RS57937B1 - Komponente ćelijskog zida kvasca i njihova detekcija - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ova prijava zahteva prioritet od privremene SAD patentne prijave serijski br.

61/334,995 podnete 14.05.2010. godine.

OBLAST PRONALASKA

[0002] Pronalazak se odnosi na postupke za imunološku detekciju komponenti ćelije kvasca.

OSNOVA PRONALASKA

[0003] U oblasti ishrane životinja, upotrebljava se širok spektar aditiva i dodataka za poboljšanje produktivnosti stoke. U nekim slučajevima, komponente ćelijskog zida kvasca koriste se kao aditivi u stočnoj hrani. Jedan primer predstavlja aditiv stočne hrane MYCOSORB (koji proizvodi ALLTECH, Inc.). MYCOSORB vezuje kontaminante u vidu mikotoksina u hrani i stočnoj hrani, izolujući tako mikotoksine u nesvarljivom stanju. Takvi kontaminanti u vidu mikotoksina obično se javljaju zbog rasta gljivica, kako na polju, tako i nakon žetve, na žitaricama, sporednim proizvodima žitarica i kukuruznoj silaži koja se koristi kao hranivo. Mada se sirovi i gotovi sastojci stočne hrane koji se prodaju komercijalno podvrgavaju neophodnoj kontroli mikotoksina, nijedan sistem kontrole nije 100% efikasan. Širom sveta, procenjeno je da je približno 25% svih useva pogođeno kontaminacijom mikotoksinima (Council for Agricultural Science and Technology (1989) "Mycotoxins: Economics and Health Risks", Task Force Report No. 116, Ames, IA), i stoga su gotovo neizbežni incidenti u kojima kontaminirani materijali ulaze u lanac snabdevanja stočnom hranom za stoku i kućne ljubimce. Posledice konzumiranja stočne hrane koja je kontaminirana mikotoksinom po stoku uključuju smanjeni apetit, redukovani rast, redukovanu reproduktivnu funkciju i davanje mleka, supresiju imunskog sistema, poremećeno varenje i u težim slučajevima smrt. Iz tog razloga, izolovanje mikotoksina se pokazalo kao korisna strategija za smanjenje opasnosti od prirodnih toksina koji negativno utiču na životinjsko i ljudsko zdravlje.

[0004] Razvijanje robusnih, specifičnih analitičkih postupaka i kompleta za kvalitativnu i kvantitativnu detekciju aditiva stočne hrane usložnjava se prisustvom mnogih interferirajućih jedinjenja, i relativno niskom koncentracijom aditiva stočne hrane koja se koristi u proizvodnji stočne hrane spremne za životinjsku upotrebu. Kwiatkowski et al., Journal of the Institute of Brewing, vol. 115, no. 2, pp 151-158, 2009, opisuje sve različite glukane zida Saccharomyces cerevisiae.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0005] Predmet pronalaska je kao što je definisano u priloženim patentnim zahtevima.

[0006] Predmetni pronalazak se odnosi na postupke za imunološku detekciju komponenti ćelijskog zida kvasca. U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je postupak za detekciju komponente ćelijskog zida kvasca i/ili njegovog fragmenta u uzorku (npr., uzorcima stočne hrane, uzorcima hrane, ili njihovim ekstraktima). Takav postupak nalazi upotrebu u, na primer, određivanju prisustva aditiva hrane i stočne hrane sačinjenih od komponenti ćelijskog zida kvasca (npr., glukan kvasca, (1→4)-α-D-glukan kvasca, (1→6)-β-D-glukan kvasca, (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan kvasca, aditiv stočne hrane MYCOSORB, aditiv stočne hrane BIOMOSS, aditiv stočne hrane ACTIGEN, i slično) u proizvodima stočne hrane (npr., stočna hrana, hrana za kućne ljubimce, ili međuproizvodi navedenog). Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi na postupak za detekciju ćelijskog zida kvasca u uzorku, koji obuhvata:

- obezbeđivanje uzorka;

- izlaganje navedenog uzorka primarnom antitelu sposobnom da veže antigen izabran iz grupe koja se sastoji od (I→4)-α-D-glukana, (I→6)-β-D-glukana i (I→4)-α-/(I→6)-β-D-glukana čime se formira kompleks primarno antitelo-antigen; i

- detekciju stepena vezivanja između navedenog primarnog antitela i navedenog antigena upotrebom sekundarnog antitela.

U nekim aspektima opisa, predmetna prijava se odnosi na postupke za ekstrakciju komponenti ćelijskog zida kvasca (npr., glukan kvasca, (1→4)-α-D-glukan kvasca, (1→6)-β-D-glukan kvasca, (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan kvasca, aditiv stočne hrane MYCOSORB, i slično) iz proizvoda stočne hrane (npr., stočne hrane, hrane za kućne ljubimce, ili njihovih međuproizvoda). Prijava opisuje antigene koji se koriste za dobijanje antitela na specifične komponente ćelijskog zida kvasca (npr., (1→4)-α-D-glukan kvasca, (1→6)-β-D-glukan kvasca, (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan kvasca, i/ili njihove konjugate). U nekim aspektima opisa, takvi antigeni su konjugovani sa nosačem, npr., proteinskim nosačem (npr., goveđi serum albumin (BSA)). U nekim primerima izvođenja, prijava opisuje obezbeđene postupke za aktivaciju ugljenih hidrata (npr., ugljeni hidrati koji sadrže glukopiranozne prstenove, glukane, (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan kvasca) na položaju/položajima C6-OH. U nekim aspektima opisa, takva aktivacija obuhvata blagu oksidaciju (npr., upotrebom dimetilsulfoksida/ anhidrida sirćetne kiseline). U nekim primerima izvođenja, prijava opisuje antitela sposobna da prepoznaju antigene ćelijskog zida kvasca (npr., monoklonska ili poliklonska antitela sposobna da prepoznaju (1→4)-α-D-glukan kvasca, (1→6)-β-D-glukan kvasca, (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan kvasca, ili njihove konjugate; monoklonska antitela 513A161.1 ili 513A431.1 protiv (1→4)-α-D-glukan/(1,6)-β-D-glukan/BSA antigena; poliklonska antitela protiv (1→4)-α-D-glukan/(1→6)-β-D-glukan/BSA antigena; ili njihove prečišćene, razblažene, konjugovane, i/ili monospecifične oblike). Sledeći aspekti opisa su kompleti koji sadrže reagense za detekciju komponenti ćelijskog zida kvasca (npr., glukan kvasca, (1→4)-α-D-glukan kvasca, (1→6)-β-D-glukan kvasca, (1→4)-α-/(1→6)β-D-glukan kvasca, aditiv stočne hrane MYCOSORB, i slično) u uzorcima (npr., uzorci stočne hrane, uzorci hrane, ili njihovi ekstrakti).

[0007] Uzorak predstavlja, ili potiče iz, proizvoda u vidu hrane ili stočne hrane. Proizvod u vidu hrane ili stočne hrane sadrži bilo koji materijal(e) koji konzumira (npr., životinja) koji doprinosi energiji i/ili nutrijentima u ishrani. Primeri hraniva obuhvataju, ali bez ograničenja, potpuni mešani obrok (TMR), krmno bilje, pelete, koncentrat(e), koproizvod(e) gotove smeše, žitarice, žitnu džibru, melasu, vlakno/vlakna, kabastu stočnu hranu, travu/trave, seno, jezgro/jezgra zrna, lišće, brašno, rastvorljivu supstancu/supstance i dodatak/dodatke. Hraniva i komponente hrane nisu ograničene svojim fizičkim oblikom. Hraniva i komponente hrane mogu da budu obrađene do manje veličine čestica (npr., iskidane, iseckane, zdrobljene, samlevene, ili slično); napravljene u tečnom obliku (npr., ekstrahovane, kuvane, koncentrovane, pretvorene u sirup ili druge viskozne oblike); ili prerađene do veće veličine (npr., presovane u bale, učvršćene, sabijene, ili formirane u složene oblike, npr., pelete, blokove, kocke, ljuspice, i slično).

[0008] Predmetni pronalazak nije ograničen vrstom ili prirodom postupka za ekstrakciju koji je korišćen za dobijanje uzoraka za ispitivanje. U nekim primerima izvođenja, originalni materijal za ispitivanje (npr., proizvod u vidu hrane ili stočne hrane; hranivo) podvrgava se tehnici ekstrakcije za dobijanje uzorka za ispitivanje. Tehnike ekstrakcije uključuju, ali nisu ograničene na kiselu ekstrakciju, alkalnu ekstrakciju, ekstrakciju organskim rastvaračem, ekstrakciju puferom, ekstrakciju solju, ekstrakciju deterdžentom, fizičku ekstrakciju (npr., kuvanje, ekstrakcija parom, ekstrakcija niskom temperaturom, usitnjavanje, i slično), ili njihovom kombinacijom. U nekim primerima izvođenja, materijal za ispitivanje (npr., proizvod u vidu hrane ili stočne hrane; hranivo) se ekstrahuje upotrebom kombinacije organskog rastvarača i rastvora kiseline. U nekim primerima izvođenja, materijal za ispitivanje (npr., proizvod u vidu hrane ili stočne hrane; hranivo) ekstrahuje se upotrebom rastvora dimetilsulfoksida (DMSO) i hlorovodonične kiseline (HCl).

[0009] Predmetni pronalazak nije ograničen količinom analita (npr., antigen, komponenta ćelijskog zida kvasca, glukan kvasca, (1→4)-α-D-glukan kvasca, (1→6)-β-D-glukan kvasca, (1→4)-α-(1→6)-β-D-glukan kvasca, aditiv stočne hrane MYCOSORB, i slično) prisutnog u originalnom uzorku. Količina analita može da bude manja od 0.005 mg, 0.005-0.05 mg, 0.05-0.5 mg, 0.5-1 mg, 1-5 mg, 5-10 mg, 10-25 mg, 25 mg ili veća. Predmetni pronalazak nije ograničen količinom analita (npr., antigen, komponenta ćelijskog zida kvasca, glukan kvasca, (1→4)-α-D-glukan kvasca, (1→6)-β-D-glukan kvasca, (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan kvasca, aditiv stočne hrane MYCOSORB, i slično) prisutnog u originalnom materijalu koji treba da se ispita. Količina detektovanog analita može da bude manja od 0.05 kg po toni, 0.05-0.5 kg po toni, 0.5-1 kg po toni, 1.0-2.0 kg po toni, 2.0-3.0 kg po toni, 3.0-4.0 kg po toni, 4.0-5.0 kg po toni, 5.0-6.0 kg po toni, 6.0-10.0 kg po toni, 10 kg po toni ili veća.

[0010] Predmetni pronalazak nije ograničen radnom koncentracijom antitela upotrebljenog za detekciju analita (npr., npr., antigen, komponenta ćelijskog zida kvasca, glukan kvasca, (1-4)-α-D-glukan kvasca, (1→6)-β-D-glukan kvasca, (1→4)α-/(1→6)-β-D-glukan kvasca, aditiv stočne hrane MYCOSORB, i slično). Radno razblaženje antitela (npr., monoklonska ili poliklonska antitela sposobna da prepoznaju (1→4)-α-D-glukan kvasca, (1→6)-β-D-glukan kvasca, (1→4)-α-/(1→6)β-D-glukan kvasca, ili njihove konjugate; monoklonska antitela 513A161.1 ili 513A431.1 protiv (1→4)-α-D-glukan/(1→6)-β-D-glukan/BSA antigena; poliklonska antitela protiv (1→4)-α-D-glukan/(1→6)-β-D-glukan/BSA antigena; ili njihove prečišćene, razblažene, konjugovane, i/ili monospecifične forme) može da bude razblaženije od 1:100000; 1:50000 do 1:100000; 1:20000 do 1:50000; 1:10000 do 1:20000; 1:5000 do 1:10 000; 1:1000 do 1:5000; 1:500 do 1:1000; 1:100 do 1:500; 1:50 do 1:100; 1:10-1:50; 1:1 do 1:10; 2:1 do 1:1; ili koncentrovanije od 2:1.

[0011] Dodatno je opisana imunogena kompozicija koja sadrži komponente ćelijskog zida kvasca. U nekim aspektima opisa komponenta ćelijskog zida kvasca sadrži glukan kvasca. U nekim aspektima opisa, glukan sadrži (1→4)-α-D-glukan kvasca, (1→6)-β-D-glukan kvasca, (1→4)-α-(1→6)-β-D-glukan kvasca, ili konjugate ili derivative navedenog. U nekim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje (1→6)-β-D-glukan kvasca, (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan kvasca konjugovan sa nosačem (npr., proteinskim nosačem). Nosači mogu da olakšaju imunogenost i/ili stabilnost u životinji-domaćinu. Primeri nosača uključuju, ali nisu ograničeni na goveđi serum albumin (BSA), hemocijanin prilepka (KLH), ovalbumin (OVA), goveđi tiroglobulin (THY) i antigen jezgra hepatitisa B patke (DHBcAg) (Gathuru et al. (2005) Vaccine 23:4727-4733). Opis nije ograničen položajem veze između antigena i nosača. U nekim aspektima opisa, antigen (npr., ugljenohidratni antigen, glukan, ugljeni hidrat koji sadrži glukopiranozni prsten(ove), (1→4)-α-D-glukan kvasca, (1→6)-β-D-glukan kvasca, (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan kvasca) je konjugovan sa nosačem na jednom ili više O-6 položaja u odnosu na antigen. U nekim aspektima opisa, antigen je (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan kvasca konjugovan sa BSA na C6 položaju.

[0012] Antitela korišćena u postupku predmetnog pronalaska nisu ograničena vrstom domaćina u kome nastaju. Vrsta domaćina može da bude, miš, zamorac, hrčak, zec, koza, ovca, kokoška, magarac, konj, govedo, pas, mačka, svinja, majmun, čovek, ili bilo koja druga vrsta. Antitela korišćena u postupku predmetnog pronalaska nisu ograničena režimom inokulacije, postupkom za pripremu antigena, ili postupkom za isporuku antigena koji se koristi za dobijanje antitela. Antigen može da bude prezentovan u prisustvu ili odsustvu imuno-stimulatornih sredstava (npr., adjuvanasa), pufera, soli, rastvarača, jedinjenja za poboljšanje rastvorljivosti, ili slično. Vrsta-domaćin može da imunizovana antigenom jednom; dva puta; tri puta; četiri puta; pet puta, 5-10 puta; 10-20 puta; ili više od 20 puta. Antitela korišćena u postupku predmetnog pronalaska nisu ograničena klonalnošću (npr., monoklonska, poliklonska). Antitela mogu da se koriste u sirovom ili prečišćenom obliku. Antitela mogu da budu polispecifična ili monospecifična. U poželjnim primerima izvođenja, antitela korišćena u postupku prema pronalasku su sposobna za specifično prepoznavanje antigena koji je korišćen za njihovo dobijanje. U nekim poželjnim primerima izvođenja, antitela korišćena u postupku predmetnog pronalaska su sposobna da specifično prepoznaju (1→4)-α-D-glukan/(1→6)-β-D-glukan ekstrahovan iz ćelijskih zidova kvasca (npr., Saccharomyces cerevisiae). U nekim poželjnim primerima izvođenja, antitela korišćena u postupku predmetnog pronalaska obuhvataju poliklonska antitela. U nekim primerima izvođenja, monoklonska ili poliklonska antitela korišćena u postupku predmetnog pronalaska sposobna su da prepoznaju (1→4)-α-D-glukan kvasca, (1→6)-β-D-glukan kvasca, (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan kvasca, ili njihove fragmente, varijante ili konjugate. U nekim aspektima opisa, kompozicije antitela vezuju (1→4)-α-D-glukan ćelijskog zida kvasca, ali ne i fragmente koji sadrže (1→4)-α-D-glukan prisutne u supstancama drugačijim od polimera koji sadrže (1→4)-α-D-glukan ćelijskog zida kvasca (npr., (1→4)-α-D-glukan ćelijskog zida kvasca, (1→4)α-/(1→6)-β-D-glukan ćelijskog zida kvasca, ili njihovi fragmenti, varijante ili konjugati). Dodatno su opisane, kompozicije antitela koje vezuju (1→6)-β-D-glukan ćelijskog zida kvasca, ali ne i fragmente koji sadrže (1→6)-β-D-glukan prisutne u supstancama drugačijim od polimera koji sadrže (1→6)-β-D-glukan ćelijskog zida kvasca (npr., (1→6)-β-D-glukan ćelijskog zida kvasca, (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan ćelijskog zida kvasca, ili njihovi fragmenti, varijante ili konjugati). U nekim aspektima opisa, kompozicije antitela vezuju (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan ćelijskog zida kvasca, ali ne i fragmente koji sadrže (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan prisutne u supstancama drugačijim od ćelijskog zida kvasca (npr., (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan ćelijskog zida kvasca, ili njegovi fragmenti, varijante ili konjugati).

[0013] Neki postupci za detekciju antigena prema predmetnom pronalasku obuhvataju metode imunodetekcije. U nekim poželjnim primerima izvođenja, metode imunodetekcije obuhvataju ELISA metod. U nekim primerima izvođenja, ELISA se izvodi upotrebom uzorka dobijenog iz originalnog materijala koji se ispituje (npr., proizvod u vidu hrane ili stočne hrane; hranivo; ekstrakt navedenog) i primarnog antitela (npr., antitelo sposobno da prepozna komponentu ćelijskog zida kvasca; antitelo sposobno da prepozna glukan kvasca; antitelo sposobno da prepozna (1→4)-α-D-glukan kvasca, (1→6)-β-D-glukan kvasca, i/ili (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan kvasca. U nekim primerima izvođenja, antitelo je neposredno spojeno sa supstancom sposobnom da stvori detektabilni signal (npr., hromogena supstanca, fluorogena supstanca, radioobeleženi izotop, itd.). U nekim primerima izvođenja, antitelo se direktno ili indirektno udružuje sa drugim sredstvom sposobnim da stvori detektabilni signal (npr., hromogena supstanca, fluorogena supstanca, radioobeleženi izotop, itd.).

[0014] Prijava opisuje komplete za detekciju analita (npr., antigen, komponenta ćelijskog zida kvasca, glukan kvasca, (1→4)-α-D-glukan kvasca, (1→6)-β-D-glukan kvasca, i/ili (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan kvasca) u uzorku (npr., proizvod u vidu hrane ili stočne hrane; hranivo, ekstrakt navedenog). Komponente kompleta mogu da uključuju, ali nisu ograničene na reagense, ekstrakcione pufere, rastvarače, deterdžente, sredstva za blokiranje, epruvete, antitela, standarde, uputstva, i bilo koju kombinaciju navedenog.

[0015] U nekim primerima izvođenja, prijava obezbeđuje usluge u kojima se informacija o koncentraciji analita (npr., antigena, komponente ćelijskog zida kvasca, glukana kvasca, (1→4)-α-D-glukana kvasca, (1→6)-β-D-glukana kvasca, i/ili (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukana kvasca) dobija za originalni materijal za ispitivanje (npr., proizvod u vidu hrane ili stočne hrane; hranivo, ekstrakt navedenog). U nekim aspektima opisa, ispitivanje sprovodi krajnji korisnik (npr., farmer, vlasnik stoke, osoba koja vodi brigu o stoci, uzgajivač stoke, vlasnik kućnih ljubimaca, osoba koja vodi brigu o kućnim ljubimcima, uzgajivač kućnih ljubimaca, veterinar, proizvođač proizvoda u vidu stočne hrane ili hrane, distributer proizvoda u vidu stočne hrane ili hrane, nadležni službenik). U nekim aspektima opisa, uzorak ili originalni materijal krajnji korisnik (npr., farmer, vlasnik stoke, osoba koja vodi brigu o stoci, uzgajivač stoke, vlasnik kućnih ljubimaca, osoba koja vodi brigu o kućnim ljubimcima, uzgajivač kućnih ljubimaca, veterinar, proizvođač proizvoda u vidu stočne hrane ili hrane, distributer proizvoda u vidu stočne hrane ili hrane, nadležni službenik) predaje trećoj strani, i treća strana sprovodi ispitivanje. U nekim aspektima opisa, treća strana prenosi informacije o rezultatima analize krajnjem korisniku (npr., farmer, vlasnik stoke, osoba koja vodi brigu o stoci, uzgajivač stoke, vlasnik kućnih ljubimaca, osoba koja vodi brigu o kućnim ljubimcima, uzgajivač kućnih ljubimaca, veterinar, proizvođač proizvoda u vidu stočne hrane ili hrane, distributer proizvoda u vidu stočne hrane ili hrane, nadležni službenik). U nekim aspektima opisa, treća strana prenosi informacije o rezultatima analize četvrtoj strani.

[0016] Dodatni primeri izvođenja i aspekti opisa će biti očigledni stručnjacima u odgovarajućoj oblasti na osnovu ovde sadržanog izlaganja.

OPIS CRTEŽA

[0017]

Slika 1 prikazuje šematski dijagram proizvodnje frakcija P1, P2, P3 i S1, S2 i S3 (videti, npr., primer 1).

Slika 2 prikazuje odgovor originalnog zečjeg antiseruma i četiri supernatanta afinitetno prečišćenih antiseruma. Afinitetno-prečišćeni antiserumi su dobijeni izdvajanjem antitela (Gab 1-Gab4) specifičnih za β-(1,6)-glukan u mikrotitracionim pločama obloženim sa BSA (videti, npr., primer 3).

Slika 3 prikazuje kalibracionu krivu konstruisanu upotrebom prečišćenih anti-(1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan-BSA poliklonskih zečjih antitela dobijenih korišćenjem postupaka koji su ovde opisani (videti, npr., primere 2 i 3).

Slika 4 prikazuje prosečnu standardnu krivu iz 5 testova izvedenih sa 6 nivoa uključenosti proizvoda MYCOSORB u materijalu stočne hrane za mlečnu stoku. Sekundarna y-osa ističe preciznost ponovljivosti u istom danu (% CVintra) i između različitih dana (% CVinter) za standardne krive.

Slika 5 prikazuje prosečnu standardnu krivu iz 5 testova izvedenih sa 6 nivoa uključenosti proizvoda MYCOSORB u materijalu hrane za piliće. Sekundarna y-osa ističe preciznost ponovljivosti u istom danu (% CVintra) i između različitih dana (% CVinter) za standardne krive.

Slika 6 prikazuje prosečnu standardnu krivu iz 5 testova izvedenih sa 6 nivoa uključenosti proizvoda MYCOSORB u materijalu stočne hrane za svinje. Sekundarna y-osa ističe preciznost ponovljivosti u istom danu (% CVintra) i između različitih dana (% CVinter) za standardne krive.

Slika 7 prikazuje razlike u prosečnim očitavanjima optičke gustine (ΔOD450) interferirajućeg proizvoda, oduzete od signala proizvoda MYCOSORB dobijenog za hranu za piliće i obrazac raspodele na nekoliko mikrotitarskih ploča (primer 7). Interferirajući proizvodi su dodati u koncentraciji od 50, 100, 200% (tež./tež.) pored proizvoda MYCOSORB (100%, 1.0 kg/T).

Slika 8 prikazuje razlike u prosečnim očitavanjima optičke gustine (ΔOD450) interferirajućeg proizvoda, oduzete od signala proizvoda MYCOSORB dobijenog za hranu za piliće i obrazac raspodele na jednoj mikrotitarskoj ploči (primer 7). Interferirajući proizvodi su dodati u koncentraciji od 50, 100, 200% (tež./tež.) pored proizvoda MYCOSORB (100%, 1.0 kg/T).

Slika 9 prikazuje rezultate testa ELISA koji ukazuju na unakrsnu reaktivnost monoklonskog antitela 513A161.1 u koncentraciji od 1:100 (pri vrhu) ili 1:200 (pri dnu).

Slika 10 prikazuje rezultate testa ELISA koji ukazuju na unakrsnu reaktivnost monoklonskog antitela 513A161.1 u koncentraciji od 1:500 (pri vrhu) ili 1:1000 (pri dnu).

Slika 11 prikazuje rezultate testa ELISA koji ukazuju na unakrsnu reaktivnost monoklonskog antitela 513A161.1 u koncentraciji od 1:1500 (pri vrhu) ili 1:2000 (pri dnu).

Slika 12 prikazuje rezultate testa ELISA koji ukazuju na unakrsnu reaktivnost monoklonskog antitela 513A161.1 u koncentraciji od 1:100 (pri vrhu) ili 1:200 (pri dnu).

Slika 13 prikazuje rezultate testa ELISA koji ukazuju na unakrsnu reaktivnost monoklonskog antitela 513A161.1 u koncentraciji od 1:500 (pri vrhu) ili 1:1000 (pri dnu).

Slika 14 prikazuje rezultate testa ELISA koji ukazuju na unakrsnu reaktivnost monoklonskog antitela 513A161.1 u koncentraciji od 1:1500 (pri vrhu) ili 1:2000 (pri dnu).

Slika 15 prikazuje prosečna očitavanja apsorpcije u ELISA testu i standardne devijacije tri standarda ekstrakta ćelijskog zida kvasca prikazana nerazblažena ili razblažena 1:1 u PBS ili PBS 3% nemasnom mleku u prahu (primer 6).

Slika 16 prikazuje grafik standardnih krivih za ekstrakt stočne hrane za vreme i temperaturu inkubacija za oblaganje mikrotitarske ploče za ELISA test opisan u primeru 6.

DEFINICIJE

[0018] Da bi se olakšalo razumevanje predmetnog pronalaska, brojni pojmovi i izrazi su definisani u nastavku teksta:

Kako se ovde koristi, pojmovi "peptid", "polipeptid" i "protein" se odnose na primarnu sekvencu aminokiselina koji su spojene kovalentnim "peptidnim vezama". Uopšteno, peptid se sastoji od nekoliko aminokiselina, tipično od 2-50 aminokiselina, i kraći je od proteina. Pojam "polipeptid" obuhvata peptide i proteine. U nekim primerima izvođenja, peptid, polipeptid ili protein su sintetskog porekla, dok su u drugim primerima izvođenja, peptid, polipeptid ili protein rekombinantni ili prirodnog porekla. Sintetski peptid je peptid je proizveden veštačkim sredstvima in vitro (tj., nije proizveden in vivo).

[0019] Pojam "glikoprotein(i)" ili "glikopeptid(i)" se odnosi na protein ili peptid koji sadrži jednu ili više ugljenohidratnih rezidua kovalentno vezanih za polipeptidni lanac. Pojam "selenoprotein(i)" ili "selenopeptid(i)" se odnosi na protein ili peptid koji sadrži jedan ili više atoma selena. Tipično, atomi selena su ugrađeni u proteine u okviru aminokiselina koje sadrže selen uključujući selenocistein i selenometionin.

[0020] Pojam "selenoglikoprotein(i)", "selenoglikopeptid(i)" ili "SGP" se odnosi na glikoprotein ili glikopeptide koji sadrže jedan ili više atoma selena. Tipično, "selenoglikoproteini" sadrže jednu ili više aminokiselina koje sadrže selen. "Selenoglikoproteini" mogu da sadrže brojne ugljene hidrate u bilo kom broju različitih oblika.

[0021] Pojmovi "uzorak" i "primerak" se koriste u svom najširem smislu i obuhvataju uzorke ili primerke dobijene iz bilo kog izvora. Kako se ovde koristi, pojam "uzorak" koristi se da označi biološke uzorke dobijene od životinja (uključujući ljude), i obuhvata fluide, čvrste uzorke, tkiva i gasove. U nekim primerima izvođenja ovog pronalaska, uzorci uključuju uzorke koji sadrže materiju iz biljke (silaža, zrno, obrađena stočna hrana, proizvodi stočne hrane u intermedijernim fazama proizvodnje). Međutim, ove primere ne treba razumeti kao ograničavajuće za vrste uzoraka koji mogu da se upotrebe sa predmetnim pronalaskom.

[0022] Kako se ovde koristi, pojam "kvasac" i "ćelije kvasca" se odnosi na eukariotske mikroorganizme klasifikovane u carstvo gljiva, koji imaju ćelijski zid, ćelijsku membranu i intracelularne komponente. Kvasci ne obrazuju specifične taksonomske ili filogenetske grupe. Trenutno je poznato oko 1 500 vrsta; procenjuje se da je samo 1% od svih vrsta kvasaca opisano. Pojam "kvasac" se često uzima kao sinonim za S. cerevisiae, ali filogenetska raznolikost kvasaca je pokazana njihovim svrstavanjem u dva razdela Ascomycota i Basidiomycota. Pojam "kvasac" obuhvata pivski kvasac, destilerijski kvasac i pekarske kvasce. Kvasci koji se odlikuju pupljenjem ("pravi kvasci") su klasifikovani u red Saccharomycetales. Većina vrsta kvasca se razmnožava aseksualno pupljenjem, mada se neki razmnožavaju binarnom deobom. Kvasci su jednoćelijski, mada neke vrste postaju višećelijske obrazovanjem niza povezanih ćelija koje pupe poznatog kao pseudohife, ili lažne hife. Veličina kvasca može znatno da varira u zavisnosti od vrste, tipično iznosi 3-4 µm u prečniku, mada neki kvasci mogu da dostignu preko 40 µm. Kako se ovde koristi, pojam "ćelijski zid kvasca" označen i kao "YCW" odnosi se na ćelijski zid organizma kvasca koji okružuje plazma-membranu i intracelularne komponente kvasca. Ćelijski zid kvasca uključuje i spoljašnji sloj (uglavnom manan) i unutrašnji sloj (uglavnom glukan i hitin) ćelijskog zida kvasca. Uloga ćelijskog zida je da obezbedi strukturu i zaštiti unutrašnjost kvasca (centar njegove metaboličke aktivnosti). Signalni i putevi prepoznavanja se odvijaju u ćelijskom zidu kvasca. Sastav ćelijskog zida kvasca varira od soja do soja i u skladu sa uslovima u kojima kvasac raste.

[0023] Kako se ovde koristi, pojam "ekstrakt ćelijskog zida kvasca" se odnosi na ćelijski zid kvasca koji je raskinut ili "liziran" (npr., tokom stadijuma raskidanja i liziranja) i odvojen od rastvorljivih intracelularnih komponenti ćelije kvasca.

[0024] Kako se ovde koristi, pojam tež./tež. (težinski/težinski) se odnosi na količinu date supstance u kompoziciji na bazi težine. Na primer, stočna hrana za životinje koja sadrži 0.02% tež./tež. dijetetskog dodatka stočnoj hrani prema pronalasku, označava da masa dijetetskog dodatka stočnoj hrani iznosi 0.02% od ukupne mase stočne hrane za životinje (npr., 200 grama kompozicije prema pronalasku dijetetskog dodatka stočnoj hrani u 907 200 grama stočne hrane za životinje).

[0025] Kako se ovde koristi, pojam "prečišćen" ili "prečistiti" se odnosi na uklanjanje komponenti iz uzorka. Na primer, ćelijski zidovi kvasca ili ekstrakti ćelijskog zida kvasca se prečišćavaju uklanjanjem komponenti koje nisu komponente ćelijskog zida kvasca (npr., plazma membrane i/ili intracelularnih komponenti kvasca); takođe se prečišćavaju uklanjanjem kontaminanata ili agenasa koji nisu ćelijski zid kvasca. Uklanjanje komponenti koje nisu komponente ćelijskog zida kvasca i/ili kontaminanata koji nisu ćelijski zid kvasca rezultuje u povećanju procenta ćelijskog zida kvasca ili njegovih komponenti u uzorku. Na molekulskom nivou, pojam "prečišćeni" se odnosi na molekule (npr., ugljeni hidrati, glikoproteini) koji su uklonjeni, izolovani ili izdvojeni iz svog prirodnog okruženja. "Izolovani ugljeni hidrat" može stoga da bude prečišćeni ugljeni hidrat. "Suštinski prečišćeni" molekuli su bar 60%, poželjno bar 75%, i još poželjnije 90% lišeni drugih komponenti sa kojima su prirodno udruženi. Kako se ovde koristi, pojam "prečišćen" ili "prečistiti" se takođe odnosi na uklanjanje kontaminanata iz uzorka. Uklanjanje kontaminirajućih proteina rezultuje u povećanju procenta polipeptida od interesa u uzorku. Dodatno, rekombinantni polipeptidi (npr., glikoproteini) se eksprimiraju ili se prečišćavaju iz biljnih, bakterijskih, ćelija kvasca, ili sisarskih ćelija-domaćina, i polipeptidi se prečišćavaju uklanjanjem proteina ćelije-domaćina; procenat rekombinantnih polipeptida se na taj način povećava u uzorku. Kako se ovde koristi, pojam "životinja" se odnosi na carstvo životinja. To uključuje, ali nije ograničeno na stoku, životinje sa farme, domaće životinje, kućne ljubimce, morske i slatkovodne životinje i divlje životinje.

[0026] Kako se ovde koristi, pojam "stoka", takođe označen i kao "vrste stoke", označen i kao "domaća stoka" i kao "komercijalno gajene životinje" odnosi se na domaće životinje sa namerom odgajane u poljoprivrednom ili akvakulturnom okruženju za proizvodnju hrane ili vlakna, ili za rad ili kao društvo.

[0027] Kako se ovde koristi, pojmovi "dodatak hrani" "dijetetski dodatak" "kompozicija dijetetskog dodatka", i slično, odnosi se na proizvod u vidu hrane formulisan kao dijetetski ili nutritivni dodatak za upotrebu kao deo dijete, npr. kao dodatak stočnoj hrani za životinje. Primeri kompozicija dijetetskog dodatka su ovde opisani.

[0028] Kako se ovde koristi, pojam "komplet" se koristi u vezi sa kombinacijom reagenasa i drugih materijala. Podrazumeva se da komplet može da uključuje reagense kao što su rastvori za ekstrakciju, antitela i reagensi za detekciju. Nije predviđeno da pojam "komplet" bude ograničen na određenu kombinaciju reagenasa i/ili drugih materijala.

[0029] Kako se ovde koristi, pojam "toksično" se odnosi na bilo koja štetna ili škodljiva dejstva na subjekat, ćeliju, ili tkivo, u poređenju sa istom ćelijom ili tkivom pre primene toksičnog sredstva.

[0030] Kako se ovde koristi, pojam "sušenje zamrzavanjem" i pojam "liofilizacija" i pojam "kriodesikacija" odnosi se na uklanjanje rastvarača iz materije u zamrznutom stanju sublimacijom. Ovo se postiže zamrzavanjem materijala koji treba da se osuši ispod njegove eutektičke tačke, i zatim obezbeđivanja latentne toplote sublimacije. Precizna kontrola unosa toplote dozvoljava sušenje iz zamrznutog stanja bez ponovnog topljenja proizvoda. U praktičnoj primeni, proces je ubrzan i precizno kontrolisan pod uslovima sniženog pritiska.

[0031] Kako se ovde koristi, pojam "suvi tečljivi prah" se odnosi na tečljivi suvi prah, npr. prah koji može da se sipa iz kontejnera, vreće, suda, itd bez ometanja velikim grumenjem.

[0032] Kako se ovde koristi, pojam "usitnjavanje" se odnosi na smanjenje veličine čestice pomoću udaranja, odsecanja, ili trenja.

[0033] Kako se ovde koristi, pojam "pranje" se odnosi na uklanjanje ili čišćenje (npr., uz korišćenje bilo kakve vrste rastvora (npr. destilovana voda, pufer, ili rastvarač) ili smeše) nečistoća ili rastvorljivih neželjenih komponenti preparata (npr., ekstrakt ćelijskog zida kvasca može da se opere da bi se uklonile komponente koje nisu komponente ćelijskog zida kvasca iz uzorka; bunarčić mikrotitracione ploče može da bude opran da bi se uklonile komponente koje se ne vezuju ili se vezuju nespecifično).

[0034] Pojmovi "antitelo" ili "imunoglobulin" odnose se na proteine koji vezuju specifični antigen. Imunoglobulini uključuju, ali nisu ograničeni na poliklonska, monoklonska, himerna i humanizovana antitela, Fab fragmente, F(ab’)2fragmente, i uključuju imunoglobuline sledećih klasa: IgG, IgA, IgM, IgD, IbE i sekretorne imunoglobuline (sIg). Imunoglobulini uopšteno sadrže dva identična teška lanca i dva laka lanca. Međutim, pojmovi "antitelo" i "imunoglobulin" takođe obuhvataju jednolančana antitela i dvolančana antitela. Antitela mogu da budu proizvedena bilo kojom od poznatih metodologija (videti, npr., Current Protocols in Immunology (1998) John Wiley and Sons, Inc., N.Y.).

[0035] Pojam "antigen" se odnosi na ugljeni hidrat, protein, glikoprotein, lipoprotein, lipid ili drugu supstancu koja je reaktivna sa antitelom specifičnim za deo molekula.

[0036] Kako se ovde koristi, pojam "analit" se odnosi na atom, molekul, grupu atoma i/ili molekula, supstancu, ili hemijski sastojak. Analit sam po sebi ne može da se meri, već mogu da se odrede aspekti ili svojstva (fizička, hemijska, biološka, itd.) analita upotrebom analitičkog postupka, kao što je HPLC ili NMR. Na primer, ne može se meriti "stolica" (analitička komponenta) sama po sebi, već može da se izmeri visina, širina, itd. stolice. Isto tako, ne može da se izmeri mikotoksin, ali može da se meri signal mikotoksina (npr., hromogeni signal, signal fluorescencije) koji je povezan sa njegovom koncentracijom.

[0037] Pojmovi "imunoprecipitat", "imunoprečišćavanje" i "afinitetno prečišćavanje" i njihove gramatičke varijante kao što su glagoli i pridevi, odnose se na upotrebu antitela za izdvajanje antigena ili njegovog dela iz smeše sa drugim molekulima.

[0038] Pojam "imunodetekcija" i njegove gramatičke varijante se odnose na upotrebu antitela za identifikaciju prisustva antigena ili njegovog dela u smeši sa drugim molekulima.

[0039] Pojam "bojenje" se odnosi na bilo koji broj postupaka poznatih stručnjacima u ovoj oblasti koji se koriste za bolju vizualizaciju, razlikovanje ili identifikaciju specifične komponente/komponenti i/ili svojstva/svojstava materijala (npr., uzorak, uzorak stočne hrane, ekstrakt uzorka stočne hrane, ćelija, ćelije).

[0040] Pojam "imunofluorescencija" se odnosi na tehniku bojenja koja se koristi za postupke za identifikaciju, označavanje, obeležavanje, vizualizaciju ili lako uočavanje poznate stručnjacima u ovoj oblasti, u kojoj je ligand (obično antitelo) vezan za receptor (obično antigen) i takav ligand je, ako je antitelo, konjugovana sa fluorescentnim molekulom, ili je ligand zatim vezan za antitelo specifično za ligand, i navedeno antitelo je konjugovano sa fluorescentnim molekulom, pri čemu navedeni fluorescentni molekul može da se vizualizuje pomoću odgovarajućeg instrumenta (npr., fluorescentnog mikroskopa).

[0041] Pojam "antigena determinanta" se odnosi na deo antigena (npr., epitop) koji ostvaruje kontakt sa konkretnim antitelom. Kada se protein ili fragment proteina koristi za imunizaciju životinje-domaćina, brojne oblasti proteina mogu da indukuju proizvodnju antitela koja se specifično vezuju za datu oblast ili trodimenzionalnu strukturu na proteinu; ove oblasti ili strukture su označene kao antigene determinante. Antigena determinanta može da kompetira sa intaktnim antigenom ("imunogenom" koji je korišćen za izazivanje imunskog odgovora) za vezivanje antitela.

[0042] Kako se ovde koristi, pojam "imunoesej" se odnosi na kvalitativni ili kvantitativni test namenjen da omogući detekciju antigena u uzorku. Za imunoesej obično se koriste antitela koja prepoznaju antigen. Antitelo koje prepoznaje antigen može da bude direktno ili indirektno kuplovano sa vizuelnom komponentom, na primer sa hromogenim ili fluorogenim markerom ili enzimom. Primeri imunoeseja uključuju, ali nisu ograničeni na enzimske imunoadsorpcione testove ("ELISA"), imunohromatografske testove sa bočnim protokom, western blot testove, testove na bazi mikročestica (npr., Luminex® testovi), magnetske imunoeseje, dot blot testove, enzimske imunoeseje (EIA), radioimunoeseje (RIA), hemiluminiscentne imunoeseje (CLIA), imunoeseje zasnovane na brojanju čestica (CIA), i slično. Imunoeseji mogu da budu kompetitivni ili nekompetitivni.

[0043] Kako se ovde koristi, pojam "enzimski imunoadsorpcioni test" ili "ELISA", ponekad označen kao "sendvič-test", odnosi se na specifičnu vrstu imunoeseja. Tipično, nepoznata količina antigena se apsorbuje ili imobilizuje na čvrstoj površini i izlaže antitelu sposobnom da ga prepozna. Količina vezanog antitela se uglavnom određuje putem direktnog ili indirektnog vezivanja za fluorogeni ili hromogeni enzim. Vrste ELISA testova uključuju, ali nisu ograničene na direktni ELISA test, indirektni ELISA test, sendvič ELISA test, kompetitivni ELISA test, i reverzni ELISA test. Kako se ovde koristi, pojam "ELISA" se odnosi na enzimski imunoadsorpcioni test (ili EIA). Brojne ELISA metode i primene su poznate u stanju tehnike, i opisane su u mnogim referencama (videti, npr., Crowther, "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)," u Molecular Biomethods Handbook, Rapley et al. (eds.), pp. 595-617, Humana Press, Inc., Totowa, N.J. (1998); Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Ch. 11, John Wiley & Sons, Inc., New York (1994)). Pored toga, postoje brojni komercijalno dostupni sistemi za ELISA testove. Kako se ovde koristi, pojmovi "hrana", "komponente hrane" "stočna hrana", "proizvod stočne hrane", "hraniva" i slično, odnose se na bilo koji materijal/materijale koje konzumiraju (npr., životinje), koji doprinose energiji i/ili nutrijentima u ishrani. Primeri obuhvataju, ali bez ograničenja, potpuni mešani obrok (TMR), krmno bilje, pelete, koncentrat(e), koproizvod(e) gotove smeše, žitarice, žitnu džibru, melasu, vlakno/vlakna, kabastu stočnu hranu, travu/trave, seno, jezgro/jezgra zrna, lišće, brašno, rastvorljivu supstancu/supstance, dodatak/dodatke. Hraniva nisu ograničena svojim fizičkim oblikom.

Hraniva mogu da budu obrađena do manje veličine čestica (npr., iskidana, iseckana, zdrobljena, samlevena, ili slično); napravljena u tečnom obliku (npr., ekstrahovana, kuvana, koncentrovana, pretvorena u sirup ili druge viskozne oblike); ili prerađena do veće veličine (npr., presovana u bale, učvršćena, sabijena, ili formirana u složene oblike, npr., pelete, blokove, kocke, ljuspice, i slično).

[0044] Kako se ovde koristi, kada je upotrebljen kao imenica, "aditiv" ili "dodatak" se odnosi na supstancu ili artikal koji se dodaje ili na drugi način uključuje u drugu supstancu ili artikal. Dalje, kako se ovde koristi, kada su upotrebljene kao imenica, reči "aditiv" ili "dodatak" mogu da se koriste uzajamno zamenljivo kada se odnose na "aditive" ili "dodatke" koji se mešaju u stočnu hranu za životinje pre nego što se ona daje životinji.

[0045] Kako se ovde koristi, pojam "glukan" se odnosi na bilo koji ugljenohidratni polimer koji sadrži glukozu. U nekim primerima izvođenja, glukani su polimeri D-glukoze bez ograničenja u stepenu polimerizacije, kovalentnom ili nekovalentnom povezivanju sa drugim polimerima, ili konkretnom sastavu ugljenog hidrata. Duž polimera glukana, jedinice D-glukoze mogu da učestvuju u α-vezama, β-vezama, ili i u α- i u β-vezama.

[0046] Kako se ovde koristi, pojam "ugljeni hidrat" upotrebljava se da označi organsko jedinjenje opšte formule Cm(H2O)n. Ugljeni hidrat se sastoji samo od atoma ugljenika, vodonika i kiseonika, pri čemu atomi vodonika i kiseonika imaju atomski odnos od 2:1.

[0047] Kako se ovde koristi, pojam "signal" se uopšteno upotrebljava u vezi sa bilo kojim detektabilnim procesom koji ukazuje na to da se reakcija dogodila, na primer, vezivanje antitela za antigen. Podrazumeva se da će signali u obliku radioaktivnosti, fluorimetrijskih ili kolorimetrijskih proizvoda/reagenasa svi naći upotrebu u predmetnom pronalasku. U različitim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, signal se procenjuje kvalitativno, dok se u alternativnim primerima izvođenja, signal procenjuje kvantitativno.

[0048] Kako se ovde koristi, pojam "čvrsta podloga" se upotrebljava za bilo koji čvrsti ili stacionarni materijal za koji se reagensi, kao antitela, antigeni i druge komponente testa vezuju. Na primer, u ELISA testu, bunarčići mikrotitarskih ploča obezbeđuju čvrstu podlogu. Drugi primeri čvrste podloge uključuju mikroskopske pločice, pokrovne ljuspice, perle, čestice, boce za ćelijsku kulturu, kao i mnoge druge pogodne predmete.

[0049] Pojmovi "specifično vezivanje" i "specifično vezan", upotrebljeni u vezi sa interakcijom antitela i antigena opisuju interakciju koja zavisi od prisustva određene strukture (tj., antigene determinante ili epitopa) na antigenu. Drugim rečima, antitelo prepoznaje i vezuje proteinsku strukturu jedinstvenu za antigen, umesto da se vezuju za sve proteine uopšteno (tj., nespecifično vezivanje).

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0050] Ćelijski zid kvasca (YCW) sadrži složenu strukturu koja uključuje dve glavne polisaharidne komponente: (1→2)(1→3)(1→6)-α-D-manan i (1→3)(1→6)-β-D-glukan. Ovi polisaharidi su spojeni sa proteinima YCW putem O- i N- glikozidnih veza, kako je razmatrano u nedavno objavljenom pregledu (Lesage et al. (2006) Microbiol. Mol. Biol. Rev.

70:317-343). U industrijskom obimu proizvodnje, YCW se obično izdvaja ili ekstrahuje iz liziranih organizama kvasca centrifugiranjem i pranjem kao što je prikazano kod D.A. Howes i K.E. Newman (videti, npr., SAD patent br. 6,045,834). Na ovom stadijumu, YCW nije rastvorljiv u vodi. Sledeća enzimska i hemijska obrada primarnog YCW modifikuje strukturu polisaharida i proteina, čineći time ove komponente YCW bar delimično rastvorljivim u vodi i u dimetil sulfoksidu "DMSO". Sastav rastvorljivih i nerastvorljivih delova proizvoda zavisi od uslova postupka.

[0051] Imuneseji obuhvataju osetljive analitičke tehnike koje se koriste sa takvim složenim, nehomogenim smešama. U nekim varijantama primera izvođenja predmetnog pronalaska, antitela iz životinje koja je imunizovana antigenom koji sadrži (1→6)-β-D-glukan kvasca koji međusobno povezuje sve glavne strukturne komponente ćelijskog zida (videti, Kollár et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:17762-17775) prepoznaju ovaj polisaharid, omogućavajući uspostavljanje robusnih i osetljivih imunoeseja. U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, kvantitativni imunoesej (ELISA) omogućava ispitivanje nutritivnog aditiva izvedenog iz YCW, MYCOSORB (ALLTECH, Inc.), u uzorcima stočne hrane za životinje. Test za (1→6)-β-D-glukan iz YCW je veoma specifičan u kvantitativnom određivanju YCW, jer je (1→6)-β-D-glukan veoma redak među biljnim ugljenim hidratima. Stoga, antitela usmerena protiv ovog polisaharida YCW ne interaguju u značajnoj meri sa biljnim polisaharidima prisutnim u stočnoj hrani za životinje, osiguravajući nizak pozadinski šum testa.

[0052] Prijava opisuje postupke za: 1) izdvajanje rastvorljivog (1→4)-α-/(1→6)β-D-glukana iz ćelijskog zida kvasca (videti, Kwiatkowski et al. (2009) J. Instit. Brew. 115:1031, i Arvindekar et al. (2002) Yeast 19:131-139 ), npr., kao antigena za pripremu antitela koja prepoznaju (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan kvasca; oksidaciju hidroksilnih grupa ovog polisaharida na položaju C-6 glukopiranoznih prstenova pomoću reagensa Pfizner-Moffat (videti, Pfizner et al. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:3027), u cilju njihovog pretvaranja u aldehidnu grupu (videti, Zekovic et al. (2006) Chem. Papers 60:243-248); i upotrebu ovog oksidovanog oblika (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukana u reakciji reduktivne aminacije (videti, Abdel-Magid et al. (1996) J. Org. Chem. 61:3849-3862) sa lizinskim reziduama goveđeg serum albumina (BSA), da bi se proizveo konjugat polisaharid-protein. Prijava opisuje postupke za izdvajanje i prečišćavanje (npr., upotrebom jonske izmene, DEAE celuloze i Na2HPO4pufera različitih jonskih jačina) konjugata (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan-BSA, koji se koristi kao rastvorljivi imunogen u imunizaciji životinje (npr., zeca) (videti, Howard et al. (2001) Basic Methods in Antibody Production and Characterization, CRC Press, pp. 11-18 i 31-50). Dodatno su opisani postupci za pripremu smole obložene sa BSA koja predstavlja afinitetnu fazu (videti, Matejtschuk (1997) Affinity Separations: a Practical Approach, Oxford University Press) i njenu upotrebu u apsorpciji BSA-specifičnih antitela iz seruma zeca koji sadrži i BSA-specifična i (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan-specifična antitela. U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, postupci za konjugaciju polisaharida sa proteinima nalaze upotrebu u proizvodnji vakcina za čoveka i životinje, budući da takvi postupci čuvaju originalnu strukturu polisaharida i ne modifikuju njegov redukujući kraj, kao što je to slučaj kod uobičajenih postupaka za konjugaciju (videti, SAD pat. br.6,596,861).

Glukani ćelijskog zida Saccharomyces cerevisae

[0053] Glukani preovlađuju među polisaharidima ćelijskog zida Saccharomyces cerevisiae (videti, Kwiatkowski et al. (2009) J. Instit. Brew.115:151-158). Uloge (1→3)-β-D-glukana u održavanju oblika i čvrstine ćelijskog zida kvasca (videti, Klis et al. (2006) Yeast 23:185-202; Lesage et al. (2006) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 70:317-343), i (1→6)-β-D-glukana kao polisaharida koji povezuje sve polisaharide ćelijskog zida su opisane u dokumentima (videti, Aimaniada et al. (2009) J. Biol. Chem. 284:13401-13412; Kollár et al. (1997) J. Biol. Chem.

272:17762-1777; Klis et al. (2002) FEMS Microbiology Rev. 26:239-256). Prisustvo rastvorljivog i nerastvorljivog (1→4)-α-D-glukana sličnog glikogenu u ćelijama S. cerevisiae koji je gajen u aerobnim uslovima je često pominjano u ranoj literaturi o kvascima (videti, Gunja-Smith et al. (1974) Biochem. Biophys. Res. Com.56:588-592; Grba et al. (1975) Appl. Microbiol. Biotechnol. 2:29-37), i identifikovana su dva oblika glikogen sintetaze (videti, Gunja-Smith et al. (1977) J. Bacteriol. 130:818-825; Rothman-Dcnes et al. (1970) PNAS 66:967-974). Glikogen je ugljeni hidrat koji predstavlja energetsku rezervu koju nakuplja S. cerevisiae, koja može da se mobiliše tokom perioda kada kvasac gladuje. To je polimer α-Dglukoze molekulske težine od ∼10<8>i razgranate strukture sa 10-14 rezidua α-D-glukoze spojenih 1→4 vezama (videti, Aklujkar et al. (2008) J. Instit. Brew. 114:205-208; Boulton et al. (2001) The Biochemistry of Fermentation. In: Brewing Yeast and Fermentation, Blackwell Science, Iowa, pp.89-92).

[0054] Sadržaj (1→4)-α-D-glukana u ćelijskom zidu kvasca može da varira od samo 1% (videti, Lille et al. (1980) J. Bacteriol. 143:1384-1394) do 29% (videti, Sedmak et al., SAD pat. prijava br.2006/0263415) suve težine, u zavisnosti od nutritivnog statusa ćelija, postupka za izdvajanje, uslova sredine i vremena kada su ćelije sakupljene (videti, Lille et al. (1980) J. Bacteriol. 143:1384-1394). Industrijski proizvedene ćelije pivskog kvasca (videti, Sedmak et al., SAD pat. prijava br. 2006/0263415) sadržale su glukane u koncentraciji od 28.9% suve težine (s.t.), koja uključuje 12.4% s.t. (1→4)-α-D-glukana. Kada su ćelije obrađene alkalnom proteazom, komponenta ćelijskog zida nerastvorljiva u vodi sadržala je 54.5% s.t. glukana i više od polovine težine (1→4)-α-D-glukana (29.2% s.t.).

[0055] Godine 2002, Arvindekar i Patil (videti, Arvindekar et al. (2002) Yeast 19:131-139) su predložili objašnjenje za prisustvo nerastvorljive frakcije koju su drugi autori definisali kao glikogen kvasca "koji se teško ispira" (videti, Fleet et al. (1976) J. Gen. Microbiol. 94:180-192) u ćelijskom zidu kvasca, zasnovan na njihovom nalazu da je (1→4)-α-D-glukan kovalentno vezan za (1→6)-β-D-glukan. Međutim, ovo je bilo u neskladu sa dokumentom koji su 1997. godine objavili Kollar i saradnici (videti, Kollár et al. (1997) J. Biol. Chem.

272:17762-17775) i sa radom koji su objavili Aimaniada i saradnici (videti, Aimaniada et al. (2009) J. Biol. Chem. 184:13401-13412) u vezi sa ulogom i strukturom (1→6)β-D-glukana u ćelijskom zidu kvasca. Treba zapaziti da su nalazi autora Arvindekar i Patil zahtevali strukturnu potvrdu, jer su autori radili sa veoma malim frakcijama iz enzimske hidrolize ćelijskog zida kvasca i nisu koristili NMR za kvantitativno određivanje ili strukturne procene njihovih izdvojenih proizvoda. U eksperimentima sprovedenim tokom razvoja primera izvođenja pronalaska, razvijeni su separacioni postupci na velikoj skali za izdvajanje mešanog polisaharida (1→4)α-D-glukan/(1→6)-β-D-glukan iz ćelijskog zida S. cerevisiae, i struktura ovog proizvoda je ustanovljena upotrebom NMR spektroskopije.

Hrana za životinje i stočna hrana

[0056] Stočna hrana je bilo koja komponenta hrane koja se koristi specifično za ishranu domaće stoke (npr., goveda, koza, ovaca, konja, živine, bufala, alpaka, lama, magaraca, mula, zečeva, kokošaka, gusaka, ćuraka i svinja). Stočna hrana često uključuje seno, slamu, silažu, komprimiranu i peletiranu stočnu hranu, ulja i mešane obroke, kao i klijava zrna i mahunarke. Širom sveta u industriji stočne hrane u potrošeno je 635 miliona tona stočne hrane u 2006. godini, sa godišnjom stopom rasta od 2%. Upotreba poljoprivrednog zemljišta za gajenje stočne hrane umesto hrane za ljude može da bude sporna; neke vrste stočne hrane, kao kukuruz, mogu da služe i kao ljudska hrana, dok druge kao trava ne mogu. Pored obezbeđivanja izvora energije za životinje, stočna hrana u takođe obezbeđuje nutrijente (npr. selen) koje telo koristi. Stočna hrana za životinje se često meša sa dodacima i/ili aditivima (npr., MYCOSORB) pre nego što se daje životinjama.

Postupci za imunodetekciju

[0057] Pronalazak obezbeđuje postupke za detekciju supstanci u uzorcima, takvi postupci obuhvataju testove za imunološku detekciju ili imunoeseje. Imunoesej (test za imunološku detekciju, postupak za imunološku detekciju) uključuje upotrebu antitela za detekciju (vizualizaciju, kvalitativnu identifikaciju, kvantitativnu detekciju) supstance (npr., antigena) za koji se antitelo vezuje. Antigen koji antitelo prepoznaje može da bude makromolekul ili njegov fragment (npr., polimer, ugljeni hidrat, glikoprotein, protein, njihov fragment ili monomer). Na primer, neki postupci predmetnog pronalaska nalaze upotrebu u detekciji glukana ćelijskog zida kvasca (npr., (1→4)-α-D-glukan, (1→6)-β-D-glukan, i/ili (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan).

[0058] Brojni imunoeseji nalaze upotrebu u kvalitativnoj ili kvantitativnoj detekciji supstanci (npr., supstanci nađenih u niskoj koncentraciji, supstanci prisutnih u složenim smešama, ugljenohidratne supstance, (1→4)-α-D-glukan kvasca, (1→6)-β-D-glukan kvasca, (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan kvasca). Vrste imunoeseja uključuju, ali nisu ograničene na enzimske imunoadsorpcione testove ("ELISA"), imunohromatografske testove sa bočnim protokom, western blot testove, testove na bazi mikročestica (npr., Luminex® testovi), magnetske imunoeseje, dot blot testove, enzimske imunoeseje (EIA), radioimunoeseje (RIA), hemiluminiscentne imunoeseje (CLIA), imunoeseje zasnovane na brojanju čestica (CIA) i slično (videti, npr., Wild et al. (2005) "The Immunoassay Handbook, 3rd Ed.", Elsevier Ltd., Oxford, UK). Imunoeseji mogu da budu kompetitivni ili nekompetitivni.

Enzimski imunoadsorpcioni test (ELISA)

[0059] Enzimski imunoadsorpcioni test, "ELISA", korišćen je kao dijagnostički instrument u medicini i biljnoj patologiji, kao i za kontrolu kvaliteta u različitim industrijama. U jednom primeru, tipični ELISA test uključuje molekulsku probu koja se prvo imobiliše na polistirensku mikroploču ili drugu površinu. Zatim se primenjuje sredstvo za blokiranje kao BSA i inkubira. Biološki ili drugi uzorak koji sadrži specifični ciljni molekul (često protein) nepoznate koncentracije se dovodi u kontakt sa imobilisanim molekulskom probom. Ako je prisutan, ciljni molekul je uhvaćen probom proporcionalno koncentraciji molekula. Zatim, površina se obično pere blagim rastvorom deterdženta da bi se uklonili bilo koji molekuli koji nisu specifično vezani. Nakon toga se primenjuje dodatni molekul, kao drugo antitelo, da bi se obrazovao "sendvič" kompleks sa probom za hvatanje ciljnog molekula, ciljni molekul i obeležena proba za detekciju. Drugi molekul je često označen kao proba za detekciju ili antitelo za detekciju, i obično je kovalentno vezan za enzim, hapten, ili drugi molekul za obeležavanje.

[0060] Posle finalnog koraka pranja, ploča se razvija dodavanjem konjugata koji se vezuje za obeleženo antitelo za detekciju i sadrži enzimski supstrat, fluorescentno obeležen reagens za detekciju, ili razne druge reportere. Reporter proizvodi detektabilan signal proporcionalan količini ciljnog antigena u uzorku. Tipično, ELISA testovi se očitavaju upotrebom kolorimetrijskog ili fluorescentnog čitača ploča i rezultuju u pojedinačnom merenju ciljnog analita po bunarčiću. Druge varijante ELISA testa uključuju, ali nisu ograničene na indirektni, kompetitivni, ili reverzni ELISA test (videti, npr., Crowther et al. (2008) "The ELISA Guidebook, 2nd Ed.", Humana Press).

[0061] U mnogim slučajevima, ELISA testovi se izvode u mikropločama napravljenim u standardizovanom formatu koji omogućava obradu putem automatizovanog uređaja. Ove standarde je uspostavilo Društvo biomolekularnih nauka (SBS) i poznati su kao SBS standardi. Prema SBS standardima, "otisak" za ploču sa više bunarčića je oko 85 mm x125 mm sa bunarčićima lociranim u određenom položaju, u zavisnosti od ukupnog broja bunarčića. Američki nacionalni institut za standarde (ANSI) je objavio SBS standarde za mikroploče kao: "Footprint Dimensions" (ANSI/SBS 1-2004), "Height Dimensions" (ANSI/SBS 2-2004), "Bottom Outside Flange Dimensions" (ANSI/SBS 3-2004) i "Well Positions" (ANSI/SBS 4-2004). Najčešće, za ELISA test se koristi 96 bunarčića na jednoj ploči. Alternativno, kada je za test potrebno manje od 96 bunarčića, može da se koristi do dvanaest "traka" sa 8 bunarčića, tako da se samo deo od 96 bunarčića koristi u isto vreme.

Usluge ispitivanja

[0062] U nekim primerima izvođenja, koristi se kompjuterski program za analizu za pretvaranje sirovih podataka dobijenih u testu (npr., imunoesej, ELISA) (npr., prisustvo, odsustvo, ili količina antigena) (npr., (1→4)-α-D-glukan kvasca, (1→6)-β-D-glukan kvasca, (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan kvasca) u podatke koji imaju prognostičku vrednost za krajnjeg korisnika (npr., odgajivača ili osobu koja vodi brigu o stoci ili kućnim ljubimcima, veterinara, poljoprivrednika, potrošača). Krajnji korisnik može da pristupi prognostičkim podacima koristeći bilo koja odgovarajuća sredstva. Na taj način, u nekim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje dodatnu korist time što krajnji korisnik, za koga nije verovatno da je obučen za imunoesej test, ne mora da razume sirove podatke. Podaci su prikazani krajnjem korisniku u najpogodnijem obliku. Krajnji korisnik je tada u mogućnosti da odmah koristi informaciju u cilju optimizacije brige o subjektu (npr., stoci ili kućnim ljubimcima).

[0063] Predmetni pronalazak obuhvata bilo koji postupak koji može da prima, obrađuje i prenosi informaciju koja se odnosi na uzorke u, i iz laboratorija koje izvode testove. Na primer, u nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, uzorak (npr., uzorak stočne hrane, ekstrakt uzorka stočne hrane) se uzima i podnosi centru za profilisanje (npr., laboratorija itd.), smeštenom u bilo kom delu sveta (npr., u zemlji istoj kao ona, ili drugačijoj od one gde subjekat živi, ili gde se informacija na kraju koristi) da bi se dobili sirovi podaci. Krajnji korisnik može da ima uzorak (npr., ekstrakt stočne hrane) koji je uzorkovala treća strana i poslala u centar za profilisanje, ili subjekti mogu sami da sakupe uzorak i da ga direktno pošalju u centar za profilisanje. Tamo gde uzorak sadrži prethodno određenu informaciju, krajnji korisnik može direktno da pošalje informaciju centru za profilisanje (npr., informaciona kartica koja sadrži informaciju može kompjuterski da se skenira i podaci mogu da se prenesu do kompjutera centra za profilisanje upotrebom elektronskih komunikacionih sistema). Jednom kada stigne u centar za profilisanje, uzorak se obrađuje i nastaje profil (npr., sadržaj antigena), specifičan za dijagnostičku ili prognostičku informaciju koja je potrebna krajnjem korisniku.

[0064] Podaci o profilu se zatim pripremaju u formatu pogodnom za tumačenje od strane krajnjeg korisnika. Na primer, umesto pružanja sirovih podataka, pripremljeni format može da predstavlja procenu rizika (npr. verovatnoću da je antigen prisutan) za krajnjeg korisnika, zajedno sa preporukama za konkretne opcije vezane za stočarstvo. Podaci mogu biti prikazani krajnjem korisniku bilo kojim odgovarajućim metodom. Na primer, u nekim primerima izvođenja, usluga profilisanja generiše izveštaj koji može da se odštampa za krajnjeg korisnika (npr., na mestu kontakta, na mestu gde se gaji stoka) ili se prikazuje krajnjem korisniku na monitoru kompjutera.

[0065] U nekim primerima izvođenja, informacija se prvo analizira na mestu gde se stoka gaji ili u regionalnom objektu. Neobrađeni podaci se zatim šalju u procesni centar za dalju analizu i/ili pretvaranje sirovih podataka u informacije korisne za krajnjeg korisnika ili drugu zainteresovanu stranu. Procesni centar pruža prednost privatnosti (svi podaci se čuvaju u centralnom objektu sa jedinstvenim sigurnosnim protokolima), brzinu i jedinstvenost analize podataka. Procesni centar može onda da kontroliše sudbinu podataka nakon komunikacije sa krajnjim korisnikom. Na primer, koristeći elektronski komunikacioni sistem, centralni objekat može da pruža podatke krajnjem korisniku.

[0066] U nekim primerima izvođenja, krajnji korisnik može direktno da pristupi podacima upotrebom elektronskog sistema za komunikaciju. Krajnji korisnik može dalje da traži savet na osnovu rezultata. U nekim primerima izvođenja, podaci se koriste u istraživačke svrhe. Na primer, podaci mogu da se koriste za dalju optimizaciju režima ishrane za stoku ili kućne ljubimce.

Kompozicije i kompleti

[0067] Kompozicije (npr., dovoljne, neophodne, ili korisne) za upotrebu u postupcima prema nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska uključuju reagense za detekciju prisustva ili odsustva specifičnih antigena (npr., (1→4)-αD-glukan kvasca, (1→6)-β-D-glukan kvasca, (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan kvasca). Bilo koja od ovih kompozicija, sama ili u kombinaciji sa drugim opisanim kompozicijama, opisana je u obliku kompleta. Kompleti mogu dalje da sadrže odgovarajuće kontrole i/ili reagense za detekciju.

Konjugacija antigen-nosač

[0068] Dodatno su opisane kompozicije (npr., antigeni) koje se koriste u ispitivanju (npr., imunološkom testu; za pripremu antitela) supstanci ćelijskog zida kvasca. Prijava opisuje postupke za: izdvajanje rastvorljivog (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukana iz ćelijskog zida kvasca (videti, Kwiatkowski et al. (2009) J. Instit. Brew. 115:1031; Arvindekar et al. (2002) Yeast 19:131-139) kao antigena za (1→6)-β-D-glukan kvasca; oksidaciju ovih polisaharidnih hidroksilnih grupa na položaju C-6 u glukopiranoznim prstenovima upotrebom reagensa Pfizner-Moffat (videti, Pfizner et al. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:3027), u cilju njihovog pretvaranja u aldehidne grupe (videti, Zekovic et al. (2006) Chem. Papers 60:243-248); i upotrebu ovih oksidovanih oblika (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukana u reakciji reduktivne aminacije (videti, Abdel-Magid et al. (1996) J. Org. Chem. 61:3849-3862) sa lizinskim reziduama nosača (npr., proteinski nosač, npr., BSA), da bi se proizveo konjugat polisaharidnosač. U nekim aspektima opisa, prijava se odnosi na primenu separacionih tehnika (npr, jonska izmena, DEAE celuloza i Na2HPO4puferi različite jonske jačine) u izdvajanju čistog antigena (npr., konjugata (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan-BSA), koji se koristi kao rastvorljivi imunogen u imunizaciji životinje (npr., zeca) (videti, Howard et al. (2001) Basic Methods in Antibody Production and Characterization, CRC Press, pp. 11-18 i 31-50). Prijava dodatno opisuje pripremu afinitetne faze obložene sa BSA (videti, Matejtschuk (1997) "Affinity Separations: A Practical Approach", Oxford University Press) i njenu upotrebu u apsorpciji antitela specifičnih za nosač (npr., BSA-specifičnih antitela) iz antiseruma (npr., seruma zeca) koji sadrži i antitela usmerena na nosač (npr., BSA) i na antigen (npr., (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan), čime se olakšava specifičnost dobijenih preparata antitela. Opisani postupci za konjugaciju polisaharida sa nosačima (npr., proteinskim nosačima, npr., BSA) nalaze upotrebu u proizvodnji vakcina za čoveka i životinje, budući da takvi postupci čuvaju strukturu polisaharida, umesto da dovode do modifikacije njegovog redukujućeg kraja, kao što je to slučaj kod uobičajenih postupaka za konjugaciju (videti, Moreau et al., SAD pat. br.

6,596,861);

[0069] Slaba antigenost poli- ili oligosaharida često zahteva da se oni modifikuju pre nego što se upotrebe kao antigeni. U nekim aspektima opisa, razvijeni su postupci sinteze u kojima su polisaharidni antigeni (koji sadrže (1→6)-β-D-glukan) konjugovani sa nosačem (npr., proteinskim nosačem, npr., BSA) koji potiče ili je izveden iz različitih životinjskih vrsta u odnosu na vrste koje su korišćene za imunizaciju (videti, Howard et al. (2001) "Basic Methods in Antibody Production and Characterization", CRC Press, pp. 11-18 i 31-50; Matejtschuk (1997) "Affinity Separations: A Practical Approach", Oxford University Press). Mada opis nije ograničen prirodom ili vrstom upotrebljenog nosača, BSA ima prednost zbog svoje komercijalne dostupnosti i prisustva pet lizinskih rezidua, od kojih svaka ima jednu slobodnu amino grupu koja može da bude konjugovana sa poli- ili oligosaharidima različitim hemijskim metodama (videti, Abdel-Magid et al. (1996) J. Org. Chem.61:3849-3862; Lees et al. (1996) Vaccine 14:190-198; Pawlowski et al. (1999) Vaccine 17:1474-1483). U nekim aspektima opisa, ugljenohidratni fragment antigena i nosač koji će se upotrebiti u konjugaciji su rastvorljivi u vodi. U nekim aspektima opisa, aldehidne grupe redukujućeg kraja ugljenohidratnog fragmenta antigena (npr., (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan polisaharid) se ne koriste za direktnu konjugaciju sa nosačem (npr., BSA), jer bi to suštinski izmenilo strukturu i kapacitet vezivanja polisaharidnog antigena. Dalje je opisana maksimalno očuvana struktura ugljenohidratnog fragmenta putem primene sistema anhidrid sirćetne kiseline/dimetilsulfoksid (Ac2O/DMSO) (videti, Zekovic et al. (2006) Chem. Papers 60:243-248 za oksidaciju na položajima koji nisu C3.

[0070] Prijava opisuje postupke za upotrebu komponenti ćelijskog zida kvasca (npr., rastvorljivi (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan iz ćelijskog zida Saccharomyces cerevisiae) u sintezi antigenog konjugata (npr., (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan-BSA (goveđi serum albumin)) za upotrebu u proizvodnji antitela (npr., poliklonskih antitela). Prijava takođe opisuje imunogenu kompoziciju koja sadrži (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan i/ili konjugat (npr., konjugat sa proteinom ili šećerom) koji ga sadrži. U nekim aspektima opisa, antitela kompozicija nalaze upotrebu u detekciji proizvoda ćelijskog zida kvasca u uzorcima od interesa (npr., uzorci stočne hrane ili derivati, frakcije, ili ekstrakti navedenog). Opisane kompozicije se ekstrahuju iz materijala obogaćenog glukanom ili proizvoda obogaćenog glukanom (GEM, ALLTECH, Inc., Nicholasville, KY, USA), npr., kiselom ekstrakcijom (videti, Kwiatkowski et al. (2009) J. Instit. Brew. 115:1031). U nekim primerima izvođenja, blaga oksidacija polisaharida (npr., (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukana) na položaju C-6 u glukopiranoznim prstenovima upotrebom smeše dimetilsulfoksid (DMSO)/anhidrid sirćetne kiseline (Ac2O) (videti, Pfizner et al. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:3027) pretvara C-6 hidroksimetilenske (-CH2OH) grupe u aldehidne (-CH=O) grupe (videti, Zekovic et al. (20060 Chem. Papers 60:243-248 ), i stvara oksidovani oblik antigena (npr., (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukana), sposoban da učestvuje u reduktivnoj aminaciji sa nosačem (npr., BSA) (videti, Moreau et al., SAD pat. br. 6,596,861; Abdel-Magid et al. (1996) J. Org. Chem. 61:3849-3862). Opisani postupci za konjugaciju koji, npr., obuhvataju aktivaciju polisaharida na C6-OH, obezbeđuju potpuno očuvanu originalnu strukturu polisaharidnog fragmenta, i stoga su pogodni za pripremu antigena. Alternativni postupci za aktivaciju poli- ili oligosaharida uključujući, ali bez ograničenja, oksidaciju perjodatom (videti, Hay et al. (1973) Methods Carb. Chem. 5:357-370) ili aktivaciju CDAP (videti, Lees et al. (1996) Vaccine 14:190-198) daju suštinski modifikovane polisaharide, što umanjuje njihovu upotrebljivost u svojstvu antigena.

Antitela

[0071] Dalje je opisan postupak za pripremu imunoglobulina za upotrebu u testovima za detekciju komponenti ćelijskog zida kvasca (npr., (1→4)-α-D-glukan kvasca, (1→6)-β-D-glukan kvasca, (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan kvasca) koji obuhvata korake imunizacije subjekta komponentom ćelijskog zida kvasca (npr, (1→4)-α-D-glukan kvasca, (1→4)-α-β-D-glukan kvasca, (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan kvasca, (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan-BSA, drugi fragmenti, varijante, ili njihovi konjugati) i izdvajanja imunoglobulina iz organizma primaoca. Imunoglobulin pripremljen ovim postupkom je takođe opisan.

[0072] Inokulumi za proizvodnju poliklonskih antitela se tipično pripremaju dispergovanjem antigene kompozicije u fiziološki podnošljivom razblaživaču kao što je fiziološki rastvor ili drugim adjuvansima da bi se obrazovala vodena kompozicija. Imunostimulatorna količina inokuluma se primenjuje kod subjekta i inokulisani subjekat se zatim održava tokom vremena koje je dovoljno da antigena kompozicija indukuje zaštitna antitela.

[0073] Antitela mogu da budu izolovana do željenog stepena dobro poznatim tehnikama kao što je afinitetna hromatografija (videti, npr., Harlow and Lane, Antibodies; a Laboratory Manual (1988) Cold Springs Harbor Laboratory Press).

[0074] Antitela uključuju preparate antiseruma iz različitih uobičajeno korišćenih životinja (npr. koze, primati, zečevi, magarci, svinje, konji, zamorci, pacovi ili čovek). Od životinje se uzima krv i izdvaja se serum.

[0075] Imunoglobulin proizveden prema predmetnom opisu može da uključuje cela antitela, fragmente ili subfragmente antitela. Antitela mogu da budu celi imunoglobulini bilo koje klase npr. IgG, IgM, IgA, IgD ili IgE, himerna antitela ili hibridna antitela sa dualnom specifičnošću za dva ili više antigena pronalaska. Ona mogu da budu i fragmenti npr. F(ab’)2, Fab’, Fab, Fv i slično, uključujući hibridne fragmente.

[0076] Alternativno, tehnike koje su opisane za proizvodnju jednolančanih antitela mogu da se prilagode upotrebom postupaka poznatih u stanju tehnike za proizvodnju jednolančanih antitela koja specifično vezuju konkretni antigen. Antitela sa srodnom specifičnošću, ali različitih idiotipskih sastava, mogu da se stvore mešanjem lanaca iz nasumičnih kombinatornih imunoglobinskih biblioteka (videti, npr., Burton, Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 11120 23, 1991).

[0077] Jednolančana antitela mogu takođe da se konstruišu upotrebom postupka za amplifikaciju DNK, kao što je PCR, upotrebom cDNK hibridoma kao obrasca (videti, npr., Thirion et al., 1996, Eur. J. Cancer Prev. 5, 507-11). Jednolančana antitela mogu da budu mono- ili bispecifična, i mogu da budu bivalentna ili tetravalentna. Konstruisanje tetravalentnog, bispecifičnog jednolančanog antitela prikazano je, na primer, u Coloma & Morrison, 1997, Nat. Biotechnol. 15, 159-63. Konstruisanje bivalentnog, bispecifičnog jednolančanog antitela prikazano je, na primer, u Mallender & Voss, 1994, J. Biol. Chem.

269, 199-206.

[0078] Nukleotidna sekvenca koja kodira jednolančano antitelo može da se konstruiše upotrebom ručne ili automatizovane sinteze nukleotida, da se klonira u ekspresioni konstrukt upotrebom standardnih metoda rekombinantne DNK, i uvede u ćeliju za ekspresiju kodirajuće sekvence, kao što je dole u tekstu opisano. Alternativno, jednolančana antitela mogu da se proizvedu neposredno, upotrebom, na primer, tehnologije filamentoznog faga (videti, npr., Verhaar et al., 1995, Int. J. Cancer 61, 497-501; Nicholls et al., 1993, J. Immunol. Meth. 165, 81-91).

[0079] Antitela koja specifično vezuju određeni antigen mogu da se proizvedu i indukcijom in vivo proizvodnje u populaciji limfocita ili pretraživanjem imunoglobulinskih biblioteka ili panela visoko specifičnih vezujućih reagenasa kao što je opisano u literaturi (videti, npr., Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci.86, 38333837, 1989; Winter et al., Nature 349, 293299, 1991).

[0080] Himerna antitela mogu da se konstruišu kao što je opisano u WO 93/03151. Vezujući proteini koji su izvedeni iz imunoglobulina i koji su multivalentni i multispecifični, kao "diantitela" opisana u WO 94/13804, takođe mogu da se pripreme. Antitela mogu da budu prečišćena postupcima koji su dobro poznati u stanju tehnike. Na primer, antitela mogu da se afinitetno prečiste propuštanjem kroz kolonu za koju je vezan relevantni antigen. Vezana antitela mogu zatim da se eluiraju sa kolone upotrebom pufera sa visokom koncentracijom soli.

[0081] Imunogena kompozicija prema pronalasku može da se primeni kod subjekta koji zatim ima ulogu izvora imunoglobulina, proizvedenih kao odgovor na stimulaciju specifičnom imunogenom kompozicijom. Tako tretirani subjekat bi bio davalac plazme iz koje bi hiperimunoglobulin bio dobijen pomoću uobičajene metodologije za frakcionisanje plazme. Opisane kompozicije uključuju, ali nisu ograničene na antitela (npr., monoklonska i/ili poliklonska antitela) koja mogu da budu celi imunoglobulini bilo koje klase (npr. IgG, IgM, IgA, IgD ili IgE, himerna antitela) ili hibridna antitela sa specifičnošću prema dva ili više antigena pronalaska. To mogu da budu i fragmenti npr. F(ab’)2, Fab’, Fab, Fv i slično, uključujući hibridne fragmente.

[0082] Postupci za pravljenje monoklonskih antitela su dobro poznati u stanju tehnike i mogu da uključuju fuziju splenocita sa ćelijama mijeloma (videti, npr., Kohler and Milstein 1975 Nature 256; 495; Harlow and Lane, Antibodies; a Laboratory Manual (1988) Cold Springs Harbor Laboratory Press). Alternativno, monoklonski Fv fragmenti mogu da se dobiju pretraživanjem pogodne biblioteke za prikaz faga (videti, npr., Vaughan TJ et al 1998 Nature Biotechnology 16; 535). Monoklonska antitela mogu da budu humanizovana ili delimično humanizovana poznatim metodama.

[0083] U nekim aspektima opisa kompozicije antitela su sposobne da prepoznaju antigene ćelijskog zida kvasca (npr., monoklonska ili poliklonska antitela sposobna da prepoznaju (1→4)-α-D-glukan kvasca, (1→6)-β-D-glukan kvasca, (1→4)α-/(1→6)-β-D-glukan kvasca, ili njihove fragmente, varijante, ili konjugate). Opisane kompozicije antitela vezuju (1→4)-α-D-glukan ćelijskog zida kvasca, ali ne i fragmente koji sadrže (1→4)-α-D-glukan prisutne u supstancama koje nisu polimeri koji sadrže (1→4)-α-D-glukan ćelijskog zida kvasca (npr., (1-4)-α-D-glukan ćelijskog zida kvasca, (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan ćelijskog zida kvasca, ili njihovi fragmenti, varijante, ili konjugati). U nekim aspektima opisa, kompozicije antitela vezuju (1→6)-β-D-glukan ćelijskog zida kvasca, ali ne i fragmente koji sadrže (1→6)-β-D-glukan prisutne u supstancama koje nisu polimeri koji sadrže (1→6)β-D-glukan ćelijskog zida kvasca (npr., (1→6)-β-D-glukan ćelijskog zida kvasca, (1→4)-α-/(1→6)β-D-glukan ćelijskog zida kvasca, ili njihovi fragmenti, varijante, ili konjugati). U sledećoj varijanti opisa, kompozicije antitela vezuju (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan ćelijskog zida kvasca, ali ne i fragmente koji sadrže (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan prisutne u supstancama koje nisu ćelijski zid kvasca (npr., (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan ćelijskog zida kvasca, ili njihovi fragmenti, varijante, ili konjugati).

PRIMERI

[0084] Sledeći primeri su obezbeđeni da bi se pokazali i dodatno ilustrovali određeni poželjni primeri izvođenja i aspekti predmetnog pronalaska i nisu namenjeni da ograniče njegov obim.

Primer 1

Ekstrakcija (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukana iz β-glukana ćelijskog zida kvasca Saccharomyces cerevisiae stepena čistoće za upotrebu u hrani

Priprema glukana ćelijskog zida kvasca

[0085] (1→6)-β-D-glukan (ALL-BGY, ALLTECH, Inc., Nicholasville, KY, USA) industrijskog stepena čistoće proizveden u S. cerevisiae putem enzimske/alkalne/termalne obrade opran je četiri puta dejoonizovanom vodom da bi se uklonili svi rastvorljivi ostaci. Posle sušenja zamrzavanjem, dobijen je "materijal obogaćen glukanom" ("GEM").

Kisela digestija glukana ćelijskog zida kvasca

[0086] Slika 1 ilustruje pripremu različitih frakcija. Kisela digestija glukana ćelijskog zida kvasca izvedena je kao što je opisano u dokumentu Kwiatkowski et al. (2009) J. Instit. Brew.

115:151-158; koji je ovde u potpunosti uključen po referenci. "Materijal obogaćen glukanom" ("GEM") (70 g) je podvrgnut hidrolizi sa 700 mL 100 mM HCl (pH 2.2) na 80°C tokom 6 časova. Nakon tog vremena, smeša je centrifugirana na 13 500 x g/10°C/10 minuta i supernatant je sakupljen. Talog je ekstrahovan dva puta sa 150 ml dejonizovane vode i liofilizovan, čime je dobijeno 57.9 g belog amorfnog proizvoda (P1).

[0087] Rastvori dobijeni u dva pranja su objedinjeni sa polaznim supernatantom i neutralizovani do pH 7.0 sa 2N NaOH. Precipitat koji se obrazovao je sakupljen (talog P1/7) centrifugiranjem (1.82 g posle liofilizacije) i supernatant je koncentrovan do zapremine od 450 ml upotrebom vakuumskog rotacionog uparivača Buchi na temperaturi nižoj od 37°C. Ovaj rastvor je dalje koncentrovan upotrebom AMICON 15 ultra-filtracionih uređaja za centrifugiranje od 5 kDa (Millipore Corporation, Delaware USA). Koncentrat (-150 mL) je opran centrifugiranjem dva puta sa dve jednake zapremine dejonizovane vode, upotrebom istih ultra-filtracionih uređaja, da bi se uklonila so i komponente niske molekuske težine nastale kiselom hidrolizom. Oprani koncentrat (S1) je liofilizovan, čime je dobijeno 7.5 g belog amorfnog proizvoda. Deo taloga P1 je podvrgnut drugoj ekstrakciji upotrebom istog odnosa reagenasa i uslova kao u prvoj ekstrakciji sa 0.1N HCl. Ovi proizvodi su liofilizovani da bi se dobili P2 i S2. Druga ekstrakcija sa 0.1N HCl nije proizvela precipitat nakon neutralizacije supernatanta. Deo taloga P2 je podvrgnut trećoj ekstrakciji upotrebom istog odnosa reagenasa i uslova kao u prvoj ekstrakciji sa 0.1N HCl i proizvodi su liofilizovani da bi se dobili P3 i S3. Treća ekstrakcija sa 0.1N HCl nije proizvela precipitat nakon neutralizacije supernatanta. Ugljenohidratna kompozicija i polisaharidna struktura rastvorljivih i nerastvorljivih frakcija iz ekstrakcija sa 0.1N HCl ustanovljena je upotrebom 1H NMR spektroskopije. Sadržaj manoze i glukoze u uzorcima je ispitan analizom kompozicije upotrebom H2SO4-HPLC (videti tekst Dallies et al. (1998) Yeast 14:1297-1306; koji je ovde u potpunosti uključen po referenci). Procenjeni sadržaj proteina je izračunat upotrebom LECO analize sagorevanjem i množenjem sadržaja azota faktorom 6.25.

Primer 2

Priprema antigena

Oksidacija preparata (1 → 4-)α -/(1 → 6)-β -D-glukana pomoću Ac2O/DMSO

[0088] Petsto osamdeset miligrama "rastvorljivog" glukana smešteno je u staklenu bočicu od 22 ml opremljenu štapićem za magnetno mešanje i zatvorenu gumeni zapušačem. U ovu bočicu je dodato 10 ml anhidrovanog DMSO i 110 µl anhidrida sirćetne kiseline upotrebom staklenog šprica, na sobnoj temperaturi i uz mućkanje. Suspenzija glukana se u potpunosti rastvorila u toku 4 časa mešanja na 20°C. Mešanje smeše je nastavljeno 24 časa, nakon čega je reakciona smeša razblažena sa 40 ml vode. Rezultujući bistri rastvor je koncentrovan upotrebom Amicon®15 ultrafiltracionog uređaja za centrifugiranje od 30 kDa i ostatak na filteru je opran pet puta sa 12 ml dejonizovane vode pri svakom pranju, da bi se izdvojio i prečistio proizvod oksidacije od rastvarača i reaktanata. Sva centrifugiranja su izvedena na 4 750 x g/30 min/10°C. Finalni ostatak na filteru je sakupljen i osušen zamrzavanjem dajući 502 mg oksidovanog (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukana u obliku belog praška. Proizvod je bio delimično rastvorljiv u vodi i potpuno rastvorljiv u DMSO.

Elementalna analiza

[0089] Nađeno za oksidovani glukan: C-40.05%; H-6.61%. Izračunato za C6H8O5x H2O: C-40.48%; H-5.66%

Reduktivna aminacija oksidovanog (1 → 4)α -/(1 → 6)β -D-glukana sa BSA

[0090] Uzorak od 412 mg oksidovanog (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukana je rastvoren u 20 ml dejonizovane vode i kombinovan sa rastvorom 256 mg BSA u 2 ml dejonizovane vode uz magnetno mešanje. Smeša je zatim obrađena sa 60 mg čvrstog natrijum cijanoborohidrida. Reakciona bočica je zatvorena gumenim zapušačem i smeša je mešana na 20°C tokom 24 časa. Nakon tog vremena, dodato je 100 mg natrijum borohidrida i smeša je mešana dodatna 22 časa. Bistar rastvor je zatim filtriran kroz Amicon®15 ultra-filtracioni uređaj za centrifugiranje od 30 kDa na 4750 x g/30 min/10°C. Ostatak je opran na filteru četiri puta sa 12 ml vode za svako pranje i finalni koncentrat je liofilizovan, čime je dobijeno 573 mg belog praška.

Elementalna analiza

[0091] C 45.01%, H 6.40%, N 2.11 %.

Izdvajanje konjugata (1 → 4)-α-/(1 → 6)-β-D-glukan-BSA pomoću jonoizmenjivačke hromatografije na DEAE celulozi

[0092] Rastvor 400 mg sirovog konjugata u 5 ml 5 mM Na2HPO4nanet je na vrh staklene hromatografske kolone od 2 x 55 cm koja sadrži 50 g DEAE celuloze u 5 mM Na2HPO4. Na2HPO4u različitim koncentracijama je korišćen za eluiranje: 40.1 mg (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukana (220 ml, 5 mM); 132.3 mg čistog konjugata (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan-BSA (280 ml, 55 mM); i 96.7 mg BSA (80 ml, 100 mM). Rastvor čistog konjugata (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan-BSA je koncentrovan do zapremine od 2 ml upotrebom AMICON15 ultrafiltracionog uređaja za centrifugiranje od 30 kDa, opran dejonizovanom vodom i liofilizovan, čime je dobijeno 132.3 mg (24.4% ukupnog prinosa) proizvoda u vidu belog praška. Gel elektroforeza je proizvela široku traku koja se vizualizuje upotrebom boje Komazi-plavo i PAS, sa centrom na ∼170 kDa. Nimalo slobodnog BSA, ili bilo koje druge nečistoće nije detektovano na elektroforegramima.

Elementalna analiza

[0093] C 40.11%, H 6.23%, N 3.06%, (20.44 tež.% od BSA). Izračunati odnos β-glukan : BSA je 4:1.

Primer 3

Priprema i prečišćavanje poliklonskog antitela

Priprema antigena i imunizacija zeca

[0094] Deset mg antigena konjugovanog sa BSA koji je pripremljen kao što je opisano u primeru 2 je liofilizovano, skladišteno na 4°C, i upotrebljeno za imunizaciju tri zeca (200 µg antigena po imunizaciji). Protokol imunizacije je dat u tabeli 1.

Tabela 1. Protokol imunizacije za stvaranje anti-(1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukan-BSA poliklonskih antitela u zečevima.

Prečišćavanje poliklonskog antitela na afinitetnoj fazi

[0095] Jedan gram epoksi-aktivirane-agaroze (Sigma E 6632) je suspendovan u rastvoru 2.68 g BSA (SIGMA A2153) u 27 ml 10 mM Na2HPO4i smeša je mešana 4 časa na 4°C u kupatilu sa mešavinom led-voda. Nakon tog vremena, smeša je centrifugirana na 2500 x g/5 min/10°C i talog je opran i centrifugiran još četiri puta sa po 30 ml 100 mM Na2HPO4/0.05 tež.% NaN3za svako centrifugiranje.

[0096] Talog iz poslednjeg centrifugiranja afinitetne faze obložene sa BSA (opisane gore u tekstu) suspendovan je u rastvoru 750 µl seruma (sakupljenog od zečeva koji su imunizovani konjugatom "rastvorljivi" glukan-BSA) u 20 ml 10mM Na2HPO4/0.05 tež.% NaN3i rotiran 2 časa na sobnoj temperaturi, a zatim centrifugiran na 1500 x g/5 min/10°C. Supernatant je sakupljen i talog je opran još tri puta sa 20 ml istog pufera, čime su sakupljena još tri supernatanta. Specifičnost supernatanta prema BSA i "rastvorljivom" glukanu je ispitana kao što je prikazano na slici 2. Prvi i drugi supernatant, koji su sadržali značajnu količinu antitela, su spojeni i koncentrovani do zapremine od 2.5 ml centrifugiranjem na 5000 x g/5 min/10°C upotrebom AMICON Ultra-15 filter-uređaja za centrifugiranje od 10 kDa. Koncentrat je opran na filteru sa 10 mM Na2HPO4/0.05 tež.%NaN3i razblažen do zapremine od 6 ml (6 g) sa istim puferom. Ovaj rastvor u razblaženju od 1:800 "afinitetno prečišćenih antitela" je korišćen u ELISA testu za MYCOSORB u stočnoj hrani za životinje. Dobijena kalibraciona kriva je prikazana na slici 3.

Primer 4

Detekcija (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukana ćelijskog zida kvasca pomoću ELISA testa Materijal i metode

Reagensi

[0097] Korišćeni su samo reagensi poznatog analitičkog stepena čistoće, osim ako nije drugačije naznačeno, i dejonizovana ili demineralizovana voda ili voda ekvivalentne čistoće (18,2 MΩ/cm na 25°C).

Reagensi i priprema rastvora reagensa su navedeni u nastavku:

• Hlorovodonična kiselina, 12.1 N; HCl

• Razblažena hlorovodonična kiselina, 1 N; HCl: 41.3 ml HCl 12.1 N je polako dodato u 400 ml dejonizovane vode i mešano štapićem na ploči za mešanje do hlađenja. Rastvor je prenet u volumetrijsku bocu od 500 ml i dopunjen do potrebne zapremine dejonizovanom vodom, zatim je uskladišten na sobnoj temperaturi.

• Dimetil sulfoksid: upotrebljen je DMSO visoke čistoće, pogodan za spektrofotometriju, tečnu hromatografiju i gasnu hromatografiju.

• Reagens za ekstrakciju: Za pripremu reagensa za ekstrakciju, 900 ml DMSO je pomešano sa 98.75 ml dejonizovane vode i 1.25 ml HCl 12,1 N. Rastvor je mešan štapićem na ploči za mešanje na srednjoj brzini i sobnoj temperaturi, zatim uskladišten na 20°C ili više.

• Natrijum hlorid ("NaCl")

• Kalijum hlorid ("KCl")

• Dinatrijum hidrogen fosfat ("Na2HPO4")

• Kalijum dihidrogen fosfat ("KH2PO4")

• Fosfatno puferisani fiziološki rastvor ("PBS") 10X: Za pripremu 10X PBS, 80.0 g natrijum hlorida [NaCl], 2.0 g kalijum hlorida [KCl], 14.2 g dinatrijum hidrogen fosfata [Na2HPO4] i 2.4 g kalijum dihidrogen fosfata [KH2PO4] je pomešano sa približno 800 ml dejonizovane vode. Rastvor je mešan upotrebom štapića za mešanje na ploči za mešanje do potpunog rastvaranja čvrstih supstanci. Rastvor je prenet u volumetrijsku bocu od 1000 ml i zapremina je dopunjena dejonizovanom vodom, zatim je uskladišten na sobnoj temperaturi ili na 2 - 8°C. Maksimalno vreme skladištenja iznosilo je 6 meseci na 2 - 8°C u vidu nerazblažene tečnosti. Rastvor je zagrejan do sobne temperature pre upotrebe.

• Razblaženi PBS, 1X: Za pripremu 1X PBS, 1 zapremina PBS razblažena je 10X sa 9 zapremina dejonizovane vode. Razblaženje je mešano upotrebom štapića za mešanje na ploči za mešanje na srednjoj brzini i sobnoj temperaturi. Maksimalno vreme skladištenja iznosilo je jedan dan.

• Polisorbat 20

• Fosfatno puferisani fiziološki rastvor, 0.01 M sa 0.05 % polisorbata 20, pH 7.4: Za pripremu, sadržaj jedne kesice je rastvoren u 1000 ml dejonizovane vode. Rastvor je mešan na ploči za mešanje do potpunog rastvaranja, zatim je skladišten na sobnoj temperaturi ili na 2 -8°C. Maksimalno vreme skladištenja iznosilo je 6 meseci na 2 - 8°C u vidu nerazblažene tečnosti. Rastvor je zagrejan do sobne temperature pre upotrebe.

• Nemasno mleko u prahu

• Nemasno mleko u prahu, 3 % (tež./zapr.) u PBS, 1X reagens za blokiranje: Za pripremu 1X reagensa za blokiranje, mleko u prahu je potpuno rastvoreno u 1X PBS pre upotrebe. Za blokiranje svake ploče bilo je potrebno 10 ml. Maksimalno vreme skladištenja iznosilo je jedan dan.

• Zečja poliklonska antitela; primarno antitelo (rastvor antitela br. 1): Afinitetno-prečišćena antitela pripremljena kao što je ovde opisano. Skladištena na - 80°C do upotrebe.

• Razblaženi rastvor zečjeg poliklonskog antitela: Razblažena do 1 : Xiu PBS dodavanjem 1 µl rastvora antitela br.1 u Xiµl PBS, 1X. Za svaku mikrotitarsku ploču bilo je potrebno 10 ml rastvora. Razblaženi rastvor antitela je dobro promešan pre upotrebe, i višak razblaženog antitela je odbačen. Maksimalno vreme skladištenja iznosilo je jedan dan.

• Kozja antitela afinitetnog stepena čistoće protiv zečjeg IgG (H+L) konjugovana sa peroksidazom; HRP-konjugovano sekundarno antitelo, ref. br. 111-035-045 (Jackson ImmunoResearch, PA, USA - rastvor antitela br. 2): Rehidratisano je sa 1.5 ml dejonizovane vode i centrifugirano do dobijanja potpuno bistrog rastvora. Uskladišteno je u alikvotima od 10 µl na - 80°C do upotrebe. Maksimalno vreme skladištenja iznosilo je 6 nedelja na 2 - 8°C u vidu nerazblažene tečnosti.

• Razblaženo kozje anti-zečje antitelo: Razblaženo je do 1:Yiu PBS dodavanjem 1 µl rastvora antitela br. 2 u Yiµl PBS, 1X. Razblaženi rastvor antitela je dobro promešan pre upotrebe, i višak razblaženog antitela je odbačen. Maksimalno vreme skladištenja iznosilo je jedan dan. • Supstrat peroksidaze za mikroploču SureBlue Reserve TMB: Potrebna zapremina je razdeljena samo u boce Nalgene HDPE i LDPE boje ćilibara. Supstrat je zagrejan do sobne temperature pre upotrebe. Poklopac je čvrsto zatvoren da bi se obezbedila zaštita od svetlosti. Suvišni supstrat je odbačen, i reagens je uskladišten na 2 - 8°C. Maksimalno vreme skladištenja iznosilo je 24 meseca od datuma proizvodnje pri skladištenju na 8°C.

• Štok-rastvor uzorka MYCOSORB; serija ref. br. 285965 (ALLTECH, Inc., KY, USA): Upotrebljen je homogeni uzorak MYCOSORB.

• Razblaživanje MYCOSORB u hranivima: 20 g materijala stočne hrane pomešano je sa rastućim količinama proizvoda MYCOSORB (0.01; 0.02; 0.08; 0.10; 0.12 g) u bocama za centrifugiranje od 250 ml u tri replikata za izradu standardne krive. Boca je mućkana na orbitalnoj mešalici na 400 obr./min. tokom 1 časa. Preciznost merenja za materijale stočne hrane iznosila je ± 0.025 g, a za proizvod MYCOSORB ± 0.005 g.

• Velika serija razblaženog MYCOSORB u hranivima: Veliki uzorak razblaženog proizvoda MYCOSORB u stočnoj hrani pripremljen je upotrebom 1.2 g proizvoda i 300 g materijala stočne hrane u kontejneru od 1000 ml. Boca je mućkana na orbitalnoj mešalici na 400 obr./min. tokom 1 časa. Finalna koncentracija proizvoda MYCOSORB u materijalu stočne hrane bila je 4.0 kg/T. U bocu za centrifugiranje od 250 ml preneto je 20.0 g homogenizovane mešavine proizvoda stočne hrane iz velike serije od 300.0 g. Prenošenje je ponovljeno još 9 puta da bi se dobilo 10 replikata uzorka. Smeša je dobro mešana između svaka 3 pripremljena alikvota da bi se izbeglo taloženje proizvoda na dnu boce. Preciznost merenja za materijale stočne hrane iznosila je ± 0.025 g, a za proizvod MYCOSORB ± 0.005 g.

• Razblaženje nepoznate količine MYCOSORB u hranivima: Nepoznati uzorak pripremljen je prenošenjem nepoznate količine proizvoda MYCOSORB i 20.0 g (± 0,025 g) materijala stočne hrane u svaku od pet boca za centrifugiranje od 250 ml. Boca je mućkana na orbitalnoj mešalici na 400 obr./min. tokom 1 časa. Priprema uzorka/uzoraka za standardnu krivu za je urađena istovremeno.

Formulacija uzorka

[0098] Tri materijala stočne hrane (videti tabelu 4, tabelu 5 i tabelu 6) su korišćena za validaciju testa. Formulacija materijala stočne hrane je odabrana prema kompozicijama koje mogu da se nađu u stanju tehnike. Veličina uzorka bila je ukupno 15 kg materijala stočne hrane koji je pažljivo homogenizovan pre slanja u laboratoriju. Uzorak je skladišten na 2 -8°C tokom celog perioda ispitivanja.

Verifikacija homogenosti uzorka

[0099] Homogenost razblaženja proizvoda MYCOSORB u materijalu stočne hrane verifikovana je pripremom velike serije proizvoda MYCOSORB razblažene u stočnoj hrani u intermedijernim koncentracijama proizvoda u stočnoj hrani od 4.0 kg/T. Uzorak je podeljen na 10 pod-uzoraka i dalje ekstrahovan prema proceduri za ekstrakciju, i nakon toga je određen koeficijent varijacije za detekciju proizvoda pomoću ELISA testa četiri puta za svaki od 10 uzoraka.

Priprema uzorka

[0100] Priprema standardnog uzorka je izvedena kao što je ovde opisano i prikazana je u tabeli 2, sa proizvodom MYCOSORB koji treba da se ispita. U ovom slučaju, polazni štok proizvoda je uzet kao referentni, kao što je ovde naznačeno. Nepoznati uzorci su pripremljeni kao što je gore opisano. Nije potrebno usitnjavanje uzorka stočne hrane pre izvođenja procedure ekstrakcije, (ovo bi takođe bio slučaj da je materijal stočne hrane obezbeđen u peletiranom obliku). Nađeno je da usitnjavanje materijala stočne hrane može da utiče na finalnu pouzdanost testa.

Tabela 2. Koraci razblaživanja proizvoda MYCOSORB za standardnu krivu.

Procedura ekstrakcije

[0101] Ceo niz boca je mućkan na orbitalnoj mešalici na 400 obr./min. tokom 1 časa. Po tri boce su uklanjane u isto vreme, i u svaku bocu je dodato po 80 ml reagensa za ekstrakciju upotrebom vršnog volumetrijskog dispenzera. Boce su zatvorene zatvaračima. Svi uzorci su mućkani ručno da bi se osiguralo potpuno mešanje sa reagensom za ekstrakciju. Boce su smeštene u termostatirano vodeno kupatilo na 80°C tokom 1 časa, pri čemu je rastvor stočne hrane u potpunosti potopljen. Posle inkubacije, boce su uklonjene iz vodenog kupatila i sadržaj boca je izmešan štapićem (marke NALGENE) upotrebom laboratorijskog mešača sa velikim obrtnim momenatom. Smeša je potpuno homogenizovana. Čist štapić je korišćen za svaki nivo uključenosti proizvoda MYCOSORB i za svaki nepoznati uzorak/uzorke. Boce su premeštene u termostatirano vodeno kupatilo na 80°C tokom 1 časa. Posle inkubacije, boce su uklonjene iz vodenog kupatila i 80 ml dejonizovane vode je dodato u svaku bocu, upotrebom vršnog volumetrijskog dispenzera, a zatim su boce zatvorene zatvaračima. Boce su mućkane ručno do potpunog mešanja; po potrebi su korišćeni štapići marke NALGENE sa laboratorijskim mešačem sa velikim obrtnim momenatom. Boce su centrifugirane na 8 000 g tokom 10 minuta. Upotrebom staklenih pipeta, približno 10 ml supernatanta je preneto u sterilne epruvete za centrifugiranje od 15 ml. Epruvete su centrifugirane na 4000 g tokom 10 minuta i sadržaj je prenet odlivanjem u adekvatno obeležene nove sterilne epruvete za centrifugiranje od 15 ml. Epruvete su uskladištene na - 20°C preko noći do upotrebe za ELISA test.

Procedura ELISA testa

[0102] Supstrat peroksidaze za mikroploču SureBlue Reserve TMB je korišćen za pokretanje kolorimetrijske reakcije putem reakcije sa razblaženim HRP-obeleženim sekundarnim antitelom, koje dalje reaguje sa razblaženim primarnim antitelom, koje specifično reaguje sa supstratom od interesa ekstrahovanim iz razblaženog proizvoda MYCOSORB, imobilizovanim na mikrotitarskoj ploči. Kolorimetrijska reakcija je zaustavljena posle 20 minuta upotrebom HCl, 1N i očitavanje apsorbance je izvedeno upotrebom čitača ploča na talasnoj dužini od 450 nm. Na taj način, slepe probe napravljene samo od materijala stočne hrane su merene da bi se uzele u obzir moguće kolorimetrijske varijacije koje potiču od matrice stočne hrane i daju pozadinski signal na spektrofotometru. Za obračun, vrednosti za slepu probu su oduzete od vrednosti apsorbance dobijene za svaki uzorak.

[0103] Prethodno ekstrahovani uzorci skladišteni preko noći su odmrznuti i zagrejani do sobne temperature. Uzorci su vorteksovani da bi se osigurala homogenost uzorka pre upotrebe ELISA testa za oblaganje bunarčića mikroploča.

[0104] Za svaki replikat uzorka, 100 µl supernatanta preneto je u svaki od 3 bunarčića mikrotitarske ploče sa 96 bunarčića kao što je prikazano u tabeli 3. Nasumično raspoređivanje uzoraka na ploči može da se izvede u laboratoriji opremljenoj programiranim robotizovanim dispenzerom za bunarčiće mikrotitarske ploče. Uzorci za standardnu krivu i replikati uzoraka su svi raspoređeni na jednu istu ploču (tj. svi replikati uzorka 0 kg/T su smešteni duž reda/kolone E1 do F10). Replikati uzoraka nepoznatog MYCOSORB su raspoređeni na istoj ploči (tj. smešteni duž reda/kolone A11 do C12). Mikrotitarske ploče su zapečaćene adhezivnim filmom za mikroploče i inkubirane na 37°C tokom 1 časa. Posle inkubacije, rastvor u svakom bunarčiću mikrotitarske ploče je uklonjen i zamenjen sa 250 µl PBS, 1X, za pojedinačno pranje. Postupak je ponavljan ukupno još 2 puta. Svaki bunarčić mikrotitarske ploče je blokiran sa 100 µl razblaženog nemasnog mleka u rastvoru PBS i inkubiran na sobnoj temperaturi 1 čas. Posle inkubacije, rastvor u svakom bunarčiću je uklonjen i zamenjen sa 250 µl PBS, 1X, za pojedinačno pranje, a nakon toga sa 250 µl PBS koji sadrži 0.05% polisorbata 20, u 2 pranja.

[0105] Zapremina od 100 µl razblaženog primarnog antitela dodata je u svaki bunarčić. Mikrotitarska ploča je inkubirana na sobnoj temperaturi 1 čas. Posle inkubacije, rastvor u svakom bunarčiću mikrotitarske ploče je uklonjen i zamenjen sa 250 µl PBS, 1X, koji sadrži 0.05% polisorbata 20, u 3 pranja.

[0106] Zapremina od 100 µl razblaženog sekundarnog antitela dodata je u svaki bunarčić. Mikrotitarska ploča je inkubirana na sobnoj temperaturi 1 čas. Posle inkubacije, rastvor u svakom bunarčiću mikrotitarske ploče je uklonjen i zamenjen sa 250 µl PBS, 1X, koji sadrži 0.05% polisorbata 20, u 3 pranja.

[0107] Zapremina od 100 µl TMB supstrata, unapred zagrejanog do sobne temperature, dodata je u svaki bunarčić i mikrotitarska ploča je inkubirana 20 minuta na sobnoj temperaturi. Posle tačno 20 minuta sa TMB supstratom, odmah je dodata zapremina od 100 µl 1N HCl u svaki bunarčić da bi se zaustavilo razvijanje boje. Svaka mikrotitarska ploča je očitana na čitaču za mikrotitarsku ploču na 450 nm.

Tabela 3. Raspored grupa uzoraka na mikrotitarskoj ploči.

Isključivanje podataka iz replikata

[0108] Statistička analiza podataka je bila potrebna da bi se potvrdila sličnost svih replikata, uz isključivanje onih koji nisu prošli Diksonov Q-test, i zatim su posledično identifikovani kao netipične vrednosti prema definiciji: Qn= |xa- xb|/R, gde je R opseg svih vrednosti; xaje pretpostavljena netipična vrednost; xbje vrednost najbliža xa. Ako je Qizračunato> Qtabelarnotada treba odbaciti sumnjivu tačku u intervalu pouzdanosti od 95%.

Izrada standardne krive

[0109] Kalibracione krive su korišćene za kvantitativno određivanje. One se konstruišu za svaku matricu stočne hrane upotrebom bar pet nivoa (uključujući nulu) u radnom opsegu proizvoda, kao što je izloženo u Direktivi Saveta 96/23. Izračunata je srednja vrednost apsorbanci na OD450za bunarčiće tri replikata za svaku grupu uzoraka. Izračunata je srednja vrednost apsorbanci na OD450za bunarčiće deset replikata za uzorak slepe probe stočne hrane. Standardna kriva ili kalibraciona kriva je zatim napravljena sa dobijenom razlikom Δ OD450(OD450grupe uzorka - OD450slepe probe stočne hrane) na ordinati i različitim opsezima koncentracije proizvoda MYCOSORB, 0.5, 1.0, 4.0, 5.0, 6.0 kg/T na apscisi.

[0110] Koeficijent regresije i jednačina zavisnosti nivoa uključenosti koji su naneti na grafik nasuprot OD450apsorbanci izračunati su linearnom regresijom upotrebom linije koja najbolje odgovara, Δ OD450= Ax (MYCOSORB) posle korekcije vrednosti prosečnom vrednošću za slepu probu. Opseg prihvatljivosti i linearnost kalibracione krive validirana je pomoću vrednosti koeficijenta korelacije (r2) veće od 0.95. Odgovarajuća jednačina za krivu je zatim korišćena za određivanje nivoa uključenosti proizvoda MYCOSORB u nepoznatom uzorku/uzorcima rešavanjem odgovarajuće jednačine.

Interpolacija

[0111] Ako se pomoću standardne krive utvrdi da je koeficijent korelacije iznad r<2>> 0.95, tada se odgovarajuća jednačina korigovane krive F(x) = Ax, (koja je oduzeta od pozadinskog signala i preseca početak koordinatnog sistema) koristi za određivanje nivoa uključenosti proizvoda MYCOSORB u nepoznatom uzorku/uzorcima. Izračunava se prosečna vrednost deset replikata na OD450za nepoznati nivo uključenosti (C) proizvoda MYCOSORB. Dobijena prosečna vrednost se oduzima od prosečne vrednosti apsorbanci na OD450za bunarčiće deset replikata za slepu probu uzorka stočne hrane koja je prethodno izračunata. Prosečna vrednost OD450se zatim koristi za rešavanje jednačine za korigovanu krivu F-1(yc), gde je yc=Axc: xc= yc/A, gde je ycdobijena srednja vrednost OD450za nepoznati uzorak (C) minus OD450slepe probe, xCje odgovarajući nivo uključenosti proizvoda MYCOSORB, i A je nagib standardne krive, u kg/T OD450.

Limit detekcije i kvantifikacije

[0112] Limit detekcije (LD= 3σslepe probe) i limit kvantifikacije (LQ= 10σslepe probe) su izmereni u skladu sa IUPAC nomenklaturom i izraženi kao ΔOD450.

[0113] Limit detekcije (LD) i limit kvantifikacije (LQ) su određeni na osnovu analize slepih proba materijala i preračunati u koncentraciju na osnovu linearne regresije, korigovane uzimajući u obzir srednju vrednost pozadinskog signala OD450pomoću kalibracione krive F(x) = Ax rešene prema: LD= 3σslepe probe/A i LQ= 3σslepe probe/A, gde je LDminimalna detektabilna koncentracija proizvoda ili limit detekcije; LQje minimalna koncentracija proizvoda koja može da se kvantifikuje ili limit kvantifikacije.

Homogenost

[0114] Koeficijent varijacije homogenosti (RSDH= CVH) definisan je kao prosečni koeficijent varijacije iz 10 nezavisnih replikata dobijenih iz istog uzorka u istom danu, koje je radio isti tehničar, istom opremom i istim postupkom.

Preciznost: Ponovljivost

[0115] Preciznost ponovljivosti unutar serije (RSDintra= CVintra) definisana je kao prosečan koeficijent varijacije iz ponavljanja dobijenih iz istog uzorka u istom danu za istu seriju, koje je radio isti tehničar, istom opremom i istim postupkom.

[0116] Preciznost ponovljivosti između serija (RSDInter= CVInter) je prosečan koeficijent varijacije iz nezavisnih rezultata dobijenih iz istog uzorka različitih dana tokom različitih serija, koje je radio isti tehničar, istom opremom i istim postupkom.

Preciznost: Ukupna preciznost

[0117] Preciznost ocenjuje disperziju (ili stepen usklađenosti) uzastopnih merenja iste količine. Disperzija niza merenja se obično izražava preko standardne devijacije. Preciznost je prema tome izračunata iz standardne devijacije rezultata pojedinačnog eksperimenta, na jednom nivou uključenosti proizvoda, dobijenih iz istog uzorka u istom danu, koje je radio isti tehničar, istom opremom i istim postupkom; iz standardne devijacije koja poredi svaku pojedinačnu seriju, koju je radio isti tehničar, istom opremom i istim postupkom prema

formuli: gde je σTotalstandardna devijacija ukupnog niza eksperimenata, σintraje standardna devijacija pojedinačnog eksperimenta, σInterje standardna devijacija između više eksperimenata, i n je broj replikata.

Poređenje standardne devijacije je postignuto analizom varijanse (jednosmerna ANOVA) upotrebom F-testa (p-vrednost ≤ 0.05) između varijanse srednjih vrednosti grupe i srednje vrednosti unutar-grupnih varijansi.

Tačnost

[0118] Tačnost predstavlja stepen usklađenosti između rezultata testa i prihvaćene referentne vrednosti za proizvod koji se meri. Tačnost se prema tome procenjuje na osnovu merenja oporavka proizvoda izraženog u procentima. Oporavak proizvoda predstavlja, u tom smislu, proporciju količine prisutnog ili umešanog analita, koji je ekstrahovan i dostupan za merenje. Greška predstavlja razliku između rezultata testa i prihvaćene referentne vrednosti (dodate poznate količine analita). Izračunavanja su urađena prema formulama:

Oporavak proizvoda koncentracija izmerena u uzorku sa

dodatom poznatom količinom analita; Xbje koncentracija izmerena u uzorku u koji nije dodat analit (slepa proba); XTHje teoretska koncentracija.

Materijal stočne hrane upotrebljen za validacione testove

[0119] Testovi su izvedeni u Centru za nutrigenomiku životinja i primenjenu ishranu životinja u ALLTECH, Inc., KY, SAD na formulaciji stočne hrane za muznu stoku, formulaciji hrane za piliće i formulaciji stočne hrane za svinje materijala stočne hrane pomešanog sa različitim nivoima uključenosti proizvoda MYCOSORB. Potpuni opis formulacije stočne hrane dat je niže u tekstu.

Materijal stočne hrane za muznu stoku

[0120] Materijal stočne hrane je formulisan u Coralis Vern (Vern sur Seiche, Francuska, ref. br. 111605) pod nazivom formule "Spirit Lait 2L5" (Tabela 4). Veličina uzorka bila je ukupno 15 kg materijala stočne hrane koji je pažljivo homogenizovan pre slanja u laboratoriju. Uzorak je uskladišten na 2 - 8°C tokom celog perioda ispitivanja. Materijal stočne hrane za muznu stoku obezbeđen je u peletiranom obliku. Usitnjavanje uzorka stočne hrane nije bilo potrebno pre sprovođenja procedure ekstrakcije.

Tabela 4. Formulacija stočne hrane za muznu stoku upotrebljena za validaciju postupka.

Fosfor svarljiv u rumenu, % 0.466 Strukturna vrednost, % 0.220 Pšenični kolači, % 20.000 Pšenični kolači tritikale, % 20.000 Kolači cerealija, % 26.000 Ukupan iznos, pšenične mekinje, % 44.940 Kolači uljane repice, % 8.100 Ukup. MP Granul , tvrdoća granula % 20.000 Vitamin A, UI/kg 4000 Vitamin D3, UI/kg 2000

* Služi za definisanje proteinske vrednosti stočne hrane i potreba životinje za proteinima, obe definisane preko pravog proteina potpuno svarljivog u tankom crevu ("PDI"). Sadržaj PDI u ishrani je zbir (i) frakcije PDIA, dijetetskog proteina nerazgrađenog u rumenu, ali potpuno svarljivog u tankom crevu; (ii) frakcije PDIM, mikrobnog pravog proteina koji je potpuno svarljiv u tankom crevu. Svaka stočna hrana doprinosi mikrobnoj sintezi proteina razgradivim azotom (PDIMN) i dostupnom energijom koju predaje mikroorganizmima rumena (PDIME). Vrednost svake stočne hrane data je direktno zbirom PDIA i PDIM, uzimajući u obzir sledeće dve jednačine: (1) PDIN = PDIA PDIMN i (2) PDIE = PDIA PDIME.

Materijal hrane za piliće

[0121] Materijal stočne hrane je formulisan na Coldstream Univerzitet u Kentakiju, od strane udružene istraživačke grupe između Univerziteta u Kentakiju i ALLTECH, Inc., KY, SAD (Tabela 5). Preparat je napravljen prema kompozicijama koje su poznate u stanju tehnike i koje se mogu uopštiti na formulacije koje se najčešće nalaze u Evropskoj uniji, Severnoj Americi, Latinskoj Americi itd. Veličina uzorka bila je ukupno 15 kg materijala stočne hrane koji je pažljivo homogenizovan pre slanja u laboratoriju. Uzorak je uskladišten na 2 - 8°C tokom celog perioda ispitivanja.

Tabela 5. Formulacija hrane za piliće upotrebljena za validaciju postupka.

Materijal stočne hrane za svinje

[0122] Materijal stočne hrane je formulisan na Coldstream Univerzitet u Kentakiju, od strane udružene istraživačke grupe između Univerziteta u Kentakiju i ALLTECH, Inc., KY, SAD (Tabela 6). Preparat je napravljen prema kompozicijama koje su poznate u stanju tehnike i koje se mogu uopštiti na formulacije koje se najčešće nalaze u Evropskoj uniji, Severnoj Americi, Latinskoj Americi itd. Veličina uzorka bila je ukupno 15 kg materijala stočne hrane koji je pažljivo homogenizovan pre slanja u laboratoriju. Uzorak je uskladišten na 2 - 8°C tokom celog perioda ispitivanja.

Tabela 6. Formulacija stočne hrane za svinje upotrebljena za validaciju postupka.

Validacija upotrebom materijala stočne hrane za muznu stoku

[0123] Testovi su izvedeni u Centru za nutrigenomiku životinja i primenjenu ishranu životinja u ALLTECH, Inc., KY, SAD na čvrstoj formulaciji evropskog tipa stočne hrane za muznu stoku pomešanog sa pet različitih koncentracija proizvoda MYCOSORB.

[0124] Materijali stočne hrane za muznu stoku pojedinačno pomešani sa 0.0; 0.5; 1.0; 4.0; 5.0; 6.0 kg/T proizvoda MYCOSORB su ispitivani kao i uzorak istog materijala stočne hrane za muznu stoku pomešan sa nepoznatim nivoom sadržaja proizvoda MYCOSORB raspoređenog na istoj mikrotitarskoj ploči.

Primenljivost

[0125] Validacija je sprovedena u cilju određivanja karakteristika ELISA testa razvijenog za specifično ispitivanje proizvoda MYCOSORB i njegovih analoga, kao metoda krajnje tačke za sledljivost u svrhu praćenja proizvoda u složenim hranivima.

[0126] Za validaciju je korišćeno šest nivoa proizvoda MYCOSORB koji odgovaraju radnom opsegu nivoa sadržaja (0.0; 0.5; 1.0; 4.0; 5.0; 6.0 kg/T) pomešanog sa uzorkom stočne hrane.

[0127] Razblaženi rastvor zečjeg poliklonskog antitela: razblaženje primarnog antitela je prilagođeno prema nivoima pozadinskog šuma. Antitela su prema tome razblažena do 1:2500 u PBS dodavanjem 1 µl rastvora antitela br.1 u 1.2 ml PBS, 1X. Za svaku mikrotitarsku ploču bilo je potrebno 10 ml rastvora.

[0128] Razblaženo kozje anti-zečje antitelo: razblaženje sekundarnog antitela prilagođeno je nivoima pozadinskog šuma. Antitela su stoga razblažena do 1:20 000 u PBS dodavanjem 1 µl rastvora antitela br.2 u 20.0 ml PBS, 1X.

Homogenost

[0129] Verifikacija homogenosti uzorka je postignuta za srednji nivo uključenosti proizvoda MYCOSORB (4.0 kg/T) u eksperimentalnom planu. Test za ovaj konkretni nivo je ponovljen 5 puta na 10 pojedinačnih uzoraka upotrebom 4 ponovka za svaki.

[0130] U skladu sa izračunatim vrednostima koje su detaljno prikazane u tabeli 7, CVHje iznosio 4.53%.

Tabela 7. Procena homogenosti na jednoj koncentraciji od 4.0 kg/T proizvoda MYCOSORB pomešanog sa evropskim tipom ishrane za muznu stoku ocenjena pomoću ELISA postupka u 5 serija na 10 pojedinačnih preparata uzorka ispitivanih u 4 replikata.

Kalibracija

[0131] Kalibracija testa je sprovedena na stočnoj hrani pomešanoj sa poznatom koncentracijom standardnog uzorka kao što je ovde opisano i u opsegu 0.0 do 6.0 kg/T proizvoda MYCOSORB. Za definisanje odnosa između koncentracije i odgovora (OD450) korišćena je linearna kriva, y = Ax,. Prosečna standardna kriva iz 5 serija prikazana je na slici 4.

Linearnost

[0132] Linearnost standardnih krivih procenjena je izračunavanjem koeficijenta regresije prema jednačini za grafički prikazane nivoe uključenosti nasuprot apsorbance OD450, upotrebom linije koja najbolje odgovara i preseca nulu, ΔOD450= Ax(MYCOSORB) nakon oduzimanja slepe probe. Linearnost standardne krive je verifikovana pomoću vrednosti koeficijenta korelacije koja je viša od r<2>> 0.95, tabela 8.

Tabela 8. Linearnost standardne krive.

Ponovljivost

[0133] Ponovljivost je mera unutrašnje varijanse pri oceni ponovljivosti standardne devijacije. Procena ponovljivosti unutar ponavljanja serija dobijena je iz istog uzorka, istog dana u istoj seriji, sa istim tehničarem, istom opremom i postupkom, da bi se predstavila varijacija detekcije unutar serije, CVintra(tabela 9). Procena ponovljivosti između različitih serija dobijena je iz istog uzorka, različitih dana za različite serije, sa istim tehničarem, istom opremom i postupkom da bi se predstavila varijacija detekcije između serija, CVInter, (tabela 10).

[0134] Rezultati pokazuju da standardne krive dobijene istog dana, kao i različitih dana ispoljavaju malu varijabilnost, sa prosečnom preciznošću tokom istog dana od 5.70% i preciznošću između različitih dana od 7.86%, u radnom opsegu standardne krive između 0.0 i 6.0 kg/T. Ukupna preciznost je bila 8.28% (tabela 11).

Tabela 9. Preciznost ponovljivosti unutar serije pri izradi standardne krive.

Tabela 10. Preciznost ponovljivosti između serija pri izradi standardne krive.

Tabela 11. Ukupna preciznost pri izradi standardne krive.

LDi LQ(osetljivost)

[0135] Vrednosti LDi LQsu prikazane u tabeli 12. Nađene vrednosti LQbile su ispod minimalne preporučene stope uključenosti od 2 kg/T proizvoda MYCOSORB, omogućavajući njegovo kvantitativno određivanje u materijalu stočne hrane.

Limit detekcije LD= 0.501 ± 0.103 kg/T

Limit kvantifikacije LQ= 1.800 ± 0.389 kg/T

Tabela 12. Određivanje LDi LQ.

Tačnost

[0136] Tačnost je merena u 5 nezavisnih eksperimenata koji su obuhvatali 10 nezavisnih uzoraka svaki, sa 4 replikata svaki, za koncentraciju proizvoda MYCOSORB pomešanog sa materijalom stočne hrane od 4.0 kg/T. Finalna koncentracija za svaki uzorak izračunata je prema jednačini koja je prikazana gore u tekstu upotrebom zapaženih vrednosti dobijenih za proračun homogenosti (tabela 13). Zatim je prosečna preciznost izračunata iz prosečne tačnosti dobijene za sve serije i upoređena sa dodatom poznatom količinom od 4.0 kg/T proizvoda MYCOSORB pomešanog sa materijalom stočne hrane. Proračuni su izvedeni prema jednačinama koje su date gore u tekstu.

[0137] Rezultati pokazuju da procena oporavka proizvoda za 21% prevazilazi stvarni sadržaj dodate poznate količine proizvoda MYCOSORB u materijalu stočne hrane (tabela 14).

Tabela 13. Tačnost i preciznost merena u 5 nezavisnih eksperimenata koji obuhvataju 10 nezavisnih uzoraka svaki, i sa 4 replikata svaki, za koncentraciju proizvoda MYCOSORB pomešanog sa materijalom stočne hrane od 4.0 kg/T.

Tabela 14. Ukupan oporavak proizvoda meren iz proseka za 5 nezavisnih eksperimenata koji obuhvataju 10 nezavisnih uzoraka svaki, i sa 4 replikata svaki, za koncentraciju proizvoda MYCOSORB pomešanog sa materijalom stočne hrane od 4.0 kg/T.

Validacija upotrebom materijala hrane za piliće

[0138] Testovi su izvedeni u Centru za nutrigenomiku životinja i primenjenu ishranu životinja u ALLTECH, Inc., KY, SAD na čvrstoj formulaciji hrane za piliće pomešanog sa pet različitih koncentracija proizvoda MYCOSORB.

[0124] Materijali hrane za piliće pojedinačno pomešani sa 0.0; 0.5; 1.0; 4.0; 5.0; 6.0 kg/T proizvoda MYCOSORB su ispitivani kao i uzorak istog materijala hrane za piliće pomešan sa nepoznatim nivoom sadržaja proizvoda MYCOSORB raspoređenog na istoj mikrotitarskoj ploči.

Primenljivost

[0140] Validacija je sprovedena u cilju određivanja karakteristika ELISA testa razvijenog za specifično ispitivanje proizvoda MYCOSORB i njegovih analoga, kao metoda krajnje tačke za sledljivost u svrhu praćenja proizvoda u složenim hranivima.

[0141] Za validaciju je korišćeno šest nivoa proizvoda MYCOSORB koji odgovaraju radnom opsegu nivoa uključenosti (0.0; 0.5; 1.0; 4.0; 5.0; 6.0 kg/T) pomešanog sa uzorkom stočne hrane.

[0142] Razblaženi rastvor zečjeg poliklonskog antitela: razblaženje primarnog antitela je prilagođeno prema nivoima pozadinskog šuma. Antitela su prema tome razblažena do 1:7500 u PBS dodavanjem 1 µl rastvora antitela br. 1 (4.15) u 7.5 ml PBS, 1X. Za svaku mikrotitarsku ploču bilo je potrebno 10 ml rastvora.

[0143] Razblaženo kozje anti-zečje antitelo: razblaženje sekundarnog antitela prilagođeno je nivoima pozadinskog šuma. Antitela su stoga razblažena do 1:30 000 u PBS dodavanjem 1 µl rastvora antitela br.2 u 30.0 ml PBS, 1X.

Homogenost

[0144] Verifikacija homogenosti uzorka je postignuta za srednji nivo uključenosti proizvoda MYCOSORB (4.0 kg/T) u eksperimentalnom planu. Test za ovaj konkretni nivo je ponovljen 5 puta na 10 pojedinačnih uzoraka upotrebom 4 ponovka za svaki (tabela 15).

Tabela 15. Procena homogenosti na jednoj koncentraciji od 4.0 kg/T proizvoda MYCOSORB pomešanog sa materijalom hrane za piliće ocenjena pomoću ELISA postupka u 5 serija na 10 pojedinačnih preparata uzorka ispitivanih u 4 replikata.

Kalibracija

[0145] Kalibracija testa je sprovedena na stočnoj hrani pomešanoj sa poznatom koncentracijom standardnog uzorka, kao što je ovde opisano, i u opsegu 0.0 do 6.0 kg/T proizvoda MYCOSORB. Za definisanje odnosa između koncentracije i odgovora (OD450) korišćena je linearna kriva, y = Ax,. Prosečna standardna kriva iz 5 serija prikazana je na slici 5.

Linearnost

[0146] Linearnost standardnih krivih procenjena je izračunavanjem koeficijenta regresije prema jednačini za grafički prikazane nivoe uključenosti nasuprot apsorbance OD450, upotrebom linije koja najbolje odgovara i preseca nulu, ΔOD450= Ax(MYCOSORB) nakon oduzimanja slepe probe. Linearnost standardne krive je verifikovana pomoću vrednosti koeficijenta korelacije koja je viša od r<2>> 0.95. Koeficijent regresije izračunat za svaku standardnu krivu serija i za prosečnu standardnu krivu serija prikazan je u tabeli 16.

Tabela 16. Linearnost standardne krive u materijalu hrane za piliće.

Ponovljivost

[0147] Ponovljivost je mera unutrašnje varijanse pri oceni ponovljivosti standardne devijacije. Procena ponovljivosti unutar ponavljanja serija dobijena je iz istog uzorka, istog dana u istoj seriji, sa istim tehničarem, istom opremom i postupkom, da bi se predstavila varijacija detekcije unutar serije, CVintra(tabela 17). Procena ponovljivosti između različitih serija dobijena je iz istog uzorka, različitih dana tokom različitih serija, sa istim tehničarem, istom opremom i postupkom da bi se predstavila varijacija detekcije između serija, CVInter, (tabela 18).

[0148] Rezultati pokazuju da standardne krive dobijene istog dana, kao i različitih dana ispoljavaju malu varijabilnost, sa prosečnom preciznošću tokom istog dana od 6.00%. Međutim, razlika između uzoraka je bila izraženija sa preciznošću između različitih dana od 21.52%, i ukupnom preciznošću od 21.75% (tabela 19) u radnom opsegu standardne krive između 0.0 i 6.0 kg/T.

Tabela 17. Preciznost ponovljivosti unutar serije pri izradi standardne krive.

T l 1 Pr izn n li i izm ri ri izr i n rn kri

Tabela 19. Ukuna reciznost ri izradi standardne krive.

LDi LQ(osetljivost)

[0149] Vrednosti LDi LQsu prikazane u tabeli 20. Nađene vrednosti LQsu ispod preporučene stope uključenosti proizvoda MYCOSORB, omogućavajući njegovo kvantitativno određivanje u materijalu stočne hrane.

Limit detekcije LD= 0.547 ± 0.237 kg/T.

Limit kvantifikacije LQ= 1.864 ± 0.806 kg/T.

T l 2 r i n LDi L m ri l hr n z ili

Tačnost

[0150] Tačnost je merena u 5 nezavisnih eksperimenata koji su obuhvatali 10 nezavisnih uzoraka svaki, sa 4 replikata svaki, za koncentraciju proizvoda MYCOSORB pomešanog sa materijalom stočne hrane od 4.0 kg/T. Finalna koncentracija za svaki uzorak izračunata je prema jednačini koja je prikazana gore u tekstu upotrebom zapaženih vrednosti dobijenih za proračun homogenosti (tabela 21). Zatim je prosečna preciznost izračunata iz prosečne tačnosti dobijene za sve serije i upoređena sa poznatom dodatom količinom od 4.0 kg/T proizvoda MYCOSORB pomešanog sa materijalom stočne hrane. Proračuni su izvedeni prema jednačinama koje su ovde date.

[0151] Rezultati pokazuju da procena oporavka proizvoda za 18% prevazilazi stvarni sadržaj dodate poznate količine proizvoda MYCOSORB u materijalu stočne hrane (tabela 22).

Tabela 21. Tačnost i preciznost merena u 5 nezavisnih eksperimenata koji obuhvataju 10 nezavisnih uzoraka svaki, i sa 4 replikata svaki, za koncentraciju proizvoda MYCOSORB pomešanog sa materijalom stočne hrane od 4.0 kg/T.

Tabela 22. Ukupan oporavak proizvoda meren iz proseka za 5 nezavisnih eksperimenata koji obuhvataju 10 nezavisnih uzoraka svaki, i sa 4 replikata svaki, za koncentraciju proizvoda MYCOSORB pomešanog sa materijalom stočne hrane od 4.0 kg/T.

Validacija upotrebom materijala stočne hrane za svinje

[0152] Testovi su izvedeni u Centru za nutrigenomiku životinja i primenjenu ishranu životinja u ALLTECH, Inc., KY, SAD na čvrstoj formulaciji stočne hrane za svinje pomešanog sa pet različitih koncentracija proizvoda MYCOSORB.

[0153] Materijali stočne hrane za svinje pojedinačno pomešani sa 0.0; 0.5; 1.0; 4.0; 5.0; 6.0 kg/T proizvoda MYCOSORB su ispitivani kao i uzorak istog materijala stočne hrane za svinje pomešan sa nepoznatim nivoom sadržaja proizvoda MYCOSORB raspoređenog na istoj mikrotitarskoj ploči.

Primenljivost

[0154] Validacija je sprovedena u cilju određivanja karakteristika ELISA testa razvijenog za specifično ispitivanje proizvoda MYCOSORB i njegovih analoga, kao metoda krajnje tačke za sledljivost u svrhu praćenja proizvoda u složenim hranivima.

[0155] Za validaciju je korišćeno šest nivoa proizvoda MYCOSORB koji odgovaraju radnom opsegu nivoa uključenosti (0.0; 0.5; 1.0; 4.0; 5.0; 6.0 kg/T) pomešanog sa uzorkom stočne hrane.

[0156] Razblaženi rastvor zečjeg poliklonskog antitela: razblaženje primarnog antitela je prilagođeno prema nivoima pozadinskog šuma. Antitela su prema tome razblažena do 1:3500 u PBS dodavanjem 1 µl rastvora antitela br.1 u 3.5 ml PBS, 1X. Za svaku mikrotitarsku ploču bilo je potrebno 10 ml rastvora.

[0157] Razblaženo kozje anti-zečje antitelo: razblaženje sekundarnog antitela prilagođeno je nivoima pozadinskog šuma. Antitela su stoga razblažena do 1:30 000 u PBS dodavanjem 1 µl rastvora antitela br.2 u 30.0 ml PBS, 1X.

Homogenost

[0158] Verifikacija homogenosti uzorka je postignuta za srednji nivo uključenosti proizvoda MYCOSORB (4.0 kg/T) u eksperimentalnom planu. Test za ovaj konkretni nivo je ponovljen 5 puta na 10 pojedinačnih uzoraka upotrebom 4 ponovka za svaki (tabela 23).

Tabela 23. Procena homogenosti na jednoj koncentraciji od 4.0 kg/T proizvoda MYCOSORB pomešanog sa materijalom stočne hrane za svinje ocenjena pomoću ELISA postupka u 5 serija na 10 pojedinačnih preparata uzorka ispitivanih u 4 replikata.

Kalibracija

[0159] Kalibracija testa je sprovedena na stočnoj hrani pomešanoj sa poznatom koncentracijom standardnog uzorka kao što je ovde opisano i u opsegu 0.0 do 6.0 kg/T proizvoda MYCOSORB. Za definisanje odnosa između koncentracije i odgovora (OD450) korišćena je linearna kriva, y = Ax. Prosečna standardna kriva iz 5 serija prikazana je na slici 6.

Linearnost

[0160] Linearnost standardnih krivih procenjena je izračunavanjem koeficijenta regresije prema jednačini za grafički prikazane nivoe uključenosti od apsorbance OD450, upotrebom linije koja najbolje odgovara i preseca nulu, ΔOD450= Ax(MYCOSORB) nakon oduzimanja slepe probe. Linearnost standardne krive je verifikovana pomoću vrednosti koeficijenta korelacije koja je viša od r<2>> 0.95. Koeficijent regresije izračunat za svaku standardnu krivu serija i za prosečnu standardnu krivu serija prikazan je u tabeli 24.

Tabela 24. Linearnost standardne krive u materijalu stočne hrane za svinje.

* Srednja kvadratna greška se definiše u linearnim regresionim modelima kao:

gde je yije eksperimentalno izmerena vrednost y; ŷije teoretska vrednost za očekivanu koncentraciju xiproizvoda MYCOSORB.

Ponovljivost

[0161] Ponovljivost je mera unutrašnje varijanse pri oceni ponovljivosti standardne devijacije. Procena ponovljivosti unutar ponavljanja serija dobijena je iz istog uzorka, istog dana u istoj seriji, sa istim tehničarem, istom opremom i postupkom, da bi se predstavila varijacija detekcije unutar serije, CVintra(tabela 25). Procena ponovljivosti između različitih serija dobijena je iz istog uzorka, različitih dana tokom različitih serija, sa istim tehničarem, istom opremom i postupkom da bi se predstavila varijacija detekcije između serija, CVInter, (tabela 26).

[0162] Rezultati pokazuju da standardne krive dobijene istog dana, kao i različitih dana ispoljavaju malu varijabilnost, sa prosečnom preciznošću tokom istog dana od 7% i preciznošću između različitih dana od 20% u radnom opsegu standardne krive između 0.0 i 6.0 kg/T.

Tabela 25. Preciznost ponovljivosti unutar serije pri izradi standardne krive.

T l 2 Pr izn n li i izm ri ri izr i n rn kri

Tabela 27. Ukuna reciznost ri izradi standardne krive.

LD i LQ (osetljivost)

[0163] Vrednosti LDi LQsu prikazane u tabeli 28. Nađene vrednosti LQsu ispod preporučene stope uključenosti proizvoda MYCOSORB, omogućavajući njegovo kvantitativno određivanje u materijalu stočne hrane.

Limit detekcije LD= 0.403 ± 0.150 kg/T

Limit kvantifikacije LQ= 1.363 ± 0.498 kg/T

T l 2 r i n LDi L m ri l n hr n z in

Tačnost

[0164] Tačnost je merena u 5 nezavisnih eksperimenata koji su obuhvatali 10 nezavisnih uzoraka svaki, sa 4 replikata svaki, za koncentraciju proizvoda MYCOSORB pomešanog sa materijalom stočne hrane od 4.0 kg/T. Finalna koncentracija za svaki uzorak izračunata je prema jednačini koja je prikazana gore u tekstu upotrebom zapaženih vrednosti dobijenih za proračun homogenosti (tabela 29). Zatim je prosečna preciznost izračunata iz prosečne tačnosti dobijene za sve serije i upoređena sa dodatom poznatom količinom od 4.0 kg/T proizvoda MYCOSORB pomešanog sa materijalom stočne hrane. Proračuni su izvedeni prema jednačinama koje su ovde date.

[0165] Rezultati pokazuju da procena oporavka proizvoda za 20% prevazilazi stvarni sadržaj dodate poznate količine proizvoda MYCOSORB u materijalu stočne hrane (tabela 30).

Tabela 29. Tačnost i preciznost merena u 5 nezavisnih eksperimenata koji obuhvataju 10 nezavisnih uzoraka svaki, i sa 4 replikata svaki, za koncentraciju proizvoda MYCOSORB pomešanog sa materijalom stočne hrane od 4.0 kg/T.

Tabela 30. Ukupan oporavak proizvoda meren iz proseka za 5 nezavisnih eksperimenata koji obuhvataju 10 nezavisnih uzoraka svaki, i sa 4 replikata svaki, za koncentraciju proizvoda MYCOSORB pomešanog sa materijalom stočne hrane od 4.0 kg/T.

Verifikacija upotrebom materijala hrane za piliće i svinje

[0166] Test ELISA za detekciju MYCOSORB u stočnoj hrani sproveden je na matricama za piliće i svinje, verifikovan u nezavisnoj laboratoriji i upoređen sa rezultatima validacije. Test je verifikovan u Alimetrics, Ltd., Koskelontic 19B, Espoo, Finska.

[0167] Kalibracija testa je sprovedena u dva različita dana na stočnoj hrani pomešanoj sa poznatom koncentracijom standardnog uzorka u opsegu 0.0 do 6.0 kg/T proizvoda MYCOSORB. Za definisanje odnosa između koncentracije i odgovora (OD450) korišćena je linearna kriva, y = Ax u hranivima za svinje i u hranivima za piliće. Apsorbanca i rezultujuća kalibracija su se značajno razlikovale između različitih serija; međutim, apsolutne koncentracije za poznate i slepe uzorke ostale su iste.

Linearnost

[0168] Linearnost standardnih krivih procenjena je izračunavanjem koeficijenta regresije prema jednačini za grafički prikazane nivoe uključenosti od apsorbance OD450, upotrebom linije koja najbolje odgovara i preseca nulu, ΔOD450= Ax(MYCOSORB) nakon oduzimanja slepe probe. Linearnost standardne krive je verifikovana pomoću vrednosti koeficijenta korelacije koja je viša od r<2>> 0.95, Koeficijent korelacije bio je u opsegu 0.991 do 0.994 (tabela 31).

Tabela 31. Linearnost standardnih krivih u materijalu hrane za piliće i svinje.

Serija br 1 Srednja vrednost rosečne krive Matrica Hrana za piliće Stočna hrana za svinj -Datum 4/6/10 4/7/10 4/6/10 4/6/10 -n 15 15 15 15 -Nagib (A 0.0954 0.0775 0.0828 0.0809 -Linearn 0.991 0.994 0.993 0.992 9

* Srednja kvadratna greška se definiše u linearnim regresionim modelima kao:

gde je yije eksperimentalno izmerena vrednost y; ŷije teoretska vrednost za očekivanu koncentraciju xiproizvoda MYCOSORB.

LDi LQ(osetljivost)

[0169] Vrednosti LDi LQsu određene u matrici 40% hlorovodonične kiseline. Procena odgovarajućih vrednosti LDi LQiznosila je 0.35 odnosno 1.20 kg/T proizvoda MYCOSORB pomešanog sa hranivima za piliće, i 0.27 odnosno 0.91 kg/T proizvoda MYCOSORB pomešanog sa hranivima za svinje (tabela 32 odnosno tabela 33).

Tabela 32. Rezultati dobijeni na uzorcima slepe probe hrane za piliće, u dve odvojene serije izvedene sa intervalom od jednog dana u verifikacionoj laboratoriji.

Tabela 33. Rezultati dobijeni na uzorcima slepe probe hraniva svinje, u dve odvojene serije izvedene sa intervalom od jednog dana u verifikacionoj laboratoriji.

Tačnost i preciznost za "poznate" uzorke

[0170] Tačnost je merena u 2 nezavisna eksperimenta koji su obuhvatali 6 replikata svaki, za koncentraciju proizvoda MYCOSORB pomešanog sa materijalom stočne hrane od 4.0 kg/T. Prosečna preciznost je izračunata iz prosečne tačnosti dobijene za sve serije, i upoređena sa dodatom poznatom količinom od 4.0 kg/T proizvoda MYCOSORB pomešanog sa materijalom stočne hrane.

[0171] Dobijene vrednosti ispunjavaju kriterijume i za tačnost i za preciznost, kao što sledi.

[0172] Procena ponovljivosti unutar ponavljanja serija dobijena je iz istog uzorka, istog dana u istoj seriji, sa istim tehničarem, istom opremom i postupkom, da bi se predstavila varijacija detekcije unutar serije, CVintra. Procena ponovljivosti između različitih serija dobijena je iz istog uzorka, različitih dana tokom različitih serija, sa istim tehničarem, istom opremom i postupkom da bi se predstavila varijacija detekcije između serija, CVInter.

[0173] Dobijene vrednosti ispunjavaju kriterijume i za tačnost i za preciznost, kao što sledi za matrice za piliće i svinje (tabela 34 i tabela 35).

Tabela 34. Tačnost i preciznost izmerena iz 6 replikata testova izvedenih u 2 različita dana upotrebom poznatih uzoraka (4.0 kg/T) proizvoda MYCOSORB pomešanog sa materijalom hrane za piliće.

Tabela 35. Tačnost i preciznost izmerena iz 6 replikata testova izvedenih u 2 različita dana upotrebom poznatih uzoraka (4.0 kg/T) proizvoda MYCOSORB pomešanog sa materijalom stočne hrane za svinje.

Tačnost i preciznost za "nepoznate" uzorke

[0174] Tačnost je merena u 2 nezavisna eksperimenta koji su obuhvatali 3 replikata svaki, za koncentraciju od 4.0 kg/T proizvoda MYCOSORB pomešanog sa materijalom stočne hrane u slepom testu. Dobijene vrednosti ispunjavaju kriterijume i za tačnost i za preciznost, kao što sledi (tabela 36 i tabela 37).

Tabela 36. Tačnost i preciznost izmerena u 3 ponovljena testa izvedena na nepoznatim uzorcima (4.0 kg/T) proizvoda MYCOSORB pomešanog sa materijalom hrane za piliće.

Tabela 37. Tačnost i preciznost izmerena u 3 ponovljena testa izvedena na nepoznatim uzorcima (4.0 kg/T) proizvoda MYCOSORB pomešanog sa materijalom stočne hrane za svinje.

Robusnost

[0175] Analiza robustnosti ocenjuje sposobnost metoda merenja da se odupre promenama u rezultatima kada se podvrgava manjim promenama varijabli okoline i postupka.

[0176] Stabilnost ELISA testa je ispitivana menjanjem razblaženja primarnog i sekundarnog antitela, stabilnosti primarnog antitela, putem menjanja rasporeda različitih uzoraka koji treba da se ispitaju na mikrotitarskim pločama (jedna ploča koja sadrži sve uzorke za merenje i sadrži slepu probu, standarde i nepoznati uzorak nasuprot nekoliko mikrotitarskih ploča koje sadrže više ponavljanja ispitivanog uzorka, ali pri čemu su slepa proba, standardi i nepoznati uzorak na različitim mikrotitarskim pločama). Tabela 38 prikazuje varijacije i prikazuje da su rezultati konzistentni, čak i kada se sprovode izmene, ukazujući na snažnu robusnost testa, posebno u odnosu na varijacije razblaženja antitela.

Tabela 38. Test robusnosti. Standardni uslovi su prikazani podebljanim slovima.

Desetoprocentne izmene su takođe označene ako su nađene.

Primer 5

Ispitivanje specifičnosti monoklonskog antitela

Postupci

[0177] Sedamnaest jedinjenja je ispitivano u koncentraciji od 50 µg/ml u PBS da bi se odredila unakrsna reaktivnost monoklonskih antitela protiv (1→4)-α-D-glukan/(1→6)-(β-D-glukan-BSA konjugata kvasca.

[0178] Ispitivana su jedinjenja: Rastvorljivi skrob krompira, skrob pirinča, skrob pšenice, skrob kukuruza, BSA, glikogen (zeca), glikogen (ostrige), glikogen (goveđi), manan, laminarin, zimozin A, maltrin QD, glukan pekarskog kvasca, (1→3)-β-D-glukan iz Eug. gracilis, kvasca Torula, Ycw-02 bead beater (frakcija ćelijskog zida kvasca – preparat bead beater), β glukan ječma.

[0179] Ekstrakt ćelijskog zida kvasca (MYCOSORB serija br. 08FS001) i antigen (I→4)-α-D-glukan/(1→6)-β-D-glukan-BSA korišćen za dobijanje monoklonskog antitela su takođe ispitani u koncentracijama od 1 µg/ml, 2 µg/ml i 5 µg/ml. Oba monoklonska antitela (513A161.1 i 513A431.1) su ispitivana u sledećem opsegu razblaženja: 1:100, 1:200, 1:500, 1:1000, 1:1500 i 1:2000. Korišćene su Nunc mikrotitarske ploče sa 96 bunarčića serije br.

0702013. Ploče su obložene sa 100 µl/bunarčiću jedinjenja i protresane lupkanjem prstima 8-10 puta. Ploče su pokrivene zaptivnom trakom i inkubirane 1 čas na 37°C. Rastvor je uklonjen i ploče su oprane 3 puta sa 200 µl PBS po pranju upotrebom multikanalne pipete. Ploče su lupkane prstima 8-10 puta pre uklanjanja svakog rastvora za pranje. Između pranja, višak fluida je uklonjen lupkanjem ploče na papirne ubruse. Za blokiranje je dodato 100 µl/bunarčiću 3% mleka (nije centrifugirano). Ploče su inkubirane 1 čas na sobnoj temperaturi. Rastvor za blokiranje je uklonjen i bunarčići su oprani sa 1 x 200 µl PBS, 2 x 200 µl PBS 0.05% polisorbata 20. Ploče su protresane lupkanjem prstima 8-10 puta pre uklanjanja svakog rastvora za pranje. Između pranja, višak fluida je uklonjen lupkanjem ploče na papirne ubruse.

[0180] U svaki bunarčić dodato je po 100 µl svakog razblaženja odgovarajućeg seruma. PBS (100 µl/bunarčiću) je upotrebljen za bunarčiće sa slepom probom. Ploča je inkubirana, pokrivena, 1 čas na sobnoj temperaturi. Rastvor je uklonjen i bunarčići su oprani 3 puta sa 200 µl PBS 0.05% polisorbata 20 za svako pranje. Ploče su lupkane prstima 8-10 puta da bi se protresle pre uklanjanja svakog rastvora za pranje. Između pranja, višak fluida je uklonjen lupkanjem ploče na papirne ubruse. Sto µl sekundarnog antitela (1:10000 kozjeg anti-mišjeg, konjugovanog sa IgG-peroksidazom) je dodato po bunarčiću. Ploča je inkubirana, pokrivena, 1 čas na sobnoj temperaturi. Rastvor je uklonjen i bunarčići su oprani 3 puta sa 200 µl po pranju PBS 0.05% polisorbata 20. Ploče su lupkane prstima 8-10 puta da bi se protresle pre uklanjanja svakog rastvora za pranje. Između pranja, višak fluida je uklonjen lupkanjem ploče na papirne ubruse.

[0181] U svaki bunarčić je dodato po 100 µl TMB supstrata sobne temperature. Posle 5 minuta, reakcija je zaustavljena sa 100 µl po bunarčiću 1N HCl. Dno ploče je očišćeno od otisaka prstiju, i posle 10 sekundi mućkanja, apsorbanca na 450 nm je očitana upotrebom čitača mikrotitarske ploče.

Rezultati

[0182] Grafici sa stubićima za podatke dobijene ELISA testom su prikazani na slikama 9-14. Oba antitela, i 513A161.1 i 513A431.1 su reagovala veoma snažno antigenom 499-73-3 u koncentraciji tako niskoj kao 1 µg/ml, proizvodeći najjače očitavanje apsorbance sa 2 µg/ml. Antitela su takođe mogla da prepoznaju 08FS001 u koncentracijama u opsegu od 1 µg/ml do 5 µg/ml, sa najjačim očitavanjem apsorbance sa 5 µg/ml. Međutim, apsorbanca je bila značajno manja za 08FS001 nego za antigen 499-73-3. Antitelo 513A161.1 je prepoznalo laminarin i značajno reagovalo sa njim, a 513A431.1 nije. Oba antitela su imala veoma jako očitavanje apsorbance za zimozin A koje je bilo slično i ponekad jače od apsorbance primećene kod antigena 499-73-3. Iznenađujuće, antitela su pokazala značajnu unakrsnu reakciju sa zimozinom A, maltrinom QD, glukanom pekarskog kvasca, (1→3)-β-D-glukanom iz Eug. gracilis, kvasca Torula i talogom ycw-02 bead beater, ograničavajući njihovu upotrebu u kvantitativnim ELISA testovima.

Primer 6

Pokušaji da se optimizuju uslovi ELISA testa za monoklonsko antitelo za detekciju antigena ekstrahovanog iz stočne hrane

Razblaženje u PBS nasuprot PBS+3% nemasno mleko u prahu

[0183] Pokušaji upotrebe monoklonskog antitela 513A161.1 (primer 5) za detekciju antigena ekstrahovanog iz stočne hrane u kvantitativnim ELISA testovima rezultovalo je u niskim očitavanjima apsorbance. Da bi se odredilo da li je razblaživanje antitela u 3% mleku nasuprot razblaživanju u PBS uticalo na očitavanja apsorbance (npr., izazivajući prekomerno blokiranje u kombinaciji sa hranivima), sproveden je sledeći protokol:

Ekstrakt ćelijskog zida kvasca (MYCOSORB serija br. 08FS001) je podvrgnut postupku hemijske ekstrakcije kao što je diskutovano u primeru 4 pomoću rastvora koji sadrži 0.5% HCl. ELISA testovi su sprovedeni kao što je opisano u primeru 5, upotrebom monoklonskog antitela 513A161 u razblaženju 1:400 kao primarnog antitela i kozjeg anti mišjeg IgG-HRP antitela (1:10000) razblaženog u PBS ili u 3% mleku kao sekundarnog antitela. Mikrotitarske ploče su obložene ekstraktom ćelijskog zida kvasca sa 100 µl/bunarčiću ili ekstraktom razblaženim 1:1 u PBS sa 200 µl/bunarčiću.

[0184] Rezultati prikazani na slici 15 pokazuju da je primećeno blago dejstvo razblaživača antitela, koje nije statistički značajno. Dodatno, pokušaji upotrebe monoklonskog antitela za detekciju antigena u standardima stočne hrane ekstrahovanim sa 0.5% HCl u triplikatu rezultovali su u velikoj varijabilnosti u očitavanjima između replikata, velikim standardnim devijacijama, i preuveličanim očitavanjima apsorbance.

Korak oblaganja antigenom - temperatura i vreme

[0185] Pokušaji upotrebe monoklonskog antitela 513A161.1 (primer 5) za detekciju antigena ekstrahovanog iz stočne hrane u kvantitativnim ELISA testovima rezultovali su niskim očitavanjima apsorbance. Da bi se povećala očitavanja apsorbance u ELISA testu upotrebom mišjeg monoklonskog antitela 513A161.1, sproveden je sledeći eksperiment da bi se odredilo da li bi promena vremena i temperature koraka inkubacije pri oblaganju antigenom poboljšala detekciju antigena ekstrahovanog iz stočne hrane bez povećanja pozadinskog šuma/nespecifičnog vezivanja.

[0186] Protokol se sastojao od izvođenja ekstrakcije stočne hrane kao što je opisano iznad u tekstu da bi se dobili uzorci za ispitivanje. Alikvoti uzorka su ili odmah korišćeni za oblaganje ploče, ili skladišteni preko noći na -25°C. Priprema uzorka je ponavljana 3 puta da bi se dobili triplikati ekstrakcije. Pripremljena je standardna kriva sa šest tačaka (0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.8, 2.4 kg/T) upotrebom antigena u preparatima hrane za piliće. Ploče su obložene prema standardnoj krivoj za ekstrakt stočne hrane i ostavljene da se inkubiraju na 4°C preko noći (stacionarno), na 4°C preko noći (uz ljuljanje), ili na 37°C tokom 1 časa (stacionarno). ELISA testovi su izvedeni kao što je opisano u primeru 5 upotrebom monoklonskog antitela 513A161.1 u razblaženju od 1:400 pripremljenog u 3% mleku kao primarnog antitela i kozjeg anti-mišjeg IgG-HRP antitela (1:10,000) razblaženog u 3% mleku kao sekundarnog antitela. Inkubacija supstrata se odvijala 30 minuta, i apsorbance na 450 nm je određena.

[0187] Rezultati prikazani na slici 16 ukazuju na to da menjanje vremena i temperature na kojoj se ploča oblaže antigenom nije povećalo apsorbancu do optimalnog opsega i takođe nije uticalo na linearnost standardne krive. Dodatno, pozadinski šum se povećavao nezavisno od vremena inkubacije.

Primer 7

Ispitivanje selektivnosti (interferencije) poliklonskog antitela

[0188] U cilju određivanja stepena interferencije, niz ispitivanja je sproveden upotrebom materijala hrane za piliće koji je ovde opisan, u odsustvu i prisustvu proizvoda MYCOSORB (ref. br. 285965) u količini od 1 kg/T, pri čemu je u poslednjem slučaju bez ili sa dodatkom mogućih interferirajućih proizvoda, u nekoliko proporcija (50%, 100%, 200% u poređenju sa nivoom uključenosti proizvoda MYCOSORB, tež./tež.), koji pripadaju ugljenim hidratima ili sporednim proizvodima nađenim u formulacijama stočne hrane. U ovom pogledu, sledeći proizvodi su istraživani i ispitivani da bi se procenio njihov uticaj na detekciju proizvoda MYCOSORB putem ovde date precizne metodologije:

• Amiloza (srob krompira): (1→4):(1→6)-α-D-glukani u odnosu 30:1.

• Maltodekstrini i čvrsta supstanca kukuruznog sirupa: lako svarljivi ugljeni hidrati napravljeni od prirodnog kukuruznog skroba, polimer dekstroze.

• Glikogen (iz goveđe jetre, tip IX): (1→4):(1→6)-α-D-glukani u odnosu 10:1.

• Laminarin (iz Laminaria digitata): (1→3):β(1→6)-β-D-glukani u odnosu 3:1.

• Suva žitna džibra; sporedni proizvodi proizvodnje bioetanola iz kukuruza.

• Suvi aktivni vinski kvasac za proizvodnju šampanjca Red Star® Pasteur Champagne Active Dry Wine Yeast (iz Saccharomyces bayanus): kvasac i ćelijski zid kvasca (složeni ugljeni hidrati napravljeni od (1→3):β(1→6)-β-D-glukana, (1→4):(1→6)-α-D-polimanoze vezane za proteine, (1→2):(1→4)-β-N-acetilglukozamina).

[0189] Kao šti je prikazano na slici 7 i slici 8, suma razlika između signala dobijenih u prisustvu proizvoda MYCOSORB, i proizvoda MYCOSORB pomešanog sa 50, 100, 200% (tež./tež.) interferirajuće supstance, približna je vrednosti nula za OD450. Rezultati ukazuju na odsustvo interferencije i, time, na specifična svojstava testa za detekciju proizvoda MYCOSORB u složenoj matrici stočne hrane koja se sastoji od različitih interferirajućih ugljenih hidrata.

[0190] Detaljni rezultati za svaku pojedinačnu interferirajuću supstancu i granice za jednosmerni ANOVA test, za interval poverenja od 95%, date su u tabelama 39 – 44, gde su izračunate prosečne vrednosti optičke gustine (450 nm) i razlike između uzoraka, kao i standardna devijacija i koeficijent varijacije. Homogenost varijansi unutar svakog interferirajućeg jedinjenja procenjena je upotrebom Levenovog, O’Brajenovog i Braun-Forsajtovog testa. U slučaju varijanse koja nije konstantna, upotrebljena je neparametarska Kruskal-Volis jednosmerna ANOVA metoda sa transformacijom ranga, što je rezultovalo robusnijim testovima u uslovima odsustva normalnosti, i otpornošću na netipične vrednosti. Ispitivanja su sprovedena na odvojenim pločama za svaku koncentraciju ispitivane interferirajuće supstance ili na jednoj pojedinačnoj ploči. Identični rezultati su dobijeni za dva preparata ploča.

Tabela 39. Prosečne vrednosti OD450dobijene za proizvod MYCOSORB pomešan sa 0, 50, 100, 200% (tež./tež.) amiloze u hrani za piliće. Razlike između vrednosti su analizirane pomoću jednosmerne analize ANOVA i statističkih testova za poređenje srednjih vrednosti sa intervalom poverenja od 95%.

Tabela 40. Prosečne vrednosti OD450dobijene za proizvod MYCOSORB pomešan sa 0, 50, 100, 200% (tež./tež.) maltodekstrina u hrani za piliće. Razlike između vrednosti su analizirane pomoću jednosmerne analize ANOVA i statističkih testova za poređenje srednjih vrednosti sa intervalom poverenja od 95%.

Tabela 41. Prosečne vrednosti OD450dobijene za proizvod MYCOSORB pomešan sa 0, 50, 100, 200% (tež./tež.) glikogena u hrani za piliće. Razlike između vrednosti su analizirane pomoću jednosmerne analize ANOVA i statističkih testova za poređenje srednjih vrednosti sa intervalom poverenja od 95%.

Tabela 42. Prosečne vrednosti OD450dobijene za proizvod MYCOSORB pomešan sa 0, 50, 100, 200% (tež./tež.) laminarina u hrani za piliće. Razlike između vrednosti su analizirane pomoću jednosmerne analize ANOVA i statističkih testova za poređenje srednjih vrednosti sa intervalom poverenja od 95%.

Tabela 43. Prosečne vrednosti OD450dobijene za proizvod MYCOSORB pomešan sa 0, 50, 100, 200% (tež./tež.) RED STAR vinskog kvasca u hrani za piliće. Razlike između vrednosti su analizirane pomoću jednosmerne analize ANOVA i statističkih testova za poređenje srednjih vrednosti sa intervalom poverenja od 95%.

Tabela 44. Prosečne vrednosti OD450dobijene za proizvod MYCOSORB pomešan sa 0, 50, 100, 200% (tež./tež.) suvom žitnom džibrom u hrani za piliće. Razlike između vrednosti su analizirane pomoću jednosmerne analize ANOVA i statističkih testova za poređenje srednjih vrednosti sa intervalom poverenja od 95%.

[0191] Različite modifikacije i varijacije opisanog metoda i sistema pronalaska će biti očigledne stručnjacima u odgovarajućoj oblasti. Iako je pronalazak opisan u vezi sa specifičnim poželjnim primerima izvođenja, potrebno je shvatiti da pronalazak, za kakav se traži zaštita, ne treba da bude nepotrebno ograničen na takve specifične primere izvođenja.

Zaista, predviđeno je da različite modifikacije opisanih modaliteta izvođenja pronalaska koje su očigledne onima koji su kvalifikovani u hemiji ugljenih hidrata, mikrobiologiji, oblasti životinjske hrane i ishrane, imunologiji ili srodnim poljima, budu obuhvaćene sledećim patentnim zahtevima.

Claims (3)

Patentni zahtevi

1. Postupak za detekciju komponente ćelijskog zida kvasca u uzorku, koji obuhvata:

- obezbeđivanje uzorka hrane ili stočne hrane izabrane iz grupe koja se sastoji od hrane za stoku, hrane za kućne ljubimce, potpunog mešanog obroka (TMR), krmnog bilja, peleta stočne hrane, koncentrata stočne hrane, koproizvoda gotove smeše stočne hrane, žitarica, žitne džibre, melase, vlakana, kabaste stočne hrane, trave, sena, jezgra zrna, lišća, brašna, rastvorljive stočne hrane, i njihovih ekstrakata;

- izvođenje testa koji obuhvata dovođenje u kontakt primarnog antitela sposobnog da veže antigen izabran iz grupe koja se sastoji od (1→4)-α-D-glukana, (1→6)-β-D-glukana i (1→4)-α-/(1→6)-β-D-glukana sa uzorkom, pod takvim uslovima da primarno antitelo obrazuje kompleks sa antigenom, ako je prisutan; i upotrebu sekundarnog antitela za detekciju kompleksa primarno antitelo-antigen, u kome detekcija kompleksa primarno antitelo-antigen ukazuje na prisustvo komponente ćelijskog zida kvasca u uzorku.

2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što postupak obuhvata dobijanje ekstrakta iz uzorka upotrebom organskog rastvarača i kiseline.

3. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što postupak obuhvata dobijanje ekstrakta iz uzorka upotrebom dimetilsulfoksida i hlorovodonične kiseline.