RS58532B1 - Metodi i kompozicije za zarastanje rana - Google Patents

Metodi i kompozicije za zarastanje rana

Info

Publication number
RS58532B1
RS58532B1 RS20190316A RSP20190316A RS58532B1 RS 58532 B1 RS58532 B1 RS 58532B1 RS 20190316 A RS20190316 A RS 20190316A RS P20190316 A RSP20190316 A RS P20190316A RS 58532 B1 RS58532 B1 RS 58532B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
compound
epoxy
tigliaen
hexahydroxy
methylbutanoyl
Prior art date
Application number
RS20190316A
Other languages
English (en)
Inventor
Paul Warren Reddell
Victoria Anne Gordon
Ryan Moseley
Robert Steadman
Rachael Louise Moses
Glen Mathew Boyle
Peter Gordon Parsons
Original Assignee
Qbiotics Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2013901359A external-priority patent/AU2013901359A0/en
Application filed by Qbiotics Ltd filed Critical Qbiotics Ltd
Publication of RS58532B1 publication Critical patent/RS58532B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D303/00—Compounds containing three-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D303/02—Compounds containing oxirane rings
    • C07D303/38—Compounds containing oxirane rings with hydrocarbon radicals, substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C07D303/40—Compounds containing oxirane rings with hydrocarbon radicals, substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals by ester radicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/12—Ketones
    • A61K31/122—Ketones having the oxygen directly attached to a ring, e.g. quinones, vitamin K1, anthralin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/336—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having three-membered rings, e.g. oxirane, fumagillin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/47—Euphorbiaceae (Spurge family), e.g. Ricinus (castorbean)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/49—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds
    • A61K8/4973—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds with oxygen as the only hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D303/00—Compounds containing three-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D303/02—Compounds containing oxirane rings
    • C07D303/12—Compounds containing oxirane rings with hydrocarbon radicals, substituted by singly or doubly bound oxygen atoms
    • C07D303/32—Compounds containing oxirane rings with hydrocarbon radicals, substituted by singly or doubly bound oxygen atoms by aldehydo- or ketonic radicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/10—Preparation or pretreatment of starting material
    • A61K2236/15—Preparation or pretreatment of starting material involving mechanical treatment, e.g. chopping up, cutting or grinding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/74—Biological properties of particular ingredients

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Epoxy Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Description

Opis pronalaska
Oblast tehnike
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na epoksi-tiglianska jedinjenja i njihovu primenu kod podsticanja zarastanja rana. U specifičnim primerima izvođenja, epoksitiglianska jedinjenja su epoksi-tiglian-3-onska jedinjenja- Opisani su postupci izazivanja podsticanja zarastanja rana, kao i postupci smanjenja stvaranja ožiljaka i poboljšanja estetskih rezultata posle izlečenja rane smanjenjem promena u pigmentaciji kože i/ili poboljšanjem ponovnog rasta dlake, kao i postupci prevencije prekomernog stvaranja ožiljaka. Takođe su opisana jedinjenja i kompozicije za primenu u lečenju rana.
Stanje tehnike
[0002] Lečenje rane je složen proces u kome se koža ili drugi organ ili tkivo samo oporavlja posle povrede. Kod normalne kože, epidermis (spoljašnji sloj) i dermis (unutrašnji ili dublji sloj) se nalaze u stacionarnom ravnotežnom stanju, obrazujući zaštitnu barijeru prema spoljašnjem okruženju. Jednom kada je ta zaštitna barijera oštećena, odmah se pokreće normalni fiziološki proces zarastanja rane. Klasični model zarastanja rane je podeljen na tri uzastopne faze, a koje se ipak preklapaju, i to: upalnu, proliferativnu i finalnu ponovnog oblikovanja.
[0003] Za vreme upalne faze zarastanja rane postoji aktivno pristizanje neutrofila, a zatim i monocita iz okolne vaskulature u ranu. Neutrofili su esencijalni za početnu kontrolu i uništenje bakterijskih i gljivičnih infekcija rane. Monociti sazrevaju u makrofage kako ulaze u ranu, gde imaju brojne uloge za vreme toka izlečenja rane, uključujući početnu fagocitozu i čišćenje matrice i ćelijskih ostataka. Oslobađanje enzima, citokina i faktora rasta i od strane neutrofila, i od strane makrofaga u rani zatim može vršiti bitan uticaj na druge ćelije u rani i okolnom tkivu. Na primer, makrofagi luče kolagenaze koje čiste ranu; interleukine i faktor nekroze tumora (TNF), koji stimuliše fibroblaste i promoviše angiogenezu; i transformišući faktor rasta (TGF), koji stimuliše keratinocite. Oni takođe luče trombocitni faktor rasta i vaskularni endotelni faktor rasta koji pokreću obrazovanje granulacionog tkiva i tako pokreću tranziciju u proliferativnu fazu i fazu ponovnog oblikovanja. Brza i robusna, ali prolazna, upalna faza često je povezana sa dobrim ishodima zarastanja rane.
[0004] Druga etapa uključuje proliferaciju ćelija i migraciju i skupljanje rane. Ovo obuhvata akcije koje vrše teli unutar rane da bi se ostvarilo zatvaranje otvora rane i nadoknadilo izgubljeno tkivo. Migracija i proliferacija keratinocita je fundamentalna za postizanje ponovne epitelizacije rane, dok je rekonstitucija dermisa, koji se nalazi dole, posledica migracije, proliferacije i diferencijacije fibroblasta koji pomažu zatvaranje rane i doprinose sintezi, zamotavanju i poravnavanju kolagenih vlakana.
[0005] U zadnje stadijumu ponovnog oblikovanja, migracije i proliferacija keratinocita na krajevima rane se ponovo-stratifikuju da bi zatvorili ranu i obrazovali kontinualni epidermis. Za vreme ove faze takođe se javljaju mnoge promene u dermisu koje uključuju ponovno oblikovanje van-ćelijske matrice da bi se povratila normalna dermalna arhitektura i vaskulatura.
[0006] U određenim slučajevima, rane mogu da sporo zarastaju ili da uopšte ne zarastaju. Na zarastanje rane utiču mnogi faktori, na primer, opšte zdravstveno stanje povređenog subjekta, starost povređenog subjekta, bolesti kao što su dijabetes, ili druge bolesti koje mogu da utiču na cirkulaciju, prisustvo infekcije, strani objekti ili nekrozno tkivo, ili u nekim slučajevima lekovi mogu da utiču na brzinu zarastanja rane.
[0007] Osim toga, kod nekih rana nesavršena regulacija zarastanja rane može imati za posledicu fibrozu i preterano formiranje ožiljnog tkiva, tako da nastaje ožiljno tkivo koje je funkcionalno i estetski inferiorno u odnosu na normalno tkivo.
[0008] Postoje mnoga istraživanja u cilju poboljšanja stanja rane i smanjenja stvaranja ožiljnog tkiva. Međutim, postoji potreba da se pronađu agensi koji su sposobni da poboljšaju zarastanje rane, na primer, da povećaju brzinu zarastanja rane, a naročito kod hroničnih rana. Takođe postoji potreba za agensima koji omogućavaju da rana zaraste uz smanjenje ožiljka koji bi prirodno nastao.
Suština pronalaska
[0009] Predmetni pronalazak je određen, bar delimično, otkrićem da ekstrakti biljaka koji sadrže epoksi-tiglianska jedinjenja mogu da poboljšaju zarastanje rana, a takođe i da smanje ožiljno tkivo koje se formira po zarastanju rane.
[0010] U prvom aspektu prema pronalasku je realizovano 5,6- ili 6,7-epoksitigliansko jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za primenu za ubrzanje zarastanja rana, pri čemu 5,6- ili 6,7-epoksi-tigliansko jedinjenje je jedinjenje formule (I):
pri čemu
R1 je vodonik i R2 je -OR17; ili R1 i R2 zajedno obrazuju karbonil grupu (=O); R3 je vodonik ili C1-6alkil;
R4 i R5 su nezavisno vodonik ili -OR17; ili R4 i R5 zajedno obrazuju dvostruku vezu ili epoksid(-O-);
R5 je vodonik ili C1-6alkil;
R7 je -OH ili -OR18;
R8 je -OH ili-OR18; pod uslovom da R7 i R8 nisu oba OH;
R9 i R10 su nezavisno izabrani između vodonika i C1-6alkila;
R11 i R12 ili R12 i R13 zajedno obrazuju epoksid i preostala grupa R11 i R13 je vodonik, -OH ili -OR17
R14 je vodonik ili -R17;
R15 je vodonik ili -R17;
R16 je vodonik ili -R17;
R17 je vodonik, -C1-6alkil, -C2-6alkenil, -C2-6alkinil, -C(O)C1-6alkil, -C(O)C2-6alkenil ili -C(O)Cz-salkinil;
R18 je C1-20alkil, -C2-20alkenil, -C2-20alkinil, -C(O)C1-20alkil, -C(O)C2-20alkenil, -C(O)C2-20alkinil, -C(O)cikloalkil, -C(O)C1-10alkilcikloalkil; -C(O)C2-
10alkenilcikloalkil, -C(O)C2-10alkinilcikloalkil, -C(O)aril, -C(O)C1-10alkilaril, -C(O)C2-
10alkenilaril, -C(O)C2-10alkinilaril, -C(O)C1-10alkilC(O)R19, -C(O)C2-
10alkenilC(O)R19, -C(O)C2-10alkinilC(O)R19, -C(O)C1-10alkilCH(OR19)(OR19), -C(O)C2-10alkenilCH(OR19)(OR19), -C(O)C2-10alkinilCH(OR19)(OR19), -C(O)C1-
10alkilSR19, -C(O)C2-10alkenilSR19, -C(O)C2-10alkinilSR19, -C(O)C1-
10alkilC(O)OR19, -C(O)C2-10alkenilC(O)OR19, -C(O)C2-10alkinilC(O)OR19, -C(O)C1-
10alkilC(O)SR19, -C(O)C2-10alkenilC(O)SR19, -C(O)C2-10alkinilC(O)SR19,
ili
i
R19 je vodonik, -C1-10alkil, -C2-10alkenil, -C2-10alkinil, cikloalkil ili aril;
pri čemu je svaka alkil, alkenil, alkinil, cikloalkil ili aril grupa opciono zamenjena; ili je geometrijski izomer ili stereoizomer ili njihova farmaceutski prihvatljiva so.
[0011] U nekim primerima izvođenja, epoksi-tigliansko jedinjenje je u obliku biljnog ekstrakta, a naročito etanolskog ekstrakta. U nekim primerima izvođenja, biljni ekstrakt se može dobiti ili je dobijen iz biljke koja pripada vrstama Fontainea ili vrstama Hylandia. U nekim primerima izvođenja, epoksi-tigliansko jedinjenje je izolovano iz biljnog ekstrakta. U drugim primerima izvođenja, epoksi-tigliansko jedinjenje je sintetički ili polu-sintetički derivat izolovanog tiglianskog jedinjenja.
[0012] U nekim primerima izvođenja, poboljšanje zarastanja rane obuhvata povećanje brzine zarastanja rane. U nekim primerima izvođenja, poboljšanje zarastanja rane obuhvata smanjenje stvaranja ožiljaka u tkivu rane. U nekim primerima izvođenja, poboljšanje zarastanja rane obuhvata i povećanje brzine zarastanja rane, i smanjenje stvaranja ožiljaka u tkivu rane. U nekim primerima izvođenja, rana je hronična rana, akutna rana ili postojeća rana.
[0013] Prema jednom drugom aspektu pronalaska, realizovano je 5,6- ili 6,7-epoksitigliansko jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za korišćenje u prevenciji stvaranja prevelikog ožiljka, a naročito kada je preveliki ožiljak keloid ili hipertrofirani ožiljak; pri čemu je 5,6- ili 6,7-epoksitigliansko jedinjenje izabrano između sledećih:
12-tigloil-13-butanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 21);
12-(3-butenoil)-13-nonanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 22);
12-benzoil-13-(2-metilbutanoil-6, 7-epoksi-4,5,9, 12, 13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 23);
12,13-dibutanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 27)
12-benzoil-13-butanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1 -tigliaen-3-on (Jedinjenje 28);
12,13-di-nonoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 41);
12,13-di-heksanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 42);
12,13-di-pentanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 43);
12,13-di-tigloil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 44)
5,20-di-acetil-12-tigloil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 45);
12,13-di-(2E,4E)-heks-2,4-enoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 46);
12-heksanoil-13-[2-(N-metilantraniloil)]-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1 -tigliaen-3-on (Jedinjenje 47)
12-acetil-13-[2-(N-metilantraniloil)]-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 48);
12,13-di-heptanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 49);
12-miristoil-13-acetil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 50);
12-miristoil-13(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 51);
12-(2-metilbutanoil)-13-acetil-6,7-epoksi-4,5,9, 12, 13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 52); i
12-hidroksi-13-heksanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 53);
12,13-di-(3-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 60)
ili njihove farmaceutski prihvatljive soli.
[0014] Prema jednom drugom aspektu realizovano je 5,6- ili 6,7-epoksi-tigliansko jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za korišćenje u smanjenju stvaranja ožiljaka izazvanih zarastanjem rane smanjenjem promena u pigmentaciji kože i /ili poboljšanju ponovnog rasta dlake; pri čemu 5,6- ili 6,7-epoksi-tigliansko jedinjenje je jedinjenje formule (I):
pri čemu
R1 je vodonik i R2 je -OR17; ili R1 i R2 zajedno obrazuju karbonil grupu (=O); R3 je vodonik ili C1-6alkil;
R4 i R5 su nezavisno vodonik ili -OR17; ili R4 i R5 zajedno obrazuju dvostruku vezu ili epoksid(-O-);
R5 je vodonik ili C1-6alkil;
R7 je -OH ili -OR18;
R8 je -OH ili -OR18; pod uslovom da R7 i R8 nisu oba OH;
R9 i R10 su nezavisno izabrani između vodonika i C1-6alkila;
R11 i R12 ili R12 i R13 zajedno obrazuju epoksid i preostala grupa R11 i R13 je vodonik, -OH ili -OR17
R14 je vodonik ili -R17;
R15 je vodonik ili -R17;
R16 je vodonik ili -R17;
R17 je vodonik, -C1-6alkil, -C2-6alkenil, -C2-6alkinil, -C(O)C1-6alkil, -C(O)C2-6alkenil ili -C(O)C2-6alkinil;
R18 je C1-20alkil, -C2-20alkenil, -C2-20alkinil, -C(O)C1-20alkil, -C(O)C2-20alkenil, -C(O)C2-20alkinil, -C(O)cikloalkil, -C(O)C1-10alkilcikloalkil; -C(O)C2-
10alkenilcikloalkil, -C(O)C2-10alkinilcikloalkil, -C(O)aril, -C(O)C1-10alkilaril, -C(O)C2-
10alkenilaril,-C(O)C2-10alkinilaril, -C(O)C1-10alkilC(O)R19, -C(O)C2-
10alkenilC(O)R19, -C(O)C2-10alkinilC(O)R19, -C(O)C1-10alkilCH(OR19)(OR19), -C(O)C2-10alkenilCH(OR19)(OR19), -C(O)C2-10alkinilCH(OR19)(OR19),-C(O)C1-
10alkilSR19,-C(O)C2-10alkenyISR19, -C(O)C2-10alkinilSR19, -C(O)C1-
10alkilC(O)OR19, -C(O)C2-10alkenilC(O)OR19, -C(O)C2-10alkinilC(O)OR19, -C(O)C1-
10alkilC(O)SR19,-C(O)C2-10alkenil(O)SR19, -C(O)C2-10alkinilC(O)SR19,
ili
i
R19 je vodonik, -C1-10alkil, -C2-10alkenil, -C2-10alkinil, cikloalkil ili aril;
pri čemu je svaka alkil, alkenil, alkinil, cikloalkil ili aril grupa opciono zamenjena; ili je geometrijski izomer ili stereoizomer ili njihova farmaceutski prihvatljiva so.
Opis pronalaska
Definicije
[0015] Osim ako nije definisano drugačije, svi ovde korišćeni tehnički i naučni izrazi imaju ista značenja koja uobičajeno podrazumevaju oni sa prosečnim znanjem iz odgovarajuće oblasti na koju se pronalazak odnosi. Iako se u praksi ili testiranju predmetnog pronalaska mogu koristiti bilo koji postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su opisani ovde, opisani su poželjni postupci i materijali. Za ciljeve predmetnog pronalaska, dole su definisani sledeći izrazi.
[0016] Članovi "jedan" i "jedna" se ovde koriste tako da se odnose na jedan ili na više od jednog (tj. bar na jedan) gramatičkog objekta člana. Na primer, "jedan element" označava jedan element ili više od jednog elementa.
[0017] Kako se ovde koristi, izraz "oko" se odnosi na količinu, nivo, vrednost, dimenziju, veličinu ili iznos/amount koji varira i do 30%, 25%, 20%, 15% ili 10% u odnosu na referentnu količinu, nivo, vrednost, dimenziju, veličinu ili iznos.
[0018] Kroz celu ovu specifikaciju, osim ako kontekst ne zahteva drukčije, podrazumeva se da reči "sadrže", "sadrži" i "obuhvata" označavaju uključivanje navedenog koraka ili elementa ili grupe koraka ili elemenata, ali ne i isključivanje bilo kog drugog koraka ili elementa ili grupe koraka ili elemenata.
[0019] Izraz "alkil" se odnosi na opciono zamenjene linearne i razgranate ugljovodonične grupe koje imaju 1 do 20 atoma ugljenika. Gde je to odgovarajuće, alkil grupa može da ima navedeni broj atoma ugljenika, na primer, -C1-C6, alkil koji obuhvata alkil grupe koje imaju 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 atoma ugljenika u linearnom ili razgranatom rasporedu. Neograničavajući primeri alkil grupa obuhvataju metil, etil, propil, izopropil, butil, s- i t-butil, pentil, 2-metilbutil, 3-metilbutil, heksil, 2-metilpentil, 3-metilpentil, 4-metilpentil, 2-etilbutil, 3-etilbutil heptil, oktil, nonil, decil, undecil, dodecil, tridecil, tetradecil i pentadecil.
[0020] Izraz "alkenil" se odnosi na opciono zamenjene, nezasićene linearne ili razgranate ugljovodonike, koji imaju 2 do 20 atoma ugljenika i imaju bar jednu dvostruku vezu. Gde je odgovarajuće, alkenil grupa može imati navedeni broj atoma ugljenika, na primer, C2-C6 alkenil koji obuhvata alkenil grupe koje imaju 2, 3, 4, 5 ili 6 atoma ugljenika u linearnim ili razgranatim rasporedima. Neograničavajući primeri alkenil grupa obuhvataju etenil, propenil, izopropenil, butenil, s- i t-butenil, pentenil, heksenil, hept-1,3-dien, heks-1,3-dien, non-1,3,5-trien i slične.
[0021] Izraz "alkinil" se odnosi na opciono zamenjene nezasićene linearne ili razgranate ugljovodonike, koji imaju 2 do 20 atoma ugljenika, i imaju bar jednu trostruku vezu. Gde je odgovarajuće, alkinil grupa može imati navedeni broj atoma ugljenika, na primer, C2-C6 alkinil koji obuhvata alkinil grupe koje imaju 2, 3, 4, 5 ili 6 atoma ugljenika u linearnim ili razgranatim rasporedima. Neograničavajući primeri obuhvataju etinil, propinil, butinil, pentinil i heksinil.
[0022] Izrazi "cikloalkil" i "karbocikl" se odnose na opciono zamenjene zasićene ili nezasićene mono-ciklične, biciklične ili triciklične ugljovodonične grupe. Gde je odgovarajuće, cikloalkil grupa može imati navedeni broj atoma ugljenika, na primer, C3-C6 cikloalkil je karbociklična grupa koja ima 3, 4, 5 ili 6 atoma ugljenika.
Neograničavajući primeri mogu uključivati ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, ciklopentenil, cikloheksil, cikloheksenil, cikloheksadienil i slične.
[0023] "Aril" označava C6-C14 člani monociklični, biciklični ili triciklični karbociklični prstenasti sistem koji ima do 7 atoma u svakom prstenu, pri čemu je bar jedan prsten aromatičan. Primeri aril grupa obuhvataju, ali nisu ograničeni na fenil, naftil, tetrahidronaftil, indanil i bifenil. Aril može sadržati 1-3 benzolova prstena. Ukoliko su prisutni dva ili više aromatičnih prstenova, tada ti prstenovi mogu biti međusobno kondenzovani, tako da susedni prstenovi dele zajedničku vezu.
[0024] Svaki alkil, alkenil, alkinil, cikloalkil i aril, bilo da je pojedinačni entitet ili deo većeg entiteta, može biti opciono zamenjen sa jednim ili više opcionih supstituenata izabranih iz grupe koju čine C1-6alkil, C2-6alkenil, C3-6cikloalkil, okso (=O), -OH, -SH, C1-6alkilO-, C2-6,alkenilO-, C3-6cikloalkilO-, C1-6alkilS-, C2-6alkenilS-, C3-6cikloalkilS-, -CO2H, -CO2C16alkil, -NH2, -NH(C1-6alkil), -N(C1-6alkil)2, -NH(fenil). -N(fenil)2, -CN, -NO2, -halogen, -CF3, -OCF3, -SCF3, -CHF2, -OCHF2, -SCHF2, -fenil, -Ofenil, -C(O)fenil,-C(O)C1-6alkil. Primeri pogodnih supstituenata obuhvataju, ali nisu ograničeni na metil, etil, propil, izopropil, butil, sek.-butil, terc.-butil, -vinil, metoksi, etoksi, propoksi, izopropoksi, butoksi, metiltio, etiltio, propiltio, izopropiltio, butiltio, hidroksi, hidroksimetil, hidroksietil, hidroksipropil, hidroksibutil, fluoro, hloro, bromo, jodo, cijano, nitro, -CO2H, -CO2CH3, trifluorometil, trifluorometoksi, trifluorometiltio, difluorometil, difluorometoksi, difluorometiltio, morfolino, amino, metilamino, dimetilamino; fenil, fenoksi, fenilkarbonil, benzil i acetil.
[0025] Jedinjenja prema pronalasku mogu biti u obliku farmaceutski prihvatljivih soli. Međutim, podrazumeva se da farmaceutski neprihvatljive soli takođe spadaju u opseg zaštite pronalaska, pošto one mogu biti korisne kao međuproizvodi u dobijanju farmaceutski prihvatljivih soli ili mogu biti korisne tokom skladištenja ili transporta. Pogodne farmaceutski prihvatljive soli obuhvataju, ali nisu ograničene na soli farmaceutski prihvatljivih neorganskih kiselina, kao što su hlorovodonična, sumporna, fosforna, azotna, ugljena, borna, sulfamino, i bromovodonična kiselina, ili soli farmaceutski prihvatljivih organskih kiselina, kao što su sirćetna, propionska, buterna, vinska, maleinska, hidroksimaleinska, fumarna, maleinska, limunska, mlečna, sluzna, glukonska, benzojeva, ćilibarna, oksalna, fenilsirćetna, metansulfonska, toluenesulfonska, benzolsulfonska, salicilna sulfanilna, asparaginska, glutaminska, etilendiaminotetrasirćetna, stearinska, palmitinska, oleinska, laurinska, pantotenska, taninska, askorbinska i valerijanska kiselina.
[0026] Soli baza obuhvataju, ali nisu ograničene na one koje su obrazovane sa farmaceutski prihvatljivim katjonima, kao što su natrijum, kalijum, litijum, kalcijum, magnezijum, amonijum i alkilamonijum.
[0027] Osnovne grupe koje sadrže azot mogu biti kvarternizovane sa takvim agensima kao što su niži alkil halid, kao što su metil, etil, propil, i butil hloridi, bromidi i jodidi; dialkil sulfati poput dimetila i dietil sulfata; i drugi.
[0028] Može se shvatiti da jedinjenja prema pronalasku mogu posedovati asimetrične centre i da su stoga sposobna da postoje u više od jednog stereoizomernog oblika. Pronalazak se stoga takođe odnosi na jedinjenja u suštinski čistom izomernom obliku na jednom ili više asimetričnih centara, npr. većem od oko 90% ee, kao što je oko 95% ili 97% ee ili većem od 99% ee, kao i njihove smeše, uključujući racemske smeše. Takvi izomeri se mogu dobiti izolovanjem iz prirodnih izvora, asimetričnom sintezom, na primer, korišćenjem hiralnih međuproizvoda, ili hiralnom rezolucijom. Jedinjenja prema pronalasku mogu postojati kao geometrijski izomeri. Pronalazak se takođe odnosi na jedinjenja u suštinski čistom cis (Z) ili trans (E) obliku ili njihovim smešama.
[0029] Jedinjenja prema predmetnom pronalasku mogu biti dobijena izolovanjem iz biljke ili dela biljke, ili derivatizacijom izolovanog jedinjenja, ili derivatizacijom srodnog jedinjenja.
[0030] Kada se ovde koristi, izraz "rana" se odnosi na fizički prekid kontinuiteta ili integriteta strukture tkiva. Rane obuhvataju da mogu biti akutne ili hronične i obuhvataju posekotine i laceracije, hirurške rezove ili rane, probode, ogrebotine, brazgotine, kompresione rane, abrazije, frikcione rane, dekubitus, čireve (npr. rane od pritiska ili kreveta); rane usled termičkog efekta (opekotine od hladnoće ili izvora toplote), hemijske rame (npr. opekotine od kiselina ili baza) ili patogene infekcije (npr. virusne, bakterijske ili gljivične), uključujući otvorene ili intaktne čireve, kožne erupcije, mitesere i akne, čireve, hronične rane (uključujući rane povezane sa dijabetesom, kao što su čirevi na donjem delu nogu i stopalima, čirevi na venama nogu i rane od pritiska), na mestima kožnog grafta/transplantata donora i primaoca, stanja imunološke reakcije, kao što su npr. psorijaza i ekcem, stomačni ili crevni čirevi, oralne rane, uključujući čireve u ustima, oštećenje hrskavice ili kosti, rane od amputacije i lezije rožnjače.
[0031] Kada se ovde koristi, izraz "hronična rana" se odnosi na ranu koja nije zarasla u toku normalnog vremenskog perioda za zarastanje kod inače zdravog subjekta. Hronične rane mogu biti one koje ne zarastaju zbog zdravlja subjekta, na primer, kada subjekat ima lošu cirkulaciju ili bolest kao što je dijabetes, ili kada je subjekat na lekovima koji sprečavaju proces normalnog zarastanja. Zarastanje takođe može biti sprečeno infekcijom, kao što je bakterijska, gljivična ili parazitna infekcija. U nekim slučajevima hronična rana može ostati nezarasla nedeljama, mesecima ili čak godinama. Primeri hroničnih rana uključuju, ali nisu ograničeni na dijabetičarske čireve, rane usled pritiska i tropske čireve.
[0032] Izraz "poboljšanje zarastanja rane" kada se ovde koristi, odnosi se na poboljšanje zarastanja rane u poređenju sa zarastanjem rane koje se može uočiti kod netretirane rane. Poboljšanje zarastanja rane uključuje povećanje brzine zarastanja rane, na primer, rana može zarastati brzinom koja je satima, danima ili nedeljama brža nego kada se rana ne tretira. Poboljšanje zarastanja rane takođe može obuhvatiti i smanjenje ožiljnog tkiva kod rane koja zarasta ili je zarasla u poređenju sa očekivanim kada se rana ne tretira.
[0033] Izraz "zarastanje rane" se odnosi na obnavljanje integriteta tkiva, bilo delimično ili u potpunosti.
[0034] Izraz "smanjenje ožiljka" ili "smanjenje ožiljnog tkiva" kada se ovde navodi, odnosi se na poboljšanje estetskog rezultata i/ili smanjenje abnormalnog tkiva izazvanog zarastanjem rane u poređenju sa ranom koja nije tretirana. U nekim primerima izvođenja, smanjenje ožiljnog tkiva uključuje smanjenje ili minimiziranje abnormalnog tkiva, smanjenje ili minimiziranje promena u pigmentaciji kože i /ili poboljšanje ponovnog rasta dlake u poređenju sa ranom koja nije tretirana.
[0035] Izraz "epoksi-tigliansko jedinjenje" se odnosi na jedinjenje koje ima jednu od sledećih osnovnih cikličnih ugljeničnih struktura:
[0036] Jedinjenja imaju triciklo[9.3.0.0]tetradekan sistem sa kondenzovanim ciklopropanskim prstenom dodatim na šestočlani prsten. Epoksid je kondenzovan sa sedmočlanim prstenom na 5,6- ili 6,7-mestu.
[0037] Izraz "epoksi-tiglien-3-on jedinjenje" se odnosi na jedinjenje koje ima epoksitigliansku strukturu gore definisanu gde petočlani prsten ima 1,2-en-3-on strukturu:
Metodi zarastanja rana
[0038] Prema prvom aspektu pronalaska realizovano je 5,6- ili 6,7-epoksi-tigliansko jedinjenje ili njegova farmaceuski prihvatljiva so za primenu u poboljšanju zarastanja rane pri čemu 5,6- ili 6,7-epoksi-tigliansko jedinjenje je jedinjenje formule (I):
pri čemu
R1 je vodonik i R2 je -OR17; ili R1 i R2 zajedno obrazuju karbonil grupu (=O);
R3 je vodonik ili C1-6alkil;
R4 i R5 su nezavisno vodonik ili -OR17; ili R4 i R5 zajedno obrazuju dvostruku vezu ili epoksid(-O-);
R6 je vodonik ili C1-6alkil;
R7 je -OH ili -OR-18;
R8 je -OH ili -OR18; pod uslovom da R7 i R8 nisu oba OH;
R9 i R10 su nezavisno izabrani između vodonika i C1-6alkila;
R11 i R12 ili R12 i R13 zajedno obrazuju epoksid i preostala grupa R11 i R13 je vodonik, -OH ili-OR17
R14 je vodonik ili -R17;
R15 je vodonik ili -R17;
R16 je vodonik ili -R17;
R17 je vodonik, -C1-6alkil, -C2-6alkenil, -C2-6alkinil, -C(O)C1-6alkil, -C(O)C2-6alkenil ili -C(O)C2-6alkinil;
R18 je C1-20alkil, -C2-20alkenil, -C2-20alkinil, -C(O)C1-20alkil, -C(O)C2-20alkenil, -C(O)C2-20alkinil, -C(O)cikloalkil, -C(O)C1-10alkilcikloalkil; -C(O)C2-
10alkenilcikloalkil, -C(O)C2-10alkinilcikloalkil, -C(O)aril, -C(O)C1-10alkilaril, -C(O)C2-
10alkenilaril, -C(O)C2-10alkinilaril, -C(O)C1-10alkilC(O)R19, -C(O)C2-
10alkenilC(O)R19, -C(O)C2-10alkinilC(O)R19, -C(O)C1-10alkilCH(OR19)(OR19), -C(O)C2-10alkenilCH(OR19)(OR19), -C(O)C2-10alkinilCH(OR19)(OR19), -C(O)C110alkilSR19, -C(O)C2-10alkenilSR19, -C(O)C2-10alkinilSR19, -C(O)C1-
10alkilC(O)OR19, -C(O)C2-10alkenilC(O)OR19, -C(O)C2-10alkinilC(O)OR19, -C(O)C1-
10alkilC(O)SR19, -C(O)C2-10alkenilC(O)SR19, -C(O)C2-10alkinilC(O)SR19,
ili
i
R19 je vodonik, -C1-10alkil, -C2-10alkenil, -C2-10alkinil, cikloalkil ili aril;
pri čemu je svaka alkil, alkenil, alkinil, cikloalkil ili aril grupa opciono zamenjena; ili geometrijski izomer ili stereoizomer ili njihova farmaceutski prihvatljiva so.
[0039] Rana koja treba da zaraste može biti prisutna na bilo kom organu ili tkivu, uključujući unutrašnje organe ili tkiva ili spoljašnja tkiva, kao što je koža. Rana može biti posledica povrede, ujeda ili opekotine. Organ ili tkivo mogu biti bilo koji ili više od kože, mišića, jetre, bubrega, pluća, srca, pankreasa, slezine, želuca, creva, bešike, jajnika, testisa, materice, hrskavice, tetive, ligamenta, kosti i sličnih. U posebnim primerima izvođenja, rana je na koži i/ili mišiću.
[0040] U nekim primerima izvođenja, epoksi-tigliansko jedinjenje formule (I) se daje ubrzo pošto je rana nastala. U drugim primerima izvođenja, rana je hronična rana koja nije uspela da zaraste danima, nedeljama, mesecima ili godinama. U nekim drugim primerima izvođenja, rana je postojeća rana koja nije uspela da zaraste normalnom brzinom ili nije reagovala na druge terapije.
[0041] Jedinjenja formule (I) se takođe mogu primeniti na ranu koja zarasta ili je zarasla uz preveliki ožiljak. Primeri takvih rana su one gde se stvaraju ili su se stvorili keloidni ožiljci ili hipertrofirani ožiljci.
[0042] U nekim primerima izvođenja, rana je inficirana bakterijskom infekcijom.
Bakterijska infekcija može biti izazvana Gram pozitivim ili Gram negativnim bakterijama, a naročito Gram pozitivnim bakterijama. Neograničavajući primeri bakterija koje kontrolišu jedinjenja prema pronalasku obuhvataju bakterije roda Bacillus, kao što su B, subtilis. B. anthracis, B. cereus, B. firmis, B. licheniformis, B. megaterium, B. pumilus, B. coagulans, B. pantothenticus, B. alvei, B. brevis, B. circubins, B. laterosporus, B. macerans, B. polymyxa, B. stearothermophilus, B. thuringiensis i B. sphaericus; stafilokoke kao što su S. aureus, S. epidemlidis. S. haemolyticus, S. suprophyticus; streptokoke, na primer, S. pyrogenes. S. pneumoniae, S. alagactiae, S. dysgalactiae, S. equisimilis, S. equi, S. zooepidemicus, S. anginosus, S. salwarius, S. milleri, S. sanguis, S. mitior, S. mutans, S. faccalis, S. faecium, S. bovis, S. equinus, S. uberus i S. avium;
Aerococcus spp.,Gemella spp., Corynehacterium spp., Listeria spp., Kurthia spp., Lactobacillus spp.. Erysipdothrix spp., Arachnia spp., Actinomyces spp., Propionibacterium spp., Rothia spp., Bifidobacterium spp., Clostridium spp., Eubacterium spp., Serratia spp., Klebsiella spp., Proteus spp., Enterococcus spp., Pseudomonas spp., Nocardia spp. i Mycobacterium spp.
[0043] U nekim primerima izvođenja, rana je inficirana gljivičnom infekcijom.
Gljivična infekcija može biti izazvana vlaknastim gljivicama ili kvascima.
Neograničavajući primeri gljivica koje kontrolišu jedinjenja prema pronalasku obuhvataju gljivice rodova kao što su Aspergillus spp., Mucor spp., Trichiophylon spp., Cladosporium spp., Ulocladium spp., Curvularia spp., Aureobasidium spp., Candida albicans, Candida spp., Cryptococcus spp., Malessezia pachydermatis, Malessezia spp. i Trichosporon spp.
[0044] U nekim primerima izvođenja rana je inficirana i bakterijskim i gljivičnim infekcijama, uključujući one u biofilmovima.
[0045] Subjekat koji ima ranu koja treba da zaraste može biti bilo koji subjekat uključujući sisare, ptice, ribe i reptile. U nekim primerima izvođenja, subjekat je ljudsko biće, kućna životinja, laboratorijska životinja, uzgojna ili radna životinja, uzgajana ptica, trkačka životinja ili uhvaćena divlja životinja, kao što su one koje se drže u zoološkim vrtovima. Primeri pogodnih subjekata obuhvataju, ali nisu ograničeni na ljude, pse, mačke, zečeve, hrčke, zamorčiće, miševe, pacove, konje, stoku, ovce, koze, jelena, svinje, majmune, torbare, piliće, guske, kanarince, papige, krokodile, zmije, guštere i slične. U posebnim primerima izvođenja, subjekat je sisar kao što je čovek, pas, mačka, konj, stoka, ovca, koza, svinja, jelen, pacov, zamorče, kengur, zec ili miš.
[0046] U nekim primerima izvođenja, administracija epoksi-tiglianskog jedinjenja formule (I) poboljšava zarastanje rane povećanjem brzine zarastanja rane. U nekim primerima izvođenja, administracija epoksi-tiglianskog jedinjenja formule (I) poboljšava zarastanje smanjenjem ožiljka ili količine ožiljnog tkiva koje bi se formiralo u odsustvu tretmana. U nekim primerima izvođenja, tretiranje poboljšava estetski rezultat ili ishod ili izgled rane jednom kada je zarasla uključujući poboljšanje pigmentacije kože i poboljšanje ponovnog rasta dlake u poređenju sa ranom koja nije bila tretirana.
[0047] U posebnim primerima izvođenja poboljšanja zarastanja rane, terapija je prvenstveno topička na mestu i oko njega ili se daje intra-leziono da bi se obezbedio lokalizovani efekat.
[0048] "Efikasna količina" označava količinu neophodnu da se bar delimično postigne željena reakcija, na primer, da se započne zarastanje rane ili poveća brzina zarastanja rane. Količina varira u zavisnosti od zdravsvenog i fizičkog stanja pojedinca koji treba da se tretira, taksonomske grupe pojedinca koji treba da se tretira, formulacije kompozicije, procene medicinskog stanja, i drugih relevantnih faktora. Očekuje se da će količina spadati u relativno širok opseg koji se može odrediti kroz rutinske pokušaje. Efikasna količina u odnosu na ljudskog pacijenta, na primer, može se nalaziti u opsegu od oko 0.1 ng po kg telesne težine do 1 g po kg telesne težine po dozi. Doziranje je poželjno u opsegu od 1μg do 1 g po kg telesne težine po dozi, kao što je u opsegu od 0.5 mg do 1 g po kg telesne težine po dozi. U jednom primeru izvođenja, doza je u opsegu od 1 mg do 500 mg po dozi. U drugom primeru izvođenja, doza je u opsegu od 1 mg do 250 mg po dozi. U jednom drugom primeru izvođenja, doza je u opsegu od 1 mg do 100 mg po dozi, kao što je do 50 mg po dozi. U još jednom sledećem primeru izvođenja, doza je u opsegu od 1 μg do 1 mg po kg telesne težine po dozi. Režimi doziranja mogu biti prilagođeni tako da obezbede optimalnu terapeutsku reakciju. Na primer, više podeljenih doza se može davati dnevno, nedeljno, mesečno ili u drugim pogodnim vremenskim intervalima, ili se doze mogu proporcionalno smanjivati, kako ukažu potrebe situacije.
[0049] U nekim primerima izvođenja, epoksi-tigliansko jedinjenje formule (I) ili biljni ekstrakt koji sadrži bar jedno epoksi-tigliansko jedinjenje formule (I) mogu biti dati odvojeno, bilo istovremeno ili sekvencijalno, ili u istoj kompoziciji kao drugi farmaceuski aktivni agens koji je koristan za zarastanje rane. Na primer, epoksitiglianska jedinjenja formule (I) mogu biti data u kombinaciji sa antibiotikom i/ili protivupalnim agensom. Pogodni antibiotici obuhvataju beta-laktamske antibiotike kao što su penicilin, ampicilin, amoksicilin, flukloksacilin, dikloksacilin, metacilin, karbenicilin i norocilin; cefalosporine kao što su cefaleksin, cefacetril, cefadroksil, cefaloglicin, cefalonijum, cefalordidin, cefatrizin, ceaklor, cefproksil, cefuzonam, cefmetozol, lorakarbef, cefminoks, cefdinir, cefpodoksim, i cefpirom; karbapeneme kao što su imipenem, meropenem, ertapenem, daripenem, panipenem i biapenem; aminoglikozide kao što su gentamicin, streptomicin, neomicin, kanamicin, vankomicin, eritromicin i azitromicin; oksazolidinone kao što su linezolid i posizolid, linkozamide kao što su klindamicin, hiinoline kao što su oksolinska kiselina, ciprofloksacin, enoksacin, ofloksacin, lomefloksacin, levofloksacin i difloksacin; i sulfonamide kao što su sulfametoksazol, sulfoadiazin i sulfacetamid, ili smeše kao što su amoksiklav (amoksicilin i klavulanska kiselina). Pogodni protiv-upalni agensi obuhvataju ne-steroidne protiv-upalne lekove kao što su meloksikam, piroksikam, oksikam, aspirin, difunizal, ibuprofen, deksibuprofen, naproksen, ketoprofen, indometacin, tolmetin, mefenaminsku kiselinu, numisulid i slično i kortikosteroide kao što su hidrokortizon, prednizolon, metilprednizolon, prednizon, budezonid, betametazon i deksametazon.
[0050] Epoksi-tiglianska jedinjenja formule (I) se mogu koristiti u kombinaciji sa drugim terapijama za zarastanje rane kao što su melemi i masti, losioni i gelovi. Na primer, epoksi-tiglianska jedinjenja se mogu koristiti u kombinaciji sa srebrnim premazom i melemima, mastima, losionima i gelovima koji sadrže terapeutske agense, kao što su jod, aloe vera, pau pau, ili medicinski aktivne medove, kao što su manuka med ili druge biološki ili fiziološki aktivne agense, kao što su antivirusni agensi, antibakterijski agensi, antigljivični agensi, i vitamini, kao što su A, C, D i E i njihovi estri. Epoksi-tiglianska jedinjenja formule (I) se takođe mogu koristiti u kombinaciji sa premazima koji obezbeđuju molekularnu strukturu za ranu. Takvi premazi mogu sadržati polimerne filmove i umrežene polimerne filmove, kao što su hijaluronska kiselina i srodne strukture, uključujući umreženu hijaluronsku kiselinu.
[0051] Epoksi-tigliansko jedinjenje je jedinjenje formule (I):
pri čemu
R1 je vodonik i R2 je -OR17; ili R1 i R2 zajedno obrazuju karbonil grupu (=O);
R3 je vodonik ili C1-6alkil;
R4 i R5 su nezavisno vodonik ili -OR17; ili R4 i R5 zajedno obrazuju dvostruku vezu ili epoksid(-O-);
R6 je vodonik ili C1-6alkil);
R7 je -OH ili -OR18;
R8 je -OH ili -OR18; pod uslovom da R7 i R8 nisu oba -OH;
R9 i R10 su nezavisno izabrani između vodonika i C1-6alkila;
R11 i R12 ili R12 i R13 zajedno obrazuju epoksid i preostala grupa R11 i R13 je vodonik, -OH ili -OR17;
R14 je vodonik ili -R17;
R15 je vodonik ili -R17;
R16 je vodonik ili -R17;
R17 je vodonik, -C1-6alkil, -C2-6alkenil, -C2-6alkinil, -C(O)C1-6alkil, -C(O)C2-6alkenil ili-C(O)C2-6alkinil;
R18 je C1-20alkil, -C2-20alkenil, -C2-20alkinil, -C(O)C1-20alkil, -C(O)C2-20alkenil, -C(O)C2-20alkinil, -C(O)cikloalkil, -C(O)C1-10alkilcikloalkil; -C(O)C2-10alkenilcikloalkil -C(O)C2-10alkinilcikloalkil, -C(O)aril, -C(O)C1-10alkilaril, -C(O)C2-10alkenilaril, -C(O)C2-10alkinilaril, -C(O)C1-10alkilC(O)R19, -C(O)C2-10alkenilC(O)R19, -C(O)C2-
10alkinilC(O)R19, -C(O)C1-10alkilCH(OR19)(OR19), -C(O)C2-
10alkenilCH(OR19)(OR19), -C(O)C2-10alkinilCH(OR19)(OR19), -C(O)C1-10alkilSR19, C(O)C2-10alkenilSR19, -C(O)C2-10alkinilSR19, -C(O)C1-10alkilC(O)OR19, -C(O)C2-
10alkenilC(O)OR19, -C(O)C2-10alkinilC(O)OR19, -C(O)C1-10alkilC(O)SR19, -C(O)C2-
10alkenilC(O)SR19, -C(O)C2-10alkinilC(O)SR19,
ili
i
R19 je vodonik, -C1-10alkil, -C2-10alkenil, -C2-10alkinil, cikloalkil ili aril;
pri čemu je svaka alkil, alkenil, alkinil, cikloalkil ili aril grupa opciono zamenjena; ili geometrijski izomer ili stereoizomer ili njihova farmaceutski prihvatljiva so.
[0052] U nekim primerima izvođenja, jedinjenje formule (I) je epoksi-tigliaen-3-on jedinjenje formule (II):
pri čemu su R3, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13 i R15 onakvi kao što su definisani za formulu (I).
[0053] U nekim primerima izvođenja, jedinjenje formule (I) ili (II) je jedinjenje formule (III):
pri čemu su R7, R8, R11, R12, R13 i R15 onakvi kao što su definisani za formulu (I).
[0054] U posebnim primerima izvođenja formule (I), formule (II) ili formule (III), primenjuje se jedno ili više od sledećeg:
R1 je vodonik i R2 je OH ili -OC(O)C1-6alkil, -OC(O)C2-6alkenil ili -OC(O)C2-6alkinil, ili R1 i R2 zajedno obrazuju karbonil grupu; a naročito gde R1 i R2 zajedno obrazuju karbonil grupu;
R3 je vodonik ili -C1-3alkil, poželjno -C1-3alkil, još poželjnije metil;
R4 je vodonik ili -OH, -OC(O)C1-6alkil, -OC(O)C2-6alkenil ili -OC(O)C2-6alkinil i R5 je vodonik ili -OH, -OC(O)C1-6alkil, -OC(O)C2-6alkenil ili -OC(O)C2-6alkinil; ili R4 i R5 zajedno obrazuju dvostruku vezu ili epoksid; a naročito gde R4 i R5 zajedno obrazuju dvostruku vezu;
R6 je vodonik ili -C1-3alkil, poželjno -C1-3alkil, još poželjnije metil;
R7 je -OH, -OC(O)C1-15alkil -OC(O)C2-15alkenil, -OC(O)C2-15alkinil, -OC(O)aril gde je aril grupa opciono zamenjena, -OC(O)C1-15alkilaril, -OC(O)C1-10alkilC(O)H, -OC(O)C2-10alkenilC(O)H, -OC(O)C1-10alkilC(O)C1-6alkil, -OC(O)C2-
10alkenilC(O)C1-6alkil, -OC(O)C1-10alkilCH(OC1-3alkil)(OC1-3alkil), -OC(O)C2-
10alkenilCH(OC1-3alkil)(OC1-3alkil),-OC(O)C1-10alkilSC1-6alkil, -OC(O)2-
10alkenilSC1-6alkil, -OC(O)C1-10alkilC(O)OC1-6alkil ili -OC(O)C2-10alkilC(O)OC1-
6alkil; poželjno -OH, -OC(O)C1-15alkil, -OC(O)C2-12alkenil,-OC(O)C2-12alkinil, -OC(O)aril gde je aril grupa opciono zamenjena, -OC(O)C1-12alkilaril, -OC(O)C1-
6alkilC(O)H, -OC(O)C2-6alkenilC(O)H, -OC(O)C1-6alkilC(O)C1-6alkil, -OC(O)C2-
6alkenilC(O)C1-6alkil), -OC(O)C1-6alkilCH(OC1-3alkil)(OC1-3alkil), -OC(O)C26alkenilCH(OC1-3alkil)(OC1-3alkil), -OC(O)C1-6alkilSC1-3alkil, -OC(O)C2-
6alkenilSC1-3alkil, -OC(O)C1-6alkilC(O)OC1-3alkil ili -OC(O)C2-6alkilC(O)OC1-3alkil; R8 je -OC(O)C1-15alkil, -OC(O)C2-15alkenil, -OC(O)C2-15alkinil, ili -OC(O)aril gde je aril grupa opciono zamenjena, poželjno -OC(O)C1-10alkil, -OC(O)C2-10alkenil, -OC(O)C2-10alkinil ili -OC(O)aril gde je aril grupa opciono zamenjena; još poželjnije -OC(O)C1-10alkil, -C(O)C2-10alkenil i -OC(O)aril gde je aril grupa opciono zamenjena;
R9 i R10 su nezavisno -C1-3alkil, a naročito gde su R9 i R10 oba metil;
R11 i R12 zajedno obrazuju epoksid i R13 je -OH, -OC(O)C1-6alkil, -OC(O)C2-
6alkenil ili-OC(O)C2-6alkinil, poželjno -OH ili -C(O)C1-3alkil; ili
R12 i R13 zajedno obrazuju epoksid i R11 je -OH, -OC(O)C1-6alkil, -OC(O)C2-
6alkenil ili-OC(O)C2-6alkinil, poželjno -OH; i
R14 je vodonik, -C(O)C1-6alkil, -C(O)C2-6alkenil ili -C(O)C2-6alkinil, poželjno vodonik; R15 je vodonik, -C(O)C1-6alkil, -C(O)C2-6alkenil ili-C(O)C2-6alkinil, poželjno vodonik ili-C(O)C1-3alkil; i
R16 je vodonik, -C(O)C1-6alkil, -C(O)C2-6alkenil ili -C(O)C2-6alkinil, poželjno vodonik.
[0055] U posebnim primerima izvođenja, epoksi-tigliansko jedinjenje je izabrano između jednog od sledećih jedinjenja u Tabelama 1 do 6:
Tabela 1
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
Tabela 2:
(nastavak)
Tabela 3:
Tabela 4:
(nastavak)
(nastavak)
[0056] Jedinjenja prema predmetnom pronalasku mogu biti u obliku čistog jedinjenja ili u obliku biljnog ekstrakta.
[0057] Kada su jedinjenja prikazana tako da imaju stereohemiju, onda je prikazana stereohemija relativna stereohemija i bazirana je na poznavanju puteva biosinteze i hemijske analize.
[0058] U nekim primerima izvođenja, biljni ekstrakt je iz biljke iz roda Fontainea ili Hylandia, poželjne vrste su Fontainea pancheri, Fontainea australis, Fontainea borealis, Fontainea fugax, Fontainea oraria, Fontainea picrosperma, Fontainea rostrata, Fontainea subpapuana, Fontainea venosa ili Hylandia dockrillii, a naročito Fontainea picrosperma, Fontainea australis, Fontainea rostrata ili Hylandia dockrillii.
[0059] Delovi biljke mogu uključivati voće, seme, koru, stabljike, list, cvet, korenje, endosperm, egzokarp i drvo, a posebno kada je ekstrakt dobijen iz semena.
[0060] Biljni ekstrakti mogu biti dobijeni standardnim postupcima, kao što je, na primer, biomasa dobijena iz semenki, listova, voća, endosperma, egzokarpa, stabljike ili kore biljke podvrgnuta početnoj ekstrakciji rastvaračem, kao što je pomoću polarnog rastvarača, na primer, etanola. Početni ekstrakt se zatim koncentruje i razređuje vodom i podvrgava ekstrakciji drugim rastvaračem, na primer, etil acetatom. Uzorci rastvarača iz druge ekstrakcije se sjedinjavaju i podvrgavaju razdvajanju pomoću preparativnog HPLC frakcionisanja. Frakcije se analiziraju pomoću analitičke HPLC i sjedinjavaju u skladu sa vremenom retencije jedinjenja pronađenog u uzorcima. Sjedinjene frakcije se mere, biotestiraju i analiziraju analitičkom HPLC. Dalje frakcionisanje pomoću jedne ili više preparativnih HPLC se vrši radi izolacije određenih jedinjenja. Svako jedinjenje se biotestira i njegova struktura se identifikuje pomoću UV, NMR i tehnika masene spektrometrije.
[0061] Druga jedinjenja prema pronalasku se mogu dobiti derivatizacijom jedinjenja izolovanog iz biljaka ili delova biljaka, a naročito iz vrste Fontainea, posebno iz vrsta Fontainea picrosperma, a naročito iz semena Fontainea picrosperma.
[0062] Derivati prirodnih jedinjenja se mogu dobiti tehnikama poznatim u odgovarajućoj oblasti. Na primer, hidroksi grupe mogu biti oksidisane u ketone, aldehide ili karboksilne kiseline izlaganjem oksidacionim agensima, kao što su hromna kiselina, Džonsov reagens, KMnO4, peracidi, kao što je mCPBA (metahloroperbenzojeva kiselina) ili dioksirani, kao što su dimetildioksiran (DMDO) i metil(trifluorometil)dioksiran (TFDO). Oksidacioni agensi mogu biti odabrani tako da takođe oksidisane druge funkcionalne grupe u molekulu ili ne. Na primer, primarni alkohol može biti selektivno oksidisan u aldehid ili karboksilnu kiselinu u prisustvu sekundarnih alkohola korišćenjem reagensa kao što je RuCl2(PPh3)3-benzol.
Sekundarni alkoholi mogu biti selektivno oksidisani u ketone u prisustvu primarnog alkohola korišćenjem Cl2-piridina ili NaBrO3-cer-amonijum nitrata. Alkoholi mogu biti oksidisani u prisustvu dvostrukih i trostrukih veza i bez epimerizacije na susednim stereocentrima korišćenjem Džonsovog reagensa sa ili bez Celita (ili amonijum hlorida). Alternativno tome, izabrani reagensi mogu biti manje selektivni, što za posledicu ima oksidaciju više od jedne funkcionalne grupe.
[0063] Hidroksi grupe takođe mogu biti derivatizovane eterifikacijom ili acilacijom. Na primer, etri mogu biti dobijeni obrazovanjem alkoksidnog jona u prisustvu baze i reagovanjem alkoksida sa odgovarajućim alkilhalidom, alkenilhalidom, alkinilhalidom ili arilhalidom. Slično tome, acilacija se može ostvariti obrazovanjem alkoksidnog jona i reagovanjem sa odgovarajućom karboksilnom kiselinom ili aktiviranom karboksilnom kiselinom (kao što su anhidrid ili acilhlorid).
[0064] Acil grupe mogu biti hidrolizovane da bi se dobili alkoholi pomoću kisele ili bazne hidrolize, kao što je poznato u odgovarajućoj oblasti, a ti alkoholi mogu biti dalje derivatizovani kao što je gore navedeno.
[0065] Ketoni mogu biti redukovani u sekundarne alkohole redukcionim agensima, kao što su litijum aluminijum hidrid i drugi hidridi metala bez redukovanja dvostrukih veza, uključujući α-nezasićene ketone.
[0066] Dvostruke veze i trostruke veze mogu biti redukovane u jednostruke veze primenom katalitičke redukcije, na primer, H2/Pd. Dvostruke veze takođe mogu biti oksidisane u epokside primenom oksidacionih agensa kao što su peracidi, na primer, mCPBA ili dioksirani, kao što su DMDO i TFDO. Dvostruke veze takođe mogu biti podvrgnute dodatnim reakcijama da bi se uveli supstituenti kao što su halo groupe, hidroksi ili alkoksi groupe.
[0067] Stručnjak iz odgovarajuće oblasti će moći da odredi pogodne uslove za dobijanje derivata izolovanih jedinjenja, na primer, prema tekstovima koji se odnose na metodologije sinteze, za koje su primeri Smith M.B. i March J., March’s Advanced Organic Chemistry, peto izdanje, John Wiley & Sons Inc., 2001 i Larock R.C., Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers Ltd., 1989. Osim toga, selektivno manipulisanje funkcionalnim grupama može zahtevati zaštitu drugih funkcionalnih grupa. Pogodne zaštitne grupe za sprečavanje neželjenih sporednih reakcija su date u Green i Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons Inc., 3. izdanje, 1999.
Jedinjenja prema pronalasku
[0068] Prema sledećem aspektu pronalaska, postoje nova jedinjenja koja obuhvataju:
12-heksanoil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 5);
12-acetil-13-(2-metil)butanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 6);
12-propanoil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 7);
12-butanoil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 8);
12-[(2E,4E)-(6,6-dimetoksiheksa-2,4-dienoil]-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 9);
12-[(2E,4E)-6-oksoheksa-2,4-dienoil]-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 10);
12-[(2E,4E)-6,7-dihidroksidodeka-2,4-dienoil]-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 11);
12-[(2E)-4,5-dihidroksi-deka-2-enoil]-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 12); 12-tigloil-13-(2-metilpropanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 13);
12-[(2E)-3-metiltioprop-2-enoil]-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 14);
12-(2-metilprop-2-enoil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 15);
12-[(2E,4E)-heksa-2,4-dienoil]-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 16);
12-[(2E,4E)-8-oksododeka-2,4-dienoil]-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 17);
12-[(2Z,4E)-deka-2,4-dienoil]-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 18);
13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 19);
12-[(2E)-but-1-enoil]-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 20);
12-tigloil-13-butanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 21);
12-(3-butenoil)-13-nonanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 22);
12-benzoil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 23);
12-[(2Z,4E)-deka-2,4-dienoil]-13-(2-metilpropanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 25);
12-[(2E,4E)-6,7-(anti)-epoksi-dodeka-2,4-dienoil]-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 26);
12,13-dibutanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 27);
12-benzoil-13-butanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 28);
12-tigloil-13-(2-metilbutanoil)-5,6-epoksi-4,7,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 29);
13-(2-metilbutanoil)-5,6-epoksi-4,7,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 30);
12-acetil-13-(2-metilbutanoil)-5,6-epoksi-4,7,9,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 31);
12,13-di-(2-metilbutanoil)-5,6-epoksi-4,7,9,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 32);
12-propanoil-13-(2-metilbutanoil)-5,6-epoksi-4,7,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 33);
12-heksanoil-13-(2-metilbutanoil)-5,6-epoksi-4,7,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 34);
12-tigloil-13-(2-metilpropanoil)-5,6-epoksi-4,7,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 35);
12-[(2E)-3-metiltioprop-2-enoil]-13-(2-metilbutanoil)-5,6-epoksi-4,7,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 36);
12-{[2-(metilsulfanil)karbonil]-acetoil}-13-(2-metilbutanoil)-5,6-epoksi-4,7,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 39);
12-[(2-metoksikarbonil)-acetoil]-13-(2-metilbutanoil)-5,6-epoksi-4,7,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 40);
12,13-di-nonoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 41);
12,13-di-heksanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 42);
12,13-di-pentanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 43);
12,13-di-tigloil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 44)
5,20-diacetil-12-tigloil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 45);
12,13-di-(2E,4E)-heks-2,4-enoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 46);
12-heksanoil-13-[2-(N-metilantraniloil)]-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 47)
12-acetil-1,3-[2-(N-metilantraniloil)]-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 48);
12,13-di-heptanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 49);
12-miristoil-13-acetil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 50);
12-miristoil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 51);
12-(2-metilbutanoil)-13-acetil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 52); i
13-heksanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 53);
12,13-di-(3-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,1-tigliaen-3on (Jedinjenje 60)
ili njihova farmaceutski prihvatljiva so.
[0069] Prema jednom drugom aspektu pronalaska, bilo koje od jedinjenja 5 do 53 ili 60 ili njihova farmaceuski prihvatljiva so može biti u obliku farmaceuske kompozicije zajedno sa farmaceuski prihvatljivim nosačem, rastvaračem i /ili ekscipijensom.
Kompozicije
[0070] Mada epoksi-tiglianska jedinjenja formule (I) ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, mogu biti davane čiste, može biti pogodnije da se epoksi-tiglianska jedinjenja daju u obliku farmaceutske kompozicije zajedno sa farmaceuski prihvatljivim nosačem, rastvaračem i /ili ekscipijensom.
[0071] Stručnjak iz odgovarajuće oblasti može lako da odredi farmaceutski oblik i učestanost za farmaceusku primenu i kompozicije.
[0072] Farmaceutski oblici obuhvataju tablete, disperzije, suspenzije, injekcije, rastvore, sirupe, dražeje, kapsule, supozitorije, aerosole, transdermalne flastere, impregnirane (okluzivne) zavoje, kreme, gelove i slično. Ovi farmaceutski oblici takođe mogu uključivati ubrizgavanje ili usađivanje uređaja posebno konstruisanih za, ili modifikovanih za kontrolisano oslobađanje farmaceuske kompozicije.
Kontrolisano oslobađanje terapeutskog agensa može biti postignuto oblaganjem istog, na primer, hidrofobnim polimerima uključujući akrilne smole, voskove, više alipatičke alkohole, polilaktidne i poliglikolne kiseline i određene derivate celuloze, kao što je hidroksipropilmetil celuloza. Osim toga, kontrolisano oslobađanje se može postići primenom drugih polimernih matrica, lipozoma i /ili mikrosfera.
[0073] Farmaceutski prihvatljivi nosači i prihvatljivi nosači za sistemsku primenu takođe mogu biti uključeni u kompozicije prema ovom pronalasku.
[0074] Pogodno je da farmaceuske kompozicije sadrže farmaceuski prihvatljiv ekscipijens ili prihvatljiv ekscipijens. Pod "farmaceuski prihvatljivim ekscipijensom" se podrazumeva čvrsti ili tečni punilac, rastvarač ili supstanca za kapsuliranje koji se mogu bezbedno koristiti. U zavisnosti od određenog načina davanja, mogu se koristiti različiti nosači koji su dobro poznati u odgovarajućoj oblasti. Ovi nosači ili ekscipijensi mogu biti izabrani između grupa koje obuhvataju šećere, skrobove, celulozu i njene derivate, slad, želatin ili druge gelirajuće agense, talk, kalcijum sulfat, biljna ulja, sintetička ulja, alkohole i /ili poliole, alginsku kiselinu, fosfatne puferovane rastvore, emulzifikatore, izotonični slani rastvor, i vodu bez pirogena.
[0075] Bilo koji način davanja se može primeniti da bi humani ili ne’humani pacijent primio farmaceutsku kompoziciju prema pronalasku. Na primer, mogu se primenjivati oralni, topički, rektalni, parenteralni, sublingualni, bukalni, intravenozni, intraartikularni, intra-muskularni, intra-dermalni, subkutani, inhalacioni, intraokularni, intraperitonealni, intracerebroventrikularni, transdermalni i slični.
[0076] Farmaceutske kompozicije prema predmetnom pronalasku pogodne za davanje mogu biti izvedene kao pojedinačne jedinice, kao što su špricevi, bočice, tube, kapsule, kesice ili tablete, od kojih svaka sadrži unapred određenu količinu jednog ili više farmaceuski aktivnih jedinjenja ili ekstrakata prema pronalasku, u obliku praha ili granula ili rastvora ili suspenzije u vodenoj tečnosti, rastvor ciklodekstrina, nevodena tečnost, emulzije ulja u vodi ili emulzije vode u ulju ili u obliku rastvora ili suspenzije u kremi ili gelu ili u obliku suspenzije mikro- ili nanočestica koje sadrže jedinjenje prema pronalasku, uključujući, ali bez ograničenja na siliku ili polilaktidne mikro- ili nano-čestice. Takve kompozicije se mogu dobiti bilo kojim farmakološkim postupkom, ali svi postupci sadrže korak dovođenja u vezu jednog ili više farmaceuski aktivnih jedinjenja prema pronalasku sa nosačem koji predstavlja jedan ili više neophodnih sastojaka. Generalno, kompozicije se dobijaju ravnomernim i bliskim mešanjem agensa prema pronalasku sa tečnim nosačima ili fino usitnjenim čvrstim nosačima ili sa oba, a zatim, ukoliko je neophodno, oblikovanjem proizvoda u željeni oblik.
[0077] Kod praškova, nosač je fino usitnjena čvrsta materija koja se nalazi u smeši sa fino usitnjenom aktivnom komponentom.
[0078] Kod tableta, aktivna komponenta je pomešana sa nosačem koji ima potrebnu vezivnu sposobnost u odgovarajučim proporcijama i komprimovani su u željeni oblik i veličinu.
[0079] Pogodni nosači za praškove i tablete obuhvataju magnezijum karbonat, magnezijum stearat, talk, šećer, laktozu, pektin, dekstrin, skrob, želatin, tragakant, metilcelulozu, natrijum karboksimetilcelulozu, vosak koji se topi na niskoj temperaturi, kakao puter, i slične. Izraz "dobijanje" ima za cilj da obuhvati formulacije aktivnog jedinjenja sa materijalom za kapsuliranje kao nosačem koji obezbeđuje kapsulu u kojoj je aktivna komponenta, sa ili bez nosača, okružena nosačem, koji je na taj način u vezi sa njom. Slično tome, obuhvaćene su kesice i lozenge. Tablete, praškovi, kapsule, pilule, kesice i lozenge se mogu koristiti kao čvrsti oblici pogodni za oralno davanje.
[0080] Za dobijanje supozitorija, vosak koji se topi na niskoj temperaturi, kao što su smeše glicerida masnih kiselina ili kakao putera, je prvo istopljen i aktivna komponenta je homogeno raspršena u njemu, na primer, mešanjem. Istopljena homogena smeša se zatim sipa u kalupe odgovarajuće veličine, ostavlja se da se ohladi, i tako očvrsne.
[0081] Formulacije pogodne za vaginalno davanje mogu biti u obliku vaginaleta, tampona, krema, gelova, pasti, pena ili sprejeva koji osim aktivnog sastojka dodatno sadrže i takve nosače kakvi su poznati u odgovarajućoj oblasti kao odgovarajući.
[0082] Preparati u tečnom obliku obuhvataju rastvore, suspenzije, i emulzije, na primer, vodu ili rastvore voda-propilen glikol. Na primer, tečni preparat za parenteralnu injekciju može biti formulisan u vidu rastvora u vodenom 1,2-propanediolu, dimetilsulfoksidu (DMSO), vodenim rastvorima gama ciklodekstrina ili 2-hidroksipropil-beta-ciklodekstrina, slanom rastvoru ili rastvoru polietilen glikola, sa ili bez pufera. Poželjni opseg pH je 3.5-4.5. Pogodnim puferima se puferuje preparat na pH 3.5-4.5 i oni obuhvataju, ali nisu ograničeni na acetatni pufer i citratni pufer.
[0083] Jedinjenja formule (I) tako mogu biti formulisana za parenteralno davanje (npr. injekcijama, na primer, bolus injekcijom ili neprekidnom infuzijom) i mogu biti u obliku jediničnih doza u obliku ampula, unapred napunjenih špriceva, infuziji male zapremine ili u kontejnerima sa više doza sa dodatim konzervansima. Kompozicije mogu biti u takvim oblicima kao što su suspenzije, rastvori, ili emulzije u uljnim ili vodenim nosačima, i mogu sadržati agense za oblikovanje, kao što su agensi za suspendovanje, stabilizaciju i /ili raspršivanje. Alternativno tome, aktivni sastojak može biti u obliku praška, dobijenog aseptičnim izolovanjem sterilne čvrste materije ili liofilizacijom iz rastvora, za mešanje, pre upotrebe sa pogodnim nosačem, npr. sterilnom, vodom bez pirogena.
[0084] Vodeni rastvori pogodni za oralnu upotrebu se mogu dobiti rastvaranjem aktivne komponente u vodi i dodavanjem pogodnih agensa za boju, ukus, stabilizaciju i zgušnjavanje, po želji.
[0085] Vodene suspenzije pogodne za oralnu upotrebu se mogu dobiti dispergovanjem fino usitnjene aktivne komponente u vodi sa viskoznom materijom, kao što su prirodne ili sintetičke gume, smole, metilceluloza, natrijum karboksimetilceluloza, ili drugi dobro poznati agensi za suspendiovanje.
[0086] Takođe su obuhvaćeni čvrsti oblici preparata koji su namenjeni da budu prevedeni, malo pre upotrebe, u tečni oblik preparata za oralno davanje. Takvi tečni oblici obuhvataju rastvore, suspenzije, i emulzije. Pored aktivne komponente, ovi preparati mogu sadržati boje, arome, stabilizatore, pufere, veštačke i prirodne zaslađivače, disperganse, zgušnjavače, agense za poboljšanje rastvaranja, i slične.
[0087] Za topičko davanje na epidermis ili drugi organ, jedinjenja prema pronalasku mogu biti formulisana kao gelovi, masti, emulzije, paste, kreme ili losioni, ili kao transdermalni flaster. Gelovi se mogu dobiti korišćenjem pogodnih agenasa za zgušnjavanje i njihovim dodavanjem u vodene/alkoholne kompozicije jedinjenja. Pogodni agensi za zgušnjavanje ili geliranje su poznati u odgovarajućoj oblasti, kao što su polivinil karboksi polimer, Carbomer 940. Masti i kreme mogu biti, na primer, formulisani sa vodenom ili uljnom bazom, uz dodavanje pogodnih agenasa za zgušnjavanje ili geliranje. Losioni mogu bitii formulisani sa vodenom ili uljnom bazom i generalno će takođe sadržati jedan ili više agenasa za emulgaciju, agenasa za stabilizaciju, agenasa za dispergovanje, agenasa za suspendovanje, agenasa za zgušnjavanje ili boja.
[0088] Formulacije pogodne za topičko davanje takođe obuhvataju rastvore ili suspenzije koji mogu biti davani topički u obliku kupke ili rastvora za namakanje ili spreja. Ove formulacije se mogu pogodno primeniti za borbu sa iritacijama kože, ujedima insekata ili ranama stopala.
[0089] Formulacije pogodne za topičko davanje u ustima obuhvataju lozenge koje sadrže aktivni agens u aromatizovanoj bazi, obično saharozi i akaciji ili tragakanti; pastile koje sadrže aktivni sastojak u inertnoj bazi, kao što su želatin i glicerin ili saharoza i akacija; i tečnost za ispiranje usta koja sadrži aktivni sastojak u pogodnom tečnom nosaču.
[0090] Rastvori ili suspenzije se primenjuju neposredno u nosnoj šupljini konvencionalnim sredstvima, na primer, pomoću kapalice, pipete ili spreja.
Formulacije mogu biti pripremljene u obliku za jednu ili više doza. U drugom slučaju, kod kapalice ili pipete, ovo se može postići tako da pacijent da odgovarajuću, unapred određenu količinu rastvora ili suspenzije. U slučaju spreja, ovo se može postići na primer, pomoću doziranja pumpe za raspršivanje. Da bi se poboljšalo nazalno davanje i zadržavanje, jedinjenja prema pronalasku mogu biti kapsulirana sa ciklodekstrinima, ili formulisana sa njihovim agensima od kojih se očekuje da poboljšaju davanje i zadržavanje u nosnoj mukozi.
[0091] Davanje u respiratorni trakt takođe može biti postignuto pomoću aerosolne formulacije u kojoj je aktivni sastojak pripremljen u pakovanju pod pritiskom uz pogodni propelant, kao što je hlorofluorougljenik (CFC), na primer, dihlorodifluorometan, trihlorofluorometan, ili dihlorotetrafluoroetan, ugljen dioksid, ili drugi pogodni gasovi. Aerosol pogodno takođe može da sadrži surfaktant kao što je lecitin. Doza leka se može kontrolisati obezbeđivanjem mernog ventila .
[0092] Alternativno tome, aktivni sastojci mogu biti obezbeđeni u obliku suvog praška, na primer, kao što je praškasta smeša jedinjenja formule (I) u pogodnoj praškastoj osnovi kao što su laktoza, skrob, derivati skroba kao što su hidroksipropilmetil celuloza i polivinilpirolidon (PVP).
[0093] Pogodno je da praškasti nosač obrazuje gel u nosnoj šupljini. Praškasta kompozicija može biti izvedena kao pojedinačni farmaceutski oblik, na primer, u kapsuli ili patroni, npr. od želatina, ili blister pakovanju iz koga se prašak može izdati pomoću inhalatora.
[0094] U formulacijama namenjenim za davanje u respiratorni trakt, uključujući intranazalne formulacije, jedinjenje će generalno imati malu veličinu čestica, na primer, reda veličine od 1 do 10 mikrona ili manju. Takva veličina čestica se može postići pomoću sredstava poznatih u odgovarajućoj oblasti, na primer, pomoću mikronizacije.
[0095] Pronalazak će sada biti opisan uz pozivanje na sledeće Primere koji ilustruju neke poželjne aspekte predmetnog pronalaska. Međutim, podrazumeva se da specifičnost sledećeg opisa neće zameniti generalnost prethodnog opisa pronalaska.
Kratak opis slika nacrta
[0096]
Slika 1 je fotografski prikaz zatvaranja ogrebotine u humanim neonatalnim ćelijama fibroblasta tretiranim samo sa nosačem kao kontrolom, 24 sata posle nastanka ogrebotine.
Slika 2 je fotografski prikaz zatvaranja ogrebotine u humanim neonatalnim ćelijama fibroblasta tretiranim sa 30 ng/mL Jedinjenja 1, 24 sata posle nastanka ogrebotine.
Slika 3 je grafički prikaz testa matrigel invazije humanih neonatalnih ćelija fibroblasta tretiranih sa 10 ng/mL ili 30 ng/mL Jedinjenja 1 u poređenju samo sa nosačem kao kontrolom. Ćelije su brojane posle 24 satne inkubacije. * p < 0.05; * p < 0.001.
Slika 4 je Vestern blot analiza testa humanih neonatalnih ćelija fibroblasta tretiranih sa Jedinjenjem 1 i prikazuje aktiviranje i naknadnu regulaciju naniže ključnih signalnih molekula uključenih u izlečenje rane i zarastanje.
Slika 5 je fotografski prikaz efekata izlaganja fibroblasta (kultivisanih u prisustvu TGF-β1) nizu koncentracija Jedinjenja 1 na diferencijaciju miofibroblasta, karakterisanu povećanom ekspresijom α-glatko-mišićnog aktina i formiranjem stresnih vlakana.
Slika 6 je fotografski prikaz efekata izlaganja fibroblasta (kultivisanih u prisustvu TCF-β1) nizu koncentracija Jedinjenja 37 na diferencijaciju miofibroblasta, karakterisanu povećanom ekspresijom α-glatko-mišićnog aktina i formiranjem stresnih vlakana.
PRIMERI
Primer 1: Biljni ekstrakti
[0097] Svi biljni ekstrakti su dobijeni seckanjem biljnog materijala i ekstrahovanjem sa etanolom u približnom odnosu od 1 deo biljnog materijala prema između 2 do 5 delova etanola (w/w). Ekstrakt je ostavljen da odstoji preko noći na 4°C i zatim je supernatant oceđen i uskladišten na 4°C do korišćenja.
[0098] Prisustvo epoksi-tiglianskih jedinjenja u biljnim ekstraktima je potvrđeno pomoću LCMSMS korišćenjem Shimadzu HPLC spojene sa ABI3200 trostrukim kvadrupolnim masenim spektrometrom. Halo amid C18 kolona je korišćena za razdvajanje jedinjenja u smešama, korišćenjem smeše acetonitril/voda kao sistema za rastvaranje.
[0099] Većina uzoraka je ispitana pomoću metoda, korišćenjem C18 Kinetix 4.6 mm x 100 mm 2.6 mikronske C18 kolone:
Acetonitril: 55% 60% 75% 100% 100% 55% Minuti: 0 2.5 15 15.1 17.5 17.6
[0100] Neki od uzoraka su ispitani pomoću Amide Long metoda korišćenjem Halo amid kolone RP 4.6 mm x 150 mm, 2.7 mikrona, proizvođača Advanced Materials Technology:
Acetonitril: 45% 58% 95% 95% 45% 45% Minuti: 0 13 20 24 24.1 27
Primer 2: Izolovanje i elucidacija epoksi-tiglianskih jedinjenja
[0101] Jedinjenja su prečišćena iz semena Fontainea picrosperma ekstrakcijom, i hromatografijom na silika gelu za čime je sledila preparativna HPLC (C18 Kolona, kombinacije rastvarača etanol/voda) primenom opštih postupaka dole.
[0102] Približno 1-2 kg biljnog materijala (listovi, plodovi, seme, stabljike, korenje cvetovi, kora ili drvo) je fino iseckano, ekstrahovano sa 2 dela etanola (w/v) tri puta, a zatim su ekstrakti kombinovani, upareni i ostatak je podeljen između vode i nemešljivog organskog rastvarača (tipično petrol etra bp 40-60 (PE) ili etil acetata EtOAc). Posle uparivanja organskog rastvarača ostatak je hromatografisan na silika gelu u smeši rastvarača sa povećavanjem polarnosti, počevši od PE ili heptana i napredujući ka EtOAc, a zatim etanolu. Frakcije silika gela su zatim dalje prečišćavane preparativnom HPLC na C18 koloni tipično koristeći gradijente etanolvoda. Kasnije frakcije su analizirane u pogledu bioaktivnosti, pa su sjedinjene u skladu sa vremenom retencije jedinjenja otkrivenog analitičkom HPLC, i podvrgnute su daljoj preparativnoj HPLC da bi se dobila čista jedinjenja. Svako jedinjenje je biotestirano i njegova struktura je potvrđena pomoću UV, NMR i tehnikama masene spektrometrije.
Jedinjenje 1: 12-tigloil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on
[0103]
[0104]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.84 (3H (18), d, J=6.4 Hz), 0.92 (3H (4"), t, J=7.3 Hz), 1.11 (3H (5"), d, J=6.8 Hz), 1.21 (3H (16), s), 1.24 (3H (17), s), 1.26 (1H (14), d, J=6.8 Hz), 1.43 (1H (3"), m, J=14.1, 7.3, 7.2 Hz), 1.69 (1H (3"). m), 1.73 (3H (19), dd, J=2.9, 1.5 Hz), 1.77 (3H (4’), dd, J=7.1, 1.2 Hz), 1.8 (3H (5’), d, J=1.5 Hz), 1.94 (1H (11), m), 2.37 (1H (2"), qt, J=7.0, 6.8 Hz), 3.17 (1H (8), d), 3.26 (1H (7), s), 3.69 (1H, OH, br.s), 3.80. (1H (20), d. J=12.7 Hz), 3.83 (1H (20), d, J=12.2.Hz), 4.06 (1H (10), t, J=2,7 Hz), 4.22 (1H (5), s), 5.42 (1H (12), d, J=9.8 Hz), 6.02 (1H, OH, br.s).6.79 (1H (3’), m, J=7.2, 7.0, 1.2 Hz), 7.71 (1H, (1), dd).
[0105]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.6 (4"), 12.2 (5’), 14.4 (4’), 15.1 (18), 16.1 (5"), 17.2 (16), 23.6 (17), 26.1 (3"), 26.6 (15), 36.0 (8), 36.1 (14), 41.2 (2"), 45.9 (11), 48.9 (10,) 61.8 (6), 64.6 (20), 65.2 (7), 65.5 (13), 71.3 (5), 72.4 (4), 76.7 (12), 77.2 (9), 128.4 (2’), 133.4 (2), 137.6 (3’), 164.7 (1), 167.4 (1’), 178.9 (1"), 209.9 (3).
Jedinjenje 2: 12,13-di-(,2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5.9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on
[0106]
[0107]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.85 (3H (18), d, J=6.4 Hz), 0.89 (3H (4"), J=73Hz), 0.91 (3H (4’), t. J=7.8 Hz), 1.11 (3H (5"), d, J=6.8 Hz), 1.12 (3H (5’), d, J=6.8 Hz), 1.21 (3H (17), s), 1.22 (3H (16), s), 1.26 (1H (14), d, J=6.8 Hz), 1.44 (1H (3’), td, J=13.9, 7.3 Hz), 1.44 (1H (3"), td, J=13.9, 7.3 Hz), 1.63 (1H (3’) dd, J=7.8, 5.9 Hz), 1.69 (1H (3"), dd, J=13.9, 7.1 Hz), 1.74 (3H (19), dd, J=2.7, 1.2 Hz), 1.90(1H (11), dd, J=10.0, 6.6 Hz), 2.36 (1H (2’), q, J=7.0 Hz), 2.36 (1H (2"), q, J=7.0 Hz). 3.16 (1H (8), d. J=6.8 Hz), 3.26 (1H (7), s), 3.61 (1H (OH). m), 3.78 (1H (20), m, J=12.7 Hz), 3.85 (1H (20), d, J=12.2 Hz), 4.06 (1H (10), t, J=2.7 Hz), 4.22 (1H (5), s), 5.40 (1H (12), d, J=10.3 Hz), 5.98 (1H (9-OH), m), 7.71 (1H (1). dd, J=2.4, 1.5 Hz),
[0108]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.6 (4’), 11.6 (4"), 15.0 (18). 16.1 (5"), 170 (5’), 17.2 (17), 23.7 (16), 26.2 (3"), 26.5 (15), 26.7 (3’), 36.0 (8), 36.0 (14), 41.2 (2"), 41.8 45.5 (11), 48.9 (10), 61.7 (6), 64.5 (20), 65.2 (7), 65.5 (13),
71.5 (5), 72.4 (4), 76.2 (12), 77.2 (9), 133.5 (2), 164.7 (1), 175.9 (1’), 178.8 (1"), 209.9 (3),
Jedinjenje 3: 12-[(2E,4E,6E)-dodeka-2,4,6-trienoil]-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on
[0109]
[0110]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.86 (3H (18), d, J=7.0 Hz), 0.87 (3H (12’), m. J=7.0 Hz).0.92 (3H (4"), t. J=7.5 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=7.0 Hz), 1.22 (3H (17), s), 1.24 (3H (16), s), 1.26 (2H (10’), m), 1.27 (1H (14), m), 1.29 (2H (11’), m), 1.39 (2H (9’), m), 1.45 (1H (3"), dd, J=14.1, 7.0 Hz), 1.71 (1H (3"), m), 1.74 (3H (19), dd, J=2.8, 1.2 Hz), 1.95 (1H (11), dq), 2.12 (2H (8’), q), 2.38 (1H (2"), sxt, J=7.0 Hz), 3.17 (1H (8), d, J=6.7 Hz), 3.27 (1H (7), s), 3.57 (1H, (4-OH), s), (3.78 (1H (20), m), 3.86 (1H (20), m), 4.06 (1H (10), d, J=2.7 Hz), 4.22 (1H (5), s), 5.41 (1H (12), d), 5.79 (1H (2’), d, J=15.2 Hz), 5.92 (1H (7’), dt, J=15.2, 7.2 Hz), 6.04 (1H (OH), m), 6.11 (1H (6’), dd, J=15.1, 10.7 Hz), 6.19 (1H (4’), dd, J=14.8, 11.2 Hz).6.51 (1H (5’), dd, J=14.9, 1.0.7 Hz), 7.23 (1H (3’), dd, J=15.5, 1.0.9 Hz), 7.72 (1H (1), dd, J=2.4. 1.3 Hz).
[0111]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.6 (4"), 14.0 (12’), 15.1 (18), 16.2 (5"), 17.2 (16), 22.5 (11’), 23.6 (17), 26.2 (3"), 26.7 (15), 28.6 (9’), 31.4 (10’), 33.0 (8’), 36.0 (8), 36.2 (14), 41.2 (2"), 45.9 (11), 48.9 (10), 61.6 (6), 64.5 (20), 65.3 (7), 65.5 (13), 71.6 (5), 72.4 (4), 76.7 (9), 77.1 (12), 119.5 (2’), 127.5 (4’), 129.7 (6’), 133.5 (2), 141.1 (7’), 141.7 (5’), 145.3 (3’), 164.8 (1), 166.6 (1’), 170.0 (1"), 210.0 (3).
Jedinjenje 4: 12-[(2E,4Z)-deka-2,4-dienoil]-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on
[0113]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.87 (3H (18), d, J=6.4 Hz), 0.87 (3H (10’), s), 0.93 (3H (4"), t, J=7.5 Hz), 1.13 (3H (5"), d. J=7.1 Hz), 1.23 (3H (16), s), 1.25 (3H (17), s), 1.27 (1H (14), d, J=1.6 Hz), 1.27 (2H (9’), m), 1.30 (2H (8’), m), 1.40 (2H (7’), m), 1.46 (1H (3"), dd, J=14.2, 6.9 Hz), 1.71 (1H (3"), m), 1.75 (3H (19), dd, J=2.9, 1.3 Hz), 1.95 (1H (11), d, J=3.3 Hz), 2.11 (1H (20-OH), m), 2.26 (2H (6’), m), 2.38 (1H (2"), q, J=7.0 Hz), 3.18 (1H (8), d, J=6.6 Hz), 3.28 (1H (7), s), 3.53 (1H (4-OH), d, J=0,9 Hz), 3.77 (1H (20), m), 3.81 (1H (5-OH), d, J=2.9 Hz), 3.87 (1H (20), dd, J=12.4, 7.6 Hz), 4.06 (1H (10), d, J=2.7 Hz), 4.22 (1H (5), d, J=1.7 Hz), 5.43 (IH (12), d, J=9.9 Hz), 5.83 (1H (2’), d, J=15.2 Hz), 5.86 (1H (5’), ddd, J=10.8, 7.9, 7.8 Hz), 6.03 (1H (9-OH), m), 6.10(1H (4’), td, J=11.2, 0.7 Hz), 7.56 (1H (3’), ddd, J=15.3, 11.7, 1.1 Hz), 7.72 (1H (1), dd. J=2.5, 1.4 Hz).
[0114]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.6 (4"), 14.0 (10’), 15.2 (18), 16.2 (5"), 17.2 (17), 22.5 (9’), 23.7 (16), 26.2. (3"), 26.7 (15), 28.3 (6’), 29.0 (7’), 31.4 (8’), 36.1 (8), 36.2 (14), 41.2 (2"), 45.9 (11), 49.0 (10), 61.6 (6), 64.5 (20), 65.3 (7), 65.5 (13), 71.7 (5), 72.3 (4), 76.8 (12), 77.1 (9), 120.8 (2), 126.4 133.5 (2), 140.0
(3’), 142.2 (5’), 164.8 (1), 166.6 (1’), 179.0 (1"), 210.0 (3).
Jedinjenje 5: 12-heksanoil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on
[0115]
[0116]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.84 (3H (18), d, J=6.5 Hz), 0.87 (3H (6’),t, J=7.0 Hz), 0.91 (3H (4"), t, J=7.5 Hz), 1.11 (3H (5"), d, J=7.0 Hz), 1.21, (3H (16), s), 1.21, (3H (17), s), 1.25 (1H (14), d, J=6.6 Hz), 1.43 (1H (3"), m, J=14.1, 7.4, 7.1 Hz), 1.60 (2H (3’), quin, J=7.4 Hz), 1.70 (1H (3"), ddd, J=13.9, 7.3, 7.1 Hz), 1.74 (3H (19), dd, J=2.9, 1.3 Hz), 1.9 (1H (11), dq, J=10.0, 6.5 Hz), 2.27 (2H (2’), dt, J=7.4, 3.7 Hz), 1.29 (2H (4’), m, J=7.5, 7.2, 3.9 Hz), 1.29 (2H (5’), m, J=7.5, 7.2, 3.9 Hz), 2.36 (1H (2"), sxt, J=7.0 Hz), 3.14 (1H (8), d, J=6.6 Hz), 3.25 (1H (7), s), 3.64 (1H, (OH), s), 3.83 (1H (OH), dd, J=12.5, 7.9 Hz), 3.79 (2H (20), dd, J=12.5, 5.7 Hz), 3.94, (1H (OH), d, J=2.5 Hz), 4.06 (1H (10), t, J=2.6 Hz), 4.22 (1H (5), s), 5.37 (1H (12), d, J=10.0 Hz), 5.95 (1H (OH), br. s.) 7.7 (1H (1), dd, J=2.4, 1.3 Hz).
[0117]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.6 (4"), 13.9 (6’), 15.0 (18), 16.1 (5"), 17.1 (16), 22.3 (5’), 23.6 (17), 24.9 (3’), 26.2 (3"), 26.6 (15), 31.1 (4’), 34.5 (2’), 35.96 (8), 36.04 (14), 41.2 (2"), 45.6 (11), 48.9 (10), 61.8 (6), 64.6 (20), 65.2 (7).
65.5 (13), 71.4 (5), 72.4 (4), 76.5 (12), 77.1 (9), 133.4 (2), 164.6 (1), 173.3 (1’), 178.8 (1"), 209.9 (3),
Jedinjenje 6: 12-acetil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on
[0118]
[0119]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.85 (3H (18), d, J=6.4 Hz), 0.92 (3H (4"), t, J=7.6 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=6.8 Hz), 1.21 (3H (16), s).1.23 (3H (17), s), 1.25 (1H (14), d, J=6.8 Hz), 1.44 (1H (3"), m, J=14.1, 7.3, 7.2 Hz), 1.71 (1H (3"), dd), 1.75 (3H (19), dd, J=2.9, 1.0 Hz), 1.91 (1H (11), m), 2.04 (3H (2’), s), 2.36 (1H (2"), m, J=7.0, 6.8 Hz), 3.14 (1H (8), d, J=6.8 Hz), 3.26 (1H (7), s), 3.78 (1H (20), d, J=12.7 Hz), 3.85 (1H (20), d, J=12.7 Hz), 4.04 (1H (10), t, J=2.7 Hz), 4.21 (1H (5), s), 5.33 (1H (12), d, J=9.8 Hz), 7.7 (1H (1), s).
[0120]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.6 (4"), 15.1 (18), 16.2 (5"), 17.1 (16), 21.0 (2’), 23.7 (17), 26.2 (3"), 26.7 (15), 36.0 (8), 36.1 (14), 41.2 (2"), 45.7 (11), 48.9 (10), 61.7 (6), 64.5 (20), 65.2 (7).65.4 (13), 71.5 (5), 72.4 (4), 76.8 (9), 77.1 (12), 133.5 (2), 164.6 (1), 170.6 178.9 (1"), 209.9 (3).
Jedinjenje 7: 12-propanoil-13-(2-.metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on
[0121]
[0122]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.85 (3H (18), d. J=6.8 Hz), 0.92 (3H (4"), t, J=7.6 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=7.3 Hz), 1.13 (3H (3’), t), 1.21 (3H (16), s), 1.22 (3H (17), s), 1.25 (1H (14), dd, J=10.3, 6.8 Hz), 1.44 (1H (3"), m J=14.0, 7.0, 6.6 Hz), 1.70 (1H (3"), dd, J=14.2, 6,8 Hz), 1.74 (3H (19), dd, J=2.9, 1.5 Hz), 1.91 (1H (11), m), 2.31 (2H (2’), m), 2.37 (1H (2"), dd, J=13.7, 6.8 Hz), 3.15 (1H (8), d, J=6.8 Hz), 3.26 (1H (7), s), 3.78 (1H (20), d, J=12.2 Hz), 3.84 (1H (20), d,J=12.7 Hz), 4.05 (1H (10), m), 4.21 (1H (5), s), 5.35 (1H (12), d, J=9.8 Hz), 5.92 (1H (OH), br.s.), 7.71 (1H (1), m).
[0123]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.3 (3’), 9.7 (19), 11.6 (4").15.1 (18), 16.1 (5"), 17.1 (16), 23.7 (17), 26.2 (3"), 26.7 (15), 27.8 (2’), 36.0 (8), 36.1 (14), 41.2 (2"), 45.7 (11), 48.9 (10), 61.7 (6), 64.6 (20), 65.2 (7), 65.4 (13), 71.5 (5), 72.4 (4), 76.8 (12), 77.1 (9), 133.5 (2), 164.6 (1), 173.9 178.9 (1"), 209.9 (3).
Jedinjenje 8: 12-butanoil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on
[0124]
[0125]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.85 (3H (18), d, J=6.4 Hz), 0.92 (3H (4"), t, J=7.6 Hz), 0.94 (3H (4’), t, J=7.3 Hz), 1.12 (3H (5"), d), 1.22 (3H (16), s), 1.23 (3H (17), s), 1.26 (1H (14), d, J=6.8 Hz), 1.45 (1H (3"), dq, J=14.0, 7.1 Hz) 1.64 (2H (3’), m, J=14.6, 7.2, 7.1 Hz), 1.71 (1H (3"), dd, J=13.7, 6.8 Hz), 1.75 (3H (19), d, J=2.9 Hz), 1.90 (1H (11), dd, J=10.0, 6.6 Hz), 2.27 (2H (2’), m), 2.37 (1H (2"), qt, J=7.0, 6.8 Hz), 3.15 (1H (8), d, J=6.4 Hz), 3.27 (1H (7), s), 3.77 (1H (20), m, J=12.2 Hz), 3.86 (1H (20), m, J=12.7 Hz), 4.05 (1H (10), d, J=2.4 Hz), 4.21 (1H (5), s), 7.71 (1H (1), dd, J=2.4, 1.0 Hz).
[0126]<13>C NMR (125 MHz. CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.6 (4").13.5 (4’), 15.1 (18), 16.1 (5").17.1 (16), 18.7 (3"), 23.7 (17), 26.2 (3"), 26.6 (15), 36.0 (8), 36.1 (14), 36.4 (2’),41.2 (2"), 45.6 (11), 48.9 (10), 61.6 (6), 64.5 (20), 65.2 (7), 65.5 (13), 71.7 (5), 72.3 (4), 76.6 (12).77.1 (9), 133.5 (2), 164.7 (1), 173.1 178.8 (1"), 209.9 (3).
Jedinjenje 9: 12-[(2E,4E)-(6,6-dimetoksiheksa-2.4-dienoil]-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13.20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on
[0127]
[0128]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.86 (3H (18), d, J=6.4 Hz), 0.92 (3H (4"), t, J=7.3 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=6.8 Hz), 1.22 (3H (17), s), 1.24 (3H (16), s), 1.27 (1H (14), dd, J=11.2, 6.8 Hz), 1.44 (1H. (3"), m), 1.72 (1H (3"). m), 1.75 (3H (19), dd, J=2.9, 1.5 Hz), 1.96 (1H (11), dd, J=10.0, 6.6 Hz), 2.37 (1H (2"). m), 3.17 (1H (8), d, J=6.8 Hz), 3.27 (1H (7), s), 3.31 (3H (7’), s), 3.31 (3H (8’), s), 3.79, (1H (20), m, J=12.2 Hz), 3.86 (1H (20), m), 4.06 (1H (10), br. s.), 4.22 (1H (5), d, J=2.4 Hz), 4.89 (1H (6’), dd, J=4.4, 1.0 Hz), 5.42 (1H. (12), d, J=9.8 Hz), 5.91 (1H (2’), d, J=15.7 Hz), 5.98 (1H (5’), dd, J=15.7, 4.4 Hz), 6.47 (1H (4’), dd, 15.6, 11.2 Hz), 7.21 (1H (3’), dd, J=15.6, 11.2 Hz), 7.71 (1H (1), s).
[0129]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.6 (4"), 15.1 (18), 16.2 (5"), 17.2 (17), 23.6 (16), 26.2 (3"), 26.8 (15), 36.0 (8), 36.2 (14), 41.2 (2"), 45.8 (11), 48.9 (10), 52.7 (7’), 52.7 (8’).61.7 (6), 64.5 (20), 65.2 (7), 65.4 (13), 71.6 (5), 72.4 (4), 77.1 (9), 77.1 (12), 101.3 (6’), 122.8 (2’), 131.0 (4’), 133.5 (2), 137.9 (5’), 143.4 (3’), 164.7 (1), 166.1 178.9 (1"), 209.9 (3).
Jedinjenje 10: 12-[(2E-,4E)-6-oksoheksa-2.4-dienoil]-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on
[0130]
[0131]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.88 (3H (18), d, J=6.4 Hz), 0.93 (3H (4"), t, J=7.5 Hz), 1.13 (3H (5"), d, J=7.1 Hz), 1.24 (3H (17), s), 1.25 (3H (16), s), 1.28 (1H (14), m), 1.46 (1H (3"), td, J=14.1, 7.3 Hz), 1.70 (1H (3"), m), 1.75 (3H (19), dd, J=2.9, 1.2 Hz), 1.99 (1H (11), dddd, J=9.8, 6.5, 6.4, 6.1 Hz), 2.38 (1H (2"), d, J=6.8 Hz), 3.19 (1H (8), d, J=6.8 Hz), 3.28 (1H (7), s), 3.77 (1H (20), m, J=12.5 Hz), 3.87 (1H (20), d, J=13.0 Hz), 4.06 (1H (10), d, J=2.7 Hz), 4.22 (1H (5), s), 5.46 (1H (12), d, J=9.8 Hz), 6.28 (1H (2’), d, J=15.4 Hz), 6.40 (1H (5’), dd, J=15.4, 7.8 Hz), 7.14 (1H (4’), dd, J=14.9, 11.2 Hz), 7.36 (1H (3’), dd, J=15.4, 11.2 Hz), 7.71 (1H (1), dd, J=2.6, 1.3 Hz), 9.66 (1H (6’), d, J=7.6 Hz).
[0132]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.6 (4"), 15.2 (18), 16.2 (5"), 17.2 (16), 23.6 (17), 26.2 (3"), 26.9 (15), 36.0 (8), 36.3 (14), 41.2 (2"), 45.8 (11), 48.9 (10), 61.7 (6), 64.5 (20), 65.1 (7), 65.3 (13), 71.6 (5), 72.3 (4), 77.1 (9), 78.2 (12), 129.4 (2’).133.6 (2), 137.2 (5’), 140.8 (3’), 146.9 (4’), 164.4 (1), 165.0 (1’), 178.9 (1"), 192.8 (6;), 209.8 (3).
Jedinjenje 11: 12-[(2E,4E)-6,7-dihidroksidodeka-2,4-dienoil]-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,3,9.12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on
[0133]
[0134]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.87 (3H (18), d, J=2.0 Hz), 0.87 (3H (12’), d, J=2.0 Hz), 0.92 (3H (4"), t, J=7.3 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=6.8 Hz), 1.22 (3H (17), s), 1.24 (3H (16), s), 1.28 (1H (14), d, J=6.4 Hz), 1,28 (2H (11’), d, J=6.4 Hz), 1.44 (2H (8’), d, J=6.8 Hz), 1.46 (1H (3"), d, J=6.8 Hz), 1.47 (2H (9’), d, J=2.9 Hz), 1.69 (1H (3"), m), 1.76 (3H (19), m), 1.95 (1H (11), dd, J=9.5, 6.6 Hz), 2.38 (1H (2"), dq, J=13.7.6.8 Hz).3.17 (1H (8), d, J=6.4 Hz), 3.27 (1H (7), s), 3.49 (1H (7’), br. s.), 3.60 (1H (OH), s), 3.82 (2H (20),), 4.03 (1H (6’), m), 4.06 (1H (10), br. s.), 4.22 (1H (5), d, J=2.9 Hz), 5.42 (1H (12), d, J=9.8 Hz), 5.88 (1H (2’), d, J=15.2 Hz), 6.08 (1H (OH), t, J=6.1 Hz), 6.11 (1H (5’), t, J=6.1 Hz), 6.43 (1H (OH), m), 6.47 (1H (4’), m), 7.21 (1H (OH), dd, J=13.2, 2.0 Hz), 7.24 (1H (3’), s), 7.71 (1H (1), s),
[0135]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm; 9.7 (19), 11.6 (4"), 14.0 (12’), 15.1 (18), 16.2 (5"), 17.2 (16), 22.6 (11’), 23.6 (17), 25.3 (9’), 26.2 (3"), 26.8 (15), 31.7 (10’), 33.1 (8’), 36.0 (8), 36.2 (14), 41.2 (2"), 45.8 (11), 48.9 (10), 61.7 (6), 64.5 (20), 65.2 (7), 65.4 (13), 71.6 (5), 72.4 (4), 74.5 (7’), 75.1 (6’), 77.1 (9), 77.1 (12), 133.5 (2), 121.8 (2’), 129.7 (4’), 141.6 (5’), 143.8 (3’), 164.6 (1), 166.2 (1’), 178.9 (1"), 209.9 (3).
Jedinjenje 12: 12-[(2E)-4,5-dihidroksi-deka-2-enoil]-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on
[0137]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.86 (3H (18), d), 0.87 (3H (10’), t), 0.93 (3H (4"), t, J=7.5 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=7.0 Hz), 1.22 (3H (17), s), 1.23 (3H (16), s), 1.26 (2H (9’). m), 1.27 (1H (14), m), 1.28 (2H (8’), m), 1.30 (1H (7’), m), 1.42 (2H (6’), m), 1.44 (1H (3"), m), 1.46 (1H (7’). m), 1.70 (1H (3"), m), 1.74 (3H (19), d, J=1.6 Hz), 1.95 (1H (11), m), 2.37 (1H (2"), m), 3.16 (1H (8), d, J=6.5 Hz), 3.27 (1H (7), s), 3.75 (1H (5’), m), 3.77 (1H (20), m), 3.85 (1H (20), d, J=19.3 Hz), 4.05 (1H (10), br. s.), 4.21 (1H (5), s), 4.32 (1H (4’), m), 5.41 (1H (12), d, J=9.5 Hz), 6.11 (1H (2’), dd, J=8.8, 1.8 Hz), 6.92 (1H (3’), dd, J=4.9, 1.6 Hz), 7.71 (1H (1), dd),
[0138]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19).11.6 (4"), 14 (10’), 15.1 (18), 16.2 (5"), 17.2 (16), 22.5 (9’), 23.7 (17), 25.5 (7’), 26.2 (3"), 26.8 (15), 31.7 (8’), 32.0 (6’), 36.0 (8), 36.2 (14), 41.2 (2"), 45.8 (11), 48.9 (10), 61.7 (6), 64.5 (20), 65.2 (7), 65.4 (13), 71.6 (5), 72.3 (4), 73.9 (4’), 74.1 (5’), 77.1 (12), 77.3 (9), 122.5 (2’), 133.6 (2), 145.9 (3’), 164.6 (1), 165.5 (1’), 179 (1"), 209.9 (3).
Jedinjenje 13: 12-tigloil-13-(2-metilpropanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,1,3,20-heksahidroksi-4-tigliaen-3-on
[0139]
[0140]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.84 (3H (18), d, J=6.4 Hz), 1.14 (3H (4") d, J=7.3 Hz, 1.17 (3H (3"), d, J=6.8 Hz), 1.22 (3H (16), s), 1.24 (3H (17), s), 1.28 (1H (8), m), 1.74 (3H (19), s), 1.77 (3H (4’), d, J=7.3 Hz), 1.95 (1H (11), dd, J=10.0, 6.6 Hz), 2.56 (1H, (2"), m, J=7.3, 7.1, 7.0 Hz), 3.16 (1H (14), d, J=6.4 Hz), 3.26 (1H (7). s), 3.82 (2H (20), m), 4.06 (1H (10), br. s.), 4.22 (1H (5), d, J=2.4 Hz), 5.41 (1H (12), d, J=9.8 Hz), 6.80 (1H (3’), m), 7.71 (1H (1), s),
[0141]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 12.2 (5’), 14.4 (4’), 15.1 (18), 17.2 (17), 18.5 (3"), 18.6 (4"), 23.7 (16), 26.5 (15), 34.1 (2"), 36.0 (8), 36.1 (14), 45.8 (11), 48.9 (10), 61.7 (6), 64.6 (20), 65.2 (7), 65.5 (13), 71.4 (5), 72.4 (4), 76.6 (12), 77.2 (9), 128.4 (2’), 133.4 (2), 137.6 (3’), 164.7 (1), 167.5 (1’), 179.3 (1"), 209.9 (3).
Jedinjenje 14: 12-[(2E)-3-metiltioprop-2-enoil]-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on
[0142]
[0143]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.86 (3H (18), d, J=6.4 Hz), 0,92 (3H (4"), 1, J=7.3 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=6.8 Hz), 1.23 (3H (17), s), 1.24 (3H (16), s), 1.27 (1H (14), d, J=6.8 Hz), 1.44 (1H (3"), m), 1.71 (1H (3"), m).1.75 (3H (19), s), 1.94 (1H (11), m), 2.14 (1H (OH), t, J=5.9 Hz), 2.32 (3H (4’), s), 2.38 (1H (2"), m), 3.16 (1H (8), d, J=6.8 Hz), 3.27 (1H (7), s), 3.55 (1H (4-OH), s), 3.78 (1H (20), dd, J=12.7, 5.9 Hz), 3.84 (1H (5-OH), s), 3.85 (1H (20), s), 4.05 (1H (10), m), 4.21 (1H (5), d, J=2.4 Hz), 5.41 (1H (12), d, J=9.8 Hz), 5.61 (1H (2’), d, J=14.7 Hz), 6.02 (1H (9-OH), m), 7.69 (1H (3’), d, J=14.7 Hz), 7.71 (1H (1), s),
[0144]<13>C NMR (125 MHz. CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.6 (4").14.3 (4’), 15.1 (18), 16.2 (5"), 17.2 (16).23.7 (17), 26.2 (3"), 26.7 (15), 36.1 (8), 36.2 (14), 41.2 (2"), 45.9 (11), 49.0 (10), 61.6 (6), 64.5 (20), 65.2 (7), 65.5 (13), 71.7 (5), 72.4 (4), 76.8 (12), 77.1 (9), 112.8 (2’), 133.5 (2), 147.5 (3’), 164.5 (1’), 164.8 (1), 178.9 (1"), 210.0 (3).
Jedinjenje 15: 12-(2-metilprop-2-enoil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12.13.20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on
[0145]
[0146]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.86 (3H (18), d), 0.92 (3H (4"), t, J=7.3 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=6.8 Hz), 1.23 (3H (17), br. s.), 1.25 (3H (16), s), 1.27 (1H (14), dd, J=11.2, 6.4 Hz), 1.45 (1H (3"), m), 1.72 (1H (3"), m), 1.75 (3H (19), dd, J=2.9, 1.0 Hz), 192 (3H (4’), s), 1.95 (1H (11), m), 2.38 (1H (2"), m), 3.18 (1H (8), d), 3.28 (1H (7), s), 3.54 (1H (OH), d, J=1,0 Hz), 3.78 (1H (20), m), 3.87 (1H (20), dd), 4.06 (1H (10), m), 4.22 (1H (5), d, J=2.0 Hz), 5.42 (1H (12), s), 5.56 (1H (3’), dt, J=2.9, 1.5 Hz), 6.05 (1H (3’), m), 7.72 (1H (1), dd, J=2.4, 1.5 Hz).
[0147]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm; 9.7 (19), 11.6 (4"), 15.1 (18), 16.2 (5"), 17.2 (17), 18.5 (4’), 23.7 (16), 26.2 (3"), 26.7 (15), 36.1 (8), 36.2 (14), 41.2 (2"), 45.9 (11), 49.0 (10), 61.6 (6), 64.5 (20), 65.2 (7), 65.5 (13), 71.7 (5), 72.3 (4), 77.1 (9), 77.3 (12), 125.8 (3’), 133.5 (2),136.2 (2’), 164.7 (1), 166.8 (1’), 178.9 (1"), 209.9 (3),
Jedinjenje 16: 12-[(2E,4E)-heksa-2,4-dienoil]-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on
[0148]
[0149]<1>H NMR (500 MHz. CDCl3,) δ ppm: 0.87 (3H (18), d, J=6.5 Hz), 0.93 (3H (4"), t), 1.13 (3H (5"), m. J=6.8 Hz), 1.23 (3H (16), br. s.), 1.26 (3H (17), s), 1.27 (1H (14), m), 1.45 (1H (3"), s), 1.70 (1H (3"), m), 1.75 (3H (19), dd, J=2.8, 1.2 Hz), 1.86 (3H (6’), dd, J=7.3, 1.7 Hz), 1.96 (1H (11), dd, J=9.8, 6.2 Hz), 2.37 (1H (2"), m), 3.18 (1H (8), d, J=6.7 Hz), 3.28 (1H (7), s), 3.78 (1H (20), m), 3.87 (1H (20), m), 4.06 (1H (10), br. s.), 4.21 (1H (5), br. s.), 5.44 (1H (12), d, J=10.1 Hz), 5.83 (1H (2’), d, J=15.0 Hz), 5.94 (1H (5’), m), 6.14 (1H (4’), m), 7.59 (1H (3’), ddd, J=15.3, 11.7, 1.2 Hz), 7.72 (1H (1), dd, J=2.2, 1.3 Hz).
[0150]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.6 (4"), 14.1 (6’), 15.2 (18), 16.2 (5"), 17.2 (17), 23.7 (16), 26.2 (3"), 26.7 (15), 36.1 (8), 36.2 (14), 41.2 (2"), 45.9 (11), 49.0 (10), 61.6 (6), 64.5 (20), 65.3 (7), 65.5 (13), 71.7 (5), 72.4 (4), 76.8 (12), 77.1 (9), 120.7 (2’), 127.3 (4’), 133.5 (2), 136.2 (5’), 139.6 (3’), 164.8 (1), 166.6 (1’), 179.0 (1"), 210.0 (3).
Jedinjenje 17: 12-[(2E,4E)-8-oksododeka-2,4-dienoil]-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on
[0151]
[0152]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.85 (3H (18), d, J=5.3 Hz), 0.88 (3H (12’), t, J=7.3 Hz), 0.92 (3H (4"), t, J=7.4 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=7.0 Hz), 1.22 (3H (16), br. s.), 1.23 (3H (17), s), 1.26 (1H (14), d, J=5.4 Hz), 1.28 (2H (11’), d, J=2,8 Hz), 1.43 (1H (3"), br. s.), 1.53 (2H (10’), m), 1.71 (1H (3"), m), 1.75 (3H (19), dd, J=2.9, 1,3 Hz), 1.95 (1H (11), m), 2.37 (1H (2"), m), 2.38 (2H (9’), d, J=7.2 Hz), 2.42 (2H (6’), m), 2.52 (2H (7’), s), 3.17 (1H (8), d, J=6.6 Hz), 3.27 (1H (7). s), 3.53 (1H (OH), s), 3.81 (1H (20), br. s.), 3.86 (1H (20), m), 4.05 (1H (10), m), 4.22 (1H (5), d, J=2.4 Hz), 5.41 (1H (12), d, J=9.8 Hz), 5.76 (1H (2’), d, J=15.4 Hz), 6.09 (1H (5’), t, J=6.8 Hz), 6.15, (1H (4’), d, J=10.6 Hz), 7.16 (1H (3’), dd, J=15.4, 10.6 Hz), 7.71 (1H (1), dd, J=2.6, 1.3 Hz).
[0153]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.6 (4"), 13.8 (12’), 15.1 (18), 16.2 (5"), 17.2 (17), 22.3 (11’).23.7 (16), 25.9 (10’), 26.2 (3"), 26.7 (15), 26.9 (6’), 36.1 (8), 36.1 (14), 41.2 (2"), 41.3 (7’), 42.7 (9’), 45.9 (11), 49.0 (10), 61.6 (6), 64.5 (20), 65.3 (7), 65.5 (13), 71.7 (5), 72.3 (4), 77.1 (12), 77.2 (9), 119.6 (2’), 129.1 (4’), 133.5 (2), 142.8 (5’), 145.0 (3’), 164.8 (1), 166.6 (1’), 179.0 (1)", 209.7 (8’), 210.1 (3).
Jedinjenje 18: 12-[(2Z,4E)-deka-2,4-dienoil]-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on
[0154]
[0155]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.86 (3H (10’), t, J=6.9 Hz), 0.87 (3H (18), d, J=6.6 Hz), 0.94 (3H (4"), t, J=7.5 Hz), 1.14 (3H (5"). d, J=7.1 Hz), 1.22 (3H (16), s), 1.23 (3H (17), s), 1.25 (1H (14), br. s.), 1.27 (2H (8’), br. s.), 1.28 (2H, (9’), br. s.), 1.41 (2H (7’), m), 1.46 (1H (3"), m), 1.71 (1H (3"), m), 1.75 (3H (19), dd, J=2.9, 1.3 Hz), 1.94 (1H (11), dd, J=10.0, 6.4 Hz), 2.16 (2H (6’), s), 2.39 (1H (2"), m, J=7.2, 7.0 Hz), 3.16 (1H (8), d, J=6.8 Hz), 3.27 (1H (7), s), 3.53 (1H (4-OH), d, J=0.6 Hz), 3.77 (1H (20), dd, J=12.7, 5.7 Hz), 3.83 (1H (5-OH), d, J=3.1 Hz), 3.86 (1H (20), m, J=12.6, 7.7 Hz), 4.05 (1H (10), t, J=2.7 Hz), 4.21 (1H (5), d, J=2.9 Hz), 5.43 (1H (12), d, J=9.9 Hz), 5.51 (1H (2’), d, J=11.4 Hz), 6.06 (1H (5’), ddd, J=15.1, 7.2, 6.8 Hz), 6.55 (1H (3"). t, J=11.6 Hz).7.29 (1H (4’), ddd, J=15.1, 7.2.6.8 Hz).7.72 (1H (1), dd, J=2.3, 1.3 Hz).
[0156]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.6 (4"), 14.0 (10’), 15.1 (18), 16.2 (5"), 17.1 (16), 22.5 (9’), 23.7 (17), 26.2 (3"), 26.6 (15), 28.3 (7’), 31.4 (8’), 33.0 (6’), 36.0 (14), 36.1 (8), 41.2 (2"), 45.8 (11), 49.0 (10), 61.6 (6), 64.5 (20), 65.3 (7), 65.5 (13), 71.7 (5), 72.3 (4), 76.1 (12), 77.1 (9), 115.0 (2’), 126.9 (4’), 145.9 (3’), 146.1 (5’), 133.5 (2), 164.8 (1), 165.9 (1’), 178.9 (1"), 210.0 (3).
Jedinjenje 19: 13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on
[0157]
[0158]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.92 (3H (4’), t, J=7.6 Hz), 1.07 (3H (18), d, J=6.4 Hz), 1.16 (3H (5’), d, J=6.8 Hz), 1.20 (3H (16), s), 1.24 (1H (14), m), 1.26 (3H (17), s), 1.45 (1H (3’),ddd, J=13.8, 7.1, 7.0 Hz), 1.71 (1H (3’), dt, J=13.7, 7.3 Hz), 1.76 (1H (11), d, J=15.7 Hz), 1.77 (3H (19), dd, J=2.7, 1.2 Hz), 2.41 (1H (2’), m, J=7.0, 6.8 Hz), 3.08 (1H (8), d, J=7.3 Hz), 3.27 (1H (7), s), 3.79 (1H (10), d, J=2.9 Hz), 3.81 (2H (20), m), 3.90 (1H (12), d, J=9.8 Hz), 4.20 (1H (5), s), 7.70 (1H (1), dd, J=2.4, 1.5 Hz).
[0159]<13>C NMR (125 MHz. CDCl3) δ ppm: 9.8 (19), 11.7 (4’).16.6 (5’), 16.2 (18), 17.2 (17), 23.4 (16).26.5 (3’), 27.9 (15), 34.8 (14), 36.5 (8), 41.0 (2’), 47.3 (11), 50.7 (10), 62.4 (6), 65.0 (20), 66.0 (7), 68.4 (13), 71.5 (5), 72.1 (4), 77.6 (9), 78.3 (12), 133.9 (2), 163.8 (1), 180.1 (1’), 209.7 (3).
Jedinjenje 20: 12-[(2E)-but-2-enoil]-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on
[0160]
[0161]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.85 (3H. (18), d, J=6.4 Hz), 0.92 (3H (4"), t, J=7.5 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=7.1 Hz), 1.22 (3H (17), s), 1.24 (3H (16), s), 1.26 (1H (14), d, J=6.7 Hz), 1.45 (1H (3"), dd, J=14.5, 6.4 Hz), 1.72 (1H (3"). dd, J=14.1.6.8 Hz), 1.75 (3H (19), dd, J=2.8, 1.3 Hz), 1.87 (3H (4’), dd, J=6.9, 1.7 Hz), 1.94 (1H (11), dd, J=9.8, 6.4 Hz), 2.37 (1H (2"), dd, J=13.8, 6.8 Hz), 3.16 (1H (8), d, J=6.5 Hz), 3.27 (1H (7), s), 3.78 (1H (20), d, J=12.2 Hz), 3.87 (1H (20), m), 4.05 (1H (10), m), 4.21 (1H (5). s), 5.40 (1H (12), d. J=9.9 Hz), 5,81 (1H (2’), dddd, J=155, 1.6, 1.5, 1.2 Hz), 6.92 (1H (3’), dd, J=15,5,7.0 Hz), 7.71 (1H (1), m).
[0162]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.6 (4"), 15.1 (18), 16.2 (5"), 17.2 (17), 18.1 (4’), 23.7 (16), 26.2 (3"), 26.7 (15), 36.1 (8), 36.2 (14), 41.2 (2"), 45.9 (11), 49.0 (10), 61.6 (6), 64.5 (20), 65.3 (7), 65.5 (13), 71.7 (5), 72.3 (4), 76.7 (12), 77.1 (9), 122.6 (2’), 133.6 (2), 145.0 (3’), 164.8 (1), 166.1 (1’), 178.9 (1"), 210.2 (3).
Jedinjenje 24: 12-(2E,4E)-deka-2,4-dienoil]-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12.13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on
[0163]
[0164]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.86 (3H (18), d, J=5.6 Hz), 0.87 (3H (10’), d J=11.7 Hz), 0,93 (3H (4"), t, J=7,5 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=7.0 Hz), 1.22 (3H (16), s), 1.24 (3H (17), s), 1.26 (1H (14), m), 1.26 (2H (8’), br. s.), 1.29 (2H (9’), m), 1.45 (1H (3"), m), 1.41 (2H (7’), m), 1.73 (1H (3"), m), 1.75 (3H (19), dd, J=2.9, 1.3 Hz), 1.95 (1H (11), dd, J=9.7, 6.4 Hz), 2.15 (2H (6’), m), 2.38 (1H (2"), m), 3.17 (1H (8), d, J=6,6 Hz), 3.27 (1H (7), s), 3.55 (1H (OH), m), 3.78 (1H (20), dd, J=12.0, 4.6 Hz), 3.87 (1H (20), m), 4.05 (1H (10), m), 4.22 (1H (5), m), 5.41 (1H (12), d, J=9,9 Hz), 5.75 (1H (2’), d, J=15.4 Hz), 6.13 (1H (5’), dd, J=6.7, 6.2 Hz), 6.16 (1H (4’), s), 7.20 (1H (3’), dd, J=1-5.5, 9.9 Hz), 7.72 (1H (1), dt, J=2,5, 1.3 Hz).
[0165]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.6 (4"), 14.0 (10’), 15.1 (18), 16.2 (5"), 17.2 (17), 22.4 (9’), 23.6 (16), 26.2 (3"), 26.7 (15), 28.4 (7’), 31.3 (8’), 33.0 (6’), 36.1 (8), 36.2 (14), 41.2 (2"), 45.9 (11), 49.0 (10), 61.6 (6), 64.5 (20), 65.3 (7), 65.5 (13),71.7 (5), 72.3 (4), 76.7 (12), 77.1 (9), 118.8 (2’), 128.3 (4’), 133.5 (2), 145.3 (5’), 145.6 (3’), 164.8 (1), 166.6 {1’), 178.9 (1"), 210.0 (3).
Jedinjenje 25: 12-[(2Z,AE)-deka-2,4-dienoil]-13-(2-metilpropanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on
[0166]
[0167]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.85 (3H (18), d), 0.86 (3H (10’), t), 1.16 (3H (4"), d), 1.19 (3H (3"), d, J=7.0 Hz), 1.22 (3H (16), s), 1.22 (3H (17), s), 1.25 (2H (8’), m), 1.27 (1H (14), (d, J=3.1 Hz), 1.29 (2H (9’), m), 1.4] (2H (7’), br. s.), 1.75 (3H (19), s), 1.94 (1H (11), dd, J=10.0, 6.4 Hz), 2.16 (2H (6’), s), 2.58 (1H (2"), dt, J=1,4.0, 7.0 Hz), 3.16 (1H (8), d, J=6.7 Hz), 3.27 (1H (7), s), 3.55 (1H (OH), br. s), 3.78 (1H (20), d, J=12.5 Hz), 3.86 (1H (20), d, J=13.1 Hz), 4.05 (1H (10), d, J=5.4 Hz), 4.21 (1H (5), s), 5.41 (1H (12), d. J=9.9 Hz), 5.51 (1H (2’), d, J=11.2 Hz), 6.06 (1H (5’), dd, J=15.3, 7.0 Hz), 6.55 (1H (3’), t, J=11.4 Hz), 7.29 (1H (4’), dd, J=15.3, 7.0 Hz), 7.71 (1H (1), s),
[0168]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 14,7 (10’), 15.1 (18), 17.1 (16), 18.6 (3"), 18.6 (4"), 22.5 (9’), 23.7 (17), 26.6 (15), 28.4 (7’), 31.4 (8’), 33.0 (6’), 34.2 (2"), 36.0 (14), 36.1 (8), 45.7 (11), 49.0 (10), 61.6 (6), 64.5 (20), 65.3 (7), 65.5 (13), 71.7 (5).72.3 (4), 76.0 (12), 77.2 (9), 115.0 (2’), 126.9 (4’), 133.5 (2), 145.9 (3’), 146.2 (5’), 164.8 (1), 165.9 (1’), 179.3 (1"), 210.0 (3).
Jedinjenje 26: 12-[(2E,4E)-6,7-(anti)-epoksi-dodeka-2,4-dienoil]-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,3,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on
[0169]
[0170]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.87 (3H (18), d, J=4.4 Hz), 0.86 (3H (12’), br. s.), 0.92 (3H (4"). t, J=7.3 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=6.8 Hz).1.22 (3H (17). br. s.).
1.24 (3H (16), s).1.27 (1H (14), d, J=7.3 Hz), 1.28 (2H (11’), m), 1.29 (2H (10’), m), 1.44 (2H (9’), m), 1.57 (2H (8’), m), 1.72 (2H (3"), dd, J=13.9, 7.1 Hz), 1.75 (3H (19), d, J=1.5 Hz), 1.95 (1H (11), m), 2.37 (1H (2"), m), 2.85 (1H (7’), tt, J=5.6, 2.0 Hz), 3.15 (1H (6’), d, J=7.8 Hz), 3.17 (1H (8), s), 3.28 (1H (7), s), 3.52 (1H (OH), d, J=2.9 Hz), 3.76 (1H (OH), m), 3.79 (1H (20), d, J=2.9 Hz), 3.87 (1H (20), m), 4.05 (1H (10), d, J=2.0 Hz), 4.22 (1H (5). d).5.42 (1H (12), d, J=10.3 Hz), 5.83 (1H (5’), d, J=15.2, 7.8 Hz), 5.87 (1H (2’), d, J=15.7 Hz), 6.00 (1H (OH), m), 6.47 (1H (4’), dd, J=14.7, 11.2 Hz), 7.20 (1H (3’), dd, J=15.2, 11.2 Hz), 7.71 (1H (1), br. s.).
[0171]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.6 (4"), 14.0 (12’), 15.1 (18), 16.2 (5"), 17.2 (16), 22.5 (11’), 23.7 (17), 25.5 (9’), 26.2 (3"), 26.8 (15), 31.5 (10’). 31.9 (8’), 36.1 (8), 36.2 (14), 41.2 (2"), 45.9 (11), 49.0 (10), 57.5 (6’), 61.6 (7’), 61.7 (6), 64.5 (20), 65.2 (7), 65.4 (13), 71.7 (5), 72.3 (4), 77.1 (9), 77.1 (12), 121,6
130.9 (4’), 133.5 (2), 139.7 (5’), 143.3 (3’), 164.7 (1), 166.2 (1’), 179.0 (1"), 210.1 (3).
Jedinjenje 29: 12-tigloil-13-(2-metilbutanoil)-5,6-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on
[0172]
[0173]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.83 (3H (18), d, J=6.8 Hz), 0.92 (3H (4"), t, J=7.6 Hz), 1.13 (3H (5"), d, J=6.8 Hz).1.20 (1H (14), d, J=5.9 Hz), 1.22 (3H (17), s), 1.23 (3H (16), s), 1.45 (1H (3"), tt, J=14.2, 7.3 Hz), 1.72 (1H (3"),dd), 1.77 (3H (5’), dd, J=7.1, 1.2 Hz), 1.80 (3H (4’), d, J=1.5 Hz), 1.81 (3H (19), dd, J=2.9, 1.5 Hz), 2.11 (1H (11), dq), 2.29 (1H (8), d, J=5.4 Hz), 2.38 (1H (2"), m, J=7.0, 6.8 Hz), 2.47 (1H (20-OH), t, J=6.8 Hz), 2.98 (1H (4-OH), s), 3.53 (1H (10), m), 3.73 (1H (5), d, J=1.0 Hz), 3.81 (1H (20), dd, J=12.7, 6.8 Hz), 3.92 (1H (2.0), m, J=12.7, 6.8 Hz), 4.46 (1H (7), d, J=5.4 Hz), 5.10 (1H (7-OH), d, J=5.4 Hz), 5.39 (1H (12), d, J=10,3 Hz), 6.55 (1H (9-OH), m), 6.80 (1H (3’), m, J=7.1, 6.8, 1.5 Hz), 7.58 (1H (1), s),
[0174]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 10.3 (19).11.6 (4"), 12.2 14.0 (18), 14.4 (5’), 16.2 (5"), 17.0 (17), 23.5 (16), 26.2 (15), 26.2 (3"), 34.7 (14), 35.2 (8), 41.3 (2"), 43.7 (11).57.3 (10), 62.6 (5), 64.2 (20), 67.0 (6), 67.0 (13), 71.3 (4), 75.8 (12), 77.3 (7), 79.1 (9), 128.3 (2’), 134.7 (2), 137.8 (3’), 159.7 (1), 167.4 (1’), 179.7 (1"), 205.7 (3).
Jedinjenje 30: 13-(2-metilbutanoil)-5,6-epoksi-4,7,9,12,13.20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on
[0175]
[0176]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.91 (3H (4’), t, J=7.6 Hz), 1.02 (3H (18), d, J=6.4 Hz), 1.15 (1H (14), d, J=5.9 Hz), 1.15 (3H(5’), d, J=7,3 Hz), 1.19 (3H (16), s), 1.22 (3H (17), s), 1.46 (1H (3’), ddd, J=14.1, 7.0, 6.8 Hz), 1.70 (1H (3’), dt, J=13.7, 7.3 Hz), 1.81 (3H (19), dd, J=2.9, 1.5 Hz), 1.93 (1H (11), dq, J=9.8, 6.6, 6.5 Hz), 2.24 (1H (8), d, J=5.9 Hz), 2.40 (1H (2’), m, J=7.0, 6.8 Hz), 2.84 (1H (20-OH), br. s.), 3.44 (1H (4-OH), s), 3.50 (1H (10), t, J=2.4 Hz), 3.76 (1H (5), s), 3.84 (1H (20), dd, J=12.2, 3.9 Hz), 3.88 (1H (12), dd, J=10.0, 3.7 Hz), 3.92 (1H (20), d, J=12.2, 5.9 Hz), 4.46 (1H (7), d, J=4.4 Hz), 4.57 (1H (OH), m), 5.20 (1H (OH), m), 7.60 (1H (1), s).
[0177]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 10.3 (19), 11.7 (4’), 14.6 (18), 16.5 (5’), 16.7 (16), 23.6 (17), 26.4 (15), 26.5 (3’), 33.8 (14), 35.5 (8), 41.1 (2’), 45.5 (11), 57.8 (10), 62.6 (5), 64.1 (20), 66.9 (6), 68.0 (13), 71.3 (4), 76.8 (12), 77.3 (7), 78.8 (9), 134.4 (2), 160.2 (1), 180.0 (1’), 206.2 (3).
Jedinjenje 31: 12-acetil-13-(2-metilbutanoil)-5,6-epoksi-4,7,9,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on
[0179]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.84 (3H (18), d, J=6.6 Hz), 0.92 (3H (4"), t, J=7.5 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=7.0 Hz), 1.17 (3H (16), s), 1.18 (1H (14), s), 1.22 (3H (1.7), s), 1.44 (1H (3"), m, J=14.1, 7.3, 7.1 Hz), 1.81 (3H (19), dd, J=2.8, 1.2 Hz), 2.04 (3H (2’), s).2.09 (1H (11), dq, J=10.2, 6.5 Hz), 2.31 (1H (8), d, J=5.6 Hz), 2.37 (1H (2"), sxt, J=7.0 Hz), 2.88 (1H (20-OH), m), 3.52 (1H (10), d, J=2.6 Hz), 3.59 (1H (4-OH). s), 3.81 (1H (5), d, J=0.9 Hz), 3.83 (1H (20), d, J=12.4 Hz), 3.96 (1H (20), d), 4.39 (1H (7), d, J=5.1 Hz), 5.04 (1H (7-OH), d, J=5.5 Hz), 5.3 (1H (12), d, J=10.1 Hz), 6.48 (1H (9-OH), br. s.), 7.58 (1H (1), s).
[0180]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 10.3 (19), 11.6 (4").14.0 (18), 16,2 (5"), 16.7 (16), 20.9 (2’), 23.3 (17), 26.1 (3"), 26.2 (15), 34.6 (14), 35.1 (8), 41.3 (2"), 43.4 (11), 57.3 (10), 62.4 (5), 63.7 (20), 65.6 (13% 67.3 (6), 71.3 (4), 76.1 (12), 77.2 (7), 79.0 (9), 134.6 (2), 159.8 (1), 170.6 (1’), 179.7 (1"), 206.1 (3).
Jedinjenje 32: 12.13-di-(2-metilbutanoil)-5,6-epoksi-4,7,9,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on
[0181]
[0182]<1>H NMR (500 MHz. CDCl3) δ ppm: 0.84 (3H (18), d, J=6.6 Hz), 0.89 (3H (4’), m, J=7.6 Hz), 0.91 (3H (4"), d, J=7.5 Hz), 1.11 (3H (5"), d, J=7.0 Hz), 1.12 (3H (5’), d, J=7.0 Hz), 1.17 (3H (16), s), 1.18 (1H (14), d, J=5.7 Hz), 1.19 (3H (17), s), 1.42 (1H (3’), m), 1.46 (1H (3"), dt, J=6.8, 3.3 Hz), 1.62 (1H (3’), dt, J=8.2, 6.9 Hz), 1.68 (1H (3"), d, J=7.1 Hz), 1.80 (3H (19), dd, J=2.8, 1.3 Hz), 2.10 (1H (11), dd, J=10.2, 6. Hz). 2,33 (1H (8), d, J=5.4 Hz), 2.35 (1H (2’), m), 2.38 (1H (2"), d, J=4.3 Hz), 3.14 (1H (20-OH), br. s.), 3.54 (1H (10), dd, J=2.4, 2.2 Hz), 3.83 (1H (20), d, J=13.0 Hz), 3.85 (1H (5), d, J=1.0 Hz), 3.96 (1H (4-OH), s), 3.98 (1H (20), m, J=12.8 Hz), 4.37 (1H (7), d, J=5.3 Hz), 5.03 (1H (7- OH), d, J=5.5 Hz), 5.36 (1H (12), d, J=10.3 Hz), 6.46 (1H (9-OH), s), 7.59 (1H (1) s).
[0183]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 10.3 (19), 11.6 (4"), 11.6 13.9 (18), 16.1 (5"), 16.8 (5’), 16.9 (16), 23.5 (17), 26.0 (15), 26.2 (3"), 26.7 (3’), 34.6 (14), 35.1 (8), 41.3 (2"), 41.7 43.3 (11), 57.2 (10), 62.2 (5), 63.2 (20), 65.6 (13), 67.6 (6),
71.3 (4), 75.4 (12), 77.2 (7), 79.1 (9), 134.6 (2), 160.0 (1), 175.9 179.6 (1"), 206.3 (3).
Jedinjenje 33: 12-propanoil-13-(2-metilbutanoil)-5,6-epoksi-4,7,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on
[0184]
[0185]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.83 (3H (18), d), 0.92 (3H (4"), t, J=7.5 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=7.0 Hz), 1.13 (3H (3’), t. J=7.6 Hz), 1.18 (3H (16), s), 1.19 (1H (14), s), 1.22 (3H (17), s), 1.44 (1H (3"), m, J=14.1, 7.5, 7.1 Hz), 1.71 (1H (3"), ddd, J=13.9, 7.3, 7.1 Hz), 1.81, (3H (19), dd, J=2.8, 1.3 Hz), 2.08 (1H (1), dd, J=10.2,6.5 Hz), 2.29 (1H (8), m), 2.31 (2H(2’), m), 2.37 (1H (2"), d, J=7.0 Hz), 2.72 (1H (20-OH), t, J=6.7 Hz), 3.34 (1H (4-OH), s), 3.53 (1H (10), d, J=2.4 Hz), 3.78 (1H (5), d), 3.82 (1H (20), dd, J=12.7, 5.9 Hz), 3.94 (1H (20), dd, J=12.7, 5.9 Hz), 4.42 (1H (7), d, J=5.6 Hz), 5.06 (1H (7-OH), d, J=5.6 Hz), 5.32 (1H (12), d, J=10.3 Hz), 6.49 (1H (9-OH), s), 7.58 (1H (1), d, J=1,3 Hz).
[0186]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.3 (3’), 10.3 (19), 11.6 (4").14.0(18), 16.2 (5"), 16.8 (16), 23.5 (17), 26.1 (3"), 26.2 (15), 27.8 (2’), 34.6 (14), 35.1 (8), 41.3 (2"), 43.4 (11), 57.3 (10), 62,5 (5), 63.8 (20), 65.6 (13), 67.2 (6), 71.3 (4), 75.9 (12), 77.3 (7), 79.1 (9), 134.6 (2), 159.8 (1), 173.9 (1’), 179.7 (1"), 206.0(3).
Jedinjenje 34: 12-heksanoil-13-(2-metilbutanoil)-5,6-epoksi-4,7,9,12.13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on
[0187]
[0188]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.83 (3H (18), d), 0.88 (3H (6’), t. J=6.9 Hz), 0.92 (3H (4"), t, J=7.5 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=7.1 Hz), 1.18 (3H (16), s), 1.19 (1H (14), s).1.21 (3H (17), s), 1.29 (2H (4’), m), 1.30 (2H (5’), m, J=7.6, 7.3, 3.6 Hz), 1.44 (1H, (3"), dt, J=14.1, 7.0 Hz), 1.61 (2H (3’), m), 1.70 (1H (3"), m, J=14.1, 7.3, 7.1 Hz), 1.81 (3H (19), dd, J=2.8, 1.3 Hz), 2.08 (1H (11), dq, J=10.3, 6.5 Hz), 2.3 (1H (8), d, J=3.8 Hz), 2.28 (2H (2’), m), 2.37 (1H (2"), q, J=7.0 Hz), 2.73 (1H (20-OH), m), 3.35 (1H (4-OH), br. s.), 3.53 (1H (10), t, J=2.5 Hz), 3.78 (1H (5), d, J=1.1 Hz), 3.82 (1H (20), d, J=12.6 Hz), 3.94 (1H (20), d, J=12.5 Hz), 4.42 (1H (7), d, J=3.9 Hz), 5.06 (1H (7-OH), d, J=5.4 Hz), 5.34 (1H (12), d, J=10.3 Hz), 6.48 (1H (9-OH), s), 7.58 (1H (1), d, J=1.5 Hz).
[0189]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 10.3 (19), 11.6 (4"), 13.9 (18), 13.9 (6’), 16.1 (5"), 16.8 (16), 22.3 (5’), 23.5 (17), 24.9 (3’), 26.1 (15), 26.2 (3"), 31.1 (4’), 34.5 (2’), 34.6 (14), 35.2 (8), 41.3 (2"), 43.3 (11), 57.3 (10), 62.5 (5), 64.0 (20), 65.6 (13), 67.1 (6), 71.3 (4), 75.6 (12), 77.2 (7), 79.1 (9), 134.6 (2), 159.8 (1), 173.3 (1’), 179.6 (1"), 206.0 (3).
Jedinjenje 35: 12-tigloil-13-(2-metilpropanoil)-5,6-epoksi-4,7,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on
[0190]
[0191]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.84 (3H (18), d), 1.15 (3H (3"), d, J=7.0 Hz), 1.17 (3H (4"), d, J=7.0 Hz), 1.21 (1H (14), m), 1.21 (3H (16), s), 1.21 (3H (17), s), 1.77 (3H (4’), dd, J=7.1, 1.1 Hz), 1.80 (3H (5’), d, J=1.3 Hz), 1.81 (3H (19), dd, J=2.9, 1.4 Hz), 2.13 (1H (11), dd. J=9.6, 6.3 Hz), 2.32 (1H (8), d,J=6.1 Hz), 2.58 (1H (2"), spt, J=7.0 Hz), 3.46 (1H (4-OH), s), 3.54 (1H (10), d, J=2.5 Hz).3.81 (1H (5), d, J=1.2 Hz).3.82 (1H (20), m), 3.96 (1H (20), d, J=13.0 Hz), 4.42 (1H (7), d, J=4.9 Hz), 5.07 (1H (7-OH), d, J=5.5 Hz), 5.37 (1H (12), d, J=10.2 Hz), 6.52 (1H (9-OH), s), 6.80 (1H (3’), dq, J=7.0, 1.4 Hz), 7.58 (1H (1), dd, J=2.0, 1.4 Hz).
[0192]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 10.3 (19), 12.2 (5’), 14.0 (18), 14.4 (4’), 16.9 (16), 18.5 (3"), 18.6 (4"), 23.5 (17), 26.0 (15), 34.2 (2"), 34.6 (14), 35.2 (8), 43.6 (11), 57.3 (10), 62.4 (5), 63.7 (20), 65.7 (13), 67.3 (6), 71.3 (4), 75.7 (12), 77.2 (7), 79.1 (9), 128.3 (2’), 134.6 (2), 137.8 (3’), 159.9 (1), 167.5 (1’), 180.1 (1"), 206.0 (3).
Jedinjenje 36: 12-[(2E)-3-metiltioprop-2-enoil]-13-(2-metilbutanoil)-5,6-epoksi-4,7,9,12,13,20-heksahidroksi-1- tigliaen-3-on
[0193]
[0194]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.92 (3H (4"), t, J=7.0 Hz), 0.84 (3H (18), d, J=6.5 Hz), 1.13 (3H (5") d, J=7.0 Hz), 1.18 (1H (14), s), 1.20 (3H (16), s), 1.22 (3H (17), s), 1.44 (1H (3"), dt, J=13.9, 7.0 Hz), 1.72 (1H (3"), d, J=13.8 Hz), 1.81 (3H (19), dd, J=2.7, 1.2 Hz), 2.12 (1H (11), dd, J=9.4, 5.6 Hz), 2.31 (1H (8), d, J=6.0 Hz), 2.32 (3H (5’), s), 2.38 (1H (2"), q, J=7.0 Hz), 3.36 (1H (4-OH), s), 3.53 (1H (10), d, J=2.3 Hz), 3.78 (1H (5), d, J=0.9 Hz), 3.82 (1H (20), d, J=12.6 Hz), 3.94 (1H (20), d), 4.43 (1H (7). d, J=4.6 Hz), 5.08 (1H (7-OH), d), 5.37 (1H (12), d. J=10.2 Hz), 5.61 (1H (2’), d, J=14.9 Hz), 6.53 (1H (9-OH), s), 7.58 (1H (1), d, J=1.9 Hz), 7.68 (1H (3’), d, J=14.9 Hz).
[0195]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 10.3 (19), 11.6 (4"), 14.0 (18), 14.3 (5’), 16.2 (5"), 16.9 (16), 23.5 (17), 26.2 (15), 26.2 (3"), 34.7 (14), 35.2 (8), 41.3 (2"), 43.6 (11), 57.3 (10), 62.5 (5), 64.0 (20), 65.6 (13), 67.1 (6), 71.3 (4), 75.8 (12), 77.3 (7), 79.1 (9), 112.7 (2’), 134.6 (2), 147.7 (3’), 159.8 (1), 164.5 (1’), 179.8 (1"), 206.0(3).
Jedinjenje 37: 12-tigloil-13-(2-metilbutanoil)-5,6-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on
[0196]
[0197]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.84 (2H (18), d, J=6.6 Hz), 0.92 (3H (4"), t, J=7.5 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=6,9 Hz), 1.19 (1H (14), s), 1.20 (1H (16), s), 1.21 (1H (17), s), 1.44 (1H (3"), dt, J=14.1, 7.0 Hz), 1.72 (1H (3"), dq), 1.77 (3H (4’), dd, J=7.1, 1.1 Hz), 1.8 (3H (5’), t, J=1.3 Hz), 1.81 (3H (19), dd, J=2.9, 1.5 Hz), 2.13 (1H (11), q, J=2.9 Hz), 2.33 (1H (8), d, J=5.7 Hz), 2.38 (1H (2"), q, J=7.0 Hz), 2.99 (1H (20-OH), br. s.), 3.55 (1H (10), t, J=2.6 Hz), 3.70 (1H (4-OH), br. s.), 3.83 (1H (20), dd, J=12.8, 4.9 Hz), 3.84 (1H (5),d, J=1.1 Hz), 3.98 (1H (20), dd, J=12.8, 7.3 Hz), 4.39 (1H (7), d, J=5.5 Hz), 5.06 (1H (7-OH), d, J=5.5 Hz), 5.39 (1H (12), d, J=10.2 Hz), 6.53 (1H (9-OH), br. s.), 6.8 (1H (3’), dd, J=7.1, 1.5 Hz), 7.59 (1H (1). dd, J=2.0, 1.5 Hz).
[0198]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 10.3 (19), 11.6 (4"), 12.2 (5’), 14.0 (1.8), 14.4 (4’), 16.2 (5"), 17.0 (16), 23.5 (17), 26.1 (15), 26.1 (3"), 34.7 (14), 35.2 (8), 41.2 (2"), 43.7 (11), 57.2 (10), 62.3 (5), 63.5 (20), 65.7 (13).67.5 (6), 71.3 (4), 75.9 (12), 77.2 (7), 79.1 (9), 128.3 (2’), 134.6 (2).137.7 (3’), 159.9 (1), 167.4 (1’), 179.7 (1"), 206.1 (3).
Jedinjenje 38: 12,13-di-(2-metilbutanoil)-5,6-epoksi-4,7,9.13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on
[0199]
[0200]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.84 (3H (18), d, J=6.6 Hz), 0.89 (3H (4’), t, J=7.4 Hz), 0.92 (3H (4"), t, J=7.5 Hz), 1.12 (3H (5’), d, J=7.0 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=7.0 Hz), 1.19 (1H (14), d, J=1.5 Hz), 1.20 (3H (16) s), 1.21 (3H (17), s), 1.45 (1H (3’), dd, J=14.1, 6.8 Hz), 1.45 (1H (3"), dd, J=14.1, 6.8 Hz), 1.62 (1H (3’), dd, J=8.3, 7.5 Hz), 1.68 (1H (3"), dd, J=14.1, 6.9 Hz), 1.81 (3H (19), dd, J=2.8, 1.3 Hz), 2.08 (1H (11), dd, J=10.3, 6.5 Hz), 2.30 (1H (8), d, J=5.5 Hz), 2.36 (1H (2’), m), 2.36 (1H (2"), m), 2.62 (1H (10-OH), t, J=6.8 Hz), 3.22 (1H (4-OH), s), 3.53 (1H (10), br. s.), 3.76 (1H (5), d, J=1.1 Hz), 3.82 (1H (20), dd, J=12.5, 6.3 Hz), 3.93 (1H (20), dd, J=12.6, 7.0 Hz), 4.44 (1H (7), d, J=5.5 Hz), 5.06 (1H (7-OH), d, J=5.6 Hz), 5.36 (1H (12), d, J=10.3 Hz).6.48 (1H (9-OH), s), 7.58 (1H (1), d, J=2.0 Hz).
[0201]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 10.3 (19), 11.6 11.6 (4"), 13.9 (18), 16.1 (5"), 16.9 (5’), 17.0 (16), 23.5 (17), 26.0 (15), 26.2 (3"), 26.7 (3’), 34.6 (14), 35.2 (8).41.3 (2’), 41.8 (2"), 43.3 (11), 57.3 (10), 62.5 (5), 63.9 (20), 65.6 (13), 67.2 (6), 71.3 (4), 75.4 (12), 77.3 (7), 79.1 (9), 134.7 (2), 159.8 (1), 175.9 179.6 (1"), 205.9 (3).
Jedinjenje 39: 12-{[2-(metilsulfanil)karbonil]-acetoil)-13-(2-metilbutanoil)-5,6-epoksi-4,7,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on
[0202]
[0203]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.87 (3H (18), d, J=6.6 Hz, 0.92 (3H (4"), t, J=7.5 Hz), 1.13 (3H (5"), d, J=7.0 Hz), 1.16 (3H (16), s), 1.20 (1H (14), d, J=5.9 Hz), 1.23 (17). br. s.), 1.45 (1H (3"), td, J=14.1, 7.2 Hz), 1.70 (1H (3"), td, J=14.0, 7.2 Hz), 1.82 (3H (19), dd, J=2.8, 1.3 Hz), 2.05 (1H (OH), d, J=3.40 Hz), 2.09 (1H (11), dd. J=10.3, 6.5 Hz), 2.27 (1H (8), d, J=5.9 Hz), 2.34 (3H (4’), s), 2.38 (1H (2"), t, J=7.0 Hz), 2.85 (1H (4-OH), s), 3.52 (1H (10), dd, J=2.6, 2.3 Hz), 3.57 (2H (2’), d, J=4.5 Hz), 3.70 (1H (5), d, J=1.1 Hz), 3.81 (1H (20), dd, J=12.2, 6.2 Hz), 3.89 (1H (20), m), 4.46 (1H (7), d, J=5.7 Hz), 5.02 (1H (7-OH), d, J=5.9 Hz), 5.35 (1H (12), d, J=10.3 Hz), 6.47 (1H (9-OH), m), 7.56 (1H (1), dd, J=2.0, 1.3 Hz).
[0204]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 10.3 (19), 11.6 (4"), 12.1 14.0 (18), 16.2 (5"), 16.6 (16), 23.5 (17), 26.2 (3"), 26.5 (15), 34.8 (14), 35.2 (8), 41.3 (2"), 43.3 (11), 49.5 57.4 (10), 62.7 (5), 64.4 (20), 65.3 (13), 66.8 (6), 71.3 (4), 77.2 (7),
77.9 (12).79.1 (9), 134.7 (2), 159.5 (1), 165.7 (1’), 179.8 (1"), 190.9 (3’), 205.6 (3).
Jedinjenje 40: 12-[(2-metoksikarbonil)-acetoil]-13-(2-metilbutanoil)-5,6-epoksi-4,7,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on
[0205]
[0206]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.88 (3H (18), d), 0.92 (3H (4"), t, J=7.6 Hz). 1.13 (3H (5"), d, J=6.8 Hz), 1.17 (3H (16), s), 1.21 (1H (14), d, J=5.9 Hz), 1.23 (3H (17), s), 1.45 (1H (3"), dt, J=14.2, 6.8 Hz), 1.70 (1H (3"), dd, J=14.2, 6.8 Hz), 1.82 (3H (19), dd, J=2.7, 1.2 Hz), 2.09 (1H (11), dd, J=10.3, 6.4 Hz), 2.27 (1H (8), d, J=4.9 Hz), 2.38 (1H (2"), m, J=14.1, 7.0, 6.8 Hz), 2.72 (1H (4-OH), s), 3.37 (2H (2’), s), 3.53 (1H (10), d, J=2.4 Hz), 3.70 (1H (5), d. J=1.0 Hz), 3.72 (3H (4’), s), 3.80 (1H (20), m), 3.90 (1H (20), m), 4.46 (1H (7), d, J=2.4 Hz), 5.02 (1H (7-OH), d, J=5.9 Hz), 6.49 (1H (9-OH), s), 7.56 (1H (1), d, J=2.0 Hz).
[0207]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 10.3 (19), 11.6 (4"), 13.9 (18), 16.2 (5"), 16.7 (16), 23.5 (17), 26.2 (3"), 26.5 (15), 34.8 (14), 35.2 (8), 41.3 (2"), 41.4 (2’), 43.3 (11), 52.5 57.4 (10), 62.7 (5), 64.7 (20), 65.3 (13), 66.6 (6), 71.3 (4), 77.2 (7),
77.7 (12), 79.1 (9), 134.8 (2), 159.4 (1).166.1 (1’), 166.1 (3’), 179.8 (1"), 205.5 (3).
Primer 3: Dobijanje tiglianskih derivata
[0208] Više jedinjenja je dobijeno polu-sintetički hidrolizom C-12 i C-13 estara smeše 5,20-acetonida tiglianskih jedinjenja, kao što su Jedinjenje 1 i srodna jedinjenja, za čime je sledila ponovna esterifikacija na C-12 i C-13 sa standardnim reagensima primenom sledećih metoda.
[0209] Sirova smeša estara tigliana za sintezu tiglianskih analoga je dobijena grubim mlevenjem u prah 150 g semena Fontainea picrosperma koji je zatim ekstrahovan mešanjem sa acetonom u balonu od 1L. Posle 4 h, ova suspenzija je vakuumski isfiltrirana, i filtracioni kolač je ispiran acetonom sve dok TLC (PE:EtOAc : 4:6) nije pokazala odsustvo estara tigliana. Prikupljeni filtrati su upareni, da bi se dobila sirova smeša estara. Masti su zatim odstranjene kratkom gravitacionom kolonskom hromatorgrafijom na silika gelu (petroleum etar/etil acetat; PE/EtOAc 8:2→4:6 kao eluent) da bi se dobio prinos od 8.2 g (5.5%) sirove smeše estara.
[0210] Smeša estara je zatim zaštićena, de-esterifikovana i ponovo-esterifikovana na C-12 i C-13 pozicijama kao što je ilustrovano u sledećim reakcijama korišćenjem različitih acil grupa da bi se dobila Jedinjenja 21, 22, 23, 27, 28, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 i 60.
[0211] 10 mL rastvora estara smeše A u dimetilformamidu (DMF) je dodato u 50 mL rastvora piridinijum-p-toluensulfonata (PPTS, 4.1 g, u višku) u DMF (10 mL) i on je mešan na sobnoj temperaturi tokom 2 minuta. Zatim mu je dodato 120 mL 2,2-dimetoksipropana (DMP) i rastvor je mešan tokom 24 h. Reakcija je razblažena sa rastvorom NaCl (150 mL) i isprana je etil acetatom (EtOAc, 50 mL). Organska faza je isprana rastvorom NaCl, pa je osušena (Na2SO4), isfiltrirana i uparena. Ostatak je prečišćen gravitacionom kolonskom hromatografijom na silika gelu (PE/EtOAc 8:2→6:4 kao eluent) da bi se dobilo 5.2 g (3.5%) estara 5.20-acetonida smeše B. Neizreagovani početni materijal je ponovo reagovao pod istim uslovima da bi se dobila estarska smeša B.
[0212] 0.21N NaOMe rastvora je sveže pripremljeno laganim dodavanjem malih komadića natrijuma (9.7 g) u mešani etanol (HPLC kvaliteta, 2 L). Uz energično mešanje, 128 mL ovog rastvora je brzo dodato u 6.4 g estara 5,20- acetonidne smeše B. pH dobijenog rastvora mora da se održava u opsegu od 11.5-12,0 diskretnim dodavanjem 0.21 M NaOMe, uz vođenje računa da se ne pređe pH 12.5. Posle mešanja na sobnoj temperaturi tokom 24 sata, reakcija je neutralisana sirćetnom kiselinom, pa je isfiltrirana i uparena do prib.1/20 originalne zapremine. Dodat je EtOAc (20 mL) i rastvor je ispran sa 2N H2SO4 (100 mL). Kiselo ispiranje je kontra-ekstrahovano sa EtOAc, a prikupljeni EtOAc rastvori su isprani rastvorom NaCl (2 x 300 mL). Posle sušenja (Na2SO4), filtriranja i uparavanja, ostatak je prečišćen gravitacionom kolonskom hromatografijom na silika gelu (PE/EtOAc 6:4→4:6 kao eluenti) da bi se dobilo 1.4 g belog praška.
Sinteza tiglianskih analoga sa simetričnim obrascem esterifikacije; Primer metoda modifikovane Šteglihove esterifikacije
[0213]
1.
[0214] U rastvor deacil-tiglian acetonida (100 mg; 0,23 mMol) u THF (5 mL), dodat je 4-dimetilaminopiridin (DMAP) (15 mg; 0,12 mMol) i rastvor je zagrevan na 60°C (temperatura uljnog kupatila). Odvojeno je u rastvor esterifikujuće karboksilne kiseline (10 ekv.) u THF (10 mL/g) dodat N,N’-dicikloheksilkarbodiimid (DCC, 10 ekv.); posle mešanja tokom oko 15 minuta, suspenzija je isfiltrirana kroz jastuče od pamuka, i ukapavanjem dodata u THF rastvor deacil-tiglian acetonida. Posle mešanja tokom 24 sata na 60°C, reakcija je prerađena razblaživanjem pomoću EtOAc (≈200 mL) i isprana sa 2N H2SO4 (≈50 mL), slanim rastvorom (2 x ≈50 mL), i zatim sa zas. NaHCO3 (≈50 mL) i slanim rastvorom (2 x≈50 mL). Posle sušenja (Na2SO4), filtriranja i uparavanja, ostatak je prečišćen gravitacionom kolonskom hromatografijom na silika gelu (PE/EtOAc 9:1→6:4 kao eluent) da bi se dobilo 111 mg (80%) belog praha.
3.2 Deprotekcija
[0215]
METOD A (TFA u CH2Cl2)
[0216] Acetonid diestar (100 mg) je dodat u sveže pripremljen rastvor triflorosirćetne kiseline (TFA) u CH2Cl2 (2% V/V; 200 µL, 2 µL/mg. Posle mešanja tokom 6-12 h na sobnoj temp. reakcija je prerađena ispiranjem pomoću smeše zas. NaHCO3 (≈10 mL) i slanog rastvora (≈40 mL), i zatim samo pomoću slanog rastvora (2x ≈40 mL). Posle sušenja (Na2SO4), filtriranja i uparavanja, ostatak je prečišćen gravitacionom kolonskom hromatografijom na silika gelu (PE/EtOAc 8:2→2:8 kao eluent) da bi se dobili tiglianski analozi (prinos prib.: 60-70%),
METOD B (HClO4 u MeOH)
[0217] Acetonid diestar (100 mg) je dodat u sveže pripremljen rastvor HClO4 u MeOH [pH opseg: 1.5-2.0]. Posle mešanja na sobnoj temp. tokom 6-24 sata, reakcija je prerađena neutralizovanjem pomoću natrijum acetata, isfiltrirana i uparena do pribl.1/20 originalne zapremine, kao sledeći je dodat EtOAc (10 mL), i rastvor je ispran pomoću 2N H2SO4 (30 mL) i zatim slanim rastvorom (30 mL). Posle sušenja (Na2SO4), filtriranja i uparavanja, ostatak je prečišćen gravitacionom kolonskom hromatografijom na silika gelu (PE/EtOAc - →4;6 kao eluent) da bi se dobio diester uz prinos od pribl.60-70%.
[0218] Ovaj metod je korišćen za dobijanje Jedinjenja 27, 41, 42, 43, 44, 46, 49 i 60.
Sinteza nesimetričnih diestara, Primeri metoda:
[0219]
1.
U rastvor 12,13-deacil-5,20-acetonida (C) (1.4 g; 3,4 mMol) u 10 mL tetrahidrofurana (THF) je dodato 740 mL 34 mMol metilamina (TEA) i rastvor je zagrevan do 60°C, Odvojeno, u rastvor (S)-(+)-2-metilbuterne kiseline (3,702 mL; 34 mMol) u THF (20 mL), je dodat N,N’-dicikloheksilkarbodiimid (DCC, 7,015 g; 34 mMol). Posle mešanja tokom oko 15 minuta, suspenzija je isfiltrirana i dodata je u zagrejani rastvor početnog diola (C). Posle mešanja tokom 24 sata na 60°C, reakcija je razblažena sa EtOAc (≈200 mL) i onda je isprana sa 2N H2SO4 (≈50 mL), NaCl rastvorom (2 x ≈50 mL), i zatim NaHCO3 rastvorom (≈50 mL) i NaCl rastvorom (2 x≈50 mL). Posle sušenja (Na2SO4), filtriranja i uparavanja, ostatak je prečišćen gravitacionom kolonskom hromatografijom na silika gelu (PE/EtOAc 9:1→6:4 kao eluent) da bi se dobio 12-deacil-5,20-acetonid-13-[(S)-(+)-2-metilbutirat (D) u obliku belog praha. 2.
U rastvor 12,13-deacil-5,20-acetonida C (100 mg; 0,25 mMol) u THF (5 mL), dodati su (S)-(+)-2-metilbuterna kiselina (109 mL; 1,00 mMol) i N,N’-dicikloheksilkarbodiimid (DCC, 206,33 mg; 1,00 mMol). Rastvor je mešan na 60°C (temperatura uljnog kupatila) tokom 24 h, i zatim je prerađen razređivanjem pomoću EtOAc (≈20 mL) i ispiranjem sa 2N H2SO4 (≈50 mL), slanim rastvorom (2 x ≈50 mL), zas. NaHCO3 (≈50 mL), i slanim rastvorom (2 x≈50 mL). Posle sušenja (Na2SO4), filtriranja i uparavanja, ostatak je prečišćen gravitacionom kolonskom hromatografijom na silika gelu (PE/EtOAc 9.1→6:4 kao eluent) da bi se dobilo 106.2 mg (60%.) 12-deacil-5,20-acetonid-13-((S)-2-metilbutirata) D u obliku belog praška.
3.
U rastvor 12,13-deacil-5,20-acetonida C (100 mg; 0,25 mMol) u THF (5 mL) dodati su diispropiletilamin (DIPEA) (131 mL; 0,75 mMol) i anhidrid sirćetne kiseline (94 mL; 0,75 mMol). Posle mešanja tokom 72h na sobnoj temp. dodat je EtOAc (10 mL), i rastvor je ispran sa 2N H2SO4 (2 x 20 mL) i slanim rastvorom (20 mL). Posle sušenja (Na2SO4), filtriranja i uparavanja, ostatak je prečišćen gravitacionom kolonskom hromatografijom na silika gelu (PE/EtOAc - →4:6 kao eluent) da bi se dobio 12-deacil-13-acetil-5,20-acetonid 104 mg (87%) u obliku belog praha.
4.
[0220] U rastvor deacil-5,20-acetonida (100 mg; 0,25 mMol) u toluenu (5 mL) / dimetilformamidu (2 mL), dodati su anhidrid N-metilizatoinske kiseline (266 mg; 1,50 mMol) i dimetilaminopiridin (DMAP) (31 mg; 0.25 mMol). Posle mešanja tokom 24 h na 80°C, reakcija je prerađena razblaživanjem sa EtOAc (≈10 mL) i ispiranjem redom sa [2N H2SO4 (≈20 mL) slanim rastvorom (≈60 mL)] (x2), i [zas. NaHCO3 (≈20 mL) slanim rastvorom (≈60 mL)] (x2). Posle sušenja (Na2SO4), filtriranja i uparavanja, ostatak je prečišćen gravitacionom kolonskom hromatografijom na silika gelu (PE/EtOAc 9:1→7:3 kao eluent) da bi se dobio 12-deacil-13-[(N-metil)-antranilat-5,20-acetonid, 114 mg (80%) u obliku belog praha.
Acilacija 13-monoestara: Primeri metoda
[0221]
1.
U rastvor 12-deacil-5,20-acetonid-13-[(S)-(+)-2-metilbutirata (D) (1062 mg; 2,04 mMol) u toluenu (10 mL), je dodat dimetilaminopiridin (DMAP) (249 mg; 2.04 mMol). Odvojeno, u rastvor benzojeve kiseline 1224 mg; 10.02 mMol) u toluenu (20 mL), je dodat trietilamin (1.397 mL; 10.02 mMol) i rastvor je mešan tokom oko 2 minuta da bi došlo do potpunog rastvaranja; zatim je dodat 2,4,6-trihlorobenzoil hlorid (1.566 mL; 10.02 mMol) (Rastvor 1). Posle mešanja kompozicije koja je sadržala jedinjenje D tokom 6 sati, suspenzija je isfiltrirana i sipana je u Rastvor 1. Posle mešanja tokom 24 do 48 sati na 60°C, reakcija je razblažena sa EtOAc (≈10 mL) i isprana je sa MH2SO4 rastvorom (≈40 mL), NaCl rastvorom (2 x ≈40 mL), i zatim sa NaHCO3 rastvorom (≈40 mL) i NaCl rastvorom (2 x≈40 mL). Posle sušenja (Na2SO4), filtriranja i uparavanja, ostatak je prečišćen gravitacionom kolonskom hromatografijom na silika gelu (PE/EtOAc 9:1→7:3 kao eluent) da bi se dobio 5,20-acetonid-12-benzoat-13-[(S)-(+)-2-metilbutirat E u obliku belog praha,
2.
U rastvor deacil-13-(N-metilantranoil)-5,20-acetonida (100 mg; 0,18 mMol) u tetrahidrofuranu (THF, 5 mL), redom su dodavani anhidrid sirćetne kiseline (51 mg; 0,54 mMol) i dimetilaminopiridin (DMAP) (2,2 mg; 0,018 mMol). Posle 6 h mešanja na 50°C, reakcija je prerađena razblaživanjem sa EtOAc (prib.10 mL) i ispiranjem redom sa 2N H3SO4 (2x prib.40 mL), zas. NaHCO3 (2x prib.40 mL), i slanim rastvorom (2x prib.40 mL). Posle sušenja (Na2SO4), filtriranja i uparavanja, ostatak je prečišćen gravitacionom kolonskom hromatografijom na silika gelu (PE/EtOAc 95:05→7:3 kao eluent) da bi se dobio 12-acetil-13-(N-metil)antranilat-5,20-acetonid, 105 mg (95%) u obliku belog praha.
3.
U rastvor 12-deacil-5,20-acetonid-13-[(S)-2-metilbutirata] (100 mg; 0,19 mMol) u toluenu (5 mL), je dodat dimetilaminopiridin (DMAP) (23 mg; 0,19 mMol). Odvojeno, u rastvor tiglinske kiseline (95 mg; 0,95 mMol) u toluenu (5 mL), je dodat trietilamin (132 mL; 0,95 mMol), i rastvor je mešan tokom oko 2 min do potpunog rastvaranja; zatim je dodat 2,4,6-trihlorobenzoil hlorid (148 mL; 0,95 mMol), i posle mešanja tokom 6 h na sobnoj temp. suspenzija je isfiltrirana (pamučni jastučić) i ukapavanjem je dodata u rastvor diterpenoid monoestra u toluenu. Posle mešanja 24-48 h na 60°C, reakcija je prerađena razblaživanjem sa EtOAc (prib.10 mL) i isprana sa 2N H2SO4 (prib.40 mL), slanim rastvorom (2 x ≈40 mL), i zatim sa NaHCO3 (prib.40 mL) i slanim rastvorom (2 x≈40 mL). Posle sušenja (Na2SO4), filtriranja i uparavanja, ostatak je prečišćen gravitacionom kolonskom hromatografijom na silika gelu (PE/EtOAc 9:1→7:3 kao eluent) da bi se dobio 12-tigloil-13-metilbutiril-5,20-acetonid, 59 mg (50%) u obliku belog praha.
4.
Rastvor 12-deacil-5,20-acetonid-13-(S)-2-metilbutirata (100 mg; 0,19 mMol) u toluenu (10 mL) je zagrevan na 60°C, i redom su dodavani miristinska kiselina (217 mg; 0,95 mMol), N,N’-dicikloheksilkarbodiimid (DCC) (196 mg; 0,95 mMol) i dimetilaminopiridin (DMAP) (23 mg; 0,19 mMol). Posle mešanja 12 sati na 60°C, reakcija je prerađena razblaživanjem sa EtOAc (≈10 mL) i isprana je sa 2N H2SO4 (2x ≈40 mL), NaHCO3(2x ≈40 mL), i slanim rastvorom (2x ≈40 mL). Posle sušenja (Na2SO4), filtriranja i uparavanja, ostatak je prečišćen gravitacionom kolonskom hromatografijom na silika gelu (PE/EtOAc 9:1→7:3 kao eluent) da bi se dobio 12-miristoil-13-(2-metilbutanoil)-5,20-acetonid, 121 mg (70%) u obliku belog praha. 5.
Rastvor 12-deacil-5,20-acetonid-13-acetata (100 mg; 0,25 mMol) u toluenu (10 mL) je zagrevan na 60°C (temperatura uljnog kupatila), i zatim su dodati miristinska kiselina(286 mg; 1,00 mMol), N,N’-dicikloheksilkarbodiimid (DCC) (206 mg; 1,00 mMol) i dimetilaminopiridin (DMAP) (31 mg; 0,25 mMol). Posle mešanja 12 sati na 60°C, reakcija je prerađena razblaživanjem sa EtOAc (prib.10 mL) i isprana sa 2N H2SO4 (2x prib.40 mL), zas. NaHCO3 (2x prib.40 mL), i slanim rastvorom (2x prib.40 mL). Posle sušenja (Na2SO4), filtriranja i uparavanja, ostatak je prečišćen gravitacionom kolonskom hromatografijom na silika gelu (PE/EtOAc 9:1→7:3 kao eluent) da bi se dobio 12-miristil-13-acetil-5,20-acetonid, 121 mg (70%) u obliku belog praha.
6.
[0222] U zagrejani (60 °C, temperatura uljnog kupatila) rastvor deacil-13-(N-metilantranoil)-5,20-acetonida (100 mg; 0,18 mMol) u toluenu (10 mL), redom su dodavani kapronska kiselina (84 mg; 0,72 mMol), dicikloheksilkarbodiimid (DCC, 149 mg; 0,72 mMol), i dimetilaminopiridin (DMAP 22 mg; 0,18 mMol). Posle mešanja 12 h na 60°C, reakcija je prerađena razblaživanjem sa EtOAc (prib.10 mL) i redom isprana sa 2N H2SO4 (2x prib.40 mL), zas. NaHCO3 (2x prib.40 mL), i slanim rastvorom (2x ca, 40 mL). Posle sušenja (Na2SO4), filtriranja i uparavanja, ostatak je prečišćen gravitacionom kolonskom hromatografijom na silika gelu (PE/EtOAc 9:1→7:3 kao eluent) da bi se dobio 12-heksanoil-13-(N-metilantranoil)-5,20-acetonid, 108 mg (90%) u obliku belog praha.
Deprotekcija
[0223]
1.
5,20-acetonid-12-benzoat-13-[(S)-(+)-2-metilbutirat E (637 mg; 1.02 mMol) je dodat u sveže pripremljen rastvor HClO4 u MeOH [1.5 < pH < 2.0]. Posle mešanja tokom 6-24 sati, reakcija je neutralizovana natrijum acetatom, pa je isfiltrirana i uparena do prib.1/20 originalne zapremine. Dodat je EtOAc (10 mL), i rastvor je ispran sa 2N H2SO4 (30 mL), a zatim sa NaCl rastvorom (30 mL). Posle sušenja (Na2SO4), filtriranja i uparavanja, ostatak je prečišćen gravitacionom kolonskom hromatografijom na silika gelu (PE/EtOAc - →4:6 kao eluent) da bi se dobio 12-benzoat-13-[(S)-(+)-2-metilbutirat F (Jedinjenje 23) u obliku belog praha.
2.
[0224] Reakcija sa 12-acetil-13-N-metilantranoil-5,20-acetonid kao predstavnikom: U rastvor 12-acetil-13-N-metilantranoil-5,20-acetonida (100 mg; 0,16 mMol) u CH2Cl2 (10 mL), dodata je trifluorosirćetna kiselina (TFA) (300 mL; 3% V/V). Posle mešanja oko 12 sati, reakcija je prerađena ispiranjem sa [NaHCO3 (≈10 mL) slanim rastvorom (≈40 mL)], a zatim slanim rastvorom (2x ≈40 mL). Posle sušenja (Na2SO4), filtriranja i uparavanja, ostatak je prečišćen gravitacionom kolonskom hromatografijom na silika gelu (PE/EtOAc 8:2→2:8 kao eluent) da bi se dobio 12-acetil-13-(N-metilantranoil)-tiglian, 69 mg (75%) u obliku belog praha.
[0225] Jedinjenja 21,22, 23, 28, 45, 47, 48, 50, 51, 52 i 53 su dobijena ovim metodima.
Jedinjenje 21
[0226]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.84 (3H, d, J=6.6 Hz), 0.93 (3 H, t, J=7.4 Hz), 1.21 (3 H. s), 1.23 (3 H, s), 1.29 (1 H, d, J=6.7 Hz), 1.64 (2 H, sxt, J=7.6 Hz), 1.73 (3 H, dd. J=2.9, 1.3 Hz), 1.77 (3 H, dq, J=7.2, 1.2 Hz), 1.79-1.81 (3 H, m), 1.95 (1 H, dd, J=9.9, 6.5 Hz), 2.24-2.38 (2 H, m), 3.16 (1 H, d, J=6.7 Hz), 3.26 (1 H, d, J=0.5 Hz), 3.65 (1 H, s), 3.83 (2H, dd, J=13.3, 12.5 Hz), 3.94 (1 H, d, J=3.1 Hz, OH), 4.06 (1 H, t, J=1.6 Hz), 4.22 (1 H, s), 5.41 (1 H, d, J=9.9 Hz), 5.82-6.00 (1 H, br. s, OH), 6.80 (1 H, qq, J=7.1, 1.4 Hz), 7.71 (1 H, dd, J=2.6, 1.3 Hz).
[0227]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.72, 12.20, 13.62, 14.43, 15.07, 17.12, 18.03, 23.66, 26.35, 35.98, 36.03, 36.13, 45.76, 48.92, 61.77, 64.56, 65.23, 65.65, 71.36, 72.41, 76.74, 77.20, 128.38, 133.46, 137.73, 164.63, 167.62, 176,12, 209.88.
Jedinjenje 22
[0228]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.85 (3 H. d, J=7.3 Hz), 0.86 (3 H, t, J=7.2 Hz), 1.20 (3 H, s), 1,21 (3 H, s), 1.20-1.40 (10 H, m), 1.29 (1 H, d, J=6.8 Hz), 1.67 (2 H, d, J=13.7 Hz), 1.75 (3 H, dd, J=2.9, 1.0Hz), 1.88-1.92 (2H, m) 1.89-1.95 (1H, m), 3.07 (2H, dd, J=6.8, 1.5 Hz), 3.15 (1 H, d. J=6.4 Hz), 3.26 (1 H, s), 3.85 (2 H, dd, J=12.7,4.4 Hz), 4.04 (1 H, d, J=2.9 Hz).4.21 (1 H. s), 5.13-5.15 (1 H, m), 5.16-5.18 (1 H, m), 5.35 (1 H, d, J=9.8 Hz), 5.82-5.92 (1 H, m), 7.70 (1. H, dd, J=2.4, 1.0 Hz).
[0229]<13>C NMR (125 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm: 9.74, 14.08, 15.12, 17.03, 22.63, 23.69, 24.48, 26.51, 29.07, 29.08, 29.19, 31.81, 34.25, 36.01, 36.04, 39.29, 45.50, 48.94, 61.69, 64.54, 65.21, 65.49, 71.58, 72.35, 77.17, 77.41, 118.62, 130.03, 133.55, 164.54, 171.11, 176.25, 209.86,
Jedinjenje 23
[0230]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.90 (3 H, d, J=6.5 Hz), 0.94 (3 H, t, J=7.5 Hz), 1.14 (3 H, d, J=7.1 Hz), 1.22 (3 H, s), 1.32 (1 H, d, J=6.6 Hz), 1.35 (3 H, s), 1.41-1.51 (1 H, m, J=14.1, 7.5, 7.0 Hz), 1.69-1.79 (1 H, m), 1.73 (3 H, dd, J=2.9, 1.3 Hz), 2.08 (1 H, dq, J=9.9, 6.5 Hz), 2.39 (1 H, sxt, J=7.0 Hz).3.24 (1 H, d, J=6.6 Hz), 3.29 (1 H, s), 3.84 (2 H, dd, J=12.8.1.3 Hz), 4.10 (1 H, t, J=2.5 Hz), 4.24 (1 H, d, J=0.7 Hz), 5.62 (1 H, d, J=9.9 Hz), 6.07 (1 H, br. s, OH), 7.43 (2 H, t, J=7.7 Hz), 7.55 (1 H, tt, J=7.5.1.3 Hz), 7.72 (1 H, dd. J=2.6, 1.3 Hz), 7.99 (2 H, dm, J=8.4, 1.3 Hz)
[0231]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.73, 11.61, 15.14, 16.14, 17.32, 23.63, 26.18, 26.82, 36.03, 36.34, 41.22, 45.92, 48.92, 61.86, 64.59, 65.20, 65.48, 71.27, 72.46, 77.23, 77.60, 128.44 (2 C), 129.70 (2 C), 130.02, 133.07, 133.52, 164.54, 165.94, 179.00, 209.84.
Jedinjenje 27
[0232]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.85 (3 H, d, J=6.5 Hz), 0.93 (6 H. t, J=7.4 Hz), 1.20 (6 H, s), 1.28 (1 H, d, J=6.6 Hz), 1.58-1.68 (4 H, m), 1.74 (3 H, d, J=1.8 Hz), 1.91 (1 H, dq, J=10.0, 6.4 Hz).2.20-2.36 (4 H, m).3.14 (1 H, d, J=6.6 Hz).3.25 (1 H, s), 3.63 (1 H, s, OH), 3.76-3.86 (1 H, m), 3.93 (1 H, d, J=3.1 Hz, OH), 4.05 (1 H, d, J=2.4 Hz), 4.21 (1 H, d, J=2.4 Hz), 5.36 (1 H, d, J=10.0 Hz), 5.84 (1 H, br. s, OH), 7.70 (1 H, s).
[0233]<13>C NMR (125 MHz, HLOROFORM-d) δ ppm: 9.72, 13.46, 13.62, 15.04, 17.02, 18.01.18.61, 23.66, 26.34, 35.90, 35.95, 36.14, 36.38, 45.42, 48.90, 61.79, 64.58, 65.21, 65.60, 71.34, 72.40, 76.59, 77.18, 133.49, 164.54, 173.30, 176.05, 209.85.
Jedinjenje 28
[0234]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.91 (3 H, d, J=6.6 Hz), 0.96 (3 H, t, J=7.4 Hz), 1.21 (3 H, s), 1.34 (3 H, s), 1.36 (1 H, d, J=3.4 Hz), 1.60 - 1.72 (2 H, m), 1.74 (3 H, d, J=2.1 Hz), 2.09 (1 H, dd, J=9.8, 6.5 Hz), 2.31 (1 H, t, J=15.9, 7.6 Hz), 2.38 (1 H, t, J=15.9, 7.6 Hz), 3.24 (1 H, d, J=6.7 Hz), 3.29 (1 H, s), 3.80 (1 H, d, J=12.4 Hz), 3.87 (1 H, d, J=12.4 Hz), 4.09 (1 H, d, J=2.7 Hz), 4.24 (1 H, s), 5.62 (1 H, d, J=9.9 Hz), 7.43 (2 H, t, J=7.7 Hz), 7.56 (1 H, t, J=7.4 Hz), 7.73 (1 H, s), 7.99 (2 H, d, J=7.3 Hz)
[0235]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.73, 13.65, 15.16, 17.25, 18.07, 23.66, 26.59, 36.07, 36.18, 36.23, 45.80, 48.95, 61.74, 64.55, 65.23, 65.62, 71.54, 72.40, 77.21, 77.63, 128.46 (2 C), 129.72 (2 C), 129.98, 133.12, 133.56, 164.57, 166.15, 176.19, 209.88.
Jedinjenje 41
[0236]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.85 (3H (18), d, J=7.3 Hz), 0.85 (3H (9’), t, J=7.3 Hz), 0.86 (3H (9"), t, J=6.8 Hz), 1.20 (3H (16), s), 1.20 (3H (17), s), 1.22-1.30 (10H (4’, 5’, 6’, 7’, 8’), m), 1.22-1.30 (10H, 4’’, 5’’, 6’’, 7’’, 8’’), m), 1.28 (1H (14), d, J=6.8 Hz), 1.53-1.62 (2H (3"), m), 1.56-1.63 (2H (3’), m), 1.74 (3H (19), dd, J=2.9, 1.3 Hz), 1.90 (1H (11), dq, J=10.1.6.5 Hz), 2.19 (1H (20-OH), t, J=6.8 Hz), 2.24-2.32(2H (2’), m), 2.29-2.37 (2H (2’’), m), 3.14 (1H (8), d, J=6.8 Hz), 3.26 (1H (7), s), 3.59 (1H (4-OH), s), 3.78 (1H (20), dd, J=12.5, 5.2 Hz), 3.82-3.87 (1H (20), m, J=12,5.7.3 Hz), 3.89 (1H (5-OH), d, J=3.1 Hz), 4.05 (1H (10), dq), 4.21 (1H (5), d, J=2.6 Hz), 5.36 (1H (12), d, J=.10.4 Hz), 5.86 (1H 9- OH), br. s.), 7.70 (1H (1), dd, J=2.6, 1.6 Hz).
[0237]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 14.1 (9’’), 14.1 (9’), 15.1 (18), 17.0 (16), 22.6 (8’’), 22.6 (8’), 23.7 (17), 24.5 (3’’), 25.2 (3’), 26.3 (15), 28.99 (4’’), 29.07 (6’), 29.07 (6’’).29.15 (4’), 29.18 (5’’), 29.2 (4’), 29.22 (5’), 31.78 (7’’), 31.80 (7’), 34.3 (2’’), 34.5 (2’), 35.9 (14), 36.0 (8), 45.4 (11), 48.9 (10), 61.7 (6), 64.5 (20), 65.2 (7), 65.6 (13), 71.5 (5), 72.4 (4), 76.5 (12), 77.2 (9), 133.5 (2), 164.6 (1), 173.5 (1’), 176.2 (1’’), 209.9 (3).
Jedinjenje 42
[0238]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.84 (3H (18), d, J=6.2 Hz), 0.87 (3H (6’), t, J=7.0 Hz), 0.88 (3H (6’’), t, J=7.0 Hz), 1.20 (3H (17), s), 1.21 (3H (16), s), 1.25-1.31 (2H (4’), m), 1.25-1.31 (2H (4’’), m), 1.26-1.32 (2H (5’’), m), 1.26-1.32 (2H (5’), m), 1.27-1.29 (1H (14), m, J=6.8 Hz), 1.57-1.62 (2H (3’’), m), 1.58-1.63 (2H (3’), m), 1.74 (3H (19), dd, J=2.9, 1.3 Hz), 1.91 (1H (11), dq, J=10.1, 6.5 Hz), 2.20 (1H (20-OH), t, J=6.8 Hz), 2.26-2,30 (2’), m), 2.29-2.34 (2H (2’’), m), 3.14 (1H (8), d, J=6.8 Hz), 3.26 (1H (7), s), 3.59 (1H (4-OH), d, J=1.0 Hz), 3.78 (1H (20), dd, J=12.5, 5.2 Hz), 3.82-3.87 (1H, (20), m), 3.88 (1H (5-OH), d, J=3.1 Hz), 4.05 (1H (10), t, J=2.6 Hz), 4.21 (1H (5), d, J=3.6 Hz).5.36 (1H (12), d, J=9.9 Hz), 5.86 (1H, (9-OH), br.s.),7.70 (1H (1), dd, J=2.3, 1.3 Hz),
[0239]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 13.8 (6’’), 13.9 (6’), 15.1 (18), 17.0 (16), 22.26 (5’’), 22.3 (5’), 23.7 (17), 24.1 (3’’), 24.8 (3’), 26.3 (15), 31.1 (4’’), 31.2 (4’), 34.2 (2’’), 34.5 (2’), 35.9 (14), 36.0 (8), 45.4 (11), 48.9 (10), 61.7 (6), 64.5 (20), 65.2 (7), 65.6 (13), 71.5 (5), 72.4 (4), 76.5 (12), 77.2 (9), 133.5 (2), 164.6 (1), 173.5 (1’), 176.2 (1’’), 210.0 (3).
Jedinjenje 43
[0240]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.85 (3H (18), d, J=6.5 Hz), 0.89 (3H (5’), t, J=7.2 Hz), 0.90, (3H (5’’), t, J=7.3 Hz), 1.21 (3H (16), s), 1.21 (3H (17), s), 1.28 (1H (14), d, J=6.6 Hz), 1.29-1.37 (2H (4’’), m), 1.29-1.38 (2H (4’), m), 1.55-1.59 (2H (3’’), m), 1.56-1.62 (2H (3’), m).1.75 (3H (19), dd, J=2.9, 1.2 Hz), 1.91 (1H (11), dq, J=10.1, 6.5 Hz), 2.19 (1H (20-OH), t, J=6.6 Hz), 2.24-2.32 (2H (2’), m), 2.30-2.38 (2H (2’’), m), 3.15 (1H (8). d, J=6.6 Hz), 3.25 (1H (7), s), 3.59 (1H (4-OH), s), 3.78 (1H (20), dd, J=12.6, 5.2 Hz), 3.85 (1H (20), dd, J=12.6, 7.4 Hz), 3.88 (1H (20-OH), d, J=3.1 Hz), 4.05 (1H (10), t. J=2.6 Hz), 4.21 (1H (5), d, J=2.3 Hz), 5.36 (1H (12), d, J=10.0 Hz), 5.85 (1H (9-OH), br. s.), 7.70 (1H (1), dd, J=2.3, 1.4 Hz).
[0241]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 13.65 (5’’), 13.68 (5’), 15.1 (18), 17.0 (16), 22.1 (4’’), 22.2 (4’), 23.7 (17), 26.4 (15), 26.5 (3’’), 27.2 (3’), 34.0 (2’’), 34.2 (2’), 35.9 (14), 36.0 (8), 45.5 (11), 48.9 (10), 61.7 (6), 64.6 (20), 65.2 (7), 65.6 (13), 71.5 (5), 72.4 (4), 76.6 (12), 77.2 (9), 133.5 (2), 164.6 (1).173.5 (1’), 176.2 (1’’), 209.9 (3).
Jedinjenje 44
[0242]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.86 (3H (18), d, J=6.2 Hz), 1.24 (3H (16). s), 1.26 (3H (17), s), 1.33 (1H (14), d, J=6.8 Hz), 1.74 (3H (19), dd, J=2.9, 1.3 Hz).
1.76-1.78 (2H (4’), m).1.77-1.79 (2H (4’’), m), 1.78-1.79 (3H (5"), m), 1.80-1.81 (3H (5’), m), 1.97 (1H (11). dq, J=9.9, 6.4 Hz), 2.19 (1H (20-OH), br.s.), 3.18 (1H (8), d, J=6.8 Hz), 3.27 (1H (7), s), 3.60 (1H (4-OH), s), 3.74-3.81 (1H (20), m), 3.86 (1H (20),br. s.), 3.89 (1H (5-OH), br. s.), 4.04-4.11 (1H (10), m).4.22 (1H (5), s), 5.45 (1H (12), d, J=9.9 Hz), 6.28 (1H (9-OH), br. s.), 6.75-6.83 (1H (3’), m), 6.85-6.94(1H (3’’), m), 7.72(1H (1). dd, J=2.6, 1.6 Hz).
[0243]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.8 (5’’), 12.2 (5’), 14.4 (4’), 14.7 (4’’), 15.2 (18), 17.3 (16), 23.7 (17), 26.8 (15), 36.1 (8), 36.2 (14), 45.9 (11), 49.0 (10), 61.6 (6), 64.5 (20), 65.3 (7), 65.6 (13), 71.7 (5), 72.4 (4), 77.0 (12), 77.2 (9), 128.2 (2’), 128.5 (2"), 133.4 (2), 137.6 (3’), 139.8(3’’), 164.9 (1), 167.5 (1’), 169.7 (1’’), 210.0 (3)..
Jedinjenje 45
[0244]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.79 (3H (18), d, J=6.6 Hz).0.93 (3H (4’’’), t, J=7.5 Hz), 1.13 (3H (5’’’), d, J=7.0 Hz), 1.24 (3H (17), s), 1.28 (3H (16), s), 1.28 (1H (14), d, J=6.7 Hz), 1.45 (1H (3’’’), dq, J=14.1, 7.3 Hz), 1.69-1.76 (1H (3’’’), m), 1.71 (3H (19), dd, J=2.8, 1.4), 1.77 (3H (4"), dq, J=7.1, 1-1 Hz), 1.79-1.81 (3H (5’’), m), 1.90 (1H (11), dq, J=9.8, 6.5 Hz), 2.01 (3H (2’’’’), s), 2.18 (3H (2’), s).2.38 (1H (2’’’), sxt, J=7.0 Hz).2.99 (1H (4-OH), s), 3.15 (1H (7). s), 3.26 (1H (8), d, J=6.8 Hz), 3.54 (1H (20), d, J=12.1 Hz), 4.14-4.17, (1H (10), m), 4.69 (1H (20), d, J=12.1 Hz), 5.42 (1H (12), d, J=9.9 Hz), 5.52 (1H (5), s), 5.98 (1H (9-OH), br.s,), 6.80 (1H (3’’), qq, J=7.1, 1.3 Hz), 7.62 (1H (1), dd, J=2.3, 1.2 Hz).
[0245]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.8 (19), 11.6 (4’’’), 12.2 (5’’), 14.4 (4’’), 15.0 (18).16.2 (5’’’), 17.3 (16), 20.7 (2’’’’), 20.8 (2’), 23.7 (17), 26.2 (3’’’), 26.7 (15), 36.0 (14), 36.1 (8), 41.2 (2’’’), 45.8 (11), 49.4 (10), 60.4 (6), 65.4 (7), 65.6 (13), 66.3 (20), 68.1 (5), 71.8 (4), 76.7 (12), 76.9 (9), 128.5 (2"), 133.8 (2), 137.6 (3’’), 162.5 (1), 167.4 (1’’), 168.8 (1’), 170.6 (1’’’’), 178.9 (1’’’), 206.3 (2).
Jedinjenje 46
[0246]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.87 (3H (18), d, J=6.6 Hz), 1.23 (3H (16), s), 1.25 (3H (17), s), 1.34 (1H (14), d, J=6.8 Hz), 1.75 (3H (19), dd, J=2.6, 1.0 Hz), 1.82-1.85 (3H (6’), m), 1.82-1.85 (3H (6’’), m), 1.93-1.99 (1H (11), m), 3.17 (1H (8), d, J=6.8 Hz), 3.27 (1H (7), br.s.), 3.78 (1H (20), d, J=12.6 Hz), 3.85 (1H (20), d, J=12.2 Hz), 4.05-4.08 (1H (10), m), 4.22 (1H (5), d, J=1.6 Hz), 5.47 (1H (12), d, J=9.9 Hz), 5.73 (1H (2’), d, J=15.2 Hz), 5.75 (1H (2’’), d, J=15.1 Hz), 6.08-6.19 (1H (4’), m), 6.08-6.19 (1H (4’’), m), 6.14-6.19 (1H (5’), m), 6.15-6.18 (1H (5’’), m), 7.16-7.23 (1H (3’), m), 7.26-7.33 (1H (3’’), m), 7.71-7.73, (1H (1), m).
[0247]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 15.2 (18), 17.2 (16), 18.7 (6’), 18.7 (6’’), 23.6 (17), 26.7 (15), 36.1 (8), 36.2 (14), 45.9 (11), 49.0 (10), 61.6 (6), 64.6 (20), 65.3 (7), 65.6 (13), 71.7 (5), 72.4 (4), 77.0 (12), 77.1 (9), 117.7 (2’’), 118.7 (2’), 129.7 (4’), 129.7 (4’’), 133.4 (2), 139.7 (5’), 141.0 (5’’), 145.5 (3’), 147.3 (3’’), 164.8 (1), 166.8 (1’), 169.2 (1’’), 210.0 (3),
Jedinjenje 47
[0248]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.89 (3H (18), d, J=6.7 Hz), 0.90 (3H (6’), t, J=6.7 Hz), 1.28 (3H (16), s), 1.29-1.34 (2H (4’), m), 1.30-1.35 (2H (5’), m), 1.31 (3H (17), s), 1.40 (1H (14), d, J=6.6 Hz).1.60-1.65 (2H (3’), m), 1.77 (3H (19), dd, J=2.7, 1.2 Hz), 1.97 (1H (11), dq, J=9.9, 6.5 Hz), 2.14 (1H (20-OH), dd, J=7.4, 6.4 Hz), 2.30 (2H, (2’), td, J=7.4, 7.3 Hz), 2.87 (3H (MeNH), d, J=4.8 Hz), 3.22 (1H (8), d, J=6.6 Hz), 3.29 (1H (7), s), 3.80 (1H (20), dd, J=12.5, 5.7 Hz), 3.86 (1H (20), dd, J=12.9, 7.8 Hz), 4.08-4.11 (1H (10), m), 4.24 (1H (5), d, J=2.5 Hz), 5.53 (1H (12). d, J=9.9 Hz), 6.30-6.37 (1H (9-OH), m).6.52 (1H (6"), ddd. J=7.9, 7.0, 0.9 Hz), 6.64 (1H (4"), d, J=8.4 Hz), 7.36 (1H (5"), ddd, J=8.4, 7.1, 1.4 Hz), 7.56 (1H (3"NH), g, J=4.8 Hz), 7.75 (1H, 7"), dd,J=8.2, 1.6 Hz), 7.72-7.76 (1H (1), m).
[0249]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δppm: 9.8 (19), 14.0 (6’), 15.2 (18), 17.2 (16), 22,4 (5’), 23.9 (17), 24.9 (3’), 27.0 (15), 29.5 (MeNH).31.2 (4’), 34.5 (2’), 36.1 (8), 36.2 (14), 45.7 (11), 49.0 (10), 61.8 (6), 64.6 (20), 65.4 (7), 65.5 (13), 71.6 (5), 72.4 (4), 76.8 (12), 77.4 (9), 108.6 (2") 111-0 (4"), 114.5 (6"), 131.8 (7"), 133.6 (2), 135.6 (5"), 152.7 (3"), 164.4 (1), 170.2 (1"), 173.2 (1’), 209.9 (3).
Jedinjenje 48
[0250]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.9 (3H (18), d, J=6.6 Hz), 1.27 (3H (16), s), 1.32 (3H (17), s), 1.4 (1H (14), d, J=6.6 Hz), 1,77 (3H (19), dd, J=2.7, 1.0 Hz), 1.98 (1H (11), dq, J=9,9, 6.5 Hz), 2.05 (3H (2’), s), 2.88 (3H (MeNH), d, J=5.1 Hz), 3.22 (1H (8), d, J=6.6 Hz), 3.29 (1H (7), s), 3.80 (1H (20), dd, J=12.2, 5.2 Hz), 3.83∼3.88 (1H (20), m), 4.09 (1H (10), br.s.), 4.24 (1H (5), d, J=2.9 Hz), 5.49 (1H (12), d, J=9.9 Hz), 6.53 (1H (6"), t, J=7.6 Hz), 6.64 (1H (4"), d, J=8.6 Hz), 7.36 (1H (5"), ddd, J=8.4, 7.0, 1.6 Hz), 7.55 (1H (3"-NH), q, J=4.6 Hz), 7.73 (1H (1), s), 7.78 (1H (7"), dd, J=8.0, 1.6 Hz).
[0251]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.8 (19), 15.3 (18), 17.2 (16), 21.0 (2’), 23.9 (17), 27.1 (15), 29.5 (MeNH), 36.1 (8), 36.3 (14), 45.8 (11), 49.0 (10), 61.8 (6).
64.6 (20), 65.3 (7), 65.4 (13), 71.6 (5), 72.4 (4).77.3 (9), 77,4 (12), 108.6 (2"), 111.0 (4"), 114.5 (6"), 131.9 (7"), 133.6 (2), 135.6 (5"), 152.7 (3"), 164.4 (1), 170.3 (1"), 170.4 (1’), 209.9 (3).
Jedinjenje 49
[0252]<1>H NMR (500MHz, CDCl3) δ ppm: 0.84 (3H (18), d, J=6.8 Hz), 0.86 (3H (7’), t, J=6.7 Hz), 0.86 (3H (7"), t, J=6.7 Hz), 1.20 (3H (16), s), 1.20 (3H (17), s), 1.22-1.32 (12 H, (4’, 5’, 6’, 4", 5", 6"), m), 1.28 (1H (14), d, J=6,7 Hz), 1.55-1.63 (4H (3’, 3"), m), 1.74 (3H (19), dd, J=2.6, 1.0 Hz), 1.90 (1H (11), m), 2.28 (2H (2"), m), 2.32 (2H (2’), m), 3.14 (1H (8), d, J=6.7 Hz), 3.25 (1H (7), s), 3.65 (1H (4-OH), s), 3.81 (2H (20), br.s.), 3.97 (1H (5-OH), br.s.), 4.05 (1H (10). t, J=2.6 Hz), 4.21 (1H (5), s), 5.35 (1H (12), d, J=9.9 Hz), 5.85 (1H (9-OH), br.s.).7.70 (1H (1), dd, J=2.6, 1.6 Hz),
[0253]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 14.0 (7’), 14,0 (7"), 15.0 (18), 17.0 (16), 22.4 (6"), 22.5 (6’), 23.7 (17), 24.4 (3’), 25.1 (3"), 26.3 (15), 28.7 (4’), 28.7 (4"), 31.4 (5’), 31.4 (5"), 34.3 (2’), 34.5 (2"), 35.9 (8), 35.9 (14), 45.4 (11).48.9 (10), 61.8 (6), 64.6 (20), 65.2 (7), 65.6 (13), 71.3 (5), 72.4 (4), 76.5 (9), 77.2 (9), 133.5 (2), 164.5 (1), 173.5 (1’), 176.2 (1"), 209.8 (2).
Jedinjenje 50
[0254]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.84 (3H (18), d, J=6.8 Hz), 0.85 (3H (14’), t, J=6.8 Hz), 1.20 (3H (16), s), 1.20 (3H (17), s), 1.21-1.28 (20H (4’, 5’, 6’, 7’, 8’, 9’, 10’, 11’, 12’, 13’), m), 1.30 (1H (14), d, J=6.8 Hz), 1.60 (2H (3’),
quin, J=7.3 Hz), 1.74 (3H (19), dd, J=2.9, 1.3 Hz).1.91 (1H (11), dq, J=10.1, 6.5 Hz), 2.07 (3H, (2"), s), 2.23-2.34 (2H (2’), m), 3.14 (1H (8), d, J=6.8 Hz), 3.24 (1H (7), s), 3.46 (1H (5-OH), s), 3.65 (1H (4-OH), s), 3.77-3.83 (2H (20), m, J=3.1 Hz), 3.97 (1H (20-OH), d, J=3.1 Hz), 4.04 (1H (10), t, J=2.6 Hz), 4.21 (1H (5), d, J=2.1 Hz), 5.36 (1H (12), d, J=10.4 Hz), 5.70 (1H (9-OH), br.s.), 7.69 (1H (1), dd, J=2.6, 1.6 Hz).
[0255]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 14.1 (14’), 15.0 (18), 17.0 (16), 21.0 (2"), 22.7 (13’), 23.6 (17), 25.1 (3’), 26.2 (15), 29.0 (4’), 29.2 (5’), 29.3 (6’), 29.5 (7’), 29.6 (8’), 29.6 (8’), 29.6 (9’), 29.6 (10’).29.6(11’), 31.9 (12’), 34.5 (2’), 35.8 (14), 35.9 (8), 45.3 (11), 48.9 (10), 61.8 (6), 64.6 (20).65.2 (7), 65.8 (13), 71.2 (5), 72.4 (4), 76.5 (12), 77.2 (9), 133.5 (2), 164.4 (1).173.6 (1’), 173.6 (1"), 209.8 (3).
Jedinjenje 51
[0256]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.84 (3H (18), d, J=6.8 Hz), 0.86 (3H (14’), t, J=7.0 Hz), 0.92 (3H (4"), t, J=7.5 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=6.8 Hz), 1.21 (3H (16), s), 1.22 (3H (17), s), 1.21-1.31 (20H (4’, 5’, 6’, 7’, 8’, 9’, 10’, 11’, 12’, 13’), m), 1.25 (1H (14), d, J=6.2 Hz), 1.44 (1H (3"), ddq, J=14.0, 7.1, 7.1 Hz), 1.60 (2H (3’), m), 1.71 (1H (3"), ddq, J=14.0, 7.5, 7.5 Hz).1.75 (3H (19), dd, J=2.9, 1.3 Hz), 1.90 (3H (11), dq, J=10.1, 6.5 Hz), 2.18 (1H (20-OH), m, J=6.8, 4.7 Hz), 2.28 (2H (2’), m, J=11.4, 7.4 Hz).2.36 (2H (2"), sxt, J=7.3 Hz), 3.15 (1H (8), d. J=6.8 Hz), 3.26 (1H (7), s), 3.57 (1H (4-OH), d, J=1.0 Hz), 3.78 (1H (20), dd, J=12.5, 4.2 Hz), 3.86 (1H (20), dd, J=12.5, 6.8 Hz), 3.87 (1H (5-OH), d, J=3.1 Hz), 4.05 (1H (10), m, J=2.6 Hz), 4.21 (1H (5), d, J=2.6 Hz), 5.37 (1H (12), d, J=9.9 Hz), 5.98 (1H (9-OH), br.s.), 7.71 (1H (1), dd, J=2.6, 1.6 Hz).
[0257]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.6 (4").14.1 (14’), 15.1 (18).
16.1 (5").17.2 (16), 22.7 (13’), 23.7 (17), 25.2 (2’), 26.2 (3"), 26.6 (15), 29.0 (5’), 29.3 (4’), 29.3 (4"), 29.5 (6’), 29.6 (8’), 29.6 (9’), 29.6 (10’), 29.7 (11’), 31.9 (12’), 34.6 (2’), 36.0 (8), 36.1 (14), 41.2 (2"), 45.6 (11), 48.9 (10), 61.7 (6), 64.5 (20), 65.2 (7), 65.5 (13), 71.6 (5), 72.4 (4), 76.5 (12), 77.2 (9), 133.5 (2).164.7 (1), 173.3 (1’), 178.8 (1"), 209.9 (3).
Jedinjenje 52
[0258]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.85 (3H (18), d, J=6.8 Hz), 0.90 (3H (4’), t, J=7.5 Hz), 1.11 (3H (5’), d, J=7.3 Hz), 1.19 (3H (16), s), 1.21 (3H(17),s), 1.31 (1H (14), d, J=6.8 Hz), 1.44-1.56 (1H (3’),m), 1.58-1.67 (1H (3’), m), 1.74 (3H (19), dd, J=2.9, 1.3 Hz), 1.88-1.96 (1H (11), m), 2.08 (3H (2"), s), 2.33-2.43 (2H (2’), m), 3.15 (1H (8), d, J=6.2 Hz), 3.25 (1H (7), s), 3.59 (1H (4-OH), br.s.), 3.78 (1H (20), d, J=13.0 Hz), 3.85 (1H (20), d, J=12.5 Hz), 4.05 (1H (10), t, J=2.9 Hz), 4.21 (1H (5), s), 5.38 (1H (12), d, J=10.4 Hz), 5.74 (1H (9-OH), br.s.), 7.71 (1H (1), dd, J=2.3, 1.3 Hz).
[0259]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.3 (4’), 15.0 (18), 16.5 (5’), 17.0 (16), 21.0 (2"), 23.6 (17), 26.1 (15), 26.9 (3’), 35.7 (14), 35.9 (8), 41.2 (2’), 45.3 (11), 48.9 (10), 61.7 (6), 64.5 (20), 65.2 (7), 65.8 (13), 71.5 (5), 72.4 (4), 76.2 (12), 76.9 (9), 133.5 (2), 164.6 (1), 173.6 (1"), 176.4 (1’), 209.9 (3).
Jedinjenje 53
[0260]<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.88 (3H (6’), m, J=7.3 Hz), 1.06 (3H (18), d, J=6.2 Hz), 1.18 (3H (16), s), 1.25 (3H (17), s), 1.25 (1H (14), d, J=7.3 Hz), 1.27-1.33 (4H (4’, 5’), m), 1.59-1.65 (2H (3’), m), 1.74-1.80 (1H (11), m), 1.76 (3H (19), dd, J=2.9, 1.3 Hz), 2.23 (1H (20-OH), t, J=6.2), 2.35 (2H (2’), td, J=7.5, 1.6 Hz), 3.06 (1H (8), d, J=7.3 Hz), 3.26 (1H (7), s), 3.57 (1H (4-OH), s), 3.77 (1H (10), t, J=2.6 Hz), 3.81 (2H (20), dd, J=7.3, 4.7 Hz), 3.94 (1H (12), dd, J=9.1, 1.3 Hz), 4.2 (1H (5), s), 7.69, (1H (1), dd, J=2.3, 1.3 Hz).
[0261]<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.8 (19), 13.9 (6’), 16.3 (18), 17.2 (16), 22.3 (5’), 23.3 (17), 24.5 (3’), 28.0 (15), 31.3 (4’), 34.0 (2’), 34.8 (14), 36.5 (8), 47.2 (11), 50.8 (10), 62.5 (6), 65.0 (20), 66.0 (7), 68.6 (13), 71.4 (5), 72.1 (4), 77.7 (9), 78.2 (12), 134.0 (2), 163.7 (1), 177.3 (1’), 209.6 (3).
Jedinjenje 60
[0262] HPLC: Kinetex C18 kolona 4.6 mm, 0.8 mL/min, etanol-voda (70:30). Vreme retencije: 10.9 minuta.
Primeri in vitro efekata na tipove ćelija uključenih u zarastanje rana
Primer 4: Zatvaranje ogrebotine i migracija fibroblasta in vitro
[0263] Sposobnost ranog prolaska neonatalnih prepucijumskih fibroblasta (NFF) kultivisanih u RPMI 1640-10% fetusnom telećem serumu da migriraju preko rane u vidu ogrebotine napravljene u konfluentnom monosloju posle tretmana prečišćenim jedinjenjima ili biljnim ekstraktima bila je određena korišćenjem jednog ili više od sledeća tri metoda.
Metod 1
[0264] Ćelije su bile zasejane u bunarčićima prečnika 16 mm (ploče sa 24 bunarčića), pa je dopušteno da postanu konfluentne i onda su u svakom bunarčiću napravljene 2 ogrebotine korišćenjem vrha sterilne plastične pipete. Medijum je odstranjen, pa su bunarčići zatim isprani fosfatnim puferovanim slanim rastvorom sa pH 7.2 (PBS) da bi se odstranile nepričvršćene ćelije, posle čega je bio dodat sveži medijum, što je bilo praćeno 10-strukim serijskim razređivanjima čistog jedinjenja ili biljnog ekstrakta (2μL). Inkubacija je bila nastavljena tokom 16 do 30 h. Eksperiment je bio završen kada su se ivice ogrebotine netretiranih kultura zatvorile približno 25% od inicijalnog zazora. Monoslojevi su bili isprani sa PBS, pa su fiksirani etanolom i obojeni sa 0.05% kristalno ljubičaste. Bile su odštampane fotomikrografije svakog bunarčića (EVOS mikroskop), a svaka ogrebotina je bila izmerena na 3 mesta da bi se odredila prosečna širina. Smatralo se da je ubrzano zatvaranje rane bilo značajno ako bi preostali zazor bio <40% od zazora kod netretiranih kontrola.
Metod 2
[0265] Ćelije su bile zasejane u bunarčićima od 6 mm (ploče sa 96 bunarčića) ili od 16 mm (ploče sa 24 bunarčića), sa 2 do 6 replikata bunarčić/razređenje, i onda su tretirane kao u Metodu 1. Neposredno posle tretmana, na donjoj strani bunarčića su bile ocrtane ivice ogrebotine pomoću flomastera sa finim vrhom. Posle fiksiranja i bojenja, migracija je bila određena pod mikroskopom uz pomoć iscrtane mreže, uz ocenjivanje migracije sa 0, 25, 50, 75 ili 100% (potpuno zatvaranje) početne širine. Ubrzano zatvaranje rana je smatrano značajnim ako je prosečna četvrtina replikata bila manja od netretiranih kontrola (p<0.05, t-test). Pored toga, oblasti "rana" su bile kreirane zasejavanjem ćelija u prisustvu pinova od nerđajućeg čelika od 3 mm (ploča sa 96 bunarčića), ili umetanjem teflonskih prstenova sa ravnim ivicama. Ova sredstva su bila uklonjena posle inkubacije NFF ćelija preko noći.
Metod 3
[0266] Ćelije su bile zasejane i tretirane u ploči sa 96 bunarčića kao u Metodu 2 (5 replikata u bunarčićima po razređenju), osim što su ogrebotine bile napravljene jednim dejstvom alatke koja je imala 96 pinova debljine 1mm prevučenih teflonom (Essen Bioscience Woundmaker). Ploča je onda bila stavljena u ovlaženu atmosferu sa 5% CO2, na 37°C, u IncuCyte FLR instrument programiran da fotografiše svaki bunarčić pod faznim kontrastom u intervalima od 3 h tokom 42 sata. Softver je odredio početne granice ogrebotina i njihove brzine zatvaranja. Ubrzano zatvaranje rana je bilo smatrano značajnim, ako je početna brzina zatvaranja bila >10% nego kod netretiranih kontrola.
[0267] Rezultati su prikazani u Tabelama 7 do 9.
Tabela 7: Brzine zatvaranja ogrebotine kod humanih neonatalnih fibroblasta posle tretmana čistim jedinjenjima
[0268] Sivo zasenčenje sa podebljanjem ukazuje da je brzina zatvaranja ogrebotine bila znatno veća nego kod kontrolnog tretmana.
[0269] Pokazalo se da sva čista jedinjenja imaju značajno povećane brzine zatvaranja ogrebotine u poređenju sa kontrolnim tretmanima samo sa nosačem.
Tabela 8: Brzine zatvaranja ogrebotine kod humanih neonatalnih fibroblasta posle tretmana nefrakcionisanim etanolskim ekstraktima različitih delova biljke Fontainea picrosperma
[0270] Sivo zasenčenje i podebljanje ukazuju da je brzina zatvaranja ogrebotine bila znatno veća nego kod kontrolnog tretmana.
[0271] Etanolski sirovi ekstrakti svih delova biljke Fontainea picrosperma koji su bili testirani su imali značajno povećane brzine zatvaranja ogrebotine u poređenju sa kontrolnim tretmanom samo sa nosačem.
Tabela 9: Brzine zatvaranja ogrebotine kod humanih neonatalnih fibroblasta posle tretmana nefrakcionisanim etanolskim ekstraktima sa različitim delovima biljaka od tri različite vrste biljaka
[0272] Sivo zasenčenje sa podebljanjem ukazuje da je brzina zatvaranja ogrebotine bila znatno veća nego kod kontrolnog tretmana.
[0273] Ekstrakti delova biljaka od dve druge vrste Fontainea, F. australis i F. rostrata, i njima veoma srodne vrste Hylandia dockrillii imali značajno povećane brzine zatvaranja ogrebotina u poređenju sa kontrolnim tretmanom samo sa nosačem.
[0274] Dodatno tome, posmatranja testiranih ploča pod mikroskopom (Metod 1) su sugerisala da su fibroblasti ispoljili veliku razliku u obrascu bojenja posle tretmana Jedinjenjem 1. Detaljnije ispitivanje je otkrilo da je ovo uzrokovano time što su ćelije očigledno rasle na višeslojan način, što potencijalno ukazuje na gubitak kontaktne inhibicije, povećanje proliferacije ili sposobnost remodeliranja. Primeri zatvaranja ogrebotina kod kontrolnog tretmana i tretmana Jedinjenjem 124 časa posle stvaranja ogrebotine su prikazani na slikama 1 i 2, respektivno.
Primer 5: Matrigel invazivni test za migratornu sposobnost humanih neonatalnih fibroblasta
[0275] Matrigel invazione komore su obezbeđivale ćelijama uslove koji omogućavaju određivanje njihove invazivne sposobnosti in vitro. Matrigel invazione komore se sastoje od prateće ploče za ćelijske kulture sa umecima za ćelijske kulture koji sadrže PET membranu sa porama veličine 8 mikrona sa tankim slojem Matrigel matrice osnovne membrane. Matrigel matrica služi kao rekonstituisana osnovna membrana in vitro. Sloj zatvara pore membrane, blokirajući migraciju neinvazivnih ćelija kroz membranu. Nasuprot tome, invazivne ćelije mogu da se same odvoje i da prodru kroz Matrigel matricu i pore membrane od 8 mikrona. Membrana se može obraditi svetlosnom i elektronskom mikroskopijom i može se lako ukloniti posle bojenja.
[0276] Komore su bile upotrebljene u skladu sa uputstvima proizvođača, kao što je opisano dole, u dve studije da bi se odredili efekti Jedinjenja 1, 2, 5 i 42 na migraciju humanih neonatalnih fibroblasta. U prvoj studiji su određeni efekti tri koncentracije (0. 10 i 30 ng/mL) Jedinjenja 1 na neonatalne fibroblaste u bunarčićima koji su sadržali medijume sa 10% fetusnog telećeg seruma. U drugoj studiji su upotrebljene dve koncentracije (0 i 30ng/mL) za svako od Jedinjenja 1, 2, 5 i 42 da bi se ispitali efekti na migraciju neonatalnih fibroblasta koji su gladovali tokom 2 dana pre tretmana, a koji su onda preneti u medijume sa 1% fetusnog telećeg seruma.
Rehidracija
[0277] Pakovanje koje je sadržalo komore bilo je izvađeno iz skladišta na -20°C, pa mu je dopušteno da se zagreje do sobne temperature. Topli medijum za kultivaciju (37°C) na bazi bikarbonata je bio dodat u unutrašnjost umetaka (500 μL) i dno bunarčića (750 μL). Komorama koje su sadržale Matrigel je bilo dopušteno da se rehidriraju tokom 2 sata u inkubatoru za kultivaciju tkiva sa ovlaživanjem, na 37°C, pod atmosferom sa 5% CO2. Posle rehidracije, medijum je bio pažljivo odstranjen aspiracijom, bez remećenja sloja Matrigel™ matrice na membrani.
Studije invazije
[0278] Ćelije su bile sakupljene, pa su resuspendovane sa 20,000 ćelija po mL. Ukupno 250 μL suspenzije ćelija je bilo stavljeno u unutrašnjost umetka (5,000 ćelija). Onda je u unutrašnjost umetka bilo dodato dodatnih 250 μL medijuma koji su sadržali odgovarajuća jedinjenja da bi se dobile željene finalne koncentracije za svaku od dve studije. Ukupno 750 μL medijuma koji su sadržali odgovarajuće koncentracije svakog jedinjenja u svakom tretmanu je bilo stavljeno u bunarčić ispod odgovarajućeg umetka. Matrigel komore su onda bile inkubirane tokom 24 sata u inkubatoru za kultivaciju tkiva sa ovlaživanjem, na 37°C, pod atmosferom sa 5% CO2.
Merenje invazije ćelija
[0279] Neinvazivne ćelije su bile odstranjene sa gornje površine membrane "ribanjem". Zašiljeni pamučni tampon je bio umočen u umetak posle odstranjivanja medijuma, pa je primenjen jak pritisak dok se vrh pomerao preko površine membrane. Ribanje je bilo ponovljeno i drugim tamponom navlaženim sa PBS. Ćelije koje su izvršile invaziju na spoljašnju površinu umetka su onda bile fiksirane stavljanjem u 500 μL 100% metanola tokom najmanje 5 min. Umeci su zatim bili preneti u prateću ploču koja je sadržala 500 μL 0.1% kristalno ljubičaste u metanolu, i onda su bojeni najmanje 15 min. Umeci su bilo obezbojeni propuštanjem kroz 3 prateće ploče koje su sadržale 500 μL vode, pre nego što su osušeni na vazduhu.
[0280] Sledećeg dana membrana je bila odstranjena iz kućišta umetka preokretanjem umetka i umetanjem vrha oštrog sečiva skalpela kroz membranu na susednoj ivici zida kućišta. Kućište umetka je bilo okretano nasuprot nepokretnog sečiva i membrana je onda oslobođena. Membrana je izvađena iz kućišta pomoću forcepsa, i onda je postavljena licem naniže na 10 μL Kajzerovog glicerolskog rastvora i zatim je pokrivena pokrivnim staklom. Ostavljeno je da se slajdovi osuše preko noći, pre brojanja invazivnih ćelija.
Rezultati
[0281] U prvoj studiji, fibroblasti tretirani sa 10 ili 30 ng/mL Jedinjenja 1 su ispoljili povećanu sposobnost migracije u sistemu sa Matrigel invazionim komorama u poređenju sa ćelijama tretiranim samo nosačem (Slika 3). Druga studija je potvrdila rezultate prve studije sa Jedinjenjem 1 i demonstrirala je slične nivoe povećanja sposobnosti migracije za Jedinjenja 2, 5 i 42 (Tabela 10).
Tabela 10: Matrigel invazioni test humanih neonatalnih fibroblastnih ćelija tretiranih sa 30 ng/mL svakog jedinjenja. Podaci su izraženi kao % povećanja invazije membrana u poređenju sa kontrolom samo sa nosačem, plus ili minus standardna odstupanja iz dva ponovljena eksperimenta. Ćelije su bile izbrojane posle 24 h inkubacije.
Primer 6: Repopulacija i zatvaranje ogrebotina sa imortalizovanim humanim keratinocitima (HaCaT) in vitro
[0282] Sposobnost imortalizovanih humanih keratinocitnih ćelija (HaCaT) da migriraju preko rane u vidu ogrebotine napravljene u konfluentnom monosloju posle tretmana Jedinjenjem 1 ili Jedinjenjem 37 je bila određena sledećim metodom.
[0283] Tripsinizovane HaCaT ćelije su bile zasejane sa gustinom ćelija od 7.4x10<4>ćelije/mL u pločama sa 24 bunarčića sa ravnim dnom za kulture tkiva BD Falcon (VWR International, UK) u 1 mL Dulbekovog Modifikovanog Igl Medijuma (DMEM), kome su bili dodati L-glutamin (2 mM), antibiotici (100 U/mL penicilin G natrijuma, 100 μg/mL streptomicin sulfata i 0.25 μg/mL amfotericina B); i 10% fetusnog telećeg seruma (sve Invitrogen Ltd. UK) da bi se dobila gustina zasejanih ćelija od 7.4x10<4>ćelija u svakom bunarčiću. Ćelije su onda održavane na 37°C, pod atmosferom sa 5% CO2/95% vazduha preko noći. Sledećeg jutra, DMEM koji je sadržao 10% fetusni teleći serum je bio zamenjen sa DMEM bez seruma, pa je ostavljeno da HaCaT ćelije posle toga gladuju bez seruma u DMEM tokom 48h.
[0284] Posle 48h je bio odstranjen DMEM bez seruma, pa je napravljena jedna jedina ogrebotina kao ’rana’ pomoću sterilne pipete preko svakog sloja ćelija. Posle ispiranja dva puta u 1mL PBS, u svaki bunarčić je bio dodat medijum koji je sadržao Jedinjenje 1 ili Jedinjenje 37 (1mL). Ovaj medijum se sastojao od DMEM, kome su bili dodati L-glutamin (2mM), antibiotici (kao gore) i 1% fetusnog telećeg seruma, pored Jedinjenja 1 ili Jedinjenja 37 u finalnim koncentracijama od 0, 0.001, 0.01, 0.1, 1.0, 10 ili 100 μg/mL. Bila su tri replikata bunarčića po koncentraciji za svako jedinjenje.
[0285] Kulture HaCaT su bile održavane na 37°C pod atmosferom sa 5% CO2/95% vazduha, a repopulacija ogoljenih površina ’rane’ je bila praćena pomoću “Time-Lapse Confocal Microscopy” (Leica TCS SP5 Confocal Microscope, Leica Microsystems UK Ltd. UK) sa uvećanjem od 100x, sa digitalnim fotografijama snimljenim u fiksnim pozicijama svakih 20 min u toku perioda od 48h. Nizovi digitalnih slika su bili eksportovani i pripremljeni kao avi video fajlovi, uz korišćenje LAS AF Softvera (Leica Microsystems). Brzine zatvaranja HaCaT rana in vitro su bile kvantifikovane korišćenjem ImageJ Softvera (ImageJ 1.37v; http://rsb.info.nih.gov/ij/).
Podaci su bili analizirani pomoću jednosmerne analize varijanse sa post-test Tukijevom analizom. Svaki eksperiment je bio izveden u 3 posebne prilike.
[0286] 48 h posle primene, Jedinjenje 1 je znatno povećalo brzinu zatvaranja ogrebotine (p<0.01) u koncentracijama od 0.001, 0.01 i 0.1 ng/ml u poređenju sa kontrolnim tretmanom (Tabela 11). Posle 48 sati Jedinjenje 37 je takođe povećalo brzinu zatvaranja ogrebotine (p<0.01) u koncentracijama od 0.001, 0.01, 0.1 i 1.0 μg/ml u poređenju sa kontrolnim tretmanom (Tabela 11).
Tabela 11: Obim repopulacije ogrebotina i zatvaranja imortalizovanim humanim keratinocitnim (HaCaT) ćelijama 48 sati posle tretmana sa nizom koncentracija Jedinjenja 1 i Jedinjenja 37. Podaci su za % površine rana - ogrebotina koje su ostale otvorene posle tretmana (± standardne greške).
[0287] Da bi se odredilo da li su efekti Jedinjenja 1 i Jedinjenja 37 na povećanje repopulacije i zatvaranje ogrebotina, kao što je prikazano u Tabeli 11, bili posredovani proliferacijom ili migracijom ćelija bila su izvedena dva sledeća eksperimenta. Prvi od ovih eksperimenata je bio usmeren na aspekte migracije i ponovljena je studija repopulacije ogrebotina, ali sa dodavanjem 1μg/mL Mitomicina C medijumu u isto vreme kada su bila primenjena jedinjenja. Poznato je da Mitomicin C inhibira ζelijsku proliferaciju, ukljuθujuζi i onu HaCaT ćelija; i bilo je utvrđeno da nije citotoksičan u sistemu za kultivaciju u koncentraciji od 1ěg/mL. Rezultati ove studije migracije su otkrili povećanje repopulacije i zatvaranja (p<0.05) ogrebotina za koncentracije između 0.001 i 1.0 μg/mL i za Jedinjenje 1, i za Jedinjenje 37.
[0288] Eksperiment proliferacije je određivao efekte dva jedinjenja na proliferaciju HaCaT (što je mereno pomoću MTT) u sistemu za kultivaciju za 4 vremenska perioda (24, 48, 120 i 168h). Oba Jedinjenja 1 i 37 su imala značajan efekat (p<0.01) na povećanje proliferacije HaCaT ćelija za niz koncentracija između 0.001 i 10 μg/mL u poređenju sa kontrolnim tretmanom bez dodatog jedinjenja.
[0289] Ovi rezultati demonstriraju da su i proliferacija i povećanje migracije ćelija uključene u proces repopulacije i zatvaranje ogrebotina sa Jedinjenjima 1 i 37.
Primer 7: Diferencijacija monocita u makrofage pomoću jedinjenja
[0290] Makrofagi igraju brojne uloge u zarastanju rana, uključujući raščišćavanje ćelijskog otpada i nekrotičnog tkiva u ranom, upalnom stadijumu, što je praćeno podržavanjem proliferacije ćelija i restauracije tkiva tokom kasnijih stadijuma zarastanja. Smatra se da je M1 fenotip povezan sa ranim upalnim stadijumom, a da je M2 fenotip povezan sa stadijumom zarastanja.
[0291] Da bi se odredili potencijalni efekti Jedinjenja 1 i petnaest drugih epoksitiglianskih jedinjenja iz te grupe na diferencijaciju monocita, humane periferne krvne mononuklearne ćelije (PBMCs) su bile izolovane pomoću Ficoll-Paque sedimentacije heparinizovane krvi 72-šnjeg muškarca kao humanog donora, koje su stavljene sa 100,000 ćelija/bunarčiću u RPMI-164010% FCS. Duplikati bunarčića su bili tretirani 10-strukim razređenjima jedinjenja, pa su bili inkubirani na 37°C tokom 4 dana. Bunarčići su bili ocenjeni vizuelno u pogledu vezivanja ćelija i morfologije, a onda su isprani dva puta sa PBS, pa su obojeni sa sumpor rodaminom, a inkorporirana boja je kvantifikovana na ELISA čitaču. Ploče su onda bile isprane vodom pa su obojene sa 1% kristalno ljubičaste u metanolu radi fotografisanja i ocenjivanja morfologije prionulih ćelija.
[0292] Rezultati eksperimenta doza-reakcija sa humanim PBMCs (Tabela 12) su pokazali da su svih šesnaest testiranih epoksitiglianskih jedinjenja diferencirali periferne krvne monocite u makrofage u ng koncentracijama, što je bilo utvrđeno na osnovu prianjanja i morfologije koja je bila smeša dendritskih ćelija tipičnih za M2 fenotip, i zaobljenih ćelija tipičnih za M1 fenotip.
Tabela 12: Krajnje koncentracije u nizu razređivanja za indukciju fenotipa makrofaga u humanim monocitima iz periferne krvi pomoću epoksi-tiglianskih jedinjenja iz niza.
Primer 8: Efekti jedinjenja 1 i 37 na diferencijaciju adultnih dermalnih fibroblasta u miofibroblaste
[0293] Fibroblasti igraju centralnu ulogu u procesu zarastanja rana, a kada su aktivirani, oni se diferenciraju u miofibroblastični fenotip koji je karakterisan izražavanjem α-glatko-mišićnog aktina (α-SMA). Dok miofibroblasti doprinose zarastanju tkiva i zatvaranju rana, njihova prekomerna ekspresija je povezana sa poremećenim zarastanjem i prekomernim stvaranjem ožiljaka.
[0294] Efekti Jedinjenja 1 i 37 na diferencijaciju dermalnih fibroblasta u miofibroblaste su bili ispitani u pogledu stepena α-SMA ekspresije pomoću TGF-β1-stimulisanih dermalnih fibroblasta.
Metode
[0295] Posle tripsinizacije, fibroblasti su bili zasejani u Permanox komorne pločice sa 8 bunarčića (VWR international) u DMEM medijumu, koje su sadržale antibiotike, 2 mM L-glutamina i 10% fetusnog telećeg seruma (250 μL, sve nabavljeno od firme Invitrogen); sa gustinom ćelija od 2,5x10<4>ćelija/bunarčiću i održavani su na 37°C u 5% CO2/95% vazduhu tokom 48h.
[0296] Posle 48h, rast fibroblasta je bio zaustavljen u DMEM bez seruma tokom 48h, a onda je on bio zamenjen sa DMEM bez seruma (250 μL), koji je sadržao Jedinjenja 1 ili 37 u koncentracijama od 0.0.001, 0.01, 0.1, 1.0 i 10.0 μg/mL (3 bunarčića/ koncentracija/jedinjenje) i TGF-β1 (10ng/ml, Peprotech). Fibroblasti su bili održavani na 37°C u 5% CO2/95% vazduha tokom 72h.
[0297] Posle 72h, bunarčići komorne pločice su bili isprani sa PBS (x1, 250 μL), a onda su fiksirani u 4% paraformaldehida (100 μL/bunarčiću) tokom 10min. Bunarčići komorne pločice su zatim ponovo bili ispirani sa PBS (x1.250 μl), pa su tretirani sa 0.1% Triton-om X-100 u PBS (100 μL, Sigma) tokom 5min i ponovo su isprani sa PBS (x1, 250 μL). Bunarčići su bili blokirani sa 1% BSA u PBS (250 μL, Sigma) tokom 1h i zatim su isprani (x3) u 0.1% BSA/PBS.
[0298] Bunarčići su bili inkubirani sa monoklonskim mišijim anti-humanim α-SMA, klon 1A4 (1:100, 150ul, Sigma) na 4°C preko noći, pa su isprani (x6) u 0.1% BSA/PBS i onda su inkubirani sa Alexa Fluor 488 kozijim anti-mišijim IgG antitelom (1:1000, 250 μL, Invitrogen), na sobnoj temperaturi tokom 1h, u mraku. Komorne pločice su bile isprane (x6) u 0.1% BSA/PBS, a zatim su suprotno bojene sa Hoescht 33258 rastvorom tokom 30 min u mraku (1:2000, 250 μL, Sigma). Komore su zatim bile skinute sa pločica i tretirane su sa Fluorsave (Santa Cruz) tokom 10min u mraku. Pločice su bile posmatrane fluorescentnom mikroskopijom (Leica Microsystem), pri čemu su digitalne fotografije bile snimljene sa uvećanjem x200. Digitalne fotografije su bile obrađene uz upotrebu HC Image J softvera.
Rezultati
[0299] U kontrolnom tretmanu sa TGF-β1, ali bez dodatih Jedinjenja, adultni dermalni fibroblasti su se diferencirali u miofibroblaste, obično karakterisane povećanom α-SMA ekspresijom, formiranjem α-SMA stresnih vlakana i sveukupnim razvojem uvećane, poligonalne ćelijske morfologije. Nasuprot tome, izlaganje adultnih dermalnih fibroblasta tretiranih sa TGF-β1 Jedinjenju 1 i Jedinjenju 37 uticalo je na diferencijaciju u miofibroblaste na način zavisan od koncentracije. U slučaju Jedinjenja 1 u koncentraciji od 0.1 μg/mL, kulturama fibroblasta je nedostajalo formiranje α-SMA stresnih vlakana i tipična poligonalna ćelijska morfologija, koja je predstavnik diferencijacije miofibroblasta (Slika 5). Sa Jedinjenjem 37 se pojavio remetilački efekat na formiranje α-SMA stresnih vlakana i razvoj poligonalne morfologije u koncentraciji od 10 μg/mL (Slika 6).
[0300] Pored toga, izgleda da postoje druge fine promene u morfologiji miofibroblasta u opsegu koncentracija između 1 i 10 μg/mL Jedinjenja 1 i između 0.1 i 1.0 μg/mL Jedinjenja 37 (Slike 5 i 6).
[0301] Specifični efekti jedinjenja na diferencijaciju fibroblasta/miofibroblasta mogu biti relevantni za minimalno stvaranje ožiljaka kod rana tretiranih in vivo sa Jedinjenjem 1 (Primeri 16 i 17).
Primer 9: Indukcija reaktivnog prodora kiseonika pomoću neutrofila u reakciji sa Jedinjenjem 1
[0302] Neutrofili su specijalizovane fagocitne ćelije urođenog imunog sistema i njihov priliv i aktivacija su esencijalni za čišćenje od bakterija, gljivica i ćelijskog otpada tokom ranih stadijuma zarastanja rana. Široki spektar antimikrobne aktivnosti neutrofila je baziran na nekoliko strategija koje uključuju prodor reaktivnih vrsta kiseonika (ROS).
[0303] Bila je sprovedena studija da bi se odredili potencijalni efekti Jedinjenja 1 na indukciju prodora reaktivnog kiseonika pomoću neutrofila.
[0304] Neutrofili su bili izolovani iz sveže krvi zdravog humanog donora lizom pelete od crvenih krvnih ćelija koja je bila dobijena Ficoll-Paque sedimentacijom. Neutrofili (∼ 4 x 10<6>ćelija/ml) su bili inkubirani sa 10 μg/ml dihidroetidijuma (DHE) (Sigma-Aldrich) u kompletnom medijumu za kultivaciju na 37°C tokom 15 min zajedno sa alikvotom neobojenih ćelija koje su trebale da budu testirane kao neobojena kontrola. Ova inkubacija je bila praćena tretmanom sa Jedinjenjem 1 u opsegu koncentracija (0, 1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml, 1 μg/ml, 10 μg/ml, 100 μg/ml) tokom 15 min. Generisanje reaktivnih vrsta kiseonika posle inkubacije je bilo određeno korišćenjem FACS Canto protočnog citometra za merenje fluorescencije zbog oksidacije DHE u etidijumski jon.
[0305] Ova studija nije otkrila produkciju ROS u kontrolnom tretmanu bez prisustva Jedinjenja 1. Nasuprot tome, Jedinjenje 1 je indukovalo značajnu produkciju reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) na način zavisan od doze, uz povećanje produkcije ROS sa povećanjem koncentracija Jedinjenja 1.
Primeri efekata jedinjenja na proteine, gene i citokine relevantne za poboljšane rezultate zarastanja rana
Primer 10: Molekularna analiza humanih neonatalnih fibroblasta tretiranih sa Jedinjenjima 1 i 42
[0306] Vestern Blot metod je bio upotrebljen za identifikaciju efekata Jedinjenja 1 i 42 na proteine relevantne za zarastanje i izlečenje rana u humanim neonatalnim fibroblastnim ćelijama (NFFs). Bile su izvedene dve studije. U prvoj studiji, NFFs su bile tretirane sa 10 ili sa 30 ng Jedinjenja 1/mL tokom 6 ili 24 sati, pre sakupljanja i ekstrakcije proteina. U drugoj studiji NFFs su bile pojedinačno tretirane sa koncentracijom Jedinjenja 1 i 42 od 30 ng/mL, respektivno, tokom 6 sati. Rezultujući lizati iz obe studije su bili podvrgnuti vestern blot analizi, i ispitivanju sa specifičnim antitelima za ključne signalne molekule uključene u zarastanje i izlečenje rana.
Priprema uzoraka proteina za Vestern bloting.
[0307] Medijum od adherentnih humanih neonatalnih fibroblasta kultivisanih u pločama od 75 cm<2>bio je odstranjen, pa su ćelije bile isprane dva puta u ledeno hladnom PBS. Pričvršćene ćelije su bile sakupljene u 10 mL ledeno hladnog PBS korišćenjem strugača za ćelije (Costar®, Corning), pa su peletirane centrifugiranjem tokom 5 min (1,500 rpm, RTemp), a zatim su resuspendovane u 1 mL ledeno hladnog PBS, i prenete su u mikroepruvete za centrifugiranje od 1.5 mL. Ćelije su bile sakupljene centrifugiranjem (13,200 rpm, RTemp, 2 s), pa je PBS odstranjen i onda su pelete čuvane na -20°C sve do upotrebe.
[0308] Zamrznute pelete su bile otopljene na ledu, i onda su resuspendovane u zapremini pufera za lizu ćelija jednakoj 3-4 puta zapremine pelete pipetiranjem naviše i naniže. Ćelijska suspenzija je bila podvrgnuta dejstvu ultrazvuka tokom 60 s na 4°C i onda je centrifugirana tokom 20 min (13,200 rpm, 4°C), a međufaza koja je sadržala protein je preneta u svežu mikroepruvetu za centrifugiranje od 1.5 ml. Protein je bio čuvan na -20°C.
Određivanje koncentracije proteina
[0309] Koncentracije proteina su bile određene korišćenjem BCA Protein Test kita (Pierce). Ovaj metod je baziran na redukciji Cu<2+>u Cu<1+>proteinom u alkalnom rastvoru. Formirani Cu<1+>je posle toga helatiran bicinhoninskom kiselinom (BCA) formirajući purpurni reakcioni proizvod.
[0310] Uzorci proteina su bili razređeni 1/10 i 1 /20 (v/v) u MilliQ vode, pa je 10 μL bilo stavljeno u duplikatu u ploču sa 96 bunarčića sa ravnim dnom (Costar®, Corning). Pripremljeni rastvori goveđeg serumskog albumina (BSA) su bili pripremljeni sa 100, 200, 400, 600, 1,000, i 1,200 μg/mL i 10 μL/bunarčiću, pa su stavljeni u duplikatu i testirani su zajedno sa uzorcima. BCA radni reagens je bio pripremljen mešanjem 50 delova reagensa A sa 1 delom reagensa B i alikvotiranjem 100 μL u svaki bunarčić. Ploča je bila inkubirana na 37°C u toku 30-45 min da bi se omogućilo odvijanje reakcije. Sirove apsorbanse su bile očitane na A590 nm na čitaču za mikroploče (VERSAmax, Molecular Devices) i napravljena je standardna kriva korišćenjem SOFT max PRO softvera (Molecular Devices). Koncentracije nepoznatih uzoraka su bile određene na osnovu krive.
SDS poliakrilamidna gel elektroforeza (SDS-PAGE).
[0311] Uzorci proteina su bili pripremljeni mešanjem sa podesnom zapreminom 2 X SDS pufera za stavljanje, pa su denaturisani zagrevanjem tokom 10 min na 70°C. SDS-PAGE gel je bio izveden uz korišćenje Mini-Protean II dual slab gel aparata (Bio-Rad Laboratories), kao što je opisao Laemmli (6). Gel za rastvaranje se sastojao od 0.275 M Tris-HCl (pH 8.8), 0.1% (w/v) SDS, 0.05% (w/v) sveže napravljenog amonijum persulfata, 1% (v/v) TEMED i između 7.5-12% (w/v) akrilamida/bisakrilamida (29:1). Rastvor je bio dopunjen do 5 mL u MilliQ H2O, i ostavljeno je da očvrsne tokom najmanje 30 min (RTemp), dok nije bio pokriven odozgo sa butanolom zasićenim vodom. Pre izlivanja gela za slaganje, bio je odliven butanol zasićen vodom. Gel za slaganje se sastojao od 0.125 M Tris-HCl (pH 6.8), 0.1% (w/v) SDS, 0.05% (w/v) sveže napravljenog amonijum persulfata, 0.1% (v/v) TEMED i 4% (w/v) akrilamida/bisakrilamida (29:1). Rastvor je bio dopunjen do 2.5 mL po gelu u MilliQ H2O, pa je izliven sa gornje strane gela za rastvaranje i ostavljeno je da očvrsne sa češljem za 10-bunarčića (Bio-Rad Laboratories) tokom najmanje 30 min. Elektroforeza je bila izvođena tokom približno 1 h ili sve dok nije izašla boja sa dna gela (200 V, RTemp) u 1 X SDS radnom puferu.
Vestern transfer
[0312] Posle SDS-PAGE elektroforeze gel ploče su bile pažljivo razdvojene, pa je gel za slaganje bio isečen i prenet u Mini Trans-Blot Cell (Bio-Rad Laboratories). "Prenosni sendvič" je bio napravljen kao što sledi: porozni sunđer, dva lista papira za bloting (Whatmann), nitrocelulozna membrana, gel, još dva lista papira za bloting i sledeći porozni sunđer, pa je umetnut u prenosni aparat. Sunđeri, membrana i papir za bloting su bili prethodno ovlaženi hladnim elektroblot puferom, a vođeno je računa da se spreči formiranje mehurića vazduha, pošto bi ovo rezultovalo nekonzistentnim prenosom proteina. Proteini su bili preneti na 100 V tokom 1 h (konstantni napon) u ledeno hladnom prenosnom puferu na 4°C sa nitroceluloznom membranom (Hybond™-C, Amersham Biosciences) bližom anjonskoj strani, pa su dodati pakovanje leda i magnetni mešač.
Ispitivanje proteinskih membrana
[0313] Kada je preneta, membrana je bila inkubirana u 5% (w/v) Blotto u 0.1% (v/v) Tween 20/TBS na STemp tokom najmanje 30 min uz blago orbitalno trešenje da bi se blokirala nespecifična mesta vezivanja. Primarno antitelo je bilo razređeno u 5% (w/v) BSA, kao što je preporučio proizvođač (vidi Tabelu 13 dole) do finalne zapremine od 2 mL. Bio je napravljen plastični omotač koji je sadržao membranu i antitelo, pa je zavaren toplotom, uz uklanjanje mehurića vazduha što je više bilo moguće. Omotači su bili okretani na specijalno napravljenom rotoru preko noći (približno 16 h) na 4°C.
[0314] Membrana je bila izvađena iz kese, pa je stavljena na plastični poslužavnik sa 0.1% (v/v) Tween 20/TBS i isprana je četiri puta na sobnoj temperaturi uz energično orbitalno trešenje tokom 15 min po ispiranju. Podesno sekundarno antitelo konjugovano sa ren peroksidazom (HRP) bilo je ispitano na membrani razređivanjem 1/1,000 u 5% (w/v) Blotto u 0.1% (v/v) Tween 20/TBS i stavljanjem u svež plastični omotač koji je bio okretan na sobnoj temperaturi tokom 2 h.
Imuno-detekcija proteina
[0315] Da bi se odstranilo bilo koje nevezano ili nespecifično vezano antitelo, membrana je bila isprana u 0.1%) (v/v) Tween 20/TBS/ na sobnoj temperaturi četiri puta, po 15 min svaki put. Vestern Lighting™ Chemiluminescence Reagent Plus (PerkinElmer Life Sciences) je bio upotrebljen za generisanje detektabilnog signala od sekundarnih antitela obeleženih sa HRP. Reagens se bazira na oksidativnoj degradaciji luminola katalizovanoj pomoću HRP, što rezultuje emisijom svetla koje se može detektovati na 420 nm i može se snimiti na filmu. Podjednake zapremine iz boce 1 i boce 2 bile su pomešane neposredno pre detekcije. Bila je upotrebljena ukupna zapremina od 2 mL po membrani i inkubirana je na sobnoj temperaturi tokom 1 min. Vođeno je računa da cela membrana bude podjednako izložena. Membrana je bila uklonjena, pa je brzo osušena na nešto papira za bloting, te je umetnuta između dva zaštitna dela od polipropilenskih listova u kaseti za film (Hypercassette™, Amersham Biosciences) i izložena je delu filma (SuperRX, Fujifilm). Inicijalno izlaganje od 2 min je bilo upotrebljeno za procenu optimalnog vremena detekcije. Film je bio razvijen u Kodak Image Station (Kodak).
Tabela 13: Antitela upotrebljena u ovoj studiji su bila:
[0316] U prvoj studiji sa Jedinjenjem 1 su izvršeni Vestern blot analiza prelazne aktivacije i MEK1/2 i ERK1/2 posle 6 sati tretmana sa 10 ili 30 ng/mL Jedinjenja 1 i prateća regulacija naniže aktivacije posle tretmana od 24 sata. Poznato je da aktivacija MEK / ERK grane MAP kinazne putanje utiče na migratorni fenotip mnogih tipova ćelija, uključujući fibroblaste. Nije bila uočena razlika u nivoima MMP9.
[0317] Slični obrasci fosforilacije fosfo-ERK su bili otkriveni na Vestern Blotovima u drugoj studiji sa koncentracijama Jedinjenja 1 i 42 od 30 ng/mL na NFFs.
Primer 11: Efekat Jedinjenja 1 na ekspresiju gena uključenih u zarastanje rana
[0318] Efekti Jedinjenja 1 na ekspresiju gena povezanih sa zarastanjem rana bili su ispitani u dve situacije (a) na humanim PBMCs i (b) mišijoj stromi sa humanim tumorskim ksenograftima.
Materijali i metode
[0319] Humane periferalne krvne mononuklearne ćelije (PBMCs) su bile izolovane pomoću Ficoll-Paque sedimentacije heparinizovane krvi 68-godišnjeg muškarca kao humanog donora, i kultivisane su u RPMI-164010% FCS. Posle tretmana Jedinjenjem 1 od 30 ng/mL, monosloj je bio jednom ispran fosfatnim puferovanim slanim rastvorom (PBS), a ćelije su bile sakupljene pomoću sterilnih strugača i čuvane su kao pelete na -80° C.
[0320] Mišije strome sa humanim tumorskim ksenograftima su bile dobijene od miševa kod kojih je Sk-Mel-28 humana melanoma ćelijska linija bila ubrizgana subkutano na 2 mesta u bokove svakog BALB/c Foxnlnu miša (2 x 10<6>ćelija/mestu), pa je ostavljeno da izrastu do prečnika od približno 7 mm. U svaki tumor je onda bilo ubrizgano 50 μL 20% propilen glikola koji je sadržao 30 μg Jedinjenja 1 ili 50 μL 20% propilen glikola. U različitim vremenskim trenucima posle ubrizgavanja miševi su bili eutanazirani, pa su tumori sakupljeni uz uklanjanje kožnog pokrivača, a zatim su intaktni tumori čuvani na -80° C
[0321] RNK je bila ekstrahovana iz 30 mg zamrznutog tumora ili 1 x 107 ćelija uz korišćenje QiagenRNeasyPlus Mini Kita, prema instrukcijama proizvođača, a onda je kvantifikovana NanoDrop instrumentom i integritet je potvrđen na denaturišućim agaroznim gelovima koji su nosili 1 kb DNK markera i obojeni su etidijum bromidom.
RNK amplifikacija i obeležavanje.
[0322] Približno 500 ng ukupne neobeležene RNK je bilo podešeno do finalne zapremine od 11 μL sa vodom bez nukleaze. RNK je bila inkubirana sa 9 μL osnovne smeše reverzne transkriptaze (1 μL T7 Oligo (dT) Prajmer, 2 μL 10X pufera za prvi lanac, 4 μL dNTP smeše, 1 μL inhibitora RNaze i 1 μL ArrayScript) na 42 °C tokom 2 h. Ovo je bilo praćeno korakom sinteze drugog lanca kDNK, koji je obuhvatao dalju inkubaciju na 16 °C tokom 2 h sa 80 μL osnovne smeše za drugi lanac (63 μL vode bez nukleaze, 10 μL 10X pufera za drugi lanac.4 μL dNTP smeše, 2 μL DNK polimeraze i 1 μL RNase H). kDNK je bila prečišćena filtriranjem kroz kDNK filtersku patronu sa 250 μL pufera za vezivanje kDNK i ispiranjem sa 500 μL pufera za ispiranje koji je bio sadržan u kitu. Prečišćena kDNK je bila eluirana sa 20 μL vode bez nukleaze na 55 °C. Svaki uzorak kDNK je bio inkubiran sa 7.5 μL IVT osnovne smeše (2.5 μL T710X reakcionog pufera, 2.5 μL T7 smeše enzima i 2.5 μL biotin-NTP smeše) na 37 °C tokom 16 h. Reakcija je bila zaustavljena dodavanjem 75 μL vode bez nukleaze svakom uzorku kRNK. Biotinilovana, amplifikovana RNK je bila prečišćena filtriranjem uzoraka kRNK kroz kRNK filtersku patronu sa 350 μL pufera za vezivanje kRNK i 250 μL 100 % etanola pomešanih zajedno pre stavljanja na filtere. kRNK filterske patrone sa vezanom RNK su onda bile isprane sa 650 μL pufera za ispiranje pre eluiranja prečišćene kRNK sa 200 μL vode bez nukleaze na 55 °C.
[0323] Hibridizacija na Illumina perlama čipovima za ekspresiju. Uzorci kRNK su bili zagrejani na 65°C tokom 5 min, pa su sakupljeni impulsnim centrifugiranjem. Posle zagrevanja na 65 stepeni tokom 5 min, približno 750 ng kRNK uzorka je bilo alikvotirano u posebne epruvete u koje je bilo dodato ∼ 5 μL vode bez RNase i 10 μL Hyb smeše. Približno 15 μL pripremljene smeše kRNK je bilo stavljeno na Illumina perle čipove za ekspresiju. Sledeći koraci hibridizacije i ispiranja su bili izvedeni u skladu sa “Whole-Genome Gene Expression Direct Hybridization Assay Guide”, koji je obezbedila Illumina.
[0324] Humane HT-12 v4 ekspresione perle čipovi pokrivaju više od 47,000 transkripata i poznatih splajsnih varijanti humanog transkriptoma. Mišije Ref-8 v2.0 ekspresione perle čipovi pokrivaju približno 25,600 dobro-poznatih RefSeq (Referentna Sekvenca) transkripata, koji sadrže preko 19,000 jedinstvenih gena.
[0325] Analiza podataka. Perle čipovi su bile očitane pomoću iScan Sistema, pa su prenete sa GenomeStudio-m u GeneSpring GX v12.5 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Vrednosti ekspresije su bile normalizovane uz korišćenje četvrtinske normalizacije sa prethodno podešenim parametrima. Entiteti su bili isfiltrirani na osnovu detekcionog skora izračunatog sa GenomeStudio-m, gde je p ≤ 0.05 bilo smatrano značajnim.
Promene ekspresije gena relevantnih za zarastanje rana indukovane u humanim PBMCs pomoću Jedinjenja 1.
[0326] Humane periferne krvne mononuklearne ćelije (PBMCs) su bogate limfocitima i prekursorima makrofaga (monocitima) uključenim u proizvodnju citokina i enzima za remodelovanje tkiva relevantnih za proces zarastanja rana. Tabela 14 daje listu promena u ekspresiji gena indukovanih sa 30 ng/mL Jedinjenja 1 koje su bile >2 puta veće ili >2 puta manje od kontrole, netretiranih PBMCs, i za koje je bilo poznato da su povezani sa zarastanjem rana. Izlečenje rana je kompleksna, višestadijumska sekvenca u kojoj procesi, kao što su zapaljenje, treba da budu regulisani naniže. Zbog toga treba naglasiti da geni prikazani u Tabeli 14 ilustruju spektar relevantnih molekula koje reguliše Jedinjenje 1 u mešovitoj limfoidnoj populaciji in vitro, bez specifikacije redosleda ekspresije specifične za tkivo in vivo.
[0327] Geni su obuhvatali pro-upalne citokine (IL-1α, IL-1β i IL-6) uključene u zaštitu od infekcije, citokine koji vrše moderaciju upalne reakcije (IL-10 i IL-24), faktore rasta (GMCSF, CSF1 i HBEGF), i niz hemokina i matričnih metalopeptidaza za remodelovanje tkiva (zadnje pomenuto je olakšano regulacijom naniže TIMP2). Regulacija naniže THBS1, koja sprečava formiranje granulacionog tkiva, takođe je pozitivan faktor u izlečenju rana. Regulacija naviše KLF10 bi trebalo da olakša angiogenezu i indikator je indukcije TGF-β. Transglutaminaze (TGM) stabilizuju proteine tako što ih umrežavaju i imaju druge korisne efekte u zarastanju rana.
Tabela 14. Promene u ekspresiji gena relevantnih za poboljšanja rezultata zarastanja rana koje su indukovane u humanim PBMCs pomoću Jedinjenja 1
Promene ekspresije gena relevantnih za zarastanje rana indukovanih u mišijoj stromi sa humanim tumorskim ksenograftima pomoću Jedinjenja 1
[0328] Odlično zarastanje mesta tumora kod miševa i kućnih životinja, potvrđeno ponovnim uspostavljanjem rasta dlake i bojom dlake, kao i minimalnim stvaranjem ožiljaka su značajne karakteristike tretmana Jedinjenjem 1 pomoću intratumorske injekcije (Primeri 16 i 17). Zbog toga su bile testirane promene ekspresije gena relevantnih za zarastanje rana u stromi koja potiče od miša sa humanim tumorskim ksenograftima u ranim vremenskim trenucima posle injekcije, dok je tumor još uvek bio intaktan.
[0329] Podaci o ekspresiji uz korišćenje mišijih mikročipova specifičnih za gen su bili izvedeni za 2-3 individualna humana SK-Mel-28 ksenografta tretirana intratumorskom injekcijom sa 30 μg Jedinjenja 1, zajedno sa 3 mesta samo sa nosačem, pa su podaci kombinovani. Samo oni mišiji geni za koje je ekspresija na mestu tretiranom Jedinjenjem 1 bila >2 puta veća ili >2 puta manja nego na mestu gde je ubrizgan nosač su bili ispitani u pogledu relevantnosti za zarastanje rane.
[0330] Tabela 15 navodi gene izabrane na osnovu gornjih kriterijuma i sa poznatim vezama sa zarastanjem rana.
[0331] Više gena sa poznatim povoljnim rezultatima za zarastanje rana je bilo regulisano naviše za najmanje 2 puta pomoću Jedinjenja 1. Ovo su bili geni koji su uključeni u kontrakciju mišića (ACTA1), rast (EGR1), modulaciju zapaljenja (CXCL1), keratine za obnavljanje keratinocita (krt5, 10, 14, 15, 17, 71. krtdap), migraciju keratinocita (Col17a1), epidermalnu diferencijaciju i ćelijsku komunikaciju (lor, Tgm2, Itga7).
[0332] Jedan gen relevantan za zarastanje rana, ThrombospOndin 2 (Thbs2), je bio regulisan naniže. Regulacija naniže ovog gena je povezana sa povećanom vaskularnom gustinom i povećanjem fibronektina u ranim stadijumima zarastanja rana.
Tabela 15. Promene u ekspresiji gena relevantnih za poboljšanje rezultata zarastanja rana koje su indukovane u mišijoj stromi sa humanim tumorskim ksenograftima pomoću Jedinjenja 1
Primer 12: Efekat jedinjenja na produkciju citokina
[0333] Specifični citokini igraju kritične uloge u procesima zarastanja rana, a agensi koji modulišu ove supstance mogu biti korisni u lečenju rana i /ili poboljšanju estetskih rezultata lečenja (npr. mogu smanjiti stvaranje ožiljaka). Efekti Jedinjenja 1, 2, 5 i 42 na regulaciju četiri citokina (IL-1β, IL-6, IL-8 i TNFα) za koje je poznato da su kritični u ranim stadijumima procesa zarastanja rana su bili ispitivani u humanim perifernim krvnim mononuklearnim ćelijama (PBMCs).
[0334] PBMCs su bile izolovane pomoću FicolI-Paque sedimentacije heparinizovane krvi dobijene od 72-godišnjeg muškarca (Donor 1) i 34-godišnjeg muškarca (Donor 2) kao humanih donora. Sve ćelije su bile kultivisane u 10% FCS, RPMI, kao što je detaljno opisano ranije.
[0335] PBMCs su bile zasejane sa gustinom od 1.5x10<5>ćelija po bunarčiću u 10% FCS, RPMI. Stimulacija ovih ćelija sa četiri jedinjenja je bila izvršena u četiri koncentracije (0 ng/mL, 3 ng/mL.30 ng/mL, 300 ng/mL) u duplikatu tokom 24h u inkubatoru sa ovlaživanjem na 37°C, pod 5% CO2. Uzorci medijuma su bili uzeti iz svakog potrebnog bunarčića, pa su bili zamrznuti na -80°C sve do upotrebe.
[0336] “Cytometric Bead Array” (CBA) testovi su bili upotrebljeni za merenje rezultata. CBA testovi predstavljaju metod za hvatanje rastvorljivog analita ili seta analita uz korišćenje perli poznatih veličina i fluorescencije obloženih antitelom.
Onda je bila izvršena detekcija uz korišćenje sledećeg fluorescentno obeleženog sekundarnog antitela da bi se formirao kompleks u vidu sendviča. Svaki uzorak medijuma je bio testiran u pogledu prisustva rastvorljivih IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70 i TNFα uz korišćenje BD (Becton Dickinson) CBA kita za detekciju humanih zapaljenskih citokina (engl. Human Inflammatory Cytokine Detection Kit) u skladu sa instrukcijama proizvođača. Srednje vrednosti intenziteta fluorescencije za svaki uzorak su bile upoređene sa standardnom krivom da bi se odredile koncentracije citokina (pg/mL).
[0337] Rezultati CBA testa za svako jedinjenje su prikazani u Tabeli 16.
[0338] Sva četiri jedinjenja su znatno povećala nivoe četiri citokina (TNFα, IL-1β, IL-6, IL-8) koji su bili detektovani u testiranim supernatantima od tretiranih PBMCs, uz konzistentne trendove između PBMCs od dva donora. Generalno, najviši nivoi citokina su se pojavili za dve najveće koncentracije (30 i 300 ng/mL) jedinjenja.
Primeri in vivo aktivnosti
Primer 13: Akutna upalna reakcija u mišijoj koži
[0339] Akutna upalna reakcija je važna početna faza procesa zarastanja rana. Prozapaljenske ćelije, a prvenstveno neutrofili i makrofagi, migriraju do tog mesta i štite ga od infekcije i oslobađaju citokine i hemokine uključene u inicijaciju i regulaciju sledstvenog oporavka tkiva.
[0340] Mužjacima bezdlakih miševa u svaki bok je bilo subkutano ubrizgano po 50 μL rastvora od 100 μg/mL jedinjenja 1, 2, 5 i 42, respektivno, u 20% propilen glikola. Svako mesto je pocrvenelo u roku od 4 h, a za 24 h pogoπena povr ina pokrila je ko u u preθniku od pribli no 1 cm. Tokom sledeζih 6 dana formirala se krasta, a za 14 dana mesto je bilo u potpunosti izleθeno uz minimalnu pojavu o iljaka.
[0341] Akutna upalna reakcija inicirana jedinjenjima u koži, koja je praćena brzim izlečenjem, konzistentna je sa uočenim direktnim efektima jedinjenja na pro-upalne ćelije (Primeri 7 i 9) i na ekspresiju gena i profile citokina u PBMCs (Primeri 11 i 12). Takva robusna, ali prolazna pro-upalna reakcija je često bila praćena dobrim rezultatom zarastanja rana in vivo.
Primer 14: Formulacija gela sa Jedinjenjem 1
[0342] 30 mg ili 50 mg Jedinjenja 1 (>97% čistoće određeno pomoću HPLC) je bilo rastvoreno u 5 mL 99.5% izopropil alkohola (Biotech Pharmaceuticals) i ostavljeno je da stoji preko noći. Kao gelirajući agens je bio pripremljen rastvor od 0.6% Carbomer-a 940 (Snowdrift Farms) u 5mL sterilne vode. Koncentrat Jedinjenja 1 i rastvor od 0.6% Carbomer-a 940 su zatim bili zajedno dodati u špric od 20 mL i pažljivo su pomešani. Onda je bilo dodato 20 μL 100% trietanolamina (Sigma-Aldrich), pa je brzo mešano. Rezultujući gel Jedinjenja 1 je onda bio raspodeljen u pojedinačne špriceve za insulin od 1 mL da bi se proizvele doze od 3 mg Jedinjenja 1/mL i 5 mg Jedinjenja 1/mL.
Primer 15: Injektabilna formulacija Jedinjenja 1
[0343] 20mg Jedinjenja 1 (>97% čistoće, određeno pomoću HPLC) je bilo rastvoreno u 8 mL 1.2 propandiola (Sigma-Aldrich) u scintilacionoj bočici od kapacitetnog stakla od 20 mL, pa je ostavljeno da stoji preko noći na sobnoj temperaturi. Onda je rastvoru bilo dodato 12 mL 30 mM acetatnog pufera sa pH 4.2 ili slanog rastvora (natrijum hlorid za injekcije BP 0.9% - AstraZeneca) i pažljivo je pomešano. Onda je rastvor bio sterilizovan filtriranjem, pa je raspodeljen u doze od 1 mL sa koncentracijom Jedinjenja 1 od 1 mg/mL.
Primer 16: Veterinarski klinički tretman nezarastajućih rana i rana koje ne reaguju na aktuelne standarde nege
[0344] Jedinjenje 1 je bilo upotrebljeno za tretiranje radi izlečenja teških rana kod 10 kućnih životinja (tj. privatnih vlasnika i o kojima je vođeno računa) sa ciljem poboljšanja druge namene zarastanja rane.
[0345] Sedam pasa (Canis lupus familiaris) i jedan kengur penjač (Dendrolagus lumholtzii) sa hroničnim, nezarastajućim ranama koje nisu reagovale na aktuelne veterinarske standarde nege za ove indikacije bile su tretirane Jedinjenjem 1 od strane nezavisnih veterinara. Drugi kengur penjač i spektakularna leteća lisica (Pteropus conspicillatus) sa ranama koje nisu bile podesne za inicijalni tretman aktuelnim standardima nege takođe su bili tretirani Jedinjenjem 1. Svi slučajevi su bili tretirani kao otvorene rane bez upotrebe zavoja za rane ili drugog zavojnog materijala u toku tretmana Jedinjenjem 1 i u pratećem periodu do izlečenja rana. Osim ako nije drugačije navedeno, u pojedinačnim studijama slučajeva, nisu bili upotrebljeni prateći lekovi u toku tretmana Jedinjenjem 1.
[0346] Beleške o slučajevima i tretmanu za svakog od ovih pacijenata su ukratko prezentovane dole. Treba naglasiti da su povratne prezentacije o ovim životinjama od strane veterinara koji su ih tretirali bile često u nepravilnim intervalima i da su se rezultati zarastanja rana mogli pojaviti znatno pre vizita za povratnu procenu.
[0347] Tretman Jedinjenjem 1 rezultovao je efektivnim izlečenjem rana uz minimalno stvaranje ožiljaka u osam okončanih slučajeva. Izlečenje rana je dobro napredovalo u dve tekuće studije slučajeva koje su bile najskorije tretirane (Studije slučajeva 8 i 10).
Studije slučajeva 1 do 8: Nezarastajuće rane
Studija slučaja 1: Nezarastajuća duboka nekrotizirajuća rana na licu, 3-godišnji bernski planinski pas
[0348] Beleške o slučaju:
• Velika, ovalno oblikovana rana na licu, 7cm duga x 4cm široka x do 2cm duboka na levoj strani njuške pacijenta.
• Rana je imala krastu sa delovima sa nekrotičnim pustulantnim odlivom.
• Histopatologija: duboka nekrotizirajuća povreda verovatno povezana sa ujedom pauka i karakterisana prisustvom bakterija koka i gnojnim zapaljenjem.
• Rana nije reagovala na standardne protokole za tretiranje rana, uključujući antibiotike (cefaleksin, amoksiklav, gentamicin) i protiv-zapaljenske lekove (makrolon) u toku perioda od 3 meseca.
• Rana se postepeno povećavala po veličini, izazivajući zatvaranje oka i znatno utičući na vid pacijenta i njegovo generalno ponašanje. Pacijentovi mandibularni limfni čvorovi su postali uvećani.
• Preostala opcija standardne nege je bila agresivna facijalna hirurška intervencija i rekonstrukcija.
• Inicijalni tretman je obuhvatio 5 nanošenja (ukupno 5.3mL) gela sa Jedinjenjem 1 (3 mg/mL) tokom inicijalnog perioda od 14 dana (Jedinjenje 1 je naneto u dane 1, 2, 6, 10 i 14).
• Posle delimičnog izlečenja rane posle 28 dana, pacijent je bio tretiran sa jednom dozom od 1 mL Jedinjenja 1 (0.5 mg/mL) ubrizganog neposredno ispod površine na više lokacija u oblasti rane.
• 35 dana posle injekcije sa Jedinjenjem 1 rana se popunila zdravim diferencirajućim granulacionim tkivom i nije bilo znakova infekcije.
• Prateći lekovi tokom tretmana Jedinjenjem 1 su bili temgesik i lignokain u vreme prvog tretmana sa formulacijom gela, temgesik i tramadol u vreme i na dan neposredno posle tretmana injekcijom (tj. dani 28 i 29), a zatim zaštitno pokrivanje oralnim kortikosteroidom u maloj dozi (makrolon) svakodnevno od dana 42.
• 76 dana posle finalnog tretmana rana je zarasla i popunila se normalnim tkivom uz minimalno stvaranje ožiljaka, a takođe je ponovo izrasla dlaka pokrivajući više od 95% originalne oblasti rane.
Studija slučaja 2: Prsla, inficirana abdominalna cista, 13-godišnji bokser
[0349] Beleške o slučaju:
• Slab pacijent sa ozbiljnim osteoartritisom, smatralo se da ima visok anestetički rizik za bilo kakvu hiruršku intervenciju.
• Pacijent je imao perzistentnu inficiranu cistu na leđima u blizini repa koja nije reagovala na redovnu drenažu i injekciju sa antibioticima (gentamicin, enrofloksacin, norocilin) u cistu tokom perioda od 5 meseci.
• Pacijent je prezentovan sa prslom cistom i povišenom temperaturom. Cista je bila očišćena da bi se uklonila mrtva koža, a onda je isprana slanim rastvorom i hlorheksidenom. Pacijent je lečen antibioticima (klindamicin i norocilin) i protivzapaljenskim lekovima (metakam).
• Posle 5 dana rana povezana sa prslom cistom nije pokazivala znake izlečenja i bila je okružena znatnim lokalnim zapaljenjem. Izložena oblast rane (približno 5cm duga x 3 cm široka, do 2.5cm duboka) je onda bila isprana slanim rastvorom, pa je preko oblasti rane ravnomerno naneto 0.5 mL gela sa Jedinjenjem 1 (3 mg/mL).
• 5 dana posle tretmana sa gelom sa Jedinjenjem 1 rana se značajno kontrahovala na manje od 30% površine originalne rane (približne dimenzije 3cm duga x 1.5cm široka x 1cm duboka) i sadržala je zdravo granulaciono tkivo.
• Posle 30 dana rana je bila izlečena, sa normalnim tkivom i više od 70% ponovnog rasta dlake u oblasti originalne rane.
• Prateći lek za ovog pacijenta u toku tretmana Jedinjenjem I je bio injektabilni nesteroidni protiv-zapaljenski lek (metakam) u vreme tretmana.
Studija slučaja 3: Nezarastajuće inficirane probojne rane, 11-godišnji čau-čau
[0350] Beleške o slučaju:
• Pacijent je prezentovan sa dve velike rane od ujeda (svaka približno 4cm duga x 1.5cm široka x 2cm duboka) na zadnjici usled borbe pasa.
• Rane su bile isprane, pa je pacijent lečen antibioticima (amoksiklav tablete i injektabilni norocilin)
• Posle 8 dana rane su bile perzistentne, nisu se zatvarale i bile su inficirane. • Rane su bile očišćene, pa je na svaku ranu bilo ravnomerno naneto 0.4 mL gela sa Jedinjenjem 1 (3 mg/mL).
• 15 dana posle tretmana Jedinjenjem 1 rane su se značajno kontrahovale na manje od 40% njihove originalne veličine, formirale su se kraste i nije bilo znakova infekcije.
• 46 dana posle tretmana Jedinjenjem 1 rane su bile potpuno izlečene sa normalnim tkivom, bez stvaranja ožiljaka i sa potpunim ponovnim rastom dlake u oblasti rana.
• Kod ovog pacijenta nije bilo pratećih lekova tokom tretmana Jedinjenjem 1.
Studija slučaja 4: Nezarastajuće inficirane rane na licu i metatarzalno kod psa (11-godišnji bokser)
[0351] Beleške o slučaju:
• Pacijent je prezentovan sa dve površine sa nezarastajućim inficiranim i zapaljenim ranama, jednom sa leve strane lica i jednom levo pozadi metatarzalno, koje nisu reagovale na produženu 8-nedeljnu terapiju antibioticima (cefaleksin, doksiciklin) i kortikosteroidima (makrolon).
• Bio je primenjen samo jedan tretman sa formulacijom gela sa Jedinjenjem 1 od 5 mg/mL koji je nanet na ranu na licu (0.4 mL) i na ranu na nozi (0.6 mL).
• Rana na licu je brzo reagovala na tretman Jedinjenjem 1 malom krastom prisutnom posle 7 dana i potpunim zatvaranjem rane, uključujući značajan ponovni rast dlake koji je bio evidentan 14 dana posle tretmana. Oblast rane je bila potpuno izlečena 63 dana posle tretmana.
• Rana na nozi je takođe brzo reagovala krastom koja je bila prisutna u lokalizovanim oblastima. Posle 14 dana veći deo kraste je otpao i ispod toga je bilo uočeno zdravo granulaciono tkivo. Oblast rane je bila potpuno zatvorena i 63 dana posle tretmana imala je pokrivenost dlakom veću od 95%.
• Prateći lekovi za ovog pacijenta u toku tretmana Jedinjenjem 1 od početka terapije su bili kortikosteroidi u malim dozama (makrolon) za tretman sindroma psećeg atopičnog dermatitisa.
Studija slučaja 5: Nezarastajuća inficirana rana na uhu psa (4-godišnji bul arab)
[0352] Beleške o slučaju:
• Pacijent je prezentovan sa nezarastajućom laceracijom zbog incidenta u lovu koji je bio prisutan na levom uhu duže od 6 nedelja.
• Tri tretmana, svaki sa 0.1 mL formulacije gela sa Jedinjenjem 1 od 5 mg/mL, bila su naneta na zahvaćenu oblast u intervalima od 8 dana. U toku tretmana pacijenta sa Jedinjenjem 1 nisu bili korišćeni prateći lekovi.
• 41 dan posle prvog tretmana Jedinjenjem 1 rana se potpuno zatvorila. Sledeća procena 152 dana posle inicijalnog tretmana je pokazala potpuno izlečenje rane, minimalno stvaranje ožiljaka sa više od 80% pokrivenosti dlakom originalnog mesta rane.
Studija slučaja 6: Nezarastajuća inficirana rana na uhu psa (11-godišnji bokser)
[0353] Beleške o slučaju:
• Pacijent je prezentovan sa nezarastajućom (inficiranom i zapaljenom) otvorenom ranom na gornjem delu levog uha i bio je lečen 10 nedelja prema standardnim protokolima za negu, uključujući redovno nanošenje (i) topičke dermatološke formulacije (Neotopik) kombinovane sa antibakterijskim (neomicin sulfat), antizapaljenskim (hidrokortizon) i anti-pruritskim (lignokain) agensom, i (b) komercijalne suspenzije (Aurakol) sa protiv-zapaljenskim (prednizolon), antigljivičnim (mikonazol nitrat) i antibakterijskim (polimiksin B sulfat) komponentama. Pre ovih tretmana pacijent je bio pod terapijom oralnim kortikosteroidima u maloj dozi (makrolon) radi lečenja sindroma hroničnog psećeg atopičnog dermatitisa.
• Posle 10 nedelja standardnog protokola za negu nije bilo znakova izlečenja rane.
• Bio je primenjen samo jedan tretman od 3 mL sa formulacijom gela sa Jedinjenjem 1 od 5 mg/mL na pogođenu oblast, a u roku od 15 minuta od nanošenja Jedinjenja 1 bilo je uočljivo crvenilo tretirane oblasti.
• 4 dana posle tretmana Jedinjenjem 1 pacijentu je preporučena mala dnevna doza kortikosteroida (makrolon) za lečenje ozbiljnog atopičnog dermatitisa. Ovaj tretman je nastavljen tokom celog toka zarastanja i izlečenja rane.
• 17 dana posle tretmana Jedinjenjem 1 nije bilo znaka infekcije ili zapaljenja i na tretiranom mestu se razvilo dobro granulisano dno rane.
• 83 dana posle tretmana postojalo je potpuno zatvaranje rane i došlo je do ponovnog rasta dlake na više od 90% originalne oblasti rane.
• 139 dana posle tretmana nije bilo moguće uočiti mesto originalne rane, nije bilo dokaza stvaranja ožiljaka i ili razlika u pigmentaciji kože ili očitoj debljini između tretirane oblasti i njenog okruženja.
Studija slučaja 7: Nezarastajuće inficirane rane na ušima i licu psa (8-godišnji Džek Rasel terijer)
[0354] Beleške o slučaju:
• Pacijent je prezentovan sa dve nezarastajuće rane na vrhu i korenu desnog uha i nezarastajućom ranom na njuški čije prisustvo je vlasnik uočio pre više od 4 nedelje. Moguće poreklo su bili inficirani ujedi pauka ili drugog insekta.
• Dva tretmana, svaki sa 0.1 mL formulacije gela sa Jedinjenjem 1 od 5 mg/mL, su bila primenjena na obe pogođene oblasti na ušima sa intervalom od 5 dana. Na facijalnu leziju je bio primenjen samo jedan tretman od 0.1 mL formulacije gela sa Jedinjenjem 1 od 5mg/mL.
• 13 dana posle prvog tretmana Jedinjenjem 1 obe rane na uhu su se znatno kontrahovale i imale su formirane kraste. Posle 29 dana rana se potpuno zatvorila i bila je potpuno pokrivena dlakom.
• 16 dana posle tretmana, rana na njuški je bila potpuno izlečena.
• Prateći lekovi za ovog pacijenta su bili terapija od 5 dana sa oralnim antibioticima amoksicilinom i klavulanskom kiselinom (amoksiklav) u vreme inicijalnog tretmana.
Studija slučaja 8: Inficirana koštana rana na nozi kengura penjača (Marsupialia, Dendrolagus lumholtzi)
[0355] Beleške o slučaju:
• Pacijent je prezentovan kao divlji kengur penjač koji je povređen u napadu psa koji je rezultovao lakrosakralnom luksacijom i osteomijelitisom. Pacijent je bio lečen 1 mesec injektabilnim antibioticima ceftazidimom (Fortum) i trimetoprim sulfametoksazolom (TMS). Mada je zapaljenje bilo smanjeno, bakterijski bris je otkrio da su još uvek bile prisutne Gram negativne bakterije i Serratia marcesens. Pogođeni ud nije bio sposoban za nošenje težine.
• Tretman ceftazidimom tokom još 2 nedelje nije rezultovao poboljšanjem stanja i veterinar je imao lošu prognozu u pogledu čišćenja infekcije iz kosti i verovatnog značajnog mehaničkog remećenja strukture kosti, koje bi u budućnosti dovelo do hromosti. Novi bakterijski bris koji je bio uzet iz sinusnog odliva na skočnom zglobu i stopalu otkrio je u to vreme pomešane anaerobne vrste i Gram pozitivne Actinomyces vrste, tako da je bila data jedna spora IV infuzija natrijum jodida (Sodid).
• Zbog nedostatka reakcije na druge tretmane i sveukupno loše prognoze sa ovim standardima nege, 2 nedelje kasnije započeo je tretman spasavanja koji je obuhvatao 4 nanošenja 5 mg/mL formulacije gela sa Jedinjenjem 1.
• Za prvo nanošenje je bilo naneto 0.1 mL gela sa Jedinjenjem 1 na svaku od tri lezije na desnom skočnom zglobu (jedna iznad članka, jedna ispod stopala i mala lezija na osnovi pete) i počela je spora IV infuzija natrijum jodida. U roku od 10 minuta od nanošenja gela sa Jedinjenjem 1 iz tretirane oblasti pojavio se purulentni odliv.
• Pri prezentaciji 8 dana posle prvog tretmana purulentni odliv je curio iz 2 od 3 rane na nozi. Preostala rana (najmanja lezija na peti) se kontrahovala i počela je da zarasta. Sledeći tretman sa 0.15 mL formulacije gela Jedinjenja 1 od 5 mg/mL je bio upotrebljen za lečenje svake od dve otvorene rane (jedne iznad skočnog zgloba, druge na osnovi stopala). Takođe je bila data spora IV infuzija natrijum jodida.
• Sledećih 15 dana kasnije (23 dana posle inicijalnog tretmana) nekoliko mL gustog purulentnog gnoja je bilo istisnuto iz rane na stopalu pre utiskivanja 0.15 mL formulacije gela Jedinjenja 1 od 5 mg/mL u drenirani sinus rane.
• Nedelju dana kasnije došlo je do značajnog poboljšanja infekcije. Iz otvora u stopalu je bio odstranjen mali komad kosti. Gnoj nije bio uočljiv, ali je bilo seroznog odliva. Još 0.2 mL gela sa Jedinjenjem 1 je bilo naneto na svaku od lezija, jednu na skočnom zglobu i drugu ispod stopala. Takođe je data spora IV infuzija natrijum jodida. Ud je sada bio sposoban za nošenje težine, ali su peta i stopalo bilo još uvek veoma kruti, sa zapaljenjem i kretanje životinje je bilo veoma neravnomerno i jako se oslanjalo na nepovređenu zadnju nogu životinje.
• Sledećih 15 dana kasnije rana iznad skočnog zgloba se potpuno zatvorila i dlaka je ponovo počela da raste. Rana na peti stopala se kontrahovala na manje od 50% svoje veličine prilikom prethodne vizite, a okolna koža i tkivo su bili meki, savitljivi i normalni. Ud je sada bio u potpunosti sposoban za nošenje težine i nije bilo neravnomernosti pri kretanju životinje.
• Osim injektabilnog natrijum jodida, nikakvi drugi prateći lekovi nisu bili davani pacijentu u toku tretmana Jedinjenjem 1.
Studije slučajeva teških rana koje nisu bile podesne za aktuelne standarde nege
Studija slučaja 9: Infektivni vaskulitis u uhu kengura penjača (Marsupialia, Dendrolagus lumholtzi)
[0356] Beleške o slučaju:
• Pacijent je prezentovan kao mlada povređena životinja pronađena u divljini. • Pacijent je bio veoma slab, dehidriran i anemičan. U uzorku urina su otkriveni krv i bakterijska infekcija, verovatno septikemija. Pacijent je bio stavljen na terapiju fluidom i lečen je lekom protiv mučnine maropitant citratom (cerenia) i dvema injektabilnim antibiotskim formulacijama Tribakteralom (trimetoprim, sulfadiazin) i ceftazidimom (fortum).
• Posle 9 dana uz ukapavanje fluida pacijentovo stanje se poboljšalo, ali je postojala trauma kod desnog uveta i verovatno infektivni vaskulitis i gangrena.
Hirurška intervencija nije bila moguća zbog značajnog anestetičkog rizika usled pacijentovog veoma kompromitovanog stanja. Umesto toga započet je tretman sa formulacijom gela sa Jedinjenjem 1.
• Tri tretmana sa 0.1 mL gela sa Jedinjenjem 1 jačine od 5 mg/mL su bila primenjena na pogođenu oblast u intervalima od 7 dana. Jedini prateći lek u toku ovog vremenskog perioda je bio cefalosporinski antibiotik ceftazidim (fortum). • 7 dana posle prvog tretmana gelom sa Jedinjenjem 1, čvrsto prianjajuća krasta je pokrila površinu rane. Ova krasta se podigla posle 10 dana otkrivajući dobro razvijenu, ružičastu granulisanu osnovu.
• U vreme trećeg i finalnog tretmana primenjenog 14 dana posle inicijalnog tretmana oblast rane se smanjila za približno 50%, a posle 25 dana zdravo tkivo je bilo prisutno duž cele oblasti rane.
• Posle 67 dana lezija je bila potpuno izlečena i postojala je potpuna pokrivenost uha dlakom.
Studija slučaja 10: Ozbiljno lacerirana rana na glavi spektakularne leteće lisice (Mammalia, Pteropus conspicillaltus)
[0357] Beleške o slučaju:
• Pacijent je prezentovan kao 4 meseca stara leteća lisica sa dubokom penetrirajućom ranom na glavi 4 meseca stare leteće lisice izazvanoj zaplitanjem u bodljikavu žicu.
• Po mišljenju ordinirajućeg veterinara koji je imao veliko iskustvo sa povredama kod divljih životinja (uključujući leteće lisice) normalni tretmani standardne nege bi verovatno bilo veoma problematični dovodeći do gubitka oblika desnog oka i nemogućnosti njegovog zatvaranja, bilo zbog formiranja viška ožiljnog tkiva povezanog sa hirurškom intervencijom ili zbog obima granulacije u slučaju stavljanja zavoja za zarastanje rana.
• Jedinjenje 1 je bilo naneto na ranu putem 3 primene po 0.1 mL formulacije gela od 5 mg/mL tokom perioda od 28 dana (dani 1, 10 i 28). Nikakvi drugi prateći lekovi ili intervencije nisu bili primenjeni u toku tretmana.
• 14 dana posle inicijalnog tretmana postojalo je značajno popunjavanje tkiva i remodelovanje, a posle 28 dana oko je moglo da se potpuno zatvori. Posle 38 dana krasta je pokrivala celu oblast rane i ona je počela da otpada posle 49 dana otkrivajući dobru granulacionu osnovu.
• 55 dana posle inicijalnog tretmana postojalo je dobro popunjavanje tkiva duž cele oblasti originalne rane, a desno oko se vratilo u svoj originalni položaj. Bila je prisutna veoma zdrava granulacija.
Primer 17: Izlečenje i estetski izgled rana generisanih posle nekroze i otpadanja spontanih tumora kod kućnih životinja tretiranih sa Jedinjenjem 1
[0358] Veterinarski klinički podaci u vezi brzine izlečenja rana koje su se formirale posle nekroze i otpadanja spontanih tumora koji su bili tretirani intratumorskom injekcijom Jedinjenja 1 (30% 1,2 propandiolska formulacija sa koncentracijom od 0.5 ili 1.0 mg/mL) kod dvadeset četiri kućne životinje su prikazani u Tabeli 17.
[0359] Napominje se da su sve rane bile tretirane kao otvorene rane i ni u jednom od ovih slučajeva nisu bili korišćeni zavoji, premazi, losioni ili prateći lekovi.
Tabela 17: Veličina rane i brzina izlečenja (vreme do zatvaranja) kod kućnih životinja praćene otpadanjem spontanih tumora koji su bili tretirani injektabilnom formulacijom Jedinjenja 1.
[0360] Podaci iz ovih slučajeva takođe pokazuju dobre estetske rezultate za izlečenje rana uz minimalno stvaranje ožiljaka i normalan ponovni rast dlake kod većine pacijenata (Tabela 18). U nekoliko slučajeva gde je došlo do pojave ožiljaka, oni su se obično podudarali sa oblastima gde je koža normalno tanka (npr. na udovima konja i pasa).
Tabela 18: Odlike tkiva, kože i dlake na mestima zaraslih rana kod kućnih životinja posle otpadanja spontanih tumora koji su bili tretirani injektabilnom formulacijom Jedinjenja 1.

Claims (20)

  1. Patentni zahtevi 1. 5,6- ili 6,7-epoksi-tigliansko jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za primenu u poboljšanju zarastanja rana; pri čemu je 5,6- ili 6,7-epoksi-tigliansko jedinjenje jedinjenje formule (I):
    pri čemu R1 je vodonik i R2 je -OR17; ili R1 i R2 zajedno obrazuju karbonil grupu (=O); R3 je vodonik ili C1-6alkil; R4 i R5 su nezavisno vodonik ili -OR17; ili R4 i R5 zajedno obrazuju dvostruku vezu ili epoksid(-O-); R6 je vodonik ili C1-6alkil; R7 je -OH ili -OR18; R8 je -OH ili -OR18; pod uslovom da i R7 i R8 nisu OH; R9 i R10 su nezavisno izabrani između vodonika i C1-6alkila; R11 i R12 ili R12 i R13 zajedno obrazuju epoksid i preostala od grupa R11 i R13 je vodonik, -OH ili -OR17 R14 je vodonik ili -R17; R15 je vodonik ili -R17; R16 je vodonik ili -R17; R17 je vodonik, -C1-6alkil, -C2-6alkenil, -C2-6alkinil, -C(O)C1-6alkil, -C(O)C2-6alkenil ili -C(O)C2-6alkinil; R18 je C1-20alkil, -C2-20alkenil, -C2-20alkinil, -C(O)C1-20alkil, -C(O)C2-20alkenil, -C(O)C2-20alkinil, -C(O)cikloalkil, -C(O)C1-10alkilcikloalkil; -C(O)C2- 10alkenilcikloalkil, -C(O)C2-10alkinilcikloalkil, -C(O)aril, -C(O)C1-10alkilaril, -C(O)C2- 10alkenilaril, -C(O)C2-10alkinilaril, -C(O)C1-10alkilC(O)R19, -C(O)C2- 10alkenilC(O)R19, -C(O)C2-10alkinilC(O)R19, -C(O)C1-10alkilCH(OR19)(OR19), -C(O)C2-10alkenilCH(OR19)(OR19), -C(O)C2-10alkinilCH(OR19)(OR19), -C(O)C1- 10alkilSR19, -C(O)C2-10alkenilSR19, -C(O)C2-10alkinilSR19, -C(O)C1- 10alkilC(O)OR19, -C(O)C2-10alkenilC(O)OR19, -C(O)C2-10alkinilC(O)OR19, -C(O)C1- 10alkilC(O)SR19, -C(O)C2-10alkenilC(O)SR19, -C(O)C2-10alkinilC(O)SR19,
    ili
    i R19 je vodonik, -C1-10alkil, -C2-10alkenil, -C2-10alkinil, cikloalkil ili aril; pri čemu je svaka alkil, alkenil, alkinil, cikloalkil ili aril grupa opciono zamenjena; ili geometrijski izomer ili stereoizomer ili njihova farmaceutski prihvatljiva so.
  2. 2. Epoksi-tigliansko jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za primenu prema zahtevu 1, pri čemu poboljšanje zarastanja rana obuhvata povećanje brzine zarastanja rana, smanjenje stvaranja ožiljaka u tkivu rane ili oba i povećanje brzine zarastanja rana i smanjenja stvaranja ožiljaka u tkivu rane.
  3. 3. Epoksi-tigliansko jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za primenu prema zahtevu 1 ili zahtevu 2 pri čemu poboljšanje zarastanja rane obuhvata poboljšanje estetskog izgleda zarasle rane.
  4. 4. Epoksi-tigliansko jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za primenu prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri čemu je rana hronična rana, akutna rana ili postojeća rana.
  5. 5. Epoksi-tigliansko jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za primenu prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu epoksi-tigliansko jedinjenje ima oblik biljnog ekstrakta, pri čemu se biljni ekstrakt naročito može dobiti iz biljke koja je iz vrste Fontainea ili vrste Hylandia.
  6. 6. Epoksi-tigliansko jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za primenu prema bilo kom od zahteva 1 do 5, pri čemu je epoksi-tigliansko jedinjenje formule (I) jedinjenje formule (II):
    pri čemu su R3, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13 i R15 kao što su definisani za formulu (I), a naročito tamo gde je jedinjenje formule (I) ili (II) jedinjenje formule (III):
    pri čemu su R7, R8, R11, R12, R13 i R15 kao što su definisani za formulu (I).
  7. 7. Epoksi-tigliansko jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za primenu prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri čemu je R1 vodonik i R2 je OH ili -OC(O)C1-6alkil, -OC(O)C2-6alkenil ili -OC(O)C2-6alkinil, ili R1 i R2 zajedno obrazuju karbonil grupu.
  8. 8. Epoksi-tigliansko jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za primenu prema bilo kom od zahteva 1 do 7, pri čemu je R3 vodonik ili -C1-3alkil.
  9. 9. Epoksi-tigliansko jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za primenu prema bilo kom od zahteva 1 do 8, pri čemu su R4 i R5 nezavisno vodonik ili -OH, -OC(O)C1-6alkil, -OC(O)C2-6alkenil ili -OC(O)C2-6alkinil ili R4 i R5 zajedno obrazuju dvostruku vezu ili epoksid.
  10. 10. Epoksi-tigliansko jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za primenu prema bilo kom od zahteva 1 do 9, pri čemu je R6 vodonik ili -C1-3alkil.
  11. 11. Epoksi-tigliansko jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za primenu prema bilo kom od zahteva 1 do 10, pri čemu je R7 -OH, -OC(O)C1-15alkil, -OC(O)C2-15alkenil, -OC(O)C2-15alkinil, -OC(O)aril, pri čemu je aril grupa opciono zamenjena, -OC(O)C1-15alkilaril, -OC(O)C1-10alkilC(O)H, -OC(O)C2 10alkenilC(O)H, -OC(O)C1-10alkilC(O)C1-6alkil, -OC(O)C2-10alkenilC(O)C1-6alkil, -OC(O)C1-10alkilCH(OC1-3alkil)(OC1-3alkil), -OC(O)C2-10alkenilCH(OC1-3alkil)(OC1- 3alkil), -OC(O)C1-10alkilSC1-6alkil, -OC(O)C2-10alkenilSC1-6alkil, -OC(O)C1- 10alkilC(O)OC1-6alkil ili -OC(O)C2-10alkilC(O)OC1-6alkil.
  12. 12. Epoksi-tigliansko jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za primenu prema bilo kom od zahteva 1 do 11, pri čemu je R8 -OC(O)C1-15alkil, -OC(O)C2- 15alkenil, -OC(O)C2-15alkinil ili -C(O)aril, pri čemu je aril grupa opciono zamenjena.
  13. 13. Epoksi-tigliansko jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za primenu prema bilo kom od zahteva 1 do 12, pri čemu su R9 i R10 nezavisno -C1-3alkil.
  14. 14. Epoksi-tigliansko jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za primenu prema bilo kom od zahteva 1 do 13, pri čemu R11 i R12 obrazuju epoksid i R13 je -OH, -OC(O)C1-6alkil, -OC(O)C2-6alkenil ili -OC(O)C2-6alkinil ili gde R12 i R13 obrazuju epoksid i R11 je -OH, -OC(O)C1-6alkil, -OC(O)C2-6alkenil ili -OC(O)C2- 6alkinil.
  15. 15. Epoksi-tigliansko jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za primenu prema bilo kom od zahteva 1 do 14, pri čemu je R15 vodonik, -C(O)C1-6alkil, -C(O)C2-6alkenil ili -C(O)C2-6alkinil.
  16. 16. 5,6- ili 6,7-epoksi-tigliansko jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za primenu i prevenciji stvaranja prevelikog ožiljka, a naročito tamo gde je preveliki ožiljak keloid ili hipertrofirani ožiljak; pri čemu je 5,6- ili 6,7-epoksitigliansko jedinjenje izabrano između sledećih: 12-tigloil-13-butanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 21); 12-(3-butenoil)-13-nonanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 22); 12-benzoil-13-(2-metilbutanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 23); 12,13-dibutanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 27) 12-benzoil-13-butanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 28); 12,13-di-nonoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 41); 12,13-di-heksanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 42); 12,13-di-pentanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 43); 12,13-di-tigloil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 44) 5,20-di-acetil-12-tigloil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 45); 12,13-di-(2E,4E)-heks-2,4-enoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 46); 12-heksanoil-13-[2-(N-metilantraniloil)]-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 47) 12-acetil-13-[2-(N-metilantraniloil)]-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 48); 12,13-di-heptanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 49); 12-miristoil-13-acetil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 50); 12-miristoil-13(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 51); 12-(2-metilbutanoil)-13-acetil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 52); i 12-hidroksi-13-heksanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 53); 12, 13-di-(3-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 60) ili njihova farmaceutski prihvatljiva so. 17. 5,6- ili 6,7-epoksi-tigliansko jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za primenu u metodima lečenja, pri čemu metod lečenja obuhvata smanjenje ožiljka izazvanog zarastanjem rane smanjenjem promena u pigmentaciji kože i/ili poboljšanju ponovnog rasta dlake; pri čemu 5,6- ili 6,7-epoksi-tigliansko jedinjenje je jedinjenje formule (I):
    pri čemu R1 je vodonik i R2 je -OR17; ili R1 i R2 zajedno obrazuju karbonil grupu (=O); R3 je vodonik ili C1-6alkil; R4 i R5 su nezavisno vodonik ili -OR17; ili R4 i R5 zajedno obrazuju dvostruku vezu ili epoksid(-O-); R6 je vodonik ili C1-6alkil; R7 je -OH ili -OR18; R8 je -OH ili -OR18; pod uslovom da i R7 i R8 nisu OH; R9 i R10 su nezavisno izabrani između vodonika i C1-6alkila; R11 i R12 ili R12 i R13 zajedno obrazuju epoksid i preostala od grupa R11 i R13 je vodonik, -OH ili -OR
  17. 17 R14 je vodonik ili -R17; R15 je vodonik ili -R17; R16 je vodonik ili -R17; R17 je vodonik, -C1-6alkil, -C2-6alkenil, -C2-6alkinil, -C(O)C1-6alkil, -C(O)C2- 6alkenil ili -C(O)C2-6alkinil; R18 je C1-20alkil, -C2-20alkenil, -C2-20alkinil, -C(O)C1-20alkil, -C(O)C2-20alkenil, -C(O)C2-20alkinil, -C(O)cikloalkil, -C(O)C1-10alkilcikloalkil; -C(O)C2- 10alkenilcikloalkil, -C(O)C2-10alkinilcikloalkil, -C(O)aril, -C(O)C1-10alkilaril, -C(O)C2-10alkenilaril, -C(O)C2-10alkinilaril, -C(O)C1-10alkilC(O)R19, -C(O)C2- 10alkenilC(O)R19, -C(O)C2-10alkinilC(O)R19, -C(O)C1-10alkilCH(OR19)(OR19), -C(O)C2-10alkenilCH(OR19)(OR19), -C(O)C2-10alkinilCH(OR19)(OR19), -C(O)C1- 10alkilSR19, -C(O)C2-10alkenilSR19, -C(O)C2-10alkinilSR19, -C(O)C1- 10alkilC(O)OR19, -C(O)C2-10alkenilC(O)OR19, -C(O)C2-10alkinilC(O)OR19, -C(O)C1-10alkilC(O)SR19, -C(O)C2-10alkenilC(O)SR19, -C(O)C2- 10alkinilC(O)SR19,
    ili
    i R19 je vodonik, -C1-10alkil, -C2-10alkenil, -C2-10alkinil, cikloalkil ili aril; pri čemu je svaka alkil, alkenil, alkinil, cikloalkil ili aril grupa opciono zamenjena; ili geometrijski izomer ili stereoizomer ili njihova farmaceutski prihvatljiva so.
  18. 18. Jedinjenje izabrano iz grupe koju čine: 12-heksanoil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 5); 12-acetil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 6); 12-propanoil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 7); 12-butanoil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 8); 12-[(2E,4E)-(6,6-dimetoksiheksa-2,4-dienoil]-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 9); 12-[(2E,4E)-6-oksoheksa-2,4-dienoil]-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 10); 12-[(2E,4E)-6,7-dihidroksidodeka-2,4-dienoil]-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 11); 12-[(2E)-4,5-dihidroksi-deka-2-enoil]-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 12); 12-tigloil-13-(2-metilpropanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 13); 12-[(2E)-3-metiltioprop-2-enoil]-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 14); 12-(2-metilprop-2-enoil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 15); 12-[(2E,4E)-heksa-2,4-dienoil]-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 16); 12-[(2E,4E)-8-oksododeka-2,4-dienoil]-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenjel7); 12-[(2Z,4E)-deka-2,4-dienoil]-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 18); 13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 19); 12-[(2E)-but-2-enoil]-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 20); 12-[(2Z,4E)-deka-2,4-dienoil]-13-(2-metilpropanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 25); 12-[(2E,4E)-6,7-(anti)-epoksi-dodeka-2,4-dienoil]-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 26); 12-tigloil-13-(2-metilbutanoil)-5,6-epoksi-4,7,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 29); 13-(2-metilbutanoil)-5,6-epoksi-4,7,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 30); 12-acetil-13-(2-metilbutanoil)-5,6-epoksi-4,7,9,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 31); 12,13-di-(2-metilbutanoil)-5,6-epoksi-4,7,9,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 32); 12-propanoil-13-(2-metilbutanoil)-5,6-epoksi-4,7,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 33); 12-heksanoil-13-(2-metilbutanoil)-5,6-epoksi-4,7,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 34); 12-tigloil-13-(2-metilpropanoil)-5,6-epoksi-4,7,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 35); 12-[(2E)-3-metiltioprop-2-enoil]-13-(2-metilbutanoil)-5,6-epoksi-4,7,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 36); 12-{[2-(metilsulfanil)karbonil]-acetoil}-13-(2-metilbutanoil)-5,6-epoksi-4,7,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 39); i 12-[(2-metoksikarbonil)-acetoil]-13-(2-metilbutanoil)-5,6-epoksi-4,7,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 40); ili njihova farmaceutski prihvatljiva so.
  19. 19. Jedinjenje izabrano iz grupe koju čine; 12-tigloil-13-butanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 21); 12-(3-butenoil)-13-nonanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 22); 12-benzoil-13-(2-metilbutanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 23); 12,13-dibutanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 27) 12-benzoil-13-butanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 28); 12,13-di-nonoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 41); 12,13-di-heksanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 42); 12,13-di-pentanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 43); 12,13-di-tigloil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 44) 5,20-di-acetil-12-tigloil-13-(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 45); 12,13-di-(2E,4E)-heks-2,4-enoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 46); 12-heksanoil-13-[2-(N-metilantraniloil)]-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 47) 12-acetil-13-[2-(N-metilantraniloil)]-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 48); 12,13-di-heptanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 49); 12-miristoil-13-acetil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 50); 12-miristoil-13(2-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 51); 12-(2-metilbutanoil)-13-acetil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 52); 12-hidroksi-13-heksanoil-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 53); i 12,13-di-(3-metilbutanoil)-6,7-epoksi-4,5,9,12,13,20-heksahidroksi-1-tigliaen-3-on (Jedinjenje 60); ili njihova farmaceutski prihvatljiva so.
  20. 20. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje prema zahtevu 18 ili zahtevu 19 ili njihovu farmaceutski prihvatljivu so i farmaceutski prihvatljivi nosač, rastvarač ili ekscipijens.
RS20190316A 2013-04-18 2014-04-17 Metodi i kompozicije za zarastanje rana RS58532B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2013901359A AU2013901359A0 (en) 2013-04-18 Methods of Treatment
EP14784998.8A EP2986615B1 (en) 2013-04-18 2014-04-17 Methods and compositions for wound healing
PCT/AU2014/050018 WO2014169356A1 (en) 2013-04-18 2014-04-17 Methods and compositions for wound healing

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS58532B1 true RS58532B1 (sr) 2019-04-30

Family

ID=51730618

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190316A RS58532B1 (sr) 2013-04-18 2014-04-17 Metodi i kompozicije za zarastanje rana

Country Status (30)

Country Link
US (3) US10183921B2 (sr)
EP (1) EP2986615B1 (sr)
JP (1) JP6415538B2 (sr)
KR (1) KR102147796B1 (sr)
CN (1) CN105308052B (sr)
AU (1) AU2014253608B2 (sr)
BR (1) BR112015026388A8 (sr)
CA (1) CA2909653C (sr)
CY (1) CY1121515T1 (sr)
DK (1) DK2986615T3 (sr)
EA (1) EA032501B9 (sr)
ES (1) ES2715105T3 (sr)
HR (1) HRP20190435T1 (sr)
HU (1) HUE043272T2 (sr)
IL (1) IL242137B (sr)
LT (1) LT2986615T (sr)
MX (1) MX365255B (sr)
MY (1) MY184372A (sr)
NZ (1) NZ713954A (sr)
PH (1) PH12015502405B1 (sr)
PL (1) PL2986615T3 (sr)
PT (1) PT2986615T (sr)
RS (1) RS58532B1 (sr)
SG (1) SG11201508588XA (sr)
SI (1) SI2986615T1 (sr)
SM (1) SMT201900148T1 (sr)
TR (1) TR201903565T4 (sr)
UA (1) UA118670C2 (sr)
WO (1) WO2014169356A1 (sr)
ZA (1) ZA201508186B (sr)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10973858B2 (en) * 2016-02-12 2021-04-13 Laimu Corporation Nerve growth promoter and method for producing same, internal preparation, medium additive, cell dilution additive, medium, cell dilution, antioxidant and method for producing same, external preparation, and wound treatment agent and method for producing same
US20190160035A1 (en) * 2016-07-28 2019-05-30 Qbiotics Limited Method of treatment
MY197427A (en) * 2017-03-23 2023-06-16 QBiotics Pty Ltd Combination therapy for the treatment or prevention of tumours
KR102249495B1 (ko) 2019-03-15 2021-06-01 주식회사 고위드 피부 관리 장치, 시스템 및 피부 관리 주기 결정 방법
WO2020206504A1 (en) 2019-04-12 2020-10-15 QBiotics Pty Ltd Method of treating tumours
US12514843B2 (en) * 2019-06-19 2026-01-06 QBiotics Pty Ltd Biofilm disruption
US20230071297A1 (en) * 2020-01-23 2023-03-09 Klox Technologies Inc. Polarized fluorescent light therapy system and method
CN112557541B (zh) * 2020-12-08 2022-07-12 河北科技大学 一种枸橼酸马罗匹坦及其有关物质的检测方法
MX2024007679A (es) * 2021-12-21 2024-07-09 QBiotics Pty Ltd Compuestos intermedios cristalinos.
JP2026500534A (ja) * 2022-12-21 2026-01-07 キューバイオティクス プロプライアタリー リミティド 結晶形態及びその製造方法
US20250000828A1 (en) * 2023-06-28 2025-01-02 Epien Medical, Inc. Wound care and method for preventing wound infection

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5641814A (en) * 1991-03-01 1997-06-24 Warner-Lambert Company Antikeratolytic-wound healing compositions and methods for preparing and using same
WO2002009639A2 (en) * 2000-07-31 2002-02-07 Bar Ilan University Methods and pharmaceutical compositions for healing wounds
JP2005230051A (ja) * 2004-02-17 2005-09-02 Nippon Riko Igaku Kenkyusho:Kk 電位治療器
JP2008511652A (ja) * 2004-08-27 2008-04-17 アドヴァンスド ヴァイラル リサーチ コーポレーション 創傷治癒の促進方法
PT1971588E (pt) * 2005-12-23 2012-10-16 Qbiotics Ltd Derivados de tiglien-3-ona
JP4785062B2 (ja) 2007-03-20 2011-10-05 日精樹脂工業株式会社 スクリュ加熱回路を備えた射出装置
AU2010200429A1 (en) 2009-02-05 2010-08-19 Ecobiotics Ltd Method of reducing or preventing blowfly strike
KR102030694B1 (ko) 2018-02-07 2019-11-18 엘지전자 주식회사 횡자속형 리니어 모터 및 이를 구비한 리니어 압축기

Also Published As

Publication number Publication date
EA201591996A1 (ru) 2016-02-29
ZA201508186B (en) 2019-08-28
EA032501B1 (ru) 2019-06-28
WO2014169356A1 (en) 2014-10-23
SG11201508588XA (en) 2015-11-27
LT2986615T (lt) 2019-03-25
IL242137B (en) 2019-03-31
PH12015502405A1 (en) 2016-02-22
TR201903565T4 (tr) 2019-04-22
PT2986615T (pt) 2019-03-22
HUE043272T2 (hu) 2019-08-28
AU2014253608A1 (en) 2015-11-26
EP2986615A4 (en) 2016-03-30
CA2909653C (en) 2022-04-12
SMT201900148T1 (it) 2019-05-10
BR112015026388A8 (pt) 2019-12-31
PH12015502405B1 (en) 2016-02-22
UA118670C2 (uk) 2019-02-25
HRP20190435T1 (hr) 2019-05-03
EP2986615B1 (en) 2018-12-12
US20190161462A1 (en) 2019-05-30
US10822317B2 (en) 2020-11-03
ES2715105T3 (es) 2019-05-31
KR20160023651A (ko) 2016-03-03
SI2986615T1 (sl) 2019-05-31
DK2986615T3 (en) 2019-04-01
BR112015026388A2 (pt) 2017-07-25
US20170144981A1 (en) 2017-05-25
US20160068499A1 (en) 2016-03-10
MX2015014607A (es) 2016-06-02
MX365255B (es) 2019-05-28
JP6415538B2 (ja) 2018-10-31
KR102147796B1 (ko) 2020-08-26
EP2986615A1 (en) 2016-02-24
CA2909653A1 (en) 2014-10-23
CN105308052B (zh) 2018-07-10
US10183921B2 (en) 2019-01-22
NZ713954A (en) 2020-05-29
PL2986615T3 (pl) 2019-06-28
JP2016522801A (ja) 2016-08-04
HK1214256A1 (en) 2016-07-22
MY184372A (en) 2021-04-01
AU2014253608B2 (en) 2018-06-07
EA032501B9 (ru) 2019-11-29
CY1121515T1 (el) 2020-05-29
US10183922B2 (en) 2019-01-22
CN105308052A (zh) 2016-02-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10822317B2 (en) Methods and compositions for wound healing
CN104080458B (zh) 用于组织创伤的愈合的产品
EP3013376B1 (en) Method of reducing scarring
RS64469B1 (sr) Kompozicije egzozoma i postupci za njihovu pripremu i primenu za regulisanje i kondicioniranje kože i kose
US10022313B2 (en) Mesenchymal stem cell extract and its use
Aravinthan et al. Collagen-based sponge hastens wound healing via decrease of inflammatory cytokines
Rezaei et al. Preclinical and clinical studies on the use of extracellular vesicles derived from mesenchymal stem cells in the treatment of chronic wounds
JP7026050B2 (ja) 慢性創傷を治療するための組成物及び方法
Wang et al. Diverse-origin exosomes therapeutic strategies for diabetic wound healing
HK1214256B (en) Methods and compositions for wound healing
TW202408482A (zh) 用於抑制免疫反應的到手香提取物
EP3856210A1 (en) Extracellular matrix protein compositions and methods for treating wounds
RU2640930C1 (ru) Способ лечения красного плоского лишая в полости рта
RU2250112C2 (ru) Способ лечения ран у животных в условиях длительной адаптации к гипокинезии
Debbarma Comparative study on therapeutic potential of allogeneic mesenchymal stem cells and collagen granules on wound healing in mice
AU2024339916A1 (en) Therapeutic use of fibroblasts for adhesive bandage wound healing
US9314504B2 (en) Use of members of IL-10 cytokine family