RS58536B1 - Ne-humane životinje koje imaju humanizovani gen klastera diferencijacije 47 - Google Patents

Ne-humane životinje koje imaju humanizovani gen klastera diferencijacije 47

Info

Publication number
RS58536B1
RS58536B1 RS20190370A RSP20190370A RS58536B1 RS 58536 B1 RS58536 B1 RS 58536B1 RS 20190370 A RS20190370 A RS 20190370A RS P20190370 A RSP20190370 A RS P20190370A RS 58536 B1 RS58536 B1 RS 58536B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
human
gene
rodent
humanized
endogenous
Prior art date
Application number
RS20190370A
Other languages
English (en)
Inventor
Cagan Gurer
Ella Ioffe
Alexander Mujica
Gavin Thurston
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=54979926&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS58536(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS58536B1 publication Critical patent/RS58536B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/5055—Cells of the immune system involving macrophages
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/12—Animals modified by administration of exogenous cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A01K2217/052—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing gain of function
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0381—Animal model for diseases of the hematopoietic system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)

Description

Opis
UNAKRSNA REFERENCA NA POVEZANE PRIJAVE
[0001] Ova prijava traži prava privremene prijave patenta u SAD br. 62/087,992, podnesene 5. decembra 2014.
LISTA SEKVENCI
[0002] Lista sekvenci u ASCII tekstualnoj datoteci, pod nazivom 32584_10108WO01_SequenceListing.txt od 96,0 KB, sačinjena 23. novembra 2015, podneta je Zavodu za patente i žigove Sjedinjenih Američkih Država putem EFS-Web.
STANJE TEHNIKE
[0003] Terapija raka se može podeliti u četiri glavne kategorije: hemioterapiju/radioterapiju, hormonsku terapiju, ciljanu terapiju i imunoterapiju. Intenzivan fokus medicinskih istraživanja i razvoja fokusiran je na ciljanu terapiju i napravljena su značajna poboljšanja na tom polju, međutim rak ostaje veliki izazov za pacijente i industriju zdravstvene zaštite širom sveta. Ovaj veliki izazov je, delimično, posledica sposobnosti ćelija raka da izbegnu mehanizme praćenja urođenog i adaptivnog imunološkog sistema, što je delimično rezultat inhibicije fagocitnog klirensa. Trenutno ne postoji in vivo sistem koji bi optimalno odredio terapijski potencijal novih terapija protiv raka koje su dizajnirane tako da aktiviraju fagocitni klirens ćelija raka i odrede molekularne aspekte načina na koji ćelije raka obezbeđuju inhibitorne signale makrofagama i fagocitnim ćelijama. Takav sistem obezbeđuje izvor za ispitivanja funkcija fagocitoze i makrofaga in vivo, i identifikaciju novih terapija raka koje su usmerene na obezbeđivanje antitumorskog okruženja promovisanjem pro-fagocitnih signala usmerenih na imuni sistem.
[0004] WO2007/033221 odnosi se na postupke i jedinjenja za inhibiciju imunskih odgovora. WO2013/063556 odnosi se na humanizovani IL-6 i IL-6 receptor.
KRATAK PRIKAZ PRONALASKA
[0005] Predmetni pronalazak se zasniva na prepoznavanju potrebe za genetskom modifikacijom ne-humanih životinja u cilju poboljšanja sistema za identifikaciju i razvoj novih terapeutika za lečenje raka. Predmetni pronalazak se takođe zasniva na prepoznavanju potrebe za genetskom modifikacijom ne-humanih životinja u cilju poboljšanja graftovanja humanih hematopoetskih matičnih ćelija. Dalje, ovaj pronalazak se takođe zasniva na prepoznavanju da su ne-humane životinje, koje imaju humanizovani CD47 gen i/ili na drugi način eksprimuju, sadrže ili proizvode humani ili humanizovani CD47 polipeptid, poželjne, na primer za upotrebu u identifikovanju i razvoju terapijskih sredstava protiv raka koji prevazilaze sistemsku toksičnost povezanu sa blokadom CD47 i prevazilaze CD47-posredovanu inhibiciju fagocitoze tumorskih ćelija, i obezbeđuju efikasniji in vivo sistem za graftovanje humanih hematopoetskih matičnih ćelija koje obezbeđuju povećanje homeostaze šireg broja tipova humanih ćelija.
[0006] Ovaj pronalazak obezbeđuje glodara čiji genom sadrži humanizovani CD47 gen, pri čemu humanizovani CD47 gen sadrži egzon 1 endogenog CD47 gena glodara, egzone 2-7 humanog CD47 gena i egzone nishodno od egzona 7 endogenog CD47 gena glodara, pri čemu je humanizovani CD47 gen operabilno vezan za endogeni CD47 promotor glodara.
[0007] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje izolovanu ćeliju ili tkivo glodara čiji genom sadrži humanizovani CD47 gen, pri čemu humanizovani CD47 gen sadrži egzon 1 endogenog CD47 gena glodara, egzone 2-7 humanog CD47 gena i egzone nishodno od egzona 7 endogenog CD47 gena glodara, pri čemu je humanizovani CD47 gen operabilno vezan za endogeni CD47 promotor glodara, i opciono ćelija ili tkivo glodara su ćelija miša ili tkivo miša, ili ćelija pacova ili tkivo pacova.
[0008] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje embrion glodara generisan iz embrionalnih matičnih ćelija ovog pronalaska.
[0009] Ovaj pronalazak dodatno obezbeđuje postupak obezbeđivanja glodara čiji genom sadrži CD47 gen koji kodira ekstracelularni deo humanog CD47 polipeptida vezanog za intracelularni deo endogenog CD47 polipeptida, postupak koji obuhvata modifikovanje genoma glodara tako da on sadrži humanizovani CD47 gen, pri čemu humanizovani CD47 gen sadrži egzon 1 endogenog CD47 gena glodara, egzone 2-7 humanog CD47 gena, i egzone nishodno od egzona 7 endogenog CD47 gena glodara, pri čemu je humanizovani CD47 gen operabilno vezan za endogeni CD47 promotor glodara, čime se obezbeđuje pomenuti glodar.
[0010] Pronalazak takođe obezbeđuje postupak za procenu graftovanja humanih ćelija, pri čemu navedeni postupak obuhvata procenu graftovanja humanih ćelija kod glodara prema ovom pronalasku, pri čemu su humane ćelije opciono hematopoetske matične ćelije.
[0011] Pronalazak dalje obezbeđuje postupak za procenu terapijske efikasnosti leka koji cilja humane ćelije, a taj postupak obuhvata: primenu kandidata za lek na glodaru iz ovog pronalaska u koga je transplantirana jedna ili više humanih ćelija; i praćenje humanih ćelija u glodaru da bi se odredila terapijska efikasnost kandidata za lek.
[0012] Ovde je opisana ne-humana životinja koja ima genom koji sadrži CD47 gen koji uključuje genetski materijal iz dve različite vrste (npr. humani i ne-humani). CD47 gen nehumanih životinja, kao što je ovde opisan, može kodirati CD47 polipeptid koji sadrži humane i ne-humane delove, pri čemu su humani i ne-humani delovi međusobno povezani i formiraju funkcionalni CD47 polipeptid.
[0013] Ovde opisana ne-humana životinja može da sadrži CD47 gen koji sadrži endogeni deo i humani deo, pri čemu su endogeni i humani delovi operabilno vezani za endogeni promotor.
[0014] Endogeni deo može da sadrži egzon 1 i egzone nishodno od egzona 7 endogenog CD47 gena. Egzon 1 i egzoni nishodno od egzona 7 endogenog CD47 gena mogu biti najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80% najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identični odgovarajućem egzonu 1 i egzonima nishodno od egzona 7 mišjeg CD47 gena koji se pojavljuje u Tabeli 3. Ekon 1 i egzoni nishodno od egzona 7 endogenog CD47 gena može biti identičan odgovarajućem egzonu 1 i egzonima nishodno od egzona 7 mišjeg CD47 gena koji se pojavljuje u Tabeli 3.
[0015] Humani deo može da kodira aminokiseline 16-292 humanog CD47 polipeptida. Humani deo može da kodira aminokiseline 19-292 humanog CD47 polipeptida. Humani deo može da kodira aminokiseline 19-141 humanog CD47 polipeptida. Humani deo može da kodira aminokiseline 19-127 humanog CD47 polipeptida. Humani deo može da sadrži egzone 2-7 humanog CD47 gena.
[0016] Egzoni 2-7 humanog CD47 gena mogu biti najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identični odgovarajućim egzonima 2-7 humanog CD47 gena koji se pojavljuju u Tabeli 3. Egzoni 2-7 humanog CD47 gena mogu biti identični odgovarajućim egzonima 2-7 humanog CD47 gena koji se pojavljuje u Tabeli 3.
[0017] Ovde opisana ne-humana životinja može da eksprimuje CD47 polipeptid koji sadrži ekstracelularni deo humanog CD47 polipeptida i intracelularni deo endogenog CD47 polipeptida. CD47 polipeptid može da sadrži transmembranski deo humanog CD47 polipeptida. CD47 polipeptid može da sadrži transmembranski deo ne-humanog CD47 polipeptida. CD47 polipeptid može biti translantovan u ćeliju ne-humane životinje sa nehumanim signalnim peptidom. Ne-humani signalni peptid može biti signalni peptid glodara (npr. miša ili pacova).
[0018] Ovde opisani CD47 polipeptid može biti eksprimovan iz endogenog ne-humanog CD47 gena.
[0019] Intracelularni deo endogenog CD47 polipeptida može da sadrži intracitoplazmatski rep koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75% najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identična intracitoplazmatskom repu mišjeg CD47 polipeptida koji se pojavljuje u Tabeli 3. Intracelularni deo endogenog CD47 polipeptida može sadržati intracitoplazmatski rep koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je identična intracitoplazmatskom repu mišjeg CD47 polipeptida koji se pojavljuje u Tabeli 3.
[0020] Ekstracelularni deo humanog CD47 polipeptida može da sadrži aminokiseline koje odgovaraju reziduima 19-141 humanog CD47 polipeptida. Ekstracelularni deo humanog CD47 polipeptida može da sadrži aminokiseline koje odgovaraju reziduima 19-127 humanog CD47 polipeptida. Ekstracelularni deo humanog CD47 polipeptida može sadržati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identična odgovarajućoj aminokiselinskoj sekvenci ekstracelularnog dela humanog CD47 polipeptida koji se pojavljuje u Tabeli 3. Ekstracelularni deo humanog CD47 polipeptida može sadržati aminokiselinsku sekvencu koja je identična odgovarajućoj aminokiselinskoj sekvenci ekstracelularnog dela humanog CD47 polipeptida koji se pojavljuje u Tabeli 3.
[0021] Ovde je takođe opisan CD47 polipeptid kodiran od strane CD47 gena ne-humane životinje, kao što je ovde opisana. Kodirani CD47 polipeptid može sadržati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85% %, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identična sa SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 ili SEQ ID NO: 20. Kodirani CD47 polipeptid može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je identična sa SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID N0: 19 ili SEQ ID N0: 20.
[0022] Humanizovani CD47 gen koji sadrži jedan ili više egzona ne-humanog CD47 gena koji je operabilno vezan za jedan ili više egzona humanog CD47 gena. Humanizovani CD47 gen koji je ovde opisan može da obuhvati ne-humane egzone koji kodiraju intracelularni deo CD47 polipeptida i humane egzone koji kodiraju ekstracelularni deo humanog CD47 polipeptida. Humanizovani CD47 gen može takođe da sadrži humane egzone koji kodiraju transmembranski deo humanog CD47 polipeptida. Ovde opisan humanizovani CD47 gen može da obuhvati ne-humane egzone koji kodiraju signalni peptid, u celini ili delimično, i intracelularni deo CD47 polipeptida, i humane egzone koji kodiraju ekstracelularni deo i opciono transmembranski deo CD47 polipeptida.
[0023] Ovde je takođe opisana izolovana ćelija ili tkivo ne-humane životinje, kao što je ovde opisana. Opisana je izolovana ćelija ili tkivo koje sadrži CD47 gen, kao što je ovde opisan. Ćelija može biti izabrana iz dendritske ćelije, limfocita (npr. B ili T ćelija), makrofaga i monocita. Tkivo može biti: adipozno tkivo, tkivo bešike, mozga, dojke, koštane srži, oka, srca, creva, bubrega, jetre, pluća, limfnog čvora, mišića, pankreasa, plazme, seruma, kože, slezine, želuca, timusa, testisa, jajne ćelije, kao i njihova kombinacija.
[0024] Ovde je takođe opisana ne-humana embrionalna matična ćelija čiji genom sadrži CD47 gen kao što je ovde opisan. Ne-humane embrionalne matične ćelije mogu biti mišje embrionalne matične ćelije, i to od sojeva 129, C57BL/6 ili BALB/c. Ne-humane embrionalne matične ćelije mogu biti mišje embrionalne matične ćelije i mogu biti iz mešavine sojeva 129 i C57BL/6.
[0025] Ovde je takođe opisana upotreba ne-humane embrionalne matične ćelije kao što je ovde opisana da se dobije ne-humana životinja. Ne-humana embrionalna matična ćelija može biti mišja embrionalna matična ćelija i može se koristiti za dobijanje miša koji sadrži CD47 gen kao što je ovde opisan. Ne-humana embrionalna matična ćelija može biti embrionalna matična ćelija pacova i može se koristiti za dobijanje pacova koji sadrži CD47 gen kao što je ovde opisan.
[0026] Ovde je takođe opisan ne-humani embrion koji sadrži, načinjen je od, dobijen iz, ili generisan od ne-humane embrionalne matične ćelije koja sadrži CD47 gen kao što je ovde opisan. Ne-humani embrion može biti embrion glodara. Embrion glodara može biti embrion miša. Embrion glodara može biti embrion pacova.
[0027] Takođe je ovde opisan postupak dobijanja ne-humane životinje koja eksprimuje CD47 polipeptid iz endogenog CD47 gena, gde CD47 polipeptid sadrži humanu sekvencu, postupak koji uključuje umetanje genomskog fragmenta u endogeni CD47 gen u ne-humanoj embrionalnoj matičnoj ćeliji, navedeni genomski fragment sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira humani CD47 polipeptid u celini ili delimično; dobijanje ne-humane embrionalne matične ćelije koja sadrži endogeni CD47 gen koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira humani CD47 polipeptid u celini ili delimično; i stvaranje ne-humane životinje koristeći ne-humanu embrionalnuu matičnu ćeliju koja sadrži navedenu nukleotidnu sekvencu koja kodira humani CD47 polipeptid u celini ili delimično.
[0028] Humana sekvenca može da sadrži aminokiseline koje odgovaraju reziduima 19-141 (ili 19-292) humanog CD47 polipeptida. Humana sekvenca može da sadrži amino kiseline koje odgovaraju reziduima 19-127 humanog CD47 polipeptida.
[0029] Nukleotidna sekvenca može sadržati egzone 2-7 humanog CD47 gena. Nukleotidna sekvenca može sadržati jedan ili više selekcionih markera. Nukleotidna sekvenca može sadržati jedno ili više specifičnih mesta za rekombinaciju.
[0030] Postupak može dalje da sadrži korak umetanja genomskog fragmenta u endogeni SIRPα gen ne-humane embrionalne matične ćelije, pri čemu navedeni genomski fragment sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira humani SIRPα polipeptid u celini ili delimično (npr. kodira ekstracelularni dio humanog SIRPα polipeptida). Genomski fragment može da sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira humani SIRPα polipeptid u celini ili delimično (npr. kodira ekstracelularni deo humanog SIRPα polipeptida) i ubacuje se u endogeni SIRPα gen nehumane embrionalne matične ćelije pre umetanja u endogeni CD47 gen.
[0031] Postupak može dalje obuhvatiti ukrštanje ne-humane životinje koja sadrži endogeni CD47 gen koji uključuje nukleotidnu sekvencu koja kodira humani CD47 polipeptid, u celini ili delimično, sa drugom ne-humanom životinjom, gde navedena druga životinja ima genom koji sadrži SIRPα gen koji kodira SIRPα polipeptid koji sadrži ekstracelularni deo humanog SIRPα polipeptida (npr. aminokiseline koje odgovaraju reziduima 28-362 humanog SIRPα polipeptida) i intracelularni deo endogenog SIRPα polipeptida.
[0032] Ovde je takođe opisan postupak obezbeđivanja ne-humane životinje čiji genom sadrži CD47 gen koji kodira ekstracelularni deo humanog CD47 polipeptida vezanog za intracelularni deo endogenog CD47 polipeptida, postupak koji obuhvata modifikovanje genoma ne-humane životinje tako da sadrži CD47 gen koji kodira ekstracelularni deo humanog CD47 polipeptida koji je vezan za intracelularni deo endogenog CD47 polipeptida i na taj način obezbeđuje pomenutu ne-humanu životinju. CD47 gen može kodirati CD47 polipeptid koji sadrži ekstracelularni deo i transmembranski deo humanog CD47 polipeptida vezanog za intracelularni deo endogenog ne-humanog CD47 polipeptida. CD47 gen može kodirati CD47 polipeptid koji sadrži ekstracelularni deo humanog CD47 polipeptida vezanog za transmembranski deo i intracelularni deo endogenog ne-humanog CD47 polipeptida.
[0033] Modifikovanje genoma ne-humane životinje može biti izvedeno u ne-humanoj embrionalnoj matičnoj ćeliji. Ne-humana embrionalna matična ćelija može biti embrionalna matična ćelija glodara; embrionalna matična ćelija miša; ili embrionalna matična ćelija pacova.
[0034] Postupak može dalje da sadrži modifikovanje genoma ne-humane životinje tako da sadrži SIRPα gen koji kodira ekstracelularni deo humanog SIRPα polipeptida (npr. aminokiseline koje odgovaraju reziduima 28-362 humanog SIRPα polipeptida) vezanih za intracelularni deo endogenog SIRPα polipeptida. Modifikovanje genoma ne-humane životinje tako da sadrži SIRPα gen koji kodira ekstracelularni deo humanog SIRPα polipeptida (npr. aminokiseline koje odgovaraju reziduima 28-362 humanog SIRPα polipeptida) vezanog za intracelularni deo endogenog SIRPα polipeptida može biti izvedeno pre modifikovanja genoma ne-humane životinje tako da sadrži CD47 gen koji kodira ekstracelularni deo i opciono transmembranski deo humanog CD47 polipeptida vezanog za intracelularni deo endogenog CD47 polipeptida.
[0035] Postupak može dalje obuhvatiti ukrštanje ne-humane životinje čiji genom sadrži CD47 gen koji kodira ekstracelularni deo humanog CD47 polipeptida vezanog za intracelularni deo endogenog CD47 polipeptida sa drugom ne-humanom životinjom, gde navedena druga nehumana životinja ima genom koji sadrži SIRPα gen koji kodira SIRPα polipeptid koji sadrži ekstracelularni deo humanog SIRPα polipeptida (npr. aminokiseline koje odgovaraju reziduima 28-362 humanog SIRPα polipeptida) i intracelularni deo endogenog SIRPα polipeptida.
[0036] Ovde je takođe opisana ne-humana životinja koja se može dobiti postupcima kao što su ovde opisani.
[0037] Ovde je takođe opisan postupak graftovanja humanih ćelija kod ne-humane životinje, a postupak sadrži korake obezbeđivanja ne-humane životinje čiji genom sadrži CD47 gen koji kodira ekstracelularni deo humanog CD47 polipeptida vezanog za intracelularni deo endogenog CD47 polipeptida; i transplantacije jedne ili više humanih ćelija u navedenu nehumanu životinju. Postupak može dalje da sadrži korak ispitivanja graftovanja jedne ili više humanih ćelija kod navedene ne-humane životinje. Korak ispitivanja može obuhvatiti upoređivanje graftovanja jedne ili više humanih ćelija sa graftovanjem kod jedne ili više nehumanih životinja divljeg tipa ili kod jedne ili više ne-humanih životinja čiji genom ne sadrži CD47 gen koji kodira ekstracelularni deo humanog CD47 polipeptida vezanog za intracelularni deo endogenog CD47 polipeptida.
[0038] Humane ćelije mogu biti hematopoetske matične ćelije. Humane ćelije se mogu transplantovati intravenozno. Humane ćelije mogu biti transplantovane intraperitonealno. Humane ćelije mogu biti transplantovane supkutano.
[0039] Ovde je takođe opisan postupak procene terapijske efikasnosti leka koji cilja humane ćelije, a postupak obuhvata obezbeđivanje ne-humane životinje čiji genom sadrži CD47 gen koji kodira ekstracelularni deo humanog CD47 polipeptida vezanog za intracelularni deo endogenog CD47 polipeptida; transplantacije jedne ili više humanih ćelija u navedenu nehumanu životinju; davanja kandidata za lek navedenoj ne-humanoj životinji; i praćenje humanih ćelija u ne-humanoj životinji da bi se odredila terapijska efikasnost kandidata za lek.
[0040] Humane ćelije mogu biti ćelije raka, a kandidat za lek može biti kandidat za lek protiv raka. Kandidat za lek može biti antitelo.
[0041] Ne-humana životinja dalje može sadržati humane ćelije imunološkog sistema. Kandidat za lek može biti bispecifično antitelo koje vezuje humani CD47 i antigen na transplantiranim humanim ćelijama raka.
[0042] Ovde je takođe opisan postupak koji obuhvata obezbeđivanje jedne ili više ćelija čiji genom uključuje CD47 gen koji kodira ekstracelularni deo humanog CD47 polipeptida vezanog za intracelularni deo endogenog CD47 polipeptida; inkubiranje jedne ili više ćelija sa obeleženim supstratom; i merenje fagocitoze obeleženog supstrata pomoću te jedne ili više ćelija. Supstrat može biti fluorescentno obeležen. Supstrat može biti obeležen antitelom. Supstrat može biti jedno ili više crvenih krvnih zrnaca. Supstrat može biti jedna ili više bakterijskih ćelija. Supstrat može biti jedna ili više tumorskih ćelija.
[0043] Ovde je takođe opisan postupak koji obuhvata obezbeđivanje ne-humane životinje čiji genom uključuje CD47 gen koji kodira ekstracelularni deo humanog CD47 polipeptida vezanog za intracelularni deo endogenog CD47 polipeptida; izlaganje ne-humane životinje antigenu; i merenje fagocitoze antigena pomoću jedne ili više ćelija ne-humane životinje. Korak izlaganja može obuhvatiti izlaganje ne-humane životinje antigenu koji je fluorescentno obeležen. Korak izlaganja može obuhvatiti izlaganje ne-humane životinje jednoj ili više ćelija koje sadrže antigen. Korak izlaganja može obuhvatiti izlaganje ne-humane životinje jednoj ili više humanih ćelija koje sadrže antigen ili jednoj ili više bakterijskih ćelija koje sadrže antigen. Korak izlaganja može obuhvatiti izlaganje ne-humane životinje jednoj ili više ćelija koje su transformisane antigenom tako da se antigen eksprimuje na površinu te jedne ili više transformisanih ćelija. Korak izlaganja može obuhvatiti izlaganje ne-humane životinje jednoj ili više tumorskih ćelija koje sadrže antigen.
[0044] Ovde su takođe opisani postupci za identifikaciju ili validaciju leka ili vakcine, postupak koji sadrži korake davanja leka ili vakcine ne-humanoj životinji čiji genom uključuje CD47 gen koji kodira ekstracelularni deo humanog CD47 polipeptida vezanog za intracelularni deo endogenog CD47 polipeptida, i praćenje jednog ili više imunih odgovora na lek ili vakcinu, profil bezbednosti leka ili vakcine, ili efekat na bolest ili stanje. Praćenje profila bezbednosti može uključivati utvrđivanje da li ne-humana životinja ispoljava neželjeno dejstvo ili neželjenu reakciju kao rezultat primanja leka ili vakcine. Neželjeno dejstvo ili neželjena reakcija može uključivati: morbiditet, mortalitet, promenu telesne težine, promenu nivoa jednog ili više enzima (npr. jetre), promenu težine jednog ili više organa, gubitak funkcije (npr. senzorne, motorne, funkcije organa itd.), povećanu osetljivost na jednu ili više bolesti, promene u genomu nehumane životinje, povećano ili smanjeno konzumiranje hrane i komplikacije jedne ili više bolesti.
[0045] Ovde je takođe opisana upotreba ne-humane životinje kao što je ovde opisana u razvoju leka ili vakcine za upotrebu u medicini, kao što je upotreba u vidu medikamenta.
[0046] Ovde je takođe opisana upotreba ne-humane životinje kao što je ovde opisana u proizvodnji medikamenta za lečenje raka ili neoplazme.
[0047] Ovde je takođe opisana upotreba ne-humane životinje kao što je ovde opisana za procenu efikasnosti terapijskog leka koji cilja ljudske ćelije. Ovde opisanoj ne-humanoj životinji mogu biti transplantirane humane ćelije, a kandidat za lek koji cilja pomenute humane ćelije može biti dat životinji. Efikasnost leka može se odrediti praćenjem humanih ćelija u nehumanoj životinji nakon davanja leka.
[0048] Ovde je takođe opisana ne-humana životinja ili ćelija kao što je ovde opisana za upotrebu u razvoju i/ili identifikaciji leka (npr. antitela) za terapiju ili dijagnozu.
[0049] Ovde je takođe opisana ne-humana životinja ili ćelija kao što je ovde opisana za upotrebu u razvoju i/ili identifikaciji leka (npr. antitela) za lečenje, prevenciju ili ublažavanje raka ili neoplazme.
[0050] Ovde je takođe opisan postupak za procenu farmakokinetike leka koji cilja humani CD47, postupak koji obuhvata korake davanja leka ne-humanoj životinji kao što je ovde opisana, i sprovođenje ispitivanja za određivanje jedne ili više farmakokinetičkih osobina leka koji cilja humani CD47.
[0051] Ovde je takođe opisan postupak za procenu toksičnosti leka koji cilja humani CD47, postupak koji se sastoji od koraka davanja leka ne-humanoj životinji, kao što je ovde opisana, i sprovođenje ispitivanja za jedan ili više parametara povezanih sa toksičnošću leka na ciljnom mestu.
[0052] Ovde je takođe opisan postupak za procenu toksičnosti leka koji cilja humani CD47, postupak koji se sastoji od koraka davanja leka ne-humanoj životinji, kao što je ovde opisana, i sprovođenje ispitivanja za jedan ili više parametara povezanih sa toksičnošću leka izvan ciljnog mesta.
[0053] Ne-humana životinja, kao što je ovde opisana, može biti glodar čiji genom uključuje CD47 gen koji kodira ekstracelularni deo humanog CD47 polipeptida vezanog za intracelularni deo endogenog CD47 polipeptida; glodar može biti miš; glodar može biti pacov.
[0054] Lek koji cilja humani CD47 može biti CD47 antagonist. CD47 antagonist može biti anti-CD47 antitelo. Lek koji cilja humani CD47 može biti CD47 agonist.
[0055] Ovde opisani CD47 gen može da sadrži CD47 gen kao što je ovde opisan. Ovde opisani CD47 polipeptid može da obuhvati CD47 polipeptid kao što je ovde opisan.
[0056] Ovde opisana ne-humana životinja ne mora detektabilno da eksprimuje endogeni nehumani CD47 polipeptid pune dužine. Ovde opisana ne-humana životinja ne mora detektabilno da eksprimuje ekstracelularni deo endogenog CD47 polipeptida. Ovde opisana ne-humana životinja ne mora detektabilno da eksprimuje ekstracelularni deo i endogenog CD47 polipeptida i endogenog SIRPα polipeptida.
[0057] Ekstracelularni deo humanog CD47 polipeptida može da sadrži aminokiseline koje odgovaraju reziduima 19-141 humanog CD47 polipeptida kao što je ovde opisan.
[0058] N-terminalni imunoglobulinski V domen humanog CD47 polipeptida može da sadrži aminokiseline koje odgovaraju reziduima 19-127 humanog CD47 polipeptida kao što je ovde opisan.
[0059] Ne-humane životinje, ćelije, tkiva, embrionalne matične ćelije i/ili embrioni opisani ovde mogu imati genom koji dalje sadrži SIRPα gen koji kodira SIRPα polipeptid koji sadrži ekstracelularni deo humanog SIRPα polipeptida (npr. aminokiseline koje odgovaraju reziduima 28-362 humanog SIRPα polipeptida) i intracelularni deo endogenog SIRPα polipeptida.
[0060] Ovde opisana ne-humana životinja može biti glodar; miš; ili pacov.
[0061] Kao što su upotrebljavani u ovoj prijavi, izrazi „oko” i „približno” se koriste kao ekvivalenti. Bilo koji brojevi u ovoj prijavi koji stoje sa ili bez otprilike/približno treba da obuhvate bilo koje normalne fluktuacije koje su razumljive licu uobičajenog znanja u odgovarajućoj struci.
[0062] Ostale karakteristike, ciljevi i prednosti sadašnjeg pronalaska su očigledni u detaljnom opisu koji sledi. Treba, međutim, razumeti, da je detaljan opis, kojim se ukazuje na realizacije predmetnog pronalaska, dat samo kao ilustracija, a ne kao ograničenje. Različite promene i modifikacije unutar obima ovog pronalaska biće jasne stručnjacima iz detaljnog opisa.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0063] Patentni ili prijavni spis sadrži najmanje jedan crtež u boji. Kopije ovog patenta ili objavljene patentne prijave sa crtežom/crtežima u boji biće dostavljene Zavodu na zahtev i nakon plaćanja potrebne naknade.
[0064] Ovde uključeni Crteži, koji se sastoje od sledećih Slika, dati su samo kao ilustracija, a ne kao ograničenje.
Slika 1 predstavlja dijagram, ne u pravoj veličini, genomske organizacije ne-humanih (npr. mišjih) i humanih gena klastera diferencijacije 47 (CD47). Egzoni su označeni brojevima koji se nalaze ispod svakog egzona.
Slika 2 predstavlja dijagram, ne u pravoj veličini, primera postupka za humanizaciju nehumanog gena klastera diferencijacije 47 (CD47).
Slika 3 predstavlja dijagram, ne u pravoj veličini, genomske organizacije mišjih i humanih gena klastera diferencijacije 47 (CD47). Naznačene su lokacije proba koje su korišćene u ispitivanju opisanom u Primeru 1.
Slika 4 prikazuje primer histograma ekspresije CD47 u crvenim krvnim zrncima kod humanizovanih CD47 miševa detektovanih pomoću anti-CD47 antitela. Ab A, Ab B, Ab C, Ab D i Ab E: anti-CD47 antitela; hIgG4s: humani IgG4 irelevantne specifičnosti sa modifikovanim Fc regionom koji ima redukovanu efektornu funkciju; hIgG4: humano IgG4 antitelo irelevantne specifičnosti.
Figure 5 prikazuje primere hemaglutinacije mišjih crvenih krvnih zrnaca kod miševa divljeg tipa (n=2) i humanizovanih CD47 miševa (n=2) pomoću anti-CD47 antitela. WT: divlji tip; HuCD47: humanizovani CD47; Ab A, Ab B, Ab C, Ab D i Ab E: anti-CD47 antitela; hIgG4s: humani IgG4 irelevantne specifičnosti sa modifikovanim Fc regionom koji ima redukovanu efektornu funkciju; hIgG4: humano IgG4 antitelo irelevantne specifičnosti.
Slika 6 prikazuje primer farmakokinetičkih profila anti-CD47 antitela kod humanizovanih CD47 miševa predstavljenih kao koncentracija antitela (u mg/ml, y-osa) tokom vremena (u danima, x-osa); Ab F, Ab G, Ab H i Ab I: anti-CD47 antitela; hIgG4s: humano IgG4 antitelo irelevantne specifičnosti sa modifikovanim Fc regionom koje ima redukovanu efektornu funkciju.
Slika 7 prikazuje primer farmakokinetičkih profila anti-CD47 antitela kod humanizovanih CD47/SIRPα miševa (CD47<hu/hu>SIRPα<hu/hu>) predstavljenih kao koncentracija antitela (u mg/ml, y-osa) tokom vremena (u danima, x-osa); Ab J, Ab F, Ab GandAb I: anti-CD47 antitela; hIgG4s: humano IgG4 antitelo irelevantne specifičnosti sa modifikovanim Fc regionom koje ima redukovanu efektornu funkciju.
Slika 8 prikazuje primer farmakokinetičkih profila anti-CD47 antitela kod humanizovanih CD47/SIRPα miševa (CD47<hu/hu>SIRPα<hu/hu>) predstavljenih kao koncentracija antitela (u mg/ml, y-osa) tokom vremena (u danima, x-osa); Ab J, Ab F: anti-CD47 antitela; Ab Fs: Ab F sa modifikovanim Fc regionom koje ima redukovanu efektornu funkciju; Ab Fmono: monovalentna verzija Ab F; hIgG4s: humano IgG4 antitelo irelevantne specifičnosti sa modifikovanim Fc regionom koje ima redukovanu efektornu funkciju.
Slika 9 prikazuje primer farmakokinetičkih profila anti-CD47 antitela kod miševa divljeg tipa predstavljenih kao koncentracija antitela (u mg/ml, y-osa) tokom vremena (u danima, x-osa). Miševi koji pokazuju mišji odgovor na anti-humana antitela (MAHA) su isključeni. Ab J, Ab F, Ab I i Ab G: anti-CD47 antitela; hIgG4s: humano IgG4 antitelo irelevantne specifičnosti sa modifikovanim Fc regionom koje ima redukovanu efektornu funkciju (zvezda: sve tačke posle 15 dana su bile isključene iz hIgG4s terapijske grupe zbog MAHA); Ab J F(ab')2: F(ab')2 fragment Ab J.
DEFINICIJE
[0065] Ovaj pronalazak nije ograničen na određene postupke i eksperimentalne uslove koji su ovde opisani, jer takvi postupci i uslovi mogu da variraju. Takođe treba razumeti da se ovde korišćena terminologija koristi samo za opisivanje određenih realizacija, i ne treba da bude ograničavajuća, pošto je obim ovog pronalaska definisan patentnim zahtevima.
[0066] Ukoliko nije drugačije definisano, svi termini i izrazi koji se ovde koriste obuhvataju značenja koja su termini i izrazi postignuti u struci, osim ako je suprotno jasno naznačeno ili jasno vidljivo iz konteksta u kome se koristi termin ili izraz. Mada se bilo koji postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani mogu koristiti u praksi ili testiranju ovog pronalaska, sada su opisani određeni postupci i materijali.
[0067] Termin „približno”, kao što se ovde primenjuje na jednu ili više vrednosti od interesa, odnosi se na vrednost koja je slična navedenoj referentnoj vrednosti. Termin „približno” ili „oko” može da se odnosi na opseg vrednosti koje potpadaju unutar 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, ili manje u oba smera (veće ili manje od) od navedene referentne vrednosti, osim ako nije drugačije navedeno ili na drugi način očigledno iz konteksta (osim kada bi taj broj prelazio 100% moguće vrednosti).
[0068] Termin „biološki aktivan”, kao što se ovde upotrebljava, odnosi se na karakteristiku bilo kog agensa koji ima aktivnost u biološkom sistemu, in vitro ili in vivo (npr. u organizmu). Na primer, agens koji, kada je prisutan u organizmu, ima biološki efekat unutar tog organizma, smatra se biološki aktivnim. U određenim realizacijama, gde je protein ili polipeptid biološki aktivan, deo tog proteina ili polipeptida koji deli najmanje jednu biološku aktivnost proteina ili polipeptida tipično se označava kao „biološki aktivan” deo.
[0069] Termin „uporediv”, kao što se ovde upotrebljava, odnosi se na dva ili više agenasa, entiteta, situacija, niza stanja, itd. koji nisu indentični ali su dovoljno slični da je moguće poređenje među njima tako da se zaključci mogu razumno doneti na osnovu opaženih razlika ili sličnosti. Lica koja su uobičajeno verzirana u stanju tehnike će razumeti, u kontekstu, koji je stepen identiteta potreban u bilo kojoj datoj okolnosti za dva ili više agenasa, entiteta, situacija, niza stanja, itd. da bi se smatrali uporedivim.
[0070] Termin „konzervativna”, kao što se ovde upotrebljava da opiše konzervativnu supstituciju aminokiseline odnosi se na zamenu rezidua aminokiseline drugim reziduom aminokiseline koji ima R grupu sa bočnim lancem sa sličnim hemijskim karakteristikama (npr. naelektrisanje ili hidrofobičnost). Generalno, konzervativna aminokiselinska supstitucija neće bitno promeniti funkcionalne karakteristike proteina od interesa, na primer, sposobnost receptora da se veže za ligand. Primeri grupa aminokiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim karakteristikama uključuju: alfatične bočne lance kao što su glicin, alanin, valin, leucin i and izoleucin; alifatično-hidroksilne bočne lance kao što su serin i treonin; bočne lance koji sadrže amid kao što su asparagin i glutamin; aromatične bočne lance kao što su fenilalanin, tirozin i triptofan; bazne bočne lance kao što su lizin, arginin i histidin; kisele bočne lance kao što su asparaginska kiselina i glutaminska kiselina; i bočne lance koji sadrže sumpor kao što su cistein i metionin. Konzervativne aminokiselinske supstitucione grupe uključuju, na primer, valin/leucin/izoleucin, fenilalanin/tirozin, lizin/arginin, alanin/valin, glutamat/aspartat i asparagin/glutamin. Konzervativna aminokiselinska supstitucija može biti supstitucija bilo kojeg nativnog rezidua u proteinu sa alaninom, kao što je upotrebljeno u, na primer, alanin skenirajućoj mutagenezi. Može se napraviti konzervativna supstitucija koja ima pozitivnu vrednost u PAM250 matriksu logaritamske verovatnoće opisanom u Gonnet i sar. (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45. Supstitucija može biti umereno konzervativna supstitucija gde supstitucija ima nenegativnu vrednost u PAM250 matriksu logaritamske verovatnoće.
[0071] Termin „kontrola”, kao što se ovde upotrebljava, odnosi se na struci razumljivo značenje „kontrole” koja je standard prema kojem se rezultati upoređuju. Tipično, kontrole se koriste za povećanje integriteta u eksperimentima izolovanjem varijabli kako bi se došlo do zaključka o takvim varijablama. Kontrola može biti reakcija ili ispitivanje koje se izvodi istovremeno sa test reakcijom ili ispitivanjem da se dobije komparator. Kao što se ovde upotrebljava, „kontrola” se može odnositi na „kontrolnu životinju”. „Kontrolna životinja” može imati modifikaciju kao što je ovde opisana, modifikaciju koja je različita kako je ovde opisana, ili bez modifikacije (tj. životinja divljeg tipa). U jednom eksperimentu, primenjuje se „test” (tj. varijabla koja se testira). U drugom eksperimentu, „kontrola”, varijabla koja se testira se ne primenjuje. Kontrola može biti istorijska kontrola (tj. test ili ispitivanje koje je prethodno sprovedeno, ili količina ili rezultat koji je prethodno poznat). Kontrola može biti ili sadržati štampani ili na drugi način sačuvani zapis. Kontrola može biti pozitivna kontrola ili negativna kontrola.
[0072] Termin „poremećaj”, koo šro se ovde upotrebljava, odnosi se na rezultat homolognog rekombinantnog događaja sa molekulom DNK (npr. sa endogenom homolognom sekvencom kao što je gen ili lokus gena). Poremećaj može postići ili predstaviti ubacivanje, deleciju, supstituciju, zamenu, misens mutaciju ili pomeranje okvira DNK sekvence (sekvenci), ili bilo koju njihovu kombinaciju. Ubacivanje može uključivati umetanje celih gena ili fragmenata gena, npr. egzona, koji mogu imati poreklo različito od endogene sekvence (npr. heterologna sekvenca). Poremećaj može povećati ekspresiju i/ili aktivnost gena ili genskog proizvoda (npr. proteina kodiranog od strane gena). Poremećaj može smanjiti ekspresiju i/ili aktivnost gena ili genskog proizvoda. Poremećaj može izmeniti sekvencu gena ili kodiranog genskog proizvoda (npr. kodirani protein). Poremećaj može skratiti ili fragmentirati gen ili kodiran genski proizvod (npr. kodirani protein). Poremećaj može proširiti gen ili kodirani genski proizvod; u nekim takvim realizacijama, poremećaj može postići sastavljanje fuzionog proteina. Poremećaj može uticati na nivo ali ne i na aktivnost gena ili genskog proizvoda. Poremećaj može uticati na aktivnost ali ne i na nivo gena ili genskog proizvoda. Poremećaj ne mora imati značajan uticaj na nivo gena ili genskog proizvoda. Poremećaj ne mora imati značajan uticaj na aktivnost gena ili genskog proizvoda. Poremećaj ne mora imati značajan uticaj ni na nivo niti na aktivnost gena ili genskog proizvoda.
[0073] Termini „određivanje”, „merenje”, „ocenjivanje”, „procenjivanje”, „ispitivanje” i „analiziranje” ovde se koriste naizmenično, odnose se na bilo koji oblik merenja, i uključuju određivanje da li je neki element prisutan ili ne. Ovi termini uključuju i kvantitativna i/ili kvalitativna određivanja. Ispitivanje može biti relativno ili apsolutno. „Ispitivanje prisutnosti” može biti određivanje količine nečeg prisutnog i/ili određivanje prisutnosti ili odsutnosti nečega.
[0074] Izraz „endogeni lokus” ili „endogeni gen”, kao što se ovde upotrebljava, odnosi se na genetski lokus koji se nalazi u roditeljskom ili referentnom organizmu pre uvođenja poremećaja, delecije, zamene, promene ili modifikacije kao što su ovde opisane. Endogeni lokus može imati sekvencu koja se nalazi u prirodi. Endogeni lokus može biti lokus divljeg tipa. Referentni organizam može biti divlji tip organizma. Referentni organizam može biti projektovani organizam. Referentni organizam može biti laboratorijski uzgajani organizam (bilo divljeg tipa ili projektovan).
[0075] Izraz „endogeni promotor” odnosi se na promotor koji je prirodno udružen, npr. u organizmu divljeg tipa, sa endogenim genom.
[0076] Termin „heterologni”, kao što se ovde upotrebljava, odnosi se na agens ili entitet iz različitog izvora. Na primer, kada se koristi u vezi sa polipeptidom, genom ili genskim proizvodom ili je prisutnim u određenoj ćeliji ili organizmu, termin pojašnjava da je relevantni polipeptid, gen ili genski proizvod: 1) konstruisan od strane čoveka; 2) uveden u ćeliju ili organizam (ili njihov prekursor) čovekovom rukom (npr. putem genetskog inženjeringa); i/ili 3) nije prirodno proizveden od strane ćelije ili organizma ili nije prisutan u relevantnoj ćeliji ili organizmu (npr. relevantni tip ćelije ili tip organizma).
[0077] Termin „ćelija domaćin”, kao što se ovde upotrebljava, odnosi se na ćeliju u koju je uvedena heterologna (npr. egzogena) nukleinska kiselina ili protein. Lica iz struke koji čitaju ovo otkriće će razumeti da se ovaj termin ne odnosi samo na određenu ćeliju datog subjekta, već se odnosi i na potomstvo takve ćelije. Pošto se određene modifikacije mogu pojaviti u narednim generacijama, bilo usled mutacije ili uticaja okoline, takvo potomstvo ne može, u stvari, biti identično roditeljskoj ćeliji, ali je svejedno uključeno u obim termina „ćelija domaćin”, kao što se ovde upotrebljava. Ćelija domaćin može biti ili sadržati prokariotsku ili eukariotsku ćeliju. Uopšteno, ćelija domaćin je bilo koja ćelija koja je pogodna za primanje i/ili proizvodnju heterologne nukleinske kiseline ili proteina, bez obzira na vrstu živog organizma kome je ćelija namenjena. Egzemplarne ćelije uključuju one ćelije prokariota i eukariota (jednoćelijske ili višećelijske), bakterijske ćelije (npr. sojeve E. coli, Bacillus spp, Streptomyces spp, itd.), mikobakterijske ćelije, fungalne ćelije, ćelije kvasca (npr. S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, itd.), biljne ćelije, ćelije insekata (npr. SF-9, SF-21, ćelije insekata inficirane bakulovirusom, Trichoplusia ni, itd.), ćelije ne-humanih životinja, humane ćelije, ili ćelijske fuzije kao što su, na primer, hibridomi ili kvadromi. Ćelija može pripadati čoveku, majmunu, primatu, hrčku, pacovu ili mišu. Ćelija može biti eukariotska i selektovana je iz sledećih ćelija: CHO (npr. CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (npr. COS-7), retinalna ćelija, Vero, CV1, bubrežna (npr. HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (npr. BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidermal), CV-1, U937, 3T3, L ćelija, C127 ćelija, SP2/0, NS-0, MMT 060562, Sertoli ćelija, BRL 3A ćelija, HT1080 ćelija, mijelomska ćelija, tumorska ćelija, kao i ćelijska linija izvedena iz gore pomenute ćelije. Ćelija može sadržati jedan ili više virusnih gena, npr. retinalna ćelija koja eksprimuje virusni gen (npr. PER.C6™ ćelija). Ćelija domaćin može biti ili sadržati izolovanu ćeliju. Ćelija domaćin može biti deo tkiva. Ćelija domaćin može biti deo organizma.
[0078] Termin „humanizovan”, kao što se ovde upotrebljava u skladu sa njegovim značenjem u struci, odnosi se na nukleinske kiseline ili proteine čije strukture (tj. sekvence nukleotida ili aminokiselina) uključuju delove koji suštinski ili identično korespondiraju sa strukturama određenog gena ili proteina koji se nalazi u prirodi kod ne-humanih životinja, i takođe uključuje delove koji se razlikuju od onih koji se nalaze u relevantnom ne-humanom genu ili proteinu i umesto toga bliže korespondiraju sa komparabilnim strukturama koje se nalaze u odgovarajućem humanom genu ili proteinu. „Humanizovan” gen može biti onaj koji kodira polipeptid koji ima suštinsku aminokiselinsku sekvencu kao što je humani polipeptid (npr. humani protein ili njegov deo - npr. njegov karakteristični deo). Da navedemo samo jedan primer, u slučaju membranskog receptora, „humanizovan” gen može da kodira polipeptid koji ima ekstracelularni deo koji ima aminokiselinsku sekvencu kao onaj iz humanog ekstracelularnog dela, i preostalu sekvencu kao sekvencu ne-humanog (npr. mišjeg) polipeptida. Humanizovani gen može da sadrži najmanje deo DNK sekvence humanog gena. Humanizovani gen može da sadrži celu DNK sekvencu humanog gena. Humanizovani gen može da sadrži sekvencu koja ima deo koji se pojavljuje u humanom proteinu. Humanizovani protein može da sadrži celu sekvencu humanog proteina i eksprimovan je iz endogenog lokusa ne-humane životinje koji odgovara homologu ili ortologu humanog gena.
[0079] Termin „identitet”, kao što se ovde upotrebljava u vezi sa poređenjem sekvenci, odnosi se na identitet koji je određen brojnim različitim algoritmima poznatim u struci koji se mogu koristiti za merenje identiteta sekvence nukleotida i/ili aminokiseline. Ovde opisani identiteti mogu biti određeni pomoću ClustalW v. 1,83 (sporog) poravnanja primenom bodovanja otvorenog međuprostora od 10.0, bodovanja proširenog međuprostora od 0,1, i upotrebom Gonnet matriksa sličnosti (MACVECTOR ™ 10.0.2, MacVector Inc)., 2008).
[0080] Termin „izolovan”, kao što se ovde upotrebljava, odnosi se na supstancu i/ili entitet koji je (1) odvojen od barem nekih komponenti sa kojima je bio povezan kada je prvobitno proizveden (bilo u prirodi i/ili na eksperimentalan način) i/ili (2) dizajniran, proizveden, pripremljen i/ili napravljen od strane čoveka. Izolovane supstance i/ili entiteti mogu biti odvojeni od oko 10%, oko 20%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99%, ili više od oko 99% ostalih komponenti sa kojima su u početku bili povezani. Izolovani agensi mogu imati čistoću od oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99%, ili više od oko 99%. Kako se ovde upotrebljava, supstanca je „čista” ako je u suštini slobodna od drugih komponenti. U nekim realizacijama, kao što će biti razumljivo onima koji su verzirani u struci, supstanca se još uvek može smatrati „izolovanom” ili čak „čistom” nakon što je kombinovana sa nekim drugim komponentama kao što su, na primer, jedan ili više nosača ili ekscipijenata (npr. pufer, rastvarač, voda, itd.); u takvim realizacijama, procenat izolacije ili čistoće supstance se izračunava bez uključivanja takvih nosača ili ekscipijenata. Da navedemo samo jedan primer, može se smatrati da je biološki polimer, kao što je polipeptid ili polinukleotid, koji se javlja u prirodi, „izolovan” kada, a) na osnovu njegovog porekla ili izvora derivacije nije povezan sa nekim ili svim komponentama koje ga prate u prirodnom stanju; b) je suštinski bez drugih polipeptida ili nukleinskih kiselina iste vrste od vrste koja ga proizvodi u prirodi; ili c) je eksprimovan od ili je inače povezan sa komponentama iz ćelije ili drugog sistema ekspresije koji nije od vrste koja ga proizvodi u prirodi. Tako, na primer, polipeptid koji je hemijski sintetizovan ili je sintetizovan u ćelijskom sistemu različitom od onog koji ga proizvodi u prirodi, može se smatrati „izolovanim” polipeptidom. Alternativno ili dodatno, polipeptid koji je bio podvrgnut jednoj ili više tehnika za prečišćavanje može se smatrati da je „izolovani” polipeptid do te mere da je odvojen od drugih komponenti a) sa kojima je povezan u prirodi; i/ili b) sa kojima je bio povezan kada je prvobitno proizveden.
[0081] Izraz „ne-humana životinja”, kao što se ovde upotrebljava, odnosi se na bilo koji organizam kičmenjaka koji nije čovek. Ne-humana životinja može biti aciklostom, koštana riba, hrskavična riba (npr. ajkula ili raža), vodozemac, reptil, sisar ili ptica. Ne-humana životinja može biti primat, koza, ovca, svinja, pas, krava ili glodar. Ne-humana životinja može biti glodar kao na primer pacov ili miš.
[0082] Izraz „nukleinska kiselina”, kao što se ovde upotrebljava, u svom najširem smislu odnosi se na bilo koje jedinjenje i/ili supstancu koja je ili može biti inkorporirana u oligonukleotidni lanac. Nukleinska kiselina može biti jedinjenje i/ili supstanca koja je ili može biti inkorporirana u oligonukleotidni lanac preko fosfodiestarske veze. Kao što će biti jasno iz konteksta, „nukleinska kiselina” se može odnositi na pojedinačne rezidue nukleinske kiseline (npr. nukleotide i/ili nukleozide); „nukleinska kiselina” se može odnositi na oligonukleotidni lanac koji sadrži pojedinačne rezidue nukleinske kiseline. „Nukleinska kiselina” može biti ili sadržati RNK; „nukleinska kiselina” može biti ili sadržati DNK. „Nukleinska kiselina” može biti, sadržati, ili se sastojati od jednog ili više prirodnih rezidua nukleinskih kiselina.
„Nukleinska kiselina” može biti, sadržati, ili se sastojati od jednog ili više analoga nukleinskih kiselina. Analog nukleinske kiseline se može razlikovati od „nukleinske kiseline” po tome što ne koristi fosfodiestarsku osnovu. Na primer, „nukleinska kiselina” može biti, sadržati, ili se sastojati od jedne ili više „peptidnih nukleinskih kiselina”, koje su poznate u struci i u svojoj osnovi imaju peptidne veze umesto fosfodiestarskih veza. Alternativno ili dodatno, „nukleinska kiselina” može imati jednu ili više fosforotioatnih i/ili 5'-N-fosforamiditnih veza pre nego fosfodiestarske veze. „Nukleinska kiselina” može biti, sadržati, ili se sastojati od jednog ili više prirodnih nukleozida (npr. denozin, timidin, gvanozin, citidin, uridin, deoksiadenozin, deoksitimidin, deoksigvanozin i deoksicitidin). „Nukleinska kiselina” može biti, sadržati, ili se sastojati od jednog ili više nukleozidnih analoga (npr. 2-aminoadenozin, 2-tiotimidin, inozin, pirolo-pirimidin, 3-metil adenozin, 5-metilcitidin, C-5 propinil-citidin, C-5 propinil-uridin, 2-aminoadenozin, C5-bromouridin, C5-fluorouridin, C5-jodouridin, C5-propinil-uridin, C5-propinilcitidin, C5-metilcitidin, 2-aminoadenozin, 7-deazaadenozin, 7-deazaguanozin, 8-oksoadenozin, 8-oksoguanozin, O(6)-metilguanin, 2-tiocitidin, metilovane baze, interkalisane baze i njihove kombinacije). „Nukleinska kiselina” može sadržati jedan ili više modifikovanih šećera (npr. 2'-fluororiboza, riboza, 2'-deoksiriboza, arabinoza i heksoza) u poređenju sa onima u prirodnim nukleinskim kiselinama. „Nukleinska kiselina” može imati nukleotidnu sekvencu koja kodira funkcionalni genski proizvod kao što je RNК ili protein. „Nukleinska kiselina” može uključivati jedan ili više introna. „Nukleinska kiselina” se može pripremati pomoću jedne ili više izolacija iz prirodnog izvora, enzimske sinteze polimerizacijom na bazi komplementarnog obrasca (in vivo ili in vitro), reprodukcijom u rekombinantnoj ćeliji ili sistemu, i hemijskom sintezom. Dužina „nukleinske kiseline” se može sastojati od najmanje 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 ili više rezidua. „Nukleinska kiselina” može biti jednolančana; ili „nukleinska kiselina” može biti dvolančana. „Nukleinska kiselina” može imati nukleotidnu sekvencu koja sadrži najmanje jedan element koji kodira, ili je komplement sekvence koja kodira, polipeptid. „Nukleinska kiselina” može imati enzimsku aktivnost.
[0083] Izraz „operabilno vezan”, kao što se ovde upotrebljava, odnosi se na jukstapoziciju u kojoj su opisane komponente u odnosu koji im dozvoljava da funkcionišu na svoj nameravan način. Kontrolna sekvenca „operabilno vezana” za kodirajuću sekvencu je povezana na takav način da se ekspresija kodirajuće sekvence postiže pod uslovima koji su kompatibilni sa kontrolnim sekvencama. „Operabilno vezane” sekvence uključuju obe sekvence za kontrolu ekspresije koje su povezane sa genom od interesa i sekvencama za kontrolu ekspresije koje ispoljavaju trans kontrolu ili deluju na daljinu na gen od interesa. Termin „sekvenca za kontrolu ekspresije”, kao što se ovde upotrebljava, odnosi se na polinukleotidne sekvence koje su neophodne da bi se izvršila ekspresija i obrada kodirajućih sekvenci na koje se ligiraju. „Sekvence za kontrolu ekspresije” uključuju odgovarajuće sekvence inicijacije, završetka, promotora i pojačivača transkripcije; efikasne RNK obradne signale kao što su signali za spajanje i poliadenilacije; sekvence koje stabilizuju citoplazmatsku mRNK; sekvence koje poboljšavaju efikasnost translacije (tj. Kozakova konsenzus sekvenca); sekvence koje poboljšavaju stabilnost proteina; i kada se želi, sekvence koje poboljšavaju sekreciju proteina. Priroda takvih kontrolnih sekvenci razlikuje se u zavisnosti od organizma domaćina. Na primer, u prokariotima, takve kontrolne sekvence obično obuhvataju promotor, mesto vezivanja ribozoma i sekvencu za terminaciju transkripcije, dok kod eukariota, tipično, takve kontrolne sekvence uključuju promotore i sekvencu za terminaciju transkripcije. Termin „kontrolne sekvence” treba da obuhvati komponente čije je prisustvo neophodno za ekspresiju i obradu, i može takođe da uključi dodatne komponente čije je prisustvo povoljno, na primer, liderske sekvence i fuzione partnerske sekvence.
[0084] Termin „polipeptid”, kao što se ovde upotrebljava, odnosi se na bilo koji polimerni lanac aminokiselina. Polipeptid može imati aminokiselinsku sekvencu koja se javlja u prirodi. Polipeptid može imati aminokiselinsku sekvencu koja se ne javlja u prirodi, polipeptid ima aminokiselinsku sekvencu koja sadrži delove koji se nezavisno jedni od drugih javljaju u prirodi (tj. delovi dva različita organizma, na primer numani i ne-humani delovi). Polipeptid može imati aminokiselinsku sekvencu koja je konstruisana tako da je dizajnirana i/ili stvorena od strane čoveke.
[0085] Termin „rekombinantni”, kao što se ovde upotrebljava, treba da se odnosi na polipeptide (npr. signalno-regulatorni proteini kao što su ovde opisani) koji su dizajnirani, konstruisani, pripremljeni, eksprimovani, kreirani ili izolovani rekombinantnim sredstvima, kao što su polipeptidi koji su eksprimovani korišćenjem rekombinantnog ekspresionog vektora transfektovanog u ćeliju domaćina, polipeptidi izolovani iz rekombinantne, kombinatorne humane polipeptidne biblioteke (Hoogenboom H. R., (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy H., i Highsmith W. E., (2002) Clin. Biochem. 35:425-445; Gavilondo J. V., i Larrick J. W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H., i Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378), antitela izolovana iz životinje (npr. miša) koji je transgeničan za humane imunoglobulinske gene (vidi npr., Taylor, L. D., i sar. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann S-A., i Green L. L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:593-597; Little M. i sar. (2000) Immunology Today 21:364-370; Murphy, A.J., i sar. (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111(14):5153-5158) ili polipeptidi pripremljeni, eksprimovani, kreirani ili izolovani na bilo koji drugi način koji uključuje spajanje odabranih sekvencijskih elemenata jednog sa drugim. Jedan ili više takvih odabranih sekvencijskih elemenata mogu se nalaziti u prirodi. Jedan ili više takvih odabranih sekvencijskih elemenata mogu biti dizajnirani in silico. Jedan ili više takvih odabranih sekvencijskih elemenata mogu biti rezultat mutageneze (npr. in vivo ili in vitro) poznatog elementa sekvence, npr. iz prirodnog ili sintetičkog izvora. Na primer, rekombinantni polipeptid može se sastojati od sekvenci koje se nalaze u genomu izvornog organizma od interesa (npr. čovek, miš, itd.). Rekombinantni polipeptid može imati aminokiselinsku sekvencu koja je nastala mutagenezom (npr. in vitro ili in vivo, na primer kod ne-humane životinje), tako da su aminokiselinske sekvence rekombinantnih polipeptida sekvence koje, dok potiču od polipeptidnih sekvenci i koje su u vezi sa njima, ne moraju prirodno da postoje u genomu ne-ljudske životinje in vivo.
[0086] Termin „zamena” se ovde upotrebljava da označi proces kroz koji se „zamenjena” sekvenca nukleinske kiseline (npr. gen) pronađena u lokusu domaćina (npr. u genomu) ukloni iz tog lokusa i na njeno mesto se postavi drugačija, „zamenska” nukleinska kiselina. Zamenjena sekvenca nukleinske kiseline i zamenska sekvenca nukleinske kiseline mogu biti uporedive jedna sa drugom u tome što su, na primer, homologne jedna drugoj i/ili sadrže odgovarajuće elemente (npr. elemente koji kodiraju proteine, regulatorne elemente, itd.) Zamenjena sekvenca nukleinske kiseline može uključivati jedan ili više promotora, pojačivača, upleteno donorsko mesto, upleteno mesto primaoca, introna, egzona, netranslantovane regije (UTR); zamenska sekvenca nukleinske kiseline može uključivati jednu ili više kodirajućih sekvenci. Zamenska sekvenca nukleinske kiseline može biti homolog zamenjene sekvence nukleinske kiseline. Zamenska sekvenca nukleinske kiseline može biti ortolog zamenjene sekvence. Zamenska sekvenca nukleinske kiseline može biti ili sadržati sekvencu humane nukleinske kiseline. U nekim realizacijama, uključujući tamo gde zamenska sekvenca nukleinske kiseline jeste ili sadrži sekvencu humane nukleinske kiseline, zamenjena sekvenca nukleinske kiseline jeste ili sadrži sekvencu glodara (npr. sekvenca miša). Sekvenca nukleinske kiseline koja je tako postavljena može uključivati jednu ili više regulatornih sekvenci koje su deo sekvence nukleinske kiseline koja se koristi da bi se dobila sekvenca koja je tako postavljena (npr. promotori, pojačivači, 5'- ili 3'- netranslantovane regije, itd.). Na primer, zamena je supstitucija endogene sekvence heterolognom sekvencom koja dovodi do proizvodnje genskog proizvoda iz tako postavljene sekvence nukleinske kiseline (koja sadrži heterolognu sekvencu), ali ne i ekspresije endogene sekvence; zamena je endogene genomske sekvence sekvencom nukleinske kiseline koja kodira protein koji ima sličnu funkciju kao protein kodiran endogenom sekvencom (npr. endogena genomska sekvenca kodira CD47 protein, a fragment DNK kodira jedan ili više humanih CD47 proteina). Endogeni gen ili njegov fragment je zamenjen odgovarajućim humanim genom ili njegovim fragmentom. Odgovarajući humani gen ili njegov fragment je humani gen ili fragment koji je ortolog, ili je suštinski sličan ili isti u strukturi i/ili funkciji, endogenom genu ili njegovom fragmentu koji je zamenjen.
[0087] Izraz „protein klastera diferencijacije 47” ili „CD47 protein”, kao što se ovde upotrebljava, odnosi se na transmembranski protein sa više prolaza koji pripada superfamiliji imunoglobulina i ima ekstracelularni amino-terminalni imunoglobulinski V domen, pet transmembranskih domena i kratki karboksil-terminalni intracelularni rep. CD47 je eksprimovan na površini ćelije i uključen je u interakcije između membranskih površinskih proteina kao što su, na primer, integrini, SIRPα i trombospondin-1 (TSP-1). CD47 se eksprimuje u normalnim tkivima i povećan je kod mnogih humanih karcinoma. Pokazano je da je CD47 uključen u nekoliko ćelijskih procesa kao što su, na primer, apoptoza, proliferacija, adhezija i migracija. Identifikovano je nekoliko alternativno spojenih CD47 izoforma između miša i čoveka. Kao ilustracija, nukleotidne i aminokiselinske sekvence mišjih i humanih CD47 gena date su u Tabeli 3. Osobe iz struke koje pročitaju ovo otkriće cprepoznaće da se jedan ili više endogenih CD47 gena u genomu (ili svi) mogu zameniti jednim ili više heterolognih CD47 gena (npr. polimorfne varijante, podtipovi ili mutanti, geni drugih vrsta, humanizovani oblici, itd.).
[0088] „CD47-eksprimujuća ćelija”, kao što se ovde upotrebljava, odnosi se na ćeliju koja eksprimuje CD47 transmembranski protein. CD47-eksprimujuća ćelija može eksprimovati CD47 transmembranski protein na njegovu površinu. CD47 protein može biti eksprimovan na površinu ćelije u količini dovoljnoj da posreduje između ćelijskih interakcija preko CD47 transmembranakog proteina eksprimovanog na površinu te ćelije. Na primer, CD47-eksprimujuće ćelije uključuju neurone, imunske ćelije, keratinocite, i ćelije u krvotoku. CD47-eksprimujuće ćelije regulišu interaciju imunskih ćelija i cirkulišućih ćelija da bi se postigla regulacija različitih ćelijskih procesa kao što su adhezija, ćelijska proliferacija i/ili apoptoza, angiogeneza i inflamacija. Ovde opisane ne-humane životinje mogu ispoljavati regulaciju različitih ćelijskih procesa (kao što su ovde opisani) preko humanizovanih CD47 proteina eksprimovanih na površinu jedne ili više ćelija te ne-humane životinje.
[0089] Termin „referenca” se ovde upotrebljava da opiše standard ili kontrolni agens, kohortu, pojedinca, populaciju, uzorak, sekvencu ili vrednost prema kojoj se upoređuje agens, životinja, kohorta, pojedinac, populacija, uzorak, sekvenca ili vrednost od interesa. Referentni agens, kohorta, pojedinac, populacija, uzorak, sekvenca ili vrednost mogu biti testirani i/ili određeni u suštini istovremeno sa testiranjem ili određivanjem agensa, kohorte, pojedinca, populacije, uzorka, sekvence ili vrednosti od interesa. Referentni agens, kohorta, pojedinac, populacija, uzorak, sekvenca ili vrednost može biti istorijska referenca, opciono otelotvorena u opipljivom mediju. Referenca se može odnositi na kontrolu. Kao što se ovde upotrebljava, „referenca” se može odnositi na „referentnu životinju”. „Referentna životinja” može imati modifikaciju kao što je ovde opisana, modifikaciju koja je različita od one koja je ovde opisana ili biti bez modifikacije (tj. životinja divljeg tipa). Tipično, kao što bi razumeli stručnjaci u ovoj oblasti, referentni agens, životinja, kohorta, pojedinac, populacija, uzorak, sekvenca ili vrednost se određuje ili karakteriše pod uslovima koji su uporedivi sa onima koji se koriste za određivanje ili karakterizaciju sredstva, životinje (npr. sisara), kohorte, pojedinca, populacije, uzorka, sekvence ili vrednosti od interesa.
[0090] Termin „suštinski”, kao što se ovde upotrebljava, odnosi se na kvalitativni uslov pokazivanja ukupnog ili skoro ukupnog obima ili stepena karakteristike ili svojstva od interesa. Osoba stručna u oblasti biologije će razumeti da biološki i hemijski fenomeni retko, ako ikada, idu do završetka i/ili prelaze na potpunost ili postižu ili izbegavaju apsolutni rezultat. Termin „suštinski” se stoga ovde koristi da bi se uhvatio potencijalni nedostatak kompletnosti inherentan mnogim biološkim i hemijskim fenomenima.
[0091] Izraz „suštinska homologija”, kao što se ovde upotrebljava, odnosi se na poređenje između sekvenci aminokiselina ili nukleinskih kiselina. Kao što stručnjaci na ovom polju razumeju, dve sekvence se generalno smatraju „suštinski homolognim” ako sadrže homologne rezidue u odgovarajućim pozicijama. Homologni rezidui mogu biti identični rezidui. Alternativno, homologni rezidui mogu biti ne-identični rezidui koji će na odgovarajući način imati slične strukturne i/ili funkcionalne karakteristike. Na primer, kao što je dobro poznato prosečnom stručnjaku, određene aminokiseline su tipično klasifikovane kao „hidrofobne” ili „hidrofilne” amino kiseline, i/ili kao aminokiseline koje imaju „polarne” ili „nepolarne” bočne lance. Supstitucija jedne aminokiseline drugom aminokiselinom istog tipa često se može smatrati „homolognom” supstitucijom. Tipične kategorizacije aminokiselina su sumirane u Tabelama 1 i 2.
TABELA 1
[0092] Kao što je dobro poznato u ovoj struci, sekvence aminokiselina ili nukleinskih kiselina mogu se upoređivati upotrebom bilo kojeg od različitih algoritama, uključujući one koji su dostupni u komercijalnim kompjuterskim programima, kao što su BLASTN za nukleotidne sekvence i BLASTP, gapped BLAST i PSI-BLAST za aminokiselinske sekvence. Primeri takvih programa opisani su u Altschul i sar. (1990) Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul i sar. (1997) Methods in Enzymology; Altschul i sar., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Baxevanis i sar. (1998) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley; i Misener i sar. (eds.) (1999) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press. Pored identifikacije homolognih sekvenci, gore pomenuti programi tipično pružaju indikaciju stepena homologije. Dve sekvence se mogu smatrati suštinski homolognim ako je najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više njihovih odgovarajućih rezidua homologno u odnosu na relevantan niz rezidua. Relevantan niz može biti kompletna sekvenca. Relevantan niz može biti najmanje 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ili više rezidua. Relevantan niz može uključivati susedne rezidue duž kompletne sekvence. Relevantan niz može uključivati diskontinuirane rezidue duž kompletne sekvence. Relevantan niz može biti najmanje 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ili više rezidua.
[0093] Izraz „suštinski identitet”, kao što se ovde upotrebljava, odnosi se na poređenje između aminokiselinskih ili nukleinsko kiselinskih sekvenci. Kao što će biti razumljivo onima koji su uobičajeno verzirani u stanju tehnike, generalno se smatra da su dve sekvence „suštinski identične” ako sadrže identične rezidue u odgovarajućim pozicijama. Kao što je dobro poznato u ovom polju, sekvence aminokiselina ili nukleinskih kiselina se mogu porediti koristeći bilo koji od različitih algoritama, uključujući one koji su dostupni u komercijalnim kompjuterskim programima, kao što su BLASTN za nukleotidne sekvence i BLASTP, gapped BLAST i PSI-BLAST za aminokiselinske sekvence. Primeri takvih programa opisani su u Altschul i sar. (1990) Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul i sar., Methods in Enzymology; Altschul i sar. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Baxevanis i sar. (1998) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley; i Misener i sar., (eds.) (1999) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press. Pored identifikacije identičnih sekvenci, gore pomenuti programi obično daju indikaciju stepena identiteta. Dve sekvence se mogu smatrati suštinski identičnim ako je najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više njihovih odgovarajućih rezidua identično u relevantnom nizu rezidua. Taj relevantni niz može biti kompletna sekvenca. Relevantni niz može biti najmanje 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ili više rezidua.
[0094] Izraz „ciljajući vektor” ili „ciljajući konstrukt”, kao što se ovde upotrebljava, odnosi se na polinukleotidni molekul koji sadrži ciljajući region. Ciljajući region sadrži sekvencu koja je identična ili suštinski identična sekvenci u ciljanoj ćeliji, tkivu ili životinji i obezbeđuje integraciju ciljajućeg konstrukta u položaj unutar genoma ćelije, tkiva ili životinje putem homologne rekombinacije. Ciljajući regioni koji se usmeravaju ka cilju pomoću lokacija prepoznavanja rekombinaze specifične za lokaciju (npr. loxP ili Frt lokacije) su takođe uključene. Ciljajući konstrukt koji je ovde opisan može dalje sadržati sekvencu nukleinske kiseline ili gen od posebnog interesa, selektabilni marker, kontrolne i/ili regulatorne sekvence, i druge sekvence nukleinskih kiselina koje omogućavaju rekombinaciju posredovanu egzogenim dodavanjem proteina koji pomažu ili olakšavaju rekombinaciju koja uključuje takve sekvence. Ovde opisan ciljajući konstrukt može dalje sadržati gen od interesa u celini ili delimično, pri čemu je gen od interesa heterologni gen koji kodira protein u celini ili delimično, a koji ima sličnu funkciju kao protein kodiran endogenom sekvencom. Ciljajući konstrukt koji je ovde opisan dalje može sadržati humanizovani gen od interesa, u celini ili delimično, pri čemu humanizovani gen od interesa kodira protein, u celini ili delimično, a koji ima sličnu funkciju kao protein kodiran endogenom sekvencom.
[0095] Termin „varijanta”, kao što se ovde upotrebljava, odnosi se na entitet koji pokazuje značajnu strukturnu identičnost sa referentnim entitetom, ali se strukturno razlikuje od referentnog entiteta u pogledu prisustva ili nivoa jedne ili više hemijskih grupa u poređenju sa referentnim entitetom. „Varijanta” se takođe može funkcionalno razlikovati od svog referentnog entiteta. Uopšteno, da li se određeni entitet ispravno smatra „varijantom” referentnog entiteta zasniva se na njegovom stepenu strukturnog identiteta sa referentnim entitetom. Kao što će biti razumljivo od strane stručnjaka, bilo koji biološki ili hemijski referentni entitet ima određene karakteristične strukturne elemente. „Varijanta”, po definiciji, je različita hemijska jedinica koja deli jedan ili više takvih karakterističnih strukturnih elemenata. Da navedemo samo nekoliko primera, mali molekul može imati karakterističan strukturni element jezgra (npr. jezgro makrocikla) i/ili jedan ili više karakterističnih visećih delova tako da je varijanta malog molekula ona koja deli osnovni strukturni element i karakteristične viseće grupe, ali se razlikuju u drugim visećim delovima i/ili u tipovima prisutnih veza (jednostruke naspram dvostrukih, E naspram Z, itd.) u jezgru, polipeptid može imati karakterističan element sekvence koji se sastoji od mnoštva aminokiselina koje imaju određene položaje u odnosu jedne na drugu u linearnom ili trodimenzionalnom prostoru i/ili koje doprinose određenoj biološkoj funkciji, nukleinska kiselina može imati karakterističan element sekvence koji se sastoji od mnoštva nukleotidnih rezidua koji imaju određene pozicije u odnosu na druge u linearnom ili trodimenzionalnom prostoru. Na primer, „varijantni polipeptid” može da se razlikuje od referentnog polipeptida kao rezultat jedne ili više razlika u aminokiselinskoj sekvenci i/ili jednoj ili više razlika u hemijskim delovima (npr. ugljenim hidratima, lipidima, itd.) kovalentno vezanim za polipeptidnu osnovu. „Varijantni polipeptid” pokazuje ukupnu identičnost sekvence sa referentnim polipeptidom koja je najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ili 99%. Alternativno ili dodatno, „varijantni polipeptid” ne mora deliti bar jedan karakteristični element sekvence sa referentnim polipeptidom. Referentni polipeptid može imati jednu ili više bioloških aktivnosti. „Varijantni polipeptid” može deliti jednu ili više bioloških aktivnosti referentnog polipeptida. „Varijantni polipeptid” može da nema jednu ili više bioloških aktivnosti referentnog polipeptida. „Varijantni polipeptid” može pokazivati smanjeni nivo jedne ili više bioloških aktivnosti u poređenju sa referentnim polipeptidom. Polipeptid od interesa se može smatrati „varijantom” roditeljskog ili referentnog polipeptida ako polipeptid od interesa ima aminokiselinsku sekvencu koja je identična onoj kod roditelja, ali za mali broj promena sekvence na određenim pozicijama. Tipično, manje od 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% rezidua u varijanti su supstituisani u poređenju sa roditeljem. „Varijanta” može imati 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 supstituisani reziduo u poređenju sa roditeljem. Često, „varijanta” ima veoma mali broj (npr. manje od 5, 4, 3, 2 ili 1) supstituisanih funkcionalnih rezidua (tj. rezidua koji učestvuju u određenoj biološkoj aktivnosti). Dalje, „varijanta” tipično nema više od 5, 4, 3, 2 ili 1 dodavanja ili brisanja, i često nema dodataka ili brisanja, u poređenju sa roditeljem. Štaviše, bilo koji dodaci ili brisanja su tipično manje od oko 25, oko 20, oko 19, oko 18, oko 17, oko 16, oko 15, oko 14, oko 13, oko 10, oko 9, oko 8, oko 7, oko 6, i obično su manje od oko 5, oko 4, oko 3, ili oko 2 rezidua. Roditeljski ili referentni polipeptid se može naći u prirodi. Kao što će biti razumljivo uobičajeno verziranoj osobi od struke, mnoštvo varijanti određenog polipeptida od interesa može se obično naći u prirodi, naročito kada je polipeptid od interesa polipeptid infektivnog agensa.
[0096] Termin „vektor”, kao što se ovde upotrebljava, odnosi se na molekul nukleinske kiseline sposoban da transportuje drugu nukleinsku kiselinu za koju je vezan. Vektori mogu biti sposobni za ekstrahromozomsku replikaciju i/ili ekspresiju nukleinskih kiselina za koje su vezani u ćeliji domaćinu kao što je eukariotska i/ili prokariotska ćelija. Vektori koji su sposobni da usmeravaju ekspresiju operabilno povezanih gena ovde se nazivaju „vektori ekspresije”.
[0097] Termin „divlji tip”, kao što se ovde upotrebljava, ima svoje značenje koje se podrazumeva u struci i koje se odnosi na entitet koji ima strukturu i/ili aktivnost onakvu kakva se nalazi u prirodi u „normalnom” (u poređenju sa mutiranim, bolesnim, promenjenim, itd.) stanjem ili kontekstom. Oni koji su uobičajeno verzirani u stanju tehnike će shvatiti da geni divljeg tipa i polipeptidi često postoje u više različitih oblika (npr. aleli).
DETALJAN OPIS ODREĐENIH REALIZACIJA
[0098] Ovde su opisane, između ostalog, unapređene i/ili projektovane ne-humane životinje koje imaju humanizovani genetski materijal koji kodira gen klastera diferencijacije 47 (CD47) određivanje terapijske efikasnosti CD47 antagonista (npr. anti-CD47 antitelo) za terapiju kancera, ispitivanja graftovanja transplantata, aktivaciju i fagocitozu i transdukciju signala. Zamišljeno je da takve ne-humane životinje obezbeđuju napredak u određivanju terapijske efikasnosti CD47 antagonista i njihovog potencijala za blokadu CD47. Takođe je zamišljeno da takve ne-humane životinje obezbeđuju poboljšanje transplantacionog graftovanja ljudskih ćelija. Prema tome, sadašnje otkriće je naročito korisno za razvoj anti-CD47 terapija za lečenje različitih karcinoma, kao i za održavanje humanih hematopoetskih ćelija kod ne-ljudskih životinja. Posebno, ovaj opis obuhvata humanizaciju mišjeg CD47 gena što rezultira ekspresijom humanizovanog CD47 proteina na površini ćelija ne-humane životinje. Takvi humanizovani CD47 proteini imaju kapacitet da obezbede izvor humanih CD47+ ćelija za određivanje efikasnosti anti-CD47 terapeutika za aktiviranje fagocitoze tumorskih ćelija. Dalje, takvi humanizovani CD47 proteini imaju sposobnost da prepoznaju graftovane ljudske angažovanjem drugih proteina ćelijskih površina i liganda prisutnih na površini graftovanih humanih ćelija (npr. SIRPα). Ne-humane životinje koje su ovde opisane mogu biti sposobne da aktiviraju fagocitozu preko blokade CD47 signalizacije kroz humanizovani CD47 protein eksprimovan na površini ćelija ne-humane životinje. Ovde opisane ne-humane životinje mogu biti sposobne da primaju transplantirane humane hematopoetske ćelije; takvi ne-humani sisari mogu razviti i/ili imati imuni sistem koji sadrži humane ćelije. Humanizovani CD47 proteini mogu imati sekvencu koja odgovara N-terminalnom imunoglobulinskom V domenu humanog CD47 proteina. Humanizovani CD47 proteini mogu imati sekvencu koja odgovara N-terminalnom delu humanog CD47 proteina koji sadrži ekstracelularni deo i transmembranski deo humanog CD47 proteina, pri čemu ekstracelularni deo obuhvata N-terminalni imunoglobulinski V domen humanog CD47 proteina, a transmembranski deo obuhvata pet transmembranskih domena humanog CD47 proteina. Humanizovani CD47 proteini mogu imati sekvencu koja odgovara intracitoplazmatskom repu ne-humanog (npr. mišjeg) CD47 proteina. Humanizovani CD47 proteini mogu imati sekvencu koja odgovara aminokiselinskim reziduima 19-292 (ili 19-141, ili 19-127) humanog CD47 proteina. Ovde opisane ne-humane životinje mogu sadržati endogeni CD47 gen koji sadrži genetski materijal ne-humane životinje i heterolognih vrsta (npr. čoveka). Ovde opisane ne-humane životinje mogu da sadrže humanizovani CD47 gen, pri čemu humanizovani CD47 gen sadrži egzone humanog CD47 gena koji kodiraju ekstracelularni deo uključujući N-terminalni imunoglobulinski V domen humanog CD47 gena. Humanizovani CD47 gen može da sadrži humane CD47 egzone, npr. egzone 2-7, koji kodiraju N-terminalni deo humanog CD47 proteina koji sadrži ekstracelularni deo i transmembranski deo humanog CD47 proteina, pri čemu ekstracelularni deo uključuje N-terminalni imunoglobulinski V domen humanog CD47 proteina, a transmembranski deo uključuje pet transmembranskih domena humanog CD47 proteina. Humanizovani CD47 gen može da sadrži ne-humane CD47 egzone koji kodiraju signalni peptid, u celini ili delimično, i intracitoplazmatski rep ne-humanog CD47 proteina. Humanizovani CD47 gen može da sadrži ne-humani CD47 egzon 1 i egzon(e) nishodno od egzona 7 koji kodiraju intracitoplazmatski rep i 3' UTR. U zavisnosti od izoforma, može postojati jedan ili više egzona nishodno od egzona 7, sa stop kodonom i 3' UTR koji su prisutni u poslednjem egzonu za sve izoforme. Na primer, izoforma 2 mišjeg i humanog CD47 prikazana u Tabeli 3 ima dva egzona nishodno od egzona 7, označenih kao egzon 8 i 9.
[0099] Različiti aspekti pronalaska su detaljno opisani u odeljcima koji slede. Upotreba odeljaka ne treba da ograničava pronalazak. Svaki odeljak se može primeniti na bilo koji aspekt pronalaska. U ovoj prijavi, upotreba „ili” znači „i/ili” ukoliko nije drugačije naznačeno.
Gen klastera diferencijacije 47 (CD47)
[0100] CD47, prvobitno nazvan integrin-povezani protein (IAP) zbog svoje uloge u transdukciji signala sa integrina na imunske ćelije, je transmembranski protein koji uključuje N-terminalni imunoglobulinski domen V (IgV), pet transmembranskih domena i kratki C-terminalni intracitoplazmatski rep. Intracitoplazmatski rep se razlikuje po dužini u skladu četiri alternativno upletene izoforme koje su identifikovane. CD47 (ili IAP) je inicijalno opisan kao eksprimovan na svim tkivima (izoforma 2), neuronima (izoforma 4) i keratinocitima i makrofagima (izoforma 1; videti Reinhold i sar. (1995) J. Cell Sci.108:3419-3425). Malo se zna o izoformi 3 uprkos što ova forma, od četiri ioforme, ima drugi po redu najduži intracitoplazmatski rep. Pored integrina, poznato je da CD47 interaguje sa nekoliko drugih proteina na površini ćelija, kao što su, na primer, trombospondin i članovi porodice SIRP. Najznačajnije je da CD47 interaguje sa SIRPα i dovodi do dvosmerne signalizacije koja reguliše različite reakcije između ćelija, kao što je, na primer, inhibicija fagocitoze i aktivacija T ćelija. Zaista, CD47-SIRPα interakcija je došla u fokus poslednjih godina zbog svoje uloge u dobijanju tumorskih ćelija koje imaju sposobnost da izbegnu imunološki nadzor. CD47 vezivanje za SIRPα normalno obezbeđuje zaštitu putem antifagocitnih signala („ne jedi me”) za normalne ćelije. Međutim, otkriveno je da tumori eksprimuju antifagocitne signale, uključujući CD47, da bi izbegli uništavanje fagocitozom. Zanimljivo, poznato je da je CD47 povećan u nekoliko hematoloških karcinoma i da doprinosi rastu i širenju tumora (Chao i sar. (2012) Curr Opin Immunol.24(2): 225-232).
[0101] Potpuni efekti ciljanja CD47 i CD47-SIRPα puta kao nove terapije za kancer su nepoznati i istražuju se neki mogući toksiciteti. Potrebno je podrobnije i detaljnije razumevanje signalizacije CD47 i CD47-SIRPα prelaza da bi se razvile bolje ciljane terapije budućnosti za lečenje kancera.
CD47 sekvence
[0102] Primeri mišjih i humanih CD47 sekvenci prikazani su u Tabeli 3. Za mRNK sekvence, masna slova označavaju kodirajuću sekvencu, a uzastopni egzoni, gde je naznačeno, razdvojeni su naizmenično podvučenim tekstom. Kod mišjih i humanih proteinskih sekvenci, signalni peptidi su podvučeni; ekstracelularne sekvence su podebljane, a intracitoplazmatske sekvence su označene kurzivom. Kod sekvenci humanizovanih proteina, ne-humane sekvence su naznačene regularnim fontom, humane sekvence su naznačene podebljanim fontom, a signalni peptidi su podvučeni. Kao što je prikazano, izoforme se razlikuju po broju egzona. Na primer, izoforme 1-4 humanog gena CD47 imaju ukupno 8, 9, 10, odnosno 11 egzona, sa egzonima 2-7 svake izoforme koja kodira ekstracelularni domen i pet transmembranskih domena.
TABELA 3
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
Mišja CD47 aminokiselinska izoforma 3 (XP_006521870.1)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
Humanizovani CD47 Ne-humane životinje
[0103] Obezbeđene su ne-humane životinje koje eksprimuju humanizovane CD47 proteine na površini ćelija ne-humanih životinja koje su rezultat genetske modifikacije endogenog lokusa ne-humane životinje koji kodira CD47 protein. Pogodni primeri koji su ovde opisani uključuju glodare, konkretno miševe.
[0104] Humanizovani CD47 gen može sadržati genetski materijal iz heterolognih vrsta (npr. ljudi), pri čemu humanizovani CD47 gen kodira CD47 protein koji sadrži kodirani deo genetskog materijala iz heterolognih vrsta. Ovde opisan humanizovani CD47 gen može da sadrži genomsku DNK heterologne vrste koja kodira ekstracelularni deo proteina CD47 koji je eksprimovan na plazma membrani ćelije. Ovde opisan humanizovani CD47 gen može da sadrži genomsku DNK heterologne vrste koja kodira ekstracelularni deo i transmembranski deo CD47 proteina koji je eksprimovan na plazma membrani ćelije. Takođe su obezbeđene ne-humane životinje, ne-humani embrioni, ćelije i ciljajući konstrukti za dobijanje ne-humanih životinja, ne-humanih embriona i ćelija koje sadrže navedeni humanizovani CD47 gen.
[0105] Endogeni CD47 gen može biti izbrisan. Endogeni CD47 gen može biti promenjen, gde je deo endogenog CD47 gena zamenjen heterolognom sekvencom (npr. humana CD47 sekvenca, u celini ili delimično). Ceo ili suštinski ceo endogeni CD47 gen može biti zamenjen heterolognim genom (npr. humanim genom CD47). Deo heterolognog CD47 gena može biti ubačen u endogeni ne-humani CD47 gen na endogenom CD47 lokusu. Heterologni gen može biti humani gen. Modifikacija ili humanizacija se može načiniti na jednoj od dve kopije endogenog CD47 gena, što dovodi do nastanka ne-humane životinje koja je heterozigotna u pogledu humanizovanog CD47 gena. Ne-humana životinja može biti obezbeđena tako da je homozigotna za humanizovani CD47 gen.
[0106] Ovde opisana ne-humana životinja može da sadrži humani CD47 gen, u celini ili delimično, na endogenom ne-humanom CD47 lokusu. Prema tome, takve ne-humane životinje se mogu opisati kao da imaju heterologni CD47 gen. Zamenjeni, umetnuti, modifikovani ili izmenjeni CD47 gen na endogenom CD47 lokusu može se detektovati korišćenjem različitih postupaka uključujući, na primer, PCR, Western blot, Southern blot, polimorfizam dužine restrikcijskih fragmenata (RFLP), ili ispitivanje dobitaka ili gubitka alela. Ne-humana životinja može biti heterozigotna u pogledu CD47 gena. Ne-humana životinja može biti homozigotna za humanizovani CD47 gen.
[0107] Humanizovani CD47 gen koji je ovde opisan uključuje CD47 gen koji ima drugi, treći, četvrti, peti, šesti i sedmi egzon, a svaki može imati sekvencu koja je najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70 %, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identična drugom, trećem, četvrtom, petom, šestom i sedmom egzonu koji se pojavljuje u humanom CD47 genu iz Tabele 3.
[0108] Humanizovani CD47 gen koji je ovde opisan može da sadrži gen CD47 koji ima prvi egzon i egzon(e) nishodno od egzona 7 (npr. osmi i deveti egzoni izoforme 2) koji imaju sekvencu koja je najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identična odgovarajućem egzonu koji se pojavljuje u mišjem CD47 genu iz Tabele 3.
[0109] Humanizovani CD47 gen koji je ovde opisan može da sadrži gen CD47 koji ima 5' netranslantovani region i 3' netranslantovani region koji ima sekvencu koja je najmanje 50% (npr. 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identična 5' netranslantovanom regionu i 3' netranslantovanom regionu koji se pojavljuje u mišjem CD47 genu iz Tabele 3.
[0110] Humanizovani CD47 gen koji je ovde opisan može uključivati CD47 gen koji ima kodirajuću sekvencu nukleotida (npr. cDNK sekvencu) koja je najmanje 50% (npr. 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, %, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identična kodirajućoj sekvenci nukleotida koja se pojavljuje u humanoj CD47 kodirajućoj sekvenci nukleotida iz Tabele 3.
[0111] Humanizovani CD47 protein proizveden od ovde opisane ne-humane životinje može imati ekstracelularni deo koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 50% (npr. 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identična ekstracelularnom delu humanog CD47 proteina koji se pojavljuje u Tabeli 3.
[0112] Humanizovani CD47 protein proizveden od ovde opisane ne-humane životinje može imati ekstracelularni deo koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je identična aminokiselinskim reziduima 19-141 koji se pojavljuju u humanom CD47 proteinu iz Tabele 3.
[0113] Humanizovani CD47 protein proizveden od ovde opisane ne-humane životinje može imati N-terminalni imunoglobulinski V domen koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identična N-terminalnom imunoglobulinskom V domenu humanog CD47 proteina koji se pojavljuje u Tabeli 3.
[0114] Humanizovani CD47 protein proizveden od ovde opisane ne-humane životinje može imati N-terminalni imunoglobulinski V domen koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je identična aminokiselinskim reziduima 19-127 koji se pojavljuju u humanom CD47 proteinu iz Tabele 3.
[0115] Humanizovani CD47 protein proizveden od ovde opisane ne-humane životinje može imati N-terminalni imunoglobulinski V domen i pet transmembranskih domena od kojih svaki ima sekvencu koja je najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65% , 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identična N-terminalnom imunoglobulinskom V domenu i pet transmembranskih domena humanog CD47 proteina koji se pojavljuje u Tabeli 3.
[0116] Humanizovani CD47 protein proizveden od ovde opisane ne-humane životinje može imati intracitoplazmatski rep koji ima sekvencu koja je najmanje 50% (npr. 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% , 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identična intracitoplazmatskom repu CD47 proteina miša koji se pojavljuje u Tabeli 3.
[0117] Humanizovani CD47 protein proizveden od ovde opisane ne-humane životinje može imati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identična aminokiselinskim reziduima 16-292 koji se pojavljuju u humanom CD47 proteinu iz Tabele 3.
[0118] Humanizovani CD47 protein proizveden od ovde opisane ne-humane životinje može imati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identična aminokiselinskim reziduima 19-292 koji se pojavljuju u humanom CD47 proteinu iz Tabele 3.
[0119] Humanizovani CD47 protein proizveden od ovde opisane ne-humane životinje može imati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identična aminokiselinskim reziduima 19-292 (ili 16-292) koji se pojavljuju u humanom CD47 proteinu iz Tabele 3.
[0120] Humanizovani CD47 protein proizveden od ovde opisane ne-humane životinje može imati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identična aminokiselinskoj sekvenci humanizovanog CD47 proteina koji se pojavljuje u Tabeli 3.
[0121] Humanizovani CD47 protein proizveden od ovde opisane ne-humane životinje može imati aminokiselinsku sekvencu koja je identična aminokiselinskoj sekvenci humanizovanog CD47 proteina koji se pojavljuje u Tabeli 3.
[0122] Data su jedinjenja i postupci za dobijanje ne-humanih životinja koje eksprimuju humanizovani CD47 protein, uključujući specifične polimorfne oblike, alelne varijante (npr. razlike u jednoj aminokiselini) ili alternativno upletene izoforme, kao i jedinjenja i postupci za dobijanje ne-humanih životinja koje eksprimuju takve proteine iz humanog promotora i humane regulatorne sekvence. Mogu se takođe obezbediti jedinjenja i postupci za dobijanje nehumanih životinja koje eksprimuju takve proteine iz endogenog promotora i endogene regulatorne sekvence. Postupci uključuju ubacivajnje genetskog materijala koji kodira humani CD47 protein u celini ili delimično na tačnoj lokaciji u genomu ne-humane životinje, koji odgovara endogenom CD47 genu, čime se stvara humanizovani CD47 gen koji eksprimuje CD47 protein koji je humani u celini ili delimično. Postupci mogu uključivati ubacivanje genomske DNK koja odgovara egzonima 2-7 humanog CD47 gena u endogeni CD47 gen nehumane životinje, čime se stvara humanizovani gen koji kodira CD47 protein koji sadrži humani deo koji sadrži aminokiseline koje kodiraju ubačeni egzoni.
[0123] Tamo gde je to prikladno, kodirajući region genetskog materijala ili polinukleotidne sekvence (sekvenci) koji kodira humani CD47 protein u celini ili delimično može biti modifikovan tako da uključuje kodone koji su optimizovani za ekspresiju u ne-humanoj životinji (npr. videti SAD Patente br. 5,670,356 i 5,874,304). Kodon-optimizovane sekvence su sintetičke sekvence, i poželjno kodiraju identični polipeptid (ili biološki aktivni fragment polipeptida pune dužine koji ima suštinski istu aktivnost kao i polipeptid pune dužine) kodiran od strane roditeljskog polinukleotida koji nije optimizovan za kodon. Kodirajući region genetskog materijala koji kodira humani CD47 protein, u celini ili delimično, može uključivati izmenjenu sekvencu da bi se optimizovala upotreba kodona za određeni tip ćelije (npr. ćelija glodara). Na primer, kodoni genomske DNK koji odgovaraju egzonima 2-7 humanog CD47 gena koji se ubacuju u endogeni CD47 gen ne-humane životinje (npr. glodar) mogu biti optimizovani za ekspresiju u ćeliji ne-humane životinje. Takva sekvenca se može opisati kao kodon-optimizovana sekvenca.
[0124] U pristupu koji koristi humanizovani CD47 gen upotrebljava se relativno minimalna modifikacija endogenog gena, što dovodi do prirodne CD47-posredovane signalne transdukcije u ne-humanoj životinji, jer je genomska sekvenca CD47 sekvenci modifikovana u jednom fragmentu i zbog toga zadržava normalnu funkcionalnost tako što uključuje neophodne regulatorne sekvence. Prema tome, u takvim slučajevima, modifikacija CD47 gena ne utiče na druge okolne gene ili druge endogene gene koji interaguju sa CD47 (npr. trombospondin, SIRP geni, integrini, itd.). Dalje, modifikacija ne utiče na sklapanje funkcionalnog CD47 transmembranskog proteina na plazma membrani i održava normalne efektorne funkcije preko vezivanja i potonje transdukcije signala kroz citoplazmatski deo proteina koji nije pod uticajem modifikacije.
[0125] Šematska ilustracija (ne u pravoj veličin) genomske organizacije endogenog mišjeg CD47 gena i humanog CD47 gena data je na Slici 1. Primer postupka za humanizovanje endogenog mišjeg CD47 gena korišćenjem genomskog fragmenta koji sadrži egzone 2-7 humanog CD47 gena dat je na Slici 2. Kao što je ilustrovano, genomska DNK koja sadrži egzone 2-7 humanog CD47 gena ubačena je u endogeni lokus mišjeg CD47 gena ciljajućim konstruktom. Ovakva genomska DNK uključuje deo gena koji kodira ekstracelularni deo i transmembranske domene (npr. aminokiselinski rezidui 16-292) humanog CD47 proteina odgovornog za vezivanje liganda.
[0126] Ne-humana životinja (npr. miš) koja ima humanizovani CD47 gen na endogenom CD47 lokusu može biti dobijena bilo kojim postupkom poznatom u stanju tehnike. Na primer, može se napraviti ciljajući vektor koji uvodi humani CD47 gen u celini ili delimično pomoću selektabilnog markerskog gena. Slika 2 ilustruje endogeni CD47 lokus genoma miša koji sadrži ubacivanje egzona 2-7 humanog CD47 gena. Kao što je ilustrovano, ciljajući konstrukt sadrži 5' homolognu granu koja sadrži sekvencu uzvodno od egzona 2 endogenog mišjeg CD47 gena (∼39 Kb), praćenu genomskim DNK fragmentom koji sadrži egzone 2-7 humanog CD47 gena (∼23,9 Kb), kasetom za selekciju leka (npr. neomicin-rezistentni gen okružen sa obe strane loxP sekvencama; ∼5 Kb), i 3' homolognom granom koja sadrži sekvencu nishodno od egzona 7 endogenog mišjeg CD47 gena (∼99 Kb). Ciljajući konstrukt sadrži samobrišuću kasetu za selekciju leka (npr. neomicin-rezistentni gen okružen sa obe strane loxP sekvencama; videti SAD Patente br.8,697,851, 8,518,392 i 8,354,389. Nakon homologne rekombinacije, egzoni 27 endogenog mišjeg CD47 gena zamenjeni su sekvencom koja je sadržana u ciljajućem vektoru (tj. egzoni 2-7 humanog CD47 gena). Stvoren je humanizovani CD47 gen koji daje ćeliju ili ne-humanu životinju koja eksprimuje humanizovani CD47 protein koji sadrži aminokiseline koje kodiraju egzoni 2-7 humanog CD47 gena. Kaseta za selekciju leka se uklanja na razvojno-zavisan način, tj. potomstvo izvedeno od miševa čije ćelije germinativne linije sadrže gore opisan humani CD47 gen će odbaciti selektabilni marker iz diferenciranih ćelija tokom razvoja.
[0127] Ovde opisane ne-humane životinje mogu biti pripremljene kao što je gore opisano, ili korišćenjem postupaka poznatih u struci, da obuhvate dodatne humane ili humanizovane gene, često zavisno od nameravane upotrebe ne-humane životinje. Genetski materijal takvih dodatnih humanih ili humanizovanih gena može da se uvede kroz dalju promenu genoma ćelija (npr. embrionalne matične ćelije) koje imaju genetske modifikacije kao što je gore opisano ili putem struci poznatih tehnika ukrštanja sa drugim genetski modifikovanim sojevima po želji. Ovde opisane ne-humane životinje mogu biti pripremljene da dalje sadrže jedan ili više humanih ili humanizovanih gena selektovanih iz SIRPα (CD172a), IL-3, M-CSF, GM-CSF i TPO. Ovde opisane ne-humane životinje mogu biti pripremljene uvođenjem ciljajućeg vektora, kao što je ovde opisan, u ćeliju iz modifikovanog soja. Da navedemo samo jedan primer, ciljajući vektor, kao što je gore opisan, može se uvesti u miša koji je Rag2-deficijentan i IL-2Rγdeficijentan i uključivati četiri humana citokina (Rag2<-/->IL2Rγc<-/->; M-CSF<Hu>; IL-3/GM-CSF<Hu>; hSIRPα<tg>; TPO<Hu>). Ovde opisane ne-humane životinje mogu biti pripremljene da dalje sadrže humani ili humanizovani signal-regulatorni proteinski alfa (SIRPα) gen. Ovde opisane nehumane životinje mogu da sadrže humanizovani CD47 gen, kao što je ovde opisan, i genetski materijal iz heterolognih vrsta (npr.ljudi), gde genetski materijal kodira, u celini ili delimično, jedan ili više heterolognih proteina selektovanih iz SIRPα (CD172a), IL-3, M-CSF, GM-CSF i TPO. Ovde opisane ne-humane životinje mogu da sadrže humanizovani CD47 gen kao što je ovde opisan i genetski materijal iz heterolognih vrsta (npr. ljudi), gde genetski materijal kodira, u celini ili delimično, heterologni (npr. humani) SIRPα (CD172a) protein. Ne-humane životinje koje su ovde opisane mogu dalje da sadrže SIRPα gen koji sadrži endogeni deo i humani deo (npr. egzoni 2-4 humanog SIRPα gena), pri čemu humani deo kodira ekstracelularni domen SIRPα proteina (npr. amino kiseline koje odgovaraju reziduima 28-362 humanog SIRPα proteina), a endogeni deo kodira intracelularni domen endogenog SIRPα proteina; humani deo i endogeni deo mogu biti operabilno vezani za endogeni SIRPα promotor.
[0128] Na primer, kao što je ovde opisano, ne-humane životinje koje sadrže humanizovani CD47 gen mogu dalje da sadrže (npr. pomoću strategije ukrštanja ili strategije ciljanja više gena) jednu ili više modifikacija kao što je opisano u PCT/US2010/051339, podnesenoj 4. oktobra 2010; PCT/US2013/058448, podnesenoj 6. septembra 2013; PCT/US2013/045788, podnesenoj 14. juna 2013; PCT/US2014/056910, podnesenoj 23. septembra 2014; PCT/US2014/060568, podnesenoj 15. oktobra 2014; PCT/US2012/025040, podnesenoj 14. februara 2014; PCT/US2012/062379, podnesenoj 29. oktobra 2012; PCT/US2014/064806, podnesenoj 10. novembra 2014. i PCT/US2014/064810, podnesenoj 10. novembra 2014. godine. Glodar koji sadrži humanizovani CD47 gen (tj. egzone 2-7 humanog CD47 gena koji su operabilno vezani za egzon 1 i egzon 8 (i stoga za bilo koje nizvodne egzone) endogenog CD47 gena glodara tako da humanizovani CD47 gen kodira CD47 polipeptid koji ima ekstracelularni deo iz humanog CD47 proteina i intracelularni deo iz CD47 proteina glodara) može biti ukršten sa glodarom koji sadrži humanizovani SIRPα gen (npr. egzoni 2-4 humanog SIRPα gena koji su operabilno vezani za egzone 1 i 5-8 endogenog SIRPα gena glodara tako da humanizovani SIRPα gen kodira SIRPα polipeptid koji ima ekstracelularni deo iz humanog SIRPα proteina (npr. aminokiseline koje odgovaraju reziduima 28-362) i intracelularni deo iz SIRPα proteina glodara; videti npr. PCT/US2014/056910, podnesenu 23. septembra 2014.
[0129] Iako su realizacije koje uključuju humanizovani CD47 gen kod miša (tj. miša sa CD47 genom koji kodira CD47 protein koji uključuje humani deo i mišji deo) ovde detaljno opisane, takođe su opisane i druge ne-humane životinje koje sadrže humanizovani CD47 gen. Takve ne-humane životinje mogu da sadrže humanizovani CD47 gen operabilno vezan za endogeni CD47 promotor. Takve ne-humane životinje mogu da eksprimuju humanizovani CD47 protein iz endogenog lokusa, pri čemu humanizovani CD47 protein sadrži aminokiselinske rezidue 16-292 (ili 19-141 ili 19-127) humanog CD47 proteina. Takve ne-humane životinje uključuju bilo koje od onih koje mogu biti genetski modifikovane da eksprimuju CD47 protein kao što je ovde opisan, kao npr. sisari, npr. miš, pacov, zec, svinja, govedo (npr. krava, bik, bivol), jelen, ovca, koza, kokoška, mačka, pas, lasica, primat (npr. marmoset, rezus makaki majmun), itd. Na primer, za one ne-humane životinje za koje nisu odmah dostupne genetski modifikovane ES ćelije, primenjuju se drugi postupci koji se koriste za dobijanje ne-humane životinje koja sadrži genetsku modifikaciju. Takvi postupci uključuju npr. modifikovanje genoma ne-ES ćelija (npr. fibroblast ili indukovana pluripotentna ćelija) i upotrebu prenosa jezgra somatske ćelije (SCNT) za prenos genetski modifikovanog genoma u odgovarajuću ćeliju, npr. u enukleisanu oocitu, i gestaciju modifikovane ćelije (npr. modifikovana oocita) u ne-humanoj životinji pod odgovarajućim uslovima da se formira embrion.
[0130] Postupci za modifikaciju ne-humanog životinjskog genoma (npr. genom svinje, krave, glodara, kokoške itd.) uključuju, na primer, upotrebu cinkov prst nukleaze (ZFN) ili nukleaze efektora sličnih aktivatorima transkripcije (TALEN) za modifikaciju genoma koji uključuje humanizovani CD47 gen.
[0131] Ovde opisana ne-humana životinja može biti sisar. Ovde opisana ne-humana životinja može biti sisar male veličine, npr. iz superfamilije Dipodoidea ili Muroidea. Ovde opisana genetski modifikovana životinja može biti glodar. Ovde opisani glodar može biti izabran iz grupe miševa, pacova i hrčka. Glodar može biti izabran iz superfamilije Muroidea. Genetski modifikovana životinja koja je ovde opisana može biti iz familije selektovane iz vrste Calomiscidae (npr. hrčci slični mišu), Cricetidae (npr. hrčci, pacovi i miševi Novog sveta, voluharica), Muridae (pravi miševi i pacovi, gerbili, egipatski ježoliki miševi, grivasti pacovi), Nesomyidae (miševi penjači, kengur-pacovi, debelorepi pacovi, Malagasy pacovi i miševi), Platacanthomyidae (npr. Platacanthomys lasiurus) i Spalacidae (npr. golo slepo kuče, Rhizomyni glodar i Myospalacinae glodar); ovde opisani genetski modifikovani glodar može biti izabran iz grupe pravih miševa ili pacova (familija Muridae), gerbila, egipatskih ježolikih miševa i grivastih pacova. Genetski modifikovani miš, opisan ovde, može biti pripadnik familije Muridae. Ovde opisana ne-humana životinja može biti glodar. Ovde opisani glodar može biti izabran iz grupe miševa i pacova. U nekim realizacijama, ovde opisana ne-humana životinja može biti miš.
[0132] Ovde opisana ne-humana životinja može biti glodar, odnosno miš iz soja C57BL izabran iz C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLvN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6BiJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr i C57BL/Ola. Ovde opisani miš može biti soj 129 izabran iz grupe koja se sastoji od sledećih sojeva: 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (npr. 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (videti npr., Festing i sar., 1999, Mammalian Genome 10:836; Auerbach, W. I sar., 2000, Biotechniques 29(5):1024-1028, 1030, 1032). Ovde opisan genetski modifikovan miš može biti mešavina prethodno pomenutog soja 129 i ranije pomenutog soja C57BL/6. Ovde opisan miš može biti mešavina prethodno navedenih 129 sojeva, ili mešavina prethodno pomenutih sojeva BL/6. Soj mešavine, kao što je ovde opisana, može biti 129S6 (129/SvEvTac) soj. Ovde opisani miš može biti iz BALB soja, npr. BALB/c soja. Ovde opisani miš može biti mešavina BALB soja i nekog drugog prethodno pomenutog soja.
[0133] Ovde opisana ne-humana životinja može biti pacov. Ovde opisani pacov je izabran iz soja Wistar pacova, LEA soja, Sprague Davlei soja, Fischer soja, F344, F6 i Dark Agouti soja. Soj pacova, kao što je ovde opisan, je mešavina dva ili više sojeva izabranih iz grupe koju čine Wistar, LEA, Sprague Davlei, Fischer, F344, F6 i Dark Agouti.
Postupci za upotrebu ne-humanih životinja sa humanizovanim CD47 genima
[0134] Prijavljene su CD47 mutantne i transgene ne-humane životinje (npr. minijaturne svinje) i ćelije (Koshimizu H. i sar. (2014) PLoS One, 9(2):e89584; Lavender, K.J. i sar. (2014) J. Immunol. Methods, 407:127-134; Tena, A. i sar. (2014) Am. J. Transplant.doi: 10.1111/ajt.12918; Lavender K.J. i sar. (2013) Blood, 122(25):4013-4020; Tena, A. i sar. (2012) Transplantation 94(10S):776; Wang, C. i sar. (2011) Cell Transplant. 20(11-12):1915-1920; Johansen, M.L. and Brown, E.J. (2007) J. Biol. Chem.282:24219-24230; Wang, H. i sar.
(2007) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 104:13744-13749; Tulasne D. i sar. (2001) Blood, 98(12):3346-52; Oldenborg, P. i sar. (2000) Science 288:2051-2054; Verdrengh, M. i sar. (1999) Microbes Infect. 1(10):745-751; Chang, H.P. i sar. (1999) Learn Mem. 6(5):448-457; Wang, X.Q. i sar. (1999) J. Cell Biol. 147(2):389-400; Lindberg, F.P. i sar. (1996) Science 274(5288):795-798). Takve životinje su primenjene u različitim ispitivanjima da bi se odredili, na primer, molekularni aspekti ekspresije, funkcije i regulacije CD47. Otkrivene su značajne razlike u vrstama. Zaista, negojazni dijabetični miševi/miševi sa teškom kombinovanom imunodeficijencijom (NOD /SCID) eksprimuju SIRPα protein koji je sposoban za interakciju sa humanim CD47 i stoga se intenzivno koristi za razvoj mišjih modela sa komponentama humanog imunog sistema (npr. videti Takenaka, K. i sar. (2007) Nat. Immunol. 8 (120:1313-1323). SIRPα alel prisutan u ovim miševima nije reprezentativan za SIRPα alele prisutne u drugim sojevima miševa i, generalno, postoji mala unakrsna reakcija između CD47 i SIRPα među vrstama. Takođe, zabeleženo je da CD47 na mišjim ćelijama ima skoro potpunu pokretljivost, dok CD47 na humanim ćelijama pokazuje samo oko 30-40% (Bruce, L. i sar. (2003) Blood 101:4180-4188; Mouro-Chanteloup, L. i sar. (2000) VoxSanguinis 78:P030; Mouro-Chanteloup, L. i sar. (2003) Blood 101:338-344). Prema tome, NOD/SCID miševi nisu bez ograničenja. Na primer, iako se višestruki razvoj humanog hematopoetskog sistema može podržati u nekim genetskim pozadinama (npr. BALB/cRag2<-/->IL-2Rɣc<-/->), homeostaza drugih tipova ćelija ostaje neefikasna (npr. T i NK ćelije; videti npr. Gimeno, R. i sar. (2004) Blood 104:3886-3893; Traggiai, E. i sar. (2004) Science 304:104-107; Legrand, N. i sar. (2006) Blood 108:238-245). Zatim, takođe je poznato da CD47 interaguje sa drugim proteinima koji se nalaze na površini ćelija i da obezbeđuje dvosmernu signalizaciju. Prema tome, postojeći miševi predstavljaju neefikasan in vivo sistem za objašnjavanje CD47-zavisnih funkcija u različitim biološkim procesima, kao što su, na primer, graftovanje i fagocitoza. Dalje, postojeći miševi predstavljaju suboptimalni in vivo sistem za razvoj CD47 ciljanih terapija.
[0135] Ovde opisane ne-humane životinje mogu da obezbede poboljšani in vivo sistem i izvor bioloških materijala (npr. ćelija) koji eksprimuju humani CD47 i koji su korisni za različita ispitivanja. Ovde opisane ne-humane životinje mogu se koristiti za razvoj terapeutika koji ciljaju CD47 i/ili moduliraju CD47-SIRPα signalizaciju. Ovde opisane ne-humane životinje mogu se koristiti za skrining i razvoj kandidata za terapeutik (npr. antitela) koji vezuju humani CD47. Ovde opisane ne-humane životinje mogu se koristiti za skrining i razvijanje kandidata za terapeutik (npr. antitela) koji blokiraju interakciju humanog CD47 sa humanim SIRPα. Ovde opisane ne-humane životinje mogu se koristiti za određivanje profila vezivanja antagonista i/ili agonista humanizovanog CD47 na površini ćelije ne-humane životinje, kao što je ovde opisana. Ovde opisane ne-humane životinje mogu se koristiti za određivanje epitopa ili epitopa (množina) jednog ili više kandidata za terapijsko antitelo koja vezuju humani CD47.
[0136] Ovde opisane ne-humane životinje mogu se koristiti za određivanje farmakokinetičkih profila anti-CD47 antitela. Jedna ili više ne-humanih životinja koje su ovde opisane i jedna ili više kontrolnih ili referentnih ne-humanih životinja može biti svaka izložena jednom ili više anti-CD47 antitela kandidata za terapiju u različitim dozama (npr.0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 7,5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, ili 50 mg/kg ili više). Terapijska antitelakandidati se mogu dozirati bilo kojim željenim putem primene (npr. supkutano, intravenozno, intramuskularno, intraperitonealno, itd.) Krv je izolovana iz ne-humanih životinja (humanizovana i kontrolisana) u različitim vremenskim trenucima (npr.0 h, 6 h, 1 dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, 7 dana, 8 dana, 9 dana, 10 dana, 11 dana ili do 30 ili više dana). Za određivanje farmakokinetičkih profila primenjenih terapijskih antitela-kandidata mogu se sprovesti različita ispitivanja korišćenjem uzoraka dobijenih od ne-humanih životinja, kao što su ovde opisane, uključujući, ali bez ograničenja, ukupni IgG, aglutinaciju anti-terapeutskih antitela, itd.
[0137] Ovde opisane ne-humane životinje mogu se koristiti za merenje terapijskog efekta blokiranja ili modulacije CD47 signalizacije i efekta na ekspresiju gena kao rezultat ćelijskih promena. Ovde opisana ne-humana životinja ili iz njih izolovane ćelije mogu biti izložene kandidatu za terapeutik koji se vezuje za humanizovani CD47 protein (ili humani deo CD47 proteina) na površini ćelije ne-humane životinje i, nakon određenog vremenskog perioda, analizirane u pogledu efekata na CD47-zavisne procese, na primer, adheziju, angiogenezu, apoptozu, inflamaciju, migraciju, fagocitozu, proliferaciju i klirens tumora (ili tumorskih ćelija).
[0138] Ovde opisane ne-humane životinje mogu da eksprimuju humanizovani CD47 protein tako da ćelije, ćelijske linije i ćelijske kulture mogu biti generisane da služe kao izvor humanizovanog CD47 za upotrebu u ispitivanjima vezivanja i funkcionalnosti, npr. da se ispita vezivanje ili funkcija CD47 antagonista ili agonista, naročito kada je antagonist ili agonist specifičan za humanu SIRPα sekvencu ili epitop. CD47 epitopi koje vežu terapijska antitelakandidati mogu se odrediti korišćenjem ćelija izolovanih iz ovde opisanih ne-humanih životinja.
[0139] Ćelije iz ovde opisanih ne-humanih životinja mogu se izolovati i koristiti na ad hoc osnovi, ili se mogu održavati u kulturi tokom mnogih generacija. Ćelije iz ovde opisanih nehumanih životinja mogu biti obesmrtljene i održavane u kulturi neograničeno (npr. u serijskim kulturama).
[0140] Ovde opisane ćelije i/ili ne-humane životinje mogu se koristiti u ispitivanju preživljavanja i/ili proliferacije (npr. upotrebom B ili T ćelija) za skrining i razvoj kandidata za terapeutik koji moduliraju signalizaciju humanog CD47. Aktivacija ili gubitak CD47 može odigrati važnu ulogu u regulaciji ćelijske proliferacije, a indukcija apoptoze putem CD47 može biti rezultat aktivacije specifičnih epitopa ekstracelularnog domena CD47, dakle, kandidati za CD47 modulatore (npr. antagonisti ili agonisti) mogu se identifikovati, okarakterisati i razviti korišćenjem ovde opisanih ćelija ne-humanih životinja i/ili ovde opisanih ne-humanih životinja. Ovde opisane ćelije i/ili nehumane životinje mogu se koristiti u ispitivanjima preživljavanja ili smrti da bi se odredio efekat na proliferaciju ili apoptozu specifične ćelije(a) (npr. ćelija raka) u prisustvu i odsustvu CD47.
[0141] Ovde opisane ćelije i/ili ne-humane životinje mogu se koristiti u enotransplantaciji heterolognih (npr. humanih) ćelija da se odrede CD47-posredovane funkcije u fiziološkom (npr. imunološkom) odgovoru na transplantirane humane ćelije. Kandidati za terapeutik koji vezuju ili blokiraju jednu ili više funkcija humanog CD47 mogu biti okarakterisani u ovde opisanim nehumanim životinjama. Pogodna merenja obuhvataju različita ćelijska ispitivanja, ispitivanja proliferacije, analizu serumskog imunoglobulina (npr. titar antitela), ispitivanja citotoksičnosti i karakterizaciju ligand-receptor interakcija (ispitivanja imunoprecipitacije). Ovde opisane nehumane životinje mogu se koristiti za karakterizaciju CD47-posredovanih funkcija koje regulišu imuni odgovor na antigen. Antigen može biti udružen sa neoplazmom. Antigen može biti udružen sa autoimunom bolešću ili stanjem. Antigen može biti meta povezana sa bolešću ili stanjem od kojeg pati jedan ili više humanih pacijenata kojima je potrebna terapija.
[0142] Ovde opisane ne-humane životinje mogu da se koriste u eksperimentima transplantacije ili adaptivnog transfera da bi se odredio terapijski potencijal jedinjenja ili bioloških agenasa da moduliraju CD47-zavisnu regulaciju novih limfocita i njihove imunološke funkcije. Ovde opisane ne-humane životinje mogu biti transplantirane sa humanim B ćelijama.
[0143] Ćelije ovde opisanih ne-humanih životinja mogu da se koriste u ispitivanju migracije ili širenja ćelija za skrining i razvoj kandidata za terapeutik koji moduliraju humani CD47. Takvi procesi su neophodni za mnoge ćelijske procese, uključujući zarastanje rana, diferencijaciju, proliferaciju i preživljavanje.
[0144] Ćelije ovde opisanih ne-humanih životinja mogu se koristiti u ispitivanjima fagocitoze da bi se odredio terapijski potencijal jedinjenja ili bioloških agenasa da moduliraju CD47-zavisnu regulaciju fagocitoze.
[0145] Ćelije ovde opisanih ne-humanih životinja mogu se koristiti u ispitivanjima rasta tumorskih ćelija (ili proliferacije) da bi se odredio terapijski potencijal jedinjenja ili bioloških agenasa da moduliraju CD47-zavisnu regulaciju i/ili apoptozu tumorskih ćelija.
[0146] Inflamatorna bolest ili stanje se može indukovati kod jedne ili više ovde opisanih nehumanih životinja u cilju obezbeđivanja in vivo sistema za određivanje terapijskog potencijala jedinjenja ili bioloških agenasa da moduliraju CD47-zavisnu regulaciju jedne ili više funkcija inflamatorne bolesti ili stanja. Inflamatorna bolest ili stanje mogu biti povezani sa neoplazmom.
[0147] Anti-angiogeno stanje može biti indukovano kod jedne ili više ovde opisanih nehumanih životinja da bi se obezbedio in vivo sistem za određivanje terapijskog potencijala jedinjenja ili bioloških agenasa da moduliraju CD47-zavisnu regulaciju jedne ili više funkcija anti-angiogenog stanja. Primeri funkcija koje se mogu proceniti da bi se odredila terapijska efikasnost uključuju ekspresiju hemokina, azot oksid (NO)-stimulisane odgovore i ponovno uspostavljanje krvotoka.
[0148] Ovde opisane ne-humane životinje mogu obezbediti in vivo sistem za analizu i testiranje leka ili vakcine. Kandidat za lek ili vakcinu može biti primenjen na jednoj ili više ovde opisanih ne-humanih životinja, praćeno posmatranjem ne-humanih životinja u cilju određivanja jednog ili više imunih odgovora na lek ili vakcinu, bezbednosnog profila leka ili vakcine, ili efekta na bolest ili stanje. Primeri postupaka koji se koriste za određivanje profila bezbednosti uključuju merenje toksičnosti, optimalnu koncentraciju doze, efikasnost leka ili vakcine i moguće faktore rizika. Takvi lekovi ili vakcine se mogu poboljšati i/ili razviti kod takvih nehumanih životinja.
[0149] Ovde opisane ne-humane životinje mogu da obezbede in vivo sistem za procenu farmakokinetičkih svojstava CD47-ciljajućeg leka. CD47-ciljajući lek može biti isporučen ili dat jednoj ili više ne-humanih životinja koje su ovde opisane, nakon čega sledi praćenje nehumanih životinja ili sprovođenje jednog ili više ispitivanja nad ne-humanim životinjama (ili ćelijama koje su izolovane iz njih) u cilju određivanja efekta leka na ne-humanu životinju. Farmakokinetička svojstva uključuju, ali nisu ograničena na to kako životinja prerađuje lek u različite metabolite (ili detekciju prisustva ili odsustva jednog ili više metabolita leka, uključujući toksične metabolite), poluživot leka, nivoe leka u krvi nakon primene (npr. serumsku koncentraciju leka), anti-lekoviti odgovor (npr. anti-lekovita antitela), apsorpciju i distribuciju leka, put primene, puteve izlučivanja i/ili klirens leka. Farmakokinetička i farmakodinamička svojstva lekova (npr. CD47 modulatori) mogu se pratiti u ili kroz upotrebu ovde opisanih nehumanih životinja.
[0150] Ovde opisane ne-humane životinje mogu da obezbede in vivo sistem za procenu toksičnosti CD47-ciljajućeg leka na ciljnom mestu. CD47-ciljajući lek može biti isporučen ili dat jednoj ili više ne-humanih životinja koje su ovde opisane, nakon čega sledi praćenje nehumanih životinja ili sprovođenje jednog ili više ispitivanja nad ne-humanim životinjama (ili ćelijama koje su izolovane iz njih) u cilju određivanja toksičnog efekta na ciljnom mestu na nehumanu životinju. Tipično, namena lekova je da moduliraju jednu ili više funkcija njihovih ciljeva. Da navedemo samo jedan primer, namena CD47 modulatora je da modulira CD47-posredovane funkcije (npr. CD47-indukovana apoptoza) tako što intereaguje na neki način sa CD47 molekulom na površini jedne ili više ćelija. Takav modulator može imati negativan efekat koji je preuveličavanje željenog farmakološkog delovanja/željenih farmakoliških delovanja modulatora. Takvi efekti se nazivaju efekti na ciljnom mestu. Primeri efekata na ciljnom mestu uključuju previsoku dozu, hroničnu aktivaciju/inaktivaciju i pravilno dejstvo u pogrešnom tkivu. Efekti na ciljnom mestu CD47-ciljajućeg leka identifikovani u upotrebi ili kroz upotrebu ovde opisanih ne-humanih životinja mogu se koristiti za određivanje ranije nepoznate funkcije(a) CD47.
[0151] Ovde opisane ne-humane životinje mogu da obezbede in vivo sistem za procenu toksičnosti van ciljnog mesta CD47-ciljajućeg leka. CD47-ciljajući lek može biti isporučen ili dat jednoj ili više ne-humanih životinja koje su ovde opisane, nakon čega sledi praćenje nehumanih životinja ili sprovođenje jednog ili više ispitivanja nad ne-humanim životinjama (ili ćelijama koje su izolovane iz njih) u cilju određivanja toksičnog efekta leka na ciljnom mestu na ne-humanu životinju. Efekti van ciljnog mesta se mogu javiti kada lek stupa u interakciju sa neplaniranim ciljem (npr. unakrsna reaktivnost na zajednički epitop). Takve interakcije mogu da se dogode u namenjenom ili nenamenjenom tkivu. Da navedemo samo jedan primer, izomeri leka koji se odnose kao predmet i lik u ogledalu (enantiomeri) mogu dovesti do neželjenih toksičnih efekata. Dalje, lek može neadekvatno da interaguje sa različitim podtipovima receptora i nenamerno ih aktivira. Primeri neželjenih efekata van ciljnog mesta uključuju nepravilnu aktivaciju/inhibiciju pogrešnog cilja bez obzira na tkivo u kome je pronađena netačna meta. Efekti van ciljnog mesta CD47-ciljajućeg leka mogu se odrediti upoređivanjem efekata davanja leka ovde opisanim ne-humanim životinjama sa jednom ili više referentnih ne-humanih životinja.
[0152] Sprovođenje ispitivanja može uključivati određivanje efekta na fenotip (npr. promenu telesne težine) i/ili genotip ne-humane životinje kojoj se daje lek. Sprovođenje ispitivanja može uključivati određivanje varijabilnosti od serije do serije za CD47 modulator (npr. antagonist ili agonist). Sprovođenje ispitivanja može uključivati određivanje razlika između efekata CD47-ciljajućeg leka koji se daje ovde opisanoj ne-humanoj životinji i referentne životinje. Referentne ne-humane životinje mogu imati modifikaciju kao što je ovde opisana, modifikaciju koja je drugačija, kao što je ovde opisano (npr. ona koja ima poremećaj, deleciju CD47 ili na drugi način nefunkcionalni CD47 gen) ili nema modifikacije (tj. ne-humana životinja divljeg tipa).
[0153] Primeri parametara koji se mogu meriti kod ne-humanih životinja (ili u i/ili iz njihovih izolovanih ćelija) za procenu farmakokinetičkih svojstava, toksičnosti na ciljnom mestu i/ili toksičnosti van ciljnog mesta CD47-ciljajućeg leka uključuju, ali nisu ograničeni na: aglutinaciju, autofagiju, deobu ćelija, smrt ćelija, komplementom posredovanu hemolizu, integritet DNK, titar specifičnih antitela na lekove, metabolizam leka, nizove ekspresije gena, nivoe hematokrita, hematuriju, metaboličku aktivnost, mitohondrijsku aktivnost, oksidativni stres, fagocitozu, biosintezu proteina, degradaciju proteina, sekreciju proteina, odgovor na stres, koncentraciju leka u ciljnom tkivu, koncentracija leka van ciljnog tkiva, aktivnost transkripcije i slično. Ovde opisane ne-humane životinje mogu se koristiti za određivanje farmaceutski efikasne doze CD47 modulatora.
[0154] Ovde opisane ne-humane životinje mogu obezbediti poboljšani in vivo sistem za razvoj i karakterizaciju kandidata za terapeutik za upotrebu kod raka. Ovde opisanim ne-humanim životinjama može biti implantiran tumor, nakon čega sledi davanje jednog ili više kandidata za terapeutik. Kandidati za terapeutik mogu uključivati multispecifično antitelo (npr. bi-specifično antitelo) ili koktel antitela; kandidati za terapeutik mogu uključivati kombinovanu terapiju kao što je, na primer, davanje mono-specifičnih antitela doziranih sekvencijalno ili istovremeno. Tumoru se može ostaviti dovoljno vremena da se formira na jednoj ili više lokacija unutar nehumane životinje. Proliferacija, rast, itd. tumorskih ćelija mogu se meriti i pre i posle primene kandidata za terapeutik. Citotoksičnost kandidata za terapeutik se takođe može meriti, po želji, u ne-humanoj životinji.
[0155] Ovde opisane ne-humane životinje mogu da obezbede poboljšani in vivo sistem razjašnjavanja mehanizama interakcije između humanih ćelija kroz adaptivni prenos. Ovde opisane ne-humane životinje mogu se implantirati sa tumorskim ksenograftom, nakon čega sledi druga implantacija tumor-infiltrirajućih limfocita koji se mogu implantirati kod ne-humanih životinja putem adaptivnog transfera, da bi se odredila efikasnost u eradikaciji čvrstih tumora ili drugih maligniteta. Takvi eksperimenti se mogu uraditi pomoću humanih ćelija zbog isključivog prisustva humanog CD47 bez konkurencije sa endogenim CD47 ne-humane životinje. Alternativno, takvi eksperimenti mogu uključivati upotrebu mišjih ćelija iz NOD/SCID ili BRG (BALB/cRag2<-/->IL-2Rɣc<-/->) porekla. Dalje, terapije i farmaceutski preparati za upotrebu u ksenotransplantaciji mogu se poboljšati ili razviti kod takvih ne-humanih životinja.
[0156] Ovde opisane ne-humane životinje mogu obezbediti poboljšani in vivo sistem za održavanje i razvoj humanih hematopoetskih matičnih ćelija putem presađivanja. Ovde opisane ne-humane životinje mogu da obezbede poboljšan razvoj i održavanje humanih matičnih ćelija unutar ne-humane životinje. Povećane populacije diferenciranih humanih B i T ćelija mogu se posmatrati u krvi, koštanoj srži, slezini i timusu ne-humanih životinja. Optimalna homeostaza T i NK ćelija može se posmatrati u ćelijama u krvi, koštanoj srži, slezini i timusu ne-humanih životinja. Ovde opisane ne-humane životinje mogu pokazati povećanje nivoa ili količine crvenih krvnih zrnaca (RBC) u poređenju sa jednom ili više referentnih ne-humanih životinja.
[0157] Ovde opisane ne-humane životinje mogu se koristiti za procenu efikasnosti terapijskog leka koji cilja humane ćelije. Ovde opisana ne-humana životinja može biti transplantirana sa humanim ćelijama, a kandidat za lek koji cilja takve humane ćelije se daje takvoj ne-humanoj životinji. Terapijska efikasnost leka se zatim određuje praćenjem humanih ćelija u ne-humanoj životinji nakon davanja leka. Lekovi koji se mogu testirati na ne-humanim životinjama uključuju mala molekularna jedinjenja, tj. jedinjenja molekulske mase manje od 1500 kD, 1200 kD, 1000 kD, ili 800 daltona, i velika molekularna jedinjenja (kao što su proteini, npr. antitela), koja imaju predviđene terapijske efekte za lečenje humanih oboljenja i stanja tako što ciljaju (npr. vezuju se za i/ili deluju na) humane ćelije.
[0158] Lek je lek protiv raka, a humane ćelije su ćelije raka, koje mogu biti ćelije primarnog karcinoma ili ćelije ćelijskih linija koje su ustanovljene primarnim karcinomom. U ovim slučajevima, ovde opisana ne-humana životinja može biti transplantirana sa humanim ćelijama raka, a lek protiv raka se daje ne-humanoj životinji. Efikasnost leka može se odrediti procenom da li je rast ili metastaza humanih ćelija raka kod ne-humane životinje inhibirana kao rezultat primene leka.
[0159] Antikancerogeni lek može biti molekul antitela koji se vezuje za antigen na humanim ćelijama raka. Antikancerogeni lek može biti bi-specifično antitelo koje se vezuje za antigen na humanim ćelijama raka, i za antigen na drugim humanim ćelijama, na primer, ćelijama humanog imunološkog sistema (ili „humane imunske ćelije”) kao što su B ćelije i T ćelije.
[0160] Ovde opisanoj ne-humanoj životinji mogu biti graftovane humane imunske ćelije ili ćelije koje se diferenciraju u humane imunske ćelije. Takva ne-humana životinja sa graftovanim humanim imunskim ćelijama je transplantirana sa humanim ćelijama raka, i dat joj je lek protiv raka, kao što je bi-specifično antitelo koje se vezuje za antigen na humanim ćelijama raka i za antigen na humanim ćelijama imunološkog sistema (npr. T ćelije). Terapijska efikasnost bispecifičnog antitela može se proceniti na osnovu njegove sposobnosti da inhibira rast ili metastaziranje humanih ćelija raka kod ne-humane životinje. Ovde opisana ne-humana životinja može biti graftovana sa humanim CD34<+>hematopoetskim progenitorskim ćelijama koje dovode do stvaranja humanih imunskih ćelija (uključujući, između ostalih, T ćelije, B ćelije, NK ćelije). Ćelije humanih B ćelijskih limfoma (npr. Raji ćelije) su transplantirane u takvu nehumanu životinju sa graftovanim humanim imunskim ćelijama, kojoj se zatim daje bi-specifično antitelo koje se vezuje za tumorski antigen (npr. antigen na normalnim B ćelijama i određenim malignitetima na B ćelijama kao što je CD20) i za CD3 podjedinicu receptora T ćelija, da bi se testirala sposobnost bi-specifičnog antitela da inhibira rast tumora kod ne-humane životinje.
PRIMERI
[0161] Sledeći primeri su dati tako da se osobama uobičajeno verziranim u struci opiše kako da razviju i koriste postupke i jedinjenja ovog pronalaska, i njihova namena nije da ograniče obim onoga što pronalazači smatraju svojim izumom. Ukoliko nije drugačije naznačeno, temperatura je naznačena u Celzijusima, a pritisak je približan ili jednak atmosferskom.
Primer 1. Humanizacija endogenog gena klastera diferencijacije 47 (CD47).
[0162] Ovaj primer ilustruje primere postupaka humanizovanja endogenog gena koji kodira klaster diferencijacije 47 (CD47) u ne-humanom sisaru kao što je glodar (npr. miš). Postupci opisani u ovom primeru mogu se koristiti za humanizovanje endogenog CD47 gena nehumane životinje korišćenjem bilo koje humane sekvence, ili kombinacije humanih sekvenci (ili fragmenta sekvence) po želji. U ovom primeru, humani CD47 gen koji se pojavljuje u klonu RP11-69A17 veštačkog hromozoma bakterija (BAC) koristi se za humanizaciju endogenog CD47 gena miša.
[0163] Ciljajući vektor za humanizaciju genetskog materijala koji kodira ekstracelularni N-terminalni IgV domen i pet transmembranskih domena endogenog CD47 gena konstruisan je upotrebom VELOCIGENE® tehnologije (videti, npr. SAD patent br. 6,586,251 i Valenzuela i sar. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech.21(6):652-659).
[0164] Ukratko, mišji klon RP23-230L20 (Invitrogen) veštačkog hromozoma bakterija (BAC) je modifikovan tako da izbriše sekvencu koja sadrži egzone 2-7 endogenog CD47 gena i ubaci egzone 2-7 humanog CD47 gena koristeći humani BAC klon RP11-69A17 (Invitrogen), koji kodira aminokiseline 16-292 humanog CD47 polipeptida. Endogena DNK koja sadrži genomsku DNK koja odgovara egzonima 1, 8 i 9 izoforme 2, kao i 5' i 3' netranslatovani regioni (UTR) su zadržani. Analiza sekvence humane CD47 sekvence sadržane u BAC klonu RP11-69A17 potvrdila je sve CD47 egzone i signale za uplitanje. Analiza sekvence je otkrila da je sekvenca odgovarala referentnom genomu i CD47 transkriptima NM_001777.3 i NM_198793.2. Genomska DNK koja odgovara egzonima 2-7 endogenog CD47 gena (~ 30.8 kb) je zamenjena u BAC klonu RP23-230L20 homolognom rekombinacijom u bakterijskim ćelijama da se ubaci fragment DNK koji sadrži 23,9 kb genomske humane DNK koja odgovara egzonima 2-7 humanog CD47 gena iz BAC klona RP11-69A17 i ∼4995 bp koji odgovaraju samobrišućoj neomicinskoj kaseti koja je sa obe strane okružena lokacijama za prepoznavanje rekombinaze (loxP-hUb1-em7-Neo-pA-mPrml-Crei-lokP; videti SAD patente br. 8,697,851, 8,518,392 i 8,354,389). Samobrišuća neomicinska kaseta je dodata na kraj ∼23,9 kb humanog DNK fragmenta koji sadrži egzone 2-7 humanog gena CD47 (Slika 2). Ciljajući vektor je sadržao, od 5' do 3', 5' homolognu granu koja sadrži ∼39 kb mišje genomske DNK iz BAC klona RP23-230L20, ∼29,3 kb humane genomske DNK iz BAC klona RP11-69A17 (sadrži egzone 2-7 humanog CD47 gena), samobrišuću neomicinsku kasetu koja je sa obe strane okružena loxP lokacijama, i ∼988 kb mišje genomske DNK iz BAC klona RP23-230L20. Nakon homologne rekombinacije u bakterijskim ćelijama sa gore opisanim ciljajućim vektorom, stvoren je modifikovani RP23-230L20 BAC klon koji je doveo do humanizovanog CD47 gena koji je sadržao mišji 5'UTR, mišji egzon 1, humane egzone 2-7, mišje egzone 8-9, kao i mišji 3'UTR. Proteinske sekvence od četiri projektovane alternativno upletene izoforme humanizovanog CD47 date su u Tabeli 3, koja ukazuje na dobijene mišje i humane aminokiseline kodirane od strane mišje, odnosno humane DNK.
[0165] Modifikovani BAC klon, opisan gore, korišćen je za elektroporaciju F1H4 (50% 129/S6/SvEv/Tac, 50% C57BL/6NTac; Auerbach, W. i sar. (2000) Biotechniques 29(5):1024-8, 1030, 1032) matičnih embrionalnih ćelija miša (ES) za stvaranje modifikovanih ES ćelija koje sadrže endogeni CD47 gen koji je humanizovan iz egzona 2-7. Pozitivno ciljane ES ćelije koje sadrže humanizovani CD47 gen identifikovane su ispitivanjem (Valenzuela i sar, ssupra) koje su detektovale prisustvo humanih CD47 sekvenci (npr. egzoni 2-7) i potvrdile gubitak i/ili zadržavanje mišjih CD47 sekvenci (npr. egzoni 1, 8 i 9 i/ili egzoni 2-7). Tabela 4 prikazuje prajmere i probe koje su korišćene za potvrđivanje humanizacije endogenog CD47 gena kao što je opisan gore (Slika 3). Nukleotidna sekvenca preko tačke uzvodnog umetanja uključivala je sledeće, što ukazuje na endogenu mišju sekvencu uzvodno od tačke ubacivanja (koja je sadržana u zagradi ispod sa AsiSI restrikcionim mestom u kurzivu) vezanu tako da imaju zajedničku granivu za humanu CD47 sekvencu prisutnu na tački ubacivanja: (GCAGACATGA TTACTTCAGA GCTTTCAAAG CTAGATACTG TACCTTGCAT ATTCCAACAC) GCGATCGC ATTTTAAGAT TTTCCATCCT AGTGGAAAGA TATGATTTGA TTCATCCTAT TTACTTTGTA TATTAAAGTA CAGTAGAACC TGCCACTTTT (SEK ID BR: 33). Nukleotidna sekvenca preko nizvodne tačke ubacivanja na 5' kraju samobrišuće neomicinske kasete uključivala je sledeće, što ukazuje na humanu CD47 genomsku sekvencu koja je susedna kasetnoj sekvenci nishodno od tačke ubacivanja (sadržana u zagradi ispod sa loxP sekvencom u kurzivu): GGATCCATTT TAAGTAATAG AATAGGATTT TTAATTGTTC CAGTGTTTCT GTGATAGAGC TGTCCTGCAC AGACCTGTTT (CTCGAGATAA CTTCGTATAA TGTATGCTAT ACGAAGTTAT ATGCATGGCC TCCGCGCCGG GTTTTGGCGC CTCCCGCGGG) (SEK ID BR: 34). Nukleotidna sekvenca preko nishodne tačke ubacivanja na 3' kraju neomicinske kasete uključivala je sledeće, što ukazuje na sekvencu kasete koja se graniči sa genomskom sekvencom miša 3' egzona 7 endogenog CD47 gena (sadržana u zagradi ispod sa loxP sekvencom u kurzivu): CATGTCTGGA ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTATGCTAGT AACTATAACG GTCCTAAGGT AGCGACTAGC (ATTAGTATGG AAGGTCCGTC CACTGTCCAG GTTCCTCTTG CGGAGCTCTT TGTCTCTCTG GACTCTGTAT ACACTGCTTG) (SEK ID BR: 35). Nukleotidna sekvenca preko nishodne tačke ubacivanja nakon brisanja neomicinske kasete (preostalo 76 bp) uključivala je sledeće, što ukazuje na humanu i mišju genomsku sekvencu u jukstapoziciji u odnosu na preostalu loxP sekvencu kasetne sekvence (sadržane u zagradi ispod sa loxP sekvencom u kurzivu): GGATCCATTT TAAGTAATAG AATAGGATTT TTAATTGTTC CAGTGTTTCT GTGATAGAGC TGTCCTGCAC AGACCTGTTT (CTCGAGATAA CTTCGTATAA TGTATGCTAT ACGAAGTTAT GCTAGTAACT ATAACGGTCC TAAGGTAGCG ACTAGC)ATT AGTATGGAAG GTCCGTCCAC TGTCCAGGTT CCTCTTGCGG AGCTCTTTGT CTCTCTGGAC TCTGTATACA CTGCTTGCAT (SEK ID BR: 36).
[0166] Pozitivni klonovi ES ćelija su zatim korišćeni za implantiranje ženki miševa pomoću VELOCIMOUSE® postupka (videti npr. SAD patent br. 7,294,754 i Poueymirou i sar, F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, 2007, Nature Biotech. 25(1):91-99) da bi se generisalo leglo mladunaca koje sadrži ubacivanje egzona 2-7 humanog CD47 gena u endogeni CD47 gen miša. Miševi koji su nosili humanizaciju egzona 2-7 endogenog CD47 gena ponovo su potvrđeni i identifikovani genotipizacijom DNK izolovane iz repova korišćenjem modifikacije ispitivanja alela (Valenzuela i sar, supra) koje je detektovalo prisustvo sekvenci humanog CD47 gena. Mladunci su genotipizovani i grupe životinja koje su heterozigotne za humanizovani CD47 genski konstrukt su odabrane za karakterizaciju.
TABELA 4
Primer 2. Ekspresija humanizovanog CD47 polipeptida od strane crvenih krvnih zrnaca miša.
[0167] Ovaj primer pokazuje da ne-humane životinje (npr. glodari) modifikovane tako da sadrže humanizovani CD47 gen u skladu sa Primerom 1 mogu da se koriste za skrining CD47 modulatora (npr. anti-CD47 antitela) i za određivanje različitih karakteristika kao što su, na primer, farmakokinetika i bezbednosni profili. U ovom Primeru, urađen je skrining nekoliko anti-CD47 antitela na mišjim crvenim krvnim zrncima (RBC) izolovanim iz glodara dobijenih u skladu sa Primerom 1, koji glodari eksprimuju humanizovani CD47 polipeptid kao što je ovde opisan.
[0168] Ukratko, 2 ml cele krvi iz humanizovanih CD47 miševa (n=2) je prebačeno u epruvetu zapremine 15 ml i centrifugirano na 200xg tokom 10 minuta na 4°C. Plazma i sloj belih krvnih zrnaca u ugrušku su aspirirani, a zatim je dodato 15 ml PBS rastvora i ćelije su lagano promešane. Mešavina je ponovo centrifugirana na 200xg tokom 5 minuta na 4°C. Supernatant je aspiriran i ćelije su isprane još dva puta. Granulisani eritrociti su resuspendovani do konačne zapremine u 10 ml PBS rastvora. Resuspendovana crvena krvna zrnca (RBC) su centrifugirana poslednji put na 200xg tokom 10 minuta na 4°C. Zapremina pakovanih eritrocita procenjena je na 0,5 ml i razblažena do koncentracije od 0,5% sa PBS rastvorom (0,5 ml pakovanih RBC/100 ml PBS). Stvarna koncentracija RBC određena je pomoću instrumenta Cellometer Auto T4 (1.5x107/ml; Nekcelom Bioscience).
[0169] Osamdeset (80) µl 0,5% mišjih eritrocita (RBC) je dodato u svaki otvor na mikrotitar ploči sa 96 otvora sa V-dnom. Anti-CD47 antitela su dodata u svaki otvor (20 µl na 33 µM). Ploča je blago nakrenuta da se promeša i inkubirana je na ledu tokom 30 minuta. Ploča je zatim isprana dva puta puferom za bojenje (PBS sa 2% FBS). Sekundarno antitelo Fab-488 (Alexa Fluor 488-konjugovani AffiniPure mišji anti-humani IgG, F(ab')2specifičan fragment, Jackson Immuno Research) je dodato u svaki otvor u koncentraciji od 10 µg/ml. Ploča je ponovo inkubirana na ledu 30 minuta, a zatim je jednom isprana puferom za bojenje. Ćelije u svakom otvoru su resuspendovane u 200 µL pufera za bojenje i filtrirane kroz filter-ploču sa 96 otvora. Ćelije u ploči su analizirane pomoću BD ACCURI™ C6 sistema (BD Biosciences). Primeri rezultata prikazani su na Slici 4. Srednja vrednost intenziteta fluorescencije (MFI) iznad kontrole izotipa za svako testirano antitelo prikazana je u Tabeli 5.
TABELA 5
[0170] Kao što je prikazano na Slici 4, sva anti-CD47 antitela su vezana za eritrocite (RBC) iz humanizovanih CD47 miševa. Sve u svemu, ovaj Primer pokazuje da (1) ne-humane životinje (npr. glodari) konstruisane tako da sadrže humanizovani CD47 gen kao što je ovde opisan, eksprimuju humanizovani CD47 polipeptid na površini ćelija (npr. eritrocita) ne-humane životinje i (2) su takve ćelije korisne za skrining CD47 modulatora (npr. CD47 antitela) i određivanje farmakokinetičkih profila takvih modulatora.
Primer 3. Hemaglutinacija crvenih krvnih zrnaca miša koja eksprimuju humanizovani CD47 polipeptid.
[0171] Ovaj primer dalje pokazuje da ne-humane životinje (npr. glodari) modifikovane da sadrže humanizovani CD47 gen u skladu sa Primerom 1 mogu da se koriste u različitim ispitivanjima (npr. hemaglutinacioni test) za skeniranje CD47 modulatora (npr. anti-CD47 antitela) i za određivanje različitih karakteristika kao što su, na primer, farmakokinetika i bezbednosni profili. U ovom Primeru, urađen je skrining nekoliko anti-CD47 antitela na mišjim crvenim krvnim zrncima (RBC) koja eksprimuju humanizovani CD47 polipeptid kako je ovde opisan da bi se odredila koncentracija antitela koja podstiče hemaglutinaciju.
[0172] Ukratko, eritrociti (RBC) iz miševa divljeg tipa i humanizovanih CD47 miševa (n = 2) pripremljeni su kao što je opisano u Primeru 2. Dvadeset (20) µl anti-CD47 antitela (u 5-strukom serijskom razblaženju) je dodato u otvore 1-12 mikrotitar ploče sa 96 otvora i V-dnom, nakon čega je dodato 80 µl 0,5% mišjih RBC u sve otvore na ploči. Ploča je blago nakrenuta da se promeša i inkubirana je na sobnoj temperaturi (24-27°C) tokom 30 minuta. Krajnja tačka aglutinacije je posmatrana vizuelno (tj. RBC se slegnu na dno u negativnim uzorcima, dok se RBC aglutiniraju u pozitivnim uzorcima). Primeri rezultata su prikazani na Slici 5, sa kućicama koje označavaju otvore koji pokazuju hemaglutinaciju.
[0173] Kao što je prikazano na Slici 5, samo lektin je izazvao aglutinaciju kod miševa divljeg tipa. Međutim, dva anti-CD47 antitela (Ab E i Ab C) pored lektina su izazvala aglutinaciju u RBC iz dva humanizovana CD47 glodara dobijena prema Primeru 1. Koncentracija pri kojoj su ova dva antitela izazvala aglutinaciju počela je od 11 nM. Sve u svemu, ovaj Primer pokazuje da ne-humane životinje (npr. glodari) konstruisane tako da sadrže humanizovani CD47 gen kao što je ovde opisan, mogu da se koriste za procenu jedne ili više svojstava (npr. hemaglutinacija) CD47 modulatora (npr. CD47 antitela).
Primer 4. Farmakokinetički klirens CD47 modulatora kod humanizovanih CD47 glodara.
[0174] Ovaj primer ilustruje postupak procene farmakokinetičkog klirensa CD47 modulatora (npr. anti-CD47 antitela) kod ne-humanih životinja (npr. glodara) modifikovanih tako da sadrže humanizovani CD47 gen u skladu sa Primerom 1. U ovom primeru, glodarima divljeg tipa i humanizovanim CD47 glodarima (npr. miševi) data su anti-CD47 antitela, a nivoi antitela u serumu su određeni pomoću ELISA testa.
[0175] Ukratko, miševima divljeg tipa (n=5) ili miševima homozigotnim za humanizovani CD47 (n=5; kao što je gore opisano) su data četiri anti-CD47 antitela (Ab F, Ab G, Ab H i Ab I) i IgG4s izotip kontrolno antitelo (IgG4s). Genetičko poreklo miševa je bila 75% CD57BL/6 i 25% 129Sv. Svako antitelo je testirano kod pet glodara sa humanizovanim CD47. Sva antitela su davana supkutano u dozi od 50 mg/kg. Jedan uzorak krvi pre injektovanja je sakupljen jedan dan pre davanja antitela (dan 0). Uzorci krvi posle injektovanja su sakupljeni nakon 6 sati, 1 dana, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 7 dana, 10 dana i 14 dana. Serumske frakcije iz uzoraka krvi su odvojene i podvrgnute analizi ukupnog humanog antitela primenom ELISA imuno-testa.
[0176] Ukratko, kozje anti-humano IgG poliklonalno antitelo (Jackson ImmunoResearch) je naneseno na mikrotitar ploče sa 96 otvora da bi se detektovala testirana humana antitela u serumu, a zatim su antitela vezana za ploču detektovana korišćenjem kozjeg antihumanog IgG poliklonalnog antitela konjugovanog sa peroksidazom rena (Jackson ImmunoResearch) i TMB supstratom (BD Pharmingen). Uzorci seruma su bili u 6-doznim serijskim razblaženjima, a referentni standardi odgovarajućih antitela u 12-doznim serijskim razblaženjima. Koncentracije antitela leka u serumu su izračunate na osnovu referentne standardne krive dobijene korišćenjem softvera Graphpad Prism. Primeri rezultata prikazani su na Slici 6 i Tabeli 6.
[0177] Podaci su pokazali da su antitela koja su data miševima divljeg tipa i humanizovanim miševima, kao što su ovde opisani, dobro tolerisana. Sve u svemu, ovaj primer pokazuje da se ovde opisane ne-humane životinje mogu koristiti za procenu jednog ili više farmakokinetičkih svojstava leka koji cilja CD47 (npr. anti-CD47 antitelo) kao što su, na primer, nivoi leka u krvi. Pored toga, ovde opisane ne-humane životinje mogu da se koriste za procenu toksičnosti CD47-ciljajućeg leka tako što se određuju negativni efekti nakon njegove primene.
Primer 5. Farmakokinetički profili CD47 modulatora kod glodara koji imaju humanizovani CD47/SIRPα.
[0178] Ovaj primer ilustruje postupak procene farmakokinetičkog klirensa CD47 modulatora (npr. anti-CD47 antitela) kod ne-humanih životinja (npr. glodara) modifikovanih tako da sadrže humanizovane CD47 (prema Primeru 1) i SIRPα gene. Konkretno, ovde opisani humanizovani CD47 glodari modifikovani su da dalje sadrže humanizovani SIRPα gen koji sadrži endogeni deo i humani deo, čiji humani deo kodira ekstracelularni domen humanog SIRPα proteina (npr. aminokiseline 28-362 humanog SIRPα proteina), a čiji endogeni deo kodira intracelularni domen endogenog SIRPα proteina (npr. aminokiseline koje kodiraju transmembranski i intracelularni deo mišjeg SIRPα proteina) kao što je opisano u PCT/US14/56910, podnesenoj 23. septembra 2014. Dvostruko humanizovani CD47/SIRPα miševi su dobijeni ukrštanjem humanizovanih SIRPα miševa sa humanizovanim CD47 miševima. U ovom Primeru, dvostruko humanizovanim CD47/SIRPa glodarima (npr. miševi) su davana različita anti-CD47 antitela i određeni su njihovi odgovarajući farmakokinetički profili.
[0179] Ukratko, grupama miševa divljeg tipa (n=5) i miševa homozigotnim za humanizovani CD47 i SIRPα gen (CD47<hu/hu>SIRPα<hu/hu>; n=5 po grupi) data su izabrana anti-CD47 antitela i IgG4 izotip kontrolno antitelo (hIgG4s). Genetičko poreklo miševa je bila 75% CD57BL/6 i 25% 129Sv. Sva antitela su data u jednoj supkutanoj dozi od 50 mg/kg. Jedan uzorak krvi je sakupljen jedan dan pre primene antitela (dan 0). Uzorci krvi nakon injektovanja sakupljeni su nakon 6 sati, 1 dana, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 7 dana i 10 dana. Serumske frakcije iz uzorka krvi su odvojene i podvrgnute analizi ukupnog humanog antitela primenom ELISA imuno-testa (opisanog gore). Pored toga, nivoi hematokrita su mereni nakon 6 sati, 1 dana, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 7 dana i 10 dana, a test urina je rađen po potrebi (nakon 6 sati i kada je boja urina odstupala od žute boje) bi se odredilo broj crvenih krvnih zrnaca. Primeri rezultata su prikazani na Slikama 7-9.
[0180] Kao što je prikazano na slikama 7 i 8, sva anti-CD47 antitela su pokazala ciljemposredovani klirens kod CD47<hu/hu>-SIRPα<hu/hu>miševa i, posebno, mnogi su pokazali slične farmakokinetičke profile. Dalje, monovalentna verzija jednog anti-CD47 antitela (Ab F) pokazala je veću bioraspoloživost od njenog bivalentnog ekvivalenta (Slika 8). Pronalazači su primetili slične farmakokinetičke profile za antitela među višestrukim eksperimentima sa humanizovanim CD47 i duplo humanizovanim životinjama (tj. CD47<hu/hu>SIRPα<hu/hu>miševima).
[0181] Ab J je imalo manje uticaja na nivoe hematokrita od drugih testiranih anti-CD47 antitela (Ab F, Ab G, Ab I, itd.) i uporedive promene u nivoima hematokrita za kontrolu (hIgG4s) kod CD47<hu/hu>SIRPα<hu/hu>miševa. Merenja hematokrita od 2. do 4. dana pokazala su najveći pad u odnosu na normalni opseg (∼38,5-45,1%), koji je uključivao grupe koje su primale Abs F, G i I. Posebno, monovalentna forma Ab F pokazala je odloženi snižavajući efekat na hematokrit u poređenju sa drugim testiranim antitelima. Pronalazači su zaključili da se razlike u nivoima hematokrita među različitim tretiranim grupama mogu pripisati razlici u epitopu prepoznatoj od različita antitela. Takođe, miševi kojima su davane doze izabranih anti-CD47 antitela imali su pozitivne rezultate na testovima urina nakon 6 sati. Na primer, tretirane grupe Ab J i Ab F imale su po jednog miša pozitivnog na hem 1. dana, dok su sve druge vremenske tačke bile negativne. Nije bilo značajnog gubitka telesne težine (>20%) u bilo kojoj tretiranoj grupi.
[0182] Sve u svemu, ovaj Primer pokazuje da ovde opisane ne-humane životinje obezbeđuju in vivo sistem za procenu farmakokinetičkih svojstava i/ili profila jednog ili više lekova koji ciljaju CD47 (npr. jedno ili više anti-CD47 antitela) kao što su, na primer, nivoi leka u krvi. Zatim, ne-humane životinje, kao što su ovde opisane, konstruisane da dalje sadrže druge humanizovane gene (npr. humanizovani SIRPα) mogu da se koriste za procenu ciljemposredovanog klirensa jednog ili više lekova koji ciljaju CD47.
EKVIVALENTI
[0183] Pošto je opisano nekoliko aspekata najmanje jedne realizacije ovog pronalaska, lica koja su verzirana u ovoj struci će razumeti da su moguće različite promene, modifikacije i poboljšanja. Takve promene, modifikacije i poboljšanja treba da budu deo ovog otkrića. Prema tome, gore navedeni opis i crtež služe samo kao primer, a pronalazak je detaljno opisan zahtevima koji slede u nastavku.
[0184] Upotreba termina u vidu rednih brojeva kao što su „prvi”, „drugi”, „treći”, itd. u zahtevima za modifikovanje elementa zahteva ne označava nikakav prioritet, prednost ili redosled jednog elementa zahteva u odnosu na drugi ili vremenski poredak u kojem se izvode koraci postupka, već se koriste samo kao oznake da bi se razlikovao jedan element zahteva koji ima određeno ime od drugog elementa koji ima isto ime da bi se razlikovali elementi zahteva.
[0185] Upotreba termina „jedan” i „neki”, kako se ovde koriste u specifikaciji i patentnim zahtevima, osim ako je jasno naznačeno suprotno, treba da se shvate da uključuju reference za množinu. Zahtevi ili opisi koji uključuju „ili” između jednog ili više članova grupe smatraju se ispunjenim ako je jedan, više od jednog, ili svi članovi grupe prisutni, upotrebljeni u, ili na drugi način relevantni za dati proizvod ili proces, osim ako nije naznačeno suprotno ili na drugi način vidljivo iz konteksta. Ovaj pronalazak obuhvata realizacije u kojima je tačno jedan član grupe prisutan u, upotrebljen u ili na drugi način relevantan za dati proizvod ili proces. Pronalazak takođe obuhvata realizacije u kojima je prisutno više od jednog člana, ili su svi članovi grupe prisutni u, ili na drugi način relevantni za dati proizvod ili proces. Dalje, treba razumeti da pronalazak obuhvata sve varijacije, kombinacije i permutacije u kojima se jedno ili više ograničenja, elemenata, klauzula, opisnih termina, itd, iz jednog ili više od navedenih patentnih zahteva uvode u drugi zahtev koji zavisi od istog osnovnog zahteva (ili, ako je relevantno, bilo kog drugog patentnog zahteva) osim ako nije drugačije naznačeno ili ako je očigledno za prosečnog stručnjaka da se javlja kontradikcija ili nekonzistentnost. Tamo gde su elementi predstavljeni kao liste (npr. u Markush grupi ili sličnom formatu), podrazumeva se da je svaka podgrupa elemenata takođe otkrivena, i svaki element(i) može biti uklonjen iz grupe. Treba imati na umu da se, generalno, kada se navodi da pronalazak ili aspekti ovog pronalaska obuhvactaju određene elemente, karakteristike, itd, određene realizacije pronalaska ili aspekata pronalaska, sastoje, ili se u suštini sastoje od takvih elemenata, karakteristika, itd. U svrhu jednostavnosti, ove realizacije nisu bile izričito navedene u svakom od slučajeva sa tako mnogo reči. Takođe treba razumeti da bilo koja realizacija ili aspekt pronalaska može biti eksplicitno isključen iz patentnih zahteva, bez obzira da li je specifično isključivanje navedeno u specifikaciji.
[0186] Stručnjaci u ovoj oblasti će uvideti tipične standarde odstupanja ili greške koji se mogu pripisati vrednostima dobijenim u analizama ili drugim ovde opisanim procesima.

Claims (12)

Patentni zahtevi
1. Glodar čiji genom sadrži humanizovani CD47 gen, naznačen time što humanizovani CD47 gen sadrži egzon 1 endogenog CD47 gena glodara, egzone 2-7 humanog CD47 gena, i egzone nishodno od egzona 7 endogenog CD47 gena glodara, i što je humanizovani CD47 gen operabilno vezan za endogeni CD47 promotor glodara.
2. Glodar iz zahteva 1, naznačen time što glodar dalje sadrži SIRPα gen koji kodira SIRPα polipeptid koji sadrži ekstracelularni domen humanog SIRPα polipeptida i intracelularni domen endogenog SIRPα polipeptida glodara, i što SIRPα polipeptid interaguje sa CD47, i opcionalno SIRPα gen sadrži egzone 1, 5, 6, 7 i 8 endogenog SIRPα gena glodara i egzone 2-4 humanog SIRPα gena.
3. Glodar iz zahteva 1 ili zahteva 2, naznačen time što je glodar pacov ili miš.
4. Izolovana ćelija ili tkivo glodara čiji genom sadrži humanizovani CD47 gen, naznačen time što humanizovani CD47 gen sadrži egzon 1 endogenog CD47 gena glodara, egzone 2-7 humanog CD47 gena i egzone nishodno od egzona 7 endogenog CD47 gena glodara, i što je humanizovani CD47 gen operabilno vezan za endogeni CD47 promotor glodara, a opcionalno, ćelija ili tkivo glodara je ćelija miša ili tkivo miša, ili ćelija pacova ili tkivo pacova.
5. Ćelija glodara iz zahteva 4, naznačeno time što je pomenuta ćelija embrionalna matična ćelija glodara, a opcionalno, embrionalna matična ćelija glodara je embrionalna matična ćelija miša ili embrionalna matična ćelija pacova.
6. Embrion glodara koji je generisan iz embrionalne matične ćelije iz zahteva 5.
7. Postupak obezbeđivanja glodara čiji genom sadrži CD47 gen koji kodira ekstracelularni deo humanog CD47 polipeptida vezanog za intracelularni deo endogenog CD47 polipeptida, postupak koji obuhvata modifikovanje genoma glodara tako da sadrži humanizovani CD47 gen, naznačen time što humanizovani CD47 gen sadrži egzon 1 endogenog CD47 gena glodara, egzone 2-7 humanog CD47 gena, i egzone nishodno od egzona 7 endogenog CD47 gena glodara, i što je humanizovani CD47 gen operabilno vezan za endogeni CD47 promotor glodara, čime se obezbeđuje pomenuti glodar.
8. Postupak dobijanja glodara koji eksprimuje CD47 polipeptid iz endogenog CD47 lokusa, pri čemu CD47 polipeptid sadrži humanu sekvencu, a postupak obuhvata:
(a) ubacivanje genomskog fragmenta u endogeni CD47 lokus glodara u embrionalnoj matičnoj ćeliji glodara, pri čemu navedeni genomski fragment sadrži egzone 2-7 humanog CD47 gena, i na taj način formira humanizovani CD47 gen na endogenom CD47 lokusu glodara;
(b) dobijanje embrionalne matične ćelije glodara koja sadrži humanizovani CD47 gen iz a); i
(c) stvaranje glodara pomoću embrionalne matične ćelije iz (b).
9. Postupak iz zahteva 7 ili zahteva 8, naznačen time što je glodar miš ili pacov.
10. Postupak za procenu graftovanja humanih ćelija, naznačen time što navedeni postupak obuhvata procenu graftovanja humanih ćelija kod glodara prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, i što su opcionalno, humane ćelije hematopoetske matične ćelije.
11. Postupak za procenu terapijske efikasnosti leka koji cilja humane ćelije, postupak koji obuhvata:
davanje kandidata za lek glodaru prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3 u koga su transplantirane jedna ili više humanih ćelija; i
praćenje humanih ćelija u glodaru u cilju određivanja terapijske efikasnosti kandidata za lek.
12. Postupak za procenu da li kandidat za modulator humanog CD47 proteina indukuje aglutinaciju crvenih krvnih zrnaca, pri čemu navedeni postupak obuhvata inkubiranje crvenih krvnih zrnaca selektovanih iz glodara iz bilo kog od patentnih zahteva 1-3 u prisustvu kandidatnog modulatora; i procenu da li kandidatni modulator indukuje aglutinaciju crvenih krvnih zrnaca.
RS20190370A 2014-12-05 2015-11-25 Ne-humane životinje koje imaju humanizovani gen klastera diferencijacije 47 RS58536B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462087992P 2014-12-05 2014-12-05
EP15813960.0A EP3086637B1 (en) 2014-12-05 2015-11-25 Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 47 gene
PCT/US2015/062614 WO2016089692A1 (en) 2014-12-05 2015-11-25 Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 47 gene

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS58536B1 true RS58536B1 (sr) 2019-04-30

Family

ID=54979926

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190370A RS58536B1 (sr) 2014-12-05 2015-11-25 Ne-humane životinje koje imaju humanizovani gen klastera diferencijacije 47
RS20210547A RS61774B1 (sr) 2014-12-05 2015-11-25 Ne-humane životinje koje imaju humanizovani gen klastera diferencijacije 47
RS20231251A RS64989B1 (sr) 2014-12-05 2015-11-25 Životinje koje nisu čovek a koje imaju humanizovani klaster diferencijacije 47 gena

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210547A RS61774B1 (sr) 2014-12-05 2015-11-25 Ne-humane životinje koje imaju humanizovani gen klastera diferencijacije 47
RS20231251A RS64989B1 (sr) 2014-12-05 2015-11-25 Životinje koje nisu čovek a koje imaju humanizovani klaster diferencijacije 47 gena

Country Status (29)

Country Link
US (5) US20160345549A1 (sr)
EP (4) EP4296278A3 (sr)
JP (2) JP6730277B2 (sr)
KR (3) KR102617691B1 (sr)
CN (2) CN112342197B (sr)
AR (1) AR102888A1 (sr)
AU (2) AU2015355328B2 (sr)
BR (1) BR112017010490A2 (sr)
CA (1) CA2967834C (sr)
CY (2) CY1121547T1 (sr)
DK (3) DK3466255T3 (sr)
ES (3) ES2969389T3 (sr)
FI (1) FI3850946T3 (sr)
HR (3) HRP20231707T1 (sr)
HU (3) HUE054661T2 (sr)
IL (2) IL286403B2 (sr)
LT (3) LT3086637T (sr)
MX (1) MX2017007293A (sr)
NZ (2) NZ769992A (sr)
PL (3) PL3850946T3 (sr)
PT (3) PT3086637T (sr)
RS (3) RS58536B1 (sr)
RU (1) RU2728412C2 (sr)
SG (2) SG10202103050YA (sr)
SI (3) SI3466255T1 (sr)
SM (3) SMT202300482T1 (sr)
TR (1) TR201903891T4 (sr)
TW (1) TWI681053B (sr)
WO (1) WO2016089692A1 (sr)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2728412C2 (ru) 2014-12-05 2020-07-29 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Животные, отличные от человека, имеющие гуманизированный ген кластера дифференцировки 47
CN107257624B (zh) 2014-12-09 2021-07-13 瑞泽恩制药公司 具有人源化分化簇274基因的非人动物
WO2016154299A1 (en) * 2015-03-24 2016-09-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Genetic modification of pigs for xenotransplantation
SG10201911257YA (en) 2015-05-29 2020-01-30 Regeneron Pharma Non-human animals having a disruption in a c9orf72 locus
PT3376857T (pt) 2015-11-20 2021-05-27 Regeneron Pharma Animais não humanos com um gene humanizado 3 de ativação de linfócitos
EP3411392B1 (en) 2016-02-04 2021-12-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having an engineered angptl8 gene
DK3422845T3 (da) 2016-02-29 2021-08-30 Regeneron Pharma Gnavere med et humaniseret tmprss-gen
EP3496530B1 (en) * 2016-08-11 2022-03-30 The Jackson Laboratory Methods and compositions relating to improved human red blood cell survival in genetically modified immunodeficient non-human animals
CN107815465B (zh) * 2016-08-31 2021-03-16 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
CN107815468B (zh) * 2016-08-31 2021-03-16 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
US11279948B2 (en) 2016-08-31 2022-03-22 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animal with human or chimeric OX40
WO2018041121A1 (en) 2016-08-31 2018-03-08 Beijing Biocytogen Co., Ltd Genetically modified non-human animal with human or chimeric ctla-4
US10781453B2 (en) * 2016-09-30 2020-09-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a hexanucleotide repeat expansion in a C9ORF72 locus
CN108467873B (zh) 2017-03-17 2020-03-13 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 一种cd132基因缺失的免疫缺陷动物模型的制备方法及应用
WO2018177441A1 (en) * 2017-03-31 2018-10-04 Beijing Biocytogen Co., Ltd GENETICALLY MODIFIED NON-HUMAN ANIMAL WITH HUMAN OR CHIMERIC SIRPα
CN108588126B (zh) 2017-03-31 2020-04-10 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 Cd47基因人源化改造动物模型的制备方法及应用
EP3638258A4 (en) * 2017-06-12 2021-09-08 Sinai Health System ALLOGRAFT TOLERANCE WITHOUT REQUIRING SYSTEMIC IMMUNE SUPPRESSION
CA3071860A1 (en) 2017-08-02 2019-02-07 Phanes Therapeutics, Inc. Anti-cd47 antibodies and uses thereof
JP7361031B2 (ja) 2017-11-30 2023-10-13 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒト化ｔｒｋｂ遺伝子座を含む非ヒト動物
SG11202008620VA (en) 2018-03-26 2020-10-29 Regeneron Pharma Humanized rodents for testing therapeutic agents
JP7634994B2 (ja) 2018-07-16 2025-02-25 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｄｉｔｒａの非ヒト動物モデルおよびその使用
US12331320B2 (en) 2018-10-10 2025-06-17 The Research Foundation For The State University Of New York Genome edited cancer cell vaccines
CN116064550A (zh) 2018-12-20 2023-05-05 瑞泽恩制药公司 核酸酶介导的重复扩增
CN114164177A (zh) * 2019-01-17 2022-03-11 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 人源化转基因动物
CN112430621B (zh) * 2019-08-09 2022-09-27 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 Il2ra基因人源化的非人动物的构建方法及应用
CN112553252B (zh) * 2019-09-06 2022-04-29 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 Tnfr2基因人源化的非人动物的构建方法和应用
US20230058049A1 (en) * 2019-12-31 2023-02-23 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. GENETICALLY MODIFIED IMMUNODEFICIENT NON-HUMAN ANIMAL WITH HUMAN OR CHIMERIC SIRPa/CD47
CN112080522A (zh) * 2020-09-15 2020-12-15 广东药康生物科技有限公司 一种cd47人源化小鼠模型的构建方法
CN112725379B (zh) * 2021-01-27 2024-08-13 上海南方模式生物科技股份有限公司 人源化cd40基因改造动物模型的构建方法及应用
WO2023046061A1 (en) * 2021-09-24 2023-03-30 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animal with human or chimeric trop2
AU2023310163A1 (en) 2022-07-19 2025-01-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified animal model and its use to model the human immune system
WO2025171307A1 (en) 2024-02-08 2025-08-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vectors, genetically modified cells, and genetically modified non-human animals comprising the same

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5670356A (en) 1994-12-12 1997-09-23 Promega Corporation Modified luciferase
US5874304A (en) 1996-01-18 1999-02-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Humanized green fluorescent protein genes and methods
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
CN101133083A (zh) * 2003-11-11 2008-02-27 中外制药株式会社 人源化的抗cd47抗体
AU2005295269B2 (en) 2004-10-19 2010-05-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method for generating an animal homozygous for a genetic modification
US20070113297A1 (en) * 2005-09-13 2007-05-17 Yongguang Yang Methods and compositions for inhibition of immune responses
ATE536374T1 (de) * 2006-09-01 2011-12-15 Therapeutic Human Polyclonals Inc Erhöhte expression von humanem oder humanisiertem immunglobulin bei nicht-humanen transgenen tieren
WO2009039244A2 (en) * 2007-09-18 2009-03-26 Genizon Biosciences Inc. Genemap of the human genes associated with crohn's disease
CN101668387A (zh) 2008-09-02 2010-03-10 鸿富锦精密工业（深圳）有限公司 印刷电路板
CN102281758B (zh) * 2009-01-16 2014-12-10 公益财团法人实验动物中央研究所 移植了人肝细胞的小鼠
RU2425880C2 (ru) * 2009-07-30 2011-08-10 Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Способ получения трансгенных мышей
US8354389B2 (en) 2009-08-14 2013-01-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. miRNA-regulated differentiation-dependent self-deleting cassette
CA2771336C (en) * 2009-09-15 2019-11-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Synergistic anti-cd47 therapy for hematologic cancers
DK3056082T3 (en) 2009-10-06 2018-12-17 Regeneron Pharma RE-MODIFIED MICE AND INPUT
EP2675271B1 (en) 2011-02-15 2018-06-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized m-csf mice
WO2013056352A1 (en) * 2011-10-19 2013-04-25 University Health Network Antibodies and antibody fragments targeting sirp-alpha and their use in treating hematologic cancers
PT2770821T (pt) 2011-10-28 2017-12-18 Regeneron Pharma Ratinhos de complexo principal de histocompatibilidade principal modificados geneticamente
PT2818478T (pt) * 2011-10-28 2017-05-12 Regeneron Pharma Il-6 e recetor de il-6 humanizados
PT3272214T (pt) 2011-10-28 2020-03-04 Regeneron Pharma Ratinhos geneticamente modificados que expressam moléculas quiméricas de complexo principal de histocompatibilidade (mhc) ii
EP2644027A1 (en) * 2012-03-26 2013-10-02 Institut Pasteur Transgenic immunodefficient mouse expressing human SIRPalpha.
US8962913B2 (en) 2012-06-18 2015-02-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized IL-7 rodents
AU2013312359B8 (en) 2012-09-07 2019-08-15 Institute For Research In Biomedicine (Irb) Genetically modified non-human animals and methods of use thereof
SG11201502685XA (en) * 2012-11-05 2015-05-28 Regeneron Pharma Genetically modified non-human animals and methods of use thereof
KR20150093770A (ko) * 2012-12-12 2015-08-18 베스쿨럭스 인코포레이티드 치료적 ｃｄ４７ 항체
SI2958938T1 (sl) 2013-02-20 2019-08-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Miši, ki izražajo humanizirane koreceptorje za celice T
US20150342163A1 (en) 2013-02-22 2015-12-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified major histocompatibility complex mice
RS57963B1 (sr) 2013-02-22 2019-01-31 Regeneron Pharma Miševi koji eksprimiraju humanizovani glavni kompleks histokompatibilnosti
SMT201900067T1 (it) 2013-09-23 2019-02-28 Regeneron Pharma Animali non umani aventi un gene di proteina regolatoria del segnale umanizzato
WO2015057758A1 (en) 2013-10-15 2015-04-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized il-15 animals
BR112016011003A2 (pt) 2013-11-19 2017-12-05 Regeneron Pharma animal roedor geneticamente modificado, célula tronco embrionária de camundongo, embrião de camundongo, e, métodos para fabricar um animal roedor e para enxertar células humanas em um camundongo
KR102173297B1 (ko) 2013-11-19 2020-11-03 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화된 증식-유도 리간드 유전자를 가지고 있는 비-인간 동물
JP6652931B2 (ja) 2014-04-08 2020-02-26 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ヒト化Ｆｃγ受容体を有する非ヒト動物
NO2785538T3 (sr) 2014-05-07 2018-08-04
SG10202002187WA (en) 2014-05-19 2020-04-29 Regeneron Pharma Genetically modified non-human animals expressing human epo
US10390522B2 (en) 2014-06-19 2019-08-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized programmed cell death 1 gene
MA50679A (fr) 2014-11-24 2021-03-17 Regeneron Pharma Animaux non humains exprimant un complexe cd3 humanisé
RU2728412C2 (ru) 2014-12-05 2020-07-29 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Животные, отличные от человека, имеющие гуманизированный ген кластера дифференцировки 47

Also Published As

Publication number Publication date
AU2015355328A1 (en) 2017-05-18
CY1121547T1 (el) 2020-05-29
AU2015355328B2 (en) 2022-03-10
DK3850946T5 (da) 2024-08-19
PL3086637T3 (pl) 2019-09-30
WO2016089692A1 (en) 2016-06-09
SI3850946T1 (sl) 2024-02-29
PL3466255T3 (pl) 2021-08-09
EP3086637A1 (en) 2016-11-02
CA2967834A1 (en) 2016-06-09
KR20230038599A (ko) 2023-03-20
LT3850946T (lt) 2024-01-10
RS61774B1 (sr) 2021-05-31
SI3466255T1 (sl) 2021-07-30
RS64989B1 (sr) 2024-01-31
NZ769992A (en) 2024-11-29
US10939673B2 (en) 2021-03-09
IL252019A0 (en) 2017-06-29
JP2020168016A (ja) 2020-10-15
PT3466255T (pt) 2021-05-10
BR112017010490A2 (pt) 2018-04-03
SMT201900178T1 (it) 2019-05-10
LT3466255T (lt) 2021-05-25
CY1124089T1 (el) 2022-05-27
ES2870462T3 (es) 2021-10-27
EP3850946A1 (en) 2021-07-21
ES2716735T3 (es) 2019-06-14
CN107205368B (zh) 2020-11-17
US20240138384A1 (en) 2024-05-02
EP4296278A2 (en) 2023-12-27
PL3850946T3 (pl) 2024-03-11
JP2018500012A (ja) 2018-01-11
RU2017123357A (ru) 2019-01-09
HK1225912A1 (en) 2017-09-22
ES2969389T3 (es) 2024-05-17
KR20210127773A (ko) 2021-10-22
CA2967834C (en) 2024-01-16
EP3086637B1 (en) 2019-01-02
SMT202300482T1 (it) 2024-01-10
EP3466255A1 (en) 2019-04-10
AU2022203787B2 (en) 2025-01-30
KR20170098800A (ko) 2017-08-30
HUE054661T2 (hu) 2021-09-28
HRP20210662T1 (hr) 2021-05-28
US20160157470A1 (en) 2016-06-09
NZ731471A (en) 2021-12-24
TWI681053B (zh) 2020-01-01
HRP20190634T1 (hr) 2019-08-09
IL286403B1 (en) 2023-06-01
HUE064960T2 (hu) 2024-04-28
EP3466255B1 (en) 2021-02-17
IL286403A (en) 2021-10-31
US20160345549A1 (en) 2016-12-01
US12389889B2 (en) 2025-08-19
IL252019B (en) 2021-10-31
PT3850946T (pt) 2024-01-02
HRP20231707T1 (hr) 2024-03-15
RU2728412C2 (ru) 2020-07-29
US11910788B2 (en) 2024-02-27
US10015953B2 (en) 2018-07-10
IL286403B2 (en) 2023-10-01
JP6730277B2 (ja) 2020-07-29
CN107205368A (zh) 2017-09-26
JP7089554B2 (ja) 2022-06-22
AR102888A1 (es) 2017-03-29
CN112342197B (zh) 2025-02-18
KR102313073B1 (ko) 2021-10-18
DK3466255T3 (da) 2021-05-03
SMT202100281T1 (it) 2021-07-12
AU2022203787A1 (en) 2022-06-23
LT3086637T (lt) 2019-04-10
PT3086637T (pt) 2019-03-26
KR102617691B1 (ko) 2023-12-27
DK3086637T3 (en) 2019-04-08
KR102508175B1 (ko) 2023-03-09
US20180249689A1 (en) 2018-09-06
TW201629210A (zh) 2016-08-16
MX2017007293A (es) 2018-03-12
TR201903891T4 (tr) 2019-04-22
EP4296278A3 (en) 2024-03-27
EP3850946B1 (en) 2023-09-27
FI3850946T3 (fi) 2023-12-28
CN112342197A (zh) 2021-02-09
HUE043132T2 (hu) 2019-07-29
RU2017123357A3 (sr) 2019-06-03
SG10202103050YA (en) 2021-05-28
DK3850946T3 (da) 2024-01-08
SG11201703463WA (en) 2017-05-30
US20210161112A1 (en) 2021-06-03
SI3086637T1 (sl) 2019-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12389889B2 (en) Mouse having a humanized cluster of differentiation 47 gene
JP6665269B2 (ja) ヒト化シグナル調節タンパク質遺伝子を有する非ヒト動物
HK40096160A (en) Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 47 gene
HK40054102A (en) Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 47 gene
HK40054102B (en) Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 47 gene
HK40007070B (en) Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 47 gene
HK40007070A (en) Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 47 gene
HK1225912B (en) Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 47 gene