RS58168B1 - Imunološko ispitivanje pojačavanjem signala - Google Patents

Imunološko ispitivanje pojačavanjem signala

Info

Publication number
RS58168B1
RS58168B1 RS20181486A RSP20181486A RS58168B1 RS 58168 B1 RS58168 B1 RS 58168B1 RS 20181486 A RS20181486 A RS 20181486A RS P20181486 A RSP20181486 A RS P20181486A RS 58168 B1 RS58168 B1 RS 58168B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
protein
detector
antigen
antibody
binding
Prior art date
Application number
RS20181486A
Other languages
English (en)
Inventor
Cristina Cuesico
Jeremy Walker
Rajesh K Mehra
Kenneth P Aron
Dennis M Bleile
Original Assignee
Abay Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Abay Sa filed Critical Abay Sa
Publication of RS58168B1 publication Critical patent/RS58168B1/sr

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
    • G01N33/54388—Immunochromatographic test strips based on lateral flow
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
    • G01N33/553—Metal or metal coated
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • G01N33/587—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/6857—Antibody fragments
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/20—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/29—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Richettsiales (o)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Description

Opis
POREKLO PRONALASKA
[0001] Imunološka ispitivanja se, između ostalog, često koriste za identifikaciju infektivnih agenasa. Neka imunološka ispitivanja su zasnovana na imunološkim odgovorima domaćina na dati infektivni agens, na primer, testiranjem na prisustvo antitela domaćina koja se specifično vezuju za jedan ili više specifičnih antigena tog infektivnog agensa. Brojni tipovi sistema imunoloških ispitivanja su raspoloživi u cilju dijagnostike, uključujući velike, automatizovane sisteme centralnih laboratorija i relativno jednostavne "over-the-counter" testove. Ova imunološka ispitivanja koriste širok opseg test formata, kao što su ispitivanje aglutinacije, ispitivanje precipitacije, imunološko ispitivanje na bazi enzima, ispitivanje direktne fluorescencije, imuno-histološki testovi, ispitivanje fiksacije komplementa, serološki testovi, imuno-elektroforetična ispitivanja i imunohromatografski i brzi testovi (to jest, testovi pomoću traka). Imunološka ispitivanja mogu da obezbede brze, jednostavne i efikasne dijagnoze za različita stanja. Međutim, u tehnici ostaje potreba za poboljšanjem imunoloških analiza koje imaju povećanu senzitivnost.
[0002] WO 2011/063235 otkriva peptide, sredstva i postupke za otkrivanje Ehrlichia antitela.
[0003] WO 2011/063003 (član familije US2011136155) otkriva peptide i postupke za detekciju antitela Lajmske bolesti.
[0004] Hong W. i saradnici, J. of Microbiological Methods, Vol.83, no.2, November 2010, p.133-140 se odnosi na razvoj 10-kanalnog imunog testa lateralnog protoka za profilisanje antitela za Yersinia pestis na bazi tehnologije prevođenja fosfora na viši nivo.
[0005] Fan Chao-ming i saradnici, Chinese journal of tuberculosis and respiratory diseases, Vol. 34, no.5, May 2011, p.356-358 [u Kini Chinese, videti Medline Abstract NLM21729624 na engleskom] otkriva studiju brze detekcije za Mycobacterium tuberculosis antitelo pomoću imunohromatografije dvostrukog antigen sendviča koloidnog zlata.
[0006] WO 2013/067524 (stanje tehnike u skladu sa članom 54(3) EPC i članom familije US2013115634) otkriva peptide i postupke za detekciju antitela Lajmske bolesti.
[0007] WO 2014/059274 (stanje tehnike u skladu sa članom 54(3) EPC) otkriva peptide, sredstva i postupke za detekciju Ehrlichia antitela.
KRATAK SADRŽAJ PRONALASKA
[0008] Ovaj pronalazak se delimično zasniva na otkriću da dodavanje detektabilnih Fcvezujućih molekula (na primer, Protein A-konjugati, Protein G-konjugati, sekundarni konjugati antitela) može da se koristi za detekciju antitela u imunološkim ispitivanjima, na primer, apsorpciji na bazi antigena ili analizi sendvič tipa. Ove detektabilne Fc-vezujuće molekule mogu da se koriste ili same ili u kombinaciji sa drugim detektabilnim entitetima za detekciju antitela u imunološkim ispitivanjima. Na primer, ove Fc-vezujuće molekule mogu da se koriste za detekciju antitela kada su antitela koja treba da se detektuju apsorbovana od strane entiteta za vezivanje specifičnog antitela, na primer, antigena. U narednom primeru, ove Fc-vezujuće molekule mogu da se koriste kao sekundarni izvor za detektabilne signale, na primer, u kombinaciji sa drugim obeleženim ili detektabilnim antitelom koje vezuje entitet kao što je antigen.
[0009] Ovo otkriće može da se primeni na različita ispitivanja tipa apsorpcije, slične postupke, kompozicije i kitove, kako je ovde opisano.
[0010] Zbog toga neka otelotvorenja uključuju postupke za detekciju antitela u test uzorku koji sadrže: (a) dovođenje u kontakt test uzorka sa prvim detektorom da se formira prvi kompleks koji se sastoji od prvog detektora i antitela, pri čemu prvi detektor uključuje Fcvezujuću molekulu konjugovanu sa prvim detektabilnim entitetom; (b) dovođenje u kontakt prvog kompleksa sa entitetom vezivanja imobilizovanog na test regionu površine, pri čemu je entitet vezivanja sposoban da se specifično veže za antitelo; i (c) detekciju prisustva signala iz prvog detektabilnog entiteta u test regionu, pri čemu je prisustvo signala indikativno za prisustvo antitela u test uzorku. U nekim otelotvorenjima, prvi detektor je imobilisan za region konjugata površine, pri čemu se region konjugata ne preklapa sa test regionom površine. U specifičnim otelotvorenjima, Fc-vezujuća molekula je protein A, protein G ili oba. U nekim otelotvorenjima, prvi detektor uključuje protein A i protein G, svaki konjugovan sa detektabilnim entitetom. U ovim otelotvorenjima, odnos proteina A prema proteinu G može da bude podešen da optimizuje nivo pojačanja signala u zavisnosti od tipa imunoglobulina koji treba da se detektuje. Na primer, u nekim otelotvorenjima, protein A i protein G su prisutni u odnosu od pribilžno 10:1 do približno 1:10, još poželjnije 5:1 do približno 1:5.
[0011] U nekim otelotvorenjima, entitet vezivanja je antigenični peptid. U posebnim otelotvorenjima, taj antigen ili antigenični peptid potiče iz organizma izabranog iz grupe koja sadrži srčani crv, na primer, srčani crv psa, Ehrlichia canis, Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii, Borrelia garinii, Anaplasma phagocytophilum, virus leukemije mačaka, parvovirus, A soj influence, B soj influence, virus ptičje influence, sincitijalni respiratorni virus, Legionella, adenovirus, rotavirus, imunodeficijenti virus mačaka, humani imunodeficijentni virus i Grupa A Streptococcus.
[0012] U nekim otelotvorenjima, prvi detektabilni entitet su nanočestice metala, nanoljuspice metala, fluorofore ili čestice obojenog lateksa. U nekim otelotvorenjima, nanočestica metala ili nanoljuspica metala je izabrana iz grupe koja se sastoji od čestica zlata, čestica srebra, čestica bakra, čestica platine, čestica kadmijuma, kompozitne čestice, šuplje sfere zlata, nanoljuspice silicijuma obložene zlatom i ljuspice zlata obložene silicijumom.
[0013] Neki ovde dati postupci dalje uključuju dovođenje u kontakt test uzorka sa drugim detektorom, pri čemu drugi detektor sadrži antigen ili antigenični peptid konjugovan sa drugim detektabilnim entitetom, gde je taj antigen ili antigenični peptid sposoban da se specifično veže za antitelo. U nekim otelotvorenjima, prvi i drugi detektor su imobilisani na regionu konjugata, pri čemu se region konjugata ne preklapa sa test regionom površine. U nekim otelotvorenjima, region konjugata dalje uključuje detektor kontrole. Nivo pojačanja signala može da se izabere podešavanjem odnosa prvog detektora i drugog detektora. U nekim otelotvorenjima, odnos prvog detektora i drugog detektora je približno 20:1 do približno 1:20, mnogo poželjnije približno 20:1 do približno 1:1.
[0014] U specifičnim otelotvorenjima, prvi i drugi detektabilni entiteti su isti. U još specifičnijim otelotvorenjima, prvi i drugi detektabilni entiteti su oba nanočestice zlata. U drugim otelotvorenjima, prvi i drugi detektabilni entiteti su različiti.
[0015] U nekim otelotvorenjima, površina je put protoka u sredstvu za ispitivanje lateralnog protoka, površina mikrotitarne ploče ili put protoka u analitičkom rotoru.
[0016] Kako je prethodno navedeno, neka otelotvorenja koriste drugi detektor koji je konjugovan sa detektabilnim entitetom, pri čemu je drugi detektor antigen ili antigenični peptid. U nekima od ovih i sličnih otelotvorenja, antigen ili antigenični peptid potiče iz organizma izabranog iz grupe koja sadrži srčani crv, na primer srčani crv pasa, Ehrlichia canis, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia ewingii, Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii, Borrelia garinii, Anaplasma phagocytophilum, Anaplasma platys, virus leukemije mačaka, parvovirus, na primer, parvovirus pasa, A soj influence, B soj influence, virus ptičje influence, sincitijalni respiratorni virus, Legionella, adenovirus, rotavirus, imunodeficijenti virus mačaka, humani imunodeficijentni virus i Grupa A Streptococcus.
[0017] U nekim otelotvorenjima, površina je put protoka u sredstvu za ispitivanje lateralnog protoka, površina mikrotitarne ploče ili put protoka u analitičkom rotoru. U posebnim otelotvorenjima, test uzorak je krv, serum ili plazma.
[0018] Takođe su uključeni oblici za detekciju antitela koji sadrže region punjenja uzorka; region konjugata, pri čemu taj region konjugata obuhvata mobilizujući prvi detektor koji uključuje Fc-vezujuću molekulu konjugovanu sa prvim detektabilnim entitetom; i test region pri čemu taj test region uključuje imobilizovani entitet vezivanja sposoban da se specifično veže za antitelo; pri čemu su region punjenja uzorka, region konjugata i test region raspoređeni tako da je tečni uzorak, kada se unese u region punjenja uzorka, u tečnoj komunikaciji sa regionom konjugata i test regionom. U nekim otelotvorenjima, Fc-vezujuća molekula je protein A i/ili protein G.
[0019] U nekim otelotvorenjima, entitet aprorpcije je antigen ili antigenični peptid. U posebnim otelotvorenjima, antigen ili antigenični peptid je iz organizma izabranog iz grupe koja sadrži srčani crv, na primer srčani crv pasa, Ehrlichia canis, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia ewingii, Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii, Borrelia garinii, Anaplasma phagocytophilum, Anaplasma platys, virus leukemije mačaka, parvovirus, na primer, parvovirus pasa, A soj influence, B soj influence, virus ptičje influence, sincitijalni respiratorni virus, Legionella, adenovirus, rotavirus, imunodeficijenti virus mačaka, humani imunodeficijentni virus i Grupa A Streptococcus.
[0020] U posebnim otelotvorenjima, prvi detektabilni entitet su nanočestice metala, nanoljuspice metala, fluorofore ili čestice obojenog lateksa. U specifičnim otelotvorenjima, nanočestica metala ili nanoljuspica metala je izabrana iz grupe koja se sastoji od čestica zlata, čestica srebra, čestica bakra, čestica platine, čestica kadmijuma, kompozitne čestice, šuplje sfere zlata, nanoljuspice silicijuma obložene zlatom i ljuspice zlata obložene silicijumom.
[0021] U nekim otelotvorenjima, sredstvo dalje uključuje kontrolni region u tečnoj komunikaciji sa tečnim uzorkom kada se ovaj unese u region punjenja uzorkom. U nekim otelotvorenjima, kontrolni region uključuje imobilizovani vezujući partner sposoban da specifično vezuje detektor kontrole.
[0022] U posebnim otelotvorenjima, prvi detektor uključuje protein A ili protein G konjugovan sa prvim detektabilnim entitetom a navedeni imobilizovani vezujući partner je anti-protein A ili anti-protein G antitelo.
[0023] Neka sredstva dalje uključuju ploču apsorbenta pozicioniranu niže od test regiona. U nekim sredstvima, region konjugata je pozicioniran ispred regiona unosa uzorka. U nekim otelotvorenjima, region konjugata je pozicioniran niže od regiona unosa uzorka. U nekim otelotvorenjima, region unosa uzorka uključuje separator krvnog materijala. U nekim slučajevima, region konjugata dalje uključuje mobilišući drugi detektor, pri čemu drugi detektor uključuje antigen ili antigenični peptid konjugovan sa drugim detektabilnim entitetom, a navedeni antigen ili antigenični peptid je sposoban da se specifično vezuje za antitelo. Odnos prvog detektora (na primer Fc-vezujuće molekule, kao što su protein A i/ili protein G, konjugovana sa prvim detektabilnim entitetom) i drugog detektora
(antigen/antigenični peptid konjugovan sa drugim detektabilnim entitetom) može da se podesi tako da se izabere traženi nivo aplifikacije signala. U nekim otelotvorenjima, odnos prvog detektora i drugog detektora je približno 20:1 do približno 1:20. U drugim otelotvorenjima, odnos prvog detektora i drugog detektora je približno 20:1 do približno 1:1.
[0024] U posebnim otelotvorenjima, prvi i drugi detektabilni entiteti su isti. U specifičnim otelotvorenjima, prvi i drugi detektabilni entiteti su nano čestice zlata. U drugim otelotvorenjima, prvi i drugi detektabilni entiteti su različiti.
[0025] U posebnim otelotvorenjima, na primer, detekcija anti-mikrobnih antitela, antigena ili antigeničnog peptida je iz organizma izabranih iz grupe koja sadrži srčani crv, na primer srčani crv pasa, Ehrlichia canis, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia ewingii, Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii, Borrelia garinii, Anaplasma phagocytophilum, Anaplasma platys, virus leukemije mačaka, parvovirus, na primer, parvovirus pasa, A soj influence, B soj influence, virus ptičje influence, sincitijalni respiratorni virus, Legionella, adenovirus, rotavirus, imunodeficijenti virus mačaka, humani imunodeficijentni virus i Grupa A Streptococcus.
[0026] Takođe su uključeni kitovi koji sadrže jedan ili više sredstava za detekciju i sistema koji su ovde opisani i uputstva za korišćenje sredstava ili sistema za detekciju antitela u test uzorku. Neki kitovi takođe sadrže drugi detektor i uputstva za kombinaciju drugog detektora sa test uzorkom pre aplikacije na region unosa uzorka sistema za detekciju, pri čemu taj drugi detektor sadrži antigen ili antigenični peptid konjugovan sa drugim detektabilnim entitetom a taj antigen ili antigenični peptid je sposoban da se specifično vezuje za antitelo. U nekim otelotvorenjima, uputstva obezbeđuju kombinaciju drugog detektora sa test uzorkom tako da je drugi detektor prisutan u određenom odnosu sa prvim detektorom da se postigne željeni nivo aplifikacije signala.
[0027] Takođe su uključeni postupci za detekciju antitela u test uzorku koji obuhvataju nanošenje test uzorka na region za unos uzorka jednog ili više sredstava ili sistema za detekciju koji su ovde opisani i detekciju prisustva ili odsustva signala iz prvog detektabilnog entiteta u test regionu. Neki postupci dalje uključuju kombinaciju drugog detektora sa test uzorkom pre aplikacije u region za unos uzorka sistema za detekciju, pri čemu taj drugi detektor sadrži antigen ili antigenični peptid konjugovan sa drugim detektabilnim entitetom a navedeni antigen ili antigenični peptid je sposoban da se specifično vezuje za antitelo.
[0028] Neka otelotvorenja se odnose na jedan ili više kompleksa apsorpcije koji uključuju entitet vezivanja, antitelo u test uzorku i prvi detektor, pri čemu se entitet vezivanja vezuje za antitelo i pri čemu prvi detektor sadrži Fc-vezujuću molekulu konjugovanu sa prvim detektabilnim entitetom i koja se vezuje za Fc region antitela. Neki od ovih i sličnih otelotvorenja dalje uključuju drugi detektor, pri čemu se drugi detektor specifično vezuje za promenljivi region antitela. U nekim otelotvorenjima, kompleks aprospricije je imobilisan na test regionu površine.
[0029] Pronalazak je definisan patentnim zahtevima.
KRATAK OPIS SLIKA
[0030]
Slika 1 ilustruje jedan primer kompleksa apsorpcije iz pronalaska, sa antitelom od interesa apsorbovanim od strane entiteta za apsorpciju (na primer, antitelo-specifični antigen konjugovan sa BSA) imobilisan na test površini (na primer, nitroceluloza), detektabilni Fcvezujuća molekula-konjugat (na primer, Protein A- ili Protein G-koloidno zlato konjugat) vezan za Fc region ciljanog antitela, i opciono drugi detektabilni konjugat (na primer, antigenkoloidno zlato konjugat) vezan za promenljivi region antitela od interesa.
Slika 2 ilustruje jedan primer sredstva za imuni test lateralnog protoka i postupak u skladu sa ovim pronalaskom. Antigenični peptidi specifični za antitelo od interesa su vezani za nosač proteina albumina seruma govečeta (BSA) a dobijeni BSA-peptid konjugati se koriste kao podloga za apsorpciju na nitrocelulozi. Ovaj isti antigenični peptid je dalje konjugovan sa koloidnim zlatom, koje služi kao marker u ovom ispitivanju datom kao primer. Dobijeni signal se nakon toga dalje amplificira dodavanjem Protein A/G-zlato konjugata u smešu konjugata.
Slika 3 ilustruje protok uzorka u odnosu na vreme u testu lateralnog protoka specifičnog za Lajmsku bolest, koristeći sredstvo za imuni test lateralnog protoka pokazano na Slici 2. U ovom ispitivanju datom kao primer, jedna kap krvi, seruma ili plazme (približno 15-20 µL preko prenosne pipete) se izmeša sa četiri kapi rastvora konjugata koloidnog zlata (približno 30 µL iz boce za ukapavanje) u reaktivnoj kiveti. Jedna kap iz dobijene reaktivne smeše se prenese na deo za uzorak test kasete smeštene na ravnu površinu. Kroz ploču za separaciju krvi se iz ukupne krvi filtriraju ćelije krvi (videti Sliku 2). Plazma (ili serum) i kompleksi B. burgdorferi antitelo-konjugat migriraju do nitrocelulozne membrane koja sadrži test i kontrolne regione. Nanošenjem tri (3) kapi (aproksimativno 60 µL iz boce za ukapavanaje) pufera za pokretanje (jedan minut nakon nanošenja uzorka) pomera se ukupna smeša kroz nitrocelulozu prema gornjoj ploči za apsorpciju koja nastavlja da izvlači tečnost. Antitela specifična za B. burgdorferi prisutna u pozitivnom uzorku su već u obliku kompleksa sa konjugatom zlato-označeni antigen. Kompleks označeni antigen-antitelo se pomera na test liniju gde imobilisani antigen hvata komplekse obeleženi antigen-antitelo preko drugog vezujućeg položaja na antitelu. Protein A/G-zlato konjugat prisutan u smeši konkjugata se vezuje za Fc region ciljanog antitela i amplifikuje test signal. Slobodni obeleženi antigen i ostatak reaktivne smeše prolazi kroz kontrolnu liniju gde je Protein A-zlato konjugat apsorbovan od strane kontrolnog apsorbensa koji sadrži pileće anti-protein A antitelo. U ovom slučaju, uređaj se očitava za približno 8 minuta. Pojava crvene linije u test zoni i druge crvene linije u kontrolnoj zoni pokazuje prisustvo antitela za B. burgdorferi. Prisustvo linije samo u kontrolnoj zoni pokazuje odsustvo antitela za B. burgdorferi. Test se smatra ne validnim ukoliko se (a) pojavi test linija ali se ne pojavi kontrolna linija ili (b) nema ni kontrolne ni test linije.
DETALJAN OPIS
[0031] Kako se ovde koristi, naredni termini će imati sledeća značenja:
Neodređeni članovi se ovde koriste da označe jedan ili više od jedan (to jest, najmanje jedan) gramatički objekat člana. Kao primer, "element" označava element ili više od jednog elementa.
[0032] "Približno" označava količinu, nivo, vrednost, broj, frekvenciju, procenat, dimenziju, veličinu, količinu, težinu ili dužinu koja varira 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1% u odnosu na referentnu količinu, nivo, vrednost, broj, frekvenciju, procenat, dimenziju, veličinu, količinu, težinu ili dužinu.
[0033] Kroz celu ovu specifikaciju, izuzev ukoliko kontekst ne zahteva drugačije, podrazumeva se da izrazi "uključuju," "uključeno," i "uključujući" sadrže i navedenu fazu ili element ili grupu faza ili elemenata ali ne isključuju bilo koju drugu fazu ili element ili grupu faza ili elemenata.
[0034] Pod "sadrži" se podrazumeva obuhvatanje i ograničeno na, nezavisno od toga šta je iza izraza "sadrži." Prema tome, izraz "sadrži" označava da su navedeni elementi zahtevani ili obavezni i da ne mogu da budu prisutni drugi elementi. Pod "u osnovi sadrži" se podrazumeva uključivanje bilo kojih elemenata navedenih nakon izraza i ograničenje na druge elemente koji nisu u vezi sa ili koji ne doprinose aktivnosti ili delovanju navedenom u otkriću za navedene elemente. Prema tome, izraz "u osnovi sadrži" pokazuje da su navedeni elementi zahtevani ili obavezni, a da su drugi elementi opcioni i mogu ili ne mogu da budu prisutni u zavisnosti da li ili ne materijalno ometaju aktivnosti ili delovanje navedenih elemenata.
[0035] Nazivi "peptid" i "polipeptid" i "protein" se ovde koriste kao međusobno zamenljivi i odnose se na polimer ostataka amino kiseline i na varijante i sintetički i prirodno dobijene analoge istih. Prema tome, ovi nazivi se koriste za polimere amino kiselina u kojima su jedan ili više ostataka amino kiseline sintetičke ne-prirodno dobijene amino kiseline, kao što je hemijski analog odgovarajuće prirodno dobijene amino kiseline, kao i na polimere prirodno dobijenih amino kiselina i njihovih prirodno dobijenih hemijskih derivata.
[0036] "Povećana" ili "pojačana" količina je opciono "statistički značajna" količina i može da obuhvati povećanje koje je približno 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 ili više puta (uključujući sve cele brojeve, opsege i decimalne tačke između i iza 1, na primer, 2.5, 3.6, 3.7.3.8, itd.) količine ili vrednosti (na primer, signal ili vrednost kao što je rezultat reaktivnosti) u odnosu, na primer, na test antitela izveden bez detektabilne Fc-vezujuće molekule. "Povećana" ili "pojačana" vrednost ili količina može takođe da uključi 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18% , 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ili veće povećanje u količini ili vrednosti u odnosu na, na primer, test antitela izveden bez detektabilne Fc-vezujuće molekule.
Postupci
[0037] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obuhvata postupke za detekciju antitela u test uzorku. U nekim otelotvorenjima, ovi postupci se u odgovarajućem delu odnose na dovođenje u kontakt test uzorka sa Fc-vezujućom molekulom konjugovanom sa prvim detektabilnim entitetom (to jest, detektabilni konjugat Fc-vezujuće mnolekule) da se formira prvi kompleks, dovođenjem u kontakt prvog komplesa sa entitetom vezivanja imobilizovanim na test regionu površine, pri čemu je entitet vezivanja sposoban za specifično vezivanje za antitelo, i detekciju prisustva signala iz detektabilnog konjugata Fc-vezujuće molekule u test regionu. Po ovome, prisustvo signala je indikativno za prisustvo antitela u test uzorku.
[0038] Reakatanti iz ovih postupaka mogu da se dovedu u kontakt bilo kojim redosledom ili sekvencom. Na primer, test uzorak može da se izmeša sa detektabilnim konjugatom Fcvezujuće molekule pre nanošenja na površinu, ili ova dva reaktanta mogu odvojeno da se nanesu na površinu, po redu ili u isto vreme na istom ili različitim mestima površine. Kada se dodaju odvijeno, reaktanti dolaze u međusobni kontakt kako se šire ili protiču kroz test površinu, na primer, kapilarnim ili nekim drugim delovanjem. U posebnim otelotvorenjima, detektabilni konjugat Fc-vezujuće molekule je prethodno imobilizovan za region konjugata površine, koji se ne preklapa sa test regionom površine. U nekim od ovih otelotvorenja, test uzorak može da se nanese na površinu, gde kapilarnim ili drugim delovanjem teče kroz region konjugata i test region i na taj način dolazi u kontak sa Fc-vezujućom molekulom i entitetom vezivanja. Ukoliko je u uzorku prisutno antitelo od interesa, tada ono formira detektabilni kompleks sa detektabilnom Fc-vezujućom molekulom i entitetom vezivanja. U specifičnim otelotvorenjima, Fc-vezujuća molekula je protein A, protein G, protein A/G, protein L ili bilo koja njihova kombinacija, na primer, kao smeša ili njihova fuzija proteina.
[0039] Neki ovde dati postupci dalje uključuju dovođenje u kontakt test uzorka sa molekulom drugog detektora. U ovim otelotvorenjima, drugi detektor može da bude bilo koji pogodan entitet koji vezuje antitelo, na primer, antigen ili antigenični peptid konjugovan sa drugim detektabilnim entitetom i sposoban da se specifično vezuje za antitelo. Kombinacija, na
1
primer, konjugat drugog detektora i drugog detektabilnog entiteta je ponekad označena kao "konjugat detektabilno antitelo-specifični antigen" ili "detekbatilni antigen-konjugat," koja uključuje peptidne antigene i ne-peptidne antigene. U nekim otelotvorenjima, prvi i drugi detektabilni entiteti su isti, to jest, konjugat Fc-vezujuće molekule i detektabilni-antigenkonjugat su konjugovani sa istim tipom detektabilnog entiteta, kao što su čestice zlata. U drugim otelotvorenjima, prvi i drugi detektabilni entiteti su različiti. U specifičnim otelotvorenjima, prvi i drugi detektabilni entiteti su oba nano čestice zlata i stvaraju koloidne konjugate zlata (CGC). U ovim i sličnim otelotvorenjima, detektabilna Fc-vezujuća molekula može da bude označena kao "Fc-vezujuća molekula-CGC"; u specifične primere spadaju Protein A-CGCi, Protein G-CGCi, protein A/G-CGCi i Protein L-CGCs. U nekim otelotvorenjima, Fc-vezujuća molekula je sekundarno antitelo ili njegov fragment sposoban da se vezuje za Fc region antitela u test uzorku dok drugi detektor može da bude bilo koji pogodan entitet koji vezuje antitelo, na primer, antigen ili antigenični peptid, itd.
[0040] Slično prethodnom, reaktanti u ovim postupcima mogu da se dovedu u kontakt bilo kojim redosledom ili sekvencom. Kao primer, test uzorak može da se izmeša sa detektabilnim konjugatom Fc-vezujuće molekule, detektabilnim antigen-konjugatom, ili oba, pre nanošenja na površinu, ili ova tri reaktanta mogu odvojeno da se nanesu na površinu, po redu ili u isto vreme, na isto ili različita mesta na površini. Kada se dodaju odvojeno, reaktanti će doći u međusobni kontakt tako što se šire ili protiču kroz test površinu, na primer, kapilarnim ili nekim drugim delovanjem.
[0041] U nekim otelotvorenjima, konjugat Fc-vezujuće molekule je imobilisan sa regionom konjugata površine koji se ne preklapa sa test regionom a test uzorak i detektabilni antigen konjugat se na površinu nanose odvojeno ili zajedno. U drugim otelotvorenjima, detektabilni antigen-konjugat je imobilisan za region konjugata površine koji se ne preklapa sa test regionom, a test uzorak i detektabilni konjugat Fc-vezujuće molekule se na površinu nanose odvojeno ili zajedno. U nekim otelotvorenjima, detektabilni konjugat Fc-vezujuće molekule i detektabilni antigen-konjugat su oba imobilisana za region konjugata površine, koji se ne preklapa sa test regionom površine, a test uzorak se nanosi na test površinu. Nakon nanošenja na površinu, test uzorak (sam ili u kombinaciji sa drugim reaktantima) može da teče ili da se širi preko površine kapilarnim ili nekim drugim delovanjem, kroz region konjugata (ukoliko je prisutan) i kroz test region, i na taj način dolazi u kontakt sa detektabilnim konjugatom Fcvezujuće molekule, detektabilnim antigen-konjugatom i entitetom vezivanja. Ukoliko je u uzorku prisutno antitelo od interesa, ono će da formira jedan ili više detektabilnih kompleksa sa ovim reaktantima i na taj način da ukaže na prisustvo antitela u uzorku. Stručnjak sa iskustvom u tehnici će da razume da ove kombinacije date kao primeri nisu ograničavajuće i da su moguće druge alternative.
[0042] U nekim otelotvorenjima, region konjugata dalje uključuje detektor kontrole, na primer, antitelo koje se specifično vezuje za Fc-vezujuću molekulu. Drugi tipovi regiona kontrole će biti očigledni stručnjaku sa iskustvom u tehnici.
[0043] Test uzorak je obično biološki uzorak dobijen od subjekta koji ima ili se sumnja da ima antitelo od interesa, kao što je antitelo specifično za infektivni agens. Preferirano, biološki uzorak se lako dobija i obuhvata krv, serum ili plazmu dobijene iz uzorka venske krvi ili čak ubodom u prst. Poznato je da tkiva drugih delova tela ili drugih telesnih tečnosti, kao što su moždano-kičmena tečnost (CSF), pljuvačka, želudačni sekreti, mukoza, urin, feces, itd., sadrže antitela i mogu da se koriste kao izvor test uzorka. U drugim otelotvorenjima, uzorak je tkivo (na primer, homogenat tkiva), ekstrakt iz organa u organizmu, ili lizat ćelija. U nekim otelotvorenjima, subjekt je divlja životinja (na primer, jelen ili glodar, kao što su miševi, mrmoti, veverice, itd.). U drugim otelotvorenjima, subjekt je laboratorijska životinja (na primer, miševi, pacovi, zamorci, zečevi, majmuni, primati, itd.). U drugim otelotvorenjima, subjekt je domaća ili divlja životinja (na primer, pas, mačka, konj). U nekim drugim otelotvorenjima, subjekt je čovek.
[0044] Antitelo, takođe označeno kao imunoglobulin, je protein imunog sistema Y-oblika koje specifično identifikuje strane predmete ili antigene kao što su komponente bakterija, kvasaca, parazita i virusa. Svaki tip "Y" antitela sadrži mesto vezivanja antigena koje je specifično za određeni epitop antigena što omogućava da se ove dve strukture precizno vežu. Produkcija datog antitela se povećava nakon izlaganja antigenu (na primer, mikrobiološkom antigenu) koji stupa u specifičnu interakciju sa tim antitelom. Prema tome, detekcija antigenspecifičnih antitela u uzorku iz subjekta može da pruži informaciju da li je subjekt u skorije vreme izložen, ili je ranije bio izložen određenom mikrobu, kao što su virus, bakterija, gljivice ili paraziti.
[0045] Fragment kristalizabilnog regiona (Fc region) je repić regiona antitela koji stupa u interakciju sa ćelijskom površinom Fc receptora i nekim proteinima komplementnog sistema. U izotipovima IgG, IgA i IgD antitela, Fc region je sastavljen od dva identična fragmenta proteina, dobijenih od drugog i trećeg konstantnog domena dva teška lanca antitela. Fc regioni IgM i IgE sadrže konstantne domene tri teška lanca (CHdomeni 2-4) u svakom polipeptidnom lancu. Fc regioni IgG antitela imaju mesto visoko konzervisane Nglikozilacije. N-glikani vezani za ovo mesto predominantno imaju strukture od dve antene sa fukosilisanim jezgrom tipa komplesa. Pored toga, male količine ovih N-glikana takođe imaju ukrštajuće GlcNAc i α-2,6 vezane ostatke sijalinske kiseline. Fab region antitela sadrži promenljive delove koji definišu ciljanu-specifičnost antitela, a nasuprot tome, Fc region svih antitela u klasi su isti za svaku vrstu; oni su konstantni više nego što su promenljivi.
[0046] "Mesto vezivanja antigena," ili "deo vezivanja" antitela se odnosi na deo molekule imunoglobulina koji učesvuje u vezivanju antigena. Mesto vezivanja antigena se formira od ostataka amino kiseline promenljivih ("V") regiona teških ("H") i lakih ("L") terminala. Tri velika odstupanja se protežu kroz V regione teških i lakih lanaca i označeni su kao "hiperpromenljivi regioni" i nalaze se između mnogo zatvorenijih bočnih protezanja poznatih kao "konstantni regioni" ili "FRs". Prema tome, naziv "FR" se odnosi na sekvence amino kiselina koje se prirodno nalaze između i pored hiperpromenljivih regiona u imunoglobulinima. U molekuli antitela, tri hiperpromenljiva regiona lakog lanca i tri hiperpromenljiva regiona teškog lanca su slobodni u odnosu jedan na drugi u trodimenzionalnom prostoru da formiraju površinu za vezivanje antigena. Površina za vezivanje antigena je komplementarna sa trodimenzionalnom površinom vezanog antigena a tri hiperpromenljiva regiona svakog od teških i lakih lanaca su označeni kao "komplementarno-određujući regioni" ili "CDRi."
[0047] Antitelo obično uključuje sve ili deo Fc regiona, da se omogući detekcija pomoću Fc vezujuće molekule, i takođe može da uključi jedno ili više antigen-vezujućih mesta da se omogući detekcija sredstvom specifičnog vezivanja antitela, kao što su antigen ili antigenični peptid. Antitela mogu da budu, na primer, IgG, IgE, IgD, IgM ili IgA tipa. Generalno, detektovana su IgM i/ili IgA antitela, na primer, za detekciju ranog stanja infekcije.
[0048] Fc-vezujća molekula sadrži bilo koje vezujuće sredstvo koje se specifično vezuje za Fc region antitela ili bilo koji region koji je izvan promenljivog regiona antitela. U nekim otelotvorenjima, Fc-vezujuća molekula nije antitelo ili njegov fragment koji vezuje antitelo. U drugim otelotvorenjima, Fc-vezujuća molekula je Fc-spepcfično sekundarno antitelo, na primer, zečije anti-pasje antitelo, kozje anti-pasje antitelo. U nekim otelotvorenjima, Fcvezujuća molekula je sekundarno antitelo u odnosu na antitelo koje je detektovano u test uzorku. Opšti primeri Fc-vezujućih molekula obuhvataju polipeptide, rastvorljive receptore, adnektine, male peptide, mimetike peptida, male molekule, aptamere, itd., koji se specifično vezuju za Fc region imunoglobulina. Posebni primeri Fc-vezujućih molekula obuhvataju
1
Protein A, Protein G, Protein A/G spojene proteine, Protein L i njihove fragmente i varijacije koji zadržavaju sposobnost da se specifično vezuju za Fc region antitela.
[0049] Protein A je 40-60 kDa MSCRAMM (komponente mikrobiološke površine koje prepoznaju adhezivni matriks molekule) protein površine nađen u ćelijskom zidu Staphylococcus aureus, i enkodiran je spa genom. Izvorni tip Proteina A je sastavljen od pet homologa Ig-vezujućih domena koji su savijeni u klupko sa tri zavojnice, i koje se pojedinačno vezuju za Fc regione antitela. Protein A se sa visokim afinitetom vezuje za humani IgG1 i IgG2 a sa umerenim afinitetom za humani IgM, IgA i IgE.
[0050] Protein G je imunoglobulin-vezujući protein ispoljen u streptokoknoj bakteriji grupe C i G (videti, na primer, Sjobring i saradnici, J Biol Chem. 266: 399-405, 1991). NMR struktura rastvora (videti Lian i saradnici, Journal of Mol. Biol.228:1219-1234, 1992) i strukture kristala (videti Derrick and Wigley, Journal of Mol. Biol.243:906-918, 1994) Proteina G su razdvojene do 1 Angstrem. Protein A i Protein G su dobro poznati u tehnici i komeercijalno raspoloživi u različitim konjugovanim i ne-konjugovanim oblicima.
[0051] Takođe su obuhvaćene funkcionalne varijante i fragmenti Proteina A i Proteina G u verzijama ukupne dužine ili izvornog tipa. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida uključuje sekvencu amino kiseline koja ima najmanje približno 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili više identičnost ili sličnost sekvence sa sekvencom izvornog tipa Proteina A i/ili Proteina G. Funkcionalni fragment može da bude fragment polipeptida koji je, na primer, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500 ili više blizak ili udaljen od ostataka izvornog tipa Proteina A i/ili Proteina G. Varijante i fragmenti Proteina A i Proteina G obično zadržavaju specifičnost vezivanja za Fc region jednog ili više izotipova imunoglobulina.
[0052] Procenat identičnosti sekvence ima prepoznatljivo značenje u tehnici i postoje brojni postupci za merenje identičnosti između dva polipeptida ili polinukleotida sekvenci. Videti, na primer, Lesk, Ed., Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York,
(1988); Smith, Ed., Biocomputing: Informatics And Genome Projects , Academic Press, New York, (1993); Griffin & Griffin, Eds., Computer Analysis Of Sequence Data, Part I, Humana Press, New Jersey, (1994); von Heinje, Sequence Analysis In Molecular Biology, Academic Press, (1987); and Gribskov & Devereux, Eds., Sequence Analysis Primer, M Stockton Press, New York, (1991). Postupci za usklađivanje polinukleotida ili polipeptida su kodirani u kompjuterskim programima, uključujući paket GCG programa (Devereux i saradnici, Nuc. Acids Res. 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul i saradnici, J Molec. Biol.
215:403 (1990)) i Bestfit program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 za Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madizon, Wis. 53711) koji koriste algoritam lokalne homologije Smith and Waterman (Adv. App. Math., 2:482-489 (1981)). Na primer, može da se koristi kompjuterski program ALIGN koji koristi FASTA algoritam, sa pretraživanjem afino prostora sa otvorima od -12 i od -2.
[0053] Takođe se razmatraju fuzije proteina koje uključuju Fc-vezujuće polipeptide, uključujući fuzije Proteina A i fuzije Proteina G. Fc vezujuće molekule mogu da budu spojene sa celom ili sa delom druge Fc-vezujuće molekule ili sa jednim ili više heterolognih polipeptida. Specifični primer spajanja Proteina A/G kombinuje četiri Fc-vezujuća domena iz Proteina A sa dva iz Proteina G (videti, na primer, Sikkema, J.W.D., Amer. Biotech. Lab, 7:42, 1989; i Eliasson i saradnici, J. Biol. Chem.263, 4323-4327, 1988); međutim, mogu da se koriste i druge kombinacije. Partneri za spajanje (na primer, peptid ili druga molekula) mogu da se koriste da se poboljša prečišćavanje, da se poboljša rastvorljivost, poveća ekspresija polipeptida u ćeliji domaćina, da pomogne u detekciji i stabilizaciji polipeptida, itd. Primeri partnera spajanja obuhvataju proteine nosača (na primer, albumin seruma kao što je albumin seruma govečeta), beta-galaktozidazu, glutation-S-transferazu, repić(e) histidina, itd.
[0054] Entitet vezivanja može da bude bilo koje vezujuće sredstvo koje se specifično vezuje za antitelo od interesa, to jest, ciljano antitelo, kao što je antitelo specifičnog mikroba, da se detektuje postupcima i načinima koji su ovde opisani. Uobičajeno, entitet vezivanja se specifično vezuje za promenljivi region antitela, i na taj način sadrži jedan ili više epitopa koji su specifični za antigen-vezujuće mesto(a) antitela. U nekim otelotvorenjima, entitet vezivanja nije antitelo ili njegov antigen vezujući fragment. U posebnim otelotvorenjima, entitet vezivanja je antigen ili antigenični peptid koji se specifično vezuje za antitelo od interesa. Primeri antigena i antigeničnih peptida su niže opisani. Takođe su obuhvaćeni rastvorljivi receptori, adnektini, mimetici peptida, male molekule, aptameri, itd., koji se specifično vezuju za antitelo od interesa, to jest, za antitelo koje može da se detektuje u skladu sa ovde datim postupcima.
[0055] Kako je prethodno navedeno, entitet vezivanja je obično povezan sa ili imobilisan na test površini ili substratu, kao što je čvrsta ili polu-čvrsta podloga. Veza može da bude kovalentna ili ne-kovalentna, i može da se postigne molekulom povezanom sa entitetom vezivanja koja omogućava kovalentno ili ne-kovalentno vezivanje, kao što je molekula koja
1
ima visok afinitet za komponentu vezanu za nosač, podlogu ili površinu. Na primer, entitet vezivanja može da bude povezan sa ligandom, kao što je biotin, a komponenta povezana sa površinom može da bude odgovarajući receptor liganda, kao što je avidin. Alternativno, entitet vezivanja može da bude povezan sa receptorom liganda, kao što je avidin, a komponenta povezana sa površinom može da bude odgovarajući ligand, kao što je biotin. Entitet vezivanja može da bude vezan za ili imobilisan na test površini ili substratu ili pre ili nakon dodavanja uzorka koji sadrži antitelo u toku imunoanalize.
[0056] U posebnim otelotvorenjima, test površina je perlica, dot blot, put protoka u imunom testu lateralnog protoka ili put protoka u analitičkom rotoru. Na primer, entitet vezivanja može da se veže ili imobilizuje na poroznoj membrani, kao što je PVDF membrana, (na primer, Immobilon™ membrana), nitrocelulozna membrana, polietilenska membrana, najlonska membrana ili sličan tip membrane. U drugim otelotvorenjima, test površina ili substrat je kiveta ili udubljenje, kao što je udubljenje u ploči (na primer, mikrotitarna ploča) pogodno za korišćenje u ELISA ili drugom testu sendvič tipa. U nekim otelotvorenjima, test površina ili substrat je senzor, kao što je elektrohemijski, optički ili opto-elektronski senzor.
[0057] Ovakve test površine ili substrati mogu da obuhvate staklo, materijale na bazi celuloze, termoplastične polimere, kao što su polietilen, polipropilen ili poliestar, sinterovane strukture sastavljene od partikulata materijala (na primer, staklo ili različiti termoplastični polimeri), izlivene film membrane sastavljene od nitroceluloze, najlona, polisulfona, ili slično. Test površina ili substrat može da bude sinterovana, finim česticama polietilena, uobičajeno poznatim kao porozni polietilen, na primer, porozni polietilen promera 0.2-15 mikrona proizvođača Chromex Corporation (Albuquerque, NM), Porex™, itd. Sve ove test površine ili substratni materijali mogu da se koriste u odgovarajućim oblicima, kao što su filmovi, listovi ili ploče, ili mogu da budu obloženi na ili vezani ili laminirani za odgovarajuće inertne nosače, kao što su papir, staklo, plastični filmovi ili vlakna.
[0058] Odgovarajući postupci za imobilizaciju entiteta apsorpcije kao što su peptidi na čvrstoj fazi uključuju jonske, hidrofobne, kovalentne interakcije i slično. Specifično ili poluspecifično vezivanje za čvrsti ili polu-čvrsti nosač, podlogu ili površinu, može da se izvede sa entitetom vezivanja koji ima, zajedno sa njim, molekulu koja omogućava njegovo kovalentno ili ne-kovalentno vezivanje za čvrsti ili polu-čvrsti nosač, podlogu ili površinu. Na primer, molekula može da ima afinitet za komponentu vezanu za nosač, podlogu ili površinu. U tom slučaju, molekula može da bude, na primer, biotin ili biotinil grupa ili njegov analog vezan za grupu amino kiseline peptida, kao što je 6-aminoheksanoatna kiselina, a komponente nakon
1
toga avidin, streptabidin, neutravidin ili njihov analog. Alternativa je situacija u kojoj molekula ima sekvencu amino kiseline od šest uzastopnih histidin ostataka (na primer 6x-His repić) a nosač uključuje derivat nitrilotriacetatne kiseline (NTA) naelektrisan sa Ni<++>ili Co<++>jonima. Pored toga, pogodni nosači, podloge ili površine uključuju, ali bez ograničenja na, perlice (na primer, magnetne perlice, koloidne čestice ili nanočestice, kao što je koloidno zlato, ili nanočestice koje sadrže silicijum, lateks, polistiren, polikarbonat ili PDVF), lateks kopolimera kao što su stiren-divinil benzen, hidroksilisani stiren-divinil benzen, polistiren, karboksilisani polistiren, perlice crnog ugljenika, neaktivirano ili polistirenom ili polivinil hloridom aktivirano staklo, epoksi-aktivirano porozno magnetno staklo, želatinske ili polisaharidne čestice ili druge proteinske čestice.
[0059] Kako je prethodno navedeno, antigeni i antigenični peptidi mogu da se koriste kao entiteti apsorpcije i/ili kao antitelo-specifični detektori. Izabrani antigen ili antigenični peptid je sposoban da se specifično veže za ciljano antitelo, najčešće preko jednog ili oba mesta vezivanja antigena za antitelo. Prema tome, naziv "antigen," kako se ovde koristi, se odnosi na molekulu sposobnu da se specifično veže za antitelo preko najmanje jednog mesta vezivanja antigena za antitelo. Antigen može da sadrži jedan ili više epitopa, posebno granični ili ne-granični region(e) antigena koji se specifično vezuje za antigen-vezujuće mesto antitela. Epitop može da bude linearni epitop, sekvencijalni epitop ili konformacioni epitop.
[0060] Antigen može da bude, na primer, peptid ili njegov modifikovani oblik, ili ne-peptidni antigen kao što je mala molekula. Kako je ovde navedeno, antigeni mogu takođe da uključe rastvorljive receptore, adnektine, mimetike pepida, male molekule, aptamere, itd., koji se specifično vezuju za antitelo od interesa.
[0061] Kada se koriste kao entiteti apsorpcije, ili "antigeni apsorpcije," antigeni ili antigenični peptidi su obično neobeleženi i imobilisani su ili na drugi način vezani za test površinu. Za neka otelotvorenja, antigeni apsorpcije mogu da budu spojeni ili konjugovani sa ili kompleksovani sa jednim ili više heterolognih proteina, kao što su albumin seruma govečeta ili višestruki antigen peptidi (MAPS), da se omogući vezivanje za test površinu ili drugi ciljevi.
[0062] Za upotrebu kao antitelo-specifičnih detektora, antigeni ili antigenični peptidi su obično konjugovani sa detektabilnim entitetom i na taj način formiraju "detektabilni antigenkonjugat." U nekim otelotvorenjima, ovi detekbatilni antigen-konjugati su takođe spojeni ili konjugovani sa ili kompleksovani sa jednim ili više heterolognih proteina kao što su albumin
1
seruma govečeta ili MAPS. Detektabilni antigen-konjugati mogu da budu izrađeni ili za direktnu ili za indirektnu detekciju, kako je niže opisano.
[0063] Takođe se razmatraju spojeni proteini koji obuhvataju antigenične peptide.
Antigenični peptidi mogu da budu spojeni sa celim ili sa delom jednog ili više antigeničnih peptida koji imaju istu ili različitu specifičnost vezivanja (na primer, koji imaju jedan ili više različitih epitopa), ili sa jednim ili više heterolognih polipeptida. Spajanje partnera (na primer, peptid ili druga molekula) može da se koristi za poboljšanje prečišćavanja, poboljšanje rastvorljivosti, poboljšanje ekspresije peptida u ćeliji domaćina, poboljšanje detekcije, stabilizaciju antigeničnog peptida, postizanje imobilizacije na test površini, itd. Primeri partnera za fuziju uključuju proteinske nosače (na primer, albumin seruma kao što je albumin seruma govečeta), beta-galaktozidazu, glutation-S-transferazu, histidin repić(e), itd.
[0064] Anatigeni i antigenični peptidi i drugi antitelo-specifično vezujuća sredstva mogu da se dobiju iz različitih izvora. Posebna otelotvorenja uključuju one koji su dobijeni iz mikrobnih izvora, uključujući viruse, bakterije, gljivice i parazite. Specifični primeri uključuju antigene koji potiču od bilo kog ili od više srčanih crva, na primer, srčani crv psa, Ehrlichia canis, Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii, Borrelia garinii, Anaplasma phagocytophilum, virus leukemije mačaka, parvovirus, na primer, parvovirus pasa, A soj influence, B soj influence, virus ptičje influence, sincitijalni respiratorni virus, humani imunodeficijentni virus (HIV), Legionella, adenovirus, Grupa A Streptococcus, imunodeficijentni virus mačaka (FIV), rotavirus, itd. Primeri Borrelia antigena za detekciju antitela Lajmske bolesti mogu da se nađu u US2013115634, U.S. Patent Publication No. US 2011/0136155 i WO 2011/063003. Primeri Ehrlichia antigena za detekciju Ehrlichia antitela mogu da se nađu u U.S. Patent Publication No.2011/0124125 i WO2011/063235.
[0065] Antigenični peptidi za upotrebu u skladu sa ovde opisanim postupcima mogu da se izrade hemijom sinteza, (to jest, "sintezom peptida"). U drugim otelotvorenjima, antigenični peptidi mogu da se dobiju biološki (to jest, ćelijskim mehanizmom, kao što je ribozom). U nekim otelotvorenjima, antigenični peptidi su izolovani. Kako se ovde koristi, "izolovani peptid" je peptid koji je dobijen ili sintetički ili biološki a nakon toga prečišćen, najmanje delimično, od hemikalija i/ili ćelijskog mehanizma korišćenih za izradu peptida. U nekim otelotvorenjima, izolovani peptid je skoro u potpunosti prečišćen. Kako se ovde koristi, naziv "skoro u potpunosti prečišćen" se odnosi na molekulu, kao što je peptid, koja je skoro potpuno oslobođena od ćelijskog metarijala (proteini, lipidi, ugljeni hidrati, nukleinske kiseline, itd.), medijuma za kulturu, hemijskih prekursora, hemikalija korišćenih u sintezi peptida, ili
1
njihovih kombinacija. Peptid koji je skoro u potpunosti prečišćen ima manje od približno 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2%, 1% ili manje ćelijskog materijala, medijuma za kulturu, drugih polipeptida, hemijskih prekursora i/ili hemikalija korišćenih u sintezi peptida. U skladu sa tim, skoro potpuno čista molekula, kao što je peptid, može da bude najmanje približno 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ili 99%, težine suve molekule od interesa. Izolovani peptid može da bude u vodi, puferu ili u suvom obliku do rekonstitucije, na primer, kao deo kita. Izolovani peptid može da bude u obliku farmaceutski prihvatljive soli. Pogodne kiseline i baze koje su sposobne da formiraju soli sa ovim peptidima su dobro poznate stručnjaku sa iskustvom u tehnici i obuhvataju neorganske i oraganske kiseline i baze.
[0066] Antitelo od interesa ili njegov antigen-vezujući fragment, je označeno kao da "specifično vezuje", "imunološki vezuje" i/ili "imunološki je reaktivno" sa entitetom vezivanja ili antitelo-specifičnim detektorom (na primer, antigenom ili antigeničnim peptidom) ukoliko reaguje na detektabilnom nivou (pri, na primer, imunohromatografiji, western blog ili ELISA testu) sa entitetom ili detektorom a pod sličnim uslovima ne reaguje detektabilno na statistički značajn način sa nepovezanim polipeptidima ili sredstvima. Naziv "specifično vezan" može takođe da znači da entitet vezivanja ili antitelo-specifični detektor ima veći afinitet (na primer, veći stepen selektivnosti) za antitelo od interesa nego za druga antitela u uzorku.
[0067] Imunološko vezivanje, kako se koristi u ovom kontekstu, se generalno odnosi na tip ne-kovalentnih interakcija koje se dešavaju između molekule imunoglobulina i antigena za koji je imunoglobulin specifičan. Jačina ili afinitet ovakvog vezivanja kao interakcije imunološkog vezivanja može da se izrazi preko konstante disocijacije (Kd) interakcije, pri čemu manja Kdpredstavlja veći afinitet. Osobine imunološkog vezivanja izabranih polipeptida mogu da se kvantifikuju postupcima koji su dobro poznati u tehnici (videti, na primer, Davies i saradnici, Annual Rev. Biochem.59:439-473, 1990). U nekim ilustrativnim primerima, antitelo ima afinitet za entitet vezivanja ili antitelo-specifični detektor (na primer, antigen ili antigenični peptid) od najmanje približno 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40 ili 50 nM. Kao drugi primer, entitet vezivanja ili antitelo-specifični detektor ima afinitet za antitelo od najmanje približno 1.5-puta, 2-puta, 2.5-puta, 3-puta ili veći nego za druga antitela u uzorku.
[0068] Na sličan način, kaže se da se Fc-vezujuća molekula "specifično vezuje" za Fc region imunoglobulina ukoliko reaguje na detektabilnom nivou sa Fc regionom a pod sličnim
1
uslovima ne reaguje detektabilno na statistički značajan način sa nepovezanim polipeptidima i sredstvima. U nekim ilustrativnim otelotvorenjima, Fc-vezujuća molekula ima afinitet za Fc region izabranog imunoglobulin izotopa od najmanje približno 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40 ili 50 nM. Neke Fc-vezujuće molekule imaju jači ili slabiji afinitet za jedan ili više imunoglobulin izotopa u odnosu na druge.
[0069] Ovakav afinitet ili stepen specifičnosti može da se odredi različitim uobičajenim procedurama, uključujući, na primer, studije kompetitivnog vezivanja. U ELISA testu, pozitivni odgovor se definiše kao vrednost 2 ili 3 standardne devijacije veći od prosečne vrednosti kontrole ili grupe kontrola.
[0070] Kako je prethodno navedeno, neke detektor molekule kao što su Fc-vezujuće molekule, antigeni i/ili antigenični peptidi su konjugovani sa detektabilnim entitetom.
Konjugacija se obično postiže kovalentnim vezivanjem. U detektabilne entitete spadaju "direktni detektabilni entiteti", kao što su nanočestice metala, nanoljuspice metala, čestice obojenog lateksa, radioizotopi i fluorofore, i "indirektno detektabilni entiteti", koji se često oslanjaju na interakcije ligand-receptor da postignu signalizaciju. U nekim slučajevima, molekula detektora (na primer, antigenični peptid, Fc-vezujuća molekula kao što je Protein A/G) je konjugovana sa direktno detektabilnim entitetom. U ovom slučaju, molekula detektora je konjugovana sa ligandom, a nakon toga stupa u interakciju sa svojim ligandreceptorom, gde je ovaj konjugovan sa direktno detektabilnim entitetom ili vice versa. U primere liganda spadaju biotin (na primer, preko ostatka cisteina ili lizina), molekule lipida
(na primer, preko ostatka cisteina) i proteinski nosači (na primer, albumin seruma). Vezivanje za ligande, kao što je biotin, može da bude korisno za povezivanje detektora sa ligand receptorima, kao što su avidin, streptavidin ili neutravidin. S druge strane, avidin, streptavidin, neutravidin mogu da budu vezani za direktno detektabilni entitet (na primer, molekula signalizacije koja može da bude vizualizovana, kao što su koloidno zlato, fluorescentna molekula ili enzim kao što su peroksidaza rena ili alkalna fosfataza).
Alternativno, molekule detektora mogu da budu spojene ili vezane za ligand receptor, kao što su avidin, streptavidin ili neutravidin i na taj način omogućavaju povezanost sa odgovarajućim ligandom koji je, nasuprot tome, vezan za direktno detektabilan entitet.
Primeri drugih parova ligand-receptor su dobro poznati u tehnici i mogu da se koriste na sličan način.
2
[0071] Primeri direktno detektabilnih entiteta (ili molekula signalizacije) uključuju radioizotope, fluorofore, boje, enzime, nanočestice, čestice obojenog lateksa, hemiluminescentne markere, boje koje emituju svetlost i druge koje su ovde opisane i poznate u tehnici.
[0072] U primere radioizotopa koji mogu da se koriste kao direktno detektabilni entiteti spadaju<32>P,<33>P,<35>S,<3>H i<125>I. Ovi radioizotopi imaju različite polu-živote, tipove raspadanja i nivoe energije koji mogu da se iskoriste da se zadovolji potreba određenog protokola. Na primer,<3>H je emiter male energije što za rezultat ima niske vrednosti u okolini, međutim ova mala energija takođe ostavlja duge vremenske periode za autografiju i druga merenja.
[0073] Primeri fluorofora ili fluorohromata koji mogu da se koriste kao direktni detektabilni entiteti uključuju fluorescein, tetrametilrodamin, teksas crveno i brojne druge (na primer, Haugland, Handbook of Fluorescent Probes - 9th Ed., 2002, Molec. Probes, Inc., Eugene OR; Haugland, The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies-10th Ed., 2005, Invitrogen, Carlsbad, CA). Takođe su uključene boje koje emituju svetlost ili su na drugi način detektabilne. Svetlo koje emituju boje može da bude vidljivo svetlo i nevidljivo svetlo, kao što su ultraljubičasto ili infracrveno svetlo. U otelotvorenjima koja služe kao primer, boja može da bude boja fluorescentno rezonantnog energetskog transfera (FRET); ksanten boja, kao što su fluorescein i rodamin; boja koja ima amino grupu na alfa ili beta položaju (kao ašto su naftilamin boja, 1-dimetilaminonaftil-5-sulfonat, 1-anilin-8-naftalen sulfonat i 2-p-touidinil-6-naftalen sulfonat); boja koja ima 3-fenil-7-izocijanatokumarin; akridin, kao što su 9-izociocijanatoakridin and akridin oranž; piren, bensoksadiazol i stilben; boja koja ima 3-(ε-karboksipentil)-3’-etil-5,5’-dimetiloksakarbocijanin (CYA); 6-karboksifluorescein (FAM); 5&6-karboksirodamin-110 (R110); 6-karboksirodamin-6G
(R6G); N,N,N’,N’-tetrametil-6-karboksirodamin (TAMRA); 6-karboksi-X-rodamin (ROX); 6-karboksi-4’,5’-dihlor-2’,7’-dimetoksifluorescein (JOE); ALEXA FLUOR™; Cy2; Texas Red i Rhodamin Red; 6-karboksi-2’,4,7,7’-tetrahlorfluorescein (TET); 6-karboksi-2’,4,4’,5’,7,7’-heksahlorfluorescein (HEX); 5-karboksi-2’,4’,5’,7’-tetrahlorfluorescein (ZOE); NAN; NED; Cy3; Cy3.5; Cy5; Cy5.5; Cy7; i Cy7.5; IR800CW, ICG, Alexa Fluor 350; Alexa Fluor 488; Alexa Fluor 532; Alexa Fluor 546; Alexa Fluor 568; Alexa Fluor 594; Alexa Fluor 647; Alexa Fluor 680 ili Alexa Fluor 750.
[0074] Veoma male čestice, označene kao nanočestice, takođe mogu da se koriste kao direktno detektabilni entiteti. Ove čestice obično imaju veličinu u rasponu od 1-1000 nm i uključuju različite hemijske strukture kao što su čestice i kvantne tačke zlata i srebra. Kada se zrače sa upadnim uglom bele svetlosti, nanočestice srebra ili zlata u rasponu od približno 40-120 nm će sa velikim intenzitetom rasuti monohromatosko svetlost. Talasna dužina rasute svetlosti će da zavisi od veličine čestica. Svaka od četiri do pet različitih čestica na malom rastojanju će rasuti monohromatsku svetlost, koja kada se sakupi daje specifičnu, jedinstvenu boju. Derivatizovane nanočestice, kao što su čestice srebra ili zlata, mogu da budu vezane za veliki niz molekula uključujući proteine, antitela, male molekule, receptor ligande i nukleinske kiseline. Specifični primeri nanočestica uključuju nanočestice metala i nanoljuspice metala, kao što su čestice zlata, čestice srebra, čestice bakra, čestice platine, čestice kadmijuma, kompozitne čestice, šuplje sfere zlata, nanoljuspice silicijuma obložene zlatom i ljuspice zlata obložene silicijumom. Takođe su uključene nanočestice silicijuma, lateksa, polistirena, polikarbonata, poliakrilata, PVDF i obojene čstice bilo kog od ovih materijala.
[0075] Kvantne tačke mogu takođe da se koriste kao direktno detektabilni entiteti. Kvantne tačke su fluorescirajući kristali promera 1-5 nm koji mogu da se ekscitiraju svetlom u velikom rasponu talasnih dužina. Nakon ekscitacije svetlom koje ima odgovarajuću talasnu dužinu, ovi kristali emituju svetlo kao što je monohromatsko svetlo, sa talasnom dužinom u zavisnosti od njihove hemijske kompozicije i veličine. Kvantne tačke kao što su CdSe, ZnSe, InP ili InAs poseduju jedinstvene optičke osobine; ove i slične kvantne tačke su raspoložive iz brojnih komercijalnih izvora (na primer, NN-Labs, Fayetteville, AR; Ocean Nanotech, Fayetteville, AR; Nanoco Technologies, Manchester, UK; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).
[0076] Detekcija prisustva signala može da se postigne bilo kojim načinom koji je odgovarajući za obeleženi ili detektabilni entitet korišćen u ispitivanju. Na primer, faza detekcije može da uključi vizuelno proveravanje kompleksa vezivanja na promenu boje ili proveravanje kompleksa vezivanja na fiziko-hemijsku promenu. Do fiziko-hemijskih promena može da dođe reakcijama oksidacije ili drugim hemijskim reakcijama. One mogu da se detektuju golim okom, upotrebom spektrofotometra ili slično.
[0077] Signal je obično indikativan za prisustvo antitela od interesa kada je jači nego signal negativne kontrole. Međutim, ne zahtevaju svi testovi negativnu kontrolu. U nekim slučajevima, ali nije neophodno, jačina pozitivnog signala može numerički da se kvantifikuje i indikativna je za prisustvo antitela kada je ta jačina statistički značajna u odnosu na kontrolu. U nekim slučajevima, određuje se tip testa na osnovu rutinskog znanja i iskustva kada je signal pozitivan ili negativan i na taj način ukazuje na prisustvo ili odsustvo antitela od interesa.
[0078] Kao primer, signal iz nekih sredstava za imuni test lateralnog protoka može da se izmeri u skladu sa rezultatom reaktivnosti, rezultatom od 0-5 (uključujući decimalne tačke između) gde je jačim i pozitivnijem signalu dat veći broj poena. Negativna kontrola obično ima rezultat koji je bliži nuli, na primer, približno 0.25 ili manji.
[0079] Signal detekcije može da se optimizuje, na primer, podešavanjem odnosa pojedinačnih reaktanata. Jedan primer uključuje podešavanje odnosa (i) konjugata(e) detektabilne vezujuće molekule i (ii) konjugata(e) detektabilnog antigen/antigeničnog peptida na sledeći način: odnos (na primer, molarni odnos) (i):(ii) od približno 1:200, 1:100, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:19, 1:18, 1:17, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1 ili 200:1, uključujući sve odnose i opsege odnosa između njih. U nekim otelotvorenjima, odnos konjugata detektabilne Fc-vezujuće molekule i konjugata detektabilnog antigen/antigenični peptid je od približno 20:1 do približno 1:20, preferirano od približno 20:1 do približno 1:1 i još poželjnije od približno 16:1 do približno 2:1. U nekim otelotvorenjima, Fc-vezujuća molekula u detektabilnom konjugatu je Protein A, Protein G, Protein A/G spojeni proteini, Protein L ili njihovi fragmenti i varijante koje zadržavaju sposobnost specifičnog vezivanja za Fc region antitela.
[0080] U nekim otelotvorenjima, smeša proteina A i proteina G se koristi kao konjugat Fcvezujuće molekule, pri čemu je svaka molekula proteina A i proteina G konjugovana sa detektabilnim entitetom. U otelotvorenjima u kojima se protein A i protein G oba koriste kao konjugat detektabilne Fc-vezujuće molekule, signal detekcije može da se optimizuje promenom odnosa proteina A i proteina G u zavisnosti od tipa klase imunoglobulina koji se detektuje. Kako je prethodno objašnjeno, protein A i protein G imaju različite afinitete vezivanja za Fc regione različitih klasa imunoglobulina (na primer, IgG, IgE, IgD, IgM ili IgA). U skladu sa tim, odnos proteina A i proteina G može da se podesi na osnovu klase imunoglobulina koja treba da se detektuje. Kao primer, ukoliko se želi da se predominantno detektuju IgM imunoglobulini, može da se koristi niži odnos proteina A i proteina G (to jest veća količina konjugata proteina G u odnosu na konjugat proteina A). S druge strane, ukoliko neko želi da predominantno detektuje IgG imunoglobuline, može da se koristi veći odnos proteina A i proteina G (to jest veća količina konjugata proteina A u odnosu na konjugat proteina G). Primeri odnosa (na primer, molarni odnosi) konjugata proteina A i proteina G uključuju, ali bez ograničenja na, 1:20, 1:19, 1:18, 1:17, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11,
2
1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1,2:1,3:1,4:1,5:1,6:1,7:1,8:1,9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1 i 20:1. U nekim otelotvorenjima, odnos konjugata proteina A i konjugata proteina G je od približno 10:1 do približno 1:10, preferirano od približno 5:1 do približno 1:5 i mnogo poželjnije od približno 2:1 do približno 1:2. U jednom otelotvorenju, odnos konjugata proteina A i konjugata proteina G je približno 1:1.
[0081] U nekim otelotvorenjima, detekcija signala može dalje da se optimizuje podešavanjem odnosa proteina A i proteina G prema količini detektabilnog antigen/antigenični peptid konjugata. Na primer, u nekim otelotvorenjima, odnos (na primer, molarni odnos) proteina A i konjugata proteina G i detektabilnog antigen/antigenični peptid konjugata može da bude od približno 20:20:1 do približno 1:1:20, od približno 10:10:1 do približno 2:2:1 ili od približno 4:2:1 do približno 1:2:1.
[0082] Protokoli za imunoanalize uz upotrebu antigena za detekciju specifičnih antitela su dobro poznati u tehnici. Na primer, može da se koristi uobičajena sendvič analiza ili može da se koristi format konvencionalne kompetitivne analize. Za razmatranje nekih pogodnih tipova analiza, videti Current Protocols in Immunology (Coligan i saradnici, editors, John Wiley & Sons, Inc). U nekim otelotvorenjima, faza detekcije obuhvata izvođenje imunoanalize lateralnog protoka. U nekim otelotvorenjima, faza detekcije uključuje sprovođenje ELISA testa. U drugim otelotvorenjima, faza detekcije obuhvata uvrtanje uzorka u analitičkom rotoru. U čak drugim otelotvorenjima, faza detekcije obuhvata analizu uzorka sa elektrohemijskim, optičkim ili opto-elektronskim senzorom.
[0083] Posebno koristan format analize je format imunoanalize lateralnog protoka. U jednom neograničavajućem primeru, reporter ili detektor molekula koji uključuje Fc-vezujuću molekulu (na primer, Protein A i/ili G) i opciono antitelo specifični-antigen se obeleže sa detektabilnim entitetom (na primer, koloidno zlato) a nakon toga suše i prenesu na ploču od staklenih vlakana (ploča za aplikaciju uzorka ili konjugatna ploča). Neobeleženi antigen ili antigenični peptid (to jest, entitet vezivanja) je imobilisan na membrani, kao što su nitrocelulozna ili PVDF (poliviniliden fluorid) membrana (na primer, Immobilon™ membrana). Kada se rastvor uzorka (krv, serum, itd.) nanese na ploču za aplikaciju uzorka (ili propusti kroz konjugatnu ploču), on rastvori obeleženi detektor(e), koji se nakon toga vezuju za antitela u uzorku, ukoliko ih ima. Dobijeni kompleksi se nakon toga prenesu u sledeću membranu (PVDF ili nitrocelulozna koja sadrži entitet vezivanja) kapilarnim delovanjem. Ukoliko su prisutna antitela na entitetu vezivanja, onda se stvara kompleks sa detektorom(ima) i dijagnostikuje se entitet vezivanja na membrani, čime se generiše signal
(na primer, opseg koji može da se vidi ili vizualizuje).
[0084] Kao naredni neograničavajući primer, ploča uzorka nije ispresecana sa molekulama detektora (to jest, detektabilnim Fc-vezujućim molekulama, detektabilnim antigenkonjugatima), to jest, ploča sa uzorkom ne sadrži region konjugata molekula prethodno imobilisanog detektora. Sve ostale komponente su u osnovi iste kako je prethodno opisano, gde je neobeleženi antigen ili antigenični peptid (to jest, entitet apsorpcije) imobilisan na membrani kao što je nitrocelulozna ili PVDF (poliviniliden fluorid) membrana (na primer, Immobilon™ membrana). Test uzorak (krv, serum, itd.) se prethodno izmeša sa molekulama jednog ili oba detektora a nakon toga nanese na ploču za uzorak. Alternativno, test uzorak i molekule detektora se odvojeno nanesu na ploču za uzorke, u isto vreme ili jedna za drugom. Druge kombinacije će da odredi stručnjak sa iskustvom u tehnici. Nezavisno od redosleda po kome su izmešani ili naneti, nastali kompleksi antitela u uzorku i molekula detektora se nakon toga kapilarnim delovanjem prenesu na sledeću membranu (PVDF ili nitroceluloza koja sadrži entitet vezivanja). Ukoliko su prisutna antitela na entitetu vezivanja, ona tada stvaraju kompleks sa detektorima i dijagnostičkim entitetom vezivanja na membrani, čime generišu signal (na primer, opseg koji može da se vidi ili vizualizuje).
[0085] U specifičnim otelotvorenjima, postupci obuhvataju dovođenje u kontakt test uzorka sa konjugatom Protein A i/ili Protein G-koloidno zlato (CGC) da se formira prvi kompleks, dovođenje u kontakt prvog kompleksa sa peptidnim antigenom imobilizovanim na test regionu nitrocelulozne ili PVDF membrane, pri čemu je peptidni antigen dobijen iz mikrobnog izvora i specifično vezan za antitela od interesa (na primer, anti-bakterijsko, antivirusno, anti-parazitno, anti-fungalno antitelo). Peptidni antigen može da bude konjugovan sa BSA ili sintetizovan kao MAPS. Prisustvo signala iz Protein A-CGC i/ili Protein G-CGC u test regionu je indikacija prisustva antitela u test uzorku.
[0086] Neki postupci dalje uključuju dovođenje u kontakt test uzorka sa peptidni antigen-CGC konjugatom, koji sadrži isti peptidni antigen kako je prethodno opisano. U nekim otelotvorenjima, Protein A/G-CGC ili sekundarni-antitelo CGC ili kombinacija njih i peptidnog antigena-CGC su imobilisani na regionu konjugata membrane (ili odvojenu ali povezanu membranu) na način da se ne preklapa sa test regionom. U drugim otelotvorenjima, Protein A/G-CGC ili sekundarno-antitelo CGC ili kombinacija njih i peptidnog antigena-CGC nisu imobilisani na membrani, već se radije nanose na površinu zajedno sa test uzorkom, u isto vreme ili po redu. Kombinovani signal iz Protein A/G-CGC i/ili sekundarnog antitela-
2
CGC i peptidnog antigena-CGC ukazuje na prisustvo antitela u test uzorku i obično je jači nego signal iz testa koji se izvodi samo sa peptidnim antigenom-CGC, to jest, bez Protein A-CGC, Protein G-CGC ili sekundarno antitelo-CGC. U specifičnim otelotvorenjima, peptidni antigen je Borrelia antigen (kakav postoji u prirodi ili sintetizovan, na primer, identičan sa ili liči na antigen koji postoji u prirodi) a test uzorak je iz subjekta za koga se sumnja da ima Lajmsku bolest. Pozitivni signal identifikuje prisustvo specifičnih antitela za Lajmsku bolest u uzorku. U drugim otelotvorenjima, peptidni antigen je Ehrlichia antigen (kakav postoji u prirodi ili sintetizovan, na primer, identičan sa ili liči na antigen koji postoji u prirodi) a za subjekt se sumnja da ima erlihiozu, bakterijsku infekciju koju prenose krpelji izazvanu bakterijom iz familije Anaplasmataceae, roda Ehrlichia i Anaplasma.
[0087] Naredna analiza za proveru krvnih produkata ili drugih fizioloških ili bioloških fluida je enzimoimuni test, to jest, ELISA. U ELISA su entiteti apsorpcije (na rimer, antitelospecifični antigeni) obično adsorbovani na površini mikrotitarnog udubljenja direktno ili preko matriksa apsorpcije (na primer, antitela). Ostaci, mesta vezivanja ne-specifičnih proteina na površini se nakon toga blokiraju sa odgovarajućim sredstvom, kao što su albumin seruma govečeta (BSA), normalni serum koze inaktiviran toplotom (NGS) ili BLOTTO
(puferovani rastvor bezmasnog mleka u prahu koje takođe sadrži konzervanse, soli i antipeneće sredstvo). Udubljenja se nakon toga inkubiraju sa biološkim uzorkom za koje se sumnja da sadrže antitelo od interesa. Uzorak može da bude nanet čist, ili mnogo češće razblažen, obično u puferovanom rastvoru koji sadrži malu količinu proteina (0.1-5.0% težinski), kao što su BSA, NGS ili BLOTTO. Nakon inkubiranja, dovoljno dugog da se omogući specifično vezivanje, udubljenja se isperu da se ukloni nevezani protein a nakon toga inkubiraju sa jednim ili više detektora molekula, uključujući Fc-vezujuću molekulu (na primer, Protein A i/ili Protein G) i opciono drugim antitelo-specifičnim antigenom (obično istim kao što je entitet vezivanja) koji su konjugovani sa enzimom ili drugim obeleživačem standardnim procedurama i rastvore u puferu za blokiranje. Obeleživač može da se izabere od različitih enzima, uključujući peroksidazu rena (HRP), beta-galaktozidazu, alkalnu fosfatazu, glukoznu oksidazu, itd. Ostavi se dovoljno vremena da ponovo dođe do specifičnog vezivanja, nakon toga se udubljenja ponovo isperu da se ukloni nevezani konjugat i doda se substrat koji odgovara enzimu. Ostavi se da se razvije boja a optička gustina sadržaja udubljenja se određuje vizuelno ili instrumentalno (merenjem na odgovarajućoj talasnoj dužini). Granična OD vrednost može da se definiše kao prosečna OD 3 standardne devijacije
(SDe) od najmanje 50 uzoraka seruma uzetih od pojedinaca iz oblasti u kojima Lajmska
2
bolest nije endemična, ili na drugi način kao što su uobičajene definicije. U slučaju vrlo specifičnog testa, OD+2 SD može da se koristi kao granična vrednost. Uslovi za sprovođenje ELISA testa su dobro poznati u tehnici.
[0088] Stručnjak sa iskustvom u tehnici će znati da bilo koji broj opšte priznatih formata za ispitivanje proteina, posebno formata imunoanaliza, može da se donese kako bi se iskoristila ovde opisana različita otelotvorenja. Prema tome, ovaj pronalazak nije ograničen izborom određenog formata analize i smatra se da obuhvata test formate koji su poznati stručnjaku sa iskustvom u tehnici.
[0089] Izrazi kao što su "uzorak koji sadrži antitelo" ili "detekcija antitela u uzorku" ne znače da su isključeni uzorci ili odrednice (na primer, pokušaji detekcije) koji ne sadrže antitelo ili u kojima nije detektovano. U generalnom smislu, ovaj pronalazak uključuje ispitivanja da se odredi da li je antitelo nastalo kao odgovor na infekciju infektivnim mikrobom prisutno u uzorku, nezavisno da li je ili nije detektovano
[0090] Uslovi za reakciju antigena/peptida i antitela tako da oni specifično reaguju su dobro poznati stručnjaku sa iskustvom u tehnici. Videti, na primer, Current Protocols in Immunology (Coligan i saradnici, editors, John Wiley & Sons, Inc).
Sredstva i kompozicije
[0091] U narednom aspektu, ovo otkriće obuhvata sredstva za detekciju antitela u uzorku. Neka otelotvorenja uključuju sredstva za detekciju antitela ili sisteme za detekciju antitela, uključujući region za stavljanje uzorka, region konjugata i test region. Region konjugata se obično ne preklapa sa test regionom; međutim, region uzorka i ova dva regiona su tako konfigurisani da prilikom nanošenja tečnog uzorka u region nanošenja uzorka, uzorak je u tečnoj komunikaciji sa regionom konjugata i test regionom. Uobičajeno, test uzorak teče kroz ili je u komunikaciji sa regionom konjugata i test regionom kapilarnim delovanjem. Region konjugata sadrži mobilišuću Fc-vezujuću molekulu konjugovanu sa prvim detektabilnim entitetom (to jest, konjugat detektabilne Fc-vezujuće molekule, kao što su Protein A i/ili Protein G-konjugat ili konjugat Fc-specifičnog sekundarnog antitela) a test region sadrži imobilisani entitet vezivanja sposoban da se specifično vezuje za antitelo. Svaka od ovih karakteristika je opisana u ovom tekstu.
[0092] U nekim otelotvorenjima, sredstvo dalje uključuje kontrolni region u tečnoj komunikaciji sa tečnim uzorkom kada se on nanese na region za nanošenje uzorka. Ponovo,
2
tečni uzorak može da teče kroz ili da bude u komunikaciji sa kontrolnim regionom kapilarnim delovanjem. U nekim otelotvorenjima, kontrolni region sadrži imobilisani partner vezivanja sposoban da se specifično veže za kontrolni detektor. Kao primer, kontrolni region sadrži anti-protein A antitelo, anti-protein G antitelo ili bilo koji od IgGa sisara koji reaguje sa proteinom A ili proteinom G.
[0093] Neka sredstva dalje uključuju absorbent ploču postavljenu niže od test regiona. U nekim sredstvima, region konjugata je pozicioniran ispred regiona za nanošenje uzorka. U nekim otelotvorenjima, region konjugata je pozicioniran niže od regiona za nanošenje uzorka. U nekim otelotvorenjima, region za nanošenje uzorka sadrži separator krvnog materijala.
[0094] U nekim slučajevima, region konjugata dalje sadrži mobilizujući drugi detektor, pri čemu drugi detektor obuhvata antigen ili antignični peptid konjugovan sa drugim detektabilnim entitetom, a taj antigen ili antigenični peptid je sposoban da se specifično veže za antitelo. U nekim otelotvorenjima, prvi (na primer, detektabilna Fc-vezujuća molekula) i drugi (na primer, detektabilni antigen-konjugat) detektori imaju isti tip detektabilnog entiteta. U drugim otelotvorenjima, prvi i drugi detektori imaju različite tipove detektabilnih entiteta. U posebnim otelotvorenjima, odnos (na primer molarni odnos) prvog detektora i drugog detektora je tako podešen da se postigne željeni nivo pojačanja signala. Na primer, odnos prvog detektora (na primer, detektabilne Fc-vezujuće molekule, kao što su protein A/protein G) i drugog detektora (na primer, detektabilnog antigen-konjugata) može da bude približno 1:200, 1:100, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:19, 1:18, 1:17, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1 ili 200:1, uključujući sve odnose i opsege odnosa između. U nekim otelotvorenjima, odnos detektabilnog konjugata Fc-vezujuće molekule i konjugata detektabilnog antigena/antigeničnog peptida je od pribilžno 20:1 do približno 1:20, preferirano od pribilžno 20:1 do približno 1:1 i još poželjnije od pribilžno 16:1 do približno 2:1. U otelotovrenjima u kojima se oba konjugata, i proteina A i proteina G koriste kao detektabilne Fc-vezujuće molekule, odnos konjugata proteina A i konjugata proteina G može da se podesi da se optimizuje detekcija signala zasnovanog na klasi imunoglobulina koja se detektuje kako je prethodno opisano. Odgovarajući odnosi (na primer molarni odnosi) konjugata proteina A i konjugata proteina G uključuju, ali se ne ograničavaju samo na, 1:20, 1:19, 1:18, 1:17, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1,
2
19:1 i 20:1. U nekim otelotvorenjima, odnos konjugata proteina A i konjugata proteina G je od pribilžno 10:1 do približno 1:10, preferirano od pribilžno 5:1 do približno 1:5 i mnogo poželjnije približno 2:1 do približno 1:2. U jednom otelotvorenju, odnos konjugata proteina A i konjugata proteina G je približno 1:1.
[0095] Sredstva za izvođenje testova specifičnog vezivanja, posebno imunoanaliza, su poznata i mogu jednostavno da se prilagode za upotrebu u postupcima iz ovog pronalaska. Generalno, ispitivanja čvrste faze se lakše izvode nego ispitivanja heterogenih uzoraka za koje postupci zahtevaju razdvajanje faza, kao što su precipitacija, centrifugiranje, filtriranje, hromatografija ili magnetizam, zato što je razdvajanje reagenasa brže i jednostavnije.
Sredstva za ispsitivanje čvrste faze uključuju mikrotitarne ploče, protok kroz sredstvo za ispitivanje (na primer, sredstvo za imuni test lateralnog protoka), merne štapove i sredstva za imunokapilarnu ili imunohromatografsku analizu.
[0096] U nekim otelotvorenjima, sredstvo je imunotest lateralnog protoka. U nekim otelotvorenjima, sredstvo je mikrotitarna ploča pogodna za ELISA test. U drugim otelotvorenjima, sredstvo je pogodno za upotrebu u analitičkom rotoru. U čak drugim otelotvorenjima, sredstvo sadrži elektrohemijski, optički ili opto-elektronski senzor.
[0097] U nekim otelotvorenjima, sredstvo za test lateralnog protoka je konstruisano tako da koristi ploču za separaciju uzorka/krvi, nitroceluloznu membranu i gornji fitilj smešten u kućištu (videti, na primer, Sliku 2). Nitrocelulozna membrana je podeljena sa test linijom ili regionom koji obuhvata entitet vezivanja, kao što je neobeleženi, anti-telo specifični antigen
(na primer, peptidni antigen ili ne-peptidni antigen) i opciono sa kontrolnom linijom ili regionom koji sadrži antitelo koje je reaktivno sa Fc-vezujućom molekulom (niže pokazanom). Uzorak za koji se sumnja da sadrži antitelo od interesa može prethodno da se izmeša sa dektabilnim konjugatom Fc-vezujuće molekule a nakon toga se nanese na sredstvo za ispitivanje lateralnog protoka. Ili, radije nego prethodno mešanje, uzorak i Fc-vezujuća molekula mogu da se nanesu u isto vreme ili po redu na sredstvo za ispitivanje, bilo kojim redosledom.
[0098] Alternativno, nitrocelulozna membrana se pripremi kao prethodno i dalje iscrta sa linijom konjugata ili regionom koji obuhvata detektabilni konjugat Fc-vezujuće molekule, pri čemu se konjugat i test regioni ne preklapaju. U nekim otelotvorenjima, uzorak za koji se sumnja da sadrži antitelo od interesa može nakon toga da se nanese na sredstvo za ispitivanje lateralnog protoka. U drugim otelotvorenjima, uzorak za koji se sumnja da sadrži antitelo od interesa može prethodno da se izmeša sa detektabilnim antigen-konjugatom, koji se specifično
2
vezuje za antitelo (koji obično ima istu specifičnost vezivanja kao entitet vezivanja) a nakon toga nanese na sredstvo za ispitivanje lateralnog protoka. Slično kao prethodno, radije nego da se prethodno meša, uzorak i detektabilni antigen-konjugat mogu da se nanesu u isto vreme ili po redu na sredstvo za analizu, bilo kojim redosledom.
[0099] U nekim otelotvorenjima, sredstvo za test lateralnog protoka je konstruisano tako da koristi ploču za separaciju uzorka/krvi, nitroceluloznu membranu i gornji fitilj smešten u kućištu (videti, na primer, Sliku 2). Nitrocelulozna membrana je iscrtana sa test linijom ili regionom koji obuhvata entitet vezivanja, kao što je neobeleženi, anti-telo specifični antigen
(na primer, peptidni antigen ili ne-peptidni antigen), opciono sa kontrolnom linijom ili regionom koji sadrži antitelo koje je reaktivno sa Fc-vezujućom molekulom (niže pokazanom), i linijom konjugata ili regionom koji obuhvata detektabilni antigen-konjugat koji se specifično vezuje za antitelo, koji obično ima istu specifičnost vezivanja kao entiet apsorpcije. Konjugat i test regioni se obično ne preklapaju. Uzorak za koji se sumnja da sadrži antitelo od interesa može prethodno da se izmeša sa dektabilnim konjugatom Fc-vezujuće molekule a nakon toga se nanese na sredstvo za ispitivanje lateralnog protoka. Takođe, radije nego prethodno mešanje, uzorak i Fc-vezujuća molekula mogu da se nanesu u isto vreme ili po redu na sredstvo za ispitivanje, bilo kojim redosledom. U jednom otelotvorenju koje služi kao primer, mogu takođe da se koriste sredstva sa dva ulaza za odvojenu aplikaciju test uzorka, konjugata i pufer za traženje.
[0100] U nekim sredstvima za lateralni protok, nitrocelulozna membrana je iscrtana sa test linijom ili regionom koji obuhvata entitet vezivanja, kao što je neobeleženi anti-telo specifični antigen (na primer, peptidni antigen ili ne-peptidni antigen), opciono sa kontrolnom linijom ili regionom koji sadrži antitelo koje je reaktivno sa Fc-vezujućom molekulom (niže pokazanom) i linijom konjugata ili regionom koji obuhvata detektabilnu Fc vezujuću molekulu i detektabilni antigen-konjugat koji se specifično vezuje za antitelo (koji obično ima istu specifičnost vezivanja kao entiet apsorpcije). Uzorak za koji se sumnja da sadrži antitelo od interesa može nakon toga da se nanese na sredstvo za ispitivanje lateralnog.
[0101] U jednom sredstvu za detekciju Lajm-specifičnog antitela koje služi kao primer, sredstvo za lateralni protok je konstruisano tako da koristi ploču za separaciju uzorka/krvi, nitroceluloznu membranu i gornji fitilj smešten u kućištu (videti, na primer, Sliku 2).
Nitrocelulozna membrana je iscrtana sa test linijom ili regionom koji obuhvata smešu peptida koji imitiraju ili simuliraju Borrelia antigene (videti, na primer, US2011136155) i kontrolnu liniju ili region koji obuhvata bilo koji Protein A- ili Protein G-reaktivni imunoglobulin (na primer, anti-Protein A IgG, mišji, humani ili neki drugi Protein A-reaktivni IgG, itd.). Uzorak za koji se sumnja da sadrži antitela na Borrelia burgdorferi može da se izmeša ili sa konjugatima koloidnog zlata sa Proteinom A i/ili G (Protein A/G-CGC) ili (ii) smešom Protein A/G-CGC konjugatima koloidnog zlata Borrelia antigena (Borrelia antigen-CGC). Ovaj uzorak smeše konjugata može nakon toga da se nanese na sredstvo za ispitivanje lateralnog protoka.
[0102] Alternativno, sredstvo za isptivanje lateralnog protoka je konstruisano kako je prethodno dato, ali je nitrocelulozna ploča iscrtana sa jednim ili više regiona konjugata, izdvojenim od test regiona. Regioni konjugata mogu da uključe, na primer, (i) samo Protein A/G-CGC, (ii) samo Borrelia antigen-CGC ili (iii) kombinaciju Proteina A/G-CGC i Borrelia antigena-CGC. Kako se ovde koristi ili bilo gde drugo u ovoj aplikaciji, Borrelia antigen, Ehrlichia antigen ili bilo koji antigen ili antigenični peptid obuhvata smešu sintetičkih peptida koji imitiraju ili simuliraju prirodni Borrelia antigen, prirodni Ehrlichia antigen ili bilo koji drugi prirodni antigen, tim redom. U nekim otelotvorenjima, na primer u
(i) ili (iii), test uzorak se sam nanosi na sredstvo za isptivanje lateralnog protoka bez bilo kakvog prethodnog mešanja. U drugim otelotvorenjima, na primer u (i), uzorak može prethodno da se izmeša sa Borrelia antigen-CGC a nakon toga nanese na sredstvo za isptivanje lateralnog protoka. U nekim otelotvorenjima, na primer u (ii), uzorak može prethodno da se izmeša sa Protein A/G-CGC a nakon toga nanese na sredstvo za isptivanje lateralnog protoka. Međutim, ove kombinacije koje služe kao primer nisu ograničavajuće i stručnjaku sa iskustvom u tehnici su poznate i druge mogućnosti.
[0103] Kompleksi apsorpcije koji obuhvataju Protein A/G-CGC, antitelo u uzorku i opciono Borrelia antigen-CGC se formiraju u toku prenošenja kroz ploču za separaciju uzorka/krvi i kretanjem kroz opcione linije konjugata i test linije. U zavisnosti od okolnosti (na primer, opciona upotreba Borrelia antigen-CGC), kompleks ili sendvič se formira od imobilisanog i neobeleženog Borrelia antigena, anaitela i obeleženog Protein A/GCGC. U prisustvu Borrelia antigen-CGC, kompleks ili sendvič se formira od neobeleženog Borrelia antigena, antitela, obeleženog Borrelia antigen-CGC i obeleženog Protein A/G-CGC. Dodavanje Protein A/G-CGC u ovaj kompleks dalje ubrzava signal iz obeleženog Borrelia antigen-CGC. U nekim otelotvorenjima, povećanje ubrzanja može da se postigne podešavanjem odnosa između svih reaktanata, kako je ovde opisano i kako je poznato u tehnici.
[0104] U sredstvu koje služi kao primer za detekciju erhilioza-specifičnih antitela, sredstvo za isptivanje lateralnog protoka je konstruisano tako da koristi ploču za separaciju uzorka/krvi,
1
nitroceluloznu membranu i gornji fitilj smešten u kućištu. Nitrocelulozna membrana je iscrtana sa test linijom ili regionom koji obuhvata Ehrlichia antigen i kontrolnom linijom ili regionom koji obuhvata bilo koji Protein A- ili Protein G-reaktivni imunoglobulin (na primer, anti-Protein A IgG). Uzorak za koji se sumnja da sadrži antitela za Ehrlichia (na primer, E. canis, E. chaffeensis, E. ewingii,) može da se izmeša ili sa konjugatima koloidnog zlata Proteina A i/ili G (Protein A/G-CGC) ili (ii) smešom Proteina A/G-CGC i konjugatima koloidnog zlata Ehrlichia antigena (Ehrlichia antigen-CGC). Ovaj uzorak smeše konjugata može nakon toga da se nanese na sredstvo za ispitivanje lateralnog protoka.
[0105] Alternativno, sredstvo za isptivanje lateralnog protoka je konstruisano kao prethodno, ali je nitrocelulozna ploča podeljena sa jednim ili više regiona konjugata, odvojeno od test regiona. Regioni konjugata mogu da uključe, na primer, (i) samo Protein A/G-CGC, (ii) samo Ehrlichia antigen-CGC ili (iii) kombinaciju Proteina A/G-CGC i Ehrlichia antigen-CGC. U nekim otelotvorenjima, na primer u (i) ili (iii), sam test uzorak se nanosi na sredstvo za isptivanje lateralnog protoka bez bilo kakvog prethodnog mešanja. U drugim otelotvorenjima, na primer u (i), uzorak može prethodno da bude izmešan sa Ehrlichia antigen-CGC a nakon toga nanet na sredstvo za isptivanje lateralnog protoka. U nekim otelotvorenjima, na primer u
(ii), uzorak može da bude prethodno izmešan sa Protein A/G-CGC a nakon toga nanet na sredstvo za isptivanje lateralnog protoka. Međutim, ovi primeri kombinacija nisu ograničavajući i stručnjak sa iskustvom u tehnici može da primeni druge mogućnosti.
[0106] Kompleksi apsorpcije koji obuhvataju Protein A/G-CGC, antitelo u uzorku i opciono Ehrlichia antigen-CGC se formiraju u toku transporta kroz ploču za separaciju uzorka/krvi i migracijom kroz linije opcionog konjugata i test linija. U zavisnosti od okolnosti (na primer, opciona upotreba Ehrlichia antigen-CGC), kompleks ili sendvič se formira od imobilisanog i neobeleženog Ehrlichia antigena, antitela i obeleženog Protein A/GCGC. U prisustvu Ehrlichia antigen-CGC, kompleks ili sendvič se formira od neobeleženog Ehrlichia antigena, antitela, obeleženog Ehrlichia antigen-CGC i obeleženog Protein A/G-CGC. Dodavanje Protein A/G-CGC u nastali kompleks dalje pojačava signal iz obeleženog Ehrlichia antigen-CGC. U nekim otelotvorenjima, povećano ubrzanje može da se postigne podešavanjem odnosa svih reaktanata, kako je ovde opisano i kako je poznato u tehnici.
[0107] U jednom otelotvorenju mikrotitarne ploče pogodne za ELISA, entitet vezivanja je imobilisan na površini, kao što je ELISA ploča sa 96 udubljenja ili ekvivalentna čvrsta faza koja je obložena sa streptavidinom ili ekvivalentnim biotin vezujućim jedinjenjem, kao što su avidin ili neutravidin, pri optimalnoj koncentraciji u alkalnom puferu za oblaganje i
2
inkubirani na 4° C u toku noći. Nakon odgovarajućeg broja ispiranja sa standardnim puferima za ispiranje, u svako udubljenje se nanese optimalna koncentracija biotiniliranog oblika Fcvezujuće molekule i opciono istog antigena upotrebljenog kao entitet vezivanja rastvorenih u uobičajenom puferu za blokiranje. Nakon toga se doda uzorak i test nastavi kako je ovde opisano i kako je poznato u tehnici.
[0108] U narednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje kompozicije koje se odnose na detekciju antitela u uzorku. Neka otelotvorenja se odnose na jedan ili više kompleksa apsorpcije koji obuhvataju entitet vezivanja, antitelo u test uzorku i prvi detektor, pri čemu se entitet vezivanja vezuje za antitelo i pri čemu prvi detektor obuhvata Fc-vezujuću molekulu konjugovanu sa prvim detektabilnim entitetom i vezuje se za Fc region antitela. Neka otelotvorenja dalje obuhvataju drugi detektor, pri čemu se drugi detektor specifično vezuje za promenljivi region antitela. U nekim otelotvorenjima, kompleks apsorpcije je imobilisan na test regionu površine, kao što je čvrsta ili polu-čvrsta podloga. Na primer, u nekim otelotvorenjima, čvrsta podloga je perlica (na primer, koloidna čestica ili nanočestica), put protoka u uređaju za imuni test lateralnog protoka, put protoka u analitičkom rotoru ili kiveta ili udubljenje (na primer, u ploči). Videti Sliku 1 kao ilustraciju ovog i sličnih otelotvorenja, uključujući opcioni konjugat drugog detektora i opcionu test površinu.
[0109] U posebnim otelotvorenjima, kompleks obuhvata antitelo od interesa (na primer, antimikrobno antitelo, kao što su anti-virusno, anti-bakterijsko, anti-fungalno ili anti-parazitno anitelo), Protein A- i/ili Protein G-konjugat, imobilisani antitelo-specifični antigen i opciono antigen-konjugat. U nekim otelotvorenjima, Protein A i/ili Protein-G konjugat obuhvata nanočestice zlata (na primer, Protein A-CGC ili Protein G-CGC - "konjugat koloidnog zlata") a antigen-konjugat obuhvata nanočestice zlata (na primer, antigen-CGC). U nekim otelotvorenjima, antigen-konjugat ili antigen-CGC obuhvata mikrobni antigen, kao što je virusni, bakterijski, gljivični ili parazitni antigen, kako je ovde opisano i kako je poznato u tehnici. U specifičnim otelotvorenjima, antigen-konjugat ili antigen-CGC uključuje antigen specifičan za Lajmsku bolest, kao što je Borrelia antigen (videti supra). U drugim otelotvorenjima, antigen-konjugat ili antigen-CGC uključuje antigen specifičan za bolesti erlihioze, kao što je Ehrlichia antigen.
Kitovi
[0110] Čak u još jednom aspektu, opis obezbeđuje kitove. U nekim otelotvorenjima, kitovi sadrže sredstvo ili sistem kako je ovde opisano. U nekim otelotvorenjima, kitovi sadrže dva, tri, četiri ili više sredstava ili sistema kako je ovde opisano.
[0111] Reagensi za određene tipove analiza mogu takođe da budu sastavni deo ovde otkrivenih kitova. Prema tome, kitovi mogu da uključe grupu nanočestica, perlice (na primer, pogodne za test aglutinacije ili test lateralnog protoka) ili ploču (na primer, ploču pogodnu za ELISA test). U drugim otelotvorenjima, kitovi sadrže sredstva, kao što je sredstvo za imuni test lateralnog protoka, analiatički rotor ili elektrohemijski optički ili opto-elektronski senzor. Grupa nanočestica, perlice, ploče i sredstva su korisni za izvođenje imunotestova. Na primer, mogu da budu korisni za detekciju formiranja antitelo-peptidnog kompleksa koji obuhvata antitelo iz uzorka, antigenični peptid (obeležen i/ili neobeležen) i Fc-vezujuću molekulu.
[0112] U nekim otelotvorenjima, antigen (ili smeša različitih antigena) je konjugova sa detektabilnim entitetom kao što su nanočestice zlata, tako da je isti antigen (ili smeša antigena) takođe vezan za ili imobilisan na ploči, nitroceluloznoj test površini ili drugoj test površini ili sredstvu, a Fc-vezujuća molekula je knjugovana sa detektabilnim entitetom, kao što je nanočestica zlata. U posebnim kitovima, antigenični peptid je konjugovan sa nanočesticom zlata i opciono je konjugovan sa BSA, tako da je isti antigen (bez čestice zlata ali opciono konjugovan sa BSA) imobilisan na definisanom test regionu ili iscrtan na površini nitrocelulozne ploče, a Protein A i/ili Protein G je konjugovan sa nanočesticom zlata, opciono kao deo kita koji sadrži sredstvo za ispitivanje lateralnog protoka. U nekim otelotvorenjima, konjugat Protein A i/ili Protein G-čestice zlata je imobilisan na odvojenom regionu nitrocelulozne površine, to jest, regionu konjugata koji se ne preklapa sa test regionom.
[0113] Pored toga, kitovi mogu da obuhvate različite razblaživače i pufere, obeležene konjugate i druge agense za detekciju specifično vezanih antigena ili antitela i druge reagense za generisanje signala, kao što su substrati enzima, kofaktori i hromogeni. Stručnjak sa iskustvom u tehnici može lako da odredi druge komponente kita. Ovakve komponente mogu da uključe reagense za oblaganje, poliklonalna ili monoklonalna antitela vezivanja specifična za Fc-vezujuću molekulu kao što su Protein A i/ili Protein G ili koktel dva ili više antitela, prečišćene ili polu-prečišćene ekstrakte antigena ili antitela kao standarde, monoklonalno antitelo detektora antitela, anti-mišje, anti-pasje, anti-pileće ili antihumano antitelo sa indikatorom molekule konjugovane sa njim, indikator karte za kolorometrijsko poređenje, rukavice za jednokratnu upotrebu, uputstva za dekontaminaciju, štapiće za nanošenje ili kontejnere, posudu za preparaciju uzorka, itd. U jednom otelotvorenju, kit sadrži pufere ili
4
druge reagense potrebne za konstituciju reaktivnog medijuma koji omogućava formiranje kompleksa peptid-antitelo.
[0114] Ovakvi kitovi obezbeđuju prigodan, efikasan način za kliničku laboratoriju pri dijagnostikovanju infekcije mikrobnim agensom, posebno patogenim mikrobnim agensima, kako je ovde u tekstu opisano i kako je poznato u tehnici. Ovakvi kitovi mogu takođe da obezbede prigodan, efikasan način za kliničku laboratoriju da dijagnostikuje druga stanja povezana sa prisustvom antitela od interesa. Na primer, neki autoimuni poremećaji mogu da budu povezani sa određenim tipovima antitela. Prema tome, do nivoa do koga su poznate kombinacije antitelo-antigen povezane sa bolešću, ovakvi kitovi mogu da postave tačne i precizne dijagnoze takvih bolesti. Specifični kitovi obezbeđuju detekciju Borrelia, kao što je B. burgdorferi i na taj način potpomažu dijagnozu Lajmske bolesti.
[0115] U nekim otelotvorenjima, kitovi dalje sadrže uputstvo. Na primer, u nekim otelotvorenjima kitovi sadrže uputstvo koje pokazuje kako koristiti kit za detekciju antitela, kao što je antitelo za mikrobni antigen (na primer, Borrelia antigen, Ehrlichia antigen) ili za dijagnozu bolesti, kao što je bolest povezana sa mikrobima (na primer, Lajmska bolest, Erlihioze). U nekim otelotvorenjima, kitovi sadže uputstvo kako da se koristi grupa perlica, ploča ili sredstvo (na primer, sredstvo za lateralni protok) za detekciju antitela na mikrobni antigen kao što su Borrelia antigen ili Ehrlichia ili za dijagnozu bolesti povezane sa mikrobima, kao što su Lajmska bolest (Borreliosis) ili Erlihioze. U nekim otelotvorenjima, kitovi obezbeđuju uputstva za kobinaciju detektabilne Fc-vezujuće molekule, specifičnog antitela, detektabilnog antigen-konjugata ili konjugata antigeničnog peptida i test uzorka po bilo kom redosledu pre aplikacije na region za nanošenje uzorka sistema za detekciju (na primer, sredstvo za analizu lateralnog protoka, mikrotitarna ploča, analitički rotor). U nekim otelotvorenjima, kitovi sadrže uputstva za kombinaciju detektabilnog antigen-konjugata ili konjugata antigeničnog peptida sa test uzorkom tako da detektabilni antigen-konjugat ili konjugat antigeničnog peptida bude prisutan u određenom odnosu sa detektabilnom Fcvezujućom molekulom da se postigne željeni nivo pojačavanja signala. Kitovi mogu takođe da sadrže uputstva za optimizaciju pufera, optimizaciju odnosa različitih komponenti (na primer, Fc-vezujuće molekule, antigena ili antigeničnog peptida, test uzorka) i optimizaciju redosleda smeše i faze pojačavanja (na primer, mešanje svih komponenti pre pojačavanja, mešanje samo nekih komponenti a odvojeno dodavanje drugih).
[0116] Peptidi, kompozicije i sredstva koja uključuju peptide, kitovi i postupci otkriveni ovde nude brojne prednosti. Na primer, oni omogućavaju jednostavnu, jeftinu, brzu, tačnu i sigurnu detekciju antitela od interesa i dijagnostikovanje povezanih stanja bez značajnog prisustva lažnih pozitivnih ili prikrivenih signala. Omogućene su sigurne i tačne dijagnoze, čak i kad uzorci sadrže veoma male, čak i na drugi način ne-detektabilne vrednosti antitela.
PRIMERI
Primer 1: Protein A pojačava specifičnu detekciju antitela u ispitivanju specifičnog lateralnog protoka kod Lajmske bolesti
[0117] Testovi se izvode da se odredi uticaj dodavanja Protein A-CGC (konjugat koloidnog zlata) u ispitivanju specifičnog lateralnog protoka kod Lajmske bolesti, uz testiranje negativnog uzorka, uzorka pozitivnog na Lajmsku bolesti i Lajm-pozitivnog uzorka niske vrednosti. Cilj je bio da se uoči i klasifikuje efekat Protein A-CGC na potencijalni lažni signal(e) uz održavanje adekvatne tačnosti analize. Testirane su različite koncentracije Protein A-CGC u odnosu na Protein A-CGC negativnu kontrolu. Ispitivanje lateralnog protoka izvedeno u ovom testu je slično ispitivanju kako je ilustrovano na Slikama 2 i 3. Rezultati su pokazani u niže datoj Tabeli 1, kako je pokazano rezultatom reaktivnosti (skala od 0-5 gde veći broj pokazuje pozitivan rezultat).
Tabela 1: sažetak test rezultata (rezultati reaktivnosti)
[0118] Kako je pokazano u Tabeli 1, dodavanje Protein A-CGC pojačava signal u svim testiranim Lajm-pozitivnim uzorcima a posebno omogućava detekciju "niskih" pozitivnih uzoraka. Bez Protein A-CGC, "niski" pozitivni uzorci nisu detektabilni, što pokazuje rezultat reaktivnosti uporediv sa negativnim uzorcima (∼0.25 ili manju). Nasuprot tome, dodavanje Protein A-CGC u IX koncentracija i razblaženju 1:2 značajno pojačava signal, što pokazuje rezultat reaktivnosti od približno 3.5. Prema tome, Protein A-CGC značajno unapređuje detekciju ciljanih antitela u ovoj analizi specifičnog lateralnog protoka kod Lajmske bolesti.
Primer 2: Protein A povećava specifičnu detekciju antitela u analizi lateralnog protoka izvedenoj na stresnom biološkom uzorku
[0119] Testovi su izvedeni da se odredi uticaj dodavanja Protein A-CGC (konjugat koloidnog zlata) u prethodno stresnoj smeši konjugata 48BSA (albumin seruma govečeta)/DAG IgG. Smeša konjugata je prethodno pripremljena u inkubatoru na 35°C u toku 15 dana. U ovom eksperimentu su testirani i stresni i ne-stresni uzorci u prisustvu ili bez prisustva Protein A-CGC. Analiza lateralnog protoka izvedena u ovom testu je slična analizi ilustrovanoj na Slikama 2 i 3. Rezultati su pokazani u prethodno datoj Tabeli 1, kako je indikovano rezultatima reaktivnosti (skala od 0-5 gde veći broj označava pozitivan rezultat). Rezultati su pokazani u niže datoj Tabeli 2.
Tabela 2: sažetak test rezultata za stresne u odnosu na ne-stresne uzorke
[0120] Kako je pokazano u prethodnoj Tabeli 2, dodavanje Protein A-CGC u smešu za analizu lateralnog protoka pojačava signal na dan 15 stresnog (35°C) biološkog uzorka u odnosu na uzorak bez prisustva Protein A-CGC, kako je pokazano povećanjem rezultata reaktivnosti od 0.75 do 1.75. Na ne-stresni uzorak (2-8°C) na dan 15 takođe blago utiče dodavanje Protein A-CGC, kako je pokazano povećanjem rezultata reaktivnosti od 2.25 do 2.75. Takođe, na negativne uzorke ne utiče dodavanje Protein A-CGC.

Claims (17)

  1. Patentni zahtevi 1. Postupak za detekciju prisustva antitela u test uzorku, naznačen time što obuhvata: a) dovođenje u kontakt test uzorka sa prvim detektorom i drugim detektorom da se formira prvi kompleks koji obuhvata prvi detektor, drugi detektor i antitelo, pri čemu prvi detektor uključuje Fc-vezujuću molekulu konjugovanu sa prvim detektabilnim entitetom, ova Fc-vezujuća molekula je sposobna da se specifično veže za Fc region antitela a pri čemu drugi detektor uključuje antigen ili antigenični peptid konjugovan sa drugim detektabilnim entitetom, taj antigen ili antigenični peptid je sposoban da se specifično veže za promenljivi region antitela; (b) dovođenje u kontakt prvog kompleksa sa entitetom vezivanja imobilisanog na test regionu površine, pri čemu se entitet vezivanja vezuje za antitelo gde antitelo formira kompleks vezivanja sa prvim detektorom, drugim detektorom i antitetom vezivanja i na taj način imobiliše kompleks vezivanja na test regionu; i (c) detekciju prisustva signala iz prvog detektabilnog entiteta u test regionu, pri čemu je prisustvo signala indikativno za prisustvo antitela u test uzorku.
  2. 2. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što je prvi detektor imobilisan sa regionom konjugata površine a pri čemu se region konjugata ne preklapa sa test regionom površine.
  3. 3. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što je Fc-vezujuća molekula Protein A i/ili protein G.
  4. 4. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što je entitet vezivanja antigen ili antigenični peptid.
  5. 5. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 4, naznačen time što je navedeni antigen ili antigenični peptid iz organizma izabranog iz grupe koja sadrži srčani crv, Ehrlichia canis, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia ewingii, Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii, Borrelia garinii, Anaplasma phagocytophilum, Anaplasma platys, virus leukemije mačaka, parvovirus, soj A influence, soj B influence, virus influence ptica, sincitijalni respiratorni virus, Legionella, adenovirus, rotavirus, imunodeficijentni virus mačaka, humani imunodeficijentni virus i grupu A Streptococcus.
  6. 6. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što je prvi detektabilni entitet nanočestica metala, nanoljuspica metala, fluorofora ili obojena čestica lateksa.
  7. 7. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 6, naznačen time što je nanočestica metala ili nanoljuspica metala izabrana iz grupe koja se sastoji od čestica zlata, čestica srebra, čestica bakra, čestica platine, čestica kadmijuma, mešovitih čestica, šupljih sfera zlata, nanoljuspica silicijuma obloženih zlatom i ljuspica zlata obloženih silicijumom.
  8. 8. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što su prvi i drugi detektor imobilisani na regionu konjugata a pri čemu se region konjugata ne preklapa sa test regionom površine.
  9. 9. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 2 ili 8, naznačen time što region konjugata dalje obuhvata detektor kontrole.
  10. 10. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što su prvi i drugi detektabilni entiteti isti, opciono, pri čemu su prvi i drugi detektabilni entiteti nanočestice zlata.
  11. 11. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što je antigen ili antigenični peptid drugog detektora iz organizma izabranog iz grupe koja sadrži srčani crv, Ehrlichia canis, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia ewingii, Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii, Borrelia garinii, Anaplasma phagocytophilum, Anaplasma platys, virus leukemije mačaka, parvovirus, soj A influence, soj B influence, virus influence ptica, sincitijalni respiratorni virus, Legionella, adenovirus, rotavirus, imunodeficijentni virus mačaka, humani imunodeficijentni virus i grupa A Streptococcus.
  12. 12. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što su prvi detektor i drugi detektor prisutni u odnosu od približno 20:1 do približno 1:1. 4
  13. 13. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 12, naznačen time što prvi detektor obuhvata Fc-vezujuću molekulu konjugovanu sa prvim detektabilnim entitetom i pri čemu je Fcvezujuća molekula Protein A i/ili protein G.
  14. 14. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što je površina put protoka u sredstvu za analizu lateralnog protoka ili put protoka u analitičkom rotoru ili pri čemu je test uzorak telesna tečnost, ekstrakt telesnog organa, krv, serum ili plazma.
  15. 15. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 2, naznačen time što je test uzorak izmešan sa drugim detektorom i prvim detektorom po bilo kom redosledu ili uzastopno.
  16. 16. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što je drugi detektor Ehrlichia antigenični peptid ili njegova smeša konjugovana sa drugim detektabilnim entitetom.
  17. 17. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što su prvi detektor i drugi detektor prisutni u smeši u odnosu od približno 16:1 do približno 2:1, opciono približno 4:1.
    �
    Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5
RS20181486A 2011-11-21 2012-11-20 Imunološko ispitivanje pojačavanjem signala RS58168B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161562302P 2011-11-21 2011-11-21
PCT/US2012/066108 WO2013078227A1 (en) 2011-11-21 2012-11-20 Signal amplification in lateral flow and related immunoassays
EP12852350.3A EP2783216B1 (en) 2011-11-21 2012-11-20 Signal amplification immunoassays

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS58168B1 true RS58168B1 (sr) 2019-03-29

Family

ID=48427325

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20181486A RS58168B1 (sr) 2011-11-21 2012-11-20 Imunološko ispitivanje pojačavanjem signala

Country Status (20)

Country Link
US (4) US9034656B2 (sr)
EP (2) EP3489685B1 (sr)
JP (2) JP6267650B2 (sr)
KR (2) KR101975178B1 (sr)
CN (2) CN104105965B (sr)
AU (2) AU2012340722B2 (sr)
CA (1) CA2853812C (sr)
CY (1) CY1121291T1 (sr)
DK (2) DK3489685T3 (sr)
ES (2) ES2966741T3 (sr)
FI (1) FI3489685T3 (sr)
HR (1) HRP20182023T1 (sr)
HU (2) HUE041414T2 (sr)
LT (1) LT2783216T (sr)
PL (2) PL2783216T3 (sr)
PT (2) PT3489685T (sr)
RS (1) RS58168B1 (sr)
SI (1) SI2783216T1 (sr)
TR (1) TR201818881T4 (sr)
WO (1) WO2013078227A1 (sr)

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102375055A (zh) * 2010-08-19 2012-03-14 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种多重检测免疫层析芯片
FI3489685T3 (fi) 2011-11-21 2023-12-21 Zoetis Services Llc Signaalin vahvistaminen lateraalivirtaus- ja vastaavissa immunomäärityksissä
US10794904B2 (en) * 2013-03-15 2020-10-06 Nicoya Lifesciences Inc. Self-referencing sensor for chemical detection
ES2696757R1 (es) * 2014-05-30 2019-01-21 Csir Método y dispositivo para detección de bacterias enteras
TWI691716B (zh) 2014-08-13 2020-04-21 美商艾巴希斯公司 電漿特異性結合搭配物檢定中之信號放大
CN104330555B (zh) * 2014-10-22 2016-05-11 中国检验检疫科学研究院 检测伯氏疏螺旋体抗体的试纸、试纸制备方法及试剂盒
US20180003701A1 (en) * 2015-01-21 2018-01-04 Agency For Science. Techology And Research Immunoglobulin assays using nanoparticles
CN106290266A (zh) * 2015-05-13 2017-01-04 上海凯创生物技术有限公司 一种军团菌抗体近红外荧光检测试剂盒及其用途
WO2017015693A1 (en) * 2015-07-27 2017-02-02 Macquarie University Luminescent biomolecular complex and use thereof
CA2991532C (en) 2015-08-04 2024-03-05 Abaxis, Inc. Signal amplification in solution-based plasmonic specific-binding partner assays
EP3341738A4 (en) * 2015-08-24 2019-02-27 University of Cincinnati METHOD AND COMPOSITIONS FOR DETECTING FC RECEPTOR BINDING ACTIVITY OF ANTIBODIES
CN108351355A (zh) 2015-08-27 2018-07-31 奎多公司 具有两个流体流动路径用于检测和区分两个或多个分析物的免疫分析测试设备
HK1257991A1 (zh) 2015-10-15 2019-11-01 Inbios International Inc. 多重横向流动测量系统及其使用方法
CN108351357A (zh) * 2015-11-04 2018-07-31 哥伦比亚大学（纽约）理事会 血清抗FadA抗体的检测和相关诊断方法
USD800912S1 (en) 2016-06-17 2017-10-24 Abreos Biosciences, Inc. Point-of-care diagnostic device
WO2018031887A1 (en) 2016-08-12 2018-02-15 Abreos Biosciences, Inc. Detection and quantification of natalizumab
CN118275398A (zh) 2017-01-30 2024-07-02 硕腾服务有限责任公司 基于溶液的等离子体振子特异性结合配偶体测定和金属纳米结构
SG11201910173YA (en) 2017-05-11 2019-11-28 Univ King Abdullah Sci & Tech Device and method for microfluidics-based 3d bioprinting
KR102611274B1 (ko) 2017-05-11 2023-12-07 킹 압둘라 유니버시티 오브 사이언스 앤드 테크놀로지 조직 가공 및 바이오프린팅 시 사용하기 위한 겔을 형성할 수 있는 펩타이드
CN107271676A (zh) * 2017-07-14 2017-10-20 河南爱微迪生物技术有限公司 一种丙型肝炎病毒抗体唾液检测试剂盒
EP3665187A4 (en) * 2017-08-08 2021-04-21 OraSure Technologies, Inc. TEST PROCEDURES FOR IMPROVED ANALYTE DETECTION
CN107589264A (zh) * 2017-08-31 2018-01-16 重庆康巨全弘生物科技有限公司 定量检测人表皮生长因受体2（her2）的双光祖荧光免疫层析试剂盒及其制备方法
CN107389928A (zh) * 2017-08-31 2017-11-24 重庆康巨全弘生物科技有限公司 定量检测胃泌素释放肽前体(pro‑GRP)的双光子荧光免疫层析试剂盒及其制备方法
WO2019060885A1 (en) 2017-09-25 2019-03-28 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York SEROLOGICAL ASSAY FOR THE DETECTION OF EXPOSURE TO PATHOGENIC AGENTS CARRIED OUT BY TICKS AND INFECTION THEREOF
CN108490171A (zh) * 2018-03-02 2018-09-04 北京库尔科技有限公司 一种高灵敏唾液抗体检测试剂盒
KR20210021316A (ko) * 2018-06-18 2021-02-25 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니 측면 유동 분석기의 신호-증폭을 위한 시스템, 장치, 및 방법
US12591974B2 (en) * 2018-06-22 2026-03-31 Oova, Inc. Methods, devices, and systems for detecting analyte levels
CN109085360A (zh) * 2018-07-03 2018-12-25 广西医科大学 一套纳米生物靶向诊断反应器检测GP73、Nrp1、Frz肿瘤标志物方法及应用
JP7153494B2 (ja) * 2018-07-27 2022-10-14 シスメックス株式会社 生体粒子の測定方法、非特異シグナルの検出方法、生体粒子測定方法及び生体粒子を検出するための試薬キット
EP3857235B1 (en) * 2018-09-27 2025-09-10 Navrogen, Inc. Methods for measuring antibody dynamics
CN113454462A (zh) * 2019-02-20 2021-09-28 株式会社合伙企业 固相反应芯片和使用该固相反应芯片的测定方法
GB201912866D0 (en) * 2019-09-06 2019-10-23 Cambridge Molecular Diagnostics Ltd Miltiply labelled polymetric molecule for detection assays
WO2021216276A1 (en) * 2020-04-24 2021-10-28 Massachusetts Institute Of Technology Rapid, point of care detection of neutralizing antibodies against a virus
EP4138915A4 (en) 2020-04-24 2024-04-24 Siemens Healthcare Diagnostics, Inc. Compositions, kits, and methods for anti-microbial serology assays using anti-human immunoglobulin antibody
US11376588B2 (en) 2020-06-10 2022-07-05 Checkable Medical Incorporated In vitro diagnostic device
US12590121B2 (en) 2020-08-20 2026-03-31 King Abdullah University Of Science And Technology Peptide compound with repetitive sequences
US12109327B2 (en) 2020-08-20 2024-10-08 King Abdullah University Of Science And Technology Scaffolds from self-assembling tetrapeptides support 3D spreading, osteogenic differentiation and angiogenesis of mesenchymal stem cells
US11673324B2 (en) 2020-08-20 2023-06-13 King Abdullah University Of Science And Technology Nozzle for 3D bioprinting
WO2022061371A1 (en) * 2020-09-18 2022-03-24 Georgia Tech Research Corporation Methods for the diagnosis and detection of viral analytes
WO2022058944A1 (en) 2020-09-18 2022-03-24 Massachusetts Institute Of Technology A method of detecting an analyte and related systems
RU2748901C1 (ru) * 2020-09-30 2021-06-01 Федеральное государственное учреждение «Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук» (ФИЦ Биотехнологии РАН) Способ высокочувствительного иммунохроматографического анализа с двойной конкуренцией
US11994520B2 (en) 2020-11-23 2024-05-28 King Abdullah University Of Science And Technology Developing lateral flow immunochromatography (LFIA) peptide-based test strips for rapid detection of antigens and antibodies against specific antigens
EP4295155A1 (en) * 2021-02-17 2023-12-27 Eltek S.p.A. Kit and process for testing a state of immunization in a subject with respect to a pathogenic microorganism
JPWO2023008129A1 (sr) * 2021-07-30 2023-02-02
WO2023097083A1 (en) * 2021-11-29 2023-06-01 Bioventures, Llc Lateral flow assay device and method for rapid detection of antibodies against felis catus gammaherpesvirus 1 in domestic cat blood
CN114264820A (zh) * 2021-12-22 2022-04-01 广东医科大学附属医院 一种流感病毒a型和b型量子点联检试纸条及其制备方法和应用
CN114966031A (zh) * 2021-12-30 2022-08-30 上海云泽生物科技有限公司 一种胶乳增强免疫抑制法定量测定全血中雷帕霉素的试剂盒
EP4220166A1 (en) * 2022-02-01 2023-08-02 Universitat Rovira I Virgili (URV) In vitro method for detecting antibodies in a sample
US12416633B2 (en) 2022-12-27 2025-09-16 Princeton Biochemicals Method and system for exposing hidden or masked antigenic sites of viral specimens present in biosamples using a home-based COVID-19 rapid lateral flow immunoassay test
WO2025070448A1 (ja) * 2023-09-26 2025-04-03 富士フイルム株式会社 対称性ジメチルアルギニンを測定するためのキットおよび対称性ジメチルアルギニンの測定方法

Family Cites Families (90)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4704366A (en) 1984-06-22 1987-11-03 Bio-Rad Laboratories, Inc. Process for binding IgG to protein A
US5061381A (en) 1990-06-04 1991-10-29 Abaxis, Inc. Apparatus and method for separating cells from biological fluids
US5186844A (en) 1991-04-01 1993-02-16 Abaxis, Inc. Apparatus and method for continuous centrifugal blood cell separation
US5122284A (en) 1990-06-04 1992-06-16 Abaxis, Inc. Apparatus and method for optically analyzing biological fluids
US5413732A (en) 1991-08-19 1995-05-09 Abaxis, Inc. Reagent compositions for analytical testing
US5304348A (en) 1992-02-11 1994-04-19 Abaxis, Inc. Reagent container for analytical rotor
AU4047493A (en) 1992-04-02 1993-11-08 Abaxis, Inc. Analytical rotor with dye mixing chamber
JP3706214B2 (ja) * 1996-10-28 2005-10-12 株式会社三菱化学ヤトロン 免疫学的分析方法
US5939021A (en) 1997-01-23 1999-08-17 Hansen; W. Peter Homogeneous binding assay
EP0979409B1 (en) 1997-02-20 2006-12-27 The Regents of the University of California Plasmon resonant particles, methods and apparatus
US7144627B2 (en) 1997-03-12 2006-12-05 William Marsh Rice University Multi-layer nanoshells comprising a metallic or conducting shell
US6344272B1 (en) 1997-03-12 2002-02-05 Wm. Marsh Rice University Metal nanoshells
US6699724B1 (en) 1998-03-11 2004-03-02 Wm. Marsh Rice University Metal nanoshells for biosensing applications
JP3841559B2 (ja) * 1998-07-07 2006-11-01 日東電工株式会社 免疫学的検査方法および免疫学的検査キット
JP2000028612A (ja) * 1998-07-07 2000-01-28 Nitto Denko Corp 免疫学的検査方法および免疫学的検査キット
JP3298836B2 (ja) * 1998-11-12 2002-07-08 アークレイ株式会社 検体分析用具
US6579726B1 (en) 1999-07-30 2003-06-17 Surromed, Inc. Instruments, methods and reagents for surface plasmon resonance
JP2003514224A (ja) 1999-11-12 2003-04-15 サーロメッド・インコーポレーテッド 表面プラズモン共鳴を使用するバイオセンシング
WO2002079764A1 (en) 2001-01-26 2002-10-10 Nanoplex Technologies, Inc. Surface-enhanced spectroscopy-active sandwich nanoparticles
AU2002246587A1 (en) 2000-11-03 2002-08-06 Wm. Marsh Rice University Partial coverage metal nanoshells and method of making same
US7135054B2 (en) 2001-09-26 2006-11-14 Northwestern University Nanoprisms and method of making them
CN1417586A (zh) * 2001-11-05 2003-05-14 福州市迈新生物技术开发公司 一种免疫检测信号放大系统和它的制备方法及其应用
US6970239B2 (en) 2002-06-12 2005-11-29 Intel Corporation Metal coated nanocrystalline silicon as an active surface enhanced Raman spectroscopy (SERS) substrate
US7212692B2 (en) 2002-11-08 2007-05-01 Ming Yan Multiple array surface plasmon resonance biosensor
JP4787938B2 (ja) 2003-03-28 2011-10-05 ザ・プロウボウスト・フェロウズ・ファウンデーション・スカラーズ・アンド・ザ・アザー・メンバーズ・オブ・ボード・オブ・ザ・カレッジ・オブ・ザ・ホリー・アンド・アンデバイデッド・トリニティ・オブ・クイーン 銀ナノ粒子を用いた検体検出用センサ
KR100531760B1 (ko) 2003-04-28 2005-11-29 대한민국(관리부서 : 농림부 국립수의과학검역원) 구제역 바이러스의 감염여부를 진단하는 방법 및 이를구현하기 위한 진단키트
US20060240573A1 (en) 2003-07-29 2006-10-26 Lamdagen, Llc Optical system including nanostructures for biological or chemical sensing
GB0321937D0 (en) 2003-09-19 2003-10-22 Univ Liverpool Nanoparticle conjugates and method of production thereof
JP4109205B2 (ja) 2004-01-07 2008-07-02 富士フイルム株式会社 被検体検出方法
JP2008521007A (ja) 2004-11-17 2008-06-19 バイオヴェリス コーポレイション 電気化学発光測定法
CN1296492C (zh) 2004-11-18 2007-01-24 博奥生物有限公司 一种基于生物芯片检测能结合特异序列的核酸结合蛋白的方法
US7405054B1 (en) 2004-12-13 2008-07-29 University Of Washington Uw Tech Transfer - Invention Licensing Signal amplification method for surface plasmon resonance-based chemical detection
US8628727B2 (en) 2005-04-08 2014-01-14 Northwestern University Compositions, devices and methods for SERS and LSPR
US20060246513A1 (en) 2005-05-02 2006-11-02 Bohannon Robert C Method and device to detect the presence of analytes in a sample
CA2655079C (en) 2005-06-15 2013-12-10 University Of Maryland Biotechnology Institute Bioassays using plasmonic scattering from noble metal nanostructures
US20070092978A1 (en) 2005-10-20 2007-04-26 Ronald Mink Target ligand detection
JP5442179B2 (ja) 2005-10-21 2014-03-12 アルフレッサファーマ株式会社 反応性物質が結合した微小粒子の沈降抑制方法および該微小粒子含有試薬
CN101365724A (zh) 2005-10-25 2009-02-11 路易斯安那科技大学研究基金会 包含多肽的多层膜、涂层和微粒
CN101360997B (zh) * 2005-11-18 2013-05-01 美国政府健康及人类服务部，疾病控制和预防中心 改性心磷脂及其应用
US7790066B2 (en) 2006-03-03 2010-09-07 William Marsh Rice University Nanorice particles: hybrid plasmonic nanostructures
JP4810304B2 (ja) 2006-05-12 2011-11-09 キヤノン株式会社 化学センサ素子及びその製造方法
US8426152B2 (en) 2007-01-03 2013-04-23 Lamdagen Corporation Enzymatic assay for LSPR
WO2008116093A2 (en) 2007-03-20 2008-09-25 Becton, Dickinson And Company Assays using surface-enhanced raman spectroscopy (sers)-active particles
JP2009150708A (ja) 2007-12-19 2009-07-09 Canon Inc 標的物質の検出方法及び検査キット
EP2229251B1 (en) 2007-12-21 2013-03-20 The Provost, Fellows, Foundation Scholars, & the other members of Board, of the College of the Holy & Undiv. Trinity of Queen Elizabeth near Dublin A process for preparing nanoparticles
WO2009117510A2 (en) * 2008-03-20 2009-09-24 Abaxis, Inc. Multi-wavelength analyses of sol-particle specific binding assays
WO2010006201A2 (en) 2008-07-10 2010-01-14 Abaxis, Inc. Methods of reducing non-specific interaction in metal nanoparticle assays
WO2010065781A2 (en) 2008-12-03 2010-06-10 Abaxis, Inc. Lateral flow strip assay with immobilized conjugate
US8313915B2 (en) * 2009-01-21 2012-11-20 Gundersen Lutheran Medical Foundation, Inc. Early detection of canine lyme disease by specific peptides and antibodies
WO2010091293A1 (en) 2009-02-06 2010-08-12 The Regents Of The University Of California Plasmonic system for detecting binding of biological molecules
PL2401392T3 (pl) 2009-02-27 2017-08-31 Beckman Coulter, Inc. Homogeniczne oznaczenia fazy roztworu
WO2010116345A1 (en) 2009-04-08 2010-10-14 National University Of Ireland, Galway Silver nanoplates
JP5563789B2 (ja) 2009-06-11 2014-07-30 富士フイルム株式会社 検出方法
US20110095636A1 (en) 2009-10-27 2011-04-28 Chiu-Fa Lee Magnetic force based automatic power generation device
EP2501719B1 (en) * 2009-11-17 2015-11-04 Abaxis, Inc. Peptides and methods for the detection of lyme disease antibodies
KR101892182B1 (ko) * 2009-11-20 2018-08-24 아박시스, 인크. 에를리키아 항체의 검출을 위한 펩티드, 장치 및 방법
WO2011065747A2 (ko) 2009-11-24 2011-06-03 한국생명공학연구원 나노입자를 이용한 미생물의 고속 검출방법
US9308582B2 (en) 2009-12-24 2016-04-12 Yi Sun Solution stable and chemically reactive metallic nanoparticles
EP2354792A1 (en) * 2010-02-08 2011-08-10 Biomonitor A/S Method for detecting anti-drug antibodies
AU2011248607B2 (en) 2010-04-27 2015-02-05 Ventana Medical Systems, Inc. Antibody-nanoparticle conjugates and methods for making and using such conjugates
KR20130095175A (ko) 2010-05-28 2013-08-27 고쿠리츠다이가쿠호진 토쿄고교 다이가꾸 금속 미립자 복합체 및 그 제조 방법
US9797842B2 (en) 2010-12-08 2017-10-24 Osaka Prefecture University Public Corporation Device and method utilizing a metallic nanoparticle assembly structure for detecting a target substance
CN102103145B (zh) * 2011-02-24 2013-01-16 南京基蛋生物科技有限公司 一种双放大系统的胶体金试纸条及其制备方法
US8697129B2 (en) 2011-03-02 2014-04-15 Imra America, Inc. Stable colloidal gold nanoparticles with controllable surface modification and functionalization
US8784895B2 (en) 2011-03-15 2014-07-22 Northwestern University Multifunctional metal nanoparticles having a polydopamine-based surface and methods of making and using the same
US20130230717A1 (en) 2011-09-02 2013-09-05 Washington University In St. Louis Copper nanostructures and methods for their preparation
US8758772B2 (en) * 2011-11-04 2014-06-24 Abaxis, Inc. Peptides and methods for the detection of lyme disease antibodies
FI3489685T3 (fi) * 2011-11-21 2023-12-21 Zoetis Services Llc Signaalin vahvistaminen lateraalivirtaus- ja vastaavissa immunomäärityksissä
US9823246B2 (en) 2011-12-28 2017-11-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescence enhancing plasmonic nanoscopic gold films and assays based thereon
WO2013109832A1 (en) 2012-01-20 2013-07-25 Imra America, Inc. Stable colloidal suspensions of gold nanoconjugates and the method for preparing the same
EP2810067A4 (en) 2012-01-31 2015-12-09 American University Of Cairo Auc DIRECT DETECTION OF ILLEGAL BIOMARKERS IN CLINICAL SAMPLES USING CATIONIC NANOPARTICLE BASED ASSAYS AND VERSATILE AND GREEN METHODS FOR SYNTHESIS FROM ANISOTROPIC SILVER NANOSTRUCTURES
EP2625966A1 (en) 2012-02-13 2013-08-14 Bionanoplus, S.L. Nanoparticles comprising a vegetable hydrophobic protein and a water miscible non-volatile organic solvent and uses thereof
TWI435843B (zh) 2012-04-27 2014-05-01 Univ Nat Taiwan 奈米顆粒的製造方法
TW201408690A (zh) 2012-05-05 2014-03-01 Academia Sinica 二氨基苯甲酸或鄰苯二胺共軛的胜肽作為功能性的醣類標幟劑
CN105051541B (zh) 2012-10-11 2017-07-04 爱贝斯股份有限公司 用于检测埃里希体属抗体的肽、装置和方法
AU2013329450B2 (en) 2012-10-11 2017-06-22 Coronado Aesthetics, Llc Silver nanoplate compositions and methods
US9441301B2 (en) 2012-12-06 2016-09-13 Nanyang Technological University Method for forming a bimetallic core-shell nanostructure
MX362075B (es) 2013-03-14 2019-01-07 Abbott Lab Ensayo de combinación de antígeno-anticuerpo del virus de la hepatitis c (vhc) y métodos y composiciones para usarlo.
JP2016512241A (ja) 2013-03-14 2016-04-25 アボット・ラボラトリーズＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 改良された抗体検出のためのｈｃｖｎｓ３組換え抗原およびこの突然変異体
WO2014197222A1 (en) 2013-06-05 2014-12-11 Purdue Research Foundation Titanium nitride plasmonic nanoparticles for clinical therapeutic applications
EP3028043A4 (en) 2013-07-30 2017-04-19 Bio-rad Laboratories, Inc. Multiplex blocker beads for immunoassays
KR20160138059A (ko) 2014-02-26 2016-12-02 람다젠 코퍼레이션 향상된 검정 감도를 위한 디지털 lspr
WO2015160923A1 (en) 2014-04-15 2015-10-22 Rutgers, The State University Of New Jersey Gold nanostar substrates for sers sensing in the femtomolar regime
WO2016007942A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 Northwestern University Synthesis of uniform anisotropic nanoparticles
US20160202251A1 (en) 2014-08-01 2016-07-14 Beacle Inc. Virus-like particle for use in immunoassay, blocking agent for use in the immunoassay, and kit comprising the virus-like particle and the blocking agent
TWI691716B (zh) 2014-08-13 2020-04-21 美商艾巴希斯公司 電漿特異性結合搭配物檢定中之信號放大
US11300519B2 (en) 2015-02-19 2022-04-12 Ionica Sciences Reagents and methods for detecting infectious diseases
WO2016170183A1 (en) 2015-04-24 2016-10-27 Pharmadiagnostics Nv Improved method of measuring an interaction between molecules
CA2991532C (en) 2015-08-04 2024-03-05 Abaxis, Inc. Signal amplification in solution-based plasmonic specific-binding partner assays
CN118275398A (zh) 2017-01-30 2024-07-02 硕腾服务有限责任公司 基于溶液的等离子体振子特异性结合配偶体测定和金属纳米结构

Also Published As

Publication number Publication date
CN106124757A (zh) 2016-11-16
CA2853812C (en) 2021-03-16
AU2012340722B2 (en) 2018-03-29
LT2783216T (lt) 2019-01-25
EP3489685A1 (en) 2019-05-29
DK2783216T3 (da) 2019-01-02
KR102065387B1 (ko) 2020-01-13
SI2783216T1 (sl) 2019-01-31
EP2783216B1 (en) 2018-09-26
KR20190049898A (ko) 2019-05-09
US10281465B2 (en) 2019-05-07
HUE064603T2 (hu) 2024-04-28
CY1121291T1 (el) 2020-05-29
DK3489685T3 (da) 2023-12-04
AU2018204793B2 (en) 2020-11-26
CA2853812A1 (en) 2013-05-30
PT3489685T (pt) 2024-01-04
ES2702033T3 (es) 2019-02-27
US9034656B2 (en) 2015-05-19
FI3489685T3 (fi) 2023-12-21
KR20140098750A (ko) 2014-08-08
HUE041414T2 (hu) 2019-05-28
US20180156790A1 (en) 2018-06-07
US11255854B2 (en) 2022-02-22
TR201818881T4 (tr) 2019-01-21
CN106124757B (zh) 2018-06-01
US20150293088A1 (en) 2015-10-15
CN104105965A (zh) 2014-10-15
JP6742978B2 (ja) 2020-08-19
PL3489685T3 (pl) 2024-03-18
HRP20182023T1 (hr) 2019-01-25
PT2783216T (pt) 2018-12-19
PL2783216T3 (pl) 2019-03-29
JP2018072354A (ja) 2018-05-10
EP3489685B1 (en) 2023-11-01
JP6267650B2 (ja) 2018-01-24
JP2015500459A (ja) 2015-01-05
AU2018204793A1 (en) 2018-07-19
CN104105965B (zh) 2016-07-06
WO2013078227A1 (en) 2013-05-30
AU2012340722A1 (en) 2014-05-22
US9921218B2 (en) 2018-03-20
ES2966741T3 (es) 2024-04-24
US20190219572A1 (en) 2019-07-18
US20130130404A1 (en) 2013-05-23
EP2783216A1 (en) 2014-10-01
KR101975178B1 (ko) 2019-05-07
EP2783216A4 (en) 2015-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11255854B2 (en) Signal amplification in lateral flow and related immunoassays
US11204351B2 (en) Compositions and methods for identifying Ehrlichia species
HK40006500A (en) Signal amplification in lateral flow and related immunoassays
HK40006500B (en) Signal amplification in lateral flow and related immunoassays
NZ724911B2 (en) Compositions and methods for identifying ehrlichia species