RS58436B1

RS58436B1 - Stabilizovani rastvorljivi pre-fuzioni rsv f polipeptidi

Info

Publication number: RS58436B1
Application number: RS20190170A
Authority: RS
Inventors: Johannes Petrus Maria Langedijk; Anders Krarup
Original assignee: Janssen Vaccines & Prevention Bv
Priority date: 2013-04-25
Filing date: 2014-04-24
Publication date: 2019-04-30
Also published as: US20230265127A1; PL2988780T3; SI2988780T1; AR096113A1; US20160102123A1; EP2988780B1; NZ713371A; SMT201900138T1; TR201902513T4; HK1220124A1; CY1121600T1; MY181066A; MX361774B; EA039803B1; CN110590916A; WO2014174018A1; PE20151867A1; JP6469081B2; EA201592048A1; ME03442B

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na oblast medicine. Pronalazak se posebno odnosi na rekombinantne pre-fuzione RSV F polipeptide i njihove upotrebe, npr. u imunogenim sastavima.

Stanje tehnike

[0002] Respiratorni sincicijski virus (RSV) je obmotan ne-segmentirani negativno- lančani RNK virus u porodici Paramyxoviridae, roda Pneumovirus. U svetu se procenjuje da se 64 miliona RSV infekcija javlja svake godine, što dovodi do 160,000 smrtnih slučajeva (WHO Acute Respiratory Infections Update September 2009). Najteža bolest javlja se posebno kod nedonoščadi, starijih i imunološki ugroženih pojedinaca. Kod dece mlađe od 2 godine, RSV je najčešći patogen respiratornog trakta, što čini oko 50% hospitalizacija zbog respiratornih infekcija, sa vrhuncem hospitalizacije koji se javlja pri starosti od 2-4 meseca. Prijavljeno je da su skoro sva deca zaražena RSV-om u dobi od dve godine. Ponovljena infekcija tokom života pripisuje se neefikasnoj prirodnoj imunosti. Stepen opterećenosti, mortaliteta i morbiditeta RSV bolesti kod starijih osoba je na drugom mestu, posle onog uzrokovanog nepandemijskim infekcijama influence A.

[0003] Kako bi se zarazila ćelija domaćina, RSV, kao i drugi virusi sa omotačem kao što su virus influence i HIV, zahtevaju fuziju virusne membrane sa membranom ćelije domaćina. RSV konzervisani fuzioni protein (RSV F protein) spaja ćelijske membrane virusa i ćelija domaćina. U trenutnim modelima, baziranim na studijama paramiksovirusa, RSV F protein se na početku savija u „pre-fuzionu“ konformaciju. Tokom ulaska u ćelije, pre-fuziona konformacija prolazi kroz preklapanje i konformacione promene do svoje „postfuzione“ konformacije. Prema tome, RSV F protein je metastabilni protein koji pokreće fuziju membrane spajanjem ireverzibilnog preklapanja proteina sa membranskom jukstapozicijom tako što se inicijalno preklapa u metastabilni oblik (pre-fuziona konformacija) koji kasnije prolazi kroz diskretne/stepenaste konformacione promene do konformacije na nižoj energiji (post-fuziona konformacija).

[0004] Iz elektronske mikroskopije RSV-F je jasno da postoje velike strukturne razlike između pre-fuzionog i post-fuzionog F trimera, što je nedavno potvrđeno kristalografijom (McLellan J.S. i dr. Science 340(6136):1113-7 (2013) i McLellan J.S. i dr. Science 342(6158): 592-8 (2013)). Ova opažanja sugerišu da su pre-fuzioni i post-fuzioni RSV F proteini antigenski različiti (Calder, L. J. i dr. Virology 271, 122-131 (2000)).

[0005] Vakcina protiv RSV infekcije trenutno nije dostupna, ali je poželjna. Kandidati vakcine na bazi RSV F proteina nisu uspeli zbog problema kao što su npr. stabilnost, čistoća, reproduktivnost i potentnost. Kao što je gore navedeno, kristalne strukture su otkrile veliku konformacijsku promenu između pre-fuzionog i post-fuzionog stanja. Veličina reorganizacije sugeriše da će samo deo antitela usmeren na post-fuzionu konformaciju RSV-F biti u stanju da reaguje sa prirodnom konformacijom pre-fuzionog vrha na površini virusa. Shodno tome, napori da se proizvede vakcina protiv RSV su fokusirani na razvoj vakcina koje sadrže prefuzione oblike RSV F proteina (pogledati, npr. WO20101149745, WO2010/1149743, WO2009/1079796, WO2012/158613). Međutim, ovi napori još nisu dali stabilne pre-fuzione RSV F polipeptide koji bi se mogli koristiti kao kandidati za testiranje kod ljudi.

Sažetak pronalaska

[0006] Predmetni pronalazak pruža stabilne, rekombinantne, fuzione (F) polipeptide prefuzionog respiratornog sincicijskog virusa (RSV), tj. rekombinantne RSV F polipeptide koji su stabilizovani u pre-fuzionu konformaciju, kao što je definisano u patentnim zahtevima. RSV F polipeptidi iz pronalaska sadrže najmanje jedan epitop koji je specifičan za prefuzioni konformacioni F protein. U određenim otelotvorenjima, pre-fuzioni RSV F polipeptidi su rastvorljivi. U nekim otelotvorenjima, polipeptidi su vezani za membranu. Pronalazak takođe pruža molekule nukleinskih kiselina koje kodiraju pre-fuzione RSV F polipeptide prema pronalasku i vektore koji sadrže takve molekule nukleinske kiseline.

[0007] Pronalazak se takođe odnosi na sastave, poželjno imunogene sastave, koje sadrže RSV F polipeptid, molekul nukleinske kiseline i/ili vektor, i na njihovu upotrebu u indukciji imunog odgovora protiv RSV F proteina, posebno njegove upotrebe kao vakcine. Poželjno, indukovani imuni odgovor karakteriše neutralizujuća antitela za RSV i/ili zaštitni imunitet protiv RSV.

Kratak opis slika

SLIKA 1: A) Superdex200 gel filtracioni hromatogram eluata A2_F24 N67I+S215P iz jonoizmenjivačke kolone. Strelice pokazuju tačke eluiranja standardnog proteina (1-tiroglobulin 669 kDa, 2-feritin 440 kDa i 3-IgG 150 kDa). B) SDS-PAGE analiza pre-fuzionog F proteina koji sadrži vrh iz SEC hromatograma u redukcionim uslovima.

SLIKA 2: Western blot od NativePAGE napunjen uzorcima koji sadrže 1) supernatant iz ćelija koje eksprimiraju pre-fuzioni konstrukt sa izoleucinskim zatvaračem (S) F43; 2) supernatant iz ćelija koje eksprimiraju uglavnom trimerični (gornji pojas) post-fuzioni RSV F protein; i 3) prečišćena trimerična pre-fuzija A2_F24 N67I.

SLIKA 3: Nivoi eksprimiranja tačkasto mutiranih konstrukata u odnosu na nemutirani A2_F24.

SLIKA 4 prikazuje rezultate postupka opisanog u Primeru 6 (A), koji određuje temperaturu gde je izgubljeno 50% CR9501 vezivanja; (B) pokazuje poređenje stabilnosti pre-fuzionog F (A2_F24 N67I+S215P) i nemodifikovanog ektodomena kada je procenjeno 50% gubitka vezivanja pre-fuzionog specifičnog antitela CR9501. SLIKA 5: Oktet merenja pokazuju gubitak vezivanja, zavistan od vremena skladištenja, pre-fuziono-specifičnog antitela CR9501 za pre-fuzione konstrukte; A) A2_F24 (SEQ ID NO: 19), B) A2_F24 K465Q, C) A2_F24 S46G, D) A2_F24 N67I i E) A2_F24 E92D na dane 1, 5 i 33.

SLIKA 6: Oktet merenja pokazuju gubitak vezivanja, zavistan od vremena skladištenja, pre-fuziono-specifičnog monoklonskog antitela CR9501 za pre-fuzione konstrukte; A) A2_F24 K465Q, B) A2_F24 K465Q N67I, C) A2_F24 S46G, D)

A2_F24 S46G E92D, E) A2_F24 S46G N67I, F) A2_F24 E92D, G) A2_F24

S46G E92D, H) A2_F24 N67I E92D I) A2_F24 E92D S215P na dan 1, 5 i 33. SLIKA 7: VNA titri miševa 6 nedelja nakon primarnog pojačanja u nedeljama 0 i 4 sa imunogenima i dozama prema Tabeli 14.

SLIKA 8: VNA titri pamučnih pacova 7 nedelja nakon primarnog pojačanja u nedeljama 0 i 4 sa imunogenima i dozama prema Tabeli 15.

SLIKA 9: Virusno opterećenje pluća i nosa 5 dana nakon i.n. RSV izazova.

Detaljan opis pronalaska

[0009] Fuzioni protein (F) respiratornog sincikcijalnog virusa (RSV) je uključen u fuziju virusne membrane sa membranom ćelije domaćina, koja je potrebna za infekciju. RSV F mRNK je prevedena u 574 aminokiselinski prekursor protein označen kao F0, koji sadrži signalnu sekvencu peptida na N-terminusu (npr. aminokiselinski ostaci 1-26 od SEQ ID NO: 1) koji je uklonjen signalnom peptidazom u endoplazmatičnom retikulumu. F0 se cepa na dva mesta (između aminokiselinskih ostataka 109/110 i 136/137) putem ćelijskih proteaza (posebno furina) u trans-goldžiju, uklanjanjem kratke glikozilovane intervencije (takođe se odnosi na p27 region, koji sadrži aminokiselinske ostatke 110 do 136, i generisanjem dva domena ili podjedinica označenih kao F1 i F2. F1 domen (aminokiselinski ostaci 137-574) sadrži hidrofobni fuzioni peptid na svom N-terminusu i C-terminusu sadrži transmembranski (TM) (aminokiselinski ostaci 530-550) i citoplazmatični region (aminokiselinski ostaci 551-574). F2 domen (aminokiselinski ostaci 27-109) je kovalentno vezan za F1 pomoću dva disulfidna mosta. F1-F2 heterodimeri su sastavljeni kao homotrimeri u virionu.

[0010] Vakcina protiv RSV infekcije trenutno nije dostupna, ali je poželjna. Jedan potencijalni pristup za proizvodnju vakcine je pod jedinična vakcina bazirana na pročišćenom RSV F proteinu. Međutim, za ovaj pristup poželjno je da pročišćeni RSV F protein bude u konformaciji koja podseća na konformaciju pre-fuzionog stanja RSV F proteina, koji je stabilan tokom vremena i može se proizvesti u dovoljnim količinama. Pored toga, za vakcinu baziranu na podjedinici, RSV F protein treba da bude skraćen uklanjanjem transmembranskog (TM) i citoplazmatičnog regiona kako bi se stvorio rastvorljiv izlučeni F protein (sF). Budući da je TM region odgovoran za usidravanje i trimerizaciju membrana, rastvorljivi F protein bez sidra je znatno labilniji od proteina pune dužine i lako će se preklapa u krajnje fuziono stanje. Kako bi se dobio rastvorljivi F protein u stabilnoj prefuzionoj konformaciji koja pokazuje visoke nivoe eksprimiranja i visoku stabilnost, prefuziona konformacija se stoga mora stabilizovati.

[0011] Stabilizacija još jednog F proteina paramiksovirusa u pre-fuzionu konformaciju je uspešno izvršena za parainfluencu tipa 5 (PIV5). Yin i dr. (Nature 439: 38-44 (2006)) su tako stabilizovali pre-fuzionu strukturu proteina PIV-5 F mutacijom mesta odvajanja furina u F0, što je blokiralo obradu u F1 i F2. Dalje, transmembranski (TM) i citoplazmatični domen su zamenjeni dobro poznatim helikoidnim domenom trimerizacije: GCN4pII. Ovaj domen formira trimeričnu spiralno namotanu strukturu zavojnice i predstavlja modifikaciju prirodnog dimernog spiralnog namotanog zavojnog peptida GCN4 O'Shea i dr., Science 243: 538-542 (1989)). GCN4-pII peptid, u kom je aminokiselinska sekvenca GCN4 Leucine zatvarača zamenjena osteulinskim ostacima na svakom a i d položaju heptada, pokazao se da formira trostruku paralelnu alfa-spiralnu namotanu zavojnicu (Harbury i dr., Science 262: 1401-1407 (1993)).

[0012] Za stabilizaciju RSV F u pre-fuzionu konformaciju, isprobana je ista strategija, kao npr. mutacije mesta odvajanja furina, i fuzije ektodomene RSV-F sa domenom trimerizacije GCN4pII (kao što je opisano u npr. WO2010/149743, WO2010/149745, WO2009/079796, WO2012/158613) ili u domenu trimerizacije fibritina (MCLellan i dr., Nature Struct. Biol,17: 2-248-250 (2010)). Ovaj fibritinski domen ili „Foldon“ je izveden iz T4 fibritina i ranije je opisan kao veštački prirodni domen trimerizacije (Letarov i dr., Biochemistry Moscow 64: 817-823 (1993); S-Guthe i dr., J. Mol. Biol.337: 905-915. (2004)). Međutim, ovi napori nisu rezultovali stabilnim pre-fuzionim RSV-F proteinom. Štaviše, ovi napori još nisu rezultovali kandidatima koji su pogodni za testiranje na ljudima.

[0013] Predmetni pronalazak sada pruža rekombinantne stabilne pre-fuzione RSV F polipeptide, tj. RSV F polipeptide koji su stabilizovani u pre-fuzionu konformaciju, kao što je definisano u patentnim zahtevima. U istraživanju koje je dovelo do predmetnog pronalaska, uvedeno je nekoliko koraka modifikacije i/ili su kombinovani kako bi se dobili navedeni stabilni rastvorljivi pre-fuzioni RSV F polipeptidi. Stabilni pre-fuzioni RSV F polipeptidi iz ovog pronalaska su u pre-fuzionoj konformaciji, tj. oni sadrže (pokazuju) najmanje jedan epitop koji je specifičan za pre-fuzioni konformacioni F protein. Epitop koji je specifičan za pre-fuzioni konformacioni F protein je epitop koji nije prikazan u post-fuzionoj konformaciji. Ne želeći da se veže za neku posebnu teoriju, veruje se da pre-fuziona konformacija RSV F proteina može da sadrži epitope koji su isti kao i oni na RSV F proteinu eksprimiranom na prirodnim RSV virionima, i stoga mogu pružiti prednosti za izazivanje zaštitnih neutralizujućih antitela.

[0014] Polipeptidi prema pronalasku sadrže najmanje jedan epitop koji je prepoznat od strane pre-fuzionih specifičnih monoklonskih antitela, koji sadrži CDR1 region teškog lanca od SEQ ID NO: 54, CDR2 region teškog lanca od SEQ ID NO: 55, CDR3 region teškog lanca od SEQ ID NO: 56 i CDR1 region lakog lanca od SEQ ID NO: 62, CDR2 region lakog lanca od SEQ ID NO: 63, i CDR3 region lakog lanca od SEQ ID NO: 64 (u daljem tekstu označen kao CR9501) i/ili pre-fuziono specifično monoklonsko antitelo, koje sadrži CDR1 region teškog lanca od SEQ ID NO: 58, CDR2 region teškog lanca od SEQ ID NO: 59, CDR3 region teškog lanca od SEQ ID NO: 60 i CDR1 region lakog lanca od SEQ ID NO: 66, CDR2 region lakog lanca od SEQ ID NO: 67, i CDR3 region lakog lanca od SEQ ID NO: 68 (označen kao CR9502). CR9501 i CR9502 obuhvataju varijabilne regione teškog i lakog lanca, i time i specifičnosti vezivanja, antitela 58C5 i 30D8, respektivno, za koje se ranije pokazalo da se specifično vezuju za RSV F protein u svojoj pre-fuzionoj konformaciji, i ne za post-fuzione konformacije (pogledati WO2012/006596).

[0015] U određenim otelotvorenjima, rekombinantni pre-fuzioni RSV F polipeptidi sadrže najmanje jedan epitop koji je prepoznat od strane najmanje jednog pre-fuzionog specifičnog monoklonskog antitela kao što je gore opisano, i trimeričan je.

[0016] Stabilni pre-fuzioni RSV F polipeptidi prema pronalasku sadrže mutaciju aminokiselinskog ostatka N ili T na položaju 67 i/ili mutaciju aminokiselinskog ostatka S na položaju 215.

[0017] U određenim otelotvorenjima, stabilni pre-fuzioni RSV F polipeptidi prema pronalasku sadrže F1 domen i F2 domen, i vezujuću sekvencu koja sadrži od 1 do 10 aminokiselinskih ostataka, koji povezuju navedeni F1 domen sa navedenim F2 domenom, gde polipeptidi dalje sadrže mutaciju aminokiselinskog ostatka N ili T na položaju 67 i/ili mutaciju aminokiselinskog ostatka S na položaju 215.

[0018] U određenim otelotvorenjima, stabilni pre-fuzioni RSV F polipeptidi prema pronalasku sadrže skraćeni F1 domen i F2 domen, i vezujuću sekvencu koja sadrži od 1 do 10 aminokiselinskih ostataka, povezujući navedeni skraćeni F1 domen sa navedenim F2 domenom, gde polipeptidi dalje sadrže mutaciju aminokiselinskog ostatka N ili T na položaju 67 i/ili mutaciju aminokiselinskog ostatka S na položaju 215.

[0019] Polipeptidi prema predmetnom pronalasku tako sadrže najmanje jednu stabilizujuću mutaciju u F1 i/ili F2 domenu u poređenju sa RSV F1 i/ili F2 domenom u divljem tipu RSV F proteina.

[0020] Prema pronalasku, pre-fuzioni RSV F polipeptidi sadrže mutaciju aminokiselinskog ostatka N ili T na položaju 67 (N/T67I) u I, i/ili mutaciju aminokiselinskog ostatka S na položaju 215 u P (S215P) .

[0021] Poznato je da RSV postoji kao jedan serotip koji ima dve antigenske podgrupe: A i B. Aminokiselinske sekvence zrelih prerađenih F proteina iz ove dve grupe su približno 93% identične. Kad se koristi u ovoj prijavi, aminokiselinski položaji su dati u odnosu na sekvencu RSV F proteina iz A2 soja (SEQ ID NO: 1). Kad se koristi u ovom pronalasku, izraz „aminokiselina na položaju „x“ RSV F proteina prema tome označava aminokiselini koja odgovara aminokiselini na položaju „x“ u RSV F proteina od RSV A2 soja SEQ ID NO: 1. Treba imati na umu da se u sistemu numerisanja koji se koristi u ovoj prijavi 1 odnosi na N-terminalnu aminokiselinu nezrelog F0 proteina (SEQ ID NO: 1) Kada se koristi RSV soj koji nije A2 soj, aminokiselinske položaje F proteina treba numerisati u odnosu na numerisanje F proteina A2 soja od SEQ ID NO: 1 poravnavanjem sekvenci drugog RSV soja sa F proteinom od SEQ ID NO: 1, uz umetanje razmaka gde je potrebno. Poravnavanje sekvenci se može izvršiti pomoću postupaka koji su dobro poznati u struci, npr. pomoću CLUSTALW, Bioedit ili CLC Workbench.

[0022] Aminokiselina prema pronalasku može biti bilo koja od dvadeset prirodnih (ili „standardnih“ aminokiselina) ili njenih varijanti, kao što su npr. D-aminokiseline (D-enantiomeri aminokiselina sa hiralnim centrom), ili bilo koje varijante koje se prirodno ne nalaze u proteinima, kao što je npr. norleucin. Standardne aminokiseline mogu se podeliti na nekoliko grupa po osnovu njihovih svojstava. Važni faktori su naelektrisanje, hidrofilnost ili hidrofobnost, veličina i funkcionalne grupe. Ova svojstva su važna za strukturu proteina i protein-protein interagmenti. Neke aminokiseline imaju posebna svojstva kao što je cistein, koji može da formira kovalentne disulfidne veze (ili disulfidne mostove) sa drugim cisteinskim ostacima, prolin koji indukuje okrete polipeptidne osnove, i glicin koji je fleksibilniji od drugih aminokiselina. Tabela 11 prikazuje skraćenice i osobine standardnih aminokiselina.

[0023] Stručnjaku će biti jasno da mutacije mogu biti napravljene na proteinu rutinskim postupcima molekularne biologije. Mutacije prema pronalasku poželjno rezultuju povećanim nivoima eksprimiranja i/ili povećanom stabilizacijom pre-fuzionih RSV F polipeptida u poređenju sa RSV F polipeptidima koji ne sadrže ove mutacije.

[0024] U određenim otelotvorenjima, pre-fuzioni RSV F polipeptidi su rastvorljivi.

[0025] U određenim otelotvorenjima, pre-fuzioni RSV F polipeptidi dalje sadrže heterologni domen trimerizacije povezan sa navedenim skraćenim F1 domenom. Prema pronalasku, pokazano je da su povezivanjem heterolognog trimerizacionog domena sa C-terminalnim aminokiselinskim ostatkom skraćenog F1 domena, opciono u kombinaciji sa vezujućom sekvencom koja povezuje F1 i F2 domen, i stabilizujućom mutacijom, pruženi RSV F polipeptidi koji pokazuju visoko eksprimiranje, i koji se vezuju za pre-fuziono-specifična antitela, što ukazuje da su polipeptidi u pre-fuzionoj konformaciji. Pored toga, RSV F polipeptidi su stabilizovani u pre-fuzionu konformaciju, tj. čak i nakon obrade polipeptida, oni se još uvek vezuju za pre-fuziono specifična antitela CR9501 i/ili CR9502, što ukazuje da je pre-fuziono-specifičan epitop zadržan.

[0026] U daljim otelotvorenjima, pre-fuzioni RSV F polipeptidi sadrže jednu ili više dodatnih mutacija (u poređenju sa RSV F proteinom divljeg tipa), izabrane iz grupe koja se sastoji od:

(a) mutacije aminokiselinskog ostatka na položaju 46;

(b) mutacije aminokiselinskog ostatka na položaju 77;

(c) mutacije aminokiselinskog ostatka na položaju 80;

(d) mutacije aminokiselinskog ostatka na položaju 92;

(e) mutacije aminokiselinskog ostatka na položaju 175;

(f) mutacije aminokiselinskog ostatka na položaju 184;

(g) mutacije aminokiselinskog ostatka na položaju 185;

(h) mutacije aminokiselinskog ostatka na položaju 201;

(i) mutacije aminokiselinskog ostatka na položaju 209;

(j) mutacije aminokiselinskog ostatka na položaju 421;

(k) mutacije aminokiselinskog ostatka na položaju 426;

(l) mutacije aminokiselinskog ostatka na položaju 465;

(m) mutacije aminokiselinskog ostatka na položaju 486;

(n) mutacije aminokiselinskog ostatka na položaju 487; i

(o) mutacije aminokiselinskog ostatka na položaju 508.

[0027] U poželjnim otelotvorenjima, jedna ili više daljnjih mutacija su izabrane iz grupe koja se sastoji od:

(a) mutacije aminokiselinskog ostatka S na položaju 46 u G (S46G);

(b) mutacije aminokiselinskog ostatka K na položaju 77 u E (K77E);

(c) mutacije aminokiselinskog ostatka K na položaju 80 u E (K80E);

(d) mutacije aminokiselinskog ostatka E na položaju 92 u D (E92D);

(e) mutacije aminokiselinskog ostatka N na položaju 175 u P (N175P);

(f) mutacije aminokiselinskog ostatka G na položaju 184 u N (G184N);

(g) mutacije aminokiselinskog ostatka V na položaju 185 u N (V185N);

(h) mutacije aminokiselinskog ostatka K na položaju 201 u Q (K201Q);

(i) mutacije aminokiselinskog ostatka K na položaju 209 u Q (K209Q);

(j) mutacije aminokiselinskog ostatka K na položaju 421 u N (K421N);

(k) mutacije aminokiselinskog ostatka N na položaju 426 u S (N426S);

(l) mutacije aminokiselinskog ostatka K na položaju 465 u E ili Q (K465Q);

(m) mutacije aminokiselinskog ostatka D na položaju 486 u N (D486N);

(n) mutacije aminokiselinskog ostatka E na položaju 487 u Q, N ili I (E487Q/N/I); i (o) mutacije aminokiselinskog ostatka K na položaju 508 u E (K508E).

[0028] Ponovo se primećuje da se za položaje aminokiselinskih ostataka upućuje na SEQ ID NO: 1. Stručnjak će biti u stanju da odredi odgovarajuće aminokiselinske ostatke u F proteinima drugih RSV sojeva.

[0029] U određenim otelotvorenjima, pre-fuzioni RSV F polipeptidi sadrže najmanje dve mutacije (u poređenju sa divljim tipom RV F proteina). U poželjnim otelotvorenjima najmanje dve mutacije su mutacija aminokiseline N ili T na položaju 67 u I (N/T67I), i mutacija aminokiseline S na položaju 215 u P (S215P).

[0030] U određenim otelotvorenjima, pre-fuzioni RSV F polipeptidi sadrže najmanje jednu dodatnu mutaciju, izabranu iz grupe koja se sastoji od:

(a) mutacije aminokiselinskog ostatka S na položaju 46 u G;

(b) mutacije aminokiselinskog ostatka K na položaju 77 u E;

(c) mutacije aminokiselinskog ostatka K na položaju 80 u E;

(d) mutacije aminokiselinskog ostatka E na položaju 92 u D;

(e) mutacije aminokiselinskog ostatka N na položaju 175 u P;

1

(f) mutacije aminokiselinskog ostatka G na položaju 184 u N;

(g) mutacije aminokiselinskog ostatka V na položaju 185 u N;

(h) mutacije aminokiselinskog ostatka K na položaju 201 u Q;

(i) mutacije aminokiselinskog ostatka K na položaju 209 u Q;

(j) mutacije aminokiselinskog ostatka K na položaju 421 u N;

(k) mutacije aminokiselinskog ostatka N na položaju 426 u S;

(l) mutacije aminokiselinskog ostatka K na položaju 465 u E ili Q;

(m) mutacije aminokiselinskog ostatka D na položaju 486 u N;

(n) mutacije aminokiselinskog ostatka E na položaju 487 u Q, N ili I; i

(o) mutacije aminokiselinskog ostatka K ili R na položaju 508 u E.

[0031] U određenim otelotvorenjima, polipeptidi sadrže najmanje tri mutacije.

[0032] U određenim otelotvorenjima, heterologni domen trimerizacije sadrži aminokiselinsku sekvencu EKKIEAIEKKIEAIEKKIEA (SEQ ID NO: 3). U nekim drugim otelotvorenjima, heterologni domen trimerizacije sadrži aminokiselinsku sekvencu GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 4).

[0033] Kao što je gore opisano, u određenim otelotvorenjima polipeptidi pronalaska sadrže skraćeni F1 domen. Kad se ovde koristi, „skraćeni“ F1 domen se odnosi na F1 domen koji nije F1 domen pune dužine, tj. gde su bilo N-terminalno ili C-terminalno jedan ili više aminokiselinskih ostataka izbrisani. Prema ovom pronalasku, barem su transmembranski domen i citoplazmatični rep izbrisani kako bi se omogućilo eksprimiranje kao rastvorljivi ektodomen.

[0034] U nekim drugim otelotvorenjima, F1 domen je skraćen nakon aminokiselinskog ostatka 495 od RSV F proteina (koji se odnosi na SEQ ID NO: 1), tj. C-terminalni deo F1 domena počevši od aminokiselinskog ostatka 496 (koji se odnosi na SEQ ID NO: 1) je izbrisan. U nekim drugim otelotvorenjima, F1 domen je skraćen nakon aminokiselinskog ostatka 513 RSV F proteina. U nekim otelotvorenjima, F1 domen je skraćen nakon aminokiselinskog ostatka 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 525 ili 525.

[0035] U određenim aspektima, domen trimerizacije je vezan za aminokiselinski ostatak 495 RSV F1 domena. U nekim otelotvorenjima, domen trimerizacije sadrži SEQ ID NO: 4 i vezan je za aminokiselinski ostatak 495 RSV F1 domena.

[0036] U nekim drugim otelotvorenjima, domen trimerizacije je vezan za aminokiselinski ostatak 513 RSV F1 domena. U određenim aspektima, domen trimerizacije sadrži SEQ ID NO: 3 i vezan je za aminokiselinski ostatak 513 RSV F1 domena.

[0037] U određenim otelotvorenjima, F1 domen, koji je opciono skraćen, i F2 domen je vezan vezujućom sekvencom, povezujući C-terminalnu aminokiselinu F2 domena sa N-terminalnom aminokiselinom (po izboru skraćenom) F1 domena. U određenim otelotvorenjima, vezujuća sekvenca (ili veznik) sadrži od 1-10 aminokiselinskih ostataka, poželjno od 2-9 aminokiselinskih ostataka, poželjno od 3-8 aminokiselinskih ostataka, poželjno od 4-7 aminokiselinskih ostataka, poželjnije veznik sadrži 5 ili 6 aminokiselinskih ostataka. Brojni konformaciono neutralni veznici su poznati u struci, i mogu se koristiti prema pronalasku bez narušavanja konformacije pre-fuzionih RVS F polipeptida. U poželjnim otelotvorenjima, veznik sadrži aminokiselinsku sekvencu GSGSG (SEQ ID NO: 5).

[0038] U određenim otelotvorenjima, F1 domen i/ili F2 domen su iz RSV A soja. U određenim otelotvorenjima, F1 i/ili F2 domen su iz RSV A2 soja od SEQ ID NO: 1.

[0039] U određenim otelotvorenjima, F1 domen i/ili F2 domen su iz RSV A soja iz RSV A soja od SEQ ID NO: 69.

[0040] U određenim otelotvorenjima, F1 domen i/ili F domen su iz RSV B soja. U određenim otelotvorenjima, F1 i/ili F2 domen su iz RSV B soja od SEQ ID NO: 2.

[0041] U nekim otelotvorenjima, F1 i F2 domen su iz istog RSV soja. U određenim otelotvorenjima, pre-fuzioni RSV F polipeptidi su himerni polipeptidi, tj. oni koji sadrže F1 i F2 domene koji su iz različitih RSV sojeva.

[0042] U određenim aspektima, nivo eksprimiranja pre-fuzionisanih RSV F polipeptida pronalaska je povećan, u poređenju sa RSV F polipeptidnim ektodomenom divljeg tipa (tj. bez transmembranskog i citoplazmatičnog regiona) bez mutacije. U nekim otelotvorenjima, nivo eksprimiranja se povećava najmanje 5 puta, poželjno do 10 puta. U određenim otelotvorenjima, nivo eksprimiranja je povećan više od 10 puta.

[0043] Pre-fuzioni RSV F polipeptidi prema pronalasku su stabilni, tj. ne prelaze u konformaciju nakon fuzije nakon obrade polipeptida, kao što je npr. prečišćavanje, ciklusi zamrzavanja i odmrzavanja, i/ili skladištenje itd.

[0044] U nekim otelotvorenjima, pre-fuzioni RSV F polipeptidi prema pronalasku imaju povećanu stabilnost pri skladištenju 4°C u poređenju sa RSV F polipeptidom bez mutacija. U određenim otelotvorenjima, polipeptidi su stabilni pri skladištenju na 4°C tokom najmanje 30 dana, poželjno najmanje 60 dana, poželjno najmanje 6 meseci, još poželjnije najmanje 1 godine. Pod „stabilnim tokom skladištenja", podrazumeva se da polipeptidi još uvek prikazuju najmanje jedan epitop specifičan za pre-fuziono-specifično antitelo (npr. CR9501) nakon skladištenja polipeptida u rastvoru (npr. medijum kulture) na 4°C tokom najmanje 30 dana, npr. kao što je određeno korišćenjem postupka opisanog u Primeru 7 ili 9. U određenim otelotvorenjima, polipeptidi prikazuju najmanje jedan pre-fuzioni specifični epitop tokom najmanje 6 meseci, poželjno najmanje 1 godinu nakon skladištenja pre-fuzionog RSV F polipeptida na 4°C.

[0045] U određenim otelotvorenjima, pre-fuzioni RSV F polipeptidi prema pronalasku imaju povećanu stabilnost kada su podvrgnuti toploti, u poređenju sa RSV F polipeptidima bez pomenute mutacije. U određenim otelotvorenjima, pre-fuzioni REV F polipeptidi su toplotno stabilni tokom najmanje 30 minuta na temperaturi od 55°C, poželjno na 58°C, poželjnije na 60°C. Pod „toplotno stabilni", podrazumeva se da polipeptidi i dalje prikazuju najmanje jedan pre-fuziono-specifičan epitop nakon što je najmanje 30 minuta podvrgnut povišenoj temperaturi (tj. temperaturi od 55°C ili više), npr. kao što je određeno postupkom opisanim u Primeru 6.

[0046] U određenim otelotvorenjima, polipeptidi prikazuju najmanje jedan pre-fuziono-

1

specifičan epitop nakon što su podvrgnuti 1 do 6 ciklusa zamrzavanja i odmrzavanja u odgovarajućem puferu za formulaciju.

[0047] U određenim poželjnim otelotvorenjima, pre-fuzioni RSV F polipeptid pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 21-52 i 71-89. U određenim otelotvorenjima, pre-fuzioni RSV F polipeptid pronalaska sastoji se od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 21-52 i 71-89.

[0048] Kako se koristi u ovoj prijavi, nukleotidne sekvence su pružene od 5 'do 3' pravca, i aminokiselinske sekvence od N-terminusa do C-terminusa, kao što je uobičajeno u struci.

[0049] U određenim otelotvorenjima, kodirani polipeptidi prema pronalasku dalje sadrže lidersku sekvencu, koja se takođe naziva signalna sekvenca ili signalni peptid, koja odgovara aminokiselinama 1-26 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 69. Ovo je kratak (obično 5-30 aminokiselina dugačak) peptid prisutan na N-terminusu većine novosintetisanih proteina koji su namenjeni prema sekretornom putu. U određenim otelotvorenjima, polipeptidi prema pronalasku ne sadrže lidersku sekvencu.

[0050] U određenim otelotvorenjima, polipeptidi sadrže HIS-Tag. His-Tag ili polihistidin-tag je aminokiselinski motiv u proteinima koji se sastoji od najmanje pet ostataka histidina (H), često na N- ili C-terminusu proteina, koji se obično koristi u svrhu prečišćavanja.

[0051] U određenim otelotvorenjima, polipeptidi ne sadrže HIS-Tag. Prema pronalasku, iznenađujuće je pokazano da kada je HIS-tag izbrisan, nivo eksprimiranja i stabilnost su povećani u poređenju sa polipeptidima sa HIS-tag-om.

[0052] Ovaj pronalazak dalje pruža molekule nukleinske kiseline koji kodiraju RSV F polipeptide prema pronalasku.

[0053] U poželjnim otelotvorenjima, molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju polipeptide prema pronalasku su kodon-optimizovani za eksprimiranje u ćelijama sisara, poželjno ljudskim ćelijama. Postupci optimizacije kodona su poznati i opisani su ranije (npr. WO 96/09378). Sekvenca se smatra optimizovana kodonom ako je barem jedan nepoželjni kodon u poređenju sa sekvencom divljeg tipa zamenjen kodonom koji je poželjniji. Ovde, nepoželjni kodon je kodon koji se koristi ređe u organizmu od drugog kodona koji kodira za istu aminokiselinu, i kodon koji je poželjniji je kodon koji se češće koristi u organizmu nego nepoželjni kodon. Učestalost upotrebe kodona za određeni organizam može se naći u tabelama frekvencija kodona, kao što je na http://www.kazusa.or.jp/codon. Poželjno je da više od jednog nepoželjnog kodona, poželjno većina ili svi nepoželjni kodoni, budu zamenjeni kodonima koji su poželjniji. Poželjno je da se najčešće korišćeni kodoni u organizmu koriste u kodon-optimizovanoj sekvenci. Zamena poželjnih kodona generalno dovodi do većeg eksprimiranja.

[0054] Stručnjaku će biti jasno da brojni različiti polinukleotidi i molekuli nukleinske kiseline mogu kodirati isti polipeptid kao rezultat degeneracije genetskog koda. Takođe se podrazumeva da kvalifikovane osobe mogu, koristeći rutinske tehnike, da naprave nukleotidne supstitucije koje ne utiču na polipeptidnu sekvencu koju kodiraju molekuli nukleinske kiseline, kako bi odrazili korišćenje kodona bilo kog organizma domaćina u kom treba eksprimirati polipeptide. Prema tome, ukoliko nije drugačije naznačeno, „nukleotidna sekvenca koja kodira neku aminokiselinsku sekvencu“ uključuje sve nukleotidne sekvence koje su degenerisane verzije jedna druge, i koje kodiraju istu aminokiselinsku sekvencu. Nukleotidne sekvence koje kodiraju proteine i RNK mogu, ali ne moraju uključivati introne.

[0055] Sekvence nukleinske kiseline mogu biti klonirane koristeći rutinske tehnike molekularne biologije, ili generisane de novo pomoću sinteze DNK, što se može izvesti koristeći rutinske procedure od strane servisnih kompanija koje posluju u oblasti sinteze DNK i/ili molekularnog kloniranja (npr. GeneArt, GenScripts, Invitrogen, Eurofins).

[0056] Pronalazak takođe pruža vektore koji sadrže molekul nukleinske kiseline kao što je gore opisano. U određenim otelotvorenjima, molekul nukleinske kiseline prema pronalasku je stoga deo vektora. Ovakvi vektori mogu lako da se manipulišu postupcima koji su dobro poznati stručnjaku u ovoj oblasti, i mogu se, na primer, dizajnirati za sposobnost replikacije u prokariotskim i/ili eukariotskim ćelijama. Pored toga, mnogi vektori mogu biti korišćeni za transformaciju eukariotskih ćelija i integrisaće se u celini ili delimično u genom takvih ćelija, rezultujući u stabilnim ćelijama domaćina koje sadrže željenu nukleinsku kiselinu u svom genomu. Korišćen vektor može biti bilo koji vektor koji je pogodan za kloniranje DNK, i koji

1

se može koristiti za transkripciju nukleinske kiseline od interesa. Pogodni vektori prema pronalasku su npr. adenovektori, kao što su npr. Ad26 ili Ad35, alphavirus, paramiksovirus, virus vakcinije, virus herpesa, retrovirusni vektori itd. Stručnjak može birati odgovarajuće vektore eksprimiranja i ubacivanje sekvenci nukleinskih kiselina iz ovog pronalaska na funkcionalan način.

[0057] Ćelije domaćini koje sadrže molekule nukleinske kiseline koje kodiraju pre-fuzione polipeptide RSV F takođe čine deo pronalaska. Pre-fuzioni RSV F polipeptidi mogu biti proizvedeni putem rekombinantne DNK tehnologije koja uključuje eksprimiranje molekula u ćelijama domaćina, npr. ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), ćelijske linije tumora, BHK ćelije, ljudske ćelijske linije kao što su HEK293 ćelije, PER.C6 ćelije, ili ćelije kvasca, gljivica, insekata i slično, ili transgene životinje ili biljke. U određenim otelotvorenjima, ćelije su iz višećelijskog organizma, u nekim otelotvorenjima su poreklom iz kičmenjaka ili beskičmenjaka. U određenim otelotvorenjima, ćelije su ćelije sisara. U određenim otelotvorenjima, ćelije su ljudske ćelije. Uopšteno, proizvodnja rekombinantnih proteina, kao što je pre-fuzioni RSV F polipeptidi pronalaska, u ćeliji domaćinu obuhvata uvođenje heterolognog molekula nukleinske kiseline koji kodira i u ćeliju domaćina polipeptid u obliku koji se može eksprimirati, uzgajanjem ćelija pod uslovima koji doprinose eksprimiranju molekula nukleinske kiseline i dozvoljavaju eksprimiranje polipeptida u navedenoj ćeliji. Molekul nukleinske kiseline koji kodira protein u obliku koji se može eksprimirati može biti u obliku kasete eksprimiranja, i obično zahteva sekvence koje mogu da dovedu do eksprimiranja nukleinske kiseline, kao što su pojačivač, promoter, poliadenilacioni signal i slično. Stručnjak u ovoj oblasti je svestan da se različiti promoteri mogu koristiti za dobijanje eksprimiranja gena u ćelijama domaćinima. promoteri mogu biti konstitutivni ili regulisani i mogu se dobiti iz različitih izvora, uključujući viruse, prokariotske ili eukariotske izvore, ili biti veštački dizajnirani.

[0058] Medijumi za ćelijsku kulturu su dostupni od različitih prodavaca, i pogodan medijum može biti rutinski izabran kako bi ćelija domaćina eksprimirala željeni protein, što su ovde pre-fuzioni RSV F polipeptidi. Pogodni medijum može, ali ne mora, da sadrži serum.

[0059] „Heterologni molekul nukleinske kiseline“ (takođe se ovde označava kao „transgen“) je molekul nukleinske kiseline koji nije prirodno prisutan u ćeliji domaćinu. Uvodi se, na

1

primer, u vektor standardnim tehnikama molekularne biologije. Transgen je generalno operativno vezan za sekvence kontrole eksprimiranja. Ovo se, na primer, može uraditi stavljanjem nukleinske kiseline koja kodira transgen pod kontrolu promotera. Mogu se dodati i druge regulatorne sekvence. Mnogi promoteri se mogu koristiti za eksprimiranje transgena, i poznati su stručnjaku, npr. oni mogu sadržati virusne, sisarske, sintetičke promotere i slično. Neograničavajući primer pogodnog promotera za dobijanje eksprimiranja u eukariotskim ćelijama je CMV-promoter (US 5,385,839), npr. CMV neposredni rani promoter, na primer koji sadrži nt. -735 do 95 od CMV ranog genskog pojačivača/promotera. Signal poliadenilacije, na primer polyA signal goveđeg hormona rasta (US 5,122,458), može biti prisutan iza transgena. Alternativno, nekoliko široko upotrebljenih vektora eksprimiranja su dostupni u struci i iz komercijalnih izvora, npr. pcDNA i pEF serije vektora od Invitrogen, pMSCV i pTK-Hyg od BD Sciences, pCMV-Script od Stratagene, itd., koji se mogu koristiti za rekombinantno eksprimiranje željenog proteina, ili za dobijanje pogodnih promotera i/ili sekvenci terminatora transkripcije, polyA sekvenci, i slično.

[0060] Kultura ćelija može biti bilo koji tip ćelijske kulture, uključujući kulturu adherentnih ćelija, npr. ćelije vezane za površinu posude za kulturu ili mikro nosače, kao i kultura suspenzije. Većina velikih suspenzionih kultura rade kao serijski ili napunjeni-serijski procesi zato što su oni najjednostavniji za rad i skaliranje. U današnje vreme, kontinuirani procesi bazirani na principima perfuzije postaju sve češći i prikladniji. Pogodne podloge za kulturu su takođe dobro poznate stručnjaku i mogu se generalno dobiti iz komercijalnih izvora u velikim količinama, ili po narudžbini prema standardnim protokolima. Kultivacija se može vršiti, na primer, u posudama, bocama sa valjcima ili u bioreaktorima, korišćenjem serijskih, napunjenih-serijskih, kontinuiranih sistema i slično. Pogodni uslovi za kultivisanje ćelija su poznati (pogledati npr. Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973), and R.I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, fourth edition (Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9)).

[0061] Pronalazak dalje pruža sastave koje sadrže pre-fuzioni RSV F polipeptid i/ili molekul nukleinske kiseline, i/ili vektor, kao što je gore opisano. Pronalazak, dakle, pruža sastave koji sadrže pre-fuzioni RSV F polipeptid koji prikazuje epitop koji je prisutan u pre-fuzionoj konformaciji RSV F proteina, ali je odsutan u post-fuzionoj konformaciji. Pronalazak takođe pruža sastave koje sadrže molekul nukleinske kiseline i/ili vektor, koji kodiraju takav pre-

1

fuzioni RSV F polipeptid. Pronalazak dalje pruža imunogene sastave koje sadrže pre-fuzioni RSV F polipeptid, i/ili molekul nukleinske kiseline, i/ili vektor, kao što je gore opisano. Pronalazak takođe pruža upotrebu stabilizovanog pre-fuzionog RSV F polipeptida, molekula nukleinske kiseline, i/ili vektora, u skladu sa pronalaskom, za indukovanje imunog odgovora protiv RSV F proteina kod pacijenta. Takođe su pruženi pre-fuzioni RSV F polipeptidi, molekuli nukleinske kiseline i/ili vektori, u skladu sa pronalaskom za upotrebu u indukovanju imunog odgovora protiv RSV F proteina kod pacijenta. Dalje, obezbeđena je upotreba prefuzionih RSV F polipeptida, i/ili molekula nukleinske kiseline, i/ili vektora prema pronalasku za proizvodnju medikamenta za upotrebu u indukciji imunog odgovora protiv RSV F proteina u pacijentu.

[0062] Pre-fuzioni RSV F polipeptidi, molekuli nukleinske kiseline ili vektori pronalaska mogu se koristiti za prevenciju (profilaksu) i/ili lečenje RSV infekcija. U nekim otelotvorenjima, prevencija i/ili lečenje mogu biti usmereni na grupe pacijenata koji su podložni RSV infekciji. Takve grupe pacijenata uključuju, ali nisu ograničene na, na primer, starije osobe (npr. ≥50 godina, ≥60 godina, i poželjno >65 godina), mladi (npr. ≤5 godina, ≤1 godina), hospitalizovane pacijente i pacijente koji su lečeni antivirusnim jedinjenjem ali su pokazali neadekvatan antivirusni odgovor.

[0063] Pre-fuzioni RSV F polipeptidi, molekuli nukleinske kiseline i/ili vektori prema pronalasku mogu se koristiti, npr., u samostalnom tretmanu i/ili profilaksi bolesti ili stanja uzrokovanog sa RSV, ili u kombinaciji sa drugim profilaktičkim i/ili terapeutskim tretmanima, kao što su (postojeće ili buduće) vakcine, antivirusni agensi i/ili monoklonska antitela.

[0064] Terapeutski efikasna količina se odnosi na količinu polipeptida, molekula nukleinske kiseline ili vektora, koja je efikasna u sprečavanju, ublažavanju i/ili tretmanu bolesti ili stanja koje proističu iz infekcije RSV. Prevencija obuhvata inhibiranje ili smanjenje širenja RSV ili inhibiranje ili smanjenje početka, razvoja ili progresije jednog ili više simptoma povezanih sa infekcijom RSV. Poboljšanje, kad se ovde koristi, može se odnositi na smanjenje vidljivih ili uočljivih simptoma bolesti, viremije, ili bilo koje druge merljive manifestacije infekcije influence.

1

[0065] Za primenu pacijentima, kao što su ljudi, pronalazak može da koristi farmaceutske sastave koje sadrže pre-fuzioni RSV F polipeptid, molekul nukleinske kiseline i/ili vektor kako je ovde opisano, i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijent. U predmetnom kontekstu, izraz „farmaceutski prihvatljiv“ označava da nosač ili ekscipijent, pri upotrebljenim dozama i koncentracijama, neće izazvati neželjene ili štetne efekte u pacijentima kojima se daju. Takvi farmaceutski prihvatljivi nosači i ekscipijenti su dobro poznati u struci (pogledati Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R.

Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; and Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]). RSV F polipeptidi, ili molekuli nukleinske kiseline, poželjno se formulišu i primenjuju kao sterilni rastvor, mada je takođe moguće koristiti liofilizovane preparate.

Sterilni rastvori se pripremaju sterilnom filtracijom ili drugim postupcima poznatim per se u struci. Rastvori se zatim liofilizuju ili pune u farmaceutske kontejnere za doziranje. pH rastvora je generalno u opsegu od pH 3,0 do 9,5, npr. pH 5,0 do 7,5. RSV F polipeptidi su tipično u rastvoru koji ima pogodan farmaceutski prihvatljiv pufer, i sastav može takođe da sadrži so. Po izboru može biti prisutan stabilizujući agens, kao što je albumin. U nekim otelotvorenjima, dodaje se deterdžent. U određenim otelotvorenjima, RSV F polipeptidi mogu biti formulisani u preparat za injektiranje.

[0066] U nekim otelotvorenjima, sastav prema pronalasku dalje sadrži jedan ili više adjuvanata. U struci su poznati adjuvanti za dalje povećanje imunog odgovora na primenjenu antigensku determinantu. Izrazi „adjuvant“ i „imunostimulant“ se ovde koriste naizmenično i definisani su kao jedna ili više supstanci koje izazivaju stimulaciju imunog sistema. U ovom kontekstu, adjuvant se koristi za pojačavanje imunog odgovora na RSV F polipeptide pronalaska. Primeri pogodnih adjuvanata uključuju soli aluminijuma kao što su aluminijum hidroksid i/ili aluminijum fosfat; sastave ulje-emulzija (ili sastavi ulje-u-vodi), uključujući skvalen-voda emulzije, kao što je MF59 (pogledati npr. WO 90/14837); formulacije saponina, kao što je na primer QS21 i imunostimulišući kompleksi (ISCOMS) (pogledati npr. US 5,057,540; WO 90/03184, WO 96/11711, WO 2004/004762, WO 2005/002620); bakterijski ili mikrobni derivati, čiji primeri su monofosforil lipid A (MPL), 3-O-deacilovani MPL (3dMPL), CpG-motiv koji sadrži oligonukleotide, ADP-ribozilujući bakterijski toksini

1

ili njihovi mutanti, kao što su E. coli toplotno labilni enterotoksin LT, CT koler toksina i slično; eukariotski proteini (npr. antitela ili njihovi fragmenti (npr. usmereni protiv samog antigena ili CD1a, CD3, CD7, CD80) i ligandi za receptore (npr. CD40L, GMCSF, GCSF, itd.), koji stimulišu imuni odgovor nakon interagmenti sa ćelijama primaocima. U nekim otelotvorenjima, sastavi pronalaska sadrže aluminijum kao adjuvant, npr. u obliku aluminijum hidroksida, aluminijum fosfata, aluminijum kalijum fosfata, ili njihove kombinacije, u koncentracijama od 0,05 do 5 mg, npr. od 0,075-1,0 mg sadržaja aluminijuma po dozi.

[0067] Pre-fuzioni RSV F polipeptidi se takođe mogu primenjivati u kombinaciji sa, ili konjugovani za, nanočestice, kao što su npr. polimeri, liposomi, virosomi, čestice slične virusu. Pre-fuzioni F polipeptidi se mogu kombinovati sa, inkapsulirati u, ili konjugovati za nanočestice, sa ili bez adjuvanta. Opisana je inkapsulacija unutar liposoma, npr. u US 4,235,877. Konjugacija sa makromolekulima je opisana, na primer, u US 4,372,945 ili US 4,474,757.

[0068] U drugim otelotvorenjima, sastavi ne sadrže adjuvante.

[0069] U određenim otelotvorenjima, pronalazak pruža postupke za pravljenje vakcine protiv respiratornog sincicijskog virusa (RSV), koji obuhvataju pružanje sastave prema pronalasku i formulisanje u farmaceutski prihvatljiv sastav. Izraz „vakcina“ se odnosi na agens ili sastav koji sadrži aktivnu komponentu koja je efikasna u indukovanju određenog stepena imuniteta kod pacijenta protiv određenog patogena ili bolesti, što će rezultovati barem smanjenjem (do potpunog odsustva) težine trajanja ili druga manifestacije simptoma povezanih sa infekcijom patogenom ili bolešću. U ovom pronalasku, vakcina sadrži efikasnu količinu pre-fuzionog RSV F polipeptida i/ili molekula nukleinske kiseline koji kodira pre-fuzioni RSV F polipeptid, i/ili vektor koji sadrži navedeni molekul nukleinske kiseline, što rezultuje u imunom odgovoru protiv F proteina RSV. Ovo pruža postupak za sprečavanje ozbiljnih bolesti donjeg respiratornog trakta koji dovodi do hospitalizacije i smanjenja učestalosti komplikacija kao što su upala pluća i bronhiolitis nastalo usled RSV infekcije i replikacije u pacijentu. Izraz „vakcina“ prema pronalasku podrazumeva da je to farmaceutski sastav, i stoga tipično uključuje farmaceutski prihvatljiv razblaživač, nosač ili ekscipijent. Može ali ne mora da sadrži dodatne aktivne sastojke. U nekim otelotvorenjima može biti kombinovana

2

vakcina koja dalje sadrži druge komponente koje indukuju imuni odgovor, npr. protiv drugih RSV proteina i/ili protiv drugih infektivnih agenasa. Davanje dodatnih aktivnih komponenti može se, na primer, izvršiti odvojenim davanjem ili primenom kombinovanih proizvoda vakcina prema pronalasku i drugih aktivnih komponenti.

[0070] Sastavi se mogu davati pacijentu, npr. ljudskom pacijentu. Ukupna doza RSV F polipeptida u sastavu za pojedinačnu primenu može, na primer, biti oko 0,01 µg do oko 10 mg, npr.1 µg - 1 mg, npr.10 µg - 100 µg. Određivanje preporučene doze će se vršiti eksperimentisanjem, što je rutinski za stručnjake.

[0071] Davanje sastava prema pronalasku može se izvesti korišćenjem standardnih puteva primene. Neograničavajuća otelotvorenja obuhvataju parenteralnu primenu, kao što je intradermalna, intramuskularna, subkutana, transkutana ili mukozna primena, npr. intranazalno, oralno i slično. U jednom aspektu, sastav se daje intramuskularnom injekcijom. Stručnjak zna različite mogućnosti primene sastave, npr. vakcina kako bi se indukovao imuni odgovor na antigene u vakcini.

[0072] Pacijent, kako se ovde koristi, poželjno je sisar, na primer glodar, npr. miš, pamučni pacov, ili primat koji nije čovek, ili čovek. Poželjno, pacijent je ljudski pacijent.

[0073] Polipeptidi, molekuli nukleinske kiseline, vektori i/ili sastavi mogu se takođe primenjivati, bilo kao primarni, ili kao pojačani, u homolognom ili heterolognom režimu primarnog pojačanja. Ako se sprovodi pojačavajuća vakcinacija, tipično, takva pojačavajuća vakcinacija će se primenjivati na istog pacijenta u vremenu između jedne nedelje i jedne godine, poželjno između dve nedelje i četiri meseca, nakon primene sastave pacijentu po prvi put (što je u takvim slučajevima nazvano „primarna vakcinacija“). U određenim otelotvorenjima, primena obuhvata primarnu i najmanje jednu primenu pojačavanja.

[0074] Pored toga, polipeptidi prema pronalasku mogu da se koriste kao dijagnostičko sredstvo, na primer za testiranje imunog statusa pojedinca utvrđivanjem da li postoje antitela u serumu takvih pojedinaca koja su sposobni da se vežu za polipeptid pronalaska. Pronalazak se prema tome takođe odnosi na dijagnostički postupak in vitro za detekciju prisustva RSV infekcije kod pacijenta, koji se sastoji od koraka a) dovođenja u dodir biološkog uzorka dobijenog od navedenog pacijenta sa polipeptidom prema pronalasku; i b) detektovanje prisustva antitelo-polipeptid kompleksa.

Primeri

PRIMER 1

Priprema stabilnih pre-fuzionih RSV F polipeptida - veznici i domeni trimerizacije [0075] U istraživanju koje je dovelo do predmetnog pronalaska, stabilizovane varijante rastvorljivog pre-fuzionog F proteina (sF) su dizajnirane stabilizovanjem dva glavna regiona koji iniciraju preklapanje. Prva strategija je bila da se zaustavi fuzioni peptid u svom položaju, i da se spreči njegovo oslobađanje iz regiona glave fiksiranjem i spajanjem F1-F2 domena kratkom petljom. Oslobađanje fuzionog peptida može se sprečiti ponovnim uspostavljanjem kovalentne veze N-terminusa F1 do C-terminusa F2. Kao što je prikazano u ovom primeru, isprobano je nekoliko različitih veznika. Najuspešnije je bilo umetanje 5 aminokiselinske petlje između F1 i F2, posebno sa sekvencom aminokiselina GSGSG (SEQ ID NO: 5). Ovaj veznik je dizajniran na osnovu udaljenosti izmerene u 3D homolognom modelu koji je generisan za RSV-F tip A2 na osnovu poravnanja sekvence sa F sekvencom parainfluenca tipa 5, za koji je objavljena 3D struktura (Yin et. al., 2006).

�

Poravnanje između F sekvence od HRSV tipa A i B sa PIV5 (gornja sekvenca) koje je korišćeno za konstrukciju homolognog modela pre-fuzionog RSV-F

[0076] Drugi nestabilni region je region drugog ponavljanje heptada (HRB) koji formira trimerični helikoidni region stabla u pre-fuzionom F proteinu. Brisanje transmembranskog domena (TM) u rastvorljivom F proteinu dalje destabilizuje ovaj region, što je kompenzovano dodavanjem različitih heterolognih trimerizacionih domena. Potpuno obrađeni zreli RSV-F ektodomen je fuzionisan C-terminalno na različite trimerizacione domene, i na različitim položajima (tj. F1 domen je skraćen na različitim aminokiselinskim ostacima).

[0077] Napravljeno je nekoliko konstrukata baziranih na RSV A2 ili B1 sojevima. Različiti domeni trimerizacije su povezani na RSV F1 domen, koji je skraćen na različitim položajima. Ispitivani domeni trimerizacije uključivali su motiv fibritina (koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 4), i motiv „dugog fibritina", duži, N-terminalni prošireni domen fibritina koji uključuje njegove prirodne spiralne oblasti (koje sadrže sekvenca aminokiselina:

SSLQGDVQALQEAGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 6), koji su dodati RSV F1 domenu u okviru (u registru) sa pretpostavljenim heptad ponavljanjem HRB regiona.

[0078] Dalji konstrukti koji su napravljeni sastoje se od heptadnih idealnih helikoidnih trimeričnih namotanih zavojnica, ili domena Izoleucinski zatvarača (IZ) (Suzuki i dr., Protein Engineering 11: 1051-1055 (1998)), koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: IEAIEKK (SEQ ID NO: 7). U skladu sa ovim pronalaskom korišćeni su različiti IZ domeni, označeni kao Izoleucinski zatvarač (L), koji sadrži aminokiselinsku sekvencu:

(I)EKKIEAIEKKIEAIEKKIEAIEAIEKKIEA (SEQ ID NO: 8) i Izoleucinski zatvarač (S), koji sadrži aminokiselinsku sekvencu EKKIEAIEKKIEAIEKKIEA ( SEQ ID NO: 3).

[0079] Ovi IZ domeni su uporedivi po strukturi sa GCN4, međutim, IZ domeni nisu prirodne sekvence već su dizajnirani da budu optimalni domeni trimerizacije, i stoga su stabilniji.

[0080] Dalji konstrukti su napravljeni sa drugim poznatim domenima trimerizacije:

GCN4II

EDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEA (SEQ ID NO: 9)

Optimizovani GCN4II

EDKVEELLSKIYHIENRIARIEKLVGEA (SEQ ID NO: 10)

Matrilin -1 (dugačka verzija) EEDPCECKSIVKFQTKVEELINTLQQKLEAVAKRIEALENKII (SEQ ID NO: 11) Matrilin-1 kratka verzija koja sadrži samo zatvarač domen:

EELINTLQQKLEAVAKRIEALENKII (SEQ ID NO: 12)

[0081] Napravljeni su sledeći konstrukti:

Konstrukt F18 obuhvata domen trimerizacije fibritina (SEQ ID NO: 4) vezan za aminokiselinski ostatak 513 od F1 domena.

Konstrukt F19 obuhvata domen trimerizacije fibritina (SEQ ID NO: 4) vezan za aminokiselinski ostatak 499 od F1 domena.

Konstrukt F20 obuhvata domen izoleucinskog zatvarača (L) (SEQ ID NO: 8) vezan za aminokiselinski ostatak 516 od F1 domena, i sadrži dodatne modifikacije u HRB kako bi se optimizovala hidrofobna priroda položaja heptada i olakšala fuzija sa IZ domenom unutar okvira.

2

Konstrukt F21 takođe obuhvata domen izoleucinskog zatvarača (L) (SEQ ID NO: 8), ali je povezan sa aminokiselinskim ostatkom 501 od F1 domena, i nema dodatnih modifikacija u HRB regionu.

Konstrukt F22 obuhvata domen izoleucina (L) (SEQ ID NO: 8) vezan za aminokiselinski ostatak 495 od F1 domena i sadrži dodatne modifikacije u HRB. Konstrukt F23 obuhvata domen izoleucinskog zatvarača (S) (SEQ ID NO: 3) vezan za aminokiselinski ostatak 495.

Konstrukt F46 takođe obuhvata domen izoleucinskog zatvarača (S) (SEQ ID NO: 3), ali je povezan sa dužim RSV-F ektodomenom, tj. F1 domen je skraćen nakon aminokiselinskog ostatka 513. Svi konstrukti sadrže HIS-tag.

[0082] Konstrukti su testirani na nivoe eksprimiranja, stabilnost skladištenja i vezivanje antitela sa antitelom CR9501. Aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona teškog i lakog lanca, kao i CDR teškog i lakog lanca ovog antitela su date u daljem tekstu. CR9501 sadrži regione vezivanja antitela koji se nazivaju 58C5 u WO2012/006596.

[0083] Konstrukti su sintetizovani i kodon-optimizovani kod Gene Art (Life Technologies, Carlsbad, CA). Konstrukti su klonirani u pCDNA2004 ili generisani standardnim postupcima koji su široko poznati u struci, uključujući mutagenezu i PCR, i sekvencirani. Korišćena je platforma za eksprimiranje ćelija 293Freestyle (Life Technologies). Ćelije su transientno transfektovane upotrebom 293Fectin (Life Technologies) prema uputstvima proizvođača, i kultivisane su tokom 5 dana na 37°C i 10% CO2. Supernatant kulture je sakupljen i centrifugiran 5 minuta na 300 g kako bi se uklonile ćelije i ćelijski ostaci. Završeni supernatant je zatim sterilno filtriran upotrebom vakuum filtera od 0,22 um, i čuvan na 4°C do upotrebe.

[0084] Supernatanti od dana 5 su procenjeni za eksprimiranje F proteina pomoću Western blot-a, korišćenjem monoklonskog antitela CR9503, koje sadrži varijabilne regione teškog i lakog lanca RSV F antitela Motavizumab (označeno kao CR9503). Približni nivoi eksprimiranja pre-fuzionih RSV F proteinskih konstrukata su procenjivani korišćenjem CR9503, anti-ljudskog IR-konjugovanog sekundarnog antitela (Li-Cor, Lincoln, NE) ili HRP konjugovanog mišjeg anti-ljudskog IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA).

Količine proteina su zatim procenjene korišćenjem serije razblaženja pročišćenog RSV standardnog proteina, bilo odokativno ili upotrebom Odyssey CLx sistema infracrvenog

2

slikanja. Alternativno, Quantitative Octet (BioLayer Interferometry) je korišćen za merenje koncentracije proteina u Supernatantima. Kako bi se procenila stabilnost konstrukta, i kako bi se identifikovali pozitivni ili negativni stabilizujući efekti uvedenih trimerizacionih motiva, konstrukti sposobni za vezivanje CR9501 su tretirani na opsegu temperatura od 45-65°C tokom 30 minuta, kako bi se testirala stabilnost CR9501 epitopa. Ova procedura je detaljno opisana u Primeru 8. Rezultati su sumirani u Tabeli 1.

Tabela 1. Eksprimiranje i stabilnost RSV F konstrukata sa različitim trimerizacionim motivima

[0085] Kao što se može videti u Tabeli 1, jedini konstrukti koji su eksprimirani su varijanta Fibritina (F18) i F23. Iako je F18 bio trimeričan i pokazivao eksprimiranje, bio je nestabilan pri skladištenju na 4°C. Nasuprot tome, F23 je bio stabilan na 4°C, vezuje se za pre-fuzionospecifična antitela, ali se čini da je monomeran. Prema tome, obe varijante F18 i F23 su korišćene za optimizaciju i za stabilnost i za trimerizaciju.

2

[0086] Sledeće, napravljeno je nekoliko konstrukata u kojima je fuzioni peptid na N-terminusu F1 fiksiran fuzionisanjem na C-terminus od F2 domena. Svi konstrukti su sadržali His-tag.

[0087] Napravljeno je nekoliko konstrukata, uključujući konstrukte u kojima su mutirana oba mesta odvajanja furina, što je rezultovalo rastvorljivim F proteinom koji je još uvek sadržao p27 peptid (tj. F12, F15.1 i F17). U drugim konstruktima region 27 ostatka (P27 petlja) koji je odvojen od prekursora F0 zamenjena je alternativnom zatvorenom petljom ili vezujućom sekvencom: bilo zamenom regiona od RSV-F sa „homolognim“ regionom PIV-5F, prefuzionim F proteinom koji je uspešno proizveden i kristalizovan (F25), ili zamenom regiona sa minimalnom (GS)n petljom koja bi premostila F2 i F1 krajeve (F24), ili zamenom regiona sa centralnim konzervisanim regionom RSV-G (F26). Homologno modeliranje RSV-F bazirano na PIV-5 i in silico merenja su rezultovala izborom minimalne petlje od 5 aminokiselinskih ostataka između ostataka 108 i 136. Kao veznik, odabrani su Gly (G) i Ser (S) ostaci koji su fleksibilni i polarni, i imaju visoku šansu da budu smešteni (F24). Dodatno, F137 je mutiran na S, jer lokalne modifikacije uzrokovane petljom mogu izmeniti hidrofobni F i uzrokovati nestabilnosti. Ovo je prikazano ispod. Takođe, R106 je mutiran na Q, i 27 ostataka (109-135) je zamenjeno sa GSGSG.

[0088] Kao što je prikazano u Tabeli 2, sve varijante ili nisu pokazale nikakvo, ili su pokazale veoma nisko eksprimiranje, osim za varijantu sa kratkom GSGSG petljom (F24) koja je pokazala mnogo veće eksprimiranje (44 µg/ml) u poređenju sa RSV F konstruktom divljeg tipa, tj. slični kontrukt, bez navedenog veznika (F11). F24, koji je bio trimeričan, međutim, bio je nestabilan pri skladištenju kao i sve druge varijante sa C-terminalnim motivom trimerizacije fibritina. Sve varijante sadrže HIS-tag.

Tabela 2. Eksprimiranje i stabilnost RSV F konstrukata sa različitim F1-F2 veznicima

2

[0089] Sledeće, najpovoljnije modifikacije su kombinovane kako bi se pronašla optimalna pre-fuziha F polipeptida. Kombinacije su napravljene od varijanti sa GSGSG petljom, C-terminalnim skraćivanjem F1, i dodavanjem bilo fibritina (SEQ ID NO: 4) ili motiva izoleucinskog zatvarača (S) (SEQ ID NO: 3) (pogledati Tabelu 3).

Tabela 3. Eksprimiranje i stabilnost RSV F konstrukata sa kombinacijama optimizacije prema Tabelama 1 i 2.

2

[0090] Dodavanje GSGSG-petlje je uvek povećavalo eksprimiranje funkcionalnih konstrukata kao i toplotnu stabilnost proteina. Kombinacija GSGSG-petlje sa skraćenim F i motivom izoleucinskog zatvarača (S) (F43, F47) pokazala je dobro eksprimiranje, toplotnu stabilnost i dobru stabilnost pri skladištenju na 4°C. Međutim, ove varijante su još uvek monomerne. Motiv za trimerizaciju izoleucina (S) pokazao je veće eksprimiranje sa F varijantom koja je bila C-terminalno skraćena F na položaju 495 (uporedi F43 sa F56 i F23 sa F46). Nasuprot tome, za varijante sa Fibritin trimerizacionim domenom skraćivanje na položaju 513 pokazalo je visoko eksprimiranje u poređenju sa skraćivanjem na položaju 495, koje nije pokazala eksprimiranje (uporedite F24 sa F44).

[0091] Pošto bi HIS-tag mogao ometati prirodno preklapanje trimera, varijante su napravljene bez HIS-tag-a za Fibritin i varijantu izoleucinskog zatvarača (S) (Tabela 4).

Tabela 4. Eksprimiranje i stabilnost RSV F konstrukata sa i bez HIS-tag-a

1

[0092] Upečatljivo, brisanje HIS-tag-a povećava eksprimiranje u F47. Štaviše, za F47 je blago povećalo sadržaj trimera, i za F24 je samo umereno povećalo nivo eksprimiranja.

[0093] Zatim je testirano nekoliko alternativnih trimerizacionih domena i skraćivanja u kombinaciji sa GSGSG petljom stabilizovanom F varijantom (F47) (pogledati Tabelu 5). Sve varijante imaju GSGSG-petlju i sadrže HIS-tag.

Tabela 5. Eksprimiranje i stabilnost RSV F varijanti sa alternativnim domenima trimerizacije

2

[0094] Samo za matrilin 1 domen (Dames-SA et. al., Nat. Struc. Biol., 5(8), 1998) koji sadrži N-terminalni zatvarač domen i C-terminalni deo sa cisteinskim ostacima koji potencijalno mogu da formiraju inter-trimerične disulfidne mostove, je otkriveno da omogućava više nivoe eksprimiranja od F47 (Tabela 5, Matrilin dugačak). Štaviše, varijanta sa Matrilin dugačkim trimerizacionim motivom pokazuje trimerične F proteine. Međutim, proizvod se nije vezao za Mab CR9501 koji je specifičan za fuziju, i takođe je pokazao heksamerne vrste koje čine da Matrilin 1 domen trimerizacije nije pogodan za proizvodnju trimeričnog nativnog F proteina. Nijedan od matrilin-baziranih ili GCN4II-baziranih zatvarač motiva nije pokazao povećanu eksprimiranje ili stabilnost u odnosu na F47 (Tabela 5, Matrilin kratak, GCN4II optimizovan). Ponovo, skraćivanje na 495 rezultuje višim nivoima eksprimiranja. Dodavanje GCN4 motiva koji je sadržao optimizovanu okidačku sekvencu nije pokazalo nikakvo eksprimiranje.

[0095] GCN4 II je domen trimerizacije koji se uspešno koristi za stabilizaciju pre-fuzionog trimera parainfluence tipa 5 (Yin i dr., Nature 439:38-44, 2006), i takođe su i drugi pokušali da stabilizuju RSV pre-fuziju F (kao što je opisano u npr. WO2010/149743, WO2010/14975, WO2009/079796, WO2010/158613). GCN4II domen trimerizacije je procenjen i upoređen sa konstruktima koji sadrže izoleucinski zatvarač (S) domen (SEQ ID NO: 3) ili fibritinski (SEQ ID NO: 4) domen (rezultati su prikazani u Tabeli 6). Ove varijante su takođe upoređene sa anter modifikacijama, tj. kratkim veznicima baziranim na jednom Lizinu i L512K mutaciji. Sve varijante sadrže HIS-tag.

Tabela 6. Eksprimiranje i stabilnost RSV F varijanti sa GCN4II, L512K i p27 zamenom (pojedinačni aminokiselinski veznik (K) između F1 i F2)

[0096] Kratka veza između F1 i F2 izgleda da je uporediva sa GSGSG petljom. Dodavanje GCN4II motiva ne rezultuje ikakvim eksprimiranjem F proteina u bilo kom testiranom konstruktu (tj. RSV A2 F sekvenca opisana u WO2010/149743 ili WO2010/149745, RSV A2 F sekvenca koja se koristi prema pronalasku, niti RSV B1 F sekvenca).

4

[0097] Prema pronalasku je pokazano da uvođenje ova dva tipa modifikacija, tj. uvođenje vezujuće sekvence i heterolognog trimerizacionog domena, nije bilo dovoljno da omogući eksprimiranje stabilnog trimeričnog pre-fuzionog F proteina. Osim dva glavna regiona nestabilnosti koji su stabilizovani, tj. HRB i fuzioni peptid, kao što je opisano gore, drugi regioni pre-fuzionog F proteina takođe doprinose i/ili prilagođavaju dramatično prelivanje u post-fuzionim F, i više položaja u sekvenci mogu biti optimizovani da zaustave pre-fuzioni F protein od preklapanja. Prema tome, različiti aminokiselinski ostaci u HRA i HRB domenu i na svim domenima koji dovode u dodir ove regione u pre-fuzionom F su mutirani kako bi se povećala stabilnost pre-fuzione strukture, kao što je opisano u sledećim Primerima.

PRIMER 2

Priprema stabilnih pre-fuzionih RSV F polipeptida - stabilizujuće mutacije

[0098] Zbog toga što sadržaj trimera (za konstrukt F47) i stabilnost skladištenja (za F24 konstrukt) nisu bili optimalni, napravljene su dodatne varijante koje sadrže tačkaste mutacije za povećanje nivoa eksprimiranja, stabilnosti i prirodne trimerične strukture. Rezultati su prikazani u Tabeli 7 i 8.

Tabela 7. Eksprimiranje i stabilnost F47 - varijanti

[0099] Nomenklatura mutacija baziranih na wt sekvenci (SEQ ID NO: 1).

Svi konstrukti su varijante F47-: tipa A2, motiv izoleucinskog zatvarača (S) (SEQ ID NO: 3), GSGSG veznik; završna tačka 495, bez HIS-tag-a (SEQ ID NO: 16). Kao što je prikazano u Tabeli 7, mnoge mutacije povećavaju eksprimiranje F47-, ali samo F47_S46G varijanta takođe pokazuje viši nivo trimera osim visokog eksprimiranja.

[0100] Tabela 8 prikazuje rezultate eksprimiranja i stabilnosti F24 varijanti. Sve varijante su RSV tipa A2, sa fibritinskim motivom, GSGSG veznik; završna tačka 513, bez HIS-tag-a.

Tabela 8. Eksprimiranje i stabilnost varijanti A2_F24- (SEQ ID NO: 19)

[0101] Mnoge mutacije povećavaju eksprimiranje A2_F24-. Za većinu mutacija došlo je do očigledne korelacije između poboljšanog eksprimiranja u F47-pozadini (Tabela 7) i A2_F24-pozadini (Tabela 8). N67I je imao pozitivniji uticaj na F izraz u A2_F24-pozadini.

Najznačajnije povećanje eksprimiranja dobijeno je sa mutacijama sa jednom tačkom: S46G, S215P, N67I, K80E, E92D, D486N, G184N, V185N, E487N, N175P, K209Q, E487I, E487Q, K77E, K201Q, N426S i K465Q. U početnom skriningu pomoću testa stabilnosti krajnje tačke (Primer 7) varijante sa najvećim eksprimiranjem pokazale su najbolju stabilnost i prilikom skladištenja (E92D, K465Q, K465E, N426S, S46G, S215P i N67I). Kako bi se procenilo da li su ove mutacije zaista stabilizovale per-fuzionu konformaciju, supernatanti kulture su razblaženi na 5 i 10 µg/ml na osnovu kvantitativnih western rezultata i oni su čuvani do 33 dana na 4°C. Kao mutanti jedne tačke, samo su N67I i S215P bili potpuno stabilni tokom vremena (pogledati Primer 9).

[0102] Nakon toga, nekoliko mutacija koje su pokazale visoko eksprimiranje i dobru stabilnost pre-fuzione konformacije su kombinovane kako bi se procenilo da li su stabilizacije aditivne, ili su imale mogući sinergetski efekat (Tabela 9).

Tabela 9. Eksprimiranje i stabilnost varijanti A2_F24 sa dve dodatne mutacije.

[0103] Sve varijante su varijante F24-: tip A2, fibritinski motiv, GSGSG veznik; završna tačka 513, vezivanje za sva monoklonska antitela, bez HIS-tag-a (SEQ ID NO: 19).

[0104] Kada se prethodno identifikovane tačkaste mutacije kombinuju, mogu se primetiti veoma interesantni sinergetski efekti, posebno u pogledu nivoa eksprimiranja sa kombinacijama koje uključuju N67I kao najsnažniji. Svi proizvedeni dvostruki mutanti, gde su bilo uključeni i N67I i S215P, bili su stabilni nakon više od 30 dana čuvanja na 4°C (Primer 9). Zapanjujuće, pronađeno je da mutacija N67I ima najjači efekat na nivoe eksprimiranja pre-fuzionog F kada su uključeni u dvostruke mutante. Zatim, kombinacije sa mutacijama S215P rezultovale su prihvatljviim eksprimiranjem. Kombinacija N67I sa S215P je izabrana jer je dovela do veoma visokog nivoa eksprimiranja, i zato što su obe tačkaste mutacije bile stabilne tokom skladištenja. Pored toga, primećeno je da su i N67I i S215P imali sposobnost da stabilizuju neke od mutanata, jer su pojedinačne mutacije bile nestabilne, što ukazuje da je region gde se nalaze ove dve mutacije centralni za konformacione promene koje proteini prolaze tokom prelaska u post-fuzionu konformaciju.

[0105] Prema pronalasku je tako pokazano da su bar neke mutacije rezultovale povećanim nivoima eksprimiranja, i povećanom stabilizacijom pre-fuzionog RSV proteina. Očekuje se da su ovi fenomeni povezani. Mutacije opisane u ovom primeru sve su rezultovale povećanom proizvodnjom pre-fuzionih F polipeptida. Samo je selekcija ovih polipeptida ostala stabilan pri dugom skladištenju (pogledati Primer 9). Test stabilnosti koji je korišćen zasniva se na gubitku pre-fuzionog specifičnog CR9501 epitopa u vrhu pre-fuzionog F proteina u testu vezivanja, i možda nije dovoljno osetljiv da izmeri sve doprinose stabilnosti celog proteina. Mutacija za koju se posmatra samo povećano eksprimiranje je stoga (vrlo verovatno stabilizujuća) potencijalna mutacija koja se može kombinovati sa drugim stabilizujućim mutacijama kako bi se dobio pre-fuzioni F konstrukt sa visokom stabilnošću i visokim nivoima eksprimiranja.

[0106] Dalje, provereno je da li je dvostruka mutacija N67I - S215P, kao i pojedinačne mutacije, bila u stanju da stabilizuje tačkaste mutacije koje su se smatrale nestabilnim na osnovu korišćenih kriterijuma. Dodatne mutacije su odabrane na osnovu povoljnih nivoa eksprimiranja i stabilnosti prema Tabeli 8. Trostruke mutantne RSV-F varijante su konstruisane i testirane za nivoe eksprimiranja i stabilnosti (Tabela 10).

Tabela 10. Eksprimiranje i stabilnost varijanti F24_N67I+S215P sa jednom dodatnom mutacijom.

4

[0107] Opet je primećen aditivni efekat na nivoe eksprimiranja. Kao što se očekivalo, trostruki mutanti D479N i E487R eksprimiraju na nešto nižim nivoima, jer su pojedinačne mutacije takođe bile među najnižim od izabranih mutacija (Tabela 8). Zbog stabilizujućeg efekta N67I+S215P mutacije, dodatne mutacije koje su nestabilne kao pojedinačni mutanti, rezultovale su stabilnim pre-fuzionim F varijantama kada su dodate u A2_F24 N67I+S215P pozadinu. Neki veoma ilustrativni primeri su trostruki mutanti sa dodatnim V185N, G184N ili E487N koji su pokazali visoko eksprimiranje, ali nisku stabilnost kao pojedinačni mutante (Tabela 8), ali su pokazali još veće eksprimiranje, i bili su visoko stabilni kada su dodati A2_F24 N67I+S215P pozadini.

Stabilizujuće mutacije takođe stabilizuju RSV-F protein iz drugih sojeva, takođe i u obrađenoj F varijanti.

[0108] Nekoliko mutacija koje su pokazale visoko eksprimiranje i dobru stabilnost prefuzijone konformacije primenjene su na RSV F proteine drugih sojeva (SEQ ID NO: 69 i 70) i primenjene su na RSV A2 F varijante bez mutacija na mestu odvajanja furina (F18: SEQID NO: 71) kako bi se procenilo da li su modifikacije univerzalno rešenje za stabilizaciju RSV pre-fuzionog F. (Tabela 11)

Tabela 11. eksprimiranje i stabilnost varijanti A2_F18 sa dodatnim mutacijama i F iz soja B1

(SEQ ID NO: 2) i tipa A CL57-v224 (SEQ ID NO: 69).

[0109] Kada su prethodno identifikovane tačkaste mutacije uvedene u A2_F18 (SEQ ID NO: 71), nivoi stabilnosti i eksprimiranja su bili veoma slični u poređenju sa varijantom F24 (SEQ ID NO: 21) koja je sadržala kratku petlju između F1 i F2. Opet, opažen je sinergizam koji pokazuje veće eksprimiranje i stabilnost kada se mutacijama dodaju varijante koje sadrže N67I ili dvostruku mutaciju N67I, S215P. Dvostruka tačkasta mutacija N67I, S215P nije samo stabilizovala pre-fuzioni F od A2 soja. već i pre-fuzioni od B1 o CL57-v224 soja (Tabela 11).

Stabilizujuće mutacije takođe stabilizuju RSV-F protein pune dužine.

[0110] Nekoliko mutacija koje su pokazale visoko eksprimiranje i dobru stabilnost prefuzione konformacije u rastvornoj verziji RSV-F koje odgovaraju ektodomenu, primenjene su na RSV-F protein pune dužine. Mutacije su uvedene u RSV-F pune dužine sa ili bez mutacija na mestu odvajanja furina. Nijedan domen trimerizacije nije spojen na ove varijante (Tabela 12)

Tabela 12. Eksprimiranje i stabilnost varijanti pune dužine verzija A2_F18 i A2_F24 sa dodatnim mutacijama.

4

[0111] Prethodno identifikovane tačkaste mutacije stabilizacije takođe se stabilizuju u F proteinu pune dužine. Povećanje nivoa eksprimiranja je bilo manje eksprimirano, ali je pokazalo isti trend. Ovo može biti uzrokovano različitom pozadinom u koju su mutacije uvedene, ali mogu biti uzrokovane različitim postupkom kvantifikacije (FACS nasuprot Western blot-a) i biološkim maksimumom eksprimiranja usled recikliranja površinskih proteina. Uvođenje povezujuće sekvence (ili kratke petlje) povećalo je eksprimiranje i stabilnost, i tačkaste mutacije su to učinile takođe. Tačkaste mutacije nisu bile ili tvrdo sinergetske sa kratkom petljom (slično kao što smo pronašli za rastvorljivi protein (Tabela 9-11)

[0112] Pošto je tačkasta mutacija na položaju 67 imala takav pozitivan efekat na nivo eksprimiranja i stabilnost, sve supstitucije aminokiselina su testirane za ovaj položaj kako bi se ispitalo da li su izabrane najoptimalnije, ili da li se ovi položaji mogu poboljšati. (Tabela 13)

Tabela 13. Potpuna analiza supstitucije eksprimiranja i stabilnosti za položaj 67 u A2_F24 pozadini.

4

[0113] Kao što je prikazano u Tabeli 13, primarno hidrofobni ostaci i naročito Ile, Leu i Met na položaju 67 su bili u stanju da povećaju eksprimiranje i stabilnost. Ile je ostatak koji najviše povećava eksprimiranje i stabilnost. Ostaci Glu i Gln, najmanji ostatak Gly i pozitivno naelektrisani ostaci Arg i Lys imali su najviše destabilizujuće dejstvo na položaju 67 na pre-fuzionoj konformaciji.

[0114] Prema pronalasku, aminokiselinske mutacije koje stabilizuju per-fuzionu konformaciju RSV F proteina mogu biti grupisane u različite kategorije koje stabilizuju konformaciju na različite načine. Strategije za pre-fuzionu F stabilizaciju baziraju se na homolognom modelu RSV-F koji je baziran na kristalnoj strukturi PIV5 (Yin et. al., 2006) i poravnanju na stranici 27.

Aminokiselinski ostaci 67 i 215:

[0115] Aminokiselinski ostaci na položajima 67 i 215 su veoma bliski u 3D strukturi, kako pre-fuzionog modela, tako i post-fuzione kristalne strukture. Ostaci su blizu konzervisanom disulfidnom mostu u vrhu DIII regiona koji formira zglob duž koje se HRA region preklapa u

4

dugačku izduženu spiralnu trimer namotanu zavojnicu. Mutacije u ovom regionu će uticati na funkciju zgloba i zato su uvedene mutacije koje stabilizuju pre-fuzionu konformaciju opstrukcijom funkcije zgloba.

Aminokiselinski ostaci 77, 80

[0116] Aminokiselinski ostaci na položajima 77 i 80 su smešteni unutar duge spirale (ostaci 76-98) na C-terminusu F2 koji je u bliskom dodiru sa grupom sekundarnih struktura u DIII na N-terminusu F1 koji se preklapaju u dugačku strukturu namotane zavojnice post-fuzione konformacije. Pošto ova dva regiona moraju da se razdvoje tokom preklapanja od pre do post fuzije, aminokiseline u ovom regionu koje sprečavaju ovo razdvajanje bi stabilizovale perfuzionu konformaciju. Budući da ova dva regiona treba da se razdvoje tokom preklapanja, neki od ostataka mogu biti optimizovani da ojačaju interakciju. Primer odbijanja koji je primećen je između pozitivno naelektrisanog Lys80. Mutacija Lys80 na negativno naelektrisani Glu ostatak povećava eksprimiranje pre-fuzionog F. Usled sekvencijalnog prelaza u post-fuzionu konformaciju, ove mutacije se mogu kombinovati sa drugim stabilizujućim mutacijama kao što su N67I i S215P, kako bi se dobila puna prednost ove stabilizacije, kao što je prikazano u Tabeli 10.

Aminokiselinski ostatak 92

[0117] Aminokiselinski ostatak na položaju 92 je takođe lociran unutar dugačke spirale (ostaci 76-98) na C-terminusu F2 koji je u bliskom dodiru sa grupom sekundarnih struktura u DIII na N-terminusu F1 koje se preklapaju u dugačku strukturu namotane zavojnice postfuzione konformacije. Kada se ova spirala odvoji od HRA regiona, ona se povlači u DIII region koji sadrži Synagis epitop (epitop II) (Arbiza i dr., J. Gen. Virol.73:2225-2234, 1992) i negativno naelektrisani Glu92 se kreće vrlo blizu pozitivno naelektrisanog Arg282 u postfuzionoj konformaciji. Mutacije koje smanjuju ovo povlačenje stabilizovaće pre-fuzionu konformaciju. Mutacija Glu92 na konzervisani Asp ostatak će smanjiti povlačenje jer nije u stanju da dostigne Arg282.

Aminokiselinski ostaci 486, 487

[0118] Aminokiselinski ostaci 486, 487 i 489 na HRB vrhu u pre-fuzionoj konformaciji formiraju negativno naelektrisanu mutaciju Glu487 u Asn ili Ile povećano pre-fuziono F eksprimiranje. Mutacije Asp486 u Asn ili Gln i/ili Glu489 u Asn, Ile ili Gln će imati isti efekat. Zbog sekvencijalnog prelaza u post-fuziju, ove mutacije mogu da se kombinuju sa drugim stabilizujućim mutacijama kao što su N67I i S215P kako bi se dobile potpune koristi od ove stabilizacije, kao što je prikazano u Tabeli 10 za npr. D486N.

4

Aminokiselinski ostaci 175, 184, 185

[0119] Kako bi se pre-fuzija preklopila u post-fuzionu konformaciju, region između ostataka 175 i 193 mora da se transformiše iz petlje - beta ukosnice u spiralu.

Ovaj region pokazuje najdramatičniju strukturnu tranziciju. Deo ovog regiona zapravo ima najveće predviđanje alfa-spirala. Stvarne spiralne strukture u pre-fuzionom modelu prikazane su u sivim tonovima. Ovaj ceo region se transformiše u jednu veliku spiralu kada se preklopi u post-fuzionu konformaciju. U donjoj sekvenci ostaci su označeni sivom bojom, sa najvećom prognozom spirala baziranoj na Agadiru (http://agadir.crg.es/). Jasno je iz ovog poređenja da C-terminalni deo koji se održava u beta-ukosnici u pre-fuzionoj konformaciji, (ostaci 187-202) ima visoku tendenciju da formira alfa-spiralu.

[0120] Sekvenca ostataka 150 - 212 RSV-F je prikazana iznad. Na drugoj liniji sekundarne strukture gornje linije su označene sa h (za spiralu) i s (za lance) na osnovu PIV-53D modela homologije. Spirale su označene sivom bojom. Donja linija je ista sekvenca u kojoj su spirale obojene u sivo na osnovu spiralne sklonosti sekvence

Prema tome, prolin je uveden na položaj 175 kako bi se stabilizovao ovaj preokret i kako bi se sprečilo preklapanje u spiralu koja kao jedna mutacija povećava nivo eksprimiranja, ukazujući da stabilizuje per-fuzionu konformaciju i omogućava bolju obradu proteina. Za skretanje u ukosnicu (ostaci 184, 185) u Brookhaven baze podataka u pretražena je strukturno homolognu ukosnicu iz stabilnog proteina koji se ne može preklopiti. Visoka strukturna homologija je otkrivena sa petljom ukosnice u proteinskoj kinazi A (pdb kod 3FHI). Prema poravnanju prikazanom u nastavku, ostaci 184 Gly ili 185Val su zamenjeni sa Asn kako bi se stabilizovao ovaj zaokret i sprečilo njegovo preklapanje.

4

[0121] Ove mutacije se mogu kombinovati sa drugim stabilizujućim mutacijama kao što su N67I i S215P kako bi se dobila puna korist od ove stabilizacije, kao što je prikazano u Tabeli 10.

Aminokiselinski ostaci 421, 426 i 46

[0122] Aminokiselinski ostaci na položajima 421 i 426 su u petlji u DII regionu. Ostatak S46 je na lancu koji prelazi iz DI u DIII. Aminokiselinski ostatak na položaju 426 je mutiran u serin i aminokiselinski ostatak na položaju 46 mutiran je u glicin. Ove mutacije povećavaju stabilnost i nivoe pre-fuzionog eksprimiranja.

Aminokiselinski ostatak 465

[0123] Aminokiselinski ostatak Lys465 se nalazi u drugom regionu koji prolazi kroz veliku konformacijsku promenu. Lys465 se nalazi na kružnoj petlji koja povezuje vrh DII regiona sa HRB-om. Pošto se HRB region kreće od dna do vrha i kompleksa sa HRA kako bi napravio snop od šest spirala, ukrštena petlja se takođe pomera od dna ka vrhu. Zbog toga ova petlja mora biti metastabilna kako bi omogućila odvajanje DII i repozicioniranje u drugom okruženju. Lys465 na ukrštenoj petlji je blizu Lys445 na DII regionu. Mutacija Lys465 bilo na Gln ili Glu neutralizuje odbijanje i povećanu stabilnost i nivoe eksprimiranja pre-fuzionog F.

PRIMER 3

Eksprimiranje pre-fuzionog F proteina

[0124] Plazmidi eksprimiranja koji kodiraju rekombinantni pre-fuzioni RSV F protein su generisani standardnim postupcima široko poznatim u struci, koji uključuju ciljanu mutagenezu i PCR. Korišćena je platforma za eksprimiranje 293Freestyle ćelija (Life Technologies, Renfreshire, UK). Ćelije su transientno transfektovane upotrebom 293Fektina (Life Technologies) prema uputstvima proizvođača i kultivisane u inkubatoru za mućkanje tokom 5 dana na 37°C i 10% CO2. Supernatant kulture je sakupljen i centrifugiran 5 minuta na 300 g kako bi se uklonile ćelije i ćelijski ostaci. Završeni supernatant je zatim sterilno filtriran upotrebom vakuum filtera od 0,22 um i čuvan na 4°C do upotrebe.

PRIMER 4

Prečišćavanje pre-fuzionog RSV F proteina

[0125] Rekombinantni polipeptidi su prečišćeni pomoću protokola za prečišćavanje u 2 koraka, primenom kolone katjonskog izmenjivača za početno prečišćavanje, i zatim i kolone Superdex200 za korak poliranja kako bi se uklonili zaostali kontaminanti. Za početni korak izmene jona supernatant kulture je razblažen sa 2 zapremine 50 mM NaOAc pH 5,0 i prevučen preko 5 ml HiTrap Capto S kolone na 5 ml u minuti. Zatim je kolona isprana sa 10 zapremina kolone (CV) 20 mM NaOAc, 50 mM NaCl, 0,01% (v/v) tween20, pH 5 i eluiranjem 2 CV od 20 mM NaOAc, 1M NaCl, 0,01% (v/v) tween20, pH 5. Eluat je koncentrovan upotrebom koncentratora za centrifugiranje i protein je dalje prečišćen korišćenjem kolone Superdex200 koristeći 40 mM Tris, 500 mM NaCl, 0,01% (v/v) tween20, pH 7,4 kao pufer za radni tok. Na Slici 1A prikazan je hromatogram iz kolone za gel filtraciju i dominantni vrh sadrži pre-fuzioni RSV F protein. Fragmenti koje sadrže ovaj pik ponovo su sakupljeni i koncentracija proteina je određena korišćenjem OD280 i čuvana na 4°C do upotrebe. Na Slici 1B je prikazana redukovana SDS-PAGE analiza finalnog preparata proteina i, kao što se može videti, čistoća je bila >95%. Identitet trake je verifikovan korišćenjem Western blot i protein F specifičnih antitela (nije prikazano).

PRIMER 5

NativePAGE

[0126] Za početno određivanje multimernog stanja pre-fuzionih F polipeptida prema pronalasku, supernatanti kulture iz privremeno transfektovanih ćelija su analizirani u NativePAGE Bis-Tris gel sistemu (Life Technologies). Zatim su gelovi blotirani korišćenjem iBlot tehnologije u skladu sa uputstvima proizvođača (Life Technologies). RSV F protein specifično antitelo CR9503 (sekvence date ispod u Tabeli 17) je korišćeno kao primarna sonda za detekciju pre-fuzionog RSV F proteina i praćeno je sa HRP konjugovanim mišjim anti-ljudskim IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) ili IRDye800CW konjugovanim afinitetno-prečišćenim anti-ljudskim IgG (zec) (Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA). Mrlje su razvijene sa standardnim filmom (Codak) ili pomoću Odyssey CLx infracrvenog sistema za snimanje. Slika 2 prikazuje NativePAGE analizu supernatanata iz monomernog F47-, (linija 1), post-fuzionog i primarno trimeričnog RSV F proteina (linija 2) i prečišćenog pre-fuzionog RSV F proteina (linija 3), pokazujući da su nakon prečišćavanja samo trimerične vrste prisutne u preparatu pre-fuzionog RSV F proteina, jer se on migrira slično kao post-fuziona trimer traka. Ovo je podržano i eluacionom zapreminom iz kolone za gel filtraciju (slika 1A).

PRIMER 6

1

Kvantitativno Western blotovanje

[0127] Za kvantifikovanje pre-fuzionih RSV F proteinskih konstrukata, korišćen je kvantitativni Western blotovanje. Razblaženja kulture supernatanata su redukovana na 4-12% (w/v) Bis-Tris NuPAGE gelovima (Life Technologi) i blotovana korišćenjem iBlot tehnologije (Life Technologi). Blotovi su ispitivani sa CR9503 (kao što je opisano gore) i razvijeni bilo sa konjugovanim mišjim anti-ljudskim IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) ili sa IRDye800CW konjugovanim afinitetno prečišćenim anti-ljudskim IgG (zec) (Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA). Količine proteina su zatim procenjene korištenjem serije razređenih pročišćenih RSV standardnih proteina i, bilo Odyssey CLx sistema infracrvenog slikanja, ili odokativno. Na Slici 3 mogu se videti efekti u odnosu na A2_F24 (SEQ ID NO: 19) konstrukt u smislu ukupnih nivoa eksprimiranja. Pokazano je da pojedinačne mutacije povećavaju nivo eksprimiranja do 5 puta. Ako su dvostruki mutanti nekih od ovih mutacija, generisani sinergetski efekti mogli su se primetiti, i u nekim slučajevima je primećeno dalje povećanje eksprimiranja do 11 puta u odnosu na A2_F24. PRIMER 7

Test stabilnosti krajnje tačke

[0128] Verifikacija pre-fuzione konformacije eksprimiranih polipeptida prema pronalasku je izvršena korišćenjem BioLayer Interferometry (Oktet) tehnologije korišćenjem pre-fuziono specifičnih antitela CR9501 ili CR9502, ili ne-konformacijski specifičnog antitela CR9503, koje sadrži varijabilne regione teškog i lakog lanca od Motavizumaba. Antitela su biotinilovana standardnim protokolima i imobilisana na Streptavidin biosenzorima (ForteBio, Portsmouth, UK). Postupak je bio sledeći. Nakon ekvilibracije senzora u kinetičkom puferu (ForteBio) tokom 60 sekundi, Tipss je prebačen u PBS sa 5 µg/ml željenog antitela.

Opterećenje je izvršeno tokom 250 sekundi. Zatim je uključen još jedan korak ravnoteže okom 200 sekundi u kinetičkom puferu. Na kraju, tipovi su prebačeni u supernatant kulture eksprimiranja koji sadrži pre-fuzionisane RSV F polipeptide, i zabeležen je odgovor vezivanja (nm) posle 1200 sekundi. Ova faza se takođe naziva faza asocijacije. Ovo je učinjeno odmah nakon prikupljanja (dan 1), kao i 5 dana kasnije (dan 5), i razlika u CR9501 vezivanju je korišćena kao alat za skrining, kako bi se identifikovale mutacije sposobne da stabilizuju per-fuzionu konformaciju. Konstrukt je smatran stabilnim ako je uočeno manje od 20% gubitka vezivanja na dan 5,- i ako je uočeno više od 20% gubitka vezivanja, smatran je nestabilnim. Stabilni konstrukti bi tada mogli biti podvrgnuti strožem testu stabilnosti, ako je

2

potrebno. Analiza podataka je izvršena korišćenjem ForteBio Data Analysis 6.4 softvera (ForteBio).

PRIMER 8

Test stabilnosti toplote

[0129] Stabilizacioni potencijal uvedenih osobina u RSV F polipeptide procenjen je toplotnim stresom. U tu svrhu se supernatant kulture iz privremeno transfektovanih ćelija ili prečišćenog proteina zagreva pomoću raspona temperatura. Uzorci su zatim ohlađeni na ledu kako bi se sprečile dalje toplotno indukovane konformacione promene, i sondiran je upotrebom CR9501 antitela na platformi za oktet tehnologiju kao što je opisano u Primeru 7. Odgovori dobijeni na kraju faze asocijacije na različitim temperaturama su ucrtani kao funkcija temperature i nelinearne regresijom pomoću Prism softvera. Ovo je rezultovalo procenom temperature gde je nivo vezivanja antitela 50% od maksimuma, i ova vrednost se može koristiti za poređenje različitih konstrukata u smislu stabilnosti pre-fuzione toplote. Na Slici 4 su upoređeni nemodifikovani ektodomen (SEQ ID NO: 13) i A2_F24 N67I+S215P konstrukt (SEQ ID N0: 21). Može se primetiti da stres izazvan temperaturom ima manji efekat na A2_F24 N67I+S215P konstrukt (SEQ ID NO: 21) u poređenju sa nemodifikovanim ektodomenom. Stoga se može zaključiti da stabilizacioni motivi uvedeni u polipeptide prema pronalasku, tj. mesto trimerizacije, F1-F2-veznik i 2 tačkaste mutacije dovode do stabilnijeg pre-fuzionog F proteina.

PRIMER 9

Test stabilnosti faze asocijacije

[0130] Kako bi se procenila stabilnost različitih tačkastih mutacija testa vezivanja okteta, razvijena je varijacija prethodno opisanog testa stabilnosti krajnje tačke (Primer 7). Analiza faze asocijacije je sprovedena zbog veoma visokih nivoa eksprimiranja nekih tačkastih mutanata, jer je stroža i potpuno sprečava pristrasnost nivoa eksprimiranja. Takođe je korišćeno CR9501 antitelo, ali umesto izbora odgovora vezivanja na kraju faze asocijacije, korišćena je kompletna kriva asocijacije, kako bi se smanjila potencijalna koncentraciona pristrasnost testa krajnje tačke. Ovo je urađeno korišćenjem podataka iz cele faze asocijacije eksperimenta koristeći naznačene A2_F24 tačkaste mutante. Podaci su kompenzovani za količinu vezanog antitela na čipu. Merenja su izvršena na dane 1, 5 i 33, i poređeni su oblici krivi iz tri dana. Ako se dobiju identične krive, konstrukt se smatra stabilnim, a ako se ne dobiju, smatra se nestabilnim. Na Slici 5 može se pogledati analiza četiri različite varijante. Nestabilni proteinski pre-fuzioni konstrukti mogu se identifikovati vremenski zavisnim gubitkom vezivanja CR9501 (A2_F24, K465Q, S46G), dok stabilni pre-fuzioni konstrukti (N67I) ne pokazuju takvo smanjenje. Izgleda da je mutacija E92D pala u grupu između dve sa srednjom stabilnošću, pošto su primećene samo manje promene u obliku krive. Na Slici 6, izabrane tačkaste mutacije su kombinovane kako bi se dobili dvostruki mutanti, i one su analizirane. Kao što se može pogledati, različite mutacije pokazuju različite fenotipove u smislu stabilnosti, i indukcije stabilnosti. Kada polipeptidi sadrže mutacije K465Q ili S46G, same ili u kombinaciji, sva tri, tj. dva pojedinačna i dvostruki mutant, su nestabilni i vezivanje antitela specifično za fuziju je izgubljeno tokom vremena. Kada se mutacija S46G kombinuje sa E92D, za koju je ranije pokazano da ima srednju stabilnost kao jednu mutaciju, ne može se videti promena stabilnosti, što ukazuje da mutacija E92D ne može da ispravi nestabilne proteinske konstrukte. Kada je mutacija N67I kombinovana ili sa S46G ili E92D mutacijom, rezultat je potpuno stabilan konstrukt. Ovo se takođe može primetiti kada je mutacija S215P kombinovana sa E92D mutacijom koja pokazuje jedinstveni potencijal ove dve mutacije da stabilizuju nestabilne pre-fuzione konstrukte.

PRIMER 10

Kvantitativni oktet

[0131] Kako bi se izmerila koncentracija pre-fuzionog RSV F proteina u supernatantima ćelijske kulture, korišćen je kvantitativni postupak baziran na oktetu. CR9501 i CR9503 antitela su biotinilovana standardnim protokolima i imobilisana na Streptavidin biosenzorima (ForteBio, Portsmouth, UK). Posle toga, obloženi biosenzori su blokirani u lažnom supernatantu kulture ćelija. Kvantitativni eksperiment je izveden na sledeći način: temperatura 30°C, brzina mešanja 1000 rpm, vreme testa 300 sec. Koncentracija proteina u supernatantu ćelijske kulture je izračunata korišćenjem standardne krive. Standardna kriva je pripremljena za svako obloženo antitelo korišćenjem A2_F24_N67I+S215P (SEQ ID # 21) proteina, razblaženog u supernatantu lažne ćelijske kulture. Merenje je izvršeno na dan sakupljanja supernatanta (dan 1), i nakon skladištenja supernatanta na 4°C tokom 5 dana, ili duže. Razlika u koncentraciji koja je određena sa CR9501 korišćena je kao alat za skrining kako bi se identifikovale mutacije sposobne da stabilizuju per-fuzionu konformaciju.

Konstrukt je smatran stabilnim ako je uočeno manje od 20% smanjenja izmerene

4

koncentracije na dan 5. Analiza podataka je izvršena korišćenjem ForteBio Data Analysis 6.4 softvera (ForteBio).

PRIMER 11

FACS analiza i toplotna stabilnost

[0132] Plazmidi eksprimiranja koji kodiraju rekombinantni RSV F protein pune dužine su generisani standardnim postupcima široko poznatim u struci, koji uključuju ciljanu mutagenezu i PCR. HEK293-T ćelije su transientno transfektovane upotrebom 293Fectin-a (Life Technologies) prema uputstvima proizvođača i kultivisane tokom 48 sati na 37°C i 10% CO2. Ćelija je odvojena od posuda za kulturu ćelija korišćenjem FACS pufera (5 mM EDTA, 1% FBS u PBS), isprana i resuspendovana u istom puferu. Ćelije su obojene za površinski RSV F protein biotinilovanim CR9501 ili CR9503 antitelima, praćeno sa APC-obeleženim streptavidinom. Za diskriminaciju između živih i mrtvih ćelija, Propidijum jodid je dodat u suspenziju ćelija na kraju postupka bojenja. Ćelije su analizirane na FACS Canto (BD Biosciences) prema standardnim postupcima koji su dobro poznati svakom stručnjaku.

Analiza podataka je izvršena korišćenjem FlowJo 9.0 softvera (Tree Star Inc.). Prosečan intenzitet fluorescencije (MFI) je izračunat za populaciju živih APC-pozitivnih ćelija.

[0133] Stabilizacioni potencijal uvedenih osobina u RSV F pune dužine membranskog RSV je procenjen toplotnim stresom. Ćelije su 48 sati nakon transfekcije odvojene od posuda za kulturu ćelija kao što je gore opisano, i ćelijska suspenzija je zagrevana 5-10 minuta korišćenjem raspona temperatura (37, 46, 55,3, 60°C). Ćelije su zatim obojene i analizirane pomoću FASC kao što je gore opisano. MFI je izračunat za populaciju živih APC-pozitivnih ćelija. Procenat APC-pozitivnih ćelija je izračunat za populaciju živih ćelija. Bojenje sa CR9503 rezultovalo je sličnim MFI i % APC-pozitivnih ćelija u uzorcima podvrgnutim toplotnom šoku sa povećanjem temperature. Bojenje sa CR9501 se smanjuje u ćelijskim uzorcima transfektovanim sa nestabilnim proteinima. Gubitak CR9501 vezivanja ukazuje na gubitak pre-fuzionog RSV F proteina na površini ćelije.

PRIMER 12

Pretklinička procena pre-fuzione F imunogenosti

[0134] Kako bi se procenila imunogenost stabilizovanog pre-fuzionog RSV F (A2F24, N67I, S215P) (SEQ ID NO: 21) imunizovali smo miševe prema Tabeli 14 sa 0,5 ili 5 µg u režimu primarne stimulacije u nedelji 0 i nedelji 4. Kao što je prikazano na Slici 7, miševi imunizovani pre-fuzionim F pokazali su više VNA titre nego miševi imunizovani sa postfuzionim RSV F.

Tabela 14. Shema imunizacije

[0135] Zatim, pamučni pacovi su imunizovani sa dve različite doze RSV-F, bilo u postfuzionoj ili pre-fuzionoj konformaciji (Tabela 15). Životinje su imunizovane i.m. u nedelji 0 i nedelji 4. Slika 8 pokazuje visoke titre neutralizujućih antitela na dan izazivanja (nedelja 7).

Tabela 15. Grupe, imunogen i doza za procenu imunogenosti i efikasnost kod pacova sa pamukom

Pet dana nakon izlaganja meren je virusni teret pluća i nosa (pogledati Sliku 9). Kao što je prikazano, pre-fuzioni F polipeptidi prema pronalasku su u stanju da izazovu jak zaštitni imuni odgovor koji smanjuje količinu virusa u plućima, a čak i u nosu.

Tabela 16. Standardne aminokiseline, skraćenice i svojstva

Tabela 17. Sekvence antitela

[0136] Aminokiselinska sekvenca od nekoliko pre-fuzionih RSV F konstrukata je data u nastavku. Napominje se da je numerisanje aminokiselina u različitim konstruktima koji su ovde opisani bazirano na sekvenci divljeg tipa (SEQ ID NO: 1), što znači da sve aminokiseline od položaja 1 do, i uključujući, položaj 108 pre-fuzionih konstrukata, odgovaraju položajima aminokiselina 1-108 sekvence divljeg tipa, dok je numerisanje aminokiselina od položaja 138 do kraja pomaknuto za 22 aminokiseline, tj. L138 u sekvenci divljeg tipa (SEQ ID NO: 1) odgovara L116 u svim pre-fuzionim konstruktima. Ovo je zbog činjenice da je izvršen brisanje u svim pre-fuzionim konstruktima, tj. umetanjem GSGSG veznika, stvarna numeracija u F1 nije ista između konstrukata. Prema tome, numeracija koja se koristi u odnosu na specifične mutacije prema pronalasku, npr., S215P, odnosi se na položaj aminokiseline u sekvenci divljeg tipa.

Sekvence

[0137]

1

2

4

1

2

4

1

Claims

Patentni zahtevi

1. Rekombinantni pre-fuzioni Fuzioni (F) polipeptid respiratornog sincicijskog virusa (RSV), koji sadrži najmanje jedan epitop koji je specifičan za pre-fuzioni konformacioni F protein, gde je najmanje jedan epitop prepoznat od strane pre-fuzionog specifičnog monoklonskog antitela, koji sadrži CDR1 region teškog lanca od SEQ ID NO: 54, CDR2 region teškog lanca od SEQ ID NO: 55, CDR3 region teškog lanca od SEQ ID NO: 56 i CDR1 region lakog lanca od SEQ ID NO: 62, CDR2 region lakog lanca od SEQ ID NO: 63, i CDR3 region lakog lanca od SEQ ID NO: 64 i/ili pre-fuziono specifično monoklonsko antitelo, koje sadrži CDR1 region teškog lanca od SEQ ID NO: 58, CDR2 region teškog lanca od SEQ ID NO: 59, CDR3 region teškog lanca od SEQ ID NO: 60 i CDR1 region lakog lanca od SEQ ID NO: 66, CDR2 region lakog lanca od SEQ ID NO: 67, i CDR3 region lakog lanca od SEQ ID NO: 68, gde polipeptid sadrži mutaciju aminokiselinskog ostatka N/T na položaju 67 u I, i/ili mutaciju aminokiselinskog ostatka S na položaju 215 u P, gde su položaji aminokiselina dati u odnosu na sekvencu od RSV F proteina iz A2 soja (SEQ ID NO: 1).

2. Pre-fuzioni RSV F polipeptid prema patentnom zahtevu 1, gde polipeptid sadrži F1 domen i F2 domen, i vezujuću sekvencu koja sadrži od 1 do 10 aminokiselinskih ostataka, koji povezuju navedeni F1 domen sa navedenim F2 domenom.

3. Pre-fuzioni RSV F polipeptid prema patentnom zahtevu 1 ili 2, koji sadrži skraćeni F1 domen i F2 domen, i vezujuću sekvencu koja sadrži 1 do 10 aminokiselinskih ostataka, koji povezuju navedeni F1 sa navedenim F2 domenom.

4. Pre-fuzioni RSV F polipeptid prema patentnom zahtevu 3, gde polipeptid sadrži heterologni domen trimerizacije povezan sa navedenim skraćenim F1 domenom.

5. Pre-fuzioni RSV F polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, gde polipeptid sadrži najmanje jednu dodatnu mutaciju, gde je navedena mutacija izabrana iz grupe koju čine:

(a) mutacije aminokiselinskog ostatka na položaju 46;

(b) mutacije aminokiselinskog ostatka na položaju 77;

(c) mutacije aminokiselinskog ostatka na položaju 80;

(d) mutacije aminokiselinskog ostatka na položaju 92;

2

(e) mutacije aminokiselinskog ostatka na položaju 175;

(f) mutacije aminokiselinskog ostatka na položaju 184;

(g) mutacije aminokiselinskog ostatka na položaju 185;

(h) mutacije aminokiselinskog ostatka na položaju 201;

(i) mutacije aminokiselinskog ostatka na položaju 209;

(j) mutacije aminokiselinskog ostatka na položaju 421;

(k) mutacije aminokiselinskog ostatka na položaju 426;

(l) mutacije aminokiselinskog ostatka na položaju 465;

(m) mutacije aminokiselinskog ostatka na položaju 486;

(n) mutacije aminokiselinskog ostatka na položaju 487; i

(o) mutacije aminokiselinskog ostatka na položaju 508.

6. Pre-fuzioni RSV F polipeptid prema patentnom zahtevu 5, gde je najmanje jedna dodatna mutacija izabrana iz grupe koja se sastoji od:

(a) mutacije aminokiselinskog ostatka S na položaju 46 u G;

(b) mutacije aminokiselinskog ostatka K na položaju 77 u E;

(c) mutacije aminokiselinskog ostatka K na položaju 80 u E;

(d) mutacije aminokiselinskog ostatka E na položaju 92 u D;

(e) mutacije aminokiselinskog ostatka N na položaju 175 u P;

(f) mutacije aminokiselinskog ostatka G na položaju 184 u N;

(g) mutacije aminokiselinskog ostatka V na položaju 185 u N;

(h) mutacije aminokiselinskog ostatka K na položaju 201 u Q;

(i) mutacije aminokiselinskog ostatka K na položaju 209 u Q;

(j) mutacije aminokiselinskog ostatka K na položaju 421 u N;

(k) mutacije aminokiselinskog ostatka N na položaju 426 u S;

(l) mutacije aminokiselinskog ostatka K na položaju 465 u E ili Q;

(m) mutacije aminokiselinskog ostatka D na položaju 486 u N;

(n) mutacije aminokiselinskog ostatka E na položaju 487 u Q, N ili I; i

(o) mutacije aminokiselinskog ostatka K na položaju 508 u E.

7. Pre-fuzioni RSV F polipeptid prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva 1-6, gde polipeptid sadrži mutaciju aminokiselinskog ostatka N/T na položaju 67 u I, i mutaciju aminokiselinskog ostatka S na položaju 215 u P.

8. Pre-fuzioni RSV F polipeptid prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva 4-7, gde heterologni domen trimerizacije sadrži aminokiselinsku sekvencu EKKIEAIEKKIEAIEKKIEA (SEQ ID NO: 3)

9. Pre-fuzioni RSV F polipeptid prema patentnom zahtevu 8, gde je domen trimerizacije povezan sa aminokiselinskim ostatkom 495 od RSV F proteina.

10. Pre-fuzioni RSV F polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 4-7, gde heterologni domen trimerizacije sadrži aminokiselinsku sekvencu GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 4).

11. Pre-fuzioni RSV F polipeptid prema patentnom zahtevu 10, gde je domen trimerizacije povezan sa aminokiselinskim ostatkom 513 od RSV F proteina.

12. Pre-fuzioni RSV F polipeptid prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je polipeptid stabilan najmanje 30 minuta na 55°C, poželjno na 58°C, poželjnije na 60°C.

13. Pre-fuzioni RSV F polipeptid prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je polipeptid stabilan nakon skladištenja na 4°C najmanje 30 dana, poželjno najmanje 60 dana, poželjno najmanje 6 meseci, još poželjnije najmanje 1 godinu.

14. Pre-fuzioni RSV F polipeptid prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 21 - SEQ ID NO: 52 i 71-89.

15. Molekul nukleinske kiseline koji kodira pre-fuzioni RSV F polipeptid prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva 1-14.

16. Vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 15.

4

17. Sastav koji sadrži pre-fuzioni RSV F polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-14, molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 15 i/ili vektor prema patentnom zahtevu 16.

18. Pre-fuzioni RSV F polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-14, molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 15 i/ili vektor prema patentnom zahtevu 16 za upotrebu kod indukovanja imunog odgovora protiv RSV F proteina.