RS58517B1 - Slit-robo signalizacija za dijagnostiku i lečenje bolesti bubrega - Google Patents

Slit-robo signalizacija za dijagnostiku i lečenje bolesti bubrega

Info

Publication number
RS58517B1
RS58517B1 RS20190250A RSP20190250A RS58517B1 RS 58517 B1 RS58517 B1 RS 58517B1 RS 20190250 A RS20190250 A RS 20190250A RS P20190250 A RSP20190250 A RS P20190250A RS 58517 B1 RS58517 B1 RS 58517B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
robo2
protein
kidney disease
nephrin
subject
Prior art date
Application number
RS20190250A
Other languages
English (en)
Inventor
Weining Lu
Xueping Fan
David J Salant
Original Assignee
Boston Medical Ct Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boston Medical Ct Corp filed Critical Boston Medical Ct Corp
Publication of RS58517B1 publication Critical patent/RS58517B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1774—Immunoglobulin superfamily (e.g. CD2, CD4, CD8, ICAM molecules, B7 molecules, Fc-receptors, MHC-molecules)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • G16B25/10—Gene or protein expression profiling; Expression-ratio estimation or normalisation
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H20/00—ICT specially adapted for therapies or health-improving plans, e.g. for handling prescriptions, for steering therapy or for monitoring patient compliance
    • G16H20/10—ICT specially adapted for therapies or health-improving plans, e.g. for handling prescriptions, for steering therapy or for monitoring patient compliance relating to drugs or medications, e.g. for ensuring correct administration to patients
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H50/00—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics
    • G16H50/30—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics for calculating health indices; for individual health risk assessment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/34—Genitourinary disorders
    • G01N2800/347—Renal failures; Glomerular diseases; Tubulointerstitial diseases, e.g. nephritic syndrome, glomerulonephritis; Renovascular diseases, e.g. renal artery occlusion, nephropathy
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
Oblast pronalaska se odnosi na postupke za lečenje hronične bolesti bubrega i proteinurije i za dijagnostiku hronične bolesti bubrega i praćenje efekata tretmana na progresiju hronične bolesti bubrega i proteinuriije.
U radu Lu, W. i saradnika (Am. J. Hum. Genet. vol 80, no 4, april 2007) pokazano je kako je razaranje ROBO2 povezano sa anomalijama urinarnog trakta i prenošenjem rizika od vezikoureteralnog refluksa. Prikazan je pacijent sa hromosomskom translokacijom kojom se narušava ROBO2 gen i dovodi do stvaranja fuzionih proteina Fu-129 (129aas) i Fu-153 (153aas), koji sadrže prvi ROBO2 ekstracelularni imunoglobulinski (Ig) domen.
SUŠTINA PRONALASKA
Ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži inhibitor ROBO2 koji inhibira biološku aktivnost ROBO2, pri čemu je inhibitor ROBO2 rastvorljivi protein ROBO2, koji uključuje fuzioni polipeptid koji sadrži i Ig1 i Ig2 SLIT vezujuće domene ROBO2, bez intracelularnog domena ROBO2.
Ovaj pronalazak, takođe, obezbeđuje navedenu farmaceutsku kompoziciju za korišćenje u lečenju ispitanika koji boluje ili je pod rizikom od hronične bolesti bubrega ili proteinurije.
Ovde su obezbeđeni novi postupci za tretman hronične bolesti bubrega i proteinurije i za dijagnostiku hronične bolesti bubrega i praćenje uticaja tretmana na progresiju hronične bolesti bubrega i proteinurije, koji su, delom, bazirani na otkriću pronalazača, koje se tiče nove i neočekivane uloge puta SLIT-ROBO signalizacije u regulaciji F-aktinskog citoskeleta podocita i strukture prstolikih produžetaka podocita u bubregu.
Sledstveno tome, u nekim aspektima, ovde su obezbeđeni postupci za lečenje hronične bolesti bubrega kod ispitanika kome je to potrebno, pri čemu postupci uključuju primenu ispitaniku koji boluje ili je pod rizikom od hronične bolesti bubrega, terapeutski efektivne količine kompozicije koja sadrži inhibitor ROBO2.
Ovde je, takođe, u nekim aspektima, obezbeđen postupak za smanjivanje proteinurije kod ispitanika kome je to potrebno, a koji obuhvata primenu ispitaniku koji boluje ili je pod rizikom od proteinurije, terapeutski efektivne količine kompozicije koja sadrži inhibitor ROBO2.
U nekim ostvarenjima ovih postupaka i svih takvih postupaka, koji su ovde opisani, inhibitor ROBO2 je blokirajuće antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji je specifičan za ROBO2, antisens molekul koji je specifičan za ROBO2, kratka interferirajuća RNA (siRNA), specifična za ROBO2, inhibitor ROBO2 malog molekula, ROBO2 inhibitorni polipeptid ili strukturni analog ROBO2.
U nekim ostvarenjima ovih postupaka i svih takvih, ovde opisanih, postupaka, inhibitor ROBO2 blokira ili smanjuje vezivanje ROBO2 za SLIT, za Nck ili za oba.
U nekim ostvarenjima ovih postupaka i svih takvih, ovde opisanih, postupaka, inhibitor ROBO2 je specifičan za Ig1 SLIT vezujući domen, Ig1 i Ig2 SLIT vezujuće domene, intracelularni vezujući domen Nck ili bilo koju njihovu kombinaciju.
U nekim ostvarenjima ovih postupaka i svih takvih, ovde opisanih, postupaka, ROBO2 inhibitorni polipeptid je dominantni negativni ROBO2 fuzioni protein, polipeptid koji sadrži ekstracelularni domen ROBO2 bez intracelularnog domena, ili polipeptid koji sadrži intracelularni domen ROBO2 bez ekstracelularnog domena.
U nekim ostvarenjima ovih postupaka i svih takvih, ovde opisanih, postupaka, ispitanik koji boluje ili je pod rizikom od hronične bolesti bubrega ima dijabetičnu nefropatiju ili visoki krvni pritisak.
U nekim ostvarenjima ovih postupaka i svih takvih, ovde opisanih, postupaka, postupak dalje, uključuje primenu ispitaniku dodatnog terapeutskog sredstva.
U nekim ostvarenjima ovih postupaka i svih takvih, ovde opisanih, postupaka, dodatno terapeutsko sredstvo je inhibitor angiotenzin-konvertujućeg enzima (ACE) ili sredstvo koje blokira angiotenzin II receptor (ARB).
Ovde su, isto tako, u nekim aspektima, obezbeđeni, postupci koji uključuju:
a. testiranje biološkog test uzorka ispitanika da bi se utvrdio nivo ekspresije ROBO2 polipeptida ili RNA koja kodira ROBO2 polipeptid;
b. utvrđivanje da li je nivo ekspresije ROBO2 polipeptida ili nivo ekspresije RNA koja kodira ROBO2 polipeptid u biološkom test uzorku iznad nivoa referentnog praga; i c. dijagnostičko ispitivanje pojedinca kome su potrebni lečenje ili terapija hronične bolesti bubrega.
U nekim ostvarenjima ovih postupaka i svih takvih, ovde opisanih, postupaka, ispitivanje nivoa ekspresije ROBO2 polipeptida se vrši korišćenjem antitela ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta, specifičnog za ROBO2 polipeptid.
U nekim ostvarenjima ovih postupaka i svih takvih, ovde opisanih, postupaka, ispitivanje nivoa ekspresije RNA koja kodira ROBO2 polipeptid se vrši korišćenjem PCR-a ili hibridizacijskog testa.
U nekim ostvarenjima ovih postupaka i svih takvih, ovde opisanih, postupaka, biološki test uzorak je uzorak biopsije bubrega, urin, krv, uzorak seruma ili ćelije, iscentifugirane iz uzorka urina.
U nekim ostvarenjima ovih postupaka i svih takvih, ovde opisanih, postupaka, nivo ekspresije ROB02 polipeptida ili nivo ekspresije RNA koja kodira ROB02 polipeptid je najmanje 20% iznad referentnog prag nivoa.
U nekim ostvarenjima ovih postupaka i svih takvih, ovde opisanih, postupaka, nivo ekspresije ROB02 polipeptida ili nivo ekspresije RNA koja kodira ROB02 polipeptid je za najmanje dve standardne devijacije iznad nivoa referentnog praga.
Ovde su, takođe, u nekim aspektima, obezbeđeni testovi koji uključuju:
a. kontakt biološkog test uzorka, koji je dobijen od ispitanika, sa reagensom koji detektuje ROBO2 polipeptid ili RNA koja kodira ROBO2 polipeptid i
b. utvrđivanje nivoa ROBO2 polipeptida ili RNA koja kodira ROBO2 polipeptid,
pri čemu se preko povišenog nivoa navedenog ROBO2 polipeptida ili navedene RNA koja kodira ROBO2 polipeptid, u odnosu na normalni biološki uzorak, identifikuje ispitanik koji ima hroničnu bubrežnu bolest i/ili kod kojeg postoji progresija hronične bolesti bubrega ili proteinurije.
U nekim ostvarenjima ovih testova i svih takvih, ovde opisanih, testova, utvrđivanje nivoa ekspresije ROBO2 polipeptida se vrši korišćenjem antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, specifičnog za ROBO2 polipeptid.
U nekim ostvarenjima ovih testova i svih takvih, ovde opisanih, testova, utvrđivanje nivoa ekspresije RNA koja kodira ROBO2 polipeptid se vrši korišćenjem PCR-a ili hibridizacijakog testa.
U nekim ostvarenjima ovih testova i svih takvih, ovde opisanih, testova, biološki test uzorak je uzorak biopsije bubrega, urin, krv, uzorak seruma ili ćelije, iscentrifugirane iz uzorka urina.
U nekim ostvarenjima ovih testova i svih takvih, ovde opisanih, testova, nivo ekspresije ROBO2 polipeptida ili nivo ekspresije RNA koja kodira ROBO2 polipeptid je najmanje 20% iznad nivoa referentnog praga.
U nekim ostvarenjima ovih testova i svih takvih, ovde opisanih, testova, nivo ekspresije ROBO2 polipeptida ili nivo ekspresije RNA koja kodira ROBO2 polipeptid je najmanje dve standardne devijacije iznad nivoa referentnog praga.
U nekim ostvarenjima ovih testova i svih takvih, ovde opisanih, testova, ispitanik ima dijagnozu šećerne bolesti ili visokog krvnog pritiska.
U nekim aspektima, ovde su obezbeđeni sistemi za utvrđivanje da li je ispitanik pod rizikom za hroničnu bubrežnu bolest ili proteinuriju, ili ima hroničnu bolest bubrega, pri čemu isti uključuju:
a. merni modul, koji je konfigurisan za određivanje nivoa ekspresije ROB02 polipeptida ili nivoa ekspresije RNA koja kodira ROB02 polipeptid u biološkom uzorku koji je dobijen od ispitanika;
b. komparativni modul koji je konfigurisan za prihvatanje navedenog nivoa ekspresije ROBO2 polipeptida ili nivoa ekspresije RNA koja kodira ROB02 polipeptid, koji je utvrđen posredstvom mernog modula, i izvođenje najmanje jedne analize za utvrđivanje da li je nivo ekspresije ROBO2 polipeptida ili nivo ekspresije RNA koja kodira ROBO2 polipeptid veći od prethodno ustanovljenog referentnog nivoa ili odnosa, i za obezbeđivanje, na taj način dobijenog, sadržaja; i
c. displej modul za prikazivanje sadržaja, baziranog na izlaznim podacima, dobijenim iz navedenog komparativnog modula, pri čemu sadržaj uključuje signal, koji je pokazatelj da je ekspresioni nivo ili odnos ROBO2 polipeptida ili RNA veći od prethodno utvrđenog referentnog nivoa ili odnosa, ili signal, koji je pokazatelj da nivo ili odnos ekspresije ROBO2 nije veći od referentnog nivoa ili prethodno ustanovljenog odnosa.
U nekim ostvarenjima ovih sistema i svih takvih, ovde opisanih, sistema, sadržaj koji je prikazan na displej modulu, dalje, uključuje signal koji kao indikator ukazuje na ispitanika kome je preporučeno da primi određeni režim tretmana.
U nekim aspektima, ovde su obezbeđeni sistemi za utvrđivanje da li je ispitanik pod rizikom za hroničnu bubrežnu bolest ili proteinuriju, ili ima hroničnu bubrežnu bolest, pri čemu isti uključuju:
a. determinacijski modul, koji je konfigurisan za prihvatanje najmanje jednog test uzorka, koji je dobijen od ispitanika, i izvođenje najmanje jedne analize u navedenom najmanje jednom test uzorku, da bi se utvrdilo prisustvo ili odsustvo jednog od sledećih uslova:
i. odnos ekspresije ROBO2 koji je veći od prethodno ustanovljenog odnosa, ili ii. nivo ekspresije ROBO2 koji je veći od prethodno utvrđenog nivoa
b. uređaj za skladištenje, konfigurisan za čuvanje izlaznih podataka, dobijenih iz navedenog determinacijskog modula i
c. displej modul za prikazivanje sadržaja, baziranog na podacima, dobijenim iz navedenog determinacijskog modula, pri čemu sadržaj uključuje signal, koji je pokazatelj da je ekspresioni odnos ROBO2 veći od prethodno ustanovljenog odnosa ili je nivo ROBO2 veći od prethodno ustanovljenog nivoa, ili signal koji je pokazatelj da ekspresioni odnos ROBO2 nije veći od prethodno utvrđenog odnosa ili nije veći od prethodno ustanovljenog nivoa.
U nekim ostvarenjima ovih sistema, i svih takvih, ovde opisanih, sistema, sadržaj koji je prikazan na displej modulu dalje uključuje signal koji kao indikator ukazuje na ispitanika kome je preporučeno da prima određeni režim tretmana.
Ovde su, isto tako, u nekim aspektima, obezbeđeni postupci za lečenje humanog ispitanika pod rizikom od hronične bolesti bubrega ili proteinurije, koji obuhvataju primenu tretmana ili terapije za prevenciju pojave hronične bolesti bubrega ili proteinurije humanom ispitaniku, kod koga je utvrđen nivo ROBO2 proteina iznad nivoa referentnog praga.
U nekim ostvarenjima ovih postupaka i svih takvih, ovde opisanih, postupaka, nivo ROB02 proteina je najmanje 20% iznad referentnog nivoa.
U nekim ostvarenjima ovih postupaka i svih takvih postupaka, koji su ovde opisani, nivo ROB02 proteina je za najmanje dve standardne devijacije iznad referentnog nivoa.
U nekim ostvarenjima ovih postupaka i svih takvih, ovde opisanih, postupaka, tretman ili terapija za prevenciju pojave hronične bolesti bubrega ili proteinurije uključuje inhibitor ROBO2.
U nekim ostvarenjima ovih postupaka i svih takvih, ovde opisanih, postupaka, inhibitor ROBO2 je blokirajuće antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, koji je specifičan za ROBO2, antisens molekul, specifičan za ROBO2, kratka interferirajuća RNA (siRNA), koja je specifična za ROBO2, inhibitor ROBO2 malog molekula, inhibitorni polipeptid ROBO2 ili strukturni analog ROBO2.
U nekim ostvarenjima ovih postupaka i svih takvih postupaka, koji su ovde opisani, inhibitor ROBO2 blokira ili redukuje vezivanje ROBO2 za SLIT, za Nck ili za oba.
U nekim ostvarenjima ovih postupaka i svih takvih, ovde opisanih, postupaka, inhibitor ROBO2 je specifičan za Ig1 SLIT vezujući domen, SLIT vezujuće domene Ig1 i Ig2, intracelularni vezujući domen Nck ili bilo koju njihovu kombinaciju.
U nekim ostvarenjima ovih postupaka i svih takvih, ovde opisanih, postupaka, ROBO2 inhibitorni polipeptid je dominantni negativni ROBO2 fuzioni protein, polipeptid koji sadrži ekstracelularni domen ROBO2 bez intracelularnog domena, ili polipeptid koji sadrži intracelularni domen ROBO2 bez ekstracelularnog domena.
Ovde su, u nekim aspektima, isto tako, obezbeđeni inhibitori ROBO2 za korišćenje u lečenju hronične bolesti bubrega, i inhibitor ROBO2 za korišćenje u lečenju proteinurije.
U nekim ostvarenjima ovih korišćenja, i svih takvih, ovde opisanih, korišćenja, inhibitor ROB02 je blokirajuće antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, koji je specifičan za ROBO2, antisens molekul koji je specifičan za ROBO2, kratka interferirajuća RNA (siRNA), koja je specifična za ROBO2, inhibitor ROBO2 malog molekula, ROBO2 inhibitorni polipeptid ili strukturni analog ROBO2.
U nekim ostvarenjima ovih korišćenja i svih takvih, ovde opisanih, korišćenja, inhibitor ROBO2 blokira ili redukuje vezivanje ROBO2 za SLIT, za Nck ili za oba.
U nekim ostvarenjima ovih korišćenja i svih takvih, ovde opisanih, korišćenja, inhibitor ROBO2 je specifičan za Ig1 SLIT vezujući domen, SLIT vezujuće domene Ig1 i Ig2, intracelularni vezujući domen Nck ili bilo koju njihovu kombinaciju.
U nekim ostvarenjima ovih korišćenja i svih takvih, ovde opisanih, korišćenja, ROBO2 inhibitorni polipeptid je dominantni negativni ROBO2 fuzioni protein, polipeptid koji sadrži ekstracelularni domen ROBO2 bez intracelularnog domena, ili polipeptid koji sadrži intracelularni domen ROBO2 bez ekstracelularnog domena.
U nekim ostvarenjima ovih korišćenja i svih takvih, ovde opisanih, korišćenja, hronična bolest bubrega ili proteinurija su uzrokovane dijabetičnom nefropatijom ili visokim krvnim pritiskom.
U nekim ostvarenjima bilo kog od ovih aspekata i svih takvih aspekata, koji su ovde opisani, ROBO2 se odnosi na humani ROBO2, koji poseduje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1, kodiranu od strane mRNA sekvence SEQ ID NO: 2. U nekim ostvarenjima bilo kog od ovih aspekata i svih takvih, ovde opisanih, aspekata, ROBO2 se odnosi na humani ROBO2, koji poseduje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3, kodiranu od strane mRNA sekvence SEQ ID NO: 4.
Definicije
Zbog pogodnosti, ovde su sakupljeni određeni termini, koji su korišćeni u tekućoj specifikaciji, primerima i priključenim patentnim zahtevima. Ukoliko nije drugačije naznačeno, ili se podrazumeva iz konteksta, nazivi i izrazi koji slede uključuju značenja data u nastavku. Izuzev ukoliko je eksplicitno naznačeno drugačije, ili je očigledno iz konteksta, nazivi i izrazi u nastavku ne isključuju značenje koje se nazivu ili izrazu pripisuje u oblasti kojoj pripada. Definicije su obezbeđene kako bi pomogle u opisu određenih ostvarenja, i nije im namera da ograničavaju zahtevani pronalazak, budući da je okvir pronalaska ograničen isključivo posredstvom patentnih zahteva. Ukoliko nije drugačije naznačeno, svi tehnički i naučni termini koji su ovde korišćeni, imaju značenje istovetno onom koje se uobičajeno podrazumeva od strane lica uobičajene stručnosti u oblasti kojoj pronalazak pripada.
Kako je ovde upotrebljavan, izraz "sadržavati" ili "sadrži" korišćen je u odnosu na kompozicije, postupke i njihovu odgovarajuću komponentu(komponente), koji su od suštinskog značaja za pronalazak, koji je još otvoren za uključivanje nespecifikovanih elemenata, bilo da su suštinski ili nisu.
Kako je ovde korišćen, izraz "koji se suštinski sastoji od" odnosi se na one elemente koji su za dato ostvarenje neophodni. Izraz dopušta prisustvo dodatnih elemenata, koji materijalno nemaju uticaja na bazičnu i novu ili funkcionalnu karakteristiku(karakteristike) ostvarenja pronalaska.
Izraz "koji se sastoji od" odnosi se na kompozicije, postupke i njihove odgovarajuće komponente kao š to su ovde opisane, koje isključuju bilo koji element koji nije naveden u tom opisu ostvarenja.
Kako su korišćeni u ovoj specifikaciji i priključenim patentnim zahtevima, izrazi u jednini uključuju reference u množini, ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije. Sledstveno tome, primera radi, reference koje se odnose na "postupak" uključuju jedan ili više postupaka, i/ili koraka ovde opisanog tipa, i/ili one koji će postati očigledni stručnjacima u ovoj oblasti nakon čitanja ovog izlaganja, i tako dalje.
S izuzetkom operativnih primera ili kada je naznačeno drugačije, svi, ovde korišćeni, brojevi koji izražavaju količine sastojaka ili reakcionih uslova trebalo bi da se shvate tako da se u svim slučajevima modifikuju izrazom "oko". Izraz "oko", kada se koristi u vezi sa procentima, može označavati ±10%, ±5% ili ±1%.
Ukoliko nije ovde definisano na drugačiji način, naučni i tehnički izrazi, koji su korišćeni u vezi sa ovom prijavom, imali bi značenja koja se uobičajeno podrazumevaju od strane lica uobičajene stručnosti u oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada. Podrazumevalo bi se da ovaj pronalazak nije ograničen na određenu metodologiju, protokole, reagense, itd. koji su ovde opisani, budući da isti mogu varirati. Ovde korišćena terminologija je namenjena isključivo u svrhu opisivanja određenih ostvarenja, i nije joj namera da ograničava okvir ovog pronalaska, koji je definisan samo uz pomoć patentnih zahteva. Definicije opštih izraza u imunologiji i molekularnoj biologiji mogu se naći u: The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 18. izdanje, publikovanom od strane Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-911910-18-2); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publikovanoj od strane Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); i Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publikovanoj od strane VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology od Wernera Luttmanna, publikovanoj od Elsevier, 2006. Definicije opštih izraza u molekularnoj biologiji nalaze se u: Benjamin Lewin, Genes IX, publikovanoj od strane Jones & Bartlett Publishing, 2007 (ISBN-13: 9780763740634); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publikovanoj od strane Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); i Robert A. Meyers (ed.), Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1986); ili Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques Vol.152, S. L. Berger i A. R. Kimmerl Eds., Academic Press Inc., San Diego, USA (1987); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB) (Fred M. Ausubel, et al. ed., John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan, et. al., ed., John Wiley and Sons, Inc.) i Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, et. al., ed. John Wiley and Sons, Inc.).
KRATAK OPIS SLIKA
SLIKE 1A-1R pokazuju da se Robo2 ekspresuje i lokalizuje na bazalnoj ćelijskoj površini podocita. Sva imuno bojenja na (SLIKAMA 1A-1Q) izvršena su na mišu E16.5 dana, sa uvećanjem od 600X (vidi SLIKE 5A-5M za imuno-bojenja na glomerulima odraslog miša).
Na (SLIKAMA 1A-1C) Robo2 se ko-lokalizuje sa podocitnim slit-dijafragmalnim proteinom nefrinom. Na (SLIKAMA 1D-1F) Robo2 se ko-lokalizuje sa podocitnim slit-dijafragmalnim proteinom podocinom. Na (SLIKAMA 1G-1I) Robo2 se ko-lokalizuje sa adapterskim proteinom Nck u glomerulima. Na (SLIKAMA 1J-1L) Robo2 se ekspresuje na bazalnoj površini podocita, u neposrednoj blizini proteina nidogena bazalne glomerularne membrane. Na (SLIKAMA 1M-1O) Robo2 se ne ko-lokalizuje sa proteinskim markerom Pecam1 glomerularnih endotelnih ćelija (SLIKA IP). Uvećani region prikazan u odeljku označenom sa (SLIKA 1L) pokazuje da se Robo2 ekspresuje prevashodno na bazalnoj ćelijskoj površini (strelica) podocita (p), u neposrednoj blizini markera nidogena bazalne glomerularne membrane. Robo2 se slabo ekspresuje na vršnim i lateralnim ćelijskim površinama (vrhovi strelica) podocita. Na (SLICI 1Q) Robo2 se ekspresuje prevashodno na bazalnoj ćelijskoj površini (strelice) podocita (p), a slabo se ekspresuje na vršnim ili lateralnim ćelijskim površinama (vrhovi strelica). Na (SLICI 1R) imuno-gold elektronskom mikroskopijom se prikazuje lokalizacija zlatnih delića (strelice), konjugovanih sa Robo2 antitelom u prstolikim produžecima (fp) podocita kod miša starog 3-nedelje. GBM, glomerularna bazalna membrana. Uvećanje: 50,000X. Vidi, takođe, SLIKE.5A-5M.
SLIKE 2A-2J pokazuju da Robo2 ulazi u interakciju sa adapterskim proteinom Nck i obrazuje kompleks sa nefrinom. Na (SLICI 2A) dvo-hibridni test kvasaca pokazuje pozitivnu interakciju između intracelularnog domena Robo2 (Robo2-ICD) i Nckl. LacZ reporter (X-gal): ++, kvasac menja boju u tamno; +, svetlo; -, belo nakon 24 sata. Leucin reporter (-Leu): , porast kvasca; -, nije bilo porasta kvasca. CC, citoplazmatski konzervisani region. Brojevi označavaju pozicije ostataka u proteinu pune dužine. (SLIKA 2B) Dvo-hibridni test kvasaca pokazuje da su prva dva SH3 domena Nckl-a neophodna za njegovu interakciju sa Robo2-ICD. (SLIKA 2C) Dvo-hibridni test kvasaca pokazuje potencijalne vezujuće domene koji posreduju u interakciji Robo2 i Nckl. Sekvenca je potencijalni vezujući region u Robo2 za Nckl. Regioni bogati prolinom su istaknuti. (SLIKA 2D) Ko-precipitacija Robo2 i Nck. Ćelijski lizati u traci 5 su sakupljeni iz His-myc-Robo2 transfektovanih ćelija (korišćene u trakama 1 i 2); Ćelijski lizati u traci 6 su sakupljeni iz His-myc-Robo2-ΔNBD transfektovanih ć elija (korišćeni u trakama 3 i 4). (SLIKA 2E) Ko-precipitacija Robo2, Nck i nefrina. (SLIKA 2F) Koprecipitacija slična kao na (SLICI 2E) osim što je His-myc-nefrin oboren umesto His-myc-Robo2. (SLIKA 2G) Ko-imunoprecipitacija bubrežnog endogenog Robo2, Nck i nefrina. (SLIKA 2H) Test sličan kao onaj na (SLICI 2G) s tom razlikom š to se precipitati izrađuju korišćenjem mišjeg anti-nefrinskog antitela. (I) Slit2 pojačava stvaranje kompleksa Robo2-Nck-nefrin. His-myc-Robo2, nefrin i Fyn se ekspresuju u HEK ćelijama, koje se stimulišu sa Sli2-kondicioniranim medijumom (trake 1, 3) ili kontrolnim kondicioniranim medijumom (traka 2, 4). (SLIKA 2J) Kvantitativno određivanje intenziteta sa (SLIKE 2I). Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM; n=7, *p < 0.05, **p < 0.01 u poređenju sa kontrolom, parni studentov t-test. Vidi, takođe, SLIKE 6A-6F’.
SLIKE 3A-3G pokazuju da Slit2-Robo2 signalizacija inhibira nefrinom-posredovanu polimerizaciju aktina. (SLIKA 3A) CD16/7-NCD se ko-ekspresuje sa Robo2 u HEK ćelijama, koje se tretiraju sa anti-CD16 antitelom i anti-IgG antitelom konjugovanim sa rodaminom, u prisustvu Slit2-kondicioniranog medijuma (Slit) ili kontrolnog kondicioniranog medijuma (CTL). Ćelije se, nakon toga, fiksiraju i boje sa FITC-konjugovanim faloidinom, da bi se otkrio F-aktin. Linearna skala, 5 µm. NCD: citoplazmatski domen nefrina. (SLIKA 3B) Test sličan kao na (SLICI 3A), s izuzetkom što je CD16/7-NCD zamenjen sa CD16/7-HA, a koristi se kao kontrolni test. (SLIKA 3C) Kvantitativno je određen procenat ćelija sa F-aktinskim repovima u odnosu na ukupni broj ćelija sa CD16/7 grozdovima u svakoj grupi. Podaci su prikazani u vidu srednje vrednosti ± SEM, *p < 0.01, n=5. (SLIKA 3D) CD16/7-NCD na (SLICI 3A) je imuno-precipitovan sa anti-CD 16 antitelom nakon stimulacije Slit2-kondicioniranim medijumima (trake 1 i 3) ili kontrolnim kondicioniranim medijumima (trake 2 i 4). Obrati pažnju na smanjeni F-aktin na traci 1. CD16/7-HA je korišćen kao negativna kontrola. (SLIKA 3E) Kvantitativno određivanje intenziteta sa (SLIKE 3D). Podaci su prikazani u vidu srednje vrednosti ± SEM; n=4, *p < 0.05, u poređenju sa kontrolom, parni studentov t-test. (SLIKA 3F) Imuno-precipitacija nefrina iz bubrega homozigotnih Robo2 ʺknockoutʺ miševa (Robo2-/-), heterozigotnih miševa (Robo2+/-) i miševa divljeg tipa (Robo2+/+), uz korišćenje anti-nefrinskog antitela. Obratite pažnju na povećani F-aktin na traci 3. (SLIKA 3G) Kvantitativno određivanje intenziteta sa (SLIKE 3F). Podaci su predstavljeni u vidu srednjih vrednosti ± SEM; n=4, *p < 0.05, u poređenju sa podacima za miševe divljeg tipa i heterozigote, ANOVA analiza. Vidi, takođe, SLIKE 7A-7C.
SLIKE 4A-4W prikazuju strukturne fenotipove podocita kod Robo2 homozigotnih nultih miševa, kod podocit-specifičnih Robo2 ʺknockoutʺ miševa i kod dvostrukih Robo2 i Nphs1 ʺknockoutʺ miševa. (SLIKE 4A i 4B) Reprezentativni snimci bubrega novorođenih miševa prikazuju tela podocita (vrhovi strelica) i Baumanovu kapsulu (strelice) kod miševa divljeg tipa (SLIKA 4A) i Robo2 homozigotnih nultih miševa (SLIKA 4B). (SLIKE 4C i 4D) Snimci sa velikim uvećanjem (SLIKE 4A i 4 B) pokazuju prstolike produžetke podocita (strelice) u bubregu novorođenog miša. Linearna skala, 1 µm. (SLIKE 4E i 4F) Reprezentativni snimci bubrega 3-nedeljnih miševa pri malom uvećanju prikazuju telo ćelije podocita (vrhovi strelica) kod Robo2 homozigotnog nultog miša (SLIKA 4F), u poređenju sa kontrolom klasifikovanom po starosti (SLIKA 4E). (SLIKE 4G i 4H) Snimci većeg uvećanja (SLIKE 4E i 4F) prikazuju dezorganizovane kraće vijugave prstolike produžetke podocita (strelica) kod 3-nedelje starog Robo2 homozigotnog nultog miša (SLIKA 4H), u poređenju sa dobroorganizovanim prstolikim produžecima podocita sličnim rajsferšlusu kod kontrola klasifikovanih prema starosti (SLIKA 4G). Linearna skala: 2 µm. (SLIKE 4I i 4J) Reprezentativni snimci transmisionom elektronskom mikroskopijom (uvećanje od 5000x) ocrtavaju fokalno segmentno brisanje prstolikih produžetaka podocita (strelica na SLICI 4J) kod podocit-specifičnog Robo2 ʺknockoutʺ miša, koji je star jedan mesec i u slučaju kontrole sa normalnim fenotipom (SLIKA 4I). Skraćenice: gc: glomerularna kapilara; us: urinarni prostor. (SLIKE 4K i 4L) Snimci transmisionom elektronskom mikroskopijom sa većim uvećanjem (40000x) prikazuju šire prstolike produžetke podocita (strelica na SLICI 4L) kod dva meseca starog Robo2 podocit-specifičnog mutant miša u poređenju sa kontrolom (SLIKA 4K). Skraćenice: fp, prstoliki produžeci podocita; GBM, glomerularna bazalna membrana. (SLIKA 4M) Kvantitativno određivanje širine prstolikih produžetaka podocita kod mesec dana starih podocit-specifičnih Robo2<del5/flox;TgNphs2-cre+ ʺknockoutʺ miševa (Robo2>KO) i kod okota divljeg tipa kao kontrola (WT). Podaci su predstavljeni u vidu srednjih vrednosti ± SEM, n=333, *p < 0.01. (SLIKA 4N) ELISA test urinske mrlje pokazuje povišeni odnos albumin/kreatinin kod odraslih Robo2<del5/flox>; Nphs2-Cre+ (KO) miševa u poređenju sa kontrolom divljeg tipa (WT). Podaci su predstavljeni kao srednje vrednosti ± SEM, n=20, *p < 0.01. (SLIKA 4O) Western blot analiza pokazuje prisustvo albumina u urinu; 1 µl urina je postavljen u svaku čašicu, 0.2 µg albumina je korišćeno kao pozitivna kontrola. WT, tri okota divljeg tipa; Robo2 KO, tri pojedinačna Robo2del5/flox;Nphs2-Cre+ miša. (SLIKE 4P i 4Q) Reprezentativni snimci skenirajućim elektronskim mikroskopijom pokazuju narušene isprepletene prstolike produžetke podocita, koji liče na dezorganizovane celularne protruzije (strelice) u bubregu Nphs1-/- jednostrukog homozigotnog novorođenog miša. Linearna skala: 1 µm. (SLIKE 4R i 4S) Glomeruli Nphs1-/-Robo2-/- dvostrukih homozigotnih novorođenih miševa pokazuju ponovo uspostavljene isprepletene prstolike produžetke (strelice), koje ukazuju na ublažavanje nefrin-nultog fenotipa, nakon izbacivanja Robo2. (SLIKE 4T i 4U), Glomeruli Robo2-/- jednostrukih homozigotnih novorođenih miševa pokazuju nepravilne i proširene prstolike produžetke, ali uz obimno formiranje isprepletenog modela (strelice). (SLIKE 4V i 4W), Glomeruli bubrega novorođenih miševa divljeg tipa sa normalnim pravilnim modelom isprepletenih produžetaka (strelice). Vidi, takođe, SLIKE 8A-8Z i Tabele 1-4.
SLIKE 5A-5M pokazuju da se Robo2 ekspresuje u glomerulima u razvoju i zrelim glomerulima. (SLIKE 5A i 5B) Analiza in situ hibridizacije pokazuje da se Robo2 transkripti ekspresuju u glomerulima u razvoju (strelice) na E16.5. Uvećanje: 60X (SLIKA 5A) i 200X (SLIKA 5B). (SLIKE 5C-5F) Imunohistohemijska (IHC) ispitivanja pokazuju da se Robo2 ekspresuje tokom razvoja glomerula od E14.5 do E17.5. Uvećanje: 600X. (SLIKA 5G) IHC pokazuje da se Robo2 specifično ekspresuje u glomerulima odraslog miša starosti 5 nedelja (SLIKA 5G). DAPI markira jedra ćelija bubrega. Uvećanje: 400X. (SLIKA 5H) IHC kolokalizacijska bojenja bubrega starog 5 nedelja pokazuju da se Robo2 ko-ekspresuje u glomerulu sa podocitnim markererom Wt1. Uvećanje: 600X. (SLIKE 5I-5K) Robo2 i WT1 se ko-ekspresuju u glomerulu miša sa E16.5. Uvećanje: 600X. (SLIKE 5L i 5M) IHC kolokalizacijska bojenja bubrega starog 5 nedelja pokazuju da se Robo2 ko-ekspresuje u glomerulu sa mezangijalnim ćelijskim markerom Pdgfrb (SLIKA 5L) i markerom endotelnih ćelija Pecam1 (SLIKA 5M). Uvećanje: 600X.
SLIKA 6A-6F’ pokazuju da Robo2 ulazi u interakciju sa Nck i obrazuje kompleks sa nefrinom, koji je uvećan putem Slit2 stimulacije. (SLIKA 6A) Co-IP Robo2 i nefrina sa endogenim Nck. Robo2, nefrin i Fyn se ekspresuju u HEK ćelijama, a stimulišu se putem Slit2. Endogeni Nck se imuno-precipituje posredstvom anti-Nck antitela. Mišji IgG je korišćen kao kontrola. Obrazovanje kompleksa sa nefrinom se povećava uz pomoć Slit2 i Fyn ekspresije. (SLIKE 6B i 6C) Slit2 se ekspresuje u glomerulima novorođenog miša uz pomoć imunoperoksidaznog bojenja (SLIKA 6B) i ko-ekspresuje se u glomerulu sa markerom podocita sinaptopodinom (SLIKA 6C). Uvećanje: 600X. (SLIKE 6D i 6D’) CD16/7-NCD se ko-ekspresuje sa Robo2 u HEK ćelijama u prisustvu Slit2, obrađuje se sa anti-CD16 antitelom i anti-IgG antitelom, konjugovanim sa rodaminom, nakon čega se fiksira i boji sa anti-Robo2 antitelom. CD16/7-NCD grozdovi se ko-lokalizuju sa Robo2 (SLIKA 6D), ali se ko-lokalizacija ne zapaža u kontrolnim CD16/7-HA grozdovima (SLIKA 6D’). Linearna skala: 5 µm. NCD: citoplazmatski domen nefrina. (SLIKE 6E i 6E’) Delecija vezujućeg domena Nck (NBD) u Robo2 ometa njegovu ko-lokalizaciju sa CD16/7-NCD u prisustvu Slit2. CD16/7-NCD grozdovi se ko-lokalizuju sa Robo2 (SLIKA 6E), ali se ko-lokalizacija ne zapaža u Robo2-ΔNBD grozdovima (SLIKA 6E’). Linearna skala: 5 µm. (SLIKE 6F i 6F’) Slit2 stimulacijom se pojačava ko-lokalizacija CD16/7-NCD i Robo2 u HEK ćelijama. Grozdovi CD16/7-NCD ko-lokalizuju se sa Robo2, u prisustvu Slit2 (SLIKA 6F), ali ne i sa kontrolnim kondicioniranim medijumom (SLIKA 6F’). Linearna skala: 5 µm.
SLIKE 7A-7C prikazuju kako delecija vezujućeg domena za Nck u Robo2 kompromituje inhibitorno dejstvo Slit2-Robo2 na nefrinom-indukovanu polimerizaciju aktina. (SLIKA 7A) CD16/7-NCD i Robo2 se ko-ekspresuju u HEK ćelijama, udruženim u grozdove sa anti-CD16 antitelom i anti-IgG antitelom, koje je konjugovano sa rodaminom, u prisustvu Slit2 kondicioniranog medjiuma (Slit2) ili kontrolnog kondicioniranog medijuma (CTL). Ćelije se, nakon toga, fiksiraju i boje sa faloidinom, konjugovanim sa FITC-om, da bi se otkrila vlakna F-aktina. Grozdovi CD16/7-NCD i vlakana F-aktina ispituju se korišćenjem konfokalne mikroskopije. Linearna skala, 5 µm. NCD, citoplazmatski domen nefrina. (SLIKA 7B) CD16/7-NCD i Robo2-ΔNBD se ko-ekspresuju u HEK ćelijama. Linearna skala, 5 µm. NBD, vezujući domen Nck. (SLIKA 7C) Kvantitativno se utvrđuje procenat ćelija sa repovima F-aktina u odnosu na ukupan broj ćelija sa CD16/7-NCD grozdovima u svakoj grupi. Podaci su prikazani u vidu srednje vrednosti ± SEM, *p = 1.436 x 10<-5>, **p = 6.32 x 10<-5>, n=5, ANOVA.
SLIKE 8A-8Z prikazuju glomerularni fenotip kod Robo2 nultih homozigotnih miševa, podocit-specifičnih Robo2 ʺknockoutʺ miševa, dvostrukih Robo2 i Nphs1 ʺknockoutʺ miševa i predloženi model Robo2-nefrin signalizacije. (SLIKE 8A-8F) Analiza transmisionom elektronskom mikroskopijom ultrastrukture glomerula bubrega novorođenih (NB) Robo2<del5/del5>mutant miševa. (SLIKE 8A, 8C, 8E) Ultrastruktura glomerula novorođenog heterozigotnog Robo2 kontrolnog miša pri malim (SLIKA 8A, 2200X), srednjim (SLIKA 8C, 15500X) i velikim (FIG. 8E, 52000X) uvećanjima. (SLIKE 8B, 8D, 8F) Ultrastruktura glomerula novorođenog homozigotnog Robo2 (-/-) (t.j., Robo2<del/del5>) mutant miša pri malim (SLIKA 8B), srednjim (SLIKA 8D) i velikim (SLIKA 8F) uvećanjima. Strelice pokazuju fokalno brisanja prstolikih produžetaka. Skraćenice: gc: glomerularna kapilara; us: urinarni prostor; GBM: glomerularna bazalna membrana. (SLIKE 8G-8N) Modeli abnormalnih prstolikih produžetaka podocita kod podocit-specifičnih Robo2 ʺknockoutʺ miševa. (SLIKE 8G-8J) Reprezentativni snimci skenirajućom elektronskom mikroskopijom glomerula mesec dana starih podocit-specifičnih Robo2<del5/flox>;Nphs2-Cre+ ʺknockoutʺ miševa i kontrolnih Robo2<flox/+>miševa, razvrstanih po starosti. Blage nepravilnosti isprepletenih prstolikih produžetaka podocita nađene su kod mesec dana starog podocit-specifičnog Robo2 ʺknockoutʺ miša (SLIKE 8K i 8N). Kod sedam meseci starih, podocit-specifičnih Robo2 ʺknockoutʺ miševa razvili su se upadljivo nepravilni prstoliki produžeci podocita (SLIKE 8L i 8N). Linearna skala: 10 µm (SLIKE 8G, 8H, 8K, 8L pri uvećanju od 2000x) i 2 µm (SLIKE 8I, 8J, 8M, 8N pri uvećanju od 13000x). (SLIKE 8O-8T) Morfologija glomerula kod podocit-specifičnih Robo2 ʺknockoutʺ miševa. (SLIKE 8O-8R) Perjodna kiselina-Schiff (PAS) bojenje je pokazalo ekspanziju mezangijalnog matriksa u glomerulima 2-mesečnih i 6-mesečnih podocitspecifičnih Robo2 ʺknockoutʺ miševa (SLIKE 8P, 8R) u poređenju sa kontrolama, klasifikovanim po starosti (SLIKE 8O, 8Q). (SLIKA 8S) Kvantitativna analiza glomerula pokazuje ekspanziju mezangijalnog matriksa kod 12-meseci starih podocit-specifičnih Robo2 ʺknockoutʺ miševa (MU) u poređenju sa kontrolama divljeg tipa (WT), klasifikovanim prema starosti. Podaci su predstavljeni u vidu srednje vrednosti ± SEM, n=5, *p < 0.01. (T) Podocit-specifična Robo2 izbacivanja nemaju uticaj na broj podocita. Identifikovanje podocitnih ćelija se vrši korišćenjem WT-1 bojenja. Broj podocita po poprečnom preseku glomerula izbrojan je kod četiri, godinu dana starih, Robo2<del5/flox>;TgN<phs2-Cre+>podocitspecifičnih ʺknockoutʺ miševa (MU) u poređenju sa četiri miša divljeg tipa (WT), klasifikovana prema starosti. Podaci su predstavljeni u vidu srednje vrednosti ± SEM, p = 0.645, t-test; mutant: n=165 glomerula; kontrola: n=166 glomerula. (SLIKE 8U-8Y) Fenotip glomerula kod dvostrukih Robo2 i Nphs1 ʺknockoutʺ miševa. (SLIKA 8U) H&E bojenjem se prikazuju glomeruli sa karakterističnim dilatacijama Baumanovog prostora (zvezdice) kod Nphs1<-/->jednostrukih homozigotnih novorođenih miševa, 400x. (SLIKA 8V) Glomeruli Robo2<-/->jednostrukih homozigotnih novorođenih miševa pokazuju odsustvo dilatacija Baumanovog prostora; 400x. (SLIKA 8W) Glomeruli normalnog izgleda bez značajnih dilatacija Baumanovog prostora (strelice) prikazani su kod Robo2<-/->;Nphs1<-/->dvostrukog homozigotnog novorođenog miša, čime se ukazuje na ublažavanje Nphs1<-/->glomerularnog fenotipa; 400x. (SLIKA 8X) H&E bojenje normalnog bubrega i glomerula kontrolnog novorođenog miša divljeg tipa, klasifikovanog po starosti.; 400x. (SLIKA 8Y) Kvantitativno određivanje glomerula sa dilatiranim Baumanovim prostorom kod novorođenih miševa pokazuje značajnu redukciju glomerula sa karakterističnim dilatacionim fenotipom Baumanovog prostora kod Robo2<-/->;Nphs1<-/->dvostrukih homozigota u poređenju sa Nphs1<-/->jednostrukim homozigotima (Robo2<+/->;Nphs1<-/->). Podaci su predstavljeni u vidu srednje vrednosti ± SEM, *p < 0.01. (SLIKA 8Z) Model inhibitornih efekata Slit2-Robo2 signalizacije na nefrin za delovanje na strukturu prstolikih produžetaka podocita: pod fiziološkim uslovima (npr., tokom razvoja podocitnih prstolikih produžetaka), intracelularni fosforilisani tirozinski domeni nefrina (YDxV-p) povlače Nck, posredstvom njegove interakcije sa SH2 domenom. Nck zauzvrat regrutuje regulatore citoskeleta preko njegovih SH3 domena, da bi se podstakla polimerizacija aktina. Slit2 se vezuje sa Robo2 da bi se pojačala interakcija intracelularnog domena Robo2 sa SH3 domenima Nck, kojom bi se sprečavalo vezivanje Nck za regulatore citoskeleta i dovelo do inhibicije polimerizacije aktina, indukovane nefrinom. Balansirana polimerizacija aktina se održava tokom razvoja podocita, zbog normalne strukture prstolikih produžetaka. U odsustvu Slit2-Robo2 signalizacije (npr., kada je izbačen Robo2), nema inhibitornih efekata Robo2 na polimerizaciju, indukovanu nefrinom. SH3 domeni Nck su u stanju da ulaze u interakciju sa nishodnim regulatorima citoskeleta, da bi se povećala polimerizacija aktina, čime se može objasniti izmenjena struktura prstolikih produžetaka podocita kod Robo2 mutant miševa. Skraćenice: Ig: imunoglobulinski domen; FN3: fibronektinski domen tipa 3; SH2: domen 2 Src homologa; SH3: domen 3 Src homologa; CC0, CC1, CC2, CC3: Citoplazmatski konzervisani region 0, 1, 2, 3.
DETALJAN OPIS
Ranije se pokazalo da je Robo2 receptor ćelijske površine za odbijajuće navođenje prema Slit-u i da je uključen u upravljanje aksonom i za migraciju neurona u nervnom sistemu. Nefrin je podocitni slit-dijafragmalni protein koji funkciju ispoljava u glomerularnoj filtracionoj barijeri bubrega. Ovde smo pokazali da se Robo2 ekspresuje na bazalnoj površini podocita, kao što su podociti miša, a ko-lokalizuje se sa nefrinom. Biohemijske studije pokazuju da Robo2 obrazuje kompleks sa nefrinom u bubregu preko adapterskog Nck proteina. Suprotno ulozi nefrina koji podstiče polimerizaciju aktina, ovde pokazujemo da Slit2-Robo2 signalizacija inhibira polimerizaciju aktina, indukovanu nefrinom. Na primer, količina F-aktina, udruženog sa nefrinom, povećana je kod Robo2 ʺknockoutʺ miševa kod kojih se razvija izmenjena struktura prstolikih produžetaka podocita i mikroalbuminurija. Studije genetskih interakcija dalje otkrivaju da se u odsustvu Robo2 ublažava abnormalni fenotip podocita kod nefrin nultih miševa. Ovde obezbeđeni rezultati pokazuju da Robo2 signalizacija deluje kao negativni regulator na nefrin, da bi se uticalo na arhitekturu prstolikih produžetaka podocita.
Pored toga, pokazalo se da pacijent koji ima vezikoureteralni refluks (VUR) poseduje hromosomsku translokaciju koja oštećuje gen ROBO2 i proizvodi dominantne negativne ROBO2 fuzione proteine koji prekidaju putanju SLIT2-ROBO2 signalizacije. Uobičajeno, VUR je bolest karakterisana retrogradnim tokom urina iz mokraćne bešike u uretere i bubreg, a pacijenti sa VUR-om mogu ispoljavati refluksnu nefropatiju, stanje koje se manifestuje ozbiljnom proteinurijom. Pokazalo se da dominantni negativni ROBO2 fuzioni proteini, koji se proizvode kod pacijenta sa VUR-om, blokiraju putanju SLIT2-ROB02 signalizacije i zaštićuju pacijenta od refluksne nefropatije i proteinurije, čime se potvrđuju i dalje podupiru rezultati pronalazača na životinjskim modelima koji se tiču terapeutske vrednosti ciljanog delovanja na SLIT2-ROB02 signalizacijski put za lečenje hronične bolesti bubrega.
U slučaju normalnog bubrega, troslojni zid glomerularne kapilare, sastavljen od fenestriranih endotelnih ćelija, bazalne membrane i podocita, ograničava propusnost za proteine plazme. Podociti su specijalizovane epitelne ćelije koje pružaju primarne i sekundarne produžetke da bi se pokrila spoljna površina bazalne membrane glomerula. Isprepleteni sekundarni produžeci, bogati aktinom, ili prstoliki produžeci ili izdanci poput nožica, iz susednih podocita stvaraju filtracione proreze, premoštene semi-poroznom slit-dijafragmom, koja obrazuje završnu barijeru za prolazak proteina. Dok su genetske mutacije slit-dijafragmalnih proteina podocita, kao što su nefrin i ostali proteini, povezane sa hereditarnim oblicima bolesti bubrega sa proteinurijom (Tryggvason et al., 2006), postalo je jasno da su proteini koji se sastavljaju i udružuju sa slit-dijafragmom mnogo više od proste strukturne barijere. Ovi proteini obrazuju uravnoteženu signalizacijsku mrežu koja može uticati na strukturu i funkciju prstolikih produžetaka podocita, preko interakcije sa citoskeletom F-aktina (Faul et al., 2007; Jones et al., 2006; Verma et al., 2006).
Porodica zaobilaznih ili ʺroundaboutʺ (Robo) proteina, Robo1, Robo2, Robo3 i Robo4 su receptori ćelijske površine za sekretovani Slit ligand (Dickson i Gilestro, 2006). Slit1, Slit2 i Slit3 se izvorno nalaze kao redovi odbijajućeg navođenja za pronalaženje putanje aksona i migraciju neurona tokom razvoja nervnog sistema (Guan i Rao, 2003). Transmembranski protein Robo sadrži pet Ig motiva i tri ponovka fibronektina tipa III (FNIII) u svom ekstracelularnom domenu (Dickson i Gilestro, 2006). Dok oba imunoglobulinska (Ig) motiva 1 i 2 ulaze u interakciju sa Slit-om, prvi Ig1 motiv Robo proteina je primarni vezujući položaj za Slit (Dickson i Gilestro, 2006). Intracelularni domen Robo proteina ima četiri citoplazmatske konzervisane (CC) sekvence, označene sa: CC0, CC1, CC2 i CC3 (Bashaw et al., 2000; Kidd et al., 1998; Morlot et al., 2007; Zallen et al., 1998). CC0 i CC1 sadrže tirozin, dok su CC2 i CC3 rasponi bogati prolinom. Odbijajuća aktivnost Slit-Robo signalizacije inhibira polimerizaciju aktina (Guan i Rao, 2003) ili indukuje depolimerizaciju F-aktina (Piper et al., 2006).
Slit-Robo signalizacija, takođe, igra ključne uloge tokom rane bubrežne indukcije i izrastanja ureteralnih izdanaka. Mutanti miševa koji nemaju Slit2 ili Robo2 razvijaju prekobrojne ureteralne izdanke, što dovodi do širokog spektra fenotipova urinarnog trakta, uključujući dupleks bubrege, abnormalna ureterovezikalna povezivanja i hidronefrozu (Grieshammer et al., 2004; Lu et al. 2007). Razaranje ROBO2 kod ljudi izaziva kongenitalne anomalije bubrega i urinarnog trakta (CAKUT), a tačkaste mutacije ROBO2 su utvrđene kod pacijenata sa vezikoureteralnim refluksom (VUR) (Lu et al., 2007). Naša skorašnja studija pokazuje da je Robo2 od ključnog značaja za obrazovanje normalnog ureteralnog otvora i za održavanje efektivnog anti-refluksnog mehanizma (Wang et al., 2011).
Ovde je demonstrirano da je Robo2 novi protein podocita koji se ekspresuje na bazalnoj površini glomerularnih podocita u bubregu, a ko-lokalizuje se sa nefrinom i podocinom. Robo2 direktno ulazi u interakciju sa SH3 domenima adapterskog proteina Nck i obrazuje kompleks sa nefrinom. Dok Robo2 ʺknockoutʺ miševi razvijaju izmenjene prstolike produžetke podocita, odsustvo Robo2 ublažava strukturne abnormalnosti produžetaka, koje se viđaju kod nefrin nultih miševa. Navedeni rezultati, koji su ovde opisani, pokazuju da Robo2 signalizacija deluje kao negativni regulator na signalizaciju nefrina za uticaj na arhitekturu prstolikih produžetaka podocita. Pored toga, kako je ovde demonstrirano, otkriveno je da dominantni negativni ROBO2 fuzioni proteini, koje proizvodi pacijent, blokiraju SLIT2-ROB02 signalizacijski put i pacijenta štite od refluksne nefropatije i proteinurije, čime se potvrđuju i dalje podupiru rezultati, koji su ovde opisani na životinjskim modelima, a tiču se terapeutske vrednosti ciljnog delovanja na SLIT2-ROBO2 signalizacijski put, za lečenje hronične bolesti bubrega.
Sledstveno tome, ovde su, u nekim aspektima, obezbeđeni postupci za lečenje hronične bolesti bubrega kod ispitanika kome je to potrebno, pri čemu takav postupak obuhvata primenu ispitaniku koji boluje ili je pod rizikom od hronične bolesti bubrega, terapeutski efektivne količine kompozicije koja sadrži inhibitor SLIT2-ROBO2 signalizacijskog puta.
Ovde su, isto tako, u nekim aspektima, obezbeđeni postupci za smanjenje proteinurije kod ispitanika kome je to potrebno, pri čemu isti obuhvataju primenu ispitaniku koji ima ili je pod rizikom od proteinurije, terapeutski efektivne količine kompozicije koja sadrži inhibitor SLIT2-ROBO2 signalizacijskog puta.
U ostalim aspektima, ovde su obezbeđeni postupci za prevenciju bolesti bubrega ili podsticanje profilakse bolesti bubrega kod ispitanika kome je to potrebno, pri č emu postupci uključuju primenu ispitaniku terapeutski efektivne količine kompozicije koja sadrži inhibitor SLIT2-ROBO2 signalizacijskog puta, tako da se sprečava ili podstiče profilaksa bolesti bubrega kod ispitanika.
Ovde su, takođe, u nekim aspektima, obezbeđeni postupci za ublažavanje efekata bolesti bubrega, redukovanje ozbiljnosti bolesti bubrega, smanjivanje verovatnoće za razvijanje bolesti bubrega i/ili usporavanje progresije bolesti bubrega kod ispitanika kome je to potrebno.
Kako je ovde korišćen, naziv "ROB02" se odnosi na polipeptid koji poseduje aminokiselinsku sekvencu:
MARRHERVTRRMWTWAPGLLMMTVVFWGHQGNGQGQGSRLRQEDFPPRIVEHPSDVIVSK GEPTTLNCKAEGRPTPTIEWYKDGERVETDKDDPRSHRMLLPSGSLFFLRIVHGRRSKPDEGS YVCVARNYLGEAVSRNASLEVALLRDDFRQNPTDVVVAAGEPAILECQPPRGHPEPTIYWKK DKVRIDDKEERISIRGGKLMISNTRKSDAGMYTCVGTNMVGERDSDPAELTVFERPTFLRRPI NQVVLEEEAVEFRCQVQGDPQPTVRWKKDDADLPRGRYDIKDDYTLRIKKTMSTDEGTYM CIAENRVGKMEASATLTVRAPPQFVVRPRDQIVAQGRTVTFPCETKGNPQPAVFWQKEGSQ NLLFPNQPQQPNSRCSVSPTGDLTITNIQRSDAGYYICQALTVAGSILAKAQLEVTDVLTDRPP PIILQGPANQTLAVDGTALLKCKATGDPLPVISWLKEGFTFPGRDPRATIQEQGTLQIKNLRIS DTGTYTCVATSSSGETSWSAVLDVTESGATISKNYDLSDLPGPPSKPQVTDVTKNSVTLSWQ PGTPGTLPASAYIIEAFSQSVSNSWQTVANHVKTTLYTVRGLRPNTIYLFMVRAINPQGLSDPS PMSDPVRTQDISPPAQGVDHRQVQKELGDVLVRLHNPVVLTPTTVQVTWTVDRQPQFIQGY RVMYRQTSGLQATSSWQNLDAKVPTERSAVLVNLKKGVTYEIKVRPYFNEFQGMDSESKTV RTTEEAPSAPPQSVTVLTVGSYNSTSISVSWDPPPPDHQNGIIQEYKIWCLGNETRFHINKTVD AAIRSVIIGGLFPGIQYRVEVAASTSAGVGVKSEPQPIIIGRRNEVVITENNNSITEQITDVVKQP AFIAGIGGACWVILMGFSIWLYWRRKKRKGLSNYAVTFQRGDGGLMSNGSRPGLLNAGDPS YPWLADSWPATSLPVNNSNSGPNEIGNFGRGDVLPPVPGQGDKTATMLSDGAIYSSIDFTTKT SYNSSSQITQATPYATTQILHSNSIHELAVDLPDPQWKSSIQQKTDLMGFGYSLPDQNKGNNG GKGGKKKKNKNSSKPQKNNGSTWANVPLPPPPVQPLPGTELEHYAVEQQENGYDSDSWCPP LPVQTYLHQGLEDELEEDDDRVPTPPVRGVASSPAISFGQQSTATLTPSPREEMQPMLQAHLD ELTRAYQFDIAKQTWHIQSNNQPPQPPVPPLGYVSGALISDLETDVADDDADDEEEALEIPRP LRALDQTPGSSMDNLDSSVTGKAFTSSQRPRPTSPFSTDSNTSAALSQSQRPRPTKKHKGGRM DQQPALPHRREGMTDEEALVPYSKPSFPSPGGHSSSGTASSKGSTGPRKTEVLRAGHQRNAS DLLDIGYMGSNSQGQFTGEL (izoforma homologa 2 ʺroundaboutʺ proteina Homo sapiensa ROBO2a; SEQ ID NO: 1), kao što je opisana, npr., od strane NP_001122401.1 i kodirana od strane NM_001128929.2 (SEQ ID NO: 2); ili MSLLMFTQLLLCGFLYVRVDGSRLRQEDFPPRIVEHPSDVIVSKGEPTTLNCKAEGRPTPTIE WYKDGERVETDKDDPRSHRMLLPSGSLFFLRIVHGRRSKPDEGSYVCVARNYLGEAVSRNA SLEVALLRDDFRQNPTDVVVAAGEPAILECQPPRGHPEPTIYWKKDKVRIDDKEERISIRGGK LMISNTRKSDAGMYTCVGTNMVGERDSDPAELTVFERPTFLRRPINQVVLEEEAVEFRCQVQ GDPQPTVRWKKDDADLPRGRYDIKDDYTLRIKKTMSTDEGTYMCIAENRVGKMEASATLTV RAPPQFVVRPRDQIVAQGRTVTFPCETKGNPQPAVFWQKEGSQNLLFPNQPQQPNSRCSVSP TGDLTITNIQRSDAGYYICQALTVAGSILAKAQLEVTDVLTDRPPPIILQGPANQTLAVDGTAL LKCKATGDPLPVISWLKEGFTFPGRDPRATIQEQGTLQIKNLRISDTGTYTCVATSSSGETSWS AVLDVTESGATISKNYDLSDLPGPPSKPQVTDVTKNSVTLSWQPGTPGTLPASAYIIEAFSQSV SNSWQTVANHVKTTLYTVRGLRPNTIYLFMVRAINPQGLSDPSPMSDPVRTQDISPPAQGVD HRQVQKELGDVLVRLHNPVVLTPTTVQVTWTVDRQPQFIQGYRVMYRQTSGLQATSSWQN LDAKVPTERSAVLVNLKKGVTYEIKVRPYFNEFQGMDSESKTVRTTEEAPSAPPQSVTVLTV GSYNSTSISVSWDPPPPDHQNGIIQEYKIWCLGNETRFHINKTVDAAIRSVIIGGLFPGIQYRVE VAASTSAGVGVKSEPQPIIIGRRNEVVITENNNSITEQITDVVKQPAFIAGIGGACWVILMGFSI WLYWRRKKRKGLSNYAVTFQRGDGGLMSNGSRPGLLNAGDPSYPWLADSWPATSLPVNNS NSGPNEIGNFGRGDVLPPVPGQGDKTATMLSDGAIYSSIDFTTKTSYNSSSQITQATPYATTQI LHSNSIHELAVDLPDPQWKSSIQQKTDLMGFGYSLPDQNKGNNGGKGGKKKKNKNSSKPQK NNGSTWANVPLPPPPVQPLPGTELEHYAVEQQENGYDSDSWCPPLPVQTYLHQGLEDELEED DDRVPTPPVRGVASSPAISFGQQSTATLTPSPREEMQPMLQAHLDELTRAYQFDIAKQTWHIQ SNNQPPQPPVPPLGYVSGALISDLETDVADDDADDEEEALEIPRPLRALDQTPGSSMDNLDSS VTGKAFTSSQRPRPTSPFSTDSNTSAALSQSQRPRPTKKHKGGRMDQQPALPHRREGMTDEE ALVPYSKPSFPSPGGHSSSGTASSKGSTGPRKTEVLRAGHQRNASDLLDIGYMGSNSQGQFT G EL (izoforma homologa 2 ʺroundaboutʺ proteina Homo sapiensa ROBO2b; SEQ ID NO: 3), kao š to je opisano od strane, npr., NP_002933.1 i kodirano od strane NM_002942.4 (SEQ ID NO: 4), zajedno sa bilo kojim u prirodi postojećim alelskim, ʺspliceʺ varijantama, i njihovim prerađenim oblicima. Uobičajeno, ROBO2 se odnosi na humani ROBO2. Gen ROBO2 je konzervisan kod čimpanze, Rhesus majmuna, psa, krave, miša, pacova, pileta, zebrice, voćne muve, komarca i C. elegans. Specifični ostaci ROBO2 mogu se označiti, na primer, kao "ROBO2(30)".
Specifični domeni ROB02 proteina mogu se, isto tako, naznačiti pomoću takve nomenklature. N-terminalni ili "ekstracelularni domen ROBO2", koji sadrži pet imunoglobulinskih motiva i tri ponovka fibronektina tipa III (FNIII), može se označiti kao ROBO2(46-848) SEQ ID NO: 1 ili ROBO2(30-832) SEQ ID NO: 3, na primer. Imunoglobulinski (Ig) motivi 1 i 2, koji ulaze u interakciju sa Slit2, ili "Ig SLIT vezujući domen" mogu se označiti kao ROB02(46-145), odnosno ROB02(151-237) SEQ ID NO: 1, i ROB02(30-129), odnosno ROB02(135-221) SEQ ID NO: 3. Na sličan način, "intracelularni domen", koji sadrži "intracelularni vezujući domen Nck", koji uključuje, ovde opisana, četiri intracelularna motiva, bogata prolinom, ovde se može označiti kao ROBO2(881-1378) SEQ ID NO: 3.
Kao što su ovde korišćeni, izrazi "inhibitor ROBO2", "antagonist ROBO2", "inhibitorni agens ROBO2" i "sredstvo koje je antagonist ROBO2" odnose se na molekul ili sredstvo koje u značajnoj meri blokira, inhibira, redukuje ili interferira sa biološkom aktivnošću ROBO2 (ROBO2 sisara, kao š to je č ovek) in vitro, in situ i/ili in vivo, uključujući aktivnost nishodnih putanja, posredovanih ROB02 signalizacijom, kao š to je, na primer, interakcija ROBO2 sa adapterskim proteinom Nck i/ili formiranje kompleksa sa nefrinom, SLIT2-ROBO-2 posredovana inhibicija nefrinom-posredovane polimerizacije aktina, i/ili izazivanje celularnog odgovora na ROB02. Izraz "sredstvo", kako je ovde korišćen u vezi sa inhibitorom ROBO2 označava bilo koje jedinjenje ili supstancu, kao što su, ali bez ograničavanja na njih, mali molekul, nukleinska kiselina, polipeptid, peptid, lek, jon, itd.. "Sredstvo" može biti bilo koji hemijski entitet ili deo, koji uključuje, bez ograničavanja, sintetske i u prirodi-postojeće proteinaste i ne-proteinaste entitete. U nekim ostvarenjima ovde opisanih aspekata, sredstvo je nukleinska kiselina, analog nukleinske kiseline, protein, antitelo, peptid, aptamer, oligomer nukleinskih kiselina, aminokiselina ili ugljeni hidrat, a uključuje, bez ograničavanja, proteine, oligonukleotide, ribozime, DNAzime, glikoproteine, antisens RNA, siRNA, lipoproteine, aptamere i njihove modifikacije i kombinacije, itd.. Za jedinjenja namenjena korišćenju u terapeutskim kompozicijama i postupcima, koji su ovde opisani, može biti poznato da poseduju željenu aktivnost i/ili osobinu, ili se mogu odabrati iz biblioteke raznovrsnih jedinjenja, uz korišćenje skrining postupaka, poznatih licu uobičajene stručnosti u ovoj oblasti.
Primerni inhibitori ROBO2, koji su razmotreni za korišćenje u raznim, ovde opisanim aspektima i ostvarenjima, uključuju, ali bez ograničavanja, anti-ROBO2 antitela ili njihove antigen-vezujuće fragmente, koji se specifično vezuju sa ROBO2; anti-sens molekule, usmerene prema nukleinskoj kiselini koja kodira ROB02 (npr., ROB02a ili ROBO2b ili oba); kratke interferirajuće molekule RNA ("siRNA"), usmerene prema nukleinskoj kiselini koja kodira ROBO2 (npr., ROBO2a ili ROB02b ili oba); RNA ili DNA aptamere koji se vezuju sa ROBO2, i inhibiraju/redukuju/blokiraju signalizaciju, posredovanu sa ROBO2; strukturne analoge ROBO2 i rastvorljive ROB02 proteine, inhibitorne polipeptide, npr., dominantne negativne polipeptide ili njihove fuzione polipeptide. U nekim ostvarenjima ovih aspekata i svih takvih, ovde opisanih, aspekata, inhibitor ROB02 (npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment) se vezuje (ulazi u fizičku interakciju) sa ROB02, ciljano nishodno deluje na ROB02 signalizaciju, i/ili inhibira (redukuje) sintezu, proizvodnju ili oslobađanje ROB02. U nekim ostvarenjima ovih aspekata i svih takvih, ovde opisanih, aspekata, inhibitor ROB02 se vezuje i sprečava njegovo vezivanje za SLIT proteinski ligand, kao što je SLIT2. U nekim ostvarenjima ovih aspekata i svih takvih, ovde opisanih, aspekata, inhibitor ROBO2 specifično smanjuje ili eliminiše ekspresiju (t.j., transkripciju ili translaciju) jedne ili više izoformi ROB02.
Kao što je ovde korišćen, inhibitor ili antagonist ROBO2 ima sposobnost da redukuje aktivnost i/ili ekspresiju ROBO2 u ćeliji (npr., podocitima), za najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95 %, najmanje 98%, najmanje 99%, ili više, u odnosu na aktivnost ili nivo ekspresije u odsustvu inhibitora ROBO2.
Sledstveno tome, u nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, inhibitor ROBO2 inhibira transdukciju signala, posredovanu sa ROBO2. U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, inhibitor ROBO2 ciljano deluje na interakciju ROBO2 sa adapterskim proteinom Nck i/ili formiranje kompleksa sa nefrinom, SLIT2-ROBO-2 posredovanu inhibiciju polimerizacije aktina, posredovanu nefrinom, i/ili poticanje ćelijskog odgovora na ROBO2.
U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, vezujući položaji inhibitora ROBO2, kao š to su antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, usmereni su prema interakcijskom položaju ROBO2 liganda, kao što je interakcijski položaj SLIT2 liganda. U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, vezujući položaji inhibitora ROBO2, kao š to je antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, usmereni su prema adapterskom interakcijskom položaju ROBO2, kao što je interakcijski položaj Nck ili intracelularni vezujući domen NCK, koji sadrži četiri intracelularna, prolinom bogata, motiva ROBO2. U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, vezujući položaji inhibitora ROB02 usmereni su prema položaju na ciljnom molekulu u blizini interakcijskog položaja liganda, da bi se obezbedila sterička prepreka za interakciju receptora (npr., ROBO2) sa njegovim ligandom (npr., SLIT2). Vezivanjem za interakcijski položaj ROB02 liganda, ovde opisani inhibitor ROBO2, može redukovati ili inhibirati aktivnost ili ekspresiju ROBO2, i posledice nishodne signalizacije ROBO2 (npr., interakcija ROBO2 sa adapterskim proteinom Nck i/ili formiranje kompleksa sa nefrinom, SLIT2-ROBO-2 posredovana inhibicija polimerizacije aktina, posredovane nefrinom i/ili pobuđivanje celularnog odgovora na ROBO2). Na primer, u nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, vezujući položaji inhibitora ROBO2 blokiraju ili ciljano deluju najmanje na vezujući položaj Ig1, a, poželjno i na položaje Ig1 i na položaje Ig2, na ROBO2, t.j., ROB02(46-145), odnosno ROB02(151-237) SEQ ID NO: 1, i ROB02(30-129), odnosno ROB02(135-221) SEQ ID NO: 3, primera radi. U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, vezujući položaji inhibitora ROBO2 blokiraju ili ciljano deluju na intracelularni domen ROBO2, koji sadrži intracelularni vezujući doomen Nck, t.j., ROB02 (881-1378) SEQ ID NO: 3. U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, vezujući položaji inhibitora ROB02 blokiraju ili ciljano deluju na intracelularni vezujući domen ROB02 za Nck, koji sadrži četiri intracelularna, prolinom bogata, motiva ROBO2. Ovo može biti izvedeno brojnim načinima, dobro poznatim u struci, kao što su antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti, inhibitori RNA, itd., i kao što je ovde opisano.
Sledstveno tome, u nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, inhibitor ROBO2 je antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se selektivno vezuje ili ulazi u fizičku interakciju sa ROBO2. U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, inhibitor ROBO2 je antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se vezuje sa ROBO2 i inhibira i/ili blokira i/ili sprečava interakciju sa Nck i/ili obrazovanje kompleksa sa nefrinom. U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment vezuje se sa Ig SLIT vezujućim domenom ROBO2. U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, antitelo ili njegov antigenvezujući fragment vezuje se sa Ig1SLIT vezujućim domenom ROBO2 ili sa oba, sa Ig1 SLIT vezujućim domenom i Ig2 SLIT vezujućim domenom ROBO2, t.j., ROB02(46-145), odnosno ROB02(151-237) SEQ ID NO: 1, i ROB02(30-129), odnosno ROB02(135-221) SEQ ID NO: 3. U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, antitelo ili njegov antigenvezujući fragment vezuje se ili blokira intracelularni domen ROBO2, t.j., ROB02(881-1378) SEQ ID NO: 3. U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment vezuju se ili blokiraju intracelularni vezujući domen Nck, koji sadrži četiri intracelularna, prolinom bogata, motiva ROBO2.
Antitela koja su specifična za ROBO2 ili koja se selektivno vezuju sa ROBO2, i koja su pogodna za korišćenje u kompozicijama i za praktičnu primenu ovde opisanih postupaka, su, poželjno, monoklonska antitela, i mogu uključiti, ali bez ograničavanja na njih, humana, humanizovana ili himerična antitela, koja uključuju jedno-lančana antitela, Fab fragmente, F(ab’) fragmente, fragmente proizvedene od strane Fab ekspresione biblioteke, i/ili vezujuće fragmente bilo kojih od prethodno pomenutih antitela. Antitela se, takođe, odnose na imunoglobulinske molekule i imunološki aktivne delove imunoglobulinskih molekula, t.j., molekule koji sadrže antigen-vezujuće ili ciljno vezujuće položaje ili "antigen-vezujuće fragmente". Imunoglobulinski molekuli, koji su ovde opisani, mogu biti bilo kog tipa (npr., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA i IgY), klase (npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2) ili podklase imunoglobulinskih molekula, kao što se od strane stručnog lica u ovoj oblasti podrazumeva.
Sledstveno tome, u nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, inhibitor ROBO2, kao što je ovde opisan, jeste monoklonsko anti-ROBO2 antitelo ili antigen-vezujući fragment.
U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, inhibitor ROBO2, kao što je ovde opisan, jeste fragment ROBO2 antitela ili antigen-vezujući fragment. Nazivi "fragment antitela", "antigen-vezujući fragment" i "derivat antitela", kako su ovde korišćeni, odnose se na proteinski fragment, koji sadrži samo deo intaktnog antitela, koji uopšteno uključuje antigen-vezujući položaj intaktnog antitela i, na taj način, zadržava sposobnost da se vezuje sa antigenom. Primeri fragmenata antitela, koji su obuhvaćeni nazivima fragment antitela ili antigen-vezujući fragment, uključuju: (i) Fab fragment, kojiposeduje VL, CL, VHi CH1 domene; (ii) Fab’ fragment, koji je Fab fragment, koji poseduje jedan ili više cisteinskih ostataka na C-terminusu CH1 domena; (iii) Fd fragment koji poseduje VHi CH1 domene; (iv) Fd’ fragment, koji poseduje VHi CH1 domene i jedan ili više cisteinskih ostataka na C-terminusu CH1 domena; (v) Fv fragment koji poseduje VLi VHdomene jednog kraka antitela; (vi) dAb fragment (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)), koji se sastoji od VHdomena ili VLdomena; (vii) izolovane CDR regione; (viii) F(ab’)2fragmente, dvovalentni fragment koji uključuje dva Fab’ fragmenta, povezana disulfidnim mostom u zglobnom regionu; (ix) jednolančane molekule antitela (npr., jednolančani Fv; scFv) (Bird et al., Science 242:423-426 (1988); i Huston et al., PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988)); (x) "diatela" sa dva antigen-vezujuća položaja, koja sadrže varijabilni domen teškog lanca (VH), koji je spojen sa varijabilnim domenom lakog lanca (VL) u istom polipeptidnom lancu (vidi, npr., EP 404,097; WO 93/11161; i Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); (xi) "linearna antitela", koja sadrže par tandem Fd segmenata (VH-CH1-VH-CH1) koji, zajedno sa komplementarnim polipeptidima lakih lanaca, obrazuju par antigen-vezujućih regiona (Zapata et al. Protein Eng.
8(10):1057-1062 (1995); i U.S. Pat. No.5,641,870); i modifikovane verzije bilo kog od prethodno navedenih primera (npr., koji su modifikovani kovalentnim vezivanjem polialkilen glikola (npr., polietilen glikol, polipropilen glikol, polibutilen glikol) ili drugog pogodnog polimera).
U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, inhibitor ili antagonist ROBO2 je derivat himeričnog antitela ROBO2 antagonist-antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.
Antitela, koja su inhibitori ili antagonisti ROBO2, i njihovi antigen-vezujući fragmenti, koji su ovde opisani, mogu, isto tako, u nekim ostvarenjima, biti derivati humanizovanog antitela.
U nekim ostvarenjima, antitela, koja su inhibitori ili antagonisti ROBO2 i njihovi antigen-vezujući fragmenti, koji su ovde opisani, uključuju derivate koji su modifikovani, t.j., koji su izmenjeni kovalentnim povezivanjem bilo kog tipa molekula za antitelo, pod uslovom da se kovalentnim vezivanjem ne sprečava vezivanje antitela za ciljani antigen, npr., ROBO2.
U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, korišćena su potpuno humana antitela, koja su, posebno poželjna za terapeutski tretman humanih pacijenata.
U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, inhibitor ROBO2 sadrži najmanje jedan antisens molekul, koji je u stanju da blokira ili smanjuje ekspresiju određenog funkcionalnog ROBO2, putem ciljanog delovanja na nukleinske kiseline, koje kodiraju ROBO2, npr., SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 4 ili obe, ili njihove odgovarajuće domene. U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, najmanje jedan antisens molekul ciljano deluje na nukleinske kiseline, koje kodiraju Ig SLIT vezujući domen ROBO2. U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, najmanje jedan antisens molekul ciljano deluje na nukleinske kiseline koje kodiraju Ig1 SLIT vezujući domen ROBO2 ili oba Ig1 i Ig2 SLIT vezujuća domena ROBO2. U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, najmanje jedan antisens molekul ciljano deluje na nukleinske kiseline koje kodiraju intracelularni domen ROBO2. U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, najmanje jedan antisens molekul ciljano deluje na nukleinske kiseline, koje kodiraju intracelularni vezujući domen Nck, koji sadrži četiri intracelularna, prolinom bogata, motiva ROBO2. Licima uobičajene stručnosti u ovoj oblasti poznati su postupci za izradu antisens oligonukleotidnih molekula koji će se specifično vezivati sa mRNA ROBO2, bez unakrsnog reagovanja sa drugim polinukleotidima. Primeri položaja ciljanog delovanja uključuju, ali ne ograničavajući se na njih, inicijacijski kodon, 5’ regulatorne regione, uključujući promotere ili pojačivače, kodirajuću sekvencu, uključujući bilo koji od konzervisanih konsenzus regiona, i 3’ netranslatovani region. U nekom ostvarenju ovih aspekata i svih takvih, ovde opisanih, aspekata, antisens oligonukleotidi su dužine oko 10 do oko 100 nukleotida, oko 15 do oko 50 nukleotida po dužini, oko 18 do oko 25 nukleotida po dužini, ili više. U određenim ostvarenjima, antisens oligonukleotidi dalje uključuju hemijske modifikacije za pojačavanje otpornosti na nukleaze i slične efekte, kao š to su, na primer, fosforotioat veze i 2’-O-šećerne modifikacije, poznate licima uobičajene stručnosti u ovoj oblasti.
U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, inhibitor ROBO2 sadrži najmanje jedan kratki interferirajući RNA (siRNA) molekul, koji je u stanju da blokira ili smanjuje ekspresiju funkcionalnog ROBO2, ciljanim delovanjem na nukleinske kiseline koje kodiraju ili obe izoforme ROBO2, npr., SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 4, ili njihove relevantne domene. U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, najmanje jedan siRNA molekul ciljano deluje na nukleinske kiseline koje kodiraju Ig SLIT vezujući domen ROBO2. U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, najmanje jedan siRNA molekul ciljano deluje na nukleinske kiseline koje kodiraju Ig1 SLIT vezujući domen ROBO2 ili oba vezujuća domena, Ig1 i Ig2 SLIT vezujuće domene ROBO2. U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, najmanje jedan siRNA molekul ciljano deluje na nukleinske kiseline koje kodiraju intracelularni domen ROBO2. U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, najmanje jedan siRNA molekul ciljano deluje na nukleinske kiseline koje kodiraju intracelularni vezujući domen Nck, koji sadrži četiri intracelularna, prolinom bogata, motiva ROBO2. Rutinskom postupku pripada izrada siRNA molekula koji će specifično ciljano delovati na mRNA ROBO2, bez unakrsnog reagovanja sa drugim polinukleotidima. siRNA molekuli za korišćenje u kompozicijama i postupcima, koji su ovde opisani, mogu se dobiti postupcima, poznatim u struci, kao što su uobičajene oligonukleotidne sinteze čvrste faze, a, često će uključivati hemijske modifikacije da bi se povećao polu-život i/ili efikasnost siRNA sredstva, i/ili da bi se omogućila mnogo robustnija formulacija za oslobađanje. Alternativno, siRNA molekuli se oslobađaju uz korišćenje ekspresione kasete koja kodira vektor za intracelularnu transkripciju siRNA.
U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, inhibitor ROBO2 je RNA ili DNA aptamer, koji se vezuje sa jednom ili više izoformi ROBO2. U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka koji su ovde opisani, inhibitor ili antagonist ROBO2 je RNA ili DNA aptamer, koji se vezuje ili ulazi u fizičku interakciju sa ROBO2, i blokira interakcije između ROBO2 i ligandnog ili adapterskog molekula, na primer, SLIT2, odnosno Nck. U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, inhibitor ili antagonist ROBO-2 je RNA ili DNA aptamer, koji se vezuje ili ulazi u fizičku interakciju sa ROB02, i redukuje, ometa ili blokira nishodnu ROB02 signalizaciju, kao š to je SLIT2-ROBO-2 posredovana inhibicija polimerizacije aktina, posredovane nefrinom, i/ili podsticanje celularnog odgovora na ROBO2. U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, RNA ili DNA aptamer vezuje se ili ulazi u fizičku interakciju sa Ig SLIT vezujućim domenom ROBO2. U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, RNA ili DNA aptamer se vezuje ili ulazi u fizičku interakciju sa Ig1 SLIT vezujućim domenom ROBO2 ili sa oba vezujuća domena, i sa Ig1 i sa Ig2 SLIT vezujućim domenima ROBO2, t.j., ROB02(46-145), odnosno ROB02(151-237) SEQ ID NO: 1, i ROB02(30-129), odnosno ROB02(135-221) SEQ ID NO: 3. U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, RNA ili DNA aptamer se vezuje ili ulazi u fizičku interakciju sa intracelularnim domenom ROBO2, t.j., ROB02(881-1378) SEQ ID NO: 3. U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, RNA ili DNA aptamer se vezuje ili ulazi u fizičku interakciju ili vrši blokadu intracelularnog vezujućeg domena Nck, koji sadrži četiri intracelularna, prolinom bogata, motiva ROBO2.
U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, inhibitor ROBO2 je jedinjenje ili sredstvo malog molekula, koje ciljano deluje ili se vezuje sa ROBO2, uključujući, ali bez ograničavanje na njih, male peptidne molekule ili molekule slične peptidima, rastvorljive peptide i sintetska ne-peptidil organska ili neorganska jedinjenja. Kao što je ovde korišćen, naziv "mali molekul" se odnosi na hemijsko sredstvo koje može uključiti, ali ne ograničavajući se na njih, peptid, peptidomimetik, aminokiselinu, analog aminokiseline, polinukleotid, analog polinukleotida, aptamer, nukleotid, analog nukleotida, organsko ili neorgansko jedinjenje (npr., uključujući heteroorganska i organometalna jedinjenja), koje ima molekulsku težinu manju od oko 10,000 grama po molu, organska ili neorganska jedinjenja koja imaju molekulsku težinu manju od oko 5,000 grama po molu, organska ili neorganska jedinjenja koja imaju molekulsku težinu manju od oko 1,000 grama po molu, organska ili neorganska jedinjenja koja imaju molekulsku težinu koja je manja od oko 500 grama po molu, i soli, estre i druge farmaceutski prihvatljive oblike takvih jedinjenja. Primeri položaja vezivanja malih molekula uključuju, ali se njima ne ograničavaju, deo ROBO2 koji se vezuje za SLIT2 ili za adapter Nck, t.j., Ig1SLIT vezujući domen ROBO2 ili oba, Ig1 i Ig2 SLIT vezujuća domena ROB02, intracelularni domen ROB02 ili intracelularni vezujući domen Nck, koji sadrži četiri intracelularna, prolinom bogata, motiva ROBO2.
U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, inhibitor ili antagonist ROB02 uključuje mali molekul koji se vezuje sa ROBO2 i inhibira biološku aktivnost ROBO2.
U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, inhibitor ili antagonist ROBO2 sadrži najmanje jedan strukturni analog ROB02, kao š to je dominantni negativni polipeptid ROBO2. Naziv strukturni analozi ROBO2, kako je ovde korišćen, odnosi se na jedinjenja koja imaju sličnu trodimenzionalnu strukturu kao deo ROBO2 i koja se vezuju sa SLIT2 i/ili sa Nck, pod fiziološkim uslovima in vitro ili in vivo, pri čemu se vezivanje barem parcijalno inhibira biološka aktivnost ROBO2, kao š to je SLIT2-ROBO2 posredovana inhibicija polimerizacije aktina, posredovane nefrinom, i/ili pobuđivanje celularno odgovora na ROBO2. Pogodni strukturni analozi ROBO2 mogu biti dizajnirani i sintetisani posredstvom molekulskog modeliranja ROBO2-SLIT2 vezivanja, na primer. Strukturni analozi ROBO2 mogu biti monomeri, dimeri ili multimeri višeg reda u bilo kojoj željenoj kombinaciji istih ili različitih struktura, da bi se postigli poboljšani afiniteti i biološki efekti.
U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, inhibitor ili antagonist ROBO2 sadrži najmanje jedan rastvorljivi receptor ROB02 ili njihov fuzioni polipeptid, kao š to je, na primer, inhibitorni polipeptid ROBO2. U nekim takvim ostvarenjima, inhibitorni polipeptid ROBO2 je dominantni negativni ROBO2 fuzioni protein. U nekim ostvarenjima kompozicija i postupaka, koji su ovde opisani, inhibitorni polipeptid ROB02 sadrži ekstracelularni domen ROBO2, na primer, Ig1SLIT vezujući domen ROB02 ili oba vezujuća domena, Ig1 i Ig2 SLIT vezujuće domene ROBO2, bez intracelularnih domena ROBO2.
Inhibitori ili antagonisti ROBO2 za korišćenje u kompozicijama i postupcima, koji su ovde opisani, mogu biti identifikovani ili okarakterisani korišćenjem postupaka, koji su poznati u struci, kao š to su testovi protein-protein vezivanja, biohemijski skrining testovi, imuno-testovi i testovi na ćelijskoj bazi, koji su u ovoj oblasti dobro poznati, uključujući, ali ne ograničavajući se na njih, postupke, koji su ovde opisani u Primerima.
Na primer, da bi se identifikovao molekul koji inhibira interakciju između ROBO2 i njegovog liganda, npr., SLIT2, mogu se koristiti testovi vezivanja. Na primer, ROBO2 ili SLIT se imobiliše na mikrotitarskoj ploči, putem kovalentnog ili ne-kovalentnog povezivanja. Test se vrši dodavanjem imobilisanoj komponenti komponente koja nije imobilisana (ligand ili receptor), i koja može biti obeležena detektibilnim obeleživačem, u prisustvu ili odsustvu test sredstva. Kada je reakcija završena, komponente koje nisu reagovale se odstranjuju, a vezujući kompleksi se detektuju. Ukoliko je obrazovanje vezujućih kompleksa inhibirano prisustvom test sredstva, test sredstvo se može smatrati kandidatom za antagonista koji inhibira vezivanje između ROBO2 i SLIT2, na primer. Testovi na bazi ćelija ili testovi na bazi membrane, takođe mogu biti korišćeni za identifikovanje inhibitora ROB02. U drugim ostvarenjima, putem detekcije i/ili merenja nivoa ekspresije gena ROBO2, mogu biti testirani molekuli inhibitora ROBO2 koji inhibiraju ekspresiju gena ROBO2. Ekspresija gena ROBO2 može se detektovati i/ili izmeriti brojnim postupcima, kao što su, RT-PCR u realnom vremenu, enzim-vezani imunosorbent test ("ELISA"), ʺNorthern blottingʺ ili protočna citometrija, kao š to je poznato licu uobičajene stručnosti u ovoj oblasti.
Tako identifikovani inhibitori ROBO2 mogu biti, dalje, testirani korišćenjem in vivo životinjskih modela hronične bolesti bubrega, kao š to su modeli sa glomerularnim i intersticijskim oštećenjem (npr., životinjski modeli lupusnog nefritisa, uključujući miševe NZB, (NZB x NZW) F1 hibridne (označene sa NZB/W) i njihove kongenske derivate, MRL/lpr i BXSB sojeve), životinjski modeli starenja (npr., ostareli Sprague Dawley pacovi i ostareli C57BL/6 miševi); spontano hipertenzivni pacovi (SHR); Buffalo/mna pacovi, koji predstavljaju model humanog idiopatskog nefrotskog sindroma; Munich Wistar Frömter (MWF) pacovi, koji predstavljaju genetski model, udružen sa kongenitalnim deficitom broja nefrona, koji imaju predispoziciju za razvoj hipertenzije i osetljivosti na so u odrasloj dobi; primarni podocitspecifični genetski FSGS modeli; modeli transgenskog miša sa nefropatijom, povezanom sa HIV-om (HIVAN); životinjski modeli Alport sindroma, koji sadrže mutacije α3, α4 ili α5 lanaca kolagena tipa IV (COL4A3, COL4A4 i COL4A5); imunološki indukovani modeli, kao što je model Thy-1 nefritisa, koji je eksperimentalni model pacova sa mezangioproliferativnim glomerulonefritisom (MsPGN), modeli sa antitelima prema glomerularnoj bazalnoj membrani (GBM) i ne-imunološki indukovani modeli.
Kako su ovde korišćeni, u odnosu na inhibitor ROBO2, izrazi "selektivno se vezivati" ili "specifično se vezivati" ili "specifično za" odnose se na sposobnost inhibitora ROBO2, kako je ovde opisan, kao što je, na primer, antitelo koje je antagonist ROBO2 ili njegov ROBO2 antigen-vezujući fragment, da se vezuje za metu, t.j., ROBO2, sa KD<od 10-5 M (10000 nM) ili manje,>npr., 10<-6>M ili manje, 10<-7>M ili manje, 10<-8>M ili manje, 10<-9>M ili manje, 10<-10>M ili manje, 10<-11>M ili manje, ili 10<-12>M ili manje. Na primer, ukoliko se, ovde opisani inhibitor/antagonist ROBO2 vezuje za ROB02 sa KDkoja je 10<-5>M ili manje, ali ne i za srodni molekul, kao što su, na primer, drugi članovi ROBO familije, tada se za sredstvo navodi da se specifično vezuje sa ROBO2. Na specifično vezivanje mogu uticati, na primer, afinitet i avidnost, primera radi, antitela koje je inhibitor/antagonist ROBO2 ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta i koncentracija polipeptidnog sredstva. Lice uobičajene stručnosti u ovoj oblasti može utvrditi pogodne uslove pod kojim se, ovde opisana, polipeptidna sredstva selektivno vezuju sa metama, uz korišćenje bilo kojih prikladnih postupaka, kao š to je titracija polipeptidnog sredstva u pogodnom testu ćelijskog vezivanja.
U odnosu na postupke lečenja hronične bolesti bubrega putem inhibiranja aktivnosti ROBO2, naziv "hronična bolest bubrega" ili CKD se odnosi na bolesti bubrega koje se tokom vremena polagano i progresivno pogoršavaju zbog progresivnog gubitka nefrona i posledičnog gubitka bubrežne funkcije. U ranim stadijumima, ne mora biti simptoma. Do ispoljavanja gubitka bubrežne funkcije uglavnom protekne vreme koje se meri mesecima ili godinama. Proces može biti tako polagan da se simptomi ne pojavljuju dok se bubrežna funkcija ne svede na manje od jedne desetine normale. Finalni stadijum hronične bolesti bubrega naziva se završni stadijum bolesti bubrega ili ʺend-stage renal diseaseʺ (ESRD). U ovom stadijumu, bubrezi više nisu u stanju da odstranjuju dovoljno otpadnih materija i suvišne tečnosti iz organizma. Pacijentu je neophodna dijaliza ili transplantacija bubrega. Šećerna bolest, koja dovodi do dijabetične nefropatije, i visoki krvi pritisak su dva najčešća uzroka hronične bolesti bubrega i odgovorni su za najveći broj slučajeva. Ostale bolesti i stanja, koji mogu oštetiti bubrege i dovesti do hronične bolesti bubrega, uključuju: autoimune poremećaje (kao š to je sistemski lupus eritematozus i sklerodermija); urođene defekte bubrega (kao š to je bolest policističnih bubrega); dejstvo određenih toksičnih hemikalija; glomerulonefritis; povredu ili traumu; kamen u bubregu i infekcije; probleme sa arterijama koje vode krv do bubrega ili unutar bubrega; dejstvo nekih lekova protiv bolova i drugih lekova (kao š to su lekovi za rak); refluksnu nefropatiju (u kojoj su bubrezi oštećeni povratnim tokom urina u bubrege); itd.. Kako je ovde korišćen, naziv "proteinurija" se odnosi na prisustvu povećane količine serumskih proteina u urinu. Proteinurija može, u nekim ostvarenjima, biti indikator bolesti bubrega, ali, sama po sebi, nije presudna.
Sledstveno tome, u nekim ostvarenjima ovih aspekata i svih takvih aspekata, koji su ovde opisani, ispitanik koji boluje ili je pod rizikom od hronične bolesti bubrega, ima dijabetičnu nefropatiju.
Pod izrazima "redukovati" ili "inhibirati" u odnosu na, ovde opisane, postupke lečenja hronične bolesti bubrega i proteinurije, misli se na sposobnost izazivanja ukupnog smanjenja poželjno od 20% ili više, 30% ili više, 40% ili više, 45% ili više, još poželjnije od 50% ili više, od 55% ili više, od 60% ili više, od 65% ili više, od 70% ili više, a, najpoželjnije, od 75% ili više, 80% ili više, 85% ili više, 90% ili više, ili 95% ili više, za dati parametar ili simptom hronične bolesti bubrega. Smanjenje ili inhibiranje se može odnositi, na primer, na simptome poremećaja koji se podvrgava tretmanu, kao što je, na primer, visoki krvni pritisak, proteini u urinu, itd..
Visoki krvni pritisak je gotovo uvek prisutan tokom svih stadijuma hronične bolesti bubrega. Ispitivanje nervnog sistema može pokazati znake nervnog oštećenja. Pružalac zdravstvene zaštite može pri pregledu stetoskopom, zapaziti abnormalne zvuke koji potiču od strane srca ili pluća. Rani simptomi bolesti bubrega su, isto tako, i simptomi drugih bolesti. Ovi simptomi mogu biti jedini simptomi bolesti bubrega, sve dok stanje ne uznapreduje. Simptomi hronične bolesti bubrega mogu uključiti: gubitak apetita; opšte osećanje slabosti i umora; glavobolje; svrab (pruritus) i suvu kožu; mučninu; gubitak težine bez namere da se smanji težina, itd.. Ostali simptomi koji se mogu razviti, posebno kada se funkcija bubrega pogorša, uključuju: abnormalno tamnu ili svetlu kožu; bol u kostima; simptome od strane mozga i nervnog sistema; pospanost i konfuziju; poteškoće pri koncentrisanju ili razmišljanju; osećaj utrnulosti u rukama, stopalima ili na drugim mestima; trzaje ili grčeve mišića; zadah iz usta; lako dobijenje modrica, krvarenje ili pojavu krvi u stolici; prekomerno žeđanje; učestalo štucanje; nizak nivo seksualne ž elje i impotenciju; izostanak menstrualnog krvarenja (amenoreja); kratak dah; probleme sa snom, kao š to je nesanica, sindrom nemirnih nogu i opstruktivnu sleep apneu; oticanje nogu i ruku (edemi); povraćanje, obično ujutro.
Sledstveno tome, u nekim ostvarenjima, ovde opisanih, postupaka, efektivna količina kompozicija, koja sadrži, ovde opisani, inhibitor ROBO2, primenjuje se ispitaniku da bi se ublažio simptom hronične bolesti bubrega. Kako je ovde korišćen, izraz "ublažavanje simptoma hronične bolesti bubrega" predstavlja poboljšavanje bilo kog stanja ili simptoma, koji su povezani sa hroničnom bubrežnom bolešću. Alternativno, ublažavanje simptoma hronične bolesti bubrega može uključiti smanjenje jednog ili više simptoma hronične bolesti bubrega kod ispitanika u odnosu na kontrolnog ispitanika koji boluje od hronične bolesti bubrega, a nije podvrgnut tretmanu, ili u odnosu na stanje ispitanika pre podvrgavanja tretmanu. Ako se uporedi sa ekvivalentnom kontrolom koja nije podvrgnuta tretmanu, ili sa ispitanikom pre podvrgavanja tretmanu sa inhibitorom ROBO2, takvo smanjenje ili stepen prevencije, iznosi najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili više, kako je utvrđeno bilo kojim standardnim postupkom. Poželjno, hronična bolest bubrega je značajno redukovana, ili je nedetekibilna, kada se utvrđuje bilo kojim, u struci poznatim, standardnim postupkom, u kom slučaju se smatra da je hronična bolest bubrega izlečena. Pacijent koji se podvrgava tretmanu za hroničnu bubrežnu bolest je pacijent kome je medicinski stručnjak postavio dijagnozu takvog stanja. Dijagnoza se postavlja bilo kojim pogodnim načinom, poznatim licu uobičajene stručnosti u ovoj oblasti. Dijagnostika i praćenje mogu uključiti, na primer, utvrđivanje nivoa specifičnih proteina ili molekula u uzorku urina, krvi ili seruma, kao što su, na primer, albumin, kalcijum, holesterol, kompletna krvna slika (CBC), elektroliti, magnezijum, fosfor, kalijum, natrijum ili bilo koja njihova kombinacija; testove za određivanje, na primer, klirensa kreatinina; nivoa kreatinina; BUN-a (azot uree ili ʺblood urea nitrogenʺ); ispitivanja posredstvom korišćenja specifičnih tehnika ili procedura, kao š to je CT snimak abdomena, MRI abdomena, ultrazvuk abdomena, biopsija bubrega, snimak bubrega, ultrazvuk bubrega; testove utvrđivanja promena u rezultatima ispitivanja ili analizama za eritropoetin, PTH; određivanje gustine kostiju, ili vitamina D; ili bilo kojom kombinacijom takvih detekcionih postupaka i testova.
Izrazi "ispitanik" i "pojedinac", kao što su korišćeni u vezi sa bilo kojim od, ovde opisanih, postupaka, ovde su upotrebljavani kao zamena jedan drugom, a odnose se na životinju, i, primera radi, čoveka, koji su primaoci inhibitora ROBO2, koji su ovde opisani. Za lečenje stanja bolesti, koja su specifična za specifične ž ivotinje, i, primera radi, za humanog ispitanika, izraz "ispitanik" se odnosi na tu specifičnu ž ivotinju. Izrazi "vrste koje nisu ljudi" i "sisari koji nisu ljudi" ovde su korišćeni kao zamena jedan drugom, a uključuju sisare, kao što su: pacovi, miševi, zečevi, ovce, mačke, psi, krave, svinje i primati koji nisu ljudi. Izraz "ispitanik" obuhvata, isto tako, bilo kog kičmenjaka, uključujući, ali bez ograničavanja na njih, sisare, gmizavce, vodozemce i ribe. Međutim, ispitanik je, pogodno, sisar, kao što je čovek, ili drugi sisar, kao što je pripitomljeni sisar, npr., pas, mačka, konj i slične životinje.
U nekim ostvarenjima ovih postupaka i svih takvih postupaka, koji su ovde opisani, postupak, dalje, obuhvata primenu ispitaniku dodatnog terapeutskog sredstva, pored inhibitora ROBO2. Takvo dodatno terapeutsko sredstvo se može primenjivati zajedno sa inhibitorom ROBO2. Kako je ovde korišćen, izraz "primenjivati se zajedno" ili "zajednička primena" označava primenu, ovde opisanog, inhibitora ROBO2 i drugog jedinjenja, npr., terapeutskog sredstva, zasebno, istovremeno i/ili uzastopno tokom vremenskog trajanja, utvrđenog od strane kvalifikovanog pružaoca zdravstvene usluge.
U nekim takvim ostvarenjima, dodatno terapeutsko sredstvo je inhibitor angiotenzinkonvertujućeg enzima (ACE), sredstvo koje blokira receptor angiotenzina II (ARB) ili antagonist mineralokortikoidnog receptora (MR).
ACE inhibitori za korišćenje sa, ovde opisanim, inhibitorima ROBO2, uključuju, ali bez ograničavanja na njih, benazepril (na tržištu SAD kao LOTENSIN™), kaptopril (na tržištu SAD kao CAPOTEN™), enalapril/enalaprilat (na tržištu SAD kao VASOTEC™ oralni i injekcioni), fozinopril (na tržištu SAD kao MONOPRIL™), lizinopril (na tržištu SAD kao ZESTRIL™ i PRINIVIL™), moeksipril (na tržištu SAD kao UNIVASC™), perindopril (na tržištu SAD kao ACEON™), kvinapril (na tržištu SAD kao ACCUPRIL™), ramipril (na tržištu SAD kao ALTACE™) i trandolapril (na tržištu SAD kao MAVIK™). ARB-i za korišćenje sa, ovde opisanim, inhibitorima ROBO2, uključuju: kandesartan (na tržištu SAD kao ATACAND™), irbesartan (na tržištu SAD kao AVAPRO™), olmesartan (na tržištu SAD kao BENICAR™), losartan (na tržištu SAD kao COZAAR™), valsartan (na tržištu SAD kao DIOVAN™), telmisartan (na tržištu SAD kao MICARDIS™) i eprosartan (na tržištu SAD kao TEVETEN™).
U nekim ostvarenjima ovih postupaka i svih takvih, ovde opisanih, postupaka, postupak, dalje, obuhvata primenu ispitaniku efektivne količine diuretika, pored primene inhibitora ROBO2. Diuretici uključuju, ali bez ograničavanja na njih, torsemid (na tržištu SAD kao DEMADEX™), furosemid (na tržištu SAD kao LASIX™), bumetanid (na tržištu SAD kao BUMEX™), etakrinsku kiselinu (na tržištu SAD kao EDECRIN™), torsemid (na tržištu SAD kao DEMADEX™), amilorid (na tržištu SAD kao MIDAMOR™), acetazolamid (na tržištu SAD kao DIAMOX™), pamabrom (na tržištu SAD kao AQUA-BAN™), manitol (na tržištu SAD kao ARIDOL™ ili OSMITROL™), traimteren (na tržištu SAD kao DYRENIUM™), spironolakton (na tržištu SAD kao ALDACTONE™), amilorid (na tržištu SAD kao MIDAMOR™), indapamid (na tržištu SAD kao LOZOL™), hidrohlorotiazid (na tržištu SAD u prodaji kao HYDRODIURIL™), metolazon (na tržištu SAD u prodaji kao ZAROXOLYN™ ili MYKROX™), metiklotiazid (na tržištu SAD u prodaji kao AQUATENSEN™ ili ENDURON™), hidrohlortiazid (na tržištu SAD u prodaji kao AQUAZIDE H™ ili ESIDRIX™ ili MICROZIDE™), hlorotiazid (na tržištu SAD u prodaji kao DIURIL™), bendroflumetiazid (na tržištu SAD u prodaji kao NATURETIN™), politiazid (na tržištu SAD u prodaji kao RENESE™), hidroflumetiazid (na tržištu SAD u prodaji kao SALURON™) i hlortalidon (na tržištu SAD u prodaji kao THALITONE™). Za kompletni spisak pogledajte, takođe, npr., Physician’s Desk Reference, izdanje 2012, PDR Network (2011).
Kako su ovde korišćeni, u odnosu na bilo koju od kompozicija i postupaka koji uključuju inhibitore ROBO-2 ili njihove kombinovane tretmane, koji su ovde opisani, izrazi "lečiti", "tretman", "lečenje" ili "poboljšavanje" odnose se na terapeutske tretmane, kojima je cilj da se izmeni, olakša, ublaži, inhibira, uspori ili zaustavi napredovanje ili ozbiljnost stanja, koje je povezano sa bolešću ili poremećajem. Izraz "lečenje" uključuje smanjenje ili ublažavanje najmanje jednog štetnog efekta ili simptoma stanja, bolesti ili poremećaja, povezanih sa hroničnom bubrežnom bolešću, kao što je, ali ne ograničavajući se na nju, dijabetična nefropatija. Tretman je, uopšteno, "efektivan" ukoliko se smanji jedan ili više simptoma ili kliničkih markera. Alternativno, tretman je "efektivan" ukoliko je došlo da smanjenja ili zaustavljanja progresije bolesti. To jest, "tretman" uključuje ne samo poboljšanje simptoma ili markera, već, isto tako, zaustavljanje ili barem usporavanje napredovanja ili pogoršavanja simptoma koji bi se očekivali u odsustvu tretmana. Povoljni ili poželjni klinički rezultati uključuju, ali bez ograničavanja na njih, ublažavanje jednog ili više simptoma, umanjivanje obima bolesti, stabilizovano (t.j., bez pogoršavanja) stanje bolesti, odlaganje ili usporavanje progresije bolesti, ublažavanje ili olakšavanje stanja bolesti i remisiju (bilo parcijalnu ili potpunu), bez obzira da li je detektibilna ili nedetektibilna. Izraz "tretman" bolesti uključuje, takođe, pružanje olakšanja od simptoma ili sporednih efekata bolesti (uključujući palijativni tretman).
Izraz "efektivna količina", kako je ovde korišćen, odnosi se na količinu, ovde opisanog, inhibitora ROBO-2, koja je potrebna za ublažavanje najmanje jednog ili više simptoma bolesti ili poremećaja, koji se podvrgavaju lečenju, i odnosi se na količinu farmakološke kompozicije koja je dovoljna za obezbeđivanje željenog efekta. Izraz "terapeutski efektivna količina" se, sledstveno tome, odnosi na količinu, ovde opisanog, inhibitora ROBO-2, koja je, uz korišćenje postupaka, kao š to su ovde izloženi, dovoljna za obezbeđivanje određenog efekta, kada se primenjuje uobičajenom ispitaniku. Efektivna količina, kao što je ovde korišćena, uključivala bi, takođe, količinu koja je dovoljna za odlaganje razvoja simptoma bolesti, menjanje toka razvijanja simptoma bolesti (primera radi, ali bez ograničavanja na njih, usporavanje progresije simptoma bolesti) ili ukidanje simptoma bolesti. Sledstveno tome, nije moguće da se specifično utvrdi tačna "efektivna količina". Međutim, za bilo koji dati slučaj, pogodnu "efektivnu količinu" može utvrditi lice uobičajene stručnosti u ovoj oblasti, korišćenjem samo rutinskih eksperimenata.
Efektivne količine, toksičnost i terapeutska efikasnost mogu se utvrditi standardnim farmaceutskim procedurama na ćelijskim kulturama ili eksperimentalnim životinjama, npr., za određivanje LD50 (doza koja je letalna za 50% populacije) i ED50 (doza koja je terapeutski efektivna kod 50% populacije). Dozaža može varirati u zavisnosti od upotrebljene forme dozaže i korišćenog puta primene. Dozni odnos između toksičnih i terapeutskih efekata jeste terapeutski indeks i može se izraziti kao odnos LD50/ED50. Poželjni su kompozicije i postupci koji ispoljavaju visoke terapeutske indekse. Terapeutski efektivna doza može se, inicijalno, utvrditi iz testova ćelijske kulture. Isto tako, formulisanje doze se može vršiti na životinjskim modelima, da bi se postigao raspon cirkulišućih plazmatskih koncentracija koji uključuje IC50 (t.j., koncentracija, ovde opisanog, inhibitora ROBO-2, kojom se postiže polovina maksimalne inhibicije izmerene funkcije ili aktivnosti), kako je utvrđeno u ćelijskoj kulturi, ili na pogodnom životinjskom modelu. Koncentracije u plazmi mogu se, primera radi, izmeriti posredstvom tečne hromatografije visokih performansi. Efekti bilo koje određene dozaže mogu biti praćeni korišćenjem pogodnog bio-testa. Dozaža može biti, od strane lekara, utvrđena i, ukoliko je to potrebno, podešena, da bi se prilagodili zapaženi efekti tretmana. U zavisnosti od tipa i ozbiljnosti hronične bolesti bubrega, doza od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg (npr., 0.1-20 mg/kg), ovde opisanog, inhibitora ROBO2 predstavlja kandidat dozu za inicijalni dozni raspon za primenu ispitaniku, bilo, primera radi, putem jedne ili više, zasebnih primena, ili posredstvom kontinuirane infuzije.
Načini primene
Inhibitori ROBO2 ili njihovi kombinovani tretmani, koji su ovde opisani, mogu biti primenjeni ispitaniku kome je to potrebno, korišćenjem bilo kog pogodnog puta, koji dovodi do efektivnog tretmana ispitanika. Kako su ovde korišćeni, izrazi "primenjivanje" i "uvođenje" upotrebljavani su kao zamena jedan drugom, i odnose se na plasiranje inhibitora ROBO-2 ispitaniku, putem postupka ili puta, koji dovodi do najmanje parcijalne lokalizacije takvih sredstava na željenom položaju, tako da se proizvodi željeni efekat(efekti).
U nekim ostvarenjima, inhibitor ROBO2 se primenjuje ispitaniku koji boluje od hronične bolesti bubrega, bilo kojim putem primene, kojim se sredstvo oslobađa sistemski ili na željenoj površini ili ciljanom položaju, a može uključiti, ali bez ograničavanja na njih, injekcionu, infuzionu, implantacionu i inhalacionu primenu. Do stepena u kome polipeptidna sredstva mogu biti zaštićena od inaktivacije u crevnom traktu, razmotreni su, isto tako, i oralni oblici primene. "Injekcija" uključuje, bez ograničavanje, intravensku, intramuskularnu, intraarterijalnu, intratekalnu, intraventrikularnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijačnu, intradermalnu, intraperitonealnu, transtrahealnu, subkutanu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidalnu, intraspinalnu, intracerebrospinalnu i intrasternalnu injekciju i infuziju. U nekim ostvarenjima, inhibitori ROBO-2 za korišćenje u, ovde opisanim postupcima, primenjuju se putem intravenske infuzije ili injekcije.
Izrazi "parenteralna primena" i "primenjen parenteralnim putem", kako su ovde korišćeni, odnose se na puteve primene, koji ne uključuju enteralnu i topikalnu primenu, a vrše se uglavnom posredstvom injekcija. Izrazi "sistemska primena", "primenjen sistemski", "periferna primena" i "primenjen periferno", kako su ovde korišćeni, odnose se na primenu inhibitora ROBO-2, koja nije direktna primena na ciljanu poziciju, tkivo ili organ, kao š to je tumorski položaj, tako da on prolazi kroz cirkulatorni sistem ispitanika i, sledstveno tome, biva izložen metaboličkim i drugim sličnim procesima.
Za kliničko korišćenje, ovde opisanih, postupaka, primena inhibitora ROBO-2, koji su ovde opisani, može uključiti formulisanje u farmaceutske kompozicije ili farmaceutske formulacije za parenteralnu primenu, npr., intravenskim; mukoznim, npr., intranazalnim; okularnim ili drugim putevima primene. U nekim ostvarenjima, inhibitori ROBO-2, koji su ovde opisani, mogu biti primenjeni zajedno sa bilo kojim jedinjenjem, materijalom ili kompozicijom farmaceutski prihvatljivog nosača, kojima se postiže delotvoran tretman kod ispitanika. Sledstveno tome, farmaceutska formulacija za korišćenje u, ovde opisanim, postupcima, može sadržavati inhibitor ROBO-2, kako je ovde opisan, u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih sastojaka.
Izraz "farmaceutski prihvatljiv" odnosi se na ona jedinjenja, materijale, kompozicije i/ili dozne oblike, koji su, u okvirima granica medicinske procene, pogodni za korišćenje u kontaktu sa tkivima ispitanika, koji su ljudska bića i ž ivotinje, bez prekomerne toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora ili drugih poteškoća ili komplikacija, i koji su u srazmeri sa prihvatljivim odnosom korist/rizik. Izraz "farmaceutski prihvatljivi nosač", kako je ovde korišćen, označava farmaceutski prihvatljivi materijal, kompoziciju ili vehikulum, kao š to je tečni ili čvrsti punjač, razblaživač, ekscipijens, rastvarač, medijum, materijal za inkapsulaciju, sredstvo za ispomoć pri izradi (npr., lubrikans, talk magnezijum, kalcijum ili cink stearat ili sterinska kiselina), ili rastvarački inkapsulirajući materijal, koji je uključen u održavanje stabilnosti, rastvorljivosti ili aktivnosti inhibitora ROBO-2. Svaki nosač mora biti "prihvatljiv" u smislu da je kompatibilan sa ostalim sastojcima formulacije i nije štetan za pacijenta. Neki primeri materijala koji mogu poslužiti kao farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju: (1) šećere, kao š to je laktoza, glukoza i saharoza; (2) skrobove, kao š to je kukuruzni skrob i krompirov skrob; (3) celulozu i njene derivate, kao š to je natrijum karboksimetil celuloza, metilceluloza, etil celuloza, mikrokristalna celuloza i celulozni acetat; (4) praškasti tragakant; (5) slad; (6) želatin; (7) ekscipijense, kao što su kakao puter i voskovi za supozitorije; (8) ulja, kao š to je kikirikijevo ulje, pamučno ulje, ulje šafrana, susamovo ulje, maslinovo ulje, kukuruzno ulje i sojino ulje; (9) glikole, kao š to je propilen glikol; (10) poliole, kao š to je glicerin, sorbitol, manitol i polietilen glikol (PEG); (11) estre, kao što je etil oleat i etil laurat; (12) agar; (13) puferišuća sredstva, kao što je magnezijum hidroksid i aluminijum hidroksid; (14) alginsku kiselinu; (15) vodu bez pirogena; (16) izotonični slani rastvor; (17) Ringerov rastvor; (19) rastvore puferisanog pH; (20) poliestre, polikarbonate i/ili polianhidride; (21) sredstva za masu, kao š to su polipeptidi i aminokiseline (22) serumske komponente, kao što je serumski albumin, HDL i LDL; (23) C2-C12 alkohole, kao što je etanol i (24) ostale netoksične kompatibilne supstance, uključene u farmaceutske formulacije. Sredstva za oslobađanje, sredstva za oblaganje, konzervansi i antioksidansi, takođe, mogu biti prisutni u formulaciji. Izrazi, kao što je "ekscipijens", "nosač", "farmaceutski prihvatljivi nosač" ili slični ovde su korišćeni kao zamena jedni drugima.
Ovde opisani, inhibitori ROBO-2 mogu biti specijalno formulisani za primenu jedinjenja ispitaniku u čvrstoj i tečnoj formi ili u formi gela, uključujući oblike, koji su adaptirani za sledeće primene: (1) parenteralna primena, na primer, putem subkutane, intramuskularne, intravenske ili epiduralne injekcije, u vidu, primera radi, sterilnog rastvora ili suspenzije, ili formulacije produženog oslobađanja; (2) topikalna primena, na primer, u vidu krema, masti ili flastera sa kontrolisanim oslobađanjem ili u vidu spreja koji se nanosi na kožu; (3) intravaginalna ili intrarektalna primena, na primer, u vidu pesara, krema ili pene; (4) okularna primena; (5) transdermalna primena; (6) transmukozna primena ili (79) nazalna primena. Pored toga, inhibitor ROBO-2 može biti implantiran pacijentu ili injiciran korišćenjem sistema za oslobađanje leka. Vidi, na primer, Urquhart, et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24: 199-236 (1984); Lewis, ed. "Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals" (Plenum Press, New York, 1981); U.S. Pat. No.3,773,919 i U.S. Pat. No.353,270,960.
Dalja ostvarenja formulacija i načina primene kompozicija koje sadrže, ovde opisane, inhibitore ROBO-2, koji mogu biti korišćeni u postupcima koji su ovde prikazani, opisana su u nastavku.
Parenteralni dozni oblici. Parenteralni dozni oblici ROBO-2 inhibitora mogu, isto tako, biti primenjeni ispitaniku sa hroničnim bubrežnim stanjem raznim putevima, koji uključuju, ali bez ograničavanja na njih, subkutanu, intravensku (uključujući bolus injekciju), intramuskularnu i intraarterijalnu primenu. Budući da primena parenteralnih doznih oblika obično zaobilazi prirodne odbrambene mehanizme pacijenta prema kontaminirajućim agensima, parenteralni dozni oblici su, poželjno, sterilni ili ih je moguće sterilisati pre primene pacijentu. Primeri parenteralnih doznih oblika uključuju, ali bez ograničavanja na njih, rastvore, spremne za injiciranje, suve proizvode koji su spremni za rastvaranje ili suspendovanje u farmaceutski prihvatljivom vehikulumu za injekcije, suspenzije spremne za injiciranje, parenteralne dozne oblike kontrolisanog oslobađanja i emulzije.
Pogodni vehikulumi, koji se mogu koristiti za dobijanje parenteralnih doznih oblika pronalaska, dobro su poznati licima, stručnim u ovoj oblasti. Primeri uključuju, bez ograničavanja: sterilnu vodu; vodu za injekcije USP; slani rastvor; rastvor glukoze; vodene vehikulume, kao š to su, ali bez ograničavanja na njih, injekcija natrijum hlorida, injekcija Ringerovog rastvora, injekcija dekstroze, injekcija dekstroze i natrijum hlorida i injekcija laktatnog Ringerovog rastvora; vehikulume koji se mešaju sa vodom, kao što je, ali bez ograničavanja na njih, etil alkohol, polietilen glikol i propilen glikol; i ne-vodene vehikulume, kao što su, ali ne ograničavajući se na njih, kukuruzno ulje, pamučno ulje, kikirikijevo ulje, susamovo ulje, etil oleat, izopropil miristat i benzil benzoat.
U nekim ostvarenjima, kompozicije koje sadrže efektivnu količinu inhibitora ROB02, formulisane su tako da budu pogodne za oralnu primenu, na primer, u vidu zasebnih doznih oblika, kao š to su, ali ne ograničavajući se na njih, tablete (uključujući, bez ograničavanja, zasečene ili obložene tablete), pilule, kaplete, kapsule, tablete za žvakanje, praškasti paketići, obložene kapsule, lozenge, oblande, aerosolni sprejevi ili tečnosti, kao š to su, ali bez ograničavanja na njih, sirupi, eliksiri, rastvori ili suspenzije u vodenoj tečnosti, ne-vodena tečnost, emulzija ulje-u-vodi, ili voda-u-ulju emulzija. Takve kompozicije sadrže prethodno utvrđenu količinu farmaceutski prihvatljive soli izloženih jedinjenja, a mogu se pripremiti putem farmaceutskih postupaka, koji su stručnjacima u ovoj oblasti dobro poznati. Vidi, uopšteno, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18. izdanje, Mack Publishing, Easton, Pa. (1990).
Zbog jednostavnosti njihove primene, tablete i kapsule predstavljaju najpogodnije čvrste oralne oblike jedinice doze, u kom slučaju su korišćeni čvrsti farmaceutski ekscipijensi. Ukoliko se to želi, tablete se mogu obložiti putem standardnih vodenih ili ne-vodenih tehnika. Ovi dozni oblici se mogu izraditi bilo kojim od farmaceutskih postupaka. Uopšteno, farmaceutske kompozicije i dozni oblici se pripremaju posredstvom uniformnog i bliskog povezivanja aktivnog sastojka(sastojaka) sa tečnim nosačima, fino podeljenim čvrstim nosačima, ili sa oba, a, nakon toga, oblikovanjem proizvoda u željeni izgled, ukoliko je to potrebno. U nekim ostvarenjima, oralni dozni oblici nisu korišćeni za antibiotsko sredstvo.
Uobičajeni oralni dozni oblici kompozicija koje sadrže efektivnu količinu inhibitora ROBO2 pripremaju se sjedinjavanjem farmaceutski prihvatljive soli inhibitora ROBO2 u blisko povezanu mešavinu sa najmanje jednim ekscipijensom u skladu sa konvencionalnim tehnikama farmaceutskog sjedinjavanja. Ekscipijensi mogu imati veoma raznolike forme, u zavisnosti od oblika kompozicije, koji je poželjan za primenu. Na primer, ekscipijensi, koji su pogodni za korišćenje u oralnim tečnim ili aerosolnim doznim oblicima, uključuju, ali bez ograničavanja na njih, vodu, glikole, ulja, alkohole, sredstva za ukus, konzervanse i sredstva za boju. Primeri ekscipijenasa, pogodnih za korišćenje u čvrstim oralnim doznim oblicima (npr., praškovi, tablete, kapsule i kaplete) uključuju, ali bez ograničavanja na njih, skrobove, šećere, mikrokristalnu celulozu, kaolin, razblaživače, sredstva za granulisanje, lubrikante, vezujuća sredstva i sredstva za dezintgrisanje.
Vezujuća sredstva, koja su pogodna za korišćenje u, ovde opisanim, farmaceutskim formulacijama, uključuju, ali bez ograničavanja na njih, kukuruzni skrob, krompirov skrob ili druge skrobove, želatin, prirodne i sintetske lepkove, kao š to je akacija, natrijum alginat, alginska kiselina, drugi alginati, praškasti tragakant, guar gumu, celulozu i njene derivate (npr., etil celuloza, celulozni acetat, karboksimetil celuloza kalcijum, natrijum karboksimetil celuloza), polivinil pirolidon, metil celulozu, pre-želatinizirani skrob, hidroksipropil metil celulozu, (npr., No.
2208, 2906, 2910), mikrokristalnu celulozu i njihove mešavine.
Primeri punjača, koji su pogodni za korišćenje u, ovde opisanim, farmaceutskim formulacijama, uključuju, ali ne ograničavajući se na njih, talk, kalcijum karbonat (npr., granule ili prašak), mikrokristalnu celulozu, praškastu celulozu, dekstrate, kaolin, manitol, silicijumovu kiselinu, sorbitol, skrob, pre-želatinizovani skrob i njihove mešavine. Vezujuće sredstvo ili punjač u, ovde opisanim, farmaceutskim kompozicijama, obično je prisutan u količini od oko 50 do oko 99 procenata po težini farmaceutske kompozicije.
Dezintegratori se koriste u, ovde opisanim, oralnim farmaceutskim formulacijama, da bi se dobile tablete koje se dezintegrišu kada se izlože vodenom okruženju. Trebalo bi da se koristi dovoljna količina dezintegratora, koja nije ni premala ni prevelika, da ne bi na nepovoljan način izmenila oslobađanje aktivnog sastojka(sastojaka), kako bi se obrazovali čvrsti oralni dozni oblici, ovde opisanih, inhibitora ROBO2. Korišćena količina dezintegratora varira u zavisnosti od tipa formulacije, što je licima uobičajene stručnosti u ovoj oblasti lako odrediti. Dezintegratori koji se mogu koristiti za obrazovanje oralnih farmaceutskih formulacija uključuju, ali bez ograničavanja na njih, agar, alginsku kiselinu, kalcijum karbonat, mikrokristalnu celulozu, kroskarmeloza natrijum, krospovidon, polakrilin kalijum, natrijum skrob glikolat, skrob krompira ili tapioke, ostale skrobove, preželatinizovani skrob, glinu, druge algine, druge celuloze, lepkove i njihove mešavine.
Lubrikansi, koji se mogu koristiti za obrazovanje oralnih farmaceutskih formulacija, ovde opisanih, inhibitora ROBO2, uključuju, ali bez ograničavanja na njih, kalcijum stearat, magnezijum stearat, mineralno ulje, blago mineralno ulje, glicerin, sorbitol, manitol, polietilen glikol, druge glikole, stearinsku kiselinu, natrijum lauril sulfat, talk, hidrogenizovano biljno ulje (npr., kikirikijevo ulje, ulje semena pamuka, suncokretovo ulje, susamovo ulje, maslinovo ulje, kukuruzno ulje i sojino ulje), cink stearat, etil oleat, etil laureat, agar i njihove mešavine. Dodatni lubrikansi uključuju, na primer, siloidni silika gel (AEROSIL® 200, proizveden od strane W. R. Grace Co. of Baltimore, Md.), koagulisani aerosol sintetske silike (u prodaji posredstvom Degussa Co. of Piano, Tex.), CAB-O-SIL® (pirogeni silikon dioksid, proizvod koji prodaje Cabot Co. of Boston, Mass.) i njihove mešavine. Ukoliko se uopšte koriste, lubrikansi se obično koriste u količini manjoj od oko 1 procenta po težini farmaceutskih kompozicija ili doznih oblika u koje se uključuju.
U drugim ostvarenjima, obezbeđene su farmaceutske formulacije i dozni oblici bez laktoze, pri čemu takve kompozicije, ukoliko ih uopšte sadrže, sadrže malu količinu laktoze ili drugih mono- ili di-saharida. Kako je ovde korišćen, izraz "bez laktoza" znači da je količina laktoze, ukoliko je uopšte prisutna, nedovoljna da bi u značajnoj meri povećala obim degradacije aktivnog sastojka. Kompozicije pronalaska koje su bez laktoze mogu sadržavati ekscipijense koji su dobro poznati u struci, a navedeni su u USP (XXI)/NF (XVI).
Oralne formulacije inhibitora ROBO2 dalje uključuju, u nekim ostvarenjima, anhidrovane farmaceutske kompozicije i dozne oblike koji sadrže, ovde opisane, inhibitore ROBO2, kao aktivne sastojke, budući da voda može olakšati razgradnju nekih jedinjenja. Na primer, dodavanje vode (npr., 5%) je široko prihvaćeno u farmaceutskoj struci kao način simuliranja dugotrajnog č uvanja, da bi se odredile karakteristike, kao š to su rok trajanja ili stabilnost formulacija tokom vremena. Vidi, npr., Jens T. Carstensen, Drug Stability: Principles & Practice, 379-80 (2. izdanje, Marcel Dekker, NY, N.Y.: 1995). Anhidrovane farmaceutske kompozicije i dozni oblici, koji su ovde opisani, mogu biti pripremljeni korišćenjem anhidrovanih sastojaka ili sastojaka sa malim sadržajem vlage i uslova sa malo vlage ili sa slabom vlažnošću. Farmaceutske kompozicije i dozni oblici koji sadrže laktozu i najmanje jedan aktivni sastojak koji uključuje primarni ili sekundarni amin, poželjno su anhidrovani, ukoliko se tokom proizvodnje, pakovanja i/ili skladištenja očekuje značajan kontakt sa vlagom i/ili vlažnošću. Anhidrovane kompozicije se poželjno pakuju uz korišćenje materijala za koje se zna da sprečavaju izloženost vodi, tako da se isti mogu uključiti u pogodne komplete formulacije. Primeri pogodnih pakovanja uključuju, ali bez ograničavanja na njih, hermetički pričvršćene folije, pakovanja sa plastičnim materijalima, kontejnere jedinice doze (npr., bočice) sa ili bez dezikanta, blister pakovanja i strip pakovanja.
Aerosolne formulacije. Inhibitor ROBO-2 može biti zapakovan u aerosolnom kontejneru pod pritiskom, zajedno sa pogodnim potiskivačima, na primer, ugljovodoničnim propelantima, kao što su propan, butan ili izobutan, sa uobičajenim adjuvansima. Inhibitor ROBO-2 se može, takođe, primenjivati u obliku bez pritiska, kao što je nebulizer ili atomizer. Inhibitor ROBO-2 se, takođe, može primenjivati direktno u vazdušne kanale u formi suvog praška, na primer, korišćenjem inhalatora.
Pogodne praškaste kompozicije uključuju, ilustracije radi, praškaste preparate inhibitora ROBO-2, u potpunosti izmešane sa laktozom, ili drugim inertnim praškovima, prihvatljivim za intra-bronhijalnu primenu. Praškaste kompozicije se mogu primenjivati preko aerosolnog razdeljivača ili mogu biti obmotane u lomljivoj kapsuli, koju ispitanik može umetnuti u aparat, u kome se kapsula izbuši, a prašak se ispusti u stabilnu struju, pogodnu za inhalaciju. Kompozicije mogu uključiti propelante, surfaktante i ko-rastvarače i mogu se puniti u uobičajene aerosolne kontejnere koje se zatvaraju pogodnim odmernim ventilom.
Aerosoli, koji su namenjeni za oslobađanje u respiratorni trakt dobro su poznati u struci. Vidi, primera radi, Adjei, A. i Garren, J. Pharm. Res., 1: 565-569 (1990); Zanen, P. i Lamm, J.-W. J. Int. J. Pharm., 114: 111-115 (1995); Gonda, I. "Aerosols for delivery of therapeutic and diagnostic agents to the respiratory tract" u Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 6:273-313 (1990); Anderson et al., Am. Rev. Respir. Dis., 140: 1317-1324 (1989)), a imaju isto tako, potencijal za sistemsko oslobađanje peptida i proteina (Patton i Platz, Advanced Drug Delivery Reviews, 8:179-196 (1992)); Timsina et. al., Int. J. Pharm., 101: 1-13 (1995); i Tansey, I. P., Spray Technol. Market, 4:26-29 (1994); French, D. L., Edwards, D. A. i Niven, R. W., Aerosol Sci., 27: 769-783 (1996); Visser, J., Powder Technology 58: 1-10 (1989)); Rudt, S. i R. H. Muller, J. Controlled Release, 22: 263-272 (1992); Tabata, Y, i Y. Ikada, Biomed. Mater. Res., 22: 837-858 (1988); Wall, D. A., Drug Delivery, 2: 101-201995); Patton, J. i Platz, R., Adv. Drug Del. Rev., 8: 179-196 (1992); Bryon, P., Adv. Drug. Del. Rev., 5: 107-132 (1990); Patton, J. S., et al., Controlled Release, 28: 1579-85 (1994); Damms, B. i Bains, W., Nature Biotechnology (1996); Niven, R. W., et al., Pharm. Res., 12(9); 1343-1349 (1995); i Kobayashi, S., et al., Pharm. Res., 13(1): 80-83 (1996).
Formulacije, ovde opisanih, inhibitora ROBO-2, uključuju, dalje, anhidrovane farmaceutske kompozicije i dozne oblike, koji sadrže prikazana jedinjenja kao aktivne sastojke, budući da voda može olakšati razgradnju nekih jedinjenja. Na primer, dodavanje vode (npr., 5%) je, u farmaceutskoj struci, široko prihvaćeno kao način simuliranja dugotrajnog skladištenja, da bi se odredile karakteristike, kao što je rok trajanja ili stabilnost formulacija tokom vremena. Vidi, npr., Jens T. Carstensen, Drug Stability: Principles & Practice, 379-80 (2. izdanje, Marcel Dekker, NY, N.Y.: 1995). Anhidrovane farmaceutske kompozicije i dozni oblici pronalaska mogu biti pripremljeni korišćenjem anhidrovanih sastojaka ili sastojaka sa malim sadržajem vlage i uslova sa malo vlage ili sa slabom vlažnošću. Farmaceutske kompozicije i dozni oblici koji sadrže laktozu i najmanje jedan aktivni sastojak koji uključuje primarni ili sekundarni amin, poželjno su anhidrovani, ukoliko se tokom proizvodnje, pakovanja i/ili skladištenja očekuje značajan kontakt sa vlagom i/ili vlažnošću. Anhidrovane kompozicije se poželjno pakuju uz korišćenje materijala za koje se zna da sprečavaju izloženost vodi, tako da se isti mogu uključiti u pogodne komplete formulacije. Primeri pogodnih pakovanja uključuju, ali bez ograničavanja na njih, hermetički pričvršćene folije, plastična pakovanja, kontejnere jedinice doze (npr., bočice) sa ili bez dezikanta, blister pakovanja i strip pakovanja.
Dozni oblici kontrolisanog i odloženog oslobađanja. U nekim ostvarenjima ovde opisanih aspekata, inhibitor ROBO-2 može se primenjivati ispitaniku korišćenjem načina kontrolisanog ili odloženog oslobađanja. Idealno, korišćenje optimalno dizajniranog preparata kontrolisanog oslobađanja u medicinskom tretmanu karakterisano je time što je minimalna količina supstance leka korišćena za lečenje ili kontrolisanje stanja u minimalnom vremenskom trajanju. Prednosti formulacija kontrolisanog oslobađanja uključuju: 1) produženu aktivnost leka; 2) smanjenu učestalost uzimanja doze; 3) povećanu saglasnost pacijenta; 4) korišćenje manje količine ukupnog leka; 5) smanjenje lokalnih ili sistemskih sporednih efekata; 6) svođenje akumulacije leka na minimum; 7) smanjenje fluktuacija koncentracija u krvi; 8) poboljšanje efikasnosti tretmana; 9) redukovanje potencijacije ili gubitka aktivnosti leka i 10) unapređenje brzine kontrolisanja bolesti ili stanja. (Kim, Cherng-ju, Controlled Release Dosage Form Design, 2 (Technomic Publishing, Lancaster, Pa.: 2000)). Formulacije kontrolisanog oslobađanja mogu biti korišćene za kontrolisanje početka delovanja, trajanja dejstva, plazmatskih koncentracija unutar terapeutskog prozora i najviših nivoa koncentracija u krvi jedinjenja sa formulom (I). Određenije, dozni oblici ili formulacije kontrolisanog ili produženog oslobađanja mogu biti korišćeni da bi se obezbedila maksimalna efikasnost jedinjenja formule (I), uz svođenje na minimalni nivo potencijalnih štetnih efekata i problema koji se tiču bezbednosti leka, koji se mogu javiti zbog malih doza leka (t.j., doza koje se kreću ispod minimalnih terapeutskih nivoa), kao i doza koje prelaze nivo toksičnog dejstva leka.
Brojni poznati dozni oblici, formulacije i sprave kontrolisanog ili produženog oslobađanja mogu se adaptirati za korišćenje sa ovde opisanim, inhibitorima ROBO-2. Primeri uključuju, ali bez ograničavanja na njih, one koji su opisani u U.S. Pat. Br.: 3,845,770; 3,916,899; 3,536,809; 3,598,123; 4,008,719; 5674,533; 5,059,595; 5,591,767; 5,120,548; 5,073,543; 5,639,476; 5,354,556; 5,733,566 i 6,365,185 B1. Ovi dozni oblici mogu biti korišćeni za obezbeđivanje polaganog ili kontrolisanog oslobađanja jednog ili više aktivnih sastojaka, uz korišćenje, primera radi, hidroksipropilmetil celuloze, drugih polimernih matriksa, gelova, permeabilnih membrana, osmotskih sistema (kao š to je OROS® (Alza Corporation, Mountain View, Calif. SAD)), višeslojnih omotača, mikročestica, liposoma ili mikro-kuglica ili njihove kombinacije, da bi se postigao željeni profil oslobađanja u varirajućim proporcijama. Pored toga, mogu biti korišćeni jon-izmenjivački materijali, da bi se pripremile imobilisane forme adsorbovanih soli izloženih jedinjenja, i, na taj način, postigao efekat kontrolisanog oslobađanja leka. Primeri specifičnih anjonskih izmenjivača uključuju, ali ne ograničavajući se na njih, DUOLITE® A568 i DUOLITE® AP143 (Rohm&Haas, Spring House, Pa. SAD).
U nekim ostvarenjima, ovde opisanih, postupaka, inhibitor ROBO-2 za korišćenje u postupcima, koji su ovde opisani, primenjuje se ispitaniku posredstvom održavanog oslobađanja ili u pulsevima. Pulsna terapija nije oblik diskontinuirane primene iste količine kompozicije tokom vremena, već uključuje primenu iste doze kompozicije smanjenom učestalošću primene ili primenu smanjenih doza. Održavano oslobađanje ili pulsne primene leka posebno su poželjne kada se poremećaj kod ispitanika javlja kontinuirano, na primer, kada ispitanik ima hroničnu bubrežnu bolest. Svaka pulsna doza može biti smanjena, a ukupna količina, ovde opisanog, inhibitora ROBO-2, koja se, tokom trajanja tretmana, primenjuje ispitaniku ili pacijentu, svodi se na minimalnu količinu.
Interval između pulseva, kada je to potrebno, može utvrditi lice uobičajene stručnosti u ovoj oblasti. Često se interval između pulseva može izračunati na način da se primeni druga doza kompozicije onda kada kompozicija ili aktivna komponenta kompozicije više nije detektibilna kod ispitanika, pre oslobađanja sledeće pulsne doze. Intervali, takođe, mogu biti izračunati iz in vivo polu-života kompozicije. Intervali se mogu izračunati u vidu povećanja vrednosti u odnosu na in vivo polu-život, ili tako da su 2, 3, 4, 5 i čak 10 puta veći od polu-života kompozicije. Razni postupci i aparati za pulsnu primenu kompozicija putem infuzije ili drugim načinima oslobađanja pacijentu, izloženi su u U.S. Pat. Br. 4,747,825; 4,723,958; 4,948,592; 4,965,251 i 5,403,590.
U nekim ostvarenjima, mogu se pripremiti preparati održavanog oslobađanja koji sadrže inhibitor ROBO-2. Pogodni primeri preparata održavanog oslobađanja uključuju semipermeabilne matrikse od čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže inhibitor, pri čemu su matriksi u formi oblikovanih materijala, npr., filmova ili mikrokapsula. Primeri matriksa održavanog oslobađanja uključuju poliestre, hidrogelove (na primer, poli(2-hidroksietilmetakrilat) ili poli(vinilalkohol)), polilaktide (U.S. Pat. Br. 3,773,919), kopolimere L-glutaminske kiseline i etil-L-glutamata, ne-razgradljivi etilen-vinil acetat, razgradljive kopolimere mlečna kiselina-glikolna kiselina, kao što je LUPRON DEPOT (injekcione mikrokuglice, koje su sastavljene od kopolimera mlečna kiselina-glikolna kiselina i leuprolid acetata), i poli-D-(-)-3-hidroksibuternu kiselinu.
Formulacije koje sadrže inhibitore ROBO-2 za korišćenje pri in vivo primeni poželjno su sterilne. Ovo se lako postiže putem filtracije preko, primera radi, sterilnih filtracionih membrana, i korišćenjem drugih postupaka, poznatih stručnjaku u ovoj oblasti.
Ovde su, takođe, u nekim aspektima, obezbeđeni testovi, postupci i sistemi za utvrđivanje da li pojedinac ima hroničnu bubrežnu bolest ili je pre-disponiran za hroničnu bubrežnu bolest ili proteinuriju, na osnovu ekspresionih profila ili podataka o sekvenci ROBO2, kao biomarkera, koji je indikator hronične bolest bubrega ili pre-dispozicije za hroničnu bubrežnu bolest ili proteinuriju. Kako je ovde demonstrirano, ROBO2 je koristan kao biomarker za identifikovanje ispitanika koji ima hroničnu bubrežnu bolest ili je pod rizikom za hroničnu bubrežnu bolest ili proteinuriju, ili za praćenje efekata tretmana na progresiju hronične bolesti bubrega ili proteinurije.
Kako je ovde korišćen, naziv "biomarker" se odnosi na organski biomolekul, čije prisustvo u uzorku uzetom od ispitanika jednog fenotipskog statusa (npr., koji ima bolest) je diferencijalno ako se uporedi sa drugim fenotipskim statusom (npr., onaj koji nema bolest). Prisustvo biomarkera služi diferencijaciji između različitih fenotipskih statusa, ukoliko se računski utvrdi da je srednja vrednost ili medijana ekspresionog nivoa biomarkera u različitim grupama statistički značajna. Uobičajeni testovi za određivanje statističkog značaja uključuju, između ostalih, t-test, ANOVA, Kruskal-Wallis, Wilcoxon, Mann-Whitney i tzv. ʺodds ratioʺ. Biomarkeri, sami ili u kombinaciji, obezbeđuju mere relativnog rizika da α-ispitanik pripada jednom ili drugom fenotipskom statusu. Sami po sebi, oni su korisni kao markeri za bolest (dijagnostički markeri), kao markeri terapeutske efikasnosti leka (teranostici) i markeri toksičnosti leka.
Ekspresija ROBO2 za korišćenje u testovima koji su ovde opisani, može se detektovati bilo kojim pogodnim postupkom, uključujući detekciju nivoa proteina ili detekciju ekspresionih nivoa mRNA. Polipeptid ROBO2 može biti detektovan u bilo kom obliku, koji se može naći u biološkom uzorku, dobijenom od ispitanika, ili u bilo kom obliku, koji može proisteći iz manipulacije biološkim uzorkom (npr., kao posledica postupanja sa uzorkom). Modifikovani oblici ROBO2 mogu uključiti modifikovane proteine, koji su proizvod alelskih varijanti, ʺspliceʺ varijanti, post-translacijske modifikacije (npr., glikozilacija, proteolitičko cepanje (npr., fragmenti matičnog proteina), glikozilacija, fosforilacija, lipidacija, oksidacija, metilacija, cisteinilacija, sulfonacija, acetilacija i slični procesi), oligomerizacije, de-oligomerizacije (za razdvajanje monomere od multimernih oblika proteina), denaturacije i sličnih procesa.
Ovde opisani testovi mogu biti dizajnirani za detekciju svih formi ili naročitih oblika ROBO2. Kada je to poželjno, diferencijacija između različitih oblika ROBO2, npr., različitih izoformi, može se izvršiti korišćenjem detekcionih postupaka, zavisnih od fizičkih karakteristika koje se razlikuju među različitim oblicima, npr., različita molekulska težina, različita veličina molekula, prisustvo/odsustvo različitih epitopa, i slično.
Sledstveno tome, ovde su, u nekim aspektima, obezbeđeni testovi za dijagnostiku ispitanika koji boluje od hronične bolesti bubrega ili je pod rizikom od hronične bolesti bubrega ili proteinurije, pri čemu test uključuje merenje nivoa ROBO2 proteina ili nukleinske kiseline u biološkom uzorku, dobijenom od ispitanika, pri čemu kada je nivo ROBO2 u biološkom uzorku, dobijenom od ispitanika, na istom nivou ili je veći (npr., veći prema statistički značajnoj količini) od nivoa referentnog praga za ROBO2, ispitanik je verovatno pod rizikom za hroničnu bubrežnu bolest ili proteinuriju ili ima hroničnu bubrežnu bolest. Na primer, povećanje nivoa ROBO2 za više od oko 10%, ili za više od oko 20%, ili više od oko 30%, ili više od oko 40%, ili više od oko 50%, ili više od oko 60%, ili više, u poređenju sa nivoom referentnog praga za ROBO2. U nekim ostvarenjima, povećanje nivoa ROBO2 je najmanje za jednu standardnu devijaciju veće, ili za najmanje dve standardne devijacije, ili više, veće od medijane ili srednje vrednosti nivoa referentnog praga ROBO2. Takve medijane ili srednje vrednosti referentnih nivoa ROBO2 mogu biti dobijene, na primer, iz pet ili više uzoraka, uzetih od ispitanika koji nemaju hroničnu bubrežnu bolest ili proteinuriju, ili od pet ili više uzoraka dobijenih od istog ispitanika u različitim vremenskim tačkama.
U nekim ostvarenjima ovih testova, količina ROBO2, koja je izmerena u biološkom uzorku, upoređena je referentnim nivoom praga, ili sa referentnim biološkim uzorkom, kao što je biološki uzorak, dobijen od normalnog kontrolnog ispitanika, klasifikovanog prema starosti (npr., ispitanik, klasifikovan prema starosti, koji nije pod rizikom od hronične bolesti bubrega ili proteinurije), ili od zdravog ispitanika, npr., zdravog pojedinca.
U nekim ostvarenjima, testovi, sistemi i kitovi, kao što su ovde izloženi, takođe su od koristi za praćenje toka lečenja koje se primenjuje ispitaniku. Na primer, moguće je da se izmeri nivo ROBO2 u biološkom uzorku ispitanika u prvoj vremenskoj tački (npr., t1) i uporedi sa nivoom referentnog praga biomarkera ROBO2, i ukoliko je izmereni nivo ROBO2 isti ili veći od nivoa referentnog praga, ispitaniku se može primeniti odgovarajući terapeutski tretman ili režim, da bi se odložilo ili smanjilo razvijanje hronične bolesti bubrega ili proteinurije, kao š to je, npr., primera radi, povećanje vežbanja, smanjenje srčanog pritiska, prilagođavanje ishrane, itd., kao što je izloženo ovde u postupcima, nakon č ega se nivo panela proteina ROBO2 biomarkera može izmeriti u drugoj vremenskoj tački (npr., t2) i sledećim vremenskim tačkama (npr., t3, t4, t5, t5 ... itd.), i uporediti sa nivoima tROBO2 u jednoj ili više vremenskih tačaka (npr., u t1 ili u bilo kojoj sledećoj vremenskoj tački) ili sa nivoima referentnog praga ROBO2, da bi se utvrdilo da li je terapeutski tretman ili medicinski tretman ili režim tretmana za smanjivanje rizika, odlaganje ili redukovanje pojave hronične bolesti bubrega ili proteinurije, efektivan. U nekim takvim ostvarenjima, testovi, sistemi i kitovi, kao što su ovde izloženi, mogu biti korišćeni za praćenje terapeutskog tretmana kod simptomatskog ispitanika (npr., ispitanik za koga se zna da ima hroničnu bubrežnu bolest ili proteinuriju), pri čemu efektivni tretman može biti smanjenje ROBO2 kod ispitanika, ili, alternativno, testovi, sistemi i kitovi, kao što su ovde izloženi, mogu biti korišćeni za praćenje efekta profilaktičkog tretmana kod asimptomatskog pacijenta (npr., da bi se sprečila pojava hronične bolesti bubrega ili proteinurije kod ispitanika), pri čemu je, na primer, utvrđeno da je ispitanik pod rizikom od hronične bolesti bubrega ili proteinurije, u skladu sa, ovde izloženim postupcima, ili drugim, u struci poznatim postupcima, ili zbog hereditarnih razloga, primera radi.
Naziv "uzorak", kako je ovde korišćen, uopšteno se odnosi na bilo koji materijal koji sadrži nukleinsku kiselinu, ili DNA ili RNA, ili aminokiseline. Uopšteno, takav materijal će biti u obliku uzorka krvi, uzorka stolice, uzorka tkiva, ćelija, bakterija, histološkog odsečka ili bukalnog brisa. Uzorci mogu biti pripremljeni, na primer, uzorci mogu biti sveži, fiksirani, zamrznuti ili potopljeni u parafin. Izraz "biološki uzorak", kako je ovde korišćen, odnosi se na ćeliju ili populaciju ćelija ili količinu tkiva ili tečnosti, uzetih od ispitanika. Najčešće se uzorak uzima od ispitanika, ali se izraz "biološki uzorak" može, isto tako, odnositi na ćelije ili tkiva, koji se analiziraju in vivo, t.j., bez izvlačenja iz ispitanika. Često će "biološki uzorak" sadržavati ćelije životinja, ali se naziv može, takođe, odnositi na ne-celularni biološki materijal, kao š to su necelularne frakcije krvi, pljuvačke ili urina, koji se mogu koristiti za merenje nivoa ekspresije gena. Biološki uzorci uključuju, ali bez ograničavanja na njih, biopsije tkiva, briseve, punu krv, plazmu, serum, urin, pljuvačku, kulturu ć elija ili cerebrospinalnu tečnost. Biološki uzorci, takođe, uključuju biopsije tkive i ćelijske kulture. Biološki uzorak ili uzorak tkiva može se odnositi na uzorak tkiva ili tečnosti, izolovan iz pojedinca, koji uključuje, ali ne ograničavajući se na njih, na primer, urin, krv, plazmu, serum, uzorak biopsije bubrega, stolicu, pljuvačku, spinalnu tečnost, pleuralnu tečnost, aspirate bradavice, limfnu tečnost, spoljne delove kože, uzorke respiratornog, intestinalnog i genitourinarnog trakta, suze, pljuvačku, mleko, ćelije (uključujući, ali bez oganičavanja na njih, ćelije krvi), tumore, organe i, takođe, uzorke konstituenata in vitro ćelijske kulture. U nekim ostvarenjima, kada se dobije uzorak urina, uzorak urina se centrifugira, da bi se istaložile bilo koje bubrežne ćelije, na kojima se mogu izvršiti, ovde opisani, testovi i postupci. U nekim ostvarenjima, uzorak je uzorak biopsije bubrega, kao što je iglena biopsija srži bubrega ili njegovog dela, kao š to je uzorak podocita. Pored toga, korišćeni su uzorci aspirata, dobijeni tankom iglom. U nekim ostvarenjima, biološki uzorci se mogu pripremiti, na primer, biološki uzorci mogu biti sveži, fiksirani, zamrznuti ili uronjeni u parafin. Uzorak se može dobiti uzimanjem uzorka ćelija od ispitanika, ali se, isto tako, može dobiti korišćenjem ranije izolovanih ćelija (npr., izolovanih od strane druge osobe), ili izvođenjem, ovde opisanih, postupaka in vivo.
Izraz "ekspresija", kako je ovde korišćen, odnosi se, naizmenično, na ekspresiju polipeptida ili proteina ili na ekspresiju polinukleotida ili ekspresiju gena. Ekspresija se, isto tako, odnosi na ekspresiju pre-translacionih modifikovanih i post-translaciono modifikovanih proteina, kao i na ekspresiju molekula pre-mRNA, alternativno upletenih i zrelih molekula mRNA. Ekspresija polinukleotida se može utvrditi, primera radi, merenjem proizvodnje molekula RNA transkripta, na primer, nivoa transkripata glasničke RNA (mRNA). Ekspresija proteina ili polipeptida može se utvrditi, na primer, posredstvom imuno-testa, uz korišćenje jednog ili više antitela, koji se vezuju sa polipeptidom. Izraz "kodirati", kada se primeni na polinukleotide, odnosi se na polinukleotid, za koji se navodi da "kodira" polipeptid ili protein, ukoliko on, u svom nativnom stanju ili kada se podvrgne manipulaciji putem postupaka, dobro poznatih stručnjacima u ovoj oblasti, može biti transkribovan da proizvodi RNA, što može dovesti do translacije u aminokiselinsku sekvencu, da bi se proizveo polipeptid i/ili njegov fragment. Antisens lanac je komplement takve nukleinske kiseline, a kodirajuća sekvenca može biti iz nje izvedena. Izraz "endogeno ekspresovan" ili "endogena ekspresija" odnosi se na ekspresiju genskog proizvoda na normalnim nivoima i pri normalnoj regulaciji za taj tip ćelija.
Detekcioni postupci, koji mogu biti korišćeni sa, ovde opisanim, testovima, postupcima i sistemima za određivanje nivoa ROBO2 proteina ili nukleinske kiseline u uzorku ili biološkom uzorku, uključuju optičke postupke, elektrohemijske postupke (tehnike voltametrije i amperometrije), mikroskopiju atomskih sila i radio-frekventne postupke, npr., multipolarna rezonantna spektroskopija. Optički postupci uključuju mikroskopiju, i konfokalnu i ne-konfokalnu, detekciju fluorescencije, luminiscencije, hemiluminiscencije, apsorbancije, reflektancije, transmitancije i birefringencije ili refraktivnog indeksa (npr.,rezonancija površinskog plazmona, elipsometrija, postupak rezonantnog ogledala, postupak ʺgrating coupler waveguideʺ ili interferometrija).
U ovim ostvarenjima, ovde opisanih, testova, postupaka i sistema, u kojima se utvrđuje koncentracija ROBO2 proteina, kao što je, na primer, nivo proteina sa SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 3, moguće je koristiti bilo koji proteomski pristup, koji je uopšteno poznat licima uobičajene stručnosti u ovoj oblasti, da bi se utvrdio nivo proteina biomarkera u biološkom uzorku. Merenje može biti ili kvantitativno ili kvalitativno, sve dotle dok je merenjem moguće utvrditi da li je nivo ROBO2 proteina u biološkom uzorku isti, veći ili niži od vrednosti referentnog praga za ROBO2 protein.
Izmereni nivo ROBO2 proteina može, u nekim ostvarenjima, biti primarno izmereni nivo ROBO2 proteina, kojim se meri količina samog ROBO2 proteina, kao na primer, putem detekcije broja molekula ROBO2 proteina u uzorku) ili on može, u nekim ostvarenjima, predstavljati sekundarno merenje ROBO2 proteina (merenje, iz koga se može, ali ne i neophodno, izvesti količina ROBO2 proteina, kao što je mera funkcionalne aktivnosti ili mera nukleinske kiseline, kao što je mRNA, koja kodira ROBO2 protein). Kvalitativni podaci se, takođe, mogu izvesti ili dobiti iz primarnih merenja.
U nekim ostvarenjima, ovde opisanih, testova i postupaka, nivoi ROB02 proteina se mogu utvrditi korišćenjem mernih tehnologija na bazi afiniteta. "Afinitet", kada se odnosi na antitelo, jeste naziv, koji je dobro razjašnjen u struci, i označava stepen ili jačinu vezivanja antitela za partnera u vezivanju, kao što je biomarker, kako je ovde opisan (ili njegov epitop).
Afinitet se može izmeriti i/ili ekspresovati na brojne načine, poznate u struci, koji uključuju, ali bez ograničavanja na njih, konstantu ravnoteže disocijacije (KDili Kd), prividnu konstantu ravnoteže disocijacije (KD. ili Kd’) i IC50(količina koja je potrebna za ispoljavanje 50%-tne inhibicije u kompetitivnom testu; ovde korišćen i sa oznakom "150"). Podrazumeva se da je, za potrebe ovog pronalaska, afinitet prosečni afinitet za datu populaciju antitela,koja se vezuju za epitop.
Tehnologija merenja na bazi afiniteta koristi molekul koji se specifično vezuje sa proteinom biomarkera koji se meri ("afinitetni reagens", kao što je antitelo ili aptamer), premda, isto tako, mogu biti korišćene druge tehnologije, kao š to su tehnologije na bazi spektroskopije (npr., matricom potpomognuta jonizacija laserskom desorpcijom – vreme leta, MALDI-TOF spektroskopija) ili testovi merenja bioaktivnosti (npr., testovi merenja mitogenosti faktora rasta). Tehnologije na bazi afiniteta, za korišćenje u, ovde opisanim, testovima i postupcima, mogu uključiti testove na bazi antitela (imuno-testovi) i testove koji koriste aptamere (molekuli nukleinske kiseline koji se specifično vezuju sa drugim molekulima), kao š to je ELONA. Pored toga, takođe su razmotreni testovi koji koriste i antitela i aptamere (npr., format sendvič testa koji koristi antitelo za prihvatanje i aptamer za detekciju). U struci je, takođe, poznat š iroki varijetet testova na bazi afiniteta.
Testovi na bazi afiniteta obično koriste najmanje jedan epitop, dobijen iz proteina biomarkera, t.j., ROBO2, a mnogi formati testova na bazi afiniteta koriste više od jednog epitopa (npr., u testove ʺsendvičʺ formata uključena su dva ili više epitopa; najmanje jedan epitop se koristi za prihvatanje proteina biomarkera, a najmanje jedan različiti epitop se koristi za detekciju markera).
Testovi na bazi afiniteta mogu biti u formatu kompetitivnih testova ili u formatu direktne reakcije, mogu koristiti formate sendvič-tipa, i, dalje, mogu biti heterogeni (npr., uz korišćenje č vrstih podloga) ili homogeni (npr., mogu se odvijati u jednoj fazi) i/ili koristiti imunoprecipitaciju. Mnogi testovi uključuju korišćenje obeleženog afinitetnog reagensa (npr., antitelo, polipeptid ili aptamer); obeleživači mogu, primera radi, biti enzimski, fluorescentni, hemiluminiscentni, radioaktivni molekuli ili molekuli boja. Takođe su poznati testovi koji amplifikuju signale iz proba; čiji primeri su testovi koji koriste biotin i avidin, i enzimom obeleženi i posredovani imuno-testovi, kao š to su ELISA i ELONA testovi. Na primer, koncentracije biomarkera u uzorcima bioloških tečnosti mogu se izmeriti putem LUMINEX® testa ili ELISA testa. Bilo biomarker, bilo reagens koji je specifičan za biomarker, može se vezati za površinu, a nivoi se mogu izmeriti direktno ili indirektno.
U nekim ostvarenjima, ovde opisanih, testova, postupaka i sistema, koncentracije ROBO2 proteina mogu se izmeriti korišćenjem tehnologije merenja imuno-testova na bazi afiniteta.
Tehnologije imuno-testova mogu uključiti bilo koju tehnologiju imuno-testova, pomoću koje je moguće kvantitativno ili kvalitativno izmeriti koncentraciju ROB02 proteina u biološkom uzorku. Pogodne tehnologije imuno-testova uključuju, ali ne ograničavajući se na njih, radioimuno-test, ELISA test (enzim-vezani imuno-sorbent test), "sendvič" imuno-testove, imuno-radiometrijske testove, imuno-difuzione testove, imuno-testove in situ (uz korišćenje koloidnog zlata, enzimskog ili radioizotopskog obeleživača, na primer), ʺwestern blotʺ analizu, imunoprecipitacije, imunofluorescentne testove, testove imunoelektroforeze, fluoro-imuno testove (FiA), imuno-radiometrijski test (IRMA), imuno-enzimometrijski test (IEMA), imunoluminiscentni test i imunofluorescentni test (Madersbacher S, Berger P. Antibodies and immunoassays. Methods 2000;21:41-50), hemiluminiscentni test, imuno-PCR i ʺwestern blotʺ test. Isto tako, testovi na bazi aptamera, kojima je moguće kvantitativno ili kvalitativno izmeriti koncentraciju biomarkera u biološkom uzorku, mogu biti korišćeni u, ovde opisanim, testovima, postupcima i sistemima. Uopšteno, aptamerima se mogu zameniti antitela u gotovo svim formatima imuno-testova, premda aptameri omogućuju dodatne formate testova (kao š to je amplifikacija vezanih aptamera, uz korišćenje tehnologije amplifikacije nukleinske kiseline, kao što je PCR (U.S. Pat. No. 4,683,202) ili izotermalne amplifikacije sa složenim prajmerima (U.S. Pat. No.6,251,639 i 6,692,918).
U nekim ostvarenjima, ovde opisanih, testova, postupaka i sistema, u kojima se koncentracije ROBO2 proteina mere korišćenjem merne tehnologije imuno-testova na bazi afiniteta, imuno-test se vrši merenjem obima interakcije protein/antitelo iz interakcije biomarker/antitelo. Može biti korišćen bilo koji poznati postupak imuno-testa.
U nekim ostvarenjima, vezujući partner, npr., antitelo ili ligand, koji se vezuju za ROBO2 protein u testu vezivanja, poželjno je specifični obeleženi vezujući partner, ali nije neophodno da bude antitelo. Vezujući partner je, uglavnom, sam obeležen, ali alternativno, može biti detektovan posredstvom sekundarne reakcije u kojoj se proizvodi signal, npr., iz druge obeležene supstance.
Sledstveno tome, antitelo koje se specifično vezuje za ROBO2 protein može biti korišćeno u testovima, postupcima i sistemima, koji su ovde opisani, da bi se odredilo prisustvo i/ili količina ROBO2 proteina u biološkom uzorku, što se može iskoristiti da se utvrdi da li je koncentracija ROBO2 proteina, koja je prisutna u dijagnostičkom uzorku, povećana ili smanjena. Takva antitela se mogu razviti bilo kojim od postupaka, koji su u oblasti imunodijagnostike dobro poznati. Antitela mogu biti antitela prema ROBO2 proteinu, prema bilo kojem biološki relevantnom stanju proteina. Sledstveno tome, primera radi, oni bi mogli biti razvijeni prema neglikozilovanom obliku ROBO2 proteina, koji u organizmu postoji u glikozilovanom obliku, ili prema peptidu koji nosi odgovarajući epitop ROBO2 proteina.
U nekim ostvarenjima ovih testova, postupka i sistema, može biti korišćena amplifikovana forma testa, pri čemu se pojačani "signal" proizvodi iz relativno niske koncentracije proteina koji se detektuje. Jedna posebna forma amplifikovanog imuno-testa je pojačani hemiluminiscentni test. Na primer, antitelo je obeleženo peroksidazom rena, uz participiranje u hemiluminiscentnoj reakciji sa luminolom, supstratom peroksida i jedinjenjem koje pojačava intenzitet i trajanje emitovanog svetla, obično 4-jodofenolom ili 4-hidroksicimetnom kiselinom.
U nekim ostvarenjima ovih testova, postupka i sistema, može biti korišćen amplifikovani imuno-test, koji uključuje imuno-PCR. U ovoj tehnici, antitelo se kovalentno vezuje sa molekulom proizvoljne DNA, koja sadrži PCR prajmere, pri čemu se DNA sa antitelom vezanim za nju, amplifikuje putem reakcije lančane polimerizacije. Vidi, E. R. Hendrickson et al., Nucleic Acids Research 23: 522-529 (1995).
Sledstveno tome, u svim ostvarenjima testova, postupka i sistema, koji su ovde opisani, koncentracija ROBO2 proteina se može odrediti korišćenjem protein-vezujućeg sredstva, koje se ovde, takođe, označava kao "protein-vezujući entitet" ili može biti korišćen "afinitetni reagens", a naročito antitela. Na primer, afinitetni reagensi, posebno, antitela, kao što su anti-biomarkerska antitela, mogu biti korišćeni u imuno-testu, posebno u ELISA testu (enzimvezani imuno-sorbent test). U ostvarenjima u kojima se može izmeriti koncentracija proteinskog biomarkera u biološkom uzorku koriste se postupci, koji su opštepoznati u struci, a uključuju, primera radi, ali bez ograničavanja na njih, za izoformu proteina specifično hemijsko ili enzimsko cepanje izoformi proteina, imuno-bloting, imunohistohemijske analize, ELISA test i masenu spektrometriju.
U nekim ostvarenjima testova, postupaka i sistema, koji su ovde opisani, koncentracije ROBO2 proteina se mere korišćenjem "enzim-vezanog imuno-sorbent testa (ELISA)". ELISA je tehnika za detekciju i merenje koncentracije antigena uz korišćenje obeleženog (npr., vezanog sa enzimom) oblika antitela. Postoje različite forme ELISA testova, koji su stručnjacima u ovoj oblasti dobro poznate. U struci poznati, standardni postupci za ELISA testove opisani su u "Methods in Immunodiagnosis", 2. izdanje, Rose i Bigazzi, eds. John Wiley & Sons, 1980; Campbell et al., "Methods and Immunology", W. A. Benjamin, Inc., 1964; i Oellerich, M.1984, J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 22:895-904.
U nekim ostvarenjima testova, postupaka i sistema, koji su ovde opisani, koncentracije ROBO2 proteina se mere korišćenjem sendvič ELISA testa. U "sendvič ELISA testu", antitelo (npr., anti-enzimsko antitelo) se vezuje za čvrstu fazu (t.j., mikrotitarsku ploču) i izlaže biološkom uzorku koji sadrži antigen (npr., enzim). Čvrsta faza se, nakon toga, ispire, da bi se odstranio nevezani antigen. Obeleženo antitelo (npr., vezano sa enzimom), se nakon toga, vezuje za vezani antigen (ukoliko je prisutan), čime se formira sendvič antitelo-antigen-antitelo. Sledstveno tome, koristeći ovaj postupak, prvo antitelo prema ROBO2 proteinu se vezuje za čvrstu fazu, kao š to je plastična mikrotitarska ploča, i inkubira se sa uzorkom i sa obeleženim drugim antitelom, specifičnim za ROBO2 protein koji se analizira. Primeri enzima koji se mogu vezivati za antitelo su: alkalna fosfataza, peroksidaza rena, luciferaza, ureaza i B-galaktozidaza. Antitelo vezano sa enzimom reaguje sa supstratom, da bi se proizveo obojeni reakcioni proizvod koji može biti izmeren.
U nekim ostvarenjima testova, postupaka i sistema, koji su ovde opisani, koncentracije ROBO2 proteina se mere korišćenjem testa vezivanja antitela ili kompetitivnog ELISA testa. U "kompetitivnom ELISA testa", antitelo se inkubira sa sa uzorkom koji sadrži antigen (t.j., enzim). Mešavina antigen-antitelo, nakon toga, dolazi u kontakt sa čvrstom fazom (npr., mikrotitarska ploča), koja je presvučena antigenom (t.j., enzimom). Što je više antigena prisutno u uzorku, manje slobodnog antitela će biti raspoloživo za vezivanje sa čvrstom fazom. Obeleženo (npr., vezano sa enzimom) sekundarno antitelo se, nakon toga, dodaje čvrstoj fazi, da bi se utvrdila količina primarnog antitela, vezanog za čvrstu fazu. Sledstveno tome, u nekim takvim ostvarenjima, biološki test uzorak se ostavi da se vezuje za čvrstu fazu, a antitelo protiv ROBO2 proteina (npr., antitela koja se specifično vezuju sa ROBO2 proteinom) može se dodati i ostaviti da se vezuje. Nakon otklanjanja nevezanog materijala ispiranjem, količina antitela, vezanog za čvrstu fazu, određuje se korišćenjem obeleženog sekundarnog antitela, koje je usmereno protiv prvog.
U nekim ostvarenjima ovih testova, postupka i sistema, obeleživač je, poželjno, enzim. Supstrat za enzim može biti, na primer, sredstvo koje obrazuje boju, fluorescentno ili hemiluminiscentno sredstvo.
U nekim ostvarenjima, ovde opisanih, testova, postupaka i sistema, koncentracije ROBO2 proteina se utvrđuju korišćenjem imunohistohemije. U "imunohistohemijskom testu", odsečak tkiva se testira na prisustvo specifičnih proteina, putem izlaganja tkiva antitelima koja su specifična za protein koji se podvrgava testu. Antitela se, nakon toga, vizuelizuju bilo kojim od brojnih postupaka, da bi se odredilo prisustvo i količina prisutnog proteina. Primeri postupaka, koji se koriste za vizuelizovanje antitela, su, primera radi, postupci posredstvom enzima vezanih za antitela (npr., luciferaza, alkalna fosfataza, peroksidaza rena ili betagalaktozidaza) ili hemijski postupci (npr., DAB/substrat hromogen). Uzorak se, nakon toga, analizira mikroskopski, najpoželjnije uz pomoć svetlosne mikroskopije uzorka obojenog bojom koja je detektibilna u vidljivom spektru, uz korišćenje bilo kog od brojnih postupaka bojenja i reagenasa, koji su poznati stručnjacima u ovoj oblasti.
U nekim ostvarenjima testova, postupaka i sistema, koji su ovde opisani, koncentracije ROBO2 proteina se određuju korišćenjem radio-imuno testova. Radio-imuno test je postupak za detekciju i merenje koncentracije antigena, t.j., ROBO2, uz korišćenje obeleženog (npr., radioaktivnim ili fluorescentnim obeleživačem) oblika antigena. Primeri radioaktivnih obeleživača za antigene uključuju: 3H, 14C i 125I. Koncentracija ROBO2 u biološkom uzorku se meri dovođenjem u kompeticiju ROBO2 u biološkom uzorku sa obeleženim (npr., radioaktivnim obeležiivačem) ROBO2 za vezivanje za antitelo prema ROBO2. Da bi se obezbedilo kompetitivno vezivanje između obeleženog ROBO2 i neobeleženog ROBO2, obeleženi ROBO2 je prisutan u koncentraciji, koja je dovoljna da se zasite vezujući položaji antitela. Što je veća koncentracija ROBO2 u uzorku, manja je koncentracija obeleženog ROBO2 koji će se vezivati za antitelo.
U nekim ostvarenjima testova, postupaka i sistema, koji su ovde opisani, koncentracije ROBO2 proteina se mere korišćenjem imuno-radiometrijskog testa (IRMA). IRMA je imuno-test, u kome je reagens antitelo obeleženo radioaktivnim obeleživačem. IRMA zahteva proizvodnju multivalentnog konjugata antigena, korišćenjem postupaka kao što je konjugovanje sa proteinom, npr., serumskim albuminom zeca (RSA). Multivalentni konjugat antigena mora imati najmanje 2 antigena ostatka po molekulu, a antigeni ostaci moraju biti dovoljno razdvojeni da bi se omogućilo vezivanje najmanje dva antitela za antigen. Na primer, u IRMA testu multivalentni konjugat antigena može se vezivati za čvrstu površinu, kao što je plastična kuglasta površina. Neobeleženi "uzorak" antigena i antitelo prema antigenu koji je obeleženo radioaktivnim obeleživačem dodaju se u test epruvetu koja sadrži multivalentnim konjugatom antigena presvučenu kuglastu površinu. Antigen u uzorku ulazi u kompeticiju sa multivalentnim konjugatom antigena za vezujuće položaje antitela za antigen. Nakon odgovarajućeg inkubacionog perioda, nevezani reaktanti se odstranjuju putem ispiranja i određuje se količina radioaktivnosti čvrste faze. Količina vezanog radioaktivnog antitela je obrnuto proporcionalna koncentraciji antigena u uzorku.
Ostale tehnike koje se mogu koristiti za detekciju nivoa ROBO2 proteina u biološkom uzorku mogu se izvesti prema prioritetima izvršioca u praksi, a na osnovu tekućeg pronalaska, i prema vrsti biološkog uzorka (t.j., plazma, urin, uzorak tkiva, itd.). Jedna takva tehnika je Western blotting (Towbin et at., Proc. Nat. Acad. Sci. 76:4350 (1979)), pri čemu se pogodno tretirani uzorak obrađuje na SDS-PAGE gelu, pre nego što se prenese na čvrstu podlogu, kao što je nitrocelulozni filter. Detektibilno obeležena anti-ROBO2 antitela ili protein-vezujući molekuli mogu, zatim, biti korišćeni za procenu nivoa ROBO2 proteina, pri čemu intenzitet signala iz detektibilnog obeleživača odgovara količini ROBO2 proteina. Količinski nivoi prisutnog ROBO2 proteina, mogu, takođe, biti kvantitativno određeni, na primer, posredstvom denzitometrije.
U nekim ostvarenjima testova, postupaka i sistema, koji su ovde opisani, koncentracije ROBO2 proteina se mere korišćenjem masene spektrometrije, kao što je MALDI/TOF (ʺtime-of-flightʺ), SELDI/TOF, tečna hromatografija-masena spektrometrija (LC-MS), gasna hromatografija-masena spektrometrija (GC-MS), tečna hromatografija visokih performansi-masena spektrometrija (HPLC-MS), kapilarna elektroforeza-masena spektrometrija, nuklearno-magnetno rezonantna spektrometrija ili tandem masena spektrometrija (npr., MS/MS, MS/MS/MS, ESI-MS/MS, itd.). Vidi, na primer, U.S. Patent Application No: 20030199001, 20030134304, 20030077616.
U nekim takvim ostvarenjima, ove metodologije se mogu kombinovati sa aparatima, kompjuterskim sistemima i medijima, da bi se dobio automatizovani sistem za određivanje koncentracije ROBO2 proteina u biološkom uzorku i analiza kojom će se dobiti izveštaj koji se može odštampati, a kojim se utvrđuje, primera radi, nivo ROBO2 proteina u biološkom uzorku. U nekim slučajevima, određivanje nivoa ROBO2 se vrši daleko od determinacijskih i komparativnih modula.
Postupci masene spektrometrije su dobro poznati u struci i koriste se za kvantitativno određivanje i/ili identifikovanje biomolekula, kao što su proteini (vidi, npr., Li et al. (2000) Tibtech 18:151-160; Rowley et al. (2000) Methods 20: 383-397; i Kuster i Mann (1998) Curr. Opin. Structural Biol. 8: 393-400). Pored toga, razvijeni su postupci masene spektrometrije koji omogućuju najmanje parcijalno de novo sekvenciranje izolovanih proteina. Chait et al., Science 262:89-92 (1993); Keough et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96:7131-6 (1999); prikazan u Bergman, EXS 88:133-44 (2000).
U određenim ostvarenjima, korišćen je jonski spektrofotometar gasne faze. U drugim ostvarenjima, za analiziranje uzorka je korišćena tehnika masene spektrometrije putem laserske desorpcije/jonizacije. Moderna masena spektrometrija posredstvom laserske desorpcije /jonizacije ("LDI-MS") može se praktikovati u dve glavne varijacije: matricom potpomognuta masena spektrometrija putem laserske desorpcije/jonizacije ("MALDI") i površinski pojačana laserska desorpcija/jonizacija ("SELDI"). U MALDI tehnici, analit se meša sa rastvorom koji sadrži matriks, a kap tečnosti se postavlja na površinu supstrata. Rastvor matriksa se, nakon toga, ko-kristališe sa biološkim molekulima. Supstrat se unosi u maseni spektrometar. Laserska energija se usmerava prema površini supstrata, gde se vrši desorpcija i jonizacija bioloških molekula, bez njihove fragmentacije u značajnoj meri. Vidi, npr., U.S. Pat. No. 5,118,937 (Hillenkamp et al.) i U.S. Pat. No.5,045,694 (Beavis & Chait).
U SELDI testu, površina supstrata se modifikuje tako da ona predstavlja aktivnog učesnika u procesu desorpcije. U jednoj varijanti, površina se derivatizuje sa adsorbentnim i/ili prihvatnim reagensima, koji se selektivno vezuju sa proteinom od značaja. U drugoj varijanti, površina se derivatizuje sa molekulima koji apsorbuju energiju, pri čemu ne dolazi do desorpcije kada se izloži laserskom udaru. U drugoj varijanti, površina se derivatizuje sa molekulima koji se vezuje sa proteinom od značaja, koji sadrži fotolitičku vezu, koja se razbija nakon aplikovanja laserske energije. U svakom od ovih postupaka, derivatizirajuće sredstvo je, uopšteno, lokalizovano na specifičnoj poziciji na površini supstrata na koju se postavlja uzorak. Vidi, npr., U.S. Pat. No. 5,719,060 i WO 98/59361. Dva postupka se mogu kombinovati, primera radi, korišćenjem, SELDI afinitetne površine za prihvatanje analita i dodavanjem tečnosti koja sadrži matriks za vezani analit, da bi se obezbedio materijal koji apsorbuje energiju.
Za dodatne informacije koje se tiču masenih spektrometara, vidi, npr., Principles of Instrumental Analysis, 3. izdanje, Skoog, Saunders College Publishing, Philadelphia, 1985; i Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 4. izdanje, Vol. 15 (John Wiley & Sons, New York 1995), pp.1071-1094.
Utvrđivanje nivoa ROBO2 proteina obično će zavisiti od detekcije intenziteta signala. Sledstveno tome, time se, zauzvrat, može odražavati količina i karakter polipeptida, koji je vezan za supstrat. Na primer, u određenim ostvarenjima, jačina signala pik vrednosti iz spektra prvog uzorka i drugog uzorka može se uporediti (npr., vizuelno, posredstvom kompjuterske analize, itd.), da bi se odredile relativne količine određenih biomolekula. Softverski programi, kao š to je program Biomarker Wizard (Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, Calif.), mogu se koristiti da bi se pomoglo u analiziranju masenih spektara. Maseni spektrometri i njihovi posupci dobro su poznati stručnjacima u ovoj oblasti.
U nekim ostvarenjima testova, postupaka i sistema, koji su ovde opisani, koncentracije ROBO2 proteina se mere korišćenjem tehnika gel elektroforeze, posebno SDS-PAGE (natrijum dodecilsulfat poliakrilamid gel elektroforeza), posebno dvo-dimenzionalne PAGE (2D-PAGE), poželjno dvo-dimenzionalne SDS-PAGE (2D-SDS-PAGE). U skladu sa određenim primerom, test se bazira na 2D-PAGE, naročito, uz korišćenje imobilisanih pH gradijenata (IPG-i) sa rasponom pH, koji je poželjno pH 4-9.
U nekim ostvarenjima testova, postupaka i sistema, koji su ovde opisani, koncentracije ROBO2 proteina se utvrđuju korišćenjem tehnika gel elektroforeze, a naročito, korišćenjem prethodno-pomenutih tehnika, kombinovanih sa drugim tehnikama separacije proteina, posebno postupaka, koji su stručnjacima u ovoj oblasti poznati, naročito, hromatografije i/ili tehnika isključivanja prema veličini.
U nekim ostvarenjima testova, postupaka i sistema, koji su ovde opisani, koncentracije ROBO2 proteina se mere korišćenjem rezonantnih tehnika, posebno, površinske rezonancije plazme.
U nekim ostvarenjima testova, postupaka i sistema, koji su ovde opisani, koncentracije ROBO2 proteina se utvrđuju korišćenjem biočipa proteina. Biočip uopšteno sadrži čvrsti supstrat koji poseduje suštinski planarnu površinu, za koju se vezuje reagens za prihvatanje (npr., adsorpcijski ili afinitetni reagens). Često, površina biočipa sadrži mnoštvo lokacija prema kojima se može usmeravati, i koje imaju vezani reagens za prihvatanje. Biočip može, isto tako, uključiti vezani reagens za prihvatanje, koji služi kao kontrola. Proteinski biočipovi su biočipovi koji su adaptirani za prihvatanje polipeptida. Mnogi proteinski biočipovi su opisani u struci. Oni uključuju, na primer, proteinske biočipove opisane od strane Ciphergen Biosystems, Inc. (Fremont, Kalifornija), Zyomyx (Hayward, Kalifornija), Invitrogen (Carlsbad, Kalifornija), Biacore (Uppsala, Švedska) i Procognia (Berkshire, VB). Primeri takvih proteinskih biočipova opisani su u sledećim patentima ili publikovanim patentnim aplikacijama: U.S. Pat. No. 6,225,047 (Hutchens & Yip); U.S. Pat. No. 6,537,749 (Kuimelis i Wagner); U.S. Pat. No.
6,329,209 (Wagner et al.); PCT International Publication No. WO 00156934 (Englert et al.); PCT International Publication No. WO 031048768 (Boutell et al.) i U.S. Pat. No. 5,242,828 (Bergstrom et al.).
Nivoi ili vrednosti referentnog praga za koncentracije ROBO2 proteina, koji su korišćeni za poređenje sa koncentracijom ROBO2 proteina kod ispitanika, mogu varirati, u zavisnosti od ovde opisanog, aspekta ili ostvarenja, koji su praktično primenjeni, kao što će tokom ove specifikacije i u nastavku biti razjašnjeno. Vrednost referentnog praga može se bazirati na vrednosti pojedinačnog uzorka, kao što je, primera radi, vrednost koja je dobijena iz biološkog uzorka ispitanika koji se testira, ali u ranijim vremenskim tačkama (npr., u prvoj vremenskoj tački (t1), npr., prvi izmereni nivo biomarkera, ili u drugoj vremenskoj tački (t2), npr.,). Vrednost referentnog praga može, takođe, biti bazirana na pulu uzoraka, na primer, vrednost(vrednosti) dobijena iz uzoraka grupe ispitanika koji se testiraju. Primera radi, u nekim ostvarenjima, vrednosti referentnog praga za ROBO2 protein bazirane su na izmerenim 50%-tnim vrednostima (npr., medijana) ROBO2 proteina, izmerenim kod ispitanika, za koje se zna da imaju hroničnu bubrežnu bolest ili proteinuriju. Na primer, ispitanici u prvih 50% vrednosti (npr., vrednosti koje su iste ili više od vrednosti medijane) za ROBO2 protein mogu se odabrati kao ispitanici čije vrednosti ukazuju na rizik od dobijanja hronične bolest bubrega ili proteinurije. Referentna vrednost(vrednosti) može, takođe, biti, bazirana na pulu uzoraka, uz uključivanje ili isključivanje uzorka(uzoraka) koji se testiraju. Referentna vrednost može biti bazirana na velikom broju uzoraka, primera radi, iz populacije zdravih ispitanika u grupama hronološki klasifikovanim prema starosti, ili od ispitanika koji ne boluju ili nisu pod rizikom od hronične bolesti bubrega ili proteinurije. U nekim ostvarenjima, referentna vrednost može biti za najmanje jednu, češće najmanje dve, standardne devijacije iznad srednje vrednosti ili medijane iz bilo kog od ovih testova ili u odnosu na prethodno-utvrđene srednje vrednosti ili medijane.
Za procenu rizika ispitanika da će verovatno iskusiti ili oboleti od hronične bolesti bubrega ili proteinurije putem testova, postupaka i sistema, kao što su ovde izloženi, "vrednost referentnog praga" je obično prethodno-ustanovljeni nivo referentnog praga, kao što je medijana vrednosti ROBO2 proteina u urinu, serumu ili krvi, dobijenim u populaciji zdravih ispitanika, koji se nalaze u grupi, koja je hronološki klasifikovana prema starosti, i koja je podudarna sa hronološkom dobi testiranog ispitanika. Kako je ranije naznačeno, u nekim situacijama, referentni uzorci mogu, takođe, biti razvrstani po rodu i/ili razvrstani prema etničkoj pripadnosti. U nekim ostvarenjima, vrednost referentnog praga za ROBO2 protein jeste nivo vrednosti medijane za taj biomarker, u datoj vrsti biološkog uzorka, npr., urin, krv, serum, u grupi ispitanika iste etničke pripadnosti, npr., bele rase, crne rase, hispano porekla, azijskog porekla i azijsko-indijskog porekla, pakistanskog porekla, srednje istočnog porekla i/ili porekla sa pacifičkih ostrva.
Za procenu rizika ispitanika da će verovatno iskusiti ili oboleti od hronične bolesti bubrega ili proteinurije, posredstvom testova, postupaka i sistema, kao što su ovde izloženi, vrednost referentnog praga za ROBO2 protein može biti prethodno-utvrđeni nivo, kao š to je srednja vrednost ili vrednost medijane za nivoe, dobijene od populacije zdravih ispitanika, koji se nalaze u grupi, koja je hronološki klasifikovana prema starosti, i koja je podudarna sa hronološkom dobi testiranog ispitanika. Alternativno, nivo referentnog praga za ROBO2 protein može biti referentni nivo za određenog ispitanika prema istoriji bolesti, koji je izveden iz uzorka, dobijenog od istog ispitanika, ali u ranijoj vremenskoj tački, i/ili kada ispitanik nije bio pod rizikom od hronične bolesti bubrega ili proteinurije. U nekim slučajevima, nivo referentnog praga za ROBO2 protein može biti referentni nivo ROBO2 proteina iz istorija bolesti, za određenu grupu ispitanika, od kojih su svi imali hroničnu bubrežnu bolest ili proteinuriju, zbog, primera radi, šećerne bolesti.
U nekim ostvarenjima, zdravi ispitanici su odabrani kao kontrolni ispitanici. U nekim ostvarenjima, kontrole su kontrolni ispitanici razvrstani prema starosti. Zdravi ispitanik može biti korišćen da bi se dobio nivo referentnog praga za ROBO2 protein u, primera radi, uzorku urina ili seruma. "Zdravi" ispitanik ili uzorak "zdravog" ispitanika ili pojedinca, kako je ovde korišćen, jeste istovetan onom koji se od strane stručnog lica u ovoj oblasti, uobičajeno podrazumeva. Na primer, mogu se koristiti postupci, koji su uopšteno poznati u oblasti evaluacije bubrežne funkcije, kao što su ovde opisani postupci, da bi se odabrali kontrolni ispitanici kao zdravi ispitanici za dijagnostiku i postupke tretmana, koji su ovde opisani. U nekim ostvarenjima, ispitanici dobrog zdravstvenog stanja bez znakova ili simptoma koji ukazuju na hroničnu bubrežnu bolest, mogu biti uzeti kao zdravi kontrolni ispitanici. Ispitanici su evaluirani na osnovu obimnih procena, koje sačinjavaju: istorija bolesti, porodična anamneza, fizikalni pregled i ispitivanja bubrežne funkcije od strane kliničara i laboratorijski testovi. Primeri ispitivanja hronične bolesti bubrega i/ili proteinurije uključuju, ali bez ograničvanja na njih, određivanje koncentracije specifičnih proteina ili molekula u uzorku urina, krvi ili seruma, kao š to su, na primer, albumin, kalcijum, holesterol, kompletna krvna slika (KKS), elektroliti, magnezijum, fosfor, kalijum, natrijum ili bilo koja njihova kombinacija; testovi za određivanje, na primer, klirensa kreatinina, koncentracije kreatinina; BUN-a (azota uree u krvi ili ʺblood urea nitrogenʺ); ispitivanja putem korišćenja specifičnih tehnika ili procedura, kao što je CT snimak abdomena, MRI abdomena, ultrazvuk abdomena, biopsija bubrega, snimak bubrega, ultrazvučni snimak bubrega; ispitivanja posredstvom utvrđivanja promena u rezultatima analiza ili testova za eritropoetin, PTH; ispitivanje gustine kostiju ili vitamina D; ili posredstvom bilo koje kombinacije takvih postupaka i testova detekcije.
Populacije, razvrstane prema starosti (od kojih mogu biti dobijene referentne vrednosti) su, idealno, iste hronološke dobi kao ispitanik ili pojedinac koji se testira, ali su, isto tako, prihvatljive populacije približno podudarne prema starosti. Populacije, približno podudarne prema starosti, mogu biti unutar okvira od 1, 2, 3, 4 ili 5 godina u odnosu na hronološku dob testiranog pojedinca, ili mogu biti grupe različitih hronoloških dobi, koje obuhvataju hronološku starost pojedinca koji se ispituje.
Ispitanik, koji se upoređuje sa svojom "grupom podudarnom po hronološkoj dobi" se uopšteno odnosi na poređenje ispitanika sa grupom, razvrstanom prema hronološkoj dobi unutar raspona od 5 do 20 godina. Populacija, približno podudarna po starosti, može biti sa povećanjima od 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili 15, ili 20 godina (npr., grupa sa "povećanjem od 5 godina" može poslužiti kao izvor referentnih vrednosti za ispitanika starog 62 godine, koji bi mogao uključiti pojedince starosti 58-62 godina, pojedince starosti 59-63 godina, pojedince starosti 60-64 godina, pojedince starosti 61-65 godina ili pojedince starosti 62-66 godina). U široj definiciji, kada postoje veći razmaci između grupa različite hronološke dobi, primera radi, kada postoji nekoliko grupa različite hronološke dobi, raspoloživih za referentne vrednosti, a razmaci između grupa različitih hronoloških dobi premašaju, ovde opisana, povećanja od 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili 15, ili 20 godina, tada se "grupa podudarna po hronološkoj dobi" može odnositi na starosnu grupu koja je bliža hronološkoj dobi ispitanika (npr., kada su raspoložive referentne vrednosti za stariju starosnu grupu (npr., starosti 80-90 godina) i mlađu starosnu grupu (npr., starosti 20-30 godina), grupa podudarna po hronološkoj dobi za ispitanika starog 51 godinu, može koristi podatke mlađe starosne grupe (20-30 godina), koja je bliža hronološkoj dobi test ispitanika, kao referentni nivo.
Ostali faktori, koji bi se trebali razmotriti pri izboru kontrolnih ispitanika uključuju, ali bez ograničavanja na njih, vrstu, rod, etničku pripadnost, i tako dalje. Stoga, u nekim ostvarenjima, referentni nivo može biti prethodno-utvrđeni referentni nivo, kao što je srednja vrednost ili medijana koncentracija, dobijenih u populaciji zdravih kontrolnih ispitanika, koji su podudarni prema rodnoj pripadnosti u odnosu na rod testiranog ispitanika. U nekim ostvarenjima, referentni nivo može biti prethodno-utvrđeni referentni nivo, kao š to je srednja vrednost ili medijana koncentracija, koje su dobijene u populaciji zdravih kontrolnih ispitanika, koji su podudarni po etničkoj pripadnosti u odnosu na etničku pripadnost testiranog ispitanika (npr., bela rasa, crna rasa, hispansko poreklo, azijsko poreklo i azijsko-indijsko poreklo, pakistansko poreklo, srednje-istočno i poreklo sa pacifičkih ostrva). U ostalim ostvarenjima, i hronološka dob i rodna pripadnost populacije zdravih ispitanika su podudarni sa hronološkom dobi, odnosno rodnom pripadnošću testiranog ispitanika. U drugim ostvarenjima, i hronološka dob i etnička pripadnost populacije zdravih ispitanika su podudarni sa hronološkom dobi, odnosno etničkom pripadnošću testiranog ispitanika. U ostalim ostvarenjima, hronološka dob, rodna pripadnost i etnička pripadnost populacije zdravih kontrolnih ispitanika, su svi podudarni sa hronološkom dobi, rodnom pripadnošću, odnosno etničkom pripadnošću testiranog ispitanika.
Postupak upoređivanja nivoa ROBO2 proteina u biološkom uzorku, dobijenom od ispitanika, sa nivoom referentnog praga za ROB02 protein se može izvesti svakim odgovarajućim prikladnim načinom koji je poznat stručnoj javnosti. Uopšteno, vrednosti nivoa ROBO2 proteina, koje su određene primenom testova, postupaka i sistema koji su ovde opisani, mogu biti kvantitativne vrednosti (npr., kvantitativne vrednosti koncentracije, kao š to su miligrami ROBO2 proteina na litar (npr., mg/L) uzorka, ili apsolutna količina). Alternativno, vrednosti nivoa ROBO2 proteina mogu biti kvalitativne, što zavisi od mernih tehnika, tako da način poređenja vrednosti kod ispitanika i referentne vrednosti može da se razlikuje u zavisnosti od upotrebljene tehnike merenja. Na primer, poređenje se može izvesti razmatranjem brojčanih podataka, razmatranjem prikaza podataka (npr., razmatranjem grafičkih prikaza kao š to su grafikoni sa stubićima ili linijski grafikoni) i korišćenjem standardnih devijacija, na primer, od najmanje jedne, ili najmanje dve standardne devijacije. U jednom primeru, kada se za merenje nivoa ROB02 proteina koristi kvalitativan test, nivoi se mogu porediti vizuelnim poređenjem intenziteta obojenog proizvoda reakcije, ili poređenjem podataka denzitometrijskih ili spektrometrijskih merenja obojenih proizvoda reakcije (npr., poređenjem brojčanih podataka ili grafičkih podataka, kao što su karte grafikona sa stupcima, koje se dobijaju iz mernog uređaja).
Kao što je ovde opisano, nivoi ROBO2 proteina mogu da se izmere kvantitativno (apsolutne vrednosti) ili kvalitativno (relativne vrednosti). U nekim ostvarenjima, kvantitativne vrednosti nivoa ROBO2 proteina u biološkim uzorcima mogu ukazati na dati nivo (ili stepen) rizika za hroničnu bubrežnu bolest ili proteinuriju.
U nekim ostvarenjima, poređenje se izvodi da bi se odredila veličina razlike između vrednosti dobijenih za ispitanika i referentnih vrednosti (npr., poređenje razlike "tipa umnoška" ili procenta između izmerenih nivoa ROBO2 proteina dobijenih za ispitanika i referentne vrednosti praga za ROBO2 protein). Razlika tipa umnoška se može odrediti merenjem apsolutne koncentracije nivoa ROBO2 proteina i, poređenjem iste sa apsolutnom vrednošću prema referentnom pragu nivoa ROB02 proteina, ili se razlika umnoška može izmeriti preko relativne razlike između referentne vrednosti i vrednosti uzorka, pri čemu ni jedna vrednost nije mera apsolutne koncentracije, i/ili gde su obe vrednosti izmerene istovremeno. Na primer, ELISA testom se meri apsolutnog sadržaj ili koncentracija proteina iz koje se promena tipa umnoška određuje u poređenju sa apsolutnom koncentracijom istog proteina u referentnom materijalu. Kao drugi primer, nizovima testova antitela meri se relativna koncentracija iz koje se određuje promena tipa umnoška. Prema tome, veličina razlike između izmerene vrednosti i referentne vrednosti koja sugeriše ili ukazuje na određenu dijagnozu, zavisiće od postupka, primenjenog u praksi.
Kao što će biti jasno stručnim licima u ovoj oblasti, kada se za merenje nivoa ROBO2 proteina izvode merenja u replikatu, izmerene vrednosti za ispitanike se mogu porediti sa nivoima referentnog praga za ROBO2 protein i, uzeti u obzir merenja u replikatu. Merenja u replikatu se mogu uzeti u obzir ili korišćenjem srednje vrednosti ili korišćenjem medijane izmerenih vrednosti.
U nekim ostvarenjima, postupak poređenja može biti manuelan ili, poželjno može biti, automatizovan. Na primer, sredstvo za testiranje (kao š to je luminometar za merenje hemiluminiscentnih signala) može uključivati strujni instrument i softver, koji omogućuje upoređivanje vrednosti, dobijene od ispitanika, sa referentnom vrednošću za ROB02 protein. Alternativno, može biti korišćeno zasebno sredstvo (npr., digitalni kompjuter) za poređenje izmerenih koncentracija ROBO2 proteina kod jednog ili više ispitanika i nivoa referentnog praga za ROBO2 protein. Automatizovane sprave za poređenje mogu sadržavati memorisane referentne vrednosti za ROB02 protein, ili mogu porediti izmerene koncentracije ROBO2 proteina jednog ili više ispitanika sa nivoima referentnog praga za ROBO2 protein, koji su izvedeni iz referentnih uzoraka, koji su istovremeno izmereni.
U nekim ostvarenjima, ispitanik kod koga su ispitivane koncentracije ROBO2 proteina, raspoređuje se u jednu od dve ili više grupa (statusa), na osnovu rezultata testova, postupaka i sistema, koji su ovde opisani. Ovde opisani dijagnostički testovi, postupci i sistemi mogu se koristi za dobijanje podataka koji omogućuju klasifikaciju između brojnih različitih stanja.
Sledstveno tome, u nekim ostvarenjima, utvrđivanje da li je ispitanik pod visokim rizikom da razvije hroničnu bubrežnu bolest ili proteinuriju (status: od malog rizika prema visokom riziku) vrši se korišćenjem, ovde opisanih, dijagnostičkih testova, postupaka i sistema. Utvrđuju su količine ili obrasci biomarkera proteina ROBO2, koji se određuju kao karakteristike raznih rizičnih stanja. npr., visoki, srednji ili niski rizik. Rizik od razvijanja hronične bolesti bubrega ili proteinurije, utvrđuje se merenjem ROBO2 proteina samog ili u kombinaciji sa drugim poznatim biomarkerima, a nakon toga unošenjem dobijenih podataka u klasifikacijski algoritam ili njihovim poređenjem sa referentnom količinom (npr., ʺcut offʺ referentna količina, kako je ovde prikazana), koja je povezana sa određenim nivoom rizika.
U nekim ostvarenjima, ovde su obezbeđeni dijagnostički testovi, postupci i sistemi za određivanje ozbiljnosti ili stadijuma ili rizika od razvijanja hronične bolesti bubrega ili proteinurije kod ispitanika. Svaki stadijum hronične bolesti bubrega, na primer, ima karakterističnu količinu ROB02 proteina ili relativne količine ROBO2 protein. Stadijum bolesti se utvrđuje merenjem ROB02 proteina, samog ili u kombinaciji sa drugim biomarkerima, a nakon toga unošenjem dobijenih podataka u klasifikacijski algoritam ili njihovim poređenjem sa referentnom količinom i/ili obrascem biomarkera, koji su povezani sa određenim stanjem, npr., koliko brzo će ispitanik verovatno razviti hroničnu bolest bubrega ili proteinuriju. Na primer, moguće je da se izvrši klasifikacija između verovatnoće od razvijanja hronične bolesti bubrega ili proteinurije u okviru godinu dana (npr., loša prognoza) ili verovatnoće da ispitanik dobije hroničnu bubrežnu bolest ili proteinuriju u okviru narednih 5 godina.
Dodatna ostvarenja dijagnostičkih testova, postupaka i sistema, odnose se na komunikaciju između rezultata ili dijagnoza ili i jednog i drugog, i tehničkog osoblja, lekara ili pacijenata, primera radi. U određenim ostvarenjima, kompjuteri su korišćeni za komunikaciju između test rezultata ili dijagnoza ili i jednog i drugog, i zainteresovanih strana, npr., lekara i njihovih pacijenata. U nekim ostvarenjima, testovi se izvode ili se test rezultati analiziraju u državi ili pravnom sistemu koji se razlikuju od države ili pravnog sistema, kojima se, primera radi, šalju rezultati ili dijagnoze. U nekim ostvarenjima, rizik od dobijanja hronične bolesti bubrega ili proteinurije, baziran na nivoima ROBO2 proteina u biološkom uzorku, prenosi se ispitaniku, nakon što su dobijene koncentracije ili prognoza. Prognoza ili dijagnoza se ispitaniku mogu preneti preko lekara koji ga leči. Alternativno, prognoza ili dijagnoza se pacijentu mogu poslati putem e-maila ili se komunikacija sa ispitanikom može obaviti telefonom. Za slanje rezultata koji se tiču prognoze ili dijagnoze, može se koristiti kompjuter za slanje putem e-maila, ili telefona, ili preko interneta korišćenjem ʺsecure gatewayʺ log-in servisa za pacijenta. U određenim ostvarenjima, poruka koja sadrži rezultate prognostičkog ili dijagnostičkog testa može se preneti i isporučiti ispitaniku automatski, korišćenjem kombinacije kompjuterskog hardvera i softvera, koji će biti bliski tehničaru sa veštinama u telekomunikacijama. U određenim ostvarenjima testova, postupaka i sistema koji su ovde opisani, sprovođenje svih ili nekih od koraka postupaka, koji obuhvataju testiranje uzoraka, dijagnostiku bolesti i prenošenje test rezultata ili dijagnoza, može uključiti raznolike (npr., strane) nadležnosti.
U nekim ostvarenjima, ovde opisanih, dijagnostičkih testova, postupaka i sistema kvalifikovanja ili procene rizika od hronične bolesti bubrega ili proteinurije, testovi, postupci ili sistemi, dalje, uključuju upravljanje tretmanom ispitanika, na osnovu utvrđivanja rizika od razvijanja hronične bolesti bubrega ili proteinurije. Takvo upravljanje obuhvata akcije lekara ili kliničara, koje slede nakon određivanja rizika ispitanika da razvije hroničnu bubrežnu bolest ili proteinuriju. Na primer, ukoliko lekar postavi dijagnozu da je ispitanik pod rizikom od hronične bolesti bubrega ili proteinurije, tada može uslediti određeni režim tretmana. Pogodni režim tretmana može uključiti, bez ograničavanja na njih, program vežbanja pod nadzorom, kontrolu krvnog pritiska, praćenje unosa š ećera i/ili nivoa lipida i terapije lekovima. U nekim ostvarenjima, postavljanje dijagnoze rizika od razvijanja hronične bolesti bubrega ili proteinurije, može biti praćeno daljim ispitivanjem da li pacijent boluje od hronične bolesti bubrega ili pacijent boluje od srodne bolesti. Isto tako, ukoliko dijagnostički test daje nedovoljno uverljiv rezultat za rizik od pojave glavnog nepovoljnog stanja, mogu biti zahtevati dodatni testovi. U nekim ostvarenjima, ovde opisanih, dijagnostičkih testova, postupaka i sistema kvalifikovanja ili procene rizika od hronične bolesti bubrega ili proteinurije, ukoliko lekar postavi dijagnozu da pacijent nije pod rizikom od hronične bolesti bubrega ili proteinurije, tada se tretman istome ne primenjuje.
Test i postupci za detekciju ROBO2, koji su ovde opisani, mogu biti automatizovani uz korišćenje robotskih sistema i kompjuterski upravljanih sistema. Biološki uzorak, kao š to je uzorak urina, plazme ili krvi, može biti injiciran u sistem, kao što je mikro-fluidna sprava, koja se u potpunosti pokreće posredstvom robotske stanice, od ulazne pozicije uzorka do pozicije izbacivanja rezultata.
Sledstveno tome, ovde su, takođe, u nekim aspektima, obezbeđeni sistemi (i kompjuterski čitljiv medij za zadate kompjuterske sisteme), za izvođenje postupka za utvrđivanje da li pojedinac ima hroničnu bubrežnu bolest ili proteinuriju, ili ima predispoziciju za hroničnu bubrežnu bolest ili proteinuriju, na osnovu ekspresionih profila ili podataka o sekvenci.
U nekim aspektima, ovde su obezbeđeni sistemi za utvrđivanje da li ispitanik boluje ili je pod povećanim rizikom od hronične bolesti bubrega ili proteinurije, pri čemu sistemi uključuju: (a) determinacijski modul, koji je konfigurisan za prihvatanje najmanje jednog biološkog uzorka i izvođenje najmanje jedne analize u navedenom biološkom uzorku, da bi se izmerila koncentracija ROBO2 u biološkom uzorku ili utvrdio ekspresioni odnos ROB02 u odnosu na prethodno-ustanovljeni nivo ili nivo referentnog praga, i za izbacivanje rezultata navedene izmerene koncentracije ili ekspresionog odnosa; (b) sredstvo za memorisanje podataka, konfigurisano za čuvanje podataka, koje čine izlazne informacije iz determinacijskog modula; (c) komparativni modul, koji je adaptiran za prihvatanje unesenih podataka iz sredstva za memorisanje i poređenje sačuvanih podataka u sredstvu za memorisanje podataka sa najmanje jednim nivoom referentnog praga za ROB02 level, pri čemu, ukoliko je izmerena koncentracija ROB02 proteina najmanje istog nivoa ili je veća od nivoa referentnog praga, komparativni modul pruža informaciju za izlazni modul da biološki uzorak, povezan sa ispitanikom, odstupa od referentnog prag nivoa za biomarker; i (d) izlazni modul za prikazivanje podataka korisniku.
U svim aspektima pronalaska, mogu biti izvedeni postupci za utvrđivanje koncentracija ROB02 proteina, uz korišćenje automatizovanog instrumenta ili sistema. Takvi instrumenti i sistemi proizvode izveštaj, poput prikaza izveštaja na vidljivom ekranu ili u vidu izveštaja koji se može odštampati, pri čemu isti prikazuje koncentracije ROB02 proteina i/ili prikazuje povećanje ili isti nivo kao što je nivo referentnog praga za ROBO2 protein, i/ili pokazuje da li je ispitanik, od koga je uzorak uzet, pod rizikom od hronične bolesti bubrega ili proteinurije.
Sledstveno tome, neka, ovde opisana, ostvarenja, obezbeđuju, takođe, aparat, kompjuterske sisteme i kompjuterski č itljive medije za izvođenje koraka (i) određivanja koncentracija ROBO2 proteina i (ii) prikazivanja ili izveštavanja da li je ispitanik pod rizikom od razvijanja hronične bolesti bubrega ili proteinurije.
Ostvarenja ovih aspekata su opisana preko funkcionalnih modula, koji su definisani posredstvom izvršnih kompjuterskih instrukcija, zabeleženih na kompjuterski čitljivim medijima, koji kompjuteru zadaju da izvede korake postupka, kada se potvrde. Moduli su izdvojeni po funkciji zbog jasnijeg prikaza. Međutim, podrazumevalo bi se da nije potrebno da moduli odgovaraju zasebnim blokovima sistema i da se opisane funkcije mogu izvesti sastavljanjem raznih delova sistema, koji su memorisani na raznim medijima, i izvođenjem u različita vremena. Pored toga, trebalo bi se prihvatiti da moduli mogu vršiti i druge funkcije, tako da moduli nisu ograničeni na vršenje bilo koje određene funkcije ili niza funkcija.
Kompjuterski čitljivi mediji mogu biti bilo koji raspoloživi materijalni mediji koji mogu imati pristup kompjuteru. Kompjuterski čitljivi mediji uključuju nepostojane i postojane, uklonjive i neuklonjive materijalne medije, koji se uklapaju u bilo koji postupak ili tehnologiju za čuvanje podataka, kao š to su kompjuterski č itljive instrukcije, strukture podataka, programski moduli ili drugi podaci. Kompjuterski čitljivi mediji uključuju, ali bez ograničavanja na njih, RAM memoriju (ʺrandom access memoryʺ), ROM memoriju (ʺread only memoryʺ), EPROM memoriju (ʺeraseable programmable read only memoryʺ), EEPROM memoriju (ʺelectrically eraseable programmable read only memoryʺ), flash memoriju ili drugu memorijsku tehnologiju, CD-ROM (ʺcompact disc read only memoryʺ), DVD (ʺdigital versatile diskʺ) ili druge optičke medije za čuvanje podataka, magnetne kasete, magnetne trake, magnetne disk medije za čuvanje podataka ili druge magnetne medije za čuvanje podataka, druge vrste nepostojane i postojane memorije i bilo koji drugi materijalni medij, koji može biti korišćen za čuvanje željenih podataka, i koji može biti dostupan kompjuteru, uključujući i bilo koju pogodnu kombinaciju prethodno pomenutih medija.
Kompjuterski č itljivi podaci, koji se ostvaruju na jednom ili više kompjuterski č itljivih medija, ili kompjuterski č itljiv medij, mogu definisati instrukcije, primera radi, kao deo jednog ili više programa, koje, kao rezultat zadavanja od strane kompjutera, navode kompjuter da izvrši jednu ili više, ovde opisanih, funkcija (npr., u odnosu na sistem ili kompjuterski čitljivi medij) i/ili razna ostvarenja, varijacije i njihove kombinacije. Takve instrukcije mogu biti napisane u bilo kom od brojnih programskih jezika, kao što su, primera radi, Java, J#, Visual Basic, C, C#, C++, Fortran, Pascal, Eiffel, Basic, COBOL složeni jezik, i slični jezici, ili u bilo kojoj od brojnih njihovih kombinacija. Kompjuterski čitljivi mediji, na kojima se ostvaruju takve instrukcije mogu se nalaziti na jednoj ili više komponenti bilo kog od sistema, ili kompjuterski č itljiv medij, koji je ovde opisan, može biti raspoređen preko jedne ili više takvih komponenti, a može se nalaziti i na poziciji između njih.
Kompjuterski čitljivi mediji mogu biti prenosivi tako da instrukcije, koje se čuvaju na njima, mogu biti prenesene na bilo koji kompjuterski izvor za potrebe primene, ovde razmotrenih, aspekata ovog pronalaska. Pored toga, trebalo bi da se prihvatiti da, ovde opisane, instrukcije, koje se čuvaju na kompjuterski čitljivim medijima, ili na kompjuterski čitljivom mediju, nisu ograničene na instrukcije koje se ostvaruju kao deo aplikacionog programa, koji se nalazi na kompjuteru, povezanom na mrežu. Instrukcije pre mogu biti ostvarene kao bilo koji tip kompjuterskog koda (npr., softver ili mikrokod), koji se može primeniti na program kompjutera, za implementaciju aspekata ovog pronalaska. Instrukcije, koje je moguće primeniti na kompjuteru, mogu biti napisane na pogodnom kompjuterskom jeziku ili na kombinaciji nekoliko jezika. Bazni kompjuterizovani biološki postupci poznati su licima uobičajene stručnosti u ovoj oblasti, a opisani su, primera radi, u: Setubal i Meidanis et al., Introduction to Computational Biology Methods (PWS Publishing Company, Boston, 1997); Salzberg, Searles, Kasif, (Ed.), Computational Methods in Molecular Biology, (Elsevier, Amsterdam, 1998); Rashidi i Buehler, Bioinformatics Basics: Application in Biological Science and Medicine (CRC Press, London, 2000) i Ouelette i Bzevanis Bioinformatics: A Practical Guide for Analysis of Gene and Proteins (Wiley & Sons, Inc., 2nd ed., 2001).
Funkcionalni moduli određenih ostvarenja, ovde opisanih, aspekata, uključuju: determinacijski modul, sredstvo za č uvanje podataka, komparativni modul i displej modul. Funkcionalni mediji mogu vršiti funkciju na jednom ili na više kompjutera, ili korišćenjem jedne ili više kompjuterskih mreža ili kompjuterskih sistema.
U nekim aspektima, ovde su obezbeđeni kompjuterski sistemi koji se mogu koristiti za utvrđivanje koliko je verovatno da ispitanik boluje ili da je pod rizikom od razvijanja hronične bolesti bubrega ili proteinurije. U nekim ostvarenjima, kompjuterski sistem je povezan sa determinacijskim modulom, a konfigurisan je tako da proizvodi izlazne podatke iz determinacijskog modula, koji se odnose na biološki uzorak, pri čemu je determinacijski modul konfigurisan tako da detektuje nivoe ROBO2 proteina u biološkom uzorku, koji je dobijen od ispitanika; i pri čemu kompjuterski sistem uključuje (a) sredstvo za memorisanje podataka, koje je konfigurisano za čuvanje izlaznih podataka iz determinacijskog modula, kao i za č uvanje referentnih podataka; pri čemu je sredstvo za memorisanje podataka povezano sa (b) komparativnim modulom koji je, u nekim ostvarenjima, adaptiran za upoređivanje izlaznih podataka, koji su sačuvani na sredstvu za memorisanje podataka, sa memorisanim referentnim podacima, i koji je u alternativnim ostvarenjima, adaptiran za sopstveno poređenje izlaznih podataka, pri čemu komparativni modul izrađuje izveštaj o podacima i povezan je sa (c) displej modulom za prikazivanje stranice učitanog sadržaja (t.j., izveštaj sa rezultatima iz komparativnog modula) za korisnika na kompjuteru klijenta, pri čemu na učitanom sadržaju mogu biti navedene koncentracije ROBO2 i/ili verovatnoća da ispitanik oboli od hronične bolesti bubrega ili proteinurije u budućnosti.
U nekim ostvarenjima, determinacijski modul pruža izvršne instrukcije kompjuteru, da bi se obezbedili podaci o ekspresiji, podaci o sekvenci, informacije koje se tiču sekvence u kompjuterski čitljivom obliku. Kako je ovde korišćen, izraz "podaci o sekvenci" odnosi se na bilo koju nukleotidnu i/ili aminokiselinsku sekvencu, uključujući, ali bez ograničavanja na njih, nukleotidne i/ili aminokiselinske sekvence pune dužine, parcijalne nukleotidne i/ili aminokiselinske sekvence, ili mutirane sekvence. Pored toga, informacija "koja se odnosi na" podatke o sekvenci uključuje detektovanje prisustva ili odsustva sekvence (npr., utvrđivanje mutacije ili delecije), određivanje koncentracije određene sekvence u uzorku (npr, nivoi ekspresije aminokiselinske sekvence, ili nivoi ekspresije nukleotida (RNA ili DNA)) i slično. Izraz "informacija o sekvenci" utvrđen je kako bi uključio podatak o prisustvu ili odsustvu posttranslacijskih modifikacija (npr., fosforilacija, glikozilacija, sumoilacija, farnezilacija i slične modifikacije).
Primera radi, determinacijski moduli za utvrđivanje informacija o sekvenci ROB02 ili o ekspresiji nukleinske kiseline mogu uključiti poznate sisteme za automatizovanu analizu sekvenci, koji uključuju, ali ne ograničavajući se na njih, Hitachi FMBIO® i Hitachi FMBIO® II fluorescentne skenere (raspoloživi posredstvom Hitachi Genetic Systems, Alameda, Kalifornija); sisteme SPECTRUMEDIX® SCE 9610 za potpuno automatizovanu 96-kapilarnu elektroforetsku genetsku analizu (raspoloživi posredstvom SpectruMedix LLC, State College, Pensilvanija); ABI PRISM® 377 DNA sekvenator, ABI® 373 DNA sekvenator, ABI PRISM® 310 genetski analizator, ABI PRISM® 3100 genetski analizator i ABI PRISM® 3700 DNA analizator (raspoloživ posredstvom Applied Biosystems, Foster City, Kalifornija); molekularne dinamske instrumente FLUORIMAGER™ 575, SI fluorescentne skenere i molekularne dinamske FLUORIMAGER™ 595 fluorescentne skenere (raspoloživi posredstvom Amersham Biosciences UK Limited, Little Chalfont, Buckinghamshire, Engleska); sistem GENOMYXSC™ za sekvenciranje DNA (raspoloživ posredstvom Genomyx Corporation (Foster City, Kalifornija) i PHARMACIA ALF™ DNA sekvenator i Pharmacia ALFEXPRESS™ (raspoloživi posredstvom Amersham Biosciences UK Limited, Little Chalfont, Buckinghamshire, Engleska).
U nekim ostvarenjima za utvrđivanje podataka o sekvenci ili proteinu, determinacijski moduli uključuju sisteme za analizu proteina i DNA. Na primer, sistemi masene spektrometrije, koji uključuju sisteme matricom potpomognute jonizacije laserskom desorpcijom – sa merenjem vremena leta ili ʺMatrix Assisted Laser Desorption Ionization - Time of Flightʺ (MALDI-TOF); sistemi sa nizom testova profilisanja sa proteinskim č ipom SELDI-TOF-MS, npr., aparati sa softverom CIPHERGEN PROTEIN BIOLOGY SYSTEM II™; sistemi za analizu podataka o ekspresiji gena (vidi, na primer, U.S. 2003/0194711); sistemi sa nizom testova na bazi analize ekspresije, na primer ʺHT arrayʺ sistemi i ʺcartridge arrayʺ sistemi, koji su raspoloživi posredstvom Affymetrix (Santa Clara, CA 95051) autoloader-a, sistem instrumenata COMPLETE GENECHIP®, fluidna stanica 450, hibridizacijska peć 645, QC Toolbox softverski kit, skener 30007G, skener 30007G plus sistem ciljane genotipizacije, skener 30007G sistema ʺWhole-Genome Associationʺ, GENETITAN™ instrument, GeneChip® ʺarrayʺ stanica, ʺHT arrayʺ; automatizovani ELISA sistem (npr.,. DSX® ili DS2® forme Dynax, Chantilly, VA ili ENEASYSTEM III®, TRITURUS®, THE MAGO® Plus); denzitometri (npr., X-Rite-508-Spectro Densitometer®, denzitometar HYRYS™ 2); automatizovani fluorescentni sistemi in situ hibridizacije (vidi, na primer, United States Patent 6,136,540); 2D gel imidžing sistemi, u kombinaciji sa 2-D imidžing softverom; čitači mikrotitarskih ploča; ćelijski sorteri aktivirani fluorescencijom (FACS) (npr., protočni citometar FACSVantage SE, Becton Dickinson); radioizotopski analizatori (npr., scintilacioni brojači), ili njihove kombinacije.
U nekim ostvarenjima ovog aspekta i svih drugih aspekata ovog pronalaska, mogu biti korišćeni brojni softverski programi i formati za čuvanje podataka o nivou proteina biomarkera na sredstvu za memorisanje. Može biti korišćen bilo koji broj strukturnih formata za obradu podataka (npr., tip ʺtext fileʺ ili ʺdatabaseʺ), da bi se izradio ili kreirao medij, koji u sebi sadrži zabeležene informacije o sekvenci ili podatke o nivou ekspresije.
Informacija o ekspresiji ROBO2 ili informacija koja se odnosi na podatke o ekspresiji ROBO2, koja je utvrđena u determinacijskom modulu, može biti očitana od strane sredstva za memorisanje podataka. Kako je ovde korišćen, izraz "sredstvo za memorisanje podataka" je utvrđen kako bi uključio bilo koji pogodni kompjuterski ili procesorski aparat ili bilo koje sredstvo koje je konfigurisano ili adaptirano za č uvanje podataka ili informacija. Primeri elektronskih aparata, pogodnih za korišćenje u ovom pronalasku, uključuju ʺstand-aloneʺ kompjuterske aparate, telekomunikacione mreže podataka, koje uključuju, lokalne računarske mreže (LAN), računarske mreže širokog područja (WAN), sisteme ʺ cloud storageʺ, internet, intranet i ekstranet, i lokalne i distribuirane kompjuterske sisteme. Sredstva za čuvanje podataka uključuju, takođe, ali bez ograničavanja na njih, magnetne medije za čuvanje, kao š to su flopi diskovi, medije za čuvanje na hard disku, magnetne trake, optičke medije za čuvanje podataka, kao š to je CD-ROM, DVD, elektronske medije za čuvanje podataka, kao što je RAM, ROM, EPROM, EEPROM i slični mediji, ʺcloud storageʺ sisteme, opšte hard diskove i hibridne sisteme od ovih kategorija, kao što su magnetno/optički mediji za č uvanje. Sredstvo za čuvanje je adaptirano ili konfigurisano za čuvanje zabeleženih podataka o sekvenci ili podataka o nivou ekspresije. Takvi podaci mogu biti obezbeđeni u digitalnom obliku, koji se može prenositi i čitati elektronski, npr., preko interneta, posredstvom ʺcloudʺ sistema, na disketi, preko USB-a (ʺuniversal serial busʺ ili univerzalna serijska magistrala), ili posredstvom bilo kog drugog pogodnog načina komunikacije.
Kako je ovde korišćen, izraz "podatak o nivou ekspresije" odnosi se na bilo koju informaciju o nivou ekspresije nukleotida i/ili aminokiseline, uključujući, ali bez ograničavanja na njih, nukleotidne i/ili aminokiselinske sekvence pune dužine, parcijalne nukleotidne i/ili aminokiselinske sekvence ili mutirane sekvence. Pored toga, informacija "koja se odnosi na" podatak o nivou ekspresije uključuje detekciju prisustva ili odsustva sekvence (npr., prisustvo ili odsustvo aminokiselinske sekvence, nukleotidne sekvence ili post-translacijske modifikacije), određivanje koncentracije sekvence u uzorku (npr., koncentracije aminokiselina ili nivoi ekspresije nukleotida (RNA ili DNA), ili nivo post-translacijske modifikacije) i slično.
Kako je ovde korišćen, izraz "sačuvani podatak" odnosi se na proces kodiranja informacije na sredstvu za skladištenje podataka. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu lako usvojiti bilo koji od trenutno poznatih postupaka za memorisanje podataka na poznatim medijima, da bi se dobili proizvodi u vidu izveštaja koji sadrže informaciju o sekvenci ili informaciju o nivou ekspresije.
Brojni softverski programi i formati mogu biti korišćeni za čuvanje podataka o sekvenci ili podataka o nivou ekspresije na sredstvu za memorisanje podataka. Može biti korišćen bilo koji broj strukturnih formata za obradu podataka (npr., tip ʺtext fileʺ ili ʺdatabaseʺ), da bi se izradio ili kreirao medij, koji u sebi sadrži zabeležene informacije o sekvenci ili podatke o nivou ekspresije.
Obezbeđujući podatke o sekvenci ili podatke o nivou ekspresije u kompjuterski čitljivom obliku, moguće je da se informacija o sekvenci ili informacija o nivou ekspresije u čitljivoj formi koristi u komparativnom modulu, za poređenje specifične sekvence ili ekspresionog profila sa referentnim podacima, koji su memorisani na sredstvu za čuvanje podataka. Na primer, mogu se koristiti programi za pretraživanje, da bi se identifikovali fragmenti ili regioni sekvenci koji se podudaraju sa određenom sekvencom (referentni podaci, npr., podaci o sekvenci, koji su dobijeni iz kontrolnog uzorka) ili se može koristiti direktna komparacija, upoređivanjem utvrđenog nivoa ekspresije sa podacima za referentni nivo ekspresije (npr., podaci o nivou ekspresije, koji su dobijeni iz kontrolnog uzorka). Poređenje, koje je izvršeno u kompjuterski č itljivom obliku, obezbeđuje rezultat poređenja u kompjuterski čitljivoj formi, koji može biti obrađen na razne načine. Sadržaj, koji je baziran na rezultatu poređenja, može biti dobijen iz komparativnog modula, da bi se ukazalo na specifičnu bolest ili poremećaj, kao što je hronična bolest bubrega ili proteinurija.
U nekim ostvarenjima, referentni podaci, koji se čuvaju na sredstvu za skladištenje podataka, koje očitava komparativni modul, jesu podaci o sekvenci ROBO2 ili podaci o ekspresiji, koji se dobijaju iz kontrolnog biološkog uzorka istog tipa kao što je biološki uzorak koji se testira. Alternativno, referentni podaci predstavljaju baze podataka, npr., deo celokupne sekvence genoma organizma ili proteinske familije sekvenci, ili profila nivoa ekspresije (RNA, protein ili peptid). U nekim ostvarenjima, referentni podaci predstavljaju informacije o sekvenci ili profilima nivoa ekspresije, koji su indikativni za specifičnu bolest ili poremećaj, kao što je hronična bolest bubrega ili proteinurija.
U nekim ostvarenjima, referentni podaci se elektronski ili digitalno beleže i memorišu iz baza podataka, koje uključuju, ali bez ograničavanja na njih, bazu podataka proteina GenBank (NCBI) i bazu DNA podataka, kao što što su baze genoma, EST, SNPS, Traces, Celara, Ventor Reads, Watson reads, HGTS i slične; baze podataka Swiss Institute of Bioinformatics, kao što su: ENZYME, PROSITE, SWISS-2DPAGE, Swiss-Prot i TrEMBL baze podataka; Melanie softverski paket ili ExPASy WWW server, i slične; SWISS-MODEL, Swiss-Shop i druge račuunarske alatke, na mrežnoj osnovi; bazu podataka Comprehensive Microbial Resource (raspoloživa posredstvom Institute of Genomic Research). Dobijeni podaci mogu biti sačuvani u bazi podataka za upoređivanje, koja može biti korišćena za utvrđivanje homologija između referentnih podataka ili gena ili proteina unutar i između genoma.
Obezbeđujući koncentracije ROBO2 u čitljivom obliku u komparativnom modulu, njih je moguće iskoristiti za poređenje sa nivoima referentnog praga za ROBO2 koji se nalaze memorisani na sredstvu za čuvanje podataka. Poređenje, koje je izvršeno u kompjuterski čitljivoj formi, obezbeđuje kompjuterski čitljivi sadržaj koji može biti obrađen na razne načine.
"Komparativni modul" može koristiti brojne raspoložive softverske programe i formate za operativnu komparaciju, za poređenje podataka o ROBO2 sekvenci ili o ekspresionom nivou, koji su utvrđeni u determinacijskom modulu, sa podacima o referentnoj ROBO2 sekvenci ili nivou ekspresije. U nekim ostvarenjima, komparativni modul je konfigurisan tako da koristi tehnike obrasca prepoznavanja za upoređivanje podataka o sekvenci ROBO2 ili ekspresionom nivou iz jednog ili više ulaznih podataka sa jednim ili više modela referentnih podataka.
Komparativni modul može biti konfigurisan uz korišćenje postojećih komercijalno dostupnih ili javno raspoloživih softvera za modele poređenja, i može se optimizovati za poređenja određenih podataka, koja se sprovode. Komparativni modul pruža kompjuterski č itljive informacije, koje se odnose na podatke o sekvenci, koji mogu uključiti, primera radi, detekciju prisustva ili odsustva sekvence (npr., utvrđivanje mutacije ili delecije (proteina ili DNA), informacije koje se odnose na zasebne alele, detekciju post-translacijskih modifikacija ili izostavljanja ili ponavljanje sekvenci); utvrđivanje koncentracije sekvence u uzorku (npr., nivoi ekspresije sekvenci aminokiselina/proteina ili nivoi ekspresije nukleotida (RNA ili DNA) ili nivoi post-translacijskih modifikacija), ili utvrđivanje ekspresionog profila.
U nekim ostvarenjima, komparativni modul omogućuje poređenje koncentracija ROBO2 iz izlaznih podataka sa determinacijskog modula sa podacima o nivou referentnog praga za svaki ROBO2.
U nekim ostvarenjima, komparativni modul poređenja vrši pomoću spektara masene spektrometrije, na primer, upoređivanja podataka o sekvenci peptidnog fragmenta mogu se izvršiti korišćenjem spektara, razvijenih u MATLB-u, sa tekstualnom podlogom pod nazivom "Qcealign" (vidi, na primer, WO2007/022248) i "Qpeaks" (Spectrum Square Associates, Ithaca, NY) ili sa Ciphergen Peaks 2.1™ softverom. Razvijeni spektri mogu, nakon toga, biti razvrstani korišćenjem algoritama poravnavanja, koji klasifikuju podatke o uzorku prema podacima iz kontrola, uz korišćenje algoritma minimalne entropije, uzimajući korigovane bazalne podatke (vidi, primera radi, WIPO Publication WO2007/022248). Rezultat poređenja može biti, dalje, obrađen izračunavanjem odnosa. Ekspresione profile proteina je moguće razlikovati.
Može biti korišćen bilo koji raspoloživi komparativni softver, koji uključuje, ali bez ograničavanja na njih, Ciphergen Express (CE) i Biomarker Patterns softverski (BPS) paket, Ciphergen Biosystems, Inc., CA, SAD. Komparativna analiza se može izvršiti sa softverskim sistemom sa proteinskim čipom (npr., garnitura proteinskih čipova Bio-Rad Laboratories). Komparativni modul, ili bilo koji drugi, ovde opisani, modul, može uključivati operativni sistem (npr., UNIX) na kome funkcioniše sistem upravljanja bazom podataka za poređenje, aplikaciju World Wide Web i server World Wide Web. Aplikacija World Wide Web uključuje izvršni kod, neophodan za proizvođenje izjava programskog jezika baze podataka (npr., izjave programskog jezika Structured Query Language (SQL)). Uopšteno, izvršne stavke će uključivati ugrađene SQL izjave. Pored toga, aplikacija World Wide Web može uključiti konfiguracijski fajl koji sadrži indikatore i adrese raznih softverskih entiteta, koji sadrže server, kao i razne eksterne i interne baze podataka, koje moraju imati pristup na zahteve korisničkog servisa. Konfiguracijski fajl, takođe, upućuje zahteve prema serverskim resursima za odgovarajućim hardverom--budući da bi moglo biti potrebno da server bude distribuiran preko dva ili više zasebnih računara. U nekim ostvarenjima, server World Wide Web podupire TCP/IP protokol. Lokalne mreže, kao što je ova, katkad se označavaju kao "intraneti". Prednost takvih intraneta je ta što omogućuje jednostavnu komunikaciju sa bazama podataka javnih domena, koje se nalaze na World Wide Web-u (npr., sajt GenBank ili Swiss Pro World Wide Web). Sledstveno tome, u nekim poželjnim ostvarenjima, korisnici mogu direktno pristupiti podacima (preko Hypertext linkova, primera radi) koji se nalaze u bazama podataka na internetu, uz korišćenje HTML interfejsa, koji obezbeđuju Web pregledači i Web serveri.
U nekim ostvarenjima, komparativnim modulom se upoređuju ekspresioni profili gena. Na primer, detekcija ekspresionih profila gena može se izvršiti korišćenjem Affymetrix Microarray Suite softvera verzije 5.0 (MAS 5.0) (raspoloživ posredstvom Affymetrix, Santa Clara, Kalifornija), za ispitivanje relativne količine jednog ili više gena, na osnovi intenziteta signala iz setova proba, a fajlovi MAS 5.0 podataka mogu biti preneseni u bazu podataka i analizirani korišćenjem Microsoft Excel i GeneSpring 6.0 softvera (raspoloživ posredstvom Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornija). Detekcioni algoritam MAS 5.0 softvera može biti korišćen za dobijanje opsežnog prikaza koliki broj transkripata se detektuje u datim uzorcima i omogućuje komparativnu analizu 2 ili više setova ʺmicroarrayʺ podataka.
U nekim ostvarenjima, komparativnim modulom se upoređuju ekspresioni profili proteina. Može biti korišćen bilo koji raspoloživi softver za poređenje, uključujući, ali bez ograničavanja na njih, Ciphergen Express (CE) i Biomarker Patterns softverski (BPS) paket (raspoloživ posredstvom Ciphergen Biosystems, Inc., Freemont, Kalifornija). Komparativna analiza može biti izvršena sa softverskim sistemom sa proteinskim čipom (npr., Proteinchip Suite (raspoloživ posredstvom Bio-Rad Laboratories, Hercules, Kalifornija). Algoritmi za identifikovanje ekspresionih profila mogu uključiti korišćenje algoritama optimizacije, kao što je algoritam srednje vrednosti varijanse (npr., algoritam JMP Genomics, raspoloživ posredstvom JMP Software Cary, Severna Karolina).
Komparativni modul obezbeđuje kompjuterski čitljiv rezultat poređenja, koji može biti obrađen u kompjuterski č itljivom obliku, prema prethodno-definisanim kriterijumima, ili prema kriterijumima, koje je definisao korisnik, kako bi se dobio sadržaj, koji je delom baziran na rezultatu poređenja, pri čemu isti može biti sačuvan i izbačen na zahtev korisnika, uz korišćenje displej modula. Displej modul omogućuje prikazivanje sadržaja, koji je delom baziran na rezultatu poređenja za korisnika, pri čemu sadržaj čini signal koji je indikativan za hroničnu bubrežnu bolest ili proteinuriju. Takav signal, može biti, primera radi, prikaz sadržaja, koji ukazuje na prisustvo ili odsustvo hronične bolesti bubrega ili proteinurije na monitoru računara, odštampana strana sadržaja, koji je indikator prisustva ili odsustva hronične bolesti bubrega ili proteinurije, izvučena sa štampača, ili može biti svetlo ili zvuk, koji ukazuju na prisustvo ili odsustvo hronične bolesti bubrega ili proteinurije.
Sadržaj, koji je zasnovan na rezultatu poređenja, može sadržavati ekspresioni profil jednog ili više proteina, ili ekspresioni profil jednog ili više gena. U nekim ostvarenjima, sadržaj, koji je baziran na rezultatu merenja, predstavlja samo signal, koji ukazuje na prisustvo ili odsustvo hronične bolesti bubrega ili proteinurije, na osnovu koncentracija ROBO2 proteina.
U nekim ostvarenjima, sadržaj, koji je baziran na rezultatu poređenja prikazuje se na monitoru kompjutera. U jednom ostvarenju pronalaska, sadržaj, zasnovan na rezultatu poređenja, prikazuje se posredstvom medija za štampanje u odštampanom obliku. U jednom ostvarenju pronalaska, sadržaj koji je baziran na rezultatu poređenja, prikazuje se u vidu svetlosnog ili zvučnog indikatora. Displej modul može biti bilo koje pogodno sredstvo, koje je konfigurisano za prihvatanje informacije sa kompjutera i prikazivanje kompjuterski čitljive informacije korisniku. Ne-ograničavajući primeri uključuju, primera radi, kompjutere opšte upotrebe, kao što su oni koji su bazirani na Intel procesoru PENTIUM-tipa, Apple kompjuter i tablete sprave, Motorola PowerPC, Sun UltraSPARC, Hewlett-Packard PA-RISC procesore, bilo koji od brojnih procesora, koji su raspoloživi posredstvom Advanced Micro Devices (AMD), Sunnyvale, Kalifornija, ili bilo koji tip procesora, sprave vizuelnog prikaza, kao što su tabletne sprave, smartfon mobilni aparati, flat-panel displeji, cevi katodnih zraka i slične, kao i kompjuterske štampače raznih tipova.
U nekim ostvarenjima, World Wide Web pregledač se koristi da bi se obezbedio korisnički interfejs za prikazivanje sadržaja, koji je baziran na rezultatu poređenja. Podrazumevalo bi se da i drugi moduli pronalaska mogu biti adaptirani kako bi imali interfejs za web pregledač. Posredstvom Web pregledača, korisnik može konstruisati zahteve za izvlačenje podataka iz komparativnog modula. Sledstveno tome, korisnik će, uglavnom, usmeravati pretragu i kliknuti na elemente korisničkog interfejsa, kao što su ikone, padajući meniji, scroll bar trake za pomeranje kroz dokumente i slični elementi, koji se uobičajeno koriste u grafičkim korisničkim interfejsima. Zahtevi, koji su na taj način formulisani sa Web pregledačem korisnika, prenose se u Web aplikaciju, koja ih formatira tako da se proizvodi upit, koji se može koristiti za izvlačenje značajne informacije, koja je u vezi sa podacima o sekvenci, npr., prikaz indikacije o prisustvu ili odsustvu mutacije ili delecije (na DNA ili proteinu); prikaz nivoa ekspresije aminokiselinske sekvence (proteina); prikaz nivoa ekspresije nukleotida (RNA ili DNA); prikaz profila ekspresije, SNP ili mutacije, ili haplotipova, ili prikaz informacije, koja je bazirana na njima. U jednom ostvarenju, takođe je prikazana informacija o sekvenci, koja se odnosi na podatke o referentnom uzorku.
U nekim ostvarenjima, displej modul prikazuje rezultat poređenja i pokazuje da li je rezultat poređenja indikativan za bolest, npr., da li je profil ekspresije ROBO2 indikativan za hroničnu bubrežnu bolest ili proteinuriju.
U nekim ostvarenjima, sadržaj baziran na rezultatu poređenja, koji je prikazan, predstavlja signal (npr., pozitivan ili negativan signal), koji je indikator prisustva ili odsustva hronične bolesti bubrega ili proteinurije, tako da može biti prikazana samo pozitivna ili negativna indikacija.
Sledstveno tome, ovde su obezbeđeni sistemi (i čitljivi kompjuterski medij za zadate kompjuterske sisteme) za izvođenje testova i postupaka za utvrđivanje da li pojedinac ima hroničnu bubrežnu bolest ili proteinuriju ili ima predispoziciju za hroničnu bubrežnu bolest ili proteinuriju, na osnovu ekspresionih profila ili podataka o sekvenci.
Sistemi i kompjuterski čitljivi medij predstavljaju samo ilustrativna ostvarenja pronalaska za izvođenje testova i postupaka za utvrđivanje da li pojedinac ima specifičnu bolest ili poremećaj ili ima predispoziciju za specifičnu bolest ili poremećaj, na osnovu ekspresionih profila ili podataka o sekvenci, a nije im namera da predstavljaju ograničenje okvira pronalaska. Varijacije sistema i kompjuterski čitljivog medija su mogućne i navedeno je da spadaju unutar okvira pronalaska.
Moduli sistema ili oni koji su korišćeni u kompjuterski čitljivom mediju, mogu imati brojne konfiguracije. Na primer, funkcija može biti obezbeđena na jednom aparatu ili može biti raspodeljena preko više aparata.
Robo2 je protein podocita lokalizovan na bazalnoj ćelijskoj površini podocita miša
Tokom razvijanja bubrega, mRNA Robo2 se ekspresuje u metanefričkom mezenhimu koji okružuje osovinski ureteralni pupoljak, a kasnije na proksimalnom kraju S-oblikovanog tela (Piper et al., 2000), što je lokacija primordijalnih podocita. Da bi se ispitalo da li je Robo2, isto tako, uključen u sazrevanje podocita, pored njegove uloge u ranoj indukciji bubrega, izvršili smo in situ hibridizaciju i utvrdili da se mRNA Robo2 ekspresuje u stadijumu kapilarne petlje razvijajućih glomerula mišjih embriona u danu embrionalnog razvoja označenom sa 16.5 (E16.5) (SLIKE 5A i 5B). Protein Robo2 postaje detektibilan posredstvom imunofluorescentnog bojenja u razvijajućem glomerulu na približno E14.5, a pik ekspresije se postiže u vremenskoj tački E16.5 (SLIKE 5C-5E). Premda se ekspresija smanjuje nakon E17.5 tokom razvoja (SLIKA 5F), ekspresija specifična za Robo2 se održava u glomerulima nakon rođenja, a detektibilna je kod odraslog miša starosti 5 nedelja (SLIKE 5G, 5H, 5L-5M).
Da bi se potvrdila ćelijska lokalizacija Robo2 u glomerulu koji se razvija, izvršili smo imunohistohemijsko ispitivanje sa dva obeleživača, sa markerima, specifičnim za glomerularnu ćelijsku vrstu. Utvrdili smo da se protein Robo2 ko-lokalizuje sa nefrinom (SLIKE 1A-1C) i podocinom (SLIKE 1D-1F), koji predstavljaju dva proteina, povezana sa slit-dijafragmom podocita. Robo2 se, takođe, ko-ekspresuje u glomerulima sa adapterskim protein Nck, koji ulazi u interakciju sa nefrinom (SLIKE 1G, 1I) i sa WT1, koji je konstituent jedra podocita (SLIKE 5H-5K). Dvostruko obeležavanje sa antitelima prema nidogenu, markeru bazalne membrane (SLIKE 1J-1L i 1P) i markeru Pecam1, koji je endotelni ćelijski marker (SLIKE 1M-1O, 35M) pokazalo je da je Robo2 lokalizovan u neposrednoj blizini spoljne površine glomerularne bazalne membrane i izvan endotelnih ćelija. Konfokalna mikroskopija visoke rezolucije, dalje je pokazala da je subcelularni Robo2 najobilniji na bazalnoj površini podocita (SLIKA 1Q). Imunogold elektronskom mikroskopijom postnatalnih bubrega miševa sa antitelom prema citoplazmatskom domenu ustanovilo se da je Robo2 lokalizovan na prstolikim produžecima podocita, u blizini citoplazmatske strane slit-dijafragmi (SLIKA 1R). Ovi rezultati pokazuju da je Robo2 protein podocita, a njegova bazalna subcelularna lokalizacija u produžecima podocita pokazuje da on igra ulogu u regulisanju strukture prstolikih produžetaka podocita.
Intracelularni domen Robo2 ulazi u direktnu interakciju sa SH3 domenima adapterskog proteina Nck
Zaposedanje ekstracelularnog domena nefrina dovodi do fosforilacije tirozina iz njegovog intracelularnog domena posredstvom Src kinaza i do povlačenja SH2 domena adapterskog proteina Nck, što, onda indukuje polimerizaciju aktina (Jones et al., 2006; Verma et al., 2006). Nck nosi jedan SH2 domen u C-terminusu i tri SH3 domena u blizini N-terminusa. Polimerizacija aktina je posredovana SH3 domenima Nck (Rivera et al., 2004), čime se mogu regrutovati razni regulatori citoskeleta, uključujući N-WASP i Pak (Jones et al., 2006). Ranije studije su pokazale da SH3 domeni Nck homologa Drosophila Dreadlock (Dock), takođe ulaze u direktnu interakciju sa intracelularnim domenom Robo, da bi se inhibirala polimerizacija aktina (Fan et al., 2003; Yang i Bashaw, 2006).
Ispitali smo da li Nck sisara može, isto tako, ulaziti u direktnu interakciju sa Robo2 u podocitu, da bi se regulisao F-aktinski citoskelet. Da bismo odgovorili na ovo pitanje, koristili smo dvo-hibridni test kvasaca, da bi se ispitalo da li je Robo2 ulazio u interakciju sa Nck. Budući da dva Nck sisara (t.j., Nckl, Nck2) dele sličnu strukturu i funkciju u razvoju bubrega (Jones et al., 2006), u ovoj studiji smo koristili Nckl i zapazili smo da je intracelularni domen Robo2 ulazio u direktnu interakciju sa Nckl (SLIKE 2A-2C). Mapiranje vezujućih položaja u Robo2 za Nckl pokazalo je da je sekvenca aminokiselina 1085 do 1301, koja sadrži 4 motiva bogata prolinom bila ključna za interakciju (SLIKE 2A i 2C). Odsustvo ovog regiona bogatog prolinom sprečavalo je njegovu interakciju sa Nckl (SLIKA 2A). Mapiranje vezujućih položaja u Nckl za Robo2 pokazalo je da su prva dva SH3 domena neophodna za njihovu interakciju sa Robo2 budući da se brisanjem jednog ili oba domen ukida interakcija (SLIKA 2B). Sledstveno tome, interakcija Robo2 i Nckl vrši se uz posredovanje dva dobro okarakterisana proteinska domena, SH3 domena i motiva bogatih prolinom (SLIKA 2C). CD2AP, drugi adapterski protein podocita, takođe nosi tri SH3 domena na svom N-terminusu (Shih et al., 2001), ali mi nismo detektovali bilo kakvu interakciju između CD2AP i Robo2 u dvo-hibridnom testu kvasaca ili u testu koprecipitacije. Ova zapažanja ukazuju da je vezivanje između Robo2 i Nckl u podocitu specifična interakcija.
Robo2 pune dužine obrazuje kompleks sa nefrinom preko Nck
Interakciju između Robo2 i Nck potvrdili smo testovima obaranja i ko-precipitacije. Humani Robo2 pune dužina sa his- i myc-tagovima (His-myc-Robo2) ili humani Robo2 sa his- i myc-tagovima i sa delecijom vezujućeg domena Nckl (His-myc-Robo2-ΔNBD) ekspresovani su u HEK ćelijama. Transfektovane HEK ćelije su stimulisane sa Slit2 kondicioniranim medijumom (pripremljenim iz Slit2 stabilno transfektovanih ćelija), da bi se aktivirao Robo2 i povećalo vezivanje Nck (Fan et al., 2003). Nck je oboren sa His-myc-Robo2 iz lizata HEK ćelija, uz korišćenje Ni-NTA zrnaca, ali ne i sa His-myc-Robo2-ΔNBD (SLIKA 2D). Budući da SH2 domen Nck ulazi u interakciju sa fosfotirozinima u citoplazmatskom domenu nefrina (NCD) (Jones et al., 2006; Verma et al., 2006), ispitali smo da li je Robo2 obrazovao kompleks sa nefrinom preko Nck, korišćenjem ko-precipitacijskog testa. Da bismo ustanovili dokazni materijal za ovaj princip, ko-ekspresovali smo Robo2 i nefrin u HEK ćelijama sa Fyn kinazom, da bi se povećala fosforilacija nefrina (Verma et al., 2006). Obaranje His-myc-Robo2 iz lizata HEK ćelija sa Ni-NTA zrncima, ko-precipitiralo je Nck i nefrin kada je ekspresovan Fyn (SLIKA 2E). Obrnutim redosledom, obaranjem His-myc-nefrina ko-precipitirali su se Nck i Robo2, kada je ekspresovana Fyn kinaza (SLIKA 2F). Pored toga, precipitati, pripremljeni sa anti-Nck antitelom, sadržavali su i Robo2 i nefrin kada je Fyn prekomerno ekspresovan (SLIKA 6A). Ovi podaci pokazuju da nefrin, Nck i Robo2 obrazuju kompleks in vitro. Da bi se ova otkrića validirala in vivo, izvršili smo imunoprecipitaciju Robo2 iz lizata bubrega novorođenog miša i utvrdili smo da je došlo do ko-precipitacije Nck i nefrina (SLIKA 2G). Suprotno tome, precipitati, koji su pripremljeni sa anti-nefrinskim antitelom, takođe su sadržavali Nck i Robo2 (SLIKA 2H). Budući da se nefrin ekspresuje jedino u podocitima, a Nck i Robo2 su, takođe, lokalizovani u ovim ćelijama u bubregu, ovi rezultati pokazuju da su nefrin, Nck i Robo2 u stanju da obrazuju kompleks u podocitima.
Da bi se utvrdila uloga Slit2 pri obrazovanju proteinskog kompleksa Robo2-Ncknefrin, His-myc-Robo2, nefrin i Fyn se ko-ekspresuju u HEK ćelijama, koje su stimulisane sa Slit2 kondicioniranim medijumom ili kontrolnim kondicioniranim medijumom bez Slit2, pre koprecipitacije (SLIKA 2I). Utvrdili smo da se Slit2 stimulacijom povećava vezivanje Robo2 za Nck i obrazovanje kompleksa sa nefrinom. Oba odnosa, i odnos Nckl prema Robo2 i nefrina prema Robo2 su povećani nakon stimulacije sa Slit2 (SLIKA 2J). U skladu sa ovim otkrićem, zapazili smo da je Slit2 snažno ekspresovan u glomerulima novorođenog miša (SLIKE 6B, 6C).
Slit2-Robo2 signalizacija inhibira polimerizaciju aktina indukovanu nefrinom
Budući da se Slit vezuje za Robo, da bi se regrutovali Dock i srGAP, kako bi se inhibirala polimerizacija aktina (Fan et al., 2003), poželili smo da ispitamo da li Robo2 takođe regrutuje i Nck, da bi se inhibirala polimerizacija aktina u ćelijama sisara, što je uloga suprotna ulozi nefrina koji podstiče polimerizaciju aktina. Da bi se ovo pitanje uputilo na pravu adresu, izvršili smo ispitivanje polimerizacije aktina, posredstvom analize repova F-aktina u ćelijama, koje ekspresuju himerični protein CD16/7-NCD, kako je ranije opisano (Jones et al., 2006; Verma et al., 2006). Ovaj model koristi ekstracelularne i transmembranske domene humanih imunoglobulinskih Fc receptora CD16 i CD7, koji su spojeni sa citoplazmatskim domenom nefrina (NCD). CD16/7-HA, u kome je NCD zamenjen HA tagom, korišćen je kao negativna kontrola. Ovi himerični proteini su ko-ekspresovani sa Robo2 u HEK ćelijama, a oblikovani su u grozdove uz pomoć tretmana sa anti-CD16 antitelom i sekundarnim antitelom, konjugovanim sa rodaminom. Najpre smo ispitali da li bi formiranje grozdova od citoplazmatskog domena nefrina moglo povući Robo2. Zapazili smo da je zaposedanjem CD16/7-NCD došlo do uvlačenja Robo2 u grozdove, budući da se najveći deo Robo2 ko-lokalizuje sa CD16/7-NCD grozdovima (SLIKE 6D-6F). Međutim, nije zapažena ko-lokalizacija Robo2 sa CD16/7-HA kontrolom (SLIKA 6D’) ili sa konstrukcijom Robo2-ΔNBD (SLIKA 6E’), u kojoj je vezujući domen Nck za Robo2 (NBD) izbrisan. Interesantno je da je u odsustvu Slit2, ko-lokalizacija CD16/7-NCD i Robo2 bila značajno smanjena (SLIKA 6F’). Ovi podaci pružaju, dalje, dokaz da je citoplazmatski domen nefrina u stanju da formira kompleks sa intracelularnim domenom Robo2 u prisustvu Slit2 i potvrđuju model za utvrđivanje da li obrazovanje kompleksa Robo2-Nck-nefrin utiče na polimerizaciju aktina.
HEK ćelije koje ekspresuju CD16/7-NCD i Robo2 stimulisane su sa Slit2 ili sa kontrolnim kondicioniranim medijumom bez Slit2, uz formiranje grozdova uz pomoć anti-CD16 antitela. Polimerizacija aktina je procenjena posredstvom kvantitativnog određivanja broja HEK ćelija bez vidljivih repova F-aktina (Rivera et al., 2004). Utvrdili smo da je ∼80% ćelija sa grozdovima CD16/7-NCD obrazovalo repove F-aktina koji su mogli biti otkriveni bojenjem sa faloidinom, kao što je prethodno prikazano (Jones et al., 2006; Verma et al., 2006). Međutim, nakon stimulacije sa Slit2, broj ćelija sa repovima F-aktina je bio značajno redukovan, do približno 40% (SLIKE 3A i 3C). Otkriveno je da samo nekoliko ćelija sadrži kraće repove F-aktina, kada se kontrolni CD16/7-HA proteini grupišu u grozdove (SLIKE 3B i 3C). Da bi se dalje istražilo da li bi ova inhibicija polimerizacije aktina zahtevala Nck, ovaj test smo ponovili uz korišćenje Robo2 bez vezujućeg domena Nck (Robo2-ΔNBD), da bi se utvrdilo da li bi blokiranje vezivanja Nck za Robo2 moglo sprečiti inhibitorni efekat Slit2-Robo2 na polimerizaciju aktina, indukovanu nefrinom. CD16/7-NCD je ko-ekspresovan ili sa Robo2 pune dužine (SLIKA 7A) ili sa Robo2-ΔNBD (SLIKA 7B) u HEK ćelijama. Utvrdili smo da je delecija Nck vezujućeg domena u Robo2 u značajnoj meri kompromitovala inhibitorni efekat Slit2-Robo2 na polimerizaciju aktina, indukovanu nefrinom (SLIKA 7C).
Ranija ispitivanja su pokazala da se nefrin povezuje sa F-aktinskim citoskeletom (Yuan et al., 2002). Da bi se utvrdilo da li bi Slit2-Robo2 signalizacija mogla inhibirati F-aktin, povezan za nefrin, izvršili smo imuno-precipitaciju CD16/7-NCD i CD16/7-HA sa anti-CD16 antitelom i utvrdili smo količinu F-aktina u precipitatima, uz pomoć Western blot-a. Zapazili smo da je količina F-aktina, povezanog sa nefrinom, značajno smanjena nakon stimulacije sa Slit2 (SLIKE 3D i 3E). Suprotno tome, test imuno-precipitacije in vivo pokazao je da je F-aktin, povezan sa nefrinom, koji je imuno-precipitiran uz pomoć anti-nefrinskog antitela iz bubrega Robo2 nultih novorođenih miševa, bio značajno smanjen u poređenju sa onim iz bubrega miševa divljeg tipa ili iz bubrega Robo2 heterozigotnih miševa (SLIKE 3F i 3G). Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da Slit2-Robo2 signalizacija inhibira polimerizaciju aktina, indukovanu nefrinom.
Gubitak Robo2 u podocitima uzrokuje izmenjenu strukturu prstolikih produžetaka podocita kod miševa
I mi i drugi istraživači već smo pokazali da gotovi svi Robo2 homozigotni nulti miševi sa mešovitom genetskom pozadinom umiru ubrzo nakon rođenja zbog ozbiljnog CAKUT fenotipa (Grieshammer et al., 2004; Lu et al., 2007; Wang et al., 2011). Nakon uzgoja miševa sa Robo2<del5>mutant alelom tokom pet generacija na C57BL/6 genetskoj osnovi, dobijenih parenjem Robo2<del5/+>heterozigotnih roditelja, dobili smo tri Robo2<del5/del5>homozigotna nulta miša čije preživljavanje je trajalo do 3 nedelje (među ukupno 160 miševa, analiziranih pri odvajanju od majke). Da bismo utvrdili da li je Robo2 neophodan za formiranje podocitnih prstolikih produžetaka tokom razvoja, ispitali smo ultrastrukturu glomerula kod Robo2 nultih miševa na rođenju i nakon 3 nedelje. Premda se telo podocita, njegovi produžeci i slit-dijafragma obrazuju na rođenju, transmisiona elektronska mikroskopija je pokazala fokalno brisanje prstolikih produžetaka podocita kod novorođenih Robo2<del5/del5>homozigotnih nultih miševa (SLIKE 8A-8F). Uz pomoć skenirajuće elektronske mikroskopije, zapazili smo nepravilne isprepletene produžetke kod Robo2<del5/del5>homozigotnih nultih miševa na rođenju i sa 3 nedelje starosti (SLIKE 4A-4H). Ova otkrića su pokazala da je Robo2 neophodan za modeliranje normalnih produžetaka podocita tokom razvijanja bubrega.
Radi ispitivanja uloge Robo2 u održavanju strukture podocitnih produžetaka u zrelim glomerulima, proizveli smo podocit-specifične Robo2 ʺknockoutʺ miševe putem ukrštanja uslovnih Robo2<flox/flox>miševa sa Robo2<del5/+>; Tg<Nphs2-Cre/+>heterozigotnim miševima koji nose podocin-Cre transgen. Dvadeset podocit-specifičnih Robo2 mutant miševa sa Robo2<del5/flox>; Tg<Nphs2-Cre/+>genotipom i 20 kontrolnih miševa iz legla analizirano je sve do starosti od godinu dana. Podocit-specifični Robo2 ʺknockoutʺ miševi su bili ž ivahni i fertilni. Oni su, međutim, pokazivali neuobičajeno široke prstolike produžetke podocita, i ispoljavali su fokalno segmentno brisanje podocitnih produžetaka sa starošću od jednog meseca (SLIKE 4I-4M). Sa starošću od 6 nedelja mutant miševi su razvili značajnu mikroalbuminuriju, koja je detektovana i ELISA testom i Western blot analizom (SLIKE 4N i 4O). Pored toga, skenirajućom elektronskom mikroskopijom su otkriveni nedostaci u modeliranju produžetaka podocita kod Robo2 podocitspecifičnih ʺknockoutʺ miševa. Umesto uredno isprepletenih sekundarnih produžetaka podocita, koji nalikuju rajsferšlusu kod miševa divljeg tipa, Robo2 podocit-specifični ʺknockoutʺ miševi su pokazivali obrazac nepravilnog i dezorganizovanog isprepletanja produžetaka podocita kada su bili starosti mesec dana (SLIKE 8G-8J). Tokom vremena ovi nedostaci su postajali očigledniji. Sa sedam meseci starosti, jasno dezorganizovani produžeci, koji su kraći i vijugavi, zapažaju se kod Robo2 podocit-specifičnih ʺknockoutʺ miševa (SLIKE 8K-8N), koji su bili slični fenotipu Robo2 nultih miševa, starih tri nedelje. Premda su Robo2 podocit-specifični ʺknockoutʺ miševi pokazivali normalan broj podocita, depozit matriksa je bio značajno povećan u glomerulima (SLIKE 8O-8T, Tabele 1 i 2). Ove morfološke promene pokazuju da Robo2 ima ulogu u regulisanju i održavanju strukture prstolikih produžetaka podocita glomerula.
Gubitak Robo2 ublažava strukturne nedostatke podocita kod nefrin-nultih miševa
Nefrinski homozigotni miševi razvijaju karakteristični fenotip sa dilatacijom Bowmanovog prostora, abnormalno širokim podocitnim produžecima, odsustvom glomerularnih slitdijafragmi i značajnom proteinurijom (Done et al., 2008; Hamano et al., 2002). Budući da je Robo2 obrazovao kompleks sa nefrinom, a Slit2-Robo2 signalizacija je inhibirala polimerizaciju aktina, indukovanu nefrinom, pitali smo se da li bi gubitak Robo2 mogao modifikovati podocitni fenotip kod nefrin-nultih miševa. Za testiranje ove hipoteze o mogućoj genetskoj interakciji između Robo2 i nefrina, proizveli smo Robo2<-/->;Nphs1<-/->miševe germinativne linije i podocitspecifične Robo2<flox/flox>;Tg<Nphs2-Cre/+>;Nphs1<-/->dvostruke Robo2-nefrin ʺknockoutʺ miševe. Poput Nphs1<-/->jednostrukog homozigota, oba i Robo2<-/->;Nphs1<-/->(4/4, 100%) i Robo2<flox/flox>;Tg<Nphs2-Cre/+>;Nphs1<-/->(3/3, 100%) dvostruki ʺknockoutʺ miševi su umirali u okviru 10 sati nakon rođenja. Histološka analiza, međutim, pokazala je da je morfologija glomerula kod Robo2<-/->;Nphs1<-/->dvostrukih homozigotnih miševa izgledala relativno normalno kada se uporedi sa fenotipom kod Nphs1<-/->jednostrukih nefrin-homozigotnih miševa, koji su imali dilatirani Bowman-ov prostor (SLIKE 8U-8X). Broj glomerula sa dilatiranim Bowman-ovim prostorom je značajno redukovan kod Robo2<-/->;Nphs1<-/->dvostrukih homozigotnih miševa (2/55, 3.6%), kada se uporedi sa jednostrukim nefrin-nultim miševima (31/122, 25.4%) (SLIKE 8Y i Tabela 3). Pored toga, analiza ultrastrukture glomerula, uz pomoć skenirajuće elektronske mikroskopije, pokazala je da se struktura isprepletenih podocitnih produžetaka zapaža samo kod 1 (6.67%) od 15 glomerula, dobijenih od jednostrukih nefrin-homozigotnih miševa (SLIKE 4P i 4Q), u poređenju sa 100% kod Robo2<-/->jednostrukih homozigota (SLIKE 4T i 4U) i kod kontrola divljeg tipa (SLIKE 4V i 4W). Upadljivo je da je obrazac isprepletenih produžetaka podocita ponovo uspostavljen kod 12 (75%) od 16 glomerula bubrega Robo2<-/->;Nphs1<-/->dvostrukih homozigotnih novorođenih miševa (SLIKE 4R i 4S, Tabela 4), čime se pokazuje da je istovremeni gubitak Robo2 i nefrina ublažavao fenotip, karakterisan strukturom prstolikih produžetaka podocita kod ovih miševa. Ova otkrića pokazuju da fizičke interakcije Robo2-Nck-nefrin, koje su prethodno opisane, imaju suštinski efekat na morfologiju prstolikih produžetaka podocita in vivo, kada se nivoi ekspresije Robo2 i nefrina genetski izmene.
Podociti ispoljavaju značajni stepen plastičnosti. Tokom razvijanja, oni se diferenciraju od jednostavnih kockastih epitelnih ćelija do složenih ćelija koje nose produžetke, koje prepoznajemo kao zrele podocite (Reeves et al., 1978). Ova plastičnost se zadržava nakon sazrevanja. Ovo se najbolje zapaža grafički, budući da dolazi do reverzibilnog iščezavanja podocitnih produžetaka nakon eksperimentalnog neutralisanja površinskog naelektrisanja sa protamin sulfatom i ponovnog uspostavljanja sa heparinom (Seiler et al., 1975) i tokom relapsa i remisije proteinurije kod dece sa minimalnom izmenom bolesti (Nachman et al., 2008). Mnogo suptilnije izmene podocitnih produžetaka javljaju se, mogućno, pod fiziološkim uslovima, u odgovoru na pozitivne i negativne signale, u formi hemodinamskih, hormonalnih ili parakrinih stimulusa. Dajući masu F-aktinu u podocitnim produžecima, verovatno je, a bez želje da se vezuje ili ograničava teorijom, da takvi stimulansi dovode do suptilnih promena u odgovoru na pozitivne i negativne signale, nakon transdukcije na citoskelet F-aktina. Prevelika količina i neuravnoteženost pozitivnih signala može dovesti do ispoljavanja fenotipa bolesti. U stvari, premda fiziološki ligand tek treba da se identifikuje, jasno je da povezivanje u grozdove i fosforilacija nefrina indukuju polimerizaciju aktina, putem povlačenja Nck, što je mehanizam koji može biti uključen u proteinuriju, koja je kod pacova indukovana posredstvom nefritogenog monoklonskog antitela prema ekstracelularnom domenu nefrina (Topham et al., 1999) i u slučajevima kongenitalnog nefrotskog sindroma, koji razvijaju anti-nefrinska alo-antitela nakon transplantacije bubrega (Patrakka et al., 2002).
Naša ispitivanja, koja su ovde opisana, utvrđuju drugi nivo negativne regulacije polimerizacije aktina podocita, u kojoj Robo2, kada se vezuje od strane Slit-a, inhibira polimerizaciju aktina, indukovanu nefrinom. Pretpostavljamo, bez želja da se vežemo ili ograničavamo teorijom, da Slit-Robo2 signalizacija može inhibirati polimerizaciju aktina, indukovanu nefrinom, da bi se održavala normalna struktura prstolikih produžetaka podocita, na sledeći način: Pod fiziološkim uslovima (npr., tokom razvijanja produžetaka podocita), angažovanje nefrina dovodi do fosforilacije intracelularnog Y1191/1208/1232, za koji se vezuje SH2 domen Nck (Jones et al., 2006; Verma et al., 2006). Nck, opet regrutuje regulatore citoskeleta, kao što je N-WASP, preko njegovog SH3 domena, da bi se podsticala polimerizacija aktina, za ekstenziju ili širenje prstolikih produžetaka podocita (SLIKA 8Z). Lokalna sekrecija i vezivanje za Slit povećavaju interakciju Robo2 sa Nck, preko njegovog, prolinom bogatog, regiona i prva dva SH3 domena Nck. Sekvestriranjem prva dva SH3 domena Nck-a posredstvom Robo2, inhibirala bi se nefrinom-Nck-om posredovana polimerizacija aktina i smanjio bi se F-aktin, udružen sa nefrinom, da bi se održao dinamski i uravnoteženi citoskelet F-aktina i normalna struktura produžetaka podocita (SLIKA 8Z). Pored direktne inhibicije nefrinom-indukovane polimerizacije aktina, preko Nck, Slit-Robo2 signalizacija može inaktivirati polimerizaciju aktina, posredstvom drugih puteva, kao što je povlačenje Ena, Abl, srGAP-a zbog negativne regulacije citoskeleta F-aktina, kao što je ranije prikazano (Bashaw et al., 2000; Wong et al., 2001). U odsustvu Slit2-Robo2 signalizacije (npr., kada je Robo2 izbačen), inhibitorni efekti Robo2 na polimerizaciju, indukovanu nefrinom, se gube. SH3 domeni Nck su u stanju da ulaze u interakciju sa nishodnim regulatorima citoskeleta, da bi se povećala polimerizacija aktina (SLIKA 8Z), čime se može objasniti struktura izmenjenih prstolikih produžetaka podocita, koja se identifikuje kod Robo2 mutant miševa. Sledstveno tome, naši rezultati, koji su ovde opisani, predstavljaju potporu mehanizmu, posredstvom koga Slit-Robo signalizacija može regulisati plastičnost podocita, putem negativne regulacije citoskeleta F-aktina, što je slično ulozi Slit-Robo signalizacije pri pronalaženju kupaste putanje razvoja aksona (Guan i Rao, 2003). Patološki nalaz povećanog depozita matriksa u glomerulima Robo2 mutant miševa verovatno predstavlja sekundarni odgovor.
Premda je iz naših ispitivanja, koja su ovde opisana, jasno da se Robo2 lokalizuje na bazalnoj površini podocita i obrazuje kompleks sa drugim utvrđenim slit-dijafragmalnim proteinima produžetaka podocita, preko njegovog intracelularnog domena, ostaje sporno da li on u stvari čini deo same slit-dijafragme. Interesantno je da ekstracelularni domen Robo2 liči na domen nefrina, koji ima osam motiva, sličnih imunoglobulinu (Ig), i jedan domen fibronektina, dok Robo2 ima pet motiva sličnih Ig, i tri domena fibronektina (SLIKA 8Z) (Tryggvason et al., 2006). Ispitali smo interakciju između intracelularnog domena Robo2 i citoplazmatskog domena nefrina u dvo-hibridnom testu kvasaca. Naši biohemijski podaci (SLIKE 2E i 2F), takođe, nisu podržali direktnu interakciju između ova dva receptora in vitro. Postoji, međutim, mogućnost da se ekstracelularni domen Robo2 može udružiti sa ekstracelularnim domenom nefrina in vivo na ćelijskim membranama susednih prstolikih produžetaka podocita, posredstvom trans-interakcije u slit-dijafragmi.
Utvrdili smo da su Robo2 homozigotni nulti i podocit-specifični ʺknockoutʺ miševi razvili izmenjene prstolike produžetke podocita, koji poprimaju isprepleteni model, fenotip koji se razlikuje od fenotipa nefrin nultih miševa (Hamano et al., 2002; Done, 2008). Ovo nije iznenađujuće budući da nefrin i Robo2 igraju suprotne uloge u regulisanju F-aktinskog citoskeleta podocita. Budući da nefrinska signalizacija indukuje lokalizovanu polimerizaciju aktina, Slit2-Robo2 signalizacija deluje kao negativni regulator na polimerizaciju aktina, da bi se održavala plastičnost i dinamika produžetaka podocita. Pažnje je vredna činjenica da se slična manjkavost u organizaciji produžetaka podocita zapaža kod miševa kod kojih je aktindepolimerizacijski faktor kofilin-1, koji je drugi negativni regulator citoskeleta F-aktina u podocitima, izbačen (Garg et al., 2010). Ovo ukazuje da ć e odsustvo faktora koji podstiče polimerizaciju aktina, kao što je nefrinska signalizacija, ili inhibitornog faktora, kao što je Robo2 signalizacija, imati uticaja na normalnu strukturu podocita. Sledstveno tome, ravnoteža između pozitivnih i negativnih regulatora citoskeleta F-aktina u podocitima, jeste važna za održavanje normalne strukture prstolikih produžetaka. Ponovno uspostavljanje ove ravnoteže, putem izbacivanja i pozitivnih (nefrin) i negativnih (Robo2) signala, može objasniti obnovu isprepletenih podocitnih prstolikih produžetaka i pojavu blažeg glomerularnog fenotipa kod dvostrukih Robo2-nefrin ʺknockoutʺ miševa. Naše studije, koje su ovde opisane, pokazuju dvostruke uloge nefrina kao suštinske komponente u slit-dijafragmi za kontrolisanje glomerularne perm-selektivnosti s jedne strane (Tryggvason et al., 2006) i kao regulatora morfologije podocitnih produžetaka posredstvom interakcije sa citoskeletom aktina (Jones et al., 2006; Verma et al., 2006) sa druge strane. Budući da Robo2 signalizacija jasno pobija pozitivne efekte nefrinske signalizacije na podocitne prstolike produžetke, ostaje da se utvrdi da li ona, isto tako, ima uticaja na integritet slit-dijafragme.
Sledstveno tome, kako je ovde opisano, identifikovali smo Robo2 kao novu komponentu intercelularnog povezivanja podocita u bubregu. Pokazali smo interakcije između Robo2 i nefrina uz korišćenje biohemijskih, funkcionalnih i genetskih tehnika i prikazali kako Slit2-Robo2 signalizacija inhibira nefrinom indukovanu dinamiku aktina. Naš razultati pokazuju da Robo2 signalizacija deluje kao negativni regulator na nefrin za moduliranje arhitekture podocitnih produžetaka. Ova studija proširuje naše razumevanje uloge Slit-Robo signalizacije i identifikuje novi mehanizam ukrštene komunikacije posredstvom koje bi Robo receptor reda navođenja mogao uticati na dinamiku F-aktinskog citoskeleta.
Ukoliko nije ovde drugačije definisano, naučni i tehnički termini, koji su korišćeni u vezi sa tekućom aplikacijom, imali bi značenja, koja se uobičajeno podrazumevaju od strane lica uobičajene stručnosti u oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada. Podrazumevalo bi se da ovaj pronalazak nije ograničen na određenu metodologiju, protokole i reagense, itd., koji su ovde opisani, i da, kao takvi mogu varirati. Terminologija, koja je ovde korišćena, namenjena je isključivo potrebama opisa određenih ostvarenja, a nije joj namera da ograniči okvir tekućeg pronalaska, koji je definisan samo posredstvom patentnih zahteva. Definicije opštih termina u imunologiji i molekularnoj biologiji mogu se naći u: The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 18. izdanje, koji je publikovan od strane Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-911910-18-2); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publikovana od strane Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); i Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publikovan od strane VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology Wernera Luttmanna, publikovana od strane Elsevier, 2006. Definicije opštih termina u molekularnoj biologiji nalaze se u Benjamin Lewin, Genes IX, koji je publikovan od strane Jones & Bartlett Publishing, 2007 (ISBN-13: 9780763740634); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publikovana od strane Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); i Robert A. Meyers (ed.), Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. izdanje), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1986); ili Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques Vol.152, S. L. Berger i A. R. Kimmerl Eds., Academic Press Inc., San Diego, USA (1987); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB) (Fred M. Ausubel, et al. ed., John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan, et. al., ed., John Wiley and Sons, Inc.) i Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, et. al., ed. John Wiley and Sons, Inc.).
Kako je ovde korišćen, izraz "sadržavati" znači da, pored definisanih elemenata, takođe mogu biti prisutni i drugi elementi. Korišćenje izraza "sadržavati" ukazuje pre na uključivanje nego na ograničavanje.
Kako je ovde korišćen, izraz "suštinski sačinjen od" odnosi se na one elemente koji su neophodni za dato ostvarenje. Izraz dopušta prisustvo dodatnih elemenata, koji materijalno ne utiču na bazične i nove ili funkcionalne karakteristike ostvarenja pronalaska.
Naziv "sačinjen od" se odnosi na kompozicije, postupke i njihove odgovarajuće komponente, kao što je ovde opisano, kojima se isključuje bilo koji element koji nije naveden u tom opisu ostvarenja.
Pored toga, ukoliko se iz konteksta ne zahteva drugačije, izrazi u jednini bi uključivali izraze u množini, a izrazi u množini ć e uključivati izraz u jednini. Kako je korišćeno u ovoj specifikaciji i priključenim patentnim zahtevima, izrazi u jednini uključuju reference u množini ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije. Sledstveno tome, primera radi, reference na "postupak" uključuju jedan ili više postupaka i/ili koraka, ovde opisane vrste i/ili onih koji će stručnjacima u ovoj oblasti biti očigledni nakon čitanja ovog izlaganja, i tako dalje.
Za razliku od operativnih primera, ili kada je indikovano drugačije, svi brojevi, koji izražavaju količine sastojaka ili reakcione uslove, koji su ovde opisani, trebalo bi da se shvataju tako da su, u svim slučajevima, modifikovani posredstvom izraza "oko". Izraz "oko", kada se koristi u vezi sa procentima, može značiti ±1%.
Podrazumevalo bi se da ovaj pronalazak nije ograničen na određenu metodologiju, protokole i reagense, itd., koji su ovde opisani, i, da kao takvi mogu varirati. Ovde korišćena terminologija je namenjena isključivo potrebama opisa određenih ostvarenja, a nije joj namera da ograniči okvir tekućeg pronalaska, koji je definisan samo posredstvom patentnih zahteva.
Ostvarenja raznih aspekata, koji su ovde opisani, mogu biti ilustrovana posredstvom sledećih numerisanih stavki:
2. Postupak za lečenje hronične bolesti bubrega kod ispitanika kome je to potrebno, pri čemu postupak obuhvata primenu ispitaniku koji boluje ili je pod rizikom od hronične bolesti bubrega, terapeutski efektivne količine kompozicije koja sadrži inhibitor ROBO2.
3. Postupak za smanjenje proteinurije kod ispitanika kome je to potrebno, pri čemu postupak obuhvata primenu ispitaniku koji ima ili je pod rizikom od proteinurije, terapeutski efektivne količine kompozicije koja sadrži inhibitor ROBO2.
4. Postupak iz bilo koje od stavki 1 ili 2, pri čemu je inhibitor ROBO2 blokirajuće antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, koji je specifičan za ROBO2, antisens molekul, koji je specifičan za ROBO2, kratka interferirajuća RNA (siRNA), specifična za ROBO2, inhibitor ROBO2 malog molekula, ROBO2 inhibitorni polipeptid ili strukturni analog ROBO2.
5. Postupak iz bilo koje od stavki 1-3, pri čemu inhibitor ROBO2 blokira ili smanjuje vezivanje ROBO2 za SLIT, za Nck ili za oba.
6. Postupak iz bilo koje od stavki 1-4, pri čemu je inhibitor ROBO2 specifičan za vezujući domen Ig1 SLIT, Ig1 i Ig2 SLIT vezujuće domene, intracelularni domen Nck, ili bilo koju njihovu kombinaciju.
7. Postupak iz stavke 3, pri čemu je inhibitorni polipeptid ROBO2 dominantni negativni fuzioni protein ROBO2, polipeptid koji sadrži ekstracelularni domen ROBO2 bez intracelularnog domena, ili polipeptid koji sadrži intracelularni domen ROBO2, bez ekstracelularnog domena.
8. Postupak iz bilo koje od stavki 1-6, pri čemu ispitanik koji boluje ili je pod rizikom od hronične bolesti bubrega ima dijabetičnu nefropatiju ili visoki krvni pritisak.
9. Postupak iz bilo koje od stavki 1-7, koji, dalje, uključuje primenu ispitaniku dodatnog terapeutskog sredstva.
10. Postupak iz stavke 8, pri čemu je dodatno terapeutsko sredstvo inhibitor angiotenzinkonvertujućeg enzima (ACE) ili blokator receptora angiotenzina II (ARB).
11. Postupak koji uključuje:
a. testiranje biološkog test uzorka ispitanika da bi se odredio nivo ekspresije ROBO2 polipeptida ili RNA koja kodira polipeptid ROBO2;
b. utvrđivanje da li je nivo ekspresije ROB02 polipeptida ili nivo ekspresije RNA koja kodira polipeptid ROBO2 u biološkom test uzorku iznad nivoa referentnog praga i c. dijagnostiku ispitanika kome je potreban tretman ili terapija za hroničnu bubrežnu bolest.
12. Postupak iz stavke 10, pri čemu se testiranje nivoa ekspresije ROB02 polipeptida izvodi korišćenjem antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koji su specifični za ROBO2 polipeptid.
13. Postupak iz stavke 10, pri čemu se ispitivanje nivoa ekspresije RNA koja kodira ROBO2 polipeptid vrši korišćenjem PCR-a ili testa hibridizacije.
14. Postupak iz bilo koje od stavki 10-12, pri čemu je biološki test uzorak uzorak biopsije bubrega, urin, krv, uzorak seruma ili ćelije, iscentrifugirane iz uzorka urina.
15. Postupak iz bilo koje od stavki 10-13, pri čemu je nivo ekspresije ROBO2 polipeptida ili nivo ekspresije RNA koja kodira ROB02 polipeptid najmanje 20% iznad nivoa referentnog praga.
16. Postupak iz bilo koje od stavki 10-13, pri čemu je nivo ekspresije ROBO2 polipeptida ili nivo ekspresije RNA koja kodira ROBO2 polipeptid za najmanje dve standardne devijacije viši od nivoa referentnog praga.
17. Test koji uključuje:
a. dovođenje u kontakt biološkog test uzorka, dobijenog od ispitanika, sa reagensom koji detektuje ROBO2 polipeptid ili RNA koja kodira polipeptid ROBO2; i
b. merenje koncentracije ROBO2 polipeptida ili RNA koja kodira ROBO2 polipeptid, c. pri čemu se posredstvom povećanja koncentracije navedenog ROB02 polipeptida ili navedene RNA koja kodira ROBO2 polipeptid, u odnosu na normalni biološki uzorak, identifikuje pojedinac koji ima hroničnu bubrežnu bolest i/ili progresiju hronične bolesti bubrega ili proteinuriju.
18. Test iz stavke 16, pri čemu se detekcija nivoa ekspresije ROBO2 polipeptida vrši korišćenjem antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koji su specifični za ROBO2 polipeptid.
19. Test iz stavke 16, pri čemu se detekcija nivoa ekspresije RNA koja kodira ROBO2 polipeptid vrši korišćenjem PCR-a ili testa hibridizacije.
20. Test iz bilo koje od stavki 16-18, pri čemu je biološki test uzorak uzorak biopsije bubrega, urin, krv, uzorak seruma ili ćelije, iscentrifugirane iz uzorka urina.
21. Test iz bilo koje od stavki 16-19, pri čemu je nivo ekspresije ROBO2 polipeptida ili nivo ekspresije RNA koja kodira ROBO2 polipeptid najmanje 20% iznad nivoa referentnog praga.
22. Test iz bilo koje od stavki 16-19, pri čemu je nivo ekspresije ROBO2 polipeptida ili nivo ekspresije RNA koja kodira ROB02 polipeptid za najmanje dve standardne devijacije iznad nivoa referentnog praga.
23. Test iz bilo koje od stavki 16-21, pri čemu ispitanik ima dijagnozu dijabetesa ili visokog krvnog pritiska.
24. Sistem za utvrđivanje da li je ispitanik pod rizikom za hroničnu bubrežnu bolest ili proteinuriju, ili ima hroničnu bubrežnu bolest, pri čemu sistem uključuje:
a. merni modul koji je konfigurisan tako da određuje nivo ekspresije ROBO2 polipeptida ili nivo ekspresije RNA, koja kodira ROBO2 polipeptid, u biološkom uzorku, dobijenom od ispitanika;
b. komparativni modul, koji je konfigurisan tako da prihvata navedeni nivo ekspresije ROBO2 polipeptida ili nivo ekspresije RNA koja kodira ROBO2 polipeptid, izmeren korišćenjem mernog modula, i vrši najmanje jednu analizu za utvrđivanje da li je nivo ekspresije ROB02 polipeptida ili nivo ekspresije RNA koja kodira ROB02 polipeptid, veći od prethodno-utvrđenog referentnog nivoa ili odnosa, i za obezbeđivanje preuzetog sadržaja; i
c. displej modul za prikazivanje sadržaja, baziranog na izlaznim podacima, dobijenim iz navedenog komparativnog modula, pri čemu sadržaj obuhvata signal, koji je pokazatelj da je ekspresioni nivo ili odnos ROBO2 polipeptida ili RNA veći od prethodno utvrđenog referentnog nivoa ili odnosa, ili signal, koji je pokazatelj da nivo ekspresije ili odnos ekspresije ROBO2 nije veći od referentnog nivoa ili prethodno utvrđenog odnosa.
25. Sistem iz stavke 23, pri čemu sadržaj koji je prikazan na navedenom displej modulu dalje sadrži signal koji je pokazatelj, indikativan za ispitanika kome se preporučuje prihvatanje određenog režima tretmana.
26. Sistem za utvrđivanje da li je ispitanik pod rizikom od hronične bolesti bubrega ili proteinurije, ili ima hroničnu bubrežnu bolest, pri čemu sistem uključuje:
a. determinacijski modul, koji je konfigurisan za prihvatanje najmanje jednog test uzorka, dobijenog od ispitanika, i izvođenje najmanje jedne analize u navedenom najmanje jednom test uzorku, da bi se utvrdilo prisustvo ili odsustvo bilo kog od sledećih kriterijuma:
i. ekspresioni odnos ROBO2 veći od prethodno-utvrđenog odnosa, ili
ii. nivo ekspresije ROBO2 veći od prethodno-utvrđenog nivoa
b. uređaj za skladištenje podataka, konfigurisan za čuvanje podataka, dobijenih iz navedenog determinacijskog modula, i
c. displej modul za prikazivanje sadržaja, baziranog na izlaznim podacima, dobijenim iz navedenog determinacijskog modula, pri čemu sadržaj obuhvata signal, koji je pokazatelj da je odnos ekspresije ROBO2 veći od prethodno ustanovljenog odnosa ili je nivo ROBO2 veći od prethodno ustanovljenog nivoa, ili signal koji je pokazatelj da odnos ekspresije ROBO2 nije veći od prethodno utvrđenog odnosa ili nije veći od prethodno ustanovljenog nivoa.
27. Sistem iz stavke 25, pri čemu sadržaj, koji je prikazan na navedenom displej modulu dalje sadrži signal, koji je pokazatelj, indikativan za ispitanika kome se preporučuje prihvatanje određenog režima tretmana.
28. Postupak za tretman humanog ispitanika, koji je pod rizikom od hronične bolesti bubrega ili proteinurije, pri čemu postupak obuhvata primenu tretmana ili terapije za sprečavanje pojave hronične bolesti bubrega ili proteinurije kod humanog ispitanika, za koga je utvrđeno da ima nivo ROBO2 proteina koji je viši od nivoa referentnog praga.
29. Postupak iz stavke 27, pri čemu je koncentracija ROBO2 proteina najmanje 20% viša od referentnog nivoa.
30. Postupak iz stavke 27, pri čemu je koncentracija ROB02 proteina za najmanje dve standardne devijacije viša od referentnog nivoa.
31. Postupak iz bilo koje od stavki 27-29, pri čemu tretman ili terapija za sprečavanje pojave hronične bolesti bubrega ili proteinurije uključuju inhibitor ROBO2.
32. Postupak iz stavke 30, u kome je inhibitor ROBO2 blokirajuće antitelo ili njegov antigenvezujući fragment koji je specifičan za ROBO2, antisens molekul koji je specifičan za ROBO2, kratka interferirajuća RNA (siRNA), specifična za ROBO2, inhibitor ROBO2 malog molekula, ROBO2 inhibitorni polipeptid ili strukturni analog ROBO2.
33. Postupak iz bilo koje od stavki 30-31, pri čemu inhibitor ROB02 blokira ili redukuje vezivanje ROBO2 za SLIT, za Nck ili za oba.
34. Postupak iz bilo koje od stavki 30-32, pri čemu je inhibitor ROB02 specifičan za Ig1 SLIT vezujući domen, Ig1 i Ig2 SLIT vezujuće domene, intracelularni vezujući domen Nck ili bilo koju njihovu kombinaciju.
35. Postupak iz stavke 31, pri čemu je ROBO2 inhibitorni polipeptid dominantni negativni ROBO2 fuzioni protein, polipeptid koji sadrži ekstracelularni domen ROBO2 bez intracelularnog domena ili polipeptid koji sadrži intracelularni domen ROBO2 bez ekstracelularnog domena.
36. Inhibitor ROBO2 za korišćenje u lečenju hronične bolesti bubrega.
37. Inhibitor ROB02 za korišćenje u lečenju proteinurije.
38. Korišćenje iz bilo koje od stavki 35 ili 36 pri čemu je inhibitor ROB02 blokirajuće antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji je specifičan za ROBO2, antisens molekul koji je specifičan za ROBO2, kratka interferirajuća RNA (siRNA), specifična za ROBO2, inhibitor ROBO2 malog molekula, ROBO2 inhibitorni polipeptid ili strukturni analog ROBO2.
39. Korišćenje iz bilo koje od stavki 35-37, pri čemu inhibitor ROBO2 blokira ili smanjuje vezivanje ROBO2 za SLIT, za Nck ili za oba.
40. Korišćenje iz bilo koje od stavki 35-38, pri čemu je inhibitor ROBO2 specifičan za vezujući domen Ig1 SLIT, za vezujuće domene Ig1 i Ig2 SLIT, za intracelularni vezujući domen Nck, ili bilo koju njihovu kombinaciju.
41. Korišćenje iz stavke 37, pri čemu je inhibitorni polipeptid ROB02 dominantni negativni ROBO2 fuzioni protein, polipeptid koji sadrži ekstracelularni domen ROBO2 bez intracelularnog domena ili polipeptid koji sadrži intracelularni domen ROBO2 bez ekstracelularnog domena.
42. Korišćenje iz bilo koje od stavki 35-40, pri čemu je hronična bolest bubrega ili proteinurija izazvana dijabetičnom nefropatijom ili visokim krvnim pritiskom.
Ovaj pronalazak je, dalje, ilustrativno prikazan uz pomoć sledećih primera koji ne bi trebalo da se tumače kao ograničenje.
PRIMERI
Tkivna in situ hibridizacija, imunohistohemija i imuno-gold elektronska mikroskopija Analiza in situ hibridizacije je izvršena sa riboprobama Robo2 obeleženim digoksigeninom, kako je ranije opisano (Grieshammer et al., 2004). Imunohistohemija je izvršena na uzorcima tkiva bubrega mišjih embriona, fiksiranih u 4% paraformaldehidu i u uzorcima tkiva odraslog miša, koji su fiksirani u metanolu. Za imuno-gold elektronsku mikroskopiju, izvršena su seciranja bubrega miša divljeg tipa i fiksirana su u paraformaldehidlizin-perjodat-u (PLP). Ultratanki odsečci tkiva mišjeg bubrega su pripremljeni i inkubirani sa kozjim anti-Robo2 antitelom (DAKO Corporation) i sekundarnim antitelom, koje je kuplovano sa 10 nm koloidnog zlata (Ted Pella).
Dvo-hibridni testovi kvasaca, testovi ko-precipitacije i polimerizacije aktina
DUPLEX-A™ dvo-hibridni sistem kvasaca (OriGene Tech) je korišćen za karakterizaciju interakcije Robo2 i Nckl, prema instrukcijama proizvođača. Ćelijska kultura, koprecipitacija proteina sa his-tagom i imunoprecipitacija su izvršeni kao š to je ranije prikazano (Fan et al., 2003). Za endogenu imunoprecipitaciju, korišćeni su bubrezi novorođenih miševa. Testovi unakrsnog povezivanja CD16/7 fuzionih proteina, posredovanog CD16 antitelom i polimerizacije aktina izvršeni su kao što je ranije opisano (Jones et al., 2006; Rivera et al., 2004; Verma et al., 2006).
Studije na ʺknockoutʺ miševima, transmisiona i skenirajuća elektronska mikroskopija i analiza glomerula bubrega
Odobrenje za protokole ispitivanja na miševima dobijeno je u Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Medicinskog centra Bostonskog univerziteta (#14388).Proizvodnja i genotipizacija Robo2<flox uslovnih alela, mutant alela germinativne linije Robo2del5>(takođe pod nazivom Robo2<->koji je u ovom dokumentu korišćen kao zamena prvom nazivu) i alela Robo2<+>divljeg tipa, ranije su opisani (Lu et al., 2007; Wang et al., 2011). Da bi se razvili dvostruki Robo2-nefrin ʺknockoutʺ miševi, Robo2<+/->miševi su ukršteni sa Nphs1<+/->miševima koji su ranije proizvedeni (Hamano et al., 2002). Za transmisionu elektronsku mikroskopiju, bubrezi su fiksirani, inkubirani su u 2% glutaraldehidu u 0.15 M natrijum kakodilatu, izvršena je dehidracija u stepenovanom etanolu, potapanje u Epon, seciranje i bojenje sa uranil acetatom i olovnim citratom. Ultratanki odsečci bubrega su ispitani korišćenjem JEM-1011 elektronskog mikroskopa. Za skenirajuću elektronsku mikroskopiju, bubrezi su pripremljeni sledeći standardni protokol. Za ispitivanja bubrežne patologije, bubrezi su fiksirani u 4% paraformaldehidu, potopljeni su u parafin, secirani i obojeni korišćenjem standardnih postupaka baziranih na bojenju perjodna kiselina-Schiff (PAS) ili eozin hematoksilin (H&E). Za kvantitativno utvrđivanje broja podocita, WT1 je korišćen kao nuklearni marker podocita, a imunoperoksidazno bojenje je izvršeno na odsečcima bubrega praćenjem standardnog protokola. Izbrojana su WT1 pozitivna jedra podocita u svakom poprečnom preseku glomerula. Za ispitivanje proteinurije, "spot" uzorci urina miševa starih 6 nedelja su analizirani korišćenjem kvantitativnog ELISA kita za utvrđivanje mišje albuminurije (Exocell), prema uputstvu proizvođača i sa urinskim trakama (Multistix, Bayer, IN), kao skrining postupkom.
Tkivna in situ hibridizacija i imunohistohemija
Analiza in situ hibridizacije izvršena je sa riboprobama Robo2 obeleženim digoksigeninom, kako je ranije opisano (Grieshammer et al., 2004). cDNA Robo2 je linearizovana sa NotI, a probe su razvijene korišćenjem DIG DNA obeležavanja i kita za detekciju (Roche Applied Science). Hibridizacija je izvršena na zamrznutim odsečcima tkiva bubrega embriona miša, fiksiranim u 4% paraformaldehidu i potopljenim u OCT. Imunohistohemija je izvedena na tkivima bubrega mišjeg embriona, koji su fiksirani u 4% paraformaldehidu, nakon čega je sledila krioprotekcija sa 30% saharozom (Mugford et al., 2008), a tkiva bubrega odraslih miševa su fiksirana u metanolu. Bubrezi miševa, potopljeni u OCT jedinjenje, zamrznuti su i isečeni korišćenjem Cryostat-a na 8-10 µm. Odsečci tkiva su obojeni sa primarnim antitelima, nakon čega je sledila primena odgovarajućih FITC ili Cy3 konjugovanih sekundarnih antitela. Primarna antitela, korišćena u ovoj studiji, uključuju antitela prema ROBO2 (R&D System, Abnova, Santa Cruz Biotechnology), nefrinu (sintetisana po narudžbi) (Topham et al., 1999), Nck (Upstate/Millipore), podocinu (Sigma), nidogenu (Santa Cruz Biotechnology), Pecam1 (BD Biosciences), WT1 (Santa Cruz Biotechnology), SLIT2 (Santa Cruz Biotechnology), beta PDGFR (Cell Signaling), sinaptopodinu (Santa Cruz Biotechnology). Snimci su dobijeni korišćenjem Perkin Elmer konfokalnog laser-skenirajućeg ʺmulti-pointʺ mikroskopa UltraView LCI sa ʺspinningʺ diskom i Zeiss LSM 510 konfokalnog laserskenirajućeg mikroskopa sa 60x uljnim imerzionim objektivom.
Imuno-gold elektronska mikroskopija
Bubrezi miševa divljeg tipa su secirani i fiksirani u paraformaldehid-lizin-perjodatu (PLP), na 4°C, preko noći. Tkivo je isprano sa 1x PBS, dehidrirano je u stepenovanom etanolu i potopljeno u LR beloj smoli (Electron Microscopy Sciences). Izrađeni su ultratanki preseci mišjeg bubrega i preneseni su u zlatne mrežice obložene formvarom, a blokiranje je izvršeno sa 1% goveđim serumskim albuminom i 5% normalnim kozjim serumom u 1x PBS. Odsečci su, nakon toga, inkubirani sa kozjim anti-Robo2 antitelom u razblaženju od 1:50 u DAKO (DAKO Corporation), na 4°C, preko noći. Kao kontrola je korišćen ne-imuni serum. Nakon tri ispiranja sa 1x PBS, odsečci su inkubirani sa sekundarnim IgG antitelom, kuplovanim sa 10 nm koloidnim zlatom (Ted Pella), tokom 2 sata na sobnoj temperaturi. Post-fiksiranje odsečaka tkiva je, na kraju, urađeno sa 1% glutaraldehidom, a kao kontrast je poslužio uranil acetat. Preseci tkiva su ispitani sa JEM-1011 transmisionim elektronskim mikroskopom (JEOL, Tokyo, Japan) na 80 kV, a snimci su dobijeni korišćenjem AMT digitalnog imidžing sistema (Advanced Microscopy Techniques, Danvers, MA.) i uneseni su u Adobe Photoshop. Sub-celularna lokalizacija Robo2, uz bojenja sa zlatnim česticama u glomerulima, prepoznaje se na digitalnim elektronskim mikrograficima, u poređenju sa kontrolnim mikrograficima, obojenim sa ne-imunim serumom.
Dvo-hibridni test kvasaca
Dvo-hibridni DUPLEX-A™ sistem kvasaca (OriGene Tech, Rockville, MD) je korišćen za karakterizaciju interakcije Robo2 i Nckl. cDNA, koje kodiraju intracelularni domen humanog Robo2 i njegove skraćene forme, klonirane su u pJG4-5 vektor na EcoRI/XhoI položajima, uz njihovu fuziju sa transkripcionim aktivacijskim domenom B42. cDNA humanog Nckl i njegovih skraćenih formi klonirane su u pEG202 vektor na EcoRI/XhoI da bi se izvršila njihova fuzija sa DNA vezujućim domenom LexA. Gen lacZ u konstrukciji pSH18-34 i gen LEU2 u genomu EGY48 soja kvasca, korišćeni su kao reporter geni. pEG202, pSH18-34 i pJG4-5 konstrukcije su ko-transformisane u ćelije EGY48 kvasca. Interakcija se smatrala pozitivnom ukoliko su ćelije kvasca menjale boju u plavo u prisustvu X-gala i rasle u odsustvu leucina.
Analiza ćelijske kulture, konstrukcije DNA, transfekcije, ko-precipitacije i Western Blot analiza
HEK (293T) ćelije su transfektovane sa 60%-tnim srastanjem, uz korišćenje transfekcije kalcijum fosfatom. Da bi se izradili fuzioni proteini sa C-terminalnim his- i myctagovima, humani nefrin i Robo2 pune dužine su klonirani u pSecTag B vektor (Invitrogen) na restriktivnim položajima Hind III/EcoR1, odnosno EcoR1/Xho1. Robo2-ΔNBD je dobijen delecijom vezujućeg domena Nck (Slika 2C), uz korišćenje kita QUIKCHANGE za mutagenezu usmerenu ka položaju (Strategene), prema instrukcijama proizvođača. Robo2 i Nckl bez tagova, su klonirani u pCS2 vektor (Addgene), na EcoR1/Xho1 položajima, a nefrin na HindIII/EcoR1 položajima. Humane Slit2 konstrukcije sa Fyn- i myc-tagovima prikazane su ranije (Li et al., 2008; Wong et al., 2001). CD16/7-NCD i CD16/7-HA konstrukcije su, takođe, ranije prikazane (Verma et al., 2006). Da bi se detektovala interakcija Robo2 i Nckl, humani Robo2 ili Robo2-ΔNBD, sa C-terminalnim his- i myc-tagovima, je ekspresovan u HEK ćelijama. Četrdeset osam sati nakon transfekcije, ćelije su lizirane u puferu za liziranje (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, 0.5% TX100, 1x proteaza inhibitor [pH 8.0]). Ćelijski lizati su centrifugirani tokom 10 minuta, na 4°C; supernatanti su inkubirani sa Ni-NTA smolom (Qiagen), na 4°C, tokom 2 sata, da bi se precipitirao His-Robo2, a NTA smola bez Ni je korišćena kao kontrola. Smola je isprana, tri puta, sa puferom za ispiranje (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol, 0.5% TX100 [pH 8.0]) i zagrevana je na 95°C, tokom 10 minuta. Precipitati su razdvojeni na SDS-PAGE gelovima i ocrtani su sa zečjim anti-myc, zečjim monoklonskim anti-Nckl (Cell Signaling) antitelima u razblaženju od 1:1000. Da bi se ispitala trostruka interakcija između Robo2, Nckl i nefrina, His-myc-Robo2 ili His-myc-Robo2-ΔNBD su ko-ekspresovani u HEK ćelijama sa humanim nefrinom i humanim Fyn. His-myc-Robo2 je isprecipitiran sa Ni-NTA zrncima, kao što je prethodno opisano. Da bi se potvrdila trostruka interakcija, His-myc-nefrin je ko-ekspresovan sa Robo2 i Fyn u HEK ćelijama, a His-myc-nefrin je povučen na dole pomoću Ni-NTA zrnaca. Precipitati su ocrtani sa zečjim poliklonskim anti-myc, zečjim monoklonskim anti-Nckl, zečjim poliklonskim anti-nefrin, mišjim monoklonskim anti-Robo2 (R&D systems) i zečjim poliklonskim anti-Fyn (Santa Cruz Biotechnology) antitelima u razblaženju od 1:1000. Za potrebe ko-imunoprecipitacije endogenih proteina, bubrezi novorođenih miševa su homogenizovani u RIPA puferu (50 mM Tris [pH 7.4], 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% natrijum deoksiholat, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1x inhibitor proteaze) na ledu. Uzorci su centrifugirani tokom 10 minuta na 4°C, a supernatant je inkubiran sa 1 µg mišjeg monoklonskog anti-Robo2 antitela (R&D Systems), tokom 1 sata na 4°C. Kontrolna kozja IgG antitela (Santa Cruz Biotechnology) su korišćena kao kontrola. Uzorci su, nakon toga, pomešani sa 30 µl žitke mase protein A/G plus agarozna zrnca (Santa Cruz Biotechnology) i dalje su inkubirani tokom 12 sati na 4°C. Zrnca su, zatim, isprana, tri puta u RIPA puferu, a proteini su eluirani u 1x proteinskom puferu za punjenje, putem zagrevanja na 95°C, tokom 10 minuta. Precipitati su razdvojeni na SDS-PAGE gelovima, a ocrtavanje u vidu mrlja urađeno je sa mišjim anti-Robo2, zečjim anti-nefrin i zečjim anti-Nckl antitelima, kako je prethodno opisano. Aktin je ocrtan u vidu mrlje sa anti-beta-aktinskim mišjim antitelom od Sigme. Intenzitet traka je izmeren korišćenjem ImageJ. Za detekciju proteinurije, ʺ spotʺ uzorci urina miša su sakupljeni i razblaženi sa 1x proteinskim puferom za punjenje u razblaženju od 1:100. Proteini urina su, nakon toga, razdvojeni na SDS-PAGE gelovima, a prečišćeni albumin je korišćen kao kontrola (MP Biomedicals). Gelovi su, za potrebe ocrtavanja u vidu mrlje, izloženi zečjem anti-albuminskom poliklonskom antitelu (MP Biomedicals).
Test unakrsnog povezivanja CD16/7-NCD i polimerizacije aktina
Unakrsno povezivanje CD16/7 fuzionih proteina, posredovano CD16 antitelom, opisano je ranije (Jones et al., 2006; Rivera et al., 2004; Verma et al., 2006). Ukratko, CD16/7-NCD ili CD16/7-HA je ko-ekspresovan u HEK ćelijama sa Robo2. Nakon 24 sata, ćelije su prenesene i zasejane na staklene pokrivene ploče, obložene polilizinom, tokom naredena 24 sata. Ćelije su, nakon toga, inkubirane sa 1 µg/ml mišjih monoklonskih anti-CD16 antitela (Beckman Coulter), tokom 30 minuta, na 37°C, isprane su, jednom sa DMEM-om, inkubirane su sa sekundarnim antitelom, konjugovanim sa rodaminom (Thermo Scientific), koje je razblaženo u Slit2 kondicioniranom medijumu (Wong et al., 2001) ili kontrolnom kondicioniranom medijumu, tokom 30 minuta, i fiksirane su u 4% paraformaldehidu u 1x PBS. F-aktin je obojen korišćenjem faloidina, konjugovanog sa FITC-om (Invitrogen), prema uputstvu proizvođača. Novo-formirane gomilice F-aktina se slepljuju sa grozdastim nefrinom (CD16/7-NCD) i izgledaju poput repa komete (t.j., aktinski repovi u glavnom tekstu) pod fluorescentnim mikroskopom. U ovom eksperimentu, analizirali smo samo gomilice F-aktina, koje se obrazuju povezivanjem sa grozdastim CD16/7-NCD i pričvršćivanjem za ove grozdove. Ćelije sa repovima F-aktina se izbroje i uporede sa ukupnim brojem CD16/7-NCD transfektovanih ćelija. Formula za kvantitativno određivanje je: procenat % = (broj transfektovanih ćelija sa repovima F-aktina / ukupan broj transfektovanih ćelija) X 100. Snimci su dobijeni korišćenjem LSM510 konfokalnog mikroskopa sa 60x uljnim imerzionim objektivom.
Proizvodnja i karakterizacija podocit-specifičnih Robo2 ʺknockoutʺ miševa i dvostrukih Robo2-nefrin ʺknockoutʺ miševa
Proizvodnja i genotipizacija Robo2<flox uslovnog alela, mutant alela Robo2del5 (takođe>pod nazivom Robo2<->koji je u ovom dokumentu korišćen kao zamena prvom nazivu) germinativne linije i alela Robo2<+>divljeg tipa, opisani su ranije (Lu et al., 2007; Wang et al., 2011). Praćena je standardna šema razmnožavanja, da bi se proizveli Robo2 podocit-specifični Robo2<del5>/<flox>;Tg<Nphs2-Cre/+>ʺknockoutʺ miševi, koji nose jedan Robo2<del5>alel i jedan Robo2<flox>alel. U ovom mutant sastavu, podocit-specifična Cre rekombinaza, navođena od strane promotera podocina briše samo Robo2<flox>alel, da bi se olakšala penetracija fenotipa, budući da je drugi alel, Robo2<del5>, bio posvuda izbrisan od ekspresije germinativne linije. Autentičnost Robo2<del5>/<flox>;Tg<Nphs2-Cre/+>miševa je utvrđena posredstvom genotipizacije DNA repova na prisustvo Robo2<del5>i Robo2<flox>alela, kao i transgena Tg<Nphs2-Cre>. F2 okoti Robo2<flox/+>miševa bez Robo2<del5>alela i transgena Tg<Nphs2-Cre>korišćeni su kao kontrole. Za proizvođenje dvostrukih Robo2-nefrin ʺknockoutʺ miševa, Robo2<+/->heterozigotni miševi su ukršteni sa Nphs1<+/->heterozigotnim miševima, koji su ranije proizvedeni (Hamano et al., 2002). Nakon proizvodnje Robo2<+/->;Nphs1<+/->dvostrukih heterozigotnih miševa, izvršeno je ukrštanje dvostrukih heterozigotnih miševa, da bi se proizveli Robo2<-/->;Nphs1<-/->dvostruki homozigotni miševi, kao i Robo1<-/->jednostruki homozigoti, Robo2<-/->jednostruki homozigoti i kontrole Robo2<+/+>;Nphs1<+/+>divljeg tipa. Protokoli ispitivanja na miševima su odobreni od strane Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) u Medicinskom centru Bostonskog univerziteta (#14388).
Transmisiona i skenirajuća elektronska mikroskopija
Za potrebe transmisione elektronske mikroskopije, secirani su uzorci bubrega Robo2 homozigotnih nultih miševa i podocit-specifičnih ʺknockoutʺ miševa, fiksirani su u PLP na 4°C, preko noći, a, nakon toga su inkubirani u 2% glutaraldehidu u 0.15 M natrijum kakodilatu, tokom 6 sati. Nakon ispiranja u 1x PBS, izvršena je dehidracija fiksiranih uzoraka bubrega u stepenovanom etanolu, potapanje u Epon, seciranje i bojenje sa uranil acetatom i olovnim citratom. Izrađeni su ultratanki preseci bubrega i ispitani su korišćenjem elektronskog mikroskopa JEM-1011. Okoti miševa divljeg tipa korišćeni su kao kontrole. Za potrebe skenirajuće elektronske mikroskopije, uzorci bubrega Robo2 homozigotnih nultih miševa, podocit-specifičnih ʺknockoutʺ miševa, nefrin-homozigotnih nultih miševa i Robo2-nefrin dvostrukih homozigotnih miševa, pripremljeni su sledeći protokol koji je ranije opisan (Friedman i Ellisman, 1981), sa manjim modifikacijama. Ukratko, izvršena je perfuzija bubrega sa 2.5% rastvorom glutaraldehida i 2% rastvorom paraformaldehida u 0.1 M kakodilatnom puferu (Karnovskijev fiksativ, Electron Microscopy Sciences), nakon čega je sledila fiksacija u Karnovskijevom fiksativu tokom 24 sata, a zatim i post-fiksacija u 2% rastvoru osmijum tetraoksida (Electron Microscopy Sciences). Uzorci bubrega su podvrgnuti krio-frakturisanju, dehidraciji i sušenju uz korišćenje heksametildisilazana (Electron Microscopy Sciences). Uzorci bubrega su snimljeni korišćenjem skenirajućih elektronskih mikroskopa Amray 1000A i Jeol 6340F. Ispitana su po tri glomerula od svake životinje, da bi se obezbedili reprezentativni snimci.
Ispitivanja patologije bubrega miševa, kvantitativno određivanje broja podocita i analiza proteinurije
Za patološka ispitivanja na bubrezima, bubrezi se seciraju i fiksiraju u 4% paraformaldehidu, tokom noći, a nakon toga se obrađuju sa serijama stepenovanog etanola za uklapanje u parafin. Parafinski blokovi bubrega su secirani na debljinu od 4 µm, korišćenjem MT-920 mikrotoma (MICROM), a obojeni su korišćenjem standardnih postupaka sa perjodna kiselina-Schiff-om (PAS) ili eozin-hematoksilinom (H&E). Analizirani su glomeruli i ispitani su na prisustvo depozita matriksa, na postojanje segmentne glomeruloskleroze i dilatacije Bowmanovog prostora, uz korišćenje Olympus BHT svetlosnog mikroskopa, koji je opremljen SPOT sistemom digitalnih kamera. Za kvantitativno određivanje broja podocita, WT1 je korišćen kao nuklearni marker podocita, a imunoperoksidazno bojenje je izvedeno na presecima tkiva bubrega sledeći protokol koji je ranije opisan (Sanden et al., 2003). Ukratko, odsečci tkiva bubrega, uklopljeni u parafin, dobijeni od 4 godinu dana stara Robo2<del5/flox;TgNphs2-Cre+ podocit->specifična ʺknockoutʺ miša i 4 kontrolna miša divljeg tipa, podudarna po starosti, su secirani na debljinu od 4 µm i obojeni su sa WT1 antitelom (Santa Cruz Biotechnology), nakon mikrotalasnog izvlačenja antigena. Biotinilizovano sekundarno antitelo i Vectastain ABC kit (Vector Laboratories) su korišćeni za detekciju WT1 signala. WT1 pozitivna jedra podocita u svakom poprečnom preseku glomerula su izbrojana na ukupno 165 glomerula od četiri mutant miša i 166 glomerula od četiri kontrolna miša. Za analizu proteinurije, "spot" uzorci urina miševa starih 6 nedelja ispitani su korišćenjem senzitivnog kvantitativnog ELISA kita za utvrđivanje mišje albuminurije (Exocell), prema instrukcijama proizvođača, i urinskih traka (Multistix od Bayera, IN) kao skrining postupka. Albumin u urinu je normalizovan sa kreatininom, da bi se dobio odnos albumin/kreatinin. Kreatinin u urinu je određen korišćenjem kita za određivanje kreatinina (Sigma), prema uputstvu proizvođača. Albumin u urinu je, takođe, određen korišćenjem 12% SDS-PAGE, i ocrtan je u vidu mrlja sa anti-albuminskim antitelom (MP Biomedicals). Podaci dobijeni od mutanata i kontrola analizirani su korišćenjem jedno-faktorske analize varijanse - ANOVA, student t-testa i Hi-kvadrat testa.
Tabela 1. Kvantitativna analiza glomerula sa povećanom ekspanzijom matriksa na podocitspecifičnim Robo2 ʺknockoutʺ miševima (mutanti), starim 2 do 9 meseci, u poređenju sa kontrolama (divlji tip)
Tabela 2. Kvantitativna analiza glomerula sa povećanom ekspanzijom matriksa na podocitspecifičnim Robo2 ʺknockoutʺ miševima (mutanti), starim 12 meseci, u poređenju sa kontrolama (divlji tip)
Tabela 3. Morfološka analiza glomerula sa dilatiranim Bowman-ovim prostorom kod Nphs1<-/->jednostrukih homozigota (Robo2<+/->;Nphs1<-/->) u poređenju sa Robo2<-/->;Nphs1<-/->dvostrukim homozigotnim novorođenim miševima prema histologiji
Tabela 4. Morfološka analiza fenotipa podocita glomerula sa isprepletenim prstolikim produžecima (FP) kod Nphs1<-/->jednostrukih homozigota (Robo2<+/->;Nphs1<-/->) u poređenju sa Robo2<-/->;Nphs1<-/->dvostrukim homozigotnim novorođenim miševima uz pomoć skenirajuće elektronske mikroskopije
REFERENCE
Bashaw, G. J., Kidd, T., Murray, D., Pawson, T., i Goodman, C. S. (2000). Repulsive axon guidance: Abelson and Enabled play opposing roles downstream of the roundabout receptor. Cell 101, 703-715.
Dickson, B. J., i Gilestro, G. F. (2006). Regulation of commissural axon pathfinding by slit and its Robo receptors. Annu Rev Cell Dev Biol 22, 651-675.
Done, S. C., Takemoto, M., He, L., Sun, Y., Hultenby, K., Betsholtz, C., i Tryggvason, K. (2008). Nephrin is involved in podocyte maturation but not survival during glomerular development. Kidney Int 73, 697-704.
Fan, X., Labrador, J. P., Hing, H., i Bashaw, G. J. (2003). Slit stimulation recruits Dock and Pak to the roundabout receptor and increases Rac activity to regulate axon repulsion at the CNS midline. Neuron 40, 113-127.
Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., i Mundel, P. (2007). Actin up: regulation of podocyte structure and function by components of the actin cytoskeleton. Trends Cell Biol 17, 428-437.
Furness, P. N., Hall, L. L., Shaw, J. A., i Pringle, J. H. (1999). Glomerular expression of nephrin is decreased in acquired human nephrotic syndrome. Nephrol Dial Transplant 14, 1234-1237.
Garg, P., Verma, R., Cook, L., Soofi, A., Venkatareddy, M., George, B., Mizuno, K., Gurniak, C., Witke, W., i Holzman, L. B. (2010). Actin-depolymerizing factor cofilin-1 is necessary in maintaining mature podocyte architecture. J Biol Chem 285, 22676-22688.
Grieshammer, U., Le, M., Plump, A. S., Wang, F., Tessier-Lavigne, M., i Martin, G. R. (2004). SLIT2-mediated ROBO2 signaling restricts kidney induction to a single site. Dev Cell 6, 709-717.
Guan, K. L., i Rao, Y. (2003). Signalling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues. Nat Rev Neurosci 4, 941-956.
Hamano, Y., Grunkemeyer, J. A., Sudhakar, A., Zeisberg, M., Cosgrove, D., Morello, R., Lee, B., Sugimoto, H., i Kalluri, R. (2002). Determinants of vascular permeability in the kidney glomerulus. J Biol Chem 277, 31154-31162.
Jones, N., Blasutig, I. M., Eremina, V., Ruston, J. M., Bladt, F., Li, H., Huang, H., Larose, L., Li, S. S., Takano, T., et al. (2006). Nck adaptor proteins link nephrin to the actin cytoskeleton of kidney podocytes. Nature 440, 818-823.
Lu, W., van Eerde, A. M., Fan, X., Quintero-Rivera, F., Kulkarni, S., Ferguson, H. L., Kim, H., Fan, Y., Xi, Q., Li, Q. G., et al. (2007). Disruption of ROBO2 is associated with urinary tract anomalies and confers risk of vesicoureteral reflux. Am J Hum Genet 80, 616-632.
Nachman, P. H., Jennette, J. C., i Falk, R. J. (2008). Primary glomerular disease. In Brenner & Rector’s The Kidney, B. M. Brenner, ed. (Pheladelphia, Saunders), pp.987-1066.
Patrakka, J., Ruotsalainen, V., Reponen, P., Qvist, E., Laine, J., Holmberg, C., Tryggvason, K., i Jalanko, H. (2002). Recurrence of nephrotic syndrome in kidney grafts of patients with congenital nephrotic syndrome of the Finnish type: role of nephrin. Transplantation 73, 394-403.
Piper, M., Anderson, R., Dwivedy, A., Weinl, C., van Horck, F., Leung, K. M., Cogill, E., i Holt, C. (2006). Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones. Neuron 49, 215-228.
Piper, M., Georgas, K., Yamada, T., i Little, M. (2000). Expression of the vertebrate Slit gene family and their putative receptors, the Robo genes, in the developing murine kidney. Mech Dev 94, 213-217.
Reeves, W., Caulfield, J. P., i Farquhar, M. G. (1978). Differentiation of epithelial foot processes and filtration slits: sequential appearance of occluding junctions, epithelial polyanion, and slit membranes in developing glomeruli. Lab Invest 39, 90-100.
Rivera, G. M., Briceno, C. A., Takeshima, F., Snapper, S. B., i Mayer, B. J. (2004). Inducible clustering of membrane-targeted SH3 domains of the adaptor protein Nck triggers localized actin polymerization. Curr Biol 14, 11-22.
Seiler, M. W., Venkatachalam, M. A., i Cotran, R. S. (1975). Glomerular epithelium: structural alterations induced by polycations. Science 189, 390-393.
Shih, N. Y., Li, J., Cotran, R., Mundel, P., Miner, J. H., i Shaw, A. S. (2001). CD2AP localizes to the slit diaphragm and binds to nephrin via a novel C-terminal domain. Am J Pathol 159, 2303-2308.
Topham, P. S., Kawachi, H., Haydar, S. A., Chugh, S., Addona, T. A., Charron, K. B., Holzman, L. B., Shia, M., Shimizu, F., i Salant, D. J. (1999). Nephritogenic mAb 5-1-6 is directed at the extracellular domain of rat nephrin. J Clin Invest 104, 1559-1566.
Tryggvason, K., Patrakka, J., i Wartiovaara, J. (2006). Hereditary proteinuria syndromes and mechanisms of proteinuria. N Engl J Med 354, 1387-1401.
Verma, R., Kovari, I., Soofi, A., Nihalani, D., Patrie, K., i Holzman, L. B. (2006). Nephrin ectodomain engagement results in Src kinase activation, nephrin phosphorylation, Nck recruitment, and actin polymerization. J Clin Invest 116, 1346-1359.
Wang, H., Li, Q., Liu, J., Mendelsohn, C., Salant, D. J., i Lu, W. (2011). Noninvasive assessment of antenatal hydronephrosis in mice reveals a critical role for Robo2 in maintaining anti-reflux mechanism. PLoS One 6, e24763.
Wong, K., Ren, X. R., Huang, Y. Z., Xie, Y., Liu, G., Saito, H., Tang, H., Wen, L., Brady-Kalnay, S. M., Mei, L., et al. (2001). Signal transduction in neuronal migration: roles of GTPase activating proteins and the small GTPase Cdc42 in the Slit-Robo pathway. Cell 107, 209-221.
Yuan, H., Takeuchi, E., i Salant, D. J. (2002). Podocyte slit-diaphragm protein nephrin is linked to the actin cytoskeleton. Am J Physiol Renal Physiol 282, F585-591.
Friedman, P. L., i Ellisman, M. H. (1981). Enhanced visualization of peripheral nerve and sensory receptors in the scanning electron microscope using cryofracture and osmiumthiocarbohydrazide-osmium impregnation. J Neurocytol 10, 111-131.
Li, X., Gao, X., Liu, G., Xiong, W., Wu, J., i Rao, Y. (2008). Netrin signal transduction and the guanine nucleotide exchange factor DOCK180 in attractive signaling. Nat Neurosci 11, 28-35.
Mugford, J. W., Sipila, P., Kobayashi, A., Behringer, R. R., i McMahon, A. P. (2008). Hoxd11 specifies a program of metanephric kidney development within the intermediate mesoderm of the mouse embryo. Dev Biol 319, 396-405.
Sanden, S. K., Wiggins, J. E., Goyal, M., Riggs, L. K., i Wiggins, R. C. (2003). Evaluation of a thick and thin section method for estimation of podocyte number, glomerular volume, and glomerular volume per podocyte in rat kidney with Wilms’ tumor-1 protein used as a podocyte nuclear marker. J Am Soc Nephrol 14, 2484-2493.

Claims (7)

Patentni zahtevi
1. Farmaceutska kompozicija koja sadrži inhibitor ROBO2 koji inhibira biološku aktivnost ROBO2, naznačena time što je inhibitor ROBO2 rastvorljivi protein ROBO2 koji sadrži fuzioni polipeptid, koji sadrži i Ig1 i Ig2 SLIT vezujuće domene ROBO2 bez intracelularnog domena ROBO2.
2. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 1, naznačena time što inhibitor ROBO2 sprečava ili smanjuje vezivanje ROBO2 polipeptida za SLIT2, za Nck, ili za oba.
3. Farmaceutska kompozicija prema zahtevima 1 ili 2, naznačena time što Ig1 SLIT domen za vezivanje sadrži aminokiselinske ostatke 46-145 SEQ ID NO: 1 ili aminokiselinske ostatke 30-129 SEQ ID NO: 3.
4. Farmaceutska kompozicija prema zahtevima 1 do 3, naznačena time što Ig2 SLIT domen za vezivanje sadrži aminokiselinske ostatke 151-237 SEQ ID NO: 1 ili aminokiselinske ostatke 135-221 SEQ ID NO:3.
5. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 4, naznačena time što rastvorljivi ROBO2 protein sadrži aminokiselinske ostatke 30-129 i aminokiselinske ostatke 135-221 iz SEQ ID NO:3.
6. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 5 za upotrebu u lečenju ispitanika koji ima ili je pod rizikom od hronične bolesti bubrega ili proteinurije.
7. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 6, naznačena time što je hronična bolest bubrega ili proteinurija uzrokovana dijabetičnom nefropatijom ili visokim krvnim pritiskom.
RS20190250A 2012-01-05 2013-01-04 Slit-robo signalizacija za dijagnostiku i lečenje bolesti bubrega RS58517B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261583379P 2012-01-05 2012-01-05
PCT/US2013/020280 WO2013103811A2 (en) 2012-01-05 2013-01-04 Slit-robo signaling for diagnosis and treatment of kidney disease
EP13733786.1A EP2800578B1 (en) 2012-01-05 2013-01-04 Slit-robo signaling for diagnosis and treatment of kidney disease

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS58517B1 true RS58517B1 (sr) 2019-04-30

Family

ID=48745540

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190250A RS58517B1 (sr) 2012-01-05 2013-01-04 Slit-robo signalizacija za dijagnostiku i lečenje bolesti bubrega

Country Status (30)

Country Link
US (2) US9572879B2 (sr)
EP (1) EP2800578B1 (sr)
JP (2) JP6153946B2 (sr)
KR (1) KR102103323B1 (sr)
CN (2) CN106390118B (sr)
AU (2) AU2013207484B2 (sr)
BR (1) BR112014016493A2 (sr)
CA (1) CA2860558C (sr)
CO (1) CO7020918A2 (sr)
CY (1) CY1121529T1 (sr)
DK (1) DK2800578T3 (sr)
ES (1) ES2714700T3 (sr)
HK (1) HK1202085A1 (sr)
HR (1) HRP20190116T1 (sr)
HU (1) HUE041779T2 (sr)
IL (1) IL233462B (sr)
LT (1) LT2800578T (sr)
MX (1) MX351313B (sr)
MY (1) MY170143A (sr)
PE (1) PE20141473A1 (sr)
PH (2) PH12014501538B1 (sr)
PL (1) PL2800578T3 (sr)
PT (1) PT2800578T (sr)
RS (1) RS58517B1 (sr)
RU (1) RU2674153C2 (sr)
SG (2) SG11201403746SA (sr)
SI (1) SI2800578T1 (sr)
SM (1) SMT201900116T1 (sr)
TR (1) TR201821294T4 (sr)
WO (1) WO2013103811A2 (sr)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3003353A4 (en) * 2013-06-04 2017-03-29 The Hospital For Sick Children Methods and uses of slit for treating fibrosis
US11101021B2 (en) * 2014-08-08 2021-08-24 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Electronic phenotyping technique for diagnosing chronic kidney disease
WO2017213435A1 (ko) * 2016-06-08 2017-12-14 재단법인 아산사회복지재단 Slit-robo 시스템을 이용한 근감소증 예방 또는 치료용 조성물
KR102011957B1 (ko) 2016-06-08 2019-08-19 재단법인 아산사회복지재단 Slit-robo 시스템을 이용한 근감소증 예방 또는 치료용 조성물
EP3527655A4 (en) 2016-10-11 2020-05-06 Tokushima University MANUFACTURING METHOD FOR KIDNEY TISSUE
CN110506206A (zh) * 2017-03-25 2019-11-26 柏林夏瑞蒂医科大学 作为肾脏疾病的生物标志物的尿液流式细胞术
CN108929383B (zh) * 2017-05-26 2021-10-15 阿思科力(苏州)生物科技有限公司 重组Slit2D2(C386S)-HSA融合蛋白及其在预防和/或治疗肺部炎症中的应用
KR20200016292A (ko) 2017-06-02 2020-02-14 화이자 인코포레이티드 재조합 robo2 단백질, 조성물, 방법 및 그의 용도
AU2018279705A1 (en) 2017-06-09 2019-11-14 Boston Medical Center Corporation Anti-ROBO2 antibodies, compositions, methods and uses thereof
US11406682B2 (en) 2017-08-24 2022-08-09 Bar-Ilan University Roundabout (Robo) receptor inhibitors and uses thereof
CN108753818B (zh) * 2018-04-24 2022-01-28 深圳市第二人民医院 RNA信号连接器、靶mRNA翻译调控方法、逻辑门及应用
CA3103836A1 (en) * 2018-06-15 2019-12-19 Microba Ip Pty Limited Methods for sample preparation and microbiome characterisation
WO2020219592A1 (en) * 2019-04-23 2020-10-29 The Regents Of The University Of California Compositions and methods useful in promoting milk production
WO2021241880A1 (ko) 2020-05-29 2021-12-02 주식회사 로킷헬스케어 그물막을 이용한 신장 치료용 조성물, 이를 포함하는 신장 치료용 의료 키트, 및 이의 경화물을 포함하는 신장 치료용 필름
CN115068480B (zh) * 2022-08-09 2023-10-20 郑州大学第一附属医院 细胞分裂周期蛋白42小分子抑制剂在制备治疗慢性肾脏病药物中的应用
CN120152711A (zh) * 2022-09-20 2025-06-13 云顶新耀医药科技有限公司 Slit2相关组合物和方法

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3536809A (en) 1969-02-17 1970-10-27 Alza Corp Medication method
US3598123A (en) 1969-04-01 1971-08-10 Alza Corp Bandage for administering drugs
US3845770A (en) 1972-06-05 1974-11-05 Alza Corp Osmatic dispensing device for releasing beneficial agent
US3916899A (en) 1973-04-25 1975-11-04 Alza Corp Osmotic dispensing device with maximum and minimum sizes for the passageway
US4008719A (en) 1976-02-02 1977-02-22 Alza Corporation Osmotic system having laminar arrangement for programming delivery of active agent
IE58110B1 (en) 1984-10-30 1993-07-14 Elan Corp Plc Controlled release powder and process for its preparation
US5073543A (en) 1988-07-21 1991-12-17 G. D. Searle & Co. Controlled release formulations of trophic factors in ganglioside-lipsome vehicle
IT1229203B (it) 1989-03-22 1991-07-25 Bioresearch Spa Impiego di acido 5 metiltetraidrofolico, di acido 5 formiltetraidrofolico e dei loro sali farmaceuticamente accettabili per la preparazione di composizioni farmaceutiche in forma a rilascio controllato attive nella terapia dei disturbi mentali organici e composizioni farmaceutiche relative.
US5118937A (en) 1989-08-22 1992-06-02 Finnigan Mat Gmbh Process and device for the laser desorption of an analyte molecular ions, especially of biomolecules
US5045694A (en) 1989-09-27 1991-09-03 The Rockefeller University Instrument and method for the laser desorption of ions in mass spectrometry
US5120548A (en) 1989-11-07 1992-06-09 Merck & Co., Inc. Swelling modulated polymeric drug delivery device
US5733566A (en) 1990-05-15 1998-03-31 Alkermes Controlled Therapeutics Inc. Ii Controlled release of antiparasitic agents in animals
US5580578A (en) 1992-01-27 1996-12-03 Euro-Celtique, S.A. Controlled release formulations coated with aqueous dispersions of acrylic polymers
US5591767A (en) 1993-01-25 1997-01-07 Pharmetrix Corporation Liquid reservoir transdermal patch for the administration of ketorolac
EP0700521B1 (en) 1993-05-28 2003-06-04 Baylor College Of Medicine Method and mass spectrometer for desorption and ionization of analytes
IT1270594B (it) 1994-07-07 1997-05-07 Recordati Chem Pharm Composizione farmaceutica a rilascio controllato di moguisteina in sospensione liquida
NZ516848A (en) 1997-06-20 2004-03-26 Ciphergen Biosystems Inc Retentate chromatography apparatus with applications in biology and medicine
DE69816467T2 (de) 1997-10-20 2004-04-15 The Regents Of The University Of California, Oakland Robo: eine familie polypeptiden und nukleinesäuren wirksam in nervenzellleitung
US6365185B1 (en) 1998-03-26 2002-04-02 University Of Cincinnati Self-destructing, controlled release peroral drug delivery system
CN1463291A (zh) 2001-04-19 2003-12-24 赛弗根生物系统股份有限公司 用质谱法和亲和标记物鉴定生物分子的特性
WO2003017177A2 (en) 2001-08-13 2003-02-27 Beyong Genomics, Inc. Method and system for profiling biological systems
ES2431040T3 (es) * 2002-03-08 2013-11-22 Shanghai Institutes For Biological Sciences, Cas Detección y modulación de la angiogénesis mediada por Slit y Roundabout (Robo), y sus usos
WO2003091735A1 (en) 2002-04-23 2003-11-06 Millipore Corporation Sample preparation of biological fluids for proteomic applications
US7972770B2 (en) 2005-08-16 2011-07-05 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods of detection of cancer using peptide profiles
FR2958936A1 (fr) 2010-04-14 2011-10-21 Sanofi Aventis Proteine de fusion robo1-fc et son utilisation dans le traitement des tumeurs
JP2014507395A (ja) 2010-12-23 2014-03-27 サノフイ 肝癌の治療における使用のためのＲｏｂｏ１−Ｆｃ融合タンパク質

Also Published As

Publication number Publication date
PH12014501538A1 (en) 2014-10-08
LT2800578T (lt) 2019-02-11
HK1202085A1 (en) 2015-09-18
RU2674153C2 (ru) 2018-12-05
CA2860558A1 (en) 2013-07-11
MX2014008088A (es) 2014-09-25
IL233462B (en) 2020-05-31
WO2013103811A2 (en) 2013-07-11
JP6153946B2 (ja) 2017-06-28
MY170143A (en) 2019-07-08
KR102103323B1 (ko) 2020-05-29
KR20140123516A (ko) 2014-10-22
US9572879B2 (en) 2017-02-21
SG10201605361RA (en) 2016-08-30
CN106390118A (zh) 2017-02-15
PT2800578T (pt) 2019-03-18
US20150037325A1 (en) 2015-02-05
AU2018200105A1 (en) 2018-01-25
MX351313B (es) 2017-10-10
SI2800578T1 (sl) 2019-03-29
EP2800578A2 (en) 2014-11-12
IL233462A0 (en) 2014-08-31
SG11201403746SA (en) 2014-07-30
JP2017193559A (ja) 2017-10-26
WO2013103811A3 (en) 2014-08-28
TR201821294T4 (tr) 2019-01-21
PL2800578T3 (pl) 2019-05-31
HRP20190116T1 (hr) 2019-03-08
PH12018502577A1 (en) 2020-03-02
PH12014501538B1 (en) 2019-02-22
PE20141473A1 (es) 2014-11-05
PH12018502577B1 (en) 2021-03-26
CO7020918A2 (es) 2014-08-11
AU2013207484A1 (en) 2014-07-24
CY1121529T1 (el) 2020-05-29
JP2015510500A (ja) 2015-04-09
RU2014132108A (ru) 2016-02-20
CN104271197A (zh) 2015-01-07
BR112014016493A8 (pt) 2017-07-04
EP2800578B1 (en) 2018-12-05
EP2800578A4 (en) 2015-07-15
DK2800578T3 (en) 2019-03-25
CA2860558C (en) 2021-03-02
ES2714700T3 (es) 2019-05-29
US10358677B2 (en) 2019-07-23
BR112014016493A2 (pt) 2021-08-10
CN106390118B (zh) 2021-05-11
HUE041779T2 (hu) 2019-05-28
US20170114412A1 (en) 2017-04-27
SMT201900116T1 (it) 2019-02-28
AU2013207484B2 (en) 2017-10-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10358677B2 (en) Method for treating kidney disease with a SLIT2-binding extracellular domain of ROBO2
Corti et al. Altered dimerization of metabotropic glutamate receptor 3 in schizophrenia
JP5823964B2 (ja) 自閉症を診断及び治療する方法
US8158364B2 (en) Methods and compositions involving nucleotide repeat disorders
ES2731609T3 (es) Polipéptidos ERFE y eritroferrona y métodos de regulación del metabolismo del hierro
US20180085423A1 (en) Methods for treating and diagnosing eating disorders
EP1272517B1 (en) Multiprotein-complexes comprising a nmda receptor and uses thereof
US9541546B2 (en) Method of promoting excitatory synapse formation with an anti-Ephexin5 phospho-Y361 antibody
US8492106B2 (en) Identification methods for ergothioneine transporter modulators and therapeutic uses thereof
JP5830329B2 (ja) 腎障害の新規マーカー
Al-Shebel et al. Kidney-specific Wdr72 deletion leads to incomplete distal renal tubular acidosis through impaired V-ATPase B1 subunit localization