RS58533B1 - Izolovani soj clonostachys rosea za upotrebu kao biološko kontrolno sredstvo - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj opis se odnosi na izolovani soj gljive Clonostachys rosea i preciznije na izolovani soj Clonostachys rosea koristan kao biološko kontrolno sredstvo za tretiranje biljaka.

STANJE TEHNIKE

[0002] Clonostachys rosea f. rosea je korisna mikro gljiva koja se nalazi u tkivima raznih biljaka u divljini i skoro svim vrstama poljoprivrednih kultura. Gljiva je često prisutna u zdravom korenju, lišću, stablima, cveću, i voću biljaka prikupljenih na farmama i u rasadnicima, voćnjacima, vinogradima, pašnjacima, i baštama širom sveta. Nalazi se u biljkama i zemljištima raznovrsnih regiona kao što je podarktik, zone umereno hladne i tople, pustinje i vlažni tropski predeli. Biljke su kolonizovane putem C. rosea ne pokazuju vizuelne znake da je gljiva prisutna sve dok tkiva prirodno ne ostare i umru. Tada fungus može da sporulira i beličasta izraslina može postati vidljiva na površinama biljke, posebno uz pomoć ručne lupe. Za razliku od patogenih organizama povezanih sa tom bolešću, Clonostachys ne prouzrokuje oštećenja u vidu lezija, tačke, uvenuća ili drugih simptoma kod biljaka. Clonostachys rosea f. rosea je takođe poznata kao korisno biološko kontrolno sredstvo za lečenje biljaka i pomaže da se zaštite biljke od bolesti i ekoloških stresova, i za poboljšanje rasta biljke i produktivnosti.

[0003] Stewart et al. (US patent br. 8,101,551) opisuje Clonostachys rosea soj 88-710 i odnosi se na soj koji ima koristi za pospešenje bujnosti, zdravlja, rasta i prinosa biljke.

[0004] Ostaje potreba za novim sojevima Clonostachys rosea korisnim kao biološki kontrolni agensi za tretiranje biljaka.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0005] Ovaj pronalazak je usmeren na predmet iznet u priloženim patentnim zahtevima.

[0006] Pronalazači su izolovali i okarakterisali nov soj gljiva Clonostachys rosea f. rosea. Kao što je ovde opisano, ovaj novi soj Clonostachys rosea f. rosea je označen "BVT Cr-7" kao posebno koristan kao biološko kontrolno sredstvo za tretiranje biljaka. U jednom varijantnom rešenju, izolovana kultura Clonostachys rosea f. rosea soja BVT Cr-7 je deponovana pod pristupnim brojem 040913-01 kod Međunarodnog depozitnog organa Kanade koji se nalazi pri Nacionalnoj laboratoriji za mikrobiologiju, Agencija za javno zdravlje Kanade, 1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, R3E 3R2, Canada, 4. septembra 2013.

[0007] Kao što je izneto u Primeru 1, niz različitih sojeva Clonostachys rosea f. rosea su izolovani i opisani da bi se identifikovali sojevi sa specifično pogodnim svojstvima za upotrebu kao biološko kontrolno sredstvo. U poređenju sa drugim sojevima Clonostachys rosea f. rosea, BVT Cr-7 su pokazali izvestan broj poboljšanih svojstava i/ili kombinaciju poželjnih svojstava za upotrebu kao biološko kontrolno sredstvo. Na primer, BVT Cr-7 je pokazao poboljšana ili poželjna svojstva u vezi sa rastom i obiljem proizvodnje spora, njenu sposobnost da se uspostavi endofitno unutar raznoraznog opsega biljaka, što obuhvata korenje poljoprivrednih kultura i cvetovime i lišće biljaka koje se testiraju i njihovu sposobnost da potisne ili kontroliše širok opseg bolesti biljke i/ili patogena. U jednom izvođenju, BVT Cr-7 pokazuje jedan ili više poboljšanih svojstava u poređenju sa kontrolnim sojem Clonostachys rosea f. rosea, kao što je 88-710 i/ili EV1a.

[0008] Pored toga, kao što je izneto u Primerima 2-5, nanošenje BVT Cr-7 na biljke u ispitivanjima na terenu kao i u plastenicima pod kontrolisanim uslovima pokazuje da je BVT Cr-7 širok spektar biološkog kontrolnog sredstva sa visokim učinkom protiv izvesnog broja različitih bolesti, pod razliitim uslovima i za raznovrsne biljke. Kao što je pokazano u Primeru 4, BVT Cr-7 je takođe koristan za smanjenje kvarenja biljnih materijala kao što je smanjenje nivoa truljenja ili gubljenja boje na požnjevenim usevima.

[0009] Sa tim u skladu, u jednom varijantnom rešenju ovde se daje izolovana kultura soja Clonostachys rosea f. rosea BVT Cr- 7 kako je ovde opisano. U jednom izvođenju, soj je deponovan pod pristupnim brojem 040913-01 kod Međnarodnog depozitnog organa Kanade koji se nalazi pri Nacionalnoj laboratoriji za mikrobiologiju, Agencija za javno zdravlje Kanade, 1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, R3E 3R2, Kanada, 4. septembra 2013.

[0010] Takođe su date spore proizvedene iz Clonostachys rosea f. rosea soja BVT Cr-7, kao i potomci Clonostachys rosea f. rosea soja BVT Cr-7 i formulacije koje obuhvataju izolovane kulture, spore i/ili potomke BVT Cr-7. Takođe je data izolovana ćelija soja Clonostachys rosea f. rosea BVT Cr-7 koja može da se reprodukuje aseksualno. U jednom izvođenju, data je spora dobijena inkubacijom izolovane kulture BVT Cr-7 na supstratu pod uslovima pogodnim za sporulaciju. U jednom izvođenju, data formulacija obuhvata spore BVT Cr-7 koje su vezane na sredstvo stabilizacije, kao što je kalcijum silikat.

[0011] U jednom izvođenju, ovde opisana izolovana kultura BVT Cr-7 kolonizuje biljke kao endofit. U jednom izvođenju, dovođenje u kontakt biljke sa BVT Cr-7 potiskuje ili kontroliše bolest ili patogen koji utiče na razlistavanje, cvetanje, plodove i/ili korenje biljke. U jednom izvođenju, bolest je bolest sive plesni, bele plesni, braon korena, trulog korena i/ili fomopsis. U jednom izvođenju, bolest je prouzrokovana dejstvom Botrytis cinerea, Sclerotinia sclerotiorum i/ili vrsta Pythium spp., Rhizoctonia, i/ili Fusarium.

[0012] U jednom izvođenju, data je biljka ili biljni materijal koji je kolonizovan sa hemijskim dodatkom BVT Cr-7.

[0013] U jednom izvođenju, Clonostachys rosea f. rosea soj BVT Cr-7 je koristan kao biološko kontrolno sredstvo za lečenje biljaka. U jednom izvođenju, dat je postupak za lečenje biljke koji obuhvata dovođenje u kontakt biljke sa sojem Clonostachys rosea f. rosea BVT Cr-7 kako je ovde opisano. Na primer, u jednom izvođenju BVT Cr-7 je koristan za poboljšanje zdravlja, rasta, i/ili prinosa biljke u odnosu na kontrolnu biljku koja nije tretirana sa BVT Cr-7. U jednom izvođenju, BVT Cr-7 je koristan za sprečavanje ili lečenje bolesti i/ili patogena u biljci. U jednom izvođenju, BVT Cr-7 je koristan da se poboljša isključivanje da druge gljive, uključujući patogene gljive, kolonizuju neku biljku. U jednom izvođenju, BVT Cr-7 je koristan za okidanje prirodne otpornosti na bolesti i stresove u biljci, kao što je odgovor na infekciju sa patogenom. Takođe je dat postupak za smanjenje uništenja biljnog materijala koji obuhvata dovođenje u kontakt tog biljnog materijala sa BVT Cr-7.

[0014] U jednom izvođenju, BVT Cr-7 se koristi za lečenje biljke da bi se sprečile ili lečile bolesti i/ili patogeni koji mogu uticati na zdravlje, rast i/ili prinos biljke. U jednom izvođenju, patogen je mikroorganizam, kao što je gljiva ili bakterija. Primeri patogena koji mogu uticati na zdravlje, rast i/ili prinos biljke koji mogu biti kontrolisani putem BVT Cr-7 obuhvataju, ali se ne ograničavaju na, Botrytis cinerea, Sclerotinia sclerotiorum, Pythium spp., Alternaria, Monilia, Monilinia, Colletotrichum, Cladosporium Rhizoctonia, Streptomyces, Didymella i/ili Fusarium. Primeri bolesti koje mogu uticati na zdravlje, rast i/ili prinos biljke koje može kontrolisati primena BVT Cr-7 obuhvataju, ali se ne ograničavaju na bolest sive plesni, bolest bele plesni, braon truljenje, i/ili truli koren. Drugi primeri obuhvataju bolesti fomopsis npr., u slučaju kraste na borovnici ili grožđu, i krompiru.

[0015] U jednom izvođenju, biljka je bilo koja biljka ili njen deo koji je moguće kolonizovati endofitno sojem Clonostachys rosea f. rosea BVT Cr-7. U jednom izvođenju, biljka je cvetna biljka, žitarica, mahunarka ili povrtna biljka. Na primer, u jednom izvođenju, ovde opisani postupci i upotrebe su korisni za lečenje biljaka kao što su cvetne biljke ili usevi kao što su povrćne biljke, voćke, žitarice, kao i njihova semena ili sadnice. U jednom izvođenju, postupci i upotrebe su korisni za lečenje sadnica/transplantata četinara. U jednom izvođenju, biljka je drvo kao što je bor, crna smrča ili transplanti bora. U jednom izvođenju, biljka je pšenica, ječam, suncokret, kanola, borovnica, jagoda, malina, grožđe, krompir, paprike, krastavci, paradajz, trave za travnjake, ljute paprike, paradajz, krastavac, brokoli, karfiol, breskve, jabuke, kanola, ukrasne cvetnice kao što su ruže, geranijumi (ždralice), ciklama, zevalica, Exacum (sirištarke), begonija ili ljiljani. U jednom izvođenju, biljka raste napolju. U jednom izvođenju, biljka raste u plasteniku.

[0016] U jednom izvođenju, postupci i upotrebe opisani ovde obuhvataju dovođenje u kontakt biljke sa BVT Cr-7, kao što je BVT Cr-7 kultura, spora, ili njihova formulacija. U jednom izvođenju, BVT Cr-7 kultura, spora, ili njena formulacija je korisna kao inokulant. U nekim izvođenjima, BVT Cr-7 se nanosi na biljku ili njen deo kao što je sprej, magla, potapanje, prah, ili rastvor nutrijenta i/ili prenos insektom, kao što je upotreba prenosa pčelama kako je opisano u PCT prijavi br. PCT/CA2013/050179.

[0017] Takođe su dati postupci za proizvodnju biološkog kontrolnog agensa, postupak obuhvata inokulaciju supstrata sa izolovanom kulturom BVT Cr-7 i inkubaciju supstrata pod uslovima pogodnim za rast gljiva da bi se proizveo Clonostachys rosea f. rosea soj BVT Cr-7. Opciono, postupak još obuhvata inkubaciju supstrata pod uslovima pogodnim za gljivičnu sporulaciju i uklanjanje spora iz supstrata da bi se proizveo hemijski dodatak.

[0018] Druge karakteristike i prednosti ovog opisa će postati očigledne iz sledećeg detaljnog opisa. Treba razumeti, međutim, da se detaljan opis i specifični primeri iako ukazuju na preporučena izvođenja ovog opisa daju samo kao ilustracija, jer različite promene i modifikacije u duhu i obimu ovog opisa će postati očigledne stručnjaku u ovoj oblasti iz ovog detaljnog opisa.

DETALJAN OPIS

Definicije

[0019] Kako se ovde koristi "Clonostachys rosea f. rosea soj BVT Cr-7" ili "BVT Cr-7" se odnosi na soj gljiva deponovan pod pristupnim brojem 040913-01 kod Međunarodnog depozitnog organa Kanade smeštenog pri Nacionalnoj laboratoriji za mikrobiologiju, Agencije za javno zdravlje Kanade, 1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, R3E 3R2, Canada, 4. septembra 2013. Pojmovi " soj Clonostachys rosea f. rosea BVT Cr-7", "BVT Cr-7" ili " soj Clonostachys rosea f. rosea IDAC 040913-01" takođe obuhvataju izolate pomenutog soja ili bilo koje ćelije, kulture, spore, i potomke proizvedene iz pomenutog soja, kao putem aseksualne reprodukcije.

[0020] Različiti postupci poznati u ovoj oblasti mogu biti korišćeni za kultivisanje BVT Cr-7 ili dobijanje gljivičnih spora, uključujući ali bez ograničenja na ovde opisane postupke i kod Sutton et al. " Gliocladium roseum: a versatile adversary of Botrytis cinerea in crops (Gliocladium roseum: raznovrsni protivnik sive plesni Botrytis cinerea u usevima)." Videti u Bolestima biljaka (Plant Dis 1997;81:316-28; Sutton et al. "Ability of Clonostachys rosea to establish and suppress sporulation potential of Botrytis cinerea in deleafed stems of hydroponic greenhouse tomatoes (Sposobnost Clonostachys rosea da uspostavi i potisne potencijal sporulacije sive plesni Botrytis cinerea kod stabla bez lišća hidroponskog paradajza iz plastenika)" Biocontrol Sci Technol 2002;12(4):413-25), i US prijavi patenta br.

2012/0021906 "Fungal Inoculant Compositions (Gljivične supstance hemijskog dodatka)".

[0021] Kako se ovde koristi, "biljka" se odnosi na bilo kog člana carstva Plantae koji može da bude kolonizovan endofitno putem BVT Cr-7. U preporučenom izvođenju, biljka je kultivisana biljka. U jednom izvođenju "biljka" takođe obuhvata krtolaste, semenike i/ili sadnice iz kojih postaju biljke i opciono obuhvata biljni materijal. Kako se ovde koristi "biljni materijal" se odnosi na bilo koji materijal koji se ubira ili odvaja od biljke i predviđen je za upotrebu kao hrana ili druge upotrebe koji je podložan kvarenju usled bolesti i/ili infekcije patogenima. Primeri biljnog materijala obuhvataju, ali se ne ograničavaju na ubrane žitarice, voćke ili biljke.

[0022] Kako se ovde koristi "endofitno kolonizovano" se odnosi na postupak po kome spore gljiva prodiru i formiraju gljivične kolonije unutar biljke domaćina, ili njenog dela, bez prouzrokovanja simptoma ili drugih aspekata bolesti, ili oštećivanja domaćina na drugačiji način.

[0023] Kako se ovde koristi, "biološko kontrolno sredstvo" se odnosi na sredstvo koje poboljšava zdravlje, rast, bujnost i/ili prinos biljka; pospešuje brzinu klijanja i/ili kvalitet semena; pospešuje otpornost na bolesti, štetočine, i/ili ekološke stresove kao što je neželjeno vreme ili stanje zemljišta; kontroliše ili deluje protiv bolesti ili patogena ili je korisno za tretiranje ili sprečavanje boleasti ili patogena; ili pospešuje oporavak biljaka od povrede i/ili infekcije. Preporučeni primer biološkog kontrolnog sredstva je Clonostachys rosea BVT Cr-7 kako je ovde opisano.

[0024] Kako se ovde koristi, "patogen" se odnosi na mikroorganizam koji može napasti i kolonizovati biljku domaćina i smanjiti zdravlje, rast, bujnost i/ili prinos te biljke. Primeri patogena obuhvataju, ali se ne ograničavaju na, bakterije i gljive kao što je Botrytis cinerea Sclerotinia sclerotiorum, i vrste Pythium, Alternaria, Monilia, Monilinia, Colletotrichum, Cladosporium Rhizoctonia, Streptomyces, Didymella i/ili Fusarium.

Interakcija Clonostachys rosea sa oganizmima biljaka i bolesti biljke

[0025] Bez ograničavanja na teoriju, veruje se da je Clonostachys rosea BVT Cr-7 pružalac zaštite biljkama kroz raznovrsne mehanizme uključujući i to da je okidač prirodne otpornosti biljke na bolesti, stresove, i kroz konkurentno isključivanje drugih patogena.

[0026] Clonostachys reprodukuje sredstva velikog broja mikroskopskih (5-7 µM) pasuljasto oblikovanih spora. Kada se nanosi na biljke, spore klijaju da bi proizvele majušne cevčice iz kojih se formiraju izuzetno fine grane i prodiru u tkiva biljke. Prodiranje može nastati na živim laticama, lišću, ranama biljke, korenju, krtolama i drugim delovima biljke. Kada se nađu unutar tkiva, svaka grana formira mikroskopsku gljivičnu koloniju. Biljke sa Clonostachys kolonijama ne pokazuju simptome kao što su oni koji su proizvedeni putem organizama koji prouzrokuju bolesti (patogeni). Kada se uspostavi kao endofit unutar biljnog tkiva Clonostachys može nametnuti pozitivno dejstvo aktiviranjem prirodne otpornosti biljke na bolesti i sresove.

[0027] Odnos mikroskopskih Clonostachys kolonija sa promenama biljnih tkiva se menja naglo kada tkiva biljke počnu da stare, kao što je kada prvo list počne da žuti ili kada bolest ili stres počne da se razvija. U tom periodu, sićušne kolonije počinju brzo da rastu i često potpuno zauzimaju susedna tkiva. Clonostachys počinje ovaj rast pre skoro svih drugih gljiva i bakterija i raste na biljkama koje stare i umiru. Dakle Clonostachys je pionir kolonizator tkiva biljaka koja su u procesu starenja. Kao rezultat, on zauzima tkiva pre drugih organizama uključujući destruktivne patogene kao što je Botrytis, Sclerotinia i Monilinia. Pošto zauzmu tkiva, drugi organizmi uključujući patogene ne izmeštaju iz oranizma koji zauzimaju. Clonostachys može da blokira rast patogena i drugih gljiva jednostavno na osnovu što ima prvenstvo u zauzimanju tkiva. Ovo konkurentno isključivanje je osnovno sredstvo pod kojim Clonostachys potiskuje bolesti organizama i razvoj bolesti kod biljaka. Kao što je prikazano u Primerima, Clonostachys BVT Cr-7 je specifično delotvorna za kontrolisanje bolesti i patogena i obuhvata veoma raznovrsne biljke.

[0028] Clonostachys proizvodi spore kada kolonizovana tkiva progresivno stare i umiru. U brojnim primerima takve spore pokreću nove cikluse endofitnog rasta kod obližnjih živih biljaka. Clonostachys može da ustraje tokom nekog perioda na mrtvoj biljci u materijalima mrtve biljke koje je kolonizovala dok su bile žive. Međutim, ima nedovoljnu sposobnost da raste na materijalima mrtve biljke koji su već okupirale druge gljive i bakterije. U ovoj vrsti situacije Clonostachys se ne takmiči dobro protiv mikroba kao što je Penicillium i Aspergillus koji su prilagođeni mikrobnom svetu biljnih ostataka i zemljišta.

[0029] Clonostachys takođe ima sposobnost da raste na hifama gljiva i micelijama drugih gljiva (t.j. je mikoparazit). Clonostachys obično napada druge gljive tek posle uspostavljanja veoma bliskog kontakta sa hifama gljiva, sklerocijom ili drugim delom gljiva (t.j apsolutni kontakt ili rastojanje od možda 1-5 µM). Pritom, Clonostachys hife gljiva ponekad se spiralno omotaju oko gljive koja je parazitirana i "gljiva domaćin" u suštini umire.

[0030] Bez ograničavanja na teoriju, osnovni načini pod kojima Clonostachys potiskuje patogene i bolesti smatra se da su: A. brzo zauzimanje tkiva koja stare ili su oštećena tako da sprečava rast patogena u tkivima; i B, stimulisanjem mehanizama koji imaju prirodnu otpornost biljaka na bolesti i organizme. Pored toga, Clonostachys može da inaktivira ili ubije preživele strukture gljiva (kao što je sklerocija i različite vrste spora u ili na zemljištima) kroz parazitiranje (t.j. rast na njima kao izvorima hrane). BVT Cr-7 je izolovani soj Clonostachys koji ispoljava izvesne karakteristike koje ga čine posebno delotvornim kao biološko kontrolno sredstvo za lečenje biljaka.

Svojstva i karakteristike soja BVT Cr-7

[0031] U jednom izvođenju, dat je izolovani soj Clonostachys, pod nazivom BVT Cr-7. U jednom izvođenju, taj soj je onaj koji je deponovan pod pristupnim brojem 040913-01 kod Međunarodnog depozitnog organa Kanade smeštenog pri Nacionalnoj laboratoriji za mikrobiologiju, Agencije za zavno zdravlje Kanade, 1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, R3E 3R2, Canada, 4. septembra 2013. U jednom izvođenju, "Clonostachys rosea f. rosea soj BVT Cr-7" ili "BVT Cr-7" obuhvata sve kulture, spore, ćelije i potomke proizvedene iz pomenutog soja kao što je aseksualna reprodukcija. Kako je ovde opisano, BVT Cr-7 ispoljava izvesna pogodna svojstva u odnosu na druge sojeve Clonostachys.

[0032] Na primer, u jednom izvođenju BVT Cr-7 može da proizvede spore na standardnoj podlozi i semenkama biljke kao što su sterilizovane semenke žitarica. U jednom izvođenju, BVT Cr-7 ima poboljšanu sposobnost da proizvede spore na standardnim agar podlogama i semenke biljke kao što su sterilizovane semenke žitarica u poređenju sa drugim sojevima Clonostachys rosea f. rosea, kao što je 88-710 (poznat još i kao AFr-710, PG-710). Soj 88-710 su opisali Sutton et al., Evaluation of the Fungal Endophyte Clonostachys rosea as an Inoculant to Enhance Growth, Fitness and Productivity of Crop Plants. (Procena endofita gljive Clonostachys rosea kao inokulanta za pospešenje rasta, pogodnosti i produktivnosti poljoprivrednih kultura. (Proc. IVth IS on Seed, Transplant and Stand Establishment of Hort. Crops (Zbornik IV S o semenu, transplantatima i stadnardnom ustrojstvu hortikulturnih useva) Ed.: D.I. Leskovar, Acta Hort. 782, ISHS 2008 pp. 279-286). U jednom izvođenju, semenke žitarice su pšenica ili semenke ječma. U jednom izvođenju, BVT Cr-7 je korisno za proizvodnju inokulanta za upotrebu za tretiranje biljaka.

[0033] U jednom varijantnom rešenju, BVT Cr-7 može da se uspostavi endofitno u biljkama. U jednom izvođenju, BVT Cr-7 može da se uspostavi endofitno u korenju biljaka, kao što je korenje poljioprivrednih kultura. U jednom izvođenju, BVT Cr-7 ima poboljšanu sposobnost da se uspostavi endofitno u korenju biljaka u poređenju sa drugim sojevima Clonostachys rosea f. rosea, kao što je 88-710. Na primer, u jednom izvođenju, BVT Cr-7 ima poboljšanu sposobnost da se uspostavi endofitno u poljoprivrednim kulturama i/ili biljkama kao što su sitnozrne žitarice, trava za travnjake, grašak, kanola, soja, paprike, paradajz i krastavci.

[0034] U jednom izvođenju, BVT Cr-7 je sposoban da se uspostavi endofitno u lišću i/ili cveću biljaka. U jednom izvođenju, BVT Cr-7 ima poboljšanu sposobnost da se uspostavi endofitno u lišću i cveću biljaka u poređenju sa drugim sojevima Clonostachys rosea f. rosea, kao što je 88-710. Na primer, u jednom izvođenju BVT Cr-7 ima poboljšanu sposobnost da se uspostavi endofitno u lišću i/ili cveću minijaturnih ruža, jagoda, suncokreta i kanole.

[0035] U drugom varijantnom rešenju, BVT Cr-7 je sposoban da potisne i/ili kontroliše bolest u biljkama. U jednom izvođenju, BVT Cr- 7 je sposoban da potisne i/ili kontroliše bolest u biljkama koju su prouzrokavali patogeni kao što su druge gljive ili mikroorganizmi. U jednom izvođenju, BVT Cr-7 ima poboljšanu sposobnost da potisne ili kontroliše bolesti kod biljaka koje nisu upoređene sa drugim sojevima Clonostachys rosea f. rosea, kao što je 88-710. Na primer, u jednom izvođenju, BVT Cr-7 ima poboljšanu sposobnost da potisne ili kontroliše bolesti koje utiču na lišće, cveće, plodove i/ili korenje biljaka. U jednom izvođenju, ta bolest je prouzrokovana dejstvom Botrytis cinerea (bolesti sive plesni), Sclerotinia sclerotiorum (bolesti bele plesni) i/ili vrsta Pythium spp., Rhizoctonia, i/ili Fusarium (trulo korenje i druge bolesti).

[0036] U jednom izvođenju, BVT Cr-7 može da smanji uništenje biljnih materijala. Na primer, u jednom izvođenju, dovođenje u kontakt ubranog biljnog materijala sa BVT Cr-7 kao što je tretiranje za sterilizaciju smanjuje učestalost truljenja u odnosu na netretirani biljni materijal.

Nanošenje BVT Cr-7 na biljke i/ili njihove delove

[0037] U jednom izvođenju, postupci i upotrebe opisani ovde obuhvataju dovođenje u kontakt biljke ili biljnog materijala sa BVT Cr-7. U jednom izvođenju, BVT Cr-7 je izloženo biljkama ili biljnom materijalu tako da ohrabri endofitnu kolonizaciju biljaka ili biljnog materijala. BVT Cr-7 moguće je naneti na bilo koji deo biljke uključujući lišće biljke, cveće, korenje, krtole i/ili semena bilo kojim poznatim postupkom, uključujući raspršivanje, maglu, ukapavanje, kroz hranljive rastvore, i/ili kroz prenos insekata zavisno od primene.

[0038] Na primer, mlade biljke za transplantaciju moguće je tretirati kvašenjem podloge zemljišta ili potapanjem biljaka pri transplantaciji.

[0039] U drugom primeru, bolesti koje su prouzrokovane patogenima koji inficiraju cvet mogu često biti delotvorno kontrolisani nanošenjem Clonostachys rosea BVT Cr-7 na cvetove kao što je tretiranje raspršivanjem ili transfer isekata kao što je tehnologija transfera pčela kako je opisano u PCT objavi br. WO2012/135940 i PCT prijava br. PCT/CA2013/050179. U jednom izvođenju, transfer pčela omogućava tretiranje cvata useva jer pčele isporučuju Clonostachys na sveže otvorene cvetove svakog dana (nasuprot, na primer, nedeljnim raspršivanjima).

[0040] Drugi primeri primena obuhvataju nanošenje Clonostachys na lišće useva u plastenicima putem ultra niske količine maglenja ili uobičajenim raspršivanjem da se kontrolišu patogeni kao što je Botrytis na lišće i u ranama korena napravljenim tokom gubljenja lišća i drugih aktivnosti obrezivanja; tretIranjem sprejom trava na golf terenima sa Clonostachys da bi se kontrolisao rast patogene gljivice koje nastaju na sušom pogođenoj travi poznate kao 'dollar spot' (Sclerotinia), snežne plesni (Typhula, Microdochium) i drugih bolesti lišća; nanošenja Clonostachys na sveže rane (u roku od 48 sati) često obezbeđuje dugoročnu zaštitu od brojnih organizama koji prouzroku bolest inficiranjem rane, na primer, prilikom kalemljenja, obrezivanja, i povređenih biljaka; i semenke mogu biti tretirane sa Clonostachys (posle čega sledi rast gljiva u sistemima korena) da bi se pospešila sposobnost useva kao što je poljski grašak da održe rast kada su pod stresom usled suše ili proizvodne prakse (uključujući izvesne pesticide).

[0041] U jednom izvođenju, BVT Cr-7 kako je ovde opisan može biti koristan za kontrolisanje patogena kao što je sclerotinia sclerotiorum, monilinia vaccinii-corymbosi, i/ili botrytis cinerea u različitim usevima, uključujući kanolu, suncokret, malinu, borovnicu, jagodu, jabuku, krušku, kivi, lubenicu, kafu, mango, avokado, trešnju, šljivu, badem, breskvu, indijski orah, guavu, alfalfu, njivski biljušac, detelinu, pasulj, grašak, crni luk, sojino zrno, pamuk, slačicu, kupinu, ogrozd, papriku, plavi patlidžan, ribizlu.

[0042] Kod nekih izvođenja, BVT Cr-7 se nanosi na biljke kao izlaganje jednoj ili više doza ili izlaganja u različitim vremenskim periodima. Na primer, u jednom izvođenju, biljke se doziraju ili izlažu BVT Cr7, kao što je raspršivanje ili transfer insekata sa košnicama za pčele opremljenim pogodnim raspršivačem hemijskog dodatka barem 2 dana, 4 dana, 1 nedelju, 2 nedelje, 1 mesec ili više od 1 mesec odvojeno.

[0043] U jednom izvođenju, biljke se dovode u kontakt sa BVT Cr-7 jednom ili više puta tokom godišnjeg ciklusa rasta ciljne biljke. Na primer, u jednom izvođenju, BVT Cr-7 se nanosi na biljke u proleće na početku sezone rasta i/ili u jesen na kraju sezone rasta. U jednom izvođenju, BVT Cr-7 se nanosi na biljke pre ubiranja biljnih materijala, kao što je 1 nedelja, 2 nedelje, 3 nedlje ili 4 nedelje pre žetve biljnih materijala.

Formulacije za inokulaciju biljaka

[0044] U jednom varijantnom rešenju, daje se formulacija koja obuhvata BVT Cr-7 koja je pogodna za inokulaciju biljaka ili biljnih materijala. Opciono, formulacija može biti čvrsta kao što je formulacija u prahu, ili rastvor kao što je vodeni rastvor. U jednom izvođenju, formulacija obuhvata spore osušene zamrzavanjem BVT Cr-7. U jednom izvođenju, formulacije opisane ovde su korisne kao inokulant za tretiranje biljaka.

[0045] U jednom izvođenju, formulacija može obuhvatiti različite aditive kombinovane sa izolovanom kulturom gljivičnih spora izvedenih iz Clonostachys rosea f. rosea soja BVT Cr

[0046] Stručnjak će shvatiti da koncentracija ćelija ili spora u formulaciji može da bude različita zavisno od uslova u kojima treba koristiti formulaciju (npr. klima, ciljna biljka, postupak nanošenja formulacije na biljke ili biljne materijale itd.).

[0047] Kod nekih izvođenja, formulacija je čvrsta formulacija i može obuhvatiti između oko 1 x 10<8>i oko 4 x 10<8>spora po gramu formulacije, opciono između oko 2 x 10<8>i oko 4 x 10<8>spora po gramu formulacije.

[0048] Kod nekih izvođenja, aditivi obuhvataju jedan ili više stabilizujućih sredstava, sredstvo za apsorpciju vlage, sredstvo za privlačenje, razblaživač, i/ili sredstvo koje sprečava zgrušnjavanje i stvaranje pogače. Kod nekih izvođenja, aditivi mogu da obuhvate dva ili više sredstava za stabilizaciju, sredstvo za apsorpciju vlage, sredstvo za privlačenje, razblaživač, i/ili sredstvo protiv zgrušnjavanja. U jednom izvođenju, formulacija je pogodna za transfer vektora, kao što je to opisano u PCT/CA2013/050179.

[0049] U jednom izvođenju, formulacija obuhvata sredstvo za stabilizaciju. Sredstvo za stabilizaciju služi da spreči ili svede na minimum propadanje truljanjem, pucanje, ili aktivaciju gljivične spore pre isporuke biljnog cilja. Primeri sredstava za stabilizaciju obuhvataju kalcijum silikat u česticama. Na primer, kod nekih izvođenja, formulacija može obuhvatiti gljivičnu sporu, i gljivična spora može da bude slepljena na barem neki od kalcijum silikata. Formulacija može imati gustinu od između oko 1 x 10<9>i 4 x 10<9>spora po gramu kalcijum silikata na koji se spaja. U jednom izvođenju, formulacija može da ima oko 2 x 10<9>spora po gramu kalcijum silikata na koji se spaja.

[0050] U jednom izvođenju, formulacija obuhvata sredstvo za apsorpciju vlage. Sredstvo za apsorpciju vlage služi da apsorbuje vlagu iz formulacije da bi se formulacija očuvala relativno suvom i da bi se sprečilo stvaranje pogače ili zgrudvanost formulacije. Primeri srestava za vlaženje obuhvataju desikante, kao što su čestice ili perlice silika gela, i super apsorpcioni polimeri, kao što je natrijum poliakrilat. Još neki primeri sredstava za apsorpciju vlage obuhvataju opiljke od drveta, i glinene kugle.

[0051] U jednom izvođenju, formulacija obuhvata sredstvo za privlačenje. To sredstvo za privlačenje može da pomogne da se formulacija privuče biljkama i/ili insektima za transfer. Na primer, sredstvo za privlačenje može imati neto pozitivno elektrostatičko naelektrisanje, tako da je elektrostatički privučeno biljkama i/ili insektima za transfer, koji imaju neto negativno elektrostatičko naelektrisanje. U nekim primerima, sredstvo za privlačenje može obuhvatiti mineral, ili mešavinu minerala. U jednom specifičnom primeru, sredstvo za privlačenje može obuhvatiti mineralnu mešavinu koju prodaje Agri-Dynamics (Martins Creek, PA) pod nazivom DYNAMIN™, koja obuhvata sledeće minerale: silicijum-dioksid, aluminijum-oksid, kalcijum, gvožđe, magnezijum, kalijum, natrijum, fosfor, titanijum, mangan, stroncijum, cirkonijum, litijum, rubidijum, boron, zink, vanadijum, hrom, bakar, itrijum, nikl, kobalt, galijum, cezijum, skandijum, kalaj, molibden, i dodatne elemente u tragovima. U drugom primeru, sredstvo za privlačenje može obuhvatiti kalcijum krečnjak.

[0052] U jednom izvođenju, formulacija obuhvata sredstvo za razblaživanje. Razblaživač može biti pogodan skrob ili fluor. U primerima gde formulacija treba da se isporuči prenosominsekatima, razblaživač je moguće izabrati tako da ne iritira ili ne oštećuje insekte, i neće biti pojeden od strane insekata. Razblaživač je moguće još odabrati tako da ne apsorbuje značajne količine vlage, tako da se razblaživač ne zgrudva. Primeri razblaživača koji mogu biti pogodni za transfer insektima obuhvataju kukuruzni fluor, i fluore iz žitarica kao što je raž, pšenica, pirinačni fluor, i speltin fluor. U alfernativnim primerima, razblaživač može da bude kaolin. U drugim primerima razblaživač može obuhvatiti mleko u prahu ili talk. Ovi mogu biti posebno korisni u primerima kod kojih se formulacija isporučuje na način koji nije transfer insektima, kao što je raspršivanje.

[0053] U jednom izvođenju, formulacija obuhvata pogodno sredstvo protiv zgrušnjavanja. Jedan specifičan primer sredstva protiv zgrušnjavanja je magnezijum oksid. Druga sredstva protiv zgrušnjavanja poznata stručnjaku u ovoj oblasti mogu takođe da budu korišćena u ovde opisanim formulacijama.

[0054] U jednom izvođenju, formulacija je tečna formulacija, kao što je vodena suspenzija. U jednom izvođenju, ta formulacija obuhvata oko 1 do 6 x 10<5>spora/mL i opciono oko 2 do 5 x 10<5>spora/mL. U jednom izvođenju, ta formulacija je tečna formulacija i obuhvata jedan ili više poljoprivredno pogodnih nosača i razblaživača. U jednom izvođenju, tečna formulacija obuhvata jedan ili više sredstava za stabilizaciju.

[0055] Takođe su dati postupci za proizvodnju biološkog kontrolnog agensa kao što je ovde opisano, kao što je hemijski dodatak koji obuhvata delotvornu količinu BVT Cr-7. Na primer, u jednom izvođenju ovde je dat postupak obezbeđivanja izolovane kulture BVT Cr-7; inokulacije supstrata izolovanom kulturom BVT Cr-7 i inkubiranja supstrata pod uslovima pogodnim za rast gljiva. U jednom izvođenju, inokulisani supstrat je inkubiran pri relativnoj vlažnosti većoj od 90% ili većoj od 95% i na temperaturi u opsegu od 20-24 stepena Celzijusa.

[0056] U jednom izvođenju, supstrat je sterilan supstrat. U jednom izvođenju, postupak još obuhvata inkubiranje supstrata pod uslovima pogodnim za gljivičnu sporulaciju. Uslovi pogodni za gljivičnu sporulaciju Clonostachys rosea su poznati u ovoj oblasti. Na primer, u jednom izvođenju, uslovi pogodni za gljivičnu sporulaciju obuhvataju rast BVT Cr-7 na supstratu kao što su sterilisana semena na oko 20-24 stepena Celzijusa pri visokim nivoima vlažnosti (većim od oko 95%) tokom nekoliko dana da bi se dozvolio rast gljiva pre smanjenja relativne vlažnosti na manje od oko 50%, opciono oko 20-50%, 35-45%, ili oko 20-25% tokom barem 10 dana, barem 2 nedelje ili više od 2 nedelje da bi pogodovali obilnoj proizvodnji spora. Pronalazači su odredili da smanjenje relativnog nivoa vlažnosti do oko 35-45% tokom barem oko 2 nedelje jeste specifično delotvorno za proizvodnju gljivičnih spora BVT Cr7. U jednom izvođenju, sterilisano seme je seme ječma. U jednom izvođenju, supstrat je prozračen kroz proizvodnju spora. Preporučljivo, supstrat je inkubiran pod sterilnim uslovima da bi se izbegla kontaminacija sa drugim mikrobima.

[0057] U jednom izvođenju, postupak još obuhvata uklanjanje spora iz supstrata, opciono suspenzijom u vodenom rastvoru. U jednom izvođenju, spore se uklanjanju iz supstrata da bi se proizveo hemijski dodatak. Opciono, spore je moguće ukloniti iz supstrata i onda osušiti zamrzavanjem ili drugačije preraditi kako je poznato u ovoj oblasti da bi se proizvelo biološko kontrolno sredstvo. U jednom izvođenju, taj postupak obuhvata mešanje hemijskog dodatka sa jednim ili više dodatnih sastojaka kao što je sredstvo za stabilizaciju, sredstvo za apsorpciju vlage, sredstvo za privlačenje, razblaživač, i/ili sredstvo protiv pravljenja pogače da bi se proizvela ovde opisana formulacija. U jednom izvođenju, postupak obuhvata uklanjanje spora iz supstrata mešanjem supstrata sa sterilnom vodom. U jednom izvođenju, postupak obuhvata mućkanje mešavine, filtriranje zgrudvanih ili grubih materijala, nežno centrifugiranje filtrata i varaćanje peletiranog materijala u suspenziju da bi se proizveo vodeni rastvor.

Dodatna izvođenja

[0058] U jednom izvođenju dat je postupak za regulisanje patogena biljke koji obuhvata isporučivanje BVT Cr-7 kao što je ovde opisano biljci ili biljnom materijalu. Na primer, BVT Cr-7 izolate, spore i formulacije kao što je ovde opisano moguće je koristiti kao profilaktičko sredstvo da bi se smanjila verovatnoća nastanka infekcije kod biljaka ili biljnih materijala, specifično infekcije patogenim gljivicama kao što je Botrytis ili Sclerotinia.

[0059] Takođe je dat postupak za kontrolisanje patogena kod biljaka, postupak koji obuhvata lečenje serije semena sa ovde opisanim kulturama ili formulacijama i zatim kultivisanje lečenog semena u biljke.

[0060] Takođe je obezbeđena formulacija koja obuhvata BVT Cr-7 kako je ovde opiano i nosač ili razblaživač, i opciono još obuhvata dodatno biokontrolno sredstvo kao što je sredstvo protiv gljivica ili pesticid. Ta formulacija može da bude formulacija za tretiranje semena, formulacija za tretiranje biljke, ili formulacija za tretiranje zemljišta. U jednom izvođenju, taj nosač ili razblaživač je poljoprivredno prihvatljiv nosač ili razblaživač koji pomaže da se osigura stabilnost i učinak te formulacije. U jednom izvođenju, nosač ili razblaživač je uporediv sa biološkim kontrolnim sredstvom, poljoprivredno prihvatljiv i ima dobar apsorpcioni kapacitet i pogodan je za gustinu rasutog matrijala, što omogućava lako raspršivanje i prianjanje čestice.

[0061] Ovde opisane formulacije koje sadrže BVT Cr-7 mogu, na primer, da se nanesu na seme ili reproduktivne čestice (tzv. propagule) biljaka, na podlogu za rast (npr. tlo ili vodu), Ili korenje biljaka i/ili lišće biljaka, na cvetove ili pistile biljaka, ili bilo koju njihovu kombinaciju. Primeri biljaka koje je moguće tretirati ovim formulacijama obuhvataju, ali se ne ograničavaju na poljoprivredne useve kao što su semenski usevi, žitarični usevi, usevi koji se gaje za proizvodnju vlakana, mahunarski usevi, hortikulturni usevi, šumski usevi, i buseni trave za travnjake.

[0062] Formulacije koje obuhvataju ovde opisanBVT Cr-7 moguće je naneti na biljku u vodenim sprejevima, granulama i formulacijama prašine/praha u skladu sa utvrđenom praksom u ovoj oblasti. Vodeni sprej se obično dobija mešanjem vlažnog pudera ili formulacije koncentrata emulgatora izolovane kulture ili spora BVT Cr-7 sa relativno velikom količinom vode da bi se formirala disperzija.

[0063] Gornji opis generalno opisuje ovu primenu. Potpunije razumevanje je moguće dobiti na osnovu specifičnih primera datih u nastavku. Ovi primeri su opisani isključivo u svrhu ilustracije i nisu predviđeni da ograniče obim opisa. Promene u obliku i supstituciji ekvivalenata se razmatraju kao okolnosti mogu nagovestiti ili dati ekspedijent. Iako se ovde koriste specifični uslovi, takvi pojmovi su predviđeni u opisnom smislu i nisu u svrhu ograničenja.

[0064] Sledeći neograničavajući primeri su ilustrativni iz ovog opisa:

PRIMERI

Primeri 1: Izolacija Clonostachys rosea f. rosea soja BVT Cr-7

[0065] Nekoliko vrsta poljoprivvrednih kultura (pšenica, soja, kukuruz, alfalfa, trave) su prikupljene u poljima blizu Gvelfa (Guelph), Ontario kao mogući izvori novih sojeva Clonostachys roseum f. roseu. Soj gljiva opisan ovde kao BVT Cr-7 je izolovan iz korena zdrave mlade biljke pšenice (stadijum ranih izdanaka) uzetih iz polja blizu Arkela (Arkell), Ontario. Niz drugih sojeva Clonostachys rosea f. rosea (BVT Cr-1 sve do BVT Cr-14) su takođe izolovani kao što je izneto dole.

[0066] Postupak korišćen da se izoluju Clonostachys sojevi iz korena biljaka pšenice i drugih useva je bio kao u nastavku. Sterilne tehnike su korišćene tokom celog postupka. Koreni iz nekoliko biljaka su oprani u vodi iz slavine da bi se uklonilo tlo, osušene suvim papirnim ubrusima i zatim su isečene u segmente dužine 1- 2 cm. Segmenti su osušeni suvim papirnim maramicama i inkubirani na parakvat-hloramfenikol agarnoj podlozi u Petrijevim posudama na 20 - 22°C. Parakvat ubrzava starenje korena, što omogućava da Clonostachys sporulira relativno brzo (npr. u roku od 6 - 8 dana) na površinama korena koje su prethodno kolonizovane. Strukture sporulacije (one nose konidiofore i konidije) su osnova da gljive budu prepoznate i identifikovane. Konidija (t.j. spore) je moguće ukloniti i rasklijati u kulturi.

[0067] Da bi se izolovala gljiva, spore su prenete na sterilnoj igli iz konidiofora na korenima krompir-dekstroza agarne (PDA) podloge izmenjene sa streptomicinom (da se potisnu bakterije) u Petrijevim posudama. Pošto su spore prokijale i proizvele kolonije na agar podlozi, gljiva je bila podkultivisana na PDA-streptomicin u Petrijevim posudama. Spore podkultura su suspendovane u sterilnoj destilovanoj vodi, i suspenzije su bile serijski razblažene i namazane na krompir dekstroza agarnu (PDA) podlogu. Kolonije koje rastu iz pojedinačnih spora su prenete na svežu agar podlogu u Petrijevim posudama i održane u kulturi na 4°C kao niz izolata za dalju karakterizaciju kao mogući biološki kontrolni agensi.

[0068] Niz izolovanih sojeva je zatim testiran i upoređen jedan sa drugim i sa utvrđenim sojevima Clonostachys rosea f. rosea uključujući 88-710 i EV-1a. Soj 88-710 su opisali Sutton et al., Evaluation of the Fungal Endophyte Clonostachys rosea as an Inoculant to Enhance Growth, Fitness and Productivity of Crop Plants. (Procena gljive endofit Clonostachys rosea kao inokulanta za pospešenje rasta, pogodnosti i produktivnosti poljoprivrednih kultura. Proc. IVth IS on Seed, Transplant and Stand Establishment of Hort. Crops (Zbornik IV IS o semenu, transplantatima i stadnardnom ustrojstvu hortikulturnih useva) Ed.: D.I. Leskovar, Acta Hort.782, ISHS 2008 pp.279-286.

[0069] Izolovan soj BVT Cr-7 [Bee-Vectoring Technology Clonostachys rosea #7] koji obuhvata i tehnologiju za prenošenje Clonostachys rosea # 7 pčelama je zatim identifikovan kao superioran izolat tokom eksperimentalnog dela kao što je izneto u Primerima 2 i 3. Izolovane kulture BVT Cr-7 su zatim održane i deponovane pod pristupnim brojem 040913-01 kod Međunarodnog depozitnog organa Kanade smeštenog u Nacionalnoj laboratoriji za mikrobiologiju, Agencija za javno zdravlje Kanade, 1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, R3E 3R2, Canada, 4. septembra 2013.

Primer 2: Testiranje i karakterizacija BVT Cr-7 u odnosu na druge sojeve Clonostachys rosea f. rosea

[0070] Novi izolovani soj BVT Cr-7 i dva dodatna soja Clonostachys rosea f. rosea (88-710 i EV- 1a) upoređeni su u serijama eksperimenata projektovanih da se procene njihova svojstva kao bioloških kontrolnih sredstava za tretiranje biljaka. BVT Cr-7 je primećen da je ekvivalent ili superioran u poređenju sa 88-710 i/ili EV-1a na osnovu svakog od sledećih kriterijuma:

<•>Rast i obilje proizvodnje spora na standardnoj agar podlozi i supstratima kao što su sterilisana semena žitarica (pšenica i ječam) koje je moguće koristiti za komercijalnu proizvodnju hemijskog dodatka.

• Sposobnost da uspostavi obilato unutar korena (t.j. endofitno) razliitih vrsta poljoprivrednih kultura uključujući sitnozrne žitarice, travu za travnjake, grašak, kanolu, soju, paprike, paradajz i krastavce.

<•>Sposobnost da se uspostavi endofitno u lišću i cveću nekoliko probnih biljaka (minjaturne ruže, jagoda, suncokreta, kanola).

Sposobnost da se potisne ili kontroliše široko spektar razornih bolesti koje utiču na lišće, cveće, voće i korenje, posebno one koje prouzrokuju Botrytis cinerea (bolesti sive plesni), Sclerotinia sclerotiorum (bolesti bele plesni) i vrste Pythium spp., Rhizoctonia, i Fusarium (koren truli i druge bolesti).

[0071] BVT Cr-7 dakle ispoljava željeni profil učinka protiv raznoraznih bolesti u razliitim vrstama useva i generalno ispoljava poželjnu aktivnost kao biološko kontrolno sredstvo u poređenju sa 88-710 i/ili EV-1a.

Primer 3: Učinka BVT Cr-7 za kontrolisanje bolesti kod biljaka

[0072] BVT Cr-7 je nanet na niz biljaka i useva da bi se procenila njihova aktivnost u ispitivanjima na terenu. Specifično, BVT Cr-7 je nanet na cveće sledećih biljaka (kao što su prenosnici pčele ili tretiranje raspršivanjem) za kontrolu bolesti prouzrokovanih specifičnim patogenima:

<•>SUNCOKRET: Sclerotinia, Botrytis, i Fusarium

<•>KANOLA: Sclerotinia

<•>BOROVNICA: Monilinia, Sclerotinia, Botrytis i Phomopsis

• JAGODE: Botrytis, Phomopsis, i Rhizopus

<•>MALINA: Botrytis

<•>GROŽĐE: Botrytis, Phomopsis

[0073] BVT Cr-7 je takođe nanet na korene hidroponskih useva u plasteniku (preko rastvora za prehranu) i bio je primećen da kontroliše bolesti prouzrokovane Pythium i Fusarium kod paprika, krastavaca i paradajza.

[0074] BVT Cr-7 je nanet na lišće (kao sprej) busen trave za travnjak, paprike iz plastenika i paradajz iz plastenika. BVT Cr-7 je pokazao da kontroliše bolesti prouzrokovane Sclerotinia, Typhula, i Microdochium u travi za travnjake, Fusarium u paprikama iz plastenika iBotrytis u paradajzu iz plastenika.

Ispitivanje na terenu BVT Cr-7 za tretiranje jagoda

[0075] Ispitivanje je izvedeno u Ontariu u kom je četiri kolonije bumbara pozicionirano u centru polja organskih jagoda na četri ara. Kutija ("košnica") svake kolonije je opremljena raspršivačem da pospe pčele formulacijom praha od BVT Cr-7 kada one izađu iz košnica. BVT Cr-7 je oporavljena iz više od 80% cvetova jagode u polju. Nivoi truljenja voća u polju u kom pčele vrše transfer BVT Cr-7 su bili izuzetno niski u poređenju sa obližnjim organskim poljem jagoda koje je bilo netretirano. U ovom ispitivanju BVT Cr-7 je potisnuo Botrytis truljenje bobica do >90%, Phomopsis truljenje bobica do 100%, i Rhizopus truljenje ("curenje") do 93%.

Ispitivanje na terenu BVT Cr-7 za tretiranje suncokreta

[0076] Test prenosa na terenu BVT Cr-7 putem bumbara je sproveden na suncokretima blizu Riplija (Ripley), Ontario. Ubrane semenke iz tretiranog polja i iz kontrolnog polja u ovom području (bez bumbara ili BVT Cr-7) su upoređene sa laboratorijskim ogledima. Klijanje semena iz tretiranja prenosom pčelama je bilo 27% više nego kod kontrolnih semena (t.j. 89,7% u poređenju sa 70,7%). BVT Cr-7 tretiranje je takođe smanjilo nivo nekolicine neželjenih plesni na semenkama (Fusarium, Botrytis, i Penicillium).

[0077] Bumbari su izraženo preneli BVT Cr-7 barem 360 m od košnica na cvetove. BVT Cr-7 delotvorno uspostavljen kao endofit u velikim proporcijama cvetova i semenki glava suncokreta. Štetni patogen Sclerotinia nije pronađen na glavama suncokreta koje je kolonizovao BVT Cr-7, ali je bio prisutan na 20 -25% glava izvan opsega BVT Cr-7 koji su prenele pčele. Uzgajivači su prijavili da seme daje povećanje veće od 20% (uticaj oprašivanja plus BVT Cr-7) i bolji kvalitet posebno seme veće dimenzije (i samim tim više uja) i smanjenje plesni na ubranim semenkama.

Ispitivanje na terenu BVT Cr-7 za tretiranje borovnice

[0078] Ispitivanja na ostrvu Princ Edvard (Prince Edward Island) su pokazala da BVT Cr-7 nanet pomoću bumbara kao formulacija u prahu ili kao sprej suspenzije spora u vodi može da se utvrdi endofitno u cvetovima, bobicama i lišću borovnica sa niskim žbunjem. Tretiranja su povećala udeo zdravih bobica za 70-100%. BVT Cr-7 je jako smanjio pojavu mumificiranih bobica, to je glavna bolest borovnice koju prouzrokuje gljiva Monilinia vaccinii-corymbosi uključujući i kada su klimatski uslovi izrazito pogodni za tu bolest. BVT Cr-7 takođe je značajno smanjio tamnjenje preuranjeno otpadanje bobica za što smo utvrdili da nastaje usled bolesti koja ovde nije opisana i prouzrokuje je Sclerotinia sclerotiorum. U jednogodišnjem ispitivanju, Sclerotinia bolest nije barem oštećujuća kao mumificiranje bobica kod netretiranih borovnica. Pravoremena primena BVT Cr-7 raspršivanjem su dale poboljšanje protiv Phomopsis propadanje u borovnicama niskog žbunja i u ispitivanju borovnica visokog žbunja u Ontariju. Dakle BVT Cr-7 je biološko kontrolno sredstvo širokog spektra protiv glavnih bolesti koje utiču na kupine u polju.

[0079] Clonostachys rosea f. rosea soj BVT Cr-7 je samim tim sposoban da kontroliše širok spektar bolesti koje imaju veći ekonomski značaj za brojne vrste useva.

Primeri 4: Učinak BVT Cr-7 u kontrolisanim uslovima

[0080] BVT Cr-7 je testiran na nekoliko specifičnih useva da bi se procenila njegova upotreba kao biološkog kontrolnog sredstva:

A. SADNICE KANOLE: Tretiranje semena sa BVT Cr-7 je dalo veoma jako suzbijanje visoko agresivnog soja Rhizoctonia solani u sterilizovanom zemljištu Pythium crveni koren u zemljištu na otvorenom polju.

B. UBRANE ŠARGAREPE (KORENI): BVT Cr-7 su u značajnoj meri suzbile Sclerotinia truljenje kada su sekundarno tretirane hemijskim dodatkom sa patogenom na šargarepama u simuliranom skladištu.

C. BROKOLI glave: Tretiranje raspršivanjem sa BVT Cr-7 je kontrolisalo Alternaria, Cladosporium i preuranjen gubitak boje uskladištenih glava brokolija.

D. BRESKVE: Primena magle BVT Cr-7 na sveže breskve je značajno suzbila pojavu i brzinu razvoja braon truljenja (Monilia) u tom voću.

E. KINESKA TRSKA: Potapanje rizoma Miscanthus u suspenziju spore BVT Cr-7 pre skladištenja je dalo zaštitu od truljenja usled Pythium, Fusarium i Rhizoctonia tokom nekoliko meseci hladnog skladištenja.

[0081] Na osnovu ovih rezultata BVT Cr-7 je pokazao širu potvrđeno visoku učinkovitu otpornosti na bolesti pri različitim uslovima kod više vrsta useva i drugih sojeva C. rosea f. rosea.

Primer 5: Tretiranje paradajza iz plastenika korišćenjem BVT Cr-7

[0082] Cvetovi paradajza iz plastenika su tretirani sa Clonostachys rosea BVT-Cr7 i netretirani kontrolni cvetovi, su ispitani na prisustvo Clonostachys rosea, Botrytis cinerea i uobičajene plesni.

[0083] C. rosea BVT Cr-7 je isporučena biljkama korišćenjem pčela kao prenosnika tako što je opremljena kutija kolonije (košnica bumbara) sa raspršivačem hemijskog dodatka da bi se isporučio taj hemijski dodatak na cveće paradajza u relativno malom komercijalnom plasteniku (manje od četvrtine ara) na test lokaciji u Novoj Škotskoj, u Kanadi.

Laboratorijski postupci

[0084] Uzorci cvetova paradajza su primljeni u odličnom stanju sa lokacije za testiranje. Svaki uzorak je obuhvatao četiri cveta u maloj plastičnoj kesi. Četiri cveta svakog uzorka su postavljena na Parakvat-hloramfenikol agar (PCA) podlogu u Petrijevim posudama 20. juna 2014. i inkubirani u providnim plastičnim kutijama na 21-25°C na dnevnom svetlu bez direktnog sunca tokom 7 dana. Svaki cvet je zatim procenjen mikroskopski za Clonostachys rosea, Botrytis cinerea i uobičajene plesni. Parakvat ubrzava prirodno starenje tkiva biljke i time dozvoljava Clonostachys rosea da proizvodi spore i tako bude identifikovan. Druge gljive mogu takođe da rastu i da stvaraju spore na tkivima dok ona stare i umiru.

Rezultati

[0085] Kako je prikazano u Tabeli 1, sporulacija biološkog kontrolnog sredstva Clonostachys rosea BVT Cr-7 je primećena 87,5% tretiranih cvetova i 0% netretiranih cvetova. Stvaranje spora C. rosea na skupinama prašnika plus tučkova tretiranih cvetova je bila gusta i ekstensivna u skoro svim slučajevima, tako da je oblik sličan kupi ovih skupina izgledao skoro u potpunosti beo. Stvaranje spora na laticama većine tretiranih cvetova je bilo umereno do izraženo.

[0086] Stvaranje spora patogena Botrytis cinerea je utvrđeno na 12% netretiranih cvetova (i bilo je blago u svim slučajevima) i 0% cvetova tretiranih sa C. rosea.

[0087] Najčešće plesni u plastenicima su primećene pri različitim stepenima na uzorcima. U suštini, obuhvataju vrste Cladosporium (ne Fulvia fulvum), Aspergillus, i Penicillium, Alternaria alternata i gljiva koja liči na Acremonium. Da bi se dobila kvantitativna informacija o efektima C. rosea na ove plesni, svaki cvet je procenjen za "Plesni" (t.j. bilo koja gljiva koja nije C. rosea ili Botrytis) na skali od 1-5 predstavljenoj u Tabeli 1, sa 1 koja predstavlja nulti trag plesni i 5 koja predstavlja veoma izraženu prisutnost plesni. Područja cvetova sa sporulacijom ovih plesni su veoma niska (srednja brzina 1,80/5,00) u cvetovima na kojima je C. rosea uspostavljena i sporulacija ipak visoka (4,55/5,00) u odsustvu C. rosea (uključujući sve cvetove iz kontrolne grupe). Biološko kontrolno sredstvo BVT Cr-7 je dakle primećeno da značajno potiskuje ove plesni pored Botrytis. U suštini zasađeno cveće C. rosea tretiranje je izgledalo veoma "čisto" u poređenju sa netretiranim cvetovima.

Tabela 1: Rezultati iz ispitivanja BVT Cr-7 raspršenog korišćenjem pčela kao prenosnika u plasteniku. * Skala za područje zasađenog cveća je pokriveno sa jednim ili više ovih plesni je imala: 1= nulti trag; 2, blagi; 3, umereno blagi; 4, umereno težak; 5, veoma težak.

[0088] Značajno, upotreba pčela kao prenosnika za isporuku BVT-Cr7 hemijskog dodatka je omogućila brzo i detaljno endofitno uspostavljanje biološkog kontrolnog sredstva u cveću kako je procenjeno na osnovu značajnih nivoa sporulacije primećenih posle inkubiranja cvetova na period od nedelju dana na parakvat-hloramfenikol agar (PCA) podlozi.

[0089] Odlično uspostavljanje C. rosea u skupinama od "prašnika plus strukture unutar samog cveta" je primećeno i od posebnog je značaja imajući u vidu da su ovi osnovni portali unosa patogeni.

[0090] Očigledno potpuno suzbijanje B. cinerea i glavno suzbijanje različitih plesni unutar plastenika kod cvetova kolonizovanih putem C. rosea je primećeno da ukazuje na širok spektar sposobnosti i aktivnosti BVT Cr-7 protiv drugih gljiva (kao što je konkurentno isključivanje).

Međunarodni depozitni organ Kanade (IDAC)

Nacionalna laboratorija za mikrobiologiju, Agencija za javno zdravlje Kanade

1015 ARLINGTON Street Tel: (204) 789-6030 Vinipeg, Manitoba Kanada R3E 3R2 Tel: (204) 789-2018 Međunarodni obrazac IDAC/BP/4

POTVRDA O PRIJEMU U SLUČAJU IZVORNOG DEPOZITA

(izdata u skladu sa Pravilom 7.1 odredbi Budimpeštanskog sporazuma)

PRILOŽITI PRIMERKE ORIGINALNOG UGOVORA O DEPONOVANJU I IZJAVU U VEZI SA VITALNOŠĆU

Prijem u slučaju originalnog depozita 1 / 1 Spis # 162 (13) Međunarodni depozitni organ Kanade

Nacionalna laboratorija za mikrobiologiju, Agencija za javno zdravlje Kanade

1015 ARLINGTON Street Tel: (204) 789-6030 Vinipeg, Manitoba Kanada R3E 3R2 Tel: (204) 789-2018 Međunarodni obrazac IDAC/BP/4

IZJAVA O VITALNOSTI

(izdata u skladu sa Pravilom 10.2 odredbi Budimpeštanskog sporazuma)

<1>Navesti podatke o izvornom depozitu ili, u slučaju novog depozita ili prenosa, najnoviji relevantan datum (datum novog depozita ili datum prenosa)

2 Popuniti ako se ta informacija traži i ako su rezultati provere negativni

Izjava o vitalnost 1/1 Spis # 162 (13)

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Izolovana kultura Clonostachys rosea f. rosea, pri čemu je izolovana kultura Clonostachys rosea f. rosea soja IDAC 040913-01.

2. Gljivična spora dobijena iz izolovane kulture Clonostachys rosea f. rosea iz patentnog zahteva 1.

3. Formulacija koja obuhvata izolovanu kulturu iz patentnog zahteva 1 ili gljivičnu sporu prema patentnom zahtevu 2 i nosač ili razblaživač.

4. Formulacija iz patentnog zahteva 3, pri čemu je ta formulacija u tečnom obliku ili u čvrstom obliku.

5. Formulacija iz patentnog zahteva 3 ili 4, pri čemu ta formulacija obuhvata između oko 1 x 10<8>i 4 x 10<8>spora po gramu formulacije, opciono između oko 2 x 10<8>i 4 x 10<8>spora po gramu formulacije.

6. Postupak za tretiranje biljke sa biološkim kontrolnim agensom koji obuhvata dovođenje u kontakt sa izolovanom kulturom, gljivične spore ili formulacije iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 5.

7. Postupak iz patentnog zahteva 6, za:

a) poboljšanje zdravlja, rast i/ili prinosa biljke;

b) za sprečavanje ili lečenje bolesti i/ili patogena u biljci;

c) za kontrolisanje rasta plesni na biljci; ili

d) za poboljšanje klijanja semena biljke.

8. Postupak iz patentnog zahteva 7, pri čemu je patogen Botrytis cinerea, Sclerotinia sclerotiorum, Pythium spp., Alternaria, Monilia, Monilinia, Colletotrichum, Cladosporium Rhizoctonia, Streptomyces, Didymella i/ili Fusarium ili pri čemu je ta bolest bolest sive plesni, bolest bele plesni, braon truljenja, trulog korenja i/ili fomopsis.

9. Postupak iz patentnih zahteva 7 ili 8, pri čemu se biljka bira iz suncokreta, kanole, borovnica, jagoda, grožđa, paprika, kratavaca, paradajza, travi za travnjak, papričica, paradajza, brokolija, bresaka, sadnica kanole i/ili kineske trske.

10. Postupak iz bilo kog od patentnih zahteva 6 do 9, pri čemu kod te izolovane kulture, gljivična spora ili formulacija obuhvata nanošenje spreja, magle, umaka, ili hranljivog rastvora na biljku.

11. Postupak iz bilo kog od patentnih zahteva 6 do 9, pri čemu dovođenje u kontakt izolovane kulture, gljivične spore ili formulacije obuhvata prenošenje insektima.

12. Upotreba izolovane kulture, gljivične spore ili formulacije iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 5 kao biološkog kontrolnog sredstva.

13. Postupak za smanjenje uništenosti biljnog materijala, taj postupak obuhvata dovođenje u kontakt biljnog materijala sa izolovanom kulturom, gljivičnom sporom ili formulacijom iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 5, opciono pri čemu je biljni materijal ubran.

14. Postupak za proizvodnju biološkog kontrolnog sredstva, taj postupak obuhvata:

inokulacija supstrata sa izolovanom kulturom iz patentnog zahteva 1; i inkubiranje supstrata pod uslovima pogodnim za gljivični rast da bi se proizveo Clonostachys rosea f. Rosea soj BVT Cr-7.

15. Postupak iz patentnog zahteva 14, pri čemu je taj supstrat sterilan supstrat, opcionosterilne semenke kao što su semenke ječma.

Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5