RS58141B1 - Anti-cxcr3 antitela - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ovom prijavom se traži korist od prioriteta prema poglavlju 35, čl. 119 američkog Zbornika zakona (U.S.C.) a za privremenu Patentnu prijavu br.61/588,936, od 20. januara 2012.

LISTA SEKVENCI

[0002] Ova prijava sadrži Listu sekvenci koja je podneta u ASCII formatu putem mreže sistema za elektronsko podnošenje patentnih prijava (EFS-Web) Američkog zavoda za patente i žigove. Pomenuti ASCII dokument, napravljen 28. januara 2013, ima naziv 12423304.txt i veličine je 307.524 bajta.

[0003] Pronalazak se odnosi na antitela i metode za primenu antitela za lečenje poremećaja vezanih za CXCR3 signalizaciju, kao što je dijabetes melitus tip 1 (dijabetes tip I; T1D).

[0004] Dijabetes se karakteriše hroničnom hiperglikemijom koja je posledica nedostatka dejstva insulina, uz druge karakteristične metaboličke abnormalnosti. Dijabetes se može grubo podeliti u tip I i tip II. T1D je okarakterisan gubitkom β-ćelija Langerhansovih ostrvaca pankreasa, dok je tip II okarakterisan smanjenim lučenjem insulina i osetljivosti na insulin (rezistencija na insulin). U Sjedinjenim Državama, prevalencija dijabetesa je oko 2 do 4 procenta populacije, dok dijabetes tipa I (poznat i kao insulin zavisni, ili IDDM) čini oko 7 do 10 posto svih slučajeva.

[0005] Dijabetes tipa I je okarakterisan neuspešnom proizvodnjom dovoljne količine insulina za održavanje homeostaze glukoze. Veruje se da je ovaj poremećaj izazvan uništavanjem βćelija pankreasa, koje je autoimunski posredovano. Autoimunost povezana sa dijabetesom tip I uključuje učešće B i T autoreaktivnih limfocita. Zaista, do 98% pacijenata sa dijabetesom tip I imaju antitela protiv jednog ili više sopstvenih antigena β-ćelija, uključujući insulin, dekarboksilazu glutaminske kiseline (GAD), insulinom antigen-2 i insulinom antigen-2b (IA-2 i IA-2 β), i heterogene citoplazmatske antigene ćelija ostrvaca (ICA). Mada to ne mora uvek biti odlučujuće, nivo jednog ili više antitela generalno je u korelaciji sa stanjem uništavanja β-ćelija. Irvine, et al., Diabetes, 26:138-47 (1997); Riley, et al., N. Engl. J. Med., 323:1167-72 (1990). Prema tome, antitela se mogu koristiti kao indikatori razvoja autoimunog dijabetesa, i uz metaboličke promene mogu da predvide rizik od razvoja dijabetesa kod rođaka pacijenata sa T1D.

[0006] Razvoj dijabetesa tip I je moguć posredstvom autoreaktivnih T ćelija, kao što dokazuju biopsije tkiva dobijene u vreme oko postavljanja dijagnoze T1D koje pokazuju da ostrvca imaju infiltrirane aktivirane T ćelije. Bottazzo et al., N. Engl. J. Med., 313:353-60 (1985); Hanninen et al., J. Clin. Invest., 90:1901-10 (1992); Itoh et al., J. Clin. Invest., 92:2313-22 (1993); Imagawa, et al., Diabetes, 50:1269-73 (2001).

[0007] Receptor hemokina 3 (C-X-C motiv; CXCR3), poznat i kao G protein vezani receptor 9 (GPR9), CD183, IP-10 receptor, i Mig receptor, predstavlja receptor hemokina eksprimiran na autoreaktivnim T ćelijama koje su uključene u niz fizioloških procesa i povezanih poremećaja, kao što je T1D. CXCR3 se uglavnom ne nalazi u naivnim T ćelijama, ali se njegova koncentracija povećava nakon aktivacije antigenom, i regrutuje aktivirane ćelije na mestima inflamacije tkiva kao odgovor na primarne ligande: CXCL9, CXCL10 i CXCL11. Pokazalo se da β ćelije pretežno eksprimiraju CXCL10, sa nižim koncentracijama CXCL9, na mišjim modelima za T1D (Christen et al The Journal of Immunology, 2003, 171: 6838-6845; Morimoto et al. J Immunol 2004;173;7017-7024; Sarkar et al. Diabetes. februar 2012;61(2):436-46); i na ostrvcima pacijenata sa T1D koji imaju insulitis (Uno et al 2010; Roep et al Clinical and Experimental Immunology, 2003, 159: 338-343; Sarkar et al.

Diabetes. februar 2012;61(2):436-46). Pored toga, dokazano je da T ćelije koje su se infiltrirale u pankreas eksprimiraju CXCR3 na modelima miševa sa T1D i uzorcima pankreasa pacijenata sa dijabetesom tip 1 (Christen et al, The Journal of Immunology, 2003, 171: 6838-6845; Van Halteren et al., Diabetologia 48:75-82 (2005); Uno et al 2010; Roep et al., Clinical and Experimental Immunology, 2003, 159: 338-343; Sarkar et al., Diabetes. februar 2012;61(2):436-46). Pored toga, nokaut miševi sa nedostatkom CXCR3 pokazuju značajno kašnjenje početka i smanjenje incidencije T1D (Frigerio et al., Nature Medicine 8:1414-1420 (2002)), dok prekomerna ekspresija CXCL10 u ostrvcima transgenih miševa poboljšava infiltriranje T ćelija i ubrzava početak T1D (Rhode et al., J. Immunol. 175(6): 3516-24 (2005)). Dokazano je da neutralizacija CXCL10 putem lečenja antitelima ima zaštitno dejstvo (Christen et al., The Journal of Immunology, 2003, 171: 6838-6845).

[0008] Postoje tri izooblika CXCR3, označeni kao A, B, i Alt., koji su identifikovani kod ljudi (Lasagni et al. J. Exp. Med.2003 197:1537; Ehlert et al J. Immunol. 2004;173;6234-6240). CXCR3-A se vezuje za CXC hemokine CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP-10) i CXCL11 (I-TAC); CXCR3-B se takođe vezuje za ove ciljeve, ali takođe vezuje CXCL4; izgleda da CXCR3-Alt interaguje sa CXCL11. Mada alternativno splajsovanje dovodi do stvaranja nekoliko izooblika proteina CXCR3, oblik CXCR3-A preovladava in vivo, pošto se CXCR3-B i CXCR3-Alt eksprimiraju na mnogo nižim nivoima na nivou proteina. Lasagni et al. J. Exp. Med.2003 197:1537; Ehlert et al J. Immunol. 2004;173;6234-6240.

[0009] Pokušaji da se prekine put CXCR3 pomoću malih molekula inhibitora CXCR3 nisu bilo sasvim efikasni. Christen et al., Clin Exp. Immunol. 165: 318-328 (2011). Prema tome, istraživanje je bilo usredsređeno na antitela i druge metode prekida CXCL10, prvenstveno pre pojave dijabetesa. Morimoto et al., J. Immun.173: 7017-7024 (2004); Oikawa et al., Rev. Diabet. Stud.7: 209-224 (2010).

[0010] Međunarodna prijava WO 2005/030793 objavljuje humana monoklonska anti-humana CXCR3 antitela, 5H7 i 7H5.

[0011] Međunarodna prijava WO 01/72334 objavljuje pacovsko monoklonsko anti-mišje CXCR3 antitelo 1G3.

[0012] Međunarodna prijava WO 2008/094942 objavljuje humanizovana anti-humana CXCR3 antitela, uključujući humanizovano mišje anti-humano CXCR3 mAt V44D7.

[0013] Američki patent US 6,184,358 objavljuje mišja (miš) monoklonska antitela protiv humanog CXCR3, naročito uključujući 1C6.

[0014] S obzirom na prevalenciju T1D i drugih poremećaja u koje je uključen CXCR3, postoji potreba za dodatnim metodama koje ciljaju na CXCR3 signalizaciju, npr., za lečenje ili smanjenje progresije poremećaja kao što je T1D kod pacijenta.

[0015] Ovde su objavljena antitela i metode za primenu antitela koja mogu da se vežu za CXCR3. U nekim otelotvorenjima, antitela se mogu upotrebiti za sprečavanje, lečenje ili smanjenje rane progresije T1D kod ispitanika, ciljanjem CXCR3 puta. Antitela i metode se, makar delimično, oslanjaju na iznenađujući rezultat da neutrališuća antitela usmerena na CXCR3 mogu sprečiti početak T1D kod negojaznih dijabetičnih miševa (NOD miševa) kada se daju pre početka bolesti, ili mogu da obrnu tok bolesti kada se daju u novonastalom stadijumu T1D kod NOD miševa. Nadalje, neutralizacija aktivnosti CXCR3 nije povezana sa značajnim oštećenjem normalnog rada pacijentovog imunskog sistema, smanjujući pri tome neželjena dejstva terapije antitelom.

[0016] Prema tome, u jednom aspektu, ovde su objavljena antitela i antigen vezujući fragmenti koji mogu da neutrališu aktivnost CXCR3. U nekim otelotvorenjima, CXCR3 neutrališuća antitela mogu biti okarakterisana sposobnošću da se vežu za peptid odabran od ostataka 1-58, 1-16 ili 1-37 ID BR. SEKV:1. U nekim otelotvorenjima, antitela sadrže cele klonove antitela ili njihove delove (CI), označene kao Cl 12, Cl 135, Cl 82, Cl 53 i/ili Cl 4. U nekim otelotvorenjima, date su varijante antitela Cl 12, Cl 135, Cl 82, Cl 53 i/ili Cl 4, uključujući CDR-graftovane, humanizovane, ponovo mutirane i potpuno humane varijante objavljenih antitela. U konkretnim otelotvorenjima, antitelo sadrži jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR), npr. jedan ili više CDR1, CDR2, i CDR3 teškog lanca, i/ili jedan ili više CDR1, CDR2, i CDR3 lakog lanca, klonova Cl 12, Cl 135, Cl 82, Cl 53 i/ili Cl 4, ili bilo koju varijantu ovde objavljenih klonova 4, 12, 53, 82 i 135. U nekim otelotvorenjima, antitela Cl 12, Cl 135, Cl 82, Cl 53 i/ili Cl 4, ili njihove himerne i humanizovane verzije, pokazuju izvesna korisna svojstva, u poređenju sa anti-CXCR3 klonovima 5H7, 7H5, V44D7, 1C6 i/ili 49801. Na primer, ovde objavljena antitela mogu da ispolje povećan afinitet vezivanja u poređenju sa anti-hCXCR3 klonovima 5H7, 7H5, V44D7, 1C6 i 49801. Na primer, antitelo može da ispolji 1, 2, 3, 4, 5 ili više puta veći afinitet (ili bilo koja vrednost između) od anti-CXCR3 antitela kao što je 1C6, npr. mereno površinskom plazmonskom rezonancom (npr. pomoću testa BIACORE™). Ovde objavljena humanizovana antitela takođe imaju predviđeno smanjenje imunogenosti u poređenju sa mišjim anti-hCXCR3 klonovima 5H7, 7H5, V44D7, 1C6 i 49801. Pored toga ovde objavljeni klonovi teškog lanca 4.7-4.11 optimizovani su da se ukloni mesto deamidacije na položajima 58 i 59 (koristeći IMGT numeraciju) i pri tome poveća stabilnost u odnosu na inicijalnu mišju anti-hCXCR3 CDR2 sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (VH).

[0017] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje metode za profilaksu pre početka T1D, kao i metode za lečenje ili smanjenje progresije novog početka T1D kod ispitanika, primenom efikasne količine CXCR3 neutrališućeg antitela. Ispitanik može biti sisar, kao što je čovek.

[0018] Ispitanik koji ima novi početak T1D može biti lečen ovde objavljenim metodama u roku od 6 meseci od kliničke dijagnoze. U drugim otelotvorenjima, ispitanik se leči duže od 6 meseci posle kliničke dijagnoze, naznačeno time što ispitanik zadržava rezidualne nivoe C-peptida u serumu uz uzdržavanje od hrane na najmanje 0,2 nmol/l.

[0019] Ispitanici mogu biti okarakterisani povišenim nivoima glukoze u krvi uz uzdržavanje od hrane u odsustvu egzogenog insulina, koji su veći od 120 mg/dl, ili abnormalno niskim nivoom C-peptida u serumu uz uzdržavanje od hrane od oko 0,033 do 1,0 nmol/l x min tokom stimulacije C-peptida. CXCR3 neutrališuće antitelo se primenjuje u dozi od oko 0,03-3,7 mg/kg/dozi. Ispitaniku se može dati najmanje jedna doza antitela. Ispitaniku se mogu dati ponovljene doze antitela (npr. najmanje godišnje, tromesečne, dvomesečne, mesečne, dvonedeljne, nedeljne ili dnevne). Gore opisane metode mogu dalje da uključe korak davanja imunosupresiva i/ili agensa za stimulaciju β ćelija istovremeno ili redno (pre ili posle) u odnosu na davanje CXCR3 neutrališućeg antitela.

[0020] Ovde objavljena anti-CXCR3 antitela su primenjena za lečenje stanja okarakterisanog abnormalnom ekspresijom CXCR3. Ona mogu biti primenjena za lečenje bilo kog stanja koje može imati koristi od smanjenja i/ili neutralizacije aktivnosti CXCR3. Ovde objavljena anti-CXCR3 antitela su primenjena za lečenje T1D.

[0021] Otelotvorenja i prednosti pronalaska, kao i dodatni primeri za poređenje biće predstavljeni u delu opisa koji sledi.

[0022] Treba shvatiti da su i ovaj opšti opis i naredni detaljni opis samo primeri dati kao objašnjenje, i nisu ograničavajući za pronalazak, koji je definisan priloženim patentnim zahtevima.

[0023] Prateći crteži, koji su uključeni u i čine sastavni deo ove specifikacije, ilustruju jedno (više) otelotvorenja pronalaska, i zajedno sa opisom, služe za objašnjenje principa pronalaska.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0024]

Slika 1 prikazuje ekspresiju insulina (levi pano), CXCL10 (centralni pano) i CD3 (desni pano) u sekcijama pankreasa 6 nedelja starih ženki NOD miševa (prvi red), 10 nedelja starih ženki NOD miševa (drugi red), i ženki NOD miševa sa novonastalim dijabetesom (treći red).

Slika 2 je protočna citometrijska analiza ekspresije CXCR3 na T ćelijama iz pankreasa ženki NOD miševa sa novonastalim dijabetesom. CD4+ i CD8+ T ćelije su identifikovane i obojene za ekspresiju CXCR3, kao što pokazuje puna linija na dva donja dijagrama. Bojenje za kontrolu izotipa je prikazano osenčenom krivom na ista dva dijagrama.

Slika 3 prikazuje procenat nedijabetičnih ženki NOD miševa tokom vremena kod životinja tretiranih sa PBS, anti-CXCR3 i kontrolnim IgG počevši od 10 nedelja starosti, pre pojave dijabetesa. Rezultati dve nezavisne studije prikazani su na sl.3A i 3B.

Slika 4 prikazuje pankreas 26 nedelja starih nedijabetičnih ženki NOD miševa profilaktički lečenih anti-CXCR3 antitelom počevši od 10 nedelja starosti, koji je obojen za insulin (levi pano) ili CD3/Foxp3 (centralni i desni panoi). Desni pano je uvećana slika sekcije prikazane na centralnom panou.

Slika 5 prikazuje dnevne jutarnje vrednosti glukoze u krvi kod ženki NOD miševa lečenih pomoću PBS, anti-CXCR3 antitela, kontrolnog IgG i mišjeg antitela antitimocitnog globulina (mišji timoglobulin, mATG) počinjući u roku od 3-4 dana nakon što je utvrđeno da je miš dijabetičan. Svaka linija prikazuje pojedinačnog miša.

Strelice pokazuju dane kada je dato lečenje.

Slika 6A je stubasti dijagram koji prikazuje procenat T ćelija iz ženki NOD miševa lečenih pomoću PBS, anti-CXCR3 antitela, kontrolnog IgG i mATG antitela koje su CD4+ (levi dijagram) i CD8+ (desni dijagram). Pankreas je sakupljen od miševa tokom lečenja nakon pete injekcije ispitivanog artikla i miševa usklađene starosti lečenih pomoću mATG. Slika 6B predstavlja zavisnost ekspresije CD44 (vertikalna osa) u odnosu na ekspresiju CD62L (horizontalna osa) na CD4+ T ćelijama iz pankreasa miševa lečenih pomoću PBS, kontrolnog antitela ili anti-CXCR3 antitela. G1 i G2 odnose se na gejtovane T ćelije sa visokim sadržajem CD44 / niskim sadržajem CD62L, odnosno niskim sadržajem CD44 / niskim sadržajem CD62L. Slika 6C pokazuje ekspresiju CXCR3 na CD4+ T ćelijama kod G1 i G2, u poređenju sa ekspresijom CXCR3 na ćelijama obojenim antitelom za kontrolu izotipa i gejtovanim na limfocitima.

Slika 7 prikazuje sekcije pankreasa ženki NOD miševa lečenih kontrolnim IgG (levi panoi), anti-CXCR3 antitelom (centralni panoi), i mATG (desni panoi), i obojenim za insulin (gornji red) ili CD3 / Foxp3 (donji red).

Slika 8A-D predstavlja zavisnost nivoa glukoze u krvi posle opterećenja glukozom kod nedijabetičnih ženki NOD miševa usklađene starosti (sl.8A), dijabetičnih NOD miševa lečenih pomoću PBS (sl.8B), NOD miševa u remisiji bolesti nakon lečenja anti-CXCR3 antitelom (sl.8C) i dijabetičnih NOD miševa lečenih kontrolnim IgG antitelom (sl.8D). Opterećenje glukozom je izvršeno na miševima 100 dana nakon početne dijagnoze dijabetesa i uključenja u studiju. Svaka linija prikazuje podatke za pojedinačnu životinju.

Slika 9A-B prikazuje procenat nedijabetičnih miševa tokom vremena za NOD.Scid primaoce koji su primili objedinjene donorske CD4+ i CD8+ T ćelije izolovane iz ženki NOD miševa lečenih pomoću PBS, anti-CXCR3, kontrolnog IgG ili mATG antitela. T ćelije su izolovane iz dijabetičnih ženki NOD miševa oko 80-90 dana nakon lečenja pomoću PBS ili kontrolnog IgG, ili iz ženki NOD miševa u remisiji bolesti oko 80-90 dana nakon lečenja pomoću anti-CXCR3 ili mATG antitela.

Rezultati dve nezavisne studije prikazani su na sl.9A i 9B.

Slika 10A prikazuje procenat CD4+ i CD8+ donorskih T ćelija izolovanih iz ženki NOD miševa lečenih pomoću PBS, anti-CXCR3, kontrolnog IgG ili mATG antitela (levi pano), kao što je opisano na slici 9. Procenat efektorskih i centralnih memorijskih ćelija u objedinjenim donorskim CD4+ i CD8+ T ćelijama za svaku lečenu grupu prikazan je na desnim panoima sl.10A. Slika 10B prikazuje procenat regulatornih T ćelija u objedinjenim donorskim T ćelijama, identifikovan preko ekspresije CD4 i CD25, ili ekspresije CD4, CD25 i Foxp3. Slika 10C prikazuje procenat CD8+ (levi pano) i CD4+ (desni pano) u objedinjenim donorskim T ćelijama koje takođe eksprimiraju CXCR3.

Slika 11A-B prikazuje procenat nedijabetičnih miševa tokom vremena nakon adoptivnog transfera T ćelija od donora OVA-specifičnih TCR transgenih miševa u RIP-OVA miševe primaoce koji su ostavljeni bez lečenja, ili su lečeni anti-CXCR3 antitelom ili kontrolnim IgG. Rezultati dve studije prikazani su na sl.11A i 11B. Slika 12A prikazuje ekspresiju CXCR3 na donorskim T ćelijama analiziranu protočnom citometrijom pre adoptivnog transfera u RIP-OVA miševe primaoce (puna kriva). Bojenje antitelom za kontrolu izotipa prikazano je na osenčenoj krivoj. Slika 12B prikazuje procenat donorskih ćelija u krvi, slezini i limfnim čvorovima pankreasa kod miševa primalaca lečenih pomoću anti-CXCR3 ili kontrolnog IgG antitela 2, 4, 7, 9. i 15. dana posle adoptivnog transfera. Slika 12C prikazuje procenat proliferativnih donorskih ćelija u krvi, slezini i limfnim čvorovima pankreasa kod miševa primalaca lečenih pomoću anti-CXCR3 ili kontrolnog IgG antitela nakon adoptivnog transfera. Slika 12D prikazuje procenat CXCR3+ donorskih ćelija u krvi, slezini i limfnim čvorovima pankreasa kod miševa primalaca lečenih pomoću anti-CXCR3 ili kontrolnog IgG antitela nakon adoptivnog transfera.

Slika 13 prikazuje sekcije pankreasa iz RIP-OVA nelečenih miševa primalaca, obojene za insulin (gore levo) ili CD3 (gore desno), ili lečenih pomoću anti-CXCR3 antitela, obojene za insulin (dole levo) ili CD3 (dole desno). Pankreas je sakupljen 60 dana nakon adoptivnog transfera donorskih ćelija.

Slike 14A-C prikazuju nivo inhibicije CXCR3 posredovane hemotakse prema CXCL11 posredstvom klonova Cl 4, 12, 53, 82 i 135. Podaci su prikazani kao srednja vrednost relativnih fluorescentnih jedinica (RFU) ćelija koje se kreću u testu hemotakse. Slika 14D prikazuje koncentraciju antitela potrebnu za inhibiranje mobilizacije kalcijuma za 50% za klonove antitela Cl 4, 12, 53 i 135.

Slike 15A-C prikazuju nivo inhibicije CXCR3 posredovane hemotakse prema CXCL9 (sl. 15A), CXCL10 (sl. 15B) i CXCL11 (sl.15C) posredstvom klonova Cl 4, 12, 53, 82 i 135. Podaci su prikazani kao srednja vrednost relativnih fluorescentnih jedinica (RFU) ćelija koje se kreću u testu hemotakse.

Sl. 16 prikazuje histogramsku zavisnost antitela koje se vezuje za ćelije koje eksprimiraju različite receptore hemokina. Koncentracija vezanog antitela se povećava duž horizontalne ose za svaki histogram.

Sl. 17A prikazuje poravnavanje varijabilnih domena teškog (VH) i lakog (VK) lanca za klon 4.0 (označen kao „matični“) i nekih humanizovanih varijanti (označenih sa VH1-3 i 7-11, i VK 1-3). Sl.17B prikazuje poravnavanje varijabilnih domena teškog (VH) i lakog (VK) lanca za klon 12.0 (označen kao „matični“) i nekih humanizovanih varijanti (označenih sa VH1-3 i VK 1-3). Sl.17C prikazuje poravnavanje varijabilnih domena teškog (VH) i lakog (VK) lanca za klon 53.0 (označen kao „matični“) i nekih humanizovanih varijanti (označenih sa VH1-6 i VK 1-9). Sl.17D prikazuje poravnavanje varijabilnih domena teškog (VH) i lakog (VK) lanca za klon 82.0 (označen kao „matični“) i nekih humanizovanih varijanti (označenih sa VH1-3 i VK 1-3). Sl.17E prikazuje poravnavanje varijabilnih domena teškog (VH) i lakog (VK) lanca za klon 135.0 (označen kao „matični“) i nekih humanizovanih varijanti (označenih sa VH1-3 i VK 1-3). Sl.17F prikazuje poravnavanje varijabilnih domena teškog (VH) i lakog (VK) lanca za klon 4.0 (označen kao „matični“) i nekih 4D humanizovanih varijanti (označenih sa VH4-6 i VK4-7). Sl.17G prikazuje poravnavanje varijabilnih domena teškog (VH) i lakog (VK) lanca za klon 53.0 (označen kao „matični“) i nekih 4D humanizovanih varijanti (označenih sa VH7-10 i VK10-13). Donja sekvenca u svakom poravnavanju na sl. 17A-G predstavlja najpribližniju sekvencu humane germinativne linije. Crni pravougaonici označavaju CDR domene, osenčeni ostaci se razlikuju po sekvenci od odgovarajućeg ostatka germinativne linije (sl.17A-E) ili odgovarajućeg matičnog ostatka (sl.17F-G), pri čemu je korišćena IMGT numeracija i ograničenje CDR. Sl.17H prikazuje poravnavanje varijabilnih domena teškog (VH) i lakog (VK) lanca za klonove 4.0, 12.0, 82.0 i 135, kao i klonove antitela 5H7 i 7H5. Crni pravougaonici označavaju CDR domene, osenčeni ostaci se razlikuju po sekvenci od prethodne sekvence u poravnavanju, korišćena je IMGT numeracija

Sl. 18 prikazuje granice minimalnih ostataka epitopa za klonove antitela 4, 12, 53, 82 i 135. Ostaci važni za vezujuću aktivnost označeni su sa X.

Sl. 19 je histogramska zavisnost koja prikazuje antitelo vezano u humanim CXCR3 transficiranim ćelijama 300.19 za himerne klonove 4, 12, 53, 82 i 135, kao i humanizovane varijante Hu1, Hu2, Hu3. Antitelo je primenjeno u koncentraciji od 5 µg/ml (crna linija), 0,5 µg/ml (tamnosiva linija), ili 0,1 µg/ml (crna isprekidana linija) ili 5 µg/ml samo sekundarnog antitela (puni sivi histogram), i podaci su predstavljeni kao broj ćelija (horizontalna osa) u odnosu na procenat maksimalne fluorescencije. Sl. 20A-C prikazuje procenat inhibicije migracije (vertikalna osa) humanih CXCR3-transficiranih ćelija do CXCL9 (sl.20A), CXCL10 (sl.20B), i CXCL11 (sl. 20C) u prisustvu ili odsustvu 10 µg/ml himernog (him) ili humanizovanog (Hu1, Hu2 ili Hu3) antitela varijanti klonova 4, 12, 53, 82 i 135, ili komercijalnog klona 1C6.

Sl. 21 je zavisnost koja pokazuje sposobnost himernog (him) i humanizovanog (Hu1, Hu2 ili Hu3) antitela varijanti klonova 4, 12, 53, 82 i 135, ili komercijalnog klona 1C6, da inhibira mobilizaciju kalcijuma u humanim CXCR3-Gqi4qi4 transficiranim CHO ćelijama. Koncentracija antitela (horizontalna osa) je predstavljena u odnosu na procenat maksimalne inhibicije (vertikalna osa).

Sl. 22A-D prikazuje efekte lečenja anti-CXCR3 antitelom na procenat CD3+/CD4+ T ćelija (sl.22A), CD3+/CD8+ T ćelija (sl. 22B), CXCR3+/CD3+/CD4+ T ćelija (sl.

22C) i CXCR3+/CD3+/CD8+ T ćelija (sl.22D) kod NOD-scid IL2rγ<nula>(NSG) miševa. HulgG1 prikazuje humani lgG1 (Herceptin), klonovi 4, 12, 53, 82 i 135 odnose se na klonove himernog antitela.

Sl. 23A predstavlja aminokiselinske sekvence za klonove teškog i lakog lanca 12.0. Sl. 23B predstavlja aminokiselinske sekvence za klonove teškog i lakog lanca 12.1. Sl. 23C predstavlja aminokiselinske sekvence za klonove teškog i lakog lanca 12.2. Sl. 23D predstavlja aminokiselinske sekvence za klonove teškog i lakog lanca 12.3. Sl. 24A predstavlja aminokiselinske sekvence za klonove teškog i lakog lanca 135.0. Sl. 24B predstavlja aminokiselinske sekvence za klonove teškog i lakog lanca 135.1. Sl. 24C predstavlja aminokiselinske sekvence za klonove teškog i lakog lanca 135.2. Sl. 24D predstavlja aminokiselinske sekvence za klonove teškog i lakog lanca 135.3. Sl. 25A predstavlja aminokiselinske sekvence za klonove teškog i lakog lanca 4.0. Sl.

25B predstavlja aminokiselinske sekvence za klonove teškog i lakog lanca 4.1. Sl. 25C predstavlja aminokiselinske sekvence za klonove teškog i lakog lanca 4.2. Sl. 25D predstavlja aminokiselinske sekvence za klonove teškog i lakog lanca 4.3. Sl. 25E predstavlja aminokiselinske sekvence za klon teškog lanca 4.4. Sl.25F predstavlja aminokiselinske sekvence za klon teškog lanca 4.5. Sl.25G predstavlja aminokiselinske sekvence za klon teškog lanca 4.6. Sl.25H predstavlja aminokiselinske sekvence za klon teškog lanca 4.7. Sl.25I predstavlja aminokiselinske sekvence za klon teškog lanca 4.8. Sl.25J predstavlja aminokiselinske sekvence za klon teškog lanca 4.9. Sl.25K predstavlja aminokiselinske sekvence za klon teškog lanca 4.10. Sl.25L predstavlja aminokiselinske sekvence za klon teškog lanca 4.11. Sl.25M predstavlja aminokiselinske sekvence za klon lakog lanca 4.4. Sl.25N predstavlja aminokiselinske sekvence za klon lakog lanca 4.5. Sl.25O predstavlja aminokiselinske sekvence za klon lakog lanca 4.6. Sl.25P predstavlja aminokiselinske sekvence za klon lakog lanca 4.7.

Sl. 26A predstavlja aminokiselinske sekvence za klonove teškog i lakog lanca 53.0. Sl. 26B predstavlja aminokiselinske sekvence za klonove teškog i lakog lanca 53.1. Sl. 26C predstavlja aminokiselinske sekvence za klonove teškog i lakog lanca 53.2. Sl. 26D predstavlja aminokiselinske sekvence za klonove teškog i lakog lanca 53.3. Sl. 26E predstavlja aminokiselinske sekvence za klon teškog lanca 53.4. Sl.26F predstavlja aminokiselinske sekvence za klon teškog lanca 53.5. Sl.26G predstavlja aminokiselinske sekvence za klon teškog lanca 53.6. Sl.26H predstavlja aminokiselinske sekvence za klon lakog lanca 53.4. Sl.26I predstavlja aminokiselinske sekvence za klon lakog lanca 53.5. Sl.26J predstavlja aminokiselinske sekvence za klon lakog lanca 53.6. Sl.26K predstavlja aminokiselinske sekvence za klon lakog lanca 53.7. Sl.26L predstavlja aminokiselinske sekvence za klon lakog lanca 53.8. Sl.26M predstavlja aminokiselinske sekvence za klon lakog lanca 53.9. Sl.26N predstavlja aminokiselinske sekvence za klon teškog lanca 53.7. Sl.26O predstavlja aminokiselinske sekvence za klon teškog lanca 53.8. Sl.26P predstavlja aminokiselinske sekvence za klon teškog lanca 53.9. Sl.26Q predstavlja aminokiselinske sekvence za klon teškog lanca 53.10. Sl.26R predstavlja aminokiselinske sekvence za klon lakog lanca 53.10. Sl.26S predstavlja aminokiselinske sekvence za klon lakog lanca 53.11. Sl.26T predstavlja aminokiselinske sekvence za klon lakog lanca 53.12. Sl.26U predstavlja aminokiselinske sekvence za klon lakog lanca 53.13.

Sl. 27A predstavlja aminokiselinske sekvence za klonove teškog i lakog lanca 82.0. Sl. 27B predstavlja aminokiselinske sekvence za klonove teškog i lakog lanca 82.1. Sl. 27C predstavlja aminokiselinske sekvence za klonove teškog i lakog lanca 82.2. Sl. 27D predstavlja aminokiselinske sekvence za klonove teškog i lakog lanca 82.3. Sl. 28A-P prikazuje sekvence nukleinskih kiselina za klonove teškog lanca 12.0-12.3 i klonove lakog lanca 12.0-12.3, klonove teškog lanca 135.0-135.3 i klonove lakog lanca 135.0-135.3, klonove teškog lanca 4.0-4.11 i klonove lakog lanca 4.0-4.7, klonove teškog lanca 53.0-53.6 i klonove lakog lanca 53.0-53.9, i klonove teškog lanca 82.0-82.3 i klonove lakog lanca 82.0-82.3.

PRIMERI OTELOTVORENJA

[0025] Sada će biti data detaljna objašnjenja pojedinih primera otelotvorenja prema predmetnom pronalasku, gde su neki primeri ilustrovani na priloženim slikama.

CXCR3

[0026] CXCR3 (MIM: 300574, ID humanog gena: 2833, receptor hemokina (C-X-C motiv) 3; poznat i kao CD182, CD183, CKR-L2, CMKAR3, GPR9, IP10-R, Mig-R, MigR, G receptor povezan sa proteinom 9, IP-10 receptor, IP10 receptor, Mig receptor, receptor hemokina (C-X-C) 3, interferonom-inducibilni protein 10 receptor) je receptor hemokina koji se uglavnom ne nalazi u naivnim T ćelijama, ali se njegova koncentracija povećava nakon aktivacije antigenom, i regrutuje te ćelije na mestima inflamacije tkiva kao odgovor na primarne ligande: CXCL9 (ID humanog gena: 4283), CXCL10 (ID humanog gena: 3627) i CXCL11 (ID humanog gena: 6373). β ćelije u Langerhansovim ostrvcima eksprimiraju CXCL9 i CXCL10 (Frigerio et al., Nature Medicine 8:1414-1420 (2002) i T ćelije infiltrirane u pankreas eksprimiraju CXCR3 (Christen et al, The Journal of Immunology, 2003, 171: 6838-6845; Van Halteren et al., Diabetologia 48:75-82 (2005); Uno et al 2010; Roep et al., Clinical and Experimental Immunology, 2003, 159: 338-343; Tanaka et al., Diabetes 58: 2285-2291 (2009); Sarkar et al., Diabetes. februar 2012;61(2):436-46).

[0027] CXCR3 se eksprimira u raznim organizmima, uključujući, na primer, čoveka, miša, pacova, kravu, šimpanzu, makakija, psa, žabu, kljunara, svinju i zebricu. U Tabeli 1 navedene su reference Nacionalnog centra SAD za biotehnološke informacije (U.S. National Center for Biotechnology Information, NCBI) i referentne sekvence proteina za CXCR3 raznih organizama. ID BR. SEKV.: 1 je kompletna humana CXCR3 sekvenca (splajsovana varijanta A). Peptidna sekvenca splajsovane varijante B data je pomoću referentne sekvence NP_001136269.1. Predviđeni ekstracelularni domeni humanog CXCR3 splajsovana varijanta A opisani su u Colvin et al., Mol. Cell. Bio., 26: 5838-49 (2006), i uključuju ostatke 1-58, 1-16, 111-126, 190-223, 278-301 ID BR. SEKV.: 1, kao što je dole prikazano.

ID BR. SEKV.: 1 NP_001495 humani CXCR3, izooblik A

1 mvlevsdhqv Indaevaall enfsssydyg enesdsccts ppcpqdfsln fdraflpaly

61 sllfllgllg ngavaavlls rrtalsstdt fllhlavadt llvltlplwa vdaavqwvfg

121 sglckvagal fninfyagal llacisfdry lnivhatqly rrgpparvtl tclavwglcl

181 lfalpdfifl sahhderlna thcqynfpqv grtalrvlql vagfllpllv maycyahila

241 vllvsrgqrr lramrlvvvv vvafalcwtp yhlvvlvdil mdlgalarnc gresrvdvak

301 svtsglgymh cclnpllyaf vgvkfrermw mlllrlgcpn qrglqrqpss srrdsswset

361 seasysgl

Tabela 1

[0028] CXCR3 i CXCL10 se eksprimiraju u humanim pacijentima sa T1D. Uno et al., Endocrine J.57: 991-996 (2010); Roep et al., Clin. and Exp. Immun.159: 338-343 (2009); Tanaka et al., Diabetes 58: 2285-2291 (2009). Kod ovih pacijenata, CXCL10 se eksprimira u preostalim beta ćelijama koje proizvode insulin, u ostrvcima. CXCR3 se eksprimira u ubačenim T ćelijama oko ostrvaca. Slični šabloni ekspresije reprodukovani su u negojaznim dijabetičnim (NOD) miševima, što je mišji model za dijabetes. Morimoto et al., J. Immun. 173: 7017-7024 (2004); Li et al., World J Gastroenterol.11(30): 4750-4752 (2005); Sarkar et al. Diabetes. februar 2012;61(2):436-46).

[0029] CXCR3 se takođe eksprimira u T ćelijama prisutnim u određenim tipovima zapaljenog tkiva, a proizvodnju CXCL9, CXCL10 i CXCL11 često obavljaju lokalne ćelije u inflamatornim lezijama. Prema tome, u nekim otelotvorenjima, objavljene su terapije za prekid CXCR3 da bi se lečio T1D.

Antitela

[0030] Termin „antitelo“, kao što se ovde koristi, odnosi se na svaki polipeptid koji sadrži antigen-vezujuće mesto, bez obzira na izvor, vrstu porekla, metod proizvodnje i/ili karakteristike, i obuhvata imunoglobuline, ili njihove antigen-vezujuće delove ili fragmente. Kao neograničavajući primer, termin „antitelo“ uključuje antitela čoveka, orangutana, miša, pacova, koze, ovce i kokoške. Termin uključuje, ali se ne ograničava na poliklonska, monoklonska, monospecifična, polispecifična, nespecifična, humanizovana, kompletno humana, kamelizovana, jednolančana, himerna, sintetička, rekombinantna, hibridna, mutirana, povratno mutirana i CDR-graftovana antitela. U svrhu predmetnog pronalaska, on takođe uključuje, ako nije drugačije rečeno, fragmente antitela, kao što su Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, VHH (takođe se pominju kao nanotela), i druge fragmente antitela koji zadržavaju antigen-vezujuću funkciju, uključujući bispecifična ili multispecifična antitela. Termin „antitelo“ se takođe odnosi na antigen-vezujuće molekule koji se ne zasnivaju na imunoglobulinima. Na primer, neimunoglobulinski skeleti poznati u struci uključuju male modularne imunofarmaceutike (vidi, npr., Američku patentnu prijavu publikacije br.

20080181892 i 20080227958, objavljene 31. jula 2008. odnosno 18. septembra 2008), tetranektine, domene fibronektina (npr., AdNectins, vidi Američku patentnu prijavu publikaciju br.2007/0082365, objavljenu 12. aprila 2007), protein A, lipokaline (vidi, npr., Američki patent br.7,118,915), ankirinska ponavljanja i tioredoksin.

[0031] Termin „antigen-vezujući domen“ odnosi se na deo molekula antitela koji sadrži oblast koja se specifično vezuje za deo antigena ili ceo antigen, ili je sa njim komplementarna. Kada je antigen veliki, antitelo može da se veže samo za konkretni deo antigena. U nekim otelotvorenjima, CXCR3 antitelo ili antigen-vezujući fragment sadrži najmanje jedan antigen-vezujući domen. U nekim otelotvorenjima, antitelo ili fragment su multispecifični, i sadrže dva ili više (npr.2, 3, 4, 5, ili više) antigen-vezujućih domena, takvih da su antitelo ili fragment sposobni da vežu dva ili više molekula CXCR3 na istom ili različitim epitopima, ili sposobni da se vežu za CXCR3 i najmanje jedan drugi antigen sa velikim afinitetom. Antigen-vezujući deo antitela može da sadrži jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost da se specifično vežu za antigen. Ti fragmenti mogu sadržati varijabilni region teškog i/ili lakog lanca matičnog antitela, ili varijante matičnog antitela.

[0032] „Epitop“ ili „antigenska determinanta“ je deo molekula antigena odgovoran za specifične interakcije sa antigen-vezujućim domenom antitela. Antigen-vezujući domen može da bude obezbeđen od strane jednog ili više varijabilnih domena antitela. Antigen-vezujući domen može da sadrži najmanje jedan varijabilni region lakog lanca antitela (VL), i najmanje jedan varijabilni region teškog lanca antitela (VH). Antigen-vezujući domen može da sadrži i samo VH ili samo VL regione. Na primer, antitela kamila i lama (Camelidae, camelidi) uključuju jednu jedinstvenu vrstu antitela, koju čine samo teški lanci, i koja nemaju lake lance. Antigen-vezujuće mesto takvog antitela je jedan jedini domen, označen kao VHH. Ona se nazivaju „kamelizovana antitela“ ili „nanotela“. Vidi, npr., Američke patente br.5,800,988 i 6,005,079 i Internacionalne prijave publikacije br. WO 94/04678 i WO 94/25591.

[0033] Ovde objavljena anti-CXCR3 antitela mogu se generisati bilo kojim pogodnim metodom poznatim u struci. Na primer, antitela mogu da sadrže poliklonska antitela ili monoklonska antitela. Metode za pripremu poliklonskih antitela poznate su obučenim stručnjacima (Harlow et al., Antibodies: a Laboratory Manual (Antitela: laboratorijski priručnik), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. izd. (1988)). Imunogeni koji sadrže polipeptide CXCR3, njihove fragmente (npr., jedan ili više ekstracelularnih domena, ili N-terminalne 58 aminokiseline, ili N-terminalne 37 aminokiseline, ili N-terminalne 20 aminokiseline, ili N-terminalne 16 aminokiseline, itd.), fuzione proteine ili njihove varijante mogu se koristiti za generisanje anti-CXCR3 antitela.

[0034] Imunogen može da proizvede ćelija koja proizvodi ili prekomerno proizvodi CXCR3, što može biti prirodna ćelija, prirodna mutirana ćelija ili genetski konstruisana ćelija. U zavisnosti od prirode polipeptida (npr. procenta hidrofobnosti, procenta hidrofilnosti, stabilnosti, naelektrisanja, izoelektrične tačke, itd.), imunogen može biti modifikovan ili konjugovan da se izmeni njegova imunogenost. Na primer, CXCR3 ili njegov deo mogu biti konjugovani za nosač. Konjugacija može da uključi ili hemijsku konjugaciju derivatizacijom sa aktivnim hemijskim funkcionalnim grupama, ili metodama na bazi fuzionog proteina, ili drugim metodama poznatim obučenom stručnjaku. Primeri za nosače i/ili druge proteine koji menjaju imunogenost uključuju, ali se ne ograničavaju na, KLH, ovalbumin, albumin iz seruma, goveđi tiroglobulin, sojin tripsin inhibitor i peptide slobodnih T pomoćnih ćelija.

[0035] Mogu da se koriste i različiti adjuvansi sa CXCR3 imunogenom, radi povećanja imunološkog odgovora. Primeri za adjuvanse uključuju, ali se ne ograničavaju na, Frojndov adjuvans (kompletni i nekompletni), mineralna ulja, gelove, aluminijum hidroksid, površinski aktivne supstance kao što je lizolecitin, pluronske poliole, polianjone, peptide, uljane emulzije, hemocijanine školjke Megathura crenulata (KLH), dinitrofenol, i humane adjuvanse, kao što je BCG (bacil Kalmet-Gerena) i Corynebacterium parvum. Dodatni primeri za adjuvanse koji se mogu koristiti uključuju MPL-TDM adjuvans (monofosforil lipid A, sintetski trehaloza dikorinomikolat). Protokoli za imunizaciju su dobro poznati u struci, i mogu se izvesti bilo kojim metodom koji izaziva imunski odgovor u izabranoj životinji domaćinu. Tako, mogu da se koriste razni putevi primene u različitim vremenskim periodima kao izbor dizajna.

[0036] Na primer, imunogen, kao što je ovde pojednostavljeno prikazan, može se dati različitim životinjama domaćinima, uključujući, ali se ne ograničavajući na, zečeve, miševe, kamelide, pacove, itd., da bi se izazvala proizvodnja seruma koji sadrži poliklonska antitela specifična za CXCR3. Primena imunogena može uključivati jednu ili više injekcija imunizujućeg agensa i, opciono, adjuvans. U nekim otelotvorenjima, imunogen (sa adjuvansom ili bez njega) se injektuje u sisara putem višestrukih supkutanih ili intraperitonealnih injekcija, ili intramuskularno ili intravenski. U nekim otelotvorenjima, kada se dobije pogodan poliklonski preparat, konkretna antitela mogu biti izolovana poznatim separacionim tehnikama, kao što je afinitetna hromatografija, panovanje, apsorpcija, itd., tako da se dobije pojedinačna vrsta antitela. U nekim otelotvorenjima, pojedinačna vrsta antitela se podvrgava daljem ispitivanju, na primer, sekvenciranjem da se dobije aminokiselinska sekvenca jednog ili više CDR.

[0037] U nekim otelotvorenjima, CXCR3 antitela su monoklonska. Monoklonsko antitelo uključuje svako antitelo dobijeno od jednog eukariotskog, faga ili prokariotskog klona koji eksprimira antitelo. Monoklonska antitela se mogu dobiti, na primer, tradicionalnim hibridoma tehnikama (Kohler and Milstein, Nature 256: 495-499 (1975) i Američki pat. br.

4,376,110), metodama rekombinantne DNK (Američki patent br.4,816,567), ili tehnikama displeja faga pomoću biblioteka antitela (Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol.222: 581-597 (1991)). Razne druge tehnike za proizvodnju antitela vidite u Antibodies: A Laboratory Manual (Antitela: laboratorijski priručnik), izd. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Ostali primeri metoda koje se mogu koristiti za proizvodnju monoklonskih antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na, tehnike humanog hibridoma B ćelija (Kosbor et al., Immunology Today 4:72 (1983); i Cole et al., Proc Natl Acad Sci USA 80:2026 (1983)), i EBV-hibridoma tehniku (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (Monoklonska antitela i lečenje kancera), str.77-96, Alan R. Liss (1985)). Takva antitela mogu biti iz klase imunoglobulina, uključujući IgG, IgM, IgE, IgA i IgD, i bilo koje njihove potklase ili varijante. Hibridoma ćelije koje proizvode mAt iz pronalaska mogu se uzgajati in vitro ili in vivo.

[0038] U nekim otelotvorenjima, imunogen koji sadrži polipeptide CXCR3, njihove fragmente (npr., jedan ili više ekstracelularnih domena, ili N-terminalne 58 aminokiseline, ili N-terminalne 37 aminokiseline, ili N-terminalne 20 aminokiseline, ili N-terminalne 16 aminokiseline, itd.), fuzione proteine ili njihove varijante može se koristiti za imunizaciju životinje domaćina (npr. zečeva, miševa, kamelida, pacova, itd.) da generiše hibridome koje proizvode monoklonska antitela. Limfociti koji proizvode, ili su u stanju da proizvode antitela koja se specifično vezuju za CXCR3 mogu se sakupiti od imunizovanog domaćina i fuzionisati sa ćelijama mijeloma pomoću odgovarajućeg fuzionog agensa, kao što je polietilen glikol, tako da formiraju ćelije hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies:

Principles and Practice (Monoklonska antitela: principi i praksa), Academic Press, str.59-103 (1986)).

[0039] Višestruke hibridoma ćelije koje proizvode monoklonska antitela se mogu generisati, a one koje pokazuju korisne osobine ili moguć terapeutski potencijal, na primer, sprečavajući vezivanje CXCR3 liganda za njegov receptor, mogu biti odabrane. Odabrana antitela mogu se dalje modifikovati da se dobiju ili povećaju korisne osobine, kao što je povećana stabilnost in vivo. Na primer, pošto se identifikuju ćelije hibridoma koje proizvode antitela željene specifičnosti, afiniteta i/ili aktivnosti, klonovi mogu biti potklonirani postupcima razblaživanja, i uzgajeni standardnim metodama uzgajanja (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (Monoklonska antitela: principi i praksa), Academic Press, str.59-103 (1986)). Pogodni medijumi za uzgajanje uključuju, na primer, Dulbekov modifikovani Iglov medijum (D-MEM) ili RPMI-1640 medijum. Pored toga ćelije hibridoma mogu da se uzgajaju in vivo kao tumori u životinji. Potklonovi se mogu ispitati na specifičnost, afinitet i/ili aktivnost, i potklonovi koji ispoljavaju najkorisnije osobine mogu biti odabrani za dalju karakterizaciju.

[0040] U struci postoje raznovrsni alternativni metodi za proizvodnju monoklonskih antitela, i bilo koji od njih može da se koristi za proizvodnju ovde objavljenih anti-CXCR3 antitela. Na primer, monoklonska antitela se mogu dobiti metodama rekombinantne DNK, kao što su one opisane u Američkom pat. br.4,816,567.

[0041] DNK koja kodira monoklonska antitela može se izolovati i sekvencirati klasičnim postupcima (npr., pomoću oligonukleotidnih sondi koje mogu da se vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance mišjih antitela, ili lance humanih, humanizovanih ili drugih antitela) (Innis et al. PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications (PCR protokoli, vodič za metode i primene), Academic (1990), i Sanger et al., Proc Natl Acad Sci USA 74:5463 (1977)). Ćelije hibridoma mogu biti izvor takve DNK. Kada se izoluje, DNK se može ubaciti u ekspresione vektore, koji mogu da se transficiraju u ćelije domaćina, kao što su ćelije E. coli, NSO ćelije, COS ćelije, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), ili ćelije mijeloma koje inače ne proizvode protein imunoglobulina, da bi se dobila sinteza monoklonskih antitela u rekombinantnoj ćeliji domaćinu. DNK takođe može da se modifikuje, na primer, zamenom kodirajuće sekvence za konstantne domene humanog teškog i lakog lanca umesto homologih mišjih sekvenci (Američki pat. br.4,816,567; i Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA 81:6851 (1984)), ili kovalentnim vezivanjem za kodirajuću sekvencu imunoglobulina, cele kodirajuće sekvence iz neimunoglobulinskog polipeptida ili njenog dela. U nekim otelotvorenjima, neimunoglobulinski polipeptid može biti supstituisan konstantnim domenima antitela, ili može biti supstituisan varijabilnim domenima jednog CXCR3-kombinujućeg mesta antitela, dajući himerno dvovalentno antitelo.

[0042] U nekim otelotvorenjima, ovde opisana antitela mogu biti modifikovana tako da generišu CDR graftovanih i/ili na drugi način humanizovanih antitela. CDR graftovanje je oblik humanizacije, ali se mogu koristiti i druge tehnike za humanizovanje poznate u struci. Postupci CDR graftovanja su poznati obučenom stručnjaku, i mogu se zasnivati na CDR numeraciji, uključujući IMGT (međunarodni imunogenetski informacioni sistem (ImMunoGeneTics information system®), Montpellier, Francuska), Kabatov, Čotijin i modifikovan Čotijin sistem numeracije. Vidite, npr., imgt.org (rezimira primenu kontinualnog IMGT sistema numeracije, koji uzima u obzir i kombinuje definiciju okvirnog regiona i regiona koji određuju komplementarnost, strukturne podatke difrakcionih studija pomoću rendgenskih zraka, i karakterizaciju hipervarijabilnih petlji, obezbeđujući jedinstvenu numeraciju za sve IG i TR V-regione svih vrsta); Abhinandan i Martin, Mol Immunol., 45:3832-9 (2008); videti takođe Abhinandan i Martin, J. Mol. Biol., 369(3):852-62 (2007) (opis metoda za određivanje „humanosti“ himernog antitela); Retter et al., Nucleic Acids Res.

33(Database issue):D671-4 (2005) (opisuje VBASE2 bazu podataka gena varijabilnih domena); i Johnson i Wu, Int. Immunol. 10(12):1801-5 (1998) (opisuje raspodelu dužina CDRH3).

[0043] Na primer, kada se koristi IMGT sistem numeracije, konzervirane aminokiseline uvek imaju isti položaj. Hidrofobne aminokiseline regiona okvira su takođe numerisane u konzerviranim položajima, omogućavajući da se aminokiseline okvira (i kodona) koje se nalaze na istim položajima u različitim sekvencama porede bez potrebe za poravnavanjem sekvenci. U drugom primeru, Kabatov sistem numeracije je kako sledi, CDR-HI počinje otprilike oko aminokiseline 31 (tj., oko 9 ostataka posle prvog ostatka cisteina), uključuje oko 5-7 aminokiselina, i završava se na sledećem ostatku tirozina. CDR-H2 počinje na petnaestom ostatku posle kraja CDR-HI, uključuje oko 16-19 aminokiselina, i završava se na sledećem ostatku arginina ili lizina. CDR-H3 počinje otprilike na trideset trećem aminokiselinskom ostatku posle kraja CDR-H2; uključuje 3-25 aminokiselina, i završava se na sekvenci W-G-X-G, gde je X bilo koja aminokiselina. CDR-LI počinje otprilike na 24. ostatku (tj., posle ostatka cisteina); uključuje oko 10-17 ostataka; i završava se na sledećem ostatku tirozina. CDR-L2 počinje otprilike na šesnaestom ostatku posle kraja CDR-LI i uključuje oko 7 ostataka. CDR-L3 počinje otprilike na trideset trećem ostatku posle kraja CDR-L2, uključuje oko 7-11 ostataka, i završava se na sekvenci F-G-X-G, gde je X bilo koja aminokiselina. Antitela koja sadrže najmanje jedan od ovih CDR mogu se upotrebiti u metodama iz predmetnog pronalaska.

[0044] CDR-graftovana antitela mogu da sadrže sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca humanog antitela, naznačeno time što je jedan ili više CDR regiona VH i/ili VL zamenjen CDR sekvencama donorskih antitela, npr., iz mišjih antitela opisanih u nastavku koja vezuju CXCR3. Sekvence okvira iz bilo kog humanog antitela mogu da budu šablon za CDR graftovanje. Međutim, zamena ravnog CDR lanca u takav okvir može dovesti do izvesnog gubitka afiniteta vezivanja za antigen. Što je humano antitelo više homologo u odnosu na originalno, npr. mišje antitelo, manja je verovatnoća da će se kombinovanjem donorskih CDR sa humanim okvirom uneti deformacije u CDR koje mogu da smanje afinitet. Zato u nekim otelotvorenjima CDR-graftovana CXCR3 antitela iz predmetnog pronalaska uključuju humani varijabilni okvir koji ima najmanje 65% identičnosti sekvence sa okvirom varijabilnog regiona donorskog mišjeg CXCR3 neutrališućeg antitela. Metode za proizvodnju takvih antitela su poznate u struci (videti EP 239,400; PCT publikaciju br. WO 91/09967; i Američke patente br.5,225,539; 5,530,101; i 5,585,089), i uključuju oblaganje (veneering) ili preuređivanje površine (resurfacing) (EP 592,106; EP 519,596; Padlan (1991) Mol. Immunol.

28(4/5): 489-498; Studnicka et al. (1994) Prot. Engineer.7(6): 805-814; i Roguska et al. (1994) Proc. Acad. Sci. USA 91: 969-973), mešanje lanaca (Američki patent br.5,565,352), i antiidiotipska antitela.

[0045] U nekim otelotvorenjima, ovde opisana antitela mogu biti humanizovana. „Humanizovana antitela“ su molekuli antitela koji vezuju željeni antigen, imaju jedan ili više CDR od ne-humanih vrsta, i imaju regione okvira i/ili konstantne domene iz molekula humanog imunoglobulina. Poznate sekvence humanog Ig su objavljene, npr., u www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez- /query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; i Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983). Uvezene humane sekvence se mogu koristiti za smanjenje imunogenosti ili za smanjenje, povećanje ili modifikovanje vezivanja, afiniteta, brzine reakcije, brzine povratne reakcije, aviditeta, specifičnosti, poluživota, ili bilo koje druge pogodne karakteristike, kao što je poznato u struci. Antitela mogu biti humanizovana pomoću raznovrsnih tehnika poznatih u struci, kao što je, ali se ne ograničavajući na, one koje su opisali Jones et al. (1986) Nature 321: 522; Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534; Sims et al. (1993) J. Immunol.151: 2296; Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol.196: 901; Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285; Presta et al. (1993) J. Immunol. 151: 2623; Američki patent br.

5,589,205; 565,332; 6,180,370; 6,632,927; 7,241,877; 7,244,615; 7,244,832; 7,262,0505; i Američki patent publikacija br.2004/0236078 (podneta 30. aprila 2004.).

[0046] U nekim otelotvorenjima, ostaci okvira u humanizovanim ili CDR-graftovanim antitelima mogu biti zamenjeni odgovarajućim ostacima iz CDR donorskog antitela, npr. zamenjeni ostacima okvira iz anti-mišjeg CXCR3 neutrališućeg antitela, tako da se izmeni, npr., poboljša, vezivanje antigena. Vidite Queen et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86:10029-33 (decembar 1989.). Ove supstitucije okvirnih regiona identifikuju se metodama dobro poznatim u struci, npr. modelovanjem interakcija CDR i ostataka okvirnih regiona kako bi se identifikovali ostaci okvira važni za vezivanje antigena i poređenje sekvenci, da bi se identifikovali neuobičajeni ostaci okvira na određenim mestima. Vidite, npr., Američki patent br. 5,585,089; i Riechmann et al. (1988) Nature 332:323. Trodimenzionalni modeli imunoglobulina su obično dostupni, i poznati su stručnjacima. Dostupni su kompjuterski programi koji ilustruju i prikazuju verovatne trodimenzionalne konformacione strukture izabranih kandidata sekvenci imunoglobulina. Pregledom ovih prikaza omogućena je analiza verovatne uloge ostataka u funkcionisanju kandidata sekvenci imunoglobulina, tj. analiza ostataka koji utiču na sposobnost kandidata imunoglobulina da vežu svoj antigen. Na taj način, ostaci okvira se mogu izabrati i kombinovati iz konsenzusa, i mogu se uvesti sekvence tako da se postignu željene karakteristike antitela, kao što je povećan afinitet prema CXCR3.

[0047] Antitela mogu biti humanizovana ili CDR-graftovana, i ostaci okvira CDR-donora koji su korisni za poboljšanje vezivanja antigena se mogu identifikovati, pomoću raznovrsnih tehnika poznatih u struci, kao što su, bez ograničenja, one opisane u Jones et al. (1986) Nature 321: 522; Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534; Sims et al. (1993) J. Immunol.

151: 2296; Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol.196: 901; Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285; Presta et al. (1993) J. Immunol.151: 2623; i Američki patent br.

5,565,332; 5,723,323; 5,976,862; 5,824,514; 5,817,483; 5,814,476; 5,763,192; 5,723,323; 5,766,886; 5,714,352; 6,204,023; 6,180,370; 5,693,762; 5,530,101; 5,585,089; 5,225,539; i 4,816,567. U nekim otelotvorenjima, koristi se 4D humanizacija za pripremu varijanti antitela iz predmetnog pronalaska (npr. za pripremu 4D humanizovanih varijanti klona 4, koji sadrži bilo koji od teških lanaca 4.4-4.6, i bilo koji od lakih lanaca 4.4-4.7). Vidite WO 2009/032661, npr., odeljke [0037]-[0044], za metode koje se koriste u 4D humanizaciji. Ukratko, 4D humanizacija može da uključi: a) izgradnju 3-D modela varijabilnog domena koga treba humanizovati; b) identifikaciju fleksibilnih ostataka u varijabilnom domenu pomoću simulacije molekulske dinamike 3-D modela domena; c) identifikovanje najpribližnije humane germinativne linije poređenjem trajektorije molekulske dinamike 3-D modela sa trajektorijama molekulske dinamike 49 humanih germinativnih linija; i d) mutiranje fleksibilnih ostataka, koji nisu deo CDR, u njihove duplikate humane germinativne linije (kako je identifikovano u koraku c).

[0048] U nekim ovde objavljenim primerima, CDR graftovana i/ili na drugi način humanizovana antitela mogu da sadrže CDR graftovane i/ili humanizovane varijante klonova 4, 12, 53, 82 i 135. Na primer, odgovarajući regioni teškog i lakog lanca iz bilo kog od klonova 4, 12, 53, 82 i 135 (npr., teški lanac klona 4 i laki lanac klona 4) mogu se spojiti sa humanim konstantnim domenima, dajući himerna antitela. Himerna antitela se dalje mogu humanizovati izmenom jednog ili više okvira ili CDR aminokiselina u odgovarajući humani ostatak. Slično tome, u nekim primerima šest CDR regiona teškog i lakog lanca iz bilo kog od klonova 4, 12, 53, 82 i 135 (npr., CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca klona 4, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca klona 4) ili bilo koje varijante klonova 4, 12, 53, 82 i 135, mogu biti potklonirani u humani okvir i/ili konstantne domene, i formirati humanizovana antitela. Humanizacija može da uključi humane varijabilne domene, isključujući aminokiseline CDR i/ili bilo koje ostatke na Vernijeovom položaju. Humanizovana antitela mogu takođe da uključe dalje izmene povratnih mutacija na ostacima pozicioniranim u četiri aminokiseline CDR i/ili u položajima koji su identifikovani kao „vrlo različiti“ između sekvence originalnog antitela i humanih sekvenci, npr. primenom modelovanja na bazi IMGT. Dalje mutacije u regionima okvira ili CDR mogu se uvesti da povećaju stabilnost ili terapeutsku efikasnost antitela, na primer, uvođenjem mutacija da se ukloni mesto deamidacije u položajima 58 i 59 (IMGT numeracija) CDR2 VH klona 4.

[0049] Na primer, ovde objavljena antitela, himerna antitela i humanizovana antitela mogu da sadrže šest CDR i/ili varijabilne domene teškog i lakog lanca iz bilo kog od klonova 4, 12, 53, 82 i 135 i njihovih himernih ili humanizovanih varijanti. Na primer, antitelo ili fragment sposoban da veže CXCR3 može da sadrži tri CDR iz bilo kog od teških lanaca 4.0-4.11, teških lanaca 12.0-12.3, teških lanaca 53.0-53.10, teških lanaca 82.0-82.3, i teških lanaca 135.0-135.3. Slično tome, antitelo ili fragment može da sadrži tri CDR iz bilo kog od lakih lanaca 4.0-4.7, lakih lanaca 12.0-12.3, lakih lanaca 53.0-53.13, lakih lanaca 82.0-82.3, i lakih lanaca 135.0-135.3. U nekim slučajevima, CDR teškog i lakog lanca su od istog klona, ali mogu biti od različitih varijanti tog klona (npr. tri CDR teškog lanca 4.1 upareni sa tri CDR lakog lanca 4.2). Teški i laki lanci 4.0, 12.0, 82.0 i 135.0 odnose se na varijabilne domene klonova mišjeg antitela i himernih antitela (gde antitela sadrže varijabilne domene miša i humane regione okvira). Preostali teški i laki lanci odnose se na humanizovane lance, kako je prikazano u Tabeli 11.

[0050] Antitelo ili fragment sposoban da veže CXCR3 može da sadrži bilo koji od teških lanaca 4.0-4.11, teških lanaca 12.0-12.3, teških lanaca 53.0-53.10, teških lanaca 82.0-82.3, i teških lanaca 135.0-135.3. Slično tome, antitelo ili fragment može da sadrži bilo koji od lakih lanaca 4.0-4.7, lakih lanaca 12.0-12.3, lakih lanaca 53.0-53.13, lakih lanaca 82.0-82.3, i lakih lanaca 135.0-135.3.

[0051] Teški i laki lanci mogu biti izabrani tako da tri CDR iz teškog lanca konkretnog klona (npr., CDR iz teškog lanca klona 4) budu sparena sa tri CDR iz bilo kog od lakih lanaca tog klona (npr., CDR iz lakog lanca klona 4). Teški i laki lanci mogu biti izabrani tako da teški lanac određenog klona (npr. teški lanac klona 4) bude uparen sa bilo kojim lakim lancem tog klona (npr. laki lanac klona 4).

[0052] Tri CDR iz jednog od varijabilnih domena teškog lanca 4.0-4.11 mogu da se spare sa tri CDR iz bilo kog varijabilnog domena lakog lanca 4.0-4.7; tri CDR iz bilo kog varijabilnog domena teškog lanca 12.0-12.3 mogu da se spare sa tri CDR iz bilo kog varijabilnog domena lakog lanca 12.0-12.3; tri CDR iz bilo kog varijabilnog domena teškog lanca 53.0-53.10 mogu da se spare sa tri CDR iz bilo kog varijabilnog domena lakog lanca 53.0-53.13; tri CDR iz bilo kog varijabilnog domena teškog lanca 82.0-82.3 mogu da se spare sa tri CDR iz bilo kog varijabilnog domena lakog lanca 82.0-82.3; ili tri CDR iz bilo kog varijabilnog domena teškog lanca 135.0-135.3 mogu da se spare sa tri CDR iz bilo kog varijabilnog domena lakog lanca 135.0-135.3.

[0053] Svaki varijabilni domen teškog lanca 4.0-4.11 može da se spari sa svakim varijabilnim domenom lakog lanca 4.0-4.7; svaki varijabilni domen teškog lanca 12.0-12.3 može da se spari sa svakim varijabilnim domenom lakog lanca 12.0-12.3; svaki varijabilni domen teškog lanca 53.0-53.10 može da se spari sa svakim varijabilnim domenom lakog lanca 53.0-53.13; svaki varijabilni domen teškog lanca 82.0-82.3 može da se spari sa svakim varijabilnim domenom lakog lanca 82.0-82.3; ili svaki varijabilni domen teškog lanca 135.0-135.3 može da se spari sa svakim varijabilnim domenom lakog lanca 135.0-135.3.

[0054] Poravnavanje nekih varijabilnih domena teškog i lakog lanca prikazano je na sl.17. Antitelo kako je ovde objavljeno može da sadrži sparene varijabilne domene teškog i lakog lanca, kao što je prikazano u Tabeli 2 (Ch = himerno, Hu = humanizovano, VH = teški lanac, VK = laki lanac). Na primer, prvi unos u Tabeli 2 odnosi se na varijantu klona 4 koja sadrži teški lanac 4.0 i laki lanac 4.0. Drugi unos u Tabeli 2 odnosi se na varijantu klona 4 koja sadrži teški lanac 4.1 i laki lanac 4.1. Svakom antitelu koje sadrži naznačenu sekvencu teškog lanca i lakog lanca takođe je dodeljen identifikator antitela u drugoj koloni Tabele 2. Na primer, prvom unosu u tabeli (koji sadrži teški lanac 4.0 i laki lanac 4.0) dodeljen je identifikator antitela 4Ch, dok je drugom antitelu u tabeli (koje sadrži teški lanac 4.1 i laki lanac 4.1) dodeljen identifikator antitela 4Hu1.

Tabela 2

[0055] Termin „specifična interakcija“, ili „specifično vezuje“, ili slično, znači da dva molekula formiraju kompleks koji je relativno stabilan pod fiziološkim uslovima. Specifično vezivanje se karakteriše velikim afinitetom i malim do umerenim kapacitetom. Nespecifično vezivanje obično ima mali afinitet sa umerenim do velikim kapacitetom. Tipično, vezivanje se smatra specifičnim kada je konstanta afiniteta Ka veća od 10<6>M<-1>, ili poželjno veća od 10<8>M<-1>U nekim otelotvorenjima, antitela, varijante i njihovi fragmenti vezuju svoje antigene uz konstante asocijacije koje su najmanje 10<6>, 10<7>, 10<8>, 10<9>M<-1>, ili više. U nekim otelotvorenjima, antitela, varijante i njihovi fragmenti vezuju CXCR3 najmanje sa kinetikom vezivanja prikazanom u bilo kojoj od Tabela 7A-B, 8-10, i/ili 12. Po potrebi, nespecifično vezivanje se može smanjiti bez značajnog uticaja na specifično vezivanje, variranjem uslova vezivanja. Takvi uslovi su poznati u struci, i vešt stručnjak pomoću rutinskih tehnika može da izabere odgovarajuće uslove. Uslovi su obično definisani koncentracijom antitela, jonskom jačinom rastvora, temperaturom, vremenom dopuštenim za vezivanje, koncentracijom blokirajućih molekula, kao što je albumin iz seruma i kazein iz mleka.

[0056] Ovde su objavljena anti-CXCR3 antitela koja u nekim otelotvorenjima neutrališu CXCR3. „CXCR3 neutrališuće antitelo“ se vezuje za CXCR3 i blokira aktivnost receptora, kao što je tipični fiziološki i genetski odgovor usled vezivanja CXCR3 liganada za CXCR3. Neutrališuća aktivnost može biti potpuna (100% neutralizacija) ili delimična, npr. oko 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 (ili bilo koji procenat između ovih) ili više neutrališuće, i zavisiće od različitih činilaca poznatih obučenom stručnjaku, kao što je koncentracija antitela, afinitet i epitop, kao i konkretan test za određivanje neutrališuće aktivnosti. Neutrališuća aktivnost CXCR3 neutrališućeg antitela može se prikazati testovima za merenje inhibicije, npr. vezivanja liganda, vezivanja GTP, mobilizacije kalcijuma, ćelijske hemotakse i/ili internalizacije receptora. Obučenom stručnjaku su poznati mnogi testovi za određivanje aktivnosti neutrališućih antitela, i CXCR3 konkretno neutrališućeg antitela, i oni se mogu lako prilagoditi da se odredi da li je konkretno antitelo neutrališuće.

[0057] Na primer, neutrališuća aktivnost antitela za primenu u metodama pronalaska može biti određena testom hemotakse, suštinski kao što je pokazano u prilogu iz pakovanja za antitelo koje je proizveo klon 49801, koje prodaje kompanija R&D Systems® (kat. br.

MAB160). Doza neutralizacije-50 (ND50) definisana je kao koncentracija antitela potrebna da se dobije polovina maksimalne inhibicije ćelijske površine CXCR3 posredovanog rhl-TAC odgovora u responsivnoj ćelijskoj liniji, pri specifičnoj koncentraciji rhl-TAC. Da bi se izmerila sposobnost antitela da blokira rhl-TAC indukovanu hemotaksu hCXCR3 transficiranih BaF/3 ćelija, dodat je rhl-TAC u koncentraciji od 7 ng/ml u donji odeljak komore za hemotaksu sa 96-bunarčića (NeuroProbe, Cabin John, MD). Komora za hemotaksu je onda sklopljena pomoću polikarbonatnog filtera bez PVP (veličina pora 5µ). Serijska razblaženja antitela (npr. od 0,001 do 10000 µg/ml) i 0,25 x 10<6>ćelija/bunarčiću je dodato u gornje bunarčiće komore. Nakon inkubacije u vlažnom inkubatoru tokom 3 sata na 37°C u 5% CO2, komora je rastavljena, i ćelije koje su migrirale u donju komoru prenete su na radnu ploču i kvantifikovane pomoću, na primer, fluorescencije resazurina.

[0058] Colvin et al., Mol. Cell. Bio., 26: 5838-49 (2006) opisuje dodatne testove koji mogu biti korišćeni, u pojedinim otelotvorenjima, da bi se utvrdila neutrališuća aktivnost neutrališućih CXCR3 antitela za primenu u pronalasku. Ukratko, ćelije 300-19, mišja pre-B-ćelija ćelijske linije leukemije koja funkcionalno eksprimira CXCR4 može biti korišćena. Nakon transfekcije, ova linija može funkcionalno da eksprimira druge receptore hemokina, npr. humani CXCR3 (videti, npr., paragrafe 201-209 Američka patentna prijava publikacija br. 2010/0061983). Ćelije 300-19 koje eksprimiraju humani CXCR3 mogu biti uzgajane u kompletnom RPMI medijumu koji sadrži 10% seruma goveđeg fetusa (FBS). Da bi se testiralo vezivanje CXCR3 liganada za CXCR3 u prisustvu potencijalno CXCR3 neutrališućih antitela, 400.000 CXCR3/300-19 ćelija je stavljeno na ploče za uzgajanje tkiva sa 96 bunarčića u ukupnoj zapremini od 150 µl pufera za vezivanje (0,5% BSA,5 mM MgCI2, 1 mM CaCI2, 50 mM HEPES, pH 7,4). Ukupno 0,04 nM<125>I-obeleženog CXCL10 (New England Nuclear, Boston, MA) ili CXCL11 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) i 5 x 10<6>nM do 500 nM neobeleženog CXCL10 ili CXCL11 (Peprotech, Rocky Hill, NJ) može biti dodato ćelijama i inkubirano 90 min na sobnoj temperaturi uz trešenje. Ćelije su prebačene na filter ploče sa 96-bunarčića (Millipore, Billerica, MA) koje su prethodno potopljene u 0,3% polietilenimin i isprane tri puta sa 200 µl vezujućeg pufera dopunjenog sa 0,5 M NaCl. Ploče su osušene, i radioaktivnost je izmerena nakon dodatka scintilacione tečnosti u Valak Mikrobeta scintilacionom brojaču (Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA). Vezivanje CXCL9 može biti ocenjeno analogno sa CXCL10 i 11.

[0059] Ovde prikazana antitela mogu sprečiti ili umanjiti fluks kalcijuma u ćelije koje eksprimiraju CXCR3. Fluks kalcijuma može biti detektovan u ćelijama kao što su ćelije CXCR3/300-19. Otprilike 5 x 10<6>ćelija je suspendovano u 2 ml RPMI medijuma sa 1% BSA. Dodato je petnaest mikrograma Fura-2 (Molecular Probes, Eugene, OR), i ćelije su inkubirane na 37°C tokom 20 min. Ćelije su dvaput isprane u PBS, i ponovo suspendovane u 2 ml pufera za fluks kalcijuma (145 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM NaHPO4, 1,8 mM CaCl2, 25 mM HEPES, 0,8 mM MgCl2, i 22 mM glukoza). Očitavanja fluorescencije su izvršena na 37°C na DeltaRAM fluorimetru (Photon Technology International, Lawrenceville, NJ). Pre i posle dodavanja hemokina (npr., CXCL9, 10, ili 11), zabeležene su intracelularne koncentracije kalcijuma kao intenzitet emitovane ekscitacije fluorescencije na 510 nm, kao odgovor na sekvencijalnu ekscitaciju na 340 nm i 380 nm, i predstavljene su kao relativni odnos fluorescencije na 340 nm u odnosu na onu na 380 nm.

[0060] Neutralizacija CXCR3 može biti procenjena merenjem smanjenja internalizacije receptora. Testovi internalizacije receptora mogu biti izvršeni inkubacijom oko 2,5 x 10<5>ćelija, kao što su ćelije CXCR3/300-19, u RPMI medijumu sa 1% BSA uz različite koncentracije CXCL10, CXCL11, ili CXCL9 tokom 30 min na 37°C. Ćelije zatim mogu biti isprane ledeno hladnim puferom za sortiranje ćelija aktiviranih fluorescencijom, i zatim analizirane na površinsku ekspresiju CXCR3 pomoću PE-konjugovanog CXCR3 antitela.

[0061] Dodatni testovi za procenu neutrališuće aktivnosti su objavljeni, na primer, u Primerima 2-4 Američkog patenta br.7,405,275.

[0062] Kao što je utvrđeno bilo kojim od prethodnih testova, CXCR3 neutrališuće antitelo može imati ND50od oko 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 40, 50, ili 100 µg/ml. Poželjno, ND50može biti 0,5-12 µg/ml, još poželjnije, 1-6 µg/ml.

[0063] Ovde prikazana izolovana CXCR3 antitela mogu uključivati ona koja vezuju specifične epitope CXCR3. Na primer, antitela za primenu u pronalasku mogu da vežu peptid koji sadrži celu sekvencu izabranu od ostataka 1-58, 1-16, ili 1-37 ID BR. SEKV.:1 ili njen deo (npr., fragment koji sadrži najmanje 5, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 18, ili 20 ostataka). Ovde objavljena antitela uključuju ona koja vezuju jedan ili više epitopa identifikovanih na sl.18. Anti-CXCR3 antitelo može da sadrži antitelo koje se vezuje za CXCR3 epitop koji sadrži SDHQVLNDAE. U nekim otelotvorenjima, epitop sadrži SDHQVLND, DHQVLND , i/ili VLNDAE. Epitop može da sadrži sekvencu VLND. Epitop može da sadrži XDXXVXNDXX, pri čemu X označava bilo koju aminokiselinu. Epitop može da sadrži XDXXVXND, DXXVXND, i/ili VXNDXX, pri čemu X označava bilo koju aminokiselinu. Epitop može da sadrži sekvencu VXND, pri čemu X označava bilo koju aminokiselinu.

[0064] Anti-CXCR3 antitela mogu biti pan-specifična za CXCR3 sekvence različitih vrsta, ili selektivna za CXCR3 sekvence određene vrste ili određenog izotipa CXCR3. CXCR3 antitelo može biti specifično za vrstu ispitanika kome se daje. U skladu sa tim, CXCR3 antitelo može biti specifično za humanu CXCR3 sekvencu (npr., sposobno za vezivanje peptida koji sadrži sekvencu koja je homologa sa bilo kojom od gore navedenih podsekvenci ID BR. SEKV.:1). Homologu sekvencu može lako identifikovati osoba sa uobičajenim znanjem iz ove oblasti, metodama kao što je poravnanje sekvenci proteina (npr., BLASTp, ClustalW, itd.). Antitelo za primenu u pronalasku može se vezati za peptid koji sadrži sekvencu barem 90, 95, ili 99% (ili bilo koji procenat između) sličnu ili identičnu sekvenci ID BR. SEKV.:1 celom dužine sekvence, ili u delu od barem 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, ili 70 ostataka (ili bilo koja vrednost između). Antitelo može biti u stanju da veže epitop koji je barem 80, 85, 90, 95, ili 99% (ili bilo koji procenat između) sličan ili identičan nekom od gore opisanih epitopa (videti takođe sl.18).

[0065] Konkretna antitela objavljena ovde uključuju, na primer, klonove antitela (CI) 12, Cl 135, Cl 82, Cl 53, i Cl 4, kao i njihove himerne i humanizovane varijante.

[0066] Antitela objavljena ovde mogu prikazati izvesna poboljšana svojstva u odnosu na antitela poznata u struci, uključujući antitela 5H7 i 7H5 (objavljeno u, npr., Američkom patentu br.7,405,275; CDR za antitela su objavljeni u Tabeli 1 i 2 i u listi referentnih sekvenci); V44D7 (opisan u Internacionalnoj publikaciji WO 2008/094942), 1C6 (opisan u Američkom patentu br.7,407,655; dok je mapiranje epitopa opisano u Primerima 8 i 9), i 49801, koji prodaje R&D Systems kao kataloški br. MAB160.

[0067] U nekim otelotvorenjima, ovde objavljeni klonovi antitela (klonovi 4, 12, 53, 82, i 135 i njihovi himerni i humanizovani parnjaci) ispoljavaju određene iznenađujuće koristi nad poznatim antitelima 5H7, 7H5, V44D7, 1C6, i 49801. Na primer, ovde objavljeni klonovi ispoljavaju povećani afinitet vezivanja u poređenju sa anti-hCXCR3 klonovima 5H7, 7H5, V44D7, 1C6, i 49801. Ovde objavljeni humanizovani klonovi takođe mogu imati umanjenu imunogenost u poređenju sa mišjim anti-hCXCR3 klonovima 5H7, 7H5, V44D7, 1C6, i 49801. Pored toga, ovde objavljena antitela, kao što su ona koja sadrže klonove teškog lanca 4.7-4.11, optimizovana su modifikovanjem na položajima 58 i 59 (koristeći IMGT numeraciju) kako bi se uklonilo mesto deamidacije i povećala stabilnost. U nekim otelotvorenjima, ovde objavljena antitela su zadržala CXCR3 neutrališuću aktivnost.

[0068] Ovde objavljena antitela ili fragmenti mogu da sadrže VH i/ili VL CDR sekvence koje su od oko 80% do oko 100% (npr., oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100%) identične sa CDR sekvencama VH i/ili VL u bilo kom od antitela Cl 12, Cl 135, Cl 82, Cl 53 i Cl 4, ili u himernim ili humanizovanim varijantama tih klonova (npr., 80-100% identične sa šest CDR u Cl 12, ili sa šest CDR u Cl 12.1, itd.). Antitela ili fragmenti mogu da sadrže CDR sekvence VH i VL koje sadrže 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 supstitucija aminokiselina (uključujući adicije, izbacivanje, i supstitucije, kao što je konzervativna supstitucija) u odnosu na CDR sekvence VH i/ili VL u bilo kom od antitela Cl 12, Cl 135, Cl 82, Cl 53, i Cl 4.

[0069] Kao što se ovde koriste, pojmovi „procenat (%) identičnosti sekvence“ ili „homologost“ su definisani kao procenat aminokiselinskih ostataka ili nukleotida u sekvenci kandidata koji su identični aminokiselinskim ostacima ili nukleotidima u referentnoj sekvenci nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ukoliko je to potrebno, da bi se postigao maksimalan procenat identičnosti sekvence, isključujući konzervativne supstitucije nukleinskih kiselina. Optimalno poravnanje sekvenci za poređenje može biti ostvareno, osim ručno, pomoću algoritama lokalne homologosti poznatih u struci, ili pomoću računarskih programa koji koriste ove algoritme (npr., BLAST P).

[0070] Izolovano CXCR3 antitelo ili antigen-vezujući fragment, kao što je ovde objavljeno, može da sadrži aminokiselinsku sekvencu VH koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% (ili bilo koji procenat između) identična sa aminokiselinskom sekvencom bilo kog od teških lanaca 4.0-4.11, teških lanaca 12.0-12.3, teških lanaca 53.0-53.10, teških lanaca 82.0-82.3, i teških lanaca 135.0-135.3. Antitelo ili fragment mogu da sadrže aminokiselinsku sekvencu VH koja ima 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 mutacija (uključujući adicije, izbacivanja i supstitucije, kao što je konzervativna supstitucija) u aminokiselinskoj sekvenci SEK. bilo kog od teških lanca 4.0-4.11, teških lanaca 12.0-12.3, teških lanaca 53.0-53.10, teških lanaca 82.0-82.3, i teških lanaca 135.0-135.3. Kao što se ovde koristi, „konzervativna supstitucija“ se odnosi na zamenu prve aminokiseline drugom aminokiselinom, koja ne menja u velikoj meri hemijska, fizička i/ili funkcionalna svojstva antitela ili fragmenta (npr., antitelo ili fragment zadržava isto naelektrisanje, strukturu, polaritet, hidrofobnost/hidrofilnost i/ili zadržava funkcije kao što je sposobnost da prepozna, veže se za i/ili neutrališe aktivnost CXCR3).

[0071] Izolovano CXCR3 antitelo ili antigen-vezujući fragment, kao što je ovde objavljeno, može da sadrži aminokiselinsku sekvencu VL koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% (ili bilo koji procenat između) identična aminokiselinskoj sekvenci bilo kog od lakih lanaca 4.0-4.7, lakih lanaca 12.0-12.3, lakih lanaca 53.0-53.13, lakih lanaca 82.0-82.3, i lakih lanaca 135.0-135.3. Antitelo ili fragment mogu da sadrže aminokiselinsku sekvencu VL koja ima 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 mutacija (uključujući adicije, izbacivanja i supstitucije, kao što je konzervativna supstitucija) u aminokiselinskoj sekvenci SEK. bilo kog od lakih lanca 4.0-4.7, lakih lanaca 12.0-12.3, lakih lanaca 53.0-53.13, lakih lanaca 82.0-82.3, i lakih lanaca 135.0-135.3.

[0072] Izolovano CXCR3 antitelo ili antigen-vezujući fragment, kako je objavljeno ovde, može da sadrži varijabilni domen teškog lanca koji je najmanje 80% identičan aminokiselinskoj sekvenci bilo kog od teških lanaca 4.0-4.11, teških lanaca 12.0-12.3, teških lanaca 53.0-53.10, teških lanaca 82.0-82.3, i teških lanaca 135.0-135.3, i sadrži varijabilni domen lakog lanca koji je najmanje 80% identičan aminokiselinskoj sekvenci bilo kog od lakih lanaca 4.0-4.7, lakih lanaca 12.0-12.3, lakih lanaca 53.0-53.13, lakih lanaca 82.0-82.3, i lakih lanaca 135.0-135.3. Teški i laki lanci mogu biti izabrani tako da teški lanac određenog klona (npr. teški lanac klona 4) bude uparen sa bilo kojim lakim lancem tog klona (npr. laki lanac klona 4). Teški i laki lanci mogu da budu upareni na način prikazan u Tabeli 2. Antitelo ili fragment koji sadrži objavljene sekvence VH i/ili VL može da zadrži sposobnost da neutrališe aktivnost CXCR3.

[0073] Ovde objavljeno antitelo može da bude humanizovana varijanta Cl 12, 135, 82, 53, i/ili 4. Antitelo može biti u potpunosti humano. Antitelo može biti humanizovani ili u potpunosti humani derivat antitela izabranog od klonova 12, 135, 82, 53 i 4. Antitelo može imati konstantu afiniteta od najmanje 10<8>M<-1>(npr. najmanje 10<8>M<-1>, najmanje 10<9>M<-1>, najmanje 10<10>M<-1>, ili najmanje 10<11>M<-1>, ili bilo koja vrednost između). Može biti sposobno za vezivanje za sve izooblike CXCR3. Antitelo može biti sposobno za vezivanje i za A i za B izooblike CXCR3. Alternativno, antitelo ne vezuje B izooblik CXCR3.

[0074] Izolovano CXCR3 antitelo ili antigen-vezujući fragment može da sadrži VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 i/ili VL CDR3 koji sadrže aminokiselinske sekvence oko 90% do oko 100% (npr. oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100%) identične VH i VL CDR sekvencama bilo kog od klonova 12, 135, 82, 53 i 4, i njihovih himernih i humanizovanih varijanti. Izolovano CXCR3 antitelo ili antigenvezujući fragment može da sadrži VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 i/ili VL CDR3 koji sadrže aminokiselinske sekvence koje su identične, ili sadrže 1, 2, 3, 4 ili 5 mutacija aminokiselinskih ostataka (uključujući adicije, izbacivanje i supstitucije, kao što je konzervativna supstitucija) u odnosu na CDR sekvence VH i VL bilo kog od klonova 12, 135, 82, 53, i 4, i njihovih himernih i humanizovanih varijanti.

[0075] Anti-CXCR3 antitelo ili fragment mogu da sadrže teški lanac koji ima tri CDR (CDR1, CDR2, i CDR3 teškog lanca) i laki lanac koji ima tri CDR (CDR1, CDR2, i CDR3 lakog lanca). VH CDR1 može da ima 1, 2 ili 3 mutacije aminokiselina u odnosu na CDR1 sekvencu VH bilo kog od klonova 12, 135, 82, 53 i 4, i njihovih himernih i humanizovanih varijanti. VH CDR2 može da ima 1, 2 ili 3 mutacije aminokiselina u odnosu na CDR2 sekvencu VH bilo kog od klonova 12, 135, 82, 53 i 4, i njihovih himernih i humanizovanih varijanti. VH CDR3 može da ima 1, 2 ili 3 mutacije aminokiselina u odnosu na CDR3 sekvencu VH bilo kog od klonova 12, 135, 82, 53 i 4, i njihovih himernih i humanizovanih varijanti. VL CDR1 može da ima 1, 2 ili 3 mutacije aminokiselina u odnosu na CDR1 sekvencu VL bilo kog od klonova 12, 135, 82, 53 i 4, i njihovih himernih i humanizovanih varijanti. VL CDR2 može da ima 1 ili 2 mutacije aminokiselina u odnosu na CDR2 sekvencu VL bilo kog od klonova 12, 135, 82, 53 i 4, i njihovih himernih i humanizovanih varijanti. VL CDR3 može da ima 1, 2 ili 3 mutacije aminokiselina u odnosu na CDR3 sekvencu VL bilo kog od klonova 12, 135, 82, 53 i 4, i njihovih himernih i humanizovanih varijanti. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog i lakog lanca mogu da budu CDR bilo kog od klonova 12, 135, 82, 53 i 4, i njihovih himernih ili humanizovanih varijanti, ili mogu da sadrže 1-3 mutacije aminokiselina u odnosu na CDR bilo kog od odabranih klonova antitela i njihovih himernih/humanizovanih varijanti. Mutacije mogu biti na istaknutim položajima prikazanim na poravnanju na sl.17 A-H. Mutacija može biti na jednom ili više položaja 58 i 59 u VH CDR2 bilo kog od klonova 4.0-4.11.

[0076] Anti-CXCR3 antitelo ili fragment mogu da sadrže teški lanac i laki lanac. Teški lanac može biti najmanje 90% identičan (npr. najmanje oko 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ili 99% identičan, ili bilo koji procenat između), ili može da ima 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 mutacija aminokiselina u odnosu na bilo koji od teških lanaca 4.0-4.11, teških lanaca 12.0-12.3, teških lanaca 53.0-53.10, teških lanaca 82.0-82.3, i teških lanaca 135.0-135.3. Laki lanac može biti najmanje 90% identičan (npr. najmanje oko 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ili 99% identičan, ili bilo koji procenat između), ili može da ima 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 mutacija aminokiselina u odnosu na bilo koji od lakih lanaca 4.0-4.7, lakih lanaca 12.0-12.3, lakih lanaca 53.0-53.13, lakih lanaca 82.0-82.3, i lakih lanaca 135.0-135.3. Teški lanac može biti najmanje 90% identičan (npr. najmanje oko 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ili 99% identičan, ili bilo koji procenat između) ili može da ima 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 mutacija aminokiselina u odnosu na bilo koji od teških lanaca 4.0-4.11, teških lanaca 12.0-12.3, teških lanaca 53.0-53.10, teških lanaca 82.0-82.3, i teških lanaca 135.0-135.3 i/ili laki lanac može biti najmanje 90% identičan (npr. najmanje oko 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ili 99% identičan, ili bilo koji procenat između) ili može da ima 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 mutacija aminokiselina u odnosu na bilo koji od lakih lanaca 4.0-4.7, lakih lanaca 12.0-12.3, lakih lanaca 53.0-53.13, lakih lanaca 82.0-82.3, i lakih lanaca 135.0-135.3. Mutacije mogu biti na položajima prikazanim na poravnanju na sl. 17 A-H.

[0077] Izolovano CXCR3 antitelo ili antigen-vezujući fragment koji sadrže gore prikazane CDR sekvence VH i/ili VL mogu da zadrže CXCR3 neutrališuću aktivnost.

[0078] Varijabilni domeni teškog i lakog lanca CXCR3 antitela ili fragmenta mogu da sadrže najmanje jedan region okvira (npr. najmanje jedan od FR1, FR2, FR3 i FR4). Regioni okvira teškog lanca su označeni sa VH FR, dok su regioni okvira lakog lanca ovde označeni sa VL FR. Regioni okvira mogu da sadrže supstitucije, umetanje i druge izmene. Ove izmene mogu dovesti do poboljšanja ili optimizacije afiniteta vezivanja antitela. Neograničavajući primeri ostataka regiona okvira koji mogu biti izmenjeni uključuju one koji direktno nekovalentno vezuju CXCR3, interaguju sa konformacijom CDR ili utiču na nju, i/ili učestvuju u VL-VH interfejsu.

[0079] Teški lanac (VH) CXCR3 antitela ili fragmenta može da sadrži FR1, FR2, FR3 i/ili FR4 koji ima aminokiselinske sekvence koje su oko 80% do oko 100% identične (npr.80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100%, ili bilo koji procenat između) odgovarajućim regionima okvira VH kod bilo kog od klonova 12, 135, 82, 53 i 4, i njihovih himernih i humanizovanih varijanti. U pojedinim otelotvorenjima CXCR3 antitelo ili fragment mogu da sadrže barem jedan VH FR (FR1, FR2, FR3 i/ili FR4) koji ima sekvencu aminokiselina koja je identična, ili sadrži 1, 2, 3, 4 ili 5 mutacija aminokiselina (uključujući adicije, uništavanje i supstitucije, kao što je konzervativna supstitucija) u odnosu na odgovarajuće VH FR regione bilo kog od klonova 12, 135, 82, 53, i 4 i njihovih himernih i humanizovanih varijanti.

[0080] Laki lanac (VL) CXCR3 antitela ili fragmenta može da sadrži FR1, FR2, FR3 i/ili FR4 koji ima aminokiselinske sekvence koje su oko 80% do oko 100% identične (npr.80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100%, ili bilo koji procenat između) odgovarajućim regionima okvira VL kod bilo kog od klonova 12, 135, 82, 53 i 4, i njihovih himernih i humanizovanih varijanti. CXCR3 antitelo ili fragment mogu da sadrže najmanje jedan VL FR (FR1, FR2, FR3 i/ili FR4) koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je identična, ili sadrži 1, 2, 3, 4 ili 5 mutacija aminokiselina (uključujući adicije, izbacivanja i supstitucije, kao što je konzervativna supstitucija) u odnosu na odgovarajuće VL FR regione bilo kog od klonova 12, 135, 82, 53 i 4, i njihovih himernih i humanizovanih varijanti.

[0081] CXCR3 antitelo ili fragment mogu da sadrže VH FR regione (FR1, FR2, FR3 i/ili FR4) koji imaju aminokiselinsku sekvencu koja je identična, ili sadrži 1, 2, 3, 4 ili 5 mutacija aminokiselina u odnosu na odgovarajuće VH FR regione bilo kog od klonova 12, 135, 82, 53 i 4, i njihovih himernih i humanizovanih varijanti., i sadrže VL FR regione (FR1, FR2, FR3 i/ili FR4) koji imaju aminokiselinsku sekvencu koja je identična, ili sadrži 1, 2, 3, 4 ili 5 mutacija aminokiselina u odnosu na odgovarajuće VL FR regione bilo kog od klonova 12, 135, 82, 53 i 4, i njihovih himernih i humanizovanih varijanti. CXCR3 antitelo ili fragment mogu da sadrže VH FR regione (FR1, FR2, FR3 i/ili FR4) koji imaju aminokiselinsku sekvencu koja je oko 80-100% identična u odnosu na odgovarajuće VH FR regione bilo kog od klonova 12, 135, 82, 53, i 4 i njihovih himernih i humanizovanih varijanti, i sadrže VL FR regione (FR1, FR2, FR3 i/ili FR4) koji imaju aminokiselinsku sekvencu koja je oko 80-100% identična u odnosu na odgovarajuće VL FR regione bilo kog od klonova 12, 135, 82, 53 i 4, njihovih himernih i humanizovanih varijanti.

[0082] Ovde objavljeni CDR i FR regioni mogu biti kombinovani na različite načine, pošto svaki CDR i FR region može biti nezavisno odabran i kombinovan sa bilo kojim drugim CDR ili FR regionom za dato antitelo. U pojedinim otelotvorenjima, sekvence VH i/ili VL CDR ili FR mogu biti prisutne u antitelu ili fragmentu u bilo kojoj kombinaciji koja zadržava sposobnost da neutrališe CXCR3 aktivnost.

[0083] Antitela i fragmenti, kako je ovde objavljeno, mogu da sadrže jednu ili više sekvenci aminokiselina koje ne menjaju u većoj meri ovde opisane sekvence aminokiselina. Sekvence aminokiselina koje su u velikoj meri iste uključuju sekvence koje sadrže konzervativnu supstituciju aminokiselina, kao i izbacivanja aminokiselina i/ili umetanja koja ne umanjuju sposobnost antitela ili fragmenta da neutrališu CXCR3 aktivnost.

[0084] Ovde objavljena antitela i fragmenti mogu biti dalje konjugovani sa jednim ili više dodatnih molekula. Na primer, konjugat može da sadrži antitelo spojeno direktno ili putem linkera sa jednim ili više terapeutskih agenasa, agenasa za solubilizaciju, agenasa za stabilizaciju, imunosupresiva, receptora ili njihovih fragmenata, antigen vezujućih peptida i/ili drugih funkcionalnih grupa za ciljanje liganda. U nekim otelotvorenjima, terapeutski agens je agens koristan za lečenje T1D i/ili drugih poremećaja vezanih za CXCR3. U nekim otelotvorenjima, antitelo ili fragment su konjugovani sa agensom koji stimuliše β-ćeliju ili insulinom.

Sekvence nukleotida

[0085] Pored prethodno opisanih sekvenci aminokiselina, ovde su objavljene sekvence nukleotida koje odgovaraju tim sekvencama aminokiselina. Sekvenca nukleotida može da kodira antitelo ili fragment sposoban da neutrališe aktivnost CXCR3. Sekvence nukleotida mogu biti korišćene za pripremu ekspresionih vektora za ekspresiju anti-CXCR3 antitela u ćelijama (npr. ekspresija u ćelijama sisara).

[0086] Ovde su takođe objavljeni polinukleotidi koji su suštinski identični onima za kodiranje ovde objavljenih aminokiselinskih sekvenci. Suštinski identične sekvence mogu biti polimorfne sekvence, tj., alternativne sekvence, ili aleli u populaciji. Suštinski identične sekvence takođe mogu sadržati mutagenizovane sekvence, uključujući sekvence koje sadrže tihe mutacije. Mutacija može da obuhvata jednu ili više promena ostataka nukleotida, izbacivanje jednog ili više ostataka nukleotida, ili umetanje jednog ili više dodatnih ostataka nukleotida. Suštinski identične sekvence takođe mogu da obuhvataju različite sekvence nukleotida koje kodiraju istu aminokiselinu na bilo kom datom položaju aminokiseline u ovde objavljenoj sekvenci aminokiselina, usled degeneracije koda nukleinske kiseline.

Takođe, u suštinski identične sekvence su uključene i sekvence koje kodiraju lanac ili lance antitela koje zadržava sposobnost da neutrališe CXCR3.

[0087] Ovde su takođe objavljeni polinukleotidi koji se hibridizuju pod veoma strogim ili manje strogim uslovima hibridizacije za polinukleotide koji kodiraju CXCR3 neutrališuće antitelo ili fragment. Pojam „striktnost“ kao što se ovde koristi, odnosi se na eksperimentalne uslove (npr., temperatura i koncentracija soli) eksperimenta hibridizacije sprovedenog da bi se utvrdio stepen homologosti između dve nukleinske kiseline. Što je veća striktnost, postoji veća homologost između dve nukleinske kiseline. Kao što se ovde koristi, fraza „hibridizacija“, ili njene gramatičke varijacije, odnosi se na vezivanje prvog molekula nukleinske kiseline za drugi molekul nukleinske kiseline pod uslovima male, srednje ili velike striktnosti, ili pod uslovima sinteze nukleinske kiseline. Hibridizacija može da uključuje slučajeve u kojima se prvi molekul nukleinske kiseline vezuje za drugi molekul nukleinske kiseline, i gde su prvi i drugi molekuli nukleinske kiseline komplementarni.

[0088] Striktni uslovi hibridizacije uključuju, ali nisu ograničeni na, hibridizaciju za DNK vezanu za filter u 6X natrijum hloridu/natrijum citratu (SSC) na oko 45 stepeni Celzijusa, a zatim jedno ili više ispiranja u 0,2X SSC/0,1% SDS na oko 50-65 stepeni Celzijusa. Drugi striktni uslovi hibridizacije uključuju hibridizaciju za DNK vezanu za filter u 6X SSC na oko 45 stepeni Celzijusa, a zatim jedno ili više ispiranja u 0,1X SSC/0,2% SDS na oko 65 stepeni Celzijusa. Drugi uslovi hibridizacije poznate striktnosti su poznati stručnjacima, i uključeni su ovde.

[0089] Nukleinska kiselina, kako je ovde objavljena, može da kodira aminokiselinsku sekvencu lanca ili lanaca u antitelu ili fragmentu sposobnom za neutralizaciju aktivnosti CXCR3, ili se nukleinske kiseline mogu hibridizovati pod striktnim uslovima za nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu lanca ili lanaca u antitelu ili fragmentu.

[0090] Sekvenca polinukleotida, kao što je objavljena ovde, obuhvata sekvencu nukleotida koja kodira aminokiselinsku sekvencu VH domena CXCR3 neutrališućeg antitela ili fragmenta, i koja je najmanje 80-100% (npr.80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100%) identična (ili bilo koji procenat između) sekvenci nukleotida koja kodira teški lanac bilo kog od klonova 12, 135, 82, 53 i 4, i njihovih himernih i humanizovanih varijanti. Sekvenca polinukleotida može da obuhvata sekvencu nukleotida koja ima 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 mutacija (uključujući adicije, izbacivanje i supstitucije, kao što je konzervativna supstitucija) u odnosu na sekvencu nukleotida koja kodira teški lanac bilo kog od klonova 12, 135, 82, 53 i 4, i njihovih himernih i humanizovanih varijanti.

[0091] Sekvenca polinukleotida, kao što je objavljena ovde, obuhvata sekvencu nukleotida koja kodira aminokiselinsku sekvencu VL domena CXCR3 neutrališućeg antitela ili fragmenta, i koja je najmanje 80-100% (npr.80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100%) identična (ili bilo koji procenat između) sekvenci nukleotida koja kodira teški lanac bilo kog od klonova 12, 135, 82, 53 i 4, i njihovih himernih i humanizovanih varijanti. Sekvenca polinukleotida može da obuhvata sekvencu nukleotida koja ima 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 mutacija (uključujući adicije, izbacivanje i supstitucije, kao što je konzervativna supstitucija) u odnosu na sekvencu nukleotida koja kodira laki lanac bilo kog od klonova 12, 135, 82, 53 i 4, i njihovih himernih i humanizovanih varijanti.

[0092] Sekvenca polinukleotida, kao što je objavljena ovde, obuhvata sekvencu nukleotida koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična (ili bilo koji procenat između) aminokiselinskoj sekvenci VH, i najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična (ili bilo koji procenat između) aminokiselinskoj sekvenci VL, pri čemu sekvence nukleotida kodiraju aminokiselinske sekvence teškog i lakog lanca bilo kog od klonova 12, 135, 82, 53 i 4, i njihovih himernih i humanizovanih varijanti.

[0093] Objavljeni polinukleotidi mogu se dobiti bilo kom metodom poznatom u struci. Na primer, ako je poznata sekvenca nukleotida antitela, polinukleotid koji kodira antitelo može biti sastavljen od hemijski sintetisanih oligonukleotida. Ovo bi uključivalo, na primer, sintezu preklapajućih oligonukleotida koji sadrže delove sekvence koja kodira antitelo, žarenjem i ligiranjem tih oligonukleotida, a zatim amplifikacijom ligiranih oligonukleotida putem PCR. Objavljeni polinukleotidi takođe mogu biti dobijeni iz bilo kog drugog pogodnog izvora nukleinske kiseline, kao što je biblioteka antitela cDNK, ili biblioteka cDNK izolovane iz bilo kog tkiva ili ćelija koje eksprimiraju antitelo (npr. od ćelija hibridoma odabranih da eksprimiraju antitelo).

[0094] Svaki od objavljenih polinukleotida može biti uključen u ekspresioni vektor. Pogodni vektori za ekspresiju različitih ljudskih i životinjskih ćelijskih tipova su poznati u struci. Objava obuhvata ćelije domaćine koje sadrže vektore. Pogodne ćelije domaćini uključuju, npr. CHO, COS, SF9 i/ili druge humane ili nehumane ćelijske linije. Ćelije domaćini nepostojano ili stabilno eksprimiraju nukleinsku kiselinu na vektoru kada se uzgajaju u medijumu, i tako obezbeđuju metodu za proizvodnju ovde objavljenih antitela ili njihovih fragmenata.

Farmaceutske smeše

[0095] Farmaceutska smeša može da sadrži bilo koje od ovde objavljenih antitela, ili njihovih fragmenata. Takođe, objavljene su farmaceutske smeše koje sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju antitela ili njihove fragmente, npr. za primenu u genskoj terapiji i/ili za prolaznu ili stabilnu ekspresiju u ćeliji domaćinu (npr. CHO, COS, SF9 i/ili druga humana ili nehumana ćelijska linija) za proizvodnju proteina ili njihovih fragmenata.

[0096] Ovde objavljene farmaceutske smeše mogu da obuhvataju farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili najmanje jedan aditiv kao što je rastvarač, punilac, sredstvo za povećanje zapremine, dezintegrans, pufer ili stabilizator. Standardne tehnike farmaceutske formulacije su dobro poznate stručnjacima za ovu oblast (videti, npr., 2005 Physicians' Desk Reference®, Thomson Healthcare: Montvale, NJ, 2004 ; Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20. izd., Gennado et al., Eds. Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000). Pogodni farmaceutski aditivi uključuju npr. manitol, skrob, glukozu, laktozu, saharozu, želatin, slad, pirinač, brašno, kredu, silika gel, natrijum stearat, glicerol monostearat, talk, natrijum hlorid, obrano mleko u prahu, glicerol, propilen, glikol, vodu, etanol i slično. Farmaceutske smeše takođe mogu da obuhvataju reagense za puferovanje pH i kvašljivce ili emulgatore (npr. slani rastvor sa fosfatnim puferom (PBS), sterilni slani rastvor za injekcije, itd.). Smeše mogu da sadrže konzervanse ili druge stabilizatore.

[0097] Farmaceutske smeše koje sadrže bilo koje od ovde objavljenih antitela ili njihove fragmente, ili nukleinske kiseline koje kodiraju antitela ili fragmente, mogu dalje da sadrže jedno ili više od sledećeg: manitol polisorbat 80, dvobazni natrijum fosfat heptahidrat i jednobazni natrijum fosfat monohidrat. U drugom otelotvorenju, farmaceutske smeše mogu da sadrže 10mM histidin pH 6,5 sa do 2% glicina, do 2% manitola, i do 0,01% polisorbata 80.

[0098] Formulacija farmaceutskih smeša može da varira u zavisnosti od planiranog načina primene i drugih parametara (videti, npr., Rowe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4. izd., APhA Publications, 2003.) Farmaceutska smeša može biti liofilizovana pogača ili prah. Liofilizovana smeša može biti rekonstituisana za primenu putem intravenske injekcije, na primer, sa sterilnom vodom za injekciju, USP. Smeša može biti sterilni, nepirogeni rastvor.

[0099] Ovde opisane farmaceutske smeše mogu da sadrže antitelo kako je ovde objavljeno, ili njegov fragment, ili nukleinske kiseline koje kodiraju antitela ili fragmente, kao jedino aktivno jedinjenje, ili farmaceutska smeša može da sadrži kombinaciju sa drugim jedinjenjem, smešom ili biološkim materijalom. Na primer, farmaceutska smeša može takođe da sadrži jedan ili više malih molekula, ili drugih agenasa korisnih za lečenje bolesti ili poremećaja povezanih sa CXCR3, kao što je T1D. Farmaceutska smeša može da sadrži agens za stimulisanje β-ćelije, insulin, i/ili ćelije koje stvaraju insulin. Farmaceutska smeša takođe može da sadrži jedan ili više imunosupresiva, inhibitora mTOR ili inhibitora autofagije.

Primeri za imunosupresive uključuju rapamicin i velcade. Rapamicin je takođe i inhibitor mTOR.

Primena i doziranje

[0100] Ovde je objavljena metoda za lečenje pacijenta koji pati od bolesti ili poremećaja povezanog sa CXCR3, koja obuhvata davanje pacijentu jednog ili više ovde objavljenih anti-CXCR3 antitela, i/ili njihovih fragmenata. Kao što je ovde objavljeno, antitelo ili fragment mogu biti sposobni za neutralizaciju CXCR3. Kao što je ovde objavljeno, bolest ili poremećaj mogu biti inflamatorni poremećaj. Kao što je ovde objavljeno, poremećaj može biti T1D. Kao što je ovde objavljeno, primena smeše (npr. farmaceutske smeše) koja sadrži antitelo ili fragment može da spreči, leči, umanji ozbiljnost, i/ili na drugi način ublaži simptome bolesti ili poremećaja povezanog sa CXCR3. Kao što je ovde objavljeno, antitelo ili fragment mogu biti davani u dozi i učestalosti dovoljnoj da spreči, leči, umanji ozbiljnost, i/ili na drugi način ublaži simptome bolesti ili poremećaja povezanog sa CXCR3.

[0101] U određenim primerima, data je smeša za primenu u proizvodnji leka za lečenje bolesti ili poremećaja, naznačeno time što lek sadrži bilo koje od ovde objavljenih antitela ili njihovih fragmenata. Na primer, antitelo ili fragment mogu da sadrže tri CDR bilo kog od varijabilnih domena teškog lanca 4.0-4.11 uparena sa tri CDR bilo kog od varijabilnih domena lakog lanca 4.0-4.7; tri CDR bilo kog od varijabilnih domena teškog lanca 12.0-12.3 uparena sa tri CDR bilo kog od varijabilnih domena lakog lanca 12.0-12.3; tri CDR bilo kog od varijabilnih domena teškog lanca 53.0-53.10 uparena sa tri CDR bilo kog od varijabilnih domena lakog lanca 53.0-53.13; tri CDR bilo kog od varijabilnih domena teškog lanca 82.0-82.3 uparena sa tri CDR bilo kog od varijabilnih domena lakog lanca 82.0-82.3; ili tri CDR bilo kog od varijabilnih domena teškog lanca 135.0-135.3 uparena sa tri CDR bilo kog od varijabilnih domena lakog lanca 135.0-135.3.

[0102] Antitelo ili fragment u leku mogu da sadrže bilo koji od varijabilnih domena teškog lanca 4.0-4.11 uparen sa bilo kojim od varijabilnih domena lakog lanca 4.0-4.7, bilo koji od varijabilnih domena teškog lanca 12.0-12.3 uparen sa bilo kojim od varijabilnih domena lakog lanca 12.0-12.3, bilo koji od varijabilnih domena teškog lanca 53.0-53.10 uparen sa bilo kojim od varijabilnih domena lakog lanca 53.0-53.13, bilo koji od varijabilnih domena teškog lanca 82.0-82.3 uparen sa bilo kojim od varijabilnih domena lakog lanca 82.0-82.3, ili bilo koji od varijabilnih domena teškog lanca 135.0-135.3 uparen sa bilo kojim od varijabilnih domena lakog lanca 135.0-135.3.

[0103] Doze CXCR3 antitela za primenu kod ovde objavljenih metoda će varirati u zavisnosti od mnogobrojnih parametara poznatih stručnjaku, kao što je fiziologija pacijenta (veličina ili površina, težina, starost, i metabolizam) i stanja bolesti, kao i farmakoloških parametara, kao što je mehanizam isporuke, formulacija i sve istovremene ili nadovezujuće terapije. „Efikasna količina“ CXCR3 antitela može proizvesti željeni efekat in vivo kao što je jedno ili više od sledećeg: održavanje ili smanjenje nivoa HA1bc (hemoglobin A1c) (manje od oko 7%, npr. manje od 7,5, 7,4, 7,3, 7,2, 7,1, 7,0, 6,9, 6,8, 6,7, 6,6 ili 6,5%, ili bilo koji procenat između), povećana endogena proizvodnja insulina i/ili nivoi insulina u krvotoku, održavanje ili povećanje nivoa C-peptida uz uzdržavanje od hrane, poboljšana tolerancija na glukozu, smanjeni nivoi glukoze u krvi uz uzdržavanje od hrane u odsustvu egzogenog insulina, smanjenje upotrebe egzogenog insulina, smanjenje inflamacije β-ćelija i/ili povećanje populacije β-ćelija i/ili njihov rast. Direktni ćelijski testovi za inhibiciju CXCR3 takođe mogu biti korišćeni, kao što je smanjenje CXCR3+ ćelija u krvi (uključujući, ali se ne ograničavajući na T ćelije), inhibicija vezivanja liganda CXCR3, vezivanje GTP, influks i/ili mobilizacija kalcijuma, hemotaksa ćelija i/ili internalizacija receptora.

[0104] Efikasna količina CXCR3 antitela može dovesti do oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ili 100% (ili bilo koji procenat između) ili 1, 2, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, ili 100-strukog (ili bilo koliko puta između), ili većeg, poboljšanja bilo kog od gorenavedenih parametara in vivo, u odnosu na kontrolne uzorke. Poboljšanje može biti okarakterisano nivoom glukoze u krvi uz uzdržavanje od hrane pri odsustvu egzogenog insulina, koji je smanjen ispod 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 180, 200, 220, 240, 250, 300, ili 350 mg/dl (ili bilo koja vrednost između). Poboljšanje može biti okarakterisano povećanjem bazalnih nivoa C-peptida u serumu na više od 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,8, ili 1,0 nmol/l (ili bilo koja vrednost između). Poboljšanje može biti okarakterisano povećanjem integrisanih nivoa C-peptida u serumu uz uzdržavanje od hrane tokom opterećenja C-peptidima (post-oralni test tolerancije na glukozu) na vrednost veću od 0,03, 0,033, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,4, 0,5, 0,6, 0,8, ili 1,0 nmol/l x min (ili bilo koja vrednost između). Efikasna doza CXCR3 antitela može biti dalje okarakterisana smanjenjem koncentracije CD4+ i/ili CD8+ ćelija u pankreasu od najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ili 90% (ili bilo koji procenat između), ili najmanje 1, 2, 3, 4 ili 5-struko (ili bilo koja vrednost između), u odnosu na kontrolne ispitanike.

[0105] Efikasna doza antitela može takođe biti izabrana da bude bezbedna doza za davanje ljudskom ispitaniku. Bezbedna doza anti-CXCR3 antitela može se okarakterisati kao ona koja ne dovodi do značajnog bruto smanjenja T ćelija ili aktivnosti T ćelija (osim aktivnosti CXCR3) kod ispitanika (npr. mereno koncentracijom ili aktivnošću T ćelija u krvi ispitanika). U posebnim primerima, „nema značajnog bruto smanjenja T ćelija ili aktivnosti T ćelija“ znači 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% (ili bilo koji procenat između) ili manje smanjenje koncentracije i/ili aktivnosti (osim aktivnosti CXCR3) CD4+ i/ili CD8+ ćelija kod ispitanika lečenog CXCR3 neutrališućim antitelom, u odnosu na kontrolne ispitanike lečene placebom i/ili u odnosu na lečene ispitanike pre početka lečenja. U nekim slučajevima, bezbedna doza je dalje okarakterisana kao 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% (ili bilo koji procenat između) ili manje smanjenje koncentracije jednog ili više tipova ćelija odabranih od T regulatornih, B ćelija, mijeloidnih ćelija, dendritskih ćelija i/ili granulocita, u odnosu na kontrolne ispitanike.

[0106] Ilustrativne, neograničavajuće doze za ispitanika, kao što je čovek, uključuju oko 0,03, 0,06, 0,12, 0,24, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5 ili 3,7 mg/kg/dozi (ili bilo koja vrednost između) za antitelo koje ima ND50od oko 1-6 µg/ml u in vitro testu hemotakse. Kao što je ovde objavljeno, antitelo može biti primenjeno u opsegu od oko 0,03-3,7 mg/kg/dozi, 0,15-0,7 mg/kg/dozi ili 0,25-0,5 mg/kg/dozi.

[0107] Anti-CXCR3 antitelo može biti primenjeno u jednoj dozi ili u više ponovljenih doza tokom različitih vremenskih perioda, recimo dnevno, nedeljno, dvonedeljno, mesečno, dvomesečno, kvartalno ili godišnje. U skladu sa tim, u neograničavajućem primeru zasnovanom na prethodno objašnjenom doznom rasponu, pacijent može dobiti približnu ukupnu dozu od 0,16-18 mg/kg CXCR3 antitela tokom trajanja režima lečenja.

[0108] Anti-CXCR3 antitela mogu biti primenjena bilo kojim prikladnim putem poznatim stručnjaku, uključujući, na primer, intravenski, intraperitonealno, nazalno, okularno, oralno, parenteralno, supkutano ili transdermalno. Kao što je ovde objavljeno, antitelo može biti dato direktno u pankreas ispitanika, ili blizu pankreasa, ili u specifične regione pankreasa, kao što su ćelije ostrvaca pankreasa.

[0109] Efikasna doza otkrivena za jednu životinju može biti konvertovana za upotrebu kod druge životinje, uključujući ljude, pomoću faktora konverzije poznatih u struci. Videti, npr., Reagan-Shaw et al., FASEB J.22:659-61 (2008); Schein et al., Clin. Pharmacol. Ther. 11: 3-40 (1970); i Freireich et al., Cancer Chemother. Reports 50(4):219-244 (1966). Na primer, ekvivalentna humana doza (human equivalent dosing (HED)) u mg/kg na osnovu doze za životinje može biti dobijena sledećom jednačinom: HED (mg/kg) = doza za životinju (mg/kg) X (Km<životinja>/Km<čovek>), pri čemu je Km = težina/površina (kg/ m<2>).

[0110] Primeri za faktor konverzije na osnovu prethodne jednačine prikazani su u sledećoj tabeli. Gore navedene ilustrativne doze za ljude mogu biti prilagođene za druge vrste ili druge humane pacijente na osnovu ovih koeficijenata, ili drugih načina poznatih stručnjacima.

Tabela 3

Ispitanici

[0111] Ispitanici koji će biti lečeni ovde objavljenim metodama mogu uključivati ljude ili životinje, kao što je stoka, domaće i divlje životinje. Životinje mogu biti ptice, goveda, psi, kitovi, konji, mačke, ovce, ribe, svinje, primati, glodari ili kopitari. Ispitanici mogu biti na bilo kom stadijumu razvoja, uključujući odrasli, mladi, fetusni, ili embrionski. Poželjno, pacijent je sisar, a još poželjnije, čovek.

[0112] Kao što je ovde objavljeno, ispitanik može biti lečen profilaktički ili nakon pojave bilo kog stanja povezanog sa nenormalnom aktivnošću CXCR3, ili bilo kog stanja kod kojeg bi prekid signalizacije CXCR3 mogao biti terapeutski koristan. Kao što je ovde objavljeno, ispitanik može biti lečen profilaktički ili nakon pojave T1D. Kao što je ovde objavljeno, ispitanik može biti lečen profilaktički pre pojave T1D pomoću ovde obezbeđenih metoda, ili ovde obezbeđene metode mogu biti korišćene u lečenju ispitanika sa skorom pojavom T1D.

[0113] „Ispitanik sa skorom pojavom T1D“ je svaki ispitanik koji ima umanjen, ali i dalje uočljiv, kapacitet za proizvodnju insulina u β-ćelijama pankreasa, bez obzira na starost ispitanika u trenutku kliničke dijagnoze dijabetesa (npr. uključujući odrasle, mlade, fetus, ili embrion). Kako je ovde objavljeno, ispitanik sa skorom pojavom T1D može dobijati lečenje poželjno u roku od oko šest meseci (npr. u roku od 1 dana, 1 nedelje, 2 nedelje, 3 nedelje, 4 nedelje, 5 nedelja, 1 meseca, 2 meseca, 3 meseca, 4 meseca, 5 meseci, 6 meseci, ili u bilo kom trenutku između) od najranije kliničke dijagnoze T1D. Kao što je ovde objavljeno, ispitanik može dobijati lečenje više od šest meseci nakon najranije kliničke dijagnoze T1D, naznačeno time što ispitanik zadržava minimalne ali merljive bazne nivoe C-peptida u serumu veće ili jednake oko 0,2 nmol/l (npr. najmanje oko 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,60,8, ili 1,0 nmol/l). Kao što je ovde objavljeno, lečenje može da obuhvata davanje jedne ili više doza koje sadrže jedno ili više ovde objavljenih antitela. Antitelo može biti CXCR3 neutrališuće antitelo.

[0114] Ispitanik sa skorom pojavom T1D može zadržati integrisani nivo C-peptida u serumu uz uzdržavanje od hrane od najmanje oko 0,03, 0,033, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,4, 0,5, 0,6, 0,8, ili 1,0 nmol/l x min, npr., oko 0,03 do 1,0 ili 0,033 do 1,0 nmol/l x min tokom stimulacije C-peptida. Ispitanik može imati integrisani nivo C-peptida u serumu uz uzdržavanje od hrane od 0,033 do 1,0 nmol/l x min tokom stimulacije C-peptida. Stimulacija C-peptida može biti post-oralni test glukoze, i može obuhvatati merenje integrisanog nivoa C-peptida u serumu tokom 60-150 minuta nakon primene 10,0-13,9 mmol/l glukoze. Vidi Keymeulen et al., Diabetologia 53: 614-623 (2010). Ispitanikovo merljivo povećanje nivoa integrisanog C-peptida u serumu posle oralnog testa tolerancije na glukozu može biti manje od 0,8, 0,7, 0,6, 0,54, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 ili 0,1 nmol/l x min. Ispitanik može imati povećanje od 0,54 nmol/l x min, ili manje, nivoa integrisanog C-peptida u serumu posle oralnog testa tolerancije na glukozu. C-peptid odgovara ostacima 57-87 peptida prekursora insulina (referentna humana sekvenca NP_000198), dok ostaci 90-110 i 25-54 odgovaraju A, odnosno B lancu insulina.

[0115] Ispitanik sa skorom pojavom T1D može imati povišeni nivo glukoze u krvi uz uzdržavanje od hrane pri odsustvu egzogenog insulina veći od oko 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 180, 200, 220, 240, 250, 300, ili 350 mg/dl (ili bilo koja vrednost između) ili veći. Ispitanik može imati i povišeni nivo glukoze u krvi uz uzdržavanje od hrane, kao što je gore opisano, i smanjeni integrisani nivo C-peptida u serumu uz uzdržavanje od hrane, kao što je gore opisano.

[0116] Kao što je ovde objavljeno, ispitanik može biti lečen ovde objavljenim metodama ubrzo nakon dijagnoze skore pojave T1D. Kao što je ovde objavljeno, ispitanik može prvi put biti lečen ovde objavljenim metodama u roku od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 dana, ili 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 nedelja, ili 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ili 12 meseci od kliničke dijagnoze skore pojave T1D (ili u bilo kom vremenu između). Kao što je ovde objavljeno, ispitanik može biti lečen ovde objavljenim metodama u roku od 6 meseci od kliničke dijagnoze skore pojave T1D. Kao što je ovde objavljeno, ispitanik koji ima T1D može biti lečen ovde objavljenim metodama u bilo kom trenutku, bez obzira na vreme prošlo od kliničke dijagnoze, naznačeno time što ispitanik zadržava rezidualni nivo C-peptida u serumu od najmanje 0,2 nmol/l.

Dodatne metode

[0117] Ovde objavljene metode mogu sadržati dodatno lečenje, koje može biti primenjeno istovremeno ili uzastopno (pre ili posle) sa davanjem ovde objavljenog anti-CXCR3 antitela. Na primer, kao što je ovde objavljeno, objavljene metode obuhvataju dalji korak primene imunosupresiva ispitaniku uz anti-CXCR3 antitela. Imunosupresivi mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na, jedan ili više od sledećeg: azatioprina (Imuran), β interferona 1a, β interferona 1b, baziliksimaba, kortikosteroida, ciklosporina (Sandimmune), ciklofosfamida, hlorambucila, dacilizumaba, deoksipergualina, etanercepta, glatiramer acetata, infliksimaba, leflunomida, merkatopurina (6-MP), metotreksata, mitoksantrona, muronomab-CD3, mikofenolata (MFM ili CellCept), natalizumaba, anakinra, kanakinumaba, rituksimaba, belimumaba, abatacepta, aldesleukina, prednizona, rapamicina, sirolimusa, takrolimusa i ustekinumaba.

[0118] Kao što je ovde objavljeno, ovde objavljene metode mogu da obuhvataju, pored davanja anti-CXCR3 antitela, korak davanja agensa za stimulisanje β-ćelija ispitaniku. Korak davanja agensa za stimulisanje β-ćelija ispitaniku može biti istovremen ili uzastopan (pre ili posle) davanju anti-CXCR3 antitela. Primeri agensa za stimulisanje β-ćelija uključuju, ali nisu ograničeni na, jedan ili više od: transplantovanih β-ćelija (autologe, alogene, ili singene), transplantovanih ćelija za proizvodnju insulina (alogene ili singene), DDP4 (referentna sekvenca humanog proteina NP_001926.2) inhibitora, TM4SF20 peptida (referentna sekvenca humanog proteina NP_079071), TMEM27 peptida (referentna sekvenca humanog proteina NP_065716), eksendin 1 ili GLP-1 (referentna sekvenca humanog proteina NP_002045) analoga, gp130 i liganada receptora EGF, i onih objavljenih u paragrafima 8-11 Američke patentne prijave publikacije br.20100130476. Agens za stimulisanje β-ćelija može biti primenjen uz imunosupresiv u ovde objavljenim metodama, ili istovremeno ili uzastopno (pre ili posle). Kao što je ovde objavljeno, agens za stimulisanje β-ćelija, ćelije za proizvodnju insulina i/ili imunosupresiv mogu biti primenjeni putem implantacije uređaja sposobnog za isporuku agensa za stimulisanje β-ćelija, ćelija za proizvodnju insulina i/ili imunosupresiva u ciljno tkivo ili organ.

[0119] Takođe, ovde su objavljene metode za detekciju i/ili kvantifikovanje CXCR3 i/ili ćelija koje eksprimiraju CXCR3 (npr. CXCR3+ T ćelije). Metode mogu da obuhvataju primenu jednog ili više ovde objavljenih anti-CXCR3 antitela za detekciju i/ili kvantifikovanje CXCR3 i/ili ćelija koje eksprimiraju CXCR3. Na primer, jedno ili više antitela može biti dodato uzorku pacijenta (npr. uzorku krvi) i detektovano putem oznake za detekciju, kao što je sekundarno antitelo konjugovano sa signalom za detekciju (npr. fluorescentno sekundarno antitelo za detekciju). Na primer, FACS sortiranje se može koristiti za kvantifikovanje nivoa ćelija koje eksprimiraju CXCR3 u uzorku nakon primarnog i fluorescentnog sekundarnog vezivanja antitela.

[0120] Metode za dijagnozu mogu biti korišćene za postavljanje dijagnoze poremećaja CXCR3 ili poremećaja povezanog sa CXCR3 (npr. dijabetes, T1D). Na primer, poremećaj može biti dijagnostikovan detekcijom prisustva ili odsustva CXCR3 u uzorku pacijenta, ili poređenjem koncentracije CXCR3 u uzorku sa nivoom u jednom ili više referentnih standarda, naznačeno time što odstupanje od nivoa standarda pokazuje prisustvo poremećaja.

[0121] Ovde su takođe objavljeni kompleti koji se sastoje od barem jednog anti-CXCR3 antitela ili fragmenta. Kompleti su korisni za svrhe raznovrsnog ispitivanja, dijagnoza, i lečenja. Na primer, kompleti mogu biti korišćeni za detekciju CXCR3+ T ćelija, ili za lečenje dijabetesa tip I davanjem ispitaniku anti-CXCR3 antitela ili fragmenta koji je obuhvaćen u kompletu. Za svrhe izolovanja i prečišćavanja, komplet može da sadrži antitelo ili fragment povezan sa perlicama (npr., perlice sefaroze). U pojedinim otelotvorenjima, komplet takođe sadrži uputstvo za korišćenje anti-CXCR3 antitela ili fragmenta u svrhe željenog istraživanja, dijagnoze i/ili lečenja.

[0122] U ovoj prijavi, upotreba jednine uključuje množinu, osim ako nije drugačije naznačeno. Pored toga u ovoj prijavi, primena izraza „ili“ znači „i/ili“, osim ako nije drugačije naznačeno. Nadalje, upotreba izraza „uključujući“, kao i drugih oblika, kao što su „uključuje“ i „uključen“ nije ograničavajuća. Smatra se da svaki opseg opisan ovde uključuje krajnje tačke i sve vrednosti između njih.

[0123] Naslovi odeljaka korišćeni ovde su isključivo za organizacione svrhe i ne treba smatrati da su ograničavajući u pogledu opisane teme.

PRIMERI

[0124] Sledeći primeri samo ilustruju, i ni na koji način ne ograničavaju predmetni pronalazak.

Primer 1: Materijali i metode

[0125] Generisanje imunogena. CHO ćelije su transformisane pomoću DNK koja kodira humani CXCR3 pune dužine, i CXCR3 je eksprimiran na površini ćelije („r-CXCR3-CHO ćelije“). Dobijena je CXCR3 sekvenca upotrebljena za transformaciju ćelija, i otvoreni okvir za čitanje CXCR3 je postavljen u ekspresioni vektor pcDNA3.1neo_DEST, i onda transficiran u 300-19 ćelije (Imunogen). Fragment N-terminalnog peptida ekstracelularnog domena CXCR3 (EC domen), sa aminokiselinskom sekvencom MVLEVSDHQVLNDAEVAALLENFSSSYDYGENESDSC, konjugovan je sa KLH preko C terminalnog cisteina, i korišćen kao imunogen. Ćelije koje eksprimiraju CXCR3 održavane su na 37°C pod 5% CO2 u RPMI (Invitrogen, Carlsbad, Kalif.) uz dodatak 10% dijalizovanog seruma goveđeg fetusa (FBS) (Invitrogen). Ćelije su pripremljene za injektovanje zamenom gorepomenutog medijuma za uzgajanje slanim rastvorom u fosfatnom puferu (bez Ca/Mg) (CMF-PBS) uz dodatak 5 mM EDTA, i izdvajanjem ćelija u tom puferu. Izdvojene ćelije su peletirane centrifugiranjem na 500 x g tokom oko 5 minuta, jednom isprane ponovnim suspendovanjem peleta u CMF-PBS i centrifugiranjem kao prethodno, prebrojane, i podešene na odgovarajuću zapreminu (kao što je 5×10<6>ćelija u 0,2 ml) za injektovanje ponovnim suspendovanjem peleta ćelija u CMF-PBS.

[0126] Priprema antitela.

N-terminalne 37 aminokiseline humanog CXCR3 korišćene su za stvaranje mišjih monoklonskih hibridoma za anti-humani CXCR3, i pet klonova antitela (4, 12, 53, 82 i 135) je odabrano za dalju karakterizaciju. N-terminus 37 aminokiselina humanog CXCR3 je 65% homolog sa poravnatim regionom u mišjem CXCR3, i sadrži ostatke važne za vezivanje CXCL9, CXCL10 i CXCL11. BALB/c miševi, starosti oko 6-8 nedelja (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) imunizovani su ćelijama koje eksprimiraju CXCR3 ili ekstracelularni peptid CXCR3. Grupa miševa je supkutano (s.c.) prajmovana 0. dana 1:1 emulzijom KLH-konjugovanog peptida pomešanog sa adjuvansom (TiterMax Gold, Sigma Aldrich, br. T2685-1ML), a zatim je usledilo s.c. pojačanje 3-5 puta u intervalima od 2-3 nedelje 1:1 emulzijom peptida prema adjuvansu, ili intraperitonealno (i.p.) ćelijama u PBS bez adjuvansa, uz pojačavanje dva uzastopna dana pre žrtvovanja i.p. putem, peptidom i/ili ćelijama u PBS, sve bez adjuvansa. Druga grupa miševa je prajmovana i.p.3-5 puta u intervalima od 2-3 nedelje, uz pojačavanje i.p. putem ćelijama u PBS dva uzastopna dana pre žrtvovanja. Za obe grupe miševa, svaka injekcija je sadržala oko 2x10^6 ćelija u zapremini od oko 100 µl.

[0127] Dan nakon poslednje injekcije, miševi su žrtvovani, i slezina je uklonjena i stavljena u oko 10 ml DMEM bez seruma (Gibco) u Petri zdeli. Ćelije Sp2\O mišjeg mijeloma (ATCC CRL-1581) fuzionisane su sa ćelijama slezine iz imunizovanih miševa pomoću 50% (m/m) PEG na osnovu metode koju su dali Kohler i Milstein (Nature, 256:495-7, (1975)). Na kraju postupka, ćelije su ponovo suspendovane u 50 ml ClonaCell-Hy medijuma za regeneraciju hibridoma (StemCell Technologies), prenete u bocu od T75cm<2>i inkubirane tokom 16-24 h na 37°C. Nakon ove inkubacije, ćelije su sakupljene i dodate u 100 ml selekcionog medijuma ClonaCell-HY sa metilcelulozom (StemCell Technologies). Alikvoti ove smeše su preneti u deset posuda sa 100 mm<2>kulture tkiva, i inkubirani 10-14 dana. Hibridomi klonova su preneti iz metilceluloze u tečni medijum, i uzgajani na pločama sa 96 bunarčića, za testove kojima se identifikuju monoklonska antitela specifična za CXCR3.

[0128] Ako nije drugačije naglašeno, reference u ovim primerima na varijantu antitela, kao što je Hu4.1, odnose se na antitelo koje sadrži varijantu teškog lanca i varijantu lakog lanca istog broja (npr., Hu4.1 će sadržati teški lanac 4.1 i laki lanac 4.1). Sve reference na antitela su usklađene sa numeracijom antitela i sparivanjem VH/VK lanca prikazanim u Tabeli 2.

[0129] Životinje. Ženke NOD/LtJ miševa nabavljene su od Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) i čuvane su u uslovima bez patogena. Miševi su podvrgnuti skriningu za glikozuriju pomoću ACCU-CHEK® Compact Plus merača glukoze u krvi (Roche, Indianapolis, IN) punktiranjem repne vene dva puta nedeljno, počevši od 10 nedelja starosti. Miševi su smatrani dijabetičnim kada je glukoza u krvi bila iznad 250 mg/dl tri uzastopna dana. Miševi su praćeni najmanje 100 dana nakon početka lečenja. Sve eksperimente na životinjama odobrio je interni Komitet za brigu o upotrebi životinja (IACUC).

[0130] Injekcije antitela. Kod prevencionih studija, predijabetičnim NOD miševima je injektovano 100 µg antitela intraperitonealno (i.p.) jednom nedeljno tokom 6 nedelja, počevši od 10 nedelja starosti. Kod reversnih studija, životinje su nasumično uključene u terapijske grupe u roku od 1 nedelje pošto su miševi proglašeni dijabetičnim, glukoza u krvi je merena dva puta dnevno, sa najmanje šest sati između očitavanja, i insulin je davan i.p. injekcijom onim miševima koji su tokom trajanja studije imali glukozu u krvi iznad 250 mg/dl. Miševi u terapijskim grupama koje su zadržale nezavisnost od insulina tokom 30 uzastopnih dana smatrani su povraćenim. Pet miševa iz svake grupe je uzeto između petog i šestog tretmana, i sakupljeni su limfoidni organi, krv, koštana srž i pankreas za ćelijsku analizu. Na kraju studije, pankreas je sakupljen i obrađen za histološku i imunohistohemijsku analizu. Antimišje CXCR3 antitelo, klon CXCR3-173 (Uppaluri et al. 2008), i kontrolno IgG antitelo hrčka nabavljeni su od BioLegend (San Diego, CA).

[0131] Analiza sortiranja ćelija na bazi protočne citometrije (FACS). Napravljene su suspenzije pojedinačne ćelije slezine, ingvinalnih limfnih čvorova, limfnih čvorova pankreasa i koštane srži. Pankreas je usitnjen na male komade i inkubiran u kolagenazi D (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) koncentracije 2 mg/ml tokom 30 minuta na 37°C, filtriran kroz ćelijsko sito od 70 mikrona (BD Biosciences, San Jose, CA), i limfociti su odvojeni od tkiva pankreasa pomoću cetrifugiranja sa gradijentom gustine. Ćelije su obojene pomoću APC obeleženog anti-mišjeg CD25, FITC obeleženog anti-mišjeg CD4 i PE obeleženog antimišjeg Foxp3 (eBiosciences, San Diego, CA) za regulatorne T ćelije (T reg), PerCP obeleženog anti-mišjeg CD8α, PE obeleženog anti-mišjeg CD44, APC obeleženog antimišjeg CD62L i PeCy7 obeleženog anti-mišjeg CXCR3 za aktivirane/memorijske T ćelije, i FITC obeleženog anti-mišjeg CD94, PerCP obeleženog anti-mišjeg CD4, APC-obeleženog anti-mišjeg B220, PeCy7 obeleženog anti-mišjeg CD11c, Pacifik plavim obeleženog antimišjeg CD11b, i PE obeleženog anti-mišjeg NKp46 za B ćelije, mijeloidne ćelije, dendritske ćelije, NK ćelije i NKT ćelije. Ćelije su inkubirane 30 min na 4°C, nakon blokiranja antimišjim CD16/32 tokom 20 min na ledu. Kod bojenja T reg, izvršeno je površinsko bojenje, ćelije su isprane, fiksirane i permeabilizovane u Cytofix/Perm puferu (eBiosciences), a zatim obojene anti-mišjim Foxp3 antitelom tokom 30 min na ledu. Nakon bojenja, ćelije su dva puta isprane, fiksirane u paraformaldehidu i određene na citometru LSRII, i podaci su analizirani pomoću Flow Jo softvera (Treestar, Ashland, OR). Sva antitela su nabavljena od BD Biosciences, ako nije drugačije naglašeno.

[0132] Test hemotakse. Ispitivanje hemotakse je izvršeno na pločama sa 24 bunarčića (Costar) na kojima su permeabilne podloge za trans-bunarčiće, sa membranom od 5µm. CXCR3- transficirane 300.19 ćelije su ubačene u uloške za trans-bunarčiće, pri koncentraciji od 1 x 10<6>ćelija u 2,5% termički inaktiviranom serumu goveđeg fetusa u RPM1640 (ukupna zapremina 0,2 ml). Čist medijum, ili medijum uz dodatak rekombinovanog hemokina 300 ng/ml CXCL9 (MIG), 100 ng/ml CXCL10 (IP-10) ili 100 ng/ml CXCL11 (I-TAC) stavljen je u donji odeljak (0,6 ml), i ulošci za trans-bunarčiće sa ćelijama šaržirani su u donji odeljak. Ploče su inkubirane između 4-5 sati u vlažnom inkubatoru sa 5% CO2na 37ºC. Nakon perioda inkubacije, ulošci za trans-bunarčiće su uklonjeni, i ukupni medijum u donjem odeljku je spojen, i ćelije peletirane centrifugiranjem 5 min na 1200 o/min. Medijum je usisan, a ćelije obojene koristeći kalcein AM (finalna koncentracija 10 µg/ml) tokom 30 minuta na 37ºC. Ćelije su peletirane i isprane, dodat je medijum (0,1 ml), i suspenzija je preneta na crne ploče providnog dna sa 96 bunarčića. Ploče su pulsno centrifugirane na 1200 o/min da se ćelije istalože, i merena je fluorescencija na 490/520 nm na uređaju Flexstation. Svi uslovi su ispitani sa tri ponavljanja. Dobijeni podaci su izraženi kao srednje relativne jedinice fluorescencije (RFU) migriranih ćelija. Vidite sl.14A-C i sl.15A-C.

[0133] Kod hemotakse sa blokadom CXCR3, CXCR3 transficirane 300.19 ćelije su prethodno tretirane različitim količinama blokirajućeg antitela ili kontrolnog IgG tokom 20-30 minuta na 37ºC pre primene u ispitivanju hemotakse. Antitelo nije isprano, nego je bilo prisutno tokom inkubacije u testu.

[0134] Test mobilizacije kalcijuma pomoću FLIPR. Ćelije bubrega humanog embriona 293 (HEK) koje eksprimiraju hCXCR3 izdvojene su sa konfluencijom od 80% tretitanjem sa PBS 2mM EDTA. Ćelije su suspendovane u HEK-SFM medijumu bez seruma pri gustini od 1 x 10<6>ćelija/ml.15 µl (15.000 ćelija) iz suspenzije raspodeljeno je u svaki bunarčić ploče sa 384 bunarčića. Ćelije su tretirane bojom tokom 30 min na sobnoj temperaturi, dodatkom 15 µl rekonstituisane boje FLIPR kalcijum 4. Klonovi anti-humanog antitela CXCR3 i kontrole izotipa su serijski razblaženi (trostruko) u HBSS 20 mM HEPES 1% BSA, da se dobije 10 ispitivanih koncentracija po klonu. Svaka test koncentracija je ispitana dva puta (n=2) na istoj ploči.15 µl ispitivane koncentracije dodato je u ćelije u svakom bunarčiću, i ploča je inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi. Fiksna koncentracija CXCL11 (R & D Systems) koja predstavlja EC80 za izazivanje intracelularne mobilizacije kalcijuma dodata je na FLIPR u svaki bunarčić, i praćena je promena fluorescencije tokom vremena. Maksimalni odgovor svakog bunarčića je normalizovan prema baznoj liniji, i podaci su nakon određivanja prosečne vrednosti ubačeni u jednačinu sa četiri parametra pomoću GraphPad Prism, i određen je IC50 za svaki klon. Videti sl.14D i sl.21.

[0135] Biacore analiza afiniteta. Biacore priprema površine. Afiniteti vezivanja klonova 4, 12, 53, 82 i 135 mišjeg α-humanog CXCR3 hibridoma antitela prema humanom CXCR3 peptidu izračunati su pomoću testa Biacore T100 kinetika/afinitet. Senzorski čip Biacore CM5 serija S (GE br. BR-1006-68) imobilisan je zečjim anti-mišjim-Fc (RAM-Fc) antitelom za snimanje (GE br. BR-1008-38) pomoću standardnog programa za vezivanje amina.

Površina čipa sa karboksimetil dekstranom aktivirana je pomoću smeše 1:10,1 M N-hidroksisukcinimida (NHS) i 0,4 M N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)karbodiimida hidrohlorida (EDC), omogućavajući da površina veže reaktivne amino grupe na antitelu za snimanje. Nakon imobilizacije antitela, reaktivna površina senzorskog čipa je neutralisana pomoću 1M etanolamin hidrohlorida/NaOH pH 8,5. Imobilizacijom je dobijeno 8.000 RU antitela za snimanje RAM-Fc na jednoj protočnoj ćeliji. Druga prazna protočna ćelija je korišćena kao površina za referentno odbijanje tokom analize podataka.

[0136] Uslovi Biacore testa. Temperatura komore za uzorke Biacore T100 instrumenta i temperature tokom testa podešene su na 4ºC, odnosno 25ºC. Mišja anti-hCXCR3 antitela su razblažena na 500 nM u HBS-EP+ tekućem puferu (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,05% P20 surfaktansa, 3mM EDTA, pH 7,4), i snimljena su korišćenjem injektovanja od trideset sekundi na 10 µl/min. Pomoću ovih uslova je dobijeno ∼1,200 RU stabilnog snimljenog ispitivanog klona svakog mišjeg anti-hCXCR3. hCXCR3 peptidi su razblaženi do koncentracija od 200, 100, 50, 25, 12,5 i 0 nM u HBS-EP+. U svakom ciklusu testa, peptidi su injektovani tokom pet minuta pri protoku od 50 µl/min radi merenja asocijacije, a zatim ispirani u HBS-EP+ tokom deset minuta pri protoku od 50 µl/min radi merenja disocijacije. Snimljena površina (RAM-Fc) regenerisana je između ciklusa testa korišćenjem 10 mM glicin-HCl pH 1,7 pri 50 µl/min tokom tri minuta. Analiza je izvršena na Biacore T100 softveru v2.0 za određivanje kinetike (GE Healthcare). Senzorgrami su uneti u 1:1 model vezivanja uz odbijanje referentne protočne ćelije i koncentracije 0 nM (dvostruko referentno odbijanje).

[0137] Biacore test za ceo receptor. Humani CXCR3 receptor protein pune dužine sa C-terminalnim 6xHis i HPC4 oznakom eksprimiran je u Sf9 ćelijama insekta sa vektorom bakulovirusa. Receptor protein je zatim prečišćen putem Ni-NTA i HPC4 afinitetnih prečišćavanja. Finalnom proizvodu je zamenjen pufer u 10 mM HEPES, 300 mM NaCl, 0,5% n-dodecil β-D-maltopiranozid i 5% glicerol. Receptor protein je uhvaćen na NTA čipovima putem Ni-heliranja, i dalje je stabilizovan kuplovanjem amina pomoću 1:10 razblažene 1:1 smeše 0,1 M N-hidroksisukcinimida (NHS) i 0,4M N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidrohlorida (EDC). Stabilizovana površina receptora je ispitana na aktivnost vezivanja liganda injektovanjem 20 nM liganada hCXCL10 i hCXCL11. Za analizu kinetike, humani CXCR3 ligandi (hCXCL9, hCXCL10 i hCXCL11) razblaženi su do koncentracija od 20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,6125, 0,3125 i 0 nM u HBS-EP+. Anti-CXCR3 antitela su razblažena do koncentracija od 80, 40, 20, 10, 5, 2,5, 1,25 i 0 nM u HBS-EP+. Analit je injektovan tokom pet minuta pri protoku od 50 µl/min radi merenja asocijacije, a zatim ispiran u HBS-EP+ tokom deset minuta pri protoku od 50 µl/min radi merenja disocijacije. Površina receptora je regenerisana između ciklusa testa korišćenjem 10 mM glicin-HCl pH 1,7 pri 50 µl/min tokom 1 minuta. Analiza je izvršena na Biacore T100 softveru v2.0 za određivanje kinetike (GE Healthcare). Senzorgrami su uneti u 1:1 model vezivanja uz odbijanje referentne protočne ćelije i koncentracije 0 nM (dvostruko referentno odbijanje).

[0138] Ispitivanje tolerancije na glukozu. Veče pre testa opterećenja na glukozu, glukoza u krvi praćena je bez gladovanja, i tretman dijabetičnih životinja insulinom je uskraćen. Miševi su gladovali 12 sati pre i.p. injektovanja D-glukoze (20%; Sigma), 2 mg/g telesne težine. Glukoza u krvi je merena pre injektovanja, kao i 15, 30, 60 i 120 minuta posle injektovanja.

Primer 2: Karakterizacija NOD miševa

[0139] Reprezentativne sekcije pankreasa 6 do 10 nedelja starih predijabetičnih ženki NOD miševa i novih dijabetičnih ženki NOD miševa ubačene u parafin obojene su za insulin, CXCL10, i T ćelijski marker CD3. Sl.1. Ekspresija CXCL10 je detektovana u pankreasu NOD miševa u ostrvcima okruženim infiltrirajućim ćelijama (strelice u središnjoj koloni sl.

1). Stariji predijabetični i novi dijabetični miševi imali su uočljivo povećanje infiltracije T ćelija ostrvaca (sl. 1, desna kolona) i smanjenje proizvodnje insulina u ostrvcima (sl.1, leva kolona).

[0140] Da bi se dalje odredilo da li su CXCR3+ T ćelije prisutne u pankreasu NOD miševa, izvršena je analiza protočne citometrije na tkivu pankreasa sakupljenom od ženki NOD miševa sa novonastalim dijabetesom. Sl.2. Ekspresija CXCR3 je određena na CD4+/TCR+ i CD8+/TCR+ T ćelijama. Bojenje antitelom za kontrolu izotipa prikazano je osenčenom krivom. Protočna citometrija je izvršena na suspenziji pojedinačne ćelije objedinjenih tkiva pankreasa sakupljenih od nekoliko miševa. Podaci ukazuju da su CXCR3+ citotoksične i pomoćne T ćelije prisutne u pankreasu NOD miševa.

Primer 3: Profilaktički tretman NOD miševa anti-CXCR3 antitelom

[0141] Predijabetične ženke NOD miševa su tokom šest nedelja tretirane jednom nedeljno sa 100 µg anti-mišjeg CXCR3 antitela hrčka (klon CXCR3-173, nabavljen od BioLegend, San Diego, CA), ili kontrolnim IgG hrčka ili PBS-om, počevši od 10 nedelja starosti. Glukoza u krvi praćena je dva puta nedeljno, i životinja je smatrana dijabetičnom i podvrgnuta eutanaziji kada je imala tri uzastopna rezultata glukoze u krvi iznad 250 mg/dl. Sl.3 prikazuje procenat miševa kod kojih se razvio dijabetes tokom vremena za svaku tretiranu grupu. Svaka linija predstavlja kombinovane rezultate od deset miševa po grupi. Prikazani su rezultati dve nezavisne studije (sl.3A i 3B). Dijagrami ilustruju da je profilaktički tretman anti-CXCR3 antitelom sprečio razvoj dijabetesa kod predijabetičnih ženki NOD miševa.

[0142] Da bi se dalje procenili efekti primene profilaktičkog anti-CXCR3 antitela, reprezentativne sekcije pankreasa ženki NOD miševa tretiranih anti-CXCR3 antitelom obojene su za insulin (sl.4, levi pano), CD3 i Foxp3 (sl.4, centralni i desni pano). Desni pano na sl.4 je uvećana slika sekcije prikazane na centralnom panou. Tkivo pankreasa je sakupljeno od miševa na kraju studije (26 nedelja starosti). Sl.4 pokazuje da su ostrvca pozitivna na insulin prisutna kod NOD miševa tretiranih anti-CXCR3 antitelom, dok najveći deo T ćelija okružuje ostrvca i ne prodire u njih.

Primer 4: Reverzibilnost novonastalog dijabetesa kod NOD miševa

[0143] Ženke miševa sa tri uzastopna rezultata glukoze u krvi iznad 250 mg/dl smatrane su dijabetičnim, i nasumično su uključene u terapijske grupe. Lečenje je počelo u roku od nedelju dana od uključivanja. Miševi su tretirani pomoću PBS, anti-mišjeg CXCR3 antitela (100 µg davano intraperitonealno, klon CXCR3-173) ili kontrolnog IgG (100 µg davano i.p.) jednom nedeljno tokom šest nedelja, ili mišjim anti-timocitnim globulinom (mATG; 500 µg davano i.p.) 0. i 4. dana. Nakon uključivanja, glukoza u krvi je merena ujutru i uveče (sa najmanje šest sati razmaka), i insulin je davan i.p. injekcijom samo miševima čija glukoza u krvi je bila iznad 250 mg/dl. Prikazane su dnevne jutarnje vrednosti glukoze pojedinačnih miševa (sl. 5). Objedinjeni su podaci iz četiri nezavisne studije sa 8-10 miševa po grupi po studiji. Podaci prikazuju reverzibilnost novonastalog dijabetesa kod NOD miševa nakon tretmana anti-CXCR3 antitelom.

[0144] Da bi se procenile promene u podskupovima T ćelija u pankreasu miševa tretiranih anti-CXCR3 antitelom, suspenzije pojedinačne ćelije pankreasa četiri miša po tretiranoj grupi (PBS, anti-mišji CXCR3, kontrolni IgG ili mATG tretirani miševi) su objedinjene, obojene za T ćelije i analizirane protočnom citometrijom. Tkivo pankreasa je sakupljeno nekoliko dana posle pete doze tretmana pomoću PBS, anti-mišjeg CXCR3 ili kontrolnog IgG, i od miševa odgovarajuće starosti tretiranih pomoću mATG. Procenat CD4+ i CD8+ T ćelija u suspenziji prikazan je na sl.6A. Sl. 6B prikazuje ekspresiju CD44 i CD62L na CD4+ T ćelijama u pankreasu miševa tretiranih pomoću PBS (levo), kontrolnog IgG (sredina), i anti-mišjeg CXCR3 antitela (desno). Procenat ćelija u gejtu 1 (G1; CD44<hi>CD62L<lo>) naznačen je za svaku terapijsku grupu (67,3% za PBS, 67,1% za kontrolni IgG i 30,4% za anti-CXCR3 tretman). Sl. 6C prikazuje ekspresiju CXCR3 na CD4+ T ćelijama na gejtu 1 (G1) ili gejtu 2 (G2), kao što je definisano na sl.6B, u poređenju sa ćelijama obojenim antitelom za kontrolu izotipa i gejtovanim na limfocitima.

[0145] Da bi se procenilo da li su ostrvca pozitivna na insulin prisutna kod NOD miševa kod kojih je postignuta reverzibilnost anti-CXCR3 tretmanom, pripremljene su sekcije pankreasa ubačene u parafin, od ženki NOD miševa tretiranih kontrolnim IgG (levi panoi), anti-mišjim CXCR3 antitelom (srednji panoi) ili mišjim ATG (desni panoi), i obojene za insulin (gornji red) ili kombinovano obojene za CD3 i Foxp3 (donji red). Pogledajte sl.7. Tkivo pankreasa je sakupljeno od miševa na kraju studije (oko 100 dana posle uključivanja). Obojene sekcije su pokazale da su ostrvca pozitivna na insulin prisutna kod NOD miševa kod kojih je postignuta reverzibilnost pomoću tretmana sa anti-CXCR3, i da T ćelije okružuju ostrvca, ali samo malobrojne prodiru u njih.

[0146] Da bi se odredio odgovor na opterećenje glukozom, izveden je test tolerancije na glukozu. Sl.8. Ženke nedijabetičnih NOD miševa odgovarajuće starosti (sl. 8A), dijabetičnih NOD miševa tretiranih PBS-om (sl.8B), dijabetičnih NOD miševa kod kojih je postignuta reverzibilnost pomoću tretmana sa anti-CXCR3 (sl.8C), i dijabetičnih NOD miševa tretiranih sa IgG (sl.8D) gladovale su preko noći, a zatim su dobile opterećenje glukozom putem i.p. injekcije. Glukoza u krvi je merena pre (vreme 0) i posle opterećenja glukozom u naznačenim vremenima. Prikazani su reprezentativni podaci za 4-5 miševa po tretiranoj grupi. Podaci ilustruju da je tretman sa anti-CXCR3 antitelom poboljšao toleranciju na glukozu nakon gladovanja 100 dana posle uključivanja.

Primer 5: Adoptivni transfer T ćelija

[0147] Da bi se procenila sposobnost T ćelija iz NOD miševa tretiranih anti-CXCR3 antitelom (klon CXCR3-173) i prikazala remisija bolesti za indukovanje dijabetesa kod životinja primalaca, izolovane CD4+ i CD8+ T ćelije su adoptivno prenete u primaoce NOD.scid (negojazni dijabetični - teška kombinovana imunodeficijencija) miševe putem intravenske injekcije. Sl.9 prikazuje procenat nedijabetičnih miševa tokom vremena nakon adoptivnog transfera izolovanih CD4+ i CD8+ T ćelija iz dijabetičnih miševa tretiranih pomoću PBS ili kontrolnog IgG, ili miševa u remisiji bolesti nakon tretmana pomoću mišjeg ATG ili anti-mišjeg CXCR3 antitela. CD4+ i CD8+ T ćelije su izolovane iz slezine, limfnih čvorova pankreasa, i ingvinalnih limfnih čvorova sakupljenih 80-90 dana nakon uključivanja od ženki NOD miševa u različitim tretiranim grupama. CD4+ i CD8+ T ćelije su objedinjene, i ukupno 8 miliona ćelija je adoptivno preneto u NOD.Scid primaoce, i razvoj dijabetesa je praćen dvonedeljnim merenjem glukoze u krvi. Svaka linija na sl. 9 predstavlja kombinovane podatke od pet miševa po grupi. Prikazane su dve nezavisne studije (sl. 9A i 9B). Izolovane T ćelije iz miševa tretiranih anti-CXCR3 antitelom pokazuju odloženi prenos bolesti.

[0148] Izolovane donorske T ćelije su dalje okarakterisane. Sl.10A prikazuje procenat ukupnih CD4+ i CD8+ T ćelija (levi pano) u donorskim T ćelijama izolovanim iz miševa tretiranih pomoću PBS, anti-mišjeg CXCR3 antitela, kontrolnog IgG, ili mišjeg ATG, kao što je opisano u prethodnom paragrafu. Desni panoi sl.10A prikazuju procenat efektorskih i centralnih memorijskih T ćelija u podskupu T ćelija koje su CD4+ (gornji pano) i CD8+ (donji pano) za svaku suspenziju donorskih ćelija, kao što je definisano ekspresijom CD44 i CD62L. Izolovane objedinjene CD4+ i CD8+ T ćelije obojene su za CD44 i CD62L ekspresiju pre transfera, prikupljeni su podaci sa protočnog citometra i analizirani. Takođe je određen procenat regulatornih T ćelija u objedinjenim izolovanim donorskim T ćelijama. Sl.

10B prikazuje procenat regulatornih T ćelija za svaku terapijsku grupu, kao što je definisano ekspresijom CD4 i CD25, ili CD4, CD25 i intracelularnom ekspresijom Foxp3. Slika 10C prikazuje procenat CD8+ (levi pano) i CD4+ (desni pano) T ćelija u donorskim ćelijama koje takođe eksprimiraju CXCR3. Podaci pokazuju da je smanjen procenat CXCR3+ T ćelija u donorskim ćelijama iz miševa kod kojih se javila reverzibilnost pomoću tretmana anti-CXCR3 antitelom.

[0149] Efikasnost tretmana pomoću CXCR3 nakon adoptivnog transfera OT-1 CD8+ donorskih T ćelija određena je pomoću RIP-OVA modela dijabetesa tip 1. RIP-OVA miševi su transgenski miševi, gde je transgen koji kodira protein ovalbumina (OVA) pod uticajem promotera insulina pacova (RIP) uveden u mišji genom, i dovodi do ekspresije membranske forme ovalbumina u β ćelijama ostrvaca. Osnovni soj miševa je C57BL/6, i kod RIP-OVA miševa dijabetes se ne razvija spontano. RIP-OVA miševi, poznati i kao C57BL/6-Tg(lns2-TFRC/OVA)296Wehi/WehiJ, nabavljeni su od Jackson Laboratory. Kod ovih miševa, dijabetes se razvija nakon adoptivnog transfera ovalbumin-specifičnih CD8+ T ćelija iz OT-1 TCR (receptora T ćelija) transgenskih miševa (Kurts et al. J Exp Med 184: 923-930) nabavljenih od Jackson Laboratory. OT-1 miševi su sadržali transgenske inserte za mišje gene TCRa-V2 i TCRb-V5 (Hogquist et al. Cell 76:17-27). Transgeni TCR prepoznaje ostatke ovalbumina u kontekstu MHCl H2K<b>proteina. Više od 95% CD8+ T ćelija u OT-1 miševima eksprimira transgeni TCR, prepoznaje peptid ovalbumina i aktivira se njime.

[0150] Sl.11 prikazuje procenat nedijabetičnih miševa tokom vremena nakon adoptivnog transfera OT-1 CD8+ T ćelija u RIP-OVA miševe primaoce koji nisu tretirani, koji su tretirani anti-mišjim CXCR3 antitelom, ili su tretirani kontrolnim IgG. Tretman (100 µg i.p.) je počeo 1 dan (studija 1 i studija 2) ili 7 dana (studija 2) nakon adoptivnog transfera, i davan je dva puta nedeljno tokom 3 nedelje. Svaka linija predstavlja kombinovane podatke od pet miševa po grupi. Rezultati dve studije prikazani su na sl.11A i 11B. Podaci pokazuju da lečenje anti-CXCR3 antitelom štiti miševe od razvoja dijabetesa u modelu RIP-OVA.

[0151] Sl.12 daje dodatne podatke koji karakterišu efikasnost različitih tretmana nakon adoptivnog transfera OT-1 T ćelija u RIP-OVA miševe primaoce. Slika 12A prikazuje ekspresiju CXCR3 na donorskim T ćelijama analiziranu protočnom citometrijom pre adoptivnog transfera u RIP-OVA primaoce. Bojenje antitelom za kontrolu izotipa prikazano je osenčenom krivom. Sl.12B prikazuje procenat donorskih ćelija u krvi, slezini i limfnim čvorovima pankreasa (pLN) u naznačenim vremenima nakon adoptivnog transfera OT-1 T ćelija u RIP-OVA miševe primaoce tretirane anti-mišjim CXCR3 antitelom ili kontrolnim IgG. Tretman antitelom (100 µg i.p.) započet je jedan dan nakon transfera T ćelija, i davan je dva puta nedeljno tokom dve nedelje. Svaka tačka prikazuje podatke za pojedinačnog miša. Sl. 12C prikazuje broj donorskih ćelija u krvi, slezini i limfnim čvorovima pankreasa (pLN) koje su nastale kao odgovor na stimulaciju auto-antigenom (OVA) kod RIP-OVA miševa primalaca tretiranih anti-mišjim CXCR3 antitelom ili kontrolnim IgG u naznačenim vremenima nakon adoptivnog transfera. Tretman antitelom (100 µg i.p.) započet je jedan dan nakon transfera OT-1 T ćelija, i davan je dva puta nedeljno tokom dve nedelje. Svaka tačka prikazuje podatke za pojedinačnog miša. Sl.12D prikazuje procenat donorskih ćelija koje eksprimiraju CXCR3 u krvi, slezini i limfnim čvorovima pankreasa (pLN) u naznačenim vremenima nakon adoptivnog transfera OT-1 T ćelija u RIP-OVA miševe primaoce tretirane anti-mišjim CXCR3 antitelom ili kontrolnim IgG. Tretman antitelom (100 µg i.p.) započet je jedan dan nakon transfera OT-1 T ćelija, i davan je dva puta nedeljno tokom dve nedelje. Svaka tačka prikazuje podatke za pojedinačnog miša. Tretman anti-CXCR3 antitelom doveo je do smanjenja procenta CXCR3+ T ćelija kod RIP-OVA miševa.

[0152] Slika 13 prikazuje reprezentativne sekcije pankreasa ubačene u parafin, iz RIP-OVA nelečenih miševa primalaca, obojene za insulin (sl.13A) ili CD3 (sl.13B), ili lečenih pomoću anti-mišjeg CXCR3 antitela, obojene za insulin (sl.13C) ili CD3 (sl.13D). Anti-CXCR3 tretman (100 µg i.p.) započet je jedan dan nakon transfera OT-1 T ćelija, i davan je dva puta nedeljno tokom 3 nedelje. Tkivo pankreasa je sakupljeno na kraju studije (oko 60 dana posle transfera T ćelija). Sekcije pokazuju da nema infiltracije T ćelija kod RIP-OVA miševa tretiranih anti-mišjim CXCR3 antitelom.

Primer 6: Ocena klonova anti-humanih CXCR3 antitela

[0153] Klonovi anti-humanog antitela CXCR3 Cl 4, 12, 53, 82 i 135 ocenjeni su u pogledu efekta na hemotaksu CXCR3 i mobilizaciju kalcijuma, korišćenjem metoda opisanih iznad, u odeljku Materijali i metode (Primer 1). Za test hemotakse, humane CXCR3 transficirane 300.19 ćelije prethodno su inkubirane samo u medijumu, ili sa različitim koncentracijama antitela, kao što pokazuju slike 14A-C, a zatim su dodate u test za hemotaksu. Slika 14A-C pokazuje da je hemotaksa posredstvom CXCR3 u CXCL 11 inhibirana klonovima Cl 4, 12, 53, 82 i 135. Klon 2 na slici 14 identičan je sa klonom 4.

[0154] Kod testa fluksa kalcijuma, humane CXCR3-transficirane HEK ćelije su prethodno inkubirane sa različitim koncentracijama antitela pre dodavanja u FLIPR prema metodama opisanim iznad, u odeljku Materijali i metode (Primer 1). Koncentracija antitela potrebna za inhibiranje mobilizacije kalcijuma za 50% za svako antitelo prikazana je na sl.14D. Slika 14D pokazuje da je mobilizacija kalcijuma posredstvom CXCR3 u CXCL 11 inhibirana klonovima Cl 4, 12, 53 i 135.

[0155] Da bi se dodatno ocenio efekat klonova 4, 12, 53, 82 i 135 na hemotaksu, hCXCR3-transficirane ćelije 300.19 prethodno su inkubirane samo u medijumu, ili sa 50 µg/ml antitela, pre dodavanja u test za hemotaksu, i ocenjena je migracija prema CXCL9 (sl. 15A), CXCL10 (sl. 15B) i CXCL11 (sl.15C). Podaci pokazuju da klonovi 4, 12, 53, 82 i 135 inhibiraju migraciju prema CXCL10 i CXCL11, i delimično inhibiraju migraciju prema CXCL9.

[0156] Da bi se ocenila specifičnost klonova 4, 12, 53, 82 i 135, antitela su ispitana na vezivanje za druge receptore hemokina. Ćelije 300.19 su transficirane humanim CXCR1, CXCR5, CXCR2, CXCR4 ili CCR5, i vezivanje antitela je analizirano inkubacijom sa klonovima anti-humanog CXCR3 antitela, a zatim bojenjem sekundarnog antitela i protočnom citometrijom. Primena samo sekundarnog antitela je korišćena kao negativna kontrola. Ćelije 300.19 transficirane humanim CXCR3 korišćene su kao pozitivna kontrola za bojenje klonovima. Sl.16 prikazuje histograme vezivanja antitela za ćelije koje eksprimiraju različite receptore hemokina, pokazuje da klonovi 4, 12, 53, 82 i 135 ne vezuju druge receptore hemokina, i specifični su za CXCR3.

[0157] U testu vezivanja receptora hemokina korišćene su procedure za standardnu protočnu citometriju. Ukratko, ćelijske linije su sakupljene tretiranjem versenom, i svaka ćelijska linija je podeljena u sedam uzoraka. Svaki uzorak je inkubiran na ledu sa jednim primarnim antitelom (5 µg/ml), a zatim obojen FITC-konjugovanim sekundarnim antitelom radi detekcije vezanog primarnog antitela. Kao negativna kontrola, ćelije su obojene samo sekundarnim antitelom (bez inkubacije sa primarnim antitelom). Primarno antitelo je bio klon anti-humanog CXCR3 antitela, ili klon anti-humanog CXCR3 kontrolnog antitela 1C6. Posle bojenja, podaci o ćelijama su sakupljeni na protočnom citometru, i analizirani pomoću softvera FlowJo. Svaka linija na sl.16 predstavlja pojedinačni uzorak ćelija obojenih jednim primarnim antitelom i sekundarnim antitelom, ili samo sekundarnim antitelom.

[0158] Afinitet (Ka) i povratna brzina (Kd) klonova 4, 12, 53, 82 i 135 analizirani su pomoću Biacore testa prema gore opisanim metodama (Primer 1). Rezultati su sažeti u tabeli 4.

Tabela 4

Primer 7: Mapiranje epitopa

[0159] Skraćeni, biotinilovani humani CXCR3 peptidi (N-terminalni fragmenti 16 aminokiselina) N-terminalnog ekstraćelijskog domena CXCR3 su korišćeni da se odrede epitopi za klonove 4, 12, 53, 82 i 135. Stvoren je niz fragmenata supstituisanih alaninom (videti tabelu 5 u nastavku, supstitucija alanina je podebljana), i oni su biotinilovani.

Mapiranje epitopa je procenjeno Octet® (ForteBio, Menlo Park, CA) i Biacore™ (GE Healthcare) analizama.

[0160] Kod Octet analize, peptidi su ponovo suspendovani u 80% DMSO i razblaženi do 10 µg/ml u PBS-u. Klonovi antitela 4, 12, 53, 82, 135 i komercijalni klon 1C6 (BD Biosciences) su razblaženi do 120 nM u PBS-u. Kinetički test je izvršen na formatu sa 96 bunarčića sa 300 µl/bunarčiću na sistemu Octet QK (ForteBio). Svaka test ploča je imala N-terminalno biotinilovani WT hCXCR3 ECD peptid pune dužine (Abgent) kao pozitivnu kontrolu, kao i PBS pufer kao blanko za referentno oduzimanje. Octet streptavidin biosenzori (ForteBio) bili su prethodno potopljeni u PBS tokom najmanje pet minuta pre početka testa. Biosenzori su prvo potopljeni u PBS tokom pet minuta bez mućkanja da bi se dobila bazna vrednost. Za sve preostale korake, brzina mućkanja je bila 1000 obrtaja/min. Biosenzori su umočeni u rastvor peptida tokom pet minuta, kako bi se naneli peptidi. Izvršen je još jedan korak za dobijanje bazne vrednosti u PBS-u tokom pet minuta. Biosenzori su zatim umočeni u rastvore antitela tokom deset minuta, kako bi se izmerila asocijacija. Konačno, biosenzori su prebačeni u PBS tokom 15 minuta radi disocijacije. Senzorgrami su analizirani pomoću Octet Data Analysis v7.0. Aktivnost vezivanja je izražena kao procenat maksimalnog nivoa odgovora svakog antitela u poređenju sa divljim tipom peptida hCXCR3 pune dužine.

[0161] Relativni nivoi odgovora su zabeleženi u toplotnoj mapi epitopa. Maksimalni odgovor senzorgrama na peptid divljeg tipa hCXCR3 ECD bio je u opsegu između 4-8 nm. Svaki ispitani klon je imao jedinstveni epitop. Nijedan od testiranih mutanata nije u potpunosti prekinuo vezivanje klona 1C6. Ostatak valina na položaju 10 i aspartata na položaju 13 odigrali su ulogu u vezivanju svih ispitivanih antitela. Antitela 12 i 1C6 imala su najviše N-terminalnih epitopa, pri čemu su mutacije valina na položaju 5 uticale na aktivnost oba. Antitelo 82 je imalo najviše C-terminalnih epitopa, i smanjenje vezujuće aktivnosti počelo je sa položajem 9 glutamina. Na osnovu ovih podataka, granice epitopa aminokiselina sekvence CXCR3 su date u nastavku za svako antitelo: Cl 4: aminokiseline 7-13; Cl 12: aminokiseline 5-13; Cl 53: aminokiseline 7-13; Cl 82: aminokiseline 9-15; Cl 135: aminokiseline 7-13; i klon 1C6: aminokiseline 5-13.

[0162] Za Biacore analizu, peptidi su razblaženi do 10 ng/ml u HBS-EP+ tekućem puferu (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% polisorbat 20). Koristeći Biacore T100™, peptidi su injektovani preko CM5-SA (GE br. BR-1005-31) čipova brzinom od 5 µl/min, dok nije ostvareno stabilnih 20 jedinica odgovora (response unit (RU)) za snimanje po protočnoj ćeliji. Protočna ćelija 1 je ostala prazna na svakom čipu radi referentnog oduzimanja. Peptid divljeg tipa 37AA hCXCR3 je uključen na jednu protočnu ćeliju svakog čipa kao pozitivna kontrola. Mišja anti-hCXCR3 antitela 4, 12, 53, 82 i 135 su razblažena do 50, 25, 12,5, 6,25 i 3,125 nM u HBS-EP+. U svakom ciklusu, antitela su injektovana tokom tri minuta i sa protokom od 50 µl/min da bi se izmerila asocijacija, nakon čega su sledila tri minuta pufera pri 50 µl/min kako bi se izmerila disocijacija. Površina peptida je regenerisana između ciklusa koristeći 10 mM glicin-HCl pufer pH 2,0 pri 50 µl/min tokom šezdeset sekundi. Senzorgrami su ubačeni u 1:1 model vezivanja i analizirani oduzimanjem dvostruke reference u BiaEvaluation v2.0.1, i snimljeni na biosenzorima streptavidina. Tipični nivoi odgovora su bili u opsegu između 0-500 RU, i određene su granične vrednosti za „jak“, „umeren“ i „slab“ odgovor vezivanja. Zabeleženi su relativni nivoi odgovora, kako bi se napravila mapa epitopa. Rangirane su povratne brzine, i peptidi koji su dali velike vrednosti Kd (veće od 0,001 s<-1>) su takođe zabeleženi.

Tabela 5

[0163] Sva antitela su se vezala za hCXCR3 divljeg tipa, i unutar prvih 16AA sekvence hCXCR3. Podaci za vezivanje su prikazani u Tabeli 6 za klonove 4, 12, 53, 82 i 135, i odgovarajuća mapa koja pokazuje minimalne granice epitopa potrebnih za vezujuću aktivnost za svaki klon antitela prikazana je na sl.18, pri čemu su važni ostaci označeni sa X. Svi epitopi antitela su mapirani u okviru ostataka 6-15 humane sekvence CXCR3, regiona koji učestvuje u vezivanju CXCL10 i CXCL11. Aminokiseline u okviru epitopa određene su detekcijom smanjenja odgovora vezivanja nakon supstitucije alanina na datom položaju u fragmentu peptida CXCR3. Klonovi 53 i 135 su imali najsličnije epitope. Klonovi 4 i 12 su imali najviše N-terminalni epitop (uticaj na snagu vezivanja počevši od valina na položaju pet). Klon 82 je imao najviše C-terminalni epitop, i smanjenje aktivnosti vezivanja počelo je sa glutaminom na položaju 9. Aspartat na poziciji 7 u CXCR3 je bio potreban za sve klonove, osim za 82. I valin na položaju deset i aspartat na položaju trinaest u CXCR3 su imali ulogu u vezivanju svih klonova. Nije bilo razlike u epitopima između mišjih, himernih i humanizovanih verzija svih pet klonova.

Tabela 6

Primer 8: Ocena anti-humanih klonova CXCR3

[0164] Generisane su četiri varijante (himerna, humanizovana 1 (Hu1), Hu2 i Hu3) za svaki od pet anti-CXCR3 klonova (klonovi 4, 12, 53, 82 i 135).20. Sve himerne varijante su proizvedene „objedinjenom ekspresijom“ za in vivo studije na životinjskim modelima. CHO-DXB11 ćelije (Urlaub i Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci., 77:4216-20, (1980)) adaptirane na uzgajanje u suspenziji elektroporirane su sa ekspresionim vektorima koji sadrže teške i lake lance klonova 4, 12, 53, 82 i 135 himernih CXCR3 antitela. Ovi ekspresioni vektori takođe sadrže gene dihidrofolat reduktaze radi izbora stabilnih transfektanasa CHO. Nakon selekcije sa 100 nM metotreksatom, stabilno transficirani skupovi CHO ćelija su korišćeni za dovršenje ciklusa bioprodukcije u bocama za trešenje, sa medijumom OptiCHO.

Rekombinantno himerno antitelo je prečišćeno iz kondicioniranog medijuma pomoću hromatografije sa standardnim proteinom A. Klonovi Hu1 su CDR graftovani u humane regione okvira, i potpuno su humanizovani, isključujući aminokiseline CDR miša i sve ostatke na Vernijeovom položaju. Klonovi Hu2 su klonovi sa „proširenim CDR“, sa povratnim mutacijama Hu1 sekvenci na ostacima pozicioniranim u opsegu od četiri aminokiseline mišjih CDR. Klonovi Hu3 uključivali su dodatne povratne mutacije Hu2 sekvenci na položajima identifikovanim kao „vrlo različiti“ između miša i čoveka, korišćenjem modelovanja na bazi IMGT. Ukupno dvadeset varijanti je nepostojano eksprimirano u CHO-NRC ćelijama, i prečišćeno za in vitro testove.

[0165] Dodatna humanizacija je izvršena za klonove 4 i 53. Teški lanci 4.7-4.11 obuhvatali su dodatne humanizovane povratne mutacije izvan CDR, kao i modifikacije da se ukloni mesto deamidacije na položajima 58 i 59 (IMGT numeracija) u VH CDR2, kako bi se poboljšala stabilnost klona. Konkretno, mesto deamidacije u VH 4.2 zamenjeno je izvesnim brojem alternativnih ostataka. Klonovi VH 53.4-53.6 i VL 53.4-53.9 obuhvatali su dodatne humanizovane povratne mutacije izvan CDR, posebno kako bi lanci bili sličniji lancima VH 4.1 i VL 4.1.

Primer 9: Kinetika vezivanja celog receptora

[0166] Kinetika vezivanja dvadeset anti-CXCR3 varijanti je ocenjena pomoću analiza Octet® i Biacore™ sa netaknutim CXCR3 peptidima. Octet analiza je izvedena kao što je već opisano. Kod Biacore analize, humani CXCR3 peptidi divljeg tipa prečišćeni na tri kolone označeni su sa C-terminalnim His i HPC4, i snimljeni na NTA čipovima putem heliranja nikla i vezivanja amina. Korišćeni su čipovi sa srednjim RU (oko 1200 RU) radi boljeg kvaliteta podataka i minimizovanja efekta dvovalentnog vezivanja.0-80 nM uzorka antitela injektovano je na receptor. Standardna Biacore™ evaluaciona analiza izvedena je korišćenjem senzorgramske zavisnosti sa lokalnim Rmax radi boljeg podešavanja krive. Ocenjene su krive vezivanja za četiri varijante (himerna (Ch) i humanizovana (Hu) 1-3) za pet klonova (4, 12, 53, 82 i 135). Radi poređenja, takođe je određena kinetika vezivanja humanih CXCR3 liganada CXCL9, CXCL10 i CXCL11, i mišjeg CXCL11 (mCXCL11). Rezultati su prikazani dole u Tabelama 7A (poređani prema KD) i 7B (poređani prema Kd).

Četiri varijante na vrhu, prema KD i Kd, istaknute su u tabelama. Kada su humanizovane anti-hCXCR3 varijante mAt poređane prema povratnim brzinama (Kd), većina varijanti je imala barem za 1 cifru manje povratne brzine od najmoćnijeg humanog CXCR3 liganda hCXCL11.

Tabela 7A

mCXCL11 3,69E+06 4,26E-03 1,17E-09

Tabela 7B

[0167] Kao što je naznačeno u Tabeli 7A, četiri varijante na vrhu prema KD su himerni klon 4 (velika brzina, mala povratna brzina), Hu 3 klon 4 (velika brzina, mala povratna brzina), Hu 3 klon 82 (velika brzina, prosečna povratna brzina), i himerni klon 53 (prosečna brzina, mala povratna brzina).

[0168] Vezivanje antitela dalje je određeno na CXCR3-eksprimirajućim ćelijama. Humane CXCR3 transficirane 300.19 ćelije su dovedene u kontakt sa prečišćenim humanizovanim varijantama anti-hCXCR3 antitela Hu1, Hu2, Hu3, i himernim antitelom. Kao što je prikazano na sl.19 za svaki od klonova 4, 12, 53, 82 i 135 na 5 µg/ml (crna linija), 0,5 µg/ml (tamnosiva linija), ili 0,1 µg/ml (crna isprekidana linija) ili 5 µg/ml samo sekundarnog antitela (ispunjeni sivi histogram). Ćelije su obojene neobeleženim klonovima antitela tokom 30 min na ledu, a zatim isprane dva puta pomoću PBS-1%FBS, i vezano antitelo je detektovano pomoću FITC-konjugovanog humanog IgG1 specifičnog sekundarnog antitela inkubiranjem na ledu tokom 30 min u mraku. Uzorci su dva puta isprani, fiksirani u 2% rastvoru paraformaldehida u PBS, čuvani u mraku na 4°C i određeni na protočnom citometru. Histogrami CXCR3 pozitivnosti gejtovani na vijabilnim ćelijama prikazani su na sl.19.

Primer 10: Poređenje sa antitelom 1C6

[0169] Anti-hCXCR3 klon mAt 1C6 (Becton, Dickinson kat. br.557183, isti klon je objavljen u Američkom patentu br.6,184,358) upoređen je sa mišjim anti-hCXCR3 klonom 4 mAt i njegovim humanizovanim varijantama Hu2 i Hu3 pomoću metode ispitivanja celog receptora Biacore. Klon 4 je pokazao oko 2 puta bolji afinitet (KD). Humanizovane varijante su pokazale još više poboljšan afinitet (oko 4 puta bolji afinitet za Hu2 i Hu3 varijante). U Tabeli 8 navedena je kinetika vezivanja i afinitet za klon 1C6 i za klon 4 i njegove humanizovane varijante Hu2 i Hu3.

Tabela 8

Primer 11: Testovi funkcionalnosti

[0170] Određeni su funkcionalni efekti dvadeset varijanti antitela. Antitela su ocenjena prema svom efektu na hemotaksu ćelija kao odgovor na CXCL9, CXCL10 i CXCL11, i inhibiciji mobilizacije kalcijuma FLIPR® testom za kalcijum.

[0171] Hemotaksa humanih CXCR3-transficiranih 300.19 ćelija prema CXCR3 ligandima CXCL9, CXCL10 i CXCL11 određena je u prisustvu ili odsustvu 10 µg/ml varijanti klonova 4, 12, 53, 82 i 135 humanizovanih anti-humanih CXCR3 antitela. Transficirane ćelije su prethodno tretirane 20 min na 37°C sa 10 ug/ml humanizovanih anti-humanih CXCR3 varijanti antitela, ili komercijalnog antitela 1C6. Ćelije sa antitelom prenete su u transbunarčiće od 5 mikrona, i ulošci su stavljeni u prijemni bunarčić sa 100 ili 300 ng/ml rekombinantnog mišjeg CXCL10 i CXCL11, odnosno CXCL9. Ploče za hemotaksu su inkubirane na 37°C, sa 5% CO2tokom 4 h. Ulošci za transbunarčiće su uklonjeni, i ćelije koje su migrirale u prijemne bunarčiće prenete su na ploče sa 96 bunarčića sa zaobljenim dnom, peletirane i ponovo suspendovane u boji kalcein AM. Ćelije su inkubirane tokom 30 min na 37°C, sa 5% CO2, jednom isprane, prenete na crnu/providnu ploču, i odmah očitane na uređaju FlexStation na 490/520 nm. Podaci su prikazani kao procenat inhibicije hemotakse. Sl. 20 daje reprezentativne podatke koji prikazuju sposobnost različitih varijanti za svaki od pet klonova da inhibiraju hemotaksu prema CXCL9, CXCL10 i CXCL11.

[0172] Da bi se ocenila inhibicija intracelularne mobilizacije kalcijuma, protok kalcijuma u humanim CXCR3-Gqi4qi4 transficiranim CHO ćelijama meren je kao odgovor na CXCL10 u prisustvu ili odsustvu različitih koncentracija varijanti anti-CXCR3 antitela ili pozitivne kontrole antitela 1C6. Ćelije su zasejane (12.000/bunarčiću) na crne ploče sa 384 bunarčića, i ostavljene da se vežu preko noći. Sledećeg dana, ćelije su napunjene bojom osetljivom na kalcijum, Fluo-4NW, 40 min pre dodavanja antitela, i inkubirane na 37°C. Antitelo je dodato, i ostavljeno da se inkubira 20 min pre dodavanja CXCR3 liganda, rekombinantnog humanog CXCL10, u prethodno određenoj EC80koncentraciji CXCL10. Dodatak boje je izvršen ručno, pomoću elektronske višekanalne pipete, ali je dodavanje antitela i agonista bilo automatizovano na FLIPR Tetra®, i ploče su odmah očitane na 470-495 nm po dodavanju CXCL10. Uzorci su propušteni u duplikatu, i prosečni procenat inhibicije (± standardna devijacija) na svakoj koncentraciji antitela je predstavljen na dijagramu. Klon 4 Hu1 ne inhibira mobilizaciju kalcijuma, i korišćen je kao negativna kontrola u ovim eksperimentima. Sl. 21 prikazuje sposobnost različitih varijanti svakog od pet klonova da inhibira mobilizaciju kalcijuma, i poredi ih sa komercijalnim klonom 1C6. Reprezentativne vrednosti IC50 (M) antitela prema CXCL10 u testu mobilizacije kalcijuma prikazane su u Tabeli 9 ispod.

Tabela 9

[0173] Kao što je prikazano u Tabeli 10, podaci o kinetici vezivanja (videti Primer 9) dobro su korelisani sa rezultatima testa funkcionalnosti. Na osnovu podataka o kinetici vezivanja i rezultatima testa funkcionalnosti, klonovi 4 i 53 su odabrani za dalju evaluaciju i 4D humanizaciju.

Tabela 10

Primer 12: 4D humanizacija

[0174] 4D humanizacija klonova anti-hCXCR3 antitela izvršena je kao što je opisano u WO 2009/032661 (npr., u odeljcima [0037]-[0044]). Ukratko, 4D humanizacija uključuje: a) izgradnju 3-D modela varijabilnog domena koji treba humanizovati; b) identifikaciju fleksibilnih ostataka u varijabilnom domenu pomoću simulacije molekulske dinamike 3-D modela domena; c) identifikovanje najpribližnije humane germinativne linije poređenjem trajektorije molekulske dinamike 3-D modela sa trajektorijama molekulske dinamike 49 humanih germinativnih linija (a ne poređenjem sekvenci antitela, kako se radi u tradicionalnoj humanizaciji); i d) mutiranje fleksibilnih ostataka, koji nisu deo CDR, u njihove parnjake humane germinativne linije (identifikovane u koraku c). Ovom metodom su dizajnirani teški lanci 4.4-4.6 i laki lanci 4.4-4.7. Konkretno, dizajniran je inicijalni 4D humanizovani konstrukt (VH 4.4 i VL 4.4) a zatim su dizajnirane dalje modifikacije teškog i lakog lanca (VH 4.5-4.6 i VL 4.5-4.7), da bi se uvele stabilizujuće i anti-agregacione mutacije, i eliminisali ostali neželjeni motivi. Slične metode su takođe korišćene za dizajniranje 4D humanizovanih konstrukata VH 53.7-53.10 i VL 53.10-53.13.

[0175] Tabela 11 daje strategiju humanizacije (i dodatne modifikacije, gde je primenljivo) upotrebljenu za pripremu varijanti teškog i lakog lanca za klonove 4, 12, 53, 82 i 135, uključujući humanizovane i 4D humanizovane lance (VH = teški lanac; VK = laki lanac).

[0176] Više 4D varijanti klona 4 (4Hu6, 4Hu7, 4Hu8, 4Hu9, 4Hu10) je ocenjeno testom Biacore za ceo receptor, kako bi se odredila kinetika vezivanja i afinitet prema CXCR3, i upoređeno sa himernim antitelom klona 4. Kao što je prikazano u Tabeli 2, klon 4Hu6 sadrži teški lanac 4.4 i laki lanac 4.4. Klon 4Hu7 sadrži teški lanac 4.4 i laki lanac 4.7. Klon 4Hu8 sadrži teški lanac 4.5 i laki lanac 4.5. Klon 4Hu9 sadrži teški lanac 4.5 i laki lanac 4.6. I klon 4Hu10 sadrži teški lanac 4.6 i laki lanac 4.4.

[0177] Kao što je prikazano u Tabeli 12, kada su varijante 4D modelovanja klona 4 upoređene sa himernim varijantama (4Ch), četiri petine varijanti je pokazalo poboljšan afinitet (KD). Međutim, 4D varijanta 4Hu10 pokazala je smanjenje afiniteta od skoro 1 reda veličine.

Tabela 11

Tabela 12

Primer 13: Model NSG-PBL miša

[0178] NOD-scid IL2rγ<nula>(NSG) miševima je injektovano 2E7 svežih primarnih humanih ficoll izolovanih mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMCs) 0. dana. Životinje (n=8/grupi) su tretirane sa 5 mg/kg anti-humanih CXCR3 himernih antitela ili kontrolnog humanog IgG1 (Herceptin) dva puta nedeljno tokom cele studije, počevši od 3. dana posle transfera ćelija. Krv uzeta 14. dana posle inicijacije obrađena je za protočnu citometriju i obojena standardnim postupcima sa antitelima na humani CD45 (hCD45), humani CD3 (hCD3), humani CD4 (hCD4), humani CD8 (hCD8) i humani CXCR3. Ćelije u limfocitnom gejtu su gejtovane na hCD45+ ćelijama, zatim su gejtovane na hCD3+ ćelijama. Ocenjena je ekspresija hCD4 i hCD8 na hCD45+hCD3+ T ćelijama, i određen je procenat humanih CD4+CD45+CD3+ T ćelija i humanih CD8+C45+CD3+ T ćelija. Utvrđen je procenat humanih CD4+ T ćelija i CD8+ T ćelija koje eksprimiraju CXCR3. Svaka tačka na sl.22 predstavlja jednog miša, dok su reprezentativni podaci prikazani za tri eksperimenta. Podaci pokazuju da je lečenje anti-CXCR3 antitelom u modelu NSG-PBL miša sa ksenogenim GvHD (bolest kalem protiv domaćina) dovelo do modulacije T ćelija koje eksprimiraju CXCR3, ali su otkrivene i funkcionalne razlike između pet klonova.

[0179] Tabela 13 pokazuje medijanu preživljavanja NSG-PBL miševa sa ksenogenim GvHD nakon lečenja himernim anti-humanim CXCR3 antitelima kandidatima.

Tabela 13

[0180] Prethodni primeri su dati sa namerom da ilustruju, i ni na koji način ne ograničavaju predmetni pronalazak.

Claims (22)

Patentni zahtevi

1. Antitelo ili antigen vezujući fragment sposoban da se veže za CXCR3, pri čemu pomenuto antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži šest regiona koji određuju komplementarnost (CDR): varijabilni domen teškog lanca (VH) CDR1, VH CDR2, VH CDR3, varijabilni domen lakog lanca (VL) CDR1, VL CDR2, i VL CDR3,

naznačeno time što:

VH CDR1 ima aminokiselinsku sekvencu

GFTFTSYA;

VH CDR2 ima aminokiselinsku sekvencu

ISHGGTYT;

VH CDR3 ima aminokiselinsku sekvencu

ARHPIYSGNYQGYFDY;

VL CDR1 ima aminokiselinsku sekvencu

SGVNY;

VL CDR2 ima aminokiselinsku sekvencu

FTS;

i

VL CDR3 ima aminokiselinsku sekvencu

QQFTSSPYT.

2. Antitelo ili fragment iz patentnog zahteva 1, naznačeno time što su antitelo ili fragment himerni, CDR graftovani, mutirani, humani, humanizovani, sintetički ili rekombinantni.

3. Antitelo ili fragment iz patentnog zahteva 1 ili 2, naznačeno time što su antitelo ili fragment sposobni da se vežu za polipeptid koji sadrži peptid odabran iz grupe koja se sastoji od:

a) peptida koji sadrži ostatke 1-58 ID. BR. SEKV.: 1;

b) peptida koji sadrži ostatke 1-16 ID. BR. SEKV.: 1; i

c) peptida koji sadrži ostatke 1-37 ID. BR. SEKV.: 1.

4. Antitelo ili fragment iz bilo kog od patentnih zahteva 1-3, naznačeno time što su antitelo ili fragment sposobni da se vežu za polipeptid koji sadrži peptid odabran iz grupe koja se sastoji od:

a) peptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SDHQVLNDAE;

b) peptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SDHQVLND;

c) peptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu DHQVLND;

d) peptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu VLNDAE;

e) peptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu VLND;

f) peptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu XDXXVXNDXX;

g) peptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu XDXXVXND;

h) peptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu DXXVXND;

i) peptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu VXNDXX;

i

j) peptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu VXND,

naznačeno time što X označava bilo koju aminokiselinu.

5. Antitelo ili fragment iz bilo kog od patentnih zahteva 1-4, koje sadrži varijabilni region teškog lanca, naznačeno time što varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična sa ID. BR. SEKV.: 48.

6. Antitelo ili fragment iz patentnog zahteva 5, naznačeno time što varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 48.

7. Antitelo ili fragment iz bilo kog od patentnih zahteva 1-4, koje sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca, naznačeno time što:

varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od ID. BR. SEKV.: 38, 40, 42, 44, 46-48, i 63-66;

i

varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od ID. BR. SEKV.: 39, 41, 43, 45, 49-54, i 67-70; i

VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 i VL CDR3 su 100% identični onima iz patentnog zahteva 1.

8. Antitelo ili fragment iz patentnog zahteva 7, naznačeno time što:

varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od ID. BR. SEKV.: 38, 40, 42, 44, 46-48, i 63-66;

i

varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od ID. BR. SEKV.: 39, 41, 43, 45, 49-54, i 67-70.

9. Antitelo ili fragment iz patentnog zahteva 7, naznačeno time što varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična sa ID. BR. SEKV.: 48; i varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična sa ID. BR. SEKV.: 41.

10. Antitelo ili fragment iz patentnog zahteva 7, naznačeno time što varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 98% identična sa ID. BR. SEKV.: 48; i varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 98% identična sa ID. BR. SEKV.: 41.

11. Antitelo ili fragment iz bilo kog od patentnih zahteva 1-10, naznačeno time što antitelo ili fragment sadrže kombinaciju varijabilnih regiona teškog lanca i lakog lanca odabranu iz grupe koja se sastoji od:

ID BR. SEKV.: 38 i 39; ID BR. SEKV.: 40 i 41; ID BR. SEKV.: 42 i 43; ID BR. SEKV.: 44 i 45; ID BR. SEKV.: 40 i 43; ID BR. SEKV.: 42 i 41; ID BR. SEKV.: 42 i 49; ID BR. SEKV.: 42 i 50; ID BR. SEKV.: 42 i 51; ID BR. SEKV.: 42 i 52; ID BR. SEKV.: 42 i 53; ID BR. SEKV.: 42 i 54; ID BR. SEKV.: 46 i 43; ID BR. SEKV.: 47 i 43; ID BR. SEKV.: 48 i 43; ID BR. SEKV.: 40 i 49; ID BR. SEKV.: 40 i 51; ID BR. SEKV.: 48 i 49; ID BR. SEKV.: 48 i 51; ID BR. SEKV.: 63 i 67; i ID BR. SEKV.: 63 i 68.

12. Antitelo ili fragment iz bilo kog od patentnih zahteva 1-11, naznačeno time što su antitelo ili fragment sposobni da se preferencijalno vežu za A-izooblik CXCR3.

13. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira aminokiselinsku sekvencu antitela ili fragmenta iz bilo kog od patentnih zahteva 1-12.

14. Metoda za proizvodnju antitela ili fragmenta iz bilo kog od patentnih zahteva 1-12, koja uključuje uzgajanje ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu iz patentnog zahteva 13, u medijumu za uzgajanje pod uslovima pogodnim za proizvodnju antitela ili fragmenta.

15. Antitelo ili fragment iz bilo kog od patentnih zahteva 1-12 za primenu u terapiji za prevenciju, lečenje ili smanjenje progresije novonastalog dijabetesa tip 1 (T1D).

16. Antitelo ili njegov fragment za primenu iz patentnog zahteva 15, naznačeno time što se pomenuto antitelo ili njegov fragment primenjuju u dozi od oko 0,03-3,7 mg/kg/dozi.

17. Antitelo ili njegov fragment za primenu iz patentnog zahteva 15 ili 16, naznačeno time što se antitelo ili njegov fragment primenjuju u ukupnoj dozi za sve primene od oko 0,16-18 mg/kg.

18. Antitelo ili njegov fragment za primenu iz bilo kog od patentnih zahteva 15-17, naznačeno time što se pomenuto antitelo ili njegov fragment primenjuju na humanom ispitaniku sa novonastalim T1D koji ima nivo C-peptida u bazalnom serumu veći ili jednak 0,2 nmol/l, i/ili nivo C-peptida u serumu uz uzdržavanje od hrane tokom stimulacije C-peptida između 0,033 i 1,0 nmol/l x min.

19. Konjugat koji sadrži antitelo ili fragment iz bilo kog od patentnih zahteva 1-12 i najmanje jedan dodatni agens, naznačeno time što pomenuti agens je terapeutski agens, agens za rastvaranje, agens za stabilizaciju, imunosupresiv, receptor ili antigen vezujući peptid.

20. Farmaceutska smeša koja sadrži antitelo ili fragment iz bilo kog od patentnih zahteva 1-12, ili nukleinsku kiselinu iz patentnog zahteva 13, i farmaceutski prihvatljiv nosač.

21. Farmaceutska smeša iz patentnog zahteva 20, naznačena time što smeša dalje sadrži najmanje jedan dodatni terapeutski agens odabran iz grupe koja se sastoji od agensa za stimulaciju β ćelija, insulina i ćelije koja proizvodi insulin.

22. In vitro metoda za detektovanje prisustva ili koncentracije CXCR3 u ispitivanom uzorku, koja obuhvata dovođenje u kontakt ispitivanog uzorka sa antitelom ili fragmentom iz bilo kog od patentnih zahteva 1-12 i oznakom koja može da se detektuje, naznačeno time što je prisustvo ili koncentracija CXCR3 direktno ili indirektno povezana sa signalom koji stvara oznaka koja može da se detektuje.