RS57974B1 - Sastavi za lečenje inflamatornog oboljenja zglobova - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ova prijava se poziva na koristi privremene patentne prijave SAD br. 61/847,851, podnesene 18. jula, 2013.

IZJAVA O FEDERALNO FINANSIRANOM ISTRAŽIVANJEM

[0002] Ovaj pronalazak je napravljen uz podršku vlade pod brojem odobrenja U44-NS071642 koji je dodelio Nacionalni institut za zdravlje. Vlada ima određena prava u pronalasku.

OBLAST PRONALASKA

[0003] Ovaj pronalazak odnosi se na preparate za lečenje kliničkih stanja povezanih s inflamatornim oboljenjima zglobova i simptoma povezanih sa njima, davanjem inflamatornom zglobu sastava koji sadrži bakterijski plazmid interleukin-10 (IL-10) ekspresioni konstrukt.

STANJE TEHNIKE

[0004] U sledećoj raspravi biće opisani određeni članovi i metode stanja tehnike i uvodne svrhe. Ništa sadržano u ovom tekstu ne treba tumačiti kao "pristup" prethodnog stanja tehnike. Podnosilac zahteva izričito zadržava pravo da, po potrebi, demonstrira da članovi i metode navedene u ovom tekstu ne predstavljaju prethodno stanje tehnike prema važećim zakonskim odredbama.

[0005] Bol u zglobu može se pojaviti iz bilo kog razloga, kao rezultat više od stotinu različitih artritičnih stanja - od kojih su najčešći reumatoidni artritis i osteoartritis, kao i tendinitis, burzitis, inflamacija ligamenta, sinovitis, giht i sistemski eritematozni lupus. Kada je povređen, pokreće se lanac događaja u imunološkom sistemu poznat kao inflamatorna kaskada, izazivajući crvenilo, oticanje i bol. Zatim, anti-inflamatorna jedinjenja preuzimaju lečenje područja kada se pretnja smanji. Kada se odvija ovaj proces - poznat kao lokalna ili akutna upala - to je znak zdravog imunološkog sistema. Međutim, ako se upala nastavi, to može dovesti do hroničnog stanja.

[0006] Aktuelni tretmani za inflamatorne bolesti zgloba kao što su reumatoidni i osteoartritis, tendinitis, sinovitis i slično ostaju neoptimalni. Identifikovanje lečenja koje bi zahtevalo manje čestu primenu značajno bi uticalo na kvalitet života pacijenata s oboljenjima inflamatornog zgloba; međutim, uprkos značajnim istraživanjima i razvoju terapija za takve uslove, još uvek postoji velika neizbežna potreba za sigurnim, delotvornim i jednostavnim lekovima.

REZIME PRONALASKA

[0007] Predmetni pronalazak obezbeđuje sastav koji sadrži bakterijski plazmatski IL-10 ekspresioni konstrukt, pri čemu IL-10 ekspresioni konstrukt sadrži bakterijski glavni lanac i sekvencu nukleinske kiseline koja kodira interleukin-10 za upotrebu u metodi lečenja bolesti inflamatornog zgloba kod subjekta, pomenuta metoda obuhvata injektiranje sastava u inflamatorni zglob pacijenta. U nekim otelotvorenjima, IL-10 ekspresioni konstrukt je enkapsuliran u biorazgradive mikročestice, a u nekim aspektima ovih otelotvorenja, mikročestice se suspenduju u razblaživaču kako bi se formirao terapeutski sastav.

[0008] U još nekim alternativnim otelotvorenjima, terapeutski sastavi prema predmetnom pronalasku su IL-10 ekspresioni konstrukti - sa bakterijskim glavnim lancem - koji se isporučuje kao "gola" DNK. To znači da se IL-10 ekspresioni konstrukt isporučuje bez enkapsulacije. U takvim otelotvorenjima, ekspresioni konstrukti IL-10 se isporučuju u kombinaciji sa jednim ili više razređivača, a u poželjnim aspektima ovih otelotvorenja, IL-10 ekspresioni konstrukt se isporučuje u kombinaciji sa jednim ili više adjuvansa U nekim aspektima ovog otelotvorenja, jedan ili više adjuvansa se mogu davati subjektu u vreme primene IL-10 ekspresionog konstrukta ili do 10 dana pre primene IL-10 ekspresionog konstrukta, npr., kao "predtretman".

[0009] U nekim aspektima, inflamacija zglobova je u kolenu, laktu, zglobu ruke, zglobu noge, kuku, ramenu ili kičmi. Stanja koja se mogu lečiti pomoću metoda prema predmetnom pronalasku uključuju reumatoidni artritis i osteoartritis, kao i tendinitis, burzitis, inflamacija ligamenta, sinovitis, protuzuma i sistemski eritematozni lupus.

[0010] Prema tome, u nekim otelotvorenjima sastav sadrži: plazmatsku DNK koja sadrži bakterijski glavni lanac najmanje jedne IL-10 kodirajuće sekvencu i razblaživač; gde terapeutsko anti-inflamatorno IL-10 jedinjenje obezbeđuje terapeutski efikasnu dozu u zglobu na oko 1 µg DNK do oko 1000 µg DNK, ili oko 5 µg DNK do oko 900 µg DNK, ili oko 10 µg DNK do oko 850 µg DNK ili oko 20 µg DNK do oko 800 µg DNK ili oko 25 µg DNK do oko 750 µg DNK ili oko 40 µg DNK do oko 500 µg DNK ili oko 50 µg DNK do oko 250 µg DNK ili oko 5 µg DNK do oko 200 µg DNK, iako poželjno oko 2.5 µg DNK do oko 500 µg DNK. U drugim slučajevima, virusni vektor se koristi kao alternativa bakterijskom vektoru.

[0011] U nekim poželjnim otelotvorenjima predmetnog pronalaska, terapijska jedinjenja IL-10 iz ovog pronalaska (tj., enkapsulirana ili ogoljena DNK) primenjuju se sa jednim ili više adjuvansa. Adjuvansi prema pronalasku su biokompatibilni agensi koji se mogu davati istovremeno sa IL-10 terapijskim jedinjenjima ili kao predtretman pre primene terapijskih jedinjenja IL-10. Adjuvansi koji su naročito poželjni uključuju, ali nisu ograničeni na manozu, saharozu, glukozu, kalcijum fosfat, dendrimere, lipozome uključujući katjonske lipozome i oligodeoksinukleotide. Adjuvansi ovog pronalaska u poželjnim otelotvorenjima su oni adjuvansi koji povećavaju upijanje ili efikasnost IL-10 ekspresionog konstrukta. Istovremena primena ili predtretman obuhvata davanje zglobu oko 5 µg adjuvansa na oko 1000 µg adjuvansa ili oko 10 µg adjuvansa na oko 750 µg adjuvansa ili oko 50 µg adjuvansa na oko 500 µg adjuvansa ili oko 25 µg adjuvansa na oko 750 µg adjuvansa u vremenu do 10 dana pre primene terapeutskog anti-inflamatornog jedinjenja IL-10.

[0012] Druga alternativna otelotvorenja obezbeđuju sastave za upotrebu u metodama za lečenje inflamatornih oboljenja zglobova u kojima sastav sadrži: IL-10 ekspresioni konstrukt; mikročestice koje enkapsuliraju IL-10 ekspresioni konstrukt; i razblaživač; gde terapeutski mikroartikularni sastav obezbeđuje terapeutski efikasnu dozu u zglobu na oko 20 µg DNK do oko 1000 µg DNK ili oko 25 µg DNK do oko 750 µg DNK ili oko 50 µg DNK do oko 500 µg DNK ili oko 50 µg DNK do oko 250 µg DNK, ili oko 50 µg DNK do oko 200 µg DNK, ili oko 25 µg DNK do oko 100 µg DNK.

[0013] U još jednom otelotvorenju su metode za usporavanje progresije inflamatornih oboljenja zglobova kod pacijenta koji obuhvata davanje pacijentu terapeutskog anti-inflamatornog IL-10 jedinjenja koje sadrži: plazmatsku DNK koja sadrži bakterijski glavni lanac i najmanje jednu IL-10 kodirajuću sekvencu, gde terapijski IL-10 ekspresioni konstrukt obezbeđuje terapeutski efikasnu dozu u zglobu na oko 1 µg DNK do oko 1000 µg DNK, oko 5 µg DNK do oko 900 µg DNK, oko 10 µg DNK do oko 850 µg DNK, oko 20 µg DNK do oko 800 µg DNK ili oko 25 µg DNK do oko 750 µg DNK ili oko 50 µg DNK do oko 500 µg DNK ili oko 50 µg DNK do oko 250 µg DNK ili oko 50 µg DNK do oko 200 µg DNK , ili oko 25 µg DNK do oko 100 µg DNK. U takvim otelotvorenjima, adjuvans se poželjno daje sa terapijskim anti-inflamatornim IL-10 jedinjenjem ili do 10 dana pre primene terapeutskog anti-inflamatornog IL-10 jedinjenja, npr., kao predtretman.

[0014] Opciono u opisanim otelotvorenjima, IL-10 ekspresioni konstrukt obuhvata najmanje jednu sekvencu ciljanja nuklearnog oružja koja se nalazi od 100 do 2000 bp 5’ do najmanje jedne IL-10 kodirajuće sekvence i/ili od 150 do 450 bp 3' do najmanje jedne IL-10 kodirajuće sekvence. U drugim aspektima predmetnog pronalaska, IL-10 ekspresioni konstrukt obuhvata dve sekvence nuklearnog ciljanja, gde je jedna sekvenca nuklearnog ciljanja pozicionirana od 100 do 2000 bp 5’ od najmanje jedne IL-10 kodirajuće sekvence i jedna nukleinska ciljna sekvenca je pozicionirana od 150 do 450 bp 3’ od najmanje jedne kodirajuće sekvence.

[0015] U pronalasku terapeutski sastav se daje injekcijom u zglobove, a u poželjnim otelotvorenjima terapeutski sastav se daje intra-artikularnom injekcijom.

[0016] U nekim aspektima sekvenca nukleinske kiseline koja kodira interleukin-10 ima aminokiselinsku supstituciju za divlji tip fenilalanina na poziciji 129 aminokiseline, a u nekim aspektima supstitucija aminokiselina je odabrana iz grupe serina, alanina, treonina ili cisteina. U nekim aspektima, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira interleukin-10 kodira IL-10<F129S>. U još nekim aspektima, IL-10 ekspresioni konstrukt sadrži najmanje jednu sekvencu 5’ ciljanja nukleinske sekvence kodiranja IL-10, a u nekim aspektima, IL-10 ekspresioni konstrukt sadrži najmanje jednu sekvencu nukleinskog ciljanja 3' na IL -10 kodiranja.

[0017] U nekim aspektima predmetnog pronalaska, mikročestice sadrže jedan ili više poli(2-hidroksietil metakrilata), poli(N-vinil pirolidona), poli(metil metakrilata), poli(vinil alkohola), poli(akrilna kiselina), poliakrilamida, poli(etilen-ko-vinil acetat), poli(etilenglikola), poli(metakrilna kiselina), polilaktida (PLA), poliglikolida (PGA), poli(laktid-ko-glikolida) (PLGA), polianhidrida, polikaprolaktona, poli-3-hidroksibutirat ili poliortoestra. U nekim aspektima predmetnog pronalaska, mikročestice sadrže PLGA. U drugim aspektima pronalaska, mikročestice obuhvataju smešu biorazgradivih polimera koji predstavljaju različite, komplementarne profile za oslobađanje.

[0018] U određenim otelotvorenjima metoda, terapeutski anti-inflamatorni IL-10 ekspresioni konstrukt (i bilo koji adjuvans ili adjuvans "predtretmana") se isporučuje otprilike svakih 40 do 120 dana koliko je potrebno za terapeutski efekat, npr., do godinu dana. U drugim otelotvorenjima, terapeutski anti-inflamatorni sastav se isporučuje otprilike svakih 40 do 120 dana koliko je potrebno za terapeutski efekat više od jedne godine. U još nekim otelotvorenjima, terapeutski anti-inflamatorni sastav se isporučuje po potrebi za terapeutski efekat otprilike svakih 40 do 120 dana, po potrebi, ceo život subjekta.

[0019] Metode opisane ovde mogu takođe biti upotrebljene kao istraživački alat za identifikaciju farmaceutskih proizvoda, malih molekula i/ili biologija koje se mogu koristiti u kombinaciji sa "koktelom" sa terapeutskim IL-10 kompozitnim sastavima.

OPIS SLIKA

[0020]

Slika 1 prikazuje rezultate u obliku trakastih grafikona koji ilustruju kliničku procenu funkcionalnog poboljšanja i smanjenja bolova koji su postignuti tretiranjem osteoartritisa prednjih zglobova kod rase pasa nakon primene terapijskog IL-10 ekspresionog konstrukta iz ovog pronalaska.

Slika 2 prikazuje rezultate u obliku trakastih grafikona koji ilustruju sopstvenu procenu funkcionalnog poboljšanja i smanjenja bolova koji su postignuti tretiranjem osteoartritisa prednjih zglobova kod rase pasa nakon primene terapijskog IL-10 ekspresionog konstrukta iz ovog pronalaska.

Slika 3 prikazuje rezultate u obliku trakastih grafikona koji ilustruju kliničku procenu funkcionalnog poboljšanja i smanjenja bolova koji su postignuti tretiranjem osteoartritisa prednjih zglobova kod rase pasa nakon primene terapijskog IL-10 ekspresionog konstrukta iz ovog pronalaska (objedinjeni podaci). Slika 4 prikazuje rezultate u obliku trakastih grafikona koji ilustruju sopstvenu procenu funkcionalnog poboljšanja i smanjenja bolova koji su postignuti tretiranjem osteoartritisa prednjih zglobova kod rase pasa nakon primene terapijskog IL-10 ekspresionog konstrukta iz ovog pronalaska (objedinjeni podaci). Slika 5 prikazani su rezultati koji pokazuju poboljšanja u dometu kretanja postignutog lečenja osteoartritisa prednjih zglobova kod rase pasa nakon primene terapijskih IL-10 ekspresionog konstrukta iz ovog pronalaska (objedinjeni podaci).

DETALJNI OPIS PRONALASKA

Definicije

[0021] Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni pojmovi koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što je obično poznato stručnjacima iz ove oblasti gde pripada predmetni pronalazak. Sve objave, objavljene patentne prijave i patenti pomenuti ovde su u svrhu opisivanja i obelodanjivanja uređaja, životinjskih modela, formulacija i metodologija koje se mogu koristiti u vezi sa trenutno opisanim pronalaskom.

[0022] Termin adjuvans koji se ovde koristi odnosi se na farmakološki ili imunološki agens koji modifikuje dejstvo drugih agenasa. U kontekstu predloženog pronalaska, pomoćni adjuvans se koristi za povećanje efikasnosti terapeutskog anti-inflamatornog jedinjenja IL-10. Adjuvansi od posebne upotrebe u predmetnom pronalasku uključuju one koji povećavaju uzimanje ili efikasnost IL-10 ekspresionog konstrukta pomoću, na primer, makrofaga ili drugih imunih ćelija prisutnih u sinovijalnoj tečnosti zgloba.

[0023] Termin "anti-inflamatorni", kako se ovde koristi, odnosi se na smanjenje dejstva ili proizvodnje jednog ili više proinflamatornih citokina ili proteina proizvedenih od strane nerva, neurona, glijalnih ćelija, endotelnih ćelija, fibroblasta, mišića, imunih ćelija ili drugih vrsta ćelija.

[0024] Termin "anti-inflamatorni citokin“, kako se ovde koristi, odnosi se na smanjenje dejstva ili proizvodnje jednog ili više proinflamatornih citokina ili proteina proizvedenih od strane nerva, neurona, glijalnih ćelija, endotelnih ćelija, fibroblasta, mišića, imunih ćelija ili drugih vrsta ćelija. Inflamatorni citokini i proteini uključuju, bez ograničenja, interleukin-1 beta (IL-1β), faktor tumorske nekroze-alfa (TNF-a), interleukin-6 (IL-6), inducibilnu azot-oksid sintetazu (iNOS) i slično. Neograničavajući primeri anti-inflamatornih citokina uključuju interleukin-10 (IL-10) uključujući virusni IL-10, interleukin-4 (IL-4), interleukin-13 (IL-13), alfa-MSH, beta 1 (TGFβ1) i slično. Prema tome, molekuli pune dužine i fragmenti anti-inflamatornih citokina, kao i anti-inflamatorni citokini sa modifikacijama, kao što su brisanja, dodaci i supstitucije (konzervativni ili nekonzervativni u prirodi), u prirodnu sekvencu za upotrebu ovde, sve dok je anti-inflamatorni citokin terapijski efikasan. Modifikacije mogu biti namerne, kao što su putem mutageneze usmerene na lokaciju, ili mogu biti slučajne, kao što su mutacije domaćina koji proizvode proteine ili greške zbog amplifikacije PCR-a. Shodno tome, aktivni proteini su tipično u suštini homologni matičnoj sekvenci, npr., proteini su tipično oko 70...80...

85... 90... 95... 98...99%, itd. homologni roditeljskoj sekvenci.

[0025] "Kodirajuća sekvenca" anti-inflamatornog citokina ili sekvenca koja "kodira" anti-inflamatorni citokin je molekul nukleinske kiseline koja se prepisuje (u slučaju DNK) i prevodi (u slučaju mRNK) u polipeptid in vivo kada se stavlja pod kontrolu odgovarajućih kontrolnih sekvenci. Granice kodirajuće sekvence određuju nukleotidi koji odgovaraju početnom kodonu na amino terminalu i nukleotidima koji odgovaraju stop koronu prevođenja na karboksi terminusu.

[0026] Termin DNK "kontrolne sekvence" odnosi se kolektivno na promotivne sekvence, poliadenilacijske signale, sekvence završetka transkripcije, regulatorne uzvodne domene, poreklo replikacije, unutrašnja mesta za unos ribozoma, pojačivače i slično, koji zajedno obezbeđuju replikaciju, transkripciju i prevođenje sekvenci kodiranja u ćeliji primaoca. Nisu svi ovi tipovi kontrolnih sekvenci prisutni sve dok se izabrana sekvenca kodiranja može replicirati, prepisati i prevoditi u odgovarajuću ćeliju domaćina.

[0027] Izrazi "efikasna količina" ili "terapeutski efikasna količina" terapeutskog IL-10 ekspresionog konstrukta koji se koriste u metodama iz ovog pronalaska odnose se na netoksični ali dovoljan iznos IL-10 ekspresionog konstrukta da bi se dobio željeni odgovor, kao što je smanjenje inflamacije zglobova, olakšanje od simptoma uzrokovanih inflamatornim oboljenjima zglobova i/ili sprečavanje progresije oštećenja zgloba usled inflamatornih oboljenja zglobova. Tačna tražena količina će se razlikovati od subjekta do subjekta, u zavisnosti od vrste, starosti i opšteg stanja subjekta, težine stanja koje se tretira, a određeni konstrukt ekspresije IL-10 treba da se dostavi da li se IL-10 ekspresija konstrukta isporučuje u mikročesticama ili kao gola DNK, način primene (npr., intra-artikularna injekcija) i slično. Parametri doziranja za predmetne metode su ovde navedeni; međutim, optimizacija odgovarajuće "efikasne" količine u bilo kom pojedinačnom slučaju može biti određena od strane stručnjaka iz oblasti tehnike koristeći metode navedene ovde i rutinsko eksperimentisanje.

[0028] Termin "ekscipijens" ili "razblaživač" odnosi se na inertnu supstancu dodatu terapeutskom sastavu pronalaska radi olakšavanja primene terapijskog IL-10 ekspresionog konstrukta. Primeri, bez ograničenja, pomoćnih supstanci su fiziološki rastvor soli, kalcijum karbonat, kalcijum-fosfat, različiti šećeri i vrste skroba, derivati celuloze, želatin, hijaluronska kiselina, opciono formulisana sa surfaktantom, Plurnoic F-68, biljna ulja i polietilen glikoli.

[0029] Pod "izolovanim" kada se govori o nukleotidnoj sekvenci, podrazumeva se da je ekspresioni konstrukt prisutan u suštinskom odsustvu drugih bioloških makromolekula istog tipa. Tako "izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira određeni polipeptid" odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji je u suštini slobodan od drugih molekula nukleinske kiseline koji ne kodiraju predmetni polipeptid; međutim, molekul može uključivati i neke dodatne baze ili delove koji ne utiču štetno na osnovne karakteristike sastava.

[0030] Termin "zglob" se odnosi na anatomsku strukturu u kojoj se susreću dve kosti, uključujući ligamente koji povezuju kosti jedni s drugima, tetive koje pričvršćuju mišiće i kosti, zajedničku kapsulu, burza i sinovija. Zglobovi koji se mogu tretirati ovdašnjim metodama uključuju fiksne, zglobne, pivotalne ili kuglične zglobove.

[0031] Termin "zglobna inflamacija" odnosi se na sve vrste artritisa uzrokovanih inflamacijom gde su najčešći reumatoidni artritis, osteoartritis, kao i tendinitis, burzitis, upala ligamenta, sinovitis, giht i sistemski eritematozni lupus.

[0032] Termin „nukleinska ciljna sekvenca" odnosi se na sekvencu nukleinske kiseline koja funkcioniše kako bi poboljšala efikasnost ekspresije anti-inflamatornog citokina u ćeliji.

[0033] "Operativno povezan" odnosi se na raspored elemenata gde su tako opisane komponente konfigurisane tako da izvršavaju svoju uobičajenu funkciju. Prema tome, kontrolne sekvence operativno povezane sa kodirajućom sekvencom mogu da izvrše ekspresiju kodirajuće sekvence. Kontrolne sekvence ne moraju biti u saglasnosti sa sekvencom kodiranja sve dok oni funkcionišu da usmeravaju njegovu ekspresiju. Tako, na primer, intervenisati neprevedene, ali transkribovane sekvence mogu biti prisutne između promoterske sekvence i sekvence kodiranja, a sekvenca promotera se i dalje može smatrati "operativno povezanom" sa sekvencom kodiranja.

[0034] Termin "promoter" se ovde koristi u svom uobičajenom smislu da se odnosi na region nukleotida koji sadrži regulatornu sekvencu DNK, pri čemu je regulatorna sekvenca izvedena iz gena koji je sposoban za vezivanje RNK polimeraze i pokretanje transkripcije nizvodne (3'-smer) kodirajuće sekvence. Propisi transkripcije mogu uključivati "inducibilne promotere" (gde je ekspresija polinukleotidne sekvence koja je operativno vezana za promoter indukovana pomoću analita, kofaktora, regulatornog proteina itd.), "potiskujućih promotera" (gde je ekspresija polinukleotidne sekvence operativno vezana za promoter je indukovana od strane analita, kofaktora, regulatornog proteina, itd.) i "konstitutivni promoteri".

[0035] U cilju opisivanja relativne pozicije nukleotidnih sekvenci u određenom molekulu nukleinske kiseline u toku trenutne primene, kao što je kada se određena nukleotidna sekvenca opisuje kao smeštena "uzvodno", "nizvodno", "3 glavni (3')" ili "5 glavni (5')" u odnosu na drugu sekvencu, treba se shvatiti da je to pozicija sekvenci u "smisli" ili "kodiranju" niza molekula DNK na koju se odnosi kao konvencionalna u stanju tehnike.

[0036] Termin "istraživački alat", kako se ovde koristi, odnosi se na sve metode pronalaska koristeći terapeutske IL-10 ekspresione konstrukte za naučno ispitivanje, bilo akademske ili komercijalne po prirodi, uključujući razvoj drugih farmaceutskih i/ili bioloških terapija. Istraživački alati iz ovog pronalaska nisu namenjeni da budu terapijski ili da budu predmet regulatornog odobrenja; pre svega, istraživački alati iz ovog pronalaska imaju za cilj da olakšaju istraživanje i pomoć u takvim razvojnim aktivnostima, uključujući i sve aktivnosti koje se sprovode sa namerom da proizvedu informacije kako bi podržale podnošenje propisa.

[0037] Pojmovi "subjekat", "pojedinac" ili "pacijent" ovde se mogu koristi naizmenično i odnose se na kičmenjake, poželjno na sisara.

[0038] Termin "terapeutski preparat" ili "terapeutski anti-inflamatorni sastav" koji se ovde koristi odnosi se na sastav koji ima mogućnost da smanji inflamaciju zglobova, pruža olakšanje od simptoma uzrokovanih inflamatornim oboljenjima zglobova i/ili sprečava progresiju zglobova oštećenja usled inflamatornih bolesti zglobova izmerenih u bilo kom od poznatih životinjskih modela ili procenom obavljenom kod ljudi.

[0039] „Tretman“ ili „ lečenje“ inflamacije zgloba uključuje: (1) smanjenje inflamacije zgloba ili izazivanje inflamacije sa manjim intenzitetom kod subjekta koji može imati predispoziciju na inflamaciju zglobova, ali još ne doživljava ili pokazuje simptome, ili (2) sprečava inflamaciju zgloba, tj., zaustavlja razvoj ili promenu simptoma ili fiziološke štete prouzrokovane inflamacijom.

[0040] "Virusni vektor" koji se ovde koristi je rekombinantno proizveden virus ili virusna čestica koja sadrži IL-10 ekspresioni konstrukt koji se isporučuje u ćeliju domaćina, bilo in vivo, ex vivo ili in vitro. Primeri virusnih vektora uključuju retrovirusne vektore, lentivirusne vektore, vektore adenovirusa, virusne vektore povezane sa adeno virusom, vektorom alfavirusa i slično.

[0041] Praksa tehnika opisanih ovde može se primeniti, osim ako nije drugačije naznačeno, konvencionalne tehnike i opise organske hemije, polimerne tehnologije, molekularne biologije (uključujući rekombinantne tehnike), ćelijske biologije, biohemije i tehnologije sekvenciranja, koje su poznate stručnjacima iz oblasti. Specifične ilustracije odgovarajućih tehnika mogu se odnositi na primere u ovom tekstu. Međutim, i druge ekvivalentne konvencionalne procedure se, naravno, mogu koristiti. Takve konvencionalne tehnike i opisi mogu se naći u standardnim laboratorijskim priručnicima kao što su LeDoux (Ed.) (2005), Animal Models of Movement Disorders (Academic Press); Chow, i dr., (2008), Using Animal Models in Biomedical Research (World Scientific Publishing Co.); Weir and Blackwell (Eds.), Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (Blackwell Scientific Publications); Creighton (1993), Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company); Sambrook and Russell (2006), Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual; i Sambrook and Russell (2002), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (both from Cold Spring Harbor Laboratory Press); Stryer, L. (1995) Biochemistry, Fourth Ed. (W.H. Freeman); Gait (1984), "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" (IRL Press); Nelson and Cox (2000), Lehninger, Principles of Biochemistry, Third Ed. (W. H. Freeman); i Berg i dr. (2002) Biochemistry, Fifth Ed. (W.H. Freeman);.

[0042] Imajte na umu da, kako se ovde koristi i u priloženim patentnim zahtevima, jedinstveni oblici "a," "an," i "the" uključuju množine, osim ako kontekst jasno ne diktira drugačije.

[0043] Kada se obezbedi niz vrednosti, podrazumeva se da je svaka vrednost između gornje i donje granice tog opsega i bilo koje druge navedene ili vrednosti u navedenom opsegu obuhvaćena u okviru pronalaska. Gornja i donja granica ovih manjih opsega mogu se nezavisno uključiti u manje opsege, a takođe su obuhvaćena u pronalasku, u zavisnosti od bilo koje izričito isključene granice u navedenom opsegu. Tamo gde naveden opseg obuhvata jednu ili obe granice, opsezi izvan ovih ili onih uključenih granica takođe su uključeni u pronalazak.

[0044] U sledećem opisu, postavljeni su brojni specifični detalji kako bi se obezbedilo detaljnije razumevanje ovog pronalaska. Međutim, stručnjaku će biti očigledno da se ovaj pronalazak može praktikovati bez jednog ili više ovih specifičnih detalja. U drugim slučajevima, dobro poznate osobine i procedure dobro poznate stručnjacima nisu opisane kako bi se smanjila mogućnost nerazumevanja pronalaska.

Metode pronalaska

[0045] Ovaj pronalazak obezbeđuje sastave za primenu u metodama za lečenje inflamatornih oboljenja zglobova, simptoma povezanih s inflamatornim oboljenjima zglobova i usporavanje progresije bolesti davanjem subjektu - obično injektiranjem putem intraartikularne injekcije - vektor koji eksprimira terapeutski interleukin -10 (IL-10) ekspresioni konstrukt. U nekim otelotvorenjima, IL-10 ekspresioni konstrukt je enkapsuliran u biorazgradive mikročestice, a u nekim aspektima ovih otelotvorenja, mikročestice se suspenduju u razblaživaču kako bi se formirao terapeutski sastav. Kao alternativa, u poželjnim otelotvorenjima terapeutski ekspresioni vektor IL-10 se isporučuje kao "ogoljeni" vektor, pri čemu isporuka ogoljenog ekspresionog vektora IL-10 prati ili prethodi davanju adjuvansa za uzimanje nukleinske kiseline. Adjuvans za uzimanje nukleinske kiseline može se primenjivati ili istovremeno ili do deset ili više dana pre primene golog ekspresionog vektora IL-10. Metode predmetnog pronalaska mogu se koristiti za lečenje zglobova zgloba u kolenima, laktovima, ručnim zglobovima, nožnim zglobovima, kuku, ramenima ili kičmi. Stanja koja se mogu lečiti pomoću metoda prema predmetnom pronalasku uključuju reumatoidni artritis i osteoartritis, kao i tendinitis, burzitis, inflamacija ligamenta, snovitis, protuzuma i sistemski eritematozni lupus.

[0046] Prema tome, pronalazak generalno obezbeđuje sastave za upotrebu u metodama lečenja inflamatornih oboljenja zglobova i simptoma i fizioloških oštećenja povezanih sa inflamatornim oboljenjima zglobova. Obelodanjivanje takođe omogućava korišćenje metoda u istraživanju inflamatornih oboljenja zglobova, uključujući identifikaciju lekova, malih molekula i/ili biologa koji se mogu koristiti zajedno (u "koktelu") sa terapeutskim IL-10 ekspresionim konstruktom. Metode obuhvataju korak davanja subjektu, poželjno injekcijom u zglob, IL-10 ekspresionog konstrukta koji sadrži bakterijski ili virusni glavni lanac i najmanje jednu IL-10 kodirajuću sekvencu. U nekim slučajevima IL-10 ekspresioni konstrukt opciono je enkapsuliran u biorazgradive mikročestice. Anti-inflamatorni sastavi su uglavnom suspendovane u razblaživaču za isporuku u zglob. IL-10 ekspresioni konstrukt može sadržati najmanje jednu nukleinsku sekvencu ciljanja, pri čemu je najmanje jedna nukleinsku sekvenca ciljanja 5', 3' ili oba za IL-10 kodirajuću sekvencu.

[0047] Anti-inflamatorna jedinjenja mogu se sastojati od "golog" bakterijskog vektora ili virusnog vektora koji može eksprimirati najmanje jednu IL-10 kodirajuću sekvencu, ili anti-inflamatorno jedinjenje može se sastojati iz bakterijskog ili virusnog vektora koji je zatvoren u mikročestice ili druge uređaje isporuke. Davanje terapijskog IL-10 ekspresionog konstrukta može biti praćena ili može prethoditi davanjem adjuvansa, a u slučaju isporuke gornjih IL-10 ekspresionih konstrukata, adjuvans za uzimanje nukleinske kiseline može se davati istovremeno ili do deset dana ili više pre primene golog IL-10 ekspresionog konstrukta.

[0048] IL-10 ekspresioni konstrukt za upotrebu u metodi lečenja prema predmetnom pronalasku sadrži bakterijski glavni lanac (plazmidnu DNK ili pDNK) najmanje jednu IL-10 kodirajuću sekvencu, najmanje jednu nukleinsku sekvencu ciljanja 5’ (uzvodno), 3’ (nizvodno) ili obe najmanje jedne IL-10 kodirajuće sekvence i jednu ili više kontrolnih sekvenci DNK. Opciono, pDNK takođe može sadržati jednu ili više dodatnih antiinflamatornih citokinskih kodirajućih sekvenci, i/ili markersku sekvencu koja omogućava izbor transformisanih ćelija tokom amplifikacije pDNK. Bakterijska osnova može biti bilo koji bakterijska glavni lanac poznat stručnjacima iz ove oblasti. Glavni lanci koji su tipično biraju su oni koji, na primer, sadrže ili nemaju odgovarajuća mesta za ograničavanje da bi se omogućila lakoća kloniranja, mogu biti proizvedeni i izolovani sa lakoćom, nisu imunogeni i slično. Na primer, bakterijski glavni lanci izvedeni iz E. coli su u upotrebi u ovom pronalasku.

[0049] Plazmidna DNA sadrži najmanje jednu IL-10 kodirajuću sekvencu. IL-10 kodirajuća sekvenca može kodirati za divlje tipove IL-10, ili IL-10 može biti mutant IL-10. Jedan mutantni IL-10 od interesa sadrži jednu ili više mutacija koje uzrokuju aminokiselinske supstitucije, dodatke ili delecije u poređenju sa divljim tipovima IL-10 u oblasti "zglobnog" IL-10 proteina. Humani protein IL-10 je homodimer, pri čemu svaki monomer sadrži šest alfa heliksa A → F, čija je dužina 21, 8, 19, 20, 12 i 23 aminokiseline. Helikse A → D jednog monomera nekovalentno komuniciraju sa heliksima E i F drugog monomera, formirajući nekovalentni homodimer u obliku slova V. Oblast "zgloba" namenjena mutaciji u skladu sa ovim pronalaskom obuhvata aminokiseline između alfa heliksa D i E na jednom ili oba monomera približno na poziciji aminokiseline X do položaja Y divljeg IL-10. Na primer, opisani su mutirani pacovi i humani IL-10 proteini u kojima je fenilalanin na poziciji 129 divlje sekvence zamenjen serinskim ostatkom. (Videti, npr., Sommer, i dr., WO2006/130580 i Milligan, i dr., Pain, 126:294-308 (2006).) Dobijeni mutant IL-10 se naziva IL-10<F129S>. Druge supstitucije za divlji tip fenilanina na poziciji 129 aminokiseline mogu biti, npr., treonin, alanin ili cistein. Prema tome, ovaj pronalazak u još jednom aspektu obuhvata jednu ili više supstitucija na poziciji 129 aminokiseline ili na drugim aminokiselinama unutar područja zglobova IL-10 proteina ili njegovih funkcionalnih ekvivalenata.

[0050] Dodatni anti-inflamatorni citokini korišćeni u predmetnom pronalasku obuhvataju, ali nisu ograničeni na interleukinu-4 (IL-4), interleukinu-13 (IL-13), alfa-MSH, transformišući faktor rasta-beta 1 (TGFβ1) i slično.

[0051] Nuklearne ciljne sekvence iz ovog pronalaska su sekvence koje promovišu ekspresiju proteina koji su kodirani najmanje jednom IL-10 kodirajućom sekvencom i opcionom, dodatnom anti-inflamatornom citokinskom sekvencom (kodovima). Na primer, u jednom aspektu nuklearne ciljne sekvence mogu se vezati za proteinske proteine nukleinskog transporta, olakšavajući uzimanje plazmidne DNK od strane ćelijskog jezgra. Takve sekvence uključuju, ali se ne ograničavaju na, interferentne (ili dispergovane) DNK ponavljanja ili ponavljajuće sekvence, kao što su prenosivi elementi, bočni ili terminalna ponavljanja, kao što su duga terminalna ponavljanja (LTRs) na retrovirusnim genomima kao što su SV40s, tandemna ponavljanja i obrnuta terminala ponavljanja (ITR) virusnih genoma kao što su Adeno-Associated Virus i Adenovirus. U drugim aspektima, nuklearne ciljane sekvence su sekvence koje deluju da vezuju transkripcione faktore za uvoz u jezgro, kao što su sekvence pojačivača.

[0052] Pored bakterijske osnove, najmanje jedna IL-10 kodirajuća sekvenca i opcionalno jedna ili više dodatnih anti-inflamatornih citokinskih kodirajućih sekvenci i, opciono, jedna ili više nukleinskih sekvenci ciljanja, plazmidna DNK sadrži jednu ili više kontrolnih sekvenci DNK, kao što su promoterske sekvence, poliadenilacioni signali, sekvence završetka transkripcije, regulatorni uzvodni domeni, poreklo replikacije, mesta za unos ribozoma i slično, koji zajedno obezbeđuju replikaciju, transkripciju i prevođenje sekvenci kodova anti-inflamatornog citokina u ćelija primaoca. Nisu sve ove kontrolne sekvence potrebne da budu prisutne sve dok su sekvence kodiranja anti-inflamatornog citokina sposobne da se repliciraju, prenose i prevode u odgovarajuću ćeliju domaćina. Promotivne sekvence upotrebe ovde obuhvataju, ali nisu ograničene na promotere pileće ili humane β-aktin promotere, neposredne promotere citomegalovirusa, promotere gliceraldehida 3-fosfat dehidrogenaze (GADPH), promotere 1α (eF1α) elongacijskog faktora, promotere GFAP, promoter virus leukemije miševa (MLV), promoter virusa herpesa jednostavnog virusa timidin kinaze (TK) i promoterski post-transkripcioni regulatorni element (VPRE) virusa hepatitisa; uzvodni regulatorni domeni upotrebe u ovom pronalasku obuhvataju, ali nisu ograničeni na pojačivače ranih promotera citomegalovirusa, pojačivače virusnog tumora sisara (MMTV) i pojačivači simian virusa 40 (SV40); i poliadenilacijski signali koji su od interesa za ovaj pronalazak obuhvataju, ali nisu ograničeni na SV40 signal poliadenilacije, signal poliadenilacije hormona rasta goveda i sintetičke signale poliadenilacije. Opciono, plazmidna DNK će takođe može sadržati selekcioni markerski gen, kao što je kodiranje za otpornost na antibiotike. Markeri gena upotrebe ovde uključuju, ali nisu ograničeni na neomicin, higromicin-B, ampicilin, kanomicin ili puromicin.

[0053] Na primer, plazmidi koji sadrže sekvencu IL-10 pacova na kojoj se nalaze dva AAV ITR-a, pojačivač promotera ranog promotera citomegalovirusa, promoter pilećeg β-aktina, signal poliadenilacije i promoter herpes simpleks timidin kinaze koji je pokretao marker otpornosti na neomicin korišćen je u neki eksperimentima pokazuju korisnost ovog pronalaska. U drugim eksperimentima korišćeni su plazmidi koji sadrže humanu sekvencu IL-10 na kojoj se nalaze dva AAV ITR-a, unapređeni promoter brzih promotora citomegalovirusa, rani promoter citomegalovirusa, signal poliadenilacije i marker otpornosti na ampicilin. Detalji o tim plazmidima su obelodanjeni u Milligan, i dr., Pain 126:294-308 (2006).

[0054] Alternativno, vektor može biti virusni vektor. Generalno, pet najčešće korišćenih klasa virusnih sistema koji se koriste u genskoj terapiji mogu se kategorizovati u dve grupe prema tome da li se njihovi geni integrišu u ćelijski hromatin domaćina (onkoretrovirusi i lentivirusi) ili da postoje u ćelijskom jezgru pretežno kao ekstrahromozomni epizomi (virus povezan sa adenovirusom, adenovirusi, herpesvirusi i lentivirusi sa deficijentnim integracijama). Na primer, u jednom otelotvorenju ovog pronalaska koriste se virusi iz porodice Parvoviridae. Parvoviridae je porodica malih jednolančanih, neobuhvatanih DNK virusa sa genomima od otprilike 5000 nukleotida. Uključeni članovi porodice su virusi povezani sa adenovirusima (AAV), zavisni parvovirus koji po definiciji zahteva ko-infekciju sa drugim virusom (tipično adenovirus ili herpesvirus) da inicira i održi produktivni infektivni ciklus. U odsustvu takvog moćnog virusa, AAV je i dalje kompetentan da inficira ili prenese ciljnu ćeliju vezivanjem receptora i intervalizacijom, prodire kroz jezgro u ćelija i onih koje se dele i onih koje se ne dele.

[0055] Drugi sistem za dostavu virusa koji je koristan sa IL-10 ekspresionim konstruktima ovog pronalaska je sistem zasnovan na virusima iz porodice Retroviridae. Retrovirusi obuhvataju jednolančane RNK životinjske viruse koje karakterišu dve jedinstvene osobine. Prvo, genom retrovirusa je diploidan, sastoji se od dve kopije RNK. Drugo, ova RNK transkribuje enzimsku reverznu transkriptazu enzima pridruženih virusu u dvostrukoj DNK. Ova dvostruka DNK ili provirus može onda da se integriše u genom domaćina i da se prenese od roditeljske ćelije do potomskih ćelija kao stabilno integrisane komponente genoma domaćina.

[0056] U nekim slučajevima, lentivirusi su poželjni članovi porodice retrovirusa koji se koriste ovde. Lentivirusni vektori su često pseudotipizirani sa glikoproteinom virusa vezikularnog stomatitisa (VSV-G), a potiču iz virusa humane imunodeficijencije (HIV), etiološkog agensa sindroma sindromom stečene imunodeficijencije (AIDS); visan-maedi, koji uzrokuje encefalitis (visnu) ili pneumoniju kod ovaca; virus zarazne anemije konja (EIAV), koji uzrokuje autoimunsku hemolitičku anemiju i encefalopatiju kod konja; virus mačje imunodeficijencije (FIV), koji uzrokuje imunski deficit kod mačaka; virus goveđeg imunodeficijencije (BIV) koji izaziva limfadenopatiju i limfocitozu kod goveda; i simian virus imunodeficijencije (SIV), koji uzrokuje imunski deficit i encefalopatiju kod primata koji nisu čovek. Vektori koji su zasnovani na HIV-u uglavnom zadržavaju < 5% roditeljskog genoma, a < 25% genoma je inkorporirano u konstrukte, što smanjuje mogućnost stvaranja povratnog kompetentnog HIV-a. Bio-bezbednost je dodatno povećana razvojem samoinaktivirajućih vektora koji sadrže delecije regulatornih elemenata u sekvenci sa nultim terminalnimponavljanjem, eliminišući transkripciju signala za pakovanje koje je potrebno za vektorsku mobilizaciju. Glavna prednost upotrebe lentiviralnih vektora je u tome što je prenos gena u svim tkivima ili tipovima ćelija uporan zbog integracije viralnog vektora. Međutim, lentivirus koji je deficit integraze takođe može da se koristi.

[0057] Adenovirusi (Ads) su relativno dobro karakterisana homogena grupa virusa, uključujući preko 50 serotipova. Videti, npr., međunarodnu PCT prijavu br. WO 95/27071. Adenovirusi su srednje veličine (90-100 nm), neobavijeni (bez spoljašnjeg lipidnog duplog sloja) ikosaedrični virusi sastavljeni od nukleokapsida i dvostrukog linearnog DNK genoma. Postoji 57 opisanih serotipova kod ljudi koji su odgovorni za 5-10% gornjih respiratornih infekcija kod dece i mnoge infekcije kod odraslih. One su klasifikovane kao grupa I pod klasifikacionom šemom Baltimore, što znači da se njihovi geni sastoje od dvostruke DNA i najveći su neobrađeni virusi. Zbog njihove velike veličine, oni se mogu transportovati kroz endozom (tj., fuzija obloge nije potrebna). Virus takođe ima jedinstveni "vrh" ili vlakno povezano sa svakom pentonskom bazom kapsida koji pomaže u vezu sa ćelijskim putem receptora koksakijevog adenovirusa na površini ćelije domaćina.

[0058] Genom adenovirusa je linearan, ne-segmentirane dvostruke (ds) DNK koja je između 26 i 45 kb, dozvoljavajući virusu da teoretski nosi 22 do 40 gena. Iako je ovo znatno veće od drugih virusa u Baltimore grupi, to je i dalje veoma jednostavan virus i veoma se oslanja na ćeliju domaćina za preživljavanje i replikaciju. Jednom kada je virus uspešno ušao u ćeliju domaćina, endozom se acidifikuje, što menja topologiju virusa izazivajući delove kapsida da se odvoje. Uz pomoć ćelijskih mikrotubula, virus se prenosi u kompleks nukleinskih pora, gde rastavlja delove adenovirusa. Virusna DNK se kasnije oslobađa, koja može ući u nukleus preko nukleinskih pora. Posle toga, DNK se povezuje sa molekulima histona. Tako se može pojaviti ekspresija virusnog gena i mogu se generisati nove čestice virusa.

[0059] Za razliku od većine lentivirusnih vektora (tj., onih koji se mogu integrisati, npr., nisu integrazno deficijentna), adenovirusna DNK se ne integriše u genom i ne replicira se tokom ćelijske deobe. Primarne primene za adenovirus su u genetskoj terapiji i vakcinaciji. Takođe su konstruisani rekombinantni vektori izvedeni adenovirusom, posebno oni koji smanjuju potencijal za rekombinaciju i generisanje virusa divljeg tipa. Videti, međunarodne PCT prijave br. WO 95/00655 i WO 95/11984.

[0060] Drugi virusni ili ne-virusni sistemi poznati stručnjacima takođe mogu biti korišćeni da isporučuju IL-10 ekspresione konstrukte u zglob, uključujući, ali ne ograničavajući se na vektore adenovirusa transpozona koji su izbrisani genom koji stabilno održavaju transgene kodirane virusom in vivo kroz integraciju u ćelije domaćina (videti Yant, i dr., Nature Biotech.20:999-1004 (2002)); sistemi dobijeni od strane Sindbis virusa ili Semliki šumsog virusa (videti Perri, i dr., J. Virol.74(20):9802-07 (2002)); sistemi koji su izvedeni iz virusa Newcastle bolesti ili Sendai virusa; ili vektora DNK mini kruga bez lanca sekvence bakterija (videti Chen, i dr., Molecular Therapy.8(3):495-500 (2003)). Mini-krug DNK kao što je opisano u patentnoj prijavi SAD br. 2004/0214329 obelodanjuje vektore koji obezbeđuju konstantno visoke nivoe transkripcije nukleinske kiseline.

[0061] Jednom kada je ekspresioni konstrukt IL-10 konstruisan, amplifikovan i izolovan pomoću tehnika poznatih u stanju tehnike, IL-10 ekspresioni konstrukt je opciono, u nekim otelotvorenjima, enkapsuliran unutar mikročestica. Tehnike za enkapsulaciju IL-10 ekspresionog konstrukta variraju u zavisnosti od vrste mikročestica koje se koriste i takve tehnike su detaljnije opisane u infra. Mikročestice mogu se sastojati od bilo kakvog biorazgradivog polimera. Da bi se uspešno koristio kao biorazgradiv polimer u formulacijama za kontrolisane isporuke lekova, materijal mora biti hemijski inertan i bez ispirajućih nečistoća. Idealno, polimer takođe ima odgovarajuću fizičku strukturu, sa minimalnim neželjenim starenjem i lako se može obraditi. Neki od materijala uključuju poli(2-hidroksi etil metakrilat), poli(N-vinil pirolidon), poli(metil metakrilat), poli(vinil alkohol), poli(akrilna kiselina), poliakrilamid, poli(etilen-ko-vinil acetat), poli(etilen glikol) i poli(metakrilna kiselina). Biorazgradivi polimeri posebne upotrebe uključuju polilaktide (PLA), poliglikolide (PGA), poli(laktidne ko-glikolide) (PLGA), polianhidride, polikaprolaktone, poli-3-hidroksibutirat i poliortoestre. Takvi biorazgradivi polimeri su obilno okarakterisani i mogu se formulisati da bi pokazali željena degradacijska svojstva koja je poznata u struci (vidi, npr., Edlund & Albertsson, Degradable Aliphatic Polyesters, str.67-112 (2002), Barman, i dr., J. of Controlled Release, 69:337-344 (2000); Cohen, i dr., Pharmaceutical Res., (8): 713-720 (1991)).

[0062] U jednom posebnom otelotvorenju pronalaska, polimer sadrži poli(laktid-ko-glikolid) (PLGA). PLGA je kopolimer koji se koristi u mnoštvu terapijskih uređaja odobrenih od strane FDA, zahvaljujući svojoj biorazgradivosti i biokompatibilnosti. PLGA se sintetiše pomoću slučajne kopolimerizacije otvaranja dva različita monomera, cikličnih dimera (1,4-dioksan-2,5-diona) glikolne kiseline i mlečne kiseline. Zajednički katalizatori koji se koriste u pripremi ovog polimera uključuju kalaj(II) 2-ethilhekanoate, kalaj(II) alkokside ili aluminijum izopropoksid. Tokom polimerizacije, sukcesivne monomerne jedinice glikolne ili mlečne kiseline povezane su u PLGA pomoću estarskih veza, čime se dobija linearni, alifatski poliester kao proizvod.

[0063] U zavisnosti od odnosa laktida i glikolida koji se koriste za polimerizaciju, mogu se dobiti različiti oblici PLGA: ovi se obično identifikuju u odnosu na odnos monomera (npr., PLGA 75:25 identifikuje kopolimer čiji je sastav 75% (mol. procenta) mlečne kiseline i 25% (molarni procenat) glikolne kiseline). PLGA se degradira hidrolizom estarskih veza u prisustvu vode. Pokazano je da je vreme potrebno za degradaciju PLGA vezano za odnos monomera koji se koristi u proizvodnji: što je veći sadržaj glikolida, to je manji vremenski period potreban za degradaciju. Izuzetak od ovog pravila je kopolimer sa odnosom 50:50 monomera koji pokazuje bržu degradaciju (oko dva meseca). Pored toga, polimeri koji su završeni sa estrima (za razliku od slobodne karboksilne kiseline) pokazuju duže poluvreme razgradnje. Od posebne primene u predmetnom pronalasku je PLGA koji ima sastav između 20% i 80% mlečne kiseline i između 80% i 20% glikolne kiseline. Poželjnije za upotrebu u ovom tekstu je PLGA koja ima sastav između 65% i 35% mlečne kiseline i između 35% i 65% glikolne kiseline. U jednom aspektu, koristi se PLGA sastav sa 50% mlečne kiseline i 50% glikolne kiseline.

[0064] Pored toga, ekspresioni konstruktu IL-10 (pDNA) mogu biti enkapsulirani u smešama mikročestica sa različitim profilima oslobađanja; na primer, 10% pDNK koja se isporučuje može biti enkapsulirana u mikročestice koje imaju, npr., profil za otpuštanje od jedne do četiri nedelje; 30% pDNK koja se isporučuje može biti enkapsulirana u mikročestice sa, npr., profilom oslobađanja od tri nedelje do šest nedelja; 30% pDNK koja se isporučuje može biti enkapsulirana u mikročestice sa, npr., profilom oslobađanja od šest nedelja do deset nedelja; i 30% pDNK koja se isporučuje može biti enkapsulirana u mikročestice sa, na primer, profilom oslobađanja od osam nedelja do dvanaest nedelja. U takvom otelotvorenju može se koristiti jedan tip biorazgradivog polimera, ali se koristi u formulacijama sa različitim profilima oslobađanja; alternativno, mogu se koristiti različiti biorazgradivi polimeri koji imaju različite karakteristike oslobađanja. U još jednom otelotvorenju, formulacija mikročestica može biti različita tako da promeni površinu mikročestica kako bi se ubrzalo ili usporilo, po želji, putovanje terapeutskog sastava kroz, na primer, sinovijalne tečnosti zgloba.

[0065] Nakon dobijanja mikročestica, suspendovane su u prihvatljivom razblaživaču kako bi se formirao terapeutski sastav za davanje subjektu. Slično tome, ako su ekspresioni konstrukti IL-10 prema predmetnom pronalasku isporučeni kao nakupljena DNK nasuprot tome što su enkapsulirane, razređivači se takođe koriste za davanje subjekta. Takvi razblaživači (ili ekscipijensi) uključuju bilo koje farmaceutsko sredstvo koje same po sebi ne indukuje proizvodnju antitela štetnih za pojedinca koji prima sastav i koji se može davati bez nepotrebne toksičnosti. Farmaceutski prihvatljivi razblaživači mogu da sadrže sorbitol, alum, dekstran, sulfat, velike polimerne anjone, bilo koje od različitih TWEEN jedinjenja i tečnosti kao što su voda, fiziološki rastvor, glicerol ili etanol, emulzija ulja i vode ili adjuvansi kao što je Frojdov adjuvans. Na njima se mogu uključiti i farmaceutski prihvatljive soli, na primer, soli mineralnih kiselina kao što su hidrohloridi, hidrobromidi, fosfati, sulfati i slično; i soli organskih kiselina kao što su acetati, propionati, malonati, benzoati i slično. Pored toga, u takvim nosačima mogu biti prisutne pomoćne supstance, kao što su ovlaživači ili emulgatori, sredstva za puferovanje pH i slično. U jednom aspektu pronalaska koriste se različiti razređivači na osnovu njihove sposobnosti da migriraju kroz ciljanu lokaciju u zglobu. Na primer, za isporuku kod odraslog čoveka, mogu se koristiti razblaživači koji favoriziraju brže širenje terapeutskog sastava kroz zglob; i obratno, kod dece ili malih životinja u kojima je veličina zgloba manje zabrinjavajuća, može se koristiti razređivač koji ne rastvara brzo terapeutski sastav. Detaljna diskusija o farmaceutski prihvatljivim razblaživačima/pomoćnim supstancama dostupna je u Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins (2005). Poželjni razblaživači uključuju, ali nisu ograničeni na, Physiosol®, veštačku sinovijalnu tečnost, 0.9% NaCl bez konzervansa, laktantni Ringerov injekcioni rastvor i Elliotts B® Solution.

[0066] Sintetizovanje i davanje sastava za inventivnu upotrebu uključuje niz koraka. Prvo, izgrađen je plazmid koji sadrži različite komponente opisane supra. Tada se plazmidna DNK (pDNK) pojačava i izoluje tehnikama koje su dobro poznate u struci. Jednom kada se pDNK izoluje, može se kombinovati sa polimerima da bi se formirale mikročestice koje sadrže pDNK. Metode formiranja mikročestica variraju u zavisnosti od polimera koji se koriste, međutim, obično se koristi tehnika dvostruke emulzije. Prvo, polimer se rastvara u organskom rastvaraču. Zatim, pDNK se suspenduje u vodenom rastvoru i dodaje se u rastvor polimera. Dva rastvora se zatim mešaju kako bi se formirala prva emulzija. Rastvori se mogu mešati mešanjem ili treskanjem ili prolazom kroz čestice koja stvara turbulenciju, ili smeša može biti sonična. Najprihvatljiviji je svaki metod kojim nukleinska kiselina dobija najmanju količinu oštećenja u vidu cepkanja, smicanja ili degradacije, dok i dalje omogućava stvaranje odgovarajuće emulzije. Tokom ovog procesa, polimer se formira u mikročestice, od kojih mnoge sadrže pDNK. Ako se to želi, u ovoj tački se može izolovati mala količina nukleinske kiseline kako bi se procenio integritet, npr., elektroforeza gela.

[0067] Prva emulzija se zatim dodaje organskom rastvoru. Rastvor se može sastojati od, na primer, metilen hlorida, etil acetata ili acetona koji obično sadrži polivinil alkohol (PVA) i često imaju približno 1:100 odnos težine PVA prema zapremini rastvora. Prva emulzija se generalno dodaje organskom rastvoru uz mešanje u homogenizatoru ili sonikatoru. Ovaj postupak formira drugu emulziju koja se kasnije dodaje u drugi organski rastvor uz mešanje (npr., u homogenizatoru). U jednom aspektu ove metode, drugi rastvor je 0.05% w/v PVA. Rezultujuće mikročestice se ispiraju nekoliko puta sa vodom kako bi se uklonila organska jedinjenja. U nekim aspektima, više od oko 40% dobijenih mikročestica sadrži pDNK. U još nekim aspektima, više od oko 50% dobijenih mikročestica sadrži pDNK, u još nekim aspektima, više od 55% rezultujućih mikročestica sadrži pDNK.

[0068] Sposobnost ugrađivanja mikročestica različitih veličina varira sa tipom ćelija. U određenim otelotvorenjima, ciljane su makrofage i ćelije koje predstavljaju antigen. Takve ćelije efikasnije internalizuju mikročestice manje od oko 5 µ (videti Shakweh, i dr., Eur J of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 61(1-2):1-13 (2005)). Prema tome, ako se to želi, čestice se mogu propustiti kroz sita za selekciju kako bi selektivno uklonili one veće od željene veličine. U jednom posebnom aspektu, u terapeutskom sastavu se koriste mikročestice manje od 5 µ, a u drugim posebnim aspektima, u terapeutskom sastavu se koriste mikročestice manje od 3 µ. Nakon ispranja, čestice se mogu odmah koristiti ili se liofilizuju za čuvanje. Distribucija veličine mikročestica, pripremljenih metodama opisanim ovde, može se odrediti pomoću, npr., Coulter™ brojača ili laserske difrakcije. Alternativno, prosečna veličina čestica može se odrediti vizuelizacijom pod mikroskopom opremljenim klizačem ili okularom za dimenzionisanje. Alternativno, skeniranje elektronskog mikroskopa može se koristiti za procenu i veličine i mikroartikularne morfologije.

[0069] Kada se dobiju mikročestice koje sadrže IL-10 ekspresioni konstrukt, mikročestice se mogu odmah suspendovati u razblaživaču ili liofilizovati za čuvanje. Kombinacija mikročestica i razblaživača formira terapeutski sastav mikročestica koji se može injektirati u zglob životinjskog subjekta. Rekombinantni vektori mogu biti uvedeni in vivo ili in vitro (takođe nazvani ex vivo) za lečenje inflamatornog zgloba. Ako se prenese in vitro, željena ćelija primaoca ili sinovijalna tečnost se uklanja iz subjekta, tretira se sa mikročesticama sa pDNK i ponovo se uvodi u subjekt. Alternativno, sinegenske ili ksenogenske ćelije mogu se transformisati za isporuku, ukoliko takve ćelije obično ne generišu neodgovarajući imuni odgovor u subjektu. Ako se primenjuju in vivo, rekombinantni vektori ili ćelije transformisane sa vektorima in vitro se direktno injektiraju u zglob.

[0070] Ekspresioni konstrukti IL-10 su, u alternativnom otelotvorenju, davani kao gola DNK. U takvom slučaju, ekspresioni konstrukti IL-10 se pojačavaju, npr., koristeći dobre proizvodne prakse. GMP se primenjuju u Sjedinjenim Državama od strane SAD Uprave za hranu i lekove (FDA), u skladu sa Odeljkom 501 (B) Zakona o hrani, lekovima i kozmetici iz 1938. godine (21 USCS § 351).

[0071] Adjuvansi pogodni za sadašnju upotrebu uključuju adjuvanse koji povećavaju uzimanje IL-10 ekspresionih konstrukata iz ovog pronalaska; to jest, odgovarajući adjuvansi uključuju bilo koji biološki kompatibilan agens koji neutrališe ili sprečava pitanje unošenja negativno-naelektrisane DNK u ćelije sa negativnim nabojem membrane. Takvi adjuvansi uključuju šećere kao što su manoza, glukoza i saharoza; kalcijum fosfat; dendrimeri (repetitivno razgranati molekuli); lipozomi (sferni mehurić koji sadrže lipidni duplo sloj) uključujući katjonske lipozome; DEAE-dekstran uključujući DEAE-dekstran polietilenimin; oligodeoksinukleotidi; i hijaluronske kiseline visoke molekulske mase (> 1MDa), anjonskog nesulfovanog glikozaminoglikana.

[0072] Jedan adjuvans od posebnog interesa je D-manoz. D-manoza je jednostavan heksozni šećer sa molekulskom težinom od 180.2 i poznato je da: smanjuje inflamatorne procese tokom zarastanja rana (Kossi J, i dr., Eur Surg Res, 31(1):74-82 (1999), smanjuje oksidativne nalete potrebne tokom inflamacije (Rest RF, i dr., J Leukoc Biol, 43(2):158-164 (1988)), suzbija artritis izazvan adjuvansom u modelu pacova (Willenborg DO, i dr., Immunol Cell Biol, 70(Pt 6):369-377 (1996)), inhibira LPS-indukovani IL-1β, TNF-α, smanjuje NF-kB/p65 kritičnu za proinflamatornu ekspresiju citokina i smanjuje priliv leukocita nakon intratrahealne instalacije LPS-a, što predstavlja model akutne povrede pluća povezane sa sepsom i sindromom respiratornog distresa (Xu XL, i dr., Inflamm Res, 57(3):104-110 (2008); Xu X, i dr., Eur J Pharmacol, 641(2-3):229-2372010)). MR je receptor za prepoznavanje transmembranskog glikoproteina koji je uključen u zaštitu urođenog imuniteta domaćina prepoznaje manosilirane ligande (na primer, lizozomske hidrolaze) koje mogu uključiti razne bakterije, kvasce i parazite koji izražavaju manosilirane molekule (videti, na primer, Engering AJ, i dr., Adv Exp Med Biol, 417:183-187 (1997); Linehan SA, i dr., Adv Exp Med Biol, 479:1-14 (2000); Stahl PD, i dr., Curr Opin Immunol, 10(1):50-55 (1998)).

[0073] Budući da terapeutski sastav ne indukuje značajno imunski odgovor ili toleranciju doze kod ispitanika, oni se mogu primenjivati po potrebi za terapeutski efekat. To znači da se terapeutski anti-inflamatorni sastav može isporučiti otprilike svakih 40 do 120 dana (ili po potrebi) koliko je potrebno za terapeutski efekat za kraću terapiju. Međutim, kada je poželjna dugoročna terapija, terapeutski sastav se može davati otprilike svakih 40 do 120 dana (ili više ili manje) koliko je potrebno za terapeutski efekat više od jedne godine; i ako je potrebno, tokom celog života subjekta. Frekvencija doze zavisi od doziranja, korišćenog adjuvansa i zdravlja subjekta.

[0074] Opseg doza terapijskih sastava koji se koriste u metodama prema predmetnom pronalasku variraju od subjekta do subjekta, u zavisnosti od vrste, starosti i opšteg stanja subjekta, težine tretiranog stanja, zajedničkog mesta i određenog IL-10 ekspresionog konstrukta koji se isporučuje, bez obzira da li je IL-10 ekspresioni konstrukt enkapsuliran ili nije, način davanja i slično. Dozni opseg uključuje terapeutski efikasnu dozu po zglobu na oko 1-1000 µg vektorska DNK, oko 5-750 µg vektorska DNK, oko 10-600 µg vektorske DNK, 20-500 µg vektorske DNK, 25-250 µg vektorska DNK ili 50 -100 µg vektorske DNK.

[0075] IL-10 ekspresioni konstrukt ili mikročestice koje sadrže IL-10 ekspresione konstrukte korišćene u metodama iz ovog pronalaska mogu se zajednički primenjivati u "koktelu" sa drugim terapeutskim sredstvima korisnim za lečenje inflamacije zgloba uključujući glukokortikoide; metotreksat; hidroksiholokvin; sulfasalazin; lefunomid; anti-TNF agense kao što su etanercept, infliksimab i adalimumab; abatacept; hijaluronska kiselina, posebno hijaluronska kiselina visoke molekulske mase (>1MDa), kao što je Hyalgan, Orthovisc ili Synvisc u dozi od npr.0.5-2.5% (5 do 25 mg/mL) od 1 do 5 mL, tako da se od 5 mg do 125 mg po zglobu; i nesteroidni anti-inflamatorni lekovi (NSAID). Pored toga, IL-10 ekspresioni konstrukti ili mikročestice koje sadrže IL-10 ekspresione konstrukte korišćene u metodama iz ovog pronalaska, mogu se davati zajedno sa ćelijama, kao što su mezenhimske matične ćelije ili druge matične ćelije, uključujući biogenezne matične ćelije da eksprimiraju IL -10 ekspresione konstrukte. Generalno, svaki metod poznat u stanju tehnike može se koristiti za praćenje uspeha lečenja kod ljudi, uključujući i kliničke i fenotipske indikatore.

[0076] Dodatni predmeti, prednosti i nove karakteristike ovog pronalaska će postati očigledni stručnjacima iz oblasti nakon ispitivanja sledećih primera, koji nisu namenjeni ograničavanju. U Primerima, postupci koji su konstruktivno smanjeni na praksu opisani su trenutno, a procedure koje su sprovedene u laboratoriji postavljene su u prošlosti.

PRIMERI

[0077] Sledeći primeri su predstavljeni kako bi stručnjaci iz oblasti pružili potpuno obelodanjivanje i opis kako napraviti i koristiti ovaj pronalazak i nisu namenjeni da ograniče obim onoga što pronalazači smatraju svojim izumom, niti je namera da predstavljaju ili impliciraju da su eksperimenti ispod navedeni ili jedini eksperimenti koji se izvode. Stručnjaci iz ove oblasti će ceniti da se brojnim varijacijama i/ili modifikacijama može napraviti pronalazak, kao što je prikazano u specifičnim otelotvorenjima, bez napuštanja obima pronalaska kao što je potanko opisano. Prema tome, trenutna obelodanjivanja se moraju uzeti u obzir u svim aspektima kao ilustrativna i ne ograničavajuća.

[0078] Uloženi su napori kako bi se osigurala tačnost u odnosu na brojeve koji se koriste (npr., količine, temperatura, itd.), ali treba uzeti u obzir neke eksperimentalne greške i odstupanja. Osim ako nije drugačije naznačeno, delovi su maseni delovi, molekulska masa je prosečna molekulska masa, temperatura je stepen celzijusima, a pritisak je atmosferski ili blizu njega.

Pojačavanje i prečišćavanje pDNK

[0079] Plazmatski konstrukt koji kodira pacovski interleukin-10 (pDNA-IL-10F129S) prethodno je detaljno opisan u Milligan, i dr., Pain 126(1-3): 294-308 (2006). Ukratko, plazmid se sastoji od 5.9 kilobaza (Kb) kružne plazmidne DNK koja sadrži transkripcionu kasetu koja se sastoji od citomegalovirusa/pilećeg beta-aktinsog promotera (CMV enh/CB pro) koji izaziva eksprimiranje gena IL-10 pacova koji sadrži tačku mutacije (F129S) i viralnog SV40 poliadenilacionog signala. Kaseta za transkripciju je obeležena konverzijom sekvencijalnog terminala od 149 bp. Identični plazmid bez IL-10 gena korišćen je kao kontrola pDNK. Oba plazmida su pojačana u SURE 2 superkompetentnim E. coli ćelijama (Agilent Technologies, SAD) i izolovana korišćenjem kompletnog preparata za prečišćavanje plazmida Giga bez endotoksina (Qiagen, Valencia, CA, SAD) prema uputstvima proizvođača. Prečišćeni plazmidi bez endotoksina resuspendovani su u sterilnom Dulbecco's PBS (DPBS, 1, 0.1 mikronski filtirane kroz pore, pH 7.2, katalog # 14190-144; Gibco, Invitrogen Corp, Grand Island, NY, SAD) sa 3% saharoze (DPBS -3%). Nosač DPBS-3% pripremljen je korišćenjem molekularne biologije D (+)-saharoze (bD-fruktofuranozil-AD-glukopiranozid, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) u DPBS, 0.2 um sterilne filtrirane (bez pirogena katalog za proizvodnju špriceva, katalog # 25AS020AS, Life Science Products, Inc., CO, SAD) i uskladišteni u sterilnim konusnim cevima od 15 ml na 4 °C do upotrebe.

Pripremanje mikročestica i karakterizacija

[0080] Mikročestice su pripremljene korišćenjem modifikovanog protokola isparavanja sa dvostrukom emulzijom/rastvaračem (A.M. Tinsley-Bown, i dr., J. of Controlled Release 66(2-3): 229-41 (2006)). Ukratko, 50:50 PLGA kopolimera (MV 75,000, polimeri koji se mogu apsorbovati) je rastvoren u etil acetatu (Sigma). Samo u nosaču (fosfatni pufer fiziološkog rastvora (PBS) 3% (w/v) sukroza (Sigma)) ili pDNK u nosaču je emulzifikovano u PLGA rastvoru praćeno sa drugom emulzijom u 5% polivinil alkohola, 28% kalcijum hlorida, 3% sukroze (Sigma) i 7% rastvora etil acetata. Posle 4 sata očvršćavanja u rastvoru za pranje, dobijene mikročestice su sakupljane, liofilizovane i čuvane na 4 °C. Skeniranje elektronske mikroskopije (SEM) korišćeno je za ispitivanje morfologije mikročestica. Prečnici od > 1000 mikro čestica prisutnih u 10 različitih slika su mereni pomoću softvera NIH ImageJ i prečnici vezanih čestica korišćeni su za generisanje normalizovane raspodele frekvencija. Zeta potencijal mikročestica je meren pomoću Nicomp 380 ZLS Zeta Potential Analyzer, a nivoi endotoksina nastalih mikročestica su testirani pomoću LAL testa, koristeći serijsko razblaženje kao kontrolu za inhibiciju. Korišćene mikročestice pokazale su sferičnu i glatku morfologiju pod SEM-om i zeta-potencijal od -28.04 ± 2.12 mV. Mikročestice su pokazale heterogenu raspodelu veličine sa ukupnim srednjim prečnikom od 4.67 ± 0.26 mm, što je u skladu s sličnim metodama proizvodnje mikročestica i efikasnost enkapsulacije pDNK za čestice je bila 55.1%.

[0081] Ukupna pDNK enkapsulacija je procenjena ekstrakcijom pDNK iz mikročestica rastvaranjem rastvora natrijum hidroksida, merenjem apsorbance na 260 nm i upoređivanjem dobijenih vrednosti sa DNK standardima u poznatim koncentracijama. Konačna opterećenja pDNK su 8.78 ± 0.65 mg pDNK/mgPLGA za mikročestice PLGA-pDNA-IL-10. Vodena ekstrakcija pDNK je sprovedena rastvaranjem mikročestica u hloroformu i dopuštajući da pDNK migrira u vodeni pufer. Ekstrakovana pDNK je kasnije koncentrisana taloženjem sa etanolom i ponovo suspendovana u PBS 3% saharoznom nosaču. Strukturni integritet vodene ekstrahovane pDNK upoređivani su sa nekapsuliranom pDNK (koja je slično izložena procesu vodene ekstrakcije), učestvujući sa 2 mg ukupne pDNK u otvorima od 1.0% agaroznog gela koji sadrži etidijum bromid, pokrećući gel na 75 V 2 sata, i snimanje gela sa UV trans-osvetljavanjem na 305 nm. Biološka aktivnost vodene ekstrahovane pDNK je procenjena transfekcijom posredovana lipofektaminom u humanoj embrionalnoj vrsti 293 ćelije prema proizvođačkim protokolima (Invitrogen) i koncentracijama proteina IL-10 u supernatantima ćelijske kulture sakupljene 24 sata nakon transfekcije sa vodenom ekstrahovanom i nekapsulisanom pDNK ELISA (R & D Sistems). In vitro profilno oslobađanje je sprovedeno inkubiranjem mikročestica u PBS tokom vremena u vodenom kupatilu na 37 °C, a sadržaj pDNK u supernatantu kvantifikovan je testom PicoGreen (Milligan, i dr., Neuron Glia Biology 2(4) 293-308 (2006)).

[0082] Elektroforeza vodenog ekstrahovanog pDNK iz mikročestica u poređenju sa nekapsuliranom pDNK pokazala je da je sigurnosni integritet opuštenog i supstituisanog pDNK-a bio očuvan nakon enkapsulacije, mada je primećeno blago otkrivanje linearizovane pDNK i blagih izmena u migraciji multimernih pDNK vrsta posle enkapsulacije. Upoređivanjem rezultujućeg nivoa ekspresije proteina IL-10 u supernatantima humanih embrionalnih bubrežnih ćelija-293 ćelija 24 sata nakon transfekcije posredstvom lipofektamina sa ekstrahovanom ili nekapsuliranom pDNK izmerenom u dozi, utvrđeno je da ekstrahovana pDNK-IL-10 iz mikročestica pokazuje 96.8% zadržavanje biološke aktivnosti za rezultujuću proizvodnju IL-10 (podaci nisu prikazani). Analiza pDNK in vitro analize pokazala je da je 30% pDNK oslobođeno nakon 3 dana i stabilno oslobađanje je postignuto više od 75 dana. Ovaj dvofazni profil oslobađanja je uobičajena karakteristika oslobađanja makromolekula iz mikročestica PLGA na bazi emulzije, gde je poboljšana faza inicijalnog pDNK oslobađanja posledica povećanog sadržaja pDNK na ili blizu površine mikročestica, a nakon čega sledi produženo oslobađanje i difuzija pDNK iz unutrašnjosti mikročestica (Yeo, Archive of Endotoxin Res. 27(1): 1-12 (2004)). Nivoi endotoksina iz mikročestica sa i bez enkapsulirane pDNK bili su ispod granica detekcije za LAL test do koncentracije mikročestica od 10 mg/ml (1 mg mikročestica/otvoru).

D- Manoza

[0083] U otelotvorenjima gde je primenjen adjuvans kao što je D-manoza. D-manoza (katalog # M6020) može se kupljen nosač bez Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). D-manoza se kombinuje sa 0.1% BSA u sterilnom fiziološkom rastvoru i primenjuje se putem intra-artikularne injekcije ili istovremeno sa IL-10 ekspresionim konstruktom ili od jednog do deset dana pre primene IL-10 ekspresionog konstrukta. D-manoza se obično isporučuju u dozama od 2.5 µg - 500 µg po zglobu kod rase pasa.

Davanje pri lečenju inflamacije zgloba kod roda pasa

[0084] IL-10 ekspresioni konstrukt (pDNA-IL-10<F129S>) kao "gola" pDNK davan je akutnom intra-artikularnom injekcijom do ugroženog zgloba u seriji pasa. Pod IV sedacijom i anesteziološkim nadzorom, zahvaćeni zglob pacijenata je hirurški obrušen kako bi se uklonilo svo krzno preko zgloba i sterilizovano uz pomoć hirurškog čišćenja, kao što je hlorahsidin 2%. Pacijentova srčana frekvencija, krvni pritisak, zasićenost kiseonikom, ventilacija i srčani ritam kontinuirano su nadgledani. Hipodermična igla sa 22 ili 20 kalibra ubačena je u sinovijalni prostor. Sinovijalna tečnost je aspirirana pre primene pDNK kako bi se osigurala pravilna postavka igle. Špric koji sadrži aspirat sinovijalnu tečnost zamenjen je uz održavanje intra-artikularnog postavljanja igle. Kada se sinovijalna tečnost aspirira, terapeutski anti-inflamatorni preparat je dat u zglob koristeći istu intraartikularnu iglu. Injektirani su do 1 mg plazmatskog DNK ekvivalenta, iako je utvrđeno da je samo 700 µg efikasno. Kada je zapremina po ubrizgavanju zgloba tokom administracije premašila 1 ml, tečnost za zglob se aspirira kako bi se nadoknadila. Posle uspešnog postavljanja terapeutskog anti-inflamatornog sastava u zglobnom prostoru, pacijent je bio odvojen od sedativa i klinički nadgledan. Bilo kakva promena krvnog pritiska, srčane frekvencije, oksigenacije, ventilacije ili srčanog ritma tokom postupka korigovana je odgovarajućim medicinskim tretmanima. Predviđeni efekti sedacije uključuju bradikardiju, hipotenziju, hipoventilaciju. Terapija kiseonikom je bila neprekidna tokom čitave procedure kako bi se maksimizirao nivo zasićenja kiseonika. Sedativi koji odgovaraju pojedinim pacijentima i sami lekovi ili kombinacije sledećih:

A: Deksmedetomidin 0.5mg/m<2>, Reversal (atipamazol 0.05-0.2mg/lb)

B: Opijati -- Butorphanol(0.05-0.1mg/lb),

C: Propofol - i.v. ostvaranje

D: Benzodiazepini (diazepam): 0.1-0.2mg/lb

Subjekti su ostali u veterinarskom objektu jedan dan (manje od 12 sati), a zatim im je dozvoljeno da idu kući.

[0085] Kliničke procene su uključivale vlasnike Canine Brief Inventory procene ponašanja, veterinarske klinike Visual Analog Scale za bol i pokretljivost, goniometrija, farmaceutska redukcija/zavisnost, i video i kontrolno praćenje. Slika 1 prikazuje rezultate u obliku trakastih grafikona koji ilustruju kliničku procenu funkcionalnog poboljšanja i smanjenja bolova koji su postignuti tretiranjem osteoartritisa prednjih zglobova kod rase pasa nakon primene terapijskog IL-10 ekspresionog konstrukta iz ovog pronalaska. Imajte na umu da je primena IL-10 ekspresionog konstrukta iz ovog pronalaska rezultirala značajnim funkcionalnim poboljšanjem i smanjenjem bolova u svim hodovima, kaskanjima, manipulacijama, dometu kretanja i funkcionalnom onesposobljenju, posebno za 11-nedelja.

[0086] Slika 2 prikazuje rezultate u obliku trakastih grafikona koji ilustruju sopstvenu procenu funkcionalnog poboljšanja i smanjenja bolova koji su postignuti tretiranjem osteoartritisa prednjih zglobova kod rase pasa nakon primene terapijskog IL-10 ekspresionog konstrukta iz ovog pronalaska. Imajte na umu da je opet postignuto značajno poboljšanje u svim parametrima aktivnosti, kvalitetu života, rastu, hodanju, trčanju i penjanju stepeništa čak i za 1. nedelju.

[0087] Slika 3 prikazuje rezultate u obliku trakastih grafikona koji ilustruju kliničku procenu funkcionalnog poboljšanja i smanjenja bolova koji su postignuti tretiranjem osteoartritisa prednjih zglobova kod rase pasa nakon primene terapijskog IL-10 ekspresionog konstrukta iz ovog pronalaska (objedinjeni podaci). Rezultati kliničke procene pokazuju značajne pozitivne rezultate, posebno kod bolova.

[0088] Slika 4 prikazuje rezultate u obliku trakastih grafikona koji ilustruju sopstvenu procenu funkcionalnog poboljšanja i smanjenja bolova koji su postignuti tretiranjem osteoartritisa prednjih zglobova kod rase pasa nakon primene terapijskog IL-10 ekspresionog konstrukta iz ovog pronalaska (objedinjeni podaci). Napomena u ovim rezultatima, slična rezultatima na Slici 2, došlo je do značajnog poboljšanja kod svih parametara aktivnosti, kvaliteta života, rasta, hodanja, trčanja i penjanja po stepeništu čak i u 1. nedelji.

[0089] Slika 5 prikazani su rezultati koji pokazuju poboljšanja u dometu kretanja postignutog lečenja osteoartritisa prednjih zglobova kod rase pasa nakon primene terapijskih IL-10 ekspresionih konstrukta iz ovog pronalaska (objedinjeni podaci). Imajte na umu da je promena stepena uglova pokazala značajno poboljšanje.

[0090] Prethodna diskusija o pronalasku predstavljena je u svrhu ilustracije i opisa. Prethodno nije namenjeno ograničenju pronalaska u smislu oblika ili obrazaca koji su ovde obelodanjeni. Iako opis pronalaska sadrži opis jednog ili više otelotvorenja i određenih varijacija i modifikacija, druge varijacije i modifikacije su u okviru pronalaska, npr., što može biti u veštinama i znanju onih iz struke, nakon razumevanja sadašnjeg obelodanjivanja. Namenjen je dobijanju prava koja obuhvataju alternativna obelodanjivanja do dozvoljene mere, uključujući alternativne, zamenjive i/ili ekvivalentne strukture, funkcije, opsege ili korake za one koji se zahtevaju, bez obzira da li takve alternativne, zamenjive i/ili ekvivalentne strukture, funkcije, opsezi ili koraci jesu obelodanjeni u ovom dokumentu, i bez namere da se javno posveti predmet koji se patentira.

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Sastav koji sadrži bakterijski plazmatski IL-10 ekspresioni konstrukt, pri čemu IL-10 ekspresioni konstrukt sadrži bakterijski glavni lanac i sekvencu nukleinske kiseline koja kodira interleukin-10 za upotrebu u metodi lečenja inflamatornog oboljenja zgloba kod subjekta, pomenuta metoda obuhvata injektiranje sastava u inflamatorni zglob pacijenta.

2. Sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, gde se u postupku daje IL-10 ekspresioni konstrukt sa adjuvansom.

3. Sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 2, gde je adjuvans odabran iz grupe koju čine D-manoza, saharoza, glukoza, kalcijum fosfat, dendrimeri, oligonukleotidi, hijaluronska kiselina visoke molekularne mase ili lipozomi.

4. Sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde sekvenca nukleinske kiseline koja kodira interleukin-10 ima aminokiselinsku supstituciju serina, alanina, treonina ili cisteina za divlji tip fenilalanina na poziciji 129 aminokiseline.

5. Sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde sekvenca nukleinske kiseline koja kodira interleukin-10 kodira IL-10<F129S>.

6. Sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde ekspresioni konstrukt sadrži najmanje jednu sekvencu 5’ ciljanja sekvence u IL-10 kodirajuću sekvencu.

7. Sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde ekspresioni konstrukt sadrži najmanje jednu sekvencu 3’ ciljanja sekvence u IL-10 kodirajuću sekvencu.

8. Sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je oboljenje inflamatornog zgloba artritis, tendinitis, burzitis, upala ligamenta, snovitis, giht i sistemski eritematozni lupus.

9. Sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde sastav sadrži mikročestice koje enkapsuliraju ekspresioni konstrukt.

10. Sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 9, gde mikročestice sadrže polimer koji sadrži poli(mlečno-ko-glikolnu kiselinu).

11. Sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 9, gde mikročestice sadrže polimer koji sadrži 50:50 poli(mlečno-ko-glikolnu kiselinu).

12. Sastav za primenu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde postupak obuhvata davanje preparata koji sadrži 1-1000 µg bakterijskog IL-10 ekspresionog konstrukta i 5-1000 µg D-manoze.

13. Sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde se u postupku D-manoza primenjuje istovremeno sa IL-10 ekspresionim konstruktom.

14. Sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde se u postupku D-manoza primenjuje do deset dana pre primene IL-10 ekspresionog konstrukta.

15. Sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde ekspresioni konstrukt sadrži najmanje jednu sekvencu 5’ i 3’ ciljanja sekvence u IL-10 kodirajuću sekvencu.