RS58146B1 - Onkolitički herpes simpleks virus i njegova terapeutska upotreba - Google Patents

Description

Opis

SRODNA PRIJAVA

[0001] Ova prijava zahteva prioritet od U.S. provizorne prijave serijskog br. 61/532,335, koja je podneta 8 septembra, 2011.

OBLAST PRONALASKA

[0002] Predmetni pronalazak se odnosi na avirulentni, modifikovani herpes simpleks virus (HSV) koji se selektivno replicira u ćelijama kancera, kao što su ćelije kancera bešike i melanoma. Takođe su opisani terapeutski postupci koji koriste modifikovani HSV, uključujući terapeutske postupke za lečenje kancera bešike, melanoma i drugih tipova kancera.

STANJE TEHNIKE PRONALASKA

[0003] Dok je osnovni cilj terapije kancera da se uništi kancer istovremeno izbegavajući prekomerna oštećenja normalnih organa u telu, njihovi toksični efekti u telu ograničavaju trenutne tretmane kao što su hemioterapija i zračenje. Kao takva, maksimalna podnošljiva doza takvih terapija često nije adekvatna za eradikaciju tumora. Novije stategije tretmana su fokusirane na identifikovanje antineoplastičnog sredstva koje može da razlikuje normalne ćelije od kancerogenih. Onkolitički virusi se repliciraju, šire i selektivno uništavaju kancerozno tkivo, ali su atenuirani i ne oštećuju normalne ćelije. Pored direktne onkolize, imunski posredovana komponenta doprinosi efikasnosti onkolitičkog virusa kod imunski kompetentnih miševa (tj., onkolitički virusi imaju efekat vakcinacije protiv tumora koji je najmanje delom posredovan kroz anti-tumorski CD8+ T ćelijski odgovor). Upotrebom imunski kompetentnih miševa sa singenim, bilateralnim subkutanim (s.c.) tumorima, prethodne studije su uspostavile da tretman jednog tumora sa onkolitičkim virusom (HSV-1) indukuje regresiju tretiranog i netretiranog kontralateralnog tumora (videti Toda M, et al. "Herpes simplex virus as an in situ cancer vaccine for the induction of specific anti-tumor immunity." Hum Gene Ther 1999;10:385-93). Dok oba, tretirani i netretirani tumori imaju regresiju, onkolitički virus se detektuje samo u tretiranom tumoru. Dalje, regresija neinjektiranog, kontralateralnog tumora nastaje iz anti-tumorskog CD8+ T ćelijskog odgovora.

[0004] Nekoliko različitih onkolitičkih sojeva herpes simpleks virusa tipa 1 (HSV-1) su pokazani bezbednim u fazi I u klinčkim ispitivanjima na ljudima. Videti Aghi & Martuza, Oncogene (2005) 24:7802-7816. Virusna genetička analiza je uspostavljena da HSV-1 može efikasno da bude neuroatenuiran delecijomγ134.5 gena neuropatogeneze. Chou et. al, Science (1990) 250:1262-1266. Ćelijska interferonom indukovana kinaza PKR eIF2α, glavna komponenta odbrane urođenog imunskog odgovora domaćina, fosforiliše kritični faktor inicijacije translacije eIF2α domaćina u odgovoru na virusnu infekciju. Fosforilisan eIF2α blokira inicijaciju translacije time isključujući proizvodnju virusnih polipeptida i potomstva. Genγ134.5 kodira za regulatornu subjedinicu ćelijskog proteina fosfataze 1 i usmerava defosfoilaciju eIF2α što dovodi do proizvodnje virusnih proteina i potomstva. Chou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:10516-10520; He et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94:843-848. Dok su virusi koji su deficijentni zaγ134.5 (Δ34.5) dovoljno atenuirani i bezbedni (videti, USP 7981669 od Coffin et al.), njihova anti-tumorska efikasnost u životinjskim modelima strogo je ograničena zbog njegove ograničene sposobnosti replikacije u mnogim tipovima ćelija kancera.

[0005] Neuspeh ovih Δ34.5 sojeva da propagiraju infekciju kroz tumorsku masu omogućava ponovni rast kancera. Videti Mohr, Oncogene (2005) 24:7697-7709. Pokazano je da HSV-1 Us11 gen kodira funkciju koja se eksprimira veoma kasno u ciklusu virusnog rasta koja antagonizuje PKR i urođene odbrane domaćina. Virusi koji su modifikovnani da eksprimiraju Us11 veoma rano nakon infekcije (koji se zovu "trenutni-rani" od "IE") omogućavaju mutiranim Δ34.5 virusima da efikasno rastu. Značajno, Δ34.5 virusi koji eksprimiraju IE Us11 (Δ34.5 IE Us11) ostaju neuro-atenuirani kao i roditeljski Δ34.5 sojevi, ali se repliciraju u i efikasno uništavaju ćelije kancera, što ih čini idealnim kandidatima onkolitičkog virusa. Mohr et. al, J. Virol. (2001) 75:5189-5196. U studijama koje koriste nezavisno konstruisane viruse u različitim modelima tumora, modifikovani derivat mutiranog Δ34.5 koji eksprimira IE Us11 dovodi do značajnog poboljšanja u mogućnosti virusa da inhibira tumorski rast. Taneja et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2001) 98:8804-8808; Todo et. al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2001) 98:6396-6401; i Liu et al., Gene Therapy (2003) 1):292-303.

[0006] Međutim, gore opisani Δ34.5 IEUs11 onkolitički sojevi imaju veliki nedostatak, kako modifikovana ekspresija IE Us11 inaktivira susedni Us12 gen, koji kodira za važi imunomodulatorni polipeptid, ICP47, koji je uključen u blokiranje prezentovanja antigena inhibiranjem transportera koji je povezan sa prezentovanjem antigena (TAP) 1/2. Mohr et al, J. Virol. (1996) 75:5189-5196; Todo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2001)98:6396-6401; Liu et al., Gene Therapy (2003) 10:292-303. S obzirom da proizvod Us12 gena deluje tako da inhibira prezentovanje antigena, njegovo odsustvo dovodi do povećanog uklanjanja inficiranih ćelija pomoću stečenog imunskog odgovora. Goldsmith et al., J. Exp. Med. (1998) 187:341-348. Prema tome, Us12 je verovatno potreban da se osigura da HSV-1 onkolitički virus nije prerano uklonjen pre nego što dobije priliku da se raširi kroz tumorsko tkivo i završi svoj zadatak eradikacije tumora. Ovo je posebno važno uzimajući u obzir prevalencu HSV-1 i HSV-1-specifičnog imuniteta (npr., seropozitivnosti) u generalnoj populaciji. Zaista, nedavno objavljene studije ukazuju da je izbegavanje CD8+ T ćelija kritično za superinfekciju sa herpesvirusom. Hansen et al., Science (2010) 328:102-106. Iako se razume da Us12 sprečava prepoznavanje ćelija kancera od strane citolitičkih T-ćelija, ne interferira sa prezentovanjem tumorskih antigena na površini neinficiranih ćelija ili, nakon početka infekcije, smanjenom regulacijom postojećih kompleksa na površini koje prikazuju tumorski antigeni. Stoga, ekspresija Us12 imunomodulatorne aktivnosti pojačava širenje virusa i onkolizu ali ne smanjuje sveukupni imunski odgovor i/ili potencijal za stvaranje efekta vakcinacije tumora.

[0007] Δ34.5 IEUs11 HSV varijante koje imaju intaktni Us12 se opisuju u U.S. Patent br.7,731,952 od strane Mohr et al. Dok su one Δ34.5 IEUs11 HSV varijante eksprimirale Us12, nije moguće ispitati te varijante u mišjim modelima, npr., kancera, upotrebom imunski kompetentnih miševa, zbog toga što Us12 ne može da inhibira mišji TAP, što dovodi do prevremenog čišćenja virusom inficiranih ćelija, kao što se razmatra u tekstu iznad.

[0008] Životinjski modeli su često korisni u razumevanju humanih bolesti, i korisni su za mogućnost ispitivanja Δ34.5 IEUs11 HSV varijanti u takvim modelima, posebno onih koji koriste imunskikompetentne miševe u cilju bližeg predstavljanja humanih bolesti, kao što je kancer, gde je većina pacijenata imunski kompetentno i takođe mogu da imaju anti-HSV specifične memorijske T ćelije. toga, u oblasti tehnike ostaje potreba za onkolitičkim virusima koji izbegavaju CD8+ T ćelije i/ili izbegavaju prerano čišćenje od strane imunskog sistema, posebno onih koji mogu da se testiraju u imunskim kompetentnim mišjim i humanim modelima.

SUŠTINA PRONALASKA

[0009] Kao što se razmatra gore u tekstu, u oblasti tehnike postoji potreba za varijantom HSV sa unapređenom anti-tumorskom aktivnošću, koja uključuje unapređeno širenje virusa i sposobnost da se izbegnu imunski odgovori domaćina, npr., čišćenje virusom inficiranih ćelija koje je posredovano sa CD8+ citolitičkim T ćelijama, koja može da se ispita u imunski kompetentnim mišjim modelima bolesti, kao što je kancer.

[0010] Prema tome, varijanta herpes simpleks virusa (HSV) obuhvata:

a. funkcionalno inaktivne ICP34.5 kodirajuće gene;

b. US11 kodirajući gen koji je operativno povezan sa trenutnim ranim (IE) promoterom;

c. intaktni endogeni US 11 kodirajući gen;

d. intaktni endogeni Us 12 kodirajući gen; i

e. gen koji kodira heterologni TAP inhibitorni polipeptid,

gde heterologni TAP inhibitor je UL49.5 TAP inhibitorni polipeptid herpes virusa, CMV US6 polipeptid, ili je obezbeđen BNLF2a polipeptid.

[0011] Varijanta herpes simpleks virusa prema pronalasku može dalje da sadrži heterologni gen koji kodira polipeptid koji se bira iz grupe koja obuhvata faktor stimulacije kolonija granulocita makrofaga (GM-CSF), faktor nekroze tumora (TNF)-alfa, CD40 ligand (CD40L); IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, G-CSF, IFN-α, IFN-γ, IL-20 (MDA-7), B7-1 (CD80) i B7-2 (CD86).

[0012] Takođe je opisana mogućnost da heterologni gen može da kodira enzim za konvertovanje proleka ili enzim koji degradira ili modifikuje vanćelijske komponente matriksa da bi se olakšalo širenje virusa kroz tumor, na primer, matriksne metaloproteinaze.

[0013] Poželjno, heterologni gen koji kodira GM-CSF. Poželjno, IE promoter jeα27 IE promoter. U nekim izvođenjima, heterologni gen je operativno povezan sa promoterom koji je odabran iz grupe koja obuhvata CMV promoter i EF1αpromoter. Poželjno, TAP inhibitor je UL49.5 polipeptid herpesvirusa govečeta (BHV).

[0014] Takođe je obezbeđena varijanta herpes simpleks virusa (HSV) koja ima endogeni intaktni Us12 kodirajući gen i intaktni endgeni Us11 kodirajući gen, kome nedostaju funkcionalni ICP34.5 kodirajući geni, gde se svaki ICP34.5 kodirajući gen replicira sa polinukleotidnom kasetom koja obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja je predstavljena u jednoj od SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22,: SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 i SEQ ID NO: 25.

[0015] Takođe je obezbeđena varijanta herpes simpleks virusa (HSV) koja ima sekvencu genoma predstavljenu u SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, ili SEQ ID NO: 30.

[0016] Ovde je obezbeđena farmaceutska formulacija koja sadrži varijantu HSV iz pronalaska i farmaceutski prihvatljivi nosač za davanje tumorskm ćelijama. Poželjno, farmaceutska formulacija sadrži varijantu herpes simpleks virusa (HSV) kao što se definiše gore u tekstu i farmaceutski prihvatljivi nosač za davanje tumorskim ćelijama.

[0017] Farmaceutska formulacija može takođe da sadrži varijantu herpes simpleks virusa (HSV) koji ima intaktni endogeni Us12 kodirajući gen i intaktni endogeni Us11 kodirajući gen, kome nedostaju funkcionalni ICP34.5 kodirajući geni, gde se svaki ICP34.5 kodirajući gen replicira sa polinukleotidnom kasetom koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline predstavljenu u jednoj od SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22,: SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 i SEQ ID NO: 25.

[0018] Farmaceutska formulacija može takođe da sadrži varijantu herpes simpleks virusa (HSV) koji ima sekvencu genoma predstavljenu u SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, ili SEQ ID NO: 30.

[0019] Poželjno, ovde obezbeđena farmaceutska formulacija je namenjena za in situ davanje tumorskim ćelijama. U nekim izvođenjima, farmaceutska formulacija sadrži varijantu HSV koja selektivno inficira ćelije kancera bešike, ćelije humanog melanoma, ćelije kancera humanog jajnika, ili ćelije humanog glioblastoma.

[0020] Varijanta HSV ili farmaceutska kompozicija prema predmetnom pronalasku može da se koristi u postupku ubijanja tumorskih ćelija kod subjekta koja obuhvata: davanje gore opisane farmaceutske formulacije subjektu kome je potrebno pod uslovima koji su efikasni za ubijanje tumorske ćelije u subjektu koji su takođe obezbeđeni. Neograničavajući primeri tumorskih ćelija koje mogu da se ubiju prema postupcima koji se ovde opisuju, obuhvataju, npr., astrocitom, oligodendrogliom, meningiom, neurofibrom, glioblastom, ependimom, Švanom, neurofibrosarkom, meduloblastom, ćelije melanoma, ćelije kancera pankreasa, ćelije karcinoma prostate, ćelije kancera grudi, ćelije kancera pluća, ćelije kancera debelog creva, ćelije hepatoma, mezoteliom, ćelije kancera bešike, i ćelije epidermoidnog karcinoma. U određenim izvođenjima, virus može selektivno da se replicira u humanim ćelijama kancera bešike ili ćelijama humanog melanoma. Davanje subjektu može da bude injekcijom, infuzijom, instilacijom ili inhlacijom. U bilo kom od gore navedenih izvođenja, subjekat može da bude sisar, kao što je čovek.

[0021] U jednom izvođenju, farmaceutska kompozicija prema predmetnom pronalasku može da se koristi u postupku lečenja kancera, gde postupak obuhvata davanje tretmana individui kojoj je potrebno, terapeutski efikasne količine farmaceutske kompozicije koja se gore opisuje. U određenim izvođenjima, kancer se bira iz grupe koja obuhvata kancer bešike, melanom, kancer jajnika i glioblastom.

[0022] Detalji jednog ili više izvođenja pronalaska su predstavljeni u priloženim slikama i u opisu ispod. Druge karakteristike, objekti, i prednosti pronalaska će biti jasne iz opisa i slika, i iz zahteva.

KRATAK OPIS SLIKA

[0023]

Slike 1A-1C illustruju genska svojstva divljeg tipa HSV-1 (Slika 1A) i modifikovanog HSV-1 OncoVEX<GMCSF>gde je GM-CSF pod kontrolom Citomegalovirusnog (CMV) promotera (Slika 1B) i OV-2711, koji eksprimiraju Us11 koji je povezan sa trenutnim ranim (IE) promoterom. (Figure 1C). Naznačeni regioni prikazuju regione invertovanih terminalnih ponovaka (TR) koji okružuju jedinstvene kratke (Us) i jedinstvene duge (UL) komponente, koje su prestavljene punim linijama. Isprekidane linije ukazuju na produženi pregled regiona genoma. Us-TRs region spajanja koji sadrži Us11 i Us12 otvorene okvire čitanja (ORFs), naznačene otvorenim pravougaonicima, deluju produženo. Zvezdice predstavljaju odgovarajuće elemente promotora sa cis-delovanjem, gde zvezdica-11 naznačava promoter za Us11 i zvezdica-12 naznačava promoter za Us12. Strelica iznad svakog boksa koja se pruža sa elementa promotora označava transkript iRNK transkript koji kodira svaki genski proizvod. Svi ovi molekuli iRNK su polidenilovani na uobičajenom signalu za poliadenilaciju (nije predstavljeno) koji se nalazi nishodno od Us11. Us12 iRNK je spojena, kao što je naznačeno sa spustom u strelici koja spaja dva ne-kontinuirana regiona kako bi se obrazovala iRNK.

Slika 2 ilustruje γ34.5 lokus strategije konstrukcije ciljanog vektora, Slike 3A-3D ilustruju 22 konstrukta koji mogu da se dobiju upotrebom konstrukta koji je prikazan na Slici 2, i Slika 4 ilustruje genske konstrukte koji se koriste za dobijanje pet specifičnih OV-2711 varijanti onkolitičkih virusa (OV) (OV-UL49.5, OV-UL49.5-fs, OV-mGM-CSF, OVUL49.5/ GM-CSF, i OV-UL49.5-fs/mGM-CSF). Na ovim slikama, γ34.5 lokus ciljani vektor, koji je prikazan na vrhu Slike 2, Slike 3A, i Slike 4, se dobija iz virusnog BamSP fragmenta. U svakom ciljanom vektoru, γ34.5, koji se nalazi između DraI (specifično nt# 125989 od X14112) i SacI (specifično od nt# 125065 od X14112) mesta za BamSP, je zamenjen sa α27-Us11 dominantnim selektabilnim markerom. U ovom postupku, SacI mesto je uništeno i DraI mesto je zamenjeno sa PacI mestom. Ispod ciljanog vektora, CMV i EF1α promoterske kasete koja eksprimira ili UL49.5 ("49.5") ili GM-CSF ("GM") ograničenim sa naznačenim restrikcionim mestima (naznačeno sa vertikalnim strelicama) su prikazani. CMV-zasnovane kasete se završavaju sa BGH signalom za poliadenilaciju (popunjen krug) i EF1α se završava sa SV40 kasnim signalom za poliadenilaciju (otvoreni kvadrat).

Slika 3A, na vrhu, pokazuje položaj gK gena uα27-promoteru, i predloženi, ali trenutno nekarakterisani, položaj gK promotera (naznačeno zvezdicom i sa "?").

Na Slici 4, dijamant u UL49.5-fs otvorenom okviru čitanja (ORF) je jedna insercija C nukleotida između drugih i trećih kodona UL49.5 da bi se dobila mutacija koja menja okvir čitanja (fs).

Slika 5 je dijagram toka koji prikazuje strategiju koja se koristi za konstruisanje ciljanih vektora koji se koriste za dobijanje rekombinovanih onkolitičkih virusa, OV-UL49.5, OV-UL49.5-fs, OV-mGM-CSF, i OV-UL49.5/mGM-CSF. Otvoreni boksovi u dijagramu su konstrukti koji su sintetisani de novo od strane GenScript Corporation (Piscataway, NJ). Popunjeni boksovi su konstrukti koji su dobijeni iz kloniranja restrikcionim enzimima.

Slika 6 sadrži Southern blot rezultat koji prikazuje prisustvo naznačenih konstrukata u virusnoj DNK iz virušnih štokova sa visokim titrom rekombinovanih HSV1 varijanti. Linije 1 do 6, sa levo na desno, pokazuju prisustvo konstrukata za sledeće rekombinovane viruse (molekulska veličina fragmenta je naznačena zagradama u baznim parovima (bp)), redom: 1. OV-mGM-CSF (4130 bp); 2. OV-UL49.5/mGM-CSF (6020 bp); 3. OV-UL49.5 (3995 bp); 4. OV-UL49.5-fs (3996 bp); 5. OV-2711 (2727 bp); i 6. Δ34.5 (1085 bp).

Slika 7A sadrži Western blot rezultat koji prikazuje ekspresiju UL49.5 polipeptida koji se detektuje u Vero ćelijama koje su lažno inficirane ili su inficirane sa pet odvojenih prečišćenih izolata plaka OV-UL49.5/GM-CSF na brojnosti infekcije (MOI) jednakoj 1

Slika 7B sadrži Western blot rezultat koji prikazuje ekspresiju UL49.5 polipeptida u Vero ćelijama koje su inficirane ili sa divljim tipom (WT) Patton soja HSV-1 ili OV-UL49.5 na brojnosti infekcije (MOI) jednakoj 5.

Slike 8A i 8B su bar grafici koji kvantifikuju ekspresiju mGM-CSF iRNK (Sl.7A) i VP16 (Sl.7B) kako je detektovano pomoću qRT-PCR i normalizovano sa 18S rRNK signalom u mišjim Balb/c 4T1 ćelijama kancera grudi koje su lažno inficirane ili inficirane sa divljim tipom (WT) Patton soja HSV-1, sa ili bez OV-mGM-CSF ili OV-UL49.5/GM-CSF.

Slika 9 je linijski grafik koji kvantifikuje replikaciju (eksprimiran kao jedinice koje obrazuju plak (pfu)/ml) naznačenih virusa (divlji tip (WT), Δ34.5ΔICP47, OV-2711 i Δ34.5) u inficiranim MBT-2 ćelijskim monoslojevima tokom vremena (sati nakon-infekcije (PI)).

DETALJNI OPIS

Pregled

[0024] Predmetni pronalazak obezbeđuje nove varijante herpes simpleks virusa (HSV) sa unapređenom anti-tumorskom aktivnošću i unapređenom sposobnošću da izbegne imunske odgovore domaćina. Posebno, ovde obezbeđene varijante HSV nisu neurovirulentne, repliciraju se u i uništavaju neoplastične ćelije, i imaju unapređenu aktivnost u singenim, imunski kompetentnim mišjim modelima, npr., humanog kancera bešike i drugih tipova kancera. Posebno, predmetni pronalazak obezbeđuje varijantu herpes simpleks virusa (HSV) koja obuhvata:

a. funkcionalno inaktivne ICP34.5 kodirajuće gene;

b. US11 kodirajući gen koji je operativno povezan sa trenutnim ranim (IE) promoterom;

c. intaktni endogeni US11 kodirajući gen;

d. intaktni endogeni Us12 kodirajući gen; i

e. gen koji kodira heterologni TAP inhibitorni polipeptid

gde heterologni TAP inhibitorni polipeptid je UL49.5 TAP inhibitorni polipeptid herpes virusa, CMV US6 polipeptid, ili BNLF2a polipeptid.

[0025] U poželjnom izvođenju, varijanta HSV iz pronalaska ima intaktni Us12 kodirajući gen i intaktni endogeni kodirajući gen Us11, i nedostaju joj funkcionalni ICP34.5 kodirajući geni, gde je svaki ICP34.5 kodirajući zamenjen sa polinukleotidnom kasetom koja se sastoji: (a) Us11 kodirajućeg gena koji je operativno povezan sa trenutnim ranim (IE) promoterom; i (b) gen koji kodira TAP inhibitor kao što se definiše gore u tekstu. Varijanta HSV takođe dalje može da sadrži heterologni gen koji kodira polipeptid koji može da pojača anti-tumorski odgovor, kao što je GM-CSF, TNF-α, interleukin (na primer IL12), interferon (kao što je IFN-γ) hemokin kao što je RANTES ili inlamatorni protein makrofaga (MIP) (na primer, MIP-3), ili drugi imunomodulatorni molekul kao što je B7.1 (CD80), B7.2 (CD86) ili CD40L, od nekoliko navedenih. U jednom poželjnom izvođenju, polipeptid je sisarski GM-CSF. Heterologni gen može takođe da kodira za enzim koji degradira ili modifikuje vanćelijske komponente matriksa kako bi se olakšalo širenje virusa kroz tumor, na primer, matriksne metaloproteinaze.

[0026] Takođe je opisana varijanta HSV koja ima intaktni Us12 kodirajući gen i/ili intaktni endogeni Us11 kodirajući gen, i kome nedostaju funkcionalni ICP34.5 kodirajući geni, gde svaki ICP34.5 kodirajući gen je zamenjen sa polinukleotidnom kasetom koja sadrži najmanje jedan gen koji kodira za heterologni polipeptid. Na primer, takva varijanta HSV ima intaktni Us12 kodirajući gen i/ili intaktni endogeni Us11 kodirajući gen, i kome nedostaju funkcionalni ICP34.5 kodirajući geni, gde svaki ICP34.5 kodirajući gen je zamenjen sa polinukleotidnom kasetom koja sadrži najmanje dva gena koja kodiraju heterologne polipeptide. U određenim slučajevima takve varijante HSV, heterologni polipeptid se bira od inhibitora za prezentovanje antigena na klasi I molekula glavnog kompleksa tkivne podudarnosti (MHC) (npr., TAP inhibitor), polipeptid koji može da pojača anti-tumorski odgovor (kao što je, ali bez ograničenja, GM-CSF, TNF-α, interleukin (na primer IL12), interferon (kao što je IFN-γ) hemokin (npr., RANTES ili inflamatorni protein makrofaga (MIP) (npr., MIP-3)), drugi imunomodulatorni molekul (npr., B7.1 (CD80), B7.2 (CD86), CD40L, itd.), i enzim za konverziju proleka. Heterologni gen takođe može da kodira za enzim koji degradira ili modifikuje vanćelijske komponente matriksa kako bi se olakšalo širenje virusa kroz tumor, na primer, matriksne metaloproteinaze.

[0027] U posebno poželjnom izvođenju, varijanta HSV iz pronalaska ima intaktni endogeni Us12 kodirajući gen i intaktni endogeni Us11 kodirajući gen, i nedostaju mu funkcionalni ICP34.5 kodirajući geni, gde svaki ICP34.5 kodirajući gen je zamenjen sa polinukleotidnom sekvencom koja se sastoji od: Us11 kodirajućeg gena koji je operativno povezan sa trenutnim ranim (IE) promoterom, gena koji kodira za sisarski GM-CSF, i gena koji kodira za TAP inhibitor kao što se definiše gore u tekstu.

[0028] Iako pronalazak nije ograničen bilo kojom posebnom teorijom ili mehanizmom delovanja, sposobnost virusa da inhibira TAP, npr., preko ICP47, genskog proizvoda Us12, povećava njegovu sposobnost da izbegne imunske odgovore domaćina (npr., citoloitičke CD8 T ćelijske odgovore), i prema tome unapredi sposobnost virusa da se širi kroz i ubije tumorske ćelije pre uklanjanja od strane imunskog odgovora domaćina. Dalje, u određenim izvođenjima, varijante HSV iz pronalaska su posebno korisne u životinjskim modelima, npr., modelima kancera kod glodara, zbog toga što sadrže gen koji kodira za TAP inhibitor koji deluje na mišjem TAP molekulu (npr., UL49.5).

[0029] Takođe je prikazana varijanta HSV koja nema intaktni endogeni Us12 gen. Poželjno je ukoliko varijanta HSV nema intaktni endogeni Us12 gen, da varijanta HSV eksprimira heterologni gen koji kodira polipeptid koji u suštini ima istu funkciju (npr., funkciju izbegavanja imunskog sistema, kao što je TAP inhibitor i drugi inhibitor prezentovanja antigena na virusom inficiranoj ćelijskoj površini pomoću MHC molekula klase I) kao onaj kodiran od strane Us12 gena.

Definicije

[0030] Sledeće definicije su obezbeđene za razumevanje i samo u ilustrativne svrhe, i nisu namenjene da ograniče obim pronalaska.

[0031] Kao što se ovde koristi, termin "intaktni endogeni gen" u kontekstu varijante HSV iz pronalaska se odnosi na gen (npr., Us11 ili Us12) koji je gen koji se prirodno pojavljuje na prirodnom položaju u HSV genomu. Intaktni endogeni geni mogu da budu spojeni sa heterolognim genom. Na primer, endogeni Us11 može da bude spojen sa GFP, ali sve dok se Us11 nalazi u položaju u HSV genomu, što je i dalje intaktni endogeni gen sa značenjem termina koji se ovde koristi.

[0032] Kao što se ovde koristi, fraza "kome nedostaju funkcionalni ICP34.5 kodirajući geni" u kontekstu varijante HSV iz pronalaska znači da svaki od dva gena koji kodiraju ICP34.5 u HSV genomu su parcijalno ili potpuno izbrisani, zamenjeni, premešteni, ili na drugi način premešteni tako da funkcionalni ICP34.5 polipeptid nije eksprimiran sa HSV. Slično, zamena ICP34.5 kodirajućeg gena (npr., u frazi "svaki ICP34.5 kodirajući gen je zamenjen") znači da heterologna sekvenca, npr., u genskoj ekspresionoj kaseti, je supstituisana za sve ili deo ICP34.5 kodirajućeg gena (γ134.5), npr., homolognom rekombinacijom, tako da funkcionalni ICP34.5 ne može da bude eksprimiran sa tog gena. ICP34.5 kodirajući gen može da bude zamenjen sa bilo kojom pogodnom heterolognom sekvencom. Takva heterologna sekvenca može zatim da bude zamenjena sa drugom heterolognom sekvencom. Na primer, kao što se opisuje u Primeru 2, ispod, ICP34.5 kodirajući gen je prvo zamenjen sa Beta-glukoronidazom da bi se izvršila delecija ICP34.5 kodirajućeg gena, i zatim je B-glukoronidaza zamenjena sa IE-Us11.

[0033] Termini "polinukleotidna kaseta" i "genska ekspresiona kaseta" označava manipulativni fragment DNK koji nosi, i može da eksprimira, jedan ili više gena od interesa između dva ili više setova restrikcionih mesta. Može da se prenese sa jedne DNK sekvence (obično vektora) na drugu ’isecanjem’ fragmenta upotrebom restrikcionih enzima i ’kopiranja’ nazad u novi kontekst. Obično, DNK fragment (sekvenca nukleinske kiseline) je operativno povezana sa sekvencama za kontrolu genske ekspresije koje obezbeđuju odgovarajući traskrpciju i translaciju ciljnih sekvenci nukleinskih kiselina (gena). Takve sekvence elemenata mogu da ukljuće promoter i signal za poliadenilaciju. "Polinukleotidna kaseta" dalje može da sadrži "vektorske sekvence." Pod "vektorskim sekvencama" je označena bilo koja sekvenca od nekoliko nukleinskih kiselina koje su ustanovljene u oblasti tehnike koje su korisne u postupcima rekombinovane DNK u pronalasku da se olakša kloniranje i propagacija polinukleotidne kasete uključujući (ali bez ograničenja) plazmide, kozmide, bakterijske veštačke hromozome, fagne vektore, virusne vektore, i veštačke hromozome kvasca.

[0034] Termin "heterologni" se odnosi na kombinaciju elemenata koji se ne pojavljuju u prirodi. Prema tome, na primer, "heterologni gen" se odnosi na gen koji treba da se uvede u genom virusa, pri čemu se taj gen ne nalazi prirodno u virusnom genomu ili je homolog gena koji je eksprimiran u virusu iz različitih vrsta (npr., gen UL49.5 herpes virusa govečeta, koji kodira za TAP-inhibitor, je heterologan kada se insertuje u HSV genom, čak iako HSV takođe eksprimira gen koji kodira za TAP-inhibitor (Us12), koji ima različitu sekvencu nukleinske kiseline i deluje preko različitog biohemijskog mehanizma.

[0035] Varijanta HSV iz pronalaska inficira i replicira se u tumorskim ćelijama, nakon toga ubijajući tumorske ćelije. Prema tome, takvi virusi su kompetentni za replikaciju. Poželjno, oni su selektivno kompetentni za replikaciju, tj., "selektivno se repliciraju" u tumorskim ćelijama. Ovo znači da se ili repliciraju u tumorskim ćelijama i ne u ćelijama koje nisu tumorske, ili da se efikasnije repliciraju u tumorskim ćelijama nego u ne-tumorskim ćelijama. Na primer, gde se varijanta HSV koristi za lečenje tumora bešike, varijanta HSV može da se replicira u ćelijama tumora bešike ali ne u okolnom tkivu.

Ćelije u kojima virus može da se replicira su permisivne ćelije. Merenja selektivne kompetencije replikacije može da se izvede pomoću testova koji su ovde opisani za merenje replikacije i kapaciteta ubijanja tumorske ćelije, i takođe se analiziraju po potrebi ovde opisanim statističkim postupcima.

[0036] Fraza "pojačavaju anti-tumorski odgovor" u kontekstu varijante HSV znači da se "antitumorski" odgovor indukuje nakon infekcije sa varijantom HSV, kao što se meri, na primer, i bez ograničenja, smanjenim tumorskim rastom, smanjenim tumorskim metastazama, povećanom ćelijskom smrti tumora, povećanom infiltracijom u tumor CD8 T ćelija, povećanim CD8 T ćelijamaposredovanim ubijanjem tumorskih ćelija, povećanim nivoima anti-tumorskih imunskih ćelija u životinji ili čoveku, i/ili povećanoj indukciji anti-tumorskog imuniteta, je veće u poređenju sa antitumorskim odgovorom u kontroli, npr., u tumorskim ćelijama posle infekcije sa, npr., Δ34.5 HSV kome nedostaje itaktni endogeni Us12 gen. Kao primer, i bez ograničenja, anti-tumorski odgovor je pojačan sa varijantom HSV ukoliko varijanta HSV povećava ćelijsku smrt tumora za, npr., najmanje 5-puta, najmanje 10-puta, najmanje 15-puta, najmanje 20-puta, najmanje 25-puta, najmanje 30-puta, najmanje 35-puta, najmanje 40-puta, najmanje 45-puta, najmanje 50-puta, najmanje 100-puta, najmanje 200-puta, najmanje 500-put, najmanje 1000-puta ili više, u poređenju sa kontrolom.

[0037] Kao što se ovde koristi, "imunomodulatorni polipeptid" u kontekstu varijante HSV iz pronalaska se odnosi na polipeptid koji može da menja imunski odgovor ili prema varijanti HSV ili ćeliji domaćina (tj., ćeliji inficiranoj varijantom HSV), i/ili prema neinficiranim tumorskim ćelijama domaćina. Na primer, jedan imunomodulatorni polipeptid obuhvaćen terminom je TAP inhibitorni polipeptid, kao što je, ali bez ograničenja, UL49.5 polipeptid iz herpes virusa govečeta (BHV). Bez namere za vezivanjem za teoriju ili bilo koji poseban mehanizam delovanja, smatra se da polipeptidni inhibitori TAP sprečavaju prezentovanje virusnih antigena na MHC molekulima na ćelijama domaćina, čime sprečavaju prepoznavanje virusima inficiranih ćelija od strane imunskog sistema domaćina (npr., citolitičkim CD8 T ćelijama). Prema tome, TAP inhibitori smanjeno regulišu sposobnost imunskog sistema domaćina da prepozna i ubija ćelije koje su inficirane virusima. Drugi imunomodulatorni polipeptidi, međutim, uključuju imunostimulatorne polipeptide, kao što su, ali bez ograničenja, GM-CSF, TNF-α i CD40L. Takvi primeri polipeptida regrutuju i/ili aktiviraju imunske ćelije da se infiltriraju u tumore, postupak imunoaktivnih molekula, prepoznaju tumorske ćelije i/ili liziraju tumorske ćelije (npr., pomažu u posredovanju onkolitičke funkcije varijante HSV iz pronalaska), i, prema tome pojačano modulišu imunski odgovor domaćina. Važno, u određenim izvođenjima, prisustvo imunostimulatornih polipeptida, npr., GM-CSF, koji mogu da pojačaju imunsko regrutovanje na ćelije i tumore koji su inficirani virusima, ima potencijal da bude štetno za virusnu infekciju tumorskih ćelija i širenje virusa kroz tumorske ćelije. Prema tome, posebno je poželjno da varijanta HSV iz pronalaska dodatno sadrži heterologni polipeptid koji može da pojača sposobnosti izbegavanja imunskog sistema, i prema tome replikaciju i širenje, varijante HSV, kao što je, ali bez ograničenja na polipeptide koji inhibiraju prezentovanje virusnih antigena od strane inficiranih ćelija (npr., UL49.5 iz BHV).

[0038] Termini "ekspresija" i "eksprimirati" znači omogućiti ili prouzrokovati da se ispolji informacija u genu ili sekvenci DNK, na primer proizvodnjom polipeptida kodiranog genom ili DNK sekvencom. Kao što se ovde koristi, gen ili DNK sekvenca se eksprimira u ili pomoću virusa da se obrazuje "proizvod ekspresije" kao što je polipeptid. Sam ekspresioni proizvod, npr., dobijeni polipeptid, takođe može da se smatra "eksprimiranim" pomoću virusa.

1

[0039] Termin "gen", takođe poznat pod imenom "strukturni gen" označava DNK sekvencu koja kodira za ili odgovara odgovarajućoj sekvenci amino kiselina koja sadrži sve ili deo jednog ili više polipeptida (npr., proteina), i može ili ne mora da uključi regulatorne DNK sekvence, kao što su sekvence promotera, koje na primer određuju uslove pod kojim se gen eksprimira. Neki geni, koji nisu strukturni geni, mogu da se transkribuju sa DNK do RNK, ali se ne translatiraju u sekvencu aminokiselina. Drugi geni mogu da funkcionišu kao regulatori strukturnih gena ili kao regulatori transkripcije DNK.

[0040] Kodirajuća sekvenca je "pod kontrolom" ili "operativno povezana sa" ekspresionim kontrolnim sekvencama u virusu ili ćeliji kada RNK polmeraza transkribuje kordirajuću sekvencu u RNK, posebno iRNK, koja se zatim spaja (ukoliko sadrži introne) i translatira u polipeptid kodiran od strane kodirajuće sekvence.

[0041] Termin "ekspresiona kontrolna sekvenca" se odnosi na promoter i bilo koje elemente pojačivača ili supresije koji se kombinuju da regulišu transkripciju kodirajće sekvence. U poželjnom izvođenju, element je transkripcioni promoter.

[0042] Sekvenca "koja kodira" proizvod ekspresije, kao što je polipeptid, je minimalna nukelotidna sekvenca koja, kada se eksprimira, dovodi do proizvodnje tog polipeptida.

[0043] Termin "ćelija domaćina" označava bilo koju ćeliju ili bilo koji organizam koji se bira, modifikuje, transformiše, raste, inficira ili koristi ili sa kojim se manipuliše na bilo koji način za proizvodnju supstance od strane ćelija ili za rast, testiranje, skrining, ili izvođenje druge željene aktivnosti na, varijanti HSV pronalaska. Na primer, ćelija domaćina može da bude ona kojom se manipuliše da bi se eksprimirao određeni gen, DNK ili RNK sekvenca, polipeptid. U poželjnom izvođenju, ćelija domaćina je bilo koja koja može da bude inficirana sa varijantom HSV (ili kontrolom HSV) iz pronalaska, npr., za skrining ili druge testove koji se opisuju infra, npr., za skrining aktivnosti, replikacije i efikasnosti sinteze proteina varijante HSV iz pronalaska. U oblasti tehnike su dobro poznate takve ćelije. Ćelije domaćina mogu in vitro da se gaje u kulturi ili sa jednom ili više ćelija u nehumanoj životinji (npr., transgena životinja ili životinja sa prolaznom transfekcijom). Primeri pogodnih ćelija domaćina uključuju, ali nisu ograničene na, UMUC3, T24, J82 and EJ (MGH-U1), J82 (CO’T), RT4, RT112, TCCSuP i SCaBER ćelije. "Lečenje" ili "tretman" stanja, poremećaja ili bolesti uključuje: (1) prevenciju ili odlaganje pojavljivanja kliničkih ili subkliničkih simptoma stanja, poremećaja ili bolesti koja se razvija kod sisara koja može da bude pogođena sa ili predisponirana na stanje, poremećaj ili bolest ali još ne prolazi kroz ili ispoljava kliničke ili subkliničke simptome stanja, poremećaja ili bolesti; ili (2) inhibira stanje, poremećaj ili bolest, tj., zaustavljanjem smanjenjem ili odlaganjem razvijanja bolesti ili njenog povratka (u slučaju tretmana održavanja) ili najmanje jednog kliničkog ili njegovog subliničkog simptoma; ili (3) ublažavanjem bolesti, tj., uzrokovanjem regresije stanja, poremećaja ili bolesti ili najmanje jednog od njihovih kliničkih ili subkliničkih simptoma.

[0044] Na primer, u vezi sa kancerom, termin "lečenje" može da označi olakšanje ili ublažavanje najmanje jednog simptoma koji se bira iz grupe koja obuhvata tumorski rast, metastazu, osetljivost tumorskih ćelija na tretmane kao što je hemoterapija, terapija zračenjem, termoterapija, itd. Termin "lečiti" se takođe odnosi na zaustavljanje, odlaganje početka (tj., period pre kliničkog pojavljivanja bolesti) i/ili smanjuje rizik razvijanja ili pogoršanja bolesti. U specifičnom izvođenju, lečenje kancera obuhvata ubijanje tumorskih ćelija, npr., sa onkolitičkim virusom iz pronalaska.

[0045] Korist subjekta koji se leči je ili od statističkog značaja ili je barem uočljiv pacijentu ili lekaru.

[0046] "Pacijent" ili "subjekat" se odnosi na sisare, na primer bez ograničenja, glodare (npr., miševe i pacove), pse, mačke, krave, ovce, primate, i uključuje humane i veterinarske subjekte.

[0047] "Efikasna količina" jedinjenja iz predmetnog pronalaska uključuje doze koje delom ili potpuno dostižu željeni terapeutski, profilaktički, i/ili biološki efekat. Prava količina koja je efikasna za određenu primenu zavisi od stanja koje se leči i od načina davanja. Efikasna količina za upotrebu kod ljudi može da se odredi iz životinjskih modela.

[0048] Kao što se ovde koristi termin "terapeutski efikasan" se odnosi na dozu ili količinu koja se odnosi na onu količinu jedinjenja ili kompozicije (npr., farmaceutske kompozicije) koja je dovoljna da dovede do željene aktivnosti nakon davanja životinji kojoj je potrebno. Prema tome, u kontekstu predmetnog pronalaska, termin "terapeutski efikasna količina" se odnosi na onu količinu jedinjenja ili kompozicije koja je dovoljna za lečenje najmanje jednog simptoma kancera, kao što je ali bez ograničenja proliferacija ćelija kancera, rast tumora, rezistencija na apoptozu, i angiogeneza, i/ili na inibiranje metastaza ćelija kancera. Kada se daje kombinacija aktivnih sastojaka, efikasna količina kombinacije može ili ne mora da uključi količine svakog sastojka koje bi bile efikasne ukoliko se daju zasebno. "Profilaktički efikasna količina" je količina farmaceutske kompozicije koja, kada se daje subjektu, ima željeni profilaktički efekat, npr., sprečavanje ili odlaganje početka (ili ponovnog pojavljivanja) kancera, ili smanjenjem verovatnoće početka (il ponovnog pojavljivanja) kancera ili simptoma kancera. Puni profilaktički efekat se ne pojavljuje neophodno davanjem jedne doze, i može da se pojavi samo nakon davanja serije doza. Prema tome, profilaktički efikasna količina može da se daje kroz jedno ili više davanja.

[0049] Termin "oko" ili "približno" označava u prihvatljivom opsegu za određenu vrednost kao što je određeno od strane stručnjaka iz oblasti tehnike, koja delom zavisi od toga kako je vrednost izmerena ili određena, npr., ograničenjima u mernom sistemu. Na primer, "oko" može da označava opseg do oko 20%, poželjno do oko 10%, poželjnije do 5%, i poželjnije još do 1% od date vrednosti. Alternativno, posebno u odnosu na biološke sisteme ili postupke, termin može da označava unutar reda veličine, poželjno unutar 5 puta, i poželjnije unutar 2 puta, od vrednosti. Osim ukoliko nije drugačije navedeno, termin ’oko’ označava unutar prihvatljivog opsega greške za određenu vrednost, kao što je ± 1-20%, poželjno ± 1-10% i poželjnije ± 1-5%.

[0050] Kao što se ovde koristi, termini "mutirani" i "mutacija" se odnosi na bilo koju detektabilnu promenu u genetičkom materijalu (npr., DNK) ili bilo koji postupak, mehanizam, ili rezultat takve promene. Ovo uključuje genske mutacije, u kojima je struktura (npr., DNK sekvenca) gena izmenjena, bilo koji gen ili DNK koji se dobija iz bilo kog postupka mutacije, i bilo koji proizvod ekspresije (npr., polipeptid) eksprimiran pomoću modifikovanog gena ili DNK sekvence. Kao što se ovde koristi, termin "mutiranje" se odnosi na postupak nastajanja mutiranog molekula ili mutacije.

[0051] Termin "hibridizacija nukleinske kiseline" se odnosi na anti-paralelno vodonično vezivanje između dve dvolančane nukleinske kiseline, gde se A sparuje sa T (ili U ukoliko je RNK nukleinska kiselina) i C sparuje sa G. Molekuli nukleinske kiseline "mogu da hibridizuju" međusobno kada najmanje jedan lanac jednog molekula nukleinske kiseline može da obrazuje vodonične veze sa komplementarnim bazama drugog molekula nukleinske kiseline pod definisanim uslovima jačine. Određuje se jačina hibridizacije, npr., pomoću (i) temperature na kojoj se hibridizacija i/ili ispiranje izvodi, i (ii) jonske jačine i (iii) koncentracije denaturanata kao što je formamid hibridizacije i rastvora za ispiranje, kao i drugih parametara. Hibridizacija zahteva da dva lanca sadrže u suštini komplementarne sekvence. U zavisnosti od jačine hibridizacije, međutim, neki stepen nepoklapanja može da bude tolerisan. Pod uslovima "niskog vezivanja", toleriše se veći procenat nepoklapanja (tj, neće sprečiti obrazovanje anti-paralelnog hibrida). Videti Molecular Biology of the Cell, Alberts et al., 3rd ed., New York and London: Garland Publ., 1994, Ch.7.

[0052] Obično, hibridizacija dva lanca na visokom jačinom zahteva da sekvence ispoljavaju visok stepen komplementarnosti preko produžene porcije njihovih dužina. Primeri uslova jakog vezivanja uključuju: hibridizaciju sa filter-vezanom DNK u 0,5 M NaHPO4, 7% SDS, 1 mM EDTA na 65°C, zatim ispiranje sa 0,1x SSC/0,1% SDS na 68°C (gde 1x SSC je 0,15M NaCl, 0,15M Na citrat) ili za oligonukleotidne molekule ispiranje u 6xSSC/0,5% natrijum pirofosfatu na oko 37°C (14 nukleotidaduge oligo), na oko 48°C (za oko 17 nukleotida-duge oligo), na oko 55°C (za oko 20 nukleotida-duge oligo), i na oko 60°C (za 23 nukleotida duge-oligo)). Prema tome, termin "visoko jaka hibridizacija" se odnosi na kombinaciju rastvarača i temperature gde će se dva lanca spariti da bi obrazovali "hibrid" heliks samo ukoliko su njihove nukleotidne sekvence skoro perfektno komplementarne (videti Molecular Biology of the Cell, Alberts et al., 3rd ed., New York and London: Garland Publ., 1994, Ch.

7).

[0053] Uslovi srednje ili umerene jačine (kao što su, na primer, vodeni rastvor 2XSSCna 65°C; alternativno, na primer, hibridizacija sa filter-vezanom DNK u 0,5 M NaHPO4, 7% SDS, 1 mM EDTA na 65°C, i ispiranje u 0,2 x SSC/0,1% SDS na 42°C) i niske jačine (kao što je, na primer, vodeni rastvor 2XSSC na 55°C), zahtevaju odgovarajuću manju sveukupnu komplementarnost za pojavu hibridizacije između dve sekvence. Specifična temperatura i uslovi prisustva soli za bilo koju jaku reakciju hibridizacije zavisi od koncentracije ciljne DNK i dužine i bazne kompozicije probe, i normalno se empirijski određuje u preliminarnim eksperimentima, koji su rutinski (videti Southern, J. Mol. Biol.

1975; 98: 503; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 2, ch. 9.50, CSH Laboratory Press, 1989; Ausubel et al. (eds.), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & Sons, Inc., New York, at p.2.10.3).

[0054] Kao što se ovde koristi, termin "standardni uslovi hibridizacije" se odnosi na uslove hibridizacije koji omogućavaju hibridizaciju sekvenci koje imaju najmanje 75% identitet sekvenci. Prema specifičnom izvođenju, uslovi hibridizacije veće jačine mogu da se koriste da se omogući hibridizacija bilo kojih sekvenci koje imaju najmanje 80% identitet sekvenci, najmanje 90% identitet sekvenci, najmanje 95% identitet sekvenci, ili najmanje 99% identitet sekvenci.

[0055] Molekuli nukelinske kiseline koji "hibridizuju" sa bilo kojim željenim nukleinskim kiselinama iz predmetnog pronalaska mogu da budu bilo koje dužine. U jednom izvođenju, takvi molekuli nukleinske kiseline su najmanje 10, najmanje 15, najmanje 20, najmanje 30, najmanje 40, najmanje 50, i najmanje 70 nukleotida u dužini. U drugom izvođenju, molekuli nukleinske kiseline koji hibridizuju su oko iste dužine kao određena željena nukleinska kiselina.

[0056] "Molekul nukleinske kiseline" se odnosi na polimerni oblik fosfatnog estra ribonukleozida (adenozin, guanozin, uridin ili citidin; "RNK molekula") ili dezoksiribonukelozida (dezoksiadenozin, dezoksiguanozin, dezoksitimidin, ili dezoksicitidin; "DNK molekuli"), ili bilo koje njihove fosfoestarske analoge, kao što su fosforotioati i tioestri, i u jednolančanom obliku, ili u obliku dvolančanog heliksa. Mogući su dvolančani heliksi DNK-DNK, DNK-RNK i RNK-RNK. Termin molekul nukleinske kiseline, i

1

posebno DNK ili RNK molekul, se odnosi samo na primarnu i sekundarnu strukturu molekula, i ne ograničava ga na bilo koje tercijarne oblike. Prema tome, ovaj termin uključuje dvolančanu DNK nađenu, između ostalog, u linearnim (npr., restrikcionim fragmentima) ili kružnim DNK molekulima, plazmidima, i hromozomoma. Razmatrajući strukturu određenih dvolančanih DNK molekula, sekvence mogu ovde da se opišu u skladu sa normalnom konvencijom dajući samo sekvencu u 5’ do 3’ pravcu zajedno sa lancem DNK koji se ne prepisuje (tj., lanac koji ima sekvencu homolognu sa iRNK). "Rekombinovani DNK molekul" je DNK molekul koji je prošao molekulano biološku manipulaciju.

[0057] Kao što se ovde koristi, termin "homologi" se odnosi na gene kod različitih vrsta koji su očigledno evoluirali specijacijom iz zajedničkog predačkog gena. Normalno, homologi zadržavaju istu funkciju tokom evolucije. Identifikacija homologa može da obezbedi pozdano predviđanje genske funkcije u novo sekvenciranim genomima. Algoritmi poređenja sekvence koji mogu da se koriste za identifikovanje homologa uključuju bez ograničenja BLAST, FASTA, DNA Strider, i GCG pileup program. Homologi često imaju visoku sličnost u sekvenci. Predmetni pronalazak obuhvata sve homologe željenog polipeptida.

[0058] Termini "procenat (%) sličnosti sekvence", "procenat (%) identiteta sekvence", i slično, generalno se odnosi na stepen identiteta ili korespodencije između različitih nukleotidnih sekvenci molekula nukleinske kiseline ili sekvenci aminokiselina polipeptida koje mogu ili ne moraju da dele zajedničko evoluciono poreklo (videti Reeck et al., supra). Identitet sekvence može da se odredi upotrebom bilo kog od brojnih javnosti dostupnih algoritama za pretraživanje poređenja sekvenci, kao što su BLAST, FASTA, DNA Strider, GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin), itd.

[0059] Da bi se odredio procenat identiteta između dve sekvence aminokiselina ili dva molekula nukleinskih kiselina, sekvence se poravnaju za optimalne svrhe poređenja. Procenat identiteta između dve sekvence je funkcija broja identičnih položaja koje sekvence dele (tj., procenat identiteta = broj identičnih položaja/ukupan broj položaja (npr., preklapajućih položaja) x 100). U jednom izvođenju, dve sekvence su, ili su oko iste dužine. Procenat identiteta između dve sekvence može da se odredi upotrebom postupaka sličnih onima koji se dole opisuju, sa ili bez omogućenih „gaps“. U računanju procenta identiteta sekvence, obično se broje tačna poklapanja.

[0060] Određivanje procenta identiteta između dve sekvence može da se postigne upotrebom matematičkog algoritma. Primer koji ne ograničuje matematičkog algoritma za poređenje dve sekvence je algoritam prema Karlin i Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87:2264, modifikovano prema Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90:5873-5877. Takav algoritam je uključen u NBLAST i XBLAST programe prema Altschul et al., J. Mol. Biol.1990; 215: 403. BLAST pretraživanje nukleotida može da se izvede pomoću NBLAST programa, rezultat = 100, dužine reči = 12, da se dobiju nukleotidne sekvence homologne sa sekvencama iz pronalaska. BLAST proteinsko pretraživanje može da se izvede pomoću XBLAST programa, rezultat = 50, dužina reči = 3, da se dobiju sekvence aminokiselina homologne sa proteinskim sekvencama iz pronalaska. Da bi se dobili „gapped“ poravnanja za svrhe poređenja, Gapped BLAST može da se koristi kao što se opisuje u Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997, 25:3389. Alternativno, PSI-Blast može da se koristi za izvođenje ponovnog pretraživanja koje detektuje dalju vezu između molekula. Videti Altschul et al. (1997) supra. Kada se koriste BLAST, Gapped BLAST, i PSI-Blast programi, mogu da se koriste uobičajeni parametri odgovarajućih programa (npr., XBLAST i NBLAST). Videti ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ na WorldWideWeb. Drugi ne-ograničavajući primer matematičkog algoritma koji se koristi za poređenje sekvenci je algoritam prema Myers and Miller, CABIOS 1988; 4: 11-17. Takav algoritam je uključen u ALIGN program (verziju 2.0), koji je deo softverskog paketa poravnanja GCG sekvence. Kada se ALIGN program koristi za poređenje sekvenci amino kiselina, tabela PAM120 težine ostataka, „gap length penalty“ od 12, i „gap penalty“ od 4 može da se koristi.

[0061] U poželjnom izvođenju, procentat identiteta između dve sekvence amino kiselina se određuje upotrebom algoritma Needleman i Wunsch (J. Mol. Biol. 1970, 48:444-453), koji je deo GAP programa u GCG softverskom paketu (Accelrys, Burlington, MA; dostupno na accelrys.com na WorldWideWeb), upotrebom ili Blossum 62 matrice ili PAM250 matrice, “gap” težine 16, 14, 12, 10, 8, 6, ili 4, i dužine težine 1, 2, 3, 4, 5, ili 6. U još drugom poželjnom izvođenju, procenat identiteta između dve nukleotidne sekvence se određuje upotrebom GAP programa u GCG softverskom paketu upotrebom NWSgapdna.CMP matrice, “gap” težine 40, 50, 60, 70, ili 80, i dužine težine 1, 2, 3, 4, 5, ili 6. Posebno poželjan set parametara (i onih koji mogu da se koriste ukoliko onaj koji vrši praksu nije siguran koje parametre treba da koristi za određivanje da li je molekul iz pronalaska identičan u sekvenci ili ograničeno homologan) je korišćenje Blossum 62 matriksa bodovanja sa “gap open penalty” od 12, “gap extend penalty” od 4, I “ frameshift gap penalty” od 5.

[0062] Statistička analiza ovde opisanih svojstava može da se izvede upotrebom standardnih testova, na primer, t-testova, ANOVA, ili Hi kvadrat testova. Obično, statistički značaj se meri do nivoa p=0,05 (5%), poželjnije p=0,01, p=0,001, p=0,0001, p=0,000001.

Struktura Herpes Simpleks Virusa i Varijanti

[0063] Varijanta HSV iz pronalaska može da se izvede iz soja herpes simpleks virusa (HSV). HSV soj može da bude HSV-1 ili HSV-2 soj, ili njihov derivat, i poželjno je HSV-1. Na primer, varijanta HSV iz pronalaska može da se izvede iz divljeg tipa HSV-1, soja 17, koji ima GenBank pristupni br. X14112 i sekvencu nukleinske kiseline koja je predstavljena u SEQ ID NO: 1 u listi sekvenci.

[0064] HSV sojevi iz pronalaska mogu da budu "laboratorijski" ili "ne-laboratorijski" ("klinički") sojevi. Laboratorijski sojevi koji se trenutno koriste uključuju HSV-1 soj F, HSV-1 soj 17, HSV-1 soj KOS, i soj Patton. Klinički sojevi korisni u pronalasku obično imaju poboljšanu onkolitičku aktivnost u poređenju sa HSV-1 sojevima F, 17+ i KOS sojevima sa ekvivalentnim modifikacijama.

[0065] Dok je sekvenca kompletnog genoma soja 17 HSV-1 ovde obezbeđena kao primer, sekvenca nukelinske kiseline bilo kog pogodnog laboratorijskog soja (npr., F, KOS, i Patton) i/ili kliničkog izolata može da se koristi u skladu sa predmetnim pronalaskom. Derivati HSV, koji takođe mogu da se koriste u skladu sa pronalaskom koji se ovde opisuju, uključuju ali bez ograničenja inter-tip rekombinanata koji sadrže DNK iz HSV-1 i HSV-2 sojeva. Takvi inter-tip rekombinanti su u oblasti tehnike opisani, na primer u, Thompson et al., "DNA sequence and RNA transcription through a site of recombination in a non-neurovirulent herpes simplex virus intertypic recombinant," Virus Genes, 1(3): 275-286, 1998; and Meignier et al., "In vivo behaviour of genetically engineered herpes simplex viruses R7017 and R7020: construction and evaluation in rodents," J. Infect. Dis., 158(3): 602-614, 1988. Derivati poželjno imaju najmanje 70% homologije u sekvenci sa ili HSV-1 ili HSV-2 genomom, poželjnije najmanje 80%, još poželjnije najmanje 90 ili 95%. Poželjnije, derivat je najmanje 70%

1

identičan u sekvenci sa ili HSV-1 ili HSV-2 genoma, poželjnije najmanje 80% identičan, još više poželjno najmanje 90%, 95% ili 98% identičan.

[0066] HSV-1 je dvolančani DNK virus, veličine genoma 152 kb, koji se replicira i transkribuje u nukleusu ćelije domaćina. HSV-1 ima dva jedinstvena segmenta genoma: Jedinstveni-dugi (UL) i Jedinstveni-kratki (Us). Kao što je prikazano na Slici 1A, obe jedinstvene sekvence su ograničene invertovanim terminalnim ponovcima. U HSV-1 divljeg tipa,γ134.5 gen, koji kodira za ICP34.5 polipeptid i ima neurovirulencu [videti, Chou J, et al. "Mapping of herpes simplex virus-1 neurovirulence to gamma 134.5, a gene nonessential for growth in culture." Science 1990; 250:1262-6], je diploidni element koji se nalazi u okviru invertovanih ponovaka koji ograničavaju UL. Us12 gen, koji se nalazi u Us segmentu, se eksprimira veoma rano tokom infekcije sa trenutnim ranim promoterom. Us11 gen,γ2gen, je eksprimiran kasno u virusnoj infekciji sa odvojenim promotorom koji se nalazi u Us12 genu.

[0067] U genomu HSV-1 soja 17 (GenBank pristupni br. X14112) (SEQ ID NO: 1), ORF za Us11 se nalazi na nukleotidima 144761-145246, i ima sledeću sekvencu:

[0068] U genomu HSV-1 soja 17 (GenBank pristupni br. X14112) (SEQ ID NO: 1), ORF za Us12 se nalazi na nukleotidima 145311-145577, i ima sledeću sekvencu:

[0069] Ovde su obezbeđeni primeri sekvenci određenih gena kodiranih u HSV-1 genomu kao i primera sekvence čitavog HSV-1 genoma. Međutim, treba razumeti da predmetni pronalazak nije ograničen primerima sekvenci koje su ovde obezbeđene, i pronalazak uključuje varijante tih sekvenci koje kodiraju iste gen(e), kao i sekvence nukleinskih kiselina (gena) koje kodiraju funkcionalne homologe (tj., polipeptid koji u suštini ima istu aktivnost, ali je kodiran različitim genom).

[0070] Brojne funkcije herpes simpleks virusa tipa 1 kontrolišu translaciju regulacijom fosforilacije faktora inicijacije eIF2 na njegovoj alfa subjedinici. Oba dva poznata regulatora,γ134.5-kodirani i Us11 genski proizvodi, se kasno proizvode u životnom ciklusu virusa, iako jeγ134.5 gen eksprimiran preγ2Us11 gena, kakoγ2geni zahtevaju replikaciju virusne DNK za njihovu ekspresiju dokγ1geni ne zahtevaju. ICP34.5 polipeptid, proizvodγ134.5 gena, preko GADD34-povezanog domena, se vezuje za ćelijsku fosfatazu (PP1α), održavajući pul aktivnog, nefosforilisanog eIF2. Infekcija ranih ćelija u kulturi sa ICP34.5 mutiranim virusom dovodi do nakupljanja fosforilovanog eIF2α i inhibicije translacije pre završetka virusnog litičkog programa. Ektopična, trenutna-rana ekspresija Us11 sprečava fosforilaciju eIF2α i inhibicija translacije se uočava u ćelijama inficiranim sa mutiranim ICP34.5 inhibiranjem aktivacije ćelijske kinaze PKR i nakon toga fosforilacije eIF2α. Dalje, Us11 polipeptid je kritičan za odgovarajuće kasne brzine translacije. Gašenje sinteze proteina koje se

1

uočava u ćelijama inficiranim sa ICP34.5 mutiranim virusom nastaje iz kombinovanog gubitka funkcija ICP34.5 i Us11, kako se Us11 iRNK ne translatira u ćelijama koje su inficirane sa mutiranim ICP34.5.

[0071] Virusni regioni koji su izmenjeni za svrhe koje se opisuju gore u tekstu mogu da budu ili eliminisani (kompletno ili delom), ili modifikovani tako da budu ne-funkcionalni, ili supstituisani sa drugim sekvencama, na primer, i bez ograničenja, genom koji kodira enzim za konvertovanje proleka, genom koji kodira polipeptid koji može da prouzrokuje međusobno spajanje ćelija, genom koji kodira imunomodulatorni polipeptid, ili genom koji kodira funkciju koja modifikuje vanćelijski matriks.

[0072] Derivat može da ima sekvencu HSV-1 ili HSV-2 genoma koja je modifikovana sa nukleotidnim supstitucijama, na primer od 1, 2 ili 3 do 10, 25, 50 ili 100 supstitucija. HSV-1 ili HSV-2 genom mogu alternativno ili dodatno da budu modifikovani sa jednom ili više insercija i/ili delecija i/ili sa ekstenzijom na jednom ili oba kraja.

[0073] Svojstva varijante HSV u odnosu na tumorske ćelije mogu da se mere na bilo koji način koji je poznat iz oblasti tehnike. Na primer, kapacitet varijante HSV da inficira tumorsku ćeliju može da se kvantifikuje merenjem kapaciteta varijante HSV da se replicira u tumorskoj ćeliji, kao što se meri merenjem rasta, npr., merenjem virusnog rasta (virusnog titra) u ćelijama u periodu od 6, 12, 24, 36, 48 ili 72 sati ili duže. Kao što je opisano u Primerima, ispod, sposobnost varijante HSV da inficira i da se replicira u tumorskoj ćeliji može da se meri određivanjem procenata ćelija koje ispoljavaju citopatski efekat (cpe) nakon infekcije sa varijantom HSV, gde varijanta HSV koja ima sposobnost da inficira ćelije će indukovati cpe u najmanje oko 50%, 60%, 70%, 80% ili poželjno 90% ćelija. Sposobnost varijante HSV da inficira i da se replicira u tumorskoj ćeliji može takođe indirektno da se meri merenjem proizvodnje virusnih polipeptida (npr., pomoću obeležavanjem 35S cisteina i metionina zatim SDS-PAGE i autoradiografijom i Western blot analizom).

[0074] Sposobnost virusa da ubija tumorske ćelije može grubo da se kvantifikuje očima ili tačnije da se kvantifikuje određivanjem broja živih ćelija koje tokom vremena ostaju u datoj vremenskoj tački i mnoštva infekcije (MOI) za dati ćelijiski tip. Na primer, poređenja mogu da se napreve preko 24, 48 ili 72 časova i upotrebom bilo kog tipa ćelije tumora. Posebno, UMUC3 invazivni, podmakli stadijum kancera bešike, HT29 kolorektalni adenokarcinom, LNCaP.FGC adenokarcinom prostate, MDA-MB-231 adenokarcinom grudi, SK-MEL-28 maligni melanom ili U-87 MG glioblastom ćelija astrocitoma može da se koristi. Drugi primeri ćelijskih linija koje su dobro poznate u oblasti tehnike i koje mogu da se koriste uključuju, ali nisu ograničene na, HTB-161, SW620, A2780S, COLO205, A2780DDP, CX-1, SW948, SKBR3, MCF-7, HCT-15, CACO-2, A549, NEC, LX-1, T47D, B7474, DU145, PC3, SK-MEL-303, i LN-CAP ćelijske linije. Bilo koji od ovih ćelijskih tipova ili bilo koja kombinacija ovih ćelijskih tipova može da se koristi, kao što mogu drugi ćelijski tipovi tumora. Može da bude korisno da se konstruiše standardni panel ćelijskih tipova tumora za ovu svrhu. Da bi se izbrojao broj živih ćelija koje ostaju u datoj vremenskoj tački, ćelije koje se boje triptan plavo (tj., žive ćelije) mogu da se broje. Kvantifikovanje takođe može da se izvede testom fluorescentno aktiviranim sortiranjem ćelija (FACS) ili MTT. Sposobnost ubijanja ćelija tumora takođe može da se meri in vivo, npr., merenjem smanjenja u zapremini tumora koja je izvedena upotrebom određenog virusa, kao što se opisuje, npr., u primerima, ispod.

[0075] Da bi se odredila svojstva varijante HSV iz pronalaska, generalno je poželjno koristiti standardni referentni laboratorijski soj za poređenje. Može da se koristi bilo koji pogodni standardni laboratorijski referentni soj. U slučaju HSV, poželjno je upotrebiti jedan ili više od HSV-1 soja 17+,

1

HSV-1 soja F, HSV-1 ssoja KOS, ili HSV-1 soja Patton. Referentni soj će obično imati ekvivalentne modifikacije sa sojem pronalaska koji se ispituje. Prema tome, referentni soj će obično imati ekvivalentne modifikacije, kao što su genske delecije i insercije heterologih gena. U slučaju varijante HSV iz pronalaska, gde su ICP34.5 kodirajući geni zamenjenu ili se na drugi način održavaju nefunkcionalnim, ICP34.5 kodirajući geni se takođe održavaju ne-funkcionalnim u referetnom soju. Modifikacije koje su napravljene u referentnom soju mogu da budu identične sa onima koje su napravljene u soju pronalaska. Na ovaj način, to znači da genska narušavanja u referentnom soju će biti u tačno ekvivalentnim položajima sa onima u soju pronalaska, npr., delecije će biti iste veličine i na istom mestu. Slično, u ovim izvođenjima, heterologni geni će biti insertovani na istom mestu, vođeni istim promoterom, itd. Međutim, nije od suštinske važnosti da se naprave identične modifikacije. Ono što je važno je da referentni soj ima funkcionalno ekvivalentne modifikacije, npr., da se isti geni održavaju ne-funkcionalnim i/ili je insertovan isti heterologni gen ili geni.

Zamena ICP34.5 kodirajućih gena

[0076] Varijante HSV pronalaska imaju intaktne Us11 i Us12 gene i ICP34.5 kodirajući geni su zamenjeni sa polinukleotidnom kasetom koja sadrži Us11 gen koji je operativno povezan sa trenutnim ranim (IE) promoterom ("IE-Us11"). Poželjno, polinukleotidna kaseta dodatno sadrži jedan ili više gena koji kodiraju heterologni polipeptid, kao što se ovde opisuje.

[0077] Kao primer, u genomu HSV-1 soja 17 (GenBank pristupni br. X14112) (SEQ ID NO: 1), ORF za prvi ICP34.5 kodirajući (γ134.5) gen se nalazi na nukleotidima 513-1259, i ima sledeću sekvencu:

[0078] Dalje, ORF za dugi ICP34.5 kodirajući (γ134.5) gen se nalazi na nukleotidima 125112-125858, i ima sledeću sekvencu:

1

[0079] ICP34.5 kodirajući geni (γ134.5 geni) mogu da budu funkcionalno inaktivni (npr., zamenjeni) pomoću nekoliko postupaka koji su dobro poznati u oblasti tehnike. Na primer, oni mogu biti funkcionalno inaktivni delecijom(a), supstitucijom(a) ili insercijom(ma), poželjno delecijom. Delecije mogu da izbrišu jednu ili više porcija gena ili čitavi gen. Na primer, može da se napravi delecija, kojom se dobija ista promena okvira čitanja. Međutim, poželjno se dobija veća delecija(e), na primer najmanje 25%, poželjnije najmanje 50% ukupne kodirajuće i ne-kodirajuće sekvence (ili alternativno, u apsolutnim terminima, najmanje 10 nukleotida, poželjnije najmanje 100 nukleotida, najpoželjnije, najmanje 1000 nukleotida). Posebno je poželjno ukloniti čitav gen i neke od ograničavajućih sekvenci, npr., zamenom gena insercijom (npr., pomoću homologne rekombinacije) jedne ili više ekspresione kasete koja sadrži heterologne gen(e) uγ134.5 lokus. Gde su dve ili više kopija gena prisutne u virusnom genomu poželjno je da obe kopije gena budu funkcionalno inaktivne. HSV ima dve kopije ICP34.5 kodirajućih (γ134.5) gena, i prema tome, posebno je poželjno da su obe kopije ICP34.5 kodirajućih gena zamenjene i/ili se održavaju funkcionalno inaktivnim.

[0080] U poželjnom izvođenju, oba ICP34.5 kodirajuća (γ134.5) gena HSV su zamenjena sa genskim ekspresionim kasetama gde svaka sadrži IE-Us11 gen i jedan ili više heterologih polipeptida koji se ovde opisuju. Međutim, takođe je moguće da je samo jedan od γ134.5 gena zamenjen sa jednom ili više ekspresionih kaseta koje sadrže IE-Us11 gen i jednim ili više heterolognim polipeptidima, i drugimγ134.5 gen je deletiran ili je na drugi način funkcionalno inaktivisan bez insertovanja ekspresione kasete, ili insertovanjem različitih genskih ekspresionih kaseta ili kombinovanjem genskih ekspresionih kaseta.

[0081] Ne-ograničavajući primeri IE promotera koji je operativno povezan sa Us11 genom uključujuα0,α4,α22,α27 iα47. U poželjnom izvođenju, IE promoter jeα27. Kao primer, sekvence nukleinske kiseline koje kodirajuα0,α4,α22,α27 iα47 promotere u genomu HSV-1 soja 17 (GenBank pristupni br. X14112) (SEQ ID NO: 1) su obezbeđene ispod:

[0082] Gen zaα0 promoter je diploidni i nalazi se u nukleotidima 1302-2166 i 125069-124205, i ima sledeću sekvencu:

[0083] Postoje dva gena zaα4 koja se sastoje iz zajedničke porcije terminalnog kratkog ponovka i ili jedinstvene kratke sekvence koja sadržiα22 ORF ili ICP47 ORF: Gen koji kodira zaα4 promoter sa jedinstvenom kratkom sekvencom koji sadržiα22 ORF se nalazi u nukleotidima 131399-136294, i ima sledeću sekvencu:

1

�

[0084] Gen za α4 promoter sa jedinstvenom kratkom sekvencom koja sadrži ICP47 ORF se nalazi na nukleotidima 144876-146834, i ima sledeću sekvencu:

[0085] Gen zaα22 promoter se nalazi na nukleotidima 131249-132604, i ima sledeću sekvencu:

[0086] Gen zaα27 promoter se nalazi na nukleotidima 111990-113647, i ima sledeću sekvencu:

2

[0087] Gen zaα47 promoter se nalazi na nukleotidima 145585-146984, i ima sledeću sekvencu:

[0088] Mutacije mogu da se naprave u varijanti HSV postupcima homologne rekombinacije koji su dobro poznati stručnjacima iz oblasti tehnike. Na primer, HSV genomska DNK je transfektovana zajedno sa vektorom, poželjno plazmidnim vektorom, koji sadrži mutiranu sekvencu koja je ograničena homolognim HSV sekvencama. Mutirana sekvenca može da sadrži delecije, insercije ili supstitucije, od koji svaka može da se konstruiše rutinskim postupkom. Insercije mogu da uključe selektabilne marker gene, na primer lacZ ili zeleni fluorescentni protein (GFP), koji mogu da se koriste za skrining rekombinovanih virusa, na primer, aktivnosti β-galaktozidaze ili fluorescencijom. U poželjnom izvođenju, selektabilni marker je IE-Us11 gen.

[0089] Dobijanje varijante HSV koja ima intaktne endogene Us11 i Us12 gene i Us11 gen koji je operativno povezan sa IE promoterom insertovanim uγ134.5 lokus se deteljno opisuje u U.S. Patent br. 7,731,952 od strane Mohr et al. Trenutni pronalazak obezbeđuje poboljšanu varijanu HSV koja se zasniva na varijanti HSV opisanoj u USP 7,731,952, i koja dalje sadrži jedan ili više gena koji kodiraju heterologne polipeptide. Kao što se ovde opisuje, poželjno, heterologni peptidi su insertovani u isti region HSV genoma kao IE-Us11 gen (tj.,γ134.5 lokus).

[0090] Ovde opisani geni koji kodiraju heterologne peptide mogu da budu insertovani u virusni genom bilo kojim pogodnim postupkom kao što je homologna rekombinacija HSV sojeva sa, na primer, plazmidnim vektorima koji nose gen ograničen sa HSV sekvencama. Na primer, gen koji kodira heterologni polipeptid može da se insertuje u gensku ekspresionu kasetu, prema postupcima koji su opsiani u USP 7731952 za inserciju IE-Us11. Kao što se opisuje u Primerima 2 i 3, ispod, na primer, gen koji kodira heterologni polipeptid može da bude spojen sa CMV ili EF1α promoterom u ekspresionoj kaseti, i ova ekspresiona kaseta može da se insertuje u ciljani vektor umestoγ134.5. Ekspresiona kaseta može da bude dizajnirana da ima ograničavajuće sekvence koje posreduju homolognu rekombinaciju uγ134.5 lokusu. Poželjno, jedna ili više gena koji kodiraju heterologni polipeptid su insertovani u istom mestu u HSV genomu kao IE-Us11 gen, na primer, njihovim uključivanjem na istoj polinukleotidnoj kaseti kao IE-Us11 gen. Međutim, jedan ili više gena koji kodiraju heterologni polipetid mogu takođe da budu insertovani na drugim mestima. U varijanti HSV koja sadrži dva gena koji kodiraju heterologne polipeptide, ekspresija svakog gena može da bude vođena različitim promotorima, na primer CMV promoterom i EF1α promoterom, ili sa dva CMV promotera ili dva EF1α promotera aranžirana u suprotnoj orijentaciji ili sa jednog promotera, npr., jednog CMV ili EF1α promotera koj pokreće ekspresiju oba gena. Gde su oba gena koja kodiraju ekspresiju heterolognih polipeptida eksprimirana sa jednog promotera, geni mogu da budu razdvojeni unutrašnjim mestom za vezivanje ribozoma (IRES). Geni mogu takođe da budu eksprimirani kao translacione fuzije tako da spojeni polipeptidi zadržavaju obe aktivnosti odvojenih gena (npr., aktivaciju proleka i spajanje ćelije sa ćelijom, aktivaciju proleka imunomuodulatornu aktivnost ili spajanje ćelije sa ćelijom i imunomodulatornu aktivnost) tako da su spojeni polipeptidi isečeni nakon ekspresije proteaze ili u cis ili u trans u odnosu na spojeni polipeptid takođe pomoću mesta isecanja ali još zadržavaju aktivnosti razdvojenih gena.

[0091] Transkribovane sekvence insertovanih gena su poželjno operativno povezane sa kontrolnim sekvencama koje dozvoljavaju ekspresiju u tumorskim ćelijama. Kontrolna sekvenca obično sadrži promoter koji omogućava ekspresiju gena koji je operativno sa njim povezan i signal za terminaciju transkripcije. Promoter je odabran od promotera koji su funkcionalni od sisarskih, poželjno humanih tumorskih ćelija. Promoter može da se dobije od promoterskih sekvenci eukariotskih gena. Na primer, promoter može da se dobije iz genoma ćelije u kojoj treba da se dogodi ekspresija heterolognog gena, poželjno sisarske tumorske ćelije, poželjnije humane tumorske ćelije. U odnosu na eukariotske promotere, mogu da budu promoteri koji funkcionišu na uobičajen način (kao što su promoter za β-aktin, tubulin) ili, alternativno, na tumor-specifičan način. Takođe mogu da budu promoteri koji odgovaraju na specifičan stimulus, na primer promoteri koji vezuju receptore steroidnih hormona. Takođe mogu da se koriste virusni promoteri, na primer promoter Moloney mišjeg virusa leukemije sa dugim terminalnim ponovcima (MMLV LTR) ili drugi retrovirusni promoteri koji nastaju iz Rous sarkoma virusa (RSV), ili (CMV) IE promoteri humanog ili mišjeg citomegalovirusa ili promoteri gena herpes virusa uključujući one koji pokreću ekspresiju transkripata koji su povezani sa latencijom.

[0092] Ekspresione kasete i drugi pogodni konstrukti koji sadrže gen koji kodira za enzim za konverziju proleka, gen koji kodira polipeptid koji može da promoviše spajanje ćelije sa ćelijom i/ili imunomodulatorni gen i kontrolne sekvence mogu da se dobiju upotrebom rutinskih postupaka kloniranja koji su poznati stručnjacima iz oblasti tehnike (videti, na primer, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning--A laboratory manual; Cold Spring Harbor Press).

[0093] Takođe može da bude prednost za promoter(e) da budu inducibilni tako da nivoi ekspresije gena mogu da se regulišu tokom trajanja u tumorskoj ćeliji. Inducibilan znači da nivoi ekspresije koji se dobijaju upotrebom promotora mogu da se regulišu. Na primer, virus iz pronalaska dalje može da sadrži heterologni gen koji kodira kombinovani protein koji sadrži tet represor/VP16 transkipcioni aktivator pod kontrolom jakog promotera (npr., CMV IE promoter) i konvetovanje proleka, spajanje ćelije sa ćelijom ili imunomodulatorni ili drugi gen može da bude pod kontrolom promoter koji odgovara na prethodno pomenuti kombinovani protein koji se sastoji iz tet represora VP16 transkripcionog aktivatora (videti, Gossen et al., "Tight control of gene expression in mammalian cells

2

by tetracycline-responsive promoters," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5547-5551, 1992, Gossen et al., "Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells," Science, 268: 1766-1769, 1995). Stoga, u ovom primeru, ekspresija gen(a) može da zavisi od prisustva ili odsustva tetraciklina.

[0094] U specifičnom izvođenju, gen koji kodira heterologni polipeptid, npr., u genskoj ekspresionoj kaseti, može da bude insertovan, poželjno uγ134.5 lokus, tako da ima istu orijentaciju kao IE-Us11 gen ili suprotnu orijentaciju. Dalje, heterologni polipeptid može da bude insertovan ili uzvodno ili nizvodno od IE-Us11 gena. Kada su prisutna dva gena koja kodiraju heterologni polipeptid, svaki gen može da se nalazi u bilo kojoj orijentaciji, tj., prvi i drugi geni koji kodiraju heterologni polipeptid mogu svaki da imaju istu ili suprotnu orijentaciju kao IE-Us11 gene. Poželjno, u varijanti HSV koja sadrži dva gena koja kodiraju heterologni polipeptid, jedan od tih gena se eksprimira sa CMV promotera, i drugi sa EF1α promotera, gde su promoteri (i geni) postavljeni u orijentaciji leđa-o-leđa jedan u odnosu na drugi i insertovani u HSV genom tako da zamenjuju gen koji kodiraju ICP34.5. Međutim, takođe mogu da se koriste drugi promoteri. Polinukleotidne kasete koje se koriste za dobijanje varijante HSV iz pronalaska su prikazane na Slikama 2, 3A-3D, i 4. Geni koji kodiraju heterologne polipeptide takođe mogu da budu insertovani u virusni genom na drugom položaju(ima) u virusnom genomu, međutim, pod uslovom da su sačuvana željena onkolitička svojstva i, poželjno, sposobnosti za izbegavanje imuskog sistema od strane varijante HSV.

[0095] Varijanta HSV iz pronalaska može da kodira brojne heterologne gene (npr., geni koji kodiraju enzim za konverziju proleka, geni koji kodiraju polipeptid koji je sposoban da promoviše spajanje ćelije sa ćelijom i/ili imunomodulatorne gene). Varijanta HSV iz pronalaska može da sadrži jedan ili više dodatnih gena, na primer od 1, 2 do 3, 4 ili 5 dodatnih gena. Dodatni gen(i) mogu dalje da budu kopije gena koji kodiraju heterologni polipeptid. Dodatni gen(i) mogu da kodiraju jedan ili više različitih gena za konverziju proleka, jedan ili više različitih gena za spajanje i/ili jedan ili više različitih imunomodulatornih gena i/ili jedan ili više enzima za modifikaciju matriksa. Dodatni gen(i) mogu da kodiraju gen(e) koji su namenjeni pojačanju terapeutskog efekta.

[0096] Više od jednog gena i povezane kontrolne sekvence mogu da budu uvedene u određeni HSV ili na jednom mestu ili na brojnim mestima u virusnom genomu. Mogu da se koriste alternativni parovi promotora (isti ili različiti promotori) koji su okrenuti u suprotnim orijentacijama jedan od drugog, gde svaki pokreće ekspresiju gena.

[0097] Takođe je prikazana mogućnost da gen koji kodira heterologni polipeptid je gen koji kodira enzim za aktivaciju proleka, heterologni gen koji kodira polipeptid koji može da prouzrokuje kombinovanje ćelije sa ćelijom ili heterologni gen koji kodira imunomodulatorni polipeptid. U poželjnom izvođenju, varijanta HSV sadrži najmanje dva (2) gena koji kodiraju heterologne polipeptide.

[0098] Polipeptid koji aktivira prolek može da bude enzim citozin deaminaza, koji je sposoban za konverziju inaktivnog proleka 5-fluorocitozina u aktivni lek 5-flurouracil. Različiti geni koji kodiraju za enzim citozin deaminazu su dostupni uključujući one koji su bakterijskog porekla i porekla iz kvasca. Drugi gen, obično gen koji kodira drugi enzim, može da se koristi da pojača aktivnost konverzije proleka gena koji kodira citozin deaminazu. Na primer, drugi gen može da kodira uracil fosforiboziltransferazu.

2

[0099] Može da se koristi bilo koji pogodni gen za kombinovanje koji kodira polipeptid koji može da prouzrokuje spajanje ćelije sa ćelijom. Poželjno polipeptid koji može da dovede do spajanja ćelije sa ćelijom se bira iz modifikovanog retrovirusnog glikoproteina omotača, kao što je glikoprotein omotača koji je izveden iz virusa leukemije gibon majmuna (GALV) ili humani endogeni retrovirus W, kombinovani F ili H protein iz virusa boginja i virus G proteina virusa vezikularnog stomatitisa. Poželjnije, polipeptid koji može da prouzrokuje spajanje ćelije sa ćelijom je GALV kombinovani glikoprotein (videti, Simpson et al. (2006) "Combination of a Fusogenic Glycoprotein, Prodrug Activation, and Oncolytic Herpes Simplex Virus for Enhanced Local Tumor Control." Cancer Res; 66:9: 4835-4842).

[0100] Kao što je gore opisano, heterologni gen koji dalje može da se nalazi u varijanti HSV može da bude imunomodulatorni gen. Takav gen može da bude bilo koji gen koji kodira polipeptid koji je sposoban za modulaciju imunskog odgovora. Polipeptid koji je sposoban za modulaciju imunskog odgovora može da bude polipeptid koji je sposoban za inhibiranje prezentovanja antigena na klasi I MHC molekula, na primer, TAP inhibitor (kao što su određeni UL49.5 polipeptidi (npr., iz BHV), humani CMV US3 i US6, HSV Us12/ICP47, EBV, ili BNLF2a) inhibitor sazrevanja klase I MHC molekula (npr., mišji CMV mK3, humani CMV US2 i US11 (nisu povezani sa HSV Us11), i varičela zoster virus ORF66). Polipeptid koji je sposoban za modulaciju imunskog odgovora takođe može da bude citokin, kao što je, ali bez ograničenja, GM-CSF, TNF-α, interleukin (na primer IL12), interferon (kao što je IFNγ) hemokin kao što je RANTES ili inflamatorni protein makrofaga (MIP) (na primer, MIP-3), ili drugi imunomodulatorni molekul kao što je B7.1 (CD80), B7.2 (CD86) ili CD40L.

[0101] Polipeptid koji može da prouzrokuje spajanje spajanje ćelije sa ćelijom može takođe da bude sposoban za modulaciju imunskog odgovora. Na primer, GALV može da moduliše imunski odgovor. Varijanta HSV iz pronalaska može, prema tome, da se koristi za in vivo isporuku gena u ćeliju gde će biti eksprimirani.

[0102] Geni TAP-inhibitora uključuju UL49.5, npr., iz herpesvirusa govečeta (BHV), koji može da inhibira TAP poreklom iz miša i čoveka (van Hall et al., J. Immunology (2007) 178:657-662). UL49.5 polipeptidi mogu takođe da budu izvedeni iz virusa pseudobesnila (PRV) i herpesvirusa 1 i 4 konja (EHV-1 i EHV-4). Ovi UL49.5 proteini interferiraju sa MHC klasom I za prezentovanje antigena blokiranjem zaliha antigenskih peptida preko inhibicije TAP molekula i aktivni su na TAP molekulu glodara, kao što je TAP poreklom iz miša. Drugi primeri TAP inhibitora uključuju UL49.5 polipeptide iz bubaline herpesvirusa 1, cervid herpesvirusa 1, felid herpesvirusa 1, (videti, Verweij et al. 2011 "Structural and functional analysis of the TAP-inhibiting UL49.5 proteins of varicelloviruses." Mol Immunol. Jul 15 Epub) i BNLF2a. Primećeno je da UL49.5 homolog iz HSV-1 i HSV-2 ne inhibira TAP [videti, Koppers-Lalic, D. et al. (2008) PLoS; 4(5): e1000080].

[0103] Primeri matriks modifikujućih enzima su: matriksne metaloproteinaze kao što su koleagenaze, gelatinaze i stromelizini, relaksin, bakterijska kolagenaza i hondroitaza ABC I.

[0104] Iako pronalazak nije ograničen bilo kojom posebnom teorijom ili mehanizmom delovanja, insercija gena za sisarski GM-CSF u genom varijante HSV iz pronalaska može da pojača anti-tumorske odgovore i lokalno i na mestima koja su udaljena od mesta gde je HSV injektiran stimulacijom imunskih odgovora koji su posredovani sa T-ćelijama. GMCSF je glavni medijator proliferacije, sazrevanja, i migracije dendritskih ćelija, najpotentnijih antigen prezentujućih ćelija imunskog sistema. Dendritske ćelije prikazuju antigene na njihovoj površini zajedno sa klasom II glavnog

2

kompleksa tkivne podudarnosti (MHC-II). Jednom kada je predstavljen na molekulima MHC klase II, antigen može da bude prepoznat od strane pomoćničkih CD4+ T ćelija, koje obezbeđuju pomoć za razvijanje B ćelija i citolitičkih CD8+ T ćelija. Ekspresija GM-CSF u lokalnom okruženju tumora služi da bi se postiglo nekoliko biloških ciljeva: (a) indukovanje lokalnih zapaljenskih odgovora, (b) pojačanje aktivnosti dendritske ćelije, i (c) povećanja ekspresije HLA klase II. Dalje, u određenim izvođenjima, citokini koji imaju sličnu aktivnost kao GM-CSF, što se opisuje gore u tekstu, takođe su predviđeni za upotrebu u predmetnom pronalasku. Pod takvim povećanim uslovima imunskog regrutovanja i aktivacije, imunomodulatorni polipeptidi koji dovode do pojačanog imunskog regrutovanja i aktivacije mogu da budu štetni za virusne infekcije i njihovo širenje. Zbog toga, pojačane sposobnosti imunskog izvegavanja varijante HSV iz pronalaska (obezbeđeno od heterolognog gena koji kodira inhibitor molekula klase I MHC za prezentovanje antigena (npr., TAP inhibitor)) su posebno važni za promovisanje replikacije virusa, brzine i efikasnosti.

[0105] U drugim izvođenjima, upotrebom standardnih molekularnih i viroloških postupaka, onkolitički soj virusa (npr., OV-2711) može da se modifikuje da se dobije nova, kancer-specifična varijanta HSV iz predmetnog pronalaska. Na primer, varijanta HSV može da bude modifikovana prema pronalasku gde je PI-3-kinazna signalizacija konstitutivno aktivirana, npr., delecijom virusomkodiranog Akt koji imitira Us3. Alternativno, može da bude izmenjen ključni virusni površinski glikoprotein, tako da virus preferencijalno ulazi u ćeliju unutar urotelijuma. Varijanta HSV iz pronalaska može da ima ili jednu ili obe ove modifikacije, i njihova onkolitička aktivnost može da se proceni i u kulturi ćelija i životinjskim modelima koji su dobro poznati u oblasti tehnike.

Farmaceutske kompozicije

[0106] Farmaceutske kompozicije uključuju aktivno sredstvo i farmaceutski prihvatljivi nosač, ekscipijens, ili rastvarač.

[0107] Termin "nosač" se odnosi na rastvarač, adjuvans, ekscipijens, ili nosač sa kojim se jedinjenje daje. Takvi farmaceutski nosači mogu da budu sterilne tečnosti, kao što su voda i ulja, uključujući petroleum, životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla, kao što je ulje kikirikija, sojino ulje, mineralno ulje, susamovo ulje i slično. Voda ili vodeni rastvori rastvora soli i vodeni rastvori dekstroze i glicerola se poželjno koriste kao nosači, posebno za rastvore koji se daju ubrizgavanjem injekcijom. Alternativno, nosač može da bude nosač u čvrstom doznom obliku, uključujuči ali bez ograničenja na jedno ili više sredstva za vezivanje (za kompresovane pilule), glidant, sredstvo za inkapsulaciju, sredstvo za davanje ukusa, i sredstvo za davanje boje. Pogodni farmaceutski nosači su opisani u "Remington’s Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin.

[0108] Kada je formulisano u farmaceutskoj kompoziciji, terapeutsko jedinjenje iz predmetnog pronalaska može da bude pomešano sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili ekscipijensom. Kao što se ovde koristi, fraza "farmaceutski prihvatljiv" se odnosi na molekulske entitete i kompozicije koji se generalno smatraju fiziološki podnošljivim i koji obično ne proizvode alergijsku ili sličnu nepovoljnu reakciju, kao što je iritacija želuca, vrtoglavica i slično, kada se daju čoveku.

[0109] Termin "farmaceutski prihvatljiv derivat" kao što se ovde koristi označava bilo koju farmaceutski prihvatljivu so, solvat ili prolek, npr. estar, ili jedinjenje iz pronalaska, koje nakon davanja recipijentu može da obezbedi (direktno ili indirektno) jedinjenje iz pronalaska, ili njegov aktivni metabolit ili ostatak. Takvi derivati su poznati stručnjacima iz oblasti tehnike, bez

2

nepotrebnog eksperimentisanja. Osim toga, referenca je napravljena na učenje Burger’s Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 5th Edition, Vol 1: Principles and Practice, koje je ovde uključeno referencom na obim podučavanja takvih derivata. Poželjni farmaceutski prihvatljivi derivati su soli, solvati, estri, karbamati, i fosfatni estri. Posebno poželjni farmaceutski prihvatljivi derivati su soli, solvati, i estri. Najpoželjniji farmaceutski prihvatljivi derivati su soli i estri.

[0110] Dok je moguće koristiti kompoziciju koja je obezbeđena u predmetnom pronalasku u samoj terapiji, poželjnije je da se primeni u obliku farmaceutske kompozicije, npr., u smeši sa pogodnim farmaceutskim ekscipijensom, rastvaračem, ili nosačem koji je odabran prema namenjenom načinu davanja i standardnoj farmaceutskoj praksi. U skadu sa tim, u jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju ili formulaciju koja obuhvata najmanje jednu aktivnu kompoziciju, ili njen farmaceutski prihvatljivi derivat, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom, rastvaračem, i/ili nosačem. Ekscipijens, rastvarač i/ili nosač mora da bude "prihvatljiv" u smislu da bude kompatibilan sa drugim sastojcima iz formulacije i da ne dovodi do štetnih efekata kod recipijenta.

[0111] Kompozicije pronalaska mogu da budu formulisane za davanje na bilo koji pogodan način za upotrebu u humanoj ili veterinarskoj medicini.

[0112] Za humanu terapiju, farmaceutske kompozicije, uključujući svako od aktivnih sredstava, mogu da se pripreme u skladu sa standardima dobrog postupka proizvodnje (GMP), kao što je predstavljeno od Food & Drug Administration (FDA). Standardi koji se tiču sigurnosti kvaliteta (QA) i kontrole kvaliteta (QC) uključuju ispitivanje čistoće i funkcije i duge mere koje su u vezi sa standardom.

[0113] Poželjni nosač za isporuku je bilo koji hemijski entitet koji osigurava isporuku varijante HSV u ćeliju tumora na selektivan nacin, postiže dovoljnu koncentraciju varijante HSV u tumorskoj ćeliji. Ovo može da uključi, bez ograničenja, standardne farmaceutske dozne oblike za isporuku virusa (npr., rastvore, suspenzije, emulzije) sa ili bez kontrolisanog oslobađanja. Takođe mogu da se koriste drugi dozni oblici, npr., čvrsti dozni oblici kao što su, ali bez ograničenja, kristali ili kuglice.

Terapeutske upotrebe

[0114] Predmetni pronalazak prikazuje postupke za ubijanje tumorskih ćelija u subjektu za lečenje kancera, uključujući, u poželjnim izvođenjima, kancer besike. Varijanta HSV iz pronalaska može da se koristi u "samostalnoj" ili monoterapiji za lečenje takvih kancera. Međutim, takođe su opisani postupci i kompozicije gde se varijanta HSV iz pronalaska kombinuje sa najmanje jednom drugom terapeutskom supstancom ili načinom tretmana za lečenje kancera. U poželjnom izvođenju, druga terapeutska supstanca je cisplatin. Međutim, može da se koristi bilo koje hemijsko ili drugo sredstvo koje se koristi za lečenje kancera besike ili drugih kancera. Ne-ogranicavajuči primeri kancera koji mogu da se leče upotrebom varijante HSV iz pronalaska uključuju, npr., kancer prostate, gliom, melanom, kancer debelog creva, kancer jajnika, kancer grudi, kancer glave/vrata, i uključujuci sve čvrste tumore.

[0115] Specifični uslovi (npr., odgovarajući farmaceutski nosač, doza, mesto i način davanja, npr.) u kojima kompozicija koja sadrži varijantu HSV iz pronalaska treba da se daje kako bi se efikasno ubijale

2

tumorske ćelije ili za lečenje kancera je individualno i može da se odredi, npr., od strane individualnog lekara.

[0116] Individue koje treba da se leče prema postupcima koji se ovde opisuju uključuju sisare, kao što su pacovi, psi, mačke, itd., i uključujući ljude.

[0117] Varijanta HSV iz pronalaska može da se koristi u postupku lečenja čoveka ili životinjskog tela. Naročito, virusi iz pronalaska mogu da se koriste u postupcima lečenja kancera. Poželjno, varijante HSV iz pronalaska se koriste u onkolitičkom tretmanu kancera. Virusi iz pronalaska mogu da se koriste u terapeutskom lečenju bilo kog čvrstog tumora kod sisara, posebno čoveka. Na primer, virusi iz pronalaska mogu da se daju subjektu koji ima kancer prostate, grudi, pluća, jetre, bubrežnih ćelija, endometrijuma, bešike, debelog creva ili karcinom cerviksa; adenokarcinom; melanom; limfom; gliom; sarkome kao što su sarkomi mekih tkiva i kostiju; ili kancer glave i vrata, i, poželjno, kancer bešike.

[0118] Termin "kancer" se odnosi na sve tipove kancera, neoplazmi ili maligne tumore koji se nalaze kod sisara, uključujuci leukemije, karcinome i sarkome. Primeri kancera uključuju kancer grudi, mozga, cerviksa, debelog creva, glave & vrata, jetre, bubrega, pluća, ne-sitnoćelijski kancer pluća, melanom, mezoteliom, jajnika, sarkom, stomaka, uterusa i meduloblastom. Dodatni primeri uključuju, Hodčkinovu bolest, ne-Hodžkinov limfom, multipli mijelom, neuroblastom, kancer jajnika, rabdomiosarkom, primarnu trombocitozu, primarnu makroglobulinemiju, primarne tumore mozga, maligni insulanom pankreasa, maligni karcinoid, urinarni kancer bešike, premaligne lezije kože, testikularni kancer, limfome, kancer tiroidne žlezde, neuroblastom, kancer jednjaka, kancer genitourinarnog trakta, malignu hiperkalcemiju, kancer endometrijuma, kortikalni kancer nadbubrežne zlezde, neoplazme endokrinog i egzokrinog pankreasa, i kancer prostate.

[0119] Termin "karcinom" se odnosi na novi maligni rast koga čine epitelne ćelije sa ciljem infiltriranja u okolno tkivo da bi se obrazovale metastaze. Primeri karcinoma uključuju, na primer, acinarni karcinom, acinusni karcinom, adenocistični karcinom, adenoidni cistični karcinom, adematozni karcinom, karcinom korteksa nadbubreznih žlezda, alveolarni karcinom, karcinom alveolarnih ćelija, karcinom bazalnih ćelija, bazocelularni karcinom, bazaloidni karcinom, karcinom bazo-skvamoznih ćelija, bronhioalveolarni karcinom, bronhiolarni karcinom, bronhogeni karcinom, cerebriformni karcinom, holangiocelularni karcinom, horionični karcinom, koloidni karcinom, komedo karcinom, karcinom trupa materice, kribniformni karcinom, carcinoma en cuirasse, karcinom kože, cilindrični karcinom, karcinom cilindričnih ćelija, karcinom žučnih kanala, durum karcinom, embrionalni karcinom, encefalidni karcinom, epiermoidni karcinom, karcinom epitelijalnih adenoida, egzofitni karcinom, karcinom ex ulcere, fibrozni karcinom, koloidni karcinom, želatinozni karcinom, karcinom džinovskih ćelija, gigantnocelularni karcinom, glandularni karcinom, karcinom granuloznih ćelija, karcinom korena dlake, hematoidni karcinom, hepatocelularni karcinom, karcinom Hurtle ćelija, hijalni karcinom, hipemefroidni karcinom, infantilni embrionalni karcinom, karcinom „in situ“, intraepidermalni karcinom, intraepitelni karcinom, Krompeherov karcinom, karcinom Kulčitzki-ćelija, karcinom velikih ćelija, lentikularni karcinom, karcinom lentikulare, lipomatozni karcinom, limfoepitelni karcinom, karcinom medulare, medularni karcinom, melanotični karcinom, karcinom mladeža, mucinozni karcinom, karcinom muciparum, mukocelularni karcinom , mukoepidermoidni karcinom, karcinom mukozum, mukozni karcinom, miksomatozni karcinom, nazofaringealni karcinom, sitnoćelijski karcinom, karcinom osifikans, osteoidni karcinom, papilarni karcinom, periportalni karcinom, preinvazivni karcinom, karcinom spinoznih ćelija, karcinom kao pulpa, karcinom ćelija bubrega, karcinom rezervnih ćelija, sarkomatodni karcinom, šnajderov karcinom, skirozni karcinom, karcinom skrotuma, signet-ring cell karcinom, karcinom simpleks, karcinom malih ćelija, solanoidni karcinom, karcinom sferoidnih ćelija, karcinom vretenastih ćelija, sponginozni karcinom, skvamozni karcinom, karcinom skvamoznih ćelija, karcinom u obliku vrpce, telangiektatski karcinom, karcinom sa teleangiektazijama, tranziciocelularni karcinom, karcinom tuberozum, tuberozni karcinom, verukozni karcinom, i vilozni karcinom.

[0120] U određenim izvođenjima, ovde obezbeđene kompozicije su korisne za ubijanje tumorskih ćelija koje se biraju iz grupe koja obuhvata astrocitom, oligodendrogliom, meningiom, neurofibrom, glioblastom, ependimom, Schwanom, neurofibrosarkom, meduloblastom, ćelija melanoma, pankreasnih ćelija kancera, ćelija karcinoma prostate, ćelija kancera grudi, ćelija kancera pluća, ćelija kancera debelog creva, ćelija hepatoma, mezotelioma i ćelija karcinoma epidermoida.

[0121] U jednom izvođenju, kancer koji treba da se leči je kancer bešike. Kancer bešike (BC) je peti najzastupljeniji humani malignitet i drugi najzastupljeniji tumor genitourinarnog sistema. Intenzivno praćenje sa citoskopijama, urinarnim citologijama, i čestim resekcijama tumora pod anestezijom čini BC malignitetom koji je najskuplji za lečenje. Pored napretka u intravezikularnoj i sistemskoj hemoterapiji, imunoterapiji i operaciji, efikasnost opcija mogućih tretmana ostaje ograničena i odgovor je prolazan. I dalje ostaju značajni problemi u održavanju BC pacijenata. Značajno, stopa neuspeha za lečenje površnih i invazivnih BC visokog stepena ostaje neprihvatljivo visoka. Dodatno, trenutni tretmani ne samo da imaju štetan uticaj na morbiditet pacijenta, ali takođe predstavlja značajno ekonomsko opterećenje. Značajnu potrebu bi ispunile novije, efektivnije terapije koje su dostupne i unapređuju rezulate kod pacijenata.

[0122] 70-80% BC su ne-invazivni, od kojih dve trećine inicijalno odgovara na Bacillus Calmette-Guerin (BCG) imunoterapiju. Preostalih 20-30% su invazivni sa visokim potencijalom za razvijanje maligniteta i ograničenim opcijama izvan radikalne cistektomije. Čak za ne-invazivni BC, trenutno dostupni tretmani donose ograničenu, prolaznu efikasnost: 80% pacijenata sa ne-invazivnom bolesti se vraća i 20-30% napreduje do potencijalno letalne bolesti. Za mnoge od ovih pacijenata, koji imaju relaps nakom BCG terapije ili kojima su dijagnostifikovani visoko invazivni tumori, verovatno je da će biti nefektivna i radikalna operacija. Sveukupni odgovori na ’standardne’ kombinovane režime sa osnovom cisplatina mogu da se razlikuju između 39-65%, sa 15-25% kompletnih pacijenata koji reaguju i pacijentima koji imaju srednje preživljavanje do 16 meseci. Pacijenti sa neresektabilnim metastatskim BC takođe se suočavaju sa „grim odds“ sa srednjim preživljavanjem od 7-20 meseci i 50% smrtnosti nakon 5 godina. Čak posle cistektomije, preživljavanje se razlikuje od 36-48% na 5 godina. S obzirom da konvencionalna hemoterapija, imunoterapija, i hirurgija nije unapredila brzine odgovora, postoje neophodne medicinske potrebe za razvijanje novih pristupa koji koriste različite načine za uništavanje BC i smanjuju mortalitet.

[0123] BC predstavlja atraktivnu metu za terapiju sa varijantom-HSV s obzirom da i) su potrebni novi pristupi za lečenje ne-invazivnih i invazivnih BC; ii) bešika je ograničeni rezervoar i intravezikularno unošenje bioloških sredstava kao što je BCG je uspostavljeni način za isporuku; i iii) klinička upotreba BCG pokazuje da imunski sistem može da se iskoristi za napad na BC. Dok BCG i HSV-zasnovana terapija obe stimulišu anti-tumorski imunitet, samo HSV onkolitički virusi takođe ubijaju ćelije

1

kancera i šire se kroz tumorsko tkivo. Prema tome, varijanta HSV kao što se ovde opisuje može da ima uticaj na lečenje invazivnog BC, prema kome BCG nije efikasan.

[0124] Melanom, kao što je metastatski melanom je druga meta za lečenje sa ovde opisanim onkolitičkim virusima, npr., u Primeru 3, ispod. Sve do odobrenja ipilimumaba i zelborafa u 2011, novi terapeutici za lečenje metastatskog melanoma nisu odobreni približno 20 godina. Uprkos impresivnm početnim stopama odgovora koji se uočavaju u Fazi 3 kliničkih ispitivanja za ipilimumab i zelboraf, stope potpunih odgovora su jako niske za oba leka. Prema tome, potrebni su novi terapeutici kao što su ovde obezbeđeni onkolitički virusi.

[0125] Novi terapeutici za druge kancere, kao što su, ali bez ograničenja, kancer jajnika i glioblastom su takođe potrebni.

[0126] Kompozicije za ubijanje tumorskih ćelija i/ili za lečenje kancera u subjektu mogu kao prednost da se koriste u kombinaciji sa drugim načinima tretmana, uključujući bez ograničenja zračenje, hemoterapiju, termoterapiju, molekulski ciljane terapije, i operaciju.

[0127] Hemoterapeutska sredstva koja se koriste u ovde opisanim postupcima uključuju bez ograničenja taksol, taksoter i druge taksoide (npr., kao što je prikazano u U.S. Patent br. 4,857,653; 4,814,470; 4,924,011, 5,290,957; 5,292,921; 5,438,072; 5,587,493; evropskom patentu br. EP 253 738; i PCT objavi br. WO 91/17976, WO 93/00928, WO 93/00929, i WO 96/01815), cisplatin, karboplatin, (i druga interkalirajuca jedinjenja platine), etopozid i etopozid fosfat, bleomicin, mitomicin C, CCNU, doksorubicin, daunorubicin, idarubicin, ifosfamid, metotreksat, merkaptopurin, tioguanin, hidroksiureu, citarabin, ciklofosfamid, nitrozoureu, mitomicin, dakarbazin, prokarbizin, kampatecine, daktinomicin, plikamicin, mitoksantron, asparaginazu, vinblastin, vinkristin, vinorelbin, paklitaksel, docetaksel, kaliheamicin, i slično.

[0128] Obicno terapija zračenjem uključuje bez ograničenja zračenje na 1-2 Gy. Primeri terapije zračenjem uključuju bez ograničenja γ-zracenje, radioterapiju zračenjem neutrona, radioterapiju zračenjem elektrona, protonsku terapiju, brahiterapiju, i sistemske radioaktivne izotope..

[0129] Terapija zračenjem i hemioterapija pomoću lokalne isporuke radiokonjugata i hemoterapeutika, mogu takođe da se koriste u postupcima koji se ovde opisuju. Usmeravanje citotoksičnog izlaganja direktno na samom tumoru je uobičajeno korišćen pristup za isporuku citotoksičnog leka dok se minimizuje citotoksično izlaganje normalnih tkiva. Međutim, jedan od faktora koji ograničavaju efikasnost takvog pristupa je nekompletna indukcija smrti tumorske ćelije zbog ograničene isporuke doze. Prema tome, veoma je poželjna istovremena upotreba terapeutika koji sadrže varijantu-HSV iz pronalaska za povećanje senzitivnosti tumorskih ćelija prema određenom citotoksičnom sredstvu. Tumor-specifična isporuka se obično postiže konjugovanjem citotoksičnog sredstva (npr., toksina (kao što je ricin) ili radioizotop) za antitelo koje preferencijalno cilja tumor (npr., glipikan-3 u hepatocelularnom karcinomu, anti-CD2 u neuroblastomu, ili anti-Her2- neu u određenim karcinomima grudi. Ciljno delovanje takođe može da se izvede sa prirodnim ciljanjem (tj., sa radioaktivnim jodom u lečenju karcinoma tiroidee), fizičkim ciljanjem (tj., davanjem radioizotopa u određenoj telesnoj šupljini), ili drugih ciljanih polipeptida (npr., feritin u hepatocelularnom karcinomu).

2

[0130] Pored kombinacije konvencionalnih terapija kancera kao što je hemoterapija, terapija zračenjem, termoterapija, operacija (resekcija tumora), TACE (transarterijska hemembolizacija), onkolitička terapija varijantom-HSV u tumorskim i ćelijama kancera može da se kombinuje sa drugim anti-tumorskim/anti-kancerogenim terapijma, uključujući ali bez ograničenja na male inhibitore tirozin kinaze (npr., sorafenib, erlotinib, gefitinib, brivanib, sunitinib, lapatinib, cediranib, vatalanib), monoklonska antitela (npr. cetuksimab, bevacizumab, IMC-A12, IMC1121B, panitumumab, trastuzumab), terapija suicidnim genom (tj., uvođenjem gena koji kodiraju enzime koji mogu da dovedu do osetljivosti tumorskih ćelija na hemoterapeutska sredstva kao što su timdin kinaza herpeks simpleks virusa ili varičela zoster virusa i bakterijska citozin deaminaza), anti-onkogena il terapija tumor supresorskim genom (npr., upotrebom anti-onkogenih molekula uključujući monoklonska antitela, vektore jednolančanih antitela, konstrukte antisens oligonukleotida, ribozime, imunogene peptide, itd.), davanje inhibitora tumorskog rasta (npr., interferon (IFN)-y, faktora nekroze tumora (TNF)- α, TNF- β, i sličnih citokina, antagonista faktora tumora rasta (TGF)- β i IL-10, itd.), davanje inhibitora angiogeneze (npr., fragmenata angiogenih polipeptida koji su inhibitorni [kao što je ATF urokinaze], inhibitornih faktora angiogeneze [kao što su angiostatin i endostatin], tkivnih inhibitora metaloproteinaze, rastvorljivih receptora angiogenih faktora [kao što je receptor urokinaze ili FGF/VEGF receptor], molekuli koji blokiraju receptore faktora rasta endotelnih ćelija , i Tie-1 ili Tie-2 inhibitori), vazokonstriktivna sredstva (npr., inhibitori azotnog oksida), imunske terapije sa imunološki aktivnim polipeptidom (uključujući imunostimulaciju, npr., gde je aktivni polipeptid citokin, limfokin, ili hemokin [npr., IL-2, GM-CSF, IL-12, IL-4], i vakcinacija, gde je aktivni polipeptid tumor specifčni ili antigen koji je pridružen tumoru), i bilo koji drugi mali molekuli koji su korisni za lečenje kancera uključujući pro-apoptotska sredstva (npr. mapatumumab), inhibitore proteazoma (npr. bortezomib), inhibitore ćelijskog ciklusa (npr. flavopiridol), inhibitore metilacije DNK (npr.5-Azacitidin) i slično.

[0131] Opeterećenje tumorom se procenjuje pre terapije pomoću objektivnog skeniranja tumora kao što je radiografija sa x-zračenjem, kompjuterizovna atomografija (CAT skeniranje), skeniranje nuklearnom magnetnom rezonancijom (NMR) ili direktna fizička palpacija tumorske mase. Alternativno, tumor može da sekretuje marker supstancu kao što je alfafetoprotein iz kancera debelog creva, CA 125 antigen iz kancera ovarijuma, ili "M" protein iz seruma mijeloma iz multiplog mijeloma, ili AFP za hepatocelularni karcinom. Nivoi ovih sekretovanih proizvoda nakon toga omogućavaju procenu opterećenja tumorom koja treba da se izračuna. Ova direktna i indirektna merenja operećenja tumorom se izvode pre uvođenja terapije, i zatim se ponavljaju u intervalima nakon davanja lekova kako bi se procenilo da li je postignut iil nije postignut objektivni odgovor. Objektivni odgovor u terapiji kancera generalno ukazuje na >50% smanjenje merljive bolesti tumora (parcijalni odgovor), ili potpuno nestajanje svake merljive bolesti (potpuni odgovor). Obično, ovi odgovori moraju da se održavaju u određenom vremenskom periodu, obično jedan mesec, da bi se klasifikovali kao stvarno parcijalni ili kompletni odgovor. Dodatno, može da dođe do stabilizacije brzog rasta tumora ili može da dođe do smanjenja tumora koje je <50%, koje se naziva manji odgovor ili stabilna bolest.

[0132] Generalno, povećano preživljavanje je povezano sa dobijanjem potpunog odgovora na terapiju, i u nekim slučajevima, parcijalni odgovor se održava za produžene periode može takođe da doprinese pojačanom preživljavanju kod pacijenta. Pacijenti koji dobijaju hemoterapiju su takođe obično "izloženi" u pogledu stepena njihove bolesti pre i nakon hemoterapije i zatim su ponovo izloženi kako bi se utvrdilo da li je došlo do promene u obimu ove bolesti. U nekim situacijama tumor može dovoljno da se smanji i ukoliko metastaze nisu prisutne, može da bude moguće hirurško uklanjanje nakon tretmana hemoterapijom gde pre nije bilo moguće zbog široko rasprostanjene bolesti. U ovom slučaju tretmana hemoterapijom, nove farmaceutske kompozicije iz pronalaska se koriste kao pomoćno dodatno sredstvo potencijalno lekovitoj operaciji. Dodatno, pacijenti mogu da imaju individualne lezije u kičmi ili na nekom drugom mestu koje proizvode simptomatske probleme kao što je bol i može da bude neophodna primena lokalnog radiozračenja. Ovo može da se izvede pored kontinuirane upotrebe sistemskih farmaceutskih kompozicija.

[0133] Pacijenti se ispituju za toksičnost da svakim kursom davanja varijante HSV iz pronalaska ili kompozicije koja sadrži varijantu HSV, obično posmatranjem efekata na enzime koji su važni za funkciju jetre i enzime za funkciju bubrega kao što je uklanjanje kreatinina BUN i efekata na koštanu srž, obično supresijom granulocita koji su važi za borbu sa infekcijom i/ili supresijom pločica koji su važni za hemostazu ili zaustavljanje protoka krvi. Za takva ispitivanja, normalna krvna slika može da se dostigne između 1-3 nedelje nakon terapije. Oporavak se nastavlja tokom sledeće 1-2 nedelje. Na osnovu oporavka normalnog broja belih krvih ćelija, tretmani mogu nakon toga da se nastave.

[0134] Obično, potpuni i parcijalni odgovori su povezani sa najmanje 1-2 log smanjenjem u broju tumorskih ćelija (90-99% efikasna terapije), iako su takođe moguća manja ili veća smanjenja u tumorskom opterećenju. Pacijenti sa uznapredovalim kancerom će obično imati >10<9>ćelija tumora u dijagnozi, brojni tretmani mogu da budu potrebni da bi se smanjilo opterećenje tumorom do veoma niskog stadijuma i potencijalno dobio lek za bolest.

[0135] Na kraju ciklusa tretmana sa farmaceutskom formulacijom iz pronalaska, koji može da se sastoji iz nekoliko nedelja kontinuiranog doziranja leka, pacijenti mogu da se ispitaju za odgovor na terapiju (potpune i parcijalne remisije), toksičnost koja se meri radom krvi i generalnog opšteg stanja klasifikovanim statusom performansi ili analizom kvaliteta života. Poslednje uključuje opšti nivo aktivnosti pacijenta i njegove sposobnosti da obavlja normalne dnevne funkcije. Utvrđeno je da je snažan prediktor odgovora i neki antikancerogeni lekovi mogu da poboljšaju status performansi i generalni osećaj dobrog stanja bez prouzrokovanja značajnog smanjenja tumora. Prema tome, za neke kancere koji nisu izlečivi, farmaceutske formulacije mogu slično da obezbede značajnu korist, status dobrog opšteg stanja, npr. bez uticaja na potpunu ili parcijalnu remisiju bolesti.

[0136] Brojni bilološki testovi su dostupni za procenu i za optimiziranje izbora varijante HSV i kompozicija koje sadrže varijantu HSV za optimalnu antitumorsku/antikancerogenu aktivnost. Ovi testovi grubo mogu da se podele u dve grupe; oni koji uključuju in vitro izlaganje varijante HSV tumorskim/ćelijama kancera i in vivo antitumorski/antikancer testovi u modelima glodara i retko, kod većih životinja.

[0137] Citolitički testovi in vitro za varijantu HSV generalno obuhvataju upotrebu upostavljenih ćelijskih linija tumora/kancera i životinjskog i humanog porekla. Ove ćelijske linije mogu da se dobiju iz komercijalnih izvora kao što su American Type Tissue Culture Laboratory in Bethesda, MD, i iz ćelijskih banaka tumora/kancera u istraživačkim centrima. Izlaganja varijanti HSV mogu da se izvedu pod simulisanim fiziološkim uslovima temperature, kiseonika i dostupnih nutrijenata u laboratoriji. Krajnje tačke ovih in vitro testova mogu da uključe: 1) obrazovanje kolonije; 2) jednostavnu kvantifikaciju deobe ćelije tokom vremena; 3) preuzimanje takozvanih "vitalnih" boja koje su isključene iz ćelija koje imaju intaktnu citoplazminu membranu; 4) uključivanje radioobeleženih nutrijenata u proliferišuću (vijabilnu) ćeliju. Testovi obrazovanja kolonija se koriste i za uspostavljene

4

ćelijske linije, i za biopsije svežih tumora koji su hirurški uklonjeni iz pacijenata koji imaju kancer. U ovom tipu testa, ćelije se obično uzgajaju u petri šoljama na mekom agaru, i broj kolonija ili grupa ćelija (>60 m u veličini) se broji ili vizuelno, ili pomoću automatskog sistema za analizu slike. Zatim se pravi poređenje sa netretrianim kontrolnim ćelijama kojima je omogućeno razvijanje kolonija pod identičnim uslovima. Zbog toga što je obrazovanje kolonija jedno od obeležja fenotipa kancera, samo će maligne ćelije obrazovati kolonije bez vezivanja za čvrsti matriks. Ovo može da se prema tome koristi kao skrining procedura i test za efikasnost za varijantu HSV, i postoje brojne objave koje pokazuju da se rezultati koji se dobijaju u testovima obrazovanja kolonija nalaze u korelaciji sa nalazima u kliničkim ispitivanjima sa istim lekovima.

[0138] Određivanje ukupnog broja ćelija je jedan pristup za in vitro ispitivanje ili ćelijskih linija ili svežih biopsija tumora. U ovom testu, nakupnine ćelija se obično razdvajaju u pojedinačne jedinice koje nakon toga mogu ili manuelno da se broje na mikroskopskoj pločici ili upotrebom automatskog protočnog sistema kao što je ili protočna citometrija ili CoulterTM brojač. Stope rasta kontrolnih (netretiranih) ćelija se zatim porede sa tretiranim (sa nukleinskom kiselinom) stopama ćelijskog rasta. Bojenje vitalnim bojama je još jedan od starijih oznaka antitumorskih testova. U ovom tipu prisupa ćelije se ili tretiraju ili se ne tretiraju sa lekom za kancer (npr., onkolitičkom varijantom HSV), i nakon toga se izlažu boji kao što je metilen plavo, koja je normalno isključena iz intaktnih (vijabilnlih) ćelija. Broj ćelija koje preuzimaju boju (mrtve ili koje umiru) je brojilac sa deliocem koji predstavlja broj ćelija koje ne preuzimaju boju.

[0139] Pored bojenja vitalnim bojama, vijabilnost može da se proceni upotrebom radioobeleženih nutrijenata i/ili nukleotida. U testovima za ispitivanje tumorskih ćelija, običan eksperiment obuhvata uključivanje nukleotida koji su obeleženi (3H) tricijumom- ili 14C kao što je timidin. Pokazano je da kontrolne (netretirane) ćelije preuzimaju znatnu količinu ovih gradivnih blokova DNK po jedinici vremena, i brzina uključivanja se poredi sa brzinom u ćelijama koje su tretirane lekom. Ovo je brz i test koji se lako kvantifikuje koji ima dodatnu prednost radnih bunarića za one ćelije koje ne moraju da obrazuju velike (brojive) kolonije. Nedostaci uključuju upotrebu radioizotopa koji predstavljaju probleme u vezi sa rukovanjem i odlaganjem.

[0140] Postoje velike banke humanih i glodarskih tumorskih/kancerognih ćelijskih linija koje su dostupne za ove tipove testova. Primeri pogodnih ćelijskih linija uključuju ali bez ograničenja UMUC3, T24, J82 i EJ (MGH-U1), J82 (CO’T), RT4, RT112, TCCSuP i SCaBER ćelije, koje su linije ćelija kancera bešike. Međutim, takođe su pogodne ćelijske linije iz drugih tipova kancera (npr., HT29 kolorektalnog adenokarcinoma, LNCaP.FGC adenokarcinoma prostate, MDA-MB-231 adenokarcinoma grudi, SK-MEL-28 malignog melanoma ili U-87 MG). Drugi primeri pogodnih ćelijskih linija melanoma uključuje bez ograničenja, A-375, HS-695T, IGR-1, MEL-CLS-1, MEL-CL2, MEL-CLS3, MEL-CLS-4, MEWO, MML01, NIS-G, SK-MEL-1, SK-MEL-2 i SK-MEL-5 (dostupan, npr., iz Cell Line Services (Germany). Neograničavajući primeri ćelijskih linija kancera jajnika, uključuju, npr., PA-1, Caov-3, SW 626 i SK-OV-3. Ne-ograničavajući primeri ćelijskih linija glioblastoma uključuju, npr., LN-18, U-87 MG, F98, T98G. Takve ćelijske linije su komercijalno dostupne, npr., od American Type Culture Collection (ATCC).

[0141] Trenutni sistem ispitivanja koji koristi Nacionalni institut za kancer koristi banku od preko 60 uspostavljenih senzitivnih i rezistentnih na brojne lekove humanih ćelijskih linija različitih podtipova ćelija. Ovo obično uključuje 5-6 uspostavljenih i dobro karakterisanih humanih ćelija tumora/kancera određenog podtipa, kao što je nesitnoćelijski ili sitnoćelijski kancer pluća, za ispitivanje novih sredstava. Upotrebom sistema grafičke analize pod imenom CompareTM, određuje se sveukupna osetljivost u terminima preuzimanja boje (ili sulforhodamina B ili MTT tetrazolijum boje). Specifični cilj ovog pristupa je identifikovanje nukleinskih kiselina koje su jedinstveno aktivne u pojedinačnom histološkom podtipu humanog kancera. Dodatno, postoji nekoliko podlinija humanog kancera koje ispoljavaju rezistenciju na brojna sredstva i poznato je da, u nekim slučajevima, eksprimiraju pumpu rezistencije više lekova, p-glikoprotein. Krajnja tačka određenih testova je uključivanje proteinske boje koja je poznata pod imenom sulforhodamin B (za adherentne tumorske ćelije) i redukciju tetrazolijum (plavo) boje u aktivnim mitohondrijskim enzimima (za ne-adherentne, slobodne tipove ćelija).

[0142] Kada jednom varijanta HSV uz pronalska pokaže neki stepen aktivnosti in vitro u inhibiranju rasta ćelija tumora/kancera i/ili tokom ubijanja tumorskih ćelija, kao što je obrazovanje kolonije ili preuzimanje boje, eksperimenti kojima se ispituje antitumor/antitumorska efikasnost se in vivo izvode. Mogu da se koriste sistemi glodara za početna ispitivanja antitumorske aktivnosti s obzirom da su brzine tumorskog rasta i krajnje tačke preživljavanja dobro definisane, i s obzirom da ove životinje generalno odražavaju iste tipove toksičnosti i obrazaca metabolizma leka kao kod ljudi. Za ova rad, obično se iz donorskih životinja pokupe singeni (iste genske linije) tumori, razdvoje se u delove, broje i zatim se nazad ubrizgaju u (isti soj) domaćina miševa. Varijante HSV se zatim obično ubrizgaju u nekim kasnijim vremenskim tačka(ma), poželjno in situ ubrizgavanjm na mestu gde se nalazi tumor. Brzine tumorskog rasta i/ili preživljavanja se određuju i porede sa netretiranim kontrolama. U ovim testovima, brzine rasta se obično određuju za tumore koji rastu na boku životinje, gde se širine vertikalnih prečnika tumora prevode u procenu ukupne mase tumora ili zapremine. Vreme koje je potrebno za dostizanje prethodno određene mase se zatim poredi sa vremenom koje je potrebno za jednaki rast tumora kod netretiranih kontrolnih životinja.

[0143] U nekim izvođenjima, značajna otkrića generalno uključuju >25% povećanje vremena za dostizanja prethodno određene mase kod tretiranih životinja u poređenju sa kontrolama. U drugim izvođenjima, značajna otkrića uključuju >50% i povećanje vremena za dostizanja prethodno određene mase kod tretiranih životinja u poređenju sa kontrolama. Značajna otkrića se nazivaju "inhibicija tumorskog rasta" ili "anti-tumorski odgovor."

[0144] Tumori humanog porekla su uspešno transplantirani u različite imunski deficijentne mišje modele. Miš koji je poznat pod imeno nu/nu ili "goli" miš može da se koristi za razvijanje in vivo testova za rast humanog tumora. Kod golih miševa, koji obično nemaju dlaku i kojima nedostaje funkcionalna tireoidna žlezda, humani tumori (milioni ćelija) se obično ubrizgaju bočno i nakon toga se polako događa tumorski rast. Ovaj vidljivi razvoj opipljive tumorske mase se naziva "primljen". Antikancerogeni lekovi kao što je varijanta HSV koja je ovde prikazana se nakon toga istim načinom ubrizgava (intravenozno, intramuskularno, subkutano, per os) na ili udaljeno od mesta gde je tumor implantiran, i brzine rasta se računaju vertikalnim merenjem najširih širina tumora kao što je ranije opisano. Poznato je da se brojni humani tumori uspešno "primaju" u modelu golog miša. Alternativni model miša za ovaj rad uključuje miševe koji imaju ozbiljnu kombinovanu bolest imunodeficijencije (SCID), kod kojih postoji defekt u sazrevanju limfocita. Zbog toga, SCID miševi ne proizvode funkcionalne B- i T-limfocite. Međutim, kod ovih životinja postoji normalna ćelijska aktivnost prirodnih ćelija ubica (NK). Osim toga, SCID miševi će "primiti" veliki broj humanih tumora. Merenja tumora i doziranje leka se generalno izvode kao što je gore navedneo. Ponovo, pozitivna jedinjenja u SCID mišjem modelu su ona koja inhibirjau brzinu tumorskog rasta za >20-50% u poređenju sa netretiranom kontrolom.

[0145] Za in vivo ispitivanja, kao što su ispitivanja za efikasnost varijante HSV iz pronalaska za lečenje kancera bešike, može da se koristi ortotropni mišji model koji blisko imitira kancer bešike kod ljudi. Najvažnija upotreba ortotropnih modela kancera je da omogućava lečenje kancera unutar bešike i intravezikularnom instilacijom u bešici koja se procenjuje kao način teapije. Ortotropni modeli koji koriste humane tumorske ćelije mogu da se ispituju u atimičnim, imunokompromitovnaim miševima, dok singeni mišji tumori mogu da se koriste kod imunksi kompetentnih miševa. Takođe mogu da se koriste transgeni miševi koji spontano razvijaju tumore u bešici. Kao što je ovde navedeno u Primerima, varijante HSV iz pronalaska su posebno korisne zbog toga što mogu da inhibiraju mišji TAP, npr., ekspresijom UL49.5 sa BHV, i prema tome mogu da se ispituju u imunski kompetentnim mišjim modelima kancera u kojima su miševi seropozitivni za HSV-1, i sposobnosti unapređene varijante HSV iz pronalaska da izbegne imunski odgovor domaćina, može da se odredi važnost izbegavanja imunskog sistema za anti-tumorsku funkciju varijante HSV. Takvi modeli obezbeđuju važne podatke u toga koliko će biti efektivna varijanta HSV iz pronalaska, npr., u imunski kompetentnom humanom subjektu, kao što je pacijent koji ima kancer.

[0146] Najčešće korišćeni imunološki kompetentni model miša za ispitivanje terapeutika (kao što je ovde obezbeđena OV varijanta) za lečenje melanoma koristi mišje B16F10 ćelije implantirane u C57/B16 miševe ili s.c. ili u organe, kao što je mozak, da bi se iniciralo obrazovanje tumora. Antitumorska efikasnost kandidata terapeutika se zatim procenjuje davanjem terapeutika životinji na bilo koje brojne načine, uključujući npr., direktno ubrizgavanje u tumor, ubrizgavanje u vaskulaturu miša za sistemsku isporuku, ili intradermalno ubrizgavanje u površinu koja se nalazi izvan mesta gde se nalazi tumor. Merenja veličine tumora, sveukupnog preživljavanja životinje u poređenju sa kontrolnim životinjama koje imaju tumor, i indukovanje imunskih ćelija koje prepoznaju i ubijaju B16F10 ćelije može da se izmeri kao indikator terapeutske efikasnosti. Model se detaljnije opisuje u Zamarin D, et al. Gene Ther 2009;16:796-804, kada se koriste B16F10 ćelije da se proceni in vivo efikasnost OV za lečenje metastatskih melanoma mogu da se koriste ot procenu in vivo svojstava OV koja se ovde opisuju. Takođe mogu da se koriste mišji model i postupci koji su opisani u Toda M, et al. Hum Gene Ther 1999;10:385-93, koji opisuju klasično ispitivanje u HSV-1 OV oblasti koja koristi DBA/2 miševe koji nose bilateralne s.c. tumore mišjeg melanoma koji su izvedeni iz M3 ćelija melanoma gajenih u kulturi. Toda et al. Ispitivanje pokazuje da HSV-1 OV mogu da pokrenu antitumorske imunske odgovore koji su specifični prema ćelijama melanoma.

[0147] Postoje brojne ćelijske linije mišjeg kancera jajnika koje se koriste kod imunski kompetentnih miševa za procenu efikasnosti terapeutika za lečenje metastatskog kancera jajnika. Neke uobičajene ćelijske linije kancera mišjih jajnika su MOSEC ćelije, ID8-VEGF, i Defb29-VEGF [videti, Chalikonda S, et al. Cancer Gene Ther 2008;15:115-25; Benencia F, et al. Cancer Biology & Therapy 2008;7:1194-205; and Hung CF, et al. Gene Ther 2007;14:20-9]. Metastatski kancer jajnika je obično predstavljen kao metastatki fokus koji oblaže peritonalnu šupljinu. Prema tome, većina modela uključuje intraperitonealno ubrizgavanje kultivisanih ćelija karcinoma jajnika miša da bi se uspostavile metastatske lezije kancera jajnika koje oblažu peritonealnu šupljinu. OV, npr., rekombinovani OV koji se ovde opisuje, može zatim da se uvede u peritonealnu šupljinu da se olakša infekcija svih tumora koji su dostupni virusu. Kao sa modelima kancera bešike i melanoma, terapeutska efikasnost OV može da se meri praćenjem veličine tumora tokom vremena i sveukupnog preživljavanja životinje u poređenju sa kontrolnim životinjama koje imaju tumor, kao i indukcijom imunskih ćelija koje prepoznaju i ubijaju ćelije kancera.

[0148] 4C8 i 203GL ćelijske linije mišjeg glioblastoma mogu da se koriste u imunski kompetentnim miševima kako bi se procenila efikasnost terapeutika za lečenje glioblastoma [videti, Hellums EK, et al. Neuro-oncology 2005;7:213-24; Markert JM, et al. J Virol 2012;86:5304-13; and Todo T, et al. Hum Gene Ther 1999;10:2741-55]. Modeli mišjeg glioblastoma uglavnom, iako nije nužno, koriste ortotropne tumore koji su uspostavljeni bušenjem (engl. ’burr’) rupe kroz kranijum miša, zatim ubrizgavanjem kultivisanih ćelija mišjeg glioma u prednje režnjeve i zatvaranje rane šavom. U unapred određenom vremenskom trenutku posle intrakranijalne implantacije tumora, izbušene rupe se ponovo otvaraju i OV se direktno ubrizgavaju u tumor. Sveukupno preživljavanje životinja u poređenju sa kontrolnim životinjama koje imaju tumor mogu da se koriste kao mera efikasnosti terapije, s obzirom da veličina tumora uglavnom može da se izmeri posle obdukcije. Opisani su primeri mišjeg modela glioma, npr., kod Bruggeman et al. 2007; Cancer Cell;12(4):328-341; and Marumoto T, et al. Nat Med.200915(1):110-6.

[0149] Svaki od ovih sistema za ispitivanje se generalno kombinuju u serijskom redu, kretanjem od in vitro do in vivo, da bi se karakterisala antitumorska aktivnost onkolitičke varijante HSV iz pronalaska. Generalno, onaj ko želi da otkrije koji tipovi tumora su posebno osetljivi na varijantu HSV i suprotno koji tipovi tumora su u suštini rezistentni (npr., ne dozvoljavaju) na varijantu HSV in vitro. Korišćenjem ove informacije, eksperimenti su zatim planirani u modelima glodara kako bi se procenilo da li će ili neće varijante HSV koje su in vitro pokazale aktivnost biti tolerisane i aktivne kod životinja. Početni eksperimenti kod životinja generalno uključuju ispitivanje toksičnosti da bi se odredio raspored podnošljive doze i zatim korišćenjem tog doznog rasporeda, da bi se procenila antitumorska efikasnost kao što se gore opisuje. Aktivna varijanta HSV iz ova dva tipa testova može zaim da se ispita u humanim tumorima koji rastu u SCID ili golim miševima i ukoliko je aktivnost potvrđena, ove varijante HSV zatim postaju kandidati za potencijalno kliničko razvijanje leka.

Davanje

[0150] Varijanta HSV iz pronalaska ili kompozicije, npr., farmaceutske kompozicije, koje sadrže varijantu HSV, mogu da se daju individui, npr., pacijentu, poželjno humanom pacijentu, kome je tretman potreban. Subjekat ili pacijent kome je tretman potreban je individua koja ima kancer, poželjno individua sa čvrstim tumorom, i poželjno je onaj koji bi imao koristi od davanja varijante HSV ili njegove farmaceutske kompozicije. Cilj terapeutskog tretmana je da se poboljša stanje pacijenta. Obično, iako nije potrebno, terapeutski tretman koji koristi varijantu HSV ili farmaceutsku kompoziciju iz pronalaska ublažava simptome kancera. Postupak za lečenje kancera prema pronalasku obuhvata davanje terapeutski efikasne količine varijante HSV iz pronalaska ili farmaceutske kompozicije koja sadrži varijantu HSV pacijentu koji ima kancer. Davanje onkolitičke varijante HSV ili kompozicije iz pronalaska individui koja ima tumor koja će takođe ubijati ćelije tumora, prema tome smanjujući veličinu tumora i/ili smanjenjem ili sprečavanjem širenja malignih ćelija iz tumora.

[0151] Varijanta HSV ili njegova farmaceutska kompozicija može da se unese parenteralno, transmukozalno, npr., oralno (per os), nazalno, ili rektalno, ili transdermalno. Parentalni načini uključuju intravenozno, intra-arteriolarno, intra-muskularno, intradermalno, subkutano, intraperitonealno, intraventrikularno, i intrakranijano davanje. Na primer, kompozicija koja sadrži varijantu HSV može da se daje injekcijom, infuzijom, instilacijom ili inhalacijom. Poželjni način davanja je davanje direktnom injekcijom. Na primer, terapeutski tretman može da se izvede nakon direktnog ubrizgavanja kompozicije varijante HSV u ciljno tkivo (npr., "in situ davanje"). Ciljno tkivo može da bude tumor ili krvni sud koji snabdeva tumor.

[0152] Varijanta kompozicija koje sadrže HSV može da bude formulisana za parenteralno davanje ubrizgavanjem injekcijom, npr., bolusnom injekcijom ili kontinuiranom infuzijom. Formulacije za ubrizgavanje mogu da budu predstavljene u jediničnom doznom obliku, npr., u ampulama ili višedoznim kontejnerima, sa dodatnim konzervansom. Kompozicije mogu da se nalaze u takvim oblicima kao što su suspenzije, rastvori ili emulzije u uljanim i vodenim nosačima, i mogu da sadrže sredstva za formulaciju kao što su sredstva za formulaciju, suspenziju stabilizaciju i/ili disperziju.

[0153] Pored formulacija koje su prethodno opisane, varijanta kompozicija koje sadrže HSV može takođe da bude formulisana kao depo preparat. Takve formulacije dugog trajanja mogu da se daju implantacijom (na primer subkutano ili intramuskularno) ili intramuskularnom injekcijom. Prema tome, na primer, varijanta kompozicije koja sadrži HSV može da se formuliše sa pogodnim polimernim ili hidrofobnim materijalima (na primer, kao što je emulzija u prihvatljivom ulju) ili jonoizmenjivačkim smolama, ili kao umereno rastvorljivim preparatima, na primer, umereno rastvorljivoj soli. U još drugom izvođenju, terapeutsko jedinjenje može da se isporuči u sistemu za kontrolisano oslobađanje. Na primer, varijanta HSV može da se daje upotrebom intravenozne infuzije sa kontinuiranom pumpom, u polimernom matriksu kao što je polimlečna/glutaminka kiselina (PLGA), pelet koji sadrži smešu holesterola i aktivnog sastojka (SilasticR.TM.; Dow Corning, Midland, Mich.; videti U.S. Pat. No. 5,554,601) subkutano implantiranog, osmotskom pumpom za implantaciju, transdermalnog flastera, lipozoma, ili drugih načina za davanje. U drugom izvođenju, aktivni sastojak može da se isporuči u nosaču, posebno u lipozomu (videti Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss: New York, pp.353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp.317-327; videti opšte ibid.).

[0154] Načini davanja i doza koji se ovde opisuju su namenjeni samo kao vodič s obzirom da stručnjak iz oblasti tehnike može brzo da odredi optimalni način davanja i doze. Doza može da se odredi u skladu sa različitim parametrima, posebno u odnosu na položaj tumora, veličinu tumora, starosno doba, težinu i stanje pacijenta koji treba da se leči i načina davanja. Poželjno se virus daje direktnim ubrizgavanjem u tumor. Virus takođe može da se daje sistemski ili ubrizgavanjem u krvni sud koji snabdeva tumor. Optimalni način davanja će zavisiti od položaja i od veličine tumora.

[0155] Davanje kompozicije koja sadrži varijantu HSV može da bude jednom dnevno, dva puta dnevno, ili češće, ali učestalost može da se smanjuje tokom faze održavanja bolesti ili poremećaja, npr., jednom svakog drugog ili trećeg dana umesto svakog dana ili dva puta dnevno. Doza ii učestalost davanja će zavisiti od kliničkih znakova, koji potvrđuju održavanje faze remisije, sa smanjenjem ili odsustvom najmanje jednog ili poželjnije više od jednog kliničkog znaka akutne faze koja je poznata stručnjaku iz oblasti tehnike. Generalno, doza i učestalost će delom zavisiti od recesije patoloških znakova i kliničkih i subkliničkih simptoma stanja bolesti ili poremećaja koji se razmatra za tretman sa ovim jedinjenjima.

[0156] Imajući u vidu gore navedeno, količina virusa koji se daje u slučaju HSV može da bude u opsegu od 10<4>do 10<10>pfu, poželjno od 10<5>do 10<8>pfu, poželjnije oko 10<6>do 10<9>pfu. Obično 1-4 ml, kao što je 2 do 3 ml farmaceutske kompozicije koja se u suštini sastoji iz virusa i farmaceutski prihvatljivog pogodnog nosača ili rastvarača može da se koristi za direktno ubrizgavanje u individualni tumor. [Videti, Senzer et al. J Clin Oncol (2009) 27(34):5763-5771.] Međutim za neke primene onkolitičke terapije, mogu takođe da se koriste veće zapremine do 10 ml, u zavisnosti od tipa tumora, veličine tumora i mesta inokulacije. Slično tome, mogu da se koriste manje zapemine koje su manje od 1 ml. Doze i režimi davanja mogu da budu podešeni u zavisnosti od starosnog doba, pola i fizičkog stanja subjekta ili pacijenta kao i koristi tretmana i nepoželjnih sporednih efekata kod pacijenta ili sisarskog subjekta koji treba da se leči i procene lekara, kao što je jasno stručnjacima koji su verzirani u stanje tehnike.

[0157] Predmetni pronalazak se ovde opisuje pomoću primera koji slede. Međutim, upotreba primera bilo gde u specifikaciji samo ilustruje i ni na koji način ne ograničava obim i značenje pronalaska ili bilo kojih termina iz primera. Slično tome, pronalazak nije ograničen na bilo koje posebno izvođenje koje se ovde opisuje. Pronalazak prema tome, treba ograničiti samo terimima priloženih zahteva zajedno sa ukupnim obimom ekvivalenata koji se štite zahtevima.

[0158] Treba razmeti da su približne numeričke vrednosti aktivnosti vezivanja i drugih parametara koji su prijavljeni u primerima, i kroz čitavu specifikaciju. Individualna merenja ovih parametara mogu da se razlikuju, npr., zbog normalne eksperimentalne greške i/ili u zavisnosti od specifičnih uslova koji se koriste.

[0159] U skladu sa predmetnim pronalaskom mogu da se korsite konvencionalni postupci molekularne biologije, mikrobiologije, i postupci rekombinovane DNK koji su poznati stručnjacima iz oblasti tehnike. Takvi postupci su u potpusnoti objašnjeni u literaturi. Videti, npr., Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (herein "Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; Transcription And Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); Ausubel, F.M. et al. (eds.). Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc., 1994. Ovi postupci uključuju mutagenezu usmerenu prema mestu kao što je opisano u Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488- 492 (1985), U. S. Patent No. 5,071, 743, Fukuoka et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.

263: 357-360 (1999); Kim and Maas, BioTech. 28: 196-198 (2000); Parikh and Guengerich, BioTech.

24: 428-431 (1998); Ray and Nickoloff, BioTech. 13: 342-346 (1992); Wang et al., BioTech. 19: 556-559 (1995); Wang and Malcolm, BioTech. 26: 680-682 (1999); Xu and Gong, BioTech. 26: 639-641 (1999), U.S. Patents Nos. 5,789, 166 and 5,932, 419, Hogrefe, Strategies 14. 3: 74-75 (2001), U. S. Patents Nos. 5,702,931, 5,780,270, and 6,242,222, Angag and Schutz, Biotech. 30: 486-488 (2001), Wang and Wilkinson, Biotech. 29: 976-978 (2000), Kang et al., Biotech. 20: 44-46 (1996), Ogel and McPherson, Protein Engineer. 5: 467-468 (1992), Kirsch and Joly, Nuc. Acids. Res. 26: 1848-1850 (1998), Rhem and Hancock, J. Bacteriol. 178: 3346-3349 (1996), Boles and Miogsa, Curr. Genet. 28: 197-198 (1995), Barrenttino et al., Nuc. Acids. Res. 22: 541-542 (1993), Tessier and Thomas, Meths. Molec. Biol.57: 229-237, and Pons et al., Meth. Molec. Biol.67: 209-218.

PRIMERI

Primer 1: Genetička svojstva HSV-1 i njihovih onkolitičkih sojeva

4

[0160] Ovaj Primer opisuje genetičku konstrukciju neuro-atenuirane varijante HSV (soja Patton) koja ima intaktne endogene US12 i US11, u kojima suγ134.5 geni zamenjeni sa US11 spojenim sa trenutnim ranim (IE) promoterom.

[0161] Genom HSV-1 obuhvata dve jedinstvene genomske sekvence, koje su označene kao Jedinstveni-dugi (UL) i Jedinstveni-kratki (US) segmenti. Obe UL i US sekvence su ograničene invertovanim terminalnim ponovcima, ilustrovano praznim pravougaonicima na Slikama 1A-1C. U divljem tipu HSV (Slika 1A)γ134.5 gen, koji daje neuro-virulenciju je diploidni element koji se nalazi u invertovanim ponovcima koji ograničavaju UL segment sa svake strane. Položaji i aranžmani US11 i US12 gena su naznačeni i prošireni ispod HSV-1 genoma na Slici 1A. Us12 gen se eksprimira rano tokom infekcije sa trenutnog ranog promotera (naznačeno sa zvezdom-12 na Slici 1A). Us11 gen se eksprimira kasno u virusnoj infekciji sa odvojenog promotora (naznačeno zvezdom-11 na Slici 1A) koja se nalazi unutar Us12 gena.

[0162] U modifikovanom HSV-1 OncoVexGMCSF (Slika 1B),γ134.5 geni su zamenjeni sa CMV promoterom, koji se kombinovan sa genom koji kodira za humani faktor stimulacije kolonija Granulocita-Makrofaga "GM-CSF". Delecijaγ134.5 dovodi do neuro-atenuacije, ali takođe dovodi do ozbiljnog smanjenja u sposobnosti virusa da prevaziđe ćelijski blok za replikaciju virusa tokom infekcije mnogi ćelijskih linija kancera. Kako bi se ova deficijencija prevazišla, Us12 je izbrisan da bi se sinteza Us11 usmerila sa trenutnog ranog Us12 promotera, što dovodi do Us11 nakupljanja pre oštrećenja bloka sinteze proteina. Međutim, dok ovo maksimalno povećava sintezu proteina tokom infekcije, gubitak Us12 rezultira nemogućnosti virusa da se izbegne CD8+ citolitičko T-ćelijsko ubijanje inficiranih ćelija, što dovodi do pojačanog virusnog uklanjanja, smanjeno ubijanje ćelija od strane virusa, i sveukupnu smanjenu sintezu GM-CSF.

[0163] U cilju rešavanja nedostataka u OncoVEXGMCSF, dobija se neuro-atenuirana varijanta HSV (soja Patton) sa intaktnim endogenim Us12 i Us11, gde suγ134.5 geni zamenjeni sa Us11 kombinovanim sa trenutnim ranim (IE) promoterom, kao što se detaljno opisuje u USP 7,731,952.

[0164] Da bi se stvorio avirulentni Δ34.5 virus koji eksprimira Us11 na trenutnim ranim (IE) vremenima i sačuvao imunomodulatorni Us12 gen, obaγ134.5 promoter i ORF od HSV-1 genoma su zamenjeni kloniranjem Us11 gena, pod transkripcionom kontrolom a27 IE promotera, između DraI i SacI smesta za Bam SP, kako je prikazano na Slici 1C. Ovaj fragment je kotransfektovan u Vero ćelije sa prečišćenom Δ34.5 virusnom DNK i rekombinanti su odabrani na U251 ćelijama glioblastoma koje ne dozvoljavaju rast Δ34.5 virusa koji ne eksprimiraju Us11 na IE vremenima. Ovaj modifikovan virus je nazvan: Δ34.5::f1α27P-Us11 ("OV-2711"). Slika 1C je detaljna mapa genoma OV-2711, uključujući restrikciona mesta, i pokazuje položaj Us11 gena koji su zamenili dva WTγ134.5 gena, ostavljajući netaknute lokuse Us11 i Us12. Prema tome, modifikovana OV-2711 varijanta HSV, koja je osnova za novu, unapređenu varijantu HSV iz predmetnog pronalaska, ima tri funkcionalna Us11 gena, kao što je prikazano u uprošćenom linijskom dijagramu na Slici 1C.

[0165] Konstrukt OV-2711 usmerava sintezu Us11 kroz čitav životni ciklus virusa, sa oba ektopična IE promotera kao i sa endogenog kasnog promotera (naznačeno zvezdom-11 na Slici 1), koj se nalaze u okviru Us12 gena, što dovodi do većeg prinosa virusa i poboljšane onkolize.

Primer 2: Onkolitička varijanta HSV optimizovana za imunski kompetentni mišji model

[0166] Ovaj Primer opisuje unapređenu varijantu HSV koja može da se dobije na osnovu OV-2711 HSV koji se opisuje u Primeru 1, i koja može da se ispita u imunski kompetentnom mišjem modelu kancera.

[0167] IE-Us11 je veoma moćan dominantni selektabilni marker kada se insertuje u Δ34.5 HSV-1. Da bi se izolovala varijanta HSV koja sadrži IE-Us11, Us11 gen je kombinovan sa HSV-1 IE promoterom α27 i ova ekspresiona kaseta se insertuje u ciljani vektor umestoγ134.5 (videti, USP 7,731,952). Specifično, ciljani vektor je virusni BamSP fragment kloniran u plazmid pBR322 (Invitrogen, Carlsbad, CA). IE-Us11 kaseta je klonirana u BamSP između DraI mesta uzvodno od 34.5 ORF i drugog SacI mesta, nizvodno od 34.5 ORF, da bi se zamenio 34.5 ORF. Sa obe strane α27-Us11 ekspresione kasete se nalaze sekvence koje posreduju homolognoj rekombinaciji uγ134.5 lokusu. Specifično, SacI-BamHI fragment je nizvodno od 34.5 ORF i DraI-BamH1 fragment je uzvodno od 34.5 ORF u BamSP fragmentu.

[0168] Postoje dva SacI-BamHI fragmenta u HSV lokusu. Prvi SacI-BamHI fragment ima sledeću sekvencu u sekvenci HSV-1 soja 17 (GenBank pristupni br. X14112 (SEQ ID NO: 1)), koja se nalazi na nukleotidima 1307-2910:

[0169] Drugi SacI-BamHI fragment ima sledeću sekvencu u sekvenci HSV-1 soja 17 (GenBank Pristupni br. X14112) (SEQ ID NO: 1)), koja se nalazi na nukleotidima 123461-125064:

[0170] DraI-BamHI fragment, koji se nalazi na jednom položaju u HSV, ima sledeću sekvencu u sekvenci HSV-1 soja 17 (GenBank pristupni br. X14112 (SEQ ID NO: 1)), koja se nalazi u nukleotidima 125990-129564:

4

[0171] Ovaj vektor je zatim kotransfektovan sa prečišćenom Δ34.5 virusnom DNK (kao što se opisuje u USP 7,731,952) u Vero ćelijama (ATCC No. CCL-81), i virusi koji eksprimiraju IE-Us11 su odabrani pomoću pasaža U251 monslojeva ćelija. U251 ćelije [Ren, Y. et al. (2010) BMC Cancer 10:27] nameću potentni translacioni blok na Δ34.5 viruse, ali ekspresija IE-Us11 prevazilazi ovaj blok za virusni rast i rekombinovani virusi koji eksprimiraju IE-Us11 mogu lako da se odaberu. Varijante HSV se dobijaju insercijom ekspresionih kaseta koje kodiraju UL49.5 i/ili mišji GM-CSF ("mGM-CSF") pod ili CMV ili EFla promoterima u blizini α27-Us11 dominantnog selektabilnog markera koji se nalazi uγ134.5 lokusu ciljanog vektora. Očekuje se da insercija mGM-CSF uγ134.5 lokus u varijanti HSV na osnovu OV-2711 (koji ima intaktne endogene Us11 i Us12 gene i kome nedostaje funkcionalna ICP34.5 ekspresija) da bude biološki značajno bolje za lečenje kancera. Ovi konstrukti su zatim kotransfektovani sa prečišćenom Δ34.5 virusnom DNK u Vero ćelije. Rekombinanti su zatim odabrani pasažom na U251 ćelijama i prečišćenom plaku. Tabela 1, ispod, navodi primere varijanti HSV koje mogu da se dobiju upotrebom ovog robustnog mehanizma selekcije.

Tabela 1: Varijante OV-2711

[0172] Dobijanje konstrukata i izolacija virusa koji kodiraju konstrukte sa funkcijama koje su naznačene u Tabeli 1 se detaljno opisuju u Primeru 3, ispod.

[0173] Da bi se dobile genetičke konfiguracije koje omogućavaju efikasan virusni rast i sintezu ektopičnih proteina, izvodi se strategija konstrukcije ciljanog vektora koja je prikazana na Slici 2.γ134.5 lokus cilijanog vektora je prikazan u gornjem delu slike. Ovaj vektor izveden iz BamSP fragmenta, iγ134.5, se nalazi između DraI i SacI mesta BamSP, je zamenjen sa α27-Us11 dominantnim selektabilnim markerom. U ovom postupku, SacI mesto je uništeno i DraI mesto je zamenjeno sa PacI mestom.

[0174] CMV i EF1αpromoterske kasete koje eksprimiraju ili UL49.5 ili GM-CSF koje su sa obe strane ograničene sa mestima za restrikcionu nukelazu (odabrane od PacI, Sal-I, XhoI, SacI, DraI, BamHI, BlpI) se de novo sintetišu (dostupno kao komercionalna usloga, npr., iz ugovora proizvođača GenScript USA). CMV-zasnovane kasete su ograničene BGH signalom za poliadenilaciju i EF1α je ograničen na krajevima sa SV40 signalom za kasnu poliadenilaciju. Sve sintetizovane kasete mogu da se insertuju u ciljani vektor digestijom sa PacI zatim spajanjem i transformacijom u E. coli. Upotrebom jednog mesta restrikcionog enzima, insercije ekspresionih kaseta u obe orijentacije mogu da se istovremeno konstruišu. Dodatno, postavljanje Sal-I i XhoI mesta u sintetisanim kasetama olakšava laku konstrukciju kombinacija CMV i EF1αkasete u svim mogućim orijentacijama u odnosu jedne na drugu (Sal-I i XhoI imaju kompatibilne lepljive krajeve). Ovi kombinovani konstrukti se zatim insertuju u PacI mesto u ciljanom vektoru u obe orijentacije. Izvođenjem ove strategije dobijaju se 22 ciljana konstrukta, koja su prikazana na Slikama 3A-3D. Kao što je prikazano na Slikama 3A-3D, različite transkripcione kasete su orijentisane ili u istom pravcu ili su međusobno okrenute (tj., imaju suprotne orijentacije). Posledenje dve kasete koje su prikazane u donjem delu Slike 3D prikazuju „back-toback“ orijentaciju CMV i EF1αpromotera ukoliko se izvede parcijalna digestija CMV kasete sa Sal-I i XhoI digestirana EF1αkaseta se insertuje u Sal-I mesto 3’ promotera CMV. Isti konstrukt može da se napravi parcijalnom digestijom EF1αkasete sa XhoI i insercijom Sal-I digestirane CMV kasete u XhoI mesto 3’ EF1αpromotera.

4

[0175] Interno prema fragmentu a27 pomotera u ciljanom vektoru je kopija HSV-1 gK gena. Položaj gK gena i predloženi položaj gK promotera su prikazani u ciljanom konstuktu koji je prikazan u gornjem delu na Slici 3A.

[0176] Primer sekvence nukleinske kiseline gK gena, je:

[0177] ATG kodon inicijacije za gK se nalazi približno 200bp nizvodno od PacI mesta i orijentisan je prema Us11. gK je poliadenilovan na signalu za poliA koji je lociran uzvodno od mesta inicijacije transkripcije α27 promotera. Insercija gK uγ134.5 lokus dovodi do nastanka dve dodatne kopije za ukupno tri gK gena. U određenim izvođenjima, ekspresiona kaseta koja je insertovana u PacI mesto ne interferira sa ekspresijom gK.

[0178] Da bi se odredilo koje kombinacije i orijentacije imaju prinos najboljih izolata za dobijanje virusnog panela upotrebom ciljanih konstrukata koji su prikazani na Slikama 3A-3D, ciljani konstrukti su linearizovani i ko-transformisani sa prečišćenom Δ34.5 virusnom DNK u Vero ćelije. Postupak se opisuje u USP 7,731,952. Jednom kada se uoči virusni citopatski efekat (cpe), ploče se zamrzavajuotapaju, virusni lizati se sonifikuju, razblažuju 1:10 i 1:100 i dodaju se na konfluentne monoslojeve U251 ćelija. Jednom kada se uoči 90% cpe, druga runda odabira U251 se izvodi upotrebom 1:100 i 1:1000 razblaženja virusnog lizata. Kada se uoči 90% cpe na najnižem razblaženju, ploče se zamrzavaju-otapaju i određuju se virusni titri.

[0179] Zatim se pripremaju štokovi sa visokim titrom infekcijom u šoljama od 10cm koje sadrže konfluentne Vero ćelijske monoslojeve na MOI od 0.01. Zatim se vrši titracija ovih štokova i koristi se za inficiranje ćelijskih monoslojeva U251 ćelija na MOI=5. 16hrs posle infekcije, supernatanti se uklanjaju i skladište za ELISA da bi se odredio nivo izlučenog mGM-CSF. Minimalni medijum koji sadrži radioaktivni cistein i metionin se zatim dodaje za obeležavanje novosintetisanih proteina.

[0180] Ćelijski monoslojevi se zatim liziraju u lemlijevom puferu i razdvajaju sa SDS-PAGE u duplikatima gelova. Jedan gen se obrađuje za Western blot analizu da se detektuje transgena (npr., UL49.5 i/ili GM-CSF) ekspresija i drugi je fiksiran, osušen i izložen filmu X-zračenja da se odrede relativne brzine virusne proteinske sinteze 15 časova nakon infekcije. Pulovi OV-2711 varijanti koji se repliciraju do visokih titra, održavaju robustne brzine sinteze virusnih proteina i eksprimiraju UL49.5 ili GM-CSF ili se prečišćuju za plak i pripremaju se štokovi visokog titra.

[0181] Dve (2) šolje od 10 cm konfluentnih Vero ćelijskih monoslojeva se zatim inficiraju na visokom MOI za svaka od tri izolata po virusu navedenom u Tabeli 1 i za koje su genske ekspresione kasete

4

prikazane na Slikama 2 i 3. Virusna DNK se zatim izoluje i analizira Southern blotom da bi se verifikovala pravilna integracija ciljanih vektora uγ134.5 lokusa i održavanje Us12 gena. Dobijaju se varijanta HSV koja raste do sličnih titrova i efikasno eksprimira ili mGM-CSF ili UL49.5 ili oba transgena (gde je svaki transgen eksprimiran na nivoima sličnim varijanti HSV sa jednom kopijom odgovarajućeg transgena). Varijanta HSV koja se dobija u ovom Primeru kodira Us12, međutim, deficijentni su za izbegavanje CD8+ T-ćelija kod miševa osim ukoliko eksprimiraju UL49.5 zbog toga što Us12 ne inhibira TAP poreklom iz glodara.

Primer 3: Dobijanje i izolovanje rekombinovanih virusa koji kodiraju UL49.5 i GM-CSF

[0182] Ovaj Primer opisuje dobijanje i izolovanje varijanti divljeg tipa HSV Stoja Patton na osnovu OV-2711 konstrukata koji se opisuju u Primeru 2, gore, koji kodiraju diploidni CMV ili EF1αpromoterkontrolisani mišji GM- CSF (mGM-CSF) gen i herpes virus govečeta (BHV) UL49.5 gen zasebno i zajedno.

[0183] Strategija za dobijanje konstrukata ciljanog vektora prikazana na Slici 4 se zasniva na povezivanju ektopičnih transkripcionih jedinica sa trenutnom rano eksprimiranim Us11 (IE-Us11) kasetom u vektoru koji cilja homolognu regombinaciju sa virusnim γ34.5 lokusom, kao što se opisuje u Primeru 2, gore. Strategija je prikazana na Slici 5.

[0184] Strategija konstrukcije ciljanog vektora se nastavlja u tri koraka, prema sledećim:

Korak 1: pCMV-mGM-CSF je digestiran sa NheI i XhoI da bi se oslobodio GM-CSF gen i vektorska osnova se prečišćava na gelu sa fragmenta koji sadrži GM-CSF. NheI-XhoI fragmenti sa pNhe-UL49.5-Xho i pNhe-UL49.5-fs-Xho su izolovani digestijom sa NheI i XhoI zatim sledi prečišćavanje na gelu. Ovi fragmenti su zatim spojeni u NheI-XhoI digestirani pCMV-mGM-CSF da se redom dobiju pCMV-UL49.5 i pCMV-UL49.5-fs.

Korak 2: pCMV-mGM-CSF je digestiran sa BamHI i XbaI i fragment koji sadrži mGM-CSF gen pod CMV promoterom i BGH poliA kontrola kao i ukupna vektorska osnova neophodna za replikaciju, segregaciju i održavanje u Escherichia coli se prečišćava na gelu. pEF1α-UL49.5 se zatim digestira sa BamHI i XbaI i fragment koji sadrži UL49.5 gen pod EFla i SV40 kasnom poliA kontrolom se prečišćava na gelu i spaja u XbaI-BamHI isečeni pCMV-GM-CSF da se dobije pCMV-mGM-CSF/EF1α-UL49.5.

Korak 3: pCMV-mGM-CSF, pCMV-UL49.5, pCMV-UL49.5-fs, i pCMV-mGM-CSF/EF1α-UL49.5 se digestuju sa BlpI i PacI i fragmenti koji sadrže mGM-CSF i/ili UL49.5 ekspresione kasete se prečišćuju na gelu i spajaju u BlpI i PacI isečak i prečišćeni vektor pSP-Δ34.5-fla27P-Us11-PacI da se dobiju ciljani vektor: pSP-Δ34.5-fla27P-Us11-CMV-mGM-CSF (koji imaju sekvencu nukleinske kiseline koja je predstavljena u SEQ ID NO: 16), pSP- Δ34.5-fla27P-Us11-CMV-UL49.5 (koji imaju sekvencu nukleinske kiseline koja je predstavljena u SEQ ID NO: 17), pSP- Δ34.5-fla27P- Us11-CMV-UL49.5-fs (koji imaju sekvencu nukleinske kiseline koja je predstavljena u SEQ ID NO: 18), pSP- Δ34.5-fla27P-Us11-CMV-mGM-CSF/EF1α-UL49.5 (koji imaju sekvencu nukleinske kiseline koja je predstavljena u SEQ ID NO: 19), i pSP- Δ34.5-f1a27P- Us11-CMV-mGM-CSF/EF1α-UL49.5-fs (koji imaju sekvencu nukleinske kiseline koja je predstavljena u SEQ ID NO: 20). Nakon uspešne homologne rekombinacije, varijanta HSV sadrži polinukleotidne kasete bez ograničavanja regiona homologne rekombinacije. Prema tome varijanta HSV sadrži polinukleotidne kasete koje imaju sledeće sekvence nukleinske kiseline: mGM-CSF polinukleotidnu kasetu (SEQ ID NO: 21), UL49.5 polinukleotidnu kasetu (SEQ ID NO: 22), UL49.5-

4

fs polinukleotidnu kasetu (SEQ ID NO: 23), UL49.5/mGM-CSF polinukleotidnu kasetu (SEQ ID NO: 24), i UL49.5-fs/mGM-CSF polinukleotidnu kasetu (SEQ ID NO: 25)

[0185] Kao što je prikazano na Slici 5, plazmid pCMV-mGM-CSF kodira mGM-CSF gen pod CMV promoterom i BGH poliA kontrolom. mGM-CSF ORF je ograničen jedinstvenim NheI mestom restrikcione endonukleaze 5’ mGM-CSF start kodona i jedinstveno XhoI mesto 3’ mGM-CSF stop kodona i 5’ od BGH poliA mesta. 3’ BGH poliA mesta su jedinstvena XbaI, BamHI i PacI mesta restrikcionih endonukelaza. 5’ CMV promotera je uzvodna porcija regiona a27 promotera pod BlpI mesta do uzvodnog kraja a27 promotera. Plazmidi pNhe-UL49.5-Xho i pNhe-UL49.5-fs-Xho kodiraju UL49.5 i UL49.5-fs ORFs ogrančeni sa NheI i XhoI mestima da bi se olakšala zamena mGM-CSF ORF u pCMV-mGM-CSF sa UL49.5 i UL49.5-fs ORF-a. pEF1α-UL49.5 kodira UL49.5 ORF pod transkripcionom kontrolom EF1α promotera i SV40 kasnog poliA signala. Uzvodno od EF1αpromotera su jedinstvena mesta BamHI i PacI restrikcionih endonukleaza. Nishodno od kasnog SV40 poliA signala je jedinstveno mesto XbaI restrikcione endonukelaze. Plazmid pSPΔ34.5-flα27P-Us11-PacI je ciljani vektor ilustrovan na Slikama 2, 3, i 4 i opisan je u Primeru 2, gore.

[0186] Upotrebom gore navedene strategije, dobija se sledeća varijanta HSV i izoluje, osim ukoliko nije drugačije naznačeno:

1. OV-UL49.5: Ova varijanta HSV sadrži isti konstrukt kao OV-mGM-CSF konstrukt, ispod, osim toga što je otvoreni okvir čitanja mGM-CSF zamenjen sa BHV UL49.5 genom.

2. OV-UL49.5-fs: Ova varijanta HSV sadrži UL49.5 sa jednom adicijom nukleotida između drugog i trećeg UL49.5 kodona da se dobije mutacija koja menja okvir čitanja (engl. „frameshift“) (fs).

3. OV-mGM-CSF: Ova varijanta HSV sadrži mGM-CSF gen pod kontrolom CMV promotera. Transkripcija se završava na BGHpA, kao u OncoVEXGM-CSF.

4. OV-UL49.5/mGM-CSF: Ova varijanta HSV sadrži mGM-CSF pod CMV promoterom i BGHpA kontrolom, kao i UL49.5 pod kontrolom EF1α promotera i SV40 kasnog signala za poliadenilaciju.

5. OV-UL49.5-fs/mGM-CSF: Ova varijanta HSV sadrži isti konstrukt kao OV-UL49.5/mGM-CSF konstrukt osim toga što je uključena gore opisana UL49.5 fs mutacija. Ova varijanta HSV je dobra izogena kontrola za doprinos izbegavanja CD8+ T-ćelija sa UL49.5 koji čini u virusnom okruženju koji kodiraju mGM-CSF. Očekuje se da se ova varijanta HSV lako izoluje, s obzirom na to da se dobija OV-UL49.5/mGM-CSF.

[0187] Iako varijanta HSV koja se dobija u ovom primeru i koja se dobija iz divljeg tipa HSV Soja Patton, koji je poznat uoblasti tehnike [videti, npr., Međunarodnu prijavu patenta objavu br. WO 2002/06513; U.S. Patent br.4,818,694; and Mohr, I. et al. J Virol.2001 June; 75(11): 5189-5196, i U.S. Prijavu patenta objavu br. 20060039894], stručnjaku iz oblasti tehnike će biti jasno da materijali i postupci koji se ovde opisuju mogu da se koriste za dobijanje homologih varijanti drugih HSV sojeva, uključujući, ali bez ograničenja, divlji tip HSV Soja 17 koji ima sekvencu nukleinske kiseline predstavljenu u SEQ ID NO: 1. Predviđena sekvenca nukelinske ksieline kompletnih varijanti HSV Soja 17, koje su homologe sa varijantom Patton HSV OV-UL49.5, OV-UL49.5-fs, OV-mGM-CSF, OV-UL49.5/mGM-CSF, i OV-UL49.5-fs/mGM-CSF, gore opisanom, su prema tome predstavljene u SEQ ID NOS:26-30, redom, kao ne-ograničavajući, primeri sekvenci varijante HSV prema ovom pronalasku.

4

[0188] Ciljani vektori su ko-transfektovani u Vero ćelije sa prečišćenom Δ34.5 virusnom DNK, i zatim su rekombinovani virusi koji eksprimiraju IE-Us11 odabrani pomoću rasta na U251 ćelijama, koje neomogućavaju rast Δ34.5 virusa. Prema tome, IE-Us11 funkcioniše kao dominantni selektabilni marker u ovom sistemu za odabir varijanti HSV koje uspešno kodiraju polinukleotidne kasete.

[0189] Da bi se pokazalo uspešno dobijanje i izolovanje varijanti HSV koje kodiraju mGM-CSF, UL49.5, UL49.5-fs, ili UL49.5/mGM-CSF polinukelotidne kasete, virusna DNK iz virunih štokova sa visokim titrom koji se dobijaju iz izolovanih plakova se dobijaju i digestuju sa dva restrikciona enzima koji seku izvan Δ34.5 lokusa i oslobađaju fragmente koji sadrže IEUsll i ektopične transgene sekvence za analizu Southern blotom. Digestirana DNK se razdvaja na 0,8% agaroznom gelu, prenosi na najlonmembranu i testira probom sa obeleženim fragmentima koji hibridizuju sa Δ34.5 lokusom. Kao što je prikazano na Slici 6, trake u svakoj liniji se slažu sa predviđenim veličinama fragmenata za svaku dobijenu varijantu HSV, kao i kontrolnih virusa Δ34.5 i OV-2711.

Primer 4: Infektivnost virusa koji kodira UL49.5/GM-CSF konstrukt

[0190] Ovaj primer pokazuje da je rekombinovani HSV-1 modifikovan da kodira UL49.5/mGM-CSF konstrukt koji se opisuje u Primeru 3, gore, kao što je prikazano u Primeru 4, eksprimira UL49.5 polipeptid, s obzirom na to da je UL49.5 polipeptid detektovan u Vero ćelijama koje su inficirane sa OV-UL49.5/mGM-CSF

[0191] Vero ćelije su lažno inficirane ili su inficirane sa pet odvojenih prečišćenih izolata plaka OV-UL49.5/mGM-CSF na broju infekcije (MOI) jednakom 1. 24 časova posle infekcije, medijum je aspiriran i ćelije su lizirane u lemlijevom puferu. Lizat je zatim prokuvan da bi se proteini denaturisali, i prokuvani uzorci se zatim razdvajaju pomoću SDS-PAGE i Western blota upotrebom antitela koje je specifično za UL49.5 polipeptid (anti-H11 poliklonsko zečje antitelo (opisano u Lipinska AD, et al. J Virol 2006;80:5822-32). Kao što je prikazano na Slici 7A, protein očekivane molekulske mase, približno 12kDa, se uočava u ćelijama koje su inficirane virusom ali ne u lažno inficirnaim ćelijama. Ne-specifični ∼15kDa pozadinski signal pokazuje da slična količina lažno inficiranog uzorka je prisutna u poređenju sa virusom inficiranim uzorkom. Ovo isključuje mogućnost da je traka od 12kDa odsutna iz lažno inficirane linije zbog niže od očekivane koncentracije lažnog uzorka ili nalivanja na gel.

[0192] Sledeće, Vero ćelije su inficirane ili sa divljim tipom (WT) Patton soja HSV-1 ili OV-UL49.5 na MOI=5, i, 24 časova nakon infekcije (PI), proteinski lizati su pripremljeni i analizirani za ekspresiju UL49.5 polipeptida sa Western blotom, kao što se gore opisuje. UL49.5 polipeptid se jasno nakuplja do lako detektabilnih nivoa u ćelijama koje su inficirane sa OV- UL49.5, ali se ne detektuje u ćelijama koje su inficirane sa WT HSV-1, što ukazuje na to da se uspešno dobija rekombinovani HSV-1 koji kodira i eksprimira UL49.5 polipeptid (OV-UL49.5) (Slika 7B).

Primer 5: Detekcija mGM-CSF iRNK u mišjim Balb/c 4T1 ćelijama kancera grudi koje su inficirane sa BV-mGM-CSF ili BV-UL49.5/GM-CSF.

[0193] Ovaj primer pokazuje da je rekombinovani HSV-1 modifikovan da kodira mGM-CSF ili UL49.5/GM-CSF konstrukt koji se opisuje u Primeru 3, gore, eksprimira mGM-CSF iRNK.

4

[0194] 4T1 ćelije su ili lažno inficirane ili su inficirane sa divljim tipom (WT), ili OV-mGM-CSF ili OV-UL49.5/mGM- CSF virusima na MOI=5.24 časova nakon infekcije, ćelije su lizirane dodavanjem Trizol reagensa (Life Technologies) i RNK je prečišćena upotrebom RNeasy kolone od silicijum dioksida (Qiagen) prema uputstvima proizvođača. Prečišćena RNK se zatim tretira sa DNazom I (new England Biolabs) 30 minuta na 37°C, EDTA se dodaje do finalne koncentracije 5mM i zagreva 15 minuta na 75°C da bi se inaktivirala DNaza I. qRT-PCR se zatim izvodi upotrebom SYBR Green detekcije sa oligonukleotidnim prajmerima koji detektuju 18S rRNK, mGM-CSF iRNK ili virusnu VP16 iRNK. 18s rRNK se detektuje upotrebom vlasničkog para prajmera koji se kupuju u SA Biosciences (Valencia, California). mGM-CSF iRNK se detektuje upotrebom prajmera mGM-CSF-FW (5’-CTGTCACCCGGCCTTGGAAGC-3’) (SEQ ID NO: 31) i mGM-CSF-RV (5’-ACAG- GCATGTCATCCAGGAGGT-3’) (SEQ ID NO: 32). VP16 iRNK se detektuje upotrebom VP16-FW (5’- TCGGCGT-GGAAGAAACGAGAGA-3’) (SEQ ID NO: 33) i VP16-RV (5’- CGAACGCACCCAAATCGACA-3’) (SEQ ID NO: 34).

[0195] Ekspresija mGM-CSF iRNK (normalizovana sa signalom 18S rRNK) se jasno detektuje u ćelijama inficiranim sa rekombinovanim OV-2711 HSV varijantama koje kodiraju GM-CSF pod CMV kontrolom protokola (OV-mGM-CSF i OV- UL49.5/mGM-CSF) (Slika 8A). Dalje, ekspresija mGM-CSF iRNK je slična u ćelijama inficiranim sa jednom varijantom insercije transgena, OV-mGM-CSF u poređenju sa duplom varijantom insercije transgena, OV-UL49.5/GM-CSF.

[0196] Sledeće, detektuje se ekspresija VP16 iRNK (normalizovana sa signalom za 18S). VP16 je esencijalan gen HSV- 1, tako da se ekspresija iRNK detektuje u svim inficiranim ćelijama koje se analiziraju u ovom eksperimentu. Najviše je bila dvostruka razlika u ekspresiji VP16 iRNK kod ćelija koje su inficirane virusom (Slika 8B). Odsustvo detekcije mGM-CSF iRNK u poređenju sa detekcijom VP16 poruke u WT-inficiranim ćelijama pokazuje da je detektovani mGM-CSF signal (videti Sliku 8A) specifičan za ćelije koje su inficirane sa OV-2711 varijantama koje kodiraju ektopičnu mGM-CSF ekspresionu kasetu.

Primer 6: Evaluacija varijante HSV u MBT-2 modelu kancera bešike

[0197] Ovaj primer pokazuje da OV-2711 virus koji se opisuje u Primeru 1 može da se replicira i širi kroz MBT-2 ćelijske monoslojeve, koji omgućava punu evaluaciju doprinosa virusne evazije CD8+ T-ćelija za širenje virusa i anti-tumorske efikasnosti. Eksperimenti koji se opisuju u ovom Primeru mogu takođe da se koriste za evaluaciju rekombinovanih HSV virusa koji kodiraju konstruke koji se opisuju u Primerima 2 i 3, iznad.

[0198] OV-2711, kao i Δ34.5 i Δ34.5ΔICP47 virusi su evaluirani u in vitro modelu kancera bešike upotrebom MBT-2 ćelija. Δ34.5ΔICP47 imitira genski aranžman OncoVEXGM-CSF koji proizvodi trenutni rani eksprimirani Us11 kako bi se prevazišao blok u sintezi proteina sa kojima se susreću mutirani Δ 34.5.

[0199] Virusi se dodaju u medijume za replikaciju sa adherentnim MBT-2 ćelijskim monoslojevima na broju infekcija koji je jednak 0,01. Duplikati setova ploča u koje se dodaju naznačeni virusi su zamrznuti na 2, 24 časova, 48, 72, 96 i 120 časova nakon dodavanja virusa. Ploče su zatim otopljene, medijum je pipetiran i postavljen na površinu ploče da bi se ćelije odvojile i homogenizovale, prenesen je u epruvetu sa koničnim dnom zapremine 15 ml, sonifikovan 15 sekundi u vodenom kupatilu za sonifikaciju uz zamrzavanje. Epruvete se zatim otapaju i nivo infektivnog virusa koji se nalazi u svakom uzorku se određuje testom plaka upotrebom Vero ćelijskih monoslojeva, koji omogućavaju replikaciju i rast Δ34.5 varijanata.

[0200] Dok se Δ34.5 nije replicirao i širio kroz MBT-2 monoslojeve, upravo zbog ćelijskog bloka za sintezu proteina koji se uočavaju u mnogim ćelijskim linijama kancera koje su inficirane Δ34.5 varijantama, oba OV-2711 i Δ34.5ΔICP47 porasla je skoro i kao divlji tip (WT) (Slika 8). Iako deluje da se OV-2711 nakuplja na nižim titrima od Δ34.5ΔICP47, OV-2711 unos doze je proporcionalno niži u ovom eksperimentu, i očekuje se nakupljanje sličnih titra Δ34.5ΔICP47 kada se koriste na istom unosu doze. Iz ovog eksperimenta je jasno da OV-2711 može da se replicira i širi kroz MBT-2 ćelijske monosojeve. Prema tome, singeni MBT-2 model tumora može precizno da proceni ulogu koju ima virusno izbegavanje anti-HSV CD8+ T-ćelija u HSV1 onkolitičkoj virusnoj terapeutskoj efikasnosti, i može da se koristi za karakterisanje svojstava rekombinovanih virusa koji kodiraju konstrukte koji se opisuju u Primerima 2 i 3, u tekstu iznad.

[0201] Onkolitički virusi takođe mogu da se ispituju kao što se opisuje u ovom Primeru upotrebom pogodnih ćelijskih linija melanoma, kancera jajnika, glioma i/ili drugih ćelijskih linija kancera, da bi se karakterisala aktivnost rekombinovanih onkolitičkih virusa prema ćelijama kancera.

Primer 7: Evaluacija varijante HSV u singenom, imunski kompetentnom mišjem modelu kancera bešike

[0202] Sledeći eksperimenti mogu da se koriste za ispitivanje performansi onkolitičkih virusa koji se ovde opisuju (npr., u Primerima 2 i 3, gore u tekstu), uključujući varijantu HSV na osnovu OV-2711 (npr., oni koji su prikazani na Slikama 3 i 4), i da se porede performanse takvih virusa sa drugim virusima poznatim iz oblasti tehnike, kao što su OncoVEXGMCSF i njemu slični virusi. Eksperimenti pokazuju da funkcije koje su poznate da onemogućavaju inficiranje ćelija od strane CD8+ T- ćelija dovode do pojačane redukcije tumora bez narušavanja virusom posredovane vakcinacije tumorskim antigenom.

[0203] Pored direktne onkolize, imunski posredovana komponenta doprinosi efikasnosti HSV-1 onkolitičkog virusa kod imunski kompetentnih miševa. Upotrebom imunski kompetentnih miševa sa singenim, bilateralnim subkutanim (s.c.) tumorima, prethodne studije su uspostavile da tretman jednog tumora sa onkolitičkim virusom indukuje regresiju tretiranog i netretiranog kontelateralnog tumora (videti Toda M, et al. "Herpes simplex virus as an in situ cancer vaccine for the induction of specific anti-tumor immunity." Hum Gene Ther 1999;10:385-93). Dok i tretirani i netretirani tumori oba ulaze u regresiju, onkolitički virus se detektuje samo u tretiranom tumoru. Dalje, regresija neinjeciranog, kontralateralnog tumora nastaje iz anti-tumorskog CD8+ T-ćelijskog odgovora. Prethodno postojeći imunski odgovor ćelija domaćina može da neutralizuje HSV-1, međutim, najverovatnije ograničava širenje onkolitičkog virusa kroz injecirani tumor i smanjuje efikasnost na kojoj se razvija antitumorski imunitet.

[0204] Ovi eksperimenti porede onkolitička i svojstva izbegavanja imunskog sistema varijante HSV koje se dobijaju kao što se opisuje u Primerima 2 i 3, gore, u singenim, imunski kompetentim mišjim modelima kancera bešike, u kojima su miševi seropzitivni za HSV-1. Posebno, eksperimenti pokazuju da HSV varijante imaju intaktne endogene Us11 i Us12 gene, i nedostaju im ICP34.5 kodirajući geni, gde su ICP34.5 kodirajući geni zamenjeni sa IE-Us11 i UL49.5 (TAP inhibitor) ili sa IE-Us11, UL49.5 i GM-CSF ("OV-UL49.5" ili "OV-UL49.5-GM-CSF", redom), su superiorni prema HSV kome nedostaju

1

sposobnosti izbegavanja imunskog sistema (npr., sposobnost za inhibiranje TAP ili na drugi način izbegavanje CD8+ T ćelijskih odgovora), kao što su OncoVEXGMCSF ili OV-2711 (iako OV-2711 kodira Us12 i predviđen je da inhibira TAP funkciju u humanim ćelijama, defektan je u funkciji Us12 tokom infekcije ćelija glodara zbog toga što Us12 polipeptid ispoljava značajno smanjeni afinitet za inhibitornu aktivnost prema TAP glodara), zbog toga mogu da ostaju duže u tumoru i imaju veći kapacitet i) za direktnu onkolizu; i ii) za stimulisanje direktnog anti-tumorskog imuniteta.

[0205] Da bi se poredila anti-tumorska aktivnost HSV koji izbegava CD8+ T-ćelije ("OV-UL49.5" & "OV-UL49.5-GM- CSF") kod miševa sa onim koji ne mogu ("OV-2711" & "OV-mGM-CSF"), imunskikompetentni miševi se prvo imunizuju sa ne-neurovirulentnim, HSV-1 kompetentnim za replikaciju, ili subletalnom dozom WT virusa, kao što se opisuje u Chahlavi A, et al. "Effect of prior exposure to herpes simplex virus 1 on viral vector-mediated tumor therapy in immunocompetent mice." Gene Ther (1999) 6:1751-8, da bi se podražavali humani HSV-1 seropozitivni ili oni koji se konvertuju u sero-pozitivne posle tretmana onkolitičkiim virusom.

[0206] Razvijanje HSV-1+ imunskog odgovora se prati ELISA testom za prisustvo antitela koja neutralizuju virus [videti, Chahlavi A, et al. "Effect of prior exposure to herpes simplex virus 1 on viral vector-mediated tumor therapy in immunocompetent mice." Gene Ther (1999) 6:1751-8]. Omogućeno je da prođu tri (3) meseca kako bi se osigurao razvoj memorijskog imunskog odgovora, u vremenu kada su miševi izazvani sa virulentnim virusom da dokažu da je uspostavljena memorija fiziološki i funkcionlani, detektovanjem prisustva anti-HSV-1 citotoksičnih T limfocita (CTLs) [videti, Kavanagh DG, Gold MC, Wagner M, Koszinowski UH, Hill AB. J Exp Med. 2001 Oct 1;194(7):967-78. Sledeće, singeni s.c. MBT-2 mišji BC zasejani tumori su bilateralno implantirani u svaku stranu HSV- 1-vakcinisanog C3H/HeJ miša (Charles River Breeding Laboratories). Zasejani tumori su pripemljeni injekcijom 1 3 108 MBT-2 ćelija [videti, Mickey DD, et al. (1982) J Urol. 127(6):1233-7] s.c. u ok BALB/c nu/nu outbred miša (Charles River Breeding Laboratories). Tumori se mere svaki drugi dan sa Vernier šublerima i njihova zapremina se određuje upotrebom formule 0,52 X širina X visina X dubina. Jednom kada veličina tumora dostigne 150 mm<3>, životinja se eutanizuje, i razloženi tumor se preseca na fragmente veličine 2 X 2 X 2 mm. Individualni fragmeni tumora se zatim hirurški implantiraju s.c. u naivnog miša. Kada tumori dostignu veličinu 50 mm<3>, 50µl rastvora onkolitičkog virusa se injecira direktno u tumor.

[0207] S.c. model tumora ima značajne prednosti za ovaj eksperiment, kako omogućava precizna, neinvazivna merenja tumora tokom vremena; onkolitičkim virusom tretirani i netretirani rast tumora na različitim bokovima može direktno da se poredi; i netretirani tumori na kontralateralnim bokovima mogu direktno da se prate za virusne antigene.

[0208] Opseg doza HSV-varijante može da se testira u grupama od 5 HSV-1-vakinisanih životinja sa 50 mm<3>MBT-2 implantiranim tumorima s.c. na oba boka (Vero lizat, 10<6>, 10<7>, i 10<8>pfu - 20 miševa). OV-2711 se daje u danima 1, 3 i 5, i veličina tumora se meri kao što je gore opisano. Iako ovaj režim sa 5 x 10<6>pfu doze 2711 eliminiše rast tumora kod „nude“ miševa, niža efikasnost za OV-2711 je očekivana u imunski kompetentnim HSV-1-vakcinisanim miševima zbog preranog čišćenja 2711 od CD8+ T-ćelija i drugih komponenata imunskog sistema. Pored sposobnosti inhibiranja TAP-posredovanog prezentovanja virusnih antigena, očekuje se da inhibicija nije apsolutna i niži nivoi virusnih antigena su prikazani na MHC-I. TAP inhibicija jendostavno usporava brzinu na kojoj se virus uklanja od strane CD8+ T-ćelija u poređenju sa odgovarajućim virusom koji je deficijentan u funkcijama koje mogu

2

efikasno da inhibiraju TAP funkciju. Prema tome, ispituju se veće doze za određivanje najniže doze virusa kojom se postiže maksimalna regresija tumora (najniža efikasna doza - LED). Zapremina tumora može da se prati kao što se gore opisuje do 60 dana.

[0209] Nakon uspostavljanja dinamičkog opsega efikasnosti OV-2711 u imunski kompetentnim HSV-1 vakcinisanim životinjama, ispituju se panel varijante HSV koji se opisuje u Primerima 2 i 3, i koji ima genske modifikacije prikazane u Slikama 2, 3 i/ili 4. Očekuje se da je doza infektivnog virusa 10-puta ispod OV-2711 LED. Ovo treba da obezbedi dinamički za procenu doprinosa koju čini ekspresija UL49.5 i mGM-CSF za povećanu efikasnost onkolitičkog virusa. Tokom vremena može da se prati zapremina tumora kao što se gore opisuje. S obzirom na to da se onkolitički virusi ne šire na neinjektirani kontralateralni tumor, veličina kontralateralnog tumora je dobra mera za efikasnost onkolitičkim virusom posredovane vakcinacije tumora. Životinje mogu da se žrtvuju kada ispoljavaju znakove prekomernog opterećenja tumorom ili umora, izmeri se vlažna veličina tumora, i tumorsko tkivo se brzo zamrzava i skladišti za buduću analizu za detekciju virusne replikacije i infiltracije CD8+ T-ćelija imunohistohemijski (IHC) sa anti-HSV-1 i anti- CD8 antitelima, redom (kao što je dostupno, npr., od Abcam® (Cambridge, MA) i Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)).

[0210] Očekuje se da će: i) injecirani i neinjecirani tumori regresirati, ali će virus moći da se detektuje samo u injeciranom tumoru; i ii) regresija neinjeciranog, kontralateralnog tumora nastaje iz antitumorskog T-ćelijskog odgovora. Rezultati iz ovog eksperimenta će definisati kako Usl2-slično imunsko izbegavanje funkcionše da doprinese efikasnosti onkolitičkog virusa i razvijanju antitumorksog imuniteta. Ukoliko izbegavanje CD8+ T-ćelija doprinosi efikasnosti onkolitičkog virusa, očekuje se veće smanjenje u veličini OV-UL49.5-injeciranog i odgovarajućih kontralateralnih tumora u poređenju sa tumorima kod miševa koji su tretirani sa OV- 2711 ili OV-mGM-CSF. Takođe se očekuje da tumori koji su injecirani sa OV-UL49.5-GM-CSF, imaju povećano regrutovanje APC od strane mGM-CSF koje je povezano sa poboljšanim širenjem virusa dodeljeno od strane UL49.5, i da će OV-UL49.5-GM- CSF varijanta obezbediti superiorniji onkolitički virus za lečenje kancera bešike.

[0211] Onkolitički virusi koji se gore opisuju takođe mogu da se ispitaju kao sto se opisuje u ovom Primeru upotrebom pogodnih in vivo životinjskih modela melanoma, kancera jajnika, glioma i/ili drugih kancera, da bi se okarakterisala aktivnost rekombinovanih onkolitičkih virusa prema ćelijama kancera. U oblasti tehnike su poznati takvi životinjski modeli i ovde se gore u tekstu detaljno opisuju.

4

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

11

12

1

14

1

1

1

�

�

11

11

11

11

11

11

11

12

��

��

12

��

��

��

�

11

��

1

14

�

1

�

1

�

14

��

��

��

��

��

��

�

11

��

�

��

�

�

�

�

�

�

11

��

�

��

�

�

�

�

�

�

11

��

�

��

�

�

�

�

�

�

11

��

1

��

�

�

�

�

�

�

11

��

�

��

�

�

�

�

�

�

21

22

�

��

�

�

�

�

�

21

21

21

21

21

21

21

22

22

22

22

22

22

22

�

21

22

�

��

�

�

�

�

�

��

��

��

��

��

��

��

�

21

22

�

��

�

�

�

�

�

�

21

22

�

��

�

�

�

�

2

�

21

22

�

��

�

�

�

�

�

�

21

22

�

��

�

�

�

�

�

�

21

22

�

��

�

�

�

�

�

�

�

�

�

11

��

1

��

�

�

�

�

�

�

21

22

�

��

�

�

�

�

�

�

�

�

�

41

42

�

44

�

�

�

�

�

�

�

�

Claims (33)

Patentni zahtevi

1. Varijanta herpes simpleks virusa (HSV) koja obuhvata:

a. funkcionalno inaktivne ICP34.5 kodirajuće gene;

b. gen koji kodira US11 koji je operativno povezan sa trenutnim ranim (IE) promoterom; c. intaktni endogeni gen koji kodira US11;

d. intaktni endogeni gen koji kodira Us12; i

e. gen koji kodira heterologni TAP inhibitorni polipeptid,

gde je heterologni TAP inhibitorni polipeptid UL49.5 TAP inhibitorni polipeptid herpes virusa, CMV US6 polipeptid, ili BNLF2a polipeptid.

2. Varijanta HSV prema zahtevu 1, gde je varijanta HSV izvedena iz HSV-1.

3. Varijanta HSV prema ili zahtevu 1 ili 2, gde je varijanta HSV izvedena iz divljeg tipa HSV-1, HSV-1 soja F, HSV-1 soja 17, HSV-1 KOS, HSV-1 soja Patton, ili kliničkog soja HSV-1.

4. Varijanta HSV prema bilo kom od zahteva 1-3, gde je varijanta HSV najmanje 70% identična sa HSV-1 ili HSV-2.

5. Varijanta HSV prema bilo kom od zahteva 1-4, gde je varijanta HSV izvedena iz SEQ ID NO: 1.

6. Varijanta HSV prema bilo kom od zahteva 1-5, gde UL49.5 TAP inhibitorni polipeptid je izveden iz herpes virusa govečeta, virusa pseudobesnila, herpes virusa 1 konja, herpes virusa 4 konja, bubaline herpesvirus 1, cervid herpes virus 1, ili feline herpesvirus 1.

7. Varijanta HSV prema zahtevu 6, gde UL49.5 TAP inhibitorni polipeptid je izveden iz herpes virusa govečeta.

8. Varijanta HSV prema bilo kom od zahteva 1-7, gde se ICP34.5 geni održavaju funkcionalno inaktivnim pomoću delecije, supstitucijom, ili insercijom.

9. Varijanta HSV prema bilo kom od zahteva 1-7, gde se najmanje jedan od ICP34.5 gena održava funkcionalno inaktivnim insercijom ekspresione kasete.

10. Varijanta HSV prema bilo kom od zahteva 1-7, gde se najmanje jedan od ICP34.5 gena održava funkcionalno inaktivnim bez insercije ekspresione kasete.

11. Varijanta HSV prema bilo kom od zahteva 1-10, gde intaktni endogeni gen koji kodira US11 je eksprimiran sa endogenog kasnog promotera koji se nalazi u genu za Us12.

12. Varijanta HSV prema bilo kom od zahteva 1-11, gde se IE promoter bira između CMV, EF1α, α0, α4, α22, α47, i α27 IE promotera.

13. Varijanta HSV prema bilo kom od zahteva 1-12, gde varijanta HSV dalje sadrži heterologni gen koji kodira polipeptid koji se bira od faktora koji stimuliše koloniju granulocita makrofaga (GM-CSF), faktora nekroze tumora (TNF)-alfa, liganda za CD40 (CD40L), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, G-CSF, IFN-a, IFN-γ, IL-20 (MDA-7), B7-1 (CD80) i B7-2 (CD86).

14. Varijanta HSV prema zahtevu 13 gde heterologni gen kodira GM-CSF.

15. Varijanta HSV prema zahtevu 13, gde heterologni gen kodira IL-12.

16. Varijanta HSV prema bilo kom od zahteva 13-15 gde heterologni gen ili gen koji kodira heterologni TAP inhibitorni polipeptid je operativno povezan sa eukariotskim ili virusnim promoterom.

17. Varijanta HSV prema zahtevu 16 gde je promoter CMV promoter, MMLV LTR promoter, RSV promoter, ili EF1α promoter.

18. Varijanta HSV prema bilo kom od zahteva 13-15 gde heterologni gen ili gen koji kodira heterologni TAP inhibitorni polipeptid je operativno povezan sa inducibilnim promoterom.

19. Varijanta HSV prema bilo kom od zahteva 1-18 koja obuhvata:

a. funkcionalno inaktivne ICP34.5 kodirajuće gene;

b. US11 kodirajući gen koji je operativno povezan sa trenutnim ranim (IE) promoterom; c. gen koji kodira UL49.5 TAP inhibitorni polipeptid;

d. intaktni endogeni US11 kodirajući gen;

e. intaktni endogeni Us12 kodirajući gen; i

f. gen koji kodira GM-CSF.

20. Varijanta HSV prema zahtevu 19, gde gen koji kodira UL49.5 TAP inhibitorni polipeptid je izveden iz herpesvirusa govečeta.

21. Varijanta HSV prema ili zahtevu 19 ili 20, gde gen koji kodira UL49.5 TAP inhibitorni polipeptid je operativno povezan sa eukariotskim ili virusnim promoterom.

22. Varijanta HSV prema bilo kom od zahteva 19-21, gde gen koji kodira GM-CSF je operativno povezan sa eukariotskim ili virusnim promoterom.

23. Varijanta HSV ili prema zahtevu 21 ili 22, gde je promoter CMV promoter, MMLV LTR promoter, RSV promoter, ili EF1α promoter.

24. Varijanta HSV prema bilo kom od zahteva 1-23, u kome je gen koji kodira heterologni TAP inhibitorni polipeptid je insertovan nishodno od US11 kodirajućeg gena koji je operativno povezan sa trenutnim ranim (IE) promoterom.

25. Varijanta HSV prema bilo kom od zahteva 1-24, u kome je gen koji kodira heterologni TAP inhibitorni polipeptid je insertovan u istoj orijentaciji kao US11 kodirajući gen.

26. Varijanta HSV prema bilo kom od zahteva 13-25, gde je heterologni gen insertovan nishodno od US11 kodirajućeg gena.

27. Varijanta HSV prema bilo kom od zahteva 13-26, gde je heterologni gen insertovan u istoj orijentaciji kao US11 kodirajući gen.

28. Varijanta HSV prema bilo kom od zahteva 14 ili 19-23, gde su gen koji kodira heterologni TAP inhibitorni polipeptid i heterologni gen koji kodira GM-CSF operativno povezani sa istim promoterom.

29. Varijanta HSV prema zahtevu 1 koja ima genomsku sekvencu koja je predstavljena u SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, ili SEQ ID NO: 30.

30. Varijanta HSV prema zahtevu 1 koja ima intaktni endogeni US12 kodirajući gen i intaktni endogeni US11 kodirajući gen, kome nedostaju funkcionalni ICP34.5 kodirajući geni, gde je svaki ICP34.5 kodirajući gen zamenjen sa polinukleotidnom kasetom koja obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja je predstavljena u jednoj od SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22,: SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 i SEQ ID NO: 25.

31. Farmaceutska formulacija koja obuhvata varijantu HSV prema bilo kom od zahteva 1-30 i farmaceutski prihvatljivi nosač.

32. Varijanta HSV prema bilo kom od zahteva 1-30 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 31, za upotrebu u postupku lečenja kancera kod pacijenta, pomenuti postupak obuhvata davanje pacijentu pomenute varijante HSV ili pomenute farmaceutske kompozicije.

33. Varijanta HSV ili farmaceutska formulacija za upotrebu prema zahtevu 32, gde se kancer bira iz grupe koja obuhvata kancer grudi, mozga, cerviksa, debelog creva, glave & vrata, jetre, bubrega, pluća, ne-sitnoćelijski kancer pluća, melanom, mezoteliom, kancer ovarijuma, sarkom, kancer stomaka, kancer materice i meduloblastom, Hodčkinovu bolest, Ne-Hodčkinov limfom, multipli mijelom, neuroblastom, kancer ovarijuma, rabdomiosarkom, primarnu trombocitozi, primarnu makroglobulinemiju, primarne tumore mozga, maligni pankreasni insulanom, maligni karcinoid, urinarni kancer bešike, premaligne lezije kože, kancer testisa, limfome, kancer tiroidee, neuroblastom, kancer jednjaka, kancer genitouriarnog trakta, malignu hiperkalcemiju, kancer endometrijuma, kortikalni kancer nadbubrežne žlezde, neoplazme endokrinog i egzokrinog pankreasa, i kancer prostate.

1