RS58553B1 - Dijagnostika zatajenja srca - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA:

[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na a) postupak za klasifikovanje zatajenja srca kod pacijenta prema NYHA klasifikaciji zatajenja srca, pri čemu pomenuti postupak obuhvata faze merenja koncentracije IGFBP2 u uzorku plazme ili urina dobijenom od pomenutog pacijenta, gde je koncentracija IGFBP2 je u korelaciji sa NYHA klasifikacijom zatajenja srca, i b) postupak za dijagnozu zatajenja srca kod pacijenta, koji obuhvata : i. određivanje koncentracije IGFBP2 u uzorku plazme ili urina dobijenom od pomenutog pacijenta; i ii. poređenje pomenute koncentracije sa nekom kontrolnom vrednošću.

POZADINA PRONALASKA:

[0002] Prevalencija zatajenja srca (HF) je rastuća zbog starenja i faktora kardiovaskularnog rizika u opštoj populaciji [Delahaye, F. et al., 2001]. HF dijagnoza ostaje prečesto komplikovana zbog atipične prezentacije i potrebe specijalizovanom pristupu nezi. Kao pomoć kliničarima da dijagnostikuju zatajenje srca, predloženi su krvni HF biomarkeri, kao što su natriuretski peptidi (NP). Međutim, NP imaju ograničenja što odražava potrebu za specifičnijim i preciznijim biomarkerima koji će omogućiti olakšani HF skrininzi velikih razmera. Dodatno, 30 % pacijenata koji primaju hitnu pomoć za akutnu dispneju imaju koncentraciju moždanih natriuretskih peptida (BNP) u « sivoj zoni » koja ne omogućava dijagnozu. U ovim slučajevima, HF dijagnoza će zahtevati skupa i dugotrajna ispitivanja. Međutim, prepoznato je da brza dijagnoza i rana medicinska nega pacijenta imaju pozitivan uticaj na zdravlje pacijenta i takođe smanjuje troškove lečenja.

[0003] Članak Hassfeld S. et al 2007 opisuje upotrebu IGFBP2 kao biomarkera za prognostiku pacijenata sa dilatiranom kardiomiopatijom koji predstavlja etiološki podskup HF pacijenata i ne opisuje upotrebu IGFBP2 za dijagnostiku zatajenja srca.

SUŠTINA PRONALASKA:

[0004] Pronalazači su pokrenuli prospektivno monocentrično ispitivanje za kontrolu slučaja i ispitivani su urinarni polipeptidi specifični za akutno (AHF) ili hronično zatajenje srca (CHF) sa holističkom analitičkom strategijom upotrebom tehnika kapilarne elektroforeze-masene spektroskopije (CE-MS). Otkrili su da IGFBP2 koncentracija može da se koristi kao biomarker zatajenja srca kao biomarker za klasifikovanje pacijenata sa zatajenjem srca.

[0005] Tako, ovaj pronalazak odnosi se na postupak za klasifikovanje zatajenja srca kod pacijenta prema NYHA klasifikaciji zatajenja srca, pri čemu pomenuti postupak obuhvata faze merenja koncentracije IGFBP2 u uzorku plazme ili urina dobijenom od pomenutog pacijenta, gde je koncentracija IGFBP2 u korelaciji sa NYHA klasifikacijom zatajenja srca.

DETALJAN OPIS PRONALASKA:

Postupak klasifikacije i dijagnostike

[0006] Ovaj pronalazak odnosi se na postupak za klasifikovanje pacijenta sa rizikom od zatajenja srca, pri čemu pomenuti postupak obuhvata merenje koncentracije IGFBP2 u uzorku dobijenom od pomenutog pacijenta.

[0007] U posebnom primeru izvođenja, pomenuti postupak dalje obuhvata faze:

(i) merenja koncentracije IGFBP2 u uzorku dobijenom od pomenutog pacijenta,

(ii) poređenja koncentracije IGFBP2 izmerene u fazi (i) sa graničnom vrednošću dobijenom od koncentracije IGFBP2 u uzorcima od pacijenata koji su u određenim stupnjevima zatajenja srca i/ili sa graničnom vrednošću dobijenom od koncentracije IGFBP2 u uzorcima od zdravih pacijenata.

[0008] Ovaj pronalazak takođe se odnosi na postupak za dijagnozu zatajenja srca kod pacijenta, koji obuhvata faze koje se sastoje od i) određivanja koncentracija IGFBP2 u uzorku dobijenom od pomenutog pacijenta; i ii) poređenja pomenute koncentracije sa nekom kontrolnom vrednošću.

[0009] U posebnom primeru, pacijent ima značajna komorbidna stanja, uključujući hipertenziju, koronarnu bolest srca i dijabetes na primer diabetes mellitus.

[0010] U drugom posebnom primeru, pacijent je na diureticima ili antiagregacijskim agensima.

[0011] U drugom posebnom primeru, pacijent ima više od 50 godina. U drugom posebnom primeru izvođenja, pacijent ima više od 60 godina.

[0012] U jednom primeru izvođenja, zatajenje srca može da bude asimptomatsko zatajenje srca, hronično zatajenje srca ili akutno zatajenje srca.

[0013] Obično, uzorak prema ovom pronalasku može da bude plazma ili urin.

[0014] Kao što se ovde koristi, pojam "IGFBP2" za "vezujući protein 2 za faktore rasta slične insulinu" označava protein koji služi kao noseći protein za faktor rasta 1 sličan insulinu (IGF I) ili faktor rasta 2 sličan insulinu (IGF II). Kao što se ovde koristi, pojam "IGFBP2" označava takođe fragmente IGFBP2. Kao što se ovde koristi, pojam "fragmenti IGFBP2" označava kraće peptide koji nastaju hemijskom ili biohemijskom hidrolizom IGFBP2.

[0015] Tako, u posebnom primeru, opis se odnosi na postupak za klasifikovanje pacijenta sa rizikom od zatajenja srca ili na postupak za dijagnozu zatajenja srca kod pacijenta prema pacijentu određivanjem koncentracije fragmenata IGFBP2.

[0016] Kao što se ovde koristi, izraz "zatajenje srca" označava nesposobnost srca da isporuči dovoljno krvi kako bi se zadovoljile telesne potrebe, a ova patologija je dobro opisana u medicinskoj praksi. Ovaj pojam obuhvata hronično zatajenje srca, akutno zatajenje srca, infarkt miokarda, nestabilnu anginu, dijastolnu disfunkciju, sistolnu disfunkciju i dijabetesnu kardiomiopatiju.

[0017] Kao što se ovde koristi, izraz "hronično zatajenje srca" označava dugotrajnu situaciju, obično sa stabilnom tretiranom simptomatologijom.

[0018] Kao što se ovde koristi, izraz "akutno zatajenje srca" označava iznenadnu pojavu zatajenja srca, kao i akutno "pogoršano" ili "dekompenzovano" zatajenje srca, koje se odnosi na epizode u kojima pacijent sa poznatim hroničnim zatajenjem srca ili bez hroničnog zatajenja srca naglo razvija pogoršavajuće simptome i potrebna mu je hospitalizacija. Uobičajeni simptomi komplikacija zbog akutnog zatajenja srca uključuju, ali bez ograničenja na, dispneju zbog plućne kongestije ili kardiogenog šoka zbog niskog srčanog izlaza, lakog umora (netolerancija na vežbanje), perifernog edema, anasarke (generalizovana pojava masivnih edema), nokturije (često noćno uriniranje), bradikardije, blokade srca, hipotenzije, vrtoglavice, sinkope, dijabetesa, oligurije ili anurije, hipokalemije, bronhospazma, hladnog znoja, i astme.

[0019] Pacijent sa zatajenjem srca klasifikuje se prema međunarodnoj gradaciji, naime funkcionalnoj klasifikaciji od New York Heart Association (NYHA). Funkcionalna klasifikacija zatajenja srca uopšteno se izvodi prema funkcionalnoj klasifikaciji od New York Heart Association (Criteria Committee, New York Heart Association. Diseases of the heart and blood vessels). Nomenklatura i kriterijumi za dijagnozu, 6. izd. Boston: Little, Brown and co, 1964;114). Ova klasifikacija svrstava ozbiljnost zatajenja srca u 4 klase (I-IV).

[0020] Pacijent sa bolešću srca ali koja nije dovela do ograničenja fizičke aktivnosti klasifikuje se kao NYHA klasa I. Uobičajena fizička aktivnost ne izaziva preteran zamor, palpitaciju, dispneju ili anginozni bol. Asimptomatski pacijent klasifikuje se kao NYHA klasa I.

[0021] Pacijent sa bolešću srca koja dovodi do malog ograničenja fizičke aktivnosti klasifikuje se kao NYHA klasa II. Uobičajena fizička aktivnost rezultuje zamorom, palpitacijom, dispnejom ili anginoznim bolom. Oni popuštaju u stanju mirovanja.

[0022] Pacijent sa bolešću srca koja dovodi do izrađenog ograničenja fizičke aktivnosti klasifikuje se kao NYHA klasa III. Manje od uobičajene aktivnosti izaziva zamor, palpitaciju, dispneju ili anginozni bol. Oni popuštaju u stanju mirovanja.

[0023] Pacijent sa bolešću srca koja dovodi do nesposobnosti da se izvodi bilo kakva fizička aktivnost bez teškoća klasifikuje se kao NYHA klasa IV. Simptomi srčane insuficijencije ili anginalnog sindroma mogu biti prisutni čak i u stanju mirovanja. Ako se bilo kakva fizička aktivnost izvodi, teškoća se povećava.

[0024] Prema postupku za klasifikovanje pacijenta sa rizikom od zatajenja srca, koncentracija IGFBP2 pacijenta će biti viša, što je njegovo zatajenje srca ozbiljnije.

[0025] Na primer i prema graničnim vrednostima određenim od strane pronalazača, pacijent sa visokom koncentracijom IGFBP2, na primer većom od 1300 ng/ml u plazmi, klasifikovaće se da ima zatajenje srca klase IV.

[0026] Pojam "detektovanje" ili "određivanje" kao što se gore koristi uključuje kvalitativnu i/ili kvantitativnu detekciju (nivoi merenja) sa ili bez upućivanja na kontrolu. Obično, IGFBP2 koncentracije mogu da se izmere, na primer, tehnikom kapilarne elektroforeze-masene spektroskopije (CE-MS) ili pomoću ELISA izvedene na uzorku.

[0027] Poželjno, ovaj pronalazak odnosi se na postupak za dijagnozu zatajenja srca kod pacijenta, koji obuhvata fazu a) koja se sastoji od merenja IGFBP2 koncentracije u uzorku dobijenom od pomenutog pacijenta. Poželjno, postupak ovog pronalaska dalje obuhvata fazu poređenja koncentracije IGFBP2 dobijene u fazi a) sa graničnim nivoom.

[0028] "Kontrola" može da bude zdrav subjekt, tj. subjekt koji ne boluje od bilo kakvog zatajenja srca. Kontrola može takođe da bude subjekt koji boluje od zatajenja srca. Poželjno, pomenuta kontrola je zdrav subjekt.

[0029] Detekcija IGFBP2 koncentracije u uzorku može takođe da se izvede merenjem nivoa IGFBP2 proteina. U ovoj prijavi, "nivo IGFBP2 proteina" znači količina ili koncentracija pomenutog IGFBP2 proteina. U drugom primeru izvođenja, "nivo IGFBP2" znači nivo IGFBP2 fragmenata.

[0030] Takvi postupci obuhvataju dovođenje u kontakt uzorka sa vezujućim partnerom koji može da selektivno uzajamno deluje sa peptidima IGFBP2 proteina prisutnim u uzorku. Vezujući partner je uopšteno neko antitelo koje može biti poliklonalno ili monoklonalno, poželjno monoklonalno.

[0031] Prisustvo proteina može da se detektuje upotrebom standardnih elektroforetskih i imunodijagnostičkih tehnika, uključujući imunotestove kao što su nadmetanje, direktna reakcija, ili testovi tipa sendviča. Takvi testovi uključuju, ali bez ograničenja na, Western blotove; testove aglutinacije; imunotestove obeležene i posredovane enzimima, kao što su ELISA-e; testove tipa biotin/avidin; radioimunotestove; imunoelektroforezu; imunotaloženje, tehniku kapilarne elektroforezemasene spektroskopije (CE-MS) itd. Reakcije uopšteno uključuju otkrivajuće obeleživače kao što su fluorescentni, hemiluminescentni, radioaktivni, enzimski obeleživači ili obojeni molekuli, ili ostale postupke za detektovanje obrazovanja kompleksa između antigena i antitela ili antitela koja reaguju sa njim.

[0032] Gore pomenuti testovi uopšteno uključuju separaciju nevezanog proteina u tečnoj fazi od nosača čvrste faze za koji su vezani antigen-antitelo kompleksi. Čvrsti nosači koji mogu da se koriste u praksi ovog pronalaska uključuju supstrate kao što su nitroceluloza (npr., u obliku membrane ili mikrotitarske ploče sa bazenčićima); polivinilhlorid (npr., ploče ili mikrotitarske ploče sa bazenčićima); polistiren lateks (npr., perle ili mikrotitarske ploče); polivinilidin fluorid; diazotizovani papir; najlonske membrane; aktivirane perle, magnetno reagujuće perle, i slično.

[0033] Određenije, može da se koristi ELISA postupak, kod kog se bazenčići mikrotitarske ploče oblažu skupom antitela protiv proteina koji se testiraju. Uzorak koji sadrži ili za koji se sumnja da sadrži marker protein zatim se dodaje u obložene bazenčiće. Nakon perioda inkubacije dovoljnog da omogući obrazovanje antitelo-antigen kompleksa, ploča(e) može da se ispere kako bi se uklonili nevezani ostaci i dodaje se detektabilni obeleženi sekundarni vezujući molekul. Sekundarni vezujući molekul može da reaguje sa bilo kojim zarobljenim marker proteinom uzorka, ploča se ispira i prisustvo sekundarnog vezujućeg molekula se detektuje upotrebom postupaka dobro poznatih u tehnici.

[0034] Postupci mogu da obuhvataju fazu koja se sastoji od poređenja koncentracije IGFBP2 proteina i fragmenata u protočnim ćelijama sa kontrolnom vrednošću. Kao što se ovde koristi, "koncentracija IGFBP2" odnosi se na količinu ili koncentraciju proizvoda transkripcije, na primer proteina IGFBP2. Obično, nivo proteina može da se izrazi kao nanogrami po mikrogramu tkiva ili nanogrami po mililitru medijuma za kulturu, na primer. Alternativno, relativne jedinice mogu da se koriste da bi se opisala koncentracija. U posebnom primeru, "koncentracija IGFBP2" može da se odnosi na fragmente IGBP2. Tako, fragmenti IGFBP2 mogu takođe da se mere.

[0035] U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak odnosi se na na postupak za klasifikovanje pacijenta sa rizikom od zatajenja srca, pri čemu pomenuti postupak obuhvata merenje koncentracije IGFBP2 u uzorku dobijenom od pomenutog pacijenta. Kao što je već objašnjeno, koncentracija IGFBP2 pacijenta će biti viša, što je njegovo zatajenje srca ozbiljnije.

[0036] Pronalazači su ustanovili granične vrednosti pomoću kojih može da se klasifikuje pacijent sa zatajenjem srca.

[0037] Kada se merenje IGFBP2 koncentracije izvodi pomoću Elisa postupka u plazmi, pacijent sa nekom koncentracijom IGFBP2 manjom od 600 ng/ml, poželjno manjom od 500 ng/ml, čak poželjno manjom od 400 ng/ml, a najpoželjnije manjom od 300 ng/ml je pokazatelj zatajenja srca stupnja I prema NYHA klasifikaciji zatajenja srca.

[0038] Kada se merenje IGFBP2 koncentracije izvodi pomoću Elisa postupka u plazmi, pacijent sa nekom koncentracijom IGFBP2 obuhvaćenom između oko 600 ng/ml i oko 1100 ng/ml, poželjno između oko 800 ng/ml i oko 1050 ng/ml, poželjno između oko 900 ng/ml i oko 1000 ng/ml, najpoželjnije između oko 925 ng/ml i oko 975 ng/ml je pokazatelj zatajenja srca stupnja II prema NYHA klasifikaciji zatajenja srca.

[0039] Kada se merenje IGFBP2 koncentracije izvodi pomoću Elisa postupka u plazmi, pacijent sa nekom koncentracijom IGFBP2 obuhvaćenom između oko 1100 ng/ml i oko 1300 ng/ml, poželjno između oko 1150 ng/ml i oko 1250 ng/ml, najpoželjnije između oko 1175 ng/ml i oko 1225 ng/ml je pokazatelj zatajenja srca stupnja III prema NYHA klasifikaciji zatajenja srca.

[0040] Kada se merenje IGFBP2 koncentracije izvodi pomoću Elisa postupka izvodi se tehnikom kapilarne elektroforeze-masene spektroskopije (CE-MS) u plazmi, pacijent sa nekom koncentracijom IGFBP2 većom od 1300 ng/ml, poželjno većom od 1350 ng/ml, čak poželjno većom od 1400 ng/ml, najpoželjnije većom od 1450 ng/ml je pokazatelj zatajenja srca stupnja IV prema NYHA klasifikaciji zatajenja srca.

[0041] U drugom primeru izvođenja, ovaj pronalazak odnosi se na postupak za dijagnozu zatajenja srca kod pacijenta, koji obuhvata određivanje koncentracije IGFBP2 u uzorku dobijenom od pomenutog pacijenta i poređenje pomenute koncentracije sa graničnom vrednošću.

[0042] Kada se merenje IGFBP2 proteina izvodi pomoću Elisa postupka, nivo IGFBP2 kod pacijenta koji boluje od zatajenja srca povećan je za najmanje 50%, poželjno za najmanje 70%, poželjno za najmanje 100%; poželjno za najmanje 150%, poželjno za najmanje 200%, poželjno za najmanje 250%, poželjnije za najmanje 300%, čak još za najmanje 400% u poređenju sa kontrolnom referencom. Drugim rečima, poželjno, kada se IGFBP2 protein meri pomoću Elisa postupka , količina IGFBP2 proteina kod pacijenta koji boluje od zatajenja srca povećana je za najmanje 50%, poželjno za najmanje 70%, poželjno za najmanje 100%; poželjno za najmanje 150%, poželjno za najmanje 200%, poželjno za najmanje 250%, poželjnije za najmanje 300%, čak još za najmanje 400% u poređenju sa kontrolnom referencom.

[0043] Koncentracija IGFBP2 u plazmi merena je Elisa tehnikom. Pronalazači su ustanovili neku graničnu vrednost za koncentraciju IGFBP2 kako bi lako dijagnostifikovali zatajenje srca. Poželjno, ova granična vrednost je veća od 150 ng/ml, poželjno veća od 200 ng/ml, čak najpoželjnije veća od 250 ng/ml, najpoželjnije pomenuta granična vrednost je veća od 300 ng/ml.

[0044] Koncentracija IGFBP2 u urinu merena je Elisa tehnikom u urinu. Pronalazači su ustanovili neku graničnu vrednost za koncentraciju IGFBP2 kako bi lako dijagnostifikovali zatajenje srca. Poželjno, ova granična vrednost je veća od 2,5 ng/ml, najpoželjnije pomenuta granična vrednost je veća od 3 ng/ml.

[0045] Obično, "vrednost praga", "granični nivo" ili "granična vrednost" može da se odredi eksperimentalno, empirijski, ili teoretski. Granična vrednost može i proizvoljno da se odabere na osnovu postojećih eksperimentalnih i/ili kliničkih uslova, kao što će biti prepoznato od strane prosečnog stručnjaka u tehnici. Poželjno, prosečan stručnjak u tehnici može da poredi koncentraciju IGFBP2 dobijenu prema postupku ovog pronalaska sa definisanom graničnom vrednošću.

[0046] Poželjno, pomenuta granična vrednost je srednja koncentracija IGFBP2 populacije zdravih pojedinaca. Kao što se ovde koristi, izraz "zdrav pojedinac" označava čoveka za kog se zna da je zdrav, tj.

koji ne boluje od zatajenja srca, nikada nije patio od tog hroničnog zatajenja srca, i ne treba mu nikakva zdravstvena nega.

[0047] Poželjno, pomenuta granična vrednost je srednja koncentracija IGFBP2 populacije bolesnih pojedinaca. Kao što se ovde koristi, izraz "bolestan pojedinac" označava čoveka za kog se zna da je bolestan, tj. koji boluje od zatajenja srca u bilo kom stupnju zatajenja srca kao prema NYHA klasifikaciji zatajenja srca.

[0048] Obično, prosečan stručnjak u tehnici može da odredi koncentraciju IGFBP2 u biološkom uzorku, poželjno plazmi ili urinu, 100 pojedinaca za koje se zna da su zdravi ili bolesni. Srednja vrednost dobijenih koncentracija se zatim određuje, prema dobro poznatoj statističkoj analizi, kako bi se dobila srednja koncentracija IGFBP2. Pomenuta vrednost se onda smatra normalnom i, prema tome, predstavlja neku graničnu vrednost. Poređenjem koncentracija IGFBP2 sa ovom graničnom vrednošću, lekar onda može da dijagnostikuje zatajenje srca ili klasifikuje pacijente. Zaista, poređenjem koncentracija IGFBP2 dobijenih u biološkom uzorku, poželjno plazmi ili urinu, datog subjekta sa graničnom vrednošću, lako može da se odredi da li pomenuti subjekt boluje od zatajenja srca ili ne ili može lako da se odredi stupanj zatajenja srca prema NYHA klasifikaciji zatajenja srca.

[0049] Prema tome, lekar može da prilagodi i optimizuje odgovarajuću zdravstvenu negu pacijenta u kritičnom i život-ugrožavajućem stanju koji boluje od zatajenja srca. Određivanje pomenute prognoze je veoma pogodno za praćenje nege i kliničko odlučivanje.

[0050] Prema tome, ovaj pronalazak odnosi se na postupak za dijagnozu zatajenjs srca kod pacijenta ili za klasifikovanje pacijenta sa rizikom od zatajenja srca, koji obuhvata sledeće faze:

a) određivanje koncentracije IGFBP2 u uzorku dobijenom od pomenutog pacijenta;

b) određivanje srednje koncentracije IGFBP2 u biološkom uzorku populacije zdravih ili bolesnih pojedinaca, poželjno 100 zdravih pojedinaca; i

c) faza poređenja koncentracije IGFBP2 dobijene u a) sa srednjom koncentracijom IGFBP2 dobijenom u b).

[0051] U daljem primeru, postupci ovog pronalaska obuhvataju merenje koncentracije najmanje jednog dodatnog biomarkera.

[0052] Pojam "biomarker", kao što se ovde koristi, odnosi uopšteno se na molekul, čija ekspresija u uzorku od pacijenta može da se detektuje standardnim postupcima u tehnici (kao onim opisanim ovde), i pokazatelj je ili označava stanje subjekta od kog je dobijen.

[0053] Na primer, drugi biomarker može da se odabere iz grupe biomarkera zatajenja srca koju čine moždani natriuretski peptid (BNP), amino-terminalni promoždani natriuretski peptid (NT-pro BNP), norepinefrin, troponin, srčani protein koji vezuje masne kiseline, miozin laki lanac-1, matrična metaloproteinaza, tkivni inhibitor matrične metaloproteinaze, C-reaktivni protein (CRP), TNFalfa, rastvorljiv receptor faktora nekroze tumora tipa 1 (sTNFR1), rastvorljiv TNFR2 receptor, rastvorljiv IL-2 receptor, CD40-CD154, CCAM-I, P-selektin, tkivni faktor i von Willebrand faktor, urokortin, mijeloperoksidaza i urinska kiselina.

[0054] U poželjnom primeru, dodatni biomarker zatajenja srca je BNP ili NT-pro BNP.

[0055] Još jedan predmet odnosi se na komplet za izvođenja postupka ovog pronalaska, pri čemu pomenuti komplet obuhvata sredstva za merenje koncentracije IGFBP2 u uzorku dobijenom od pacijenta. Komplet može da uključuje neko antitelo, ili skup antitela kao što je opisano gore. U posebnom primeru, antitelo ili skup antitela su obeleženi kao što je opisano gore. Komplet može takođe da sadrži ostale pogodne upakovane reagense i materijale potrebne za određen protokol detekcije, uključujući matrice čvrste faze, ako se primenjuju, i standarde. Komplet može takođe da sadrži jedno ili više sredstava za detekciju dodatnog biomarkera. Obično, komplet može takođe da sadrži sredstva za detekciju jednog ili više biomarkera zatajenja srca odabranih iz grupe koju čine moždani natriuretski peptid (BNP), amino-terminalni pro-moždani natriuretski peptid (NT-pro BNP), norepinefrin, troponin, srčani protein koji vezuje masne kiseline, miozin laki lanac-1, matrična metaloproteinaza, tkivni inhibitor matrične metaloproteinaze, C-reaktivni protein (CRP), TNFalfa, rastvorljiv receptor faktora nekroze tumora tipa 1 (sTNFR1), rastvorljiv T2 receptor, rastvorljiv IL-2 receptor, CD40-CD154, CCAM-I, P-selektin, tkivni faktor i von Willebrand faktor, urokortin, mijeloperoksidaza, galektin-3 i urinska kiselina.

[0056] U jednom primeru, komplet obuhvata sredstva merenja koncentracije IGFBP2 i sredstva za merenje koncentracije BNP ili NT-pro BNP.

[0057] Dodatni predmet ovog pronalaska odnosi se na upotrebu IGFBP2 kao biomarkera za zatajenje srca.

[0058] Ovaj pronalazak će dalje biti ilustrovan slikama i primerima koji slede. Međutim, ovi primeri i slike ne treba da se tumače ni na koji način kao ograničenja obima ovog pronalaska.

SLIKE:

[0059]

Fig.1: Analiza ROC krive IGFBP2 nivoa od CHF i AHF pacijenata (n=80) vs kontrolni subjekti (n=50).

Fig.2: Plazmatična koncentracija IGFBP2 (ng/ml) kod kontrole; pacijenata sa hroničnim zatajenjem srca (CHF) i akutnim zatajenjem srca (AHF). Višestruko poređenje izvedeno je sa Anova i Bonferroni post hoc testom (*** p<0,001).

Fig.3: Urinska koncentracija IGFBP2 (ng/ml). Kontrol, n=21; Hronično zatajenje srca (CHF), n=19. Poređenja su izvedena upotrebom Studentovog t testa gde je * za p<0,001.

Fig.4: Plazmatična koncentracija IGFBP2 prema NYHA klasifikaciji stupnja zatajenja srca.

Višestruko poređenje izvedeno je sa Anova i Bonferroni post hoc testom (* p<0,01).

Fig.5: Dijagram rasipanja IGFBP2 versus BNP koncentracija u plazmi. Procenjena linija regresije je ucrtana uključujući njen 95% interval pouzdanosti (isprekidane linije).

Fig.6: Plazmatična koncentracija IGFBP2 i ejekcione frakcije leve komore su u korelaciji.

Plazmatična koncentracija IGFBP2 izmerena je pomoću ELISA i ejekciona frakcija leve komore (LVEF) transtorakalnom ehokardiografijom.

Fig.7: IGFBP2 i BNP nivoi u plazmi iz skupa za otkrivanje-testiranje. Merenja biomarkera su izvedena sa plazmom od kontrolnog pacijenta sa faktorima rizika za nastanak kardiovaskularnih bolesti (CRF) ili pacijenata sa zatajenjem srca (HF) (akutno i hronično, videti Fig.1). * Značajna razlika; p<0,05.

Fig.8: IGFBP2 i BNP nivoi u plazmi iz skupa za validaciju.

(A) IGFBP2 i BNP nivoi su procenjeni kod pacijenata sa faktorima rizika za nastanak kardiovaskularnih bolesti (CRF), pacijenta sa nesrčanom dispnejom (NCD), sa hroničnim zatajenjem srca (CHF) i sa akutnim zatajenjem srca (AHF). * Značajna razlika; p<0,05.

Horizontalna isprekidana linija odgovara optimalnoj tački preseka od 556 ng/ml.

Fig.9: IGFBP2 i BNP nivoi u plazmi od NCD i AHF pacijenata iz skupa za validaciju.

Analiza ROC krive za NCD (n=17) vs AHF (n=24) pacijente sa BNP obuhvata između 100 i 600 pg/ml. AUC su 0,838 (CI 95%: 0,690 - 0,934) za IGFBP2 značajno različite od AUC=0,5 p<0,0001 i 0,653 (CI 95%: 0,895-0,969) značajno se ne razlikuju od AUC=0,5 p=0,109 za BNP. *Poređenja u parovima ROC krive bila su značajna između BNP i IGFBP2 sa p=0,034.

Fig.10: Analiza modela pacova za ishemijsko zatajenje srca.

(A) Ehokardiografska analiza. (B) qPCR analiza IGFBP2 mRNK nivoa u srcima i jetrama pacova. N=5 po grupi. *p<0,05. Pacovi su operisani 14. dana i tkiva za mRNK analizu su prikupljena 70. dana.

Tabela 1: Demografske i kliničke karakteristike skupa za otkrivanje-testiranje. Ovaj set se sastoji od 28 pacijenata sa faktorima rizika za nastanak kardiovaskularnih bolesti (CRF) kao "kontrola" koje su upoređene sa 12 pacijenata sa akutnim zatajenjem srca (AHF) i 9 pacijenata sa hroničnim zatajenjem srca (CHF) kao "slučajevi". LVEF: ejekciona frakcija leve komore.

Tabela 2: Diferencijalno predstavljeni polipeptidi određeni pomoću CE-MS.

[0060] Oblasti ispod krive (AUC) naznačene su za 9 polipeptida koji su bolji prediktori za HF. "p" vrednosti nepodešene i nakon Bonferroni ili Benjamini Hochberg (BH) podešavanja.

Tabela 3: Demografske i kliničke karakteristike seta za validaciju, faktori rizika za nastanak kardiovaskularnih bolesti (CRF); pacijenti sa nesrčanom dispnejom (NCD), sa hroničnim zatajenjem srca (CHF) i sa akutnim zatajenjem srca (AHF) su regrutovani. LVEF: ejekciona frakcija leve komore.

Tabela 4: Korelacije IGFBP2 i BNP nivoa sa kliničkim karakteristikama. Rho: Spearmanov koeficijent korelacije ranga, n=228. Rho >0,5 umeren do visok odnos je podebljan.

Tabela 5: Demografske i kliničke karakteristike eksterne validacione kohorte. LVEF: ejekciona frakcija leve komore.

PRIMERI

PRIMER 1: prva analiza pacijenata

Materijal i postupci

Pacijenti:

1. Populacija:

[0061] Izvedena je monocentrična transverzalna studija sa uključenih preko 200 pacijenata između Novembera 2010. i Marta 2011. god. u univerzitetskoj bolnici Rangueil u Tuluzu. Tri grupe pacijenata su formirane: hronično zatajenje srca, (CHF), akutno zatajenje srca (AHF) i kontrola. Svi pacijenti potpisali sporazum o saglasnosti i kolekcija biouzoraka odobrena je od strane Francuskog ministarstva zdravlja, CCTIR, CNIL i etičkog komiteta (CPP). Pacijenti ispod 18 godina koji nisu ili mogli da razumeju ili da potpišu saglasnost isključeni su kao i pacijenti sa insuficijencijom bubrega ili transplantirani pacijenti.

a. Pacijenti sa hroničnim zatajenjem srca (CHF):

[0062] Uključeni su pacijenti sa poznatim stabilnim CHF (>3 meseca bez bilo kakve dekompenzacije) u opsegu od NYHA stupnja I do IV sa raznovrsnim etiologijama (ishemijska kardiopatija (CMI), valvularna (CMV), post-hipertenzivna (CMH post-HTA), hipertrofna genetska kardiomiopatija (CMH gen), primarna dilatirana kardiomiopatija ili toksična (CMD)), aritmogena displazija desne komore, aritmogena i kongenitalna kardiomiopatija. Uključivanje je zahtevalo jasnu dijagnozu zatajenja srca (klinička, istorija bolesti, transtorakalna ehokardiografija (TTE) i/ili BNP). Ovi pacijenti primljeni su u nekoliko kardioloških ustanova (bolnica, Pr Galinier i Pr Carrié jedinice za konsultacije) nakon njihovog prijema za zatajenje srca.

b. Akutno zatajenje srca (AHF):

[0063] Uključeni su pacijenti prihvaćeni za akutnu srčanu dekompenzaciju bez obzira da li je tip (levi, desni, mešani, slabog izlaza, kardiogeni šok) mogao da identifikuje pretpostavljene CHF i AHF biomarkere.

c. Kontrola:

[0064] Kontrolni pacijenti uključeni su preko odeljenja za prevenciju arteroskleroze univerzitetske bolnice Rangueil tokom dnevne hospitalizacije.

2. Klinički podaci:

[0065] Za sve pacijente, antropometrijski podaci (masa, visina, pol), klinička istorija, elektrokardiografijski i biološki podaci (plazmatični natrijum, kreatinin, stanje jetre, protrombin, CRP, hematokrit i hemoglobin) su prikupljeni. Podaci o BNP nivoima prikupljeni su za CHF i AHF pacijente. Sva ova ispitivanja bila su zahtevana tokom tretmana od strane lekara zaduženog za pacijente i izvedena su radi praćenja stupnja zatajenja srca, ali i funkcije bubrega i jetre, hidratacije i nivoa zapaljenja. Svi lekovi su zabeleženi.

3. Ehokardiografija:

[0066] Transtorakalna ehokardiografija (TTE) izvedena je za sve subjekte uključene od strane jednog kardiologa na namenskom uređaju (Kontron) koji omogućava prikupljanje podataka tokom procedure i naknadnu obradu podataka upotrebom softvera My Lab Desk - Kontron za svakog pacijenta.

[0067] TTE omogućila je sistematsko merenje zapremina i prečnika, sistolnu i dijastolnu funkciju leve komore left. Dodatno, funkcija desne komore analizirana je kao i aortne, mitralne ili triskupidne valvulopatije. TTE smatran je za « zlatni standard » za dijagnozu zatajenja srca koja je završena sa njegovom etilogijom prema evropskim i američkim trenutnim preporukama.

Biološki uzorci:

[0068] Urin je prikupljen u standardnim polipropilenskim epruvetama i odmah je zamrznut i održavan na -80°C. Plazma je prikupljena u EDTA epruvetama, centrifugirana, alikvotirana na ledu i neposredno zamrznuta na -80°C.

Analitički postupci:

[0069] CE-MS je izvedena upotrebom standardne procedure [Mischak, H. et al., 2010]. Ukratko, peptidi su elektroforetski razdvojeni na kapilarnim kolonama od silicijum-dioksida dugim 90 cm i prečnika 50 µm (Beckmann-Coulter, Fullerton, CA, SAD) kuplovane sa ESI-TOF masenim spektrometrom (elektrosprej jonizacija – vreme leta) (MicroTOF, Brucker-Daltonic, Bremen, Nemačka). CE-MS pufer bio je 20 vol.% acetonitril i 250 mM mravlja kiselina u HPLC vodi. Elektroforetsko razdvajanje izvedeno je tokom 60 min u električnom polju (+ 35 do - 40 kV) koje dovodi do intenziteta od 13 µA. Kapilarna temperatura održavana je na 35 °C tokom izvođenja.

[0070] Enzim-vezani imunosorbentni test (ELISA) kvantizacija IGFBP2 izvedena je upotrebom R&D SYSTEMS EUROPE LTD reagenasa prema protokolu proizvođača ELISA reagensa.

Rezultati

[0071] Prvo je pregledan urinarni proteom 50 pacijenata (9 CHF, 13 AHF, 28 zdrave kontrole za starost pol i faktor rizika), što je dovelo do otkrivanja panela polipeptida specifičnih za HF. Jadan polipeptid (x64054, masa 1878,792 Da; vreme kapilarne elektroforeze t = 20,72 min) bio je veoma značajan jer je mogao da razlikuje AHF i CHF sa visokom specifičnošću i osetljivošću na osnovu CE-MS podataka (AUC = 0,99; p<0,0001). Upotrebom MALDI-TOF analize, identifikovan je pretpostavljeni biomarker kao fragment vezujućeg proteina 2 za faktore rasta slične insulinu (IGFBP2).

[0072] Validacija IGFBP2 kao pretpostavljenog biomarkera izvedena je pomoću ELISA upotrebom merenja i plazmatične i urinarne koncentracije kod 200 pacijenata. Analiza ROC krive obezbedila je AUC vrednost od 0,988, p<0,0001 (Fig.1). Jasna plazmatična (Fig.2) i urinarna (Fig.3) koncentracija IGFBP2 snažno su pojačane kod CHF i AHF pacijenata. Štaviše, povećanje IGFBP2 koncentracije u plazmi zavisilo je od ozbiljnosti zatajenja srca kao što je naznačeno NYHA klasifikacijom (Fig.4). Dalje, primećeno je da su IGFBP2 i BNP nivoi bili u slaboj korelaciji dajući veći značaj ovom novom biomarkeru kao gotovo nezavisnom indikatoru (Fig.5). Konačno, primećeno je da su IGFBP2 nivo u plazmi i ejekciona frakcija leve komore bili negativno povezani, što ukazuje na fiziološku vezu između IGFBP2 nivoa u krvotoku i funkcije srca i donosi IGFBP2 nivoe kao moguću procenu stanja srca (Fig.6). Prema tome, predloženo je da povišena IGFBP2 koncentracija može da se koristi kao biomarker zatajenja srca.

PRIMER 2 : druga analiza pacijenata

Materijal i postupci

Uključivanje pacijenata

[0073] Dve nezavisne kohorte korišćene su u ovoj studiji. Kohorta za otkrivanje i validaciju sa 228 pacijenata koji su regrutovani između Novembera 2010. i Novembera 2011. god. u univerzitetskoj bolnici Rangueil (Tuluz, Francuska) i eksterna validaciona kohorta sa 40 pacijenata koji su regrutovani između 2009. i 2011. god. u univerzitetskoj bolnici Lariboisière (Paris, Francuska).

[0074] Radi fokusiranja na specifične biomarkere zatajenja srca bez predrasude prema etiologiji ili ozbiljnosti zatajenja srca, grupa slučajeva kohorte za otkrivanje i validaciju bila je sastavljena od pacijenata koji boluju od hroničnog (CHF) ili akutnog (AHF) zatajenja srca. CHF pacijenti imali su poznato stabilno HF sa > 3 meseca bez bilo kakvih epizoda dekompenzacije, bez obzira na stupanj kliničke ozbiljnosti (stupanj I do IV NYHA klasifikacije) i, bez obzira na etiologiju. Dijagnoza zatajenja srca bila je formalno uspostavljena na osnovu kliničkih zapažanja, praćenja bolesti srca, praćenja transtorakalne ehokardiografije (TTE) i BNP. Ovi pacijenti su uključeni tokom njihove redovne zakazane posete bolnici. AHF pacijenti su regrutovani bez obzira na kliničku sliku (levi, desni, mešani, mali protok-kardiogeni šok.

[0075] Kontrolna grupa kohorte za otkrivanje i validaciju sastojala se od pacijenata bez HF ali sa faktorima rizika za nastanak kardiovaskularnih bolesti (CRF) ili CRF i nesrčane dispneje (NCD) za fazu otkrivanja i fazu validacije, respektivno. CRF pacijenti su regrutovani tokom njihove zakazane posete u centru za prevenciju ateroskleroze univerzitetsk bolnice Rangueil. Uključivanje u ovu grupu tražilo je isključenje svih pacijenata sa istorijom, kliničkim znacima, biološkim, ili ehokardiografskim dokazom zatajenja srca (sistolna ili dijastolna disfunkcija).

[0076] Eksterna validaciona kohorta oformljena je u univerzitetskoj bolnici Lariboisière (Paris, Francuska) sa COPD pacijentima (sa BNP<20 pg/ml za testiranje "čistog" COPD bez bilo kakvog desnog ili levog srčanog stresa) kao kontrolni pacijent i AHF pacijentima kao pacijenti slučajevi.

[0077] Za sve subjekte, prikupljeni su antropometrijski podaci (masa, visina, pol), klinička istorija, biološki podaci i elektrokardiografski (Tabele 1, 3, 5). Sva ova ispitivanja izvedena su tokom tretmana od strane lekara zaduženog za pacijente i izvedena su radi praćenja stupnja zatajenja srca ali i funkcije bubrega i jetre, hidratacije i nivoa zapaljenja. Svi lekovi su zabeleženi.

[0078] TTE je izvedena za sve subjekte uključene od strane jednog kardiologa. Ehokardiografija (Konton Imagic, Kontron, Saint German en Laye, Francuska) omogućila je sistematska merenja zapremina i prečnika, sistolne i dijastolne funkcije leve komore i merenja ejekcione frakcije. Pacijenti sa dijalizom bubrega ili transplantom (stupanj 5D i 5T) su isključeni.

[0079] Protokol istraživanja registrovan u kliničkoj bazi podataka (ClinicalTrials.gov NCT01024049) usklađen je sa etičkim smernicama 1975 Deklaracije iz Helsinkija. Protokol je odobren od strane odbora za istraživanja na ljudima u ustanovama (COSSEC) i regionalnog etičkog odbora (Comité de Protection des Personnes (CPP) # DC 2008-452). Pismena informativna saglasnost dobijena je od svih ućesnika i/ili njihovih zakonski ovlašćenih predstavnika.

Skupovi za otkrivanje i validaciju

[0080] Prvo je nasumično oformljen skup za otkrivanje-testiranje od 49 subjekata od 228 pacijenata iz kohorte za otkrivanje i validaciju . Dvadeset jedan HF pacijenti sa 9 od 67 AHF i 12 od 51 AHF činili su podskup slučajeva, a 28 od 67 CRF pacijenata činili su podskup kontrola. Urini od ovih 49 subjekata korišćeni su za CE-MS analizu proteomika (Tabela 1). X64054 peptid izolovan ovom analizom dalje je identifikovan dole kao IGFBP2 i testiran u plazmi skupa za otkrivanje i testiranje. Dalje, dve kohorte za validaciju su formirane. Prva koja obuhvata pacijente iz univerzitetske bolnice u Tuluzu (Tabela 3); Skup za validaciju uključivao je 179 pacijenata sa podskupom kontrola kojeg je činilo 39 CRF i 43 NCD i podskupom slučajeva kojeg je činilo 39 AHF i 58 CHF.

[0081] Druga kohorta za validaciju oformljena je sa 40 pacijenata iz univerzitetske bolnice Lariboisière iz Pariza. Ova eksterna validaciona kohorta uključivala je 10 COPD i 30 AHF pacijenata (Tabela 5).

Biološki uzorci

[0082] Svi subjekti su venepunktirani i periferna venozna krv je izvučena u natrijum/EDTA epruvete. Nakon centrifugiranja pri 1500 g na 4 °C tokom 10 min, plazma je odvojena, alikvotirana i čuvana ana -80°C do testiranja. Subjekti su takođe obezbedili jutarnji uzorak urina, i 20 ml je prikupljeno u polipropilensku sabirnu posudu, alikvotirano i čuvano kao što je prethodno navedeno.

Analitički postupci

Priprema uzoraka i analiza pomoću kapilarne elektroforeze kuplovane sa masenom spektrometrijom (CE-MS)

[0083] Svi učesnici prikupili su jutarnji uzorak urina na dan ehokardiografskih ispitivanja.

[0084] Alikvoti su čuvani na -80°C do vremena obrade. Uzorci urina zatim su obrađeni kao što je prethodno opisano 13 i zatim resuspendovani u vodi HPLC-kvaliteta kratko pre CE-MS analiza. CE-MS analiza izvedena je kao što je opisano upotrebom P/ACE MDQ sistema elektroforeze (Beckman Coulter, Villepinte, Francuska) u liniji kuplovanog sa MicroQTOF MS (Bruker Daltonics, Bremen, Nemačka). ESI raspršivač (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, SAD) je uzemljen, i potencijal interfejsa elektrosprej jonizacije bio je između -4,0 i -4,5 kV. Akvizicija podataka i MS postupci akvizicije automatski su kontrolisani pomoću CE preko kontakt-blizu-releji. Spektri su akumulirani svake 3 s, preko opsega m/z 350 do 3000. Detalji o tačnosti, preciznosti, selektivnosti, osetljivosti, reproducibilnosti i stabilnosti CE-MS postupka prethodno su obezbeđeni.

Obrada podataka

[0085] Maseni spektri su obrađeni upotrebom MosaiquesVisu softvera (Mosaiques, Hannover, Nemačka), including biranje pikova, dekonvulaciju i de-izotopiranje. Vreme migracije i intenzitet pika normalizovani su upotrebom internnih polipeptidnih standarda. Veruje se da su ovi fragmenti rezultat normalnih bioloških procesa i čini se da ne utiče na bilo koje stanje bolesti ispitano do danas na osnovu 20.000 uzoraka u bazi podataka ovde. Dobijena lista pikova karakteriše svaki polipeptid njegovom molekulskom masom, normalizovanim vremenom migracije kapilarne elektroforeze, i normalizovanim intenzitetom signala. Svi detektovani polipeptidi su deponovani, upareni i označeni u Microsoft SQL bazi podataka, što omogućava dalju analizu i poređenje više grupa pacijenata.

Statistički postupci i identifikacija biomarkera

[0086] Upoređene su srednje vrednosti i proporcije kliničkih i ehokardiografskih karakteristika otkrića i testnih uzoraka pomoću t-testa i x2 statistika, respektivno, upotrebom SAS softvera, verizija 9.1.3 (SAS Institute, Cary, NC, SAD). U fazi otkrivanja, upoređena je prirodna amplituda logaritam- transformisanog signala CE-MS profila urinarih polipeptida između pacijenata i kontrola upotrebom Vilkoksonovog testa ranga sa znakom. Ovaj ne-parametrijski test pogodan je za iskrivljene podatke proteomika. Testirana je nulta hipoteza da pacijenti i kontrole imaju istu kontinuiranu distribuciju amplitude signala CE-MS profila urinarnih polipeptida. Amplituda signala predstavlja kalibrisana brojanja (intenzitet) zabeležena uređajem za masenu spektrometriju. Statističko podešavanje za višestruko testiranje izvedeno je primenom Benjamini-Hochberg korekcije. Tragano je za klasterom urinarnih polipeptida koji prave razliku između slučajeva i kontrola na osnovu distribucije biomarkera kod pojedinačnih subjekata. Za svaki slučaj i svaku kontrolu, odabrani polipeptidi kombinovani su u jednoj zbirnoj varijabli, upotrebom MosaCluster softvera na bazi uređaja koji podržava vektor, verzija 1.6.5. U setu testova, istraživači zaslepljeni kliničkim stanjem ispitivanih učesnika merili su polipeptide klastera. Posle razbijanja koda, izrašunata je osetljivost i specifičnost na osnovu tabeliranja brojnih ispravno klasifikovanih uzoraka u setu testova, upotrebom dijagrama karakteristika rada prijemnika (ROC). Oblast ispod ROC krive (AUC) obezbeđuje jednu meru ukupne tačnosti koja je nezavisna od bilo kog određenog praga.

Sekvenciranje

[0087] Uzorci urina su analizirani na Dionex Ultimate 3000 RSLS sistemu nano protoka (Dionex, Camberly UK), u suštini kao što je opisano (Carty et al., 2011; Metzger et al., 2012). Uzorci (5 µl) su napunjeni na Dionex 100 µm x 2 cm 5 µm C18 nano hvatajuću kolonu protokom od 5 µl/min sa Ultimate 3000 RS autosemplerom (Dionex, Camberley UK). Sastav rastvora punjenja bio je 0,1% mravlje kiseline i acetonitrila (98:2). Jednom kada se napuni na hvatajuću kolonu, uzorak je zatim ispran u Acclaim PepMap C18 nano koloni 75 µm x 15 cm, 2 µm 100 Å protokom od 0,3 µm/min. Eluiranje je izvedeno sa linearnim gradijentom rastvarača A, 0,1% mravlje kiseline i acetonitrila (98:2) u odnosu na rastvarač B, 0,1% mravlje kiseline i acetonitrila (20:80) polazeći od 1% B tokom 5 minuta raste do 30% u 90 minutu zatim do 50%B u 120 minutu. Hvatajuća kolona i kolona nano protoka održavane su na 35°C u kolonskoj peći u Ultimate 3000 RSLC. Eluent iz kolone usmereni su ka Proxeon nano spray ESI izvoru (Thermo Fisher Hemel UK) koji radi u režimu pozitivnih jona zatim u Orbitrap Velos FTMS. Napon jonizacije bio je 2,5 kV i kapilarna temperatura bila je 200°C. Maseni spektrometar radio je u MS/MS režimu koji skenira od 380 do 2000 amu. Postupak fragmentacije bio je HCD sa 35% energije sudara. Joni su odabrani za MS2 upotrebom postupka zavisnih od podataka sa brojem ponavljanja 1 i ponavljanjem i vremenom isključivanja od 15 s. Joni prekursora sa stanjem naelektrisanosti od 1 su odbačeni. Rezolucija jona MS1 bila je 60.000 i 7.500 za HCD MS2. Datoteka podataka od eksperimenata izvedena na HCD-omogučenoj LTQ pretraživana je za IPI humanu ne-redundantnu bazu podataka upotrebom Thermo Proteome Discoverer, bez bilo kakve enzimske specifičnosti. Nije izabrana fiksna modifikacija, i oksidacija metionina i prolina podešena je kao modifikacije varijabli. Prozor masovne greške od 10 ppm i 0,05 Da dozvoljeni su za MS i MS/MS, respektivno. Za dalju validaciju dobijenih identifikacija peptida, stroga korelacija između naelektrisanja peptida pri radnoj pH od 2 i CE-vremenu migracije korišćena je za minimiziranje lažno-pozitivne identifikacione stope 17. Izračunato CE-vreme migracije kandidata sekvence na osnovu njegove peptidne sekvence (broj osnovnih aminokiselina) upoređeno je sa eksperimentalnim vremenom migracije. Odstupanja CE-vremena migracije ispod ±2 min koja odgovaraju CE-MS merenju prihvaćena su.

Imunološki postupci

[0088] Western blot je izveden kao što je već objavljeno 18 upotrebom zečjeg monoklonalnog antihumanog IGFBP2 antitela, klon EPR3380(2) (Clinisciences, Nanterre, Francuska). IGFBP2 enzim-vezani imunosorbentni test (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA) korišćen je za merenje humanog IGFBP2 kao prema specifikacijama proizvođača.

mRNK ekstrakcije, reverzna transkripcija (RT) i kvantitativna PCR u stvarnom vremenu (qPCR)

[0089] mRNK ekstrakcije i RT-qPCR izvedena je kao što je već opisano upotrebom različitih prajmera kao što je već izvedeno [Harmancey R et al, 2007].

Statistička analiza

[0090] Zbog veoma velike količine signala u poređenju sa brojem testiranih pacijenata u CE-MS analizi, samo signali sa odnosom signalom i šuma 4 puta većim od pozadine su zadržani. Osim ukoliko nije drugačije specificirano, kontinuirane varijable predstavljene su kao kategorijske varijable srednjih vrednosti (±SD) kao procenti. Za kontinuirane varijable, Studentov t-test ili Mann-Whitney test ranga sa znakom kada test normalnosti nije uspio ili za kategorijske varijable chi square test korišćen je za određivanje njihove statističke razlike između grupa. Statističke analize su izvedene upotrebom R kompjuterskog jezika (http://www.R-project.org) i Medcalc (Medcalc, version 11.6.0.0, Medcalc software bva, Belgija).

Rezultati

Studije za otkrivanja

[0091] Demografski i klinički podaci skupa testova za otkrivanje dati su u Tabeli 1. Značajne razlike između kontrola i HF pacijenata za parametre lekova, prijemne laboratorije, ehokardiografije i prijemnih vitalnih znakova su u skladu sa njihovim kliničkim statusom Thus, plazmatične BNP i CRP koncentracije bile su značajno više kod HF pacijenata dok su klirens kreatinina, koncentracija natrijuma bile smanjene. Štaviše, srednji krvni pritisak i ejekciona frakcija (EF) bile su smanjene kod HF pacijenata. HF pacijenti takođe su imali povećane otkucaje srca. HF pacijenti bili su stariji od kontrolnih subjekata (70 ± 15 vs 53 ± 12; p<0,001).43 % HF pacijenata imalo je istoriju CAD. Faktori rizika za nastanak kardiovaskularnih bolesti bile su slične u dve grupe.

Diferencijalno prikazani polipeptidi određeni pomoću CE-MS i identifikacija novog pretpostavljenog HF biomarkera.

[0092] Cilj je bio detektovanje pretpostavljenih profila biomarkera koji mogu da budu potpis HF upotrebom CE-MS analize uzoraka urina kao prvi korak. Na osnovu analize proteoma urina AHF i CHF pacijenata (svi stupnjevi i etilogije) i CRF kontrolnih subjekata, definisan je skup polipeptida specifičnih za HF (9 polipeptidi sa AUC≥0,923, p<0,001 (Benjamini Hochberg višestruka korekcija testiranja) (Tabela 2). Jedan polipeptid (x64054, masa 1878,792 Da; vreme elektroforeze t=20,7224s) delovao je veoma interesantno jer je pokazao odličnu moć razlikovanja za HF sa i AUC od 0,988, p = 1.39.10-5. Prema tome, fokus je bio na ovom peptidu i mogao je uspešno da se identifikuje kao vezujući protein 2 za faktore rasta slične insulinu (IPI:IPI00297284.1). Prvo je provereno prisustvo IGFBP2 u humanom urinu i krvi i primećeno je da je IGFBP2 bio više u izobilju u plazmi nego u urinu (podaci nisu prikazani). ELISA analiza IGFBP2 urinarne koncentracije otkrila je da je koncentracija bila 505 ± 198 (n=35) puta niža nego u plazmi (nije prikazano). Zbog ovog zapažanja, dalje je analiziran IGFBP2 u uzorcima u plazmi pomoću ELISA.

IGFBP2 plazmatična koncentracija

[0093] Analiza IGFBP2 u plazmi pokazala je značajno povećanje kod pacijenata sa zatajenjem srca vs kontrolni pojedinci sa 1350 ± 635 (p<0,001) i 214 ± 136 ng/ml, respektivno (Fig.7). BNP nivoi u ovim pacijentima prikazani sa višom koncentracijom kod HF nego kod kontrolnih pacijenata; 806 ± 693 i 39 ± 28 (p<0,001), respektivno (Fig.7).

Validaciona studija

[0094] Demografski i klinički podaci pacijenata uključeni u skup za validaciju predstavljeni su u Tabeli 3. CRF pacijenti imaju faktore rizika za nastanak kardiovaskularnih bolesti bez bilo kakvih simptoma ili objektivnih parametara HF. AHF pacijenti bili su najstarija grupa. AHF pacijenti imali su značajna komorbidna stanja, uključujući hipertenziju (81 %), koronarnu bolest srca (52 %) i diabetes mellitus (24 %). Najveći broj pacijenata bio je na diureticima (89 %) i antiagregacijskim agensima (60 %). Raspodela pacijenata po starosti CHF grupe nalazi se u kontrolnoj grupi između CRF i NCD grupa. CHF pacijenti imali su 62 ± 13 godina sa 68 % muškaraca i LVEF bio je ≤ 45 % kod 42 pacijenata. Pacijenti imali su značajna komorbidna stanja, uključujući hipertenziju (37 %), koronarnu bolest srca (51%) i diabetes mellitus (30%). Ponovo, najveći broj pacijenata bio je na diureticima (78%) i antiagregacijskim agensima (54 %). Nije bilo značajne razlike za pol između grupa. IGFBP2 koncentracije bile su značajno povećane kod CHF i AHF vs CRF ili NCD pacijenti. Ovo povećanje IGFBP2 nivoa pratilo je sličan obrazac kao BNP nivoi u ovom skupu pacijenata (Fig.8). Analiza ROC krive CRF i NCD pacijenata vs CHF i AHF pacijenti pokazala je oblast ispod krive (AUC) od 0,933 za IGFBP2 sa 0,81 Youden indeksom povezanim sa IGBP2 >556 ng/ml koji je bio viši od BNP (0,870 ; p=0,038). Logistička regresija IGFBP2+BNP podigla je AUC do 0,942 ali nije značajno povećala performansu IGFBP2 (podaci nisu prikazani).

[0095] IGFFBP2 je dalje testiran za srčanu dijagnostiku pacijenata sa akutnom dispnejom. Vrednosti IGFBP2 i BNP koncentracija od ovih pacijenata sa akutnom dispnejom predstavljene su da prikazuju globalnu distribuciju pacijenata (podaci nisu prikazani). Analiza ROC krivih NCD vs AHF pacijenata prikazala je povećanu AUC za IGFBP2+BNP vs BNP (0,925 vs 0,859; p=0,04). U ovim grupama pacijenata, IGFBP2 performansa diskriminacije nije se značajno razlikovala od onog od BNP (podaci nisu prikazani). Jasna razlika između BNP i IGFBP2 performanse dijagnostike primećena je kada je plazmatični BNP nivo bio njegova zona loše dijagnoze, koja je ovde proširena od 100 do 600 pg/ml što je odgovaralo njegovom nižen nivou do koncentracije isključenja i 600 pg/ml koja je definisana kao razumna viša vrednost isključenja do uključenja HF. Nasuprot BNP, koji nije imao dijagnostičku vrednost (AUC = 0,643; 95% CI: 0,479-0,787) u ovoj zoni koncentracija, IGFBP2 dostigao je AUC od 0,838 (95% CI: 0,690-0,934) (Fig.9).

IGFBP2 nivoi i korelacije sa kliničkim parametrima

[0096] Univarijatna analiza korelacije između IGFBP2 i BNP sa glavnim parametrom karakteristika pacijenata dati su u Tabeli 4. IGFBP2 i BNP nivoi u snažnoj su međusobnoj korelaciji (rho = 0,722 ; p<0,001). Dalje, BNP i IGFBP2 nivoi bili su u sličnoj korelaciji sa diuretikom i C reaktivnim proteinom, klirensom kreatinina i LVEF.

Eksterna validacija IGFBP2 kao AHF biomarkera

[0097] Testirana je predviđajuća vrednost IGFBP2 za AHF dijagnozu na kohorti pacijenata regrutovanih u bolnici Lariboisière u Parizu. Ova kohorta obuhvatala je AHF i COPD pacijente i opisana je u Tabeli 5. Upotreba praga 556 ng/ml koji je prethodno i nezavisno određen u kohorti za otkrivanje i validaciju kao što je naznačeno gore dovela je do osetljivosti od 80 % za AHF dijagnostiku i specifičnosti od 90 % za COPD pacijente (podaci nisu prikazani).

PRIMER 3: analiza na životinjama

Materijal i postupci

Pacovski HF model i transtorakalna ehokardiografija

[0098] Istraga koja je bila u skladu sa National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals odobrena je od strane Inserm Animal Ethics Committee. Studija, gde se primenjuje infarkt miokarda kod Sprague-Dawley pacova starih 2 meseca (Janvier laboratorije) ligacijom koronarnih arterija, odobrena je od strane Local Animal Ethics Committee (# MP/03/03/01/12). Analize transtorakalne ehokardiografije izvedene su za merenje ejekcione frakcije leve komore upotrebom Vivid 7 pro 7 ehokardiografskog sistema (GE Medical System) kao što je već izvedeno.

Rezultati

Test IGFBP2 u pacovskom modelu ishemijskog HF

[0099] Dana 20., tj.4 dana nakon operacijom indukovane ishemije, životinje su imale smanjenu ejekcionu frakciju (Fig.10A) do dana 70. kada su životinje eutanazirane i organi su prikupljeni. Analiza nivoa genske ekspresije u tkivima pokazala je da su IGFBP2 mRNK nivoi povećani u atrijumima životinja sa ishemijom u poređenju sa lažnim (Fig.10B). Interesantno, a u ovoj vremenskoj tački, IGFBP2 mRNK nivoi u atrijumima od HF životinja bili su deset puta viši vs komora i 4 puta povišeni vs jetra.

DISKUSIJA

[0100] Plazmatični BNP ili NT-proBNP nivoi značajan su alat za dijagnozu pacijenata sa HF 2. Prema tome, upoređenju su i IGFBP2 dijagnostička vrednost sa onom od BNP i pretpostavljena dodata vrednost IGFBP2 sa BNP. Dijagnostičko izvođenje IGFBP2 merenja dovelo je do razlikovanja HF slučajeva od kontrolnih slučajeva bez bolesti srca (CRF i NCD pacijenti) sa povećanom AUC u poređenju sa onom od BNP. Logistička kombinacija IGFBP2 i BNP dovela je do povećane AUC u poređenju sa BNP samo kada se testira upotreba IGFBP2 i BNP u pravljenju razlike između NCD i AHF pacijenata. Dodata vrednost performanse IGFBP2 dijagnostike bila je još očiglednija kod pacijenata sa umerenim BNP povećanjem tj. u opsegu koncentracija od 100-600 pg/ml.

[0101] Ushodna regulacija IGFBP2 ukazala je na potencijalnu ulogu vezujućih proteina (IGFBP) za faktore rasta slične insulinu (IGF) kod HF i u većoj meri uključuje somatotropnu osu koja obuhvata hormone hipotalamusa kao što su oslobađajući hormon hormona rasta (GHRH) hipotalamusa, hormon rasta hipofize, i IGF 1 i 2. IGFBP dodeljuju regulaciju IGF bioaktivnosti ali takođe mogu da imaju direktnu ulogu. Jasno, raspoloživost IGF1 regulisana je vezujućim proteinima za faktore rasta slične insulinu IGFBP. Samo jedan do 5 % od IGF1 je slobodan u krvotoku, preostali IGF1 čvrsto su vezani za IGFBP sa afinitetom koji je veći ili jednak onom za njegov receptor. Tako, IGFBP modulišu IGF1 i IGF1 receptorsku interakciju. Međutim, za neke IGFBP nedavno je otkriveno da imaju njihovu sopstvenu aktivnost čak i u odsustvu IGF, kroz direktnu interakciju sa faktorima transkripcije i modulaciju genske ekspresije.

[0102] IGFBP2 je drugi najrasprostranjeniji IGFBP u humanoj plazmi. IGFBP2 je uglavnom IGF1 inhibitor. Podaci korelacije ovde potvrdili su da BNP i IGFBP2 plazmatični nivoi nisu zavisni od pola ali su pozitivno povećani sa gonima i negativno sa indeksom telesne mase.

[0103] IGF1 je prepoznat da je uključen u rast i razvoj miokarda 28. IGF1 i njegov receptor eksprimiraju se u srcu od fetalne faze i indukuje miokardijalnu hipertrofiju preko MAP-kinaza i puteva PI-3 kinaza. IGF1 takođe stimuliše miokardijalnu proizvodnju proteina, uključujući neke sa kontraktilnim funkcijama kao što su troponin i aktin. Prema tome, IGF1 odnosi se na kontraktilnu funkciju srca, a IGF1 nivoi su u korelaciji sa ejekcionom frakcijom leve komore (LVEF). IGF1 je takođe uključen u opstanak i apoptozu kardiomiocita. Mišji modeli i takođe male kliničke probe koje uključuju GH ili IGF1 injekciju otkrile su smanjenje ranog remodelinga srca, poboljšanje sistolne i dijastolne funkcije, i poboljšanje kontraktilnosti. Nedavno, dodavanje neutralizujućeg IGFBP2 antitela usled diferencijacije ćelija, dovelo je do značajne hipertofije mioblasta.

[0104] Ova studija je omogućila da se analizira veza između HF i plazmatičnog IGFBP2 i potencijalna upotreba IGFBP2 kao novog biomarkera. Jasno je primećeno povećane skoro 7 puta u IGFBP2 plazmatičnoj koncentraciji kod HF pacijenata. Štaviše, test IGFBP2 u BNP "sivoj zoni" otkrilo je povećanu moć diskriminacije za ovaj novi biomarker.

[0105] IGFBP2 se uglavnom proizvodi u jetri i srcu, pa je zbog toga verovatnije da je indikativan za funkciju jetre ili srca. Ove tačke procenjene su u ishemijskom pacovskom modelu HF koji je takođe otkrio veći IGFBP2 mRNK nivo u atrijumima vs komora ili jetra. Iznad svega, IGFBP2 mRNK nivoi su značajno povećani u atrijumima od HF životinja. Ovo zapažanje postavlja pitanje pretpostavljene uloge IGFBP2 u atrijumima. Moglo bi se nagađati da IGFP2 povećana sinteza može da bude uključena u zaštitni mehanizam protiv prekomernog remodelovanja u srcu jer smanjenje in vitro neutralizacije IGFBP2 na bazi antitela usled diferencijacije mioblasta differentiation dovodi do hipertrofije 34. Dodatno, prekomerna ekspresija IGFBP2 dovodi do smanjenja mišićne mase kod miševa 36. Međutim, uprkos čvrstoj pozadini, ova hipoteza biće dalje testirana u životinjskim modelima HF.

[0106] Konačno, primećena je značajna negativna korelacija IGFBP2 nivoa sa LVEF vrednosti kod pacijenata. Ova zapažanja imaju tendenciju da predlože upotrebu IGFBP2 kao potencijalnog biomarkera praćenja koji može da se koristi za procenu stabilnosti i ozbiljnosti zatajenja srca. Međutim, zbog njegove osetljivosti i specifičnosti kod HF, prva upotreba IGFBP2 može biti u komplementarnosti sa BNP u HF dijagnozi u populaciji pacijenata sa akutnom dispnejom srčanog porekla ili ne.

[0107] Ova studija ima neka ograničenja. Validacija novog IGFBP2 biomakera izvodi se sa malom eksternom kohortom pacijenata. Međutim, porast IGFBP2 koncentracije kod AHF pacijenata bio je pouzdan i kvalifikuje IGFBP2 kao novi biomarker. Sada je cilj testiranje IGFBP2 u veoma velikim multicentričnim internacionalnih kohortama za dalje validacije. Dalje, funkcionalna uloga IGFBP2 kod HF biće definisana u životinjskim modelima glodara.

[0108] Upotreba IGFBP2 kao HF biomarker je obećavajuća i može da poboljša HF dijagnostiku naročito u BNP opsegu vrednosti indikativnim za blago do umereno HF. Uprkos tome što se IGFBP2 sinteza uglovnom izvodi u srcu, on se takođe izlučuje jetrom. Ovo zapažanje ne bi trebalo da ugrozi upotrebu IGFBP2 za HF dijagnozu. Jasno, HF je sindrom i podaci ovde predlažu da je IGFBP2 pouzdan biomarker koji može da otkrije funkcionalno stanje srca.

REFERENCE:

[0109] U ovoj prijavi, razne reference opisuju stanje tehnike nakoju se ovaj pronalazak odnosi. Obim zaštite definisan je priloženim patentnim zahtevima.

Delahaye, F., Roth, O., Aupetit, J. F. & de Gevigney, G. [Epidemiology and prognosis of cardiac insufficiency]. Arch Mal Coeur Vaiss 94, 1393-1403 (2001).

Harmancey R, Senard J-M, Rouet P, Pathak A, Smih F. Adrenomedullin inhibits adipogenesis under transcriptional control of insulin. Diabetes.2007; 56:553-63.

Hassfeld S, Eichhorn C, Stehr K, Naegele H, Geier C, Steeg M, Ranke MB, Oezcelik C, Osterziel KJ. Insulin-like growth factor-binding proteins 2 and 3 are independent predictors of a poor prognosis in patients with dilated cardiomyopathy. Heart.2007 Mar;93(3):359-60.

Mischak, H. et al. Comprehensive human urine standards for comparability and standardization in clinical proteome analysis. Proteomics Clin Appl 4, 464-478, doi:10.1002/prca.200900189 (2010).

Phillips K, M A Park, L H Quarrie, M Boutinaud, J D Lochrie, D J Flint, G J Allan, J Beattie.

Hormonal control of IGF-binding protein (IGFBP)-5 and IGFBP-2 secretion during differentiation of the HC11 mouse mammary epithelial cell line. Journal of molecular endocrinology, 31:197-208 (2003).

Claims (7)

Patentni zahtevi

1. Postupak za klasifikovanje zatajenja srca kod pacijenta prema klasifikaciji zatajenja srca od New York Heart Association (NYHA), pri čemu pomenuti postupak obuhvata faze merenja koncentracije vezujućeg proteina 2 za faktore rasta slične insulinu (IGFBP2) u uzorku plazme ili urina dobijenom od pomenutog pacijenta, pri čemu je koncentracija IGFBP2 u korelaciji sa NYHA klasifikacijom zatajenja srca.

2. Postupak za dijagnozu zatajenja srca kod pacijenta, koji obuhvata :

i. određivanje koncentracije IGFBP2 u uzorku plazme ili urina dobijenom od pomenutog pacijenta; i

ii. poređenje pomenute koncentracije sa nekom kontrolnom vrednošću.

3. Postupak prema zahtevima 1 ili 2, pri čemu je zatajenje srca asimptomatsko zatajenje srca, hronično zatajenje srca ili akutno zatajenje srca.

4. Postupak prema bilo kojim zahtevima 1 do 3, pri čemu se koncentracija IGFBP2 meri kvantifikacijom nivoa IGFBP2 proteina u uzorku.

5. Postupak prema zahtevu 4, pri čemu se kvantifikacija nivoa IGFBP2 proteina izvodi upotrebom skupa antitela usmerenih protiv IGFBP2.

6. Postupak prema zahtevu 4, pri čemu se kvantifikacija nivoa IGFBP2 proteina izvodi pomoću ELISA.

7. Postupak prema zahtevu 4, pri čemu se kvantifikacija nivoa IGFBP2 proteina izvodi tehnikom kapilarne elektroforeze-masene spektroskopije.