u ostacima koji se nalaze u CDR-a, i zamenu supsitucija ostataka iz pacovskih mAt u sekvence humanih okvirnih regiona (“back” mutacije). U oblasti tehnike su dobro poznati postupci za inženjeringa ili humanizacije ne-humanih ili humanih antitela.

[0063] Termin "humano antitelo", kao što se ovde koristi, uključuje antitela koja imaju varijabilne i kostantne regione koji se dobijaju od humanih germinativnih imunoglobulinskih sekvenci koje se blisko poklapaju. Humana antitela pronalaska mogu da uključe ostatke aminokiselina koje nisu kodirane humanim germinativnim imunoglobulinskim sekvencama (npr., mutacije koje su nasumično uvedene ili mutageneza specifična za mesto in vitro ili somatskom mutacijom in vivo). Prema tome, kao što se ovde koristi, termin "humano antitelo" se odnosi na antitelo u kome u osnovi svaki deo proteina (npr., CDR, okvirna sekvenca, CL, CH domeini (npr., CH1, CH2, CH3), zglob, (VL, VH)) je u osnovi sličan sa humanim germinativnim antitelom.

[0064] Kao što se ovde koristi, termin "humano antitelo" takođe se odnosi na antitelo u kome je u osnovi svaki deo proteina (npr., CDR, okvirna sekvenca, CL, CH domaini (npr., CH1, CH2, CH3), zglob, (VL, VH)) je u osnovi ne-imunogen kod ljudi, sa samo malim promenama u sekvenci ili varijacijama. Slična, antitela naznačena primatima (majmunom, babunom, šimpanzom, itd.), glodarom (mišem, pacovom, zecom, zamorcem, hrčkom, islično) i drugim sisarima koji označavaju ove vrste, podrodove, rodove, pod-familije, i antitela koja su specifična za familiju. Humano antitelo može da se proizvede pomoću ne-humane životinjske ili prokariotske ili eukariotske ćelije koja može da eksprimira funkcionalno rearanžirane gene humanog imunoglobulina (npr., teški lanac i/ili laki lanac). Dalje, kada je humano antitelo jednolančano antitelo, može da sadrži peptid za povezivanje koji se ne nalazi u prirodnim humanim antitelima. Na primer, Fv može da sadrži peptid za povezivanje, kao što su dva do osam ostataka glicina ili druge aminokiseline, koji povezuje varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca. Smatra se da su takvi peptidi za povezivanje humanog porekla.

[0065] Antitela mogu da budu bilo koje klase imunoglobulina, uključujući IgG, IgM, IgE, IgA, GILD i i bilo koje njihove subklase. Kao što se ovde koristi, "izotip" se odnosi na klasu antitela (npr., IgM ili IgG1) koja je kodirana genima za konstantni region teškog lanca. Kod ljudi, postoji pet izotipova teškog lanca i dva izotipa lakog lanca. Za teški lanac, IgA1 i 2; IgD; IgG1, 2, 3, i 4; IgE; i IgM su izotipovi teških lanaca. Kapa i lambda su izotipovi lakih lanaca. U određenim izvođenjima, teški lanac je IgG klase. U drugim izvođenjima, teški lanac je IgM klase teškog lanca. U određenim izvođenjima, teški lanac dalje sadrži najmanje oko 8 aminokiselina J regiona.

[0066] Antitela mogu da budu poliklonska antitela, monoklonska antitela (mAt-a), anti-idiotipska (anti-Id) antitela prema antitelima koja mogu da budu obeležena u rastvorljivom ili vezanom obliku, i fragmentima, regionima ili njihovima derivatima, koji su obezbeđeni bilo kojim pogodnim postupkom, kao što je, ali bez ograničenja, isecanje enzimima, sinteza peptida ili postupcima rekombinacije. Takva antitela mogu da se vezuju za porcije antigena (npr., TNF) tako da inhibiraju vezivanje antigena za receptore antigena.

[0067] Poliklonska antitela su heterogena populacija molekula antitela koja se dobija iz seruma životinja koje su imunizovane antigenom.

[0068] Monoklonsko antitelo (mAt) sadrži u osnovi homogenu populaciju antitela koja je specifična za antigen, Kompozicija monoklonskog antitela prikazuje jednu specifičnost vezivanja za određeni epitop.

[0069] MAt-a mogu da se se dobiju postupcima koji su poznati stručnjacima iz oblasti tehnike. Videti, na primer, Kohler and Milstein, Nature 256:495-497 (1975); U.S. Patent No.4,376,110; Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1987, 1992); and Harlow and Lane ANTIBODIES: A LAtoratory Manual Cold Spring Harbor LAtoratory (1988); Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993).

[0070] Anti-idiotipsko (anti-Id) antitelo je antitelo koje prepoznaje jedinstvene determinanate koje su generalno u vezi sa mestom za vezivanje antigena na antitelu. Anti-Id antitelo može takođe da se koristi kao "imunogen" za indukovanje imunskog odgovora u drugoj životinji, pri čemu se proizvodi takozvano anti-anti-Id antitelo. Anti-anti-Id može da bude epitopski identično saoriginalnim mAt koje je indukovalo anti-Id. Prema tome, korišćenjem antitela za idiotipske determinante mAt, moguće je identifikovati druge klonove koji eksprimiraju antitela identične specifičnosti.

[0071] Fragmenti antitela uključuju, na primer, FAt, FAt’, F(At’)2 i Fv. Ovim fragmentima nedostaje Fc fragment intaktnog antitela, brže se uklanjaju iz cirkulacije, i imaju manje ne-specifičnog tkivnog vezivanja u odnosu na intaktno antitelo (Wahl et al., J. Nucl. Med.24:316-325 (1983)). Ovi fragmenti se proizvode iz intaktnih antitela korišćenjem postupaka koji su dobro poznati iz oblasti tehnike, na primer proteolitičkim isecanjem sa enzimima kao što je papain (za proizvodnju Fat fragmenata) ili pepsin (za proizvodnju F(At’)2 fragmenata).

[0072] Kao što se ovde koristi, termin "fragment za vezivanje antigena" odnosi se na onu porciju molekula antitela koja sadrži ostatke aminokiselina koji interaguju sa antigenom i daju antitelu njegovu specifičnost i afinitet prema antigenu. "Antigen" je molekul ili porcija molekula koju može da veže antitelo koje dodatno može da indukuje životinju da proizvodi antitelo koje može da se veže za epitop antigena. Antigen može da ima jedan ili više od jednog epitopa. Region antitela uključuje "okvirne" ostatka aminokiselina koji su neophodni za održavanje odgovarajuće konformacije ostataka za vezivanje antigena.

[0073] "Fragment za vezivanje antigena" ili njegova porcija uključuje, npr., jednolančana antitela i njihove fragmente. Primeri fragmenta za vezivanje antigena uključuju (i) Fat fragment, a monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH, domena; (ii) F(At’)2 fragment, a bivalentni fragment koji se sastoji iz dva FAt fragmenata koji su povezani disulfidnim mostom u region zgloba; (iii) Fd fragment koji se sastoji iz VH i CH, domena; (iv) Fv fragment koji se sastoji iz VL i VH domena jednog kraka antitela, (v) dAt fragment u keome su VH i VL domeni eksprimirani na jednom polipeptidnom lancu; i (vi) jedan ili više izolovanih regiona koji određuju komplementarnost (CDRi). Takvi fragmenti mogu da se proizvedu enzimskim isecanjem, sintetičkim ili postupcima rekombinacije, kao što je poznato u oblasti tehnike i/ili kao što se ovde opisuje. U nekim izvođenjima, fragmenti mogu da uključe jedanu ili više porcija lanca antitela, kao što su regioni konstantnog dela teškog lanca, spajanja, diverziteta ili varijabilnih regiona, ili regioni konstantnog dela lakog lanca, spajanja, varijabilnih regiona.

[0074] Region za vezivanje antigena može da ne bude humanog porekla, npr., mišjeg porekla. U nekim izvođenjima, region za vezivanje antigena može da se dobije od zeca ili glodara, kao što je pacov ili hrčak.

[0075] Fragment za vezivanje antigena iz himernog antitela može da se dobije iz antitela koje nije humano koje je specifično za humani antigen. U nekim izvođenjima, izvori DNK koja kodira takvo himerno antitelo uključuju ćelijske linije koje proizvode antitelo, poželjno hibridne ćelijke linije koje su u stanju tenike poznate pod imenom hibridomi. U jednom izvođenju, hibridim je A2 ćelijska linija hibridoma.

[0076] Termin "epitop" označava proteinsku determinantu koja može specifično da se veže za antitelo. Epitopi se obično sastoje iz hemijskih aktivnih grupa molekula na površini kao što su aminokiseline ili bočni lanci šećera i obično imaju specifične tro-dimenzionalne strukturne karakteristike, kao specifične karakteristike naelektrisanja. "Epitop" može da bude ona porcija bilo kog molekula kaog antitelo može da prepozdna i da se veže za njega jednim ili više regoionima antitela za vezivanje antigena. Pod "inhibiranjem i/ili neutralizovanjem epitopa" podrazumeva se epitop, koji, kada je vezan od antitela, dolazi do gubitka biološke aktivnosti molekula ili organizma koji sadrži epitop, in vivo, in vitro ili in situ, poželjnije in vivo, na priemr, vezivanje TNF za TNF receptor.

[0077] Antitela mogu da budu, na primer, izolovana, rekombinovana i/ili sintetička antitela.

[0078] "Rekombinovano antitelo", kao što se ovde koristi, uključuje sva antitela koja se dobijaju, eksprimiraju, nastaju ili se izoluju pomoću postupaka rekombinacije. Termin rekombinovana ćelija domaćina" (ili jednostavnije "ćelija domaćina"), se odnosi na ćeliju u kojoj je uveden rekombinovani ekpresioni vektor. Rekombinovane ćelije domaćina uključuju, na primer, CHO ćelijske linije ili ćelijske linije koje su izvedene iz SP2/0 linije mišjeg mijeloma. Rekombinovana antitela, kao što su mišja ili himerna mišja-humana ili humana-humana antitela mogu da se proizvedu korišćenjem poznatih postupaka. Videti, npr., Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, N.Y. (1987, 1992, 1993); and Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

[0079] Antitela, fragmenti ili derivati koji imaju himerne H lance i L lance sa istom ili različitom specifičnšću vezivanja varijabilnog regiona, mogu da se dobiju, na primer, odgovarajućim povezivanjem individualnih polipeptidnih lanaca, u skladu sa poznatim koracima postupka, npr., prema Ausubel supra, Harlow infra, i Colligan infra.

[0080] Sa ovim pristupom, domaćini koji eksprimiraju himerne H lance (ili njihove derivate) se gaje odvojeno u kulturi od domaćina koji eksprimiraju L lance (ili njihove derivate), i imunoglobulinski lanci se odvojeno dobijaju i zatim se spajaju. Alternativno, domaćini mogu da se istovremeno gaje u kulturi i u medijumu kulture se omogućava spontano povezivanje lanaca, nakon čega sledi dobijanje spojenog imunoglobulina, fragmenta ili derivata.

[0081] Hibridne ćelije se obrazuju kombinovanjem ćelije koja proizvodi ne-humani anti-hTNFα antitelo, obično ćelija slezine životinje koja je imunizovnana sa ili prirodnim ili rekombinovanim humanim TNF, ili peptidnim fragmentom proteinske sekvence humanog TNFα. Alternativno, ćelija koja proizvodi ne-humano anti-TNFα antitelo može da bude B limfocit koji se dobija iz krvi, slezine, limfnih čvorova ili drugog tkiva životinje koja je imunizovana sa TNF.

[0082] Drugi kombinovani partner, koji obezbeđuje funkciju imortalizacije, može da bude limfoblastoidna ćelija ili plazmacitom ili ćelija mijeloma, koja sama po sebi nije ćelija koja proizvodi antitelo, ali je maligna. U nekim izvođenjima, ćelije kombinovanih partnera uključuju hibridom SP2/0-Ag14, skraćeno SP2/0 (ATCC CRL1581) i mijelom P3X63Ag8 (ATCC TIB9), ilinjegove derivate. Videti, npr, Ausubel infra, Harlow infra, i Colligan infra.

[0083] "Izolovano antitelo," kao što se ovde koristi, je namenjeno da se odnosi na antitelo koje je u osnovi bez drugih antitela koja imaju različite specifičnosti za antigene. Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za epitop humanog anitgena može, međutim, ukršeno da reguje sa drugim srodnim antigenima. Osim toga, izolovano antitelo može u osnovi da bude oslobođeno od drugih ćelijskih materijala i/ili hemikalija.

[0084] Postupci određivanja specifičnosti mAt i afiniteta kompetitivnom inhibicijom mogu da se pronađu, na primer, u Harlow, et al., Antibodies: A LAtoratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988), Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993), and Muller, Meth. Enzymol.92:589-601 (1983).

[0085] U nekim izvođenjima, antitelo može da bude biološki aktivno antitelo. Biološki aktivna antitela imaju specifičniu aktivnost na najmanje 20%, 30%, ili 40%, i poželjno najmanje 50%, 60%, ili 70%, i najpoželjnije njamanje 80%, 90%, ili 95%-100% prirodnog (ne-sintetičkog), endogenog ili srodnog i poznatog antitela. Stručnjacima iz oblasti tehnike su dobro poznati postupci ispitivanja i kvantitativnog merenja enzimske aktivnosti i specifičnosti supstrata.

ANTI-TNFα ANTITELA

[0086] U nekim izvođenjima, antitela proizvedena postupcima koji se ovde opisuju su anti-tumorska antitela faktora nekroze-α (TNFα). Kao što se ovde korsiti, faktor nekroze tumora-α (TNFα) i faktor nekroze tumora (TNF) naizmenično se korisite da označe faktor nekroze tumora-α (TNFα), osim ukoliko nije drugačije naznačeno. Slično tome, antitela koja su specifična za faktor nekroze tumora-α (TNFα) i faktor nekroze tumora (TNF) i anti-tumorska faktor nekroze-α (TNFα) i anti tumorska antitela faktora nekroze (TNF) se koriste naizmenično, osim ukoliko drugačije nije specifično naznačeno.

[0087] TNFα je rastvorljivi homotrimer koji se sastoji iz 17 kD proteinskih subjedinica (Smith, et al., J. Biol. Chem. 262:6951- 6954 (1987)). Takođe postoji prekursorski oblik 26 kD TNF-a koji je vezan za membranu (Kriegler et al., Cell 53:45-53 (1988)). Za preglede TNF-a, videti Beutler, et al., Nature 320:584 (1986), Old, Science 230:630 (1986), and Le, et al., LAt. Invest.56:234. Kompletna primarna sekvenca humanog TNFα, prema Pennica et al., Nature 312:724-729 (1984) prikazana je na Slici 28 (SEQ ID NO:1).

[0088] TNFα može da prouzrokuje pro-inflamatorna delovanja koja za posledicu imaju povredu tkiva. Faktor nekroze tumora (TNFα) posreduje ili je uključen u mnogim patologijama, kao što su, ali bez ograničenja, bakterijske, virusne ili parazitske infekcije, hronične zapaljenske bolesti, autoimunske bolesti, maligniteti, i/ili neurodegenerativne bolesti. Prema tome, u nekim izvođenjima, antitela imaju aktivnosti neutralizacije i/ili aktivnosti inhibiranja u odnosu na TNF.

[0089] U nekim izvođenjima, antitela su visokaofinitetna humana-mišja himerna anti-TNF antitela, i fragmenti ili njihovi regioni, koji imaju potentnu aktivnost in vivo inhibiranja i/ili neutralizacije u odnosu na humani TNFα. Takva antitela i himerna antitela mogu da uključe one koje se dobijaju imunizacijom korišćenjem prečišćenog rekombinovanog hTNFα (SEQ ID NO:1) ili njegovih peptidnih fragmenata.

[0090] U nekim izvođenjima, antitela i fragmenti specifično vezuju TNFα. U nekim izvođenjima, ona takođe smanjuju, blokiraju, ukidaju, ometaju, sprečavaju i/ili inhibiraju sintezu TNF RNK, DNK ili sintezu proteina, oslobađanje TNF-a, signalizacijiu receptora za TNF, isecanje membranskog TNF-a, aktivnost TNF-a, proizvodnju TNF-a i/ili sintezu in vitro, in situ i/ili in vivo.

[0091] U nekim izvođenjima, antitelo je cA2. Himerno antitelo cA2 sastoji se iz varijabilnog regiona za vezivanje antigena visoko afinitetnog neutralizujućeg mišjeg anti-humanog TNFα IgG1 antitela, naznačenog A2, i konstantnih regiona IgG1, kapa imunoglobulina. Humani IgG1 Fc region poboljšava alogensku efektorsku funkciju antitela, povećava polu-život u serumu krvotoka i smanjuje imunogenost antitela. Aviditet i specifičnost epitopa himernog antitela cA2 su izvedeni iz varijabilnog regiona mišjeg antitela A2. U posebnom izvođenju, izvor za nukleinsku kiselinu koja kodira varijabilni region mišjeg antitela A2 je A2 ćelijska linija hibridoma.

[0092] U jednom izvođenju, mišje monoklonsko antitelo A2 je proizvedeno od ćelijske linije naznačene c134A. U jednom izvođenju, himerno antitelo cA2 je proizvedeno iz ćelijske linije naznačene c168A.

[0093] U nekim izvođenjima, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena može da sadrži najmanje jedan teški lanac CDR3 od cA2 i/ili laki lanac CDR3 od cA2. U posebnom izvođenju, antitelo ili fragment za vezivanje antigena može da ima fragment za vezivanje antigena koji sadrži najmanje deo od najmanje jednog teškog lanca CDR (tj., CDR1, CDR2 i/ili CDR3) koji ima sekvencu aminokiselina koja odgovara CDR-a 1, 2 i/ili 3 od cA2. U drugom posebnom izvođenju, antitelo ili porcija za vezivanje antigena ili varijanta može da ima fragment za vezivanje antigena koji sadrži najmanje porciju najmanje jednog CDR lakog lanca (tj., CDR1, CDR2 i/ili CDR3) koji ima sekvencu aminokiselina odgovarajućih CDR-a 1, 2 i/ili 3 od cA2. U jednom izvođenju, CDR-i tri teška lanca i CDR-i tri laka lanca antitela ili fragmenta za vezivanje antigena imaju sekvence aminokiselina odgovarajućih CDR-a od najmanje jednog mAt A2 ili cA2, kao što se ovde opisuje.

[0094] Aviditet i specifičnost epitopa za A2 su izvedeni iz varijabilnog regiona mišjeg A2. U ELISA testu na čvrstoj fazi, ukrštena kompeticija za TNF je uočena između himernog i mišjeg A2, što ukazuje na identičnu specifičnost epitopa cA2 i mišjeg A2. Specifičnost cA2 za TNF-α je potvrđena njegovom nemogućnošću da neutralizuje citotoksične efekte limfotoksina (TNF-β). Himerno A2 neutralizuje citotoksičan efekat i prirodnog i rekombinovanog TNF-a na način koji zavisi od doze. Iz testova vezivanja za cA2 i rekombinovani humani TNF, izračunata konstanta afiniteta za cA2 je 1,8 x 10<9>M<1>.

[0095] Postupci skrininga koji mogu da se koriste za određivanje neutralizujuće aktivnosti TNF-a od TNF neutralizujućeg jedinjenja mogu da uključe in vitro ili in vivo testove. Takvi in vitro testovi mogu da uključe TNF test citotoksičnosti, kao što je radioimuno test, koji određuje smanjenje u smrti ćelija uz kontakt sa TNF-om, kao što je TNF poreklom od čoveka ili šimpanze u izolovanom ili rekombinovanom obliku, pri čemu istovremeno prisustvo TNF neutralizujućeg jedinjenja smanjuje stepen ili stopu ćelijske smrti. Ćelijska smrt može da se odredi korišćenjem ID50 vrednosti koje predstavljaju koncentraciju jedinjenja koje neutralizuje TNF koje neutralizuje stopu ćelijske smrti za 50%. Na primer, pronađeno je da mAt-a A2 i cA2 imaju ID50 oko 17mg/ml /- 3mg/ml, kao što je 14-20 mg/ml, ili bilo koji opseg ili vrednost u njemu.

[0096] U nekim izvođenjima, antitela mogu kompetitvno da in vivo inhibiraju vezivanje za humani TNFα od anti-TNFα mišjeg mAt A2, himernog mAt cA2, ili antitela koje u osnovi ima iste specifične karakteristike vezivanja, npr., epitopsku specifičnost, kao A2 i/ili cA2.

[0097] Epitopi prepoznati od antitela, i njihovi fragmenti i regioni, mogu da uključe 5 ili više aminokiselina koji sadrže najmanje jednu aminokiselinu od svake ili obe sekvence aminokiselina TNF, koje obezbeđuju topografiju ili tro-dimenzionalni epitop za TNF koji je prepoznat od strane, i/ili se vezuje za anti-TNF aktivnost, antitelo specifično za TNF, ili njegove fragmente:

[0098] U nekim izvođenjima, antitela, fragmenti i regioni od anti-TNF antitela prepoznaju epitope uključujući 5 aminokiselina koji sadrže najmanje jednu aminokiselinu iz ostataka aminokiselina 87-108 ili oba ostataka 59-80 i 87-108 od hTNFα (of SEQ ID NO:1). U nekim izvođenjima, antitela, fragmenti i regioni od anti-TNF antitela ne prepoznaju epitope od najmanje jedne od aminokiselina 11-13, 37-42, 49-57 ili 155-157 od hTNFα (of SEQ ID NO:1). (Pretpostavljeni lokus za vezivanje receptora kao što je predstavljeno od Eck i Sprang (J. Biol. Chem.264(29): 17595-17605 (1989)).

[0099] U jednom izvođenju, antitelo je anti-hTNF himerno anitelo koje se sastoji iz dva laka lanca i dva teška lanca, svaki od lanaca sadrže najmanje deo humanog konstantnog regiona i najmanje deo varijabilnog (V) regiona ne-humanog porekla koji ima specifičnost prema TNF-u, pomenuto antitelo vezivanjem sa većim afiniteom za inhibiranje i/ili neutralizovanje epitopa humanog TNF-a.

[0100] U jednom izvođenju, antitelo je za upotrebu u dijagnostičkim postupcima za detekciju TNF-a kod pacijenata ili životinja za koje se pretpostavlja da imaju stanja koja su povezana sa abnormalnom proizvodnjom mTNF-a. U nekim izvođenjima, antitela koja su specifična za TNF se koriste za ublažavanje simptoma ili patologija koje uključuju TNF, kao što je, ali bez ograničenja na bakterijske, virusne ili parazitske infekcije, hronične inflamatorne bolesti, autoimunske bolesti, malignitete, i/ili neurodegenerativne bolesti.

[0101] Mišji hibridomi koji proizvode mAt specifična za humani TNFα ili TNFβ se obrazuju spajanjem mišje partner ćelije koja se koristi za spajanje, kao što je SP2/0, i ćelija slezine iz miševa koji su imunizovani prema prečišćenim hTNFα, rekombinovanim hTNFα, prirodnim ili sintetičkim TNF peptidima, uključujući peptide koji uključuju 5 ili više aminokiselina odabranih od ostataka 59-80, i 87-108 TNF-a (od SEQ ID NO:1) ili drugih bioloških preparata koji sadrže TNF. Da bi se izvršila imunizacija miševa, moraju da budu ispunjeni razni ili različiti konvencionalni protokoli. Na primer, miševi mogu da prime primarne i dodatne pospešujuće (engl. “boost”) imunizacije TNF.

[0102] Antitela koja su ovde opisana mogu da se vezuju za humani TNF sa širokim opsegom afiniteta (KD). U jednom izvođenju, najmanje jedno humano mAt može opciono da veže humani TNF sa visokim afinitetom. Na primer, humani mAt može da se veže za humani TNF sa KD koja je jedaka sa ili manja od oko 10<-7>M, kao što je ali bez ograničenja, 0,1-9,9 (ili bilo koji opseg ili vrednost u njemu) X 10<-7>, 10<-8>, 10<-9>, 10<-10>, 10<-11>, 10<-12>, 10<-13>ili bilo koji opseg ili vrednost u njemu.

[0103] Afinitet ili aviditet antitela prema antigenu može eksperimentalno da se odredi korišćenjem bilo kog pogodnog postupka. (Videti, na primer, Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, NY (1992); i postupke koji su ovde opisani). Izmereni afinitet određene interakcije antitela sa antigenom može da varira ukoliko se meri pod različitim uslovima (npr., koncentracija soli, pH). Prema tome, merenja afiniteta i drugih parametara za vezivanje antigena (npr., KD, Ka, Kd) se poželjno dobijaju sa standardizovanim rastvorima antitela i antigenima, i standardizovanim puferom, kao što je pufer koji se ovde opisuje.

[0104] Anti-TNF antitelo može da sadrži najmanje jedan varijabilni region teškog ili lakog lanca koji ima definisanu aminokiselinsku sekvencu. Na primer, u jednom izvođenju, anti-TNF antitelo sadrži najmanje jedan od najmanje jednog varijabilnog regiona lakog lanca, koji opciono ima sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:3 i/ili najmanje jedan varijabilni region teškog lanca, koji opciono ima sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:5. Antitela koja se vezuju za humani TNF i koja sadrže definisani varijabilni region teškog ili lakog lanca mogu da se dobiju korišćenjem pogodnih postupaka, kao što je fagni prikaz (Katsube, Y., et al., Int J Mol. Med, 1(5):863-868 (1998)) ili postupaka koji koriste transgene životinje, kao što je poznato iz oblasti tehnike i/ili kao što je ovde opisano. U jednom izvođenju, anti-TNF antitelo sadrži CDR-e CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence lakog lanca koje odgovaraju sekvencama aminokiselina redom 24-34, 50-56 i 89-97 od SEQ ID NO: 3, i CDR-e teškog lanca HCDR1, HCDR2 i HCDR3 koje odgovaraju sekvencama aminokiselina redom 31-35, 50-68 i 101-109 SEQ ID NO: 5, obeleženo prema Kabatu.

[0105] Anti-TNF antitelo može dalje opcione da sadrži polipeptid od najmanje jedne od 70-100% susednih aminokiselina najmanje jedne od SEQ ID NOS:3 i 5.

[0106] U nekim izvođenjima, sekvenca aminokiselina imunoglobulinskog lanca, ili njegova porcija (npr., varijabilni regio) je oko 70-100% identična (npr., 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ili bilo koji opseg ili vrednost u njemu) sa odgovarajućim lancem najmanje jedne SEQ ID NOS:3 i 5. Na primer, sekvenca aminokiselina varijabilnog regiona lakog lanca može da se poredi sa sekvencom SEQ ID NO:8, ili sekvenca aminokiselina CDR3 teškog lanca može da se poredi sa SEQ ID NO:7. Poželjno, 70-100% identičnost aminokiselina (i.e., 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ili bilo koji opseg ili vrednost u njemu) je određena upotrebom pogodnog kompjuterskog algoritma, kao što je poznato iz oblasti tehnike.

[0107] Primeri sekvenci varijabilnih regiona teškog i lakog lanca su obezbeđeni u SEQ ID NOs: 3 i 5. Antitela mogu da sadrže bilo koji broj susednih ostataka aminokiselina iz antitela, gde se taj broj bira iz grupe celih brojeva koji se sastoji iz 10-100% broja susednih aminokiselina u anti-TNF antitelu. Opciono, ova podsekvenca susednih aminokiselina je najmanje oko 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 ili više aminokiselina u dužini, ili bilo koji opseg ili vrednost u njemu. Dalje, broj takvih podsekvenci može da bude bilo koji ceo broj koji je odabran iz grupe koja se sastoji iz 1 do 20, kao što je najmanje 2, 3, 4, ili 5.

[0108] Antitela takođe uključuju visoko afinitetna i/ili potentna in vivo TNF-inhibirajuća i/ili neutralizujuća antitela, fragmente ili njihove regione, za oba TNF imunotesta i terapiju TNF-posredovane patologije. Takva antitela, fragmenti, ili regioni, će poželjno imati afinitet za hTNFα, izražen kao Ka, od najmanje 10<8>M<-1>, poželjnije, najmanje 10<9>M<-1>, kao što je 10<8>-I0<10>M<-1>, 5 X 10<8>M<-1>, 8 X 10<8>M<-1>, 2 X 10<9>M<-1>, 4 X 10<9>M<-1>, 6 X 10<9>M<-1>, 8 X 10<9>M<-1>, ili bilo koji opseg ili vrednost u njemu.

[0109] TNF antitela takođe uključuju visoko afinitetna mišja i himerna antitela, i fragmente, regione i derivate koji imaju potentnu in vivo TNFα-inhibirajuću i/ili neutralizujuću aktivnost koja blokira sekreciju IL-6 indukovanu sa TNF. U nekim izvođenjima, antitela za humane terapeutske upotrebe uključuju visoko afinitetna mišja i himerna anti-TNFα antitela, i fragmente, regione i njihove derivate, koji blokiraju prokoagulantnu aktivnost koja je indukovana sa TNF, uključujući blokiranje TNF indukovane ekspresije ćelijskih adhezivnih molekula kao što su ELAM-I i ICAM-I i blokiranje mitogene aktivnosti TNF-a, in vivo, in situ, i in vitro.

[0110] U oblasti tehnike su opisani dodatni primeri monoklonskih anti-TNF antitela (videti, npr., U.S. Patent No. 5,231,024; Moller, A. et al., Cytokine 2(3):162-169 (1990); U.S. Application No.

07/943,852 (podneta 11 septembra, 1992); Rathjen et al., International Publication No. WO 91/02078 (objavljena 21 februara, 1991); Rubin et al., EPO Patent Publication No. 0 218 868 (objavljena 22 aprila 22, 1987); Yone et al., EPO Patent Publication No.0288088 (oktobar 26, 1988); Liang, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 137:847-854 (1986); Meager, et al., Hybridoma 6:305-311 (1987); Fendly et al., Hybridoma 6:359-369 (1987); Bringman, et al., Hybridoma 6:489-507 (1987); and Hirai, et al., J. Immunol. Meth.96:57-62 (1987)).

[0111] Rezultati iz Primera koji su opisani u tekstu ispod prikazuju broj važnih otkrića:

[0112] Uklanjanje CTL može da se kontroliše do nivoa manjeg od maksimuma kontrolisanjem vanćelijskog Zn+2. Na primer, kao što je prikazano u eksperimentalnim grupama u SMF-10.1 Eksperimentu, DOE3 Eksperimentu, BSA eksperimentu mešanja Br. 1, i BSA Eksperimentu mešanja Br. 2 koji su opisani u tekstu ispod, sadržaj CTL može da se kontroliše u okviru opsega (npr., 40 do 70%) kontrolisanjem vanćelijske koncentracije Zn+2 do vrednosti ≤ 1,2 µM. Dalje, kao što je prikazano u DOE3 Eksperimentu, kontrola do većeg opsega sadržaja CTL je moguća sa većim Zn+2 koncentracijama koje iznose do 6,3 µM.

[0113] Osim toga, kao što je pokazano eksperimentalnim grupama u DOE3 Eksperimentu, BSA Eksperimentu mešanja Br. 1, i BSA Eksperimentu mešanja Br. 2, u okviru opsega vanćelijske Zn+2 koncentracije, sadržaj CTL može dalje da se kontroliše kontrolisanjem vanćelijskog [EDTA] ili [EDTA -Fe+3].

[0114] Dodatno, sadržaj sijalinske kiseline može da se kontroliše do nivoa koji je manji od maksimuma kontrolisanjem vanćelijskog Zn+2. Na primer, kao što je prikazano eksperimentalnim grupama u DOE3 Eksperimentu, BSA eksperimentu mešanja Br.1, i BSA eksperimentu mešanja Br.2, sijalinska kiselina može da se kontroliše u opsegu (npr., 4 do 13%) kontrolisanjem vanćelijske koncentracije Zn+2 do vrednosti ≤ 1,2 µM. Osim toga, kao što je prikazano u DOE3 Eksperimentu, kontrola do većeg opsega sadržaja sijalinske kiseline je moguća sa većim Zn+2 koncentracijama do vrednosti 6,3 µM.

[0115] Dalje, kao što je prikazano u DOE3 Eksperimentu, BSA eksperimentu mešanja Br. 1, i BSA eksperimentu mešanja Br. 2, u okviru opsega vanćelijske Zn+2 koncentracije, sadržaj sijalinske kiseline može dalje da se kontroliše kontrolisanjem vanćelijskog [EDTA] ili [EDTA - Fe+3].

[0116] Osim toga, kao što je pokazano u SFM-10.3 Eksperimentu i DOE3 Eksperimentu, proizvodnja antitela može da se kontroliše kontrolisanjem vanćelijske koncentracije Zn+2.

[0117] Kontrola koncentracija Zn+2, Fe+3 i EDTA da se postigne kontrola dodavanja sijalinske kiseline, uklanjanje CTL i proizvodnje antitela može da se postigne upotrebom različitih sredstava, uključujući bilo kojih prema sledećim, zasebno ili u kombinaciji:

1) Diretno dodavanje Zn+2, Fe+3 i EDTA u medijum kulture, 2) kroz mešanje sirovih materijala koji sadrže Zn+2, Fe+3 ili EDTA kao komponente, 3) kroz tretiranje sirovih materijala da se podese Zn+2, Fe+3 ili EDTA koncentracije, i/ili 4) kroz modifikaciju postupaka proizvodnje kompleksnih sirovih materijala da bi se postigli željeni nivoi Zn+2, Fe+3, i/ili EDTA.

PRIMERI

Materijali i Postupci

[0118] Eksperimenti koji su ovde opisani su izvedeni u kontrolisanim, 3L Applikon® bioreaktorima, sa operativnim uslovima za koje je pokazano da obezbeđuju rezultate koji predstavljaju komercijalni proces infliksimaba.

[0119] U naznačenom danu, infliksimab se prečišćava direktnim hvatanjem proizvoda (DPC) upotrebim kolone koja sadrži Protein A. Zatim se karakteriše kapilarnim izoelektričnim fokusiranjem (cIEF) ili WAX testom. Infliksimab se zatim prečišćava pomoću DPC upotrebom kolone koja sadrži Protein A koji se ove naziva "DPC uzorak" ili "DPC eluat."

PRIMER 1 - cIEF Postupak

[0120] cIEF se koristi za računanje CTL sadržaja oligosaharida infliksimaba. Postoje tri očigledna izvora heterogenosti naelektrisanja u analizi prethodno obrazovane mase infliksimaba (PFB): (1) CTL varijabilnost; (2) sadržaj sijalinske kiseline; i (3) deamidacija. TipiČni eluati infliksimaba, od ranih, srednjih i kasnih uzoraka komercijalnog bioreaktora ispoljavaju uklanjanje CTL sa teškog lanca infliksimaba od približno 30% do 80%, sa prosečnim uklanjanjem CTL u PFB od približno 40% do 60%. CTL lakog lanca nije izloženo uklanjanju. Uklanjanje CTL teži da bude manje kod ranih uzoraka bioreaktora i raste kod srednjih i kasnih uzoraka bioreaktora. Tipični eluati infliksimaba iz ranih i kasnih uzoraka bioreaktora ispoljavaju sadržaje sijalinske kiseline od prIbližno 3% do 14% oligosaharida IgG. Dodavanje sijalinske kiseline je obično niže za uzorke iz ranog bioreaktora i veće za uzorke iz srednjeg i kasnog bioreaktora. Mapiranje reverzno faznog peptida otkriva konzistentne, niske nivoe deamidacije na nekoliko mesta deamidacije infliksimaba na teškom lancu i lakom lancu.

[0121] Ova heterogenost naelektrisanja obično vodi do 4 do 6 maksimalnih vrednosti u cIEF elektroferogramu. Maksimalna vrednost 1 odgovara infliksimabu koji ne sadrži višak naelektrisanja; to jest, ova maksimalna vrednost ili traka sadrži oba C-terminalna lizina, bez sijalinske kiseline, i bez deamidacije. Druge, treće, četvrte, pete i šeste maksimalne vrednosti ili trake sadrže 1, 2, 3, 4 i 5 viška naelektrisanja, redom, zbog kombinacije uklanjanja CTL, dodavanja sijalinske kiseline i deamidacije.

[0122] SL. 1 je cIEF elektroferogram uzorka infliksimaba, i pokazuje pI vrednosti za maksimalne vrednosti 1-6.

[0123] Zbog relativno visokog nivoa uklanjanja CTL, niskog nivoa dodavanja sijalinske kiseline, i konzistentnosti deamidacije, relativni procenat maksimalne vrednosti 1 je u visokoj korelaciji sa uklanjanjem CTL. SL. 2 je podešeni linijski grafik procenta des-lizina (des-Lys) kao funkcije procenta Maksimalne vrednosti 1, i pokazuje korelaciju između sadržaja CTL (koji je izražen kao procenat des-Lys) i procenta Maksimalne vrednosti 1 kroz opseg eksperimentalnih uslova. Korelacija koja je predstavljena na SL. 2 je napravljena iz uzoraka infliksimaba za koje je procenat des-Lys određen mapiranjem peptida i procenat Maksimalne vrednosti 1 je određen sa cIEF.

[0124] Sadržaj CTL je ovde izražen kao procenat teškog lanca koji sadrži C-terminalni lizine i može da se izračuna upotrebom sledeće jednačine: sadržaj CTL (%) = (broj teških lanaca koji sadrže CTL)/(ukupn broj teških lanaca) x 100. Uklanjanje CTL je ovde izraženo kao procenat teških lanaca kojima nedostaje C-terminalni lizin (des-Lys). Tako da, "80% Des-Lys" je ekvivalentno sa 20% sadržajem CTL. Korelacija između procenta des-Lysine i procenta Maksimalne vrednosti 1 (mereno cIEF) drži za uzorke infliksimaba koji ispoljavaju očekivane procente uklanjanja CTL dodavanja sijalinske kiseline, i deamidacije. Ova korelacija može, prema tome, da se primeni na ovde opisane eksperimente zbog:

(1) dodavanje sijalinske kiseline pomoću WAX je određeno na mnoge DPC uzorke iz ovih eksperimenata, i rezultati ukazuju na to da sijalinska kiselina ostaje u tipičnom opsegu od 3% za uzorke iz ranog bioreaktora do približno 14% za uzorke iz kasnog bioreaktora (što, procenat sijalinske kiseline ostaje u opsegu podataka koji se koriste da se dobije korelacija prema SL. 1); i (2) treba pretpostaviti da procenti deamidacije ostaju na niskom nivou i konzistentni, kao što je slučaj za eksperimentalne uzorke koji se koriste da se dobije korelacija prema SL.1.

[0125] Uklanjanje CTL u ovim eksperimentima je opsega uobičajenih vrednosti 30-60%, do većih vrednosti. Pod ovim uslovima, uklanjanje CTL nastavlja da bude dominantna odrednica procent Maksimalne vrednosti 1.

PRIMER 2 - WAX Test

[0126] WAX test se koristi za određivanje sadržaja sijalinske kiseline i sadržaja galaktoze oligosaharida infliksimaba. U testu, N-vezani oligosaharidi se oslobađaju sa IgG upotrebom PNGaze F, zatim se derivatizuju upotrebom rastvora antranilne kiseline i natrijum cijanoborohidrida. Uzorci su pročišćeni upotrebom najlon filtera sa dijametrom pora 0,45-mikrona ACRODISC®, i analizirani na Agilent 1100 HPLC sa fluorescentnim detektorom. Maksimalne vrednosti istovetnosti se razdvajaju upotrebom komercijalno dostupnih standarda N-glikana.

[0127] U WAX testu koji se ovde opisuje, Komponenta 5A je procenat oligosaharida infliksimaba koji sadrže sijalinsku kiselinu. Komponenta 1 se nalazi u visokoj korelaciji sa procentom oligosaharida infliksimaba kojima nedostaje galaktoza. Prema tome, (100 - procenata Komponente 1) predstavlja razumnu procenu procenta oligosaharida infliksimaba koji sadrži galaktozu.

[0128] U teškom lancu infliksimaba, jedan ostatk asparagina (Asn) je glikozilovan sa oligosaharidom, koji može da sadrži, na primer, jedan ili dva ostatka galaktoza i jedan ili dva ostatka sijalinske kiseline. Sadržaj galaktoze infliksimaba je ovde predstavljen kao procenat oligosaharida koji sadrže galaktozu, i može da se računa upotrebom sledeće jednačine: sadržaj galaktoze (%) = (broj oligosaharida koji sadrže galaktozu)/(ukupan broj oligosaharida) x 100. Ova jednačina nezavisno primenjuje broj jedinica galaktoze u oligosaharidu. Drugim rečima, bez obzira na to da li postoji, na primer, jedan ili dva ostatka galaktoze u oligosaharidima, oligosaharid se broji samo jednom za svrhe računanja sadržaja galaktoze.

[0129] Sadržaj sijalinske kiseline infliksimaba je ovde eksprimiran kao procenat oligosaharida koji sadrže sijalinsku kiselinu, i može da se računa upotrebom sledeće jednačine: sadržaj sijalinske kiseline (%) = (broj oligosaharida koji sadrže sijalinsku kiselinu)/(ukupan broj oligosaharida) x 100. Ova jednačina nezavisno primenjuje broj ostataka sijalinske kiseline u oligosaharidu. drugim rečima, bez obzira na to da li postoji, na primer, jedan ili dva ostataka sijalinske kiseline u oligosaharidu, oligosaharid se broji samo jednom za svrhe računanja sadržaja sijalinske kiseline.

[0130] Obično su oba teška lanca infliksimaba glikozilovana. Međutim, u nekim slučajevima, neki od teških lanaca ostaju aglikozilovani. Na primer, u nekim izvođenjima, približno su 94% molekula infliksimaba glikozilovani na oba lanca, približno 6% molekula infliksimaba su polu-glikozilovani, i približno 0,1% molekula infliksimaba su potpuno aglikozilovani.

[0131] Odnos sijalinske kiseline prema galaktozi se računa iz molarnog odnosa sijalinske kiseline prema galaktozi u oligosaharidima infliksimaba.

PRIMER 3 – Ispitivanja zadržavanjem sakupljanja (engl. „Harvest hold“)

[0132] Sprovedena su dva ispitivanja u kojim se sakupljanje infliksimaba bez ćelija održava u produženim trajanjima. Svrha ovih ispitivanja je da se razume da li uklanjanje CTL može da se dogodi van ćelije (tj., nakon sekrecije).

[0133] Poznato je da se sijalinska kiselina dodaje glikoproteinima intraćelijski, pre sekrecije. Međutim, vanćelijsko uklanjanje sijalinske kiseline iz sekretovanih rekombinovanih glikoproteina je prijavljeno kod kultura ćelija ovarijuma kinečkog hrčka (CHO). Za CHO ćelije, sijalidaza se oslobađa u vanćelijski medijum iz liziranih ćelija. Tako da, druga svrha ovih ispitivanja zadržavanjem sakupljanja je da se razjasni da li postoji vanćelijsko uklanjanje sijalinske kiseline u bez-ćelijskom prikupljanju za postupak infliksimaba.

[0134] Ispitivanje zadržavanjem sakupljanja korišćenjem prikupljanja iz proizvodnih bioreaktora pokazuje da održanje prikupljanja pod različitim uslovima (bistro, sakupljanje bez ćelija se održalo 30 dana na 2 do 14°C; sakupljanje koje nije bistro se održalo 14 dana na 2-8°C) i različite starosti bioreaktora nisu imale uticaj na cIEF gel profil infliksimaba.

[0135] Da bi se ovi rezultati podržali, izvedeno je drugo ispitivanje zadržavanjem sakupljanja. Sakupljanje infliksimaba bez ćelija je prikupljeno iz dva bioreaktora. Za svaki bioreaktor, jedan sakupljeni deo je odmah prečišćen Protein A hromatografijom da bi se proizveo DPC eluat. Drugi sakupljeni deo je skladišten 7 dana na temperaturama između 10-14°C (tipična temperatura skladištenja), pre obrade do DPC eluata. Temperatura zadržavanja sakupljanjem se prati probom u frižideru i kontroliše se ručnim podešavanjem. Četiri uzorka DPC eluata su zatim analizirana pomoću cIEF za bilo koji dokaz promene distribucije naelektrisanja koja može da ukazuje na CTL ili uklanjanje sijalinske kiseline u sakupljenom delu.

[0136] Ovo ispitivanje zadržavanja nije otkrilo značajnu razliku u cIEF obrascima za DPC eluate koji se odmah nakon sakupljanja dobijaju ili od sakupljanja koje se drži 7 dana na temperaturi 10-12°C pre prečišćavanja sa Proteinom A.

[0137] Ispitivanja tipa zadržavanja sakupljanjem pokazuju da se uklanjanje CTL iz teškog lanca infliksimaba verovatno dešava unutar ćelije. Slično tome, sadržaj sijalinske kiseline oligosaharida infliksimaba je određen intraćelijski.

PRIMER 4 - SFM-10.1 Eksperiment

[0138] Termin SFM-10.1 odgovara infliksimab SFM-10 medijumu koji nema BSA i CM2 (Deo B) tečnost (uključujući insulin koji sadrži cink). Svrha SFM-10.1 Eksperimenta je da se testira uticaj dopune Zn+2 na proizvodnju infliksimaba.

[0139] Četiri eksperimentalna stanja predstavljaju SFM-10.1 medijum koji je dopunjen sa cink sulfat heptahidratom, koji se dodaje u količini dovoljnoj da se doda 0,25, 0,5, 1,0 ili 2,0 µM Zn+2 u konačnoj koncentraciji medijuma. Ukupna Zn+2 koncentracija u svakom eksperimentu je zbir ove dopune plus Zn+2 doprinet iz PRIMATONE ® (dostupan od Kerry Ingredients and Flavours, Beloit, WI), koji je određen da bude 0,49 µM (na osnovu analize metala). Prema tome, ukupne koncentracije cinka u ova četiri bioreaktora su razumno procenjene sa 0,74, 1,0, 1,5 i 2,5 µM. Fe+3 koncentracija u ovim bioreaktorima je bila 5,8 µM, na osnovu analize metala korišćene serije PRIMATONE®. EDTA koncentracija je procenjena 2 µM, što je doprineto od transferina. EDTA ima mnogo veći afinitet za Fe+3 nego za Zn+2 i druge dvalentne katjone. Prema tome, računanje [EDTA - Fe+3] može da predstavlja koncentraciju EDTA koja je dostupna za heliranje Zn+2. Prema tome, u ovom prvom setu eksperimenata, može da se očekuje da ne postoji slobodan EDTA koji je dostušan za vezivanje vanćelijskog Zn2+.

Tabela 1. Koncentracije Zn<+2>, Fe<+3>, EDTA, i [EDTA - Fe+3] u četiri bioreaktora SFM-10.1 eksperimenta (koncentracije su u µM)

[0140] SL.3 je grafik koji prikazuje uklanjanje CTL uklanjanje (izražen kao procenat des-Lys i izračunat upotrebom cIEF postupka iz podatka Maksimalne vrednosti 1) kao funkcije starosti bioreaktora, i pokazuje efekat varirajućih Zn+2 koncentracija na uklanjanje CTL. Bioreaktori sa ukupnim Zn+2 koncentracijama od približno 1,5 i 2,5 µM ispoljavaju 70% do 80% CTL uklanjanja u svim vremenskim tačkama. Ne postoji promena u distribuciji naelektrisanja kao funkcije starosti bioreaktora, tako da u svim vremenskim tačkama (rani, srednji i kasni uzorci bioreaktora) imaju visoko uklanjanje CTL. Bioreaktor sa Zn+2 koncentracijom od 1,0 µM ispoljava 60% uklanjanje CTL rano u ispitivanju i približno 70% uklanjanje u sredini i tačkama kod kasnih uzoraka. Bioreaktor sa Zn+2 koncentracijom od približno 0,74 µM ispoljava povećanje CTL uklanjanja kao funkcije starosti bioreaktora.

[0141] SL. 4 je grafik procenta oligosaharida infliksimaba sa sijalinskom kiselinom, kao što je određeno WAX postupkom, kao funkcije starosti bioreaktora, i pokazuje efekat varirajućih Zn+2 koncentracija na procenat sijalinske kiseline. SL. 4 pokazuje da ne postoji jasan trend u dodavanju sijalinske kiseline kao funkcije Zn+2 koncentracije u ovom eksperimentu.

[0142] Nije poznato da li ovaj nedostatak uticaja predstavlja pravu neosetljivost sadržaja sijalinske kiseline na vanćelijsku koncentraciju Zn+2 u kontekstu SFM-10.1 medijuma, ili je to odraz eksperimentalnog šuma uzimajući u obzir mali broj bioreaktora, ili postoji proceduralno pitanje u vezi sa eksperimentalnom implementacijom.

[0143] SL-e. 5-7 su grafici gustina vijabilnih ćelija, vijabilnosti kulture i koncentracije infliksimaba, redom, kao funkcije vremena, i pokazuju efekat varirajućih koncentracija Zn+2 u SFM-10.1 eksperimentu. Rezultati u periodu pre dostizanja ciljne ćelijske gustine u približno Danu 15-20 su najizraženiji, i ovo predstavlja period u kome svaki bioreaktor deluje konzistentno. Nakon dostizanja ciljne ćelijske gustine, ćelije se dnevno uklanjaju iz kultura da bi se pokušalo održavanje ciljne ćelijske koncentracije, i varijacije u ovom postupku uklanjanja mogu da prouzrokuju fluktuacije u ćelijskoj gustini, vijabilnosti kulture i koncentraciji antitela.

[0144] U SFM-10.1 eksperimentu, bioreaktor sa 0,74 µM Zn+2 ima nižu stopu ćelijskog rasta, nižu vijabilnost kulture i nižu koncentraciju antitela pre dostizanja ciljne ćelijske gustine u odnosu na bioreaktore koji sadrže 1,5 i 2,5 µM Zn+2. Bioreaktor sa 1,0 µM Zn+2 ispoljava performansu u svakom slučaju koja je intermedijar između bioreaktora sa 0,74 µM i bioreaktora sa 1,5 ili 2,5 µM Zn+2.

[0145] Uslovi ovog eskperimenta su pogodni za nakupljanje Zn+2 od SP2/0 ćelija. [EDTA - Fe+3] je manja od nule, što ukazuje na to da je sav EDTA heliran za Fe+3 i nije dostupan za heliranje sa Zn+2 u vanćelijskom medijumu. Dalje, drugi potencijalni helator, BSA, nije prisutan u medijumu.

[0146] Uprkos ovim favorizovanim uslovima za nakupljanje Zn+2, eksperimentalni rezultati ukazuju na utcaj vanćelijskih koncentracija Zn+2 od 0,74 i 1,0 µM na uklanjanje CTL, početni ćelijski rast, vijabilnost kulture, i koncentraciju antitela, posebno tokom prvih 20 dana kulture. Rezultati ne pokazuju jasan uticaj Zn+2 na dodavanje sijalinske kiseline pod uslovima ovog eksperimenta.

[0147] Bez želje za vezivanjem za bilo koju posebnu teoriju, ovi rezultati su u skladu sa sledećim hipotezama:

• SP2/0 ćelije moraju intraćelijski da nakupe Zn+2 da bi se podržali intraćelijski procesi koji su u vezi sa enzimima koji imaju potrebe za Zn+2 kofaktorom. Ovo uključuje enzime koji su odgovorni za uklanjanje CTL, ćelijski rast, ćelijsku deobu, i proizvodnju antitela.

• Zn+2 koncentracije reda od 0,74 do 1,0 µM ne obezbeđuju dovoljan vanćelijski Zn+2 da adekvatno zadovolje Zn+2-potrebe intaćelijskih procesa tokom početnih stadijuma proizvodnje u bioreaktorskom procesu.

• Efekat je najizraženiji prvih 20 dana kulture. Ovo je period gde je količina intraćelijskog Zn+2 po ćeliji kontinuirano smanjena usled ćelijske deobe. To jest, svaki put kada se ćelija podeli, nakupljeni Zn+2 je podelejn između ćerki ćelija. Na 0,74 do 1,0 µM vanćelijskog Zn+2, ćelijsko uključivanje Zn+2 ne može da se održi sa ćelijskim smanjenjem Zn+2 zbog dupliranja ćelije. Prema tome, ćelije su deficijentne u Zn+2 i imaju ne-optimalni ćelijski rast, vijabilnost kulture i proizvodnju antitela.

• Posle oko Dana 20, ćelijse se nalaze blizu njihove ciljne ćelijske gustine za perfuzionu kulturu, i ćelijska deoba usporava. Od te tačke pa nadalje, brzina unutarćelijskog smanjenja Zn+2 zbog ćeljske deobe usporava, i ćelijsko uključivanje je adekvatno da bi se osiguralo povećanje nakupljanja Zn+2 po ćeliji tokom vremena. Pod ovim uslovima i nakon Dana 20, ćelije postepeno povećavaju njihova unutarćelijska skladišta Zn+2.

• Za bioreaktor sa 0,74 µM Zn+2, obrazac Zn+2 nakupljanja kao funkcije starosti bioreaktora je odgovoran za promene koje su uočene u cIEF obrascu kao funkcije starosti bioreaktora. To jest, CTL uklanjanje je najmanje u Danu 20, tačka u kulturi kada će intraćelijski enzim karboksipeptidaza najviše biti deficijentan za neophodni Zn+2 kofaktor. Nakon usporavanja ćelijske deobe i nakon Dana 20, CTL uklanjanje raste usled povećanja nakupljanja Zn+2, pti čemu se funkcija karboksipeptidaze povećava.

[0148] Za eksperimentalne grupe sa 1,5 µM i 2,5 µM Zn+2, vanćelijske koncentracija Zn+2 je dovoljno visoka da ćelijski enzimi ne prolaze kroz deficijenciju Zn+2 u bilo kojoj tački u kulturi. Prema tome, CTL uklanjanje je na visokoj stopi od Dana 20 do Dana 60. Slično tome, ćelijski rast, vijabilnost kulture i proizvodnja antitela se nastavlja visokim stopama kao funkcije kulture u danu.

PRIMER 5 - DOE3 Eksperiment

[0149] Praćenjem tragova koji su dobijeni u SFM-10.1 eksperimentu, izvodi se detaljniji eksperiment upotrebom komercijalnog medijuma infliksimabA SFM-10 za testiranje uticaja Zn+2, EDTA, i koncentracije Fe+3 na uklanjanje CTL, dodavanje sijalinske kiseline, ćelijskog rasta, vijabilnosti kulture i proizvodnje antitela.

[0150] Razume se da vanćelijsko vezivanje Zn+2 to EDTA može hipotetički da inhibira unutarćelijsko nakupljanje Zn+2. S obzirom da vanćelijski Fe+3 može da ima mnogo veći afinitet vezivanja za EDTA u odnosu na Zn+2, razume se da ključni faktor u određivanju unutarćelijskog nakupljanja Zn+2 može da bude [EDTA - Fe+3].

[0151] DOE3 eksperiment uključuje dvanaest bioreaktora. Medijum za ovaj eksperiment je komercijalni SFM-10 medijum. Odabrane serije PRIMATONE®, insulina, transferina i BSA čine osnovne nivoe 0,76 µM Zn+2, 5,9 mM EDTA, i 0,9 µM Fe+3. Matrica eksperimentalnih uslova se dobija dopunom sa Zn+2, EDTA, i/ili Fe+3, kao što je naznačeno u Tabeli 2.

Tabela 2. Koncentracije Zn<+2>, Fe<+3>, EDTA, i [EDTA - Fe+3] u dvanaest bioreaktora DOE3 eksperimenta (koncentracije su u µM)

[0152] U DOE3 eksperimentu, ukupna Zn+2 koncentracija imala je opseg od 0,76 do 1,7 µM, Fe+3 koncentracija je imala opseg od 0,90 do 5,4 µM, EDTA koncentracija je imala opseg od 5,9 do 26,8 µM, i [EDTA - Fe+3] je imala opseg od 0,53 do 23,6 µM.

[0153] U analizi DOE3 eksperimentalnih rezultata, uticaj Zn+2 je dominantan u odnosu na uticaj [EDTA] i [EDTA - Fe+3]. Prema tome, to je razumno u sledećoj prezentaciji rezultata sa grupom DOE3 eksperimentalnih rezultata kao funkcije [Zn+2] u svakom bioreaktoru; šest bioreaktora su ciljni za [Zn+2] od 0,76 µM i šest bioreaktora su ciljni za [Zn+2] od 1,7 µM.

[0154] SL. 8A je grafik CTL uklanjanja (izražen kao procenat des-Lys i izračunat upotrebom cIEF postupka iz podatka Maksimalne vrednosti 1) kao funkcije starosti bioreaktora, i pokazuje efekat varirajućih EDTA koncentracija na CTL uklanjanje u prisustvu 0,76 µM Zn+2 (početna koncentracija Zn+2 u bioreaktoru koja odgovara oznaci "Fe:5 Zn:1 EDTA: 10" bila je 6,3 µM, pre nego 0,76 µM; ciljna koncentracija 0,76 µM Zn+2 je primenjena od Dana 13 do kraja eksperimenta). SL.8B je grafik uklanjanja CTL (eksprimiran kao procenat des-Lys i izračunat upotrebom cIEF postupka iz podatka Maksimalne vrednosti 1) kao funkcije starosti bioreaktora, i pokazuje efekat varirajućih EDTA koncentracija na CTL uklanjanje u prisustvu 1,7 µM Zn+2. Kao u SFM-10.1 eksperimentu, bioreaktori iz DOE3 eksperimenta ispoljavaju snažnu vezu između procenta CTL uklanjanja i koncentracije Zn+2.

[0155] Bioreaktori sa 0,76 µM Zn+2 ispoljavaju značajno niži procenat uklanjanja CTL u odnosu na bioreaktore sa 1,7 µM koncentracijom Zn+2. Bioreaktori sa većom koncentracijom Zn+2 ispoljavaju 60 do 75% CTL uklanjanja u ranim, srednjim i kasnim periodima kulture. Bioreaktori sa nižom koncentracijom Zn+2 ispoljavaju 40% uklanjanje CTL u Danima 10-20, i uklanjanje CTL postepeno raste kao funkcija kulture u danu, približavajući se 60% uklanjanju CTL na kraju kultura. Ovi rezultati se poklapaju sa efektom koncentracije Zn+2 koja se uočava u SFM-10.1 eksperimentu.

[0156] Kao što je ranije pomenuto, bioreaktor naznačen sa "Fe:5, Zn:1, EDTA:10" ima veoma visoku koncentraciju Zn+2 od 6,3 mM pre Dana 13, koja se nalazi u korelaciji sa 80% uklanjanjem CTL u ranim stadijumima kulture, najveće uklanjanje CTL je postignuto u ovom ispitivanju. Procenat uklanjanja CTL u ovom bioreaktoru postepeno opada nakon ispravke koncentracije u medijumu od 0,76 µM Zn+2 u Danu 13. Sa brzinom perfuzije od približno 0,7 zapremine kulture po danu, Zn+2 koncentracija u proizvodnom bioreaktoru opada do 0,76 µM tokom 10 dana ili manje. Opet, procenat uklanjanja CTL ostaje mnogo veći u ovom bioreaktoru nego u njegovim sestrama bioreaktorima na 0,76 µM Zn+2. To jest, izgleda da ćelije imaju mehanizam koji "se seća" prošlog izlaganja koncentraciji Zn+2.

[0157] Bez želje za vezivanjem za određenu teoriju, predložena je hipoteza da se ova ćelijska "memorija" odnosi na nakupljanje Zn+2 unutar ćelija. Nakupljen Zn+2 ne može da bude zamenjen iznenadnim smanjenjem u koncentraciji vanćelijskog Zn+2. Verovatno je da nakupljeni Zn+2 po ćeliji može da bude smanjen samo naknadnom ćelijskom deobom, gde je nakupljeni Zn+2 podeljen između ćerki ćelija. Pod uslovima DOE3 eksperimenta, obim ćelijske deobe je ogranićen nakon što ćelije dostignu ciljnu ćelijsku gustinu u približno Danima 15-20.

[0158] Uklanjanje CTL u Danima 10 i 13 za bioreaktor "Fe:5, Zn:1, EDTA:10" je približno oko 80%, veće nego za bioreaktore na 1,7 µM Zn+2. Ovo ukazuje na to da pod eksperimentalnim uslovima DOE3 eksperimenta, 1,7 µM Zn+2 nije dovoljan za zasićenje ćelijske potrebe za Zn+2.

[0159] Kao što je gore navedeno, rezultati DOE3 eksperimenta se nalaze u snažnoj korelaciji sa Zn+2 koncentracijom. Međutim, unutar rezultata na datoj Zn+2 koncentraciji, postoji dokaz efekta EDTA (ili EDTA - Fe+3) na uklanjanje CTL. Kod bioreaktora sa 0,7 µM Zn+2, dva bioreaktora sa najnižim uklanjanjem CTL u Danima 13, 20, i 28 imaju najviše [EDTA] i [EDTA - Fe+3] (bioreaktori "Fe:1 Zn:1 EDTA:25" i "Fe:5 Zn:1 EDTA:28") (SL.8A). Suprotno, bioreaktor sa najnižim [EDTA] i [EDTA - Fe+3] ima najviše CTL uklanjanja ("Fe:1 Zn:1 EDTA:6").

[0160] Slično tome, kod bioreaktora sa 1,7 µM Zn+2, bioreaktor sa najnižim uklanjanjem CTL u Danima 13, 20, i 28 ima najviše [EDTA] i [EDTA - Fe+3] ("Fe:3 Zn:2 EDTA:27") (SL.8B).

[0161] SL-e. 9A i 9B pokazuju da postoji značajna razlika u sadržaju sijalinske kiseline kao funkcije [Zn+2] u DOE3 eksperimentu. U danima 10-20, postoji značajno veći sadržaj sijalinske kiseline u bioreaktorima sa 1,7 mM Zn+2 (SL. 9B) u odnosu na bioreaktore sa 0,76 µM (SL. 9A). Za "kasne" uzorke bioreaktora, razlika u sadržaju sijalinske kiseline se sužava, ali je i dalje visoka na 1,7 µM Zn+2 u odnosu na 0,76 µM Zn+2.

[0162] SL-e. 9A i 9B su takođe dokaz ćelijske "Zn+2 memorije" koja je razmotrena u tekstu iznad. U bioreaktoru "Fe:5, Zn:1, EDTA:10", sadržaj sijalinske kiseline je bio veoma visok u najranijoj vremenskoj tački ovog bioreaktora, i ostao je mnogo viši u odnosu na njegove sestre bioreaktore koji koje imaju 0,76 µM Zn+2 kroz period trajanja kulture, uprkos činjenici da su vanćelijske koncentracije Zn+2 u svim bioreaktorima bile približno iste oko Dana 20.

[0163] Sadržaj sijalinske kiseline u Danima 10 i 13 za bioreaktor "Fe:5, Zn:1, EDTA: 10" je približno 18%, značajno veći neko kod bioreaktora koji imaju 1,7 µM Zn+2. Ovo ukazuje na to da, pod eksperimentalnim uslovima DOE3 eksperimenta, 1,7 µM Zn+2 nije dovoljno za zasićenje ćelijske potrebe za Zn+2 da bi se podržalo dodavanje sijalinske kiseline.

[0164] Kao što je gore navedeno, rezultati DOE3 eksperimenta se nalaze u snažnoj korelaciji sa koncentracijom Zn+2. Međutim, unutar rezultata na datoj Zn+2 koncentraciji, postoji dokaz efekta [EDTA] (ili [EDTA - Fe+3]) na dodavanje sijalinske kiseline. SL. 9A pokazuje da kod bioreaktora sa 0,7 µM Zn+2, sadržaj sijalinske kiseline u Danu 38 se povećava kako [EDTA] opada. SL.9B pokazuje da u Danima 20 i 38, sadržaj sijalinske kiseline raste kako sadržaj [EDTA] opada.

[0165] U DOE3 eksperimentu, pet bioreaktora sa 0,76 µM Zn+2 su imali mnogo nižu stopu ćelijskog rasta tokom prvih 20 dana (pre dostizanja ciljne ćelijske gustine) u odnosu na šest bioreaktora koji su imali 1,7 µM Zn+2 (SL. 10). Kao što je prethodno zabeleženo, bioreaktor naznačen sa "Fe:5, Zn:1, EDTA:10" je imao veoma visoku koncentraciju Zn+2 od 6,3 µM pre Dana 13. Ovaj bioreaktor ispoljava ponašanje ćelijskog rasta u periodu pre Dana 20 koje se pokalapa sa bioreaktorima sa 1,7 µM Zn+2. Ovi podaci ukazuju na to da je vanćelijska koncentacija Zn+2 od 1,7 µM dovoljna za zasićenje ćelijskih intraćelijskih potreba za Zn+2 za ćelijsku deobu.

[0166] SL-e.11A i 11B pokazuju da je vijabilnost kulture privih pet bioreaktora sa 0,76 µM Zn+2 niža tokom prvih 30 dana u odnosu na vijabilnost kulture 1.7 mM Zn+2. Od posebnog značaja, šest bioreaktora naznačenih sa "Fe:5, Zn:1, EDTA:10" koji ispoljavaju visoku vijabilnost kulture u Danu 10 i 13, ali se zatim vraćaju da se poklope sa sestrom bioreaktora koji ima Zn+2 koncentraciju od 0,76 µM ubrzo nakon što se ispravi koncentracija Zn+2. Ovo podržava hipotezu da je vijabilnost kulture u vezi sa trenutnom koncentracijom vanćelijskog Zn+2, a ne sa skladištenim Zn+2 unutar ćelije.

[0167] SL-e. 12A i 12B pokazuju da koncentracija antitela u pet bioreaktora sa 0,76 µM Zn+2 je niža za prvih 20 dana u odnosu na šest bioreaktora sa 1,7 µM Zn+2. Bioreaktor naznačen sa "Fe:5, Zn:1, EDTA:10" ispoljava koncentraciju antitela koja može da se poredi da bioreaktorima od 1,7 µM Zn+2, što podržava hipotezu da je proizvodnja antitela povezana sa nakupljenim Zn+2 pre nego sa trenutnom vrednosti vanćelijskog Zn+2.

[0168] SL-e 10, 11A, 11B, 12A i 12B pokazuju da ne postoji jasna korelacija između [EDTA] i vijabilne ćelijske gustine, vijabilnosti kulture i koncentracije antitela u DOE3 rezultatima.

[0169] DOE3 je uključivao opseg [Zn+2], [EDTA], i [EDTA - Fe+3]. Na primer, [EDTA - Fe+3] opsega od 0,5 do 23 µM. Međutim, dominantni faktor u ishodu ovih eksperimenata je vanćelijska koncentracija Zn<+2>, sa opsegom od 0,76 µM do 1,7 µM (i početna 6,3 µM u bioreaktoru "Fe:5, Zn:1, EDTA:10"). Bioreaktori sa vanćelijskim Zn<+2>od 1,7 µM su imali značajno veće uklanjanje CTL, sadržaj sijalinske kiseline, početni ćelijski rast, početnu vijabilnost kulture, i početnu proizvodnju antitela u odnosu na bioreaktore sa vanćelijskim vrednostima Zn<+2>od 0,76 µM (SL-e. 8A, 8B, 9A, 9B, 10, 11A, 11B, 12A i 12B).

[0170] Unutar bioreaktora na datim koncentracijama Zn<+2>, postoji neki dokaz sekundarnog uticaja [EDTA] (ili [EDTA - Fe+3]) na uklanjanje CTL i dodavanje sijalinske kiseline (SL-e. 8A, 8B, 9A i 9B).

Rezultati nisu obezbedili dokaz uticaja [EDTA] na ćelijski rast, vijabilnost kulture i proizvodnju antitela (SL-e. 10, 11A, 11B, 12A i 12B). Uticaj [EDTA] je detaljnije ispitan u BSA eskperimentu mešenja #1 i #2, i razmotren je u sledećem odeljku.

[0171] Bioreaktor "Fe:5, Zn:1, EDTA:10" je imao veoma visoku koncentraciju Zn<+2>od 6,3 µM pre Dana 13, i zatim je vraćen na ciljnu koncentraciju Zn<+2>od 0,76 µM. Ovaj bioreaktor ispoljava poredivi početni rast ćelija (SL.10), vijabilnost kulture (SL-e.11A i 11B) i proizvodnju antitela (SL-e.12A i 12B) sa bioreaktorima sa 1,7 µM Zn<+2>. Međutim, ovaj bioreaktor ispoljava veće početno uklanjanje CTL i sadržaja sijalinske kiseline u odnosu na bioreaktore sa 1,7 µM Zn<+2>. Ovaj bioreaktor ispoljava "memoriju" za početnu visoku koncentraciju Zn<+2>koja se proširuje dosta iznad korekcije vanćelijske koncentracije Zn<+2>za uklanjanje CTL, sadržaja sijalinske kiseline, ćelijske gustine i proizvodnje antitela (SL-e. 8A, 8B, 9A, 9B, 10, 12A i 12B). Međutim, ovaj bioreaktor ne ispoljava memoriju za vijabilnost kulture; to jest, vijabilnost klture je ispravljena bez odlaganja kako koncentracija vanćelijskog Zn<+2>opada od 6,3 µM do 0,76 µM (SL-e.11A i 11B).

[0172] SL-e.9C i 9D su grafici procenta G0F (WAX Komponenta 1) kao funkcije starosti bioreaktora, i pokazuju efekat varirajućih EDTA koncentracija na procenat ne-galaktozilovanih vrsta u prisustvu 0,76 µM Zn<+2>i 1,7 µM Zn<+2>.

[0173] Rezultati DOE3 eksperimenta su dosledni hipotezi koja je prethodno izražena za SFM- 10.1 eksperiment. Takođe se pojavljuje dodatna hipoteza:

• CTL uklanjanje, dodavanje sijalinske kiseline, ćelijski rast i ekspresija antitela su u vezi sa nakupljenom količinom intraćelijkog Zn<+2>, pre nego trenutne vanćelijske koncentracije Zn<+2>. Nakupljena skladišta Zn<+2>su zasnovana na prošloj istoriji vanćelijskog Zn<+2>, ne na trenutnoj vanćelijskoj koncentraciji. Ovo je osnova za "ćelijsku memoriju" koja se odnosi na prošlu vanćelijsku vrednost Zn+2.

• Vijabilnost kulture je u vezi sa trenutnom vanćelijskom koncentracijom Zn<+2>.

[0174] Pod uslovima u ovom eksperimentu, vanćelijska koncentracija od 1,7 µM Zn<+2>je dovoljna za zasićenje ćelijske potrebe za Zn<+2>da bi se podržale enzimske aktivnosti koje su uvezi sa ćelijskim rastom i ekspresijom antitela. Međutim, 1,7 µM Zn<+2>nije dovoljno za zasićenje ćelijske potrebe za Zn<+2>da se podrži uklanjanje CTL ili dodavanje sijalinske kiseline. Ove hipoteze su podržane rezultatima za bioreaktor "Fe:5, Zn:1, EDTA:10," koji je imao koncentraciju Zn<+2>od 6,3 µM pre Dana 13.

PRIMER 6 - BSA eksperimenti mešanja Br.1 i Br.2

[0175] Ova dva eksperimenta koriste SFM-10 medijum. U svakom ekperimentu, koriste se iste serije PRIMATONE® i insulina, pri čemu se obezbeđuju konstantne koncentracije Zn<+2>i Fe<+3>. U BSA eksperimentima mešanja Br.1 i Br.2, koncentracije Zn<+2>su redom 1,1 i 1.2 µM.

[0176] U svakom eksperimentu, identifikovane su BSA serije koje sadrže visoke i niske koncentracije EDTA, zati su pomešane da bi se dobili opsezi EDTA koncentracija u bioreaktorima. BSA eksperiment mešanja Br. 1 koristi osam bioreaktora, sa dupliranim bioreaktorima na četiri EDTA koncentracije.

Duplikati bioreaktora u BSA eksperimentu mešanja Br. 1 su označeni sa "A" i "B". BSA eksperiment mešanja Br. 2 koristi osam bioreaktora, svaki ima različitu EDTA koncentraciju. Tabele 3 i 4 navode Zn<+2,>Fe<+3>, EDTA i EDTA - Fe koncentracije u bioreaktorima u BSA eksperimentima mešanja Br.1 i Br.2

Tabela 3. Koncentracije Zn<+2>, Fe<+3>, EDTA, i [EDTA - Fe+3] u osam bioreaktora BSA eksperimenta mešanja Br.1 (koncentracije su u µM)

Tabela 4. Koncentracije Zn<+2>, Fe<+3>, EDTA, i [EDTA - Fe+3] u osam bioreaktora BSA eksperimenta mešanja Br.2 (koncentracije su u µM)

[0177] U oba BSA eksperimenta mešanja, bioreaktori sa većim EDTA koncentracijama imaju manje CTL uklanjanja, i obrnuto – bioreaktori sa nižim EDTA koncentracijama imaju povećano CTL uklanjanje. Efekat je najočigledniji u Danu 35 u svakom eksperimentu, zatim se smanjuje u kasnijim danima u kulturi (SL-e.13A i 14A).

[0178] U oba BSA eksperimenta mešanja, bioreaktori sa većim koncentracijama EDTA imaju niži sadržaj sijalinske kiseline i obrnuto – bioreaktori sa nižim koncentracijama EDTA imaju veći sadržaj sijalinske kiseline. Efekat se održavao u ranim, srednjim i kasnim uzorcima bioreaktora (SL-e. 13B i 14B).

[0179] U oba BSA eksperimenta mešanja, bioreaktori sa većim EDTA i nižim EDTA koncentracijma ispoljavaju poredivi ćelijski rast (SL-e.13C i 14C) i poredivu vijabilnost kulture (SL-e.13D i 14D).

[0180] Uočen je manji efekat koncentracije EDTA na proizvodnju antitela u BSA eksperimentima mešanja. U BSA eksperimentu mešenja Br. 1, bioreaktori sa niskim i visokim sadržajem EDTA imaju poredivu proizvodnju antitela pre dostizanja ciljne ćelijske gustine. Tokom perioda koji sledi odmah nakon dostizanja ciljne ćelijske gustine (od približno Dana 15 do Dana 25) bioreaktori sa većim sadržajem EDTA imaju nižu ekspresiju antitela u odnosu na bioreaktore sa nižim EDTA (SL-e. 13E i 13F). U BSA eksperimentu mešanja Br.2, primećena je smanjena proizvodnja antitela za dve najveće [EDTA] sa početkom u Danu 10, i bioreaktori sa najnižim [EDTA] ispljavaju veću proizvodnju antitela u približno Danu 15 (SL-e. 14E i 14F). Međutim, efekat [EDTA] na proizvodnju antitela nije uočen u DOE3 eksperimentu (SL.12B).

[0181] Za bioreaktore sa ektraćelijskim Zn<+2>od približno 1,1 do 1.2 mM, BSA eksperimenti mešanja pokazuju da EDTA koncentracija može da ima značajan uticaj na uklanjanje CTL i dodavanje sijalinske kiseline. Dodatno, može da postoji manji uticaj koncentracije EDTA na proizvodnju antitela tokom perioda od Dana 10 do Dana 25, pored toga što ovaj efekat nije evidentan u DOE3 eksperimentu. Na ovim Zn<+2>koncentracijama, EDTA nema primetan uticaj na ćelijski rast ili vijabilnost kulture.

[0182] Zbog toga što je koncentracija Fe<+3>bila konstantna u bioreaktorima za BSA eksperimente mešanja, gore navedene korelacije za [EDTA] jednako važe za [EDTA - Fe<+3>].

[0183] U oba BSA eksperimenta mešanja, pokazano je da opadajuća EDTA koncentracija vodi do smanjenja u procentu agalaktozilovanih oligosaharida (SL-e. 13G i 15). Prema tome, opadajuća koncentracija EDTA vodi i do većeg sadržaja galaktoze i do većeg sadržaja sijalinske kiseline.

[0184] Bez želje za vezivanjem za bilo koji teoriju, podaci u BSA eksperimentima mešanja podržavaju sledeće hipoteze:

• EDTA (ili [EDTA - Fe<+3>]) mogu da utiču na brzinu unosa Zn<+2>od ćelija. Ovaj efekat je najočigledniji kada je ekstraćelijska koncentracija Zn<+2>niska, i ćelije prolaze kroz intraćelijsku deficijenciju Zn<+2>za podršku enzima koji imaju potrebe za Zn+2.

• Ćelije imaju razrađene intraćelijske sisteme za skladištenje i distribuciju Zn<+2>, i postoje prioriteti za distribucijom Zn<+2>u periodima gde je koncentracija Zn<+2>ograničena. Pod uslovima ograničenja Zn<+2>, ćelije će dati prioritet intraćelijskim procesima kojima je Zn<+2>neophodan za deobu ćelija. Prema tome, u BSA eksperimentima mešanja Br.1 i Br.2, EDTA nema uticaja na ćelijski rast, zbog toga što ćelije imaju adekvatnu koncentraciju Zn<+2>za deobu ćelija u uslovima ovog istraživanja. Slično tome, ekpresija antitela je minimalno pogođena sa EDTA u uslovima ovog eksperimenta. Intraćelijska distribucija Zn<+2>za podršku uklanjanja CTL i dodavanja sijalinske kiseline imaju niži intraćelijski prioritet nego distribucija Zn<+2>za ćelijski rast. Prema tome, pod uslovima u kojima EDTA ne pogađa ćelijski rast, postoji značajan uticaj EDTA na uklanjanje CTL i dodavanje sijalinske kiseline.

[0185] Bioreaktorima koji sadrže se upravlja prvih 15-20 dana na način koji podseća na serijski napajanu hranjene (“fed-batch”). To jest, ćelije su inokulisane u niskoj početnoj ćelijskoj gustini, i sledećih 15 do 20 dana se u kontinuitetu dodaje sveži medijum da bi se podržao ćelijski rast i ekspresija antitela. Prema tome, eksperimentalni rezultati koji u ovde opisani jedako se primenjuju na serijski hranjene (“fed-batch”) i perfuzione kulture.

PRIMER 7 – Dalja analiza DOE3 i BSA Mešanja Br.1 i Br.2

Eksperimenti

[0186] Eksperimenti mešanja DOE3 i BSA se svi izvode u istoj laboratoriji koriščenjem istog modela bioreaktora male skale, i uzorci se analiziraju pomoću iste grupe za testiranje. Prema tome, treba da bude moguće međusobno porediti rezultate eksperimenata DOE3 i BSA Mešanja Br. 1 i eksperimenata Br.2.

[0187] U DOE3 eksperimentu i eksperimentu BSA Mešanje Br. 1, uzorci su sakupljeni u Danu 20, i analizirani pomoću cIEF i WAX testa. SL.-e 17, 19, 20 i 21 pokazuju podatke iz dana 20 iz DOE3 eksperimenta i eksperimenta BSA Mešanje Br. 1 koji su grafički prikazani zajedno. Rezultati koji su prikazani na Slikama. 17, 19 i 20 podržavaju pretodne analize, odnosni, da se uklanjanje CTL povećava sa povećanjem [Zn<+2>], sadržaj sijalinske kiseline se povećava sa povećanjem [Zn<+2>], i procenat agalaktozil oligosaharida se smanjuje sa povećanjem [Zn<+2>]. Ova dva poslednja rezultata su u skladu sa promovisanjem enzimskih reakcija za dodavanje galaktoze i dodavanje sijalinske kiseline, kao što je prikazano na SL.16.

[0188] SL. 21 pokazuje da se odnos sijalinske kiseline prema galaktozi povećava sa povećavanjem [Zn<+2>].

[0189] SL.26 je grafik koji predstavlja procentat sijalinske kiseline (WAX Komponenta 5) kao funkcije procenta G0F (dominantne agalaktozil komponente WAX Komponente 1), i pokazuje obrnuti odnos između procenta sijalinske kiseline i procenta agalaktozil oligosaharida, za DOE3 i BSA Mešanje Br.1 i Br. 2 eksperimente. SL. 26 pokazuje da dodavanje galaktoze i dodavanje sijalinske kiseline imaju tendenciju da budu spojeni u DOE3 i BSA Mešanje Br. 1 i Br. 2 eksperimentima, u skladu sa reakcijama spajanja katalizovanim sa galaktoziltransferazom i sialiltransferazom. Drugim rečima, faktori koji pojačavaju ove dve reakcije glikozilacije direktno više G0F do oligosaharida koji sadrže sijalinsku kiiselinu.

[0190] Eksperimenti mešanja BSA Br.1 i Br.2 zajedno uključuju uzorak koji je sakupljen u danima 33-35. SL-e.22-25 pokazuju podatke iz dana 33-35 iz eksperimenta mešanja BSA Br.1 i Br.2. SL-e.22-25 pokazuju da pri nižim EDTA koncentracijama, postoji veće uklanjanje CTL, veći sadržaj sijalinske kiseline, niži procenat agalaktozil oligosaharida, i veći odnos sijalinske kiseline prema galaktozi.

[0191]

Claims

Patentni zahtevi

1. Postupak za proizvodnju antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena koji ima sadržaj C-terminalnog lizina od 20% do 70%, i sadržaj sijalinske kiseline od 1% do 20%, što postupak obuhvata:

gajenje u kulturi ćelija domaćina osetljivih na cink koje su transfecirane sa DNK koja kodira antitelo, u medijumu kulture koji sadrži 0,5 μM do 6,5 μM cinka; i

kontrolisanje koncentracije cinka u medijumu, pri čemu se proizvodi antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena.

2. Postupak prema zahtevu 1, gde:

a) sadržaj C-terminalnog lizina antitela je 40% do 70%, opciono 55% do 65%, i opciono 60%; i/ili

b) sadržaj sijalinske kiseline antitela je 3% do 14%.

3. Postupak prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, gde antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena je anti-TNFa antitelo, ili njegov fragment za vezivanje antigena, gde pomenuto anti-TNFa antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena (i) kompetitivno inhibira vezivanje monoklonskog antitela koje je proizvedeno iz hibridoma deponovanog pod ATCC Pristupnim Br. PTA-7045 za humani TNFα; i (ii) vezuje se za neutralizujući epitop humanog TNFα sa afinitetom od najmanje 1 x 10<8>litara/molu, mereno kao konstanta asocijacije (Ka).

4. Postupak prema zahtevu 3, u kome je anti-TNFa antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena:

a) humano antitelo;

b) humanizovano ili himerno antitelo;

c) imunoglobulin klase IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 ili IgM, opciono gde anti-TNFa antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena sadrži konstantni region IgG1; ili

d) se bira iz grupe koja se sastoji od FAt, FAt’, F(At’)2 i Fv.

5. Postupak prema zahtevu 3, gde

a) laki lanac sadrži sve antigen vezujuće regione lakog lanca monoklonskog antitela koje je proizvedno iz hibridoma deponovanog pod ATCC Pristupnim Br. PTA-7045;

b) teški lanac sadrži sve antigen vezujuće regione teškog lanca monoklonskog antitela koje je proizvedno iz hibridoma deponovanog pod ATCC Pristupnim Br. PTA-7045; ili

c) laki lanac sadrži sve antigen vezujuće regione lakog lanca monoklonskog antitela koje je proizvedno iz hibridoma deponovanog pod ATCC Pristupnim Br. PTA-7045 i teški lanac sadrži sve antigen vezujuće regione teškog lanca monoklonskog antitela koje je proizvedno iz hibridoma deponovanog pod ATCC Pristupnim Br. PTA-7045.

6. Postupak prema zahtevu 5, gde anti-TNFa antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena sadrži ne-humani varijabilni region koji sadrži sekvencu aminokiselina koja se bira iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3 i SEQ ID NO: 5, opciono gde ne-humani varijabilni region sadrži polipeptid kodiran sekvencom nukleinske kiseline koja se bira iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2 i SEQ ID NO: 4.

7. Postupak prema zahtevu 3 ili zahtevu 4, gde anti-TNFa antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena ima epitopsku specifičnost koja je identična sa infliksimabom, opciono gde anti-TNFa antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena je infliksimab.

8. Postupak prema bilo kojim od zahteva 1-7, gde:

a) koncentracija cinka u medijumu kulture je u opsegu od 0,6 µM do 6,5 µM, opciono gde koncentracija cinka u medijumu kulture je u opsegu od 0,6 µM do 1,1 µM; i/ili

b) medijum kulture dalje sadrži ukupni EDTA u opsegu koncentracija od 2,5 µM do 30 µM, i postupak dalje sadrži kontrolisanje koncentracije EDTA bez gvožđa u medijumu kulture, opciono gde medijum kulture dalje sadrži EDTA u slobodnom obliku u opsegu koncentracija od 5 µM do 16 µM.

9. Postupak prema zahtevu 8, koji dalje sadrži dobijanje antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena.

10. Postupak prema zahtevu 9, gde se antitelo dobija kada ćelija domaćina koja je ostetljiva na cink u medijumu kulture dostigne ćelijsku gustinu od 1,5 milliona ćelija po mL do 11 miliona ćelija po mL, opciono ćelijsku gustinu od 3 milliona ćelija po mL do 11 milliona ćelija po mL.

11. Postupak prema zahtevu 9 ili zahtevu 10, gde je koncentracija cinka kontrolisana do regeneracije antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena.

12. Postupak prema bilo kojim od zahteva 1-11, gde:

a) koncentracija cinka je kontrolisana tokom eksponencijalne faze rasta ćelija domaćina koje su osetljive na cink;

b) kontrolisanje koncentracije cinka sadrži praćenje koncentracije cinka u medijumu kulture, i regulacije koncentracije cinka u medijumu kulture, tako da je koncentracija cinka u medijumu kulture najmanje 0,5 µM, opciono u opsegu od 0,6 µM do 6,5 µM;

c) antitelo ima sadržaj galaktoze od 50% do 90%, opciono 45% do 85%;

d) antitelo ima odnos sijalinske kiseline prema galaktozi od 0,05 do 0.20; i/ili

e) ćelija koja je osetljiva na cink je SP2/0 ćelija.

13. Postupak za kontrolu:

a) sadržaja C-terminalnog lizina antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena koji ima sadržaj C-terminalnog lizina od 20% do 70%;

b) sadržaj sijalinske kiseline antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena koji ima sadržaj sijalinske kiseline 1% do 20%;

c) sadržaj galaktoze antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena koji ima sadržaj galaktoze od 50% do 90%; i/ili

d) odnos sijalinske kiseline prema galaktozi u antitelu koji ima odnos sijalinske kiseline prema galaktozi 0,05 do 0,20, u postupku biosinteze antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena u medijumu kulture, što postupak sadrži:

praćenje nivoa cinka u medijumu kulture tokom biosinteze antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena;

regulisanje nivoa cinka u medijumu kulture tokom biosinteze antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena.

14. Postupak kao prema zahtevu 13, gde antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena je anti-TNFa antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena, opciono gde antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena je anti-TNFa antitelo, ili njegov fragment za vezivanje antigena, gde pomenuto anti-TNFa antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena (i) kompetitivno inhibira vezivanje monoklonskog antitela koje je proizvedeno iz hibridoma deponovanog pod ATCC Pristupnim br. PTA-7045 za humani TNFα; i (ii) vezuje neutralizujući epitop humanog TNFα sa afinitetom od najmanje 1 x 10<8>litara/molu, mereno konstantom asocijacije (Ka).

15. Postupak prema zahtevu 14, u kome antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena je anti-TNFa antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena koji ima specifičnost epitopa identičnu sa infliksimabom, opciono gde antitelo je infliksimab, gde je antitelo dobijeno biosintezom od SP2/0 ćelijske linije.