RS57890B1 - Procena i tretman poremećaja posredovanih bradikininom - Google Patents

Description

Opis

UNAKRSNE REFERENCE NA POVEZANE PRIJAVE STANJE TEHNIKE

[0001] Kalikrein plazme (pKal) je primarni enzim koji generiše bradikinin u cirkulaciji. Aktivacija pKal se javlja preko dodirnog sistema koji je povezan sa patologijom bolesti povezanom sa naslednim angioedemom (HAE). Bradikinin je ključni medijator bola, upala, edema i angiogeneze.

[0002] Kininogeni su prekursori kinina, kao što su bradikinin i kalikrein. Postoje dve vrste ljudskih kininogena, kininogen visoke molekulske mase (HMWK) i kininogen niske molekulske mase (LMWK), koji su varijante deljenja. HMWK deluje uglavnom kao kofaktor na koagulaciju i upalu, i predstavlja poželjan supstrat za stvaranje bradikinina posredovano sa pKal. I HMWK i LMWK su inhibitori cisteinskih proteaza.

[0003] Phipps i dr. (Hypertension. 2009 Feb;53(2):175-81) navodi da kalikrein plazme posreduje retinalnu vaskularnu permeabilnost stimulisanu receptorom angiotenzin II tipa. Zhang i dr. (FASEB J.2000 Dec;14(15):2589-600) objašnjava da je deo teškog lanca razdvojenog HMWK takođe prisutan u LMWK.

SAŽETAK PRONALASKA

[0004] Pronalazak pruža postupak za identifikovanje pacijenta pod rizikom da dobije, ili koji ima poremećaj kalikreina plazme (pKal), gde postupak sadrži:

merenje nivoa razdvojenog kininogena visoke molekulske mase (HMWK), i po izboru nivoa netaknutog (HMWK) u uzorku pacijenta;

određivanje vrednosti razdvojenog HMWK; i

identifikovanje pacijenta kao rizičnog za poremećaje posredovane sa pKal, ako je vrednost razdvojenog HMWK iznad referentne vrednosti,

gde se referentna vrednost odnosi na vrednost razdvojenog HMWK u zdravom pacijentu;

i gde je poremećaj posredovan sa pKal nasledni angioedem (HAE), reumatoidni artritis, ulcerativni kolitis ili Kronova bolest.

[0005] Pronalazak takođe pruža postupak za procenu tretmana poremećaja posredovanog sa pKal kod pacijenta, gde postupak sadrži:

merenje nivoa razdvojenog HMWK, i po izboru nivoa netaknutog HMWK, u uzorcima prikupljenim od pacijenta pre i nakon tretmana, ili tokom tretmana; određivanje vrednosti razdvojenog HMWK u svakom uzorku na osnovu nivoa razdvojenog i opciono netaknutog HMWK u istom uzorku; i

procenjivanje efikasnost lečenja na osnovu promena vrednosti razdvojenog HMWK u uzorcima pre i nakon tretmana ili tokom tretmana,

gde je poremećaj posredovan sa pKal nasledni angioedem (HAE), reumatoidni artritis, ulcerativni kolitis ili Kronova bolest.

[0006] Pronalazak takođe pruža farmaceutski sastav za upotrebu u lečenju bolesti posredovane sa pKal kod pacijenta, gde sastav sadrži inhibitor pKal i farmaceutski prihvatljiv nosač, gde pacijent ima vrednost razdvojenog kininogena visoke molekulske mase (HMWK) koja je iznad referentne vrednosti, koja se odnosi na vrednost razdvojenog HMWK u zdravom pacijentu; i gde je bolest posredovana sa pKal nasledni angioedem (HAE), reumatoidni artritis, ulcerativni kolitis ili Kronova bolest.

[0007] Kalikrein plazme (pKal) je komponenta serinske proteaze dodirnog sistema i primarni enzim koji generiše bradikinin u cirkulaciji. Dodirni sistem se aktivira bilo faktorom XIIa nakon izlaganja stranim ili negativno naelektrisanim površinama, ili površinama endotelnih ćelija putem prolilarkarboksipeptidaza (Sainz I.M. i dr., Thromb Haemost 98, 77-83, 2007). Aktivacija kalikreina plazme pojačava intrinzičnu koagulaciju pomoću aktivacije povratne sprege faktora XII i pospešuje upale kroz proizvodnju pro-upalnog neapeptidnog bradikinina. Kao primarna kininogenaza u cirkulaciji, pKal je uglavnom odgovoran za generisanje bradikinina u vaskulaturi. Genetski nedostatak C1 inhibitor proteina (C1-INH), glavnog prirodnog inhibitora kalikreina plazme, dovodi do naslednog angioedema (HAE). Pacijenti sa HAE pate od akutnih napada bolnih edema koji često izazivaju nepoznati pokretači (Zuraw B.L. i dr., N Engl J Med 359, 1027-1036, 2008). Kroz upotrebu farmakoloških agenasa ili genetskih studija u modelima životinja, kalikrein-kinin plazme sistem (plazma KKS) je impliciran u različitim bolestima.

[0008] Kao što je opisano ovde, razvijen je Western blot test za detektovanje netaknutog (1-lančanog) i razdvojenog (2-lančanog) kininogena visoke molekulske mase (HMWK), koristeći reagens za detektovanje (npr. antitelo) koji posebno (npr. Poželjno) vezuje ili netaknuti kininogen ili razdvojeni kininogen, i opciono, ne vezuje LMWK. Takav reagens za detektovanje može se koristiti za praćenje relativnih količina 1-lančanog i 2-lančanog HMWK u plazmi pacijenta. Primenom ovog postupka utvrđeno je da je nivo (npr., procenat) razdvojenog kininogena u uzorku pacijenta povišen u stanjima bolesti za koje je poznato da su posredovana viškom aktivacije pKal, kao što su edematični HAE napadi. Procenat razdvajanja kininogena u plazmi pacijenata sa drugim bolestima može kasnije biti testiran kako bi se utvrdilo da li je aktivan pKal povezan sa bolestima. Druge bolesti koje su testirane, i za koje se pokazalo da imaju povišen razdvojeni kininogenu odnosu na zdravu plazmu, uključuju reumatoidni artritis (RA), ulcerativni kolitis (UC) i Kronovu bolest.

[0009] Shodno tome, jedan aspekt predmetnog obelodanjenja odnosi se na postupak za identifikovanje pacijenta koji je pod rizikom da dobije, ili ima poremećaj posredovan sa pKal, gde postupak sadrži: (a) merenje nivoa razdvojenog kininogena (npr., HMWK) i nivo netaknutog kininogena (npr., HMWK) u uzorku pacijenta (npr. uzorak krvi ili uzorak plazme) putem, npr., Western blot testa; (b) određivanje vrednosti (npr., procenta) razdvojenog kininogena, vrednosti netaknutog kininogena (npr., procenat) ili oba u uzorku; i (c) identifikovanje pacijenta kao rizičnog za poremećaje posredovane sa pKal, ako vrednost razdvojenog kininogena, vrednost netaknutog kininogena ili obe, odstupaju od referentne vrednosti. U nekim primerima se određuje procenat razdvojenog kininogena i pacijent se identifikuje kao rizičan ili da ima ciljanu bolest ako je procenat razdvojenog kininogena u uzorku na ili iznad referentne vrednosti.

[0010] U nekim otelotvorenjima, nivoi razdvojenog kininogena i netaknutog kininogena se mere agensom za detektovanje (npr., antitelo) koji specifično (npr. Poželjno) vezuje ili razdvojeni ili netaknuti kininogen. Takav agens za detektovanje (npr., antitelo) može se vezati i za netaknuti i za razdvojeni kininogen, ali ne vezuje LMWK. U drugim otelotvorenjima, nivoi razdvojenog kininogena i netaknutog kininogena se mere agensom za detektovanje (npr., antitelo), koji specifično vezuje razdvojeni kininogen u poređenju sa netaknutim kininogenom, ili specifično vezuje netaknuti kininogen u poređenju sa razdvojenim kininogenom. U jednom primeru, reagens za detektovanje je antitelo koje specifično vezuje razdvojeni kininogen u odnosu na netaknuti kininogen. U drugom primeru, agens za detektovanje je antitelo koje se vezuje za C-terminus lakog lanca razdvojenog kininogena, koji nije prisutan u LMWK.

[0011] Poremećaj posredovan sa pKal može biti nasledni angioedem (HAE), reumatoidni artritis, ulcerativni kolitis ili Kronova bolest. Ako je osoba identifikovana kao rizična ili ima poremećaj posredovan sa pKal, ovde opisan postupak može dalje obuhvatati davanje efikasne količine inhibitora pKal pacijentu. U nekim primerima, inhibitor pKal je DX-88, EPIKAL-2 ili DX-2930,

[0012] U nekim otelotvorenjima uzorak je od pacijenta koji ima simptom poremećaja posredovanog sa pKal, uključujući, ali ne ograničavajući se na, edem, ponavljajuće napade otoka, otok gde je navedeni otok potpuno ili pretežno periferan, koprivnjača, crvenilo, bol, i oticanje u odsustvu dokaza o infekciji; ili edemom koji nije posredovan histaminom. U drugim otelotvorenjima, uzorak je od pacijenta koji nema simptom poremećaja posredovanog sa pKal u trenutku sakupljanja uzorka, nema istoriju simptoma poremećaja posredovanih sa pKal, ili nema istorije poremećaja posredovanih sa pKal. Alternativno ili pored toga, pacijent je otporan na anti-histamin terapiju, terapiju kortikosteroidom ili obe.

[0013] U drugom aspektu, predmetno obelodanjenje pruža postupak za utvrđivanje da li je poremećaj podložan tretmanu sa inhibitorom pKal, gde postupak sadrži: (a) merenje nivoa razdvojenog kininogena (npr. HMWK) i nivoa netaknutog kininogena (npr. HMWK) u uzorku pacijenta (npr., uzorak krvi ili uzorak plazme) koji imaju poremećaj; (b) određivanje vrednosti (npr., procenta) razdvojenog kininogena, vrednosti (npr., procenta) netaknutog kininogena, ili oba, u uzorku; i (c) identifikovanje poremećaja kao osetljivog na tretman sa inhibitorom pKal ako vrednost razdvojenog kininogena, vrednost netaknutog kininogena ili obe, odstupaju od referentne vrednosti. U jednom primeru se procenjuje procenat razdvojenog kininogena i utvrđuje se da je bolest podložna lečenju ako je procenat razdvojenog kininogena na, ili iznad, referentne vrednosti.

[0014] U nekim otelotvorenjima, nivoi razdvojenog kininogena i netaknutog kininogena se mere agensom za detektovanje (npr., antitelo), koji specifično vezuje razdvojeni kininogen u poređenju sa netaknutim kininogenom, ili specifično vezuje netaknuti kininogen u poređenju sa razdvojenim kininogenom. U nekim primerima, reagens za detektovanje je antitelo koje specifično vezuje razdvojeni kininogen u odnosu na netaknuti kininogen. U drugim primerima, reagens za detektovanje je antitelo koje se vezuje za C-terminus lakog lanca razdvojenog kininogena. U bilo kom od opisanih postupaka, nivoi netaknutog kininogena i razdvojenog kininogena mogu se meriti Western blot testom.

[0015] Ako je poremećaj identifikovan kao podložan tretmanu inhibitorom pKal, postupak može dalje obuhvatati davanje pacijentu efikasne količine inhibitora pKal, koji uključuje, ali nije ograničen na, DX-88, EPIKAL-2 ili DX -2930,

[0016] U još jednom aspektu, predmetno obelodanjenje pruža postupak za procenu tretmana poremećaja posredovanih sa pKal kod pacijenta, gde postupak sadrži: (a) merenje nivoa razdvojenog kininogena (npr., HMWK) i nivoa netaknutog kininogena (npr., HMWK) u uzorcima (npr., uzorci krvi ili uzorci plazme) prikupljenim od pacijenta pre i posle tretmana ili tokom tretmana; (b) određivanje vrednosti (npr., procenta) razdvojenog kininogena, vrednosti (npr., procenta) netaknutog kininogena, ili oba, u svakom uzorku na osnovu nivoa razdvojenog i netaknutog kininogena u istom uzorku; i (c) procenu efikasnosti lečenja na osnovu na promena vrednosti razdvojenog i/ili netaknutog kininogena pre i nakon tretmana ili tokom tretmana. Na primer, smanjenje procenta razdvojenog kininogena posle tretmana ili tokom tretmana ukazuje na to da je lečenje efektivno kod pacijenta. U nekim otelotvorenjima, tretman obuhvata davanje pacijentu efikasne količine inhibitora pKal, npr., DX-88, EPIKAL-2 ili DX-2930,

[0017] U bilo kom od opisanih postupaka procene, nivoi razdvojenog kininogena i netaknutog kininogena mogu se izmeriti agensom za detektovanje (npr., antitelo), koji specifično vezuje razdvojeni kininogen u poređenju sa netaknutim kininogenom, ili specifično vezuje netaknut kininogen u poređenju sa razdvojenim kininogenom. U nekim primerima, reagens za detektovanje je antitelo koje specifično vezuje razdvojeni kininogen u odnosu na netaknuti kininogen. U drugim primerima, agens za detektovanje je antitelo koje se vezuje za C-terminus lakog lanca razdvojenog kininogena. U bilo kom od opisanih postupaka, nivoi netaknutog kininogena i razdvojenog kininogena mogu se meriti Western blot testom.

[0018] U nekim otelotvorenjima poremećaj posredovan sa pKal je nasledni angioedem (HAE), reumatoidni artritis, ulcerativni kolitis ili Kronova bolest.

[0019] Osim toga, predmetno obelodanjenje pruža postupak za određivanje vrednosti razdvojenog kininogena, vrednosti netaknutog kininogena ili oba u uzorku, koji sadrži (a) dovođenje u dodir uzorka (npr., uzorak krvi ili uzorak plazme) koji sadrži netaknut i razdvojen kininogen sa reagensom za detektovanje pod uslovima koji dozvoljavaju interakciju između agensa za detektovanje i netaknutog i razdvojenog kininogena, gde agens za detektovanje specifično vezuje razdvojeni kininogen u odnosu na netaknuti kininogen, ili specifično vezuje netaknuti kininogen u poređenju sa razdvojenim kininogenom; (b) merenje nivoa razdvajanja kininogena i/ili netaknutog kininogena u uzorku na osnovu njihove interakcije sa reagensom za detektovanje; i (c) određivanje vrednosti (npr., procenta) razdvojenog kininogena, vrednosti (npr., procenta) netaknutog kininogena, ili oba, u uzorku na osnovu nivoa razdvojenog kininogena i netaknutog kininogena. U nekim otelotvorenjima, reagens za detektovanje je antitelo, kao što su antitelo koje se specifično vezuje za razdvojeni kininogen u poređenju sa netaknutim kininogenom, ili antitelo koje se vezuje za C-terminus lakog lanca razdvojenog kininogena. U nekim otelotvorenjima, količine netaknutog kininogena i razdvojenog kininogena se mere Western blot testom.

[0020] Takođe, u okviru predmetnog obelodanjenja su (i) postupak za lečenje bolesti posredovane sa pKal, koji obuhvata davanje pacijentu, kom je to potrebno, efikasne količine inhibitora pKal kako je ovde opisano, gde pacijent ima vrednost (npr. procenat) razdvojenog kininogena, vrednost (npr. procenat) netaknutog kininogena, ili obe, koje odstupaju od referentne vrednosti, (ii) farmaceutski sastav za upotrebu u lečenju bolesti posredovane sa pKal kod pacijenta, gde sastav sadrži inhibitor pKal i farmaceutski prihvatljiv nosač, i gde je pacijent imao poremećenu vrednost razdvojenog kininogena i/ili netaknutog kininogena, u poređenju sa referentnom vrednošću, i (iii) upotreba farmaceutskog sastava za proizvodnju leka za upotrebu u lečenju bolest posredovane sa pKal, npr. HAE. U nekim otelotvorenjima vrednost razdvojenog i/ili netaknutog kininogena je procenat razdvojenog i/ili netaknutog kininogena u uzorku.

[0021] Naredna otelotvorenja su takođe u okviru predmetnog obelodanjenja:

Ovde su navedeni postupci za procenu pacijenta, npr. pacijent koji je pod rizikom ili pati od poremećaja posredovanih sa pKal ili bradikininom. Predviđeni postupci dozvoljavaju analizu pacijenata sa angioedemom posredovanim kalikreinom plazme (KMA), ili drugim bolestima posredovanim pomoću pKal korisnim u proceni i tretmanu.

[0022] Varijacije predmetnog obelodanjenja pružaju biomarker i njihovo korišćenje u identifikovanju i tretmanu pacijenata, npr. pacijenata koji pate od edema izazvanih bradikininom koji generiše kalikrein plazme. Postupci, sastavi i uređaji koji su ovde prikazani su korisni na više načina. Na primer, nivoi pKal markera mogu se koristiti za identifikovanje poremećaja povezanih sa povišenom aktivacijom dodirnog sistema. Inicijalno skrining se može pratiti in vitro ili in vivo testiranjem sa inhibitorima kalikreina plazme (npr., DX-88, EPIKAL2 ili DX-2930), npr., u pretkliničkim modelima bolesti. Marker koji je ovde obelodanjen takođe se može koristiti kao farmakodinamički biomarker ili inače nadgledati odgovor pacijenta na inhibitor kalikreina. Marker koji je ovde obelodanjen može se koristiti u pratećoj dijagnostici kako bi se omogućilo lečenje bolesti posredovanih kalikreinom plazme, za upravljanje doziranja tokom profilaktičke terapije poremećaja posredovanih sa pKal ili bradikininom, npr. HAE, idiopatski angioedem koji nije zavisan od histamina, reumatoidni artritis, Kronova bolest, ulcerativni kolitis, lupus, Alchajmerova bolest, septički šok, povreda opekotina, ishemija mozga/povreda reperfuzije, cerebralni edem, dijabetička retinopatija, dijabetična nefropatija, makularni edem, vaskulitis, arterijska ili venska tromboza, tromboza povezana sa ventrikularnim pomoćnim uređajima ili stentovima, trombocitopenija izazvane heparinom uz trombozu, tromboembolijske bolesti i koronarne bolesti srca sa nestabilnom anginom pektoris, edemom, bolestima očiju, gihtom, bolesti creva, oralni mukozitis, neuropatski bol, upalni bol, kičmena stenoza-degenerativne bolesti kičme, post operativni ileus, aneurizma aorte, osteoartritis, nasledni angioedem, embolija pluća, moždani udar, povreda glave ili peri-tumorski moždani edem, sepsa, akutne ishemijski poremećaj srednje moždane arterije (MCA), restenoza (npr. nakon angioplastike), sistemski lupus eritematozni nefritis, autoimuna bolest, upalno oboljenje, kardiovaskularna bolest neurološka oboljenja, bolest povezana sa poremećajima proteina, bolest povezana sa angiogenezom, hipertenzivna nefropatija i diabetična nefropatija, alergijske i respiratorne bolesti (npr. anafilaksija, astma, hronična opstruktivna bolest pluća, sindrom akutnog respiratornog distresa, cistična fibroza, uporan, rinitis) i povrede tkiva (npr. opekotine ili hemijske povrede).

[0023] Predmetno obelodanjenje pruža postupak procene ili lečenja pacijenta, na primer, razlikovanje poremećaja posredovanog sa pKal, npr. angioedema posredovanog bradikininom, od poremećaja posredovanog histaminom ili predviđanjem budućeg napada poremećaja posredovanog sa pKal, koji obuhvata dobijanje, npr. određivanje nivoa jednog ili više markera u korelaciji sa aktivacijom pKal (marker pKal), koji je ovde obelodanjen, npr. netaknuti kininogen i razdvojeni kininogen, čime se procenjuje ili tretira navedeni pacijent. U nekim otelotvorenjima, postupak obuhvata dobijanje, na primer, detektovanje, nivoa jednog ili više markera u korelaciji sa histaminom posredovanim upalnim odgovorima (H-marker), na primer, triptaza.

[0024] U nekim otelotvorenjima, pomenuti poremećaj posredovan sa pKal je HAE, IAE, IBD ili IBS. U nekim otelotvorenjima pomenuti poremećaj posredovan sa pKal je izabran iz grupe koji čine idiopatski angioedem koji nije zavisan od histamina, reumatoidni artritis, Kronova bolest, ulcerativni kolitis, lupus, Alchajmerova bolest, septički šok, povreda opekotina, ishemija mozga/povreda reperfuzije, cerebralni edem, dijabetička retinopatija, dijabetična nefropatija, makularni edem, vaskulitis, arterijska ili venska tromboza, tromboza povezana sa ventrikularnim pomoćnim uređajima ili stentovima, trombocitopenija izazvane heparinom uz trombozu, tromboembolijske bolesti i koronarne bolesti srca sa nestabilnom anginom pektoris, edemom, bolestima očiju, gihtom, bolesti creva, oralni mukozitis, neuropatski bol, upalni bol, kičmena stenoza-degenerativne bolesti kičme, post operativni ileus, aneurizma aorte, osteoartritis, nasledni angioedem, embolija pluća, moždani udar, povreda glave ili peritumorski moždani edem, sepsa, akutne ishemijski poremećaj srednje moždane arterije (MCA), restenoza (npr. nakon angioplastike), sistemski lupus eritematozni nefritis, autoimuna bolest, upalno oboljenje, kardiovaskularna bolest neurološka oboljenja, bolest povezana sa poremećajima proteina, bolest povezana sa angiogenezom, hipertenzivna nefropatija i diabetična nefropatija, alergijske i respiratorne bolesti (npr. anafilaksija, astma, hronična opstruktivna bolest pluća, sindrom akutnog respiratornog distresa, cistična fibroza, uporan, rinitis) i povrede tkiva (npr. opekotine ili hemijske povrede).

[0025] Predmetno obelodanjenje takođe daje postupak procene ili lečenja pacijenta, gde navedeni pacijent ima simptom koji je konzistentan sa poremećajem posredovanim sa pKal, npr. angioedem posredovan bradikininom, i poremećaj povezan sa histaminom, koji obuhvata a) opciono, određivanje da li navedeni pacijent ima simptom, npr. edem ili disfunkciju abdomena, u skladu sa jednim ili oba od poremećaja posredovanog sa pKal i poremećaja povezanog sa histaminom; b) ako navedeni pacijent nije tretiran anti-histaminskom terapijom za navedeni simptom, zatim tretiranje pomenutog pacijenta sa anti-histaminskom terapijom; c) dobijanje, na primer, detektovanje, nivoa jednog ili više markera u korelaciji sa aktivacijom pKal (marker pKal), na primer, netaknuti kininogen i razdvojeni kininogen; d) ako navedeni nivo odgovara unapred utvrđenom kriterijumu, npr., ako je na nivou ili iznad referentnog nivoa: odabir pacijenta za terapiju inhibitorima kalikreina; ili primena inhibitora kalikreina navedenom pacijentu, čime se procenjuje ili leči navedeni pacijent. U nekim otelotvorenjima, postupak obuhvata odabir pacijenta za terapiju inhibitora kalikreina. U izvesnim otelotvorenjima, postupak obuhvata davanje inhibitora kalikreina navedenom pacijentu. U konkretnim otelotvorenjima, odabir pacijenata za terapiju inhibitora kalikreina; ili davanje inhibitora kalikreina navedenom pacijentu, dolazi pre utvrđivanja da pacijent ne reaguje na pomenutu anti-histamin terapiju, npr. Se javlja unutar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 sati od navedenog tretmana sa terapijom anti-histaminima. U nekim otelotvorenjima dolazi do utvrđivanja da navedeni pacijent ima simptom koji je u skladu i sa poremećajem posredovanim sa pKal i sa poremećajem povezanim sa histaminom, i dobijanja uzorka od navedenog pacijenta za određivanje nivoa pKal markera: u razmaku od 30 minuta, 1, 2 ili 3 sata jedan od drugog; ili u istoj poseti pružaocu zdravstvene zaštite.

[0026] U nekim otelotvorenjima pomenuti inhibitor pKal je izabran od DX-88, DX-2930 ili EpiKal-2.

[0027] U nekim otelotvorenjima, postupak obuhvata dobijanje, npr., određivanje nivoa jednog ili više markera u korelaciji sa upalnim odgovorima posredovanim histaminom (H-marker). U određenim otelotvorenjima, navedeni pacijent se procenjuje za podložnost poremećaju posredovanim sa pKal. U određenim otelotvorenjima, navedeni pacijent ima simptom, na primer, u skladu sa poremećajem posredovanim sa pKal, npr. edem, npr., HAE. U određenim otelotvorenjima, navedeni pacijent ima simptom poremećaja koji se karakteriše neželjenom aktivacijom pKal, i tom pacijentu je primenjena anti-histamin terapija. U posebnim otelotvorenjima, pomenuta anti-histamin terapija se primenjuje u roku od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 8 ili 10 sati pre ili posle koraka određivanja kad se ovde obelodanjeno. U konkretnim otelotvorenjima, postupak dalje obuhvata davanje anti-histamin terapije tom pacijentu, npr., pre, posle ili tokom procene ili određivanja kad se ovde obelodanjeno.

[0028] U nekim otelotvorenjima, odgovara na navedeno određivanje ili procenu, davanje inhibitora kalikreina pacijentu. U određenim otelotvorenjima, navedeni pacijent ima jedan ili više ili sve navedene simptome ili osobine: ponavljajući napadi otoka; oticanje u kom je

1

navedeno oticanje potpuno ili pretežno periferno, npr., pacijent nema značajne abdominalne ili otoke disajnih puteva; koprivnjača; crvenilo, bol i otok u odsustvu dokaza o infekciji; ne reaguje na anti-histamin terapiju ili kortikosteroide; ili ima edem koji nije posredovan histaminom. U određenim otelotvorenjima, navedeni pacijent ima uporni ili ponavljajući edem i ne reaguje na jednu ili obe od anti-histamin i steroidne terapije. U određenim otelotvorenjima, pacijent nema istoriju poremećaja posredovanog sa pKal, npr. HAE, IAE, IBD ili IBS; pacijent ima istoriju poremećaja posredovanog sa pKal, npr. HAE, IAE, IBD ili IBS, pacijent nema istoriju HAE; pacijent ima istoriju HAE; pacijent nema istoriju IAE; pacijent ima istoriju IAE; pacijent nema istoriju IBD ili IBS; pacijent ima istoriju IBD ili IBS; pacijent nema istoriju poremećaja posredovanog histaminom, npr. alergija na hranu; pacijent ima istoriju poremećaja posredovanog histaminom, na primer, alergija na hranu; pacijent nema istoriju poremećaja posredovanog sa pKal, npr. HAE, IAE, IBD ili IBS i nema istoriju poremećaja posredovanog histaminom, npr. alergija na hranu; ili pacijent nema istoriju poremećaja posredovanog sa pKal, npr. HAE, IAE, IBD ili IBS, i ima istoriju poremećaja posredovanog histaminom, npr. alergija na hranu: pacijent ima istoriju poremećaja posredovanog sa pKal, npr. HAE, IAE, IBD ili IBS, i nema istoriju poremećaja posredovanog histaminom, alergija na hranu; ili pacijent ima istoriju poremećaja posredovanog sa pKal, npr., HAE, IAE, IBD ili IBS, i ima istoriju poremećaja posredovanog histaminom, na primer, alergija na hranu.

[0029] U nekim otelotvorenjima pacijent je tretiran sa inhibitorom kalikreina, npr. u profilaktičkoj terapiji, npr. za HAE, i odgovor pacijenta na inhibitor kalikreina se procenjuje ili prati, i opciono, kao odgovor na pomenuto praćenje, terapija je odabrana ili primenjena, npr., kao odgovor na određivanje, doziranje inhibitora kalikreina je prilagođeno. U nekim otelotvorenjima, određivanje pKal markera se izvodi u kontekstu prateće dijagnostike, i opciono, davanje ili zadržavanje terapeutske primene se daje na osnovu određivanja. U određenim otelotvorenjima, odgovor na navedeni tretman se oslanja na identifikovanje nadolazećeg akutnog napada, npr. HAE ili IEA napada. U konkretnim otelotvorenjima, navedeni pacijent se procenjuje na podložnost idiopatskom angioedemu. U konkretnim otelotvorenjima, pomenuta procena obuhvata određivanje da li navedeni pacijent pati od poremećaja posredovanog sa pKal, npr. Poremećaja posredovanog bradikininom, npr. angioedem posredovan sa pKal, ili od poremećaja posredovanog histaminom, npr. alergijska reakcija na hranu.

[0030] U nekim otelotvorenjima, pacijent nema istoriju poremećaja posredovanog sa pKal, npr., HAE ili IAE. U nekim otelotvorenjima, pacijent ima istoriju poremećaja posredovanog sa pKal, npr., HAE ili IAE. U nekim otelotvorenjima, pacijent nema istoriju poremećaja posredovanog sa pKal, npr. HAE, IAE, IBD ili IBS; pacijent ima istoriju poremećaja posredovanog sa pKal, npr. HAE, IAE, IBD ili IBS, pacijent nema istoriju HAE; pacijent ima istoriju HAE; pacijent nema istoriju IAE; pacijent ima istoriju IAE; pacijent nema istoriju IBD ili IBS; pacijent ima istoriju IBD ili IBS; pacijent nema istoriju poremećaja posredovanog histaminom, npr. alergija na hranu; pacijent ima istoriju poremećaja posredovanog histaminom, na primer, alergija na hranu; pacijent nema istoriju poremećaja posredovanog sa pKal, npr. HAE, IAE, IBD ili IBS i nema istoriju poremećaja posredovanog histaminom, npr. alergija na hranu; ili pacijent nema istoriju poremećaja posredovanog sa pKal, npr. HAE, IAE, IBD ili IBS i ima istoriju poremećaja posredovanog histaminom, npr. alergija na hranu: pacijent ima istoriju poremećaja posredovanog sa pKal, npr. HAE, IAE, IBD ili IBS, i nema istoriju poremećaja posredovanog histaminom, alergija na hranu; ili pacijent ima istoriju poremećaja posredovanog sa pKal, npr. HAE, IAE, IBD ili IBS, i ima istoriju poremećaja posredovanog histaminom, npr. alergija na hranu.

[0031] U nekim otelotvorenjima, pka marker, npr., ovde obelodanjen pKal marker, detektuje se sa reagensom na osnovu antitela. U određenim otelotvorenjima, pKal marker se detektuje sa imunološkim sendvič testom . U određenim otelotvorenjima, postupak obuhvata dobijanje, na primer, detektovanje, nivoa kininogena, npr. jednog ili oba od netaknutog ili razdvojenog kininogena, na primer, pomoću testa elektroforitičkog odvajanja, na primer, Western blot. U nekim otelotvorenjima, marker pKal, na primer, kininogen, detektuje se u analizi koja se oslanja na odvajanje, na primer, elektroforetsko odvajanje, na primer, Western blot analita iz drugih proizvoda.

[0032] U nekim otelotvorenjima, marker pKal je detektovan sa sendvič imunološkim testom, i drugi marker pKal, npr. kininogen, se detektuje u testu koji se oslanja na odvajanje, npr. elektroforetsko odvajanje, npr., Western blotom, analitom iz drugih proizvodi. U određenim otelotvorenjima, detektovanje pKal markera je kvalitativno. U određenim otelotvorenjima, detektovanje pKal markera je kvantitativno. U konkretnim otelotvorenjima se detektuje nivo netaknutog kininogena i razdvojenog kininogena.

[0033] U nekim otelotvorenjima, postupak obuhvata upoređivanje nivoa pKal markera, npr. netaknutog kininogena ili razdvojenog kininogena, sa referentnom vrednošću. U određenim otelotvorenjima pomenuta referentna vrednost je funkcija nivoa pomenutog pKal markera u HAE, na primer, u jednom ili više HAE pacijenata. U određenim otelotvorenjima pomenuta referentna vrednost je funkcija nivoa pomenutog pKal markera u HAE tokom napada, npr. kod jednom ili više HAE pacijenta tokom akutnog napada. U određenim otelotvorenjima pomenuta referentna vrednost je funkcija nivoa pKal markera u IAE, npr., kod jednog ili više IAE pacijenata. U određenim otelotvorenjima pomenuta referentna vrednost je funkcija nivoa pKal markera u IAE tokom akutnog napada, npr. kod jednog ili više IAE pacijenata tokom akutnog napada. U određenim otelotvorenjima pomenuta referentna vrednost je funkcija nivoa pKal markera u odsustvu HAE ili IAE, npr. kod jednog ili više pacijenata koji nemaju istoriju HAE ili IAE.

[0034] U konkretnim otelotvorenjima, postupak obuhvata, na primer, kao odgovor na poređenje, klasifikovanje pacijenta, npr. klasifikovanje pacijent za rizik za poremećaj posredovan sa pKal, ili davanje ili zadržavanje terapije od navedenog pacijenta. U određenim otelotvorenjima, postupak obuhvata, na primer, kao odgovor na poređenje, biranje tretmana za pomenutog pacijenta. U nekom otelotvorenju, postupak obuhvata, na primer, kao odgovor na poređenje, primenu ili suzdržavanja od terapije kod navedenog pacijenta, npr., agens za vezivanje kalikreina; antagonist bradikinin B2 receptora; ili C1-INH zamenski agens. U konkretnim otelotvorenjima, pomenuti tretman je davanje inhibitora pKal, npr. inhibitor pKal odabran od DX-88; EpiKal-2 i DX-2930,

[0035] U nekim otelotvorenjima, uzorak iz pomenutog pacijenta se dovodi u dodir sa supstratom koji sadrži agens za hvatanje za dva ili više markera, npr., od: pKal markera ili H markera, na primer, anti-H marker antitela; opciono, gde je najmanje jedan agens za hvatanje agens za pKal marker.

[0036] U nekim otelotvorenjima, postupak obuhvata dobijanje uzorka, na primer, uzorka krvi ili plazme od navedenog pacijenta.

[0037] U nekim otelotvorenjima, prvo agens za uzimanje (za prvi marker) i drugi agens za hvatanje (za drugi marker) se postavljaju na podlogu tako da se signal prisustva prvog

1

markera može razlikovati od signala prisustva drugog markera. U određenim otelotvorenjima, pomenuti prvi agens za hvatanje (za prvi marker) nalazi se na prvoj lokaciji ili adresi, i pomenuti drugi agens za hvatanje (za drugi marker) nalazi se na drugoj lokaciji ili adresi. U konkretnim otelotvorenjima, navedena prva mesto ili adresa i navedena druga mesto ili adresa se ne preklapaju na navedenom supstratu. U određenim otelotvorenjima, pomenuti prvi agens za hvatanje je za prvi pKal marker. U određenim otelotvorenjima, pomenuti prvi agens za hvatanje je za prvi pKal marker, i pomenuti drugi agens za hvatanje je za drugi pKal marker. U određenim otelotvorenjima, pomenuti prvi agens za hvatanje je za pKal marker, i pomenuti drugi agens za hvatanje je za H-marker.

[0038] U određenim otelotvorenjima, postupak obuhvata dovođenje u dodir supstrata sa detektabilnim, npr. antitelom, kako bi se utvrdilo prisustvo ili količina pKal markera. U određenim aspektima, navedena antitela su označena sa ostatkom koji proizvodi obojeni proizvod, emituje foton, apsorbuje foton, menja supstrat ili menja provodljivost supstrata. U određenim otelotvorenjima, navedena antitela su označena sa ostatkom koji koristi elektrohemiluminiscenciju. U određenim otelotvorenjima, navedena antitela se označavaju sa resinijumom. U konkretnim otelotvorenjima, pomenuti supstrat je predviđen u uređaju za detektovanje meso skale. U konkretnim otelotvorenjima, pomenuti supstrat je dat kao dipstick uređaj, pogodan za upotrebu sa jednom ili oba od krvi i plazme. U konkretnim otelotvorenjima, pomenuti prvi agens za hvatanje i pomenuti drugi agens za hvatanje se nalaze u zajedničkoj ili fluidima spojeni komori, npr. komora, npr. komorica ili dno, u uređaju sa više komora, npr. u konkretnim otelotvorenjima, pomenuti prvi agens za uzimanje i pomenuti drugi agens za hvatanje se štampaju na supstrat.

[0039] U nekim otelotvorenjima, pomenuti agens za hvatanje za prvi pKal marker je na prvoj lokaciji na pomenutom supstratu, i pomenuti agens za hvatanje za drugi pKal marker je na drugoj lokaciji na pomenutom supstratu, i pomenute prva i druga mesto se nalaze na pomenutom supstratu, tako da se signal prisustva prvog markera pKal može razlikovati od signala iz drugog pKal markera. U određenim otelotvorenjima, navedeni supstrat sadrži agens za hvatanje trećeg markera na trećoj lokaciji, i treća mesto je postavljena na pomenutom supstratu tako da se signal prisustva trećeg markera može razlikovati od signala od pomenutog prvog i drugog markera.

[0040] U nekim otelotvorenjima, određivanje nivoa pKal markera u uzorku može se napraviti unutar 1, 2, 3, 4 ili 5 sati od dodira supstrata sa navedenim uzorkom. U nekim otelotvorenjima, određivanje nivoa dva pKal markera u uzorku može se napraviti unutar 1, 2, 3, 4 ili 5 sati dodira supstrata sa navedenim uzorkom. U nekim otelotvorenjima, određivanje nivoa dva pKal markera radi se istovremeno izvedenim analizama, npr., inkubacija ili drugi intervala za testove se preklapaju jedni sa drugima.

[0041] U još jednom aspektu, ovo detektovanje pruža supstrat koji sadrži agens za hvatanje za mnoštvo markera pKal, npr., Kako je ovde opisano.

[0042] U daljem aspektu, predmetno obelodanjenje pruža postupak utvrđivanja da li je poremećaj podložan tretiranju sa inhibitorom pKal koji obuhvata: procenu nivoa jednog ili mnoštva pKal markera, npr. Kad se ovde opisano, npr., pacijent koji pati od navedenog poremećaj ili životinjski model za navedeni poremećaj; upoređujući određeni nivo sa referentnim, gde nivo koji odgovara unapred utvrđenom kriterijumu, npr., ako je na nivou ili iznad referentnog nivoa, označava poremećaj koji je podložan tretmanu sa inhibitorom pKal. U nekim otelotvorenjima, postupak obuhvata procenu afekta inhibitora kalikreina, in vitro ili in vivo, ili u životinjskom modelu pomenutog poremećaja.

[0043] U drugom aspektu, predmetno obelodanjenje pruža postupak lečenja pacijenta koji ima poremećaj posredovan sa pKal, npr. Poremećaj posredovan bradikininom, koji obuhvata procenu nivoa pKal markera koji je ovde opisan, npr. Postupkom koji je ovde opisan, određivanje i kao odgovor na navedenu procenu, bira tretmana, npr. biranje jedne ili obe od količine doziranja ili frekvencije doziranja inhibitora kalikreina. U nekim otelotvorenjima, postupak obuhvata davanje inhibitora kalikreina pacijentu. U nekim otelotvorenjima, navedenom pacijentu je dat inhibitor kalikreina pre navedene procene. U određenim otelotvorenjima, postupak obuhvata primenu inhibitora kalikreina pri izabranoj dozi ili frekvenciji.

[0044] U daljem aspektu, predmetno obelodanjenje pruža postupak utvrđivanja da li je poremećaj podložan tretiranju sa inhibitorom pKal koji obuhvata: procenu nivoa jednog ili mnoštva pKal markera, npr. kad se ovde opisano, na primer, kod pacijenta koji pati od navedenog poremećaj ili životinjskog modela za navedeni poremećaj; upoređujući određeni nivo sa referencom, gde nivo koji odgovara unapred utvrđenom kriterijumu, npr., ako je na nivou ili iznad referentnog nivoa, označava poremećaj koji je podložan tretmanu sa

1

inhibitorom pKal. U nekim otelotvorenjima, postupak obuhvata procenu afekta inhibitora kalikreina, in vitro ili u vivo, ili u životinjskom modelu pomenutog poremećaja.

[0045] U drugom aspektu, obelodanjenje sadri postupke i uređaje za sakupljanje uzorka, npr. krvi, sa minimalnim dodirom aktivacije. U jednom otelotvorenju, obelodanjenje sadrži kontejner, koji u sebi sadrži ovde opisan reagens za hvatanje, npr. inhibitor kalikreina, npr. Polipeptid koji je sličan po sekvenci sa DX-88, npr. onaj koji se razlikuje od DX-88 sa ne više od 1, 2 ili 5 aminokiselinskih ostataka, npr. EPIKAL-2. Kontejner je konfigurisan, npr. Sa otvorom, septumom itd., kako bi se omogućilo sakupljanje uzorka, npr. krvi, od pacijenta i vezivanja markera koji se odnosi na pKal u uzorku, npr. pKal, sa reagensom za hvatanje, u istom kontejneru. Merenje vezanih vrsta, npr. pKal, može se izvesti u istom kontejneru ili u otelotvorenjima, supstrat se uklanja iz prethodnog kontejnera za merenje, npr. merenje može biti u ili na drugom uređaju. U otelotvorenjima zapremina kontejnera je 0,5-100, 0,5-50, 0,5-10. 1-100, 1-50, je 1-25 ml. U jednom aspektu, reagens za hvatanje, npr., reagens za hvatanje pKal, nalazi se na unutrašnjoj površini posude. Reagens za hvatanje može se spojiti sa površinom pomoću prvog specifičnog vezujućeg partnera vezanog za površinu i drugog specifičnog vezujućeg partnera spojenog sa reagensom za hvatanje. Primeri specifičnih vezujućih partnera su biotin i avidin. U jednom aspektu biološki reagens za hvatanje, npr. reagens za hvatanje pKal, npr. inhibitor kalikreina, npr. Polipeptid koji je sličan po sekvenci sa DX-88, npr. onaj koji se razlikuje od DX-88 sa ne više od 1, 2, ili 5 aminokiselinskih ostataka, npr. Epikal-2, nalazi se na površini posude koja je prevučena avidinom.

[0046] Predmetno obelodanjenje pruža biomarkere koji mogu identifikovati pacijente sa angioedemom posredovanim kalikreinom plazme (KMA), ili drugim bolestima posredovanim sa pKal koje su korisne u proceni i tretmanu.

[0047] Pacijenti koji pokazuju da aktiviraju pKal aktivaciju putem biomarkera su kandidati za lečenje sa inhibitorom pKal, kao što je DX-88, mali inhibitor proteina pKal odobren za lečenje akutnih edematoznih napada povezanih sa HAE. Ostali inhibitor pKal uključuju DX-2930, koji je potpuno ljudski inhibitor antitela. U nekim otelotvorenjima, pacijenti koji pokazuju da aktiviraju pKal putem biomarkera su kandidati za lečenje antagonistom bradikinin B2 receptora, npr. Incatibant (Firazyr®). U nekim otelotvorenjima, pacijenti koji pokazuju da aktiviraju pKal putem biomarkera su kandidati za tretman sa C-INH zamenskim agensom, npr. pročišćenim nanofiltriranim C-INH koncentratom (Berinert®).

1

[0048] Varijacije obelodanjenja pružaju biomarker i njegovo korišćenje u identifikovanju i tretmanu pacijenata, na primer, pacijenata koji pate od edema izazvanog bradikininom koji generiše kalikrein plazme. Postupci, sastavi i uređaji koji su ovde prikazani su korisni na više načina. Na primer, nivoi pKal markera mogu se koristiti za identifikovanje poremećaja povezanih sa aktivacijom povišenog dodirnog sistema. Inicijalni skrining se može pratiti in vitro ili in vivo testiranjem sa inhibitorima kalikreina plazme (npr. DX-88, EPIKAL-2 ili DX-2930), npr., u pretkliničkim modelima bolesti. Marker koji je ovde obelodanjen takođe se može koristiti kao farmakodinamički biomarker ili inače posmatrati odgovor pacijenta na inhibitor kalikreina. Marker koji je ovde obelodanjen može se koristiti u pratećoj dijagnostici kako bi se omogućio lečenje bolesti posredovanih kalikreinom plazme, upravljanje doziranjem tokom profilaktičke terapije HAE ili identifikovanje predstojećeg akutnog HAE napada.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0049]

SLIKA 1 je prikaz elemenata uključenih u aktivaciju dodirnog sistema kalikreina plazme.

SLIKA 2 pokazuje razdvojeno detektovanje kininogena Western blot analizom. Uzorci su analizirani koristeći SDS-PAGE (3-8% Tris-Acetat) pod redukovanim uslovima praćeno prenošenjem na PVDF membranu i imunoblotiranjem. Linija 1 - 50 nM netaknuti kininogen; Linija 2 - 50 nM razdvojeni kininogen; Linija 3 - 50 nM kininogen niske molekulske mase; Linija 4 - 1:20 natrijum citrirana ljudska plazma (staklene cevi za prikupljanje); Linija 5 - 1:20 natrijum citrirana ljudska plazma (plastika) tretirana kalikreinom; Linija 6 - 1:20 natrijum citrirana ljudska plazma (plastika); Linija 7 - 1:20 natrijum citrirana ljudska plazma (plastika) 20nM dodat 2-lančani kininogen.

SLIKA 3 pokazuje detektovanje netaknutog kininogena (tj.1-lančani) u uzorku pacijenta koji je dobijen tokom napada. Uzorak plazme u krvi je sakupljen u cevi citrirane plazme koje sadrže koktel za zaštitu od proteaze.

SLIKA 4 pokazuje šematsku strukturu domena HMWK 1-lančani i 2-lančani HMWK nakon razdvajanja od strane pKal i Western blot lanca1-1 i lanca-2 HMWK za detektovanje koristeći antitelo koje se vezuje za laki lanac razdvojenog kininogena. C1 = 1-lančani HMWK, C2 = 2-lančani HMWK, G = staklo, P = plastika.

1

SLIKA 5 pokazuje LICOR detektovanje pročišćenog HMWK kao polu-kvantitatvni test. Pročišćeni ljudski HMWK i razdvojeni HMWK su titrirani od 90μg/mL do 5,6 μg/mL u HMWK-deficijentnoj ljudskoj plazmi. Uzorci su razblaženi 1:20 u TBS i puferu za opterećenje uzorka (sa DTT). Razblaženi uzorci su korišćeni na 4-12% Bis-Tris gelu i, nakon elektroforeze, prebačeni u nitroceluloznu membranu. Nakon blokiranja, blot je vizualizovan korišćenjem mišjeg anti-ljudskog HMWK antitela (klon # 11H05), koje je specifično za laki lanac HMWK i kozjeg anti-mišjeg IR Dye 680, Gelovi su skenirani koristeći LI-COR Odyssey IR Scanner, koji je u stanju da detektuje signal pobuđivanja IR Dye 680,

SLIKA 6 pokazuje Western blot i LICOR analizu uzorka HAE pacijenta i pokazuje da uzorci HAE pacijenata pokazuju veće endogene nivoe razdvojenog HMWK. I bazalna i napadnuta HAE plazma pacijenta imale su veću procentualno rastvorljivu HMWK u poređenju sa plazmom ne-bolesnog stanja, po Licor analizi. Analizirani uzorci plazme sakupljeni su u rastvoru anti-proteaze, koji je, u poređenju sa uzorcima natrijum citrirane plazme od istih pacijenata u istom istom periodu sakupljanja, zaštitio HAE plazmu pacijenta plazmu od daljeg dodira aktivacije. Granice grešaka na grafiku predstavljaju standardnu devijaciju.

SLIKA 7 pokazuje Western blot i grafik koji pokazuje procenu uslova aktivacije FXIIa. SLIKA 7A: Western blot sa Licor detektovanjem normalne ljudske plazme aktivirane sa različitim koncentracijama FXIIa na različitim temperaturama (led nasuprot 37°C) i vremenima inkubacije (10 nasuprot 30 minuta). Linija 1: markeri molekulske mase; Linija 2: pročišćeni 1-lančani i 2-lančani HMWK; Linija 3: normalna ljudska plazma; Linija 4: normalna ljudska plazma 2,5 nM FXIIa tokom 10 minuta na 37 C; Linija 5: normalna ljudska plazma 2,5 nM FXIIa 30 minuta na 37 C; Linija 6: normalna ljudska plazma 2,5 nM FXIIa 10 minuta na ledu; Linija 7: normalna ljudska plazma 2,5 nM FXIIa 30 minuta na ledu; Linija 8: normalna ljudska plazma 5 nM FXIIa tokom 10 minuta na 37 C; Linija 9: normalna ljudska plazma 5 nM FXIIa tokom 30 minuta na 37 C; Linija 10: normalna ljudska plazma 5 nM FXIIa 10 minuta na ledu; Linija 11: normalna ljudska plazma 5 nM FXIIa 30 minuta na ledu; Linija 12: normalna ljudska plazma 7,5 nM FXIIa tokom 10 minuta na 37 C; Linija 13: normalna ljudska plazma 7,5 nM FXIIa tokom 30 minuta na 37 C; Linija 14: normalna ljudska plazma 7,5 nM FXIIa tokom 10 minuta na ledu; Linija 15: normalna ljudska plazma 7,5 nM FXIIa 30 minuta na ledu. SLIKA 7B: Procenat dvolančanog HMWK u svakoj liniji određen korišćenjem

1

intenziteta Licor signala [%2-lančanog HMWK = (signal 46 kDa 56 kDa signal)/(46 kDa signal 56 kDa signal 110 kDa signal)].

SLIKA 8 pokazuje Western blot i grafik koji pokazuje inhibitorne efekte DX-88 i DX-2930 na FXIIa aktivaciju pKal aktivnosti. SLIKA 8A: Western blot analiza koja pokazuje da ekalantid i DX-2930 inhibiraju razdvajanje HMWK putem pKAL kada se dodaju u ljudsku plazmu ex vivo. Slika 8B: grafik koji pokazuje efekte DX-88 i DX-2930 na proizvodnju razdvojenog HMWK u prisustvu FXIIa. Prikupljena natrijum citrirana ljudska plazma je prethodno pripremljena sa DX-2930 ili ekalantidom u koncentracijama u rasponu od 1370 do 34,3nM. Svi uzorci (uključujući netretirani uzorak) su aktivirani dodatkom 2,5nM FXIIa. Enzimi su zatim inhibirani dodatkom koktela inhibitora proteaze. Jednake molarne koncentracije ekalantida i DX-2930 smanjuju količinu razdvojenog HMWK jednako u prikupljenoj ljudskoj plazmi u poređenju sa netretiranim uzorkom plazme. C = 25 nM 1- i 2-lančani HMWK; N = Normalna plazma; = Aktivirana ljudska plazma (bez leka).

SLIKA 9 pokazuje Western blot analizu aktivacije dodirnog sistema kod pacijenata sa ulcerativnim kolitisom (UC) i reumatoidnim artritisom (RA). Linija 1: markeri molekulske mase; Linija 2: pročišćeni 1-lančani i 2-lančani HMWK; Linije 3 do 5: normalna ljudska plazma; Linije 6 do 10: plazma od UC pacijenata; Linije 11 do 15: plazma od pacijenata sa RA. Dalji detalji uzoraka u svakoj liniji su dati u Tabeli 3. SLIKA 10 pokazuje Western blot analizu aktivacije dodirnog sistema kod pacijenata sa Kronovom bolesti (CD). Linija 1: markeri molekulske mase; Linija 2: pročišćeni 1-lančani i 2-lančani HMWK; Linije 3 do 5: normalna ljudska plazma; Linija 6 do 10: plazma od CD pacijenata. Dalji detalji uzoraka u svakoj liniji su dati u Tabeli 4.

DETALJAN OPIS

Definicije

[0050] Za pogodnost, pre daljeg opisa predmetnog pronalaska, ovde su definisani određeni izrazi koji se koriste u specifikaciji, primerima i priloženim zahtevima. Ostali izrazi su definisani kako se pojavljuju u specifikaciji.

[0051] Oblici jednine uključuju i oblike množine, , osim ako kontekst jasno ne diktira drugačije.

[0052] Kad se ovde koristi, „dobiti“ ili „dobijanje“ se odnosi na dobijanje fizičkog entiteta, ili

1

vrednosti, npr. numeričke vrednosti, „direktnim dobijanjem“ ili „indirektnim dobijanjem“ fizičkog entiteta ili vrednosti. „Direktno dobijanje“ znači obavljanje procesa (npr. obavljanje analize ili testiranja na uzorku ili „analiziranje uzorka“ kako je taj pojam definisan ovde) kako bi se dobili fizički entitet ili vrednost. „Indirektno dobijanje“ odnosi se na primanje fizičkog entiteta ili vrednosti od druge strane ili izvora (npr. laboratorija treće strane koja je direktno stekla fizički entitet ili vrednost). Direktno dobijanje fizičkog entiteta uključuje obavljanje procesa, npr. analiziranje uzorka, koji uključuje fizičku promenu fizičke supstance, npr. Početnog materijala. Primerne promene uključuju stvaranje fizičkog entiteta od dva ili više polaznih materijala, razdvajanje ili fragmentisanje supstance, odvajanje ili pročišćavanje supstance, kombinovanje dva ili više odvojenih entiteta u smešu, vršenje hemijske reakcije koja uključuje prekidanje ili oblikovanje kovalentne ili nekovalentne veze. Direktno dobijanje vrednosti uključuje otelotvorenje procesa koji uključuje fizičku promenu u uzorku ili drugoj supstanci, npr. otelotvorenje analitičkog procesa koji uključuje fizičku promenu supstance, npr. uzorka, analita ili reagensa (ponekad ovde označeno kao „fizička analiza“), izvodeći analitički postupak, npr. Postupak koji obuhvata jedno ili više od sledećeg: odvajanje ili pročišćavanje supstance, npr. analita ili fragmenta ili njenog drugog derivata; kombinovanjem analita ili fragmenta ili njenog drugog derivata, sa drugom supstancom, npr. puferom, rastvaračem ili reagensom; ili promenu strukture analita ili fragmenta ili njenog drugog derivata, npr., razbijanjem ili formiranjem kovalentne ili nekovalentne veze između prvog i drugog atoma analita; ili promenom strukture reagensa ili fragmenta ili njenog drugog derivata, na primer, razbijanjem ili formiranjem kovalentne ili nekovalentne veze između prvog i drugog atoma reagensa.

[0053] Kad se ovde koristi, „analiziranje“ uzorka uključuje otelotvorenje procesa koji uključuje fizičku promenu u uzorku ili drugoj supstanci, npr., početnom materijalu. Primerne promene uključuju stvaranje fizičkog entiteta od dva ili više polaznih materijala, razdvajanje ili fragmentisanje supstance, odvajanje ili pročišćavanje supstance, kombinovanje dva ili više odvojenih entiteta u smešu, vršenje hemijske reakcije koja uključuje prekidanje ili oblikovanje kovalentne ili nekovalentne veza. Analiziranje uzorka može obuhvatiti otelotvorenje analitičkog procesa koji uključuje fizičku promenu supstance, npr. uzorak, analit ili reagens (ponekad ovde označeno kao „fizička analiza“), obavljanje analitičkih postupaka, npr. Postupak koja uključuje jedno ili više od sledećeg: odvajanje ili pročišćavanje supstance, npr. analita ili fragmenta ili njenog drugog derivata; kombinovanjem analita ili fragmenta ili njenog drugog derivata, sa drugom supstancom, npr. puferom, rastvaračem ili

2

reagensom; ili promenu strukture analita ili fragmenta ili njenog drugog derivata, npr., razbijanjem ili formiranjem kovalentne ili nekovalentne veze između prvog i drugog atoma analita; ili promenom strukture reagensa ili fragmenta ili njenog drugog derivata, na primer, razbijanjem ili formiranjem kovalentne ili nekovalentne veze između prvog i drugog atoma reagensa.

[0054] Izraz „agonist“, kad se ovde koristi, ima za cilj da se odnosi na agens koji imitira ili reguliše na gore (npr. Potencira ili dopunjuje) bioaktivnost proteina. Agonist može biti protein divljeg tipa ili njegov derivat koji ima najmanje jednu bioaktivnost proteina divljeg tipa. Agonist može takođe biti jedinjenje koje povećava barem jednu bioaktivnost proteina. Agonist može takođe biti jedinjenje koje povećava interakciju polipeptida sa drugim molekulom, na primer, ciljanim peptidom ili nukleinskom kiselinom.

[0055] Izraz „antagonist“, kad se ovde koristi, podrazumeva da se odnosi na agens koji reguliše na dore (npr., potiskuje ili inhibira) najmanje jednu bioaktivnost proteina. Antagonist može biti jedinjenje koje inhibira ili smanjuje interakciju između proteina i nekog drugog molekula, npr. ciljanog peptida ili enzimskog supstrata. Antagonist takođe može biti jedinjenje koje smanjuje ili inhibira količinu prisutnog eksprimiranog proteina. Tipično, inhibiranje proteina ili gena odnosi se na smanjenje eksprimiranja ili relevantne aktivnosti proteina ili gena za najmanje 10% ili više, na primer, 20%, 30%, 40% ili 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili više, ili na smanjenje eksprimiranja ili relevantne aktivnosti više od 1 puta, 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 10 puta, 50 puta, 100 ili više, mereno jednim ili više postupaka koji su ovde opisani ili su priznati u struci.

[0056] Kad se ovde koristi, „afinitet vezivanja“ odnosi se na konvencionalnu konstantu asocijacije ili Ka. Kaje recipročna konstanti disociacije (Kd). Vezujući protein može, na primer, imati afinitet vezivanja najmanje 10<5>, 10<6>, 10<7>, 10<8>, 10<9>, 10<10>i 10<11>M<-1>za određeni ciljani molekul. Više afinitetno vezivanje vezujućeg proteina na prvu metu u odnosu na drugu metu može biti indikovano višim Ka(ili manjom numeričkom vrednosti Kd) za vezivanje prve mete osim Ka(ili numerička vrednost Kd) za vezivanje druge mete. U takvim slučajevima, vezujući protein ima specifičnost za prvu metu (npr., protein u prvoj konformaciji ili njegovu mimetik) u odnosu na drugu metu (na primer, isti protein u drugoj konformaciji ili njegov mimetik ili drugi protein). Razlike u afinitetu vezivanja (npr. za specifičnost ili druga poređenja) mogu biti najmanje 1,5, 2, 3, 4, 5, 10.15, 20.37,5, 50, 70, 80, 91, 100, 500, 1000, ili 10<5>puta.

[0057] Afinitet vezivanja može se odrediti različitim postupcima uključujući ravnotežnu dijalizu, ravnotežno vezivanje, gel filtraciju, ELISA, površinsku plazmonsku rezonancu ili spektroskopiju (npr. Pomoću fluorescentne analize). Primeri uslova za procenu afiniteta vezivanja su u TRIS-puferu (50mM TRIS, 150mM NaCI, 5mM CaCl2pri pH7,5). Ove tehnike mogu se koristiti za merenje koncentracije vezanih i slobodnih vezujućih proteina kao funkcije vezivanja proteina (ili ciljane) koncentracije. Koncentracija vezujućeg vezujućeg proteina ([Vezan]) odnosi se na koncentraciju slobodnog vezujućeg proteina ([Slobodan]) i na koncentraciju mesta vezivanja za vezujući protein na metu gde je (N) broj mesta vezivanja po ciljanom molekulu prema sledećoj jednačini:

[Vezan] = N ⋅ [Slobodan]/((1/Ka) [Slobodan]).

[0058] Nije uvijek potrebno precizno odrediti Ka, iako, pošto je ponekad dovoljno da se dobije kvantitativno merenje afiniteta, npr., određen je korišćenjem postupaka kao što su ELISA ili FACS analiza, proporcionalno je Ka, i stoga se mogu koristiti za upoređivanje, kao što je određivanje da li je veći afinitet, npr. dvostruko veći, kako bi se dobilo kvalitativno merenje afiniteta, ili da se dobije zaključak o afinitetu, npr. Po aktivnosti u funkcionalnom testu, npr in vitro ili in vivo testiranju.

[0059] Izraz „vezujući protein“ odnosi se na protein koji može da interakuje sa ciljanim molekulom. Ovaj izraz se koristi međusobno zamenjivo sa „ligandom“. „Vezujući protein kalikreina plazme“ se odnosi na protein koji može da interakuje sa (npr., vezuje) kalikreinom plazme, i naročito sadrži proteine koji poželjno ili specifično interakuju sa i/ili inhibiraju kalikrein plazme. Protein inhibira kalikrein plazme ako uzrokuje smanjenje aktivnosti kalikreina plazme u odnosu na aktivnost kalikreina plazme u odsustvu proteina i pod istim uslovima. U nekim otelotvorenjima vezujući protein kalikreina plazme je antitelo.

[0060] Izraz „reagens za hvatanje“ odnosi se na deo koji se specifično vezuje za njegov ligand.

[0061] Kad se ovde koristi, termini „kompleks“ ili „kompleksna formacija“ odnose se na kompleks između članova koji imaju specifičan afinitet jedan za drugog.

[0062] „Konzervativna supstitucija aminokiselina“ je ona u kojoj se aminokiselinski ostatak zamenjuje aminokiselinskim ostacima koji imaju sličan bočni lanac. Porodice aminokiselinskih ostataka koji imaju slične bočne lance su definisane u struci. Ove porodice uključuju aminokiseline sa osnovnim bočnim lancima (npr. lizin, arginin, histidin), kiselim bočnim lancima (npr. asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nenaelektrsani polarni bočni lanci (npr. glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin (npr. treonin, valin, izoleucin) i aromatični bočni lanci (npr. tirozin, terezin, tinein, fenilalanin, triptofan, histidin).

[0063] Motiv sekvence za biopolimere mogu uključivati položaje koje mogu da budu varirajuće aminokiseline. Na primer, simbol „X“ u takvom kontekstu uglavnom se odnosi na bilo koju aminokiselinu (npr. bilo koja od dvadesetak prirodnih aminokiselina), osim ako nije drugačije naznačeno, npr., da se odnosi na bilo koju ne-cisteinsku aminokiselinu. Druge dozvoljene aminokiseline mogu takođe biti naznačene na primer, koristeći zagrade i kose crte. Na primer, „(A/W/F/N/Q)“ znači da su alanin, triptofan, fenilalanin, asparagin i glutamin dozvoljeni na toj određenom položaju.

[0064] Kad se ovde koristi, „reagens za detektovanje“ odnosi se na deo koji se vezuje za deo koji se detektuje. Obično generiše signal, na primer, fluorescenciju ili proizvodi merljivo jedinjenje.

[0065] „Epitop“ se odnosi na mesto na ciljanom jedinjenju koje je vezano za vezujući protein (npr., antitelo kao što je Fab ili antitelo pune dužine). U slučaju kada je ciljano jedinjenje protein, mesto se može u biti potpunosti sastavljeno od aminokiselinskih komponenti, u potpunosti sastavljeno od hemijskih modifikacija aminokiselina proteina (npr., glikozil delova) ili sastavljeno od njihovih kombinacija. Preklapajući epitopi obuhvataju bar jedan zajednički aminokiselinski ostatak, glikozilnu grupu, fosfatnu grupu, sulfatnu grupu ili drugu molekularnu osobinu.

[0066] Prvi vezujući protein (npr. antitelo) se „vezuje za isti epitop“ kao drugi vezujući protein (npr. antitelo) ako se prvi vezujući protein vezuje za isto mesto na ciljanom jedinjenju koje drugi vezujući protein vezuje ili se vezuje za mesto koja se preklapa (npr.50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100% preklapanja, npr. u smislu aminokiselinske sekvence ili druge

2

molekularne osobine (npr. glikozil grupe, fosfatne grupe ili sulfata grupa)) sa mestom na koju se vezuje drugi vezujući protein.

[0067] Prvi vezujući protein (npr. antitelo) se „nadmeće za vezivanje“ sa drugim vezujućim proteinom (npr. antitelo) ako vezivanje prvog vezujućeg proteina na njegov epitop smanjuje (npr. za 10%, 20%, 30%, 40 %, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ili više) količinu drugog vezujućeg proteina koji se vezuje za njegov epitop. Nadmetanje može biti direktno (npr. prvi vezujući protein se vezuje za epitop koji je isti ili se preklapa sa epitopom koji je vezan drugim vezujućim proteinom) ili indirektno (npr. vezivanje prvog vezujućeg proteina na njegov epitop izaziva steričnu promenu u ciljanom jedinjenju koja smanjuje sposobnost drugog vezujućeg proteina da se veže na svoj epitop).

[0068] Kad se ovde koristi, „funkcionalni“ biološki molekul je biološki molekul u obliku u kom ima svojstvo i/ili aktivnost pomoću koga se karakteriše.

[0069] Izračunavanje „homologije“ ili „identičnosti sekvence“ između dve sekvence (izrazi se ovde koriste međusobno zamenjivo) vrši se na sledeći način. Sekvence su poravnate u cilju optimalnog poređenja (npr., praznine se mogu uvesti u jednu ili obe od prve i druge aminokiselinske sekvence ili sekvence nukleinske kiseline za optimalno poravnanje, i nehomologne sekvence se mogu zanemariti u svrhu poređenja). Optimalno poravnanje se određuje kao najbolji rezultat korišćenjem GAP programa u GCG softverskom paketu sa matricom za ocenjivanje Blossum 62 sa gap penalty od 12, gap extend penalty od 4, i frameshift gap penalty od 5 stepeni. Zatim se porede minokiselinski ostaci ili nukleotidi na odgovarajućim položajima aminokiselina ili položajima nukleotida. Kada je položaj u prvoj sekvenci zauzet istim aminokiselinskim ostacima ili nukleotidom kao odgovarajući položaj u drugoj sekvenci, onda su molekuli identični u tom položaju (kad se ovde koristi „identičnost“ aminokiseline ili nukleinske kiseline je ekvivalentan „homologiji“ aminokiseline ili nukleinske kiseline). Procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih položaj koje dele sekvence.

[0070] U poželjnom otelotvorenju, dužina referentne sekvence poravnate u svrhu poređenja je najmanje 30%, poželjno najmanje 40%, poželjnije najmanje 50%, čak i poželjnije najmanje 60%, i još poželjnije najmanje 70%, 80%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98% ili 100% dužine referentne sekvence. Na primer, referentna sekvenca može biti dužina sekvence varijabilnog domena imunoglobulina.

[0071] Kad se ovde koristi, pojam „hibridizuje pod niskom strogoćom, srednjom strogoćom, visokom strogoćom ili veoma visokim uslovima strogoće“ opisuje uslove za hibridizaciju i pranje. Smernice za obavljanje reakcija hibridizacije mogu se naći u Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6,3,1-6,3.6. Vodeni i nevodeni postupci opisane su u toj referenci i mogu se koristiti. Specifični uslovi hibridizacije navedeni u ovom tekstu su sledeći: (1) uslovi hibridizacije niske strogoće u 6X natrijum hloridu/natrijum citratu (SSC) na oko 45°C, nakon čega slede dva pranja u 0,2X SSC, 0,1% SDS najmanje na 50°C (temperatura pranja može se povećati na 55°C za niske uslove stajanja); (2) uslovi hibridizacije srednje strogoće u 6X SSC pri oko 45°C, praćeno jednim ili više pranja u 0,2X SSC, 0,1% SDS na 60°C; (3) uslovi hibridizacije visoke strogoće u 6X SSC na oko 45°C, praćeno jednim ili više pranja u 0,2X SSC, 0,1% SDS na 65°C; i (4) uslovi vrlo visoke strogoće hibridizacije su 0,5M natrijum fosfat, 7% SDS na 65°C, nakon čega sledi jedno ili više pranja na 0,2X SSC, 1% SDS na 65°C. Veoma visoki uslovi strogoće (4) su poželjni uslovi i oni koje treba koristiti, osim ako nije drugačije naznačeno. Obelodanjenje obuhvata nukleinske kiseline koje hibridizuju sa niskom, srednjom, visokom ili veoma visokom strogoćom do nukleinske kiseline opisane ovde ili njenog komplementa, npr. nukleinske kiseline koje kodiraju ovde opisan vezujući protein. Nukleinske kiseline mogu biti iste dužine ili unutar 30, 20 ili 10% dužine referentne nukleinske kiseline. Nukleinska kiselina može odgovarati regionu koji kodira sekvencu varijabilnog domena imunoglobulina koja je ovde opisana.

[0072] „Izolovani sastav“ odnosi se na sastav koji se uklanja od najmanje 90% od najmanje jedne komponente prirodnog uzorka iz kog se može dobiti izolovani sastav. Sastavi proizvedeni veštački ili prirodno mogu biti „sastavi od najmanje“ određenog stepena čistoće ako vrsta ili populacija vrsta od interesa bude najmanje 5, 10.25, 50, 75, 80, 90, 92, 95, 98, ili 99% čista na osnovu težine.

[0073] Kad se ovde koristi, izraz „in vitro“ odnosi se na događaje koji se javljaju u veštačkom okruženju, npr., u epruveti ili reakcionom sudu, u ćelijskoj kulturi, itd., umesto u višećelijskom organizmu.

2

[0074] Kad se ovde koristi, izraz „in vivo“ odnosi se na događaje koji se javljaju u višećelijskim organizmima kao što su čovek ili životinja koja nije čovek.

[0075] „Izolovani sastav“ odnosi se na sastav koji se uklanja od najmanje 90% od najmanje jedne komponente prirodnog uzorka iz kog se može dobiti izolovani sastav. Sastavi proizvedene veštački ili prirodno mogu biti „sastavi od najmanje“ određenog stepena čistoće ako vrsta ili populacija vrste od interesa bude najmanje 5, 10.25, 50, 75, 80, 90, 92, 95, 98, ili 99% čista na osnovu težine.

[0076] „Izolovan“ protein se odnosi na protein koji se uklanja od najmanje 90% od najmanje jedne komponente prirodnog uzorka iz kog se može dobiti izolovani protein. Proteini mogu biti „od najmanje“ određenog stepena čistoće ako je vrsta ili populacija vrsta od interesa najmanje 5, 10.25, 50, 75, 80, 90, 92, 95, 98 ili 99% čista na osnovu težine.

[0077] Izraz „kalikrein“ (npr., kalikrein plazme) se odnosi na peptidaze (enzime koji rastavljaju peptidne veze u proteinu), podgrupu porodice serinske proteaze. Kalikrein plazme cepa kininogen kako bi stvarao kinine, moćnih pro-upalne peptide.

[0078] Izraz „inhibitor kalikreina“ odnosi se na bilo koji agens ili molekul koji inhibira kalikrein. Na primer, DX-88 (takođe ovde označen kao „PEP-1“) je snažan (Ki <1 nM) i specifičan inhibitor kalikreina plazme (NP_000883). (Pogledati takođe, npr., WO 95/21601 ili WO 2003/103475).

[0079] Kad se ovde koristi izraz „DX-2922“ koji se koristi međusobno zamenjivo sa izrazom „X101-A01“. Ostale varijante ovog antitela su opisane u nastavku.

2

[0080] Kad se ovde koristi, izraz „DX-2930“ se koristi međusobno zamenjivo sa izrazom „X124-G01“. Ostale varijante ovog antitela su opisane u nastavku.

[0081] Izraz „modulator“ odnosi se na polipeptid, nukleinsku kiselinu, makromolekule, kompleks, molekul, mali molekul, jedinjenje, vrstu ili slično (prirodne ili veštačke), ili ekstrakt napravljen od bioloških materijala kao što su ćelije ili tkiva bakterija, biljaka, gljiva ili životinja, koji mogu biti sposobni da izazovu modulaciju. Modulatori se mogu proceniti za potencijalnu aktivnost kao inhibitori ili aktivori (direktno ili indirektno) funkcionalnih svojstava, biološke aktivnosti ili procesa ili njihove kombinacije (npr. agonist, parcijalni antagonist, parcijalni agonist, inverzni agonist, antagonist, anti-mikrobni agensi, inhibitori mikrobne infekcije ili proliferacije i slično) inkluzijom u testovima. U takvim testovima, mnogi modulatori mogu biti istovremeno prikazani. Aktivnost modulatora može biti poznata, nepoznata ili delimično poznata.

[0082] „Ne-esencijalni“ aminokiselinski ostatak je ostatak koji se može izmeniti od divlje vrste sekvence vezujućeg agensa, npr. antitela, bez ukidanja ili poželjnije, bez bitne promene biološke aktivnosti, dok menjanje „esencijalnog“ aminokiselinskog ostatak rezultuje znatnim gubitkom aktivnosti.

[0083] „Pacijent“, „bolesnik“ ili „domaćin“ (ovi termini se koriste međusobno zamenjivo) koji se tretiraju predmetnim postupkom mogu značiti ili ljudsku ili ne-ljudsku životinju. U

2

nekim otelotvorenjima, za pacijenta se sumnja da je u opasnosti, ili boluje, od poremećaja posredovanog kalikreinom, npr. poremećen posredovanim bradikininom, npr. naslednim angioedem (HAE). U nekim otelotvorenjima, pacijent je pod rizikom, ili pati od, poremećaja kao što su idiopatski angioedem koji nije zavisan od histamina, reumatoidni artritis, Kronova bolest, ulcerativni kolitis, lupus, Alchajmerova bolest, septički šok, povreda opekotina, ishemija mozga/povreda reperfuzije, cerebralni edem, dijabetička retinopatija, dijabetična nefropatija, makularni edem, vaskulitis, arterijska ili venska tromboza, tromboza povezana sa ventrikularnim pomoćnim uređajima ili stentovima, trombocitopenija izazvane heparinom uz trombozu, tromboembolijske bolesti i koronarne bolesti srca sa nestabilnom anginom pektoris, edemom, bolestima očiju, gihtom, bolesti creva, oralni mukozitis, neuropatski bol, upalni bol, kičmena stenoza-degenerativne bolesti kičme, post operativni ileus, aneurizma aorte, osteoartritis, nasledni angioedem, embolija pluća, moždani udar, povreda glave ili peritumorski moždani edem, sepsa, akutne ishemijski poremećaj srednje moždane arterije (MCA), restenoza (npr. nakon angioplastike), sistemski lupus eritematozni nefritis, autoimuna bolest, upalno oboljenje, kardiovaskularna bolest neurološka oboljenja, bolest povezana sa poremećajima proteina, bolest povezana sa angiogenezom, hipertenzivna nefropatija i diabetična nefropatija, alergijske i respiratorne bolesti (npr. anafilaksija, astma, hronična opstruktivna bolest pluća, sindrom akutnog respiratornog distresa, cistična fibroza, uporan, rinitis) i povrede tkiva (npr. opekotine ili hemijske povrede).

[0084] Izrazi „prekalikrein“ i „prekalikrein plazme“ ovde se koriste međusobno zamenjivo, i odnose se na zimogeni oblik aktivnog kalikreina plazme, koji je takođe poznat kao prekalikrein.

[0085] Izraz „sprečavanje“ ili „sprečiti“ bolest kod pacijenta podrazumeva podvrgavanje pacijenta farmaceutskom tretmanu, npr. davanje leka, tako da se spreči najmanje jedan simptom bolesti, odnosno, primenjuje se pre kliničke manifestaciju neželjenog stanja (npr. bolesti ili drugih neželjenih stanja životinje domaćina), tako da štiti domaćina od razvoja neželjenog stanja. „Sprečavanje“ bolesti može se takođe nazvati „profilaksa“ ili „profilaktički tretman“.

[0086] Kad se ovde koristi, izraz „u suštini identičan“ (ili „u suštini homologan“) se ovde koristi da se odnosi na prvu aminokiselinsku sekvencu ili sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži dovoljan broj identičnih ili ekvivalentnih (npr. sa sličnim bočnim lancem, npr.,

2

konzervirane aminokiselinske supstitucije) aminokiselinskih ostataka ili nukleotida sa drugom aminokiselinskom sekvencom ili nukleinskom kiselinom, tako da prva i druga aminokiselinska sekvenca ili sekvenca nukleinske kiseline imaju (ili kodiraju proteine koje imaju) slične aktivnosti, npr. aktivnost vezivanja, preferencije vezivanja ili biološke aktivnosti. U slučaju antitela, drugo antitelo ima istu specifičnost i ima najmanje 50%, najmanje 25% ili najmanje 10% afiniteta u odnosu na isti antigen.

[0087] Slične ili homologne sekvence (npr., najmanje oko 85% identičnosti sekvence) ovde obelodanjenim sekvencama su takođe deo ove prijave. U nekim otelotvorenjima identičnost sekvence može biti oko 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više.

[0088] Osim toga, značajan identičnost postoji kada se segmenti nukleinske kiseline hibridizuju pod uslovima selektivne hibridizacije (npr., visoko strogi uslovi hibridizacije), do komplementa lanca. Nukleinske kiseline mogu biti prisutne u celoj ćeliji, u ćelijskom lizatu ili u delimično pročišćenom ili suštinski čistom obliku.

[0089] Motiv sekvence za biopolimere mogu uključivati položaje koje mogu da budu varirajuće aminokiseline. Na primer, simbol „X“ u takvom kontekstu uglavnom se odnosi na bilo koju aminokiselinu (npr. bilo koja od dvadesetak prirodnih aminokiselina), osim ako nije drugačije naznačeno, npr., da se odnosi na bilo koju ne-cisteinsku aminokiselinu. Druge dozvoljene aminokiseline mogu takođe biti naznačene na primer, koristeći zagrade i kose linije. Na primer, „(A/W/F/N/Q)“ znači da su alanin, triptofan, fenilalanin, asparagin i glutamin dozvoljeni na tom određenom položaju.

[0090] Statistička značajnost može se odrediti bilo kojom poznatom postupkom. Primeri statističkih testova uključuju: Studentov T-test, Mann Whitney U neparametarski test i Wilcoxon neparametarski statistički test. Neke statistički značajne veze imaju vrednost P manju od 0,05 ili 0,02. Pojmovi „indukovati“, „inhibirati“, „potencirati“, „podići“, „povećati“, „smanjiti“ ili slično, npr. koji označavaju primetne kvalitativne ili kvantitativne razlike između dva stanja, može da se odnosi na razliku, npr., statistički značajnu razliku između dva stanja.

[0091] Kad se ovde koristi, „uzorak“ se odnosi na sastav koji sadrži tkivo, npr. krv, plazmu ili

2

protein, od pacijenta. Uzorak uključuje i početni netretirani uzorak uzet od pacijenta, kao i naknadno obrađen, npr., delimično pročišćene ili očuvane oblike. Primeri uzoraka uključuju krv, plazmu, suze ili sluz. U nekim otelotvorenjima, uzorak je uzorak krvi ili plazme.

[0092] „Terapeutski efikasna doza“ poželjno modulira merljivi parametar, npr. aktivnost kalikreina plazme u statistički značajnom stepenu ili najmanje oko 20%, poželjnije za najmanje oko 40%, i još poželjnije za najmanje oko 60% i još poželjnije za najmanje oko 80% u odnosu na netretirane pacijente. Sposobnost jedinjenja da modulira merljivi parametar, na primer, parametar povezan sa bolesti, može se proceniti u sistemu životinjskog modela koji predviđa efikasnost kod poremećaja i stanja čoveka. Alternativno, ova svojstva sastavi mogu se proceniti ispitivanjem sposobnosti jedinjenja da modulira parametar in vitro.

[0093] „Tretman“ bolesti (ili stanja) u pacijentu ili „tretman“ pacijenta koji ima bolest podrazumeva podvrgavanje pacijenta farmaceutskom tretmanu, npr. davanju leka, tako da se bar jedan simptom bolesti izleči, ublaži ili smanji.

[0094] Izraz „sprečavanje“ bolesti kod pacijenta podrazumeva podvrgavanje pacijenta farmaceutskom tretmanu, na primer, davanju leka, tako da se spreči najmanje jedan simptom bolesti, odnosno da se primenjuje pre kliničkog ispoljavanja neželjenog stanja (npr. bolest ili drugo neželjeno stanje životinje domaćina), tako da štiti domaćina od razvoja neželjenog stanja. „Sprečavanje“ bolesti može se takođe nazvati „profilaksa“ ili „profilaktički tretman“.

[0095] „Profilaktički efikasna količina“ odnosi se na količinu koja je efikasna, u dozama i za vremenske periode potrebne za postizanje željenog profilaktičkog rezultata. Tipično, pošto se profilaktička doza koristi kod osoba pre bolesti, ili u ranijoj fazi bolesti, profilaktički efikasna količina će biti manja od terapeutski efikasne količine.

[0096] Naslovi, uključujući abecedne ili numeričke naslove, samo su za lakše razumevanje i čitanje, osim ukoliko tekst odmah ne ukazuje na suprotno, i ne nameću vremenski poredak ili hijerarhiju preferencija.

Detektovanje razdvojenog i netaknutog HMWK

[0097] Kalikrein plazme cirkuliše kao neaktivan zimogen koji se naziva prekalikrein koji se uglavnom vezuje za svoj supstrat, kininogen visoke molekulske mase (HMWK). Kao odgovor na stimulans, FXII se aktivira na FXIIa. FXIIa cepa prekalikrein kako bi se formirao aktivni kalikrein plazme (Slika 1). Približno 75-90% cirkulišućeg prekalikreina je vezano za HMWK kroz interakciju neaktivnog mesta sa domenom 6 od HMWK. Slobodni i HMWK-vezani aktivni pKal generiše razdvojeni HMWK i bradikinin. Biomarkeri aktivacije kalikreina plazme prikazani su u Tabeli 2. Pogodnost biomarkera može se pokazati prateći nivoe u prisustvu i odsustvu akutnog napada HAE. Nivoi ovih biomarkera takođe mogu biti izmenjeni tokom napada edema posredovanog bradikininom, ili druge bolesti posredovane aktivacijom pKal. Pogledati Tabelu 2.

Tabela 2. Biomarkeri povezani sa KMA

1

[0098] Predmetno obelodanjenje zasnovano je, barem delimično, na otkriću da vrednost specifičnog oblika NMVK (npr., procent razdvojenog HMWK) u uzorku pacijenta korelira sa određenim pKal-posredovanim bolestima (npr., HAE) i autoimunim bolestima (npr., RA, UC i Kronova bolesti). Prema tome, vrednost (npr. procenat) razdvojenog HMWK-a, netaknutog HMWK-a ili oba, može se koristiti kao biomarker za identifikovanje pacijenata koji imaju, ili su pod rizikom za takve bolesti, za identifikovanje poremećaja koji je verovatno podložan tretmanu sa inhibitorom pKal, i za procenu efikasnosti lečenja bolesti koji uključuje jedan ili više inhibitora pKal.

Reagens za detektovanje

[0099] U nekim otelotvorenjima, reagens za detektovanje (npr., antitelo) koji se specifično (poželjno) vezuje za jedan oblik HMWK u poređenju sa drugim oblicima HMWK može se koristiti u test postupcima opisanim ovde za određivanje nivoa razdvojenog HMWK u uzorku koji može biti biološki uzorak (npr. uzorak krvi ili uzorak plazme) od kandidata pacijenta. U jednom primeru, reagens za detektovanje je antitelo koje se specifično vezuje za razdvojeni HMWK u poređenju sa netaknutim HMWK. U drugom primeru, reagens za detektovanje je antitelo koje se specifično vezuje za netaknute HMWK u poređenju sa razdvojenim oblikom. Alternativno ili pored toga, antitelo specifično vezuje C-terminus lakog lanca razdvojenog HMWK. Takvo antitelo se može koristiti za razlikovanje HMWK od LMWK, jer LMWK ne sadrži C-terminalni fragment lakog lanca razdvojenog HMWK zbog alternativnog spajanja.

[0100] Reagens za detektovanje koji se „specifično vezuje“ za antigen ili epitopu je izraz koji se dobro razume u struci, i postupci za određivanje takvog specifičnog vezivanja takođe su dobro poznati u struci. Za reagens za detektovanje, kao što je antitelo, se kaže da pokazuje „specifično vezivanje“ ako reaguje ili povezuje češće, brže, sa većim trajanjem i/ili sa većim afinitetom sa određenim ciljanim antigenom nego sa alternativnim ciljevima. Reagens za detektovanje se „specifično vezuje“ za ciljani antigen (npr. Razdvojeni HMWK) ili njegov

2

epitop ako se vezuje sa većim afinitetom, aviditetom, lakše i/ili sa dužim trajanjem nego što se vezuje za druge supstance (npr. netaknuti HMWK). Na primer, antitelo koje se specifično (ili poželjno) vezuje za antigen (npr. Razdvojeni HMWK ili C-terminus lakog lanca razdvojenog HMWK) ili antigeni epitop na njemu je antitelo koje vezuje ovaj ciljani antigen sa većim afinitetom, aviditetom, lakše i/ili sa dužim trajanjem nego što se vezuje za druge antigene (npr., netaknute HMWK) ili druge epitope u istom antigenu. Takođe se iz čitanja ove definicije ratzume da se, na primer, antitelo koje se specifično vezuje za prvi ciljani antigen može ali ne mora specifično ili poželjno vezati za drugi ciljani antigen. Kao takvo, „specifično vezivanje“ ili „poželjno vezivanje“ ne zahteva nužno (iako može uključivati) ekskluzivno vezivanje. Generalno, ali ne obavezno, referenca na vezivanje znači poželjno vezivanje. U nekim primerima, antitelo koje se „specifično vezuje“ protiv ciljanog antigena ili njegovog epitopa ne mora se vezati za druge antigene ili druge epitope u istom antigenu.

[0101] U nekim aspektima, antitelo za upotrebu u test postupcima koji su ovde opisane ima odgovarajući afinitet vezivanja za ciljani antigen ili antigenski epitop (npr. Razdvojeni kininogen, netaknuti HMWK ili C-terminus lakog lanca razdvojenog kininogena). Kad se ovde koristi, „afinitet vezivanja“ odnosi se na konvencionalnu konstantu asocijacije ili KA. KAje recipročna konstanti disociacije (KD). Ovde opisano antitelo može imati afinitet vezivanja (KD) od najmanje 10<-5>, 10<-6>, 10<-7>, 10<-8>, 10<-9>, 10<-10>M, ili niže. Povećan afinitet vezivanja odgovara smanjenom KD. Više afinitetno vezivanje antitela za prvi antigen u odnosu na drugi antigen može biti indikovano višim KA(ili manjom numeričkom vrednosti KD) za vezivanje prvog antigena nego KA(ili numerička vrednost KD) za vezivanje drugog antigena. U takvim slučajevima, antitelo ima specifičnost za prvi antigen u odnosu na drugi antigen. Razlike u afinitetu vezivanja (npr. Kod specifičnosti ili drugih poređenja) mogu biti najmanje 1,5, 2, 3, 4, 5, 10.15, 20.37,5, 50, 70, 80, 91, 100, 500, 1000, 10,000 ili 10<5>puta.

[0102] Kad se ovde koristi, izraz „antitelo“ odnosi se na protein koji uključuje najmanje jedan varijabilni domen imunoglobulina ili sekvencu promenljivih domena imunoglobulina. Na primer, antitelo može da sadrži varijabilni region teškog (H) lanca (skraćeno ovde kao VH), i varijabilni region lakog (L) lanca (skraćeno ovde kao VL). U drugom primeru, antitelo uključuje dva varijabilna regiona teškog (H) lanca i dva varijabilna regiona lakog (L) lanca. Izraz „antitelo“ obuhvata antigen-vezujuće fragmente antitela (npr. jednolančana antitela, Fab i sFab fragmente, F(ab')2, Fd fragmente, Fv fragmente, scFv i domene antitela (dAb) (de Wildt i dr., Eur J Immunol. 1996; 26(3):629-39.)) kao i kompletna antitela. Antitelo može imati strukturne karakteristike IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (kao i njihove podtipove). Antitela mogu biti iz bilo kog izvora, ali poželjna su primatska (čovek i primat koji nije čovek) i primatizovana.

[0103] VH i VL regioni mogu se dalje podeliti na regione hipervarijabilnosti, nazvane „regioni koji određuju komplementarnost“ („CDR“), prošarani sa regionima koji su više konzervirani, označeni kao „okvirni regioni“ („FR“). Obim okvirnog regiona i CDR je precizno definisan (pogledati, Kabat, E.A., i dr. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242, and Chothia, C. i dr. (1987) J. Mol. Biol.196:901-917, pogledati takođe www.hgmp.mrc.ac.uk). Ovde se koriste Kabat definicije. Svaki VH i VL se obično sastoji od tri CDR i četiri FR, raspoređenih od amino-terminusa do karboksi-terminusa u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

[0104] VH ili VL lanac antitela može dalje da uključi sve ili deo konstantnog regiona teškog ili lakog lanca, kako bi se stvorio teški ili laki lanac imunoglobulina, respektivno. U jednom otelotvorenju antitelo je tetramer dva teška lanca imunoglobulina i dva laka lanca imunoglobulina, gde su teški i laki lanci imunoglobulina međusobno povezani, npr., sa disulfidnim vezama. U IgG, konstantni region teškog lanca sadrži tri domena imunoglobulina, CH1, CH2 i CH3. Konstantni region lakog lanca uključuje CL domen. Varijabilni region teškog i lakog lanca sadrži vezujući domen koji interakuje sa antigenom. Konstantni regioni antitela tipično posreduju vezivanjem antitela na tkiva ili faktore domaćina, uključujući različite ćelije imunog sistema (npr. efektorske ćelije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog sistema komplementa. Laki lanci imunoglobulina mogu biti kapa ili lambda tipa. U jednom otelotvorenju, antitelo je glikozilirano. Antitelo može biti funkcionalno za citotoksičnost zavisnu od antitela i/ili citotoksičnost posredovanu komplementom.

[0105] Jedan ili više regiona antitela može biti ljudski ili efektivno ljudski. Na primer, jedan ili više varijabilnih regiona može biti ljudsko ili efektivno ljudsko. Na primer, jedan ili više CDR može biti ljudski, npr. HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2 i LC CDR3. Svaki CDR lakog lanca može biti ljudski. HC CDR3 može biti ljudski. Jedan ili više okvirni region može biti ljudski, npr. FR1, FR2, FR3 i FR4 HC ili LC. Na primer, Fc region može biti ljudski. U jednom aspektu, svi okvirni regioni su ljudski, na primer, imaju sekvencu

4

okvira antitela proizvedenu od strane ljudskih somatskih ćelija, na primer, hematopoetska ćelija koja proizvodi imunoglobuline, ili ne-hematopoetska ćelija. U jednom otelotvorenju, ljudske sekvence su germlinijske sekvence, na primer, kodirane germlinijskp, nukleinskom kiselinom. U jednom otelotvorenju, ostaci okvira (FR) izabranog Faba mogu se pretvoriti u tip aminokiselina odgovarajućeg ostatka u najsličnijem primatskom germlinijskom genu, posebno ljudski germlinijski gen. Jedan ili više konstantnih regiona može biti ljudski ili efektivno ljudski. Na primer, najmanje 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 98 ili 100% varijabilnog domena imunoglobulina, konstantnog regiona, konstantnih domena (CHI, CH2, CH3, CL1) ili antitela pune dužine može biti ljudsko ili efektivno ljudsko.

[0106] Celo ili deo antitela mogu da budu kodirani sa genom imunoglobulina ili njegovim segmentom. Primeri ljudskih gena imunoglobulina uključuju kapa, lambda, alfa (IgA1 i IgA2), gama (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), delta, epsilon i mu konstantni region gena, kao i mnogi geni varijabilnog regiona imunoglobulina. „Laki lanci“ pune dužine (oko 25 KDa ili oko 214 aminokiselina) kodirani su genom varijabilnog regiona na NH2-terminusu (oko 110 aminokiselina) i kapa ili lambda genom konstantnog regiona na COOH-terminusu. „Teški lanci“ imunoglobulina pune dužine (oko 50 KDa ili oko 446 aminokiselina) su slično kodirani genom varijabilnog regiona (oko 116 aminokiselina) i jednim od gore pomenutih gena konstantnog regiona, npr. gama (kodiranje oko 330 aminokiselina). Dužina ljudskog HC značajno varira jer HC CDR3 varira od oko 3 aminokiselinska ostatka do preko 35 aminokiselinskih ostataka.

[0107] Izraz „antigen-vezujući fragment“ antitela pune dužine odnosi se na jedan ili više fragmenata antitela pune dužine koji zadržavaju sposobnost da se specifično vezuju za ciljanu grupu od interesa. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćenih izrazom „antigen-vezujući fragment“ antitela pune dužine uključuju (i) Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena; (ii) F(ab')2fragment, dvovalentni fragment koji uključuje dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom na zglobnom regionu; (iii) Fd fragment koji se sastoji od VH i CH1 domena; (iv) Fv fragment koji se sastoji od VL i VH domena jednog kraka antitela, (v) dAb fragment (Ward i dr., (1989) Nature 341:544-546), koji se sastoji od VH domena; i (vi) izolovan region za određivanje komplementarnosti (CDR) koji zadržava funkcionalnost. Osim toga, iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirana odvojenim genom, mogu se spojiti, koristeći rekombinantne postupke, pomoću sintetičkog veznika koji im omogućava da budu napravljeni kao pojedinačni proteinski lanac u kom se VL i VH regioni uparuju kako bi se formirali monovalentni molekuli poznati kao jednolančani Fv (scFv). Pogledati npr., US patente 5,260,203, 4,946,778, and 4,881,175; Bird i dr. (1988) Science 242:423-426; i Huston i dr. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883.

[0108] Fragmenti antitela mogu se dobiti korišćenjem bilo koje odgovarajuće tehnike uključujući i konvencionalne tehnike poznate stručnjacima u oblasti. Izraz „monospecifično antitelo“ odnosi se na antitelo koje pokazuje jednu vezivnu specifičnost i afinitet za određenu metu, na primer, epitop. Ovaj pojam obuhvata „monoklonsko antitelo“ ili „sastav monoklonskih antitela“, koji se ovde koristi odnosi na pripremu antitela ili njihovih fragmenata od mono molekularnog sastava, bez obzira na to kako je antitelo nastalo.

[0109] Kad se ovde koristi, varijabilni region „humanizovanog“ imunoglobulina se odnosi na varijabilni region imunoglobulina koji je modifikovan tako da uključuje dovoljan broj aminokiselinskih položaja ljudskom okviru, tako da varijabilni region imunoglobulina ne izaziva imunogeni odgovor kod normalnog čoveka. Opisi „humanizovanih“ imunoglobulina uključuju, na primer, U.S.6,407,213 i U.S.5,693,762.

[0110] Konstanta inhibicije (Ki) daje meru potencije inhibitora; to je koncentracija inhibitora koja je potrebna da se smanji aktivnost enzima za pola, i ne zavisi od koncentracije enzima ili supstrata. Očigledni Ki (Ki,app) se dobija na različitim koncentracijama supstrata merenjem inhibitornog efekta različitih koncentracija inhibitora (npr., inhibitornog vezujućeg proteina) na stepen reakcije (npr., aktivnost enzima); uklapajući promenu konstante brzine pseudoprvog reda kao funkcije koncentracije inhibitora u Morison jednačinu (Jednačina 1) daje procenu očigledne Ki vrednosti. Ki se dobija iz y-intercepta ekstrakovanog iz linearne regresione analize putanje Ki,app nasuprot koncentracije supstrata.

Jednačina 1

[0111] Gde v = izmerena brzina; v0= brzina u odsustvu inhibitora; Ki,app= očigledna konstanta inhibicije; I = ukupna koncentracija inhibitora; i E = ukupna koncentracija enzima.

[0112] U nekim otelotvorenjima, reagens za detektovanje, kako je ovde opisan, može biti konjugovan na detektabilnu oznaku, i vezivanje reagensa za detektovanje na antigen od interesa (npr. Razdvojeni HMWK i netaknuti HMWK) može se odrediti na osnovu intenziteta signala koji oslobađa detektabilna oznaka. Alternativno, može se koristiti sekundarno antitelo specifično za reagens za detektovanje. Jedno ili više antitela može biti povezano sa detektabilnom oznakom. Svaka pogodna oznaka poznata u struci može se koristiti u ovde opisanim postupcima ispitivanja. U nekim otelotvorenjima, detektabilna oznaka sadrži fluorofor. Kad se ovde koristi, izraz „fluorofor“ (koji se takođe naziva „fluorescentna oznaka“ ili „fluorescentna boja“) odnosi se na delove koji apsorbuju energiju svetlosti na definisanu talasnu dužinu pobuđivanja i emituju energiju svetlosti na drugačijoj talasnoj dužini. U nekim otelotvorenjima, detektabilni deo je enzim ili sadrži enzim. U nekim otelotvorenjima, enzim je jedan (npr., Β-galaktozidaza) koji od bezbojnog supstrata proizvodi obojeni proizvod.

Kininogen visoke molekulske mase

[0113] Kininogen visoke molekulske mase (HMWK) postoji u plazmi kao jedan polipeptidni (1-lančani) multi-domenski (1-6 domena) protein sa molekulskom težinom od oko 110 kDa (Slika 4). HMWK se cepa od strane pKal u domenu 4 kako bi se oslobodio 9 aminokiselina, pro-upalni peptid bradikinin i 2-lančani oblik HMWK (razdvojeni kininogen). 2 lanca HMWK su teški lanac, koji sadrži domene 1-3 od HMWK, i laki lanac, koji sadrži domene 5 i 6 od HMWK. Teški i laki lanci imaju molekulsku težinu od oko 56 i 46 kilodaltona, respektivno. Slika 4.

Neaktivan HMWK

[0114] Neaktivan kininogen visoke molekulske mase (HMWK), takođe ovde označen kao „netaknuti kininogen“, može se analizirati, na primer, korišćenjem koagulantnih ili imunoloških postupaka, npr. radioimuno testa (pogledati, na primer, Kerbiriou-Nabias, D.M., Br J Haematol, 1984, 56(2):2734-86). Poznato je monoklonsko antitelo lakog lanca ljudskog HMWK. Pogledati, na primer, Reddigari, S.R. & Kaplan, A.P., Blood, 1999, 74:695-702. Takođe se može koristiti i test za HMWK koji se oslanja na hromogeni supstrat. Pogledati, na primer, Scott, C.F. i dr. Thromb Res, 1987, 48(6):685-700; Gallimore, M.J. i dr. Thromb Res, 2004, 114(2):91-96.

[0115] Ljudski gen koji kodira HMWK je kininogen 1 (KNG1). KNG1 se transkribuje i alternativno se deli kako bi se formirale mRNK koje kodiraju HMWK ili kininogen niske molekulske mase (LMWK). Primerna proteinska sekvenca HMWK je data u nastavku:

>gi|156231037|ref|NP_001095886,1| kininogen-1 izoform 1 prekursor [Homo sapiens]

Razdvojeni HMWK

[0116] razdvojeni kininogen visoke molekulske mase (HMWK), koji se takođe ovde naziva „razdvojeni kininogen“, može se proceniti, na primer, koristeći postupci opisane u Primerima 1 i 3 do 7, npr., Western blot. U nekim otelotvorenjima, može se proceniti laki lanac razdvojenog HMWK. Antitela koja vezuju razdvojeni HMWK, kao što su antitela koja se vezuju za laki lanac razdvojenog HMWK (npr., epitop koji sadrži ostatke C-terminusa).

Jedan primer je mišji mAb klon 11H05. Pored toga, razdvojeni HMWK se može proceniti korišćenjem masene spektrometrije. Tehnike imunoblotinga za procenu nivoa razdvojenih HMWK su poznate u struci. Pogledati, na primer, Buhler R. i dr. Blood Coagul Fibrinolysis, 1995, 6(3):223-232.

[0117] Primeri sekvenci teških i lakih lanaca razdvojenog kininogena su navedeni u nastavku.

> razdvojeni kininogen-1 teški lanac

> razdvojeni kininogen-1 laki lanac

Format testa

[0118] Vrednosti (npr. apsolutne količine ili nivoi ili relativne količine ili nivoi kao što je procentualnost) biomarkera koji su ovde obelodanjeni, ili promene vrednosti biomarkera koji su ovde obelodanjeni, mogu se proceniti korišćenjem analiza opisanih ovde i/ili analiza poznatih u struci. U nekim otelotvorenjima, procenat razdvojenog kininogena u uzorku od pacijenta se koristi u bilo kom od opisanih postupaka.

[0119] Analize koje se mogu koristiti za procenu nivoa biomarkera obuhvataju, na primer, imunotestove, npr. Western blotove, enzimske imunosorbentne testove (ELISAs) (npr., sendvič ELISA), radioimuno testove, elektrohemiluminiscentne testove detekcije i srodne tehnike. Može se koristiti i pristupi zasnovani na masenoj spektrometriji. Mogu se koristiti i testovi koji se oslanjaju na hromogeni supstrat. Analize, npr. Western blot analiza, mogu dalje uključivati upotrebu kvantitativnog sistema za snimanje, na primer, LICOR tehnologiju za snimanje, koja je komercijalno dostupna (pogledati, na primer, Odyssey® CLx infracrveni sistem za snimanje od LI-COR Biosciences). U nekim otelotvorenjima koristi se test za detektovanje elektrohemiluminiscencije ili test koji se oslanja na kombinaciju elektrohemiluminiscencije i tehnologije šablonskih nizova (npr., ECL ili MULTI-ARRAY tehnologija test od Meso Scale Discovery (MSD)).

[0120] Kad se ovde koristi, izrazi „meriti“ ili „merenje“ ili alternativno „detektovanje“ ili „detektovati“ označavaju procenu prisustva, odsustva, iznosa ili količine (koja može biti efikasna količina) supstance u okviru uzorka, uključujući otelotvorenje kvalitativnih ili kvantitativnih nivoa koncentracije takvih supstanci, ili na drugi način procenjivanje vrednosti ili kategorizaciju pacijenta.

[0121] U nekim otelotvorenjima, dati testovi mogu se izvoditi na platformama sa visokim protokom. U nekim otelotvorenjima, ploče sa više komorica, npr.24, 48, 96, 384 ili više komorične ploče, mogu se koristiti za testove velikog protoka. Pojedinačne analize mogu se izvršavati u svakom izvoru paralelno. Prema tome, generalno je poželjno koristiti čitač ploča da izmeri više komorica paralelno kako bi se povećao protok testa. U nekim otelotvorenjima, za ovu platformu mogu se koristiti paralelni čitači koji mogu paralelno prikazivati više komorica (npr.4, 16, 24, 48, 96, 384 ili više komorica). Na primer, može se koristiti komercijalno dostupan čitač ploča (npr. plate::vision sistem dostupan od Perkin Elmer, Waltham, MA). Ovaj čitač ploča je sposoban za kinetičku analizu fluorescencije.

Plate::vision sistem ima optičku efikasnost prikupljanja podataka i ima posebnu optiku dizajniranu za analizu 96 komorica paralelno. Dodatni pogodni čitači paralelnih ploča uključuju, ali nisu ograničeni na SAFIRE (Tecan, San Jose, CA), FLIPRTETRA® (Molecular Devices, Union City, CA), FDSS7000 (Hamamatsu, Bridgewater, NJ), i CellLux (Perkin Elmer, Waltham, MA). U nekim otelotvorenjima, testovi visokog protoka testiranja pronalaska su automatizovani (npr., prilagođeni robotskim testovima).

Kompleti

[0122] Predmetno obelodanjenje takođe pruža komplete za upotrebu u procenjivanju razdvojenog i/ili netaknutog kininogena u uzorcima koji ih sadrže, na primer, biološki uzorke od ljudskih pacijenata. Takvi kompleti mogu sadržati reagens za detektovanje koji se specifično vezuju za razdvojeni kininogen ili netaknut kininogen u poređenju sa drugim oblicima, i opciono, razdvojeni kininogen i/ili netaknuti kininogen kao kontrole. U nekim otelotvorenjima, kompleti dalje sadrže sekundarna antitela i/ili reagense za detektovanje vezivanja reagensa za detektovanje na razdvojeni i/ili netaknuti kininogen.

[0123] U nekim otelotvorenjima, komplet može sadržati uputstva za upotrebu u skladu sa bilo kojim od ovde opisanih postupaka. Uključena uputstva mogu sadržati opis načina korišćenja komponenti sadržanih u kompletu za merenje nivoa razdvojenog i/ili netaknutog kininogena u uzorku, što može biti biološki uzorak prikupljen od pacijenta kod čoveka.

[0124] Uputstva koja se odnose na upotrebu kompleta uključuju informacije o količini svake komponente i odgovarajućim uslovima za otelotvorenje ovde opisanih test postupaka.

Komponente u kompletima mogu biti u jediničnoj dozi, većim paketima (npr. paketi sa više doza) ili pod-jediničnim dozama. Uputstva koja se isporučuju u sklopu obelodanjenja su obično napisana uputstva na oznaci ili ulošku (npr. list papira koji je uključen u komplet), ali instrukcije koje se mogu čitati na računaru (npr. uputstva na magnetskom ili optičkom disku) su takođe prihvatljive.

[0125] Nalepnica ili umetak za pakovanje ukazuje na to da se komplet koristi za procenu nivoa razdvojenog i/ili netaknutog kininogena. Moguće je pružiti uputstva za izvođenje bilo kog ovde opisanog postupka.

[0126] Kompleti ovog obelodanjenja su u odgovarajućoj ambalaži. Pogodna ambalaža uključuje, ali nije ograničena na, epruvete, boce, tegle, fleksibilnu ambalažu (npr. zapečaćene

4

Milar ili plastične kese) i slično. Takođe su obuhvaćeni paketi koji se koriste u kombinaciji sa određenim uređajem, kao što su inhalator, uređaj za nazalno davanje (npr. atomizer) ili infuzioni uređaj kao što je mini pumpa. Komplet može imati sterilni priključak za pristup (na primer, kontejner može biti vreća za intravenozni rastvor ili bočica koja ima zatvarač kroz koji može proći hipodermična igla za injekciju). Kontejner može takođe imati sterilni pristupni otvor (na primer, kontejner može biti intravenozna vrećica za rastvor ili bočica koja ima zatvarač kroz koji može proći hipodermična igla za injekciju).

[0127] Kompleti mogu opciono da pružaju dodatne komponente kao što su puferi i interpretativne informacije. Uobičajeno, komplet sadrži kontejner i oznaku ili umetak u pakovanje, na ili povezanu sa kontejnerom. U nekim otelotvorenjima, predmetno obelodanjenje pruža predmete za proizvodnju koji obuhvataju sadržaj navedenih kompleta.

Primena metoda analize u dijagnostici i prognozi bolesti

[0128] Ovde opisani postupci testiranja i kompleti mogu se primeniti za procenu bolesti, npr. dijagnozu ili prognozu bolesti. Procena može obuhvatiti identifikovanje pacijenta koji je pod rizikom da dobije, ili ima bolest kako je ovde opisano, npr. poremećaj posredovan sa pKal, kao što je HAE i autoimuna bolest kao što su RA, UC i Kronova bolest. procena takođe može uključiti praćenje tretmana bolesti, kao što je procena efikasnosti lečenja poremećaja posredovanog sa pKal, kao što je HAE. Dalje, procena može uključivati identifikovanje bolesti koja može biti tretirana putem inhibitora pKal.

A. Dijagnoza

[0129] U nekim otelotvorenjima se test postupci i kompleti obavljaju za određivanje nivoa razdvojenog kininogena i/ili netaknutog kininogena u biološkom uzorku (npr. uzorak krvi ili uzorak plazme) sakupljenom od kandidata (npr. ljudski pacijent za kog se sumnja da ima poremećaj posredovana sa pKal, kao što je HAE ili autoimuna bolest, kao što su RA, UC i Kronova bolest). Nivo razdvojenog kininogena se onda može uporediti sa bilo ko netaknutim kininogenom, ili sa ukupnom količinom kininogena u uzorku, kako bi se odredila vrednost (npr., procenat) razdvojenog kininogena, vrednost netaknutog kininogena, ili oba u uzorku. Vrednost razdvojenog kininogena i/ili netaknutog kininogena može se porediti sa referentnom vrednošću kako bi se utvrdilo da li pacijent ima, ili je u opasnosti da razvije poremećaj posredovan sa pKal, npr. HAE ili autoimuna bolest, kao što su RA, UC i Kronova bolest. Na primer, ako je procenat razdvojenog kininogena isti kao ili viši od referentnog broja, pacijent može biti identifikovan kao da ima ili je pod rizikom da razvije poremećaj posredovan sa pKal, kao što su HAE, RA, UC i Kronova bolest. Alternativno, ako je procenat netaknutog kininogena isti kao ili niži od referentnog broja, pacijent može biti identifikovan kao da ima ili je pod rizikom da razvije poremećaj posredovan sa pKal kao što su HAE, RA, UC i Kronova bolest.

[0130] Referentna vrednost može biti nivo kontrole procenta razdvojenog kininogena. U nekim otelotvorenjima nivo kontrole je procenat razdvojenog kininogena u kontrolnom uzorku, kao što je uzorak (npr. uzorak krvi ili plazme) dobijen od zdravog pacijenta ili populacije zdravih pacijenata, koji su poželjno iste vrste kao što je kandidat pacijent. Kad se ovde koristi, zdrav pacijent je pacijent koji je očigledno bez ciljane bolesti (npr. poremećaj posredovan sa pKal kao što su HAE ili autoimune bolesti kao što su RA, US i Kronova bolest) u vreme kada se meri nivo razdvojenog i/ili netaknutog kininogena, ili nema istoriju bolesti.

[0131] Kontrolni nivo takođe može biti unapred određeni nivo. Takav unapred određeni nivo može predstavljati procenat razdvojenog kininogena u populaciji ispitanika koji nemaju ili nisu u opasnosti za ciljanu bolest. Takođe može predstavljati procenat razdvojenog kininogena u populaciji ispitanika koji imaju ciljanu bolest.

[0132] Unapred određeni nivo može uzeti različite oblike. Na primer, to može biti jedna isečena vrednost, kao što je medijana ili srednja vrednost. U nekim otelotvorenjima takav unapred određeni nivo može se utvrditi na osnovu komparativnih grupa, kao što je kada je poznato da je jedna definisana grupa imala ciljanu bolest, i druga definisana grupa za koju je poznato da nije imala ciljanu bolest. Alternativno, unapred određeni nivo može biti opseg, na primer, opseg koji predstavlja procente razdvojenog kininogena u kontrolnoj populaciji u unapred određenom percentilu.

[0133] Kontrolni nivo kako je ovde opisan može se odrediti rutinskom tehnologijom. U nekim primerima, nivo kontrole se može dobiti primenom konvencionalnog postupka (npr., istog testa za dobijanje nivoa razdvojenog i/ili netaknutog kininogena u uzorku za testiranje, kako je ovde opisano) na kontrolnom uzorku kako je takođe ovde opisano. U drugim primerima, nivoi razdvojenog i/ili netaknutog kininogena mogu se dobiti od članova kontrolne populacije, i rezultati se mogu analizirati npr. Računskim programom, kako bi se dobio kontrolni nivo (unapred određeni nivo) koji predstavlja nivo razdvojenog i/ili netaknuti kininogena u kontrolnoj populaciji.

[0134] Upoređivanjem procenta razdvojenog kininogena u uzorku dobijenom od kandidata pacijenta sa referentnom vrednosti kako je ovde opisano, može se odrediti da li kandidat ima, ili je pod rizikom da razvije bolest posredovanu sa pKal (npr. HAE ili autoimune bolesti kao što su RA, UC i Kronova bolest). Na primer, ako procenat razdvojenog kininogena u uzorku kandidat pacijenta odstupa od referentne vrednosti (npr. povećan u odnosu na referentnu vrednost), kandidat pacijent može biti identifikovan kao da ima, ili je pod rizikom da razvije bolest. Kada referentna vrednost predstavlja procentualni opseg razdvojenog kininogena u populaciji pacijenata koji imaju ciljanu bolest, procenat razdvojenog kininogena u uzorku kandidata pada u opseg koji ukazuje na to da kandidat ima ili je pod rizikom da razvije ciljanu bolest.

[0135] Kad se ovde koristi, „povišeni nivo ili nivo iznad referentne vrednosti“ znači da je nivo/procenat razdvojenog kininogena viši od referentne vrednosti, kao što je unapred određeni prag nivo/procenat razdvojenog kininogena u kontrolnom uzorku. Nivoi kontrole su detaljno opisani ovde. Povećan procenat razdvojenog kininogena uključuje procenat razdvojenog kininogena koji je, na primer, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500% ili više iznad referentne vrednosti.

Povišeni procenat razdvojenog kininogena takođe uključuje povećanje fenomena iz nultog stanja (npr., nema ili se ne može detektovati razdvojeni kininogen i/ili netaknuti kininogen koji se vezuje za reagens za hvatanje u uzorku) u ne-nulto stanje (npr. Razdvojeni kininogen i/ili netaknuti kininogen).

[0136] Kad se ovde koristi, „smanjeni procenat/nivo ili procenat/nivo ispod referentne vrednosti“ znači da je procenat/nivo razdvajanja niži od referentne vrednosti, kao što je unapred određeni prag razdvojenog kininogena u kontrolnom uzorku. Nivoi kontrole su detaljno opisani ovde. Smanjen nivo razdvojenog kininogena uključuje razdvojeni kininogen koji je, na primer, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100 %, 150%, 200%, 300%, 400%, 500% ili više ispod referentne vrednosti. Smanjen nivo razdvojenog kininogena koji se vezuje za reagens za hvatanje takođe uključuje smanjenje fenomena iz ne-nultog stanja (npr. ima ili se može detektovati razdvojeni kininogen u uzorku) u nulto stanje (npr., nema ili se ne može detektovati razdvojeni kininogen u uzorku ).

4

[0137] U nekim otelotvorenjima, kandidat pacijent je ljudski pacijent koji ima simptom poremećaja posredovanog sa pKal, npr. HAE ili autoimune bolesti kao što su RA, UC i Kronova bolest. Na primer, pacijent ima edem, otok gde je navedeni otok potpuno ili pretežno periferan, koprivnjača, crvenilo, bol, i oticanje u odsustvu dokaza o infekciji; ili edemom koji nije posredovan histaminom, ponavljajuće napade otoka, ili njihovu kombinaciju. U drugim otelotvorenjima, uzorak je od pacijenta koji nema simptom poremećaja posredovanog sa pKal u trenutku sakupljanja uzorka, nema istoriju simptoma poremećaja posredovanih sa pKal, ili nema istorije poremećaja posredovanih sa pKal, kao što je HAE. U drugim otelotvorenjima, pacijent je otporan na anti-histamin terapiju, terapiju kortikosteroidom ili obe.

(i) HAE

[0138] U nekim otelotvorenjima, bolest ili stanje koje uključuje aktivnost kalikreina plazme je nasledni angioedem (HAE). Nasledni angioedem (HAE) je poznat i kao „Kvinke edem“, nedostatak inhibitora C1 esteraze, nedostatak inhibitora C1 i nasledni angionurotski edem (HANE). HAE karakterišu ponavljajuće epizode ozbiljnog otoka (angioedem), koje mogu uticati, na primer, na udove, lice, genitalije, gastrointestinalni trakt i disajne puteve. Simptomi HAE uključuju, na primer, oticanje na rukama, nogama, usnama, očima, jeziku i/ili grlu; blokadu disajnih puteva koja može uključiti oticanje grla i iznenadnu hrapavost; ponavljajuće epizode abdominalnih grčeva bez očiglednog uzroka; i/ili oticanje creva, što može biti ozbiljno i može dovesti do abdominalnih grčeva, povraćanja, dehidracije, dijareje, bola i/ili šoka. Oko jedna trećina osoba sa ovim HAE tokom napada razvija osip koji ne svrbi, nazvan eritema marginatum.

[0139] Oticanje disajnih puteva može biti opasno po život i izaziva smrt kod nekih pacijenata. Stopa mortaliteta procenjuje se na 15-33%. HAE uzrokuje oko 15.000-30,000 poseta hitnih službi godišnje.

[0140] Trauma ili stres, npr. stomatološke procedure, bolesti (npr. virusne bolesti kao što su prehlada i grip), menstruacija i operacija mogu izazvati napad angioedema. Kako bi se sprečili akutni napadi HAE, pacijenti mogu pokušati da izbegnu specifične stimuluse koji su ranije izazivali napade. Međutim, u mnogim slučajevima napad se javlja bez poznatog okidača. Tipično, simptomi HAE se prvi put pojavljuju u detinjstvu i pogoršavaju se tokom puberteta. U proseku, netretirani pojedinci imaju napad svakih 1 do 2 nedelje, i većina epizoda traje oko 3 do 4 dana (ghr.nlm.nih.gov/condition/hereditary-angioedema). Učestalost i trajanje napada značajno variraju kod ljudi sa naslednim angioedem, čak i među osobama u istoj porodici.

[0141] Postoje tri vrste HAE, poznate pod nazivom I, II i III. Procenjuje se da HAE utiče na 1 od 50,000 ljudi, da tip I čini oko 85 procenata slučajeva, tip II čini oko 15 procenata slučajeva, i tip III je vrlo redak. Tip III je najnoviji oblik, i izvorno se smatralo da se javlja samo kod žena, ali su otkrivene porodice sa pogođenim muškarcima.

[0142] HAE se nasleđuje u autosomalnom dominantnom obliku, tako da osoba koja je pogođena može naslediti mutaciju od jednog pogođenog roditelja. Mogu se pojaviti i nove mutacije u genu, pa se HAE može pojaviti i kod ljudi bez istorije poremećaja u porodici. Procenjuje se da je 20-25% slučajeva rezultat nove spontane mutacije.

[0143] Mutacije u SERPING1 genu uzrokuju nasledni angioedem tipa I i tip II. SERPING1 geni daju uputstva za pravljenje proteina inhibitora C1, što je važno za kontrolu upale.

Inhibitor C1 blokira aktivnost određenih proteina koji promovišu upale. Mutacije koje uzrokuju nasledni angioedem tipa I dovode do smanjenja nivoa inhibitora C1 u krvi.

Nasuprot tome, mutacije koje uzrokuju tip II rezultuju proizvodnjom inhibitora C1 koji funkcioniše abnormalno. Bez odgovarajućih nivoa funkcionalnog inhibitora C1, nastaju prekomerne količine bradikinina. Bradikinin promoviše upalu povećanjem curenja tečnosti kroz zidove krvnih sudova u tkiva tela. Prekomerna akumulacija tečnosti u tkivima tela dovodi do epizoda oticanja kod osoba sa naslednim angioedem tipa I i tipa II.

[0144] Mutacije u F12 genu su povezane sa nekim slučajevima naslednog angioedema tipa III. F12 gen daje uputstva za pravljenje faktora koagulacije XII. Osim igranja ključne uloge u zgrušavanju krvi (koagulacija), faktor XII je takođe važan stimulator upale i uključen je u proizvodnju bradikinina. Određene mutacije u genu F12 dovode do proizvodnje faktora XII sa povećanom aktivnošću. Kao rezultat toga, generiše se više bradikinina, i zidovi krvnih sudova postaju više propustljivi, što dovodi do epizoda oticanja. Uzrok drugih slučajeva naslednog angioedema tipa III ostaje nepoznat. Mutacije u jednom ili više još uvek neidentifikovanih gena mogu biti odgovorne za poremećaj u ovim slučajevima.

4

[0145] HAE se može ispoljiti slično drugim oblicima angioedema koji nastaju usled alergija ili drugih zdravstvenih stanja, ali se značajno razlikuje u uzroku i terapiji. Kada se nasledni angioedem pogrešno dijagnostikuje kao alergija, najčešće se leči sa anti-histaminima, steroidima i/ili epinefrinima, koji su tipično neefikasni kod HAE, iako se epinefrin može koristiti za reakcije životne opasnosti. Pogrešne dijagnoze su takođe rezultovale nepotrebnim eksperimentalnim operacijama kod pacijenata sa abdominalnim otokom, i kod nekih HAE bolesnika abdominalni bol je netačno dijagnostifikovan kao psihosomatski.

[0146] Simptomi HAE mogu se proceniti, na primer, koristeći upitnike, npr. upitnike koji popunjavaju pacijenti, lekari ili članovi porodice. Takvi upitnici su poznati u struci i uključuju, na primer, vizuelne analogne skale. Pogledati, na primer, McMillan, C.V. i dr. Pacijent. 2012;5(2):113-26.

(ii) Reumatoidni artritis

[0147] Reumatoidni artritis (RA) je autoimuna, hronična upalna bolest koja uzrokuje oticanje i bol zglobova, i obično rezultuje uništenjem zglobova. RA uglavnom prati ciklus povlačenja/povraćaja, sa „bljeskovima“ aktivnosti oboljenja prožimanim povlačenjem simptoma bolesti. RA je povezan sa nizom dodatnih upalnih poremećaja, uključujući Sjogrenov sindrom (suve oči i usta prouzrokovana upalom sluzne i pljuvačke žlezde), pleuritis (upala pleure koja uzrokuje bol prilikom dubokog udisanja i kašlja), reumatoidne nodule (nodularne mesta upale koje se razvijaju u plućima), perikarditis (upala perikarda koji izaziva bol kada se leži ili naginje unapred), Feltijev sindrom (splenomegalija i leukopenija primećena u kombinaciji sa RA, čineći pacijenta podložnim infekciji), i vaskulitis upale krvnih sudova koje mogu blokirati protok krvi). Kalikrein plazme je umešan u reumatoidni artritis.

[0148] Simptomi aktivnog RA uključuju umor, nedostatak apetita, nisku temperaturu, bolove u mišićima i zglobovima i krutost. Ukočenost mišića i zglobova je obično najznačajnija ujutro i nakon perioda neaktivnosti. Tokom bljeskova, zglobovi često postaju crveni, otečeni, bolni i osetljivi, uglavnom kao posledica sinovitisa.

[0149] Lečenje za reumatoidni artritis podrazumeva kombinaciju lekova, odmora, vežbi za jačanje zgloba i zaštitu zglobova. Dve klase lekova se koriste u lečenju reumatoidnog

4

artritisa: protivupalni „lekovi prve linije“ i „antireumatski lekovi koji modifikuju bolest“ (DMARD). Lekovi prve linije uključuju NSAIDS (npr., aspirin, naproksen, ibuprofen i etodolak) i kortizon (kortikosteroidi). DMARD, kao što su zlato (npr. zlatne soli, zlatna tioglukoza, zlatni tiomalat, oralno zlato), metotreksat, sulfasalazin, D-penicilamin, azatioprin, ciklofosfamid, hlorambucil i ciklosporin, leflunomid, etanercept, infliksimab, anakinra i adalimumab i hidroksihlorokin, promovišu povlačenje bolesti i sprečavaju progresivno uništavanje zgloba, ali nisu protivupalni agensi.

[0150] Skale korisne za procenu RA i simptoma RA uključuju, npr. Skalu težine reumatoidnog artritisa (R RASS; Bardwell i dr., (2002) Rheumatology 41(1):38-45), SF-36 specifičan zdravstveni indeks artritisa (AASHI; Ware i dr., (1999) Med. Care.37(5 Suppl):MS40-50), Skala za merenje uticaja artritisa ili skala za merenje uticaja artritisa 2 (AIMS ili AIMS2; Meenan i dr. (1992) Arthritis Rheum.35(1):1-10); Stanford Health upitnik za procenu (HAQ), HAQII, ili modifikovani HAQ (pogledati, npr., Pincus i dr. (1983) Arthritis Rheum. 26(11):1346-53).

(iii) Upalna bolest creva (IBD) - Kronova bolest i ulcerativni kolitis

[0151] Upalna bolest creva (IBD) je grupa upalnih stanja debelog creva i, u nekim slučajevima, tankog creva. Glavni oblici IBD su Kronova bolest i ulcerativni kolitis (UC). Daleko manje slučajeva zauzimaju drugi oblici IBD: kolagenski kolitis, limfocitni kolitis, ishemijski kolitis, kolitis kod diverzije, Behčetov sindrom, infektivni kolitis i neodređeni kolitis. Glavna razlika između Kronove bolesti i UC su mesto i priroda upalnih promena. Kronova bolest mogu uticati na bilo koji deo gastrointestinalnog trakta, od usta do anusa (preskakanje lezija), iako većina slučajeva počinje u terminalnom ileumu. Ulceratni kolitis, za razliku od toga, ograničen je na debelo crevo i rektum. Mikroskopski, ulcerativni kolitis je ograničen na mukozu (epitelna obloga creva), dok Kronova bolest utiče na celo crevo.

Konačno, Kronova bolest i ulcerativni kolitis su prisutni sa ekstraintestinalnim manifestacijama (kao što su problemi sa jetrom, artritis, manifestacije kože i problemi sa očima) u različitim proporcijama.

[0152] Simptomi IBD uključuju bol u stomaku, povraćanje, dijareju, hematocheziju, gubitak telesne težine, povećanje telesne težine i razne povezane smetnje ili bolesti (artritis, pioderma gangrenu, primarni sklerozni holangitis). Dijagnoza je uglavnom kolonoskopija sa biopsijom patoloških lezija.

4

[0153] Lečenje IBD, u zavisnosti od nivoa ozbiljnosti, može zahtevati imunosupresiju za kontrolu simptoma. Mogu se koristiti imunosupresivi kao što su azatioprin, metotreksat ili 6-merkaptopurin. Obično, lečenje IBD zahteva oblik mesalamina. Često se steroidi koriste za kontrolu bljeskova oboljenja i nekad su prihvatljivi kao lek za održavanje. Biologici, kao što je infliksimab, koriste se za lečenje bolesnika sa Kronovom bolešću ili ulcerativnim kolitisom. Za teške slučajeve može se zahtevati operacija, kao što je resekcija creva, strikturaplastija ili privremena ili trajna kolostomija ili ileostomija. Alternativni medicinski tretmani za IBD postoje u različitim oblicima, međutim, takve postupci se koncentrišu na kontrolu osnovne patologije kako bi se izbegla produžena steroidna izloženost ili hirurška intervencija. Obično se tretman započinje primenom lekova, kao što je prednizon, sa visokim protivupalnim uticajem. Kada se upala uspešno kontroliše, pacijent se obično prebacuje na lakši lek, kao što je asakol - mesalamin - kako bi se bolest održala u povlačenju. Ako je to neuspešno, kombinacija pomenutih imunosupresivnih lekova sa mesalaminom (koji može imati i protivupalni efekat) može ali ne mora biti primenjena, u zavisnosti od pacijenta.

(iv) Ostali poremećaji posredovani sa pKal ili bradikininom

[0154] Drugi primeri bolesti ili stanja koji su povezani sa aktivnošću kalikreina u plazmi uključuju bilo šta iz grupe koju čine idiopatski angioedem koji nije zavisan od histamina, reumatoidni artritis, Kronova bolest, ulcerativni kolitis, lupus, Alchajmerova bolest, septički šok, povreda opekotina, ishemija mozga/povreda reperfuzije, cerebralni edem, dijabetička retinopatija, dijabetična nefropatija, makularni edem, vaskulitis, arterijska ili venska tromboza, tromboza povezana sa ventrikularnim pomoćnim uređajima ili stentovima, trombocitopenija izazvane heparinom uz trombozu, tromboembolijske bolesti i koronarne bolesti srca sa nestabilnom anginom pektoris, edemom, bolestima očiju, gihtom, bolesti creva, oralni mukozitis, neuropatski bol, upalni bol, kičmena stenoza-degenerativne bolesti kičme, post operativni ileus, aneurizma aorte, osteoartritis, nasledni angioedem, embolija pluća, moždani udar, povreda glave ili peri-tumorski moždani edem, sepsa, akutne ishemijski poremećaj srednje moždane arterije (MCA), restenoza (npr. nakon angioplastike), sistemski lupus eritematozni nefritis, autoimuna bolest, upalno oboljenje, kardiovaskularna bolest neurološka oboljenja, bolest povezana sa poremećajima proteina, bolest povezana sa angiogenezom, hipertenzivna nefropatija i diabetična nefropatija, alergijske i respiratorne bolesti (npr. anafilaksija, astma, hronična opstruktivna bolest pluća, sindrom akutnog

4

respiratornog distresa, cistična fibroza, uporan, rinitis) i povrede tkiva (npr. opekotine ili hemijske povrede).

[0155] Osoba koja je identifikovana kao da ima ili je pod rizikom od poremećaja posredovanog sa pKal, kako je ovde opisano, može se podvrgnuti odgovarajućem tretmanu kao što je opisano ovde.

B. Procena efikasnosti lečenja

[0156] Postupci ispitivanja opisani ovde mogu takođe biti primenjene kako bi se procenila efikasnost lečenja poremećaja posredovanog od pKal (npr., HAE). Na primer, višestruki biološki uzorci (npr. uzorci krvi ili plazme) mogu se sakupljati od pacijenta kome se lečenje vrši bilo pre i posle tretmana ili tokom tretmana. Nivoi razdvojenog i/ili netaknutog kininogena mogu se meriti pomoću bilo kog postupka ispitivanja kako je ovde opisano, i zatim se mogu odrediti vrednosti (npr., procenti) razdvojenog i/ili netaknutog kininogena. Ako se procenat razdvojenog kininogena smanjuje nakon tretmana ili u toku terapije (procenat kininogena u kasnije prikupljenom uzorku u poređenju sa onim u ranije sakupljenom uzorku) ili se procenat netaknutog kininogena povećava nakon tretmana ili tokom tretmana, to pokazuje da je lečenje efikasno. U nekim primerima lečenje uključuje terapeutski agens, kao što je agens za vezivanje kalikreina kad se ovde opisano, antagonist bradikinin B2 receptora kako je ovde opisano, ili C1-INH zamenski agens kako je ovde opisano. Primeri terapeutskih agenasa uključuju, ali nisu ograničeni na, DX-2930 ili DX88.

[0157] Ako je pacijent identifikovan da ne odgovara na tretman, veća doza i/ili učestalost doze terapeutskog agensa se primenjuju na identifikovanog pacijenta. U nekim otelotvorenjima, doziranje ili učestalost doze terapeutskog agensa se održava, spušta ili prekida kod pacijenta koji je identifikovan da ima dobar odgovor na tretman, ili kom nije potreban dalji tretman. Alternativno, drugačiji tretman se može primeniti pacijentu koji se smatra da ne odgovara na prvi tretman.

Identifikovanje poremećaja koji su podložni terapiji inhibitorom pKal

[0158] Vrednosti razdvojenog kininogena i/ili netaknutog kininogena takođe se mogu oslanjati na identifikovanje poremećaja koji može biti tretiran od strane inhibitora pKal. Kako bi se ovaj postupak primenjivao, nivo razdvojenog kininogena i/ili nivo netaknutog kininogena u uzorku prikupljenom od pacijenta (npr. uzorak krvi ili uzorak plazme) koji ima

4

ciljanu bolest može se izmeriti odgovarajućim testom, npr. onim koji su ovde opisani, kao što je Western blot test. Vrednosti kao što su procenti razdvojenog i/ili netaknutog kininogena mogu se odrediti kako je ovde opisano. Vrednosti razdvojenog kininogena i/ili netaknutog kininogena mogu se upoređivati sa referentnom vrednošću kako je ovde opisano. Ako vrednost razdvojenog kininogena/netaknutog kininogena odstupa od referentne vrednosti (na primer, povišene ili smanjene), to ukazuje na to da inhibitor pKal može biti efikasan u lečenju bolesti. Na primer, ako se procenti razdvojenih kininogena smanjuju posle tretmana ili tokom tretmana, tretman može biti identifikovan kao efikasan. Alternativno, ako procenti netaknutog kininogena raste nakon tretmana ili tokom tretmana, tretman je identifikovan kao efikasan.

[0159] U nekim otelotvorenjima, nivo odloženog i/ili netaknutog kininogena se može izmeriti pomoću reagensa za detektovanje (npr., antitelo) koji se specifično vezuju za razdvojeni kininogen ili netaknuti kininogen u poređenju sa drugim oblikom kininogena. U nekim primerima, antitelo specifično vezuje razdvojeni kininogen u poređenju sa netaknutim kininogenom. U drugim primerima, antitelo specifično vezuje C-terminus lakog lanca razdvojenog kininogena.

[0160] Ako je bolest identifikovana kao podložna na (može se tretirati sa) inhibitor pKal, ovaj postupak može dalje obuhvatiti davanje pacijentu, koji ima bolest, efikasne količine inhibitora pKal, npr. DX-88, EPIKAL-2 ili DX-2930,

Tretman

[0161] Pacijent pod rizikom od dobijanja ili koji pati od (npr. ima poremećaj posredovan sa pKal ili bradikininom), kao što je identifikovano bilo kojim od ovde opisanih postupaka, može se tretirati sa odgovarajućim terapeutskim agensom. U nekim otelotvorenjima, pod uslovom da postupci uključuju izbor tretmana pacijenta na osnovu rezultata datog testa, na primer, detektovanja biomarkera.

[0162] U nekim otelotvorenjima, postupak obuhvata jedno ili oba od odabira i primene terapeutskog agensa, npr. agensa za vezivanje kalikreina kad se ovde opisano, npr. antagonista bradikinin B2 receptora kako je ovde opisano, npr. C1-INH zamenski agens kako je ovde opisano, za primenu pacijentu na osnovu rezultata testa, npr. detektovanja

biomarkera.

[0163] U nekim otelotvorenjima se pacijentu daje vezujući protein kalikreina plazme ili polipeptid. U nekim otelotvorenjima, agens za vezivanje kalikreina je inhibitor kalikreina, npr. peptid, inhibitor malih molekula, kalikrein antitelo ili njegov fragment. U nekim otelotvorenjima, pacijentu se daje antagonist bradikinin B2 receptora. U nekim otelotvorenjima C1-INH zamenski terapeutski agens se daje pacijentu.

[0164] Terapeutski agens, npr. Inhibitor kalikreina, npr. antagonist receptora bradikinin B2, npr. C1-INH zamenski agens, može se primeniti zajedno sa drugom terapijom kao deo kombinovane terapije za lečenje bolesti ili stanja koji uključuje kalikrein plazme i/ili aktivnost bradikinina. Kombinovana terapija, npr. sa jednim ili više inhibitora kalikreina, antagonista bradikinin B2 receptora ili C1-INH zamenskog agensa, npr. Sa jednim ili više inhibitora kalikreina, antagonista bradikinin B2 receptora ili C1-INH zamenskog agensa i druge terapije, mogu se dati u više različitih konfiguracija. Prvi agens se može primenjivati pre ili nakon primene druge terapije. U nekim situacijama, prvi agens i druga terapija (npr. terapeutski agens) se primenjuju istovremeno ili u kratkom vremenskom razmaku (npr., kratki vremenski interval između injekcija, kao što je tokom istog tretmana). Prvi agens i druga terapija se takođe mogu primenjivati u većim vremenskim intervalima.

Vezujući agensi kalikreina plazme

[0165] Vezujući agensi kalikreina plazme (npr. vezujući proteini, npr. polipeptidi, npr. inhibitorni polipeptidi, npr. antitela, npr. inhibitorna antitela ili drugi vezujući agensi, npr., mali molekuli) su korisni terapeutski agensi za različite bolesti i stanja, npr. bolesti i stanja koji uključuju aktivnost kalikreina plazme. Na primer, u nekim otelotvorenjima, bolest ili stanje koje uključuje aktivnost kalikreina plazme je nasledni angioedem (HAE). U nekim otelotvorenjima se vezujući protein ili polipeptid kalikreina plazme primenjuju pacijentu koji je pod rizikom da dobije, ili pati od poremećaja posredovanog sa pKal ili bradikininom.

[0166] Brojni korisni proteinski inhibitori kalikreina, bilo kalikreina tkiva i/ili plazme, uključuju Kunitz domen. Kad se ovde koristi, „Kunitz domen“ je polipeptidni domen koji ima najmanje 51 aminokiselinu i sadrži najmanje dva, i poželjno tri, disulfida. Domen je preklopljen tako da prvi i šesti cistein, drugi i četvrti, i treći i peti cistein formiraju disulfidne veze (npr. u Kunitz domenu koji ima 58 aminokiselina, cisteini mogu biti prisutni na položajima koji odgovaraju aminokiselinama 5, 14, 30, 38, 51 i 55, prema broju BPTI

1

homolognih sekvenci datih dole, i disulfidi mogu da se formiraju između cisteina na položaju 5 i 55, 14 i 38 i 30 i 51) ili, ako su dva disulfida prisutna, mogu se formirati između odgovarajućeg podskupa cisteina. Razmak između odgovarajućih cisteina može biti unutar 7, 5, 4, 3, 2, 1 ili 0 aminokiselina sledećeg razmaka između položaja koji odgovaraju: 5 do 55, 14 do 38 i 30 do 51, prema broju BPTI sekvence datom u nastavku. BPTI sekvenca se može koristiti kao referenca kako bi se pozvalo na određene položaje u bilo kom generičkom Kunitz domenu. Upoređivanje Kunitz domena od interesa sa BPTI može se izvršiti identifikovanjem najboljeg usklađivanja u kom je maksimalno povećan broj poravnatih cisteina.

[0167] Poznata je 3D struktura (u visokoj rezoluciji) Kunitz domena BPTI. Jedna od rentgenskih struktura deponovana je u Brookhaven Protein Data Bank kao „6PTI“. Poznata je 3D struktura nekih BPTI homologa (Eigenbrot i dr., (1990) Protein Engineering, 3(7):591-598; Hynes i dr., (1990) Biochemistry, 29:10018-10022). Poznato je najmanje osamdeset Kunitz domena. Poznati ljudski homologi uključuju tri Kunitz domena LACI takođe poznate kao inhibitore puta faktora tkiva (TFPI) (Wun i dr., (1988) J. Biol. Chem.263(13):6001-6004; Girard i dr., (1989) Nature, 338:518-20; Novotny i dr, (1989) J. Biol. Chem., 264(31):18832-18837) dva Kunitz domena inhibitora inter-α-tripsina, APP-I (Kido i dr., (1988) J. Biol. Chem., 263(34):18104-18107), Kunitz domen iz kolagena, tri Kunitz domena TFPI-2 (Sprecher i dr., (1994) PNAS USA, 91:3353-3357), Kunitz domen inhibitora tipa 1 aktivatora faktora rasta hepatocita, Kunitz domen inhibitora tipa 2 aktivatora faktora rasta hepatocita, Kunitz domen opisan u U.S. Patent Publication No.: 2004-0152633. LACI je ljudski serumski fosfoglikoprotein sa molekulskom masom od 39 kDa (aminokiselinska sekvenca u Tabeli 1) koji sadrži tri Kunitz domena.

Tabela 1: Primerni prirodni Kunitz domeni

2

[0168] Gore navedeni Kunitz domeni nazivaju se LACI-K1 (ostaci od 50 do 107), LACI-K2 (ostaci od 121 do 178) i LACI-K3 (213 do 270). CDNA sekvencaod LACI je prijavljena od strane Wun i dr. (J. Biol. Chem., 1988, 263(13):6001-6004). Girard i dr. (Nature, 1989, 338:518-20) izveštava o mutacijskim studijama u kojima su izmenjeni PI ostaci svakog od tri Kunitz domena. LACI-K1 inhibira faktor VIIa (F.VIIa) kada je F.VIIa kompleksiran na faktor tkiva i LACI-K2 inhibira Faktor Xa.

[0169] Proteini koji sadrže primere Kunitz domena uključuju sledeće, sa SWISS-PROT pristupnim brojevima u zagradama:

A4_HUMAN (P05067), A4_MACFA (P53601), A4_MACMU (P29216),

A4_MOUSE (P12023), A4_RAT (P08592), A4_SAISC (Q95241),

AMBP_PLEPL (P36992), APP2_HUMAN (Q06481), APP2_RAT (P15943),

AXP1_ANTAF (P81547), AXP2_ANTAF (P81548), BPT1_BOVIN (P00974),

BPT2_BOVIN (P04815), CA17_HUMAN (Q02388), CA36_CHICK (P15989),

CA36_HUMAN (P12111), CRPT_BOOMI (P81162), ELAC_MACEU (062845),

ELAC_TRIVU (Q29143), EPPI_HUMAN (095925), EPPI_MOUSE (Q9DA01),

HTIB_MANSE (P26227), IBP_CARCR (P00993), IBPC_BOVIN (P00976),

IBPI_TACTR (P16044), IBPS_BOVIN (P00975), ICS3_BOMMO (P07481),

IMAP_DROFU (P11424), IP52_ANESU (P10280), ISC1_BOMMO (P10831),

ISC2_BOMMO (P10832), ISH1_STOHE (P31713), ISH2_STOHE (P81129),

ISIK_HELPO (P00994), ISP2_GALME (P81906), IVB1_BUNFA (P25660),

IVB1_BUNMU (P00987), IVB1_VIPAA (P00991), IVB2_BUNMU (P00989),

IVB2_DABRU (P00990), IVB2_HEMHA (P00985), IVB2_NAJNI (P00986),

IVB3_VIPAA (P00992), IVBB_DENPO (P00983), IVBC_NAJNA (P19859),

IVBC_OPHHA (P82966), IVBE_DENPO (P00984), IVBI_DENAN (P00980),

IVBI_DENPO (P00979), IVBK_DENAN (P00982), IVBK_DENPO (P00981),

IVBT_ERIMA (P24541), IVBT_NAJNA (P20229), MCPI_MELCP (P82968),

SBPI_SARBU (P26228), SPT3_HUMAN (P49223), TKD1_BOVIN (Q28201),

TKD1_SHEEP (Q29428), TXCA_DENAN (P81658), UPTI_PIG (Q29100),

AMBP_BOVIN (P00978), AMBP_HUMAN (P02760), AMBP_MERUN (Q62577),

AMBP_MESAU (Q60559), AMBP_MOUSE (Q07456), AMBP_PIG (P04366),

AMBP_RAT (Q64240), IATR_HORSE (P04365), IATR_SHEEP (P13371),

SPT1_HUMAN (043278), SPT1_MOUSE (Q9R097), SPT2_HUMAN (043291),

SPT2_MOUSE (Q9WU03), TFP2_HUMAN (P48307), TFP2_MOUSE (035536),

TFPI_HUMAN (P10646), TFPI_MACMU (Q28864), TFPI_MOUSE (054819),

TFPI_RABIT (P19761), TFPI_RAT (Q02445), YN81_CAEEL (Q03610)

[0170] Različiti postupci se mogu koristiti za identifikovanje Kunitz domena iz baze podataka sekvenci. Na primer, poznata aminokiselinska sekvenca Kunitz domena, konsenzus sekvenca ili motiv (npr. ProSite Motif) može se pretraživati u odnosu na GenBank baze podataka sekvenci (National Center for Biotechnology Information, National Institutes of Health, Bethesda MD), npr. koristeći BLAST; protiv Pfam baze podataka od HMM (Hidden Markov Models) (npr. koristeći podrazumevane parametre za pretraživanje Pfam-a, u odnosu na SMART bazu podataka ili u odnosu na ProDom bazu podataka. Na primer, Pfam pristupni broj PF00014 od Pfam Release 9 pruža brojne Kunitz domene i HMM za identifikovanje Kunitz domena. Opis Pfam baze podataka može se naći kod Sonhammer i dr. (1997) Proteins 28(3):405-420 i detaljan opis HMM se može pronaći, na primer, kod Gribskov i dr. (1990) Meth. Enzymol. 183:146-159; Gribskov i dr. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4355-4358; Krogh i dr. (1994) J. Mol. Biol.235:1501-1531; and Stultz i dr. (1993) Protein Sci. 2:305-314. SMART baza podataka (Simple Modular Architecture Research Tool, EMBL, Heidelberg, DE) od HMM kao što je opisano kod Schultz i dr. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5857 i Schultz i dr. (2000) Nucl. Acids Res 28:231. SMART baza podataka sadrži domene identifikovane profilisanjem sa sakrivenim Markov modelima HMMer2 programa za pretraživanje (R. Durbin i dr. (1998) Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press). Baza podataka je takođe anotirana i nadgledana. ProDom baza podataka proteinskih domena se sastoji od automatske kompilacije homolognih domena (Corpet i dr. (1999), Nucl. Acids Res. 27:263-267). Trenutna ProDom verzija izgrađena je korišćenjem rekurzivnih PSI-BLAST pretraživanja (Altschul i dr. (1997)

4

Nucleic Acids Res.25:3389-3402; Gouzy i dr. (1999) Computers and Chemistry 23:333-340.) SWISS-PROT 38 i TREMBL proteinskih baza podataka. Baza podataka automatski generiše konsenzus sekvencu za svaki domen. Prosite navodi Kunitzov domen kao motiv i identifikuje proteine koji uključuju Kunitzov domen. Pogledati, na primer, Falquet i dr.

Nucleic Acids Res.30:235-238(2002).

[0171] Kunitz domeni komuniciraju sa ciljanom proteazom koristeći prvenstveno aminokiseline u dva regiona petlji („vezivne petlje“). Prvi region petlje je između ostataka koji odgovaraju aminokiselinama 13-20 od BPTI. Drugi region petlje je između ostataka koji odgovaraju aminokiselinama 31-39 od BPTI. Primerna biblioteka Kunitz domena varira jedan ili više položaj aminokiselina u prvom i/ili drugom regionu petlje. Posebno korisni položaje variraju, kada se skrininguju za Kunitz domene koji interakuju sa kalikreinom ili kada se biraju za poboljšane varijante afiniteta, uključujući: položaje 13, 15, 16, 17, 18, 19, 31, 32, 34 i 39 u odnosu na sekvencu BPTI. Očekuje se da će bar neki od ovih položaj biti u bliskom dodiru sa ciljanom proteazom. Takođe je korisno promeniti druge položaje, npr. položaje koje su u blizini gore navedenih položaja u trodimenzionalnoj strukturi.

[0172] „Okvirni region“ Kunitz domena definisan je kao ostatak koji je deo Kunitz domena, ali posebno isključujući ostatke u prvom i drugom regionu vezujućih petlji, tj. o ostacima koji odgovaraju aminokiselinama 13-20 BPTI i 31-39 BPTI. Nasuprot tome, ostaci koji nisu u vezujućoj petlji mogu tolerisati širi spektar supstitucije aminokiselina (npr., konzervativne i/ili nekonzervativne supstitucije).

[0173] U jednom otelotvorenju, ovi Kunitz domeni su varijantni oblici strukture petlje uključujući Kunitz domen 1 ljudskog lipoprotein-povezanog inhibitor koagulacije (LACI) proteina. LACI sadrži tri interne, dobro definisane strukture peptidnih petlji koje su paradigma Kunitz domena (Girard, T. i dr., 1989. Nature, 338:518-520). Ovde opisane varijante Kunitz domena od 1 LACI su prikazane, izolovane i vezuju kalikrein sa poboljšanim afinitetom i specifičnostima (pogledati, na primer, U.S. Pat. Br.5,795,865 i 6,057,287). Ovi postupci se takođe mogu primeniti na druge okvire Kunitz domena kako bi se dobili drugi Kunitz domeni koji interakuju sa kalikreinom, npr. kalikreinom plazme.

Korisni modulatori funkcije kalikreina tipično se vezuju i/ili inhibiraju kalikrein, kako se određuje pomoću testova vezivanja i inhibicije kalikreina.

[0174] U nekim aspektima, agens za vezivanje kalikreina (npr. vezujući protein, npr. polipeptid, npr. inhibitorni polipeptidi, npr. antitelo, npr. inhibitorno antitelo ili drugi vezujući agens, npr. mali molekul) se vezuje za aktivni oblik kalikreina plazme. U nekim otelotvorenjima, agens za vezivanje kalikreina, se vezuje i inhibira kalikrein plazme, npr., ljudski kalikrein plazme i/ili mišji kalikrein.

[0175] Vezujući proteini kalikreina plazme mogu biti puni dužine (npr. IgG (npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA (npr. IgA1, IgA2), IgD i IgE) ili mogu uključiti samo antigenvezujući fragment (npr. Fab, F(ab')2 ili scFv fragment). Vezujući protein može uključivati dva imunoglobulina teškog lanca i dva imunoglobulina lakog lanca ili mogu biti antitelo sa jednim lancem. Vezujući proteini kalikreina plazme mogu biti rekombinantni proteini kao što su humanizovana, CDR graftovana, himerni, deimunizovana ili in vitro generisana antitela i mogu opciono da uključuju konstantne regione izvedene iz ljudskih imunoglobulinskih sekvenci za germinalnu liniju. U jednom otelotvorenju, vezujući protein kalikreina plazme je monoklonsko antitelo.

[0176] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein kalikreina se vezuje i inhibira kalikrein plazme, npr., ljudski kalikrein plazme i/ili mišji kalikrein. Primeri vezujućih proteina kalikreina plazme su opisani u U.S. objava br.20120201756. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein kalikreina je antitelo (npr. ljudsko antitelo) koje ima laki i/ili teški lanac antitela izabran iz grupe koju čine M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 (takođe ovde označen kao DX-2922), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X124-G01 (takođe ovde označen kao DX-2930), X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 i M35-G04. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein kalikreina plazme konkuriše ili vezuje isti epitop kao M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 (takođe ovde označen kao DX-2922), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X124-G01 (takođe ovde označen kao DX-2930), X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 i M35-G04. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein kalikreina plazme je DX-2930,

[0177] U nastavku su navedene sekvence varijabilnog regiona teškog lanca i lakog lanca od DX-2930.

DX-2930 varijabilni region teškog lanca:

DX-2930 varijabilni region lakog lanca:

[0178] U nekim aspektima, vezujući polipeptid kalikreina (npr. inhibitorni polipeptid) koji se vezuje za aktivni oblik kalikreina plazme. Primeri kalikrein plazme polipeptidnih agensa su opisani u U.S. Patent No.5,795,865, U.S. Patent No. 5,994,125, U.S. Patent No.6,057,287, U.S. Patent No.6,333,402, U.S. Patent No.7,628,983, i U.S. Patent No.8,283,321, U.S. Patent No.7,064,107, U.S. Patent No.7,276,480, U.S. Patent No.7,851,442, U.S. Patent No.

8,124,586, U.S. Patent No.7,811,991, i U.S. prijava br.20110086801. U nekim otelotvorenjima, vezujući polipeptid kalikreina je DX-88 (ne-prirodni inhibitor kalikreina, takođe poznat kao KALBITOR® (ekalantid), SEQ ID NO: 8). U nekim otelotvorenjima inhibitor kalikreina sadrži ili se sastoji od oko 58-aminokiselinskih sekvenci aminokiselina 3-60 SEQ ID NO: 8 ili DX-88 polipeptida koji ima 60-aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8.

[0179] U nekim otelotvorenjima vezujući protein kalikreina plazme je EPIKAL-2 (SEQ ID NO: 9), koji je ne-prirodni inhibitor kalikreina koji ima 58 aminokiselinsku sekvencu ostatka (koja odgovara ostacima 3-60 SEQ ID NO: 8) i aminokiselinske supstitucije od Ile do Ser u ostatku 34 i Glu to Gli na ostatku 39. Sekvenca EPIKAL-2 je prikazana u nastavku:

[0180] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein kalikreina plazme može imati oko 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili veću identičnost sekvence sa ovde opisanim vezujućim proteinom. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein kalikreina plazme može imati oko 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili veću identičnost sekvence u HC i/ili LC okvirnim regionima (npr. HC i/ili LC FR 1, 2, 3 i/ili 4) sa ovde opisanim vezujućim proteinom. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein kalikreina plazme može imati oko 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili veću identičnost sekvence u HC i/ili LC CDR (npr. HC i/ili LC CDR1, 2, i/ili 3) sa ovde opisanim vezujućim proteinom. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein kalikreina plazme može imati oko 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili veću identičnost sekvence u konstantnom regionu (npr., CH1, CH2, CH3, i/ili CL1) sa ovde opisanim vezujućim proteinom.

[0181] U nekim aspektima, mali molekul se vezuje za aktivni oblik kalikreina plazme.

Antagonisti bradikinin B2 receptora

[0182] U nekim otelotvorenjima, pacijentu se daje antagonist bradikinin B2 receptora.

Primeri antagonisti bradikinin B2 receptora uključuju Incatibant (Firazyr®), koji je peptidomimetički lek koji sadrži 10 aminokiselina koje blokiraju vezivanje prirodnog bradikinina na bradikinin B2 receptor.

C1-INH zamenski agensi

[0183] U nekim otelotvorenjima, pacijentu se daju C1-INH zamenski agensi. Primeri C1-INH zamenskih agenasa su javno dostupni i uključuju, na primer, Berinert®, koji je pročišćeni ljudski pasterizovani nanofiltrirani C-INH koncentrat.

PRIMERI

Primer 1: razdvojeni kininogen

[0184] Na osnovu analize dodirnog sistema, razdvojeni kininogen je pogodan biomarker za merenje dodirnog sistema. Razdvojeni kininogen se ranije pokazao kao povišen tokom HAE napada, u cirozi), i kao posledica aktivacije dodirnog sistema tokom sepse. Biblioteke antitela za prikaz faga poređene su sa rastvorenim kininogenom u kombinaciji sa smanjenjem intenziteta kininogena. Paralelno su miševi imunizovani razdvojenim kininogenom i monoklonskim antitelima dobijenim iz ćelijskih linija hibridoma. Oba napora pružila su niz različitih monoklonskih antitela koja su vezala i razdvojeni i netaknuti kininogen, ali bez antitela koja su vezivala samo razdvojeni kininogen.

[0185] Više antitela je pregledano za prikladnost u Western blot testu, i identifikovano je nekoliko koja dobro funkcionišu, uključujući i mišje mAb (klon 11H05) prikazano na Slici 2. Očigledno je da je ovaj test sposoban da detektuje razdvojeni kininogen u uzorcima ljudske plazme. Osim toga, podaci na Slici 2 potvrđuju da je sakupljanje plazme u staklu dovoljno za sprečavanje aktivacije dodirom i razdvajanja kininogena.

[0186] Pristup zasnovan na masenoj spektrometriji se takođe može koristiti za detektovanje razdvojenog kininogena u plazmi pacijenta. U ovom pristupu, jedan imunitet adsorbuje kininogen iz uzorka pacijenta, proteolitički digestira eluirani kininogen i analizira peptidne fragmente pomoću LC-MC.

Primer 2: Netaknuti i razdvojeni kininogen

[0187] Western blot je korišćen kako bi se pokazalo da plazma dobijena od pacijenta tokom napada i sakupljena u epruvetama citrirane plazme koje sadrže koktel za zaštitu od proteaze pokazuje smanjenje količine netaknutog kininogena (tj.1-lančani) (Slika 3). Uočeno je povećanje razdvojenog kininogena (tj., 2-lančani).

Primer 3: Analiza mernih nivoa razdvojenog kininogena

[0188] Western blot test za detektovanje netaknutog (1-lančanog) i razdvojenog (2-lančanog) kininogena visoke molekulske mase (HMWK) dodatno je optimizovan korišćenjem Licor detektovanja. Ovaj ovde opisan test koristi mišje monoklonsko antitelo (klon 11H05) koji je generisan hibridoma tehnologijom imunizacijom životinja sa 2-lančanim HMWK i skriningom fuzija hibidoma i sa 1-lančanim i 2-lančanim HMWK pomoću ELISA.11H05 mAb je odabrano na osnovu svojih performansi u Western blot testu i svoje sposobnosti da specifično vezuje laki lanac i ne vezuje teški lanac HMWK. Veznici lakog lanca su poželjni jer laki lanac nije prisutan u drugom plazma kininogenu (kininogen niske molekulske mase, LMWK), koji nije pKal supstrat. Analiza se takođe koristi da bi pokazala važnost sakupljanja plazme u plastičnim cevima, jer je sakupljanje u staklenim cevima rezultovalo aktivacijom dodirnog sistema (Slika 4).

[0189] U nekim primerima u Western blot testu su opisani sledeći materijali i uslovi:

Materijali

[0190]

• XCell SureLock® Mini-Cell, Life Technologies (Invitrogen), Cat. # EI0001

• Gel Box napajanje

iBlot® Western Blotting Transfer Device, Life Technologies (Invitrogen), Cat. # IB1001

iBlot® Transfer Stack, nitroceluloza, mini, Life Technologies (Invitrogen), Cat. # IB301001

Matrix Laboratories Impact 2 Multichannel Pipettor, ili ekvivalent

Rainin Pipetman, izabrani raspon zapremina, Rainin, Cat #: P-10. P-20. P-100, P-200, i P-1000, ili ekvivalent

-80°C zamrzivač sa grafičkim dijagramom

-20°C zamrzivač sa grafičkim dijagramom

2-8°C frižider sa grafičkim dijagramom

0,22 µm polietersulfon (PES) Filter Systems, Corning, Cat # 431096 ili ekvivalent Dejonizovana i pročišćena voda (DI voda), Ricca Chemical, Cat # 9150-5, ili ekvivalent

NuPAGE 7% Tris-Acetat gelovis, 15-komorični, Life Technologies (Invitrogen), Cat. # EA03555Box

Tris-Acetat SDS tekuću pufer (20X), Life Technologies (Invitrogen), Cat. #LA0041 NuPAGE agens za redukciju uzorka (10X), Life Technologies (Invitrogen), Cat. #NP0009

NuPAGE pufer za uzorak (4X), Life Technologies (Invitrogen), Cat. #NP0007 NuPAGE 4-12% Bis-Tris gelovi, 15-komorični, Life Technologies (Invitrogen), Cat. # NP0336BOX

MES SDS tekući pufer (20X), Life Technologies (Invitrogen), Cat. #NP0002 Odyssey blokirajući pufer, LI-COR, Cat. #927-40000

Tween20. Sigma, Cat. #P1379

Fosfatom puferisan fiziološki rastvor pH 7,4, Sigma, Cat # P-3813 ili ekvivalent Tris, Fisher Scientific, Cat. # T393-5000

Natrijum hlorid, JT Baker, Cat. # 3624-19

6N hlorovodonična kiselina, EMD, Cat. #HX0603M-6

3M natrijum acetat pufer pH 5,2, Teknova, Cat. #S0296

Goveđi serum albumin (BSA), IgG i bez proteaze, Jackson ImmunoResearch, Cat. # 001-000-162

Mišje monoklonsko anti-LC HMWK antitelo klone, Klon 11H05 (#16), 1,4 mg/mL, Dyax

Kozje anti-mišje IRDye 680RD, LI-COR, Cat. #926-68070

• Odyssey jednobojni markeri molekulske mase, LI-COR, Cat. # 928-40000 • Inhibitor anti-proteaze koktel (10X), nabavljen od strane Dyax

• Faktor XIIa, 1,47 mg/mL (21,6 µM), Enzyme Research Labs, nabavljen od strane Dyax

• Plazma kojoj nedostaje kininogen, Hyphen-Biomed, nabavljena od strane Dyax • Jednoančani HMWK, 1,61 mg/mL, Enzyme Research Labs, Cat. #HK 2700 • Dvolančani HMWK, 2,01 mg/mL, Enzyme Research Labs, Cat. # HK 2362 • Normalni ljudski uzorci plazme, uzorci HAE pacijenata, i Bioreclamation uzorci nabavljeni od strane Dyax

• DX2930, Dyax, Lot# PURDX1-L01, 32,1 mg/mL

• DX88, Dyax, Lot# B2007-029, 10,1 mg/mL

•

Okvir protokola:

1

[0191] Kako bi se procenila sposobnost mAb 11H05 da detektuje 1-lančani i 2-lančani HMWK, pročišćeni proteini su ušli u HMWK-deficijentnu plazmu u koncentracijama koje uključuju nivoe koji se primećuju u normalnoj plazmi (Slika 5). Bilo je očigledno da pod redukovanim uslovima, 11H05 sa većom osetljivošću detektuje 1-lančani od 2-lančanog HMWK. Obračunavajući diferencijalnu senzitivnost mAb za dva oblika HMWK, ovaj test se može koristiti za precizno kvantifikovanje koncentracije 1-lančanog i 2-lančanog HMWK u plazmi pacijenta. Alternativno, procenat 2-lančanog signala može se odrediti u uzorcima plazme za koje se sumnja da uključuju dodirnu aktivaciju i upoređuju se sa onim u plazmi od normalnih zdravih pojedinaca. Korišćenjem ovog poslednjeg pristupa, test se može koristiti za skrining uzoraka iz različitih bolesti i identifikovanje bolesti povezanih sa aktivacijom dodirnog sistema.

[0192] Takođe su izvršeni inter i intra testovi preciznosti i tačnosti testova. I pod neredukovanim uslovima i pod redukovanim uslovima, test je obavljen dajući prihvatljive vrednosti za procenat CV od ≤25% u svim testiranim parametrima.

[0193] Testovi stabilnosti zamrzavanja i odmrzavanja su takođe obavljeni na normalnoj

2

plazmi čoveka. Utvrđeno je da HMWK nije degradirao između 0 i 3 ciklusa zamrzavanja i odmrzavanja.

[0194] Western blot test je potvrđen primenom uzoraka plazme kod pacijenata sa naslednim angioedem (HAE), bolestima za koje je poznato da su uzrokovane aktivacijom viška dodirnog sistema i aktivnošću pKal. Kao što je prikazano na Slici 6, procenat razdvojenog HMWK u HAE plazmi je oko 20%, što je znatno više od prosečne plazme. Tokom HAE napada, procenat razdvojenog HMWK detektovan korišćenjem ovog testa dodatno je povišen. Ovi podaci jasno pokazuju povećan razdvojeni HMWK u HAE plazmi tokom bolesti u stanju mirovanja (osnovica). Test se stoga može koristiti za nadgledanje efikasnosti terapijskih inhibitora pKal putem procene stepena do kog se obnavljaju normalni nivoi razdvojenog kininogena.

[0195] Poznato je da negativno naelektrisane površine ili čestice, kao što su fosfolipidi ili polifosfati, predstavljaju delotvorne aktivatore dodirnog sistema, što dovodi do stvaranja aktivnog pKal i stvaranja bradikinina iz proteolize 1-lančanog HMWK. Identitet fiziološke površine koja dovodi do aktivacije dodirnog sistema kod HAE napada nije poznata. Međutim, HAE napadi su povezani sa generisanjem FXIIa. Korišćenje FXIIa kao inicijatora dodirnog sistema, pre nego naelektrisanih supstanci kao što su dekstran sulfat ili kaolin, omogućava više ponovljivog aktiviranja dodirnog sistema i optimizovane performanse testa. Utvrđena je koncentracija FXIIa i reakcionih uslova kako bi se procenio procenat razdvojenog kininogena koji je primećen kod pacijenata sa HAE (~ 20-50%) (Slika 7, Tabela 1).

Tabela 1 - Intenziteti Licor signala uzoraka ljudske plazme tretiranih sa FXIIa*

% dvolančanog u liniji: zbir dvolančanog signala/zbir ukupnog signala linija % dvolančanog od netretiranog signala: 1 – (tretirani jednolančani signal/netretirani jednolančani signal)

*Analiza signala uzoraka od Western Blot na Slici 5.

[0196] Koristeći koncentraciju FXIIa od 2,5 nM i optimizovane uslove reakcija, normalna ljudska plazma od 15 muškaraca i 15 žena je ispitivana u prisustvu ili odsustvu 10 μg/mL DX-2930 (potentni inhibitor antitela od pKal aktivnosti) i određen je procenat 2-lanačanog HMWK (Tabela 2). Očigledno je da je test sposoban za detektovanje inhibicije HMWK proteolize u plazmi pomoću kalikreina plazme. Pokazano je da DX-2930 pokazuje približno ekvivalentnu potenciju u ovom testu za ekolantid, odobreni inhibitor pKal za lečenje HAE

4

napada (Slika 8). Jednaka potencija ekolantida u ovom in vitro testu ukazuje na to da ekvivalentni nivoi lekova mogu biti jednako efikasni kod HAE.

Tabela 2. Prosečan procenat dvolančanog u liniji, redukovane i neredukovane vrednosti*

[0197] Uzorci pacijenata sa ulcerativnim kolitisom (UC) i reumatoidnim artritisom (RA) takođe su testirani korišćenjem ovog Western blot testa. Uzorci plazme pacijenta su dobijeni od Bioreclamation i prikupljeni u antikoagulantu u plastičnim cevima. Utvrđeno je da je procenat razdvojenog kininogena povećan kod obolelih od UC i RA u poređenju sa normalnim kontrolnim pacijentima (Slika 9, Tabela 3).

Tabela 3. Sažetak Western Blot analize uzoraka ulcerativnog kolitisa i reumatoidnog artritisa

[0198] Uzorci pacijenata sa Kronovom boleti (CD) takođe su testirani korišćenjem Western blot testa. Uzorci plazme pacijenta su dobijeni od Bioreclamation i prikupljeni su u antikoagulantu u plastičnim cevima. Utvrđeno je da je procenat razdvojenog kininogena povećan kod CD pacijenata u poređenju sa normalnim kontrolnim pacijentima (Slika 10. Tabela 4).

Tabela 4. Sažetak Western Blot analize za uzorke Kronove bolesti

Primer 4: Efekti FXIIa i DX2930 na uzorke normalne ljudske plazme (NHP)

Svrha:

[0199] Svrha ovog eksperimenta bila je određivanje efekata DX-2930 na aktivaciju dodirnog sistema FXIIa. DX2930 može inhibirati kalikrein plazme, redukujući mereni odnos odgovora dvolančanog u odnosu na jednolančani na tretman sa FXIIa. Natrijum citrirani NHP uzorci od pet muškaraca i pet žena su testirani netretirani, posle FXIIa aktivacije, i nakon FXIIa aktivacije, kada su uzorci prethodno tretirani sa 10 μg/mL DX-2930, Svaki skup uzoraka je analiziran pod neredukujućim i redukujućim uslovima.

Procedura:

Priprema uzorka

[0200]

1. Uzorci NHP-a su uklonjeni iz zamrznutog skladištenja i dozvoljeno im je da se uravnoteže na sobnoj temperaturi. Ispitani su sledeći muški NHP uzorci: BRH745050, BRH745051, BRH745052, BRH745053 i BRH745054. Ispitani su sledeći ženski uzorci: BRH745065, BRH745066, BRH745067, BRH745068 i BRH745069.

2. DX2930 je pripremljen na 215 μg/mL dodavanjem 3,35 μL DX2930 (Lot # PURDX1-L01, 32,1 mg/mL) do 496,65 μL 1X TBS.

3. 1:10 međuproizvod FXIIa rastvora je pripremljen dodavanjem 5 μL FXIIa osnovnog rastvora (25,300 nM) do 45 μL TBS.56,25 nM FXIIa rastvor je pripremljen dodavanjem 4,45 μL 1:10 međuproizvoda do 195,55 μL TBS.

4. Svaki NHP uzorak je pripremljen sa 10 μg/mL DX2930 dodavanjem 2 μL 215 μg/mL DX2930 rastvora u 41 μL NHP.

5. Svaki NHP uzorak je pripremljen sa 2,5 nM FXIIa dodavanjem 2 μL 56,25 nM FXIIa rastvora u 43 μL svakog uzorka NHP sa i bez DX2930,

6. Uzorci su inkubirani sa FXIIa na 37°C tokom 10 minuta. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 5 μL 10X anti-proteaza inhibitora.

7. Svaki NHP uzorak, sa FXIIa, sa DX2930 i FXIIa, i netretirani uzorak razređeni su do 5% plazme dodavanjem 5 μL uzorka na 95 μL TBS.

8. Neredukovani uzorci su pripremljeni dodavanjem 5 μL 4X pufera uzorka do 15 μL uzorka.

9. Redukovani uzorci su pripremljeni dodavanjem 5 μL 4X pufera uzorka i 2 μL 10X redukcionog agensa do 13 μL uzorka.

10. Svi uzorci su zagrevani na 95°C tokom 5 minuta korišćenjem toplotnog bloka.

Postavljanje, pokretanje i transfer gela

1. Zapremina 1 L 1X Tris-Acetat SDS tekućeg pufera je pripremljena dodavanjem 50 mL Tris-Acetat SDS 20X tekućeg pufera do 950 mL DI vode.

2. Zapremina 1L 1X MES tekućeg pufera pripremljena je dodavanjem 50 mL 20X MES SDS tekućeg pufera do 950 mL DI vode.

3. Pufer za pranje (Odyssey blokirajućeg pufera sa 0,2% Tween) pripremljen je dodavanjem 1 ml Tween-20 do 499 ml Odyssey blokirajućeg pufera.

4. Pufer za pranje (PBS sa 0,1% Tween) pripremljen je dodavanjem 1 paketa PBS i 1 ml Tween-20 do 900 ml DI vode. Rastvor je dobro pomešan i QS-ovan do 1 L pomoću DI vode. Krajnji rastvor je filtriran kroz 0,22 μM PES filtracioni sistem.

5. Na liniju 1 od dva gela dodata je zapremina od 4 μL jednobojnog proteina.

6. Zapremina od 13 μl neredukovanih uzoraka dodata je odgovarajućim linijama 7% Tris-Acetat gela.

7. Zapremina od 13 μL redukovanih uzoraka dodata je odgovarajućim linijama 4-12% Bis-Tris gela.

8. Gelovi su radili na 125 volti u trajanju od ~ 75 minuta.

9. Svaki gel pojedinačno je premešten na membranu pomoću iBlot mini transfera i Program P0 od iBlot sistema transfera.

10. Svaka membrana je prebačena u plastičnu ladicu koja sadrži 20 mL Odyssey blokirajućeg pufera. Membrane su inkubirane u Odyssey blokirajućem pufera na mikseru ploča na sobnoj temperaturi u trajanju od 1 sata.

11. Primarni rastvor antitela 1 μg/mL je pripremljen dodavanjem 28,58 μL mišjeg anti-HMWK mAb, klon# 11H05, 1,4 mg/mL do 29,971,42 μL test pufera.

12. Blokirajući pufer je uklonjen iz plastičnih ladica. Zapremina od 20 mL primarnog rastvora antitela dodata je u svaku ladicu, i membrane su inkubirane na mikseru ploča na sobnoj temperaturi u trajanju od 1 sata.

13. 1:10 međuproizvod kozjeg anti-mišjeg IgG IRDye680 je pripremljen dodavanjem 5 μL kozjeg anti-mišjeg IgG IRDye680 do 45 μL test pufera. Sekundarni rastvor antitela je pripremljen pri razblaženju od 1:15.000 dodavanjem 26,661:10 μL kozjeg anti-mišjeg IgG IRDye680 međuproizvoda do 39,973,34 μL test pufera.

14. Primarni rastvor antitela je uklonjen iz ladica.

15. Svaka membrana je isprana tokom pet minuta sa 20 mL pufera za pranje, i zatim je odbačen rastvor za pranje. Pranje je ponovljeno za ukupno 4 pranja.

16. Zapremina od 20 mL sekundarnog rastvora antitela dodata je u svaku ladicu, i membrane su inkubirane na mikseru ploča na sobnoj temperaturi tokom 1 sata.

17. Sekundarni rastvor antitela je uklonjen iz ladica.

18. Svaka membrana je isprana tokom pet minuta sa 20 mL pufera za pranje, i zatim je odbačen rastvor za pranje. Pranje je ponovljeno za ukupno 4 pranja.

19. Svaka membrana je isprana sa PBS tokom 5 minuta.

20. Membrane su skenirane pomoću LiCor Odyssey CLx.

Rezultati:

[0201] Tabele 5 i 6 sadrže podatke o neredukovanom uzorku. Tabele 7 i 8 sadrže podatke o redukovanom uzorku. Procenat razdvojenog HMWK izračunat je korišćenjem dva postupka. Procenat dvolančanog u liniji određen je korišćenjem sledeće jednačine: zbir signala sa dva lanca/zbir ukupnog signala linija. Procenat dvolančanog od netretiranog signala određen je korišćenjem sledeće formule: 1 - (tretirani jednolančani signal/netretirani jednolančani signal). Tretirani i netretirani uzorci su pripremljeni malo drugačije, gde netretirani uzorci koji imaju nešto viši procenat plazme u pripremi uzorka. Prema tome, netretirani uzorci su proizveli nešto više ukupne signale od tretiranih uzoraka. Procenat vrednosti dvolančane linije korišćen je za određivanje procenta razdvojenog HWMK zbog neznatno drugačije pripreme uzorka između tretiranih i netretiranih uzoraka.

[0202] Tabela 16 sadrži sažetak rezultata aktivacije i inhibicije. U redukovanim uslovima, netretirani muški i ženski NHP uzorci sadržali su u proseku 16,1% i 9,6% razdvojenog HMWK respektivno. Muški i ženski NHP uzorci tretirani sa FXIIa sadržali su u proseku 42,0% i 43,8% razdvojenih HMWK, respektivno. Muški i ženski NHP uzorci prethodno tretirani sa DX-2930, nakon čega su tretirani sa FXIIa, sadržali su u proseku od 29,5% i 26,4% razdvojenog HMWK.

[0203] Pod neredukovanim uslovima, netretirani muški i ženski NHP uzorci sadržali su prosečno 32,0% i 21,5% razdvojenog HMWK, respektivno. Muški i ženski NHP uzorci tretirani sa FXIIa sadržali su u proseku 61,2% i 50,2% razdvojenih HMWK, respektivno. Muški i ženski NHP uzorci prethodno tretirani sa DX-2930, nakon čega su tretirani sa FXIIa, sadržali su u proseku od 43,6% i 30,3% razdvojenog HMWK, respektivno.

Zaključak:

[0204] Tretman NHP uzoraka sa FXIIa povećao je procenat razdvojenog HMWK u poređenju sa netretiranim uzorcima. NHP uzorci prethodno tretirani sa DX-2930, i zatim sa FXIIa aktivacijom, proizveli su manje razdvojene HMWK u odnosu na uzorke tretirane samo sa FXIIa, ali nešto veći procenat razdvojenih HMWK u poređenju sa netretiranim uzorcima. Redukovani netretirani NHP uzorci sadržali su manje razdvojenog HMWK od neredukovanih netretiranih uzoraka NHP. Takođe je utvrđeno da su NHP uzorci netretirani, tretirani sa FXIIa, i prethodno tretirani sa DX2930 praćenim tretmanom sa FXIIa, proizveli rezultate koji se mogu ponoviti.

Tabela 5. Inhibicija FXIIa aktivacije sa neredukovanim DX2930, muški uzorci, jedno/dvolančani HMWK signali, ukupan signal, procenat dvolančanih HMWK

% dvolančanog u liniji: zbir dvolančanog signala/zbir ukupnog signala linija

% dvolančanog od netretiranog signala: 1 - (tretirani jednolančani signal/netretirani jednolančani signal)

1

Tabela 6. Inhibicija FXIIa aktivacije sa neredukovanim DX2930, ženski uzorci, jedno/dvolančani HMWK signali, ukupan signal, procenat dvolančanih HMWK

2

% dvolančanog u liniji: zbir dvolančanog signala/zbir ukupnog signala linija

% dvolančanog od netretiranog signala: 1 - (tretirani jednolančani signal/netretirani jednolančani signal)

Tabela 7. Inhibicija FXIIa aktivacije sa redukovanim DX2930, muški uzorci, jedno/dvolančani HMWK signali, ukupan signal, procenat dvolančanih HMWK

% dvolančanog u liniji: zbir dvolančanog signala/zbir ukupnog signala linija % dvolančanog od netretiranog signala: 1 - (tretiran jednolančani signal/netretirani jednolančani signal)

Tabela 8. Inhibicija FXIIa aktivacije sa redukovanim DX2930, ženski uzorci, jedno/dvolančani HMWK signali, ukupan signal, procenat dvolančanih HMWK

4

% dvolančanog u liniji: zbir dvolančanog signala/zbir ukupnog signala linija % dvolančanog od netretiranog signala: 1 - (tretiran jednolančani signal/netretirani jednolančani signal)

Tabela 9. Prosečni procenat dvolančanih u liniji, redukovanih i neredukovanih vrednosti

Primer 6. Inhibicija aktivacije FXIIa pomoću DX-2930 i DX-88

Svrha:

[0205] Cilj ovog eksperimenta bio je da se utvrdi efikasnost DX-2930 i DX-88 na inhibiciju FXIIa aktivacije. DX-2930 je testiran u 5 koncentracija: 200, 100, 30, 12 i 5 μg/mL. DX-88 je testiran u 5 koncentracija: 9,4, 4,7, 1,4, 0,56 i 0,24 μg/mL. Uzorci prethodno tretirani sa DX-2930 i DX-88 tretirani su sa FXIIa. Pored prethodno tretiranih uzoraka testirani su i jedan netretirani uzorak i dva uzorka tretirana samo sa FXIIa. Uzorci su testirani u redukovanim uslovima.

Procedura:

[0206]

1. NHP grupa je pripremljen dodavanjem 250 μL svakog uzorka plazme, BRH745070, BRH745071 i BRH745048 u 1,5 mL mikrocentrifugirne cevi i dobro pomešan.

2. 4500 μg/ml DX2930 rastvor je pripremljen dodavanjem 4,21 μL osnovnog rastvora DX2930 (32,1 mg/mL) do 25,79 μL TBS.2250 μg/mL DX2930 rastvor je pripremljen dodavanjem 15 μL od 4500 μg/ml rastvora do 15 μL TBS. Rastvor 675 μg/ml DX2930 je pripremljen dodavanjem 6 μL od 2250 μg/ml rastvora do 14 μL TBS.270 g/ml DX2930 rastvor je pripremljen dodavanjem 8 μL od 675 μg/ml rastvora do 12 μL TBS.112,5 μg/mL DX2930 rastvor je pripremljen dodavanjem 10 μl od 270 μg/mL rastvora do 14 μL TBS.

3. Pet uzoraka plazme prethodno tretiranih sa DX-2930 su pripremljeni dodavanjem 2 μL svakog DX2930 rastvora do 41 μL NHP grupe.

4. 211,5 ug/ml DX88 rastvor je pripremljen dodavanjem 6,28 μL osnovnog rastvora DX88 (10,1 mg/mL) do 293,72 μL TBS.105,75 μg/ml DX88 rastvor je pripremljen dodavanjem 15 μL od 211,5 μg/ml rastvora do 15 μL TBS.31,5 μg/ml DX88 rastvor je pripremljen dodavanjem 8,94 μL od 105,75 μg/ml rastvora do 21,06 μL TBS.12,6 μg/mL DX88 rastvor je pripremljen dodavanjem 12 μL od 31,5 μg/ml rastvora do 18 μL TBS.

5,4 g/ml DX88 rastvor je pripremljen dodavanjem 12,86 μL od 12.6 μg/mL rastvora do 17,14 μL TBS.

5. Pet uzoraka plazme prethodno tretiranih sa DX-88 su pripremljeni dodavanjem 2 μL svakog DX-88 rastvora do 41 μL NHP grupe.

6. 1:10 međuproizvod od FXIIa je pripremljen dodavanjem 5 μL osnovnog rastvora (25,300 nM) do 45 μL TBS.56,25 nM FXIIa rastvor je pripremljen dodavanjem 4,45 μL 1:10 međuproizvoda do 195,55 μL TBS.

7. Svaki uzorak plazme prethodno tretiran sa DX2930 i DX88 je tretiran sa 2,5 nM FXIIa dodavanjem 2 μL 56,25 nM FXIIa rastvora u svaki uzorak.

8. Dva uzorka koji sadrže samo FXIIa su pripremljeni dodavanjem 2 μL TBS i 2 μL 56,25 nM FXIIa rastvora u 41 μL NHP grupe.

9. Jedan netretirani uzorak je pripremljen dodavanjem 4 μL TBS do 41 μL NHP grupe.

10. Inkubirali smo sve uzorke koji sadrže FXIIa na 37°C tokom 10 minuta.

11. Zapremina od 5 μL inhibitora anti-proteaze je dodata svakom uzorku, uključujući netretirani uzorak. Ukupni zapremina uzorka za svaki replikat bila je 50 μL.

12. Svaki uzorak je razređen do ~ 5% plazme dodavanjem 5 μL uzorka do 95 μL TBS. 13. Uzorci su pripremljeni dodavanjem 5 μL 4X pufera uzorka i 2 μL 10X redukcionog agensa do 13 μL uzorka.

14. Svi uzorci su zagrevani na 95°C tokom 5 minuta koristeći toplotni blok.

15. Obim 1L 1X MES tekućeg pufera pripremljen je dodavanjem 50 mL 20X MES SDS tekućeg pufera do 950 mL DI vode.

16. Test pufer (Odyssey blokirajući pufera sa 0,2% Tween) pripremljen je dodavanjem 1 ml Tween-20 do 499 ml Odyssey blokirajućeg pufera.

17. Pufer za pranje (PBS sa 0,1% Tween) pripremljen je dodavanjem 1 paketa PBS i 1 ml Tween-20 do 900 ml DI vode. Rastvor je dobro pomešan i QS-ovan do 1 L pomoću DI vode. Krajnji rastvor je filtriran kroz 0,22 μM PES filtracioni sistem.

18. Na liniju 1 od dva gela dodata je zapremina od 4 μL jednobojnog proteina.

19. Zapremina 13 μL redukovanih uzoraka dodata je odgovarajućim linijama 4-12% Bis-Tris gela.

20. Gel je pušten na 125 volti u trajanju od ~ 75 minuta.

21. Gel je prebačen na membranu koristeći iBlot mini-transfer gomilu i program P0 na iBlot sistemu prenosa.

22. Membrana je prebačena u plastičnu ladicu koja sadrži 20 mL Odyssey blokirajućeg pufera. Membrana je inkubirana u Odyssey blokirajućem puferu na mikseru ploča na sobnoj temperaturi u trajanju od 1 sata.

23. Prvobitni rastvor antitela 1 μg/mL je pripremljen dodavanjem 14,29 μL mišjeg anti-HMWK mAb, klon# 11H05, 1,4 mg/mL do 19,985,7 μL test pufera.

24. Blokirajući pufer je uklonjen iz plastične ladice. Na membranu je dodata zapremina od 20 mL primarnog rastvora antitela i inkubirano je na mikseru ploča na sobnoj temperaturi tokom 1 sata.

25. 1:10 međuproizvod kozjeg anti-mišjeg IgG IRDye680 je pripremljen dodavanjem 5 μL kozjeg anti-mišjeg IgG IRDye680 do 45 μL test pufera. Sekundarni rastvor antitela je pripremljen sa 1:15.000 razblaživanjem dodavanjem 13,33 od 1:10 μL kozjeg anti-mišjeg IgG IRDye680 međuproizvoda do 19.986,7 μL test pufera.

26. Primarni rastvor antitela je uklonjen iz ladice.

27. Membrana je oprana tokom pet minuta sa 20 mL pufera za pranje, i zatim je odbačen rastvor za pranje. Pranje je ponovljeno za ukupno 4 pranja.

28. Zapremina od 20 mL sekundarnog rastvora antitela dodat je u membranu i inkubirana je na mikseru ploča na sobnoj temperaturi tokom 1 sata.

29. Sekundarni rastvor antitela je uklonjen iz ladica.

30, Membrana je oprana tokom pet minuta sa 20 mL pufera za pranje, i zatim je odbačen rastvor za pranje. Pranje je ponovljeno za ukupno 4 pranja.

31. Membrana je isprana sa PBS tokom 5 minuta.

32. Membrana je skenirana pomoću LiCor Odyssey CLx.

Rezultati:

[0207] Tabela 10 sadrži rezultate za eksperiment inhibicije DX-2930 i DX-88. Procenat dvolančanog obračunat je unutar svake linije i izračunava se upoređivanjem tretiranog signala sa netretiranim signalom. Za ovo poređenje korišćen je procenat dvolančanog u liniji.

Netretirani NHP grupa proizveo je procenat dvolančane vrednosti od 3,8%. Kada je NHP grupa tretiran samo sa FXIIa, dva replikata uzorka proizvela su procenat dvolančanih vrednosti od 24,4%. Uzorci prethodno tretirani sa DX-2930 proizveli su nešto niži procenat vrednosti od dvolančanih u odnosu na uzorke pripremljene sa DX-88. Uzorci koji su prethodno tretirani sa 5 μg/mL DX-2930 i 0,24 μg/mL DX-88 proizveli su procenat dvolančanih vrednosti od 22,3% i 23,9% respektivno. Ove vrednosti su veoma blizu procentu dvolančanih vrednosti u uzorku tretiranom samo sa FXIIa.

Zaključak:

[0208] Uzorci prethodno tretirani sa DX-2930 proizveli su nešto niži procenat dvolančanih vrednosti od uzoraka koji su prethodno tretirani sa DX-88.

Tabela 10. Inhibicija FXIIa koristeći DX-2930 i DX-88, HMWK signali, procenat dvolančanih HMWK

% dvolančanog u liniji: zbir dvolančanog signala/zbir ukupnog signala linija

% dvolančanog od netretiranog signala: 1 - (tretirani jednolančani signal/netretirani jednolančani signal)

Primer 7. Određivanje nivoa razdvojenog kininogena kod HAE, RA, UC i CD pacijenata

Svrha:

[0209] Svrha ovog eksperimenta bila je procena uzoraka plazme tretiranih anti-proteazom od pacijenata sa naslednim angioedemom (HAE). Dva HAE uzorka su testirana od svakog pacijenta, jedan bazalni uzorak i jednog uzorak napada. Uzorci su testirani u redukovanim i neredukovanim uslovima. Pored toga, testirani su uzorci pacijenata sa dijagnozom Kronove bolesti, reumatoidnog artritisa i ulcerativnog kolitisa. Takođe su testirani i uzorci ljudske plazme. Dodatni uzorci su testirani pod samo redukovanim uslovima.

Procedura:

[0210]

1. Ispitano je šest setova uzoraka HAE pacijenata. Svaki uzorak plazme je pripremljen dodavanjem 5 μL uzorka do 95 μL TBS.

2. Ispitani su uzorci plazme pet Kronovih bolesti, pet uzoraka plazme reumatoidnog artritisa i pet uzoraka ulcerativnog kolitisa. Svaki uzorak plazme je pripremljen dodavanjem 5 μL uzorka do 95 μL TBS.

3. Sedam normalnih uzoraka ljudske plazme pripremljeno je za primenu kao kontrola dodavanjem 5 μL uzorka do 95 μL TBS.

4. Neredukovani uzorci su pripremljeni dodavanjem 5 μL 4X pufera uzorka do 15 μL uzorka.

5. Redukovani uzorci su pripremljeni dodavanjem 5 μL 4X pufera uzorka i 2 μL 10X redukcionog agensa do 13 μL uzorka.

6. Svi uzorci su zagrevani na 95°C tokom 5 minuta koristeći toplotni blok.

7. Zapremina 1 L 1X Tris-Acetat SDS koji se pokreće je pripremljen dodavanjem 50 mL Tris-Acetat SDS tekućeg pufera do 950 mL DI vode.

8. Zapremina 2L 1X MES tekućeg pufera je pripremljena dodavanjem 100 mL 20X MES SDS tekućeg pufera do 1900 mL DI vode.

9. Pufer za testiranje (Odyssey blokirajući pufera sa 0,2% Tween) pripremljen je dodavanjem 2 ml Tween-20 do 998 ml Odyssey blokirajućeg pufera.

10. Pufer za pranje (PBS sa 0,1% Tween) pripremljen je dodavanjem 1 paketa PBS i 1 ml Tween-20 do 900 ml DI vode. Rastvor je dobro pomešan i QS-van do 1 L pomoću DI vode. Krajnji rastvor je filtriran kroz 0,22 μM PES filtracioni sistem.

11. Na liniju 1 od četiri gela dodata je zapremina od 4 μL jednobojnog proteina.

12. Zapremina od 13 μl neredukovanih uzoraka dodata je odgovarajućim linijama 7% Tris-Acetat gela.

13. Zapremine 13 μL redukovanih uzoraka dodato je odgovarajućim linijama od 4-12% Bis-Tris gela.

14. Gelovi su pokrenuti na 125 volti u trajanju od ~75 minuta.

15. Svaki gel pojedinačno je premešten na membranu pomoću iBlot mini transfera i programa P0 na iBlot sistemu prenosa.

16. Svaka membrana je prebačena u plastičnu ladicu koja sadrži 20 mL Odyssey blokirajućeg pufera. Membrane su inkubirane u Odyssey blokirajućem puferu na mikseru ploča na sobnoj temperaturi u trajanju od 1 sata.

17. Prvobitni rastvor antitela 1 μg/mL je pripremljen dodavanjem 57,14 μL mišjeg anti-HMWK mAb, klon # 11H05, 1,4 mg/mL do 79,942,86 μL test pufera.

18. Blokirajući pufer je uklonjen iz plastičnih ladica. Zapremina od 20 mL primarnog rastvora antitela dodato je u svako ladicu, i membrane su inkubirane na mikseru ploča na sobnoj temperaturi u trajanju od 1 sata.

19. 1:10 međuproizvod kozjeg anti-mišjeg IgG IRDye680 je pripremljen dodavanjem 10 μL kozjeg anti-mišjeg IgG IRDye680 do 90 μL test pufera. Sekundarni rastvor antitela je pripremljen pri od 1:15.000 razblaženju dodavanjem 53,33 μL 1:10 kozjeg anti-mišjeg IgG IRDye680 međuproizvoda do 79,946.67 μL test pufera.

20. Primarni rastvor antitela je uklonjen iz ladica.

21. Svaka membrana je isprana tokom pet minuta sa 20 mL pufera za pranje, i zatim je odbačen rastvor za pranje. Pranje je ponovljeno za ukupno 4 pranja.

22. Zapremina od 20 mL sekundarnog rastvora antitela dodata je u svaku ladicu, i membrane su inkubirane na mikseru ploča na sobnoj temperaturi tokom 1 sata.

1

23. Sekundarni rastvor antitela je uklonjen iz ladica.

24. Svaka membrana je isprana tokom pet minuta sa 20 mL pufera za pranje, i zatim je odbačen rastvor za pranje. Pranje je ponovljeno za ukupno 4 pranja.

25. Svaka membrana je isprana sa PBS tokom 5 minuta.

26. Membrane su skenirane pomoću LiCor Odyssey CLx.

Rezultati:

[0211] Kao što se očekivalo, najveći broj uzoraka pacijenata pokazivao je povišeni nivo dvolančanog HMWK u uzorcima napada, nasuprot bazalnih uzoraka. Tabele 11 i 12 sadrže HAE podatke za ovaj eksperiment. Tabela 13 sadrži skup podataka za ulcerativni kolitis i uzorke pacijenata sa reumatoidnim artritisom. Tabela 14 sadrži podatke za uzorke pacijenata Kronove bolesti.

Tabela 11. Neredukovani uzorci HAE pacijenta, bazalni i napad, HMWK signali, procenat dvolančanih u liniji

2

Tabela 12. Redukovani uzorci HAE pacijenta, bazalni i napad, HMWK signali, procenat dvolančanih u liniji

% dvolančanog u liniji: zbir dvolančanog signala/zbir ukupnog signala linija

Tabela 13. Uzorci plazme od pojedinaca sa ulcerativnim kolitisom i reumatoidnim artritisom, HMWK signali, procenat dvolančanih u liniji

% dvolančanog u liniji: zbir dvolančanog signala/zbir ukupnog signala linija

4

Tabela 14. Uzorci plazme od pojedinaca sa Kronovom bolesti, HMWK signali, procenat dvolančanih u liniji

% dvolančanog u liniji: zbir dvolančanog signala/zbir ukupnog signala linija

OSTALA OTELOTVORENJA

[0212] Sve karakteristike opisane u ovoj specifikaciji mogu biti kombinovane u bilo kojoj kombinaciji. Svaka karakteristika obelodanjena u ovoj specifikaciji može biti zamenjena alternativnom karakteristikom koja služi istoj, ekvivalentnoj ili sličnoj svrsi. Stoga, osim ako nije izričito navedeno drugačije, svaka objavljena karakteristika je samo primer generičke serije ekvivalentnih ili sličnih karakteristika.

1

�

4

Claims (13)

Patentni zahtevi

1. Postupak za identifikovanje pacijenta pod rizikom za razvojem, ili koji ima poremećaj, kalikreina plazme (pKal), gde postupak sadrži:

merenje nivoa razdvojenog kininogena visoke molekulske mase (HMWK), i po izboru nivoa netaknutog (HMWK) u uzorku pacijenta;

određivanje vrednosti razdvojenog HMWK; i

identifikovanje pacijenta kao rizičnog za poremećaje posredovane sa pKal, ako je vrednost razdvojenog HMWK iznad referentne vrednosti, gde se referentna vrednost odnosi na vrednost razdvojenog HMWK kod zdravog pacijenta;

i gde je poremećaj posredovan sa pKal nasledni angioedem (HAE), reumatoidni artritis, ulcerativni kolitis ili Kronova bolest.

2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, gde je vrednost razdvojenog HMWK procenat razdvojenog HMWK u uzorku.

3. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-2, gde su nivoi razdvojenog HMWK i opciono netaknutog HMWK izmereni agensom za detektovanje, koji specifično vezuje razdvojen HMWK u poređenju sa netaknutim HMWK, ili specifično vezuje netaknut HMWK u poređenju sa razdvojenim HMWK, gde opciono agens za detektovanje ne vezuje kininogen niske molekulske mase (LMWK).

4. Postupak prema patentnom zahtevu 3, gde je agens za detektovanje antitelo; poželjno gde antitelo specifično vezuje razdvojeni HMWK u poređenju sa netaknutim HMWK, i opciono, ne vezuje LMWK, poželjnije gde je agens za detektovanje antitelo koje se vezuje za C-terminus lakog lanca razdvojenog HMWK.

5. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, gde su nivoi netaknutog HMWK i razdvojenog HMWK mereni Western blot testom.

6. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, gde je uzorak krvi ili uzorak plazme.

7. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, gde pacijent ima simptom poremećaja posredovanog sa pKal; ili gde je pacijent otporan na anti-histamin terapiju, terapiju kortikosteroidom ili obe.

8. Postupak prema patentnom zahtevu 7, gde je simptom edem.

9. Postupak prema patentnom zahtevu 7, gde je simptom:

ponavljajući napadi otoka;

oticanje gde je navedeno oticanje potpuno ili pretežno periferno; koprivnjača; crvenilo, bol i otok u odsustvu dokaza o infekciji; ili

edem koji nije posredovan histaminom.

10. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, gde pacijent nema simptom poremećaja posredovanog sa pKal u vreme sakupljanja uzorka, nema istoriju simptoma poremećaja posredovanog sa pKal ili nema istoriju poremećaja posredovanog sa pKal.

11. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva koji dalje sadrži utvrđivanje da li je poremećaj podložan tretmanu sa inhibitorom pKal, gde je poremećaj podložan tretmanu sa inhibitorom pKal ako je vrednost razdvojenog HMWK iznad referentne vrednosti.

12. Postupak za procenu tretmana poremećaja posredovanog sa pKal kod pacijenta, gde postupak sadrži:

merenje nivoa razdvojenog HMWK i po izboru nivoa netaknutog HMWK u uzorcima prikupljenim od pacijenta pre i nakon tretmana, ili tokom tretmana;

određivanje vrednosti razdvojenog HMWK u svakom uzorku na osnovu na nivoima razdvojenog i opciono netaknutog HMWK u istom uzorku; i

procenjuje efikasnost lečenja na osnovu na promena vrednosti razdvojenog HMWK u uzorcima pre i nakon tretmana ili tokom tretmana,

gde je poremećaj posredovan sa pKal nasledni angioedem (HAE), reumatoidni artritis, ulcerativni kolitis ili Kronova bolest.

13. Farmaceutski sastav za upotrebu u lečenju bolesti posredovane sa pKal kod pacijenta, gde sastav sadrži inhibitor pKal i farmaceutski prihvatljiv nosač, gde pacijent ima vrednost razdvojenog kininogena visoke molekulske mase (HMWK) koja je iznad referentne vrednosti, koja se odnosi na vrednost razdvojenog HMWK kod zdravog pacijenta; i gde je bolest posredovana sa pKal nasledni angioedem (HAE), reumatoidni artritis, ulcerativni kolitis ili Kronova bolest.