RS58310B1 - Anti-angptl3 antitela i njihove upotrebe - Google Patents

Anti-angptl3 antitela i njihove upotrebe

Info

Publication number
RS58310B1
RS58310B1 RS20181508A RSP20181508A RS58310B1 RS 58310 B1 RS58310 B1 RS 58310B1 RS 20181508 A RS20181508 A RS 20181508A RS P20181508 A RSP20181508 A RS P20181508A RS 58310 B1 RS58310 B1 RS 58310B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
fragment
hangptl3
angptl3
seq
Prior art date
Application number
RS20181508A
Other languages
English (en)
Inventor
Mark W Sleeman
Viktoria Gusarova
Andrew J Murphy
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=46298728&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS58310(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS58310B1 publication Critical patent/RS58310B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/455—Nicotinic acids, e.g. niacin; Derivatives thereof, e.g. esters, amides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na humana antitela i fragmente humanih antiela za vezivanje antigena koji specifično vezuju humani angiopoietinu sličan protein 3 (hANGPTL3), i terapijske postupke upotrebe tih antitela.
STANJE TEHNIKE
[0002] Gen angiopoietina sličan proteinu 3 (ANGPTL3) je identifikovan iz EST baze podataka na osnovu sekvenci signala i amfipatskih spirala, i ANGPTL3 kDNK pune dužine je naknadno izolovana iz biblioteke kDNK jetre/slezine humanog fetusa (Conklin et al., 1999, Genomics 62: 477-482). Izvedeni 460-aminokiselinski hANGPTL3 protein deli identičnost sekvence amino kiseline od 76% sa ANGPTL3 miša i ima karakterističnu strukturu angiopoietina; t.j., peptidni signal, produženi domen spirale predviđen da formira dimerne ili trimerne spiralne zavojnice, kratki linker peptid, i globularni domen homologije fibrinogena (FD) (Conklin et al., 1999, supra). ANGPTL3 obuhvata 4 sačuvana ostatka cisteina implicirana u unutarmolekularnim disulfidnim vezama unutar FD; međutim, ANGPTL3 ne obuhvata niti dva dodatna cisteina niti karakteristični motiv vezivanja kalcijuma koji je pronađen u FD angiopoietina (ANG; t.j., ANG1, ANG2 i ANG4) (Conklin et al., 1999, supra), koji su faktori rasta proteina koji pospešuju angiogenezu. Pored toga, za razliku ANG, ANGPTL3 se ne vezuje na Tie2; međutim, može takođe da indukuje angiogenezu vezivanjem na integrin αvβ3preko njegovog C-terminala FD (Camenisch et al., 2002, J Biol Chem 277:17281-17290).
[0003] Dobijeno je dosta in vivo podataka iz modela uzgojenog KK miša, koji je umerenno debeo sa abnormalno visokim nivoima insulina plazme, glukoze, i lipida, nalik na tip 2 dijabetesa (diabetes mellitus) kod ljudi (Koishi et al., 2002, Nature Genetics 30:151-157). Jedan pod soj miša, za KK/San, međutim, je utvrđeno da ispoljava nenormalno niske nivoe lipida u plazmi krvi (hipolipidemija), koji su nasleđeni kao Mendelian recesivni. Mesta su mapirana na hromozom 4 i konačno identifikovana kao gen koji kodira ANGPTL3, koji je sadržao umetak 4-bp sekvence nukleotida u eksonu 6 (Koishi et al., 2002, supra). Nasuprot tome, nivoi lipida u plazmi posle adenovirusom posredovanog prenosa ANGPTL3 gena, i posle isporuke rekombinantnog humanog ANGPTL3 kod KK/San miševa. Ovo dejstvo nije posredovano promenama u genima uključenim u sintezu holesterola, izbacivanje lipoproteina ili NEFA oksidaciju (Koishi et al., 2002, supra). Pored toga, in vitro analiza rekombinantnog proteina je pokazala da ANGPTL3 direktno inhibira aktivnost lipaze lipoproteina. (LPL), što ukazuje da je modulator metabolizma lipida taj koji reguliše nivoe triglicerida lipoproteinom male gustine (VLDL) inhibiranjem aktivnosti lipaze LPL (Shimizugawa et al., 2002, J Biol Chem 277(37):33742-33748). Pokazalo se da domen spiralne zavojnice N terminala posebno ostaci 17-165 regiona N terminala, a ne FD C terminala, od ANGPTL3, neophodan za njegovu aktivnost povećavanja nivoa triglicerida u plazmi krvi kod miševa (Ono et al., 2003, J Biol Chem 278:41804-41809).
[0004] Amino kiselina i sekvence nukleotida humanog ANGPTL3 su prikazane u SEK ID BR:161 i 162, prema opisanom redosledu. Antitela na ANGPTL3 su opisana u, na primer, WO2008/073300 i US 7,935,796.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0005] U prvom varijantnom rešenju, ovaj pronalazak obezbeđuje potpuno humana monoklonalna antitela (mAb) i njihove fragmente vezivanja antigena kako je definisano u patentnim zahtevima koji specifično vezuju i neutralizuju, inhibiraju, blokiraju, uništavaju, smanjuju ili ometaju, barem jednu aktivnost ANGTPL3, specifično, humani ANGPTL3 (SEK ID BR:161). Aktivnost ANGPTL3 koju je moguće neutralizovati, inhibirati, blokirati, uništiti, smanjiti ili ometati, antitelima ili njihovim fragmentima iz ovog pronalaska, obuhvata, ali ne kao ograničenje, inhibiranje LPL aktivnosti, indukovanje angiogeneze, i slično. Antitelo ili njegov fragment može neutralisati, inhibirati, blokirati, uništiti, smanjiti ili ometati, aktivnost hANGPTL3 vezivanjem na epitop hANGPTL3 koji je direktno uključen u ciljanu aktivnost hANGPTL3. Antitelo ili njegov fragment mogu takođe neutralisati, inhibirati, blokirati, uništiti, smanjiti ili ometati, aktivnost hANGPTL3 vezivanjem na epitop hANGPTL3 koji nije direktno uključen u ciljanu aktivnost hANGPTL3, ali antitelo ili fragment koji se na njega vezuje sterno ili konformaciono suzbija, blokira, uništava, smanjuje ili ometa, ciljanu aktivnost hANGPTL3. Antitelo ili njegov fragment iz ovog opisa može da se veže na epitop hANGPTL3 koji nije direktno uključen u ciljanu aktivnost (npr., inhibiranjem LPL aktivnosti, indukovanjem angiogeneze, i sličnog) koja dolazi od hANGPTL3 (t.j., neblokirajućeg antitela), ali antitelo ili fragment vezivanja na to antitelo daje kao rezultat pospešeno izbacivanje hANGPTL3 iz krvotoka, u poređenju sa izbacivanjem hANGPTL3 u odsustvu antitela ili njegovog fragmenta, čime se indiretkno inhibira, blokira, uništava, smanjuje ili ometa, aktivnost hANGPTL3. Izbacivanje hANGPTL3 iz krvotoka može da bude posebno pospešeno kombinovanjem dva ili više različitih neblokirajućih antitela koja se ne takmiče međusobno za specifično vezivanje na hANGPTL3.
[0006] Antitela (Abs) mogu biti pune dužine (na primer, IgG1 ili IgG4 antitelo) ili mogu obuhvatiti samo deo koji vezuje antigen (na primer, Fab, F(ab’)2 ili scFv fragment), i mogu biti modifikovana da utiču na funkcionalnost, npr., da eliminišu funkcije zaostalog efektora (Reddy et al., 2000, J. Immunol.164:1925-1933).
[0007] U jednom varijantnom rešenju, opis obuhvata antitelo ili fragment vezivanja antigena antitela koje obuhvata promenljivi region teškog lanca (HCVR) izabran iz grupe koja obuhvata SEK ID BR:2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146 i 180, ili njenu pretežno sličnu sekvencu koja ima barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnu sekvencu. U drugom varijantnom rešenju, antitelo ili njegov fragment vezivanja antitela obuhvata HCVR koja ima sekvencu amino kiseline izabranu iz grupe koja obuhvata SEK ID BR:2, 18, 34, 66, 82, 114, i 180. U ovom pronalasku, antitelo ili njegov fragment vezivanja može da obuhvati HCVR koja ima sekvencu amino kiseline SEK ID BR:66.
[0008] U jednom varijantnom rešenju, antitelo ili fragment vezivanja antigena nekog antitela obuhvata promenljivi region lakog lanca (LCVR) izabran iz grupe koja obuhvata SEK ID BR:10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154 i 188, ili njenu pretežno sličnu sekvencu koja ima barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnu sekvencu. U drugom varijantnom rešenju, antitelo ili deo koji vezuje antigen nekog antitela obuhvata LCVR koji ima sekvencu amino kiseline izabranu iz grupe koja obuhvata SEK ID BR:10, 26, 42, 74, 90, 122 i 188. U ovom pronalasku, antitelo ili deo koji vezuje antigen nekog antitela može obuhvatiti LCVR koji ima sekvencu amino kiseline iz SEK ID BR: 74.
[0009] U drugim varijantnim rešenjima, antitelo ili njegov fragment obuhvata HCVR i LCVR par sekvence (HCVR/LCVR) izabran iz grupe koja obuhvata SEK ID BR:2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154 i 180/188. U jednom varijantom rešenju, antitelo ili njegov fragment obuhvata HCVR i LCVR par sekvence izabran iz grupe koja obuhvata SEK ID BR:2/10, 18/26, 34/42, 66/74, 82/90, 114/122 i 180/188. U ovom pronalasku, antitelo ili njegov fragment može obuhvatiti HCVR i LCVR par sekvence iz SEK ID BR:66/74.
[0010] U drugom varijantnom rešenju, ovaj opis karakteriše antitelo ili fragment koji vezuje antigen antitela koje obuhvata region 3 određivanja komplementarnosti teškog lanca (HCDR3) sekvence amino kiseline izabrane iz grupe koja obuhvvata SEK ID BR:8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152 i 186, ili njenu pretežno sličnu sekvencu koja ima barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnost sekvence; i CDR3 lakog lanca (LCDR3) sekvence amino kiseline izabrane iz grupe koja obuhvata SEK ID BR:16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160 i 194, ili njene pretežno slične sekvence koje imaju barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnost sekvence. U jednom varijantnom rešenju, antitelo ili njegov fragment obuhvata HCDR3/LCDR3 par sekvence amino kiseline koja obuhvata SEK ID BR:8/16, 24/32, 40/48, 56/64, 72/80, 88/96, 104/112, 120/128, 136/144, 152/160 ili186/194. U drugom varijantnom rešenju, antitelo ili njegov fragment obuhvata HCDR3/LCDR3 par sekvence amino kiseline koja obuhvata SEK ID BR:8/16, 24/32, 40/48, 72/80, 88/96, 120/128 ili 186/194. U ovom pronalasku, antitelo ili njegov fragment može obuhvatiti HCDR3/LCDR3 par sekvence amino kiseline koja obuhvata SEK ID BR:72/80.
[0011] U još jednom varijantnom rešenju ovog opisa, antitelo ili njegov vragment još obuhvata teški CDR1 teškog lanca sekvence amino kiseline (HCDR1) izabrane iz grupe koja obuhvata SEK ID BR:4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148 i 182, ili njoj pretežno sličnu sekvencu koja ima barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnost sekvence; i CDR2 teškog lanca (HCDR2) sekvence amino kiseline izabrane iz grupe koja obuhvata SEK ID BR:6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150 i 184, ili njoj pretežno sličnu sekvencu koja ima barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnost sekvence; i opciono još obuhvata CDR1 lakog lanca (LCDR1) sekvence amino kiseline izabrane iz grupe koja obuhvata SEK ID BR:12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156 i 190, ili njoj pretežno sličnu sekvencu koja ima barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnost sekvence; i /ili CDR2 lakog lanca (LCDR2) sekvence amino kiseline izabrane iz grupe koja obuhvata SEK ID BR:14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158 i 192, ili njoj pretežno sličnu sekvencu koja ima barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnost sekvence.
[0012] Alternativno, ovaj opis karakteriše antitelo ili fragment koji vezuje antigen koje obuhvata kombinaciju HCDR1/HCDR2/HCDR3 izabranu iz grupe koja obuhvata SEK ID BR:4/6/8, 20/22/24, 36/38/40, 52/54/56, 68/70/72, 84/86/88, 100/102/104, 116/118/120, 132/134/136, 148/150/152 i 182/184/186; i/ili kombinacija LCDR1/LCDR2/LCDR3 izabrana iz grupe koja obuhvata SEK ID BR:12/14/16, 28/30/32, 44/46/48, 60/62/64, 76/78/80, 92/94/96, 108/110/112, 124/126/128, 140/142/144, 156/158/160 i 190/192/194. U jednom varijantnom rešenju, CDR teškog i lakog lanca sekvenci amino kiseline obuhvata kombinaciju sekvence CDR izabranu iz grupe koja obuhvata SEK ID BR:4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 36/38/40/44/46/48, 52/54/56/60/62/64, 68/70/72/76/78/80, 84/86/88/92/94/96, 100/102/104/108/110/112, 116/118/120/124/126/128, 132/134/136/140/142/144, 148/150/152/156/158/160 i 182/184/186/190/192/194. U jednom varijantnom rešenju, CDR teškog i lakog lanca sekvenci amino kiseline obuhvata kombinaciju sekvence CDR iz SEK ID BR: 4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 36/38/40/44/46/48, 68/70/72/76/78/80, 84/86/88/92/94/96, 116/118/120/124/126/128 ili 182/184/186/190/192/194. U jednom izvođenju, CDR teškog i lakog lanca sekvenci amino kiseline obuhvata kombinaciju sekvence CDR iz SEK ID BR:68/70/72/76/78/80.
[0013] U srodnom varijantnom rešenju, opis obuhvata antitelo ili fragment koji vezuje antigen od antitela koje specifično veže hANGPTL3, pri čemu to antitelo ili njegov fragment obuhvata domene CDR teškog i lakog lanca sadržane unutar HCVR/LCVR parova izabranih iz grupe koja obuhvata SEK ID BR:2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154 i 180/188. Postupci i tehnike za identifikovanje CDR unutar sekvenci amino kiseline HCVR i LCVR su poznati u ovoj oblasti i moguće ih je primeniti da bi se utvrdili CDR unutar specifičnih sekvenci amino kiseline HCVR i/ili LCVR koje su ovde opisane. Uobičajene definicije koje je moguće primeniti da bi se utvrdile granice CDR obuhvvataju Kabat definiciju, the Chothia definiciju, i AbM definiciju. U opštem smislu, Kabat definicija se bazira na promenljivosti sekvence, Chothia definicija se bazira na lokaciji regiona strukturnih petlji i AbM definicija je kompromis između Kabat i Chothia pristupa. Videti, npr., Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); and Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989). Javne baze podataka su takođe dostupne za identifikovanje CDR sekvenci unutar nekog antitela. U jednom varijantnom rešenju, antitelo ili njegov fragment obuhvvata sekvence CDR sadržane unutar HCVR i LCVR para SEK ID BR: 2/10, 18/26, 34/42, 66/74, 82/90, 114/122 ili 180/188. U jednom izvođenju, to atntitelo ili njegov fragment obuhvata CDR sekvence sadržane unutar HCVR i LCVR para SEK ID BR:66/74, pri čemu su CDR određeni Kabat definicijom, Chothia definicijom ili AbM definicijom.
[0014] U jednom varijantnom rešenju, taj opis obezbeđuje antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se takmiči za specifično vezivanje na hANGPTL3 sa antitelom ili fragmentom koji vezuje antigen koji obuhvata sekvence CDR teškog i lakog lanca sadržane u HCVR/LCVR paru sekvenci iz SEK ID BR:2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154 ili 180/188. U jednom varijantnom rešenju, antitelo ili fragment koji vezuje antigen se takmiči za specifično vezivanje na hANGPTL3 sa antitelom ili njegovim fragmentom koji obuhvata HCVR/LCVR par sekvence iz SEK ID BR:66/74. U drugom varijantnom rešenju, antitelo ili fragment koji vezuje antigen se takmiči za specifično vezivanje na hANGPTL3 sa antitelom ili njegovim fragmentom koje obuhvata kombinaciju sekvence CDR teškog i lakog lanca izabranu iz grupe koja obuhvata od 4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 36/38/40/44/46/48, 52/54/56/60/62/64, 68/70/72/76/78/80, 84/86/88/92/94/96, 100/102/104/108/110/112, 116/118/120/124/126/128, 132/134/136/140/142/144, 148/150/152/156/158/160 i 182/184/186/190/192/194. U jednom varijantnom rešenju antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen se takmiči za specifično vezivanje na hANGPTL3 sa antitelom ili njegovim fragmentom koji obuhvata kombinaciju sekvence CDR teškog i lakog lanca iz SEK ID BR:68/70/72/76/78/80.
[0015] U još jednom srodnom varijantnom rešenju, taj opis obezbeđuje antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji veže isti epitop na hANGPTL3 koji prepoznaje antitelo ili njegov fragment koji obuhvata sekvence CDR teškog i lakog lanca iz para ekvenci HCVR/LCVR iz SEK ID BR:2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154 ili 180/188. U jednom varijantnom rešenju, antitelo ili fragment koji vezuje antigen veže isti epitop na hANGPTL3 kao što je onaj koji je prepoznalo antitelo ili njegov fragment koji obuhvata par sekvence HCVR/LCVR iz SEK ID BR:66/74. U jednom varijantnom rešenju, to antitelo ili njegov fragment veže isti epitop na hANGPTL3 koji je prepoznat pomoću antitela ili njegovog fragmenta koji obuhvata kombinaciju sekvence CDR teškog i lakog lanca izabranu iz grupe koja obuhvata 4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 36/38/40/44/46/48, 52/54/56/60/62/64, 68/70/72/76/78/80, 84/86/88/92/94/96, 100/102/104/108/110/112,
116/118/120/124/126/128, 132/134/136/140/142/144, 148/150/152/156/158/160 i 182/184/186/190/192/194. U jednom varijantnom rešenju, takav epitop prepoznat pomoću antitela ili njegovog fragmenta obuhvata kombinaciju sekvence CDR teškog i lakog lanca iz SEK ID BR:68/70/72/76/78/80.
[0016] Ovaj opis karakteriše izolovano anti-hANGPTL3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se veže na epitop smešten unutar regiona spiralne zavojnice N terminala na ostacima 17 do 209 od SEK ID BR:161 i neutralizuje, inhibira, uništava, smanjuje ili interferira sa, barem jednom aktivnošću hANGPTL3. Ovaj opis obezbeđuje izolovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen antitela koje se specifično veže na epitop smešten unutar regiona spiralne zavojnice N terminala od hANGPTL3 (SEK ID BR:161) i neutralizuje, inhibira, uništava, smanjuje ili interferira sa, barem jednom aktivnošću hANGPTL3, čije antitelo ili njegov fragment ne veže na ANGPTL3 peptid iz SEK ID BR:170 (odgovara ostacima Glu32 na Leu57 od hANGPTL3 iz SEK ID BR:161). Antitela ili njihovi fragmenti iz ovog opisa se specifično vežu na epitop unutar ostataka 17 do 200, 17 do 100, 17 do 70, 17 do 65, 17 do 60, 17 do 57, ili 17 do 50, od hANGPTL3 (SEK ID BR:161), opciono uz uslov da se antitelo ili njegov fragment ne vezuje na ANGPTL3 peptid iz SEK ID BR:170. U drugom varijantnom rešenju, to antitelo ili njegov fragment se specifično veže na epitop unutar ostataka 40 do 200, 40 do 100, 40 do 70, 50 do 200, 50 do 100, 50 do 70, 58 do 200, 58 do 100, 58 do 70, 58 do 68, ili 61 do 66, od hANGPTL3 (SEK ID BR:161), opciono uz uslov da se to antitelo ili njegov fragment ne vezuje na ANGPTL3 peptid iz SEK ID BR:170. Kod nekih varijantnih rešenja, antitelo ili njegov fragment vezuje epitop koji može obuhvatiti više od jednog od brojnih epitopa ili ostataka unutar regiona spiralne zavojnice N terminala hANGPTL3, opciono uz uslov da se to antitelo ili njegov fragment ne vezuje na ANGPTL3 peptid iz SEK ID BR:170.
[0017] U još jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji kodiraju anti-ANGPTL3 antitela ili njihove fragmente iz ovog pronalaska. Rekombinantni vektori ekspresije koji nose nukleinske kiseline iz ovog pronalaska, i ćelije domaćina, npr. bakterijske ćelije, kao što je E. coli, ili ćelije sisara, kao što je CHO ćelije, u koje su takvi vektori uvedeni, su takođe obuhvaćeni, ovim pronalaskom, kao postupci za proizvodnju antitela kultivisanjem ćelija domaćina pod uslovima koji dozvoljavaju proizvodnju antitela, i oporavljanje proizvedenih antitela.
[0018] U jednom varijantnom rešenju, ovaj opis obezbeđuje antitelo ili njegov fragment koji obuhvata HCVR koji je kodiran pomoću sekvence nukleinske kiseline izabrane iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145 i 179, ili pretežno identičnu sekvencu koja joj je barem 90%, barem 95%, barem 98%, ili barem 99% homologna. U drugom varijantnom rešenju, antitelo ili njegov fragment obuhvata HCVR kodiran pomoću sekvence nukleinske kiseline iz SEK ID BR:1, 17, 33, 65, 81, 113 ili 179. U jednom izvođenju, antitelo ili njegov fragment obuhvata HCVR kodiran pomoću sekvence nukleinske kiseline iz SEK ID BR:65.
[0019] U jednom varijantnom rešenju ovog opisa, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata LCVR koji je kodiran pomoću sekvence nukleinske kiseline izabrane iz grupe koja obuhvvata SEK ID BR: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153 i 187, ili pretežno identičnu sekvencu koja joj je barem 90%, barem 95%, barem 98%, ili barem 99% homologna. U drugom varijantnom rešenju ovog opisa, antitelo ili njegov fragment obuhvata LCVR kodiran pomoću sekvence nukleinske kiseline iz SEK ID BR:9, 25, 41, 73, 89, 121 ili 187. U jednom izvođenju, antitelo ili njegov fragment obuhvata LCVR koji je kodiran pomoću sekvence nukleinske kiseline iz SEK ID BR:73.
[0020] U još nekim varijantnim rešenjima ovog opisa, antitelo ili njegov fragment obuhvata HCVR i LCVR (HCVR/LCVR) par sekvence kodiran pomoću para sekvence nukleinske kiseline izabran iz grupe koja obuhvata SEK ID BR:1/9, 17/25, 33/41, 49/57, 65/73, 81/89, 97/105, 113/121, 129/137, 145/153 i 179/187. U jednom varijantnom rešenju ovog opisa, antitelo ili njegov fragment obuhvata HCVR/LCVR par sekvence kodiran pomoću para sekvence nukleinske kiseline iz SEK ID BR:1/9, 17/25, 33/41, 65/73, 81/89, 113/121 ili 179/187. U jednom izvođenju, antitelo ili njegov fragment obuhvata HCVR/LCVR par sekvence kodiran pomoću para sekvence nukleinske kiseline iz SEK ID BR:65/73.
[0021] U jednom varijantnom rešenju, ovaj opis karakteriše antitelo ili fragment vezivanja antitela iz antitela koje obuhvvata HCDR3 domen kodiran pomoću sekvence nukleotida izabrane iz grupe koja obuhvata SEK ID BR:7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151 i 185, ili pretežno identičnu sekvencu koja ima barem 90%, barem 95%, barem 98%, ili barem 99% njihove homologije; i LCDR3 domen kodiran sekvencom nukleotida izabranom iz grupe koja obuhvata SEK ID BR:15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159 i 193, ili pretežno identičnu sekvencu koja ima barem 90%, barem 95%, barem 98%, ili barem 99% njihove homologije. U jednom varijantnom rešenju ovog opisa, antitelo ili njegov fragment obuhvata HCDR3 i LCDR3 par sekvence kodirane parom sekvence nukleinske kiseline izabranim iz grupe koja obuhvata SEK ID BR:7/15, 23/31, 39/47, 55/63, 71/79, 87/95, 103/111, 119/127, 135/143, 151/159 i 185/193. U drugom varijantnom rešenju ovog opisa, antitelo ili njegov fragment obuhvata HCDR3 i LCDR3 par sekvence kodiran pomoću para sekvence nukleinske kiseline iz SEK ID BR:7/15, 23/31, 39/47, 71/79, 87/95, 119/127 ili 185/193. U jednom izvođenju, antitelo ili njegov fragment obuhvata par sekvence HCDR3 i LCDR3 kodiran parom sekvence nukleinske kiseline iz SEK ID BR:71/79.
[0022] U još jednom varijantnom rešenju ovog opisa, antitelo ili njegov fragment još obuhvata HCDR1 domen kodiran sekvencom nukleotida izabranom iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147 i 181, ilI pretežno identičnu sekvencu koja joj je barem 90%, barem 95%, barem 98%, ili barem 99% homologna; i HCDR2 domen kodiran sekvencom nukleotida izabranom iz grupe koja obuhvata SEK ID BR:5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149 i 183, ili pretežno identičnu sekvencu koja joj je barem 90%, barem 95%, barem 98%, ili barem 99% homologna; i opciono još obuhvata LCDR1 domen kodiran sekvencom nukleotida izabranom iz grupe koja obuhvata SEK ID BR:11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155 i 189, ili pretežno identičnu sekvencu koja joj je barem 90%, barem 95%, barem 98%, ili barem 99% homologna; i /ili LCDR2 domen kodiran pomoću sekvence nukleotida izabrane iz grupe koja obuhvata SEK ID BR:13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157 i 191, ili pretežno identičnu sekvencu koja joj je barem 90%, barem 95%, barem 98%, ili barem 99% homologna.
[0023] Alternativno, taj opis karakteriše antitelo ili fragment koji vezuje antigen od antitela koje obuhvata HCDR1/HCDR2/HCDR3 kombinaciju kodiranu kombinacijom sekvence nukleotida izabranom i grupe koja obuhvata SEK ID BR:3/5/7, 19/21/23, 35/37/39, 51/53/55, 67/69/71, 83/85/87, 99/101/103, 115/117/119, 131/133/135, 147/149/151 i 181/183/185; i/ili LCDR1/LCDR2/LCDR3 kombaciju kodiranu pomoću kombinacije sekvence nukleotida izabrane iz grupe koja obuhvata SEK ID BR:11/13/15, 27/29/31, 43/45/47, 59/61/63, 75/77/79, 91/93/95, 107/109/111, 123/125/127, 139/141/143, 155/157/159 i 189/191/193. U jednom izvođenju, antitelo ili njegov fragment obuhvata sekvence CDR teškog i lakog lanca kodirane kombinacijom sekvence nukleotida iz SEK ID BR:67/69/71/75/77/79.
[0024] U još jednom izvođenju, ovaj pronalazak karakteriše humano anti-ANGPTL3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji obuhvata promenljivi region teškog lanca (HCVR) kodiran segmentima sekvence nukleotida izvedenim iz VH, DHi JHsekvenci klicine linije, i promenljivi region lakog lanca (LCVR) kodiran segmentima sekvence nukleotida izvedenim iz VKi JKsekvenci linije klice, pri čemu se taj HCVR i LCVR kodiraju pomoću segmenata sekvence nukleotida izvedenih iz kombinacije gena linije klice izabrane iz grupe koja obuhvata: (i) VH3-43, DH3-3, JH3, VK1-5 i JK2; (ii) VH3-11, DH1-1, JH4, VK1-39 i JK4; (iii) VH3-30, DH1-7, JH6, VK1-5 i JK1; (iv) VH3-30, DH1-26, JH6, VK1-12 i JK3; (v) VH3-30, DH3-10, JH6, VK1-12 i JK3; i (vi) VH3-23, DH3-10, JH4, VK1-5 i JK1.
[0025] U još jednom izvođenju, ovaj pronalazak karakteriše antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se specifično veže na hANGPTL3 sa ravnotežom konstante disocijacije (KD) od oko 7 nM ili manje, oko 6 nM ili manje, oko 5 nM ili manje, oko 4 nM ili manje, oko 3 nM ili manje, oko 2 nM ili manje, ili oko 1 nM ili manje, kako se meri ispitivanjem sa rezonancom površinskog plazmona (na primer, BIACORE™). Kod izvesnih izvođenja, antitelo iz ovog pronalaska ispoljava KDod oko 800 pM ili manje, oko 700 pM ili manje; oko 600 pM ili manje; oko 500 pM ili manje; oko 400 pM ili manje; oko 300 pM ili manje; oko 200 pM ili manje; oko 100 pM ili manje; ili manje 50 pM ili manje.
[0026] Anti-hANGPTL3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen iz ovog pronalaska koji vezuje hANGPTL3 protein iz SEK ID BR:161, moždane reaguje unakrsno sa povezanim proteinom, kao što je humani angiopoietinu sličan protein 4 (hANGPTL4; SEK ID BR:164), kako je određeno pomoću, na primer, ELISA, ogleda sa rezonancom površinskog plazmona, ili LUMINEX® XMAP® Technology, kako je ovde opisano. ANGPTL4 je još jedan izlučeni protein koji je poznat da smanjuje LPL aktivnost i ima region spiralne zavojnice N terminala i domen sličan fibrinogenu C terminala (Ge et al., 2004, J Biol Chem 279:2038-2045; Yau et al., 2009, J Biol Chem 284:11942-11952). Kod drugih izvođenja, ovaj opis obezbeđuje anti-hANGPTL3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji vezuje hANGPTL3 protein i unakrsno reaguje sa hANGPTL4 proteinom. Kod izvesnih varijantnih rešenja, afinitet vezivanja hANGPTL3 antitela ili njegovog fragmenta na hANGPTL4 protein jest oko 75% ili manji, ili oko 50% ili manji, od afiniteta vezivanja antitela ili fragmenta na hANGPTL3 protein.
[0027] U drugom srodnom varijantnom rešenju, taj opis obezbeđuje anti-hANGPTL3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji ne reaguje unakrsno sa ANGPTL3 miša (mANGPTL3; SEK ID BR:163), ili ANGPTL3 pacova (rANGPTL3; SEK ID BR:175), ali ne reaguje unakrsno sa ANGPTL3 makaki majmuna (Macaca fascicularis) (MfANGPTL3), na primer, sa 17-170 ostataka N terminala od SEK ID BR:177 (delimična sekvenca amino kiseline iz MfANGPTL3). Ovaj pronalazak obezbeđuje anti-hANGPTL3 antitelo ili njegov fragment koji unakrsno reaguje sa MfANGPTL3, mANGPTL3 i rANGTPL3.
[0028] Ovaj pronalazak obuhvata anti-hANGPTL3 antitela koja imaju modifikovani obrazac glikosilacije. Kod nekih primena, modifikacija da bi se uklonila neželjena mesta glikosilacije mogu biti korisna, ili npr., uklanjanje fukoznog dela da bi se povećala funkcija od antitela zavisne ćelijske citotoksičnosti (ADCC) (videti Shield et al. (2002) JBC 277:26733). Kod drugih primena, uklanjanje mesta N glikosilacije može da smanji neželjene reakcije imunog sistema protiv terapijskih antitela, ili da se povećaju afiniteti tih antitela. Kod još nekih drugih primena, modifikaciju galaktosilacije moguće je izvesti da bi se modifikovala citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC).
[0029] U još jednom varijantnom rešenju, ovaj pronalazak karakteriše farmaceutska supstanca koja obuhvata rekombinantno humano antitelo ili njegov fragment ovog pronalaska koje specifično vezuje hANGPTL3 i farmaceutski prihvatljiv nosač. U jednom varijantnom rešenju, taj opis obezbeđuje farmaceutsku supstancu koja obuhvata jedno ili više anti-ANGPTL3 antitela ili njegovih fragmenata, koja se ne takmiče unakrsno jedan sa drugim, i farmaceutski prihvatljiv nosač. U jednom varijantnom rešenju, ta farmaceutska supstanca može obuhvatiti dva ili više neblokirajuća antitela, koja se ne takmiče jedan sa drugim za specifično vezivanje na hANGPTL3 i delotvorna su za izbacivanje hANGPTL3 iz krvotoka. Pogodne kombinacije neblokirajućih antitela obuhvataju, ali se ne ograničavaju na, kombinaciju antitela koja obuhvata HCVR i i LCVR parove sekvence (HCVR/LCVR) iz: (i) SEK ID BR:82/90 i 180/188, prema opisanom redosledu; (ii) SEK ID BR: 114/122 i 180/188, prema opisanom redosledu; (iii) SEK ID BR:82/90 i 18/26, prema opisanom redosledu; ili (iv) SEK ID BR:114/122 i 18/26, prema opisanom redosledu.
[0030] U srodnim izvođenjima, ovaj pronalazak karakteriše supstanca koja je kombinacija
1
antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena, i drugog terapijskog agensa. Drugi terapojski agens može biti jedan ili više agenasa kao što je (1) inhibitori 3-hidroksi-3-metilglutarilkoenzim A (HMG-CoA) reduktaze, kao što je cerivastatin, atorvastatin, simvastatin, pitavastatin, rosuvastatin, fluvastatin, lovastatin, pravastatin, i slični; (2) inhibitori apsorpcije holesterola i/ili ponovne apsorpcije žučne kiseline; (3) niacin, koji povećava katabolizam lipoproteina; (4) fibratili amfipatičke karboksilne kiseline, koje smanjuju nivo lipoproteina niske gustine (LDL), poboljšavaju nivoe lipoproteina visoke gustine (HDL) i nivoe TG, i smanjuju broj nefatalnih srčanih udara; i (5) aktivatori faktora LXR transkripcije koji igra ulogu u eliminaciji holesterola kao što je 22-hidroksiholesterol, ili fiksne kombinacije kao što je ezetimib plus simvastatin; statin sa žučnom smolom (npr., holestiramin, kolestipol, kolesevelam), fiksna kombinacija niacin plus statin (npr., niacin sa lovastatinom); ili sa drugim agensima za spuštanje lipida kao što su etil estri omega-3-masne kiseline (na primer, omakor). Pored toga, drugi terapijski agens može biti jedan ii više drugih inhibitora ANGPTL3 kao i inhibitori drugih molekula, kao što je ANGPTL4, ANGPTL5, ANGPTL6 i proprotein pretvaranja proproteina subtilisinkog/keksinskog tipa 9 (PCSK9), koje su obuhvaćene u metabolizam lipida, specifično, holesterol i/ili homeostaza triglicerida. Inhibitori ovih molekula obuhvataju male molekule i antitela koji se specifično vežu na ove molekule i blokiraju njihovu aktivnost.
[0031] U srodnim izvođenjima, drugi terapijski agens može biti jedan ili više agenasa protiv kancera, kao što su hemoterapijski agensi, anti-angiogeni agensi, agensi suzbijanja rasta, citotoksični agensi, apoptotski agensi, i drugi agensi dobro poznati u ovoj oblasti za lečenje kancera ili drugih proliferativnih bolesti ili poremećaja, kao i drugih terapijskih agenasa, kao što su analgetici, anti-inflamatorni agensi, uključujući nesteroidne lekove protiv upale (NSAIDS), kao što su inhibitori Cox-2 (ciklooksigenaze 2), i slični tako da se poboljšaju i/ili smanje simptomi koji prate kancer/tumor koji ih prouzrokuje.
[0032] U još jednom varijantnom rešenju, ovaj opis karakterišu postupci za neutralizovanje, inhibiranje, blokiranje, uništenje, smanjenje ili ometanje, aktivnosti hANGPTL3 korišćenjem jednog ili više anti-hANGPTL3 antitela ili njegovih fragmenata koji vezuju antigen iz ovog opisa. U jednom varijantnom rešenju, ovaj opis obezbeđuje terapijski postupak koji obuhvata isporuku subjektu kom je potrebno delotvorne količine farmaceutske supstance koja obuhvata jedno ili više anti-hANGPTL3 antitela ili njegovih fragmenata za vezivanje antigena iz ovog opisa i, opciono jedan ili više terapijskih agenasa koji su opisani gore u tekstu. Anti-ANGPTL3 antitela ili njihovi fragmenti mogu biti neutralizujuća antitela ili neblokirajuća antitela protiv ANGPTL3, ili njihovih kombinacija.
[0033] U srodnim varijantnim rešenjima, ovaj opis obezbeđuje postupke pospešivanja izbacivanja hANGPTL3 iz krvotoka subjekta kom je potreban, obuhvata isporuku subjektu barem dva anti-hANGPTL3 antitela ili njihova fragmenta koji se ne takmiče jedan sa drugim za vezivanje na hANGPTL3 i preporučljivo ne blokiraju barem jednu aktivnost hANGPTL3 (t.j., neblokirajuća antitela). Barem jedna aktivnost koja se odnosi na hANGPTL3 obuhvata, ali ne u smislu ograničenja, inhibiranje LPL aktivnosti, indukovanje angiogeneze, i slično. U jednom varijantnom rešenju, kombinacija barem dva neblokirajuća anti-hANGPTL3 antitela ili njihova fragmenta pospešuje izbacivanje hANGPTL3 iz krvotoka pomoću barem oko 20%, oko 30 %, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, ili oko 80%, u odnosu na slučajeve gde ne postoji isporuka antitela ili fragmenata. Nivoi u krvotoku za hANGPTL3 mogu biti izmereni pomoću in vitro ogleda dobro poznatih u ovoj oblasti i onim koji su ovde opisani. U drugom varijantnom rešenju, kombinacija barem dva neblokirajuća anti-hANGPTL3 antitela obuhvata HCVR i LCVR parove sekvenci (HCVR/LCVR) iz: (i) SEK ID BR:82/90 i 180/188, prema opisanom redosledu; (ii) SEK ID BR: 114/122 i 180/188, prema opisanom redosledu; (iii) SEK ID BR:82/90 i 18/26, prema opisanom redosledu; ili (iv) SEK ID BR:114/122 i 18/26, prema opisanom redosledu.
[0034] Bolest ili poremećaj koje je moguće lečiti ovde opisanim postupcima je bilo koja bolest ili stanje koje je poboljšano, obrađeno, suzbijeno ili sprečeno, ili nje smanjena učestalost ponavljanja, u poređenju sa nalazima dobijenim iz slučajeva kod kojih nije postojala terapija anti-hANGPTL3 antitelom (npr., ANGPTL3-posredovane bolesti ili poremećaji), uklanjanjem, suzbijanjem, smanjenjem, ili intervencijom na neki drugi način u aktivnost ANGPTL3. Primeri bolesti ili poremećaja koje je moguće lečiti ovde opisanim postupcima obuhvataju, ali se ne ograničavaju na, one koji obuhvataju metabolizam lipida, kao što je hiperlipidemija, hiperlipoproteinemija i dislipidemija, uključujući aterogenu dislipidemiju, dijabetesnu dislipidemiju, hipertrigliceridemiju, uključujući ozbiljnu hipertrigliceridemiju sa TG > 1000 mg/dL, hiperholesterolemiju, hilomikronemiju, mešovitu dislipidemiju (gojaznost, metabolički sindrom, dijabetes, itd.), lipodistrofiju, lipoatrofiju, i slično, koji su prouzrokovani pomoću, na primer, smanjene aktivnosti LPL i/ili deficijencije, smanjene aktivnosti LDL receptora (LDLR) i/ili deficijencije LDL receptora (npr., homozigotna familijarna hiperholesterolemija sa LDLR-/-), promenjena ApoC2, ApoE deficijencija, povećan ApoB, povećana proizvodnja i/ili smanjena eliminacija lipoproteina veoma niske gustine (VLDL), terapija izvesnim lekom (npr., dislipidemija indukovana terapijom glukokortikoida), bilo koja genetska predispozicija, dijeta, stil života, i slično. Ovi postupci mogu takođe da spreče ili leče bolesti ili poremećaje povezane sa ili koji nastaju od hiperlipidemije, hiperlipoproteinemije, i/ili dislipidemije, uključujući, ali ne ograničavajući se na, kardiovaskularne bolesti ili poremećaje, kao što je ateroskleroza, aneurizam, hipertenzija, angina, moždani udar, cerebrovaskularne bolesti, kongestivno zatajenje srca, bolesti srčane arterije, infarkt miokarda, periferne vaskularne bolesti, i slično, akutni pankreatitis, nealkoholičarski steatohepatitis (NASH); poremećaji šećera u krvi, kao što je dijabetes, gojaznost, i slični.
[0035] Drugi primeri bolesti ili poremećaja koje je moguće lečiti postupcima obuhvataju kancer /tumor kao i sa neneoplastičnom angiogenzom povezane bolesti i poremećaje, uključujući očne angiogenske bolesti ili poremećaje, kao što je sa starenjem povezana degeneracija oka u zoni žute mrlje (makule), okluzija centralne vene mrežnjače, bolesti, okluzija razgranate vene mrežnjače, dijabetesna retinopatija, retinopatija usled preuranjenog sazrevanja, i slično, inflamatorne bolesti ili poremećaje, kao što je artritis, reumatoidni artritis (RA), psorijaza, i slično.
KRATAK OPIS SLIKA NACRTA
[0036]
Slika 1 pokazuje usklađivanje sekvence peptida 1-3 korišćene za eksperiment vezivanja anti-hANGPTL3 antitela (Primer 5) protiv relevantnih delova hANGPTL3 sekvence (t.j., sa ostacima 30 do 70 iz SEK ID BR:161 ili GenBank #NP_055310). Peptid 1 (kontrola: ANGPTL4 peptid; SEK ID BR:168); Peptid 2 (ANGPTL3 peptid; SEK ID BR:169); i Peptid 3 (ANGPTL3 peptid; SEQ ID BR:170).
Slika 2 pokazuje rezultate vezivanja anti-hANGPTL3 antitela na peptide spiralne zavojnice N terminala hANGPTL3 (peptidi 2 i 3) ili hANGPTL4 (Peptid<:>kontrola izotipom; i ■ : H4H1276S antitelo.
DETALJAN OPIS
[0037] Pre nego što se ovaj pronalazak detaljno opiše, treba razumeti da ovaj pronalazak nije ograničen na specifične postupke, i opisane eksperimentalne uslove, jer postupci i uslovi koji mogu varirati. Takođe, treba razumeti da je ovde korišćena terminologija samo u svrhu opisa određenih izvođenja, i nije predviđena da bude ograničavajuća, jer će obim ovog pronalaska biti ograničen samo pomoću priloženih patentnih zahteva.
[0038] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni pojmovi koji su ovde korišćeni imaju isto značenje kako ih ubičajeno razume prosečan stručjak u oblasti tehnike kojoj pripada ovaj pronalazak. Iako bilo koji postupci i materijali slični ili ekvivalentni stručnjacima opisanim ovde mogu biti jasni u praksi ili testiranju ovog pronalaska, preporučeni postupci i materijali su sada opisani.
Definicije
[0039] Pojam "human angiopoietinu sličan protein 3" ili "hANGPTL3", kako se ovde koristi, se odnosi na ANGPTL3 sa sekvencom nukleinske kiseline prikazanom u SEK ID BR:162 i sekvencom amino kiseline iz SEK ID BR:161, ili njenim biološki aktivnim fragmentom.
[0040] Pojam "antitelo", kako se ovde koristi, je predviđen da se odnosi na molekule imunoglobulina koji obuhvataju četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca
1
međusobno povezane disulfidnim vezama. Svaki teški lanac obuhvata promenljivi region teškog lanca (HCVR) i konstantni region teškog lanca (CH; koje čine domeni CH1, CH2 i CH3). Svaki laki lanac obuhvata promenljivi region lakog lanca (LCVR) i konstantni region lakog lanca (CL). HCVR i LCVR mogu još da budu podpodeljeni u regione hiperodrživosti, koji su poznati pod pojmom regioni određivanja komplementarnosti (CDR), razmaknuti sa mnogo konzervativnijim regionima, poznatim pod pojmom okvirni regioni (FR). Svaki HCVR i LCVR obuhvata tri CDR i četiri FR, raspoređena iz amino terminusa na karboksi terminus sledećim redosledom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, i FR4.
[0041] Supstitucija jednog ili više CDR ostataka ili izostavljene jednog ili više CDR je takođe moguća. Antitela su opisana u naučnoj literaturi u kojoj jedan ili dva CDR mogu da budu izostavljena radi vezivanja. Padlan et al. (1995 FASEB J. 9:133-139) su analizirali dodirne regione između antitela i njihovih antigena, na osnovu objavljenih struktura kristala, i zaključili da samo oko jedne petine do jedne trećine CDR ostataka zapravo dodiruju taj antigen. Padlan je takođe pronašao brojna antitela u kojima su jedan ili dva CDR bila bez amino kiselina u dodiru nekim antigenom (videti takođe, Vajdos et al.2002 J Mol Biol 320:415-428).
[0042] CDR ostaci koji nisu u dodiru sa antigenom mogu da budu identifikovani na osnovu njihovih prethodnih studija (na primer; ostaci H60- H65 u CDRH2 često nisu neophodni), iz regiona Kabat CDR koji leže izvan Chothia CDR, molekularnim modelovanjem i/ili empirijski. Ako se izostave CDR ili njegov(i) ostatak(ci), obično je supstituisan sa amino kiselinom koja zauzima odgovarajućuju poziciju na drugoj humanoj sekvenci antitela ili konsenzusom takvih sekvenci. Pozicije za supstituciju unutar CDR i amino kiselina radi supstitucisanja moguće je i empirijski izabrati. Empirijske supstitucije mogu biti konzervativne ili nekonzervativne supstitucije.
[0043] Pojam "humano antitelo", kako se ovde koristi, je predviđeno da obuhvati antitela koja imaju promenljive i konstantne regione izvedene iz humanih sekvenci imunuglobulina linije klice. Humana mAb iz ovog pronalaska mogu obuhvatiti ostatke amino kiseline koji nisu kodirani humanim sekvencama imunoglobulina linije klice (npr., mutacije uvedene nasumičnom ili za mesto specifičnom mutagenezom in vitro ili somatskom mutagenezom in vivo), na primer u CDR i specifično CDR3. Međutim, pojam "humano antitelo", kako se ovde koristi, nije predviđeno da obuhvati mAb u kojima su sekvence CDR izvedene iz linije klice drugih vrsta sisara (npr., miša), i nakalemljen na humane sekvence okvirnog regiona (FR).
[0044] Potpuno humana anti-hANGPTL3 antitela opisana ovde mogu obuhvatti jedan ili više supstituenata amino kiseline, umetaka i/ili brisanja u okviru i/ili CDR regione promenljivih domena teškog i lakog lanca u poređenju sa odgovarajućim sekvencama linije klice. Takve mutacije mogu biti lako ustanovljene upoređivanjem sekvenci amino kiseline opisanim ovde sa sekvencama linije klice koje su dostupne iz, na primer, javno dostupnih baza podataka sekvenci antitela. Ovaj opis obuhvata antitela, i njihove fragmente koji vezuju antigen, koji su izvedeni iz bilo koje od ovde opisanih sekvenci amino kiseline, pri čemu su jedna ili više amino kiselina sa jednim ili više okvirnim i/ili CDR regionima mutirale u odgovarajuće ostatke sekvence llinije klice iz kojih je to antitelo izvedeno, ili u odgovarajuće ostatke druge humane sekvence linije klice, ili u konzervativnu supstituciju amino kiseline odgovarajućih ostataka linije klice (takve promene na sekvencama kako se ovde pominje su poznate kolektivno kao 'mutacije linije klice"). Prosečan stručnjak u ovoj oblasti, počevši od ovde opisanih sekvenci promenljivog regiona teškog i lakog lanca, može lako da proizvede brojna antitela i fragmente koji vezuju antigen koji obuhvataju jednu ili više pojedinačnih reverznih mutacija linije klice ili njihovih kombinacija. U izvesnim varijantnim rešenjima, svi od okvirnih i/ili CDR ostataka unutar domena VHi/ili VLmutiraju nazad u ostatke pronađene u originalnoj sekvenci linije klice iz koje je to antitelo izvedeno. U drugim varijantnim rešenjima, samo izvesni ostaci reverzno mutiraju u originalnu sekvencu linije klice, npr. samo mutirani ostatci pronađeni unutar prvih 8 amino kiselina FR1 ili unutar poslednjih 8 amino kiselina FR4, ili samo mutirani ostaci pronađeni unutar CDR1, CDR2 ili CDR3. U drugim varijantnim rešenjima, jedan ili više okvirnih i/ili CDR ostataka se mutiraju u odgovarajuće ostatke različite sekvence linije klice (t.j., sekvencu linije klice koja je drugačija od sekvence linije klice iz koje je antitelo originalno izvedeno). Pored toga, ta antitela mogu da obuhvate bilo koju kombinaciju od dve ili više mutacija linije klice unutar okvira i/ili CDR regiona, npr., pri čemu su izvesni pojedinačni ostaci mutirani u odgovarajuće ostatke specifične sekvence linije klice pri čemu se zadržavaju izvesni drugi ostaci koji se razlikuju od originalne sekvence linije klice ili se mutiraju odgovarajući ostatak drugačije sekvence linije klice. Pošto se dobiju, antiela, i fragmenti koji vezuju antigen koji obuhvataju jednu ili više mutacija linije klice moguće je lako ispitati za jedno ili više željeno svojstvo kao što je, poboljšana specifičnost vezivanja, povećan afinitet vezivanja, poboljšana ili pospešena antagonistička biološka svojstva (kao što može biti slučaj), smanjenu imunogenost, itd. Antitela i fragmenti vezivanja antigena dobijeni na ovaj opšti način su obuhvaćeni ovim opisom.
[0045] Ovaj opis takođe obuhvata antitela anti-ANGPTL3 koja obuhvataju varijante ovde opisanih HCVR, LCVR, i/ili CDR sekvenci amino kiseline koji imaju jednu ili više konzervativnih supstitucija. Na primer, ovaj opis obuhvata anti-ANGPTL3 antitela koja imaju HCVR, LCVR, i/ili CDR sekvence amino kiseline sa, npr., 10 ili manje 8 ili manjer, 6 ili manje, 4 ili manje, 2 ili 1, konzervativnih supstitucija amino kiseline u odnosu na bilo koju od ovde opisanih HCVR, LCVR, i/ili CDR sekvenci amino kiseline. U jednom varijantnom rešenju, HCVR obuhvata sekvencu amino kiseline iz SEK ID BR:487 sa 10 ili manje konzervativnih supstitucija amino kiseline. U drugim varijantnimr ešenjima, HCVR obuhvata sekvence amino kiseline iz SEK ID BR:487 sa 8 ili manje konzervativnih supstitucija amino kiseline. U drugim varijantnim rešenjima, HCVR obuhvata sekvencu amino kiseline iz SEK ID BR: 487 sa 6 ili manje konzervativnih supstitucija amino kiseline. U drugom varijantnom rešenju, HCVR obuhvata sekvencu amino kiseline iz SEK ID BR:487 sa 4 ili manje konzervativnih supstitucija amino kiseline. U još jednom drugom
1
varijantnom rešenju, HCVR obuhvata sekvencu amino kiseline iz SEK ID BR:487 sa 2 ili manje konzervativnih supstitucija amino kiseline u njoj. U jednom varijantnom rešenju, LCVR obuhvata sekvencu amino kiseline iz SEK ID BR:44 sa 10 ili manje konzervativnih supstitucija amino kiseline. U drugom varijantnom rešenju, LCVR obuhvata sekvencu amino kiseline iz SEK ID BR:44 sa 8 ili manje konzervativnih supstitucija amino kiseline u njoj. U drugom varijantnom rešenju, LCVR obuhvata sekvencu amino kiseline iz SEK ID BR:44 sa 6 ili manje konzervativnih supstitucija amino kiseline. U drugom varijantnom rešenju, LCVR obuhvata sekvencu amino kiseline iz SEK ID BR:44 sa 4 ili manje konzervativnih supstitucija amino kiseline. U još jednom drugom varijantnom rešenju, LCVR obuhvata sekvencu amino kiseline iz SEK ID BR:44 sa 2 ili 1 konzervativnom supstitucijom amino kiseline u njoj.
[0046] Osim ako nije specifično drugačije navedeno, pojam "antitelo, kako se ovde koristi, treba razumeti da obuhvata molekule antitela sa dva teška lanca imunoglobulina i dva laka lanca imunoglobulina (t.j., "celi molekuli antitela") kao i njihove fragmente koji vezuju antigen. Pojmovi "deo koji vezuje antigen" nekog antitela, "fragment koji vezuje antigen" nekog antitela, i slični, kako se ovde koriste, obuhvataju bilo koji prirodno nastao, enzimski dobijen, sintetisan, ili genetski projektovvan polipeptid ili glikoprotein koji se specifično veže na antigen da bi se formirao kompleks. Fragmenti koji vezuju antigen nekog antitela mogu biti izvedeni, npr., iz celih molekula antitela korišćenjem pogodnih standardnih tehnika kao što je razgradnja proteolita ili tehnika rekombinantnog genetskog inženjeringa koje obuhvataju manipulaciju i ekspresiju promenljivih i (opciono) konstantnih domena antitela koje kodira DNK. Takva DNK je poznata i/ili je lako dostupna iz, npr., komercijalnih izvora, DNK biblioteka (uključujući, npr., biblioteke antitela prikaza faga), ili ih je moguće sintetisati. DNK može biti sekvencionirana i manipulisana hemijski ili korišćenjem tehnika u molekularnoj biologiji, na primer, da bi se rasporedili jedan ili više promenljivih i/ili konstantnih domena u pogodnu konfiguraciju, ili da bi se uveli kodoni, stvorili ostaci cisteina, modifikovale, dodale ili obrisale amino kiseline, itd.
[0047] Neograničavajući primeri fragmenata koji vezuju antigen su: (i) Fab fragmenti; (ii) F(ab’)2 fragmenti; (iii) Fd fragmenti; (iv) Fv fragmenti; (v) molekuli jednolančanog Fv (scFv); (vi) dAb fragmenti; i (vii) minimalne jedinice prepoznavanja koje obuhvataju ostatke amino kiseline koji oponašaju hiperpromenljivi region antitela (npr.l, izolovan region određivanja komplementarnosti (CDR) kao što je CDR3 peptid), ili ograničen FR3-CDR3-FR4 peptid. Drugi projektovani molekuli kao što su za domen specifična antitela , antitela pojedinačnog domena, antitela izbrisanog domena, himerna antitela, CDR kalemljena antitela, diatela, triatela, tetratela, minitela, nanotela (npr. monovalentna nanotela, bivalentna nanotela, itd.), mali modularni imunolekovi (SMIP), i promenljivi IgNAR domeni ajkule, su takođe obuhvaćeni izrazom "fragment koji vezuje antigen," kako se ovde koristi.
[0048] Fragment koji vezuje antigen antitela će obično obuhvatiti barem jedan promenljiv domen. Promenljiv domen može biti bilo koje veličine ili sastava amino kiselien i generalno će
1
obuhvatiti barem jedan CDR koji je susedan ili u okviru sa jednom ili više sekvenci okvirnog domena. Kod fragmenata koji vezuju antigen sa VHdomenom povezanim sa VLdomenom, VHi VLdomeni mogu biti smešteni u odnosu jedan prema drugom u bilo kom pogodnom rasporedu. Na primer, promenljivi region može biti dimerni i obuhvatiti VH-VH, VH-VLili VL-VLdimere. Alternativno, fragment koji vezuje antigen nekog antitela može obuhvatiti monomerni VHili VLdomen.
[0049] Kod izvesnih izvođenja, fragment koji vezuje antigen nekog antitela može obuhvatiti barem jedan promenljivi region kovalentno povezan na barem jedan konstantni domen. Neograničavajuće, za primer uzete konfiguracije promenljivih i konstantnih domena koje je moguće pronaći unutar fragmenta koji vezuje antigen antitela iz ovog pronalaska obuhvataju: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; i (xiv) VL-CL. U bilo kojoj konfiguraciji promenljivih i konstantnih domena, uključujući bilo koju od konfiguracija navedenih gore uzetih kao primer, promenljivi i konstantni domeni mogu biti bilo direktno povezani jedan na drugi ili mogu biti povezani putem potpunog ili delimičnog zglobnog (hinge) regiona ili vežućeg (linker) regiona. Zglobni region može obuhvatiti barem 2 (npr., 5, 10, 15, 20, 40, 60 ili više) amino kiselina koje daju kao rezultat fleksibilnu ili polufleksibilnu vezu između susednih promenljivih i/ili konstantnih domena u pojedinačnom molekulu polipeptida. Pored toga, fragment koji vezuje antigen nekog antitela iz ovog pronalaska može obuhvatiti homo-dimer ili hetero-dimer (ili drugi multimer) iz bilo koje od gore navedenih konfiguracija promenljivog i konstantnog domena u nekovalentnoj vezi jednih sad drugim i/ili sa jednim ili više monomernih VHili VLdomena (npr., disulfidnim vezom(ama)).
[0050] Kako kod celih molekula antitela, fragmenti koji vezuju antigen mogu biti monospecifični ili multispecifični (npr., bispecifični). Višespecifičan fragment koji vezuje antigen antitela će obično obuhvatiti barem dva različita promenljiva domena, pri čemu je svaki promenljivi domen sposoban da se specifično veže na odvojeni antigen ili na različtii epitop na istom antigenu. Bilo koji višespecifičan format antitela, uključujući primere bispecifičnih ovde opisanih formata antitela, moguće je prilagoditi za upotrebu u kontekstu fragmenta koji vezuje antigen antitela iz ovog pronalaska korišćenjem rutinskih tehnika dostupnih u ovoj oblasti.
[0051] Kod izvesnih izvođenja, antitelo ili fragmenti antitela iz ovog pronalaska mogu biti konjugovani do terapijskog dela ("imunokonjugat"), kao što je citotoksin, hemoterapijski lek, imunosupresant ili radioizotop.
[0052] Pojam "specifično veže," ili slično, znači da antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen formira kompleks sa antigenom koji je relativno stabilan pod fiziološkim uslovima. Specifično vezivanje može da karakteriše ravnoteža konstante disocijacije (KD) od oko 1x10<-6>M ili manje (t.j., manji KDoznačava viši stepen vezivanja). Metode za određivanje da li se dva molekula specifično vezuju su dobro poznati u ovoj oblasti i obuhvataju, na primer, ravnotežu dijalize,
1
rezonancu površinskog plazmona, i slične. Izolovano anatitelo koje specifično veže hANGPTL3 može, međutim, ispoljiti unakrsnu reaktivnost na druge antigene, kao što su ANGPTL3 molekuli iz drugih vrsta, na primer, ANGPTL3 makaki majmuna, ANGPTL3 miša, ANGPTL3 pacova,i/ili hANGPTL4 sa sekvencom amino kiseline iz SEK ID BR:164. Pored toga, višestruka specifična antitela (npr., bispecifična) koja se vežu na hANGPTL3 i jedan ili više dodatnih antigena se isto tako smatraju antitelima koja "specifično vežu" hANGPTL3, kako se ovde koristi.
[0053] Pojam antitelo "visokog afiniteta" se odnosi na ona antitela koja imaju afinitet vezivanja na hANGPTL3, izražen kao KD, od oko 2x10<-9>M ili manje, oko 1,5x10<-9>M ili manje, oko 1x10<-9>M ili manje, oko 0,5x10<-9>M ili manje, oko 0,25x10<-9>M ili manje, oko 1x10<-10>M ili manje, ili oko 0,5x10<-10>M ili manje, kako se meri rezonancom površinskog plazmona, npr., BIACORE™ ili ELISA tehnikom za merenje afiniteta rastvora.
[0054] Pojam "KD", kako se ovde koristi je predviđen da se odnosi na ravnotežu konstante disocijacije iz specifične interakcije antitelo-antigen.
[0055] Pod pojmom "usporavanje brzine", "Koff" ili "kd" se implicira antitelo koje se razdružuje od hANGPTL3 konstantom brzine od 4 x 10<-3>s<-1>ili manjom, 3 x 10<-3>s<-1>ili manjom, 2 x 10<-3>s<-1>ili manjom, 1 x 10<-3>s<-1>ili manjom, 1 x 10<-4>s<-1>ili manjom, kako je određeno rezonancom površinskog plazmona, npr., BIACORE™.
[0056] Pod pojmom "konstanta unutrašnjeg afiniteta" ili "ka" se podrazumeva antitelo koje se povezuje sa hANGPTL3 konstantom brzine od oko 1 x 10<3>M<-1>s<-1>ili višom, kao što je utvrđeno rezonancom površinskog plazmona, npr., BIACORE™.
[0057] Kako se ovde koristi, "izolovano antitelo" je predviđeno da se odnosi na antitelo koje je pretežno bez drugih mAb koja imaju različite antigenske specifičnosti (npr., izolovano antitelo koje specifično vezuje hANGPTL3 je pretežno bez mAbs koje specifično vezuje antigene koji nisu hANGPTL3). Izolovano antitelo koje specifično vezuje hANGPTL3 može, međutim da ima unakrsnu reaktivnost sa drugim antigenima, kao što su ANGPTL3 molekuli iz drugih vrsta, kao što su makaki majmun, miš, pacov, i/ili drugi srodni proteini, kao što je humani ANGPTL4.
[0058] Pojam "neutralizujuće", "blokirajuće" ili "uništavajuće" antitelo, kako se ovde koristi (ili antitelo koje "neutralizuje", "blokira" ili "uništava" ANGPTL3 aktivnost), je predviđeno da se odnosi na antitelo čije vezivanje na ANGPTL3 daje kao rezultat direktnu inhibiciju barem jedne biološke aktivnosti ANGPTL3, kako je procenjeno standardnim in vitro ogledima poznatim u ovoj oblasti (na primer, videti Primere dole u tekstu). Pojmove, "neutralizuje", "inhibira", "blokira" i "uništava", moguće je koristiti ovde naizmenično. Pojam "neblokirajuće" antitelo se odnosi na antitelo čije vezivanje na ANGPTL3 ne blokira direktno ciljanu aktivnost ANGPTL3 kako je procenjeno standardnim in vitro ogledima, ali ipak može da bude "interferirajuće" antitelo čije vezivanje na ANGPTL3 daje kao rezultat direktnu inhibiciju, redukciju, ublažavanje (atenuaciju), ili drugu interferenciju, barem jedne biološke aktivnosti ANGPTL3 in vivo, npr: pospešivanjem izbacivanja ANGPTL3 iz krvotoka. Brisanje ANGPTL3 iz krvotoka moguće je specifično
1
pospešiti kombinovanjem barem dva neblokirajuća antitela. Neutralizacija, inhibicija, uništenje, smanjenje, ublažavanje ili interferencija, biološke aktivnosti ANGPTL3 može biti procenjena merenjem jednog ili više indikatora biološke aktivnosti ANGPTL3 pomoću jednog ili više od nekoliko standardnih in vitro ili in vivo ogleda poznatih u ovoj oblasti (takođe videti Primere u daljem tekstu).
[0059] Pojam "rezonanca površinskog plazmona", kako se ovde koristi, se odnosi na optički fenomen koji omogućava analizu biospecifičnih interakcija u realnom vremenu detekcijom promena u koncentracijama proteina unutar matrice biosenzora, na primer korišćenjem BIACORE™ sistema (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.).
[0060] Pojam "epitop" je region antigena na koji se veže neko antitelo. Epitope je moguće definisati kao strukturne ili funkcionalne. Funkcionalni epitopi su generalno podskup strukturnih epitopa i imaju one ostatke koji direktno doprinose afinitetu interakcije. Epitopi mogu biti i konformacioni, to jest, da ih čine nelinearne amino kiseline. Kod izvesnih izvođenja, epitopi mogu obuhvatiti determinante koji su hemijski aktivne površinske grupacije molekula kao što su amino kiseline, bočni lanci šećera, fosforil grupe, ili sufonil grupe, i u izvesnim izvođenjima, mogu imati specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, i/ii specifične karakteristike naelektrisanja.
[0061] Pojam "pretežna identičnost" ili "pretežno identično," kada se odnosi na nukleinsku kiselinu ili njen fragment, označava da, kada je optimalno usklađen sa odgovarajućim umecima nukleotida ili brisanjima sa drugom nukleinskom kiselinom (ili njenim komplementarnim lancem), postoji identičnost sekvence nukleotida od barem oko 90%, i još preporučljivije barem oko 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% baza nukleotida, kako je izmereno nekim dobro poznatim algoritmom identičnosti sekvence, kao što je FASTA, BLAST ili GAP, kako je razmatrano dole u tekstu.
[0062] Kada se odnosi na polipeptide, pojam "pretežna sličnost" ili "pretežno slično" znači da dve sekvence peptida kada su optimalno usklađene, kao što je pomoću programa GAP ili BESTFIT korišćenjem težina zadatih praznina, dele barem 90% identičnost sekvence, čak preporučljivije barem 95%, 98% ili 99% identičnost sekvence. Preporučljivo, pozicije ostataka koje nisu identične se razlikuju konzervativnim supstitucijama amino kiseline. "Konzervativna supstitucija amino ksieline" je ona kod koje je ostatak amino kiseline supstituisan drugim ostatkom amino kiseline sa bočnim lancem (R grupa) sa veoma sličnim hemijskim svojstvima (npr., naelektrisanje ili hidrofobnost). Generalno, konzervativna supstitucija amino kiseline neće u znatnoj meri promeniti funkcionalna svojstva nekog proteina. U slučajevima gde se dve ili više sekvence amino ksieline razlikuju jedna od druge konzervativnim supstitucijama, procenat ili stepen sličnosti može biti podešen nagore da bi se izvršila korekcija zbog konzervativne prirode supstitucije. Načini da se ova podešavanja izvedu su dobro poznati stručnjaku u ovoj oblasti. Videti, npr., Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Primeri grupa amino kiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim svojstvima obuhvataju 1) alifatne bočne lance: glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; 2) alifatne hidroksilne bočne lance: serin i treonin; 3) bočne lance
1
koji sadrže amid; 4) aromatične bočne lance: fenilalanin, tirozin, i triptofan; 5) bazne lance baze: lizin, arginin, i histidin; 6) kiselinske bočne lance: aspartat i glutamat, i 7) bočne lance koji obuhvataju sumpor: cistein i metionin. Preporučene konzervativne supstitucione grupe amino kiseline su: valin-leucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alanin-valin, glutamat-aspartat, i asparagin-glutamin. Alternativno, konzervativna zamena je bilo koja promena koja ima pozitivnu vrednost u PAM250 log matrici verovatnoće što su opisali Gonnet et al. (1992) Science 256: 144345. "Umereno konzervativna" zamena je bilo koja promena koja ima nenegativnu vrednost u PAM250 log matrici verovatnoće.
[0063] Sličnost sekvence za polipeptide se obično meri korišćenjem softvera za analizu sekvence. Softver za analizu proteina odgovara sličnim sekvencama koje koriste merenje sličnosti dodeljeno različitim supstitucijama, brisanjima i drugim modifikacijama, uključujući konzervativne supstitucije amino kiseline. Na primer, GCG softver koji sadrži programe kao što je GAP i BESTFIT koje je moguće koristiti bez zadatih parametara da bi se utvrdila homologija sekvence ili identičnost sekvence između blisko srodnih polipeptida, kao što su homologni polipeptidi iz različitih vrsta ili organizama ili između proteina divljeg tipa njegovog muteina. Videti, npr., GCG verzija 6.1. Sekvencu polipeptida je takođe moguće uporediti korišćenjem FASTA sa zadatim ili preporučenim parametrima; programom u GCG verziji 6.1. FASTA (npr., FASTA2 i FASTA3) omogućava poravnanja i procenat identičnosti sekvence regiona koji se najbolje preklapaju između upoređenih i pretraženih sekvenci (Pearson (2000) supra). Još jedan preporučeni algoritam kada se uporedi sekvenca iz ovog pronalaska sa bazom podataka koja obuhvata veliki broj sekvenci iz različitih organizama je računarski program BLAST, posebno BLASTP ili TBLASTN, korišćenjem zadatih parametara. Videti, npr., Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.215: 403410 and (1997) Nucleic Acids Res.25:3389402.
[0064] Pod izrazom "terapijski delotvorna količina" misli se na količinu koja proizvodi željeno dejstvo za koje se isporučuje. Tačna količina će zavisiti od svrhe terapije, starosti i veličine lečenog subjekta, rute isporuke, i sličnog, i moguće ju je utvrditi korišćenjem poznatih tehnika (videti, na primer, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).
Dobijanje humanih antitela
[0065] Metode za generisanje humanih antitela kod transgenetičkih miševa su poznati u ovoj oblasti. Sve takve poznate metode moguće je koristiti u kontekstu ovog pronalaska da bi se napravila humana antitela koja se specifično vezuju na ANGPTL3.
[0066] Upotreba VELOCIMMUNE™ tehnologije ili bilo koje druge poznate metode za generisanje monoklonalnih antitela, himernih antitela visoke himernosti na ANGPTL3 su prvobitno izolovana tako da imaju humani promenljivi region i mišji konstantni region. Kao u
2
eksperimentalnom segmentu dole u tekstu, antitela se karakterišu i biraju zbog poželjnih svojstava, uključujući afinitet, selektivnost, epitop, i slično.
[0067] Generalno, antitela iz ovog pronalaska poseduju visoke afinitete, obično poseduju KDod oko 10<-12>M do oko 10<-9>M, kada se meri vezivanjem na antigen bilo imobilizovan na čvrstoj podlozi ili u fazi rastvora. Konstantni regioni miša se zamenjuju željenim humanim konstantnim regionima, na primer, divljeg tipa IgG1 ili IgG4, ili modifikovani IgG1 ili IgG4, da bi se generisala potpuno humana antitela iz ovog pronalaska. Kako izabrani konstantni region može varirati prema specifičnoj upotrebi, karakteristike specifičnosti vezivanja antigena visokog afiniteta i karakteristike specifičnosti cilja tih antitela se nalaze u promenljivom regionu.
Mapiranje epitopa i srodne tehnologije
[0068] Za pretragu antitela koja se vezuju na specifičan epitop, moguće je izvesti rutinski ogled unakrsnog blokiranja kao što je opisano u (Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY)). Druge metode obuhvataju analize mutacija koji pretražuju alanin, mrlje peptida (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63), ili cepanja peptida. Pored toga, mogu biti korišćene metode poznate kao ekscizija epitopa, ekstrakcija epitopa i hemijska modifikacija antigena (Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496).
[0069] Pojam "epitop" se osnosi na mesto na antigenu na koje odgovaraju B i/ili T ćelije. Epitopi B ćelije se mogu formirati iz dodirnih amino kiselina ili nedodirnih amino kiselina suprotstavljenih tercijarno presavijenom proteinu. Epitopi formirani iz dodirnih amino kiselina se obično zadržavaju pri izlaganju denaturisanim rastvaračima, pri čemu su epitopi formirani tercijarnim prevojem obično izgubljeni usled terapije denaturisanim rastvaračima. Epitop obično obuhvata barem 3, a češće, barem 5 ili 8-10 amino kiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji.
[0070] Modifikacijom potpomognuto profilisanje (MAP), takođe je poznato kao profilisanje antitela bazirano na strukturi antigena (ASAP) je metod koji kategoriše velike broj monoklonalnih antitela (mAbs) usmeren protiv istog antigena prema sličnostima profila vezivanja svakog antitela na hemijski ili enzimski modifikovane površine antigena (US 2004/0101920). Svaka kategorija može da odrazi jedinstveni epitop bilo distinktivno različiti od ili delimično preklopljen sa epitopom predstavljen drugom kategorijom. Ova tehnologija omogućava brzo filterisanje genetski identičnih mAb, tako da ta karakterizacija može da se usredsredi na genetski distinktivna mAb. Kada se primeni na pretragu hibridoma, MAP može olakšati identifikaciju retkih klonova hibridoma koji proizvode mAb koja imaju željene karakteristike. MAP je moguće koristiti da bi se razvrstala anti-ANGPTL3 mAb iz ovog pronalaska u grupe mAb koje vezuju različite epitope.
[0071] ANGPTL3 obuhvata domen spiralne zavojnice amino terminala i domen karboksilnog terminala sličan fibrinogenu (FD) i ANGPTL3 protein formira oligomer u odsustvu intermolekularnih disulfidnih veza (Ge et al., 2005, J Lipid Res 46:1484-1490). Zapaženo je da je domen spiralne zavojnice N terminala važan u suzbijanju LPL aktivnosti (Ono et al., 2003, J Biol Chem 278:41804-41809). Antitelo anti-hANGPTL3 ili fragment koji vezuje antigen iz ovog opisa vezuje epitop unutar domena spiralne zavojnice N terminala (ostatke 17-209) od hANGPTL3 (SEK ID BR:161) i neutralizuje barem jednu aktivnost hANGPTL3 (npr., inhibiciju LPL aktivnosti). Anti-hANGPTL3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen veže epitop unutar domena spiralne zavojnice N terminala od hANGPTL3 i neutralizuje barem jednu aktivnost hANGPTL3, uz uslov da se to antitelo ili njegov fragment ne vezuje na ANGPTL3 peptid iz SEK ID BR: 170. Antitelo ili njegov fragment može specifično da se veže na epitop sa ostacima 17 do 200, 17 do 100, 17 do 70, 17 do 65, 17 do 60, 17 do 57, 17 do 55, 17 do 50, 17 do 45, 17 do 40, ili 17 do 35, od hANGPTL3 (SEK ID BR:161), opciono uz uslov da to antitelo ili njegov fragment ne vezuje na ANGPTL3 peptid od SEK ID BR:170. Antitelo ili njegov fragment može specifično da veže epitop unutar ostataka 40 do 200, 40 do 100, 40 do 70, 50 do 200, 50 do 100, 50 do 70, 58 do 200, 58 do 100, 58 do 70, 58 do 68, ili 61 do 66 (poznat kao "motiv koji vezuje heparin ") od hANGPTL3 (SEK ID BR:161), opciono uz uslov da se to antitelo ili njegov fragment ne vezuje na ANGPTL3 peptid od SEK ID BR:170. Kod nekih varijantnih rešenja, antitelo ili njegov fragment se veže na epitop koji može da obuhvati više od jednog od brojnih epitopa ili ostataka unutar regiona spiralne zavojnice N terminala od hANGPTL3, opciono uz uslov da se to antitelo ili njegov fragment ne vezuje na ANGPTL3 peptid iz SEK ID BR:170.
[0072] Kod drugih varijantnih rešenja iz ovog opisa, hANGPTL3 antitelo ili njegov fragment veže jedan ili više fragmenata iz hANGPTL3, na primer, fragment od barem 5 ostataka, barem 7 ostataka, barem 10 ostataka, barem 20 ostataka, barem 30 ostataka, barem 50 ostataka, barem 70 ostataka, barem 100 ostataka, barem 150 ostataka, ili barem 200 ostataka od hANGPTL3 (SEK ID BR:161), opciono uz uslov da se to antitelo ili njegov fragment ne vezuje na ANGPTL3 peptid od SEK ID BR:170.
[0073] Ovaj opis obuhvata hANGPTL3 antitela koja se vežu na isti epitop kao bilo koje od specifičnih ovde opisanih antitela uzetih kao primer. Pored toga, ovaj opis takođe obuhvata antihANGPTL3 antitela koja se takmiče za vezivanje na hANGPTL3 ili hANGPTL3 fragment sa bilo kojim od specifičnih ovde opisanih antitela uzetih kao primer.
[0074] Stručnjak u ovoj obolasti može lako da odredi da li se antitelo vezuje na isti epotop kao, ili se takmiči za vezivanje sa, referentnim anti-hANGPTL3 antitelom koristeći rutinske postupke poznate u ovoj oblasti. Na primer, da bi se utvrdilo da li se antitelo koje se testira vezuje na isti epitop kao referentno anti-hANGPTL3 antitelo, referentno telo se pusti da se veže na hANGPTL3 protein ili peptid pod uslovima zasićenosti. Dalje, procenjivana je sposobnost antitiela koje se testira da se veže na hANGPTL3 molekul. Ako antitelo koje se testira može da se veže na hANGPTL3 posle vezivanja zasićenjem sa referencom na anti-hANGPTL3 antitelo, može se zaključiti da se to testirano antitelo veže na drugačiji epitop nego što je referentno antihANGPTL3 antitelo. Sa druge strane, ako antitelo koje se testira ne može da se veže na hANGPTL3 molekul posle vezivanja zasoćenjem sa referentnim anti-hANGPTL3 antitelom, onda to antitelo koje se testira može da se veže na isti epitop kao što je epitop na koje se vezalo referentno anti-hANGPTL3 antitelo.
[0075] Da bi se odredilo da li se neko antitelo takmiči za vezivanje sa referentnim antihANGPTL3 antitelom, gore opisana metodologija vezivanja se izvodi u dve orijentacije: U prvoj orijentaciji, referentno antitelo se pusti da se veže na hANGPTL3 molekul pod uslovima zasićenosti posle čega sledi procena vezivanja antitela koje se testira na hANGPTL3 molekul. U drugoj orijentaciji, antitelo koje se testira se ostavi da se veže na hANGPTL3 molekul pod uslovima saturacije posle čega sledi procena vezivanja referentnog antitela na ANGPTL3 molekul. Ako, u oba smera, samo prvo (zasićeno) antitelo može da se veže na ANGPTL3 molekul, onda je zaključeno da se to antitelo koje se testira i referentno antitelo takmiče za vezivanje na hANGPTL3. Kao što će uvideti prosečan stručnjak u ovoj oblasti, antitelo koje se takmiči za vezivanje sa referentnim antitelom ne mora neophodno da se veže na identični epitop kao to referentno antitelo, ali može sterno da blokira vezivanje referentnog antitela vezivanjem preklapanja ili susednog epitopa.
[0076] Dva antitela koja se vežu na isti ili preklapajući epitop ako svako konkurentno suzbija (blokira) vezivanje drugog na antigen. To jest, 1-, 5-, 10-, 20- ili 100-struki višak jednog antitela inhibira vezivanje drugog pomoću barem 50% ali preporučljivo 75%, 90% ili čak 99% kako se meri ogledom konkurentnog vezivanja (videti, npr., Junghans et al., Cancer Res, 1990:50:1495-1502). Alternativno, dva antitela imaju isti epitop ako u suštini sve mutacije amino kiselien u antigenu koje smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog antitela smanjuju ili eliminišu vezivanje tog drugog. Dva antitela imaju epitope koji se preklapaju ako neke mutacije amino kiseline koje smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog antitela smanjuju ili eliminišu vezivanje tog drugog.
[0077] Dodatno rutinsko eksperimentisanje (npr., analize mutacije peptida i vezivanja) mogu zatim da budu izvedeni da bi se potvrdilo da li će primećen nedostatak vezivanja testiranog antitela zapravo da bude usled vezivanja na isti epitop kao referentno antitelo ili da li sterno blokiranje (ili drugi fenomen) koji je odgovoran za nedostatak primećenog vezivanja. Eksperimente ovog tipa moguće je izvesti korišćenjem ogleda ELISA, RIA, rezonance površinskog plazmona, protočne citometrije ili bilo koje druge kvantitativne ili kvalitativne analize za vezivanje antitela kojie je dostupno u ovoj oblasti.
Imunokonjugati
[0078] Ovaj pronalazak obuhvata humano anti-ANGPTL3 monoklonalno antitelo konjugovano u terapijski deo ("imunokonjugat"), kao što je citotoksin, hemoterapijski lek, imunosupresant ili radioizotop. Agensi citotoksina obuhvataju bilo koji agens koji je štetan za ćelije. Primeri
2
pogodnih agenasa citotoksina i hemoterapijskih agenasa za formiranje imunokonjugata su poznati u ovoj oblasti, videti na primer, WO 05/103081.
Bispecifičnosti
[0079] Antitela iz ovog pronalaska mogu biti monospecifična, bispecifična, ili višestrukospecifična antitela. Višestruko specifična mAb mogu biti specifična za različite epitope jednog ciljnog polipeptida ili mogu obuhvatiti domene koji vezuju antigen specifične za više od jednog ciljnog polipeptida. Videti, npr., Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147:60-69. Humana antihANGPTL3 mAb mogu biti povezana na ili koizražena sa drugim funkcionalnim molekulom, npr., drugim peptidom ili proteinom. Na primer, antitelo ili njegov fragment može biti funkcionalno povezano (npr., hemijskim spajanjem, genetskom fuzijom, nekovalentnom vezom ili drugačije) na jedan ili više drugih molekularnih entiteta, kao što je drugo antitelo ili fragment antitela da bi se proizvelo bispecifično ili višestruko specifično antitelo sa drugom specifičnošću vezivanja.
[0080] Primer formata bispecifičnog antitela koje je moguće koristiti u kontekstu ovog ponalaska obuhvata upotrebu prvog domena imunoglobulina (Ig) CH3 i drugog domena Ig CH3, pri čemu se prvi i drugi domeni Ig CH3 razlikuju jedan od drugog u samo jednoj amino kiselini, i pri čemu barem jedna razlika amino kiseline smanuje vezivanje bispecifičnog antitela na Protein A kada se uporedi sa bi-specifičnim antitelom kom nedostaje ta razlika amino kiseline. U jednom izvođenju, prvi domen Ig CH3 vezuje Protein A i drugi domen Ig CH3 obuhvata mutaciju koja smanjuje ili poništava vezivanje Proteina A kao što je H95R modifikacija (prema IMGT numeraciji eksona; H435R prema EU numeraciji). Drugi CH3 može još da obuhvata Y96F modifikaciju (prema IMGT; Y436F prema EU). Dalje modifikacije koje je moguće pronaći unutar drugog CH3 obuhvataju: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, i V82I (prema IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, i V422I prema EU) u slučaju IgG1 antitela; N44S, K52N, i V82I (IMGT; N384S, K392N, i V422I prema EU) u slučaju IgG2 antitela; i Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, i V82I (prema IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, i V422I prema EU) u slučaju IgG4 antitela. Varijacije u formatu bispedifičnog antitela koje su opisane gore se razmatraju.
Bioekvivalenti
[0081] Anti-hANGPTL3 antitela i fragmenti antitela iz ovog opisa obuhvataju proteine sa sekvencama amino kiseline koje se razlikuju od onih u opisanim mAb, ali koje zadržavaju sposobnost da se vežu na humani ANGPTL3. Takva varijantna mAb i fragmenti antitela obuhvataju jedan ili više dodataka, brisanja, suspstitucija amino kiselina kada se uporede sa roditeljskom sekvencom, ali ispoljavaju biološku aktivnost koja je u suštini ekvivalentna aktivnosti opisanog mAb. Pored toga, anti-hANGPTL3 sekvence DNK koje kodiraju antitelo iz ovog opisa obuhvataju sekvence koje obuhvataju jedno ili više dodavanja, brisanja, ili supstitucija nukleotida kada se uporede sa opisanom sekvencom, ali koja kodira anti-hANGPTL3 antitelo ili fragment antitela koje je u suštini bioekvivalentno anti- hANGPTL3 antitelu ili fragmentu antitela iz ovo opisa. Primeri takvih varijanti sekvenci amino kiseline i sekvenci DNK se razmatraju gore u tekstu.
[0082] Dva proteina koja vezuju antigen, ili antitela, se posmatraju kao bioekvivalentna ako su, na primer, farmaceutski ekvivalenti ili farmaceutske alternative čija brzina i nivo apsorpcije ne pokazuju značajnu razliku kada se isporuče u istoj molarnoj dozi pod sličnim eksperimentalnm uslovima, bilo kao pojedinačna doza ili višestruka doza. Neka antitela će biti posmatrana kao ekvivalenti ili farmaceutske alternative ako su ekvivalenti u nivou njihove apsorpcije ali ne u njihovoj brzinii apsorpcije i ipak mogu biti posmatrani kao bioekvivalenti jer su takve razlike u brzini apsorpcije namerne i odražavaju se na oznakama, nisu ključne za dobijanje delotvornih koncentracija leka u telu za, npr., hroničnu upotrebu, i smatraju se medicinski nevažnim za specifični proučavan proizvod lek. U jednom varijantnom rešenju, dva proteina koja vezuju antigen su bioekvivalenti ako ne postoje kilnički značajne razlike za njihovu bezbednost, čistoću i jačinu.
[0083] U jednom varijantnom rešenju, dva proteina koja vezuju antigen su bioekvivalenti ako pacijent može da bude prebačen jednom ili više puta između referentnog proizvoda i biološkog proizvoda bez očekivanog povećanja rizika od neželjenih dejstava, uključujući klinički značajnu promenu imunogenosti, ili smanjenu delotvornost, u poređenju sa kontinuiranom terapijom bez takvog prebacivanja.
[0084] U jednom varijantnom rešenju, dva proteina koja vezuju antigen su bioekvivalenti ako su oba prema uobičajenom mehanizmu ili mehanizmima aktivnosti za stanje ili stanja upotrebe, do nivoa do kog su takvi mehanizmi poznati.
[0085] Bioekvivalenti mogu biti prikazani putem in vivo i in vitro postupaka. Merenje bioekvivalentnosti obuhvata, npr., in vivo test kod ljudi ili drugih sisara, u kom se koncentracija antitela ili njegovih metabolita meri u krvi, plazmi, serumu, ili drugom biološkom fluidu kao što je funkcija vremena; (b) in vitro test koji je doveden u vezu sa i razumno predvidiv kada je reč o humanim in vivo podacima biodosupnosti; (c) in vivo test na ljudima ili drugim sisarima kod kojih se odgovarajuće akutno farmakološko dejstvo antitela (ilI njegovog cilja) meri kao funkcija vremena; i (d) u dobro kontrolisanom kliničkom ispitivanju koje uspostavlja bezbednost, efikasnot, ili biodostupnost ili bioekvivalentnost nekog antitela.
[0086] Bioekvivalentne varijante anti-hANGPTL3 antitela iz ovog opisa moguće je konstruisati putem, na primer, pravljenja različitih supstitucija ostataka ili sekvenci ili brisanja terminalnih ili unutrašnjih ostataka ili sekvenci koje nisu potrebne za biološku aktivnost. Na primer, ostaci cisteina koji nisu ključni za biološku aktivnost mogu biti obrisani ili zamenjeni sa drugim amino
2
kiselinama da bi se sprečilo formiranje bespotrebnih ili pogrešnih unutarmolekularnih disulfidnih mostova posle renaturacije.
Terapijska isporuka supstance i formulacije
[0087] Ovaj pronalazak daje terapijske supsance koje obuhvataju anti-hANGPTL3 antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen iz ovog pronalaska i takođe se odnose na terapijske postupke korišćenjem istih. Isporuka terapijskih supstanci u skladu sa ovim pronalaskom biće isporučena sa pogodnim nosačima, ekscipijentima, i drugim agensima koji su inkorporirani u formulacije da bi se obezbedio poboljšan transfer, isporuka, tolerancija, i slično. Više odgovarajućih formulacija moguće je naći u formularu (spisku medicinskih supstanci i lekova) poznatom svim farmacutskim hemičarima: Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Ove formulacije obuhvataju, na primer, prahove, paste, masti, gelove, voskove, ulja, lipide, mehuriće koji sadrže lipid (katjonski ili anjonski) (kao što je LIPOFECTIN™), konjugate DNK, anhidrovane apsorpcione paste, emulzije ulje u vodi i voda u ulju, emulzije carbowax (polietilen glikoli različitih molekularnih težina), polučvrsti gelovi, i polučvrste mešavine koje sadrže carbovax. Videti takođe Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.
[0088] Ta doza može varirati zavisno od starosti i veličine subjekta kom će biti isporučena, ciljne bolesti, svrhe lečenja, stanja, rute isporuke, i slično. Kada se antitelo iz ovog pronalaska koristi za lečenje različitih stanja i bolesti direktno ili indirektno povezanih sa ANGPTL3, uključujući hiperholesterolemiju, poremećaje povezane sa LDL i apolipoproteinom B, i poremećaje metabolizma lipida, i slične, kod odraslog pacijenta, prednost je intravenozno ili potkožno isporučiti antitelo iz ovog pronalaska kao jednu dozu od oko 0,01 do oko 20 mg/kg telesne težine, još preporučljivije oko 0,02 do oko 7, oko 0,03 do oko 5, ili oko 0,05 do oko 3 mg/kg telesne težine. Zavisno od ozbiljnosti stanja, učestalosti i trajanja lečenje je moguće podesiti. Kod izvesnih izvođenja, antitelo ili njegov fragment vezivanja antigena iz ovog pronalaska moguće je isporučiti kao početnu dozu od barem oko 0,1 mg do oko 800 mg, oko 1 do oko 500 mg, oko 5 do oko 300 mg, ili oko 10 do oko 200 mg, do oko 100 mg, ili do oko 50 mg. Kod izvesnih izvođenja, početnu dozu je moguće isporuiti posle isporuke druge ili više naknadnih doza antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen u količini koja može približno biti ista ili manja od količine početne doze, pri čemu se naknadne doze odvajaju vremenom od barem 1 dan do 3 dana; barem jedne nedelje, barem 2 nedleje; barem 3 nedelje; barem 4 nedelje; barem 5 nedelja; barem 6 nedelja; barem 7 nedelja; barem 8 nedelja; barem 9 nedelja; barem 10 nedelja; barem 12 nedelja; ili barem 14 nedelja.
[0089] Poznati su razlčiti sistemi isporuke i moguće ih je koristiti da bi se isporučila farmaceutska supstanca iz ovog pronalaska, npr., kapsulacija u lipozome, mikročestice,
2
mikrokapsule, rekombinantne ćelije koje mogu da izražavaju mutirane viruse, receptorom posredovanu endocitozu (videti, npr., Wu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Metode uvođenja obuhvataju, ali se ne ograničavaju na, intradermalnu, intramuskularnu, intraperitonealnu, intravenoznu, potkožnu, intranazalnu, epiduralnu, i druge rute. Supstancu je moguće isporučiti bilo kojom prikladnom rutom, na primer infuzijom ili bolusnom injekcijom, apsorpcijom kroz obloge epitela ili sluzokože (npr., oralna sluzokoža, sluzokoža rektuma i sluzokoža creva, itd.) i moguće ih je isporučiti zajedno sa drugim biološki aktivnim agensima. Isporuka može biti sistemska ili lokalna.
[0090] Farmaceutska supstanca moguće je takođe isporučiti u mehuriću, posebno lipozomu (videti Langer (1990) Science 249:1527-1533; Treat et al. (1989) u Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer (Lipozomi u terapiji infektivnih bolesti i kancera), Lopez Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365; Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; videti generalno ibid.).
[0091] U izvesnim situacijama, farmaceutsku supstancu moguće je isporučiti u sistemu sa kontrolisanim ispuštanjem. U jednom izvođenju, pumpu je moguće koristiti (videti Langer, supra; Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). U drugom izvođenju, moguće je koristiti polimerne materijale; videti, Medical Applications of Controlled Release (Medicinske primene kontrolisanog otpuštanja), Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974). U nekom drugom izvođenju, sistem kontrolisanog otpuštanja moguće je postaviti u blizinu cilja te supstance, dakle zahteva samo frakciju sistemske doze (videt, npr., Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol.2, pp.115-138, 1984).
[0092] Preparati koje je moguće ubrizgati mogu obuhvatiti oblike doze za intravenozne, potkožne, intrakutane i intramuskularne injekcije, infuzije kap po kap, itd. Ove preparati koje je moguće ubrizgati moguće je dobiti opšte poznatim metodama. Na primer, preparate koje je moguće ubrizgati moguće je dobiti, npr. rastvaranjem, suspendovanjem ili emulzifikovanjem antitela ili gore opisane soli u sterilnoj vodenoj podlozi ili uljnoj podlozi koja se uobičajeno koristi za injekcije. Kao vodeni medijum za injekcije, postoje, na primer, fiziološki slanir rastvor, izotonični rastvor koji obuhvata glukozu i druge pomoćne agense, npr., koji je moguće koristiti u kombinaciji sa odgovarajućim rastvarajućim agensom kao što je alkohol (npr., etanol), polialkohol (npr., propilen glikol, polietilen glikol), nejonski surfaktant [npr., polisorbat 80, HCO-50 (polioksietilen (50 mol) adukt hidrogenisanog ricinusovog ulja)], itd. Kao uljna podloga, koriste se, npr., susamovo ulje, sojino ulje, itd., koje je moguće koristiti u kombinacij sa rastvarajućim agensom kao što je benzil benzoat, benzil alkohol, itd. Injekcija pripremljena na taj način se poželjno puni u odgovarajuću ampulu. Farmaceutsku supstancu iz ovog pronalaska moguće je isporučiti potkožno ili intravenozno sa standardnom iglom i špricem. Pored toga, u vezi sa potkožnom isporukom, uređaj za isporuku u vidu olovke isto tako ima primene za isporuku farmaceutske supstance iz ovog pronalaska. Takav uređaj za isporuku u vidu olovke
2
moguće je ponovo koristiti ili upotrebiti samo jednokratno. Uređaj za isporuku u vidu olovke za ponovnu upotrebu generalno koristi zamenjivu patronu koja sadrži farmaceutsku supstancu. Pošto se cela farmaceutska supstanca u patroni isporuči i patrona se isprazni, prazna patrona može lako da se baci i zameni novom patronom koja sadrži tu farmaceutsku supstancu. Uređaj za isporuku u vidu olovke moguće je ponovo koristiti. Kod uređaja za isporuku u vidu olovke za jednokratnu upotrebu, ne postoji patrona koju je moguće zameniti. Pored toga, uređaj za isporuku u vidu olovke za jednokranu upotrebu se isporučuje prethodno napunjen sa farmaceutskom supstancom držanom u rezervoaru sa uređajem. Pošto se iz rezervoara isprazni farmaceutska supstana, ceo uređaj se odloži u smeće.
[0093] Brojni uređaji za isporuku leka sa ponovnom upotrebom u vidu olovke ili kao autoinjektori imaju primene u potkožnoj isporuci farmaceutske supstance iz ovog pronalaska. Primeri obuhvataju, ali svakako nisu ograničeni na AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC™ olovka (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Switzerland), HUMALOG MIX 75/25™ olovka, HUMALOG™ olovka, HUMALIN 70/30™ olovka (Eli Lilly and Co., Indianapolis,IN), NOVOPEN™ I, II i III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), BD™ olovka (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™, i OPTI- CLIK™ (sanofiaventis, Frankfurt, Germany), da se pomenu samo neki. Primeri uređaja za isporuku u vidu olovke za jednokratnu upotrebu imaju primene u potkožnoj isporuci farmaceutske supstance iz ovog pronalaska obuhvataju, ali se sasvim sigurno ne ograničavaju na SOLOSTAR™ olovku (sanofi-aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk), i KWIKPEN™ (Eli Lilly).
[0094] Kao pogodnost, farmaceutske supstance za oralnu i parenteralnu upotrebu opisane gore u tekstu se dobijaju u doziranim oblicima u jediničnoj dozi pogodnoj da odgovara dozi aktivnih sastojaka. Takvi oblici doze u jediničnoj dozi obuhvataju, na primer, tablete, pilule, kapsule, injekcije (ampule), supozitorije, itd. Količina gore pomenutog antitela generalno ima sadržinu oko 0,1 do oko 800 mg po obliku doze u jediničnoj dozi; posebno u obliku injekcije, gore pomenuto antitelo je sadržano u oko 1 do oko 500 mg, u oko 5 do 300 mg, u oko 8 do 200 mg, i u oko 10 do oko 100 mg za druge oblike doze.
Kombinovane terapije
[0095] Ovaj pronalazak još obezbeđuje hANGPTL3 antitela ili njegove fragmente iz ovog pronalaska u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapijskih agenasa za upotrebu u terapijskim metodama za lečenje bolesti ili poremećaja, kako je definisano u patentnim zahtevima, koji se direktno ili indirektno povezuju sa hANGPTL3. Dodatni terapijski agens može biti jedan ili više agenasa koji se kombinuje pogodno sa jednim ili više antitela ili njegovih fragmenata iz ovog pronalaska, uključujući inhibitore HMG-CoA reduktaze, kao što je cerovastatin, atorvastatin,
2
simvastatin, pitavastin, ros uvastatin, fluvastatin, lovastatin, pravastatin, i slični; niacin; različiti fibrati, kao što je fenofibrat, bezafibrat, ciprofibrat, klofibrat, gemfibrozil, i slični; aktivatori faktora transkripcije LXR, i slični. Pored toga, hANGPTL3 antitelo ili njegov fragment iz ovog pronalaska može biti istovremeno isporučen sa drugim ANGPTL3 inhibitorima kao i inhibitorima drugih molekula, kao što je ANGPTL4, ANGPTL5, ANGPTL6 i pretvaranja proproteina subtilisinskog/keksinskog tipa 9 (PCSK9), koji su uključeni u metabolizam lipida, specifično, homeostazu holesterola i/ili triglicerida. Inhibitori ovih molekula obuhvataju male molekule i antitela koja specifično vezuju na ove molekule i blokiraju njihovu aktivnost (videti, na primer, anti-PCSK9 antitela opisana u U.S.2010/0166768 A1).
[0096] Pored toga, dodatni terapijski agens može biti jedan ili više agenasa protiv kancera, kao što su hemoterapiski agensi, anti-angiogenski agensi, agensi inhibicije rasta, citotoksični agensi, apopototski agensi, i drugi agensi dobro poznati u ovoj oblasti za lečenje kancera ili drugih proliferativnih bolesti ili poremećaja. Primeri anti-kancernih agenasa obuhvataju, ali se ne ograničavaju na, antimitotski agens,kao što je docetaksel, paklitaksel, i slični; hemoterapijsko jedinjenje na bazi platine, kao što je cisplatin, karboplatin, iproplatin, oksaliplatin, i slični; ili drugi standardni citotoksični agens, kao što je 5-fluorouracil, kapecitabin, irinotekan, leukovorin, gemcitabin, i slični, i anti-angiogenski agensi, uključujući vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF) antagoniste, kao što su anti-VEGF antitela, npr., bevacizumab (AVASTIN®, Genentech) i blokator VEGF na bazi receptora, npr., "VEGF zamka" opisano u US Patent br.
7,070,959, delta slični antagonisti liganda 4 (DII4), kao što su anti-DII4 antitela kako je opisano u U.S. objavi prijave patenta br. 2008/0181899, i proteinu fuzije koji obuhvata vanćelijski domen DII4, npr., DII4-Fc kako je opisano u U.S. objavi prijave patenta br.
2008/0107648; inhibitori receptora tirozin kinaza i/ili angiogeneza, uključujući sorafenib (NEXAVAR® iz Bayer Pharmaceuticals Corp.), sunitinib (SUTENT® iz Pfizer), pazopanib (VOTRIENT™ iz GlaxoSmithKline), toceranib (PALLADIA™ iz Pfizer), vandetanib (ZACTIMA™ iz AstraZeneca), cediranib (RECENTIN® iz AstraZeneca), regorafenib (BAY 73-4506 iz Bayer), aksitinib (AG013736 iz Pfizer), lestaurtinib (CEP-701 iz Cephalon), erlotinib (TARCEVA® iz Genentech), gefitinib (IRESSA™ iz AstraZeneca), BIBW 2992 (TOVOK™ iz Boehringer Ingelheim), lapatinib (TYKERB® iz GlaxoSmithKline), neratinib (HKI-272 iz Wyeth/Pfizer), i slične, i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate bilo kog od gore navedenih. Pored toga, drugi terapijski agensi, kao što su analgetici, anti-inflammatorni agensi, uključujući nesteroidne antiinflamatorne lekove, (NSAIDS), kao što su Cox-2 inhibitori, i slični, mogu takođe da budu istovremeno isporučeni sa hANGPTL3 antitelom ili njegovim fragmentom iz ovog pronalaska da bi poboljšali i/ili smanjili simptome koji prate kancer/tumor koji leži u osnovi.
[0097] Antitelo hANGPTL3 ili njegov fragment iz ovog pronalaska i dodatni terapijski agens(i) mogu biti isporučeni zajedno ili odvojeno. Kada se koriste odvojene formulacije doziranja, antitelo ili njegov fragment iz ovog pronalaska i dodatni agensi mogu biti isporučeni
2
istovremeno, ili odvojeno ili u određenim vremenskim razmacima, t.j., u sledu, odgovarajućim redosledima.
Dijagnostičke upotrebe antitela
[0098] Antitela anti-ANGPTL3 iz ovog pronalaska moguće je takođe koristiti da bi se detektovao i/ili izmerio ANGPTL3 u uzorku, npr., u dijagnostičke svrhe. Na primer, anti-ANGPTL3 Ab ili njegov fragment, moguće je koristiti da bi se dijagnostikovalo stanje ili bolest koju karakteriše nepravilna ekspresija (npr., prekomerna ekspresija, nedovoljna ekspresija, nedostatak ekspresije, itd.) ANGPTL3 antitela. Dijagnostički ogledi kao primer za ANGPTL3 mogu obuhvatiti, npr., dovođenje u kontakt uzorka dobijenog iz pacijenta, sa anti-ANGPTL3 Ab iz ovog pronalaska, pri čemu je to anti-ANGPTL3 antitelo označeno sa detektibilnom oznakom molekula reportera ili korišćeno da se uhvati i izoluje ANGPTL3 protein iz uzoraka pacijenta. Alternativno, neoznačeno anti-ANGPTL3 Ab moguće je koristiti u dijagnostičkim primenama u kombinaciji sa sekundarnim antitelom koje je samo detektibilno označeno. Detktibilna oznaka ili molekul reporter može biti radioizotop, kao što je<3>H,<14>C,<32>P,<35>S,<131>I ili<125>I; fluorescentni ili hemiluminescentni deo, kao što je fluorescein izotiocijanat, ili rodamin; ili enzim kao što je alkalna fosfataza, β-galaktozidaza, peroksidaza rena, ili luciferaza. Ogledi koje je moguće koristiti da bi se detektovao ili izmerio ANGPTL3 u uzorku obuhvataju sa enzimom povezan imunosorbent test (ELISA), radioimunotest (RIA), razvrstavanje ćelija aktiviranih fluorescencijom (FACS), i slično.
PRIMERI
[0099] Primeri u nastavku su izneti da bi se prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti dao potpuno otkrivanje i opis kako da pravi i koristi postupke i supstance iz ovog pronalaska, i nisu predviđeni da ograniče obim predmeta koji ovi pronalazači smatraju svojim pronalaskom. Nastojalo se da se osigura preciznost kada je reč o korišćenim brojevima ali neke eksperimentalne greške i odstupanja treba uzeti u obzir kao moguće. Osim ako nije drugačije navedeno, molekularna težina je prosečna molekularna težina, temperatura u stepenima Celzijusove skale, i pritisak je na ili blizu atmosferskog.
Primer 1: Generisanje humanih antiela u humano ANGPTL3
[0100] VELOCIMMUNE™ miševi su imunizovani sa humanim ANGPTL3, i odgovor imunog sistema je nadgledan imunoogledom specifičnim za antigen korišćenjem seruma dobijenog iz ovih miševa. Anti-hANGPTL3 ekspresija B ćelija koje su prikupljene iz jetri imunizovanih miševa kod kojih je utvrđeno da imaju povišene titre anti-hANGPTL3 antitela i spojene su sa mišjim ćelijama mijeloma da bi formirali hibridome. Hibridomi su pregledani i izabrani da bi se utvrdile linije ćelija kod kojih postoji ekspresija hANGPTL3-specifičnih antitela korišćenjem ogleda kako je opisano ovde dole u tekstu. Ovi ogledi su prepoznali nekoliko linija ćelije koje su proizvele himerna anti-hANGPTL3 antitela, npr., H1M896N.
[0101] Humana ANGPTL3 specifična antitela su takođe izolovana direktno iz antigenom imunizovanih B ćelija bez fuzije na ćelije mijeloma kako je opisano u prijavi patenta u S.A.D. br. U.S. 2007/0280945 A1. Promenljivi regioni teškog i lakog lanca su klonirani da bi generisali potpuno humana anti-hANGPTL3 antitela iz IgG4 izotipa projektovana kao H4H1248P, H4H1250P, H4H1263S, H4H1268S, H4H1276S, H4H1279P, H4H1282P, H4H1292P, H4H1295P i H4H1296P. Uspostavljene su stabilne rekombinantne linije ćelije CHO iz kojih postoji ekspresija antitela CHO.
Primer 2. Analiza korišćenja promenljivog gena
[0102] Da bi se analizirala struktura proizvedenih antitela, nukleinske kiseline koje kodiraju promenlive regione antitela su klonirane i sekvencirane. Iz sekvence nukleinske kiseline i predviđene sekvence amino kiseline antitela, upotreba gena je utvrđena za svaki promenljiivi region teškog lanca (HCVR) i promenljivi region lakog lanca (LCVR). Tabela 1 pokazuje upotrebu gena za izabrana antitela u skladu sa ovim pronalaskom.
Tabela 1
[0103] Tabela 2 pokazuje promenljivi region teškog i lakog lanca para sekvenci amino kiseline
1
izabran iz anti-hANGPTL3 antitela i njihovih odgovarajućih identifikatora antitela. Ta N, P i S naznačenja se odnose na antitela koja imaju teške i lake lance sa identičnim CDR sekvencama ali sa varijacijama sekvence u regionima koji padaju izvan sekvence CDR (t.j. u okvirnim regionima). Dakle, N, P i S varijante specifičnog antitela imaju identične sekvence CDR unutar njihovih promenljivih regiona teškog i lakog lanca ali sadrže modifikacije unutar okvirnih regiona.
Tabela 2
Primer 3. Kinetički parametri anti-hANGPTL3 antitela koji se vezuju na ANGPTL3
[0104] Svi kinetički eksperimenti vezivanja su izvedeni na 25°C ili 37°C na BIACORE™ T200 instrumentu molekularne interakcije bez oznake (GE Healthcare) korišćenjem CM5 sensorskog čipa. Ukratko, površina registrovanja antigena je generisana pomoću kovalentnog spajanja bilo anti-mišjeg IgG-specifičnog antitela (anti-mFc; GE Healthcare; katalog #BR-1008-38) ili antipentahistidin-specifičnog antitela (Qiagen; katalog #34660) na površini CM5 senzorskog čipa korišćenjem standardne metode spajanja amina. Korišćenje HBS-EP (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% surfaktanta P20, pH 7,.4) ili PBSP (10 mM natrijum fosfata, 2,7 mM KCI, 137 mM NaCl, 0,025% surfaktant P20, pH 7,2 ili 5,75) kao radnog puferskog sredstva, varijante humanog i drugih vrsta ANGPTL3 sa oznakama oligohistidina su registrovane na površini spojenoj na anti-penta-histidin sve dok nije dobijen odgovor vezivanja od 4,4- 46., RU. Registrovani rekombinantni proteini su bili: zreli humani ANGPTL3 pune dužine (t.j., ostaci amino kiseline 17-460 od SEK ID BR:161) sa oznakom dekahistidina na C terminalu [hANGPTL3(17-460)-His; R&D Systems, MN; katalog #3829-AN], domain spiralne zavojnice N terminala hANGPTL3 (t.j., ostatke amino kiseline 17-170 od SEK ID BR:161) obuhvata oznaku heksahistidina na C terminalu [hANGPTL3(17-170)-His], domen spiralne zavojnice na N terminalu ANGPTL3 od Macaca fascicularis [t.j. ostataka amino kiseline 17-170 od SEK ID BR:177 (delimična sekvenca Macaca fascicularis ANGPTL3)] koja obuhvata oznaku myc-mycheksahistidina [MfANGPTL3(17-170)-mmH; SEK ID BR:167], zreli ANGPTL3 pune dužine Mus musculus (t.j. ostatke amino kiseline 17-455 od SEK ID BR:163) sa oznakom dekahistidina C terminalu mANGPTL3(17-455)-His; R&D Systems, MN; katalog #136-AN], domen spiralne
2
zavojnice N terminala od ANGPTL3 iz Mus musculus (t.j. ostataka amino kiseline 17-240 od SEK ID BR:163) koji obuhvata oznaku heksahistidina [mANGPTL3(17-240)-His; SEK ID BR:166], i domen spiralne zavojnice N terminala od ANGPTL3 iz Rattus norvegicus (t.j., ostataka amino kiseline 17-240 od SEK ID BR:175) obuhvata oznaku myc-myc-heksahistidina [rANGPTL3(17-240)-mmH; SEK ID BR:176]. Pored toga, domen spiralne zavojnice N terminala od hANGPTL3 (t.j., ostataka amino kiseline 17-169 od SEK ID BR:161) obuhvata Fc fuziju mišjeg C terminala [hANGPTL3(17-169)-mFc; SEK ID BR:165] je registrovana na površini spojenoj na anti-mFc sve dok nije dobijen odgovor vezivanja 24,8 ± 1,5 RU. Da bi se izmerile brzine udruživanja i disocijacije za formiranje kompleksa antitelo/antigen, jedna (Tabele 3 i 7) ili više (Tabele 4-6) koncentracije antitela su ubrizgane na površinu registrovanog proteina brzinom protoka od 50 µl/minutu tokom 3 minuta i disocijacija kompleksa je nadgledana tokom 20 minuta. Podaci vezivanja su obrađeni i stavljeni u 1:1 model vezivanja sa transportom mase korišćenjem Scrubber verzija 2.0a (BioLogic Software). Kinetički poluživot (t1/2) je izračunat iz brzine konstante disocijacije, kd.
[0105] Tabela 3 pokazuje vezivanje različitih anti-ANGPTL3 antitela na hANGPTL3 pri 25°C, pH 7,4, u HBS-EP puferskom sredstvu.
Tabela 3
[0106] Kao što je prikazano u Tabeli 3, anti-hANGPLT3 antitela su vezana na protein pune dužine sa oznakom dekahistidina na C terminalu [hANGPTL3(17-460)-His] sa izračunatom ravnotežom konstanti disocijacije (KD= kd/ka) u opsegu od 96,8 pM do 5,62 nM i na domenu spiralne zavojnice N terminusa sa Fc fuzijom C terminala [hANGPTL3(17-169)-mFc] sa KDs u opsegu od 8,41 pM do 6,23 nM.
[0107] Tabele 4 i 5 pokazuju vezivanje između vrsta H4H1276S na ANGPTL3 pri 25°C i 37°C, prema opisanom redosledu, na pH 7,4, u HBS-EP puferskom sredstvu. Tabela 6 pokazuje vezivanje H4H1276S to humani i makaki ANGPTL3, pri 25°C ili 37°C, na pH 5,75 ili pH 7,2, u PBSP puferskom sredstvu.
Tabela 4
4
Tabela 6
[0108] Kako je prikazano u Tabelama 4-6, antitelo H4H1276S je ispoljilo vezivanje na ANGPTL3 iz majmuna, miša, i pacova sa afinitetima vezivanja i kinetičkim konstantama sličnim onima za vezivanje na humani ANGPTL3.
[0109] Tabela 7 pokazuje vezivanje izabranih anti-ANGPTL3 antitela na hANGPTL3 i mANGPTL3 pri 37°C, pH 7,4, u HBS-EP puferskom sredstvu. NB: Nije vezano.
Tabela 7
[0110] Kao što je prikazano u Tabeli 7, anti-hANGPLT3 antitela su se vezala na protein pune dužine sa oznakom dekahistidina C terminala [hANGPTL3(17-460)-His] na pH 7,4 i 37°C sa izračunatom ravnotežom konstanti disocijacije (KD= kd/ka) u opsegu od 158 pM do 1,02 nM i na mišji ANGPTL3 [mANGPTL3(17-455)-His] sa KDs u opsegu od 167 pM do 682 pM, izuzev za H4H1248P i H4H1263S, što nije pokazalo detektibilno vezivanje na mANGPTL3. Ovde su takođe prikazane vrednosti za kinetički poluživot trajanja (t1/2).
Primer 4. Biacore studija unakrsnog takmičenja za Anti-ANGPTL3 antitela
[0111] Eksperimenti takmičenja između vrsta su izvedeni na temperaturi od 25°C na Biacore su u suštini opisani u Primeru 3 gore. Ukratko, korišćenje HBS-EP kao radnog puferskog sredstva, puna dužina hANGPTL3 (t.j., ostataka amino kiseline 17-460 od SEK ID BR:161) sa oznakom dekahistidina na C terminalu [hANGPTL3(17-460)-His; R&D Systems, MN; katalog #3829-AN] je registrovano na površini spojenoj na anti-penta-histidin sve dok nije dostignut odgovor vezivanja 64 RU. Da bi se utvrdilo da li bi dva antitela mogla da se vežu istovremeno na registrovan ANGPTL3, parovima antitela su izbrizgane u sledu, svaki na 167 nM pri brzini protoka od 4 µl/minutu tokom 15 minuta, na površini, i signal odgovora maksimalnog vezivanja (RU) je izmeren za svaki događaj vezivanja. Rezultati su prikazani u Tabeli 8 sa odgovorom u vidu vezivanja za prvo antitelo (mAb1), posle čega je usledio odgovor vezivanja za drugo antitelo (mAb2) na ANGPTL3 površini na koju je prethodno stavljeno prvo antitelo. Brojevi masnim slovima označavaju da su parovi antitela sposobni da se vežu na hANGPTL3 istovremeno. Brojevi kurzivom označavaju da su ti parovi antitela sposobni da se vežu na hANGPTL3 istovremeno kada je dodato u sledu u jednom smeru ali ne i u drugom. Zagrade označavaju tamičenje sa samim sobom (self-self).
Tabela 8
[0112] Kao što je prikazano u Tabeli 8, parovi antitela H1M896N/H4H1279P i H1M896N/H4H1292P su mogli da se vežu istovremeno na imobilizovan ANGPTL3, bez obzira na redosled dodavanja antitela. H4H1250P se vezao na ANGPTL3 prethodno vezan sa H4H1279P; međutim, kada je redosled dodavanja antitela obrnut, H4H1279P je ispoljio signal vezivanja približno 24% od očekivanog maksimalnog odgovora pošto je ANGPTL3 bilo prethodno vezano sa H4H1250P. Slično, H4H1250P se vezao na ANGPTL3 prethodno vezan sa H4H1292P; međutim, kada je redosled dodavanja antitela obrnut, H4H1292P je ispoljio signal vezivanja približno 20% od očekivanog maksimalnog odgovora pošto je ANGPTL3 bio prethodno vezan sa H4H1250P.
Primer 5. Vezivanje anti-hANGPTL3 antitela na ANGPTL3 peptide spiralne zavojnice N terminala
[0113] Da bi se procenilo vezivanje anti-ANGPTL3 antitela H4H1276S na peptide izvedene iz regiona spiralne zavojnice N terminala ANGPTL3, izveden je ogled vezivanja biosenzora bez oznake korišćenjem OCTET® RED sistema (FortéBio, Inc.). Za imobilizaciju na senzor, peptidi su označeni sa bilo oznakom biotina na N terminalu [odvojen fleksibilnim linkerom, amino kiseline "AGSSPGG" (SEK ID BR:171), za Peptid 1 i Peptid 2; i amino kiseline "GGGGS" (SEK ID BR:172) za Peptid 3], ili oznaka biotina na C terminalu [odvojeno fleksibilnim linkerom, amino kiselinama "GPSSGAPPPK" (SEK ID BR:173), za Peptid 1 i Peptid 2; i amino kiseline "GGGGSK" (SEK ID BR:174) za Peptid 3]. Testirane sekvence peptida su bile: peptid negativna kontrola A, Peptid 1 sa oznakom biotina na N terminalu (SEK ID BR:168; ostaci Arg34 na Leu66 od humanog ANTGPTL4 od SEK ID BR:164); i peptidi izvedeni iz regiona spiralne zavojnice N termina ANGPTL3, t.j., Peptid 2 sa oznakom biotina na N terminalu (SEK ID BR:169; ostaci Arg36 do Leu68 od hANGPTL3 od SEK ID BR:161); Peptid 2 sa oznakom biotina na C terminalu; Peptid 3 sa oznakom biotina na N terminalu (SEK ID BR:170; odgovara ostacima Glu32 do Leu57 od hANGPTL3 od SEK ID BR:161); i Peptid 3 sa oznakom biotina na C terminalu. Sekvence peptida su takođe prikazane na Slici 1. Streptavidinom obloženi vrhovi biosenzora su obloženi sa biotinilisanim peptidima koji daju kao rezultat 1,22-2,26 nm jedinice odgovora vezivanja zavisno od peptida. Peptidom obloženi vrhovi biosenzora su zatim uronjeni u pregrade sa 1 µM bilo anti-ANGPTL3 antitela H4H1276S ili izotipom odgovarajuće negativno kontrolno antitelo, i vezivanje je nadgledano tokom 2,5 minuta. Odgovor u vidu vezivanja H4H1276S i izotipnog kontrolnog antitela na svakom od peptida je sažeto prikazano na Slici 2. Primećeno je da se H4H1276S veže na ANGPTL3 linearnu sekvencu definisanu Peptidom 2 ali ne preklapajuću već distinktivnu sekvencu definisanu Peptidom 3 (videti takođe Slika 1). Izotipno kontrolno antitelo je takođe služilo kao pozitivna kontrola za postavljanje Peptida 1 (t.j., hANGPTL4 peptid) na biosenzor, jer izotipno kontrolno antitelo specifično prepoznaje hANGPTL4. Kao što je prikazano na Slici 2, vezivanje kontrolnog antitela na Peptide1 je potvrdilo da je Peptid 1 bio prisutan na površini senzora i tako je bilo i sa drugim peptidima.
Primer 6. Inhibicija hANGPTL3 anti-hANGPTL3 antitelima u LPL bioogledima
[0114] Lipaza lipoproteina (LPL) igra ključnu ulogu u metabolizmu lipida kod ljudi. LPL katalizuje hidrolizu triglicerida i otpušta masne kiseline koje treba metabolizovati. ANGPTL3 inhibira aktivnost LPL što vodi do povećanog nivoa lipida (Oike et al., 2005, Trends in Molecular Medicine 11(10):473-479). Region spiralne zavojnice N terminala ANGPTL3 inhibira LPL kada je izražen bez fibrinogenog regiona C terminala i samim tim se čini da daje svoju inhibitornu funkciju. Ogled bez ćelije je da bi se utvrdila sposobnost anti-ANGPTL3 antitela da suzbiju ANGPTL3-indukovano smanjenje u LPL aktivnosti.
[0115] Inhibicija aktivnosti hANGPTL3 putem anti-ANGPTL3 antitela je utvrđena korišćenjem CONFLUOLIP™ testa kontinualne fluorometrijske lipaze (Progen, Germany) korišćenjem tri hANGPTL3 proteina:zreli hANGPTL3 pune dužine (t.j., ostaci amino kiseline 17-460 od SEK ID BR:161) sa oznakom dekahistidina na C terminalu [hANGPTL3(17-460)-His; R&D Systems, MN; katalog #3829-AN], region spiralne zavojnice N terminala (t.j., ostaci amino kiseline 17-169 od SEK ID BR:161) sa Fc fuzijom na C terminalu miša [hANGPTL3(17-169)-mFc; SEK ID BR:165], i domen spiralne zavojnice N terminala hANGPTL3 (t.j., ostataka amino kiseline 17-170 od SEK ID BR:161) koji obuhvata oznaku heksahistidina na C terminalu [hANGPTL3(17-170)-His].
[0116] Ukratko, goveđi LPL (finalna koncentracija od 2 nM), humanog ApoCII (kofaktora od LPL, finalna koncentracija od 0,23 µM), i BSA (finalna koncentracija od 2 mg/mL) u PBS su prethodno pomešani. Ti hANGPTL3 rekombinantni proteini su dodati u Apo/LPL mešavinu (finalnih koncentracija od 80 -100 nM). Te Apo/LPL/ANGPTL3 mešavine proteina su zatim dodate zajedno sa serijski razblaženim anti-hANGPTL3 antitelima i inkubirani na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Posle inkubacije, 100 µl rekonstituisanog supstrata lipaze, 1-trinitrofenil-amino-dodekanoil-2-pirendekanoil-3-0-heksadecil-sn-glicerola (LS-A, Progen), je dodato u 25 µl mešavine antitela u oglednu ploču sa 96 pregrada i inkubirano na 37°C tokom dva sata. Fluorescencija je zatim izmerena na 342 nm/400 nm (ekscitacija/emisija) korišćenjem FLEXSTATION® 3 čitača mikroploče (Molecular Devices, CA). Fluorescencija je direktno bila proporcionalna LPL aktivnosti.
[0117] Antitelo H4H1276S je ispoljiilo inhibiciju od hANGPTL3 inhibitorne aktivnosti protiv LPL. Pun odgovor na dozu korišćenjem hANGPTL3 proteina u LPL ogledu je izvedeno da bi se odredio ANGPTL3 EC50za svaki eksperiment, i zatim su izvedena određivanja IC50za to antitelo korišćenjem konstantnih koncentracija ANGPTL3 proteina, kako je prikazano u Tabeli 8. Koncentracije antitela neophodne za 50% maksimalnu inhibiciju (IC50) su određene kao 9.6 nM za 80 nM hANGPTL3(17-460)-His, 2.9 nM za 100 nM hANGPTL3(17-170)-His i 21 nM za 80 nM hANGPTL3(17-169)-mFc, prema opisanom redosledu. Koncentracije antitela su bile u opsegu od 0 do 300 nM za testiranje humanih ANGPTL3 proteina.
[0118] Slično, H4H1276S je testiran u LPL bioogledu za svoju sposobnost da suzbije ortologe između vrsta:regiona N terminala makaki majmuna (ostatke amino kiseline 17-170 od SEK ID BR:177) je izraženo myc-myc-heksa-histidin oznakom na C terminalu [MfANGPTL3(17-170)-mmH; SEK ID BR:167], region N terminala mišjeg ortologa za ostatke amino kiseline 17-240 od SEK ID BR:163 sa oznakom heksahistidina na C terminalu [mANGPTL3(17-240)-His; SEK ID BR:166], i zrelo ANGPTL3 pune dužine iz Mus musculus (t.j. ostataka amino kiseline 17-455 od SEK ID BR:163) sa oznakom dekahistidina na C terminalu [mANGPTL3(17-455)-His; R&D Systems, MN; katalog #136-AN]. Vrednosti IC50 su utvrđene kao 10 nM za 500 nM konstantni MfANGPTL3(17-170)-mmH, 14 nM za 80 nM konstantni mANGPTL3(17-455)-His, i 31 nM za 500 nM konstantni mANGPTL3(17-240)-His. Koncentracije antitela su bile u opsegu od 0 do 600 nM za testiranje majmunskih i mišjih ANGPTL3 proteina. Rezultati su sažeto prikazani u Tabeli 9.
[0119] Antitela protiv regiona N terminala od homolognog proteina ANGPTL4 su takođe pokazala da blokiraju inhibitornu funkciju ANGPTL4 na LPL (Lee et al., 2009, J. Biol. Chem.
284:13735-13745). Samim tim, da bi se procenila moguća unakrsna reaktivnost na ANGPTL4, inhibitorno anti-ANGPTL3 antitelo H4H1276S je takođe testirano protiv humanog ANGPTL4 u ogledu LPL lipaze, je izveden kako je opisano gore za ANGPTL3 proteine. Rekombinantni oblik regiona spiralne zavojnice od humanog ANGPTL4 (ostaci 26-148 od SEK ID BR:164) sa Fc fuzijom IgG2a miša na C terminalu [hANGPTL4(26-148)-mFc, SEK ID BR:178] je ispoljio EC50 u LPL ogledu 0,2 nM (Tabela 9). H4H1276S, testiran kroz opseg koncentracije od 0 - 600 nM, nije blokirao ovu inhibiciju (NB: Nije vezano; u Tabeli 9).
9
ela
Tab
[0120] Kako je prikazano gore u tekstu, H4H1276S je inhibirao humani ANGPTL3 (pune dužine i N terminal), ANGPTL3 (N terminal) protein majmuna i ANGPTL3 miša (pune dužine i N terminal) aktivnost na svim uporedivim stepenima sa IC50opsegom od oko 3-31 nM.
[0121] Podskup antitela su takođe testirana da bi se utvrdile kombinacije dva ANGPTL3 neblokirajuća antitela dodata istovremeno su mogla da blokiraju LPL inhibitornu aktivnost od ANGPTL3. Parovi antitela su testirani za inhibiranje domena N terminala i za humano i za mišje ANGPTL3, t.j., hANGPTL3(17-169)-mFc i mANGPTL3(17-240)-His, prema opisanom redosledu. Za ovaj ogled, ANGPTL3 proteini su ispoljili IC50 vrednosti za blokiranje LPL od 47 nM [za hANGPTL3(17-169)-mFc] i 341 nM [za mANGPTL3(17-240)-His]. Sledeći parovi, kada su dodati u finalne koncentracije za svako antitelo od barem 200nM, nisu blokirali inhibiciju LPL bilo hANGPTL3(17-169)-mFc na 80nM ili mANGPTL3(17-240)-His na 500 nM: H1M896N H4H1279P; H4H1250P H4H1279P; H4H1248P H4H1292P; i H4H1263S H4H1292P. U ovom istom ogledu, H4H1276S sam je blokirao iste konstante koncentracija humanog i mišjeg ANGPTL3 sa IC50 od 33 nM i 64 nM, prema opisanom redosledu.
Primer 7,1. In Vivo dejstvo anti-ANGPTL3 antitela na nivoima lipida u serumu krvi
[0122] Dejstvo anti-hANGPTL3 antitela H4H1726S na nivoe lipida u serumu krvi je utvrđen kod C57BI/6 miševa. Miševima je prethodo uzeta krv 7 dana pre eksperimenta i stavljeni su u grupe od šest miševa u svakoj za svaku testiranu dozu antitela. Antitela su isporučena u 5 mg/kg (H4H1726S) i 10 mg/kg [H4H1726S i izotipom odgovarajuća hIgG4(S108P) kontrola sa nevažnom specifičnošću] nivoi doze potkožnim ubrizgavanjem i to 0. dana studije. Miševima je uzet uzorak krvi posle 4 sata izgladnjivanja i to 1., 4., 7. i 12. dana posle ubrizgavanja antitela i nivoi lipida u serumu krvi (trigliceridi, ukupni holesterol, ne-HDL holesterol, LDL holesterol i HDL holesterol) su određeni u serumu krvi pomoću ADVIA® 1800 Chemistry System (Siemens). Prosečne vrednosti su izračunate za svaku vremensku tačku za svako antitelo. Rezultati, izraženi kao (srednja ± SEM) koncentracije lipida u serumu krvi, su prikazani u Tabelama 10-14.
Tabela 10
Tabela 11
Tabela 12
Tabela 13
Tabela 14
[0123] Nivoi H4H1726S u krvi (Serum Ab) su takođe utvrđeni korišćenjem standardnog ELISA ogleda. Ukratko, ploče su obložene anti-humanim Fc antitelom koze/jarca (Sigma-Aldrich) da bi se registrovalo Ab u serumu krvi. Serum je zatim dodato u ploče i registrovano humano antitelo je detektovano hemiluminiscencijom korišćenjem peroksidaze rena (HRP) konjugovan kozji antihumani IgG antitelo (Sigma-Aldrich). Rezultati, izraženi kao (srednje ±6 SEM) su prikazani u Tabeli 15. Kontrola: Miševi koji su primili izotip-odgovarajuće kontrolno Ab.
Tabela 15
[0124] Pojedinačna isporuka H4H1276S u C57BI/6 miševa na 10 mg/kg je odvela do�60% smanjenja u krvi triglicerida 7 dana posle isporuke antitela (u poređenju sa izotipnom kontrolom). Isporuka H4H1276S je takođe ovela doznačajnog smanjenja ukupnog holesterola, ne-HDL holesterola i HDL holesterola i nije imala nikakvo dejstvo na LDL holesterol. Smanjenje nivoa lipida je takođe primećeno, ali je bilo manje izraženo, na 5 mg/kg u poređenju sa nivoima doze od 10 mg/kg; npr., trigliceridi u serumu krvi su bili smanjeni za 44% (u poređenju sa
4
izotipnom kontrolom) 7 dana posle isporuke antitela.
Primer 7,2. In Vivo dejstvo anti-ANGPTL3 antitela na nivoe lipida u serumu krvi [0125] Procena in vivo dejstava anti-hANGPTL3 antitela H4H1276S i uporednog antiela 4.9.1 na nivoe lipida u serumu krvi je sprovedena na C57BI/6 miševima. Antitelo 4.9.1 je pripremljeno na bazi sekvenci amino kiselina iz SEK ID BR: 24 (VH) i SEK ID BR: 32 (VL) kako je opisano u objavi patenta u US br.2008/0177045 i IgG1 izotip miša. Miševima su uzeti uzorci krvi 7 dana pre eksperimenta i razvrstani su u grupe od šest miševa po grupi. Antitela H4H1276S, 4.9.1, i negativne kontrole koje su odgovarale izotipu (humani IgG4 i IgG1 miša, prema odgovarajućem redosledu) sa nevažnom specifičnošću su isporučeni u dozi od 10 mg/kg potkožnom injekcijom 0 dana studije. Uzorci krvi su miševima uzeti posle 4 sata izgladnjivanja 1, 7, 11 i 20 dana posle ubrizgavanja antitela, i utvrđeni su nivoi lipida u serumu krvi (trigliceridi, ukupan holesterol, ne-HDL holesterol, LDL holesterol i HDL holesterol) su utvrđeni u serumu korišćenjem ADVIA® 1800 Chemistry System (Siemens). Prosečne koncentracije lipida su izračunate za svaku vremensku tačku za svako antitelo. Rezultati, izraženi kao (srednja ± SEM) koncentracije lipida u serumu krvi, su prikazani u Tabelama 16-20.
Tabela 16
Tabela 17
Tabela 18
Tabela 19
4 Tabela 20
4
[0126] Jedna doza od 10 mg/kg ubrizganog H4H1276S u miševe C57BI/6 je dala kao rezultat smanjenje nivoa triglicerida u plazmi krvi u poređenju sa izotipnom kontrolom 1., 7., 11. i 20. dana posle ubrizgavanja antitela, i ovo dejstvo je bilo održivije u poređenju sa jednom terapijom na istom nivou doze sa uporedivim 4.9.1 (Tabela 16). Isporuka H4H1276S takođe vodi smanjenju ukupnog holesterola (Tabela 17) i HDL holesterola (Tabela 20) kod C57BI/6 miševa.
Primer 8. In Vivo dejstvo H4H1276S na nivoe lipida u serumu krvi kod hiperlipidemijskih ApoE<-/->miševa
[0127] Dejstvo anti-hANGPTL3 antitela H4H1276S na nivoe lipida u serumu krvi je određeno kod apoE<-/->miševa. Ovi miševi su hiperlipidemijski pri čemu je veći deo holesterola u njihovoj krvi pronađen u obliku VLDL i LDL. Miševima su 7 dana pre eksperimenta uzeti uzorci krvi i stavljeni su u grupe od šest miševa po grupi. Antitela, H4H1276S i kontrola koja je odgovarala izotipu (hlgG4) se nevažnom specifičnošću, su isporučeni u dozi od 10 mg/kg potkožnim ubrizgavanjem 0. dana studije. Uzorci krvi su miševima uzeti posle 4 sata izgladnjivanja i to 1., 4., 7. i 11. dana posle ubrizgavanja antitela; i nivoi lipida u serumu (trigliceridi, ukupan holesterol, ne-HDL holesterol, LDL holesterol i HDL holesterol) su utvrđeni u serumu korišćenjem ADVIA® 1800 Chemistry System (Siemens). Prosečne koncentracije lipida su izračunate za svaku vremensku tačku za svaku antitelom lečenu grupu. Rezultati, izraženi kao (srednja ± SEM) koncentracije lipida u serumu krvi, su prikazani u Tabelama 21-25.
Tabela 21
4
Tabela 22
Tabela 23
Tabela 24
4 Tabela 25
[0128] Jedna isporuka H4H1276S za apoE<-/->miševe u dozi od 10 mg/kg je odvela do ~72% (srednje) smanjenje triglicerida u krvotoku (Tabela 21) i ~46% (srednje) smanjenje nivoa LDL holesterola (Tabela 24) 7 dana posle isporuke antiela (u poređenju sa izotipom odgovarajućim kontrolnim Ab, t.j., hIgG4). Isporuka H4H1276S je takođe donela smanjenje ukupnog holesterola (Tabela 22) i ne-HDL holesterola (Tabela 23).
[0129] Nivoi H4H1276S u krvi (Serum Ab) su takođe utvrđeni korišćenjem standardnog ELISA ogleda. Ukratko, ploče su obložene anti-humanim Fc antitelom koze (Sigma-Aldrich) da bi se registrovalo Ab u serumu krvi. Serum je zatim dodat u ploče i registrovana anatitela su detektovana hemiluminiscencijom korišćenjem peroksidaze rena (HRP) konjugovanog antihumanog IgG antitela koze (Sigma-Aldrich). Rezultati, izraženi kao ( srednja vrednost ± SEM), su prikazani u Tabeli 26 (Kontrola: miševi koji su primili izotipu odgovarajuće kontrolno Ab, t.j., hIgG4).
Tabela 26
4
Primer 9. In Vivo dejstvo H4H1276S na nivoe lipida u krvi kod hiperlipidemijskih Ldlr<-/->miševa
[0130] Dejstvo anti-hANGPTL3 antitela H4H1726S na nivoe lipida u serumu krvi je utvrđeno kod Ldlr<-/->miševa. Ovi miševi su hiperlipemijski kod kojih je najveći deo holesterola pronađen u obliku LDL usled nedostatka LDLR, glavnom receptoru za apsorpciju LDL holesterola.
[0131] Miiševima su uzeti uzorci krvi 7 dana pre eksperimenta i stavljeni su u grupe od šest miševa. Antitela, H4H1726S i izotipu-odgovarajuća (hlgG4) negativna kontrola, su isporučeni u dozi od 10 mg/kg potkožnim ubrizgavanjem 0. dana studije. Uzorci krvi su miševima uzeti 4 sata posle izgladnjivanja 1., 4., 7. i 11. dana posle ubrizgavanja antitela i nivoi lipida u serumu krvi (trigliceridi, ukupan holesterol, ne-HDL holesterol, LDL holesterol i HDL holesterol) su utvrđeni korišćenjem analizatora za kliničku hemiju ADVIA® 1800 Chemistry System (Siemens). Prosečne vrednosti su izračunate za svaku vremensku tačku za svako antitelo. Rezultati, izrađeni kao (srednje ± SEM) koncentracije lipida u serumu krvi (trigliceridi, ukupan holesterol, ne-HDL holesterol, LDL holesterol i HDL holesterol), su prikazani u Tabelama 27-31, prema opisanom redosledu. (Kontrola = miševi koji su primili izotipu odgovarajuće kontrolno antitelo).
Tabela 27. Trigliceridi u serumu krvi (mg/dL)
Tabela 28. Ukupni holesterol (mg/dL)
Tabela 29. Ne-HDL holesterol (mg/dL)
Tabela 30. LDL holesterol m /dL
Tabela 31. HDL holesterol (mg/dL)
[0132] Kao što je prikazano u Tabelama 27-31, isporuka H4H1726S za Ldlr<-/->miševe je dovela do značajnog smanjena u trigliceridima plazme u krvi sa maksimalnim primećenim smanjenjem 44% (bazirano na srednjim vrednostima). Značajna smanjenja LDL holesterola (i do 23%), kao i ukupnog holesterola, ne-HDL holesterol i HDL holesterol, su takođe primećena kod H4H1726S-subjekata koji su lečeni. Smanjenje LDL holesterola kod miševa kojima nedostaje veći receptor za apsorpciju LDL holesterola (LDLR) nagoveštava LDLR-nezavisni mehanizam za smanjenje LDL holesterola inhibicijom ANGPTL3.
1
[0133] Nivoi H4H1726S u krvi (Serum Ab) su takođe utvrđeni korišćenjem standardnog ELISA ogleda. Ukratko, ploče su obložene anti-humanim Fc antitelom koze (Sigma-Aldrich) da bi se registrovalo Ab u serumu krvi. Serum je zatim dodat u ploče i registrovana anatitela su detektovana hemiluminiscencijom korišćenjem peroksidaze rena (HRP) konjugovanog kozjeg anti-humanog IgG antitela (Sigma-Aldrich). Rezultati, izraženo kao (srednje ± SEM) su prikazani u Tabeli 32. (Kontrola = miševi koji su primili izotipu odgovarajuće kontrolno antitelo).
Tabela 32. Ab u serumu (µg/mL)
[0134] Kako je prikazano u Tabeli 32, nivoi H4H1726S u serumu krvi su smanjeni na oko 21 µg/mL 11. dana posle ubrizgavanja miševima 10 mg/kg antitela.
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
�
1
1
11
11
11

Claims (14)

Patentni zahtevi
1. Izolovano humano antitelo ili njegov fragment koji veže antigen koji specifično veže humani angiopoietinu sličan protein 3 (hANGPTL3) od SEK ID BR:161 i neutralizuje, smanjuje, ili interferira sa, barem jednom aktivnošću hANGPTL3, pri čemu antitelo ili fragment:
(a) obuhvata HCVR i LCVR sekvence par (HCVR/LCVR) od SEK ID BR: 66/74;
(b) obuhvata sekvence regiona za određivanja komplementarnosti (CDR) teškog lanca, HCDR1, HCDR2 i HCDR3, i sekvence CDR lakog lanca, LCDR1, LCDR2 i LCDR3, sadržane unutar para skevenci (HCVR/LCVR) promenljivog regoina teškog lanca (HCVR) i promenljivog regiona lakog lanca (LCVR) od SEK ID BR: 66/74, pri čemu CDR se određuju Kabat definicije, Chothia definicija ili AbM definicija; ili
(c) obuhvata HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 kombinaciju sekvence SEK ID BR: 68/70/72/76/78/80.
2. Antitelo ili fragment vezivanja antitela prema patentnom zahtevu 1, pri čemu:
(a) antitelo ili fragment koji veže antigen unakrsno reaguje sa ANGPTL3 makaki majmuna; i/ili
(b) antitelo ili fragment koji veže antigen unakrsno reaguje sa ANGPTL3 miša ili pacova; i/ili
(c) antitelo ili fragment koji veže antigen unakrsno reaguje sa bilo kojim ANGPTL3 makaki majmunima; ANGPTL3 miša, i ANGPTL3 pacova.
3. Antitelo ili fragment iz patentnog zahteva 1 ili 2, pri čemu:
(a) antitelo ili fragment je anitetelo jednog lanca, Fab, ili F(ab’)2; ili/ili (b) antitelo ili fragment je himerni fragment ili fragment potpuno humanog antitela ili fragment antitela.
4. Antitelo iz bilo kog od patentnog zahteva 1-3, koje je IgG1 ili IgG4.
5. Izolovan molekul nukleinske kiseline koji kodira antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, ili antitelo prema patentnom zahtevu 4.
6. Vektor ekspresije obuhvata molekul nukleinske kiseline iz patentnog zahteva 5.
7. Izolovana ćelija domaćina obuhvata vektor ekspresije iz patentnog zahteva 6.
8. Postupak za proizvodnju anti-hANGPTL3 antitela ili njegovog fragmenta vezivanja, obuhvata uzgajanje ćelije domaćina iz patentnog zahteva 7 pod uslovima koji dozvoljavaju proizvodnju antitela ili njegovog fragmenta, i obnavljanje antitela ili njegovog fragmenta tako proizvedenog.
9. Farmaceutska supstanca koja obuhvata jedno ili više antitela ili njegovih fragmenata iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 3, ili jedno ili više antitela iz patentnog zahteva 4, i njegov farmaceutski prihvatljiv nosač.
10. Farmaceutska supstanca iz patentnog zahteva 9, još obuhvata jedan ili više dodatnih terapijskih agenasa izabranih iz grupe koja obuhvata inhibitor HMG-CoA reduktaze, niacin, fibrat, 22-hidroksiholesterol, ezetimib plus simvastatin, statin sa žučnom smolom, niacin plus statin, niacin plus etil estar omega-3-masne kiseline, statin, anti-hANGPTL4 antitelo i anti-PCSK9 antitelo.
11. Antitelo ili njegov fragment iz bilo kog od patentnih zahteva 1-3, ili antitelo iz patentnog zahteva 4, ili farmaceutska supstanca iz patentnog zahteva 9 ili 10, za upotrebu u postupku za sprečavanje ili lečenje bolesti ili poremećaja koji je sprečen, poboljšan, smanjen ili sprečen smanjenjem ili inhibicijom aktivnosti ANGPTL3, pri čemu se pomenuta bolest ili poremećaj bira iz grupe koja obuhvata hipertrigliceridemiju, hiperholesterolemiju, hilomikronemiju, aterogenu dislipidemiju, pomešanu dislipidemiju, kardiovaskularnu bolest ili poremećaj, akutni pankreatitis, nealkoholičarski steatohepatitis (NASH), dijabetes i gojaznost.
12. Antitelo, fragment, ili supstanca za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, pri čemu je hiperholesterolemija homozigotna familijarna hiperholesterolemija sa LDLR<-/->.
13. Antitelo, fragment, ili supstanca za upotrebu prema patentnom zahtevu 11 ili 12, pri čemu taj postupak još obuhvata isporuku subjektu jednog ili više dodatnih terapijskih agenasa izabranih iz grupe koja obuhvata inhibitor HMG-CoA reduktaze, niacin, fibrat, 22-hidroksiholesterol, ezetimib plus simvastatin, statin sa žučnom smolom, niacin plus statin, niacin plus etil estar omega-3-masne
11
kiseline, statin, anti-hANGPTL4 antitelo i anti-PCSK9 antitelo.
14. Antitelo, fragment ili supstanca za upotrebu prema patentnom zahtevu 13, pri čemu se to antitelo ili njegov fragment i jedan ili više dodatnih terapijskih agenasa isporučuje istovremeno ili u sledu.
11
RS20181508A 2011-06-17 2012-06-14 Anti-angptl3 antitela i njihove upotrebe RS58310B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161498518P 2011-06-17 2011-06-17
US201161578309P 2011-12-21 2011-12-21
EP12727767.1A EP2721065B1 (en) 2011-06-17 2012-06-14 Anti-angptl3 antibodies and uses thereof
PCT/US2012/042338 WO2012174178A1 (en) 2011-06-17 2012-06-14 Anti-angptl3 antibodies and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS58310B1 true RS58310B1 (sr) 2019-03-29

Family

ID=46298728

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20181508A RS58310B1 (sr) 2011-06-17 2012-06-14 Anti-angptl3 antitela i njihove upotrebe

Country Status (46)

Country Link
US (7) US9018356B2 (sr)
EP (2) EP2721065B1 (sr)
JP (2) JP6400471B2 (sr)
KR (1) KR102031007B1 (sr)
CN (1) CN103732624B (sr)
AR (1) AR087329A1 (sr)
AU (1) AU2012271663B2 (sr)
CA (1) CA2838867C (sr)
CL (1) CL2013003552A1 (sr)
CO (1) CO6821892A2 (sr)
CR (1) CR20130621A (sr)
CY (2) CY1120996T1 (sr)
DK (1) DK2721065T3 (sr)
DO (1) DOP2013000299A (sr)
EC (1) ECSP13013085A (sr)
ES (1) ES2699499T3 (sr)
FI (1) FIC20210028I1 (sr)
FR (1) FR21C1061I2 (sr)
GT (1) GT201300306A (sr)
HR (1) HRP20182098T1 (sr)
HU (1) HUS2100034I1 (sr)
IL (2) IL229612B (sr)
JO (1) JO3412B1 (sr)
LT (2) LT2721065T (sr)
LU (1) LUC00231I2 (sr)
MA (1) MA35190B1 (sr)
MX (2) MX361859B (sr)
MY (1) MY160516A (sr)
NI (1) NI201300136A (sr)
NL (1) NL301122I2 (sr)
NO (2) NO2021037I1 (sr)
PE (1) PE20141166A1 (sr)
PH (1) PH12013502570B1 (sr)
PL (1) PL2721065T3 (sr)
PT (1) PT2721065T (sr)
RS (1) RS58310B1 (sr)
RU (1) RU2620064C2 (sr)
SG (1) SG195165A1 (sr)
SI (1) SI2721065T1 (sr)
SM (1) SMT201800658T1 (sr)
TR (1) TR201816591T4 (sr)
TW (3) TWI644922B (sr)
UA (1) UA114891C2 (sr)
UY (2) UY34137A (sr)
WO (1) WO2012174178A1 (sr)
ZA (1) ZA201308879B (sr)

Families Citing this family (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JO3412B1 (ar) * 2011-06-17 2019-10-20 Regeneron Pharma أجسام مضادة ل angptl3 واستخداماتها
US9255154B2 (en) 2012-05-08 2016-02-09 Alderbio Holdings, Llc Anti-PCSK9 antibodies and use thereof
AR095196A1 (es) 2013-03-15 2015-09-30 Regeneron Pharma Medio de cultivo celular libre de suero
WO2017011929A1 (zh) * 2015-07-17 2017-01-26 北京大学第一医院 检测血清血管生成素样蛋白2含量的物质在制备检测肝脏炎症和纤维化程度产品中的应用
TWI870789B (zh) 2015-08-04 2025-01-21 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法
TW201713690A (zh) 2015-08-07 2017-04-16 再生元醫藥公司 抗ａｎｇｐｔｌ８抗體及其用途
HRP20230992T1 (hr) * 2016-02-17 2023-12-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Postupci za liječenje ili sprečavanje ateroskleroze davanjem inhibitora angptl3
MX2018010401A (es) * 2016-03-03 2019-03-06 Regeneron Pharma Metodos para el tratamiento de pacientes con hiperlipidemia administrando un inhibidor de pcsk9 en combinacion con un inhibidor de angptl3.
PL3439689T3 (pl) * 2016-04-08 2022-01-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Sposoby leczenia hiperlipidemii inhibitorem angptl8 i inhibitorem angptl3
AU2017258105B2 (en) * 2016-04-28 2024-09-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating patients with familial hypercholesterolemia
EP3504328A1 (en) 2016-08-24 2019-07-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Host cell protein modification
MX382035B (es) 2016-11-17 2025-03-13 Regeneron Pharma Uso de un inhibidor angptl8 en la preparación de un medicamento para tratar la obesidad.
BR112020000127A2 (pt) 2017-07-06 2020-07-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. método para selecionar um hidrolisado de soja, e, glicoproteína
WO2019126194A1 (en) 2017-12-18 2019-06-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Angptl8 assay and uses thereof
BR112020010615A2 (pt) 2017-12-22 2020-10-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. produto farmacêutico proteico, método e sistema para caracterizar impurezas de produto farmacêutico proteico e de fármaco de baixo peso molecular, método para produzir um anticorpo, anticorpo, e, usos do método e do sistema
MX2020008095A (es) 2018-01-31 2020-09-24 Regeneron Pharma Sistemas y métodos para caracterizar variantes de tamaño y carga de impurezas de productos farmacológicos.
TWI786265B (zh) 2018-02-02 2022-12-11 美商再生元醫藥公司 用於表徵蛋白質二聚合之系統及方法
KR20200127979A (ko) 2018-02-28 2020-11-11 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 바이러스 오염물질을 확인하기 위한 시스템 및 방법
US12253490B2 (en) 2018-03-19 2025-03-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Microchip capillary electrophoresis assays and reagents
US12259355B2 (en) 2018-03-19 2025-03-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Microchip capillary electrophoresis assays and reagents
CA3246952A1 (en) 2018-03-19 2025-10-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Microchip capillary electrophoresis assays and reagents
TW202016125A (zh) 2018-05-10 2020-05-01 美商再生元醫藥公司 用於定量及調節蛋白質黏度之系統與方法
CN120795059A (zh) 2018-08-27 2025-10-17 瑞泽恩制药公司 拉曼光谱在下游纯化中的应用
US11754569B2 (en) 2018-08-30 2023-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for characterizing protein complexes
JP2022513626A (ja) * 2018-11-26 2022-02-09 ノバルティス アーゲー Ｌｐｌ－ｇｐｉｈｂｐ１融合ポリペプチド
TWI747098B (zh) * 2018-12-21 2021-11-21 美商美國禮來大藥廠 抗angptl3/8複合物抗體及其使用方法
PL3857237T3 (pl) 2019-01-16 2023-07-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Sposoby charakteryzowania mostka disiarczkowego
US20220144961A1 (en) * 2019-03-11 2022-05-12 Xyence Therapeutics, Inc. Cd27-binding antibodies and uses thereof
AU2020275406A1 (en) 2019-05-13 2021-11-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Improved competitive ligand binding assays
US12559551B2 (en) * 2019-05-24 2026-02-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Stabilized formulations containing anti-ANGPTL3 antibodies
CN112062845B (zh) * 2019-06-10 2022-09-02 山东博安生物技术股份有限公司 Angptl3结合片段及其用途
EP3993820A4 (en) * 2019-07-04 2023-08-16 Cadila Healthcare Limited VACCINE BASED ON ANGPTL3 FOR THE TREATMENT OF LIVER DISEASES
IL291020B2 (en) 2019-09-24 2025-04-01 Regeneron Pharma Systems and methods for use in chromatography and regeneration
US12297451B1 (en) 2019-10-25 2025-05-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cell culture medium
MY207613A (en) 2019-11-25 2025-03-06 Regeneron Pharma Sustained release formulations using non-aqueous emulsions
CN110938144B (zh) * 2019-11-27 2022-07-26 复旦大学附属儿科医院 一种抗angptl3单克隆抗体及其在制备治疗肾病综合征药物中的用途
US11835527B2 (en) 2020-01-21 2023-12-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Deglycosylation methods for electrophoresis of glycosylated proteins
CN114829395B (zh) * 2020-01-22 2023-12-12 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗angptl3抗体及其应用
IL300828A (en) 2020-08-31 2023-04-01 Regeneron Pharma Asparagine feeding strategies to improve cell culture performance and reduce asparagine sequence variants
MX2023006077A (es) 2020-11-25 2023-06-06 Regeneron Pharma Formulaciones de liberacion sostenida mediante emulsificacion por membrana no acuosa.
US12350374B2 (en) 2020-12-17 2025-07-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fabrication of protein-encapsulating microgels
TW202233827A (zh) 2021-01-20 2022-09-01 美商再生元醫藥公司 改良細胞培養中蛋白質效價的方法
AR125585A1 (es) 2021-03-03 2023-08-02 Regeneron Pharma Sistemas y métodos para cuantificar y modificar la viscosidad de proteínas
US20240141029A1 (en) * 2021-03-05 2024-05-02 Anji Pharmaceuticals Inc. Methods and compositions for treating sepsis
CA3211302A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Ross Kenyon Methods and systems for developing mixing protocols
WO2022205021A1 (zh) * 2021-03-30 2022-10-06 复旦大学附属儿科医院 一种抗angptl3抗体或其抗原结合片段及其制备方法和用途
BR112023024984A2 (pt) 2021-06-01 2024-02-20 Regeneron Pharma Tampão de amostra de eletroforese aquosa, método para identificar contaminantes ou impurezas em uma amostra de droga proteica, e, kit
CA3225970A1 (en) * 2021-07-21 2023-01-26 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. Pharmaceutical composition of anti-angptl3 antibody or antigen binding fragment thereof and its application
TW202326138A (zh) 2021-09-08 2023-07-01 美商再生元醫藥公司 用於定量抗體及其他含Ｆｃ蛋白之高通量及基於質譜之方法
CA3232463A1 (en) 2021-09-20 2023-03-23 Philip Mellors Methods of controlling antibody heterogeneity
JP2024538673A (ja) 2021-10-07 2024-10-23 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ｐＨモデリング及び制御のシステム及び方法
KR20240090312A (ko) 2021-10-07 2024-06-21 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. Ph 미터 보정 및 교정
MX2024005090A (es) 2021-10-26 2024-07-19 Regeneron Pharma Sistemas y metodos para generar agua de laboratorio y distribuir agua de laboratorio a diferentes temperaturas.
CN116284377A (zh) * 2021-12-21 2023-06-23 复旦大学 抗人血管生成素3纳米抗体及其应用
CA3241896A1 (en) * 2021-12-22 2023-06-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment of kidney diseases with angiopoietin like 3 (angptl3) inhibitors
EP4493921A1 (en) 2022-03-18 2025-01-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for analyzing polypeptide variants
TWI833641B (zh) 2022-05-02 2024-02-21 丹麥商諾佛 儂迪克股份有限公司 適於高濃度組成物及皮下投藥之新穎抗ａｎｇｐｔｌ３抗體
CN117603361A (zh) * 2022-08-22 2024-02-27 复旦大学附属儿科医院 包含angptl3单抗的融合蛋白
CN116143919B (zh) * 2022-11-01 2025-06-13 中国药科大学 全人源抗人nt-angptl3抗体、其抗原结合片段及其应用
CN120418653A (zh) 2022-12-16 2025-08-01 里珍纳龙药品有限公司 评估色谱柱完整性的方法和系统
WO2024130165A1 (en) 2022-12-16 2024-06-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Angptl3 inhibitors for triglyceride reduction in multifactorial chylomicronemia syndrome
US20240245779A1 (en) 2023-01-25 2024-07-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modeling liquid protein composition stability
WO2024158961A1 (en) 2023-01-25 2024-08-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mass spectrometry-based characterization of antibodies co-expressed in vivo
WO2024163708A1 (en) 2023-02-01 2024-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Asymmetrical flow field-flow fractionation with mass spectrometry for biomacromolecule analysis
US20240280551A1 (en) 2023-02-22 2024-08-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. System suitability parameters and column aging
TW202508625A (zh) 2023-05-01 2025-03-01 美商再生元醫藥公司 使用苯酚或苯甲醇之多劑量抗體藥物產品
CN119192369A (zh) * 2023-06-25 2024-12-27 百奥泰生物制药股份有限公司 抗angptl3抗体及其应用
WO2025054406A1 (en) 2023-09-08 2025-03-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for assessing chromatographic column integrity
WO2025064403A2 (en) 2023-09-18 2025-03-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for developing chromatography protocols
CN121925272A (zh) 2023-09-29 2026-04-24 瑞泽恩制药公司 利用受控成核进行冻干
CN117535353A (zh) * 2023-10-11 2024-02-09 首都医科大学附属北京潞河医院 一种糖尿病视网膜病变模型的建立方法及应用
WO2025085594A1 (en) 2023-10-18 2025-04-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Rapid purification of monoclonal antibody from in-process upstream cell culture material
AU2024373307A1 (en) 2023-11-02 2026-05-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing lipase activity using stress
WO2025166281A1 (en) 2024-02-01 2025-08-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Platform for charge-detection mass spectrometry analysis of aavs
WO2025175164A1 (en) 2024-02-16 2025-08-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of producing concentrated formulated drug substances comprising proteins, and concentrated formulated drug substance made by the methods
WO2025194043A1 (en) 2024-03-15 2025-09-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Polysorbate and polyoxyethylene sorbitan as excipients for stable protein formulations
WO2025259840A1 (en) 2024-06-13 2025-12-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for scaled chromatography
WO2026025028A1 (en) 2024-07-26 2026-01-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of making ultra-high concentrated protein formulations using lyophilization
WO2026060350A1 (en) 2024-09-13 2026-03-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of improving photo stability and controlling formation of hmw species in biologic formulations, and biologic formulations produced by the methods
WO2026076201A2 (en) 2024-10-03 2026-04-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Systems and methods for producing therapeutic proteins using single pass tangential flow filtration for in-line concentration and volume reduction of production pools
WO2026080597A1 (en) 2024-10-08 2026-04-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Sustained delivery of biologics and non-aqueous manufacture of same

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020035058A1 (en) 1996-05-15 2002-03-21 The University Of Sheffield Isopentenyl pyrophosphate isomerase (IPI) and/or prenyl transferase inhibitors
US6030831A (en) 1997-09-19 2000-02-29 Genetech, Inc. Tie ligand homologues
US7070959B1 (en) 1999-06-08 2006-07-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties
US6534088B2 (en) 2001-02-22 2003-03-18 Skyepharma Canada Inc. Fibrate-statin combinations with reduced fed-fasted effects
ES2429034T3 (es) 2001-11-16 2013-11-12 Genentech, Inc. Uso de antagonistas de ANGPTL3 para el tratamiento de enfermedades hepáticas
EP1576137A4 (en) 2002-10-29 2010-06-30 Genentech Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF IMMUNE DISEASES
US20040101920A1 (en) 2002-11-01 2004-05-27 Czeslaw Radziejewski Modification assisted profiling (MAP) methodology
JP2005080508A (ja) 2003-09-04 2005-03-31 Sankyo Co Ltd 脂質代謝改善剤の試験方法
WO2005103081A2 (en) 2004-04-20 2005-11-03 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against cd20
EP1863340A2 (en) 2005-03-11 2007-12-12 Genentech, Inc. Gene disruptions, compositions and methods relating thereto
DK1962895T3 (da) 2005-12-16 2013-03-04 Regeneron Pharma TERAPEUTISK ANVENDELSE AF EN Dll4-ANTAGONIST OG EN VEGF-HÆMMER TIL HÆMNING AF TUMORVÆKST
NZ587107A (en) 2006-06-02 2012-05-25 Regeneron Pharma High affinity antibodies to human il-6 receptor
LT2769992T (lt) * 2006-10-02 2021-04-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Didelio afiniškumo žmogaus antikūnai, atpažįstantys žmogaus il-4 receptorių
WO2008073300A2 (en) * 2006-12-08 2008-06-19 Lexicon Pharmaceuticals, Inc. Monoclonal antibodies against angptl3
RU2448979C2 (ru) 2006-12-14 2012-04-27 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Антитела человека к дельта-подобному лиганду-4 человека
JO3672B1 (ar) 2008-12-15 2020-08-27 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9).
US20130064834A1 (en) 2008-12-15 2013-03-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia using antibodies to pcsk9
EP2216016A1 (en) 2009-02-06 2010-08-11 LEK Pharmaceuticals d.d. Process for the preparation of a pharmaceutical composition comprising ezetimibe
CN101852805B (zh) 2009-03-31 2015-04-01 浙江大学 Angptl3作为卵巢癌的诊断标记物的用途
PT2453921E (pt) 2009-07-14 2015-09-25 Novartis Ag Diferenciação de células estaminais mesenquimais
CN111700901A (zh) 2010-01-08 2020-09-25 Ionis制药公司 血管生成素样3表达的调节
JO3412B1 (ar) * 2011-06-17 2019-10-20 Regeneron Pharma أجسام مضادة ل angptl3 واستخداماتها
EP3444348A1 (en) * 2011-06-21 2019-02-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Angiopoietin-like 3 (angptl3) irna compositions and methods of use thereof
US10111953B2 (en) 2013-05-30 2018-10-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing remnant cholesterol and other lipoprotein fractions by administering an inhibitor of proprotein convertase subtilisin kexin-9 (PCSK9)
HUE052243T2 (hu) 2013-12-24 2021-04-28 Ionis Pharmaceuticals Inc Az angiopoietin-szerû 3 expressziójának modulációja
MX382230B (es) 2014-05-01 2025-03-13 Ionis Pharmaceuticals Inc Composiciones y metodos para modular la expresion de similar a la angiopoyetina tipo 3.
CN107206068A (zh) 2014-07-16 2017-09-26 赛诺菲生物技术公司 用于治疗杂合型家族性高胆固醇血症(heFH)患者的方法
TW201713690A (zh) 2015-08-07 2017-04-16 再生元醫藥公司 抗ａｎｇｐｔｌ８抗體及其用途
HRP20230992T1 (hr) 2016-02-17 2023-12-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Postupci za liječenje ili sprečavanje ateroskleroze davanjem inhibitora angptl3
MX2018010401A (es) 2016-03-03 2019-03-06 Regeneron Pharma Metodos para el tratamiento de pacientes con hiperlipidemia administrando un inhibidor de pcsk9 en combinacion con un inhibidor de angptl3.
PL3439689T3 (pl) 2016-04-08 2022-01-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Sposoby leczenia hiperlipidemii inhibitorem angptl8 i inhibitorem angptl3
AU2017258105B2 (en) 2016-04-28 2024-09-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating patients with familial hypercholesterolemia
US12559551B2 (en) * 2019-05-24 2026-02-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Stabilized formulations containing anti-ANGPTL3 antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
JP6400471B2 (ja) 2018-10-03
EP2721065B1 (en) 2018-09-12
CA2838867A1 (en) 2012-12-20
EP3418301A1 (en) 2018-12-26
MX2013014345A (es) 2014-01-31
US10358487B2 (en) 2019-07-23
HRP20182098T1 (hr) 2019-02-08
EP2721065A1 (en) 2014-04-23
JO3412B1 (ar) 2019-10-20
LTC2721065I2 (sr) 2022-10-25
ZA201308879B (en) 2014-07-30
DOP2013000299A (es) 2014-04-15
IL259436A (en) 2018-07-31
CY2021036I2 (el) 2022-05-27
GT201300306A (es) 2015-03-09
US9018356B2 (en) 2015-04-28
FR21C1061I2 (fr) 2022-11-18
JP2014523739A (ja) 2014-09-18
IL229612A0 (en) 2014-01-30
UY34137A (es) 2013-01-03
FIC20210028I1 (fi) 2021-09-09
PT2721065T (pt) 2018-12-06
UY39340A (es) 2021-08-31
TWI644922B (zh) 2018-12-21
NI201300136A (es) 2014-05-15
TW201815822A (zh) 2018-05-01
MX361859B (es) 2018-12-18
SMT201800658T1 (it) 2019-01-11
US9951127B2 (en) 2018-04-24
SI2721065T1 (sl) 2018-12-31
CL2013003552A1 (es) 2014-07-25
US20220153825A1 (en) 2022-05-19
NO2021037I1 (no) 2021-09-15
US20190092845A1 (en) 2019-03-28
KR20140037218A (ko) 2014-03-26
NL301122I1 (sr) 2021-09-01
US20190315851A1 (en) 2019-10-17
LTPA2021009I1 (sr) 2021-09-27
SG195165A1 (en) 2013-12-30
PH12013502570A1 (en) 2014-01-27
CA2838867C (en) 2020-07-14
LUC00231I2 (sr) 2025-02-03
UA114891C2 (uk) 2017-08-28
NZ619092A (en) 2016-03-31
US20220403016A1 (en) 2022-12-22
KR102031007B1 (ko) 2019-11-08
PH12013502570B1 (en) 2019-01-16
HUS2100034I1 (hu) 2021-10-28
IL229612B (en) 2019-06-30
LT2721065T (lt) 2018-12-10
CN103732624A (zh) 2014-04-16
DK2721065T3 (en) 2018-12-03
US20130171149A1 (en) 2013-07-04
RU2620064C2 (ru) 2017-05-22
ECSP13013085A (es) 2014-01-31
MX337644B (es) 2016-03-14
RU2013155906A (ru) 2015-07-27
NO2025028I1 (no) 2025-06-13
MY160516A (en) 2017-03-15
CY2021036I1 (el) 2022-03-24
ES2699499T3 (es) 2019-02-11
MA35190B1 (fr) 2014-06-02
CR20130621A (es) 2014-02-12
US20250136675A1 (en) 2025-05-01
PL2721065T3 (pl) 2019-02-28
TW201313738A (zh) 2013-04-01
US20150197564A1 (en) 2015-07-16
TR201816591T4 (tr) 2018-11-21
JP2018166516A (ja) 2018-11-01
NL301122I2 (nl) 2021-12-30
AU2012271663A1 (en) 2014-01-16
CY1120996T1 (el) 2019-12-11
PE20141166A1 (es) 2014-09-16
WO2012174178A1 (en) 2012-12-20
AR087329A1 (es) 2014-03-19
CN103732624B (zh) 2016-08-17
TW201920261A (zh) 2019-06-01
AU2012271663B2 (en) 2017-04-20
CO6821892A2 (es) 2013-12-31
FR21C1061I1 (fr) 2022-01-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20250136675A1 (en) Anti-angptl3 antibodies and uses thereof
EP2516466B1 (en) Human antibodies to human angiopoietin-like protein 4
HK1194399A (en) Anti-angptl3 antibodies and uses thereof
HK1194399B (en) Anti-angptl3 antibodies and uses thereof