RS58578B1 - Faktor viii himernih i hibridnih polipeptida i postupci za njihovu upotrebu - Google Patents

Faktor viii himernih i hibridnih polipeptida i postupci za njihovu upotrebu

Info

Publication number
RS58578B1
RS58578B1 RS20190355A RSP20190355A RS58578B1 RS 58578 B1 RS58578 B1 RS 58578B1 RS 20190355 A RS20190355 A RS 20190355A RS P20190355 A RSP20190355 A RS P20190355A RS 58578 B1 RS58578 B1 RS 58578B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
fviii
factor viii
rfviiifc
subject
polypeptide
Prior art date
Application number
RS20190355A
Other languages
English (en)
Inventor
Jennifer A Dumont
Susan Low
Alan J Bitonti
Glenn Pierce
Alvin Luk
Haiyan Jiang
Byron Mckinney
Matt Ottmer
Jurg Sommer
Karen Nugent
Lian Li
Robert Peters
Original Assignee
Bioverativ Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bioverativ Therapeutics Inc filed Critical Bioverativ Therapeutics Inc
Publication of RS58578B1 publication Critical patent/RS58578B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A61K38/37—Factors VIII
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis
Oblast pronalaska
[0001] Ovaj pronalazak se generalno odnosi na oblast terapeutika za hemostatske poremećaje.
Pozadina stanja tehnike
[0002] Hemofilija A je X-vezani poremećaj krvarenja uzrokovan mutacijama i/ili delecijama u genu faktora VIII (FVIII) što dovodi do nedostatka aktivnosti FVIII (Peyvandi, F. i dr. Haemophilia 12:82-89 (2006). Bolest se karakteriše spontanim krvarenjem i preteranim krvarenjem nakon traume. Vremenom, ponovljeno krvarenje u mišiće i zglobove, koje često počinje u ranom detinjstvu, dovodi do hemofilne artropatije i nepovratnog oštećenja zglobova. Ova oštećenja su progresivna i mogu dovesti do ozbiljno ograničene pokretljivosti zglobova, atrofije mišića i hroničnog bola (Rodriguez-Merchan, E.C., Semin. Thromb.
Hemost. 29:87-96 (2003).
[0003] A2 domen je neophodan za prokoagulantnu aktivnost molekula faktora VIII.
Istraživanja pokazuju da svinjski faktor VIII ima šest puta veću prokoagulantnu aktivnost od humanog faktora VIII (Lollar, P., and E. T. Parker, J. Biol. Chem.266:12481-12486 (1991)), i da razlika u koagulacionoj aktivnosti između humanog i svinjskog faktora VIII izgleda da se zasniva na razlici u aminokiselinskoj sekvenci između jednog ili više ostataka u humanim i svinjskim A2 domenima (Lollar, P., i dr., J. Biol. Chem.267:23652-23657 (1992)).
[0004] Lečenje hemofilije A je zamenskom terapijom koja je usmerena na vraćanje aktivnosti FVIII na 1 do 5% normalnih nivoa kako bi se sprečilo spontano krvarenje (Mannucci, P.M., i dr., N. Engl. J. Med.344:1773-1779 (2001). Postoje proizvodi plazme i rekombinantni FVIII dostupni za lečenje epizoda krvarenja na zahtev ili za sprečavanje nastupanja epizoda krvarenja profilaktičkim lečenjem. Na osnovu kratkog poluživota ovih proizvoda, međutim, npr., 8-12 sati, režimi lečenja zahtevaju primenu čestih intravenskih injekcija. Takva česta primena je bolna i nezgodna.
[0005] Smanjena smrtnost, prevencija oštećenja zglobova i poboljšanje kvaliteta života su važna dostignuća zbog razvoja plazme izvedenog i rekombinantnog FVIII. Produžena zaštita od krvarenja predstavlja još jedan ključni napredak u lečenju pacijenata sa hemofilijom A. Međutim, do danas nisu razvijeni proizvodi koji omogućavaju produženu hemostatsku zaštitu. Prema tome, ostaje potreba za poboljšanim postupcima za lečenje hemofilije usled nedostatka faktora VIII koji su podnošljiviji, dugotrajniji i efikasniji od trenutnih terapija. KRATAK REZIME PRONALASKA
[0006] Na osnovu ovog obelodanjivanja, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutski sastav koji sadrži (i) himerni polipeptid, koji sadrži deo Faktora VIII (FVIII) i drugi deo, i (ii) najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, pri čemu 15% do 25% FVIII dela himernog polipeptida je jednolančani FVIII i 75% do 85% FVIII dela himernog polipeptida je obrađeni FVIII, pri čemu jednostruki lanac FVIII sadrži FVIII teški lanac i FVIII laki lanac na jednom polipeptidnom lancu i obrađeni FVIII sadrži FVIII teški lanac i FVIII laki lanac na dva polipeptidna lanca.
U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutski sastav pronalaska, za upotrebu u prevenciji, smanjenju ili lečenju epizode krvarenja u subjektu, profilaktičko lečenje epizode krvarenja kod ispitanika, lečenje krvarenja na zahtev kod ispitanika ili u održavanju homeostata kod ispitanika kome je potrebna operacija.
Ovaj pronalazak i njegova otelotvorenja su prikazani u priloženim patentnim zahtevima.
[0007] U jednom aspektu, jednolančani faktor VIII može sadržati netaknuto intracelularno mesto za obradu. U drugom aspektu, jednolančani FVIII ne sadrži intracelularno mesto za obradu. Na primer, SCFVIII sadrži supstituciju ili mutaciju na položaju aminokiseline koja odgovara argininu 1645, supstituciju ili mutaciju na položaju aminokiseline koja odgovara argininu 1648, ili supstituciju ili mutaciju na položajima aminokiselina koji odgovaraju argininu 1645 i argininu 1648 u Faktoru VIII pune dužine. Aminokiselina supstituisana na položaju aminokiseline koja odgovara argininu 1645 je različita aminokiselina od aminokiseline supstituisane na položaju aminokiseline koja odgovara argininu 1648. U nekim otelotvorenjima, supstitucija ili mutacija je aminokiselina drugačija od arginina, npr., alanin.
[0008] U nekim otelotvorenjima, himerni polipeptid koji sadrži jednolančani faktor VIII ima aktivnost faktora VIII na nivou koji se može porediti sa himernim polipeptidom koji se sastoji od dva Fc dela i obrađenog faktora VIII, koji je fuzionisan sa jednim od dva Fc dela, kada aktivnost faktora VIII se meri in vitro pomoću hromogenog testa. U drugim otelotvorenjima, himerni polipeptid koji sadrži jednolančani faktor VIII ima aktivnost faktora VIII in vivo uporediv sa himernim polipeptidom koji se sastoji od dva Fc dela i obrađenog faktora VIII, koji je fuzionisan sa jednim od dva Fc dela. U drugim otelotvorenjima, himerni polipeptid koji sadrži jednolančani Faktor VIII ima stopu generisanja Faktora Xa koja se može uporediti sa himernim polipeptidom koji se sastoji od dva Fc dela i obrađenog Faktora VIII, koji je fuzionisan sa jednim od dva Fc dela. U određenim otelotvorenjima, jednolančani VIII u himernom polipeptidu je inaktiviran aktiviranim proteinom C na nivou koji je uporediv sa obrađenim faktorom VIII u himernom polipeptidu koji se sastoji od dva Fc dela i obrađenog faktora VIII. U određenim otelotvorenjima, jednolančani Faktor VIII u himernom polipeptidu ima stopu interakcije Faktora IXa uporedivu sa obrađenim Faktorom VIII u himernom polipeptidu koji se sastoji od dva Fc dela i obrađenog Faktora VIII. U daljim otelotvorenjima, jednolančani VIII u himernom polipeptidu je inaktiviran aktiviranim proteinom C na nivou koji je uporediv sa obrađenim faktorom VIII u himernom polipeptidu koji se sastoji od dva Fc dela i obrađenog faktora VIII.
[0009] U jednom otelotvorenju, drugi deo može biti Fc. U još jednom otelotvorenju, polipeptid je u obliku hibrida koji sadrži drugi polipeptid, pri čemu se navedeni drugi polipeptid sastoji u osnovi od Fc. U drugim otelotvorenjima, polipeptid ima polu-raspad najmanje jedan i po do šest puta duži, jedan i po do pet puta duži, jedan i po do četiri puta duži, jedan i po do tri puta. puta duže, ili jedan i po do dva puta duži do polipeptida koji se sastoji od navedenog faktora VIII.
[0010] Takođe je obezbeđen postupak za lečenje stanja krvarenja koji se sastoji od davanja terapeutski efikasne količine sastava. Tretman može biti profilaktički tretman ili tretman na zahtev ili perioperativni tretman. Poremećaj koagulacije krvarenja može biti hemofilija. U jednom slučaju, ispitanik koji se tretira je pedijatrijski ispitanik.
[0011] Predmetno obelodanjivanje je takođe usmereno na postupak za sprečavanje, smanjivanje ili lečenje epizode krvarenja kod ispitanika, koja se sastoji od davanja subjektu efikasne količine proteina dugog dejstva FVIII, pri čemu ispitanik izražava visok nivo von Willebrand faktora (VWF) u plazmi. U jednom slučaju, ispitanik je identifikovan kao ekspresija visokog nivoa VWF u plazmi. Predmetno obelodanjivanje je takođe usmereno na postupak za sprečavanje, smanjenje ili lečenje epizode krvarenja kod ispitanika koji sadrži:(a) identifikovanje ispitanika koji ima visoke nivoe VWF merenjem nivoa VWF u plazmi navedenog ispitanika, pri čemu nivo VWF od najmanje oko 100 IU/dL identifikuje ispitanika kao da ima visok nivo VWF; i (b) davanje ispitaniku efikasne količine proteina dugog dejstva FVIII.
[0012] U jednom slučaju, ispitanik je čovek. U drugom slučaju, ispitanik je pedijatrijski ispitanik. U drugom slučaju, ispitanik ima hemofiliju A.
[0013] U jednom slučaju, visok nivo VWF je barem oko 100 IU/dL. U drugom slučaju, visok nivo VWF je između oko 100 IU/dL i oko 200 IU/dL. U drugom slučaju, visok nivo VWF je oko 110 IU/dL, oko 120 IU/dL, oko 130 IU/dL, oko 140 IU/dL, oko 150 IU/dL, oko 160 IU/dL, oko 170 IU/dL, oko 180 IU/dL, oko 190 IU/dL ili oko 200 IU/dL.
[0014] U jednom slučaju, ispitanik ima krvni serotip A, B ili AB.
[0015] U jednom slučaju, dugo-delujući FVIII protein ima polu-raspad kod navedenog ispitanika između oko 20 i oko 40 sati. U drugom slučaju, dugo-delujući FVIII protein ima polu-raspad od oko 21 sat, 22 sata, 23 sata, 24 sata, 25 sati, 26 sati, 27 sati, 28 sati, 29 sati, 30 sati, 31 sat, 31 sat, 32 sata, 33 sata, 34 sata, 35 sati, 36 sati, 37 sati, 38 sati, 39 sati ili 40 sati. U drugom slučaju, dugo-delujući FVIII protein ima polu-raspad između oko 20 i 27 sati. U drugom slučaju, dugo-delujući FVIII ima polu-raspad koji je najmanje oko 1.2 puta veći od poluživota pomenutog dugo-delujućeg FVIII proteina kada se daje pojedincu koji ima prosečne nivoe VWF. U drugom slučaju, dugo-delujući FVIII protein ima polu-raspad koji je najmanje oko 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 ili 2.5 puta. veći od poluživota navedenog dugo-delujući FVIII proteina kada se daje pojedincu koji ima prosečne nivoe VWF.
[0016] U jednom slučaju, efikasna količina dugo-delujućeg FVIII proteina koji se daje je najmanje oko 20IU/kg, najmanje oko 25 IU/kg, najmanje oko 30IU/kg, najmanje oko 35 IU/kg, bar oko 40IU/kg, najmanje oko 45 IU/kg, najmanje oko 50IU/kg, najmanje oko 55 IU/kg, najmanje oko 60IU/kg, najmanje oko 65IU/kg, najmanje oko 70IU/kg, najmanje oko 75IU/kg, najmanje oko 80IU/kg, najmanje oko 85IU/kg ili najmanje oko 90IU/kg. U drugom slučaju, efektivna količina je najmanje oko 65IU/kg do najmanje oko 90IU/kg. U drugom slučaju, efektivna količina je 80 IU/kg.
[0017] U jednom slučaju, dugo-delujući FVIII protein se daje svakih 72 sata ili duže. U drugom slučaju, dugo-delujući FVIII protein se daje otprilike jednom nedeljno ili duže. U drugom slučaju, dugo-delujući FVIII protein se daje otprilike svakih 10 dana, otprilike jednom u dve nedelje, otprilike svakih 15 dana, otprilike svakih 20 dana, otprilike jednom svaka tri nedelje, jednom svakih 25 dana, otprilike jednom svaka četiri nedelje ili otprilike jednom mesečno.
[0018] U jednom slučaju, dugo-delujući FVIII se daje u dozi od 80 IU/kg jednom svakih 72 sata. U daljem slučaju, dugo-delujući FVIII se daje u dozi od 80 IU/kg jednom svakih 72 sata kod pedijatrijskog ispitanika.
[0019] U jednom slučaju, davanje dugo-delujućeg FVIII proteina je veća od 5-20%, veća od 5-15%, veća od 5-10%, veća od 10-20% ili veća od 10-15% epizode krvarenja. U jednom slučaju, najniži nivo plazma faktora VIII:C kod ispitanika se održava iznad 1-3 ili 3-5 IU/dl. U jednom slučaju, davanje sprečava epizodu krvarenja kod ispitanika. U drugom slučaju, epizoda krvarenja je spontana. U drugom slučaju, davanje rešava više od 80-100%, više od 80-90%, više od 85-90%, više od 90-100%, više od 90-95% ili više od 95-100% epizode krvarenja.
[0020] U jednom slučaju, davanje održava homeostat u populaciji ispitanika kojima je potrebna operacija. U drugom slučaju, dugo-delujući FVIII protein se daje pre, tokom ili nakon operacije. U drugom slučaju, operacija je manja operacija, velika operacija, vađenje zuba, tonzilektomija, ingvinalna herniotomija, sinovijektomija, totalna zamena kolena, kraniotomija, osteosinteza, traumatska hirurgija, intrakranijalna hirurgija, operacija unutar abdomena, intratorakalna operacija ili operacija zamene zglobova. U drugom slučaju, operacija je hitna operacija.
[0021] U drugom slučaju, dugo-delujući FVIII protein ima polu-raspad duži od polipeptida koji sadrži FVIII. U drugom slučaju, dugo-delujući FVIII protein je pegilovan, heziliran ili polisialilovan.
[0022] U jednom slučaju, dugo-delujući FVIII protein je himerni protein koji sadrži deo FVIII i drugi deo. U drugom slučaju, drugi deo je Fc region, albumin, PAS sekvenca, transferin, CTP (28 C-terminalni peptid aminokiseline (CTP) hCG sa 4 O-glikana), polietilen glikol (PEG), hidroksietil skrob (HES), albumin-vezujući polipeptid, albumin-vezujući mali molekuli ili dve ili više njihovih kombinacija. U drugom slučaju, drugi deo je fuzionisan na amino-kraj ili na karboksi-kraj dela FVIII. U drugom slučaju, drugi deo je ubačen između dve aminokiseline u delu FVIII. U drugom slučaju, himerni protein je FVIIIFc monomerni dimer hibrid. U drugom slučaju, FVIII deo je jednolančani. U drugom slučaju, FVIII deo sadrži teški lanac i laki lanac. U drugom slučaju, FVIII deo sadrži faktor VIII pune dužine, zreli faktor VIII ili faktor VIII sa punom ili delimičnom delecijom B domena. U drugom slučaju, FVIII deo sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnu sa aminokiselinama od 1 do 1438 SEQ ID NO:2 ili aminokiselinama 1 do 2332 od SEQ ID NO:6. U drugom slučaju, FVIII deo sadrži aminokiseline 1 do 1438 SEQ ID NO:2 ili aminokiselinama 1 do 2332 od SEQ ID NO:6. U drugom slučaju, himerni polipeptid sadrži Fc region koji je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičan sa aminokiselinama od 1439 do 1665 SEQ ID NO:2 ili aminokiselinama 2333 do 2559 od SEQ ID NO:6. U drugom slučaju, drugi deo sadrži aminokiseline 1439 do 1665 SEQ ID NO:2 ili aminokiselinama 2333 do 2559 od SEQ ID NO:6. U drugom slučaju, dugo-delujući FVIII polipeptid se primenjuje kao deo farmaceutskog sastava koji sadrži najmanje jedan ekscipijens.
[0023] Obelodanjivanje takođe obezbeđuje postupak za lečenje ispitanika sa dijagnozom poremećaja krvarenja, koji obuhvata merenje poluživota FVIII-Fc kod navedenog ispitanika, pri čemu polu-raspad koji je najmanje oko 1.2 puta veći od poluživota FVIII-Fc kod normalnog ispitanika ukazuje da je ispitanik kandidat za doziranje dugog intervala, i davanje FVIII-Fc polipeptida u efikasnoj količini i u intervalu doziranja od najmanje 3 dana.
[0024] Obelodanjivanje takođe obezbeđuje postupak lečenja ispitanika sa dijagnozom poremećaja krvarenja, koji se sastoji od davanja FVIII-Fc polipeptida u efikasnoj količini i u intervalu doziranja od najmanje 3 dana ispitaniku, pri čemu polu-raspad FVIII-Fc u navedeni ispitanik je najmanje oko 1,2 puta veći od poluživota FVIII-Fc kada se daje ispitaniku sa prosečnim nivoima VWF.
[0025] U jednom slučaju, polu-raspad plazme FVIII-Fc u navedenom subjektu je najmanje oko 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 ili 2.5 puta veći. od polu-života plazme FVIII-Fc kada se daje subjektu sa prosečnim nivoima VWF. U drugom slučaju, poluraspad FVIII-Fc plazme je između 20-40 sati. U drugom slučaju, dugo-delujući FVIII protein ima polu-raspad od oko 21 sat, 22 sata, 23 sata, 24 sata, 25 sati, 26 sati, 27 sati, 28 sati, 29 sati, 30 sati, 31 sat, 31 sat, 32 sata, 33 sata, 34 sata, 35 sati, 36 sati, 37 sati, 38 sati, 39 sati ili 40 sati. U drugom slučaju, dugo-delujući FVIII protein ima polu-raspad između oko 20 i 27 sati.
[0026] Slučaj takođe obezbeđuje postupak za lečenje ispitanika sa dijagnozom poremećaja krvarenja, koji obuhvata merenje poluživota kratko-delujućeg FVIII primenjenog kod navedenog ispitanika, pri čemu je polu-raspad najmanje oko 1.2 puta veći od poluživota navedenog kratko-delujućeg FVIII kod ispitanika sa prosečnim VWF nivoima pokazuje da subjekt je kandidat za doziranje dugog intervala i davanje dugo-delujućeg FVIII-Fc polipeptida u efikasnoj količini i u intervalu doziranja od najmanje 3 dana. U jednom slučaju, polu-raspad kratko-delujućeg FVIII ima u navedenom subjektu je najmanje oko 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 ili 2.5 puta veći od polu-života kratko-delujućeg FVIII kada se daje subjektu sa prosečnim nivoima VWF.
[0027] U jednom slučaju, ispitanik je čovek. U drugom slučaju, ispitanik je pedijatrijski ispitanik. U drugom slučaju, ispitanik ima hemofiliju A. U drugom slučaju, ispitanik ima krvni serotip A, B ili AB.
[0028] U jednom slučaju, dugo-delujući FVIII-Fc se daje u efektivnoj količini koja je bar oko 20IU/kg, najmanje oko 25 IU/kg, najmanje oko 30IU/kg, najmanje oko 35 IU/kg, bar oko 40IU/kg, najmanje oko 45 IU/kg, najmanje oko 50IU/kg, najmanje oko 55 IU/kg, najmanje oko 60IU/kg, najmanje oko 65IU/kg, najmanje oko 70IU/kg, najmanje oko 75IU/kg, najmanje oko 80IU/kg, najmanje oko 85IU/kg ili najmanje oko 90IU/kg. U drugom slučaju, efektivna količina je najmanje oko 65IU/kg do najmanje oko 90IU/kg.
[0029] U jednom slučaju, efikasna količina FVIII-Fc proteina se daje otprilike jednom nedeljno, otprilike svakih 10 dana, otprilike svakih 15 dana, otprilike svakih 20 dana, otprilike jednom svaka tri nedelje, jednom svakih 25 dana, otprilike jednom svaka četiri nedelje ili otprilike jednom mesečno.
[0030] U jednom slučaju, davanje rešava više od 5-20%, više od 5-15%, više od 5-10%, više od 10-20% ili više od 10-15% epizode krvarenja. U jednom slučaju, najniži nivo plazma faktora VIII:C kod ispitanika se održava iznad 1-3 ili 3-5 IU/dl.
[0031] U jednom slučaju, davanje sprečava epizodu krvarenja kod ispitanika. U jednom slučaju, epizoda krvarenja je spontana. U jednom slučaju, davanje rešava više od 80-100%, više od 80-90%, više od 85-90%, više od 90-100%, više od 90-95% ili više od 95-100% epizode krvarenja. U jednom slučaju, davanje održava homeostat u populaciji ispitanika kojima je potrebna operacija. U jednom slučaju, FVIII-Fc protein se daje pre, tokom ili nakon operacije. U jednom slučaju, operacija je manja operacija, velika operacija, vađenje zuba, tonzilektomija, ingvinalna herniotomija, sinovijektomija, totalna zamena kolena, kraniotomija, osteosinteza, traumatska hirurgija, intrakranijalna hirurgija, operacija unutar abdomena, intratorakalna operacija ili operacija zamene zglobova. U jednom slučaju, operacija je hitna operacija.
[0032] U jednom slučaju, FVIII-Fc protein ima polu-raspad duži od polipeptida koji sadrži FVIII. U jednom slučaju, FVIII-Fc protein je pegilovan, heziliran ili polisialilovan. U jednom slučaju, FVIII-Fc protein je FVIIIFc monomerni dimer hibrid. U jednom slučaju, FVIII deo je jednolančani. U jednom slučaju, FVIII deo sadrži teški lanac i laki lanac. U jednom slučaju, FVIII deo sadrži faktor VIII pune dužine, zreli faktor VIII ili faktor VIII sa punom ili delimičnom delecijom B domena. U jednom slučaju, FVIII deo sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnu sa aminokiselinama od 1 do 1438 SEQ ID NO:2 ili aminokiselinama 1 do 2332 od SEQ ID NO:6. U jednom slučaju, FVIII deo sadrži aminokiseline 1 do 1438 SEQ ID NO:2 ili aminokiselinama 1 do 2332 od SEQ ID NO:6. U jednom slučaju, himerni polipeptid sadrži Fc region koji je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičan sa aminokiselinama od 1439 do 1665 SEQ ID NO:2 ili aminokiselinama 2333 do 2559 od SEQ ID NO:6. U jednom slučaju, drugi deo sadrži aminokiseline 1439 do 1665 SEQ ID NO:2 ili aminokiselinama 2333 do 2559 od SEQ ID NO:6.
[0033] U drugom slučaju, FVIII-Fc polipeptid se daje kao deo farmaceutskog sastava koji sadrži najmanje jedan ekscipijens.
[0034] Obelodanjivanje takođe obezbeđuje postupak za određivanje da li je ispitanik sa dijagnozom poremećaja krvarenja kandidat za doziranje dugog intervala sa dugo-delujućim FVIII polipeptidom, koji obuhvata merenje nivoa ekspresije VWF plazme, pri čemu nivo ekspresije VWF od najmanje 100 IU/dL ukazuje da je ispitanik kandidat za doziranje dugog intervala upotrebom dugo-delujućeg FVIII polipeptida. U jednom slučaju, ekspresija VWF je barem oko 110 IU/dL, oko 120 IU/dL, oko 130 IU/dL, oko 140 IU/dL, oko 150 IU/dL, oko 160 IU/dL, oko 170 IU/dL, oko 180 IU/dL, oko 190 IU/dL ili oko 200 IU/dL.
[0035] Obelodanjivanje takođe obezbeđuje postupak za određivanje da li je ispitanik sa dijagnozom poremećaja krvarenja kandidat za dugotrajno doziranje dugo-delujućeg FVIII polipeptida, koji obuhvata merenje poluživota FVIII-Fc u navedenom ispitaniku, pri čemu polu-raspad koji je najmanje oko 1.2 puta veći od poluživota FVIII-Fc kada se daje subjektu sa prosečnim nivoima VWF označava da je ispitanik kandidat za doziranje dugog intervala. U jednom slučaju, polu-raspad FVIII-Fc u navedenom subjektu je najmanje oko 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 ili 2.5 puta veći od poluživota FVIII-Fc kada se daje subjektu sa prosečnim nivoima VWF.
[0036] Obelodanjivanje takođe obezbeđuje postupak za određivanje da li je ispitanik sa dijagnozom poremećaja krvarenja kandidat za dugotrajno doziranje dugo-delujućeg FVIII polipeptida, koji obuhvata merenje poluživota kratko-delujućeg FVIII-Fc u navedenom ispitaniku, pri čemu polu-raspad koji je najmanje oko 1.2 puta veći od poluživota kratkodelujućeg FVIII-Fc kada se daje subjektu sa prosečnim nivoima VWF označava da je ispitanik kandidat za doziranje dugog intervala. U jednom slučaju, polu-raspad je najmanje oko 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 ili 2.5 puta veći od poluživota FVIII-Fc kada se daje subjektu sa prosečnim nivoima VWF.
KRATAK OPIS CRTEŽA/SLIKA
[0037]
SL. 1. Šematski prikaz rFVIIIFc monomera.
SL-e. 2A-E. A-B. Neredukovanje i smanjenje SDS-PAGE analize rFVIIIFc (obrađene ili jednolančane). C. rFVIIIFc analizirana struktura LC/UV i LC/MS. D.
Hromatogram ukupne jonske struje (TIC) (LC/MS mapa) rFVIIIFc nakon cepanja trombina. Označeni su glavni proizvodi za varenje. E. Dekonvoluirani maseni spektar A2 domena rFVIIIFc i rBDDFVIII. Navedeni su glavni proizvodi i njihove srodne
1
mase, koje odgovaraju A2 domenu trombina (S373 do R740) i dva skraćena proizvoda, S373 do Y729 i S373 do E720.
SL-e. 3A-C. Biohemijska karakterizacija rFVIII-Fc:A. Aktivacija faktora X kao funkcije koncentracije fosfolipidnih vezikula; B. Aktivacija faktora X kao funkcije koncentracije FX. C. Aktivacija faktora X kao funkcije koncentracije faktora IXa. Sl. 4 Aktivacija faktora X posle odvajanja aktiviranim proteinom C.
SL-e. 5A-D. Posmatrane grupe ukazuju na aktivnost FVIII (±SE) u odnosu na vremenske profile, sortirane prema nivou doze, grupisane po jedinjenju (test jedne faze, 25 IU/kg (A) ili 65 IU/kg (B); i hromogeni test, 25 IU/kg (C) ili 65 IU/kg (D)) u odnosu na vreme.
SL-e. 6A-B. Posmatrane grupe ukazuju na aktivnost FVIII (±SE) grupisane u odnosu na vremenske profile, prema nivou doze i prema jedinjenju (test jedne faze kg (A) ili hromogeni test (B)) u odnosu na vreme.
SL-e. 7(A)-(C). In vivo Efikasnost jednog lanca FVIII:Fc u modelu transekcije vena repa miša HemA. (A) Jednolančani rFVIII:Fc doze su prikazane kao kvadrati, a obrađene doze rFVIII:Fc su prikazane kao krugovi. (B) Procenat preživljavanja nakon preseka vene repa od 4.6 µg/kg, 1.38 µg/kg i 0.46 µg/kg rFVIIIFc ili SC rFVIIIFc. (C) Procenat nekrvarenja nakon preseka vene repa od 4.6 µg/kg (crni krug ili obrnuti trougao), 1.38 µg/kg (trokut ili dijamant) i 0.46 µg/kg (kvadratni i sivi krug) rFVIIIFc ili SC rFVIIIFc, respektivno.
SL. 8. Dizajn ispitivanja. Slika 8 prikazuje dizajn ispitivanja faze 1/2a, koja je bila doza-eskalacija, sekvencijalni dizajn za procenu bezbednosti i PK rFVIIIFc u poređenju sa ADVATE® nakon jedne intravenske doze od 25 IU/kg (niska doza Kohorte A) ili 65 IU/kg (visoke doze Kohorte B).
SL. 9. Veza aktivnosti rFVIII pomoću jedne faze (aPTT) i hromogenih testova. Veza između rezultata jednofaznog zgrušavanja (aPTT) i rezultata hromogenog testa merenja aktivnosti FVIII (IU/mL) nakon injekcije ADVATE® (◆) i rFVIIIFc (□). SL-e. 10(A)-(B). Aktivnost grupe FVIII za srednju plazmu farmakokinetičkog profila za niske doze i visoke doze Kohorte. Aktivnost FVIII u plazmi (jedna faza aPTT testa) u odnosu na vremensku krivu nakon jedne intravenske injekcije rFVIIIFc ili ADVATE® prikazana je za (A) 25 IU/kg (niske doze Kohorte, n=6); i (B) 65 IU/kg (visoke doze Kohorte, n=10 [ADVATE®]; n=9 [rFVIIIFc]). Prikazani rezultati su srednja vrednost ± standardna greška srednje vrednosti (SEM).
SL-e. 11(A)-(B). Uticaj nivoa antigena VWF na Cl i t1/2aktivnosti FVIII nakon injekcije ADVATE® ili rFVIIIFc. Veza između nivoa VWF antigena i (A) Cl ADVATE® sa podešenom težinom (R<2>=0.5415 i p=0.0012) i rFVIIIFc (R<2>=0.5492 i p=0.0016); i (B) t1/2ADVATE® (R<2>=0.7923 i p<0.0001) i rFVIIIFc (R<2>= 0.6403 i p=0.0003). Svaka tačka predstavlja pojedinačnog ispitanika.
SL-e. 12(A)-(B). ROTEM® Ex Vivo cele krvi za pojedinačne ispitanike nakon injekcije ADVATE® ili rFVIIIFc. Uzorci krvi uzimani su od ispitanika pre i posle tretmana u dozama (A) 25 IU/kg ADVATE® i rFVIIIFc; i (B) 65 IU/kg ADVATE® i rFVIIIFc u određenim vremenskim tačkama. Vreme koagulacije je određeno NATEM-om iniciranim sa Ca++ na ROTEM® instrumentu. Prikazani rezultati su srednja ± standardna greška srednje vrednosti (SEM) iz trostrukih očitavanja kanala za svaki pojedinačni uzorak.
SL-e. 13(A)-(B). Poređenje aktivnosti u testu generisanja trombina (TGA). (A) SC rFVIIIFc je pokazao smanjeni endogeni potencijal trombina (ETP), i (B) smanjeni vrh trombina u poređenju sa rFVIIIFc.
SL-e. 14(A)-(C):In vitro ROTEM podaci. ROTEM (NATEM) rezultati (srednji±SD) za različite koncentracije XYNTHA, ADVATE < i rFVIIIFc su dostigli vrhunac su u celokupnoj krvi dobijenoj od naivnih HemA miševa. (A). Prosečno vreme zgrušavanja (CT) (Slika 14A), (B). vreme formiranja ugruška (CFT), i (C). alfa ugao. SL-e. 15(A)-(C). Ex vivo ROTEM podaci. ROTEM (NATEM) rezultati (srednji±SD) iz HemA miševa nakon jedne intravenske primene 50 IU/kg XYNTHA, ADVATE ili rFVIIIFc 5 minuta, 24, 48, 72 i 96 sati nakon doziranja. (A). Prosečno vreme formiranja ugruška (CT), (B). Vreme formiranja ugruška (CFT) i (C). alfa ugao. SL-e. 16(A)-(E):Evaluacija u realnom vremenu interakcije rFVIIIFc i jednolančanog (SC) rFVIIIFc sa vWF i realnom vremenu procene trombina posredovanog oslobađanja rFVIIIFc i SC rFVIIIFc iz vWF. (A). Analiza površinske plazmonske rezonance (SPR) rFVIIIFc i SC rFVIIIFc afiniteta za vWF. Prikazane su krive vezivanja i model interakcije 1:1. X-osa pokazuje vreme u sekundama, a y-osa pokazuje odgovor u jedinicama za odgovor (RU). (B). Senzogrami kojima je oduzeta referenca oslobađanja aktiviranog rFVIIIFc, SC rFVIIIFc i B-domena sa rFVIII koji nemaju Fc ostatke (rBDD FVIII) na 25° C (vrh) i 37° C (dno). X-osa pokazuje vreme u sekundama, a y-osa pokazuje odgovor u jedinicama za odgovor (RU). Pojedinačne linije ukazuju na odgovor na različite koncentracije α-trombina. Najviša linija je odgovor na 0 U/mL α-trombina, a svaka naredna linija je u redu za koncentracije αtrombina od 0.005, 0.01, 0.02, 0.04, 0.08, 0.16, 0.31, 0.63, 1.3, 2.5, 5, 10 i 20 U/mL. (C). Dvostruki senzogrami kojima je oduzeta referenca faze oslobađanja posredovane trombinom za rFVIIIFc, SC rFVIIIFc i rBDD FVIII na 25° C (vrh) i 37° C (dno). X-osa pokazuje vreme u sekundama, a y-osa pokazuje odgovor u jedinicama za odgovor (RU). Pojedinačne linije ukazuju na odgovor na različite koncentracije α-trombina. Najviša linija je odgovor na 0 U/mL α-trombina, a svaka naredna linija je u redu za koncentracije α-trombina od 0.005, 0.01, 0.02, 0.04, 0.08, 0.16, 0.31, 0.63, 1.3, 2.5, 5,0, 10 i 20 U/mL. (D). Brzina oslobađanja posredovana trombinom kao funkcija vremena za rFVIIIFc, SC rFVIIIFc, i rBDD FVIII na 25° C (vrh) i 37° C (dno). X-osa pokazuje vreme u sekundama, a y-osa pokazuje odgovor u jedinicama za odgovor (RU). Pojedinačne linije ukazuju na odgovor na različite koncentracije α-trombina. Najviša linija je odgovor na 20 U/mL α-trombina, a svaka naredna linija je u redu za koncentracije α-trombina od 10, 5, 2.5, 1.3, 0.63, 0.31, 0.16, 0.08, 0.04, 0,02, 0,01 i 0,005 U/mL. (E). Maksimalna brzina otpuštanja posredovana trombinom kao funkcija koncentracije trombina za rFVIIIFc, SC rFVIIIFc, i rBDD FVIII na 25° C (vrh) i 37° C (dno). EC50je polovina maksimalne efektivne koncentracije. X-osa je koncentracija a-trombina u U/mL, a y-osa je maksimalna brzina otpuštanja u RU/sekundi.
DETALJNI OPIS PRONALASKA
[0038] Predmetno obelodanjivanje obezbeđuje postupak za lečenje hemofilije A sa Faktorom VIII (obrađen, jednolančani ili njihova kombinacija) korišćenjem dužeg intervala doziranja i/ili veće AUC nego što je moguće sa trenutno poznatim proizvodima Faktora VIII.
Predmetno obelodanjivanje takođe obezbeđuje poboljšane himerne polipeptide faktora VIII i postupke proizvodnje.
[0039] Lečenje hemofilije A je zamenskom terapijom koja je usmerena na vraćanje aktivnosti FVIII na 1 do 5% normalnih nivoa kako bi se sprečilo spontano krvarenje (Mannucci, P.M., i dr., N. Engl. J. Med.344:1773-9 (2001)). Postoje proizvodi plazme i rekombinantni FVIII dostupni za lečenje epizoda krvarenja na zahtev ili za sprečavanje nastupanja epizoda krvarenja profilaktičkim lečenjem. Na osnovu kratkog poluživota ovih proizvoda (8-12 sati) (White G.C., i dr., Thromb. Haemost.77:660-7 (1997); Morfini, M., Haemophilia 9 (suppl 1):94-99; diskusija 100 (2003)), režimi lečenja zahtevaju često intravensko davanje, obično dva do tri puta nedeljno za profilaksu i jedan do tri puta dnevno za lečenje na zahtev (Manco-
1
Johnson, M.J., i dr., N. Engl. J. Med.357:535-544 (2007)). Takva česta primena je bolna i nezgodna.
[0040] Predmetno obelodanjivanje obezbeđuje postupak za davanje Faktora VIII humanom subjektu kome je to potrebno (npr., čovek pacijent), koji se sastoji od davanja ispitaniku terapeutske doze himernog polipeptida faktora VIII, npr., himernog faktora VIII-Fc polipeptida, ili hibrid takvog polipeptida u doznom intervalu najmanje oko jedan i po puta duži od intervala doziranja potrebnog za ekvivalentnu dozu navedenog Faktora VIII bez dela bez faktora VIII (polipeptid koji se sastoji od pomenutog dela Faktora VIII) npr., bez Fc dela. Ovaj pronalazak je takođe usmeren na postupak povećanja intervala doziranja davanja Faktora VIII kod čoveka kome je to potrebno, a koji se sastoji od davanja himernog polipeptida faktora VIII.
[0041] Interval doziranja može biti najmanje jedan do pola do šest puta duži, jedan i po do pet puta duži, jedan i po do četiri puta duži, jedan i po do tri puta duži, ili jedan i po do dva puta duže, nego interval doziranja potreban za ekvivalentnu dozu navedenog Faktora VIII bez dela bez faktora VIII (polipeptid koji se sastoji od pomenutog dela Faktora VIII), npr., bez Fc dela. Interval doziranja može biti najmanje oko jedne i po, dva, dva i po, tri, tri i po, četiri, četiri i po, pet, pet i po ili šest puta duže nego interval doziranja potreban za ekvivalentnu dozu navedenog Faktora VIII bez dela bez faktora VIII (polipeptid koji se sastoji od pomenutog dela Faktora VIII), npr., bez Fc dela. Interval doziranja može biti oko svaka tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest ili četrnaest dana ili duže.
[0042] Interval doziranja može biti najmanje jedan i po do 5, jedan i po, 2, 3, 4 ili 5 dana ili duže.
[0043] Predmetno obelodanjivanje takođe obezbeđuje postupak za davanje Faktora VIII humanom ispitaniku kome je to potrebno, koji se sastoji od davanja ispitaniku terapeutske doze himernog polipeptida faktora VIII, npr., himernog faktora VIII-Fc polipeptida ili hibrida takvog polipeptida da bi se dobila površina ispod krive koncentracije plazme u odnosu na vremensku krivu (AUC) najmanje oko jedne i jedne četvrtine puta veće od AUC dobijene ekvivalentnom dozom navedenog faktora VIII bez dela bez faktora VIII (polipeptid koji se sastoji od navedenog faktora VIII deo), npr., bez Fc dela. Predmetno obelodanjivanje tako obuhvata postupak povećanja ili produženja AUC aktivnosti faktora VIII kod čoveka pacijenta kod koga je to potrebno, a koji obuhvata primenu himernog polipeptida faktora VIII.
[0044] Predmetno obelodanjivanje takođe obezbeđuje postupak za davanje Faktora VIII ispitaniku kome je to potrebno, koji se sastoji od davanja subjektu terapeutske doze polipeptida koji sadrži Faktor VIII i Fc ili hibrid takvog polipeptida u intervalu doziranja od oko svakog tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest ili četrnaest dana ili duže.
[0045] Postupak iz obelodanjivanja mogu se praktikovati na ispitaniku kome je potreban profilaktički tretman ili tretman na zahtev.
[0046] "Davanje", kako se ovde koristi, znači dati farmaceutski prihvatljiv polipeptid Faktora VIII iz ovog pronalaska subjektu putem farmaceutski prihvatljivog puta. Načini davanja mogu biti intravenski, npr., intravenska injekcija i intravenska infuzija. Dodatni putevi davanja uključuju, npr., subkutano, intramuskularno, oralno, nazalno i pulmonalno davanje. Himerni polipeptidi i hibridni proteini mogu biti davani kao deo farmaceutskog sastava koji sadrži najmanje jedan ekscipijens.
[0047] "Površina ispod krive koncentracije plazme u odnosu na vremensku krivu (AUC)", "kako se ovde koristi, je ista kao termin u farmakologiji i zasniva se na brzini i obimu apsorpcije faktora VIII nakon davanja. AUC se određuje u određenom vremenskom periodu, kao što je 12, 18, 24, 36, 48 ili 72 sata ili za beskonačnost korišćenjem ekstrapolacije zasnovane na nagibu krive. Ukoliko ovde nije drugačije naznačeno, AUC je određen za beskonačnost. Određivanje AUC može se izvršiti u jednom ispitanik, ili u populaciji ispitanika za koje se izračunava prosek.
[0048] "B domen" Faktora VIII, kako je ovde korišćen, je isti kao i B domen poznat u struci koji je definisan unutrašnjim identitetom aminokiselinske sekvence i mestima proteolitičkog cepanja trombinom, npr., ostaci Ser741-Arg1648 pune dužine humani faktor VIII. Drugi domeni humanog faktora VIII su definisani sledećim aminokiselinskim ostacima:A1, ostaci Ala1-Arg372; A2, ostaci Ser373-Arg740; A3, ostaci Ser1690-Ile2032; C1, ostaci Arg2033-Asn2172; C2, ostaci Ser2173-Tyr2332. Sekvenca A3-C1-C2 uključuje ostatke Ser1690-
1
Tyr2332. Preostala sekvenca, ostaci Glu1649-Arg1689, obično se nazivaju peptid aktivacije lakog lanca faktora VIII. Položaji granica za sve domene, uključujući B domene, za svinjski, mišji i pseći faktor VIII su takođe poznati u tehnici. U jednom otelotvorenju, B domen Faktora VIII se briše ("faktor VIII" koji je izbrisan sa B domena ili "BDD FVIII"). Primer BDD FVIII je REFACTO® (rekombinantni BDD FVIII), koji ima istu sekvencu kao deo Faktora VIII sekvence u Tabeli 2A (i) (aminokiseline 1 do 1457 ili 20 do 1457 SEQ ID NO:2). U još jednom otelotvorenju, faktor VIII koji je izbrisan iz B domena sadrži netaknuto intracelularno mesto za obradu, koje odgovara argininu na ostatku 754 B domena koji je izbrisan Faktor VIII, koji odgovara ostatku arginina 773 SEQ ID NO:2, ili ostatak 1648 Faktora VIII pune dužine, koji odgovara ostatku arginina 1667 SEQ ID NO:6. Brojevi sekvenci koji su ovde korišćeni bez pozivanja na bilo koje SEQ ID brojeve odgovaraju sekvenci faktora VIII bez sekvence signalnog peptida (19 aminokiselina) ako nije drugačije naznačeno. Na primer, S743/Q1638 faktora VIII pune dužine odgovara S762/Q1657 SEQ ID NO:6 usled sekvence signalnog peptida od 19 aminokiselina. U drugim otelotvorenjima, B domen izbrisani FVIII sadrži supstituciju ili mutaciju na položaju aminokiseline koja odgovara argininu 1645, supstituciju ili mutaciju na položaju aminokiseline koja odgovara argininu 1648, ili supstituciju ili mutaciju na položajima aminokiselina koji odgovaraju argininu 1645 i argininu 1648 u Faktoru VIII pune dužine. U nekim otelotvorenjima, aminokiselina supstituisana na položaju aminokiseline koja odgovara argininu 1645 je različita aminokiselina od aminokiseline supstituisane na položaju aminokiseline koja odgovara argininu 1648. U nekim otelotvorenjima, supstitucija ili mutacija je aminokiselina drugačija od arginina, npr., alanin.
[0049] "Faktor VIII koji je izbrisan iz B domena" može imati potpuno ili delimično brisanje opisano u patentima SAD br..6,316,226, 6,346,513, 7,041,635, 5,789,203, 6,060,447, 5,595,886, 6,228,620, 5,972,885, 6,048,720, 5,543,502, 5,610,278, 5,171,844, 5,112,950, 4,868,112 i 6,458,563. U nekim otelotvorenjima, sekvenca faktora VIII koja je izbrisana sa B domena ovog pronalaska sadrži bilo koju od delecija opisanih u kol.4, red 4 do kol.5, red 28 i primeri 1-5 iz patenta SAD br.6,316,226 (takođe u US 6,346,513). U nekim otelotvorenjima, faktor VIII koji je izbrisan iz B domena ovog pronalaska ima deleciju opisanu u kol.2, redovi 26-51 i primeri 5-8 iz patenta SAD br.5,789,203 (takođe US 6,060,447, US 5,595,886 i US 6,228,620). U nekim otelotvorenjima, faktor VIII koji je izbrisan iz B domena ima deleciju opisanu u kol.1, red 25 do kol.2, red 40 iz patenta SAD br. 5,972,885; kol.6, redovi 1-22 i primer 1 patenta SAD br.6,048,720; kol.2, redovi 17-46
1
patenta SAD br.5,543,502; kol.4, red 22 do kol.5 red 36 patenta SAD br.5,171,844; kol.2, redovi 55-68 slika 2 i primer 1 patenta SAD br.5,112,950; kol.2, redovi 2 do kol.19, red 21 i tabela 2 patenta SAD br.4,868,112; kol.2, red 1 do kol.3, red 19, kol.3, red 40 do kol.4, red 67, kol.7, red 43 do kol.8, red 26, i kol.11, red 5 do kol.13, red 39 iz patenta SAD br.
7,041,635; ili kol.4, redovi 25-53 patenta SAD br.6,458,563; U nekim otelotvorenjima, faktor VIII izbrisan iz B domena ima deleciju većine B domena, ali još uvek sadrži aminoterminalne sekvence B domena koje su neophodne za in vivo proteolitičku obradu primarnog translacionog proizvoda u dva polipeptidna lanca (tj., intracelularno mesto za obradu), kao što je obelodanjeno u WO 91/09122. U nekim otelotvorenjima, faktor VIII koji je izbrisan iz B domena je konstruisan sa delecijom aminokiselina 747-1638, tj., praktično potpunim brisanjem B domena. Hoeben R.C., i dr. J. Biol. Chem. 265 (13):7318-7323 (1990). Faktor VIII izbrisan iz B domena može takođe da sadrži deleciju aminokiselina 771-1666 ili aminokiselina 868-1562 faktora VIII. Meulien P., i dr. Protein Eng.2(4):301-6 (1988).
Dodatna brisanja B domena koja su deo pronalaska uključuju, npr.,:delecija aminokiselina 982 do 1562 ili 760 do 1639 (Toole i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 83:5939-5942 (1986)), 797 do1562 (Eaton i dr., Biochemistry 25:8343-8347 (1986)), 741 do1646 (Kaufman (PCT objava prijave Br. WO 87/04187)), 747-1560 (Sarver i dr., DNA 6:553-564 (1987)), 741 do 1648 (Pasek (PCT prijava Br.88/00831)), 816 do 1598 ili 741 do 1689 (Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988) No 82:16-25, EP 295597)). Svaka od prethodnih delecija može biti napravljena u bilo kojoj sekvenci faktora VIII.
[0050] U jednom otelotvorenju, deo faktora VIII koji je izbrisan iz B domena u himernom polipeptidu se prerađuje u dva lanca povezana (ili povezana) metalnom vezom, prvi lanac koji sadrži teški lanac (A1-A2-delimični B) i drugi lanac koji sadrži laki lanac (A3-C1-C2). U još jednom otelotvorenju, deo faktora VIII koji je izbrisan iz B domena je faktor VIII sa jednim lancem. Faktor VIII sa jednim lancem može sadržati intracelularno mesto za obradu, koje odgovara argininu na ostatku 754 izbrisanog F domena B (ostatak 773 SEQ ID NO:2) ili na ostatku 1648 Faktora VIII pune dužine (ostatak 1657 SEQ ID NO:6).
[0051] Metalna veza između teškog lanca i lakog lanca može biti bilo koji metal poznat u struci. Na primer, metali korisni za pronalazak mogu biti dvovalentni metalni joni. Metali koji se mogu koristiti za povezivanje teškog lanca i lakog lanca uključuju, ali nisu ograničeni na,Ca<2+>, Mn<2+>ili CU<2+>. Fatouros i dr., Intern. J. Pharm.155(1):121-131 (1997); Wakabayashi i dr., JBC.279(13):12677-12684 (2004).
1
[0052] "Himerni polipeptid", kako se ovde koristi, označava polipeptid koji uključuje u sebi najmanje dva polipeptida (ili podsekvence ili peptide) iz različitih izvora. Himerni polipeptidi mogu uključivati, npr., dva, tri, četiri, pet, šest, sedam ili više polipeptida iz različitih izvora, kao što su različiti geni, različite cDNK, ili različite životinje ili druge vrste. Himerni polipeptidi mogu uključivati, npr., jedan ili više veznika koji spajaju različite sekvence.
Prema tome, podsekvence se mogu direktno spojiti ili se mogu povezati indirektno, preko veznika, ili oboje, unutar jednog himernog polipeptida. Himerni polipeptidi mogu uključivati, npr., dodatne peptide kao što su signalne sekvence i sekvence kao što su 6His i FLAG koji pomažu u prečišćavanju proteina ili detekciji. Pored toga, himerni polipeptidi mogu imati aminokiselinske ili peptidne dodatke na N- i/ili C-krajeve.
[0053] U nekim otelotvorenjima, himerni polipeptid sadrži deo faktora VIII i deo ne-faktora VIII. Primeri delova ne-faktora VIII uključuju, na primer, Fc, XTEN, albumin, PAS sekvencu, transferin, CTP (C-terminalni peptid sa 28 aminokiselina (CTP) humanog horionskog gonadotropina (hCG) sa 4 O-glikana), polietilen glikol (PEG), hidroksietil skrob (HES), albumin vezujući polipeptid, i mali molekuli koji vezuju albumin. Primeri himernih polipeptida pronalaska obuhvataju, na primer, himerne faktore VIII-Fc polipeptide, himerne faktore VIII-XTEN polipeptide, himerne faktore VIII-albumin polipeptide, himerne faktore VIII-PAS polipeptide, himerni faktor VIII-transferin polipeptide, himerni faktor VIII-CTP polipeptidi, himerni faktor VIII-PEG polipeptidi, himerni faktor VIII-HES polipeptidi, himerni Faktor VIII-albumin vezujući polipeptidi, i himerni faktor VIII.-albumin-vezujućih polipeptida malih molekula.
[0054] Primeri himernih polipeptida faktora VIII-Fc uključuju, npr., SEQ ID NO:2 ili 6 (Tabela 2), sa ili bez njihovih signalnih sekvenci i himernog Fc polipeptida sa SEQ ID NO:4 (Tabela 2).
[0055] Himerni polipeptid može da sadrži sekvencu koja je najmanje 90% ili 95% identična sekvenci faktora VIII i Fc aminokiselina prikazanoj u Tabeli 2A (i) bez signalne sekvence (aminokiseline 20 do 1684 od SEQ ID NO:2) ili najmanje 90% ili 95% identična sekvenci faktora VIII i Fc aminokiselinske sekvence prikazane u Tabeli 2A (i) sa signalnom sekvencom (aminokiseline 1 do 1684 od SEQ ID NO:2), gde sekvenca ima aktivnost faktora VIII. Aktivnost Faktora VIII može se meriti aktiviranim delimičnim tromboplastinskim
1
vremenom (aPPT) testom, hromogenim testom ili drugim poznatim postupcima. Himerni polipeptid može sadržati sekvencu identičnu faktoru VIII i Fc aminokiselinskoj sekvenci prikazanoj u Tabeli 2A (i) bez signalne sekvence (aminokiseline 20 do 1684 od SEQ ID NO:2) ili identične sa Faktorom VIII i Fc aminokiselinske sekvence prikazane u Tabeli 2A (i) sa signalnom sekvencom (aminokiseline 1 do 1684 SEQ ID NO:2).
[0056] Kao što je iznad diskutovano, primeri himernih polipeptida uključuju Faktor VIII spojen za jedan ili više XTEN polipeptida. Schellenburger i dr., Nat. Biotech. 27:1186-90 (2009). XTEN polipeptid može biti fuzionisan ili na N-terminalni kraj FVIII ili na C-terminalni kraj FVIII. Mesto proteaze može biti uključeno između XTEN dela i dela Faktora VIII da bi se omogućila takva obrada. XTEN polipeptidi uključuju, npr., one obelodanjene u WO 2009/023270, WO 2010/091122, WO 2007/103515, US 2010/0189682, i US 2009/0092582.
[0057] Kao što je iznad razmotreno, primeri himernih polipeptida takođe uključuju Faktora VIII fuzionisan za jedan ili više albumin polipeptida, albumin vezujućih polipeptida, ili male molekule koji vezuju albumin. U jednom otelotvorenju, albumin je humani albumin. Protein koji vezuje albumin ili albumin može se spojiti ili sa N-terminalnim krajem FVIII ili sa C-terminalnim krajem FVIII ili umetnuti između dve aminokiseline u FVIII. Poznati su primeri albumina, npr., njihovi fragmenti, koji se mogu koristiti u ovom pronalasku. npr., patentu SAD br.7,592,010; patentu SAD br.6,686,179; i Schulte, Thrombosis Res. 124 Suppl.2:S6-S8 (2009).
[0058] Polipeptidi koji vezuju albumin mogu da sadrže, bez ograničavanja, bakterijske domene za vezivanje albumina, peptide koji vezuju albumin ili fragmente antitela koji se vezuju za albumin koji se mogu vezati za albumin. Domen 3 od proteina G streptokoka, kao što je opisano Kraulis i dr., FEBS Lett.378:190-194 (1996) i Linhult i dr., Protein Sci.
11:206-213 (2002) je primer bakterijskog domena za vezivanje albumina. Primeri peptida koji vezuju albumin uključuju niz peptida koji imaju sekvencu jezgra DICLPRWGCLW (SEQ ID NO:7). Videti npr., Dennis i dr., J. Biol. Chem. 2002, 277:35035-35043 (2002). Primeri fragmenata antitela koji se vezuju za albumin su obelodanjeni u Muller and Kontermann, Curr. Opin. Mol. Ther.9:319-326 (2007); Rooverset i dr., Cancer Immunol. Immunother. 56:303-317 (2007) i Holt i dr., Prot. Eng. Design Sci., 21:283-288 (2008).
1
[0059] U određenim aspektima, rekombinantni FVIII polipeptid pronalaska sadrži najmanje jedno mesto vezivanja za ne-polipeptidni mali molekul, varijantu ili derivat koji se može vezati za njegov albumin. Primer takvih vezujućih grupa albumina je 2-(3-maleimidopropanamido)-6-(4-(4-jodofenil)butanamido)heksanoat ("Albu" oznaka) kako je opisano u Trusselet i dr., Bioconjugate Chem. 20:2286-2292 (2009).
[0060] Kao što je gore razmotreno, primeri himernih polipeptida takođe obuhvataju Faktora VIII fuzionisan za najmanje jednu p podjedinicu C-terminalnog peptida (CTP) humanog horionskog gonadotropina ili njegovog fragmenta, varijante ili derivata. CTP se može vezati na Faktor VIII ili na N-terminalni kraj FVIII ili na C-terminalni kraj FVIII ili umetnuti između dve aminokiseline u FVIII. Poznato je da jedan ili više CTP peptida spojenih ili ubačenih u rekombinantni protein povećavaju polu-raspad in vivo tog proteina. Videti npr., patent SAD br.5,712,122. Primeri CTP peptida uključuju DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL (SEQ ID NO:8) ili SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ. (SEQ ID NO:9). Videti npr., objava patentne prijave SAD br. US 2009/0087411 A1.
[0061] Kao što je gore razmotreno, primeri himernih polipeptida takođe obuhvataju Faktora VIII vezan za najmanje jednu PAS sekvencu ili njegov fragmenta, varijantu ili derivat. PAS sekvenca se može vezati na N-terminalni kraj FVIII ili na C-terminalni kraj FVIII ili umetnuti između dve aminokiseline u FVIII. PAS peptid ili PAS sekvenca, kako se ovde koristi, označava aminokiselinsku sekvencu koja sadrži uglavnom alaninske i serinske ostatke ili sadrži uglavnom alaninske, serinske i prolinske ostatke, aminokiselinska sekvenca koja formira konformaciju slučajnog kalema pod fiziološkim uslovima. Shodno tome, PAS sekvenca je blok za izgrađivanje, aminokiselinski polimer, ili kaseta sekvence koja sadrži, koji se sastoji, u suštini od, ili se sastoji od alanina, serina i prolina koji se mogu koristiti kao deo heterologne grupe u himernom proteinu. Polimer aminokiseline takođe može da formira konformaciju slučajnog kalema kada se ostaci koji nisu alanin, serin i prolin dodaju kao manji konstituent u PAS sekvenci. Pod "manjim konstituentom" misli se da aminokiseline koje nisu alanin, serin i prolin mogu da se dodaju u PAS sekvenci do određenog stepena, npr., do oko 12%, tj., oko 12 od 100 aminokiselina PAS sekvence, do oko 10%, do oko 9%, do oko 8%, oko 6%, oko 5%, oko 4%, oko 3%, tj., oko 2%, ili oko 1%, amino kiselina .
Aminokiseline koje se razlikuju od alanina, serina i prolina kabine mogu biti izabrane iz grupe koja se sastoji od Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr,
2
Trp, Tyr i Val. Pod fiziološkim uslovima, PAS peptid formira konformaciju slučajnog kalema i na taj način može posredovati povećanu in vivo i/ili in vitro stabilnost na rekombinantni protein iz pronalaska i ima prokoagulantnu aktivnost.
[0062] Neograničavajući primeri PAS peptida uključuju ASPAAPAPASPAAPAPSAPA (SEQ ID NO:10), AAPASPAPAAPSAPAPAAPS (SEQ ID NO:11), APSSPSPSAPSSPSPASPSS (SEQ ID NO:12), APSSPSPSAPSSPSPASPS (SEQ ID NO:13), SSPSAPSPSSPASPSPSSPA (SEQ ID NO:14), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (SEQ ID NO:15), ASAAAPAAASAAASAPSAAA (SEQ ID NO:16) ili bilo koje njihove varijante, derivati, fragmenti ili njihove kombinacije. Dodatni primeri PAS sekvenci su poznati iz, npr., patent SAD. obj. br.2010/0292130 A1 i PCT objava prijave br. WO 2008/155134 A1.
Evropski izdati patent EP2173890.
[0063] Kao što je gore razmotreno, primeri himernih polipeptida takođe obuhvataju Faktora VIII vezan za najmanje jedan transferinski peptid ili njegov fragmenta, varijantu ili derivat. Najmanje jedan peptid transferina može biti fuzionisan ili na N-terminalni kraj FVIII ili na C-terminalni kraj FVIII ili umetnut između dve aminokiseline u FVIII. Bilo koji transferin može biti fuzionisan ili ubačen u rekombinantni FVIII protein iz pronalaska. Kao primer, humani Tf (Tf) divljeg tipa je protein od 679 aminokiselina, približno 75 KDa (ne računajući glikozilaciju), sa dva glavna domena, N (oko 330 aminokiselina) i C (oko 340 aminokiselina), koji izgleda da potiču od dupliranja gena. Videti GenBank pristupni brojevi NM001063, XM002793, M12530, XM039845, XM 039847 i S95936 (www.ncbi.nlm.nih.gov).
[0064] Transferin prenosi gvožđe preko endocitoze posredovane receptorom transferina (TfR). Nakon što se gvožđe ispusti u endosomalni prostor, a Tf-TfR kompleks se reciklira na površinu ćelije, Tf se oslobađa nazad u ekstracelularni prostor za sledeći ciklus transporta gvožđa. Tf poseduje duži polu-raspad koji je veći od 14-17 dana (Li i dr., Trends Pharmacol. Sci. 23:206-209 (2002)). Fuzioni proteini za transferin proučavani su za produženje poluživota, ciljanu terapiju za terapiju kancera, oralnu primenu i kontinuiranu aktivaciju proinsulina (Brandsma i dr., Biotechnol. Adv., 29:230-238 (2011); Bai i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:7292-7296 (2005); Kim i dr., J. Pharmacol. Exp. Ther., 334:682-692 (2010); Wang i dr., J. Controlled Release 155:386-392 (2011)).
[0065] Kao što je gore razmotreno, primeri himernih polipeptida takođe uključuju Faktor VIII fuzionisan za najmanje jednu polietilen glikolnu (PEG) grupu.
[0066] PEGilovani FVIII se može odnositi na konjugat formiran između FVIII i najmanje jednog molekula polietilen glikola (PEG). PEG je komercijalno dostupan u velikom broju molekulskih težina i srednjih opsega molekulske težine. Tipični primeri PEG-ovih srednjih opsega molekulske težine uključuju, ali nisu ograničeni na, oko 200, oko 300, oko 400, oko 600, oko 1000, oko 1300-1600, oko 1450, oko 2000, oko 3000, oko 3000-3750, oko 3350, oko 3000-7000, oko 3500-4500, oko 5000-7000, oko 7000-9000, oko 8000, oko 10000, oko 8500-11500, oko 16000-24000, oko 35000, oko 40000, oko 60000 i oko 80000 daltona. Ove prosečne molekulske težine su date samo kao primeri i nisu predviđene da budu ograničavajuće na bilo koji način.
[0067] Rekombinantni FVIII protein iz pronalaska se može PEGilovati tako da uključuje mono- ili poli- (npr., 2-4) PEG grupe. PEGilacija se može izvesti bilo kojom reakcijom PEGilacije koja je poznata u stanju tehnike. Postupci za pripremu PEGilovanog proteinskog proizvoda će generalno uključivati (i) reakciju polipeptida sa polietilen glikolom (kao što je reaktivni estar ili aldehidni derivat PEG) pod uslovima u kojima peptid pronalaska postaje vezan za jednu ili više PEG grupa; i (ii) dobijanja proizvoda reakcije. Generalno, optimalni uslovi reakcije za reakcije će se odrediti od slučaja do slučaja na osnovu poznatih parametara i željenog rezultata.
[0068] Postoji veliki broj PEG postupaka vezivanja dostupnih stručnjacima, na primer Malik F i dr., Exp. Hematol.20:1028-35 (1992); Francis, Focus on Growth Factors 3(2):4-10 (1992); Evropski pat. obj. br. EP0401384, EP0154316, i EP0401384; i međunarodna pat. prij. obj. br. WO92/16221 i WO95/34326. Kao neograničavajući primer, FVIII varijante mogu da sadrže cisteinske supstitucije na jednom ili više mesta ubacivanja u FVIII, a cisteini se dalje mogu konjugovati sa PEG polimerom. Videti Mei i dr., Blood 116:270-279 (2010) i patent SAD br.7,632,921.
[0069] Kao što je iznad razmotreno, primeri himernih polipeptida takođe obuhvataju Faktor VIII fuzionisan za najmanje jedan polimer hidroksietilnog skroba (HES). HES je derivat prirodnog amilopektina i razgrađuje se alfa-amilazom u telu. HES pokazuje povoljna biološka svojstva i koristi se kao sredstvo za zamenu zapremine krvi i za terapiju hemodilucije u klinikama. Videti, npr., Sommermeyer i dr., Krankenhauspharmazie 8:271-278 (1987); i Weidler i dr., Arzneim.-Forschung/Drug Res. 41:494-498 (1991).
[0070] HES se uglavnom karakteriše raspodelom molekulske težine i stepenom supstitucije. HES ima srednju molekulsku masu (srednja težina) od 1 do 300 kD, od 2 do 200kD, od 3 do 100 kD, ili od 4 do 70kD. Hidroksietil skrob može dalje da pokazuje molarni stepen supstitucije od 0.1 do 3, od 0.1 do 2, od 0.1 do 0.9, ili od 0.1 do 0.8, i odnos između supstitucije C2:C6 u opsegu od 2 do 20 u odnosu na na hidroksietilne grupe. HES sa srednjom molekulskom masom od oko 130 kD je Voluven® od Freseniusa. Voluven® je veštački koloid, koji se koristi, npr., za zamenu zapremine koji se koristi u terapijskoj indikaciji za terapiju i profilaksu hipovolemije. Postoji veliki broj HES postupaka vezivanja dostupnih onima koji su verzirani u stanje tehnike, npr., isti PEG postupci vezivanja koji su iznad opisani.
[0071] U nekim otelotvorenjima, himerni polipeptid koji sadrži deo Faktora VIII ima povećani polu-raspad (t1/2) u odnosu na polipeptid koji se sastoji od istog dela Faktora VIII bez dela Faktora VIII. Himerni polipeptid Faktora VIII sa povećanim t1/2 može se ovde navesti kao dugo-delujući Faktor VIII. Dugo-delujući himerni polipeptidi faktora VIII uključuju, npr., Faktor VIII fuzionisan za Fc (uključujući, npr., himerne polipeptide faktora VIII u obliku hibrida kao što je FVIIIFc monomerni dimer hibrid; videti Primer 1, Sliku 1 i Tabelu 2A; i patente SAD br.7,404,956 i 7,348,004), Faktor VIII vezan za XTEN, i Faktor VIII vezan za albumin.
[0072] "Kultura", "kulturi" i "kultivacija", kako se ovde koristi, označava inkubaciju ćelija pod uslovima in vitro koji omogućavaju rast ćelija ili deljenje ili održavanje ćelija u živom stanju. "Kultivisane ćelije", kako se ovde koriste, označavaju ćelije koje se propagiraju in vitro.
[0073] "Faktor VIII", kako se ovde koristi, označava polipeptid funkcionalnog faktora VIII u njegovoj normalnoj ulozi u koagulaciji, ako nije drugačije naznačeno. Tako, termin Faktor VIII uključuje varijantne polipeptida koji su funkcionalni. Proteini faktora VIII mogu biti humani, svinjski, pseći i mišji faktori VIII proteina. Kao što je opisano u odeljku prethodnog stanja tehnike, poznate su polipeptidne i polinukleotidne sekvence pune dužine, kao i mnogi funkcionalni fragmenti, mutanti i modifikovane verzije. Primeri sekvenci humanog faktora
2
VIII su prikazane kao sekvence u SEQ ID NO:2 ili 6 (Tabela 2). Polipeptidi faktora VIII uključuju, npr., faktor pune dužine VIII, faktor pune dužine VIII minus Met na N-terminusu, zreli faktor VIII (minus signalnu sekvencu), zreli faktor VIII sa dodatnim Met na N-kraju, i/ili faktor VIII sa potpunim ili delimičnim brisanjem B domena. Varijacije faktora VIII uključuju delecije B domena, bilo delimične ili potpune delecije.
[0074] Poznato je mnogo različitih varijanti funkcionalnog faktora VIII, kao što je iznad i ispod objašnjeno. Pored toga, identifikovane su na stotine nefunkcionalnih mutacija faktora VIII kod pacijenata sa hemofilijom, i utvrđeno je da je efekat ovih mutacija na funkciju faktora VIII više posledica toga gde leže unutar trodimenzionalne strukture faktora VIII nego na prirodi supstitucije (Cutler i dr., Hum. Mutat.19:274-8 (2002)). Pored toga, poređenja između faktora VIII od ljudi i drugih vrsta identifikovala su konzervirane ostatke koji će verovatno biti potrebni za funkcionisanje (Cameron i dr., Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998); US 6,251,632).
[0075] Gen humanog faktora VIII je izolovan i eksprimiran u ćelijama sisara (Toole, J. J., i dr., Nature 312:342-347 (1984); Gitschier, J., i dr., Nature 312:326-330 (1984); Wood, W. I., i dr., Nature 312:330-337 (1984); Vehar, G. A., i dr., Nature 312:337-342 (1984); WO 87/04187; WO 88/08035; WO 88/03558; pat. SAD.. No.4,757,006), i sekvenca aminokiselina je izvedena iz cDNK. Capon i dr., U.S. Pat. No.4,965,199, obelodanjuje postupak rekombinantne DNK za proizvodnju faktora VIII u ćelijama domaćina sisara i prečišćavanje humanog faktora VIII. Prikazana je ekspresija humanog faktora VIII u CHO (jajnika kineskog hrčka) i BHKC (ćelije bubrega malog hrčka). Humani faktor VIII je modifikovan da izbriše deo ili ceo B domen (patent SAD. br.4,994,371 i 4,868,112), i izvršena je zamena domena humanog faktora VIII B domenom humanog faktora VB (patent SAD. No.5,004,803). cDNK sekvenca koja kodira humani faktor VIII i predviđena aminokiselinska sekvenca prikazani su u SEQ ID NO:1 i 2, respektivno, iz objave prijave SAD. No.2005/0100990.
[0076] pat. SAD.. br.5,859,204, Lollar, J. S., opisuje funkcionalne mutante faktora VIII koji imaju smanjenu antigenost i smanjenu imunoreaktivnost. pat. SAD.. br.6,376,463, Lollar, J. S., takođe prijavljuje mutante faktora VIII koji imaju smanjenu imunoreaktivnost. objava patentne prijave SAD br.2005/0100990, Saenko i dr., izveštava o funkcionalnim mutacijama u A2 domenu faktora VIII.
[0077] Brojne molekule funkcionalnog faktora VIII, uključujući delecije B-domena, opisane su u sledećim patentima US 6,316,226 i US 6,346,513, oba su dodeljena Baxter; US 7,041,635 dodeljena In2Gen; US 5,789,203, US 6,060,447, US 5,595,886, i US 6,228,620 dodeljena Chiron; US 5,972,885 i US 6,048,720 dodeljena Biovitrum, US 5,543,502 i US 5,610,278 dodeljena Novo Nordisk; US 5,171,844 dodeljena Immuno Ag; US 5,112,950 dodeljena Transgene S.A.; US 4,868,112 dodeljena Genetics Institute.
[0078] Sekvenca svinjskog faktora VIII je objavljena (Toole, J. J., i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5939-5942 (1986)) i opisana je kompletna cDNK sekvenca svinje dobijena iz PCR amplifikacije sekvence faktora VIII iz cDNK biblioteke slezine svinje. (Healey, J. F. i dr., Blood 88:4209-4214 (1996)). Hibridni humani/svinjski faktor VIII koji ima supstitucije svih domena, sve podjedinice i specifične aminokiselinske sekvence su otkriveni u patent SAD. No. 5,364,771 od strane Lollar and Runge, i u WO 93/20093. U skorije vreme, nukleotidne i odgovarajuće aminokiselinske sekvence A1 i A2 domena svinjskog faktora VIII i himernog faktora VIII sa svinjskim A1 i/ili A2 domenima supstituisanim za odgovarajuće humane domene su prijavljene u WO 94/11503. pat. SAD br.5,859,204, Lollar, J. S., takođe obelodanjuje svinjsku cDNK i izvedene sekvence aminokiselina. pat. SAD. br.6,458,563, dodeljen Emoriy obelodanjuje svinjski Faktor VIII koji je izbrisan iz B-domena.
[0079] Faktor VIII (ili deo Faktora VIII himernog polipeptida) može biti najmanje 90% ili 95% identičan sekvenci aminokiselina faktora VIII prikazanoj u Tabeli 2 bez signalne sekvence (aminokiseline 20 do 1457 SEQ ID NO:2); i aminokiseline 20 do 2351 od SEQ ID NO:6), gde navedeni deo Faktora VIII ima aktivnost faktora VIII. Faktor VIII (ili deo Faktora VIII himernog polipeptida) može biti identičan sekvenci aminokiselina faktora VIII prikazanoj u Tabeli 2 bez signalne sekvence (aminokiseline 20 do 1457 SEQ ID NO:2); i aminokiseline 20 do 2351 SEQ ID NO:6).
[0080] Faktor VIII (ili deo faktora VIII himernog polipeptida) može biti najmanje 90% ili 95% identičan sekvenci aminokiselina faktora VIII prikazanoj u tabeli 2 sa signalnom sekvencom (aminokiseline 1 do 1457 iz SEQ ID NO:2) i aminokiseline 1 do 2351 od SEQ ID NO:6), gde navedeni deo Faktora VIII ima aktivnost faktora VIII. Faktor VIII (ili deo faktora VIII himernog polipeptida) može biti identičan sekvenci aminokiselina faktora VIII
2
prikazanoj u tabeli 2 sa signalnom sekvencom (aminokiseline 1 do 1457 od SEQ ID NO:2 i aminokiseline 1 do 2351 od SEQ ID NO:6).
[0081] "Ekvivalentna doza", kako se ovde koristi, označava istu dozu aktivnosti faktora VIII koja je izražena u internacionalnim jedinicama, koja je nezavisna od molekularne težine dotičnog polipeptida. Jedna međunarodna jedinica (IU) aktivnosti faktora VIII približno odgovara količini faktora VIII u jednom mililitru normalne humane plazme. Dostupno je nekoliko testova za merenje aktivnosti faktora VIII, uključujući analizu hromogenog supstrata Evropske farmakopeje i analizu zgrušavanja u jednoj fazi.
[0082] "Fc", kako je ovde korišćeno, označava funkcionalne neonatalne Fc receptore (FcRn) vezujuće partnere, ukoliko nije drugačije naznačeno. Partner za vezivanje FcRn je bilo koji molekul koji može biti specifično vezan za FcRn receptor sa posledičnim aktivnim transportom pomoću FcRn receptora FcRn vezujućeg partnera. Tako, termin Fc uključuje bilo koje varijante IgG Fc koje su funkcionalne. Oblast Fc dela IgG koja se vezuje za FcRn receptor je opisana na osnovu rendgenske kristalografije (Burmeister i dr. , Nature 372:379 (1994)). Glavna kontaktna površina Fc sa FcRn je blizu spoja CH2 i CH3 domena. Fc-FcRn kontakti su svi unutar jednog Ig teškog lanca. Partneri za vezanje FcRn uključuju, npr., Ceo IgG, Fc fragment IgG, i druge fragmente IgG koji uključuju kompletan region vezivanja FcRn. Glavna kontaktna mesta uključuju aminokiselinske ostatke 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 i 314 CH2 domena i aminokiselinskih ostataka 385-387, 428 i 433-436. CH3 domen. Reference na aminokiselinske brojeve imunoglobulina ili fragmenata imunoglobulina, ili regiona, zasnivaju se na Kabat i dr.1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Department of Public Health, Bethesda; MD. (FcRn receptor je izolovan iz nekoliko vrsta sisara, uključujući ljude. Sekvence humanog FcRn, pacovskog FcRn i mišjeg FcRn su poznate (Story i dr., J. Exp. Med.180:2377 (1994).) Fc može sadržati CH2 i CH3 domene imunoglobulina sa ili bez zglobnog regiona imunoglobulina. Primeri Fc varijanti su dati u WO 2004/101740 i WO 2006/074199.
[0083] Fc (ili Fc deo himernog polipeptida) može da sadrži jednu ili više mutacija i kombinacije mutacija.
[0084] Fc (ili Fc deo himernog polipeptida) može da sadrži mutacije koje povećavaju poluraspad kao što su M252Y, S254T, T256E i njihove kombinacije, kao što je obelodanjeno u
2
Oganesyan i dr., Mol. Immunol.46:1750 (2009); H433K, N434F i njihove kombinacije kao što je obelodanjeno u Vaccaro i dr., Nat. Biotechnol.23:1283 (2005); mutanti obelodanjeni na stranama 1-2, paragraf [0012] i Primeri 9 i 10 od US 2009/0264627 A1; i mutanti obelodanjeni na strani 2 paragrafi [0014] do [0021] US 20090163699 A1.
[0085] Fc (ili Fc deo himernog polipeptida) može takođe uključiti, npr., sledeće mutacije:Fc region IgG može da se modifikuje u skladu sa dobro poznatim procedurama kao što je mestom usmerena mutageneza i slično, da bi se dobili modifikovani IgG ili Fc fragmenti ili njihovi delovi koji će biti vezani za FcRn. Takve modifikacije uključuju, npr., modifikacije udaljene od FcRn kontaktnih mesta kao i modifikacije u kontaktnim mestima koje čuvaju ili čak poboljšavaju vezivanje za FcRn. Na primer, sledeći pojedinačni aminokiselinski ostaci u humanom IgGl Fc (Fcil) mogu biti supstituisani bez značajnog gubitka afiniteta vezivanja za FcRn:P238A, S239A, K246A, K248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, A330S, P331A, P331S, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A i K447A, gde na primer P238A predstavlja divlji tip prolina supstituisan sa alaninom na poziciji broj 238. Pored alanina, druge aminokiseline se mogu zameniti za aminokiseline divljeg tipa na iznad navedenim pozicijama. Mutacije se mogu uvesti pojedinačno u Fc dajući više od stotinu FcRn vezujućih partnera koji se razlikuju od izvornog Fc. Pored toga, kombinacije od dve, tri ili više od ovih pojedinačnih mutacija mogu biti uvedene zajedno, što dovodi do stotina drugih FcRn vezujućih partnera. Neke od ovih mutacija mogu dati novu funkcionalnost partneru za vezivanje FcRn. Na primer, jedno otelotvorenje uključuje N297A, uklanjajući visoko konzervirano mesto N-glikozilacije. Efekat ove mutacije je da se smanji imunogenost, čime se poboljšava cirkulacioni poluraspad partnera za vezivanje FcRn, i da se učini da je FcRn vezujući partner nesposoban za vezivanje za FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB i FcyRIIIA, bez ugrožavanja afiniteta za FcRn (Routledge i dr.1995, Transplantation 60:847; Friend i dr.1999, Transplantation 68:1632; Shields i dr.1995, J. Biol. Chem. 276:6591). Pored toga, čini se da najmanje tri humana Fc
2
gama receptora prepoznaju mesto vezivanja na IgG unutar donjeg zglobnog regiona, uglavnom aminokiseline 234-237. Prema tome, drugi primer nove funkcionalnosti i potencijalne smanjene imunogenosti može da proistekne iz mutacija ovog regiona, kao na primer zamenom aminokiselina 233-236 humanog IgG1 "ELLG" u odgovarajuću sekvencu iz IgG2 "PVA" (sa jednom aminokiselinskom delecijom). Pokazano je da FcyRI, FcyRII i FcyRIII koji posreduju u različitim efektorskim funkcijama neće se vezati za IgG1 kada se uvedu takve mutacije (Ward and Ghetie, Therapeutic Immunology 2:77 (1995); i Armour i dr., Eur. J. Immunol. 29:2613 (1999)). Kao sledeći primer nove funkcionalnosti koja proizilazi iz mutacija opisanih iznad, afinitet za FcRn može se povećati iznad granica divljeg tipa u nekim slučajevima. Ovaj povećani afinitet može odražavati povećanu stopu "rastuću", smanjenu "opadajuću" stopu ili i povećanu stopu "rastuću" i smanjenu "opadajuću" stopu. Mutacije za koje se veruje da daju veći afinitet za FcRn uključuju, npr., T256A, T307A, E380A, i N434A (Shields i dr. , J. Biol. Chem.276:6591 (2001)).
[0086] Fc (ili Fc deo himernog polipeptida) može biti najmanje 90% ili 95% identičan sa Fc aminokiselinskom sekvencom prikazanom u Tabeli 2 (aminokiseline 1458 do 1684 od SEQ ID NO:2 ili aminokiseline 2352 do 2578 od SEQ ID NO:6).
Fc (ili Fc deo himernog polipeptida) može biti najmanje 90% ili 95% identičan sa Fc aminokiselinskom sekvencom prikazanom u Tabeli 2 (aminokiseline 1458 do 1684 od SEQ ID NO:2 ili aminokiseline 2352 do 2578 od SEQ ID NO:6).
[0087] "Hibridni" polipeptidi i proteini, kako se ovde koriste, označavaju kombinaciju himernog polipeptida sa drugim polipeptidom. Himerni polipeptid i drugi polipeptid u hibridu mogu biti povezani međusobno preko interakcija protein-protein, kao što su naelektrisanje ili hidrofobne interakcije. Himerni polipeptid i drugi polipeptid u hibridu mogu biti povezani jedan sa drugim preko disulfidnih ili drugih kovalentnih veza. Hibridi su opisani u WO 2004/101740 i WO 2006/074199. Videti takođe patente SAD br.7,404,956 i 7,348,004 ovde obuhvaćeni u celini, referencom. Drugi polipeptid može biti druga kopija istog himernog polipeptida ili može biti ne-identičan himerni polipeptid. Videti npr., Sliku 1, Primer 1 i Tabelu 2. U jednom otelotvorenju, drugi polipeptid je polipeptid koji sadrži Fc. U još jednom otelotvorenju, himerni polipeptid je himerni Faktor VIII-Fc polipeptid i drugi polipeptid se sastoji u suštini od Fc, npr., hibridni polipeptid iz Primera 1, koji je rFVIIIFc rekombinantni fuzioni protein koji se sastoji od jednog molekula rekombinantnog domena koji je izbrisan
2
FVIII (BDD-rFVIII) fuzionisan za dimerni Fc domen humanog IgGl, bez interventne sekvence veznika. Ovaj hibridni polipeptid se ovde označava kao FVIIIFc monomerni Fc fuzioni protein, FVIIIFc monomer hibrid, monomerni FVIIIIFc hibrid, i FVIIIFc monomerdimer. Videti Primer 1, Sliku 1 i Tabelu 2A. Primeri pružaju prekliničke i kliničke podatke za ovaj hibridni polipeptid.
[0088] Drugi polipeptid u hibridu može da sadrži ili da se sastoji uglavnom od sekvence koja je najmanje 90% ili 95% identična sekvenci aminokiselina prikazanoj u Tabeli 2A (ii) bez signalne sekvence (aminokiseline 21 do 247 od SEQ ID NO:4) ili najmanje 90% ili 95% identična sekvenci aminokiselina prikazanoj u Tabeli 2A (ii) sa signalnom sekvencom (aminokiseline 1 do 247 od SEQ ID NO-:4). Drugi polipeptid može sadržati ili sadržati sekvencu identičnu aminokiselinskoj sekvenci prikazanoj u Tabeli 2A (ii) bez signalne sekvence (aminokiseline 21 do 247 od SEQ ID NO:4) ili identične sekvenci aminokiselina prikazanoj u Tabela 2A (ii) sa signalnom sekvencom (aminokiseline 1 do 247 iz SEQ ID NO:4).
[0089] Slika 1 je šematski prikaz strukture himernog polipeptida faktora VIII-Fc koji je izbrisan iz B domena, i njegove povezanosti sa drugim polipeptidom koji je Fc polipeptid. Da bi se dobio ovaj hibrid, kodirajuća sekvenca humanog rekombinantnog B-domena obrisanog FVIII je dobijena reverznom transkripcijom-lančanom reakcijom polimeraze (RT-PCR) iz humane jetre poli A RNK (Clontech) korišćenjem FVIII-specifičnih primera. FVIII sekvenca uključuje izvorni signalni niz za FVIII. Brisanje B-domena je iz serina 743 (S743; 2287 bp) u glutamin 1638 (Q1638; 4969 bp) za ukupno brisanje od 2682 bp. Zatim, kodirajuća sekvenca za humani rekombinantni Fc je dobijena pomoću RT-PCR iz cDNK biblioteke humanog leukocita (Clontech) korišćenjem Fc specifičnih primera. Prajmeri su dizajnirani tako da je FVIII sekvenca izbrisana sa B-domenom fuzionisana direktno na N-terminus Fc sekvence bez interventnog veznika. FVIIIFc sekvenca DNK je klonirana u dvostruki ekspresioni vektor sisara pBUDCE4.1 (Invitrogen) pod kontrolom CMV promotora. Druga identična sekvenca Fc uključujući signalnu sekvencu mišjeg Igk dobijena je RT-PCR i klonirana nizvodno od drugog promotora, EF1α, u ekspresionom vektoru pBUDCE4.1.
[0090] Vektor ekspresije rFVIIIFc je transfektovan u ćelije bubrega 293 humanog embriona (HEK293H; Invitrogen) upotrebom Lipofektamina 2000 transfekcionog reagensa (Invitrogen). Stabilne klonirane ćelijske linije su generisane selekcijom sa Zeocin
2
(Invitrogen). Jedna klonirana ćelijska linija, 3C4-22 je korišćena za generisanje FVIIIFc za karakterizaciju in vivo. Rekombinantni FVIIIFc je proizveden i prečišćen (McCue i dr.2009) na Biogen Idec (Cambridge, MA). Za strategiju transfekcije koja je iznad opisana očekivano je da se dobiju tri proizvoda, tj., monomerni rFVIIIFc hibridi, dimerni rFVIIIFc hibridi i dimerni Fc. Međutim, u suštini nije bilo dimernog rFVIIIFc detektovanog u uslovljenoj podlozi iz ovih ćelija. Umesto toga, kondicionirana podloga je sadržala Fc i monomerni rFVIIIFc. Moguće je da je veličina dimernog rFVIIIFc bila suviše velika i sprečila efikasnu sekreciju iz ćelije. Ovaj rezultat je bio koristan jer je pročišćavanje monomera bilo manje komplikovano nego da su sva tri proteina bila prisutna. Materijal korišćen u ovim ispitivanjima imao je specifičnu aktivnost od oko 9000 IU/mg.
[0091] U jednom slučaju, polipeptidi pronalaska se daju pacijentu koji izražava visok nivo von Willebrandovog faktora (VWF). "Ispitanik" ili "pacijent", kako se ovde koristi, označava ljudsku individuu. Ispitanik može biti pacijent koji trenutno pati od poremećaja krvarenja ili se očekuje da mu je potreban takav tretman. "Ispitanik" može uključiti odraslog ili pedijatrijskog ispitanika. Pedijatrijski ispitanik može biti pedijatrijski pacijent mlađi od 12 godina. Termin "pedijatrija" kao što je ovde korišćen je grana medicine koja se bavi zbrinjavanjem odojčadi i dece i lečenjem njihovih bolesti. U jednom slučaju, subjekt je pedijatrijski pacijent koji ima dijagnozu teške hemofilije A. U određenim slučajevima, pedijatrijski ispitanici se tretiraju sa dugo-delujućim Faktorom VIII polipeptida iz pronalaska.
[0092] VWF je protein plazme koji ima multimernu strukturu u kojoj molekularna težina različitih oblika varira između približno 230 kDa za svaku monomernu podjedinicu i do više od 20 miliona Da u multimernim oblicima veće molekulske težine, formirajući tako najveći poznati rastvorljiv protein. Njegova koncentracija u plazmi je oko 5-10 µg/ml (Siedlecki i dr., Blood, vol 88:2939-2950 (1996)) i oblik plazme manje veličine je onaj koji odgovara dimeru, sa približnom veličinom od 500 kDa.
[0093] VWF ima suštinsku ulogu u primarnoj hemostazi, odgovoran je za adheziju trombocita na oštećene vaskularne površine, a samim tim i na formiranje trombocitnog čepa na kojem se razvijaju mehanizmi za formiranje fibrina. Predloženo je da multimeri više molekulske težine podržavaju mehanizme adhezije trombocita na pod-endotelu sa većom efikasnošću, a klinička efikasnost VWF koncentrata je povezana sa koncentracijom ovih multimera veće molekulske težine (Metzner i dr., Haemophilia 4:25-32 (1998).
[0094] Prema tome, ispitanici koji eksprimiraju visoke nivoe VWF zahtevaju manje učestalo doziranje FVIII u poređenju sa ispitanikom koji eksprimira niže ili normalne nivoe VWF. Prosečan opseg VWF u plazmi je između oko 50 IU/dL i oko 200 IU/dL. U jednom slučaju, prosečan nivo VWF u plazmi je oko 50 IU/dL. U drugom slučaju, nivo VWF u plazmi od najmanje oko 100 IU/dL se smatra visokim nivoom VWF. U drugom slučaju, visok nivo VWF u plazmi je između oko 100 IU/dL i oko 200 IU/dL. U drugom slučaju, visok nivo VWF u plazmi je barem oko 110 IU/dL, oko 120 IU/dL, oko 130 IU/dL, oko 140 IU/dL, oko 150 IU/dL, oko 160 IU/dL, oko 170 IU/dL, oko 180 IU/dL, oko 190 IU/dL ili oko 200 IU/dL.
[0095] Prema tome, u jednom slučaju, ispitanici koji eksprimiraju najmanje oko 100 IU/dL plazme VWF se daju dugotrajnim FVIII polipeptidom pronalaska u režimu doziranja dugog intervala. U jednom slučaju, dugo-delujući FVIII polipeptid se daje u doznom intervalu od najmanje oko 3 dana. U drugom slučaju, dugo-delujući FVIII polipeptid se daje u doznom intervalu od najmanje jednom svake nedelje, otprilike jednom u dve nedelje, otprilike svakih 15 dana, otprilike jednom svakih 20 dana, otprilike svaka tri nedelje, otprilike jednom svakih 25 dana, otprilike jednom u četiri nedelje ili otprilike jednom u mesecu.
[0096] U jednom slučaju, ispitanici su prethodno identifikovani kao oni koji imaju visok nivo VWF. U određenim slučajevima, ispitanici koji imaju serotip krvi različit od O (tj., A, B ili AB) zahtevaju manje učestalo doziranje dugotrajnog FVIII, jer dugo-delujući FVIII ima duži polu-raspad u ovim subjektima. Kod ovih ispitanika, povećani polu-raspad je posledica povišenih nivoa VWF.
[0097] Pored toga, farmakokinetički podaci, definisani kao proučavanje vremenskog perioda apsorpcije, raspodele, metabolizma i izlučivanja leka, mogu se koristiti kao identifikatori ispitanika koji ispunjavaju uslove za duže ili kraće intervale doziranja koristeći dugotrajni FVIII polipeptid pronalaska. Klinička farmakokinetika je primena farmakokinetičkih principa na bezbedno i efikasno terapijsko lečenje lekova kod pojedinog pacijenta. Primarni ciljevi kliničke farmakokinetike uključuju povećanje efikasnosti i smanjenje toksičnosti terapije leka kod pacijenta. Razvoj jake veze između koncentracija leka i njihovih farmakoloških odgovora omogućio je lekarima da primene farmakokinetičke principe na stvarne situacije pacijenata.
1
[0098] Prema tome, u jednom slučaju, polu-raspad FVIII-Fc polipeptida pronalaska se koristi za identifikaciju pacijenata koji eksprimiraju visoke nivoe VWF. Opseg polu-života FVIII-Fc je između oko 10 i oko 40 sati, zavisno barem delimično o nivoima VWF koji su takođe prisutni. Međutim, u proseku, polu-raspad FVIII-Fc je oko 18 sati. Generalno, FVIII-Fc pokazuje povećani polu-raspad od najmanje oko 1.2 puta kod pacijenata koji imaju visoke nivoe VWF u poređenju sa polu-raspadom FVIII-Fc kada se daju pojedincima koji imaju prosečne nivoe VWF. U jednom slučaju, FVIII-Fc pokazuje povećani polu-raspad najmanje oko 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, ili 2.5 puta u poređenju sa pola život FVIII-Fc kada se daje pojedincima sa prosečnim nivoima VWF. U jednom slučaju, kod ispitanika koji eksprimiraju visoke nivoe VWF, polu-raspad FVIII-Fc je između najmanje oko 20 sati i oko 40 sati. U drugom slučaju, polu-raspad FVIII-Fc je najmanje oko 21 sat, 22 sata, 23 sata, 24 sata, 25 sati, 26 sati, 27 sati, 28 sati, 29 sati, 30 sati, 31 čas, 32 sata. sati, 33 sata, 34 sata, 35 sati, 36 sati, 37 sati, 38 sati, 39 sati ili 40 sati. U jednom slučaju, polu-raspad FVIII-Fc je između oko 20 i oko 27 sati kod ispitanika koji imaju visoke nivoe VWF. Prema tome, u jednom slučaju, povećani polu-raspad FVIII-Fc u poređenju sa prosečnim vrednostima je indikativan za ispitanika koji je podoban za duži interval doziranja sa dugodelujućim FVIII polipeptidom pronalaska.
[0099] U drugom slučaju, polu-raspad kratko-delujućeg FVIII polipeptida se koristi za identifikaciju pacijenata koji ispoljava visoke nivoe VWF. Kako se ovde koristi, termin "kratko-delujući FVIII" se odnosi na FVIII polipeptid u kome nisu dodati produživači poluživota. U jednom slučaju, kratko-delujući FVIII polipeptidi se sastoje od FVIII pune dužine ili B domena. Primeri kratko-delujućih FVIII polipeptida su Advate® i ReFacto®.
[0100] Pošto polu-raspad kratko-delujućeg FVIII takođe varira u zavisnosti barem delimično od VWF nivoa, kratko-delujući FVIII polipeptidi mogu takođe da se koriste za identifikaciju pacijenata koji ispunjavaju uslove za duži interval doziranja dugo-delujućeg FVIII polipeptida pronalaska. U jednom slučaju, kratko-delujući FVIII pokazuje povećani poluraspad od najmanje oko 1.2 puta kod pojedinaca koji eksprimiraju visoke nivoe VWF u poređenju sa polu-životom kratko-delujućeg FVIII kada se daje pojedincima sa prosečnim nivoima VWF . U drugom slučaju, FVIII kratkog dejstva pokazuje povećani polu-raspad od najmanje 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 ili 2.5 puta kod pojedinaca koji eksprimiraju visok nivo VWF u poređenju sa polu-raspadom kratko-delujućeg FVIII kada se daje pojedincima sa prosečnim nivoima VWF. Prema tome, pojedinci koji pokazuju povećani
2
polu-raspad od najmanje oko 1.2 puta kada se daje kratko-delujući FVIII su prihvatljivi za duži interval doziranja sa dugo-delujućim FVIII polipeptidom pronalaska.
[0101] "Interval doziranja", kako se ovde koristi, označava dozu vremena koja prolazi između višestrukih doza koje se daju ispitaniku. Poređenje intervala doziranja može se izvršiti na jednom subjektu ili u populaciji ispitanika i tada se može izračunati prosek dobijen u populaciji.
[0102] Interval doziranja kod davanja himernog polipeptida faktora VIII, na primer, himerni polipeptid faktora VIII-Fc (polipeptid koji sadrži faktor VIII ili hibrid) pronalaska može biti najmanje oko jedan i po puta duži od intervala doziranja potreban za ekvivalentnu dozu navedenog Faktora VIII bez udela ne-faktora VIII, npr. bez Fc dela (polipeptid koji se sastoji od navedenog Faktora VIII). Interval doziranja može biti najmanje jedan do pola do šest puta duži, jedan i pol do pet puta duži, jedan i pol do četiri puta duži, jedan i pol do tri puta duži, ili jedan i pol do dva puta duže, nego interval doziranja potreban za ekvivalentnu dozu navedenog Faktora VIII bez dela bez faktora VIII, npr., bez Fc dela (polipeptid koji se sastoji od navedenog Faktora VIII). Interval doziranja može biti najmanje oko jedne i po, dva, dva i po, tri, tri i po, četiri, četiri i po, pet, pet i po ili šest puta duže nego interval doziranja potreban za ekvivalentnu dozu navedenog Faktora VIII bez udela ne-faktora VIII, npr. bez Fc dela (polipeptid koji se sastoji od navedenog Faktora VIII). Interval doziranja može biti oko svaka tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest ili četrnaest dana ili duže. Interval doziranja može biti najmanje jedan i po do 5, jedan i po, 2, 3, 4 ili 5 dana ili duže. Za tretman na zahtev, interval doziranja pomenutog himernog polipeptida ili hibrida je otprilike svaki put 24-36, 24-48, 24-72, 24-96, 24-120, 24-144, 24-168, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 ili 72 sata ili duže.
[0103] U jednom slučaju, efektivna doza je 25-80 IU/kg (25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 62, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ili 80 IU/kg) i interval doziranja je jednom svaki 3-5, 3-6, 3-7, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 ili više dana, ili tri puta nedeljno, ili ne više od tri puta nedeljno. U jednom slučaju, efektivna doza je 80 IU/kg, a interval doziranja je jednom svaka 3 dana. U daljem slučaju, efektivna doza od 80 IU/kg data u intervalima doziranja svaka 3 dana se daje pedijatrijskom ispitaniku. U drugom slučaju, efektivna doza je 65 IU/kg, a interval doziranja je jednom nedeljno, ili jednom svakih 6-7 dana. Doze se mogu davati opetovano dok su potrebne (npr., najmanje 10, 20, 28, 30, 40, 50, 52 ili 57 nedelja, najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 , 8, 9 ili 10 godina).
[0104] U određenim slučajevima, efektivna doza za lečenje na zahtev je 20-50IU/Kg (20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ili 50 IU/kg). Lečenje na zahtev može biti jednokratno doziranje ili ponovljeno doziranje. Za ponovljeno doziranje, interval doziranja može biti svakih 12-24 sata, svakih 24-36 sati, svakih 24-48 sati, svakih 36-48 sati, ili svakih 48-72 sati.
[0105] "Dugo-delujući Faktor VIII" je faktor VIII koji ima povećani polu-raspad (takođe se ovde označava kao t1/2, t1/2 beta, polu-raspad eliminacije i HL) u odnosu na referentni Faktor VIII. Povećani polu-raspad dugog dejstva Faktora VIII može biti posledica fuzije sa jednim ili više ne-faktor VIII polipeptida kao što su, na primer, Fc, XTEN, albumin, PAS sekvenca, transferin, CTP (28 aminokiselina C-terminalni peptid (CTP) hCG sa 4 O-glikana), polietilen glikol (PEG), hidroksietil skrob (HES), albumin vezujući polipeptid, mali molekuli koji vezuju albumin, ili dve ili više njihovih kombinacija. Povećani polu-raspad može biti posledica jedne ili više modifikacija, kao što je, na primer, pegilacija. Primeri polipeptida dugo-delujućeg faktora VIII uključuju, npr., himerne polipeptide faktora VIII koji sadrže Fc, polipeptide himernog faktora VIII koji sadrže XTEN i himerne polipeptide faktora VIII koji sadrže albumin. Dodatni primeri polipeptida faktora VIII dugog dejstva obuhvataju, npr., pegilovani Faktor VIII.
[0106] "Referentni" polipeptid, u slučaju dugo-delujućeg himernog polipeptida faktora VIII, je polipeptid koji se u osnovi sastoji od dela faktora VIII himernog polipeptida, npr., istog dela faktora VIII bez Fc dela, bez XTEN dela ili bez dela albumina. Slično, referentni polipeptid u slučaju modifikovanog faktora VIII je isti faktor VIII bez modifikacije, npr., faktor VIII bez pegilacije.
[0107] U nekim otelotvorenjima, dugo-delujući Faktor VIII ima jedno ili više sledećih svojstava kada se daje ispitaniku:
srednje vreme zadržavanja (MRT) (aktivnost) u navedenom subjektu od oko 14-41.3 sati;
klirens (CL) (aktivnost) u navedenom subjektu od oko 1.22-5.19 mL/sat/kg ili manje;
4
t1/2beta (aktivnost) u navedenom subjektu od oko 11-26.4 sati;
postepeni oporavak (vrednost K) (aktivnost; posmatrano) u navedenom subjektu od oko 1.38-2.88 IU/dL po IU/kg;
Vss (aktivnost) u navedenom subjektu od oko 37.7-79.4 mL/kg; i
AUC/doza u navedenom ispitaniku od oko 19.2-81.7 IU*h/dL po IU/kg.
[0108] U nekim otelotvorenjima, dugo-delujući Faktor VIII ima jedno ili više sledećih svojstava kada se daje ispitaniku:
srednji inkrementalni oporavak (K-vrednost) (aktivnost; opaženo) veće od 1.38 IU/dL po IU/kg;
srednji inkrementalni oporavak (K-vrednost) (aktivnost; najmanje 1.5, najmanje oko 1.85, ili najmanje oko 2.46 IU/dL po IU/kg.
srednji klirens (CL) (aktivnost) u navedenoj populaciji pacijenata od oko 2.33 ± 1.08 mL/sat/kg ili manje;
srednji klirens (CL) (aktivnost) u navedenoj populaciji pacijenata od oko 1.8 -2.69 mL/sat/kg ili manje;
srednji klirens (CL) (aktivnost) u navedenoj populaciji pacijenata koji je oko 65% klirensa polipeptida koji sadrži navedeni faktor VIII bez modifikacije;
srednje vreme zadržavanja (MRT) (aktivnost) u navedenoj populaciji pacijenata od najmanje oko 26.3 ± 8.33 sati;
srednji MRT (aktivnost) u navedenoj populaciji pacijenata od oko 25.9 - 26.5 sati; srednji MRT (aktivnost) u navedenoj populaciji patenata koji je oko 1.5 puta duži od srednje MRT polipeptida koji sadrži navedeni faktor VIII bez modifikacije; srednji MRT (aktivnost) u navedenoj populaciji pacijenata od oko 18.3 ± 5.79 sati; srednja t1/2beta (aktivnost) u navedenoj populaciji pacijenata koja je oko 18 - 18.4 sati;
srednji t1/2beta (aktivnost) u navedenoj populaciji patenata koji je oko 1.5 puta duži od srednje t1/2beta polipeptida koji sadrži navedeni faktor VIII bez modifikacije; srednji inkrementalni oporavak (K-vrednost) (aktivnost; posmatrano) u navedenoj populaciji pacijenata od oko 2.01 ± 0.44 IU/dL po IU/kg;
srednji inkrementalni oporavak (K-vrednost) (aktivnost; posmatrano) u navedenoj populaciji pacijenata od oko 1.85 ± 2.46 IU/dL po IU/kg;
srednji inkrementalni oporavak (K-vrednost) (aktivnost; posmatrano) u navedenoj populaciji pacijenata koji je oko 90 % inkrementalni oporavak polipeptida koji sadrži navedeni faktor VIII bez modifikacije;
srednji Vss (aktivnost) u navedenoj populaciji pacijenata od oko 55.1 ± 12.3 mL; srednji Vss (aktivnost) u navedenoj populaciji pacijenata od oko 45.3 ± 56.1 mL; srednja AUC/doza (aktivnost) u navedenom populacije pacijenata od oko 49.918.2 IU*h/dL po IU/kg.
srednja AUC/doza (aktivnost) u navedenom populacije pacijenata od oko 44.8 - 57.6 IU*h/dL po IU/kg.
[0109] U drugim otelotvorenjima, dugo-delujući Faktor VIII ima jedno ili više sledećih svojstava kada se daje ispitaniku:
Cmax_OBS u navedenom subjektu primenjen sa himernim polipeptidom je uporediv sa Cmax_OBS kod ispitanika koji je primenjen sa istom količinom polipeptida koji se sastoji od zrelog faktora VIII pune dužine kada se meri jednofaznim (aPTT) testom ili dvofaznim testom. (hromogeni) test;
Cmax_OBS kod pomenutog ispitanika je oko 60,5 IU/dL, oko 60.5 ± 1 IU/dL, oko 60.5 ± 2 IU/dL, oko 60.5 ± 3 IU/dL, oko 60,5 ± 4 IU/dL, oko 60.5 ± 5 IU/dL, oko 60.5 ± 6 IU/dL, oko 60.5 ± 7 IU/dL, oko 60.5 ± 8 IU/dL, oko 60,5 ± 9 IU/dL ili oko 60.5 ± 10 IU/dL kao što je izmereno jednofaznim (aPTT) testom, kada se primenjuje oko 25 IU/kg himernog polipeptida;
Cmax_OBS kod pomenutog ispitanika od oko 53.1 - 69 IU/dL kao što je izmereno jednofaznim (aPTT) testom kada se primenjuje oko 25 IU/kg himernog polipeptida; Cmax_OBS kod pomenutog ispitanika je oko 119 IU/dL, oko 119 ± 1 IU/dL, oko 119 ± 2 IU/dL, oko 119 ± 3 IU/dL, oko 119 ± 4 IU/dL, oko 119 ± 5 IU/dL, oko 119 ± 6 IU/dL, oko 119 ± 7 IU/dL, oko 119 ± 8 IU/dL, oko 119 ± 9 IU/dL, oko 119 ± 10 IU/dL, oko 119 ± 11 IU/dL, oko 119 ± 12 IU/dL, oko 119 ± 13 IU/dL, oko 119 ± 14 IU/dL, oko 119 ± 15 IU/dL, oko 119 ± 16 IU/dL, oko 119 ± 17 IU/dL, ili oko 119 ± 18 IU/dL, kao što je izmereno jednofaznim (aPTT) testom, kada se primenjuje oko 65 IU/kg himernog polipeptida;
Cmax_OBS kod pomenutog ispitanika od oko 103 - 136 IU/dL kao što je izmereno jednofaznim (aPTT) testom kada se primenjuje oko 65 IU/kg himernog polipeptida; Cmax_OBS kod pomenutog ispitanika je oko 76.5 IU/dL, oko 76.5 ± 1 IU/dL, oko 76.5 ± 2 IU/dL, oko 76.5 ± 3 IU/dL, oko 76.5 ± 4 IU/dL, oko 76.5 ± 5 IU/dL, oko 76.5 ± 6 IU/dL, oko 76.5 ± 7 IU/dL, oko 76.5 ± 8 IU/dL, oko 76.5 ± 9 IU/dL, oko 76.5 ± 10 IU/dL, oko 76.5 ± 11 IU/dL, oko 76.5 ± 12 IU/dL, oko 76.5 ± 13 IU/dL, oko 76.5 ± 14 IU/dL, ili oko 76.5 ± 15 IU/dL, kao što je izmereno dvofaznim (hromogenim) testom, kada se primenjuje oko 25 IU/kg himernog polipeptida;
Cmax_OBS kod pomenutog ispitanika od oko 64.9 – 90.1 IU/dL kao što je izmereno dvofaznim (hromogenim) testom kada se primenjuje oko 25 IU/kg himernog polipeptida;
Cmax_OBS kod pomenutog ispitanika je oko 182 IU/dL, oko 182 ± 2 IU/dL, oko 182 ± 4 IU/dL, oko 182 ± 6 IU/dL, oko 182 ± 8 IU/dL, oko 182 ± 10 IU/dL, oko 182 ± 12 IU/dL, oko 182 ± 14 IU/dL, oko 182 ± 16 IU/dL, oko 182 ± 18 IU/dL ili oko 182 ± 20 IU/dL kao što je izmereno dvofaznim (aPTT) testom, kada se primenjuje oko 65 IU/kg himernog polipeptida; ili
Cmax_OBS kod pomenutog ispitanika od oko 146 - 227 IU/dL, oko 146 ± 5 IU/dL, oko 146 ± 10 IU/dL, oko 227 ± 5 IU/dL ili oko 146 ± 10 IU/dL kao što je izmereno dvofaznim (hromogenim) testom kada se primenjuje oko 65 IU/kg himernog polipeptida;
[0110] U određenim otelotvorenjima, dugo-delujući Faktor VIII ima jedno ili više sledećih svojstava kada se daje ispitaniku:
t1/2beta (aktivnost) u navedenom subjektu koji je najmanje 1.48, 1.49, 1.50, 1.51,
1.52, 1.53, 1.54, 1.55, 1.56, 1.57, 1.58, 1.59, 1.60, 1.61, 1.62, 1.63, 1.64, 1.65, 1.66,
1.67, 1.68, 1.69, 1.70, 1.71, 1.72, 1.73, 1.74, 1.75, 1.76, 1.77, 1.78, 1.79, 1.80, 1.81,
1.82, 1.83, 1.84, 1.85, 1.86, 1.87, 1.88, 1.89 ili 1.90 puta više od t1/2beta (aktivnost) kod ispitanika koji je primenjen sa istom količinom polipeptida koji se sastoji od pune dužine, zrelog faktora VIII kada se meri jednofaznim (aPTT) testom ili dvofaznim (hromogenim) testom;
t1/2beta (aktivnost) u navedenom ispitaniku od oko 18.8 sati, 18.8 ± 1 sati, 18.8 ± 1 sati, 18.8 ± 2 sati, 18.8 ± 3 sati, 18.8 ± 4 sati, 18.8 ± 5 sati, 18.8 ± 6 sati, 18.8 ± 7 sati, 18.8 ± 8 sati, 18.8 ± 9 sati, 18.8 ± 10 sati ili 18.8 ± 11 kao što je izmereno putem jednofaznog (aPTT) testa;
t1/2beta (aktivnost) kod navedenog ispitanika od oko 14.3 - 24.5 sati kao što je izmereno jednofaznim (aPTT) testom;
t1/2beta (aktivnost) u navedenom ispitaniku od oko 16.7 sati, 16.7 ± 1 sati, 16.7 ± 2 sati, 16.7 ± 3 sati, 16.7 ± 4 sati, 16.7 ± 5 sati, 16.7 ± 6 sati, 16.7 ± 7 sati, 16.7 ± 8 sati, 16.7 ± 9 sati, 16.7 ± 10 sati ili 16.7 ± 11 kao što je izmereno putem dvofaznog (hromogenog) testa;
t1/2beta (aktivnost) kod navedenog ispitanika od oko 13.8 - 20.1 sati kao što je izmereno dvofaznim (hromogenim) testom.
t1/2beta (aktivnost) u navedenom ispitaniku od oko 19.8 sati, 19.8 ± 1 sati, 19.8 ± 2 sati, 19.8 ± 3 sati, 19.8 ± 4 sati, 19.8 ± 5 sati, 19.8 ± 6 sati, 19.8 ± 7 sati, 19.8 ± 8 sati, 19.8 ± 9 sati, 19.8 ± 10 sati ili 19.8 ± 11 kao što je izmereno putem dvofaznog (hromogenog) testa; ili
t1/2beta (aktivnost) kod navedenog ispitanika od oko 14.3 - 27.5 sati kao što je izmereno dvofaznim (hromogenim) testom.
[0111] U određenim otelotvorenjima, dugo-delujući Faktor VIII ima jedno ili više sledećih svojstava kada se daje ispitaniku:
klirens (CL) (aktivnost) u navedenom subjektu je 0.51, 0.52, 0.53, 0.54, 0.55, 0.56, 0.57, 0.58, 0.59, 0.60, 0.61, 0.62, 0.63, 0.64, 0.65, 0.66, 0.67, 0.68, 0.69, ili 0.70 puta niže od klirensa u ispitanika koji je primenjen sa istom količinom polipeptida koji se sastoji od zrelog faktora VIII pune dužine kada se meri jednofaznim (aPTT) testom ili dvofaznim (hromogenim) testom;
klirens (CL) (aktivnost) u navedenom subjektu od oko 1.68 mL/sat/kg, 1.68 ± 0.1 mL/sat/kg, 1.68 ± 0.2 mL/sat/kg, 1.68 ± 0.3 mL/sat/kg, 1.68 ± 0.4 mL/sat/kg, 1.68 ± 0.5 mL/sat/kg, 1.68 ± 0.6 mL/sat/kg, ili 1.68 ± 0.7 mL/sat/kg, mereno jednofaznim testom (aPTT) kada je oko 25 IU/kg himernog polipeptida;
klirens (CL) (aktivnost) kod pomenutog ispitanika od oko 1.31 - 2.15 mL/sati/dL kao što je izmereno jednofaznim (aPTT) testom kada se primenjuje oko 25 IU/kg himernog polipeptida;
klirens (CL) (aktivnost) u navedenom subjektu od oko 2.32 mL/sat/kg, 2.32 ± 0.1 mL/sat/kg, 2.32 ± 0.2 mL/sat/kg, 2.32 ± 0.3 mL/sat/kg, 2.32 ± 0.4 mL/sat/kg, 2.32 ± 0.5 mL/sat/kg, 2.32 ± 0.6 mL/sat/kg, ili 2.32 ± 0.7 mL/sat/kg, mereno jednofaznim testom (aPTT) kada je oko 65 IU/kg himernog polipeptida;
klirens (CL) (aktivnost) kod pomenutog ispitanika od oko 1.64 - 3.29 mL/sati/dL kao što je izmereno jednofaznim (aPTT) testom kada se primenjuje oko 65 IU/kg himernog polipeptida;
klirens (CL) (aktivnost) u navedenom subjektu od oko 1.49 mL/sat/kg, 1.49 ± 0.1 mL/sat/kg, 1.49 ± 0.2 mL/sat/kg, 1.49 ± 0.3 mL/sat/kg, 1.49 ± 0.4 mL/sat/kg, 1.49 ± 0.5 mL/sat/kg, 1.49 ± 0.6 mL/sat/kg, ili 1.49 ± 0.7 mL/sat/kg, mereno dvofaznim (hromogenim) testom kada je dato oko 25 IU/kg himernog polipeptida;
klirens (CL) (aktivnost) kod pomenutog ispitanika od oko 1.16 - 1.92 mL/sati/dL kao što je izmereno dvofaznim (hromogenim) testom kada se daje oko 25 IU/kg himernog polipeptida;
klirens (CL) (aktivnost) u navedenom subjektu od oko 1.52 mL/sat/kg, 1.52 ± 0.1 mL/sat/kg, 1.52 ± 0.2 mL/sat/kg, 1.52 ± 0.3 mL/sat/kg, 1.52 ± 0.4 mL/sat/kg, 1.52 ± 0.5 mL/sat/kg, 1.52 ± 0.6 mL/sat/kg, ili 1.52 ± 0.7 mL/sat/kg, mereno dvofaznim (hromogenim) testom kada je dato oko 65 IU/kg himernog polipeptida; ili klirens (CL) (aktivnost) kod pomenutog ispitanika od oko 1.05-2.20 mL/sati/dL kao što je izmereno dvofaznim (hromogenim) testom kada se daje oko 65 IU/kg himernog polipeptida;
[0112] U nekim otelotvorenjima, dugo-delujući Faktor VIII ima jedno ili više sledećih svojstava kada se daje ispitaniku:
MRT u navedenom ispitaniku koji je najmanje 1.46, 1.47, 1.48, 1.49, 1.50, 1.51, 1.52,
1.53, 1.54, 1.55, 1.56, 1.57, 1.58, 1.59, 1.60, 1.61, 1.62, 1.63, 1.64, 1.65, 1.66, 1.67,
1.68, 1.69, 1.70, 1.71, 1.72, 1.73, 1.74, 1.75, 1.76, 1.77, 1.78, 1.79, 1.80, 1.81, 1.82,
1.83, 1.84, 1.85, 1.86, 1.87, 1.88, 1.89, 1.90, 1.91, 1.92 ili 1.93 puta više od AUCINF kod ispitanika koji je primenjen sa istom količinom polipeptida koji se sastoji od pune dužine, zrelog faktora VIII kada se meri jednofaznim (aPTT) testom ili dvofaznim (hromogenim) testom;
MRT (aktivnost) u navedenom ispitaniku od oko 27 sati, 27 ± 1 sati, 27 ± 2 sati, 27 ± 3 sati, 27 ± 4 sati, 27 ± 5 sati, 27 ± 6 sati, 27 ± 7 sati, 27 ± 8 sati, 27 ± 9 sati, 16.7 ± 10 sati ili 27 ± 10 kao što je izmereno putem jednofaznog (aPTT) testa;
MRT (aktivnost) kod navedenog ispitanika od oko 20.6 - 35.3 sati kao što je izmereno jednofaznim (aPTT) testom;
MRT (aktivnost) kod navedenog ispitanika od oko 23.9 - 28.5 sati kao što je izmereno dvofaznim (hromogenim) testom;
MRT (aktivnost) kod navedenog ispitanika od oko 19.8 - 28.9 sati kao što je izmereno dvofaznim (hromogenim) testom; ili
MRT (aktivnost) kod navedenog ispitanika od oko 20.5 - 39.6 sati kao što je izmereno dvofaznim (hromogenim) testom.
[0113] U drugim otelotvorenjima, dugo-delujući Faktor VIII ima jedno ili više sledećih svojstava kada se daje ispitaniku:
inkrementalni oporavak u navedenom subjektu koji je uporediv sa inkrementalnim oporavkom kod ispitanika koji je primenjen sa istom količinom polipeptida koji se sastoji od pune dužine, zrelog faktora VIII kada se meri jednofaznim (aPTT) testom ili dvofaznim (hromogenim) testom;
postepeni oporavak u pomenutom ispitaniku od oko 2.44 IU/dL po IU/kg, 2.44 ± 0.1 IU/dL po IU/kg, 2.44 ± 0.2 IU/dL po IU/kg, 2.44 ± 0.3 IU/dL po IU/kg, 2.44 ± 0.4 IU/dL po IU/kg, 2.44 ± 0.5 IU/dL po IU/kg, 2.44 ± 0.6 IU/dL po IU/kg, 2.44 ± 0.7 IU/dL po IU/kg, 2.44 ± 0.8 IU/dL po IU/kg, 2.44 ± 0.9 IU/dL po IU/kg, 2.44 ± 1.0 IU/dL po IU/kg, 2.44 ± 1.1 IU/dL po IU/kg ili 2.44 ± 1.2 IU/dL po IU/kg kao što je izmereno jednofaznim (aPTT) testom kada se primenjuje oko 25 IU/kg himernog polipeptida;
postepeni oporavak u pomenutom ispitaniku od oko 2.12 - 2.81 IU/dL po IU/kg, kao što je izmereno jednofaznim (aPTT) testom kada se daje oko 25 IU/kg himernog polipeptida;
postepeni oporavak u pomenutom ispitaniku od oko 1.83 IU/dL po IU/kg, 1.83 ± 0.1 IU/dL po IU/kg, 1.83 ± 0.2 IU/dL po IU/kg, 1.83 ± 0.3 IU/dL po IU/kg, 1.83 ± 0.4 IU/dL po IU/kg, 1.83 ± 0.5 IU/dL po IU/kg, 1.83 ± 0.6 IU/dL po IU/kg, 1.83 ± 0.7 IU/dL po IU/kg, 1.83 ± 0.8 IU/dL po IU/kg, 1.83 ± 0.9 IU/dL po IU/kg, 1.83 ± 1.0 IU/dL po IU/kg ili 1.83 ± 1.1 IU/dL po IU/kg kao što je izmereno jednofaznim (aPTT) testom kada se primenjuje oko 65 IU/kg himernog polipeptida; postepeni oporavak u pomenutom ispitaniku od oko 1.59 - 2.10 IU/dL po IU/kg, kao što je izmereno jednofaznim (aPTT) testom kada se daje oko 65 IU/kg himernog polipeptida;
postepeni oporavak u pomenutom ispitaniku od oko 3.09 IU/dL po IU/kg, 3.09 ± 0.1 IU/dL po IU/kg, 3.09 ± 0.2 IU/dL po IU/kg, 3.09 ± 0.3 IU/dL po IU/kg, 3.09 ± 0.4 IU/dL po IU/kg, 3.09 ± 0.5 IU/dL po IU/kg, 3.09 ± 0.6 IU/dL po IU/kg, 3.09 ± 0.7 IU/dL po IU/kg, 3.09 ± 0.8 IU/dL po IU/kg, 3.09 ± 0.9 IU/dL po IU/kg, 3.09 ± 1.0 IU/dL po IU/kg, 3.09 ± 1.1 IU/dL po IU/kg ili 3.09 ± 1.3 IU/dL po IU/kg kao što je izmereno dvofaznim (hromogenim) testom kada se primenjuje oko 25 IU/kg himernog polipeptida;
postepeni oporavak u pomenutom ispitaniku od oko 2.80 IU/dL po IU/kg, 2.80 ± 0.1 IU/dL po IU/kg, 2.80 ± 0.2 IU/dL po IU/kg, 2.80 ± 0.3 IU/dL po IU/kg, 2.80 ± 0.4 IU/dL po IU/kg, 2.80 ± 0.5 IU/dL po IU/kg, 2.80 ± 0.6 IU/dL po IU/kg, 2.80 ± 0.7 IU/dL po IU/kg, 2.80 ± 0.8 IU/dL po IU/kg, 2.80 ± 0.9 IU/dL po IU/kg, 2.80 ± 1.0 IU/dL po IU/kg, 2.80 ± 1.1 IU/dL po IU/kg ili 2.80 ± 1.2 IU/dL po IU/kg kao što je izmereno dvofaznim (hromogenim) testom kada se primenjuje oko 65 IU/kg himernog polipeptida;
4
postepeni oporavak u pomenutom ispitaniku od oko 2.61 - -3.66 IU/dL po IU/kg, kao što je izmereno dvofaznim (hromogenim) testom kada se daje oko 25 IU/kg himernog polipeptida; ili
postepeni oporavak u pomenutom ispitaniku od oko 2.24 - -3.50 IU/dL po IU/kg, kao što je izmereno dvofaznim (hromogenim) testom kada se daje oko 65 IU/kg himernog polipeptida;
[0114] U drugim otelotvorenjima, dugo-delujući Faktor VIII ima jedno ili više sledećih svojstava kada se daje ispitaniku:
Vss (aktivnost) u navedenom subjektu koji je uporediv sa Vss (aktivnošću) kod ispitanika koji je primenjen sa istom količinom polipeptida koji se sastoji od pune dužine, zrelog faktora VIII kada se meri jednofaznim (aPTT) testom ili dvofaznim (hromogenim) testom;
Vss (aktivnost) u navedenom ispitaniku oko 45.5 mL/kg, 45.5 ± 1 mL/kg, 45.5 ± 2 mL/kg, 45.5 ± 3 mL/kg, 45.5 ± 4 mL/kg, 45.5 ± 5 mL/kg, 45.5 ± 6 mL/kg, 45.5 ± 7 mL/kg, 45.5 ± 8 mL/kg, 45.5 ± 9 mL/kg, 45.5 ± 10 mL/kg ili 45.5 ± 11 mL/kg, kao što je izmereno jednofaznim (aPTT) testom kada se primenjuje oko 25 IU/kg himernog polipeptida;
Vss (aktivnost) kod pomenutog ispitanika od oko 39.3 - 52.5 mL/dL kao što je izmereno jednofaznim (aPTT) testom kada se primenjuje oko 25 IU/kg himernog polipeptida;
Vss (aktivnost) u navedenom ispitaniku oko 62.8 mL/kg, 62.8 ± 1 mL/kg, 62.8 ± 2 mL/kg, 62.8 ± 3 mL/kg, 62.8 ± 4 mL/kg, 62.8 ± 5 mL/kg, 62.8 ± 6 mL/kg, 62.8 ± 7 mL/kg, 62.8 ± 8 mL/kg, 62.8 ± 9 mL/kg, 62.8 ± 10 mL/kg, 62.8 ± 11 mL/kg, 62.8 ± 12 mL/kg, 62.8 ± 13 mL/kg, 62.8 ± 14 mL/kg, 62.8 ± 15 mL/kg ili 62.8 ± 16 mL/kg kao što je izmereno jednofaznim (aPTT) testom kada se primenjuje oko 65 IU/kg himernog polipeptida;
Vss (aktivnost) kod pomenutog ispitanika od oko 55.2 - 71.5 mL/dL kao što je izmereno jednofaznim (aPTT) testom kada se primenjuje oko 65 IU/kg himernog polipeptida;
Vss (aktivnost) u navedenom ispitaniku oko 35.9 mL/kg, 35.9 ± 1 mL/kg, 35.9 ± 2 mL/kg, 35.9 ± 3 mL/kg, 35.9 ± 4 mL/kg, 35.9 ± 5 mL/kg, 35.9 ± 6 mL/kg, 35.9 ± 7 mL/kg, 35.9 ± 8 mL/kg, 35.9 ± 9 mL/kg, 35.910 mL/kg, 35.9 ± 11 mL/kg, 35.9 ± 12 mL/kg ili 35.9 ± 13 mL/kg, kao što je izmereno dvofaznim (hromogenim) testom kada se primenjuje oko 25 IU/kg himernog polipeptida;
Vss (aktivnost) kod pomenutog ispitanika od oko 30.4-42.3 mL/dL kao što je izmereno dvofaznim (hromogenim) testom kada se primenjuje oko 25 IU/kg himernog polipeptida;
Vss (aktivnost) u navedenom ispitaniku oko 43.4 mL/kg, 43.4 ± 1 mL/kg, 43.4 ± 2 mL/kg, 43.4 ± 3 mL/kg, 43.4 ± 4 mL/kg, 43.4 ± 5 mL/kg, 43.4 ± 6 mL/kg, 43.4 ± 7 mL/kg, 43.4 ± 8 mL/kg, 43.4 ± 9 mL/kg, 43.4 ± 10 mL/kg, 43.4 ± 11 mL/kg, 43.4 ± 12 mL/kg, 43.4 ± 13 mL/kg, 43.4 ± 14 mL/kg, 43.4 ± 15 mL/kg ili 43.4 ± 16 mL/kg kao što je izmereno dvofaznim (hromogenim) testom kada se primenjuje oko 65 IU/kg himernog polipeptida; ili
Vss (aktivnost) kod pomenutog ispitanika od oko 38.2-49.2 mL/dL kao što je izmereno dvofaznim (hromogenim) testom kada se primenjuje oko 65 IU/kg himernog polipeptida.
[0115] U drugim otelotvorenjima, dugo-delujući Faktor VIII ima jedno ili više sledećih svojstava kada se daje populaciji pacijenata:
AUCINFu navedenom ispitaniku koji je najmanje 1.48, 1.49, 1.50, 1.51, 1.52, 1.53,
1.54, 1.55, 1.56, 1.57, 1.58, 1.59, 1.60, 1.61, 1.62, 1.63, 1.64, 1.65, 1.66, 1.67, 1.68,
1.69, 1.70, 1.71, 1.72, 1.73, 1.74, 1.75, 1.76, 1.77, 1.78, 1.79, 1.80, 1.81, 1.82, 1.83,
1.84, 1.85, 1.86, 1.87, 1.88, 1.89 ili 1,90 puta više od AUCINFkod ispitanika koji je primenjen sa istom količinom polipeptida koji se sastoji od pune dužine, zrelog faktora VIII kada se meri jednofaznim (aPTT) testom ili dvofaznim (hromogenim) testom;
AUCINFkod pomenutog ispitanika 1440 ± 316 h*IU/dL po IU/kg kao što je izmereno jednofaznim (aPTT) testom kada se primenjuje oko 25 IU/kg himernog polipeptida; AUCINFkod pomenutog ispitanika 1160 - 1880 h*IU/dL po IU/kg kao što je izmereno jednofaznim (aPTT) testom kada se primenjuje oko 25 IU/kg himernog polipeptida; AUCINFkod pomenutog ispitanika 1480 h*IU/dL po IU/kg, 1480 ± 100 h*IU/dL po IU/kg, 1480 ± 200 h*IU/dL po IU/kg, 1480 ± 300 h*IU/dL po IU/kg, 1480 ± 400 h*IU/dL po IU/kg, 1480 ± 500 h*IU/dL po IU/kg, 1480 ± 600 h*IU/dL per IU/kg, 1480 ± 700 h*IU/dL po IU/kg, 1480 ± 800 h*IU/dL po IU/kg, 1480 ± 900 h*IU/dL po IU/kg ili 1480 ± 1000 h*IU/dL po IU/kg, kao što je izmereno jednofaznim (aPTT) testom kada se primenjuje oko 25 IU/kg himernog polipeptida;
AUCINFkod pomenutog ispitanika 2910 ± 1320 h*IU/dL po IU/kg kao što je izmereno jednofaznim (aPTT) testom kada se primenjuje oko 65 IU/kg himernog polipeptida;
AUCINFkod pomenutog ispitanika 1980 - 3970 h*IU/dL po IU/kg kao što je izmereno jednofaznim (aPTT) testom kada se primenjuje oko 65 IU/kg himernog polipeptida; AUCINFkod pomenutog ispitanika 2800 h*IU/dL po IU/kg, 2800 ± 100 h*IU/dL po IU/kg, 2800 ± 200 h*IU/dL po IU/kg, 2800 ± 300 h*IU/dL po IU/kg, 2800 ± 400 h*IU/dL po IU/kg, 2800 ± 500 h*IU/dL po IU/kg, 2800 ± 600 h*IU/dL po IU/kg, 2800 ± 700 h*IU/dL po IU/kg, 2800 ± 800 h*IU/dL po IU/kg, 2800 ± 900 h*IU/dL po IU/kg ili 2800 ± 1000 h*IU/dL po IU/kg, kao što je izmereno jednofaznim (aPTT) testom kada se primenjuje oko 65 IU/kg himernog polipeptida;
AUCINFkod pomenutog ispitanika 1660 h*IU/dL po IU/kg, 1660 ± 100 h*IU/dL po IU/kg, 1660 ± 200 h*IU/dL po IU/kg, 1660 ± 300 h*IU/dL po IU/kg, 1660 ± 400 h*IU/dL po IU/kg, 1660 ± 500 h*IU/dL po IU/kg, 1660 ± 600 h*IU/dL po IU/kg, 1660 ± 700 h*IU/dL po IU/kg, 1660 ± 800 h*IU/dL po IU/kg, 1660 ± 900 h*IU/dL po IU/kg, or 1660 ± 1000 h*IU/dL po IU/kg, kao što je izmereno dvofaznim (hromogenim) testom kada se primenjuje oko 25 IU/kg himernog polipeptida;
AUCINFkod pomenutog ispitanika 1300 - 2120 h*IU/dL po IU/kg kao što je izmereno dvofaznim (hromogenim) testom kada se primenjuje oko 25 IU/kg himernog polipeptida;
AUCINFkod pomenutog ispitanika 4280 h*IU/dL po IU/kg, 4280 ± 100 h*IU/dL po IU/kg, 4280 ± 200 h*IU/dL po IU/kg, 4280 ± 300 h*IU/dL po IU/kg, 4280 ± 400 h*IU/dL po IU/kg, 4280 ± 500 h*IU/dL po IU/kg, 4280 ± 600 h*IU/dL po IU/kg, 4280 ± 700 h*IU/dL po IU/kg, 4280 ± 800 h*IU/dL po IU/kg, 4280 ± 900 h*IU/dL po IU/kg, 4280 ± 1000 h*IU/dL po IU/kg, 4280 ± 1100 h*IU/dL po IU/kg, 4280 ± 1200 h*IU/dL po IU/kg, 4280 ± 1300 h*IU/dL po IU/kg, 4280 ± 1400 h*IU/dL po IU/kg, 4280 ± 1500 h*IU/dL po IU/kg ili 4280 ± 1600 h*IU/dL po IU/kg kao što je izmereno dvofaznim (hromogenim) testom kada se primenjuje oko 65 IU/kg himernog polipeptida; ili
AUCINFkod pomenutog ispitanika 2960 - 6190 h*IU/dL po IU/kg kao što je izmereno dvofaznim (hromogenim) testom kada se primenjuje oko 65 IU/kg himernog polipeptida.
[0116] "Tretman na zahtev", kako se ovde koristi, označava tretman koji je namenjen da se odvija tokom kratkog vremenskog perioda i koji je odgovor na postojeće stanje, kao što je epizoda krvarenja, ili opažena potreba kao što je planirana hirurgija. Stanja koja mogu zahtevati lečenje na zahtev uključuju, na primer, epizodu krvarenja, hemartrozu, krvarenje mišića, krvarenje u ustima, krvarenje u mišiće, traumu, traumatitis, gastrointestinalno
4
krvarenje, intrakranijalno krvarenje, intraabdominalno krvarenje, intrakranijalno krvarenje, intraabdominalno krvarenje, intrakranijalno krvarenje, fraktura kostiju, krvarenje u centralnom nervnom sistemu, krvarenje u retrofaringealnom prostoru, krvarenje u retroperitonealnom prostoru ili krvarenje u ovojnici. Ispitaniku može biti potrebna hirurška profilaksa, peri-operativno lečenje ili lečenje za operaciju. Takve operacije uključuju, npr., malu operaciju, veliku operaciju, vađenje zuba, tonzilektomiju, ingvinalnu herniotomiju, sinovijektomiju, celokupnu zamenu kolena, kraniotomiju, osteosintezu, traumatsku hirurgiju, intrakranijsku hirurgiju, intraabdominalnu hirurgiju, intratorakalnu hirurgiju ili operaciju zamene zglobova.
[0117] U jednom otelotvorenju, lečenje na zahtev rešava više od 80% (više od 80%, više od 81%, više od 82%, više od 83%, više od 84%, više od 85%, više od 86%, više od 87%, više od 88%, više od 89%, više od 90%, više od 91%, više od 92%, više od 93%, više od 94%, više od 95%, više od 96%, više od 97%, više od 98%, više od 99%, ili 100%) ili 80-100%, 80-90%, 85-90%, 90-100%, 90-95%, ili 95-100% krvarenje (npr., spontano krvarenje) u jednoj dozi. U jednom otelotvorenju, više od 80% (više od 81%, više od 82%, više od 83%, više od 84%, više od 85%, više od 86%, više od 87%, više od 88%, više od 89%, više od 90%, više od 91%, više od 92%, više od 93%, više od 94%, više od 95%, više od 96%, više od 97%, više od 98%, ili 100%) ili 80-100%, 80-90%, 85-90%, 90-100%, 90-95%, ili 95-100% epizoda krvarenja su označeni kao odlični ili dobri od strane lekara nakon tretmana na zahtev. U jednom otelotvorenju, više od 5%, (više od 6%, više od 7%, više od 8%, više od 9%, više od 10%, više od 11%, više d 12%, vod 13%, vod 14% , više od 15%, više od 16%, više od 17%, više od 18%, više od 19%, više od 20%), ili 5-20%, 5-15%, 5-10%, 10- 20%, ili 10-15% epizoda krvarenja su ocenjeni kao korektni od strane lekara nakon tretmana na zahtev.
[0118] "Polipeptid," "peptid" i "protein" se koriste naizmenično i odnose se na polimerno jedinjenje koje se sastoji iz kovalentno vezanih aminokiselinskih ostataka.
[0119] "Polinukleotid" i "nukleinska kiselina" se koriste naizmenično i odnose se na polimerno jedinjenje koje se sastoji iz kovalentno vezanih nukleotidnih ostataka.
Polinukleotidi mogu biti DNK, cDNK, RNK, jednolančani, ili dvolančani, vektori, plazmidi, fagi ili virusi. Polinukleotidi uključuju, npr., one u Tabeli 1, koji kodiraju polipeptide iz Tabele 2 (videti Tabelu 1). Polinukleotidi takođe uključuju, npr., fragmente polinukleotida iz Tabele 1, npr., one koji kodiraju fragmente polipeptida iz Tabele 2, kao što su Faktor VIII, Fc, signalna sekvenca, 6His i drugi fragmenti polipeptida iz Tabele 2.
[0120] "Profilaktički tretman", kako se ovde koristi, označava davanje polipeptida faktora VIII u višestrukim dozama subjektu tokom vremena da se poveća nivo aktivnosti faktora VIII u plazmi ispitanika . Povećani nivo može biti dovoljan da smanji učestalost spontanog krvarenja ili da spreči krvarenje, npr., u slučaju nepredviđene povrede. Tokom profilaktičkog lečenja, nivo proteina u plazmi kod ispitanika ne može pasti ispod osnovnog nivoa za tog ispitanika , ili ispod nivoa Faktora VIII koji karakteriše tešku hemofiliju (<1 IU/dl [1%]).
[0121] U jednom otelotvorenju, profilaksa je "prilagođena" pojedinačnom pacijentu, na primer, određivanjem PK podataka za svakog pacijenta i primenom Faktora VIII pronalaska u doznom intervalu koji održava najniži nivo od 1-3% FVIII aktivnosti. Podešavanja se mogu izvršiti kada ispitanik doživi neprihvatljive epizode krvarenja definisane kao ≥ 2 epizode spontanog krvarenja tokom dvomesečnog perioda probe. U ovom slučaju, prilagođavanje će ciljati najniže nivoe od 3-5%. U još jednom otelotvorenju, profilaktički tretman rezultira prevencijom i kontrolom krvarenja, kontinuiranom kontrolom krvarenja, održivom zaštitom od krvarenja i/ili kontinuiranom koristi. Profilaksa, npr., trajna zaštita može se pokazati povećanom AUC do zadnje izmerene vremenske tačke (AUC-LAST) i smanjenim klirensom, što rezultira povećanim terminalnim t1/2 u odnosu na kratko-delujući FVIII. Profilaksa se može pokazati boljim Cmax, boljim Tmax, i/ili većim srednjim vremenom zadržavanja u odnosu na kratko-delujući FVIII. U nekim otelotvorenjima, profilaksa ne dovodi do spontanih epizoda krvarenja unutar oko 24, 36, 48, 72 ili 96 sati (npr., 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 96, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 ili 96 sati), nakon injekcije (npr., poslednja injekcija). U nekim otelotvorenjima, profilaksa ima za rezultat više od 30% (npr., više od 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 96, 87, 88, 89, ili 90%, na primer, više od 50%), srednja redukcija u godišnjim epizodama krvarenja sa doziranjem jednom nedeljno (npr., 65 IU/kg).
"Terapijska doza", kako se ovde koristi, označava dozu koja postiže terapeutski cilj, kao što je ovde opisano. Izračunavanje potrebne doze faktora VIII zasniva se na empirijskom nalazu
4
da, u proseku, 1 IU faktora VIII po kg telesne težine povećava aktivnost faktora VIII u plazmi za približno 2 IU/dL. Potrebna doza se određuje sledećom formulom:
[0122] Terapijske doze koje se mogu koristiti u postupcima iz obelodanjivanja su oko 10-100 IU/kg, preciznije, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70 -80, 80-90, ili 90-100 IU/kg, i konkretnije, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 , 90, 95 ili 100 IU/kg.
[0123] Terapijske doze koje se mogu koristiti u postupcima iz obelodanjivanja su oko 10-100 IU/kg, preciznije, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70 -80, 80 -90, ili 90-100 IU/kg, i konkretnije, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ili 100 IU/kg.
[0124] "Varijanta", kako se ovde koristi, odnosi se na polinukleotid ili polipeptid koji se razlikuje od originalnog polinukleotida ili polipeptida, ali zadržava njegove esencijalne karakteristike, npr., aktivnost koagulanta Faktora VIII ili aktivnost Fc (FcRn). Generalno, varijante su generalno slične, i, u mnogim regionima, identične originalnom polinukleotidu ili polipeptidu. Varijante uključuju, npr., polipeptidne i polinukleotidne fragmente, delecije, insercije i modifikovane verzije originalnih polipeptida.
[0125] Varijantni polinukleotidi mogu da sadrže, ili alternativno sadrže, nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična, na primer, sekvenci koja kodira nukleotide u SEQ ID NO:1, 3 ili 5 (deo faktora VIII, Fc deo, pojedinačno ili zajedno) ili komplementarni lanac, sekvenca koja kodira nukleotide poznatog mutanta i rekombinantnog faktora VIII ili Fc, kao što su oni opisani u publikacijama i patentima Navedena sekvenca ili komplementarni lanac, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid SEQ ID NO:2, 4 ili 6 (deo faktora VIII, Fc deo, pojedinačno ili zajedno), i/ili polinukleotidni fragmenti bilo koje od ovih nukleinskih molekuli kiseline (npr., ovde opisani fragmenti). Polinukleotidi koji se hibridizuju sa ovim molekulima nukleinske kiseline pod strogim uslovima hibridizacije ili sa manje strogim uslovima takođe su uključeni kao varijante, kao i polipeptidi kodirani ovim polinukleotidima sve dok su funkcionalni.
[0126] Varijantni polipeptidi mogu sadržati, ili alternativno sadrže, aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identična, na primer,
4
polipeptidnoj sekvenci prikazanoj u SEQ ID NOS:2, 4, ili 6 (deo faktora VIII, Fc deo, pojedinačno ili zajedno), i/ili polipeptidni fragmenti bilo kog od ovih polipeptida (npr., ovde opisani fragmenti).
[0127] Nukleinskom kiselinom koja ima nukleotidnu sekvencu najmanje, na primer, 95% "identična" referentnoj nukleotidnoj sekvenci, namera je da je nukleotidna sekvenca nukleinske kiseline identična referentnoj sekvenci osim što nukleotidna sekvenca može uključiti do pet tačkastih mutacija za svakih 100 nukleotida referentne nukleotidne sekvence. Drugim rečima, da bi se dobila nukleinska kiselina koja ima nukleotidnu sekvencu najmanje 95% identičnu referentnoj nukleotidnoj sekvenci, do 5% nukleotida u referentnoj sekvenci može biti izbrisano ili supstituisano sa drugim nukleotidom, ili sa brojem nukleotida do 5% ukupnih nukleotida u referentnoj sekvenci može biti ubačeno u referentnu sekvencu. Upitna sekvenca može biti, na primer, čitava sekvenca prikazana u SEQ ID NO:1 ili 3, ORF (otvoreni okvir za čitanje), ili bilo koji fragment koji je ovde opisan.
[0128] Kao praktična stvar, da li se može odrediti bilo koji određeni molekul nukleinske kiseline ili polipeptid najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan nukleotidnoj sekvenci ili polipeptidu ovog pronalaska. uobičajenim korišćenjem poznatih kompjuterskih programa. U jednom otelotvorenju, postupak za određivanje najboljeg ukupnog podudaranja između sekvence upita (referentne ili originalne sekvence) i sekvence ispitivanja, koja se takođe naziva globalno poravnanje sekvenci, može se odrediti korišćenjem FASTDB računarskog programa zasnovanog na algoritmu Brutlag i dr., Comp. App. Biosci.6:237-245 (1990). U redosledu sekvenci sekvence upita i ispitanika su obe DNK sekvence. RNK sekvenca se može uporediti konvertovanjem U u T. Rezultat navedenog poravnanja globalne sekvence je u procentu identiteta. U sledećem otelotvorenju, parametri koji se koriste u FASTDB poravnanju DNK sekvenci za izračunavanje procenta identiteta su: Matrica=Jedinična , k-tuple=4, Penal neusklađenosti=1, Penal pridruživanja=30, Dužina grupe za nasumičnost=0, Rezultat odsecanja=1, Penal pukotine=5, Penal veličine pukotine 0.05, Veličina prozora=500 ili dužina predmetne nukleotidne sekvence, koja je kraća.
[0129] Ako je sekvenca ispitanika kraća od sekvence upita zbog 5’ ili 3' brisanja, a ne zbog internih brisanja, ručno ispravljanje rezultata mora biti izvršeno. To je zato što FASTDB program ne računa za 5’ i 3' skraćenice subjekt sekvence kada izračunava procenat identiteta.
4
Za predmetne sekvence skraćene na 5’ ili 3' krajevima, u odnosu na sekvencu upita, procenat identiteta se koriguje izračunavanjem broja baza za sekvencu upita koje su 5’ i 3' sekvence ispitanika , koje nisu uparene/poravnati, kao procenat ukupnih baza sekvence upita. Da li je ostatak usklađen/poravnat određen je rezultatima poravnanja FASTDB sekvence. Ovaj procenat se zatim oduzima od procenta identiteta, izračunatog pomoću gore navedenog FASTDB programa koristeći navedene parametre, da bi se dobio konačni procenat identiteta procenta. Ovaj korigovani rezultat je ono što se koristi u svrhe ovog pronalaska. Samo baze van 5’ i 3' baza predmetne sekvence, kao što je prikazano u FASTDB poravnanju, koje nisu uparene/poravnate sa sekvencom upita, izračunate su za potrebe ručnog podešavanja procenta identičnosti.
[0130] Na primer, 90 baza predmetne sekvence je poravnata sa 100 baza predmetne sekvence da bi se odredio procenat identiteta. Brisanja se dešavaju na 5’ kraju sekvence ispitanika i prema tome, FASTDB poravnanje ne pokazuje uparivanje/poravnanje prvih 10 baza na 5' kraju. 10 neuparenih baza predstavljaju 10% sekvence (broj baza na 5’ i 3' krajevima nije usklađen/ukupan broj baza u sekvenciji upita) tako da se 10% oduzima od procenta procene identiteta izračunatog od strane FASTDB programa. Ako se preostalih 90 baza savršeno poklapa, konačni procenat identiteta bi bio 90%. U drugom primeru, 90 baznih predmetnih sekvenci upoređeno je sa 100 baznih predmetnih sekvenci. Ovaj put delecije su unutrašnja brisanja, tako da nema osnova na 5’ ili 3' sekvence ispitanika koje nisu uparene/poravnate sa upitom. U ovom slučaju procenat identiteta izračunat od strane FASTDB nije ručno ispravljen. Još jednom, samo baze 5’ i 3' sekvence ispitanika koje nisu uparene/poravnate sa sekvencom upita su ručno ispravljene. Nikakve druge ručne korekcije nisu napravljene za svrhe ovog pronalaska.
[0131] Polipeptidom koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje, na primer, 95% "identičan" upitnoj aminokiselinskoj sekvenci ovog pronalaska, namera je da aminokiselinska sekvenca predmetnog polipeptida bude identična sa sekvencom upita osim predmetna polipeptidna sekvenca može da obuhvati do pet aminokiselinskih promena za svaku 100 aminokiselina iz sekvence upitne aminokiseline. Drugim rečima, da bi se dobio polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična sekvenci upita za aminokiselinu, do 5% aminokiselinskih ostataka u predmetnoj sekvenci može biti ubačeno, izbrisano, (indels) ili supstituisano sa drugu aminokiselinu. Ove promene referentne sekvence mogu se pojaviti na amino ili karboksi terminalnim pozicijama referentne aminokiselinske
4
sekvence ili bilo gde između onih terminalnih pozicija, isprepletanih bilo pojedinačno između ostataka u referentnoj sekvenci ili u jednoj ili više susednih grupa unutar referentne sekvence.
[0132] Kao praktična stvar, da li je bilo koji određeni polipeptid najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan, na primer, aminokiselinskim sekvencama SEQ ID NO:2 (deo faktora VIII, Fc deo, pojedinačno ili zajedno) ili 4, ili poznati sekvenca faktora VIII ili Fc polipeptida, može se konvencionalno odrediti korišćenjem poznatih kompjuterskih programa. U jednom otelotvorenju, postupak za određivanje najboljeg ukupnog podudaranja između sekvence upita (referentne ili originalne sekvence) i sekvence ispitanika, koja se takođe naziva globalno poravnanje sekvenci, može se odrediti korišćenjem FASTDB računarskog programa zasnovanog na algoritmu Brutlag i dr., Comp. App. Biosci.6:237-245(1990). U redosledu sekvenci, sekvence upita i ispitanika su ili nukleotidne sekvence ili obe aminokiselinske sekvence. Rezultat navedenog poravnanja globalne sekvence je u procentu identiteta. U još jednom otelotvorenju, parametri koji se koriste u FASTDB aminokiselinskom poravnanju su: Matrica=PAM 0, k-tuple=2, Penal neusklađenosti=1, Penal pridruživanja=20, Dužina grupe za nasumičnost=0, Rezultat odsecanja=1, Veličina prozora=dužina sekvence, Penal pukotine=5, Penal veličine pukotine 0.05, Veličina prozora=500 ili dužina predmetne aminokiselinske sekvence, koja je kraća.
[0133] Ako je predmetna sekvenca kraća od sekvence upita zbog N-ili C-terminalnih brisanja, a ne zbog internih brisanja, ručno ispravljanje rezultata mora biti izvršeno. To je zato što FASTDB program ne računa za N- i C-terminalno skraćivanje sekvence ispitanika kada izračunava globalni procenat identiteta. Za predmetne sekvence skraćene na N- i C-krajevima, u odnosu na sekvencu upita, procenat identiteta je korigovan izračunavanjem broja ostataka sekvence upita koji su N- i C-terminalni niz sekvenci, koji nisu upareni/poravnati sa odgovarajućim predmetnim ostatkom, kao procenat od ukupnih baza sekvence upita. Da li je ostatak usklađen/poravnat određen je rezultatima poravnanja FASTDB sekvence. Ovaj procenat se zatim oduzima od procenta identiteta, izračunatog pomoću gore navedenog FASTDB programa koristeći navedene parametre, da bi se dobio konačni procenat identiteta procenta. Ovaj konačni procenat procene identiteta je ono što se koristi za svrhe ovog pronalaska. Samo ostaci N- i C-krajeva predmetne sekvence, koji nisu upareni/poravnati sa sekvencom upita, razmatraju se u svrhu ručnog podešavanja procenta procene identiteta. To jest, samo pozicije ostataka upita izvan najudaljenijih N- i C-terminalnih ostataka predmetne sekvence.
4
[0134] Na primer, 90 aminokiselinskih ostataka predmetne sekvence je poravnata sa 100 ostatak predmetne sekvence da bi se odredio procenat identiteta. Brisanja se dešavaju na N-terminusu sekvence ispitanika i prema tome, FASTDB poravnanje ne pokazuje uparivanje/poravnanje prvih 10 ostatka na N-terminusu. 10 neuparenih ostataka predstavljaju 10% sekvence (broj ostataka na N- i C- krajevima nije usklađen/ukupan broj ostataka u sekvenciji upita) tako da se 10% oduzima od procenta procene identiteta izračunatog od strane FASTDB programa. Ako se preostalih 90 ostataka savršeno poklapa, konačni procenat identiteta bi bio 90%. U drugom primeru, 90 ostataka predmetnih sekvenci upoređeno je sa 100 ostataka predmetnih sekvenci. Ovaj put delecije su unutrašnja brisanja, tako nema ostatka na N- ili C- sekvence ispitanika koje nisu uparene/poravnate sa upitom. U ovom slučaju procenat identiteta izračunat od strane FASTDB nije ručno ispravljen. Još jednom, samo pozicije ostataka izvan N- i C-terminalnih krajeva predmetne sekvence, kao što je prikazano u FASTDB poravnanju, koje nisu uparene/poravnate sa sekvencom upita su ručno ispravljene za. Nikakve druge ručne korekcije nisu napravljene za svrhe ovog pronalaska.
[0135] Polinukleotidne varijante mogu sadržati izmene u kodirajućim regionima, nekodirajućim regionima ili oba. U jednom otelotvorenju, ove polinukleotidne varijante sadrže izmene koje proizvode tihe supstitucije, dodavanja, ili brisanja, ali ne menjaju svojstva ili aktivnost kodiranog polipeptida. U drugom otelotvorenju, nukleotidne varijante su proizvedene tihim supstitucijama usled degeneracije genetskog koda. U drugim otelotvorenjima, varijante u kojima su 5-10, 1-5, ili 1-2 aminokiseline supstituisani, izbrisani ili dodati u bilo kojoj kombinaciji. Polinukleotidne varijante mogu biti proizvedene iz različitih razloga, npr., da se optimizuje ekspresija kodona za određenog domaćina (promena kodona u humanoj mRNK na druge, npr., bakterijski domaćin kao što je E.coli).
[0136] Prirodno nastale varijante se nazivaju "alelne varijante" i odnose se na jedan od nekoliko alternativnih oblika gena koji zauzimaju određeni lokus na hromozomu organizma (Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985)). Ove alelne varijante mogu varirati bilo na nivou polinukleotida i/ili polipeptida i uključene su u ovaj pronalazak.
Alternativno, ne-prirodne varijante mogu biti proizvedene tehnikama mutageneze ili direktnom sintezom.
[0137] Koristeći poznate postupke inženjeringa proteina i tehnologiju rekombinantne DNK, mogu se generisati varijante za poboljšanje ili promenu karakteristika polipeptida. Na primer, jedna ili više aminokiselina mogu biti izbrisane iz N-terminusa ili C-terminusa izlučenog proteina bez značajnog gubitka biološke funkcije. Ron i dr., J. Biol. Chem.268:2984-2988 (1993), prijavljena varijanta KGF proteina koji imaju aktivnost vezivanja heparina čak i nakon brisanja 3, 8 ili 27 amino-terminalnih aminokiselinskih ostataka. Slično tome, Interferon gama pokazuje do deset puta veću aktivnost nakon brisanja 8-10 aminokiselinskih ostataka iz karboksi terminusa ovog proteina. (Dobeli i dr., J. Biotechnology 7:199-216 (1988).
[0138] Štaviše, brojni dokazi pokazuju da varijante često zadržavaju biološku aktivnost sličnu onoj kod prirodno prisutnog proteina. Na primer Gayle and coworkers (J. Biol. Chem 268:22105-22111 (1993) sprovedena je opsežna mutacijska analiza humanog citokina IL-1a. Oni su koristili slučajnu mutagenezu da bi generisali preko 3500 pojedinačnih IL-1a mutanata koji su u proseku iznosili 2.5 aminokiselinskih promena po varijanti po celoj dužini molekula. Mnoge mutacije su ispitivane na svim mogućim aminokiselinskim položajima. Istraživači su otkrili da "[većina molekula može biti promenjena sa malim efektom na [vezivanje ili biološku aktivnost]." (Videti sažetak.) U stvari, samo 23 jedinstvene aminokiselinske sekvence, od više od 3.500 ispitanih nukleotidnih sekvenci, proizvele su protein koji se značajno razlikovao u aktivnostima od divljeg tipa.
[0139] Kao što je iznad navedeno, polipeptidne varijante uključuju, npr., modifikovane polipeptide. Modifikacije uključuju, na primer, acetilaciju, acilaciju, ADP-ribozilaciju, amidaciju, kovalentno vezivanje flavina, kovalentno vezivanje heme grupe, kovalentno vezivanje nukleotidnog ili nukleotidnog derivata, kovalentno vezivanje lipidnog ili lipidnog derivata, kovalentno vezivanje fosfatidilinozitola, umrežavanje, ciklizacija, formiranje disulfidnih veza, demetilacija, formiranje kovalentnih unakrsnih veza, formiranje cisteina, formiranje piroglutamata, formilacija, gama-karboksilacija, glikozilacija, formiranje sidra GPI, hidroksilacija, jodinacija, metilacija, miristilacija, oksidacija, pegilacija (Mei i dr., Blood 116:270-79 (2010)), proteolitička obrada, fosforilacija, prenilacija, racemizacija, selenoilacija, sulfatacija, transfer-RNK posredovana dodavanja aminokiselina proteinima kao što su arginilacija i ubikvitinacija. U nekim otelotvorenjima, Faktor VIII je modifikovan, npr., pegilovan, na bilo kojem pogodnom mestu. U nekim otelotvorenjima, Faktor VIII je pegilovan na površinski izloženoj aminokiselini Faktora VIII, npr., cistein na površini
1
izložen, koji može biti inženjerski cistein. U nekim otelotvorenjima, modifikovani Faktor VIII, npr., pegilovani Faktor VIII, je dugo-delujući Faktor VIII.
[0140] "Zapremina distribucije u stabilnom stanju (Vss)", kako se ovde koristi, ima isto značenje kao termin koji se koristi u farmakologiji, što je prividni prostor (zapremina) u koji se lek distribuira. Vss=količina leka u telu podeljena sa koncentracijom u plazmi u stabilnom stanju.
[0141] Himerni polipeptid koji je ovde korišćen može da sadrži obrađeni faktor VIII ili jednolančani faktor VIII ili njihovu kombinaciju. "Obrađeni faktor VIII", kako je ovde korišćeno, označava Faktor VIII koji je ocepljen na Argininu 1648 (za Faktor VIII pune dužine) ili Arginin 754 (za Faktor VIII koji je izbrisan iz B-domena), tj., intracelularno mesto obrade. Zbog cepanja na intracelularnom mestu obrade, obrađeni faktor VIII sadrži dva polipeptidna lanca, prvi lanac je teški lanac i drugi lanac je lak lanac. Na primer, obrađeni fuzioni protein faktora VIII-Fc (tj., teški lanac i laki lanac fuzionisani sa Fc) teče na približno 90 kDa i 130 kDa na ne-redukujućem SDS-PAGE, odnosno, i 90 kDa i 105 kDa na smanjenje SDS-PAGE, respektivno. Prema tome, u jednom slučaju, najmanje oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98% %, oko 99%, ili oko 100% dela Faktora VIII u himernom polipeptidu je obrađen Faktor VIII. U još jednom otelotvorenju, oko 75%, oko 80%, oko 85% dela faktora VIII u himernom polipeptidu je obrađeno Faktorom VIII. U posebnom slučaju, himerni polipeptid koji sadrži obrađeni faktor VIII je prečišćen (ili izolovan) iz himernog polipeptida koji sadrži jednolančani Faktor VIII, i najmanje oko 90%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98% oko 99%, ili oko 100% dela Faktora VIII u himernom polipeptidu je obrađen Faktor VIII.
[0142] "Faktor VIII za jedan lanac", "SC Faktor VIII" ili "SCFVIII", kako je ovde korišćen, znači Faktor VIII koji nije ocepljen na mestu arginina (ostatak 1648 za Faktor VIII pune dužine (tj., ostatak 1667 SEQ ID NO:6) ili ostatak 754 za faktor VIII koji je izbrisan za B-domen (tj., ostatak 773 SEQ ID NO:2). Zbog toga, lanac jedinjenja VIII u himernom polipeptidu koji se ovde koristi sadrži jedan lanac. U jednom otelotvorenju, jednolančani faktor VIII sadržati netaknuto intracelularno mesto za obradu. U drugom otelotvorenju, jednolančani Faktor FVIII sadrži supstituciju ili mutaciju na položaju aminokiseline koja odgovara argininu 1645, supstituciju ili mutaciju na položaju aminokiseline koja odgovara argininu 1648, ili supstituciju ili mutaciju na položajima aminokiselina koji odgovaraju
2
argininu 1645 i argininu 1648 u Faktoru VIII pune dužine. U nekim drugim otelotvorenjima, aminokiselina supstituisana na položaju aminokiseline koja odgovara argininu 1645 je različita aminokiselina od aminokiseline supstituisane na položaju aminokiseline koja odgovara argininu 1648. U izvesnim otelotvorenjima, supstitucija ili mutacija je aminokiselina drugačija od arginina, npr., izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenilalanin, treonin, triptofan, valin, alanin, asparagin, aspirinska kiselina, cistein, glutaminska kiselina, glutamin, glicin, prolin, selenocistein, serin, tirozin, histidin, ornitin, pirolizin ili taurin. Fuzioni protein Faktora VIII-Fc jednolančanog lanca može da radi na približno 220 kDa na SDS-PAGE koji nije redukovan i na približno 195 kDa na redukujućem SDS-PAGE.
[0143] U jednom slučaju, himerni polipeptid koji sadrži jednolančani Faktor VIII je prečišćen (ili izolovan) od himernog polipeptida koji sadrži obrađeni Faktor VIII, i najmanje oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95%, oko 99%, ili oko 100% dela Faktora VIII himernog polipeptida koji je ovde korišćen je jednolančani Faktor VIII. U drugom slučaju, najmanje oko 1%, oko 5%, oko 10%, oko 15%, oko 20%, oko 25%, oko 30%, ili oko 35% dela Faktora VIII himernog polipeptida je jednolančani Faktor VIII. U drugim otelotvorenjima, korišćeno je oko 15%-oko 25% dela Faktora VIII himernog polipeptida jednolančanog Faktora VIII. U određenom otelotvorenju, oko 15%, oko 20%, oko 25% dela faktora VIII u himernom polipeptidu je ovde korišćeno je obrađeno Faktorom VIII. U jednom slučaju, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98% %, oko 99%, ili oko 100% dela Faktora VIII u himernom polipeptidu je ovde korišćeno jednolančani Faktor VIII. U drugim otelotvorenjima, odnos jednolančanog Faktora VIII prema obrađenom faktoru VIII himernog polipeptida je (a) oko 25% jednolančanog faktora VIII i oko 75% obrađenog faktora VIII; (b) oko 20% jednolančanog Faktora VIII i oko 80% obrađenog faktora VIII; (c) oko 15% jednolančanog Faktora VIII i oko 85% obrađenog faktora VIII; U drugim slučajevima, odnos jednolančanog Faktora VIII prema obrađenom faktoru VIII himernog polipeptida je (a) oko 30% jednolančanog faktora VIII i oko 70% obrađenog faktora VIII; (b) oko 40% jednolančanog Faktora VIII i oko 60% obrađenog faktora VIII; (c) oko 50% jednolančanog Faktora VIII i oko 50% obrađenog faktora VIII; (d) oko 60% jednolančanog Faktora VIII i oko 40% obrađenog faktora VIII; (e) oko 70% jednolančanog Faktora VIII i oko 30% obrađenog faktora VIII; (f) oko 80% jednolančanog Faktora VIII i oko 20% obrađenog faktora VIII; (g) oko 90% jednolančanog Faktora VIII i oko 10% obrađenog faktora VIII; (h) oko 95% jednolančanog Faktora VIII i oko 5% obrađenog faktora VIII; (i) oko 99% jednolančanog Faktora VIII i oko 1% obrađenog faktora VIII; ili (j) oko 100% jednolančanog Faktora VIII.
[0144] Deo Faktora VIII u himernom polipeptidu koji se ovde koristi ima aktivnost Faktora VIII. Aktivnost Faktora VIII može se meriti bilo kojim poznatim postupkom u tehnici. Na primer, jedan od tih postupaka može biti hromogeni test. Mehanizam hromogenog testa zasniva se na principima kaskade koagulacije krvi, gde aktivirani faktor VIII ubrzava konverziju faktora X u faktor Xa u prisustvu aktiviranog faktora IX, fosfolipida i kalcijumovih jona. Aktivnost faktora Xa se procenjuje hidrolizom p-nitroanilidnog (pNA) supstrata specifičnog za faktor Xa. Početna brzina oslobađanja p-nitroanilina merena na 405 nM je direktno proporcionalna aktivnosti faktora Xa, a time i aktivnosti faktora VIII u uzorku. Hromogeni test se preporučuje od strane pod komiteta Faktora VIII i Faktora IX Komiteta za nauku i standardizaciju (SSC) Međunarodnog društva za trombozu i hemostazu (ISTH). Od 1994. godine, hromogeni test je takođe bio referentni postupak Evropske farmakopeje za određivanje potentnosti FVIII koncentrata. Prema tome, u jednom otelotvorenju, himerni polipeptid koji sadrži jednolančani Faktor VIII ima aktivnost Faktora VIII uporedivu sa himernim polipeptidom koji sadrži obrađeni Faktor VIII (npr., himerni polipeptid koji se sastoji u osnovi od ili se sastoji od dva Fc dela i obrađenog Faktora VIII, gde je pomenuti obrađen Faktor VIII je fuzionisan sa jednim od dva Fc dela), kada se aktivnost Faktora VIII meri in vitro pomoću hromogenog testa.
[0145] U drugim otelotvorenjima, himerni polipeptid koji sadrži jednolančani Faktor VIII ovog pronalaska ima stopu generisanja Faktora Xa koja se može uporediti sa himernim polipeptidom koji sadrži obrađeni Faktor VIII (npr., himerni polipeptid koji se u osnovi sastoji od ili se sastoji od dva Fc dela i obrađenog Faktora VIII, pri čemu je obrađen Faktor VIII je fuzionisan sa jednim Fc od dva Fc dela).
[0146] Da bi se Faktor X aktivirao na Faktor Xa, aktivirani Faktor IX (Faktor IXa) hidrolizira jednu arginin-izoleucinsku vezu u Faktoru X da formira Faktor Xa u prisustvu Ca2+, membranskih fosfolipida i faktora VIII kofaktora. Zbog toga je interakcija faktora VIII sa faktorom IX kritična za put koagulacije. U drugim otelotvorenjima, himerni polipeptid koji sadrži jednolančani Faktor VIII ovog pronalaska ima stopu generisanja Faktora Xa koja se može uporediti sa himernim polipeptidom koji sadrži obrađeni Faktor VIII (npr., himerni
4
polipeptid koji se u osnovi sastoji od ili se sastoji od dva Fc dela i obrađenog Faktora VIII, pri čemu je obrađen Faktor VIII je fuzionisan sa jednim Fc od dva Fc dela).
[0147] Pored toga, faktor VIII je vezan za von Willebrandov faktor dok je neaktivan u cirkulaciji. Faktor VIII se brzo razgrađuje kada nije vezan za vWF i oslobađa se iz vWF dejstvom trombina. U određenim otelotvorenjima, himerni polipeptid koji sadrži jednolančani Faktor VIII se vezuje za von Willebrandov faktor na nivou koji je uporediv sa himernim polipeptidom koji sadrži obrađeni faktor VIII (npr., himerni polipeptid koji se u osnovi sastoji od ili se sastoji od dva Fc dela i obrađenog Faktora VIII, pri čemu je obrađen Faktor VIII je fuzionisan sa jednim Fc od dva Fc dela).
[0148] Faktor VIII može biti inaktiviran aktiviranim proteinom C u prisustvu kalcijuma i fosfolipida. Aktivirani protein C razlaže teški lanac Faktora VIII nakon Arginina 336 u domenu A1, što remeti mesto interakcije supstrata Faktora X, i odvaja se nakon Arginina 562 u A2 domenu, što poboljšava disocijaciju A2 domena, kao i ometa mesto interakcije sa Faktorom IXa. Ovo cepanje takođe razdvaja A2 domenu (43 kDa) i generiše A2-N (18 kDa) i A2-C (25 kDa) domene. Prema tome, aktivirani protein C može katalizovati višestruka mesta cepanja u teškom lancu. U jednom otelotvorenju, himerni polipeptid koji sadrži jednolančani Faktor VIII je inaktiviran aktiviranim proteinom C na nivou koji je uporediv sa himernim polipeptidom koji sadrži obrađeni faktor VIII (npr., himerni polipeptid koji se u osnovi sastoji od ili se sastoji od dva Fc dela i obrađenog Faktora VIII, pri čemu je obrađen Faktor VIII je fuzionisan sa jednim Fc od dva Fc dela).
[0149] U jednom otelotvorenju, himerni polipeptid koji sadrži jednolančani Faktor VIII ima aktivnost faktora VIII in vivo uporedivu sa himernim polipeptidom koji sadrži obrađeni faktor VIII (npr., himerni polipeptid koji se u osnovi sastoji od ili se sastoji od dva Fc dela i obrađenog Faktora VIII, pri čemu je obrađen Faktor VIII je spojen sa jednim Fc od dva Fc dela). U posebnom otelotvorenju, himerni polipeptid koji sadrži jednolančani faktor VIII je sposoban da zaštiti HemA miš na nivou koji je uporediv sa himernim polipeptidom koji sadrži obrađeni faktor VIII (npr., himerni polipeptid koji se sastoji uglavnom od dva sastojka ili se sastoji od dva Fc dela i obrađenog faktora VIII, gde je pomenuti obrađeni faktor VIII fuzionisan sa jednim Fc od dva Fc dela) u modelu transekcije repne vene HemA miša.
[0150] Termin "uporediv", kako je ovde korišćen, označava upoređenu stopu ili nivo koji je rezultat upotrebe himernog polipeptida jednak, u suštini jednak ili sličan referentnoj stopi ili nivou. Termin "sličan", kako je ovde korišćen, označava upoređenu stopu ili nivo koji ima razliku od ne više od 10% ili ne više od 15% od referentne stope ili nivoa (npr. Brzina generisanja FXa pomoću himernog polipeptida koji se sastoji uglavnom od ili se sastoji od dva Fc dela i obrađeni Faktor VIII, pri čemu je navedeni obrađeni Faktor VIII fuzionisan sa jednim Fc od dva Fc dela). Termin "u suštini jednak" znači da je stopa ili nivo u poređenju niža od 0.01%, 0.5% ili 1% od referentne stope ili nivoa.
[0151] Predmetno obelodanjivanje dalje obuhvata sastav koji sadrži himerni polipeptid koji ima aktivnost Faktora VIII, gde najmanje oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 85%, oko 90% oko 95%, ili oko 99% himernog polipeptida sadrži deo Faktora VIII, koji je jednolančani Faktor VIII i drugi deo. U drugom slučaju, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%. % ili oko 99% himernog polipeptida u sastavu je jednolančani Faktor VIII. U drugom otelotvorenju, drugi deo je Fc, XTEN, albumin, PAS sekvenca, transferin, CTP (28 C-terminalni peptid aminokiseline (CTP) hCG sa 4 O-glikana), polietilen glikol (PEG), hidroksietil skrob (HES), albumin-vezujući polipeptid, albumin-vezujući mali molekuli ili dve ili više njihovih kombinacija. U još nekim slučajevima, sastav iz predmetnog obelodanjivanja obuhvata kombinaciju himernog polipeptida koji sadrži obrađeni Faktor VIII i himerni polipeptid koji sadrži jednolančani faktor VIII, (a) gde je oko 30% dela Faktora VIII himernog polipeptida jednolančanog Faktora VIII, i oko 70% dela Faktora VIII himernog polipeptida je obrađen Faktor VIII; (b) gde je oko 40% dela Faktora VIII himernog polipeptida jednolančani Faktor VIII, i oko 60% dela Faktora VIII himernog polipeptida je obrađeni Faktor VIII; (c) gde je oko 50% dela Faktora VIII himernog polipeptida jednolančani Faktor VIII, i oko 50% dela Faktora VIII himernog polipeptida je obrađeni Faktor VIII; (d) gde je oko 60% dela Faktora VIII himernog polipeptida jednolančani Faktor VIII, i oko 40% dela Faktora VIII himernog polipeptida je obrađeni Faktor VIII; (e) gde je oko 70% dela Faktora VIII himernog polipeptida jednolančani Faktor VIII, i oko 30% dela Faktora VIII himernog polipeptida je obrađeni Faktor VIII; (f) gde je oko 80% dela Faktora VIII himernog polipeptida jednolančani Faktor VIII, i oko 20% dela Faktora VIII himernog polipeptida je obrađeni Faktor VIII; (g) gde je oko 90% dela Faktora VIII himernog polipeptida jednolančani Faktor VIII, i oko 10% dela Faktora VIII himernog polipeptida je obrađeni Faktor VIII; (h) gde je oko 95% dela Faktora VIII himernog polipeptida jednolančani Faktor VIII, i oko 5% dela Faktora VIII himernog polipeptida je obrađeni Faktor VIII; (i) gde je oko 99% dela Faktora VIII himernog polipeptida jednolančani Faktor VIII, i oko 1% dela Faktora VIII himernog polipeptida je obrađeni Faktor VIII; ili (j) gde je oko 100% dela Faktora VIII himernog polipeptida jednolančani faktor VIII.
[0152] U određenim otelotvorenjima, sastav iz ovog pronalaska obuhvata kombinaciju himernog polipeptida koji sadrži obrađeni Faktor VIII i himerni polipeptid koji sadrži jednolančani Faktor VIII, (a) gde je oko 30% Faktora VIII himernog polipeptida pojedinačno lanac Faktora VIII, i oko 70% dela Faktor VIII himernog polipeptida je obrađen Faktor VIII;
[0153] U drugim otelotvorenjima, sastav pronalaska ima stopu generisanja faktora Xa koja se može porediti sa sastavom koji sadrži obrađeni Faktor VIII (npr., sastav koji sadrži himerni polipeptid, koji se sastoji u osnovi od ili se sastoji od dva Fc dela i obrađenog Faktora VIII, gde je obrađeni Faktor VIII spojen sa jednim Fc od dva Fc dela). U još nekim drugim otelotvorenjima, sastav koji sadrži jedan lanac Faktora VIII može da stupa u interakciju sa Faktorom IXa brzinom koja je uporediva sa sastavom koji sadrži obrađeni Faktor VIII (npr., sastav koji sadrži himerni polipeptid, koji se u osnovi sastoji ili se sastoji od dva Fc dela i obrađen Faktor VIII, gde je obrađeni faktor VIII spojen sa jednim Fc). U sledećim otelotvorenjima, jednolančani Faktor VIII u himernom polipeptidu ovog sastava je inaktiviran aktiviranim proteinom C na nivou koji je uporediv sa obrađenim Faktorom VIII u himernom polipeptidu sastava (npr., sastav koji sadrži himerni polipeptid, koji se sastoji od suštinski od ili se sastoji od dva Fc dela i obrađenog Faktora VIII, pri čemu je obrađeni Faktor VIII fuzionisan sa jednim Fc od dva Fc dela). U posebnom otelotvorenju, sastav koji sadrži jednolančani Faktor VIII ima aktivnost Faktora VIII in vivo uporedivu sa sastavom koji sadrži obrađeni Faktor VIII (npr. sastav koji sadrži himerni polipeptid, koji se sastoji u osnovi od ili se sastoji od dva Fc dela i obrađenog Faktora VIII gde je obrađeni Faktor VIII spojen sa jednim Fc od dva Fc dela). U nekim otelotvorenjima, sastav koji sadrži jednolančani Faktor VIII iz ovog pronalaska je sposobna da zaštiti HemA miš na nivou koji je uporediv sa sastavom koji sadrži obrađeni Faktor VIII (npr., sastav koji sadrži himerni polipeptid, koji se sastoji uglavnom od ili se sastoji od dva Fc delova i obrađenog Faktora VIII, pri čemu je navedeni obrađeni Faktor VIII spojen sa jednim Fc od dva Fc dela) u modelu transekcije repne vene HemA miša.
[0154] Predmetno obelodanjivanje dalje obezbeđuje postupak za lečenje stanja krvarenja kod čoveka koji koristi sastav pronalaska. Primerni postupak obuhvata davanje ispitaniku kome je to potrebno terapeutski efikasne količine farmaceutskog sastava/formulacije koja sadrži himerni polipeptid koji ima aktivnost Faktora VIII, pri čemu najmanje oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95%, ili oko 99% himernog polipeptida sadrži deo Faktora VIII, koji je jednolančani Faktor VIII i drugi deo.
[0155] Stanje krvarenja može biti uzrokovano poremećajem zgrušavanja krvi. Poremećaj zgrušavanja krvi takođe se može nazvati koagulopatijom. U jednom primeru, poremećaj zgrušavanja krvi, koji se može lečiti farmaceutskim sastavom trenutnog obelodanjivanja, je hemofilija ili von Willebrandova bolest (vWD). U drugom primeru, poremećaj zgrušavanja krvi, koji se može lečiti farmaceutskim sastavom iz ovog pronalaska je hemofilija A.
[0156] U nekim otelotvorenjima, tip krvarenja povezan sa stanjem krvarenja je izabran između hemartroze, krvarenja mišića, krvarenja iz usta, krvarenja, krvarenja u mišiće, oralnog krvarenja, traume, traume capitisa, gastrointestinalnog krvarenja, intrakranijalnog krvarenja, intraabdominalnog krvarenja, intrakranijalnog krvarenja, intrakranijalnog krvarenja, fraktura kostiju, krvarenje u centralnom nervnom sistemu, krvarenje u retrofaringealnom prostoru, krvarenje u retroperitonealnom prostoru i krvarenje u omotaču bočnoslabinskog mišića.
[0157] U drugim otelotvorenjima, ispitanik koji pati od stanja krvarenja treba lečenje za operaciju, uključujući, npr., hiruršku profilaksu ili peri-operativno lečenje. U jednom primeru, operacija je odabrana iz manjih operacija i većih operacija. Primeri hirurških procedura obuhvataju ekstrakciju zuba, tonzilektomiju, ingvinalnu herniotomiju, sinovijektomiju, kraniotomiju, osteosintezu, traumatsku hirurgiju, intrakranijsku hirurgiju, intraabdominalnu hirurgiju, intratorakalnu hirurgiju, operaciju zamene zglobova (npr. totalna zamena kolena, zamena kuka i slično), operacija srca i carski rez.
[0158] U drugom primeru, ispitanik se istovremeno tretira sa FIX. Pošto su jedinjenja prema pronalasku sposobna da aktiviraju FIXa, mogu se koristiti za pre-aktiviranje FIXa polipeptida pre davanja FIXa subjektu.
[0159] Postupci iz obelodanjivanja mogu se praktikovati na ispitaniku kome je potreban profilaktički tretman ili tretman na zahtev.
[0160] Farmaceutski sastavi koji sadrže najmanje 30% jednog lanca Faktora VIII mogu biti formulisane za bilo koji odgovarajući način primene, uključujući, na primer, topikalnu (npr. transdermalnu ili okularnu), oralnu, bukalnu, nazalnu, vaginalnu, rektalnu ili parenteralnu primenu.
[0161] Termin parenteralno kako se ovde koristi obuhvata subkutanu, intradermalnu, intravaskularnu (npr., intravensku), intramuskularnu, spinalnu, intrakranijalnu, intratekalnu, intraokularnu, periokularnu, intraorbitalnu, intrasinovijalnu i intraperitonealnu injekciju, kao i bilo koju sličnu tehniku za injekcije ili infuzije. na primer, suspenzija, emulzija, formulacija sa odloženim oslobađanjem, krema, gel ili prah. Sastav može biti formulisan kao supozitorij, sa tradicionalnim vezivima i nosačima kao što su trigliceridi.
[0162] U jednom primeru, farmaceutska formulacija je tečna formulacija, npr., puferisana, izotonična, vodeni rastvor. U drugom primeru, farmaceutski sastav ima pH vrednost koja je fiziološka ili blizu fiziološke. U drugim primerima, vodena formulacija ima fiziološku ili blisku fiziološku osmolarnost i salinitet. Može da sadrži natrijum hlorid i/ili natrijum acetat. U nekim primerima, sastav predmetnog pronalaska je liofilizovan.
[0163] Pošto je sada detaljno opisan predmetni pronalazak, isto će biti jasnije shvaćeno na osnovu sledećih primera, koji su ovde obuhvaćeni samo u svrhu ilustracije i nisu namenjeni da ograniče pronalazak.
Primeri
Primer 1
Kloniranje, ekspresija i prečišćavanje rFVIIIFc
[0164] Svi postupci molekularne biologije izvedeni su prema standardnim tehnikama.
Kodirajuća sekvenca humanog FVIII (Genbank pristupni broj NM_000132), uključujući njenu izvornu signalnu sekvencu, dobijena je reverznom transkripcionom lančanom reakcijom polimeraze (RT-PCR) iz humane jetre poliA RNK. Zbog velike veličine FVIII, kodirajuća sekvenca je dobijena u nekoliko sekcija od odvojene RT-PCR reakcije, i sastavljena kroz seriju PCR reakcija, restrikcionih digestija i ligacija u klonirajući vektor međujedinjenja koji sadrži izbrisani B domen (BDD) FVIII kodirajući region sa fuzijom serina 743 (S743) do glutamina 1638 (Q1638), eliminišući 2682 bp iz B domena pune dužine FVIII. Humana IgGl Fc sekvenca (npr., GenBank pristupni broj Y14735) je dobijena pomoću PCR iz leukocitne cDNK biblioteke, a konačna ekspresiona kaseta je napravljena na takav način da je BDD FVIII sekvenca spojena direktno na N-terminus Fc sekvence (domeni sa zglobom, CH2 i CH3, počevši od D221 sekvence IgG1, EU numerisanje) bez povezujućeg veznika. Za ekspresiju samog lanca Fc, signalna sekvenca lakog Igκ (kappa) lakog lanca je stvorena sa sintetskim oligonukleotidima i dodata u Fc kodirajuću sekvencu koristeći PCR da omogući izlučivanje ovog proteinskog proizvoda. Sekvence koje kodiraju FVIIIFc i Fc lanac su klonirane u dvostruki vektor ekspresije, pBudCE4.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA).
[0165] HEK 293H ćelije (Invitrogen, Carlsbad, CA) su transfektovane sa pSYN-FVIII-013 plazmidom koristeći Lipofektamin transfekcioni reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) i stabilna ćelijska linija je izabrana sa zeocinom. Ćelije su uzgajane u kulturi suspenzije bez seruma, i rFVIIIFc protein prečišćen iz bistre medije za sakupljanje korišćenjem postupka prečišćavanja sa četiri kolone, uključujući FVIII-specifičan korak prečišćavanja afiniteta (McCue J. i dr., J. Chromatogr. A., 1216(45):7824-30 (2009)), praćena kombinacijom kolona anjonske izmene i kolone hidrofobne interakcije.
Primer 2
Biohemijska karakterizacija
[0166] Prerađeni rekombinantni FVIII-Fc (rFVIIIFc) je sintetizovan kao dva polipeptidna lanca, jedan lanac koji se sastoji od BDD-FVIII (S743-Q1638 fuzija, 1438 aminokiselina) fuzionisanih za Fc domen (zglobni, CH2 i CH3 domeni) IgGl (226 aminokiseline), koje se protežu od D221 do G456, EU broje), za ukupnu dužinu lanca od 1664 aminokiselina, drugi lanac koji se sastoji od istog Fc regiona (226 aminokiselina). Iako se očekivalo da ćelije transfektovane sa FVIIIFc/Fc dualnim ekspresionim plazmidom izluče tri proizvoda (FVIIIFc dimer, FVIIIFc monomer i Fc dimer), samo su FVIIIFc monomer i Fc dimer detektovani u kondicioniranoj podlozi. Prečišćeni FVIIIFc je analiziran neredukovanjem i redukovanjem SDS-PAGE analize (Slika 2A i, B). Za neredukovani SDS-PAGE, trake su pronađene migrirajuće na približno 90 kDa i 130 kDa, u skladu sa predviđenim molekulskim masama FVIIIFc teškog lanca (HC) i fuzije Fc-a lakog lanca-dimera (LCFc2) (Slika 2A, linija 3) . Treća traka je takođe detektovana na približno 220 kDa, u skladu sa predviđenom molekulskom težinom za jedan lanac FVIIIFc (SC FVIIIFc; HC LCFc2), u kome se argininski ostatak na poziciji 754 (1648 u odnosu na sekvencu pune dužine) ne odcepi tokom sekrecije. Za redukovanu SDS-PAGE analizu, glavne trake su viđene migrirajući na približno 25 kDa, 90 kDa, 105 kDa i 195 kDa, u skladu sa predviđenim molekulskim masama za jednolančani Fc, HC, LCFc i SC FVIIIFc (Slika 2B) , staza 3). Kotransfekcija sa humanim PC5, članom proproteinske konvertaze subtilizin/keksin (PCSK) tipa proteaza, rezultirala je potpunom obradom rFVIIIFc proizvoda (Slika 2A, B, staza 2).
[0167] Denzitometrijska analiza nekoliko serija rFVIIIFc nakon SDS-PAGE pokazala je više od 98% čistoće očekivanih traka. Hromatografija isključivanja po veličini (SEC) je takođe korišćena za procenu prisutnog stepena agregacije, a za sve serije je nađeno da imaju agregatne nivoe od 0.5% ili manje.
[0168] Struktura rFVIIIFc je dalje analizirana cepanjem, redukcijom i analizom trombina pomoću LC/UV i LC/MS. Četiri fragmenta Faktora VIII generisana trombinom (odvajanjem na tri argininska ostatka, na položajima 372, 740 i 795 (795 odgovara 1689 u odnosu na FVIII sekvencu pune dužine), mogu se detektovati UV apsorbancijom (Slika 2C), što odgovara na sledeće segmente proteina:Fc (vrh 1), laki-lanac-Fc (vrh 2); A1 domen iz teškog lanca (vrh 3) i A2 domen iz teškog lanca (vrh 4). Veznik domena od 14 aminokiselina i ∼ 6 kDa peptida povezani sa a3 se ne detektuju UV apsorbancijom zbog njihove male veličine.
[0169] Analiza digestije trombina rFVIIIFc pomoću HPLC/MS obezbedila je dodatne detaljne informacije o četiri glavna domena, kao i ∼6 srodni peptidi kDa a3, i upoređeni su sa REFACTO®, rekombinantnim proteinom BDD-FVIII (rBDD FVIII) izvedenim iz CHO, koristeći iste postupke. FVIII uzorci su propušteni kroz Detergent-OUTDTG-100X kolone (GBioscience, Maryland Heights, MO) za uklanjanje Tween, potpuno digestirani sa trombinom, redukovani i analizirani bilo RP-HPLC-UV (POROS R1/10, Applied Biosystems) ili RP-HPLC-MS (Agilent 1200 povezan sa Agilent 6210TOF masenim spektrometrom) koristeći gradijente acetonitrila u vodi 0.1% mravlja kiselina. Sekvenca peptida je takođe potvrđena sa LysC mapiranjem peptida, analiziranim pomoću RP-HPLC/MS (Thermo Finnigan LTQ-XL-ETD).
[0170] Kao što se i očekivalo, hromatogram ukupne jonske struje (TIC) rFVIIIFc (slika 2D) izgleda slično UV hromatogramu (slika 2C). Pet od očekivanih šest proizvoda može se
1
detektovati pomoću LC/MS, uključujući dva oblika a3 kiselog regiona generisanih iz obrađenih i jednolančanih izoformi, kao i trombin koji se koristi za varenje. Dodatni skraćeni oblik kiselinskog regiona je takođe primećen, i opisan je u potpunosti ispod. rBDD FVIII daje sličan TIC hromatogram, ali bez slobodnog Fc lanca i koji ima različitu masu za LC u poređenju sa rFVIIIFc LC-Fc, u skladu sa nedostatkom Fc regiona (podaci nisu prikazani).
[0171] Zbog heterogenosti glikozilacije u odnosu na veći deo proteina, dekonvoluirani maseni spektri za A1, LC-Fc i Fc regione su kompleksni i stoga identitet svih molekularnih jona nije ustanovljen. Međutim, nađeno je da masa za tri glavna vrha iz Fc regiona odgovara G0, G1 i G2 izoformama koje se nalaze na molekulima IgG, što odgovara biantenarnim oligosaharidima koji završavaju sa 0, 1 ili 2 ostatka galaktoze. Dekonvoluirani maseni spektri a3-srodnih peptida i A2 domena daju najefikasnije podatke, jer ne postoji heterogenost u post-translacionim modifikacijama u ovim regionima, što omogućava da se očekivane mase identifikuju nedvosmisleno.
[0172] Predviđa se da 6-kDa N-terminalni peptid oslobođen iz LC nakon cepanja R1689 sadrži a3 kiseli region (aminokiseline E1649 do R1689) ako je izvedena iz obrađene izoforme, a 14 aminokiselina skraćena B domena fuzionisana na kiselu kiselinu region ako je izveden iz izoforma sa jednim lancem. Nađeno je da oba rFVIIIFc i rBDD FVIII sadrže oba oblika a3 regiona, proporcionalna očekivanim nivoima na osnovu SDS-PAGE analize. Pored toga, oba proteina su sadržala skraćeni oblik a3 regiona koji odgovara aminokiselinama D1658-R1689, kao što je prijavljeno za druge FVIII proizvode, mada je to nađeno u većem broju u rBDD FVIII nego u rFVIIIFc.
[0173] A2 domen sadrži tri potencijalna mesta za sulfidaciju tirozina, ali ne i mesta glikozilacije koja mogu dovesti do kompleksne heterogenosti, pa se stoga mogu izračunati tačne mase ovog regiona. Pored primarnog očekivanog maksimuma u dekonvoluiranom masenom spektru rFVIIIFc koji je povezan sa masom sekvence S373 do R740 (Slika 2E), identifikovana su dva dodatna oblika koji odgovaraju poznatim skraćivanjem FVIII HC, interagujući i sa A2 domenom skraćenim na E720 i Y729. Ove prijavljene skraćene forme su takođe posmatrane direktno u dekonvoluiranom spektru rBDD FVIII A2 (Slika 2E). I rFVIIIFc i rBDD FVIII A2 sadrže slične relativne količine forme skraćene na Y729 dok je rBDD FVIII A2 domen sadržao značajno veći nivo forme skraćenog na E720 u poređenju sa istim oblikom u rFVIIIFc (Slika 2E).
2
[0174] Primarna sekvenca rFVIIIFc je potvrđena mapiranjem peptida sa lizil endopeptidazom (Lys-C) digestama praćenim UV i masenom spektrometrijskom detekcijom. Od 99 teoretskih peptida proizvedenih od rFVIIIFc, otkriveno je 81, što odgovara 98% ukupne sekvence. Posttranslacijske modifikacije rFVIIIFc su takođe okarakterisane ovom postupkom. FVIII sadrži 6 potencijalnih tirozin sulfatnih mesta, koji odgovaraju položajima 346, 718, 719, 723, 1664 i 1680. Nađeni su potpuno sulfidni peptidi koji odgovaraju ovim šest mesta, sa tragovima nesulfatnog peptida koji odgovaraju položaju 1680, kako je procenjeno integracijom ukupnog jonskog hromatograma u masenim spektrima, i bez detektabilnih ne-sulfatnih peptida koji odgovaraju drugim položajima. BDD FVIII takođe sadrži 6 potencijalnih N-glikozilacionih mesta, od kojih su četiri prijavljena kao glikozilovana u rekombinantnim FVIII proizvodima. U skladu sa tim, za rFVIIIFc je nađeno da ima ista 4 mesta glikozilovana; Nađeno je da N239 i N2118 sadrže visoke strukture manoze, dok je za N41 i N1810 nađeno da sadrže više složenih ugljenih hidrata, slično onima nađenim na rBDD FVIII. Nađeno je da je Fc region N-vezana glikozilacija odgovarala G0, G1 i G2 izoformama koje su pronađene sa mapom trombina pomoću LC/MS. Objavljeno je da FVIII ima O-glikozilaciona mesta na Ser 741 i 743 koji su delimično zauzeti, a to je nađeno i za slučaj rFVIIIFc.
[0175] Polipeptid rFVIIIFc koji je proizveden bez enzima ko-transfektirane obrade pokazao je 15-25% jednostrukog lanca FVIIIFc (SC FVIIIFc), koji se razlikuje od obrađenog rFVIIIFc pomoću jedne peptidne veze između R754 i E755 (R1648/E1649 u odnosu na FVIII pune dužine). Ova izoforma je prečišćena i okarakterisana u svim prethodno opisanim biohemijskim analizama i pronađeno je da je uporedivo sa rFVIIIFc kao što je prikazano ispod. Nađeno je da je aktivnost prečišćenog jednolančano FVIIIFc slična rFVIIIFc u hromogenom testu, kao i različitim funkcionalnim analizama opisanim u daljem tekstu.
Merenje FVIII aktivnosti hromogenim i jednofaznim aPTT testovima
[0176] Aktivnost FVIII je merena pomoću FVIII hromogenog testa. Utvrđeno je da je prosečna specifična aktivnost iz četiri odvojene šarže rFVIIIFc 9762±449 IU/mg hromogenim testom, što odgovara 2148±99 IU/nmol. Utvrđeno je da je prosečna specifična aktivnost iz četrnaest odvojenih serija rFVIIIFc 8460±699 IU/mg pomoću testa aPTT, a 9348±1353 IU/mg hromogenim testom, što odgovara 1861±154 i 2057±298 IU/nmol, redom. Aktivnost FVIII jednog lanca FVIII:Fc je takođe merena hromogenim testom i upoređena sa potpuno obrađenim rFVIII:Fc ili rFVIII:Fc DS (koji sadrži oko 25% jednog lanca rFVIII:Fc). Kao što pokazuje Tabela 3A, jedno lančani rFVIIIFc nije pokazao značajnu razliku u aktivnosti FVIII u odnosu na aktivnost Faktora VIII potpuno obrađenog FVIIIFc ili rFVIIIFc DS hromogenim testom, kako u prisustvu, tako i u odsustvu von Willebrand faktora (VWF). Tabela 3B pokazuje da je puna aktivnost SCrFVIIIFc, kao što je izmerena u jednom stadijumu aktivnog parcijalnog tromboplastinskog vremena (aPTT), uočena u odsustvu VWF.
TABELA_3A_FVIII Aktivnost hromogenim testom
TABLE_3B_FVIII Aktivnost aPTT test
4
[0177] U jednofaznom testu zgrušavanja (APTT), SC rFVIIIFc je pokazao 60% smanjenje aktivnosti kada plazma ima normalan nivo VWF, što sugeriše potencijalnu ulogu VWF u aktivaciji SC rFVIIIFc. Ovo zapažanje je dalje potvrđeno dodavanjem ljudskog VWF nazad u plazmu sa FVIII/VWF-om (Tabela 3), gde je koagulaciona aktivnost SC rFVIIIFc redukovana na isti nivo kao kod kongenitalne plazme sa deficijentnim FVIII.
Aktivnost u kompleksu Ksase
[0178] Aktivnost FVIII je takođe merena u kontekstu Ksase kompleksa, inkubacijom aktiviranog FIX i TROMBIN-aktiviranog REFACTO® ili rFVIIIFc proteina na površini fosfolipida u prisustvu kalcijuma, i praćenje konverzije FX u FXa mereno cepanjem a hromogeni ili fluorogenski supstrat, od koga su utvrđene stope proizvodnje FXa. Ovaj test je zatim modifikovan variranjem jedne komponente testa, dok su ostale konstantne da bi se ispitale interakcije sa svakom pojedinačnom komponentom.
[0179] Brzina generisanja FXa je određena kao funkcija variranja koncentracije fosfolipida za rFVIIIFc DS, rBDD FVIII i jedno lančani rFVIIIFc (Slika 3A), koristeći sintetske fosfolipidne vezikule (25% fosfatidil serin/75% fosfatidil holin). Nađeno je da oba proteina imaju sličan profil aktivnosti, sa vršnom aktivnošću na približno 156 µM fosfolipida.
[0180] Stopa generisanja FXa je zatim određena kao funkcija varijabilnih koncentracija FX, i izračunate vrednosti Km i Vmax (Slika 3B). Profili aktivnosti za rFVIIIFc DS, rBDD FVIII i jedno lančani rFVIIIFc su pronađeni slični, sa sličnim Km i Vmax (Tabela 4). Konačno, stopa generisanja FXa je određena kao funkcija različitih koncentracija FIX (Slika 3C). Profil aktivnosti se pojavio slično, sa sličnim Kd i Vmax (Tabela 4). Slični rezultati su dobijeni upotrebom trombocita kao izvora fosfolipida (neobjavljeni podaci, jun 2009).
TABELA 4. Parametri FXa generisanja za FVIII proteine na fosfolipidima
TABELA 5. FIXa interakcija sa FVIII Proteinima
Inaktivacija od strane APC
[0181] Jednom aktivan, FVIII se deaktivira cepanjem aktiviranim proteinom C (APC), kao i disocijacijom A2 domene. rFVIIIFc i rBDD FVIII su oba aktivirani pomoću trombina, zatim inkubirani sa APC za različita vremena i aktivnost određena u FXa generacijskom testu (Slika 4). U odsustvu aktivacije trombina, detektovana je mala FXa generacija, koja je značajno povećana sa digestijom trombina. Tretman sa APC tokom 90 minuta doveo je do značajnog smanjenja brzine generisanja FXa, slično ne-aktiviranim uzorcima, i ovi rezultati su bili slični za rFVIIIFc DS, rBDD FVIII i jedan lanac rFVIIIFc.
Afinitet za vWF
[0182] FVIII interakcije sa von Willebrandovim faktorom (vWF) su merene analizom biomolekularnih interakcija u realnom vremenu (BIAcore), zasnovane na tehnologiji površinske plazmonske rezonance (SPR), da bi se odredila kinetika vezivanja rFVIIIFc i rBDD FVIII prema vWF (Tabela 6). Parametri kinetičke brzine Ka (povećani) i Kd (smanjeni), i afinitet KD (Kd/Ka), određeni su za svaku interakciju FVIII pod identičnim uslovima. Nađeno je da oba rFVIIIFc i rBDD FVIII imaju nizak nM vezujući afinitet (KD) za vWF, od 1.64±0.37 i 0.846±0.181 nM, respektivno. Proteini su imali slične smanjene brzine, sa dvostrukom razlikom u povećanoj brzini, što je rezultiralo dvostrukom razlikom u afinitetu.
TABELA 6. Biocore analiza vezivanja FVIII proteina za vWF
[0183] Kao što je prikazano u Tabeli 6, afinitet rFVIII:Fc DS ili jednolančani rFVIIIFc sa vWF je nađeno da je u niskim nM opsegu, približno dva puta većim od samog BDD FVIII. U fiziološkim koncentracijama, to bi dovelo do blagog smanjenja u procentu rFVIIIFc (obrađenog ili jedno lančanog) kompleksa sa vWF u poređenju sa slobodnim FVIII, međutim in vivo studije su pokazale da je polu-raspad rFVIIIFc značajno produžen preko pune dužine ili BDD FVIII uprkos ovom malo nižem afinitetu, pa se čini da to ne kompromituje poluraspad molekula. Može biti moguće da se slobodni rFVIIIFc efikasnije reciklira kroz putanju FcRn i zbog toga ovo može doprineti većem produženju poluživota.
Afinitet za vWF i trombin-posredovano otpuštanje iz vWF
[0184] Faktor VIIIFc (rFVIIIFc) koji je izbrisan iz rekombinantnog B-domena eksprimiran je u HEK293 ćelijama. Tokom biosinteze u HEK293 ćelijama, većina rFVIIIFc je obrađena ograničenom proteolizom da bi se generisao FVIII teški lanac (HC) i FVIII laki lanac (LC) na koji je Fc grupa vezana. Smatra se da spontana disasocijacija HC i LC u plazmi i tokom skladištenja FVIII lekova doprinosi gubitku aktivnosti FVIII. Preostali deo biosintetizovanog rFVIIIFc, koji nije obrađen, formira izoformu jednog lanca rFVIIIFc (SC rFVIIIFc), koja može da obezbedi poboljšanu proizvodnost i stabilnost u poređenju sa obrađenim rFVIIIFc.
[0185] Ovaj primer opisuje analizu poređenja interakcije SC rFVIIIFc sa von Willebrandovim faktorom (vWF) u odnosu na interakciju rFVIIIFc sa vWF. Interakcije sa vWF merene su analizom biomolekularnih interakcija u realnom vremenu (BIAcore), baziranom na tehnologiji površinske plazmonske rezonance (SPR), da bi se odredila kinetika vezivanja rFVIIIFc i SC rFVIIIFc prema vWF (Tabela 11 i Slika 16A). VWF-slobodni humani plazma dobijen vWF je imobilizovan aminskom vezom na površini biosenzora na nivoima dovoljno niskim da spreči ograničenje transporta mase. rFVIIIFc i SC rFVIIIFc su sekvencijalno injektirani u kinetičkom modu jednog ciklusa u koncentracijama u rasponu od 0.13 do 5.0 nM. Podaci senzorgrama su odgovarali modelu interakcije 1:1.
[0186] Parametri kinetičke brzine Ka (povećani) i Kd (smanjeni), i afinitet KD (Kd/Ka), određeni su za svaku interakciju FVIII pod identičnim uslovima. Nađeno je da oba rFVIIIFc i SC rFVIIIFc imaju nizak nM vezujući afinitet (KD) za vWF, od 0.34±0.1 i 0.31±0.1 nM, respektivno. Obe izoforme su takođe imale slične smanjene i povećane stope.
TABELA 11. Biocore analiza vezivanja FVIII proteina za vWF
[0187] Sledeće, trombin-posredovano oslobađanje rVVIIIFc, SC rFVIIIFc, i B-domena FVIII bez Fc delova (rBDD FVIII) je mereno i na 25° C i 37° C. ćelije na površini biosenzora. Preostala ćelija protoka je služila kao prazna za referentne svrhe. RFVIIIFc i SC rFVIIIFc proteini su uhvaćeni pomoću vWF i ostavljeni da se polako rastavljaju, i koncentracije rFVIIIFc i SC rFVIIIFc su podešene tako da se dobiju ekvimolarni nivoi hvatanja do kraja faze disocijacije. Rastvori humanog a-trombina su pripremljeni 2-strukim serijskim razblaživanjem i primenjeni u koncentracijama koje su se kretale od 0.005 do 20 U/mL, što je rezultiralo proteolitičkim oslobađanjem FVIIIa vrsta iz vWF. Trombin posredovano otpuštanje aktiviranog rFVIIIFc, SC rFVIIIFc i rBDD FVIII iz vWF praćeno je u realnom vremenu koristeći optički biosenzor na bazi SPR (Slika 16B). Posle slepe referentne suptrakcije (Slika 16C), određena je brzina oslobađanja kao funkcija koncentracije αtrombina (Slika 16D). Maksimalna efektivna koncentracija trombina (EC50) za SC rFVIIIFc bila je 12 ± 1 U/mL u poređenju sa 3.9 ± 0.3 U/mL za rFVIIIFc na 25° C i bila je 15 ± 1 U/mL za SC rFVIIIFc u poređenju sa 4.8 ± 0.2 U/mL za rFVIIIFc na 37° C (Slika 16E). rFVIIIFc je imao sličnu vrednost EC<50>trombina u poređenju sa rBDD FVIII, sa vrednostima od 3.9 ± 0.3 U/mL i 3.3 ± 0.3 U/mL, odnosno na 25° C i vrednostima 4.8 ± 0.2 U/mL i 4.0 ± 0.2 U/mL. SC rFVIIIFc je imao vrednost EC50trombina koja je bila približno 3 puta veća od rFVIIIFc. Ovo oštećenje otpuštanja posredovanog trombinom iz vWF može biti osnova specifične redukcije specifične aktivnosti za SC rFVIIIFc, opaženog u testu aPTT u kome je prisutan vWF (Tabela 3B).
Primer 3
[0188] Faza I/IIa, otvorena, prelazna, doza-eskalacija, multi-centar i prva u humanoj studiji je dizajnirana da proceni bezbednost, toleranciju i farmakokinetiku jedne doze rFVIIIFc kod ispitanika sa teškim (definisanim) kao <1 IU/dL [1%] endogeni faktor VIII [FVIII]) hemofilija A. Ukupno oko 12 prethodno lečenih pacijenata je uključeno i dozirano sa rFVIIIFc na 25 ili 65 IU/kg. Posle skrininga (zakazanog u roku od 28 dana pre prve doze ADVATE® [rFVIII], referentnog komparatora) i najmanje 4 dana (96 sati) bez FVIII tretmana pre prve injekcije, približno 6 dana ispitanici su primili pojedinačnu dozu od 25 IU/kg ADVATE®, nakon čega je usledio 3-dnevni (72 sata) farmakokinetički (PK) profil, a zatim prelazio i primao 25 IU/kg pojedinačne otvorene doze rFVIIIFc za 7 dana (168 sati) Profilisanje PK. Prva 3 ispitanika su dozirana sekvencijalno. Za prva tri (3) ispitanika koji su dozirani sa 25 IU/kg rFVIIIFc, svaki ispitanik je podvrgnut proceni inhibitora na 14 dana (336 sati) nakon injekcije rFVIIIFc. Doziranje sledećeg ispitanika (samo za prva tri ispitanika ) desilo se kada je završeno testiranje inhibitora. Nakon što je treći ispitanik završio 14-dnevnu procenu inhibitora, preostala tri ispitanika sa 25 IU/kg i šest ispitanika sa 65 IU/kg počela su sa upisivanjem sekvencijalno najmanje 1 dan u okviru svake grupe doza.
[0189] Nedelju dana nakon što je poslednji ispitanik primio dozu od 25 IU/kg rFVIIIFc, približno 6 jedinstvenih ispitanika je regrutovano za Kohortu od 65 IU/kg. Svaki ispitanik u grupi od 65 IU/kg primio je pojedinačnu dozu od 65 IU/kg ADVATE®, nakon čega je usledilo 4-dnevno profilisanje PK (96 sati), a zatim je prešla doza od 65 IU/kg jedne otvorene oznake rFVIIIFc za profilisanje u trajanju od 10 dana (240 sati). Ako se epizoda krvarenja dogodila pre prve injekcije rFVIIIFc u bilo kojoj kohorti, FVIII proizvod pre studije je korišćen za tretman i interval od najmanje 4 dana je morao proći pre nego što je primljena prva injekcija rFVIIIFc za PK profil.
[0190] Svi ispitanici su praćeni u periodu od 14 dana (336 sati) i 28 dana za procenu bezbednosti posle primene rFVIIIFc 25 IU/kg ili 65 IU/kg za bezbednost. Svi ispitanici su podvrgnuti farmako-kinetičkom uzorkovanju pre i posle doziranja zajedno sa uzorcima krvi za analizu aktivnosti FVIII u određenim vremenskim tačkama.
[0191] Farmakokinetički podaci za kliničko ispitivanje faze I/IIa pokazali su sledeće rezultate za FVIIIFc. FVIIIFc je imao oko 50% povećanje sistemske izloženosti (AUCINF), oko 50% smanjenje klirensa (C1), i oko 50-70% povećanje poluvremena eliminacije i MRT u poređenju sa ADVATE® (puna dužina rFVIII). Pored toga, FVIIIFc je pokazao povećane vrednosti C168, TBLP1, TBLP3 i TBLP5 u poređenju sa ADVATE®.
AUCINF
Površina ispod krive koncentracije-vremena od nule do beskonačnosti
Beta HL
Uklanjanje faze polu-raspada; takođe se odnosi kao na t1/2β
C168
Procenjena aktivnost FVIIIFc iznad polazne vrednosti približno 168 h posle doze Cl
Odobrenje
MRT
Srednje vreme boravka
TBLP1
Predviđeno vreme nakon doziranja kada se aktivnost FVIIIFc smanjila na približno 1 IU/dL iznad osnovne vrednosti
TBLP3
Predviđeno vreme nakon doziranja kada se aktivnost FVIIIFc smanjila na približno 3 IU/dL iznad osnovne vrednosti
TBLP5
Predviđeno vreme nakon doziranja kada se aktivnost FVIIIFc smanjila na približno 5 IU/dL iznad osnovne vrednosti
Primer 4
[0192] Rekombinantni fuzioni protein faktora VIII-Fc (rFVIIIFc) koji je izbrisan iz B-domena je stvoren kao pristup za produženje polu-života FVIII. Farmakokinetika (PK) rFVIIIFc je upoređena sa rFVIII kod miševa hemofilije A. Otkrili smo da je terminalni poluraspad dvostruko duži za rFVIIIFc u poređenju sa rFVIII. Da bi se potvrdilo da je osnovni mehanizam za produženje poluživota zbog zaštite rFVIIIFc od FcRn, PK je procenjena u FcRn nokautu i humanim FcRn transgenskim miševima. Jedna intravenska doza (125 IU/kg) je primenjena i koncentracija u plazmi merena korišćenjem testa hromogene aktivnosti. Cmax je bio sličan između rFVIIIFc i rFVIII (XINTHA®) kod oba soja miša. Međutim, dok je polu-raspad za rFVIIIFc bio uporediv sa onim kod rFVIII u FcRn nokaut miševima, poluraspad za rFVIIIFc je produžen do otprilike dva puta duže nego kod rFVIII u hFcRn transgenskim miševima. Ovi rezultati potvrđuju da FcRn posreduje ili je odgovoran za
1
produženi polu-raspad rFVIIIFc u poređenju sa rFVIII. Pošto se pokazalo da hemostaza u punoj krvi izmerena rotacionom tromboelastometrijom (ROTEM®) korelira sa efikasnošću faktora koagulacije u modelima krvarenja kod hemofilija miševa, kao i u kliničkoj primeni, nastojali smo da procenimo ex vivo efikasnost rFVIIIFc u hemofiliji Miševi koji koriste ROTEM®. Miševima hemofilije A je davana jedna intravenska doza od 50 IU/kg rFVIIIFc, XINTHA® (FVIII) ili ADVATE® (FVIII).5 minuta nakon doziranja, formiranje ugruška je slično u odnosu na vreme zgrušavanja (CT), vreme formiranja ugruška (CFT) i α-ugao. Međutim, rFVIIIFc je pokazao značajno poboljšan CT u 72 i 96 sati nakon doze, a CFT i augao su takođe poboljšani u 96 h u poređenju sa oba XINTHA® (FVIII) i ADVATE® (FVIII), u skladu sa produženim PK od rFVIIIFc. Stoga konstrukcija Fc fuzije FVIII proizvodi molekul sa definisanim mehanizmom delovanja koji ima povećani polu-raspad i potencijal da obezbedi produženu zaštitu od krvarenja.
Primer 5
[0193] Ovaj primer predstavlja konačne rezultate analize za FVIII aktivnost od 16 pacijenata tretiranih sa 25 i 65 IU/kg FVIII proizvoda. Videti Primer 3.
[0194] U ovom primeru, rFVIIIFc je rekombinantni fuzioni protein koji se sastoji od jednog molekula humanog FVIII (BDD-rFVIII) koji je izbrisan iz rekombinantnog B-domena, fuzionisan za dimerni Fc domen humanog IgG1, bez interventne sekvence linkera. Ovaj proteinski konstrukt se takođe ovde navodi kao rFVIIIFc heterodimerni hibridni protein, FVIIIFc monomerni Fc fuzioni protein, FVIIIFc monomer hibrid, monomerni FVIIIIFc hibrid, i FVIIIFc monomer-dimer. Videti Primer 1, Sliku 1 i Tabelu 2A.
[0195] Prekliničke studije sa rFVIIIFc pokazale su približno 2-struko produženje poluživota aktivnosti rFVIII u poređenju sa komercijalno dostupnim proizvodima rFVIII. Razlog za ovu studiju je bio da se proceni bezbednost i tolerancija jedne doze rFVIIIFc u smrznutoj tečnoj formulaciji i da se obezbede podaci o PK kod ispitanika sa teškom hemofilijom A. Za ovo ispitanje, bilo je 16 ispitanika koji su mogli da se procene. Jedinstvena primena dve doze i rFVIIIFc i ADVATE® u nominalnoj dozi od 25 (n=6) i 65 IU/kg telesne težine (n=10) su intravenski uneti tokom približno 10 minuta. Uzorci krvi za procenu PK u plazmi su dobijeni pre infuzije, kao i do 10 dana nakon doziranja. PK aktivnosti FVIII i za ADVATE® i za rFVIIIFc su naznačeni u ovoj studiji koristeći postupak zavisnu od modela.
CILJEVI
2
[0196] Primarni cilj ove studije je bio da se proceni bezbednost i tolerancija pojedinačne primene dve doze rFVIIIFc (25 i 65 IU/kg) kod prethodno lečenih pacijenata (PTP) starih 12 i više godina sa teškom hemofilijom A.
[0197] Sekundarni ciljevi su bili određivanje farmakokinetičkih (PK) parametara određenih farmakodinamičnom (PD) aktivnošću FVIII tokom vremena nakon jednokratne primene 25 ili 65 IU/kg rFVIIIFc u poređenju sa ADVATE® u jednofaznom zgrušavanju i hromogenim testovima.
Dizajn ispitivanja (Videti Primer 3)
[0198] Uzorci krvi su sakupljani za FVIII procene PK aktivnosti tokom poseta skriningu (u roku od 28 dana pre doziranja ADVATE®); na Dan 0 (injekcija ADVATE®) pre injekcije i 10 i 30 minuta i 1, 3, 6 i 9 sati nakon injekcije; 1. dan 24 sata nakon ubrizgavanja ADVATE®; 2. dan na 48 sati nakon injekcije ADVATE®; 3. dan na 72 sata nakon ubrizgavanja ADVATE®; i 4. dan na 96 sati nakon injekcije visoke doze ADVATE® (samo kohorta B).
[0199] Uzorci krvi su sakupljeni za FVIII aktivnosti PK procene na dan injekcije rFVIIIFc neposredno pre primene rFVIIIFc, 10 i 30 minuta i 1, 3, 6 i 9 sati nakon injekcije rFVIIIFc; na dan 1 u 24 sata nakon injekcije rFVIIIFc; dana 2 do 5 na 48, 72, 96 i 120 sati nakon injekcije rFVIIIFc; na dan 7 u 168 sata nakon injekcije rFVIIIFc; dana 8, 9 i 10 na 192, 216 i 240 sati nakon ubrizgavanja visoke doze rFVIIIFc (samo kohorta B). Aktivnost FVIII je takođe merena na završnoj studijskoj poseti (28 dana posle injekcije rFVIIIFc) u 672 sata nakon injekcije rFVIIIFc.
Farmakokinetičko modelovanje i kalkulacije
Skraćenice
[0200]
TBLP1 =modelovanjem predviđeno vreme nakon doziranja kada se aktivnost FVIII smanjila na približno 1 IU/dL iznad osnovne vrednosti
TBLP3 =modelovanjem predviđeno vreme nakon doziranja kada se aktivnost FVIII smanjila na približno 3 IU/dL iznad osnovne vrednosti
REZULTATI
Farmakokinetika sa jednom dozom (Jednofazni test)
[0201] Posmatrana aktivnost FVIII naglo je porasla nakon kratke IV infuzije bilo ADVATE® ili rFVIIIFc, sa srednjim (± SD) modelom predviđenim Cmax vrednostima 56.6 ± 4.74 i 121 ± 28.2 IU/dL za ADVATE® i 55.6 ± 8.18 i 108 ± 16.9 IU/dL za rFVIIIFc za grupe doza od 25 i 65 IU/kg, respektivno. Svi pacijenti koji su primali ADVATE® i rFVIIIFc imali su povećanje doze FVIII aktivnosti. Uočeno povećanje u Cmax i AVCINF bilo je nešto manje od proporcionalne dozi tokom procenjenog opsega doza.
[0202] Nakon završetka infuzije, opadanje uočene aktivnosti FVIII pokazalo je monoeksponentne karakteristike raspadanja dok se ne dostigne osnovni nivo. Stopa smanjenja aktivnosti FVIII bila je sporija za rFVIIIFc nego za ADVATE® sa srednjim (± SD) modelom predviđenim polu-raspadom eliminacije od 11.9 ± 2.98 i 10.4 ± 3.03 h za ADVATE® i 18.0 ± 3.88 i 18.4 ± 6.99 sati za rFVIIIFc za grupe doza od 25 i 65 IU/kg, respektivno. Izgleda da su vrednosti poluživota eliminacije nezavisne od doze u rasponu doza procenjenog za oba FVIII proizvoda.
[0203] Ukupna sistemska izloženost FVIII AVCINF) je ∼ 48% i 61% veća nakon primene rFVIIIFc nego ADVATE® na nivoima doze od 25 i 65 IU/kg, respektivno. Srednje (± SD) vrednosti predviđene za AUCINFsu bile 974 ± 259 i 1810 ± 606 h*IU/dL za ADVATE® i 1440 ± 316 i 2910 ± 1320 h*IU/dL za rFVIIIFc za 25 i 65 IU/kg dozne grupe, respektivno.
[0204] Slično polu-životu eliminacije, MRT je produžen za rFVIIIFc u odnosu na ADVATE®. Srednje (± SD) vrednosti modelom predviđene za MRT su bile 17.1 ± 4.29 i 14.9 ± 4.38 h*IU/dL za ADVATE® i 25.9 ± 5.60 i 26.5 ± 10.1 h*IU/dL za rFVIIIFc za 25 i 65 IU/kg dozne grupe, respektivno. Izgleda da su MRT vrednosti poluživota eliminacije nezavisne od doze u rasponu doza procenjenog za oba FVIII proizvoda.
4
[0205] Pored toga, utvrđene su vrednosti primarnih PK parametara za CL i V. CL vrednosti za rFVIIIFc samo su obračunate ∼ 66% onih koji su uočeni kod ADVATE® u ekvivalentnim dozama. Srednje (± SD) vrednosti modelom predviđene za CL su bile 2.70 ± 0.729 i 4.08 ± 1.69 h*IU/dL za ADVATE® i 1.80 ± 0.409 i 2.69 ± 1.25 h*IU/dL za rFVIIIFc za 25 i 65 IU/kg dozne grupe, respektivno. V vrednosti su bile uporedive između ADVATE® i rFVIIIFc sa srednjim (± SD) predviđenim V vrednostima od 43.9 ± 4.27 i 56.1 ± 13.4 mL/kg za ADVATE® i 45.3 ± 7.23 i 61.6 ± 10.6 mL/kg za rFVIIIFc za 25 i 65 IU/kg doznih grupa, respektivno. Blagi porast u srednjim vrednostima CL i V zabeležen je sa povećanjem doze ADVATE® i rFVIIIFc; međutim, povećanje standardnih devijacija u dozi od 65 IU/kg u kombinaciji sa ograničenim nivoima doza ograničilo je procenu zavisnosti ovih parametara od doze. Na primer, CV% geometrijska srednja vrednost CL za grupu za tretman rFVIIIFc povećala se sa 23.0% (25 IU/kg) na 48.6% (65 IU/kg).
[0206] Pored primarnih PK parametara, sekundarni PK parametri (npr. K-vrednosti, IVR, itd.) su određeni za procenu trajanja efekta FVIII. Dokaz o PK razlika je takođe primećen sa rFVIIIFc koji pokazuje povećane vrednosti TBLPl i TBLP3 u poređenju sa ADVATE® u ekvivalentnim dozama. IVR i K-vrednosti za ADVATE® i rFVIIIFc izgledale su uporedive. Blagi porast vrednosti TBLP1 i TBLP3 primećen je sa povećanjem doze ADVATE® i rFVIIIFc. Nasuprot tome, neznatno smanjenje srednjih vrednosti IVR i K su zabeležene sa povećanjem doze ADVATE® i rFVIIIFc. Kao što je prethodno naznačeno, procena zavisnosti ovih doza o dozama je ograničena ograničenim nivoima doza.
[0207] Srednje vrednosti (±SD) posmatrane TBLP1 bile su 2.88 ± 0.733 i 2.93 ± 0.848 IU/dL po IU/kg za ADVATE® i 4.28 ± 0.873 i 5.16 ± 2.02 IU/dL po IU/kg za rFVIIIFc za 25 i 65 IU/kg dozne grupe, respektivno. Srednje vrednosti (±SD) posmatrane TBLP3 bile su 2.06 ± 0.527 i 2.26 ± 0.666 IU/dL po IU/kg za ADVATE® i 3.09 ± 0.623 i 3.93 ± 1.59 IU/dL po IU/kg za rFVIIIFc za 25 i 65 IU/kg dozne grupe, respektivno.
[0208] Srednje vrednosti IVR i K, izračunate korišćenjem posmatranih vrednosti Cmax (oduzete sa baznom linijom i zaostalim lekom u modelu) su generalno veće od vrednosti utvrđenih pomoću Cmax vrednosti koje su predviđene modelom; konzistentno sa malim potcenjivanjem posmatrane vršne aktivnosti korišćenjem modela sa jednim odeljkom.
Srednje vrednosti (±SD) posmatrane K-vrednosti bile su 2.57 ± 0.198 i 2.13 ± 0.598 IU/dL po IU/kg za ADVATE® i 2.46 ± 0.330 i 1.85 ± 0.332 IU/dL po IU/kg za rFVIIIFc za 25 i 65 IU/kg dozne grupe, respektivno. Srednje vrednosti (± SD) posmatrane IVR vrednosti su bile 94.1 ± 15.6 i 85.8 ± 4.38 h*IU/dL za ADVATE® i 89.5 ± 11.9 i 74.8 ± 10,1 h*IU/dL za rFVIIIFc za 25 i 65 IU/kg dozne grupe, respektivno.
Farmakokinetici sa jednom dozom (Hromogeni test)
[0209] Posmatrana aktivnost FVIII naglo je porasla nakon kratke IV infuzije bilo ADVATE® ili rFVIIIFc, sa srednjim (± SD) modelom predviđenim Cmax vrednostima 70.2 ± 9.60 i 157 ± 38.6 IU/dL za ADVATE® i 70.3 ± 10.0 i 158 ± 34.7 IU/dL za rFVIIIFc za grupe doza od 25 i 65 IU/kg, respektivno.
[0210] Svi pacijenti koji su primali ADVATE® i rFVIIIFc imali su povećanje doze FVIII aktivnosti. Uočeno povećanje u Cmax i AUCINFbilo je nešto manje od proporcionalne dozi tokom procenjenog opsega doza.
[0211] Nakon završetka infuzije, opadanje uočene aktivnosti FVIII pokazalo je monoeksponentne karakteristike raspadanja dok se ne dostigne osnovni nivo. Stopa smanjenja aktivnosti FVIII bila je sporija za rFVIIIFc nego za ADVATE® sa srednjim (± SD) modelom predviđenim polu-raspadom eliminacije od 10.7 ± 1.98 i 10.3 ± 3.27 h za ADVATE® i 16.2 ± 2.92 i 19.0 ± 7.94 sati za rFVIIIFc za grupe doza od 25 i 65 IU/kg, respektivno. Izgleda da su vrednosti poluživota eliminacije nezavisne od doze u rasponu doza procenjenog za oba FVIII proizvoda.
[0212] Ukupna sistemska izloženost FVIII (procenjeno od AUCINF) je ∼ 53% i 84% veća nakon primene rFVIIIFc nego ADVATE® na nivoima doze od 25 i 65 IU/kg, respektivno. Srednje (± SD) vrednosti predviđene za AUCINFsu bile 1080 ± 236 i 2320 ± 784 h*IU/dL za ADVATE® i 1650 ± 408 i 4280 ± 1860 h*IU/dL za rFVIIIFc za 25 i 65 IU/kg dozne grupe, respektivno.
[0213] Slično polu-životu eliminacije, MRT je produžen za rFVIIIFc u odnosu na ADVATE®. Srednje (± SD) vrednosti modelom predviđene za MRT su bile 15.3 ± 2.86 i 14.8 ± 4.72 h*IU/dL za ADVATE® i 23.4 ± 4.22 i 27.3 ± 11.4 h*IU/dL za rFVIIIFc za 25 i 65 IU/kg dozne grupe, respektivno. Izgleda da su MRT vrednosti poluživota eliminacije nezavisne od doze u rasponu doza procenjenog za oba FVIII proizvoda.
[0214] Pored toga, utvrđene su vrednosti primarnih PK parametara za CL i V. CL vrednosti za rFVIIIFc samo su obračunate ∼ 58-66% onih koji su uočeni kod ADVATE® u ekvivalentnim dozama. Srednje (± SD) vrednosti modelom predviđene za CL su bile 2.39 ± 0.527 i 3.21 ± 1.40 h*IU/dL za ADVATE® i 1.57 ± 0.349 i 1.86 ± 0.970 h*IU/dL za rFVIIIFc za 25 i 65 IU/kg dozne grupe, respektivno. V vrednosti su bile uporedive između ADVATE® i rFVIIIFc sa srednjim (± SD) predviđenim V vrednostima od 35.8 ± 5.52 i 43.6 ± 11.2 mL/kg za ADVATE® i 35.9 ± 6.65 i 42.7 ± 8.91 mL/kg za rFVIIIFc za 25 i 65 IU/kg doznih grupa, respektivno. Porast u srednjim vrednostima CL i V zabeležen je sa povećanjem doze ADVATE® i rFVIIIFc; međutim, povećanje standardnih devijacija od 65 IU/kg u kombinaciji sa ograničenim nivoima doza ograničilo je procenu zavisnosti ovih parametara od doze.
[0215] Pored primarnih PK parametara, sekundarni PK parametri (npr. K-vrednosti, IVR, itd.) su određeni za procenu trajanja efekta FVIII. Dokaz o PK razlika je takođe primećen sa rFVIIIFc koji pokazuje povećane vrednosti TBLPl i TBLP3 u poređenju sa ADVATE® u ekvivalentnim dozama. IVR i K-vrednosti za ADVATE® i rFVIIIFc izgledale su uporedive.
[0216] Blagi porast vrednosti TBLP1 i TBLP3 primećen je sa povećanjem doze ADVATE® i rFVIIIFc. Nasuprot tome, neznatno smanjenje srednjih vrednosti IVR i K su zabeležene sa povećanjem doze ADVATE® i rFVIIIFc. Kao što je prethodno naznačeno, procena zavisnosti ovih doza o dozama je ograničena ograničenim nivoima doza.
[0217] Srednje vrednosti (±SD) posmatrane TBLP1 bile su 2.70 ± 0.511 i 3.09 ± 0.978 IU/dL po IU/kg za ADVATE® i 4.06 ± 0.798 i 5.66 ± 2.38 IU/dL po IU/kg za rFVIIIFc za 25 i 65 IU/kg dozne grupe, respektivno. Srednje vrednosti (±SD) posmatrane TBLP3 bile su 1.98 ± 0.377 i 2.39 ± 0.718 IU/dL po IU/kg za ADVATE® i 3.04 ± 0.598 i 4.44 ± 1.84 IU/dL po IU/kg za rFVIIIFc za 25 i 65 IU/kg dozne grupe, respektivno.
[0218] Srednje vrednosti IVR i K, izračunate korišćenjem posmatranih vrednosti Cmax (oduzete sa baznom linijom i zaostalim lekom u modelu) su generalno veće od vrednosti utvrđenih pomoću Cmax vrednosti koje su predviđene modelom; konzistentno sa malim potcenjivanjem posmatrane vršne aktivnosti korišćenjem modela sa jednim odeljkom.
Srednje vrednosti (±SD) posmatrane K-vrednosti bile su 3.08 ± 0.429 i 2.85 ± 0.721 IU/dL po IU/kg za ADVATE® i 3.12 ± 0.451 i 2.92 ± 0.985 IU/dL po IU/kg za rFVIIIFc za 25 i 65 IU/kg dozne grupe, respektivno. Srednje vrednosti (± SD) posmatrane IVR vrednosti su bile 112 ± 14.5 i 116 ± 26.9 h*IU/dL za ADVATE® i 113 ± 16.3 i 117 ± 33.6 h*IU/dL za rFVIIIFc za 25 i 65 IU/kg dozne grupe, respektivno.
ZAKLJUČCI
[0219] Svi pacijenti koji su primali ADVATE® i rFVIIIFc imali su uporedivo povećanje doze Cmax i AUCINF u odnosu na procenjeni opseg doza. Maksimalne koncentracije ADVATE® i rFVIIIFc aktivnosti u plazmi su generalno posmatrane unutar prvog sata nakon završetka infuzije i ostale su detektabilne nekoliko dana nakon doziranja. Posle završetka infuzije, smanjenje bazne korekcije korigovane FVIII aktivnosti pokazalo je monoeksponentni raspad sve dok nije postignuta osnovna vrednost za oba proizvoda.
Vrednosti parametara za polu-raspad eliminacije i MRT su izgledale kao nezavisne od doze u opsegu doza koje su procenjene za oba proizvoda FVIII. Blagi porast u srednjim vrednostima CL i V zabeležen je sa povećanjem doze ADVATE® i rFVIIIFc; međutim, povećana varijabilnost inter ispitanika na 65 IU/kg u kombinaciji sa ograničenim nivoima doza ograničila je procenu zavisnosti ovih parametara od doze.
[0220] Poređenjem rFVIIIFc i ADVATE® aktivnosti PK otkriveno je približno 48-61% (jednofazni test) ili 53-84% (hromogeni test) povećanje sistemske izloženosti, približno 30-40% smanjenje klirensa, i približno 50-80% % povećanja i polu-života eliminacije i MRT za rFVIIIFc u odnosu na ADVATE® u uporedivim dozama. Dokaz o PK razlika je takođe primećen sa rFVIIIFc koji pokazuje povećane vrednosti TBLPl i TBLP3 u poređenju sa ADVATE® u ekvivalentnim dozama. IVR i K-vrednosti za ADVATE® i rFVIIIFc izgledale su uporedive.
[0221] PK parametri dobijeni iz rezultata hromogenog testa se generalno slažu sa onima iz jednofaznog testa, osim što je hromogeni test dao veću procenu parametara izlaganja (npr., Cmax, AUCINF, itd.).
[0222] Sa uočenim poboljšanjima u PK, rFVIIIFc može pružiti produženu zaštitu od krvarenja, omogućavajući manje česte injekcije za osobe sa hemofilijom A.
Primer 6
[0223] Na osnovu interne PK analize iz prve studije rFVIII:Fc (Primer 3), dizajnirana je A-LONG studija. A-LONG je otvorena etiketa, multi-centar procena bezbednosti, farmakokinetike i efikasnosti rekombinantne Fuzije Faktora VIII (FVIII:Fc) u prevenciji i lečenju krvarenja kod prethodno lečenih ispitanika sa teškom hemofilijom A (definisano kao < 1 IU/dL [<1%] endogenog FVIII).
[0224] Približno 106 ispitanika će biti upisano u jedan od tri režima: prilagođeni režim profilakse (krak 1), režim nedeljnog doziranja (krak 2) i režim na zahtev (krak 3).
Krak 1:Skrojen režim profilakse
[0225] Krak 1 će obuhvatiti ukupnu grupu i PK podgrupu. Približno 66 ispitanika će biti upisano. Početni režim će biti dva puta nedeljno na 25 IU/kg prvog dana, a zatim na 50 IU/kg četvrtog dana u nedelji. Ispitanik će primenjivati rFVIIIFc na ovom nedeljnom režimu profilakse dok PK rezultati za rFVIIIFc nisu dostupni. Na osnovu ovih rezultata, utvrdiće se prilagođeni profilaksa za svakog pojedinca, u kojoj će se odrediti doza i interval kako bi se održao najniži nivo aktivnosti od 1-3% FVIII. Svaki ispitanik će zatim primenjivati svoj individualno prilagođeni profilaksni režim tokom celog ispitivanja.
[0226] Ispitanici će biti praćeni tokom čitave studije i vršiće se stalna prilagođavanja doza i intervala. Podešavanja se mogu izvršiti kada ispitanik doživi neprihvatljive epizode krvarenja definisane kao ≥ 2 epizode spontanog krvarenja tokom dvomesečnog perioda probe. U ovom slučaju, prilagođavanje će ciljati najniže nivoe od 3-5%.
Krak 2:Nedeljni režim doziranja
[0227] Približno 20 ispitanika će biti uključeni/nasumično određeni i podvrgnuti se skraćenom profilu rFVIIIFc PK na sljedeći način: ispiranje od najmanje 96 sati; jedna doza rFVIIIFc 65 IU/kg; Skraćeno uzimanje uzoraka koje počinje na rFVIIIFc danu 0, uključujući pre-injekciju i 10 (± 2) minuta, 3 sata (± 15 minuta), 72 (± 2) časova [dan 3] i 96 (± 2) časova [dan 4] od početka injekcije. Nakon skraćenog PK profilisanja, ispitanici će primenjivati fiksnu dozu od 65 IU/kg rFVIIIFc svakih 7 dana najmanje 28 nedelja i do 52 nedelje.
Krak 3:Režim na zahtev
[0228] U studiji će biti ocenjeno najmanje 10 velikih operacija u najmanje 5 ispitanika. Glavna operacija je definisana kao bilo koja hirurška procedura (elektivna ili hitna) koja obuhvata opštu anesteziju i/ili respiratornu pomoć u kojoj je prodrla i izložena velika telesna šupljina, ili za koju se stvara značajno oštećenje fizičkih ili fizioloških funkcija (npr., laparotomija, torakotomija, kraniotomija, zamena zglobova i amputacija udova).
[0229] Za profilaksu tokom operacije, ispitanici će biti tretirani sa 20 do 50 IU/kg rFVIIIFc svakih 12 do 24 sata. Pre operacije, lekar će pregledati rFVIIIFc PK profil ispitanika i proceniti režim doziranja Faktora VIII, koji je obično potreban za tip planirane hirurgije i klinički status ispitanika . Preporuke za odgovarajuće doziranje rFVIIIFc u periodu hirurškog tretmana, uključujući i vreme rehabilitacije, uzimaju u obzir ove faktore.
[0230] Primarni ciljevi ove studije su:(a) proceniti bezbednost i podnošljivost rFVIIIFc koji se daju kao profilaksa, na zahtev i hirurški režim lečenja; i (b) da proceni efikasnost rFVIIIFc koji se daje kao profilaksa, na zahtev i hirurški režim lečenja. Sekundarni ciljevi ove studije su (a) da se okarakteriše PK profil rFVIIIFc i uporedi PK FVIIIFc sa trenutno prodatim proizvodom, ADVATE®; (b) procenu individualnih odgovora sa FVIIIFc; i (c) procenu potrošnje FVIIIFc.
Primarni ciljevi
[0231]
• Za procenu bezbednosti i tolerancije rFVIIIFc koji se primenjuje kao profilaksa, nedeljni, na zahtev i hirurški režim lečenja
• Da bi se procenila efikasnost rFVIIIFc primenjenog kao prilagođena profilaksa, na zahtev i hirurški režim lečenja
Sekundarni ciljevi
[0232]
• Da bi se okarakterisao PK profil rFVIIIFc i uporedio PK rFVIIIFc sa trenutno plasiranim proizvodom, ADVATE®
• Da biste procenili pojedinačne odgovore pomoću rFVIIIFc
• Da se karakteriše opseg doze i raspored potreban za adekvatno sprečavanje krvarenja u profilaksu; održava homeostazu u hirurškom okruženju; ili za lečenje epizoda krvarenja u tretmanu na zahtev, nedeljnom tretmanu ili profilaksi
• Za procenu potrošnje rFVIIIFc (npr., ukupna godišnja potrošnja po rFVIIIFc po subjektu)
Primer 7
Klinička ROTEM® procena
[0233] U studiji iz Primera 7, pored merenja aktivnosti FVIII u plazmi pomoću testa parcijalno aktiviranog parcijalnog tromboplastinskog vremena (aPTT), istraživana je rotaciona tromboelastometrija (ROTEM®) u celoj krvi za procenu poboljšanja globalne hemostaze pomoću rFVIIIFc i ADVATE® u 2 ispitanika, konkretno, 1 u kohorti niske doze i 1 u kohorti visoke doze.
[0234] Čini se da su rFVIIIFc i ADVATE® uporedivo aktivni u formiranju ugruška kada su ubačeni u krv ispitanika pre tretmana rFVIIIFc. Vreme zgrušavanja (CT) bilo je linearno u odnosu na dozu rFVIIIFc i ADVATE® u opsegu od približno 1% od 100% normale, a odgovor doze bio je uporediv između rFVIIIFc i ADVATE® u istom subjektu.
[0235] Nakon doziranja sa ADVATE® i zatim rFVIIIFc, uzorkovana je citrirana cela krv u različitim vremenskim tačkama i formiranje ugruška nakon rekalcifikacije je praćeno pomoću ROTEM®. Uprkos varijabilnom baznom CT zbog ostataka FVIII nivoa pre ADVATE® ili rFVIIIFc doziranja, oba proizvoda su efikasno korigovala CT do uporedivih nivoa 30 minuta nakon injekcije. Dodatno, poboljšanje CT je bolje održavano na i nakon 3 sata nakon ubrizgavanja 25 IU/kg rFVIIIFc u odnosu na ADVATE® kod ispitanika koji je doziran u ovoj niskoj dozi. Međutim, diferencijalno poboljšanje rFVIIIFc u odnosu na ADVATE® bilo je mnogo manje značajno u dozi od 65 IU/kg.
Primer 8
[0236] HemA miševi su korišćeni za ispitivanja sa klipom na repu. Miševi su prvo anestezirani i zatim injektirani sa 4.6 µg/kg, 1.38 µg/kg, ili 0.46 µg/kg bilo obrađenog rFVIIIFc (lek supstanca, koja sadrži oko 75% -85% obrađenog rFVIIIFc) i pročišćenog jednolančanog rFVIIIFc. Nakon ubrizgavanja, rep je odrezan od vrha i odmah stavljen u epruvetu da bi se sakupila krv. Procenat zaštite na preživljavanju je meren za rFVIIIFc koji je obrađen (lekovita supstanca) i jednolančani FVIIIFc kao što je prikazano u Tabeli 7 i 7.
TABELA 7. In vivo Efikasnost rFVIII:Fc DS i jednolančani rFVIIIFc
[0237] Kao što je prikazano u Tabeli 7 i Slika 7, zaštita preživljavanja od strane jednolančanog rFVIIIFc je uporediva sa obrađenom rFVIIIFc (DS).
Aktivnost zgrušavanja putem in vitro ROTEM
[0238] Potentnost zgrušavanja rFVIIIFc je dalje istraživana u rotacionoj tromboelastometriji u punoj krvi (ROTEM) u opsegu koncentracija, i upoređena sa rBDD FVIII (Xyntha) i
1
rekombinantnim FVIII pune dužine (rflFVIII; Advate). Za in vitro ROTEM, rFVIII proteini su obogaćeni u triplikatu u citriranu sakupljenu krv sakupljenu iz šuplje vene od 5-6 mužjaka HemA miševa do konačne koncentracije od 0, 0.1, 1, 10 i 100% normalnog nivoa FVIII u plazmi. Ugrušak je iniciran dodavanjem CaCl2(NATEM) i vremena zgrušavanja (CT), vremena formiranja ugruška (CFT), alfa-ugao i maksimalnu čvrstoću ugruška (MCF) su zabeleženi na ROTEM sistemu (Pentapharm GmbH, Minhen, Nemačka).
Vreme zgrušavanja (CT), vreme formiranja ugruška (CFT), i alfa ugao za tri proteina obogaćenih HemA mišom u eskalirajućim dozama od 0.1 - 100% normalnih nivoa FVIII prikazani su na Slici 14. U širokom rasponu od 0.1 do 100% normale, CT i CFT su uporedivi među rFVIIIFc, rBDD FVIII i rflFVIII. Ugao alfa je značajno različit (p<0.05) između rFVIIIFc i rBDD FVIII na 10%.
Aktivnost zgrušavanja putem ex vivo ROTEM
[0239] Farmakodinamika rFVIIIFc, merena pomoću ROTEM-a, upoređena je sa rBDD FVIII i rflFVIII nakon jedne intravenske injekcije u miševe hemofilije A. Za ex vivo ROTEM, muški HemA miševi su injektirani intravenozno jednom dozom od 50 IU/kg rFVIIIFc, ADVATE®, ili XYNTHA®, i 5 miševa žrtvovani u svakoj vremenskoj tački (5 minuta, 24, 48, 72 i 96 sati doziranje). Pojedinačna citrirana puna krv uzeta iz šuplje vene je odmah analizirana od strane NATEM-a na ROTEM sistemu i parametri izmereni kao iznad. Ugao CT, CFT i alfa je određen za uzorke uzete od 5 minuta do 96 sati nakon doziranja, i prikazani na Slici 15. Na 5 minuta, svi su uporedivo efikasni, što rezultira sličnim CT, CFT i alfa kutom (Slika 15A - C). Međutim, rFVIIIFc je pokazao značajno poboljšani (p<0.05) CT na 72 i 96 sati, CFT i alfa ugao na 96 h (slike 15A-C) u odnosu na rBDD FVIII i rflFVIII.
Primer 9
[0240] Rekombinantni faktor VIIIFc (rFVIIIFc) se sastoji od proteina r (BDD) rFVIII koji je izbrisan iz domena B, genetski fuzionisan sa Fc domenom humanog imunoglobulina G1 (IgGl). Pre sekrecije iz HEK 293 ćelija, većina rFVIIIFc se prerađuje u FVIII teški lanac (HC) i laki lanac (LC+Fc). U cirkulaciji, rFVIIIFc je kompleksiran sa von Willebrandovim faktorom (VWF) i oslobođen nakon aktivacije na način koji se ne razlikuje od prirodnog FVIII. Smatra se da spontana disocijacija HC i LC doprinosi gubitku aktivnosti FVIII u plazmi i tokom skladištenja FVIII lekova. Ovde ćemo opisati jednu lančanu neobrađenu izoformu rFVIIIFc (SC rFVIIIFc), koja može da obezbedi superiornu proizvodnost i povećanu stabilnost u poređenju sa prirodnim FVIII.
2
[0241] SC rFVIIIFc je prečišćen od rFVIIIFc, koji sadrži frakciju neobrađene izoforme. U poređenju sa rFVIIIFc, SC rFVIIIFc je pokazao ekvivalentnu hromogenu aktivnost, ali približno 60% smanjenu aktivnost u jednoj fazi (aPTT) testu (Tabela 3A-B). Test generacije trombina (TGA) je izveden pomoću kalibrisanog automatizovanog trombograma (od Thrombinoscope®). U testu generisanja trombina (TGA), SC rFVIIIFc je takođe pokazao smanjeni potencijal trombina (Slika 13A), a pik trombin (Slika 13B) u poređenju sa rFVIIIFc. Međutim, kao što je prikazano u Tabeli 3B, puna aktivnost SC rFVIIIFc pomoću aPTT je uočena u odsustvu vWF, što sugeriše da se oslobađanje iz vWF može odložiti zbog kovalentne veze a3 kiselog regiona sa HC posle odvajanja Arg 1680 u SC rFVIIIFc za razliku od a3 oslobađanja i disocijacije od potpuno obrađenog FVIII. Odložena disocijacija iz vWF može objasniti smanjenu aktivnost zapaženu u aPTT testu i TGA, dok je puna aktivnost uočena u dvostepenom hromogenom testu. Smanjena brzina aktivacije u prisustvu vWF je potvrđena u modifikovanom testu hromogenog supstrata sa ograničavanjem trombina kao FVIII aktivatora.
[0242] In vivo funkcija SC rFVIIIFc je procenjena u modelu transekcije vena repa HemA miša (TVT). HemA mužjaci miševa su tretirani sa naznačenim dozama ili rFVIIIFc leka ili SC rFVIIIFc 48 sati pre TVT. Ponovno krvarenje repa i preživljavanje praćeni su svakih sat vremena do 12 sati nakon TVT, a konačno opažanje obavljeno je 24 sata nakon TVT. SC rFVIIIFc i rFVIIIFc su pokazali ekvivalentnu in vivo efikasnost u ovom modelu, sa ED50 od 1.17 µg/kg i 1.23 µg/kg, kada je TVT obavljen 48 sati nakon infuzije (Slika 7 (A)). Uporedne 24-satne krive preživljavanja TVT (p ≥ 0.65) (Slika 7 (B)) i stope ponovnog krvarenja (Slika 7 (C)) kod HemA miševa su primećene za SC rFVIIIFc i rFVIIIFc na svakom ispitanom nivou doze, što ukazuje da SC rFVIIIFc je bio jednako efikasan kao rFVIIIFc uprkos njegovoj nižoj očiglednoj aPTT aktivnosti. Odložena in vitro aktivacija SC rFVIIIFc u prisustvu vWF stoga izgleda da nema značajan uticaj na njegovu in vivo efikasnost. Prema tome, SC rFVIIIFc predstavlja novu i efikasnu izoformu rFVIIIFc sa potencijalnim kliničkim primenama. Biće potrebne dodatne studije da se pokaže poboljšana stabilnost proizvoda u kontekstu ovog Fc fuzionog proteina.
Primer 10
[0243] Proizvodi sadašnjeg faktora VIII (FVIII) pokazuju polu-raspad (t<1/2>) od približno 8-12 sati, zahtevajući česte intravenske injekcije za profilaksu i lečenje pacijenata sa hemofilijom A. rFVIIIFc je rekombinantni fuzioni protein sastavljen od jednog molekula FVIII kovalentno vezanog za Fc domen ljudskog IgG1da produži cirkulirajući polu-raspad rFVIII.
Ovo prvo u humanom ispitivanju kod prethodno tretiranih muških ispitanika sa teškom hemofilijom A ispitivalo je bezbednost i farmakokinetiku rFVIIIFc. Šesnaest ispitanika primilo je jednu dozu ADVATE® na 25 ili 65 IU/kg, a zatim jednaku dozu rFVIIIFc. Većina neželjenih događaja nije bila povezana sa ispitivanim lekom. Nijedan od ispitanika nije razvio anti-FVIIIFc antitela ili inhibitore. U svim nivoima doze, u poređenju sa ADVATE®, rFVIIIFc je pokazao 1.54 do 1.71 puta duži eliminacioni t1/2i srednje vreme zadržavanja, 1.49 do 1.56 puta manji klirens, i 1.48 do 1.56 puta veći ukupni sistemski izlaganje.
ADVATE® i rFVIIIFc imali su uporedive doze zavisne maksimalne koncentracije u plazmi i oporavak. Vreme do 1% aktivnosti FVIII iznad polazne vrednosti bilo je približno 1.53 do 1.68 puta duže nego ADVATE® preko nivoa doza. Prema tome, rFVIIIFc može ponuditi održiv terapijski pristup za postizanje produžene hemostatske zaštite i manje učestalo doziranje kod pacijenata sa hemofilijom A.
[0244] Hemofilija A je nasleđeni poremećaj krvarenja koji rezultira čestim spontanim i traumatskim krvarenjem u zglobovima i mekim tkivima. Mannucci PM, Tuddenham EGD, N Engl J Med, 344:1773-1779 (2001). Kada se neadekvatno leči, ovo krvarenje dovodi do hronične artropatije, invalidnosti i povećanog rizika od smrti. Soucie JM i dr., Blood.
96(2):437-442 (2000).
[0245] FVIII (pdFVIII) i rekombinantni humani FVIII (rFVIII) proizvodi dobijeni iz plazme su korišćeni za tretman (terapija na zahtev) i prevenciju (profilaksa) epizoda krvarenja. rFVIII je razvijen kako bi se smanjio rizik prenosa patogena koji se prenosi krvlju nakon široko rasprostranjene kontaminacije proizvoda plazme virusima HIV-a i hepatitisa, i da se osigura adekvatno snabdevanje FVIII proizvodom. Međutim, hemostatska zaštita sa trenutnim FVIII proizvodima je privremeno ograničena zbog kratkog polu-života (t1/2) od približno 8-12 sati, što zahteva profilaktičku injekciju tri puta tjedno ili svaki drugi dan za većinu pacijenata kako bi se održale razine FVIII. iznad 1%, nivo koji je utvrđen kao zaštitni protiv većine spontanih krvarenja. Manco-Johnson i dr., New Engl J Med.357(6):535-44 (2007).
[0246] Mnoge studije su pokazale da, čak i u visokim dozama, terapija na zahtev nije efikasna u sprečavanju artropatije. Aledort L. i dr., J Intern Med.236:391-399 (1994); Petrini P. i dr., Am J Pediatr Hematol Oncol.13:280-287 (1991). Prednosti profilaktičke terapije su pokazane u brojnim kliničkim studijama<4, 6-15>i Manco-Johnson i dr., supra, utvrdili su da su
4
deca počela primarnu profilaksu nakon prvog krvarenja u zglobovima imala značajno manje krvarenja i manje oštećenja zglobova nego deca koja su tretirana na zahtev.
[0247] U poređenju sa lečenjem na zahtev, profilaktička terapija takođe smanjuje invaliditet, stopu hospitalizacije i vreme koje je izgubljeno iz škole ili posla,<6,16>i poboljšava kvalitet života pacijenata i njihovih porodica.<17>Međutim, profilaktička terapija često zahteva upotrebu sredstava za centralni venski pristup kod dece, kao i opasnosti od infekcije, sepse i tromboze. Pored toga, uprkos koristima, prihvatanje i pridržavanje profilakse se smanjuje sa godinama, delom zbog neugodnosti i invazivnosti.<18,19>Dakle, rFVIII proizvod sa produženom plazmom t1/2bi potencijalno bio od koristi. Lillicrap D., Current Opinion in Hematology 17:393-397 (2010).
[0248] rFVIIIFc je rekombinantni fuzioni protein sastavljen od jednog molekula B-domena izbrisanog rFVIII kovalentno vezanog za humani IgGl Fc domen. Potencijalne prednosti Fcfuzionih proteina uključuju bolju podnošljivost i produženu hemostatičku zaštitu, a Fc domen predstavlja prirodni molekul bez poznate inherentne toksičnosti.<21,22>Vezivanje za IgGlFc domen dozvoljava vezivanje za neonatalni Fc receptor (FcRn), koji se eksprimira u mnogim tipovima ćelija, uključujući endotelne ćelije. Ekspresija FcRn ostaje stabilna tokom čitavog života i odgovorna je za zaštitu IgG1i Fc-fuzionih proteina od lizozomske degradacije, čime se produžava t1/2proteina.<21,23>Brojni proteini unutar cirkulacije se internalizuju u ćelije koje oblažu krvne sudove putem nespecifične pinocitoze i kojima se dovodi do endosomalnih i lizozomskih puteva degradacije.
[0249] Fc proteini stupaju u interakciju sa FcRn, koji su smešteni unutar endozoma.
Endozomi koji sadrže FcRn usmeravaju Fc fuzione proteine nazad na plazmatsku membranu, oslobađajući ih u cirkulaciju na pH-zavisan način,<24>čime se izbegava lizozomalna degradacija. Ovaj pristup recikliranju uspešno je korišćen za proširenje t1/2terapeutskih bioloških materijala; određen broj lekova baziranih na Fc fuziji odobren je za kliničku upotrebu (npr. etanercept, romiplostim), a drugi su u razvoju.<25,26>
[0250] Preklinički podaci za rFVIIIFc ukazuju da se FVIII može spasiti od degradacije prirodnim zaštitnim putem posredovanim sa FcRn, čime se produžava t1/2. Kod miševa i pasa kod hemofilije A, terminalni t1/2plazme za rFVIIIFc bio je približno 2 puta duži nego kod rFVIII.<27,28>. Na osnovu ovih podataka, sproveli smo prvu kliničku studiju za ispitivanje bezbednosti i PK dugotrajnog fFVIIIFc fuzionog proteina kod osoba sa hemofilijom A.
[0251] Dizajn ispitivanja. Ova otvorena, povećana doza, multicentrična faza 1/2a studija kod prethodno lečenih pacijenata sa teškom hemofilijom A ispitala je bezbednost rFVIIIFc i njegovu farmakokinetiku (PK) u poređenju sa ADVATE® (antihemofilni faktor [rekombinantni], bez plazme/albumina) metoda, oktokog alfa, Baxter Healthcare). Ova studija je izvedena u skladu sa US CFR i ICH Smernicama za dobre kliničke prakse. Pre bilo kakvog testiranja, dobijena je saglasnost od strane Institucionalnih odbora za razmatranje i pismeno informisano odobrenje svih subjekata. Dizajn studije je bio sekvencijalan; jedna doza ADVATE® je primenjena na 25 ili 65 IU/kg, a zatim na jednaku dozu rFVIIIFc (Sl.8). Oba leka su injektirana intravenozno tokom približno 10 minuta. Očekuje se da će dva nivoa doza zagraditi tipične terapeutske doze. Ispitanici su praćeni 28 dana nakon primanja rFVIIIFc za bezbednosne analize, uključujući testiranje anti-FVIII antitela i inhibitora na 14 i 28 dana nakon injekcije. Aktivnost FVIII plazme merena je kod ispitanika pre injekcije, 10 i 30 minuta, 1, 3, 6, 9, 24, 48, 72, 96, 120 i 168 sati (7 dana) nakon injekcije rFVIIIFc, sa dodatnim uzorcima na 192, 216, i 240 sati (10 dana) za subjekte doze od 65 IU/kg rFVIIIFc. Aktivnost FVIII u plazmi je merena u istim vremenskim tačkama nakon ADVATE® tretmana, kroz 72 sata za grupu od 25 IU/kg i 96 sati za grupu od 65 IU/kg.
[0252] Ispitanici: muškarci su bili stari najmanje 12 godina sa teškom hemofilijom A (definisanom kao nivo aktivnosti FVIII <1%) i imali su najmanje 100 dokumentovanih prethodnih dana izlaganja koncentracijama FVIII (pdFVIII ili rFVIII). Ispitanici sa poznatom preosetljivošću na proteine miševa ili hrčka, istoriju inhibitora ili titra inhibitora koji se mogu detektovati kod skrininga, ili koji su uzimali neke lekove koji mogu da utiču na hemostazu ili sistemske imunosupresivne lekove, ili koji su imali aktivnu bakterijsku ili virusnu infekciju (osim hepatitisa ili HIV-a) ) unutar 30 dana skrininga su isključeni. Genotip ispitanika je zabeležen na početku ispitivanja, kada je bio poznat.
[0253] Proizvod za tretman: humani rFVIIIFc i Fc transgeni su stabilno transfektovani u HEK293 ćelije i ćelijska linija je opsežno testirana na stabilnost, sterilnost i virusnu kontaminaciju da bi se obezbedila bezbednost. Prečišćeni lek je sastavljen od monomernog B-domena obrisanog FVIII kovalentno vezanog preko svog karboksi-kraja do N-kraja Fc monomera, koji formira disulfidnu vezu sa drugim Fc monomerom tokom sinteze i sekrecije iz ćelija. rFVIIIFc je prečišćen hromatografijom i nanofiltracijom, i bio je potpuno aktivan u jednosmernim i hromogenim testovima zgrušavanja u odnosu na komercijalno dostupne preparate rFVIII. Isporučuje se kao smrznuta tečnost koja sadrži 1000 IU na 2 mL rastvora i formuliše sa L-histidinom (pH 7), natrijum hloridom, kalcijum hloridom, saharozom, manitolom i Polisorbatom 20. Za injekcije, proizvod je razblažen sa slanim rastvorom (0.9% NaCl).
[0254] Spoljašnje mere: primarni cilj ove studije je bio da se proceni bezbednost kroz fizički pregled, izveštavanje o neželjenim događajima koji su se pojavili na tretmanu, razvoj antitela i laboratorijsko praćenje tokom vremena. Sekundarni ciljevi su uključivali parametre izvedene iz PK analiza. Laboratorijske procene su uključivale protrombinsko vreme, aktivirano parcijalno tromboplastinsko vreme (aPTT), međunarodni normalizovani odnos, nivoe D-dimera, von Willebrandov faktor (vWF) antigen, standardne hematološke i hemijske testove krvi, i analizu urina.
[0255] Aktivnost FVIII je merena jednofaznim testom zgrušavanja (aPTT) na Siemens BCS-XP analizatoru koristeći komercijalne reagense (Dade Actin FSL) sa kalibracijom na normalnu referentnu plazmu (Precision Biologics CRYOcheck ™) koja se može pratiti do Svetske zdravstvene organizacije (VHO) ) 5. međunarodni standard (IS) za ljudsku plazmu. Pored testa aPTT, aktivnost FVIII je merena testom hromogenog supstrata<29>korišćenjem komercijalno dostupnog kompleta (Aniara BIOPHEN FVIII:C) koji je u skladu sa preporukama Evropske farmakopeje. Hromogeni test je kalibrisan protiv normalne humane referentne plazme (Instrumentation Laboratories ORKE45), koja je takođe imala potencijal određen prema WHO 5. standardu humane plazme.
[0256] Donja granica kvantifikacije (LLOQ) za jednofazne i hromogene analize bila je 0.5 IU/dL, odnosno 0.4 IU/dL. FVIII inhibitori su mereni pomoću - * Nijmegen-modifikovanog Bethesda testa i manje od 0.6 BU/mL je smatrano negativnim. Anti-rFVIIIFc antitela su procenjivana korišćenjem specifičnog premošćujućeg elektrokemiluminiscentnog imuno testa koji koristi biotin i sulfo-označeni rFVIIIFc. Osetljivost testa je određena kao 89 ng/mL korišćenjem anti-humanog FVIII monoklonskog antitela kao surogatne kontrole.
Tromboelastometrija eksploratorne rotacije cele krvi (ROTEM®) je izvedena u dva ispitanika , po jedan iz svakog nivoa doze, u različitim vremenskim tačkama za procenu poboljšanja globalne hemostaze nakon injekcije sa ADVATE® i rFVIIIFc.
[0257] Farmakokinetičke analize: korisnički definisani model dispozicije jednog odeljka, koji automatski procenjuje endogeni nivo FVIII i kasniji rezidualni raspad, korišten je u WinNonLin-u za analizu podataka o aktivnostima FVIII u odnosu na vreme pojedinog ispitanika nakon jednog davanja ADVATE® ili rFVIIIFc. Stvarna vremena uzimanja uzoraka, doze i trajanje injekcije korišćeni su za izračunavanje parametara uključujući maksimalnu aktivnost (Cmax), t1/2, klirens (CL), volumen raspodele u stacionarnom stanju (Vss), površinu ispod krive (vreme nula) ekstrapoliran na beskonačnost [AUCINF]), srednje vreme zadržavanja (MRT) i inkrementalni oporavak.
[0258] Monte Carlo simulacija rFVIIIFc profila aktivnosti u odnosu na vreme - Da bi se konstruisali profili vremena aktivnosti FVIII nakon režima doziranja od 25 IU/kg ili 65 IU/kg, sprovedena je Monte Carlo simulacija korišćenjem populacionog PK modela ADVATE® i rFVIIIFc. Srednje procene parametara modela (CL, zapremina distribucije) u testiranoj populaciji, interindividualna varijacija i rezidualna varijabilnost procenjene su na osnovu podataka o aktivnostima ADVATE® i rFVIIIFc iz jedne faze (aPTT). u ovoj studiji faze 1/2a. Pet stotina ispitanika je simulirano sa 15 tačaka uzorkovanja za svakog ispitanika za svaki režim doziranja. Procenjen je procenat populacije sa aktivnostima FVIII iznad ili jednakih 1% i 3% u različitim vremenima nakon različitih režima doziranja ADVATE® ili rFVIIIFc.
[0259] Statističke analize - Odabrani PK parametri za rFVIIIFc i ADVATE® su upoređeni pomoću modela analize varijante. PK parametri su log-transformisani za ove analize i procenjena sredstva, srednje razlike i intervali pouzdanosti na logaritamskoj skali su transformisani da bi se dobile procene za geometrijska sredstva, geometrijske srednje vrednosti (GMR) i intervale pouzdanosti, respektivno, na originalnoj skali. GMR je geometrijska sredina intra-subjektivnog odnosa vrednosti parametra rFVIIIFc PK na vrednost parametra ADVATE® PK.
Rezultati
[0260] Dispozicija ispitanika - u ispitivanje je bilo uključeno 19 ispitanika; 16 su podvrgnuti PK evaluaciji i za ADVATE® i za rFVIIIFc. Jedan ispitanik je sam preuzeo svoj prethodni proizvod pre završetka perioda ispiranja nakon doze sa ADVATE® i tako je bio isključen iz PK analize, ali je bio uključen u bezbednosnu analizu. Tri ispitanika su izbačena iz ispitivanja pre nego što su primili bilo koji ispitivani lek: jedan se dobrovoljno povukao; drugi je povučen od strane istražitelja zbog neusklađenosti; i jedan je povučen na zahtev sponzora zbog završetka upisa na ispitivanje. Od ispitanika koji su primali dozu, šest ispitanika je primilo 25 IU/kg, a 10 ispitanika je primilo 65 IU/kg i ADVATE® i rFVIIIFc. Srednja starost je bila 40.3 godine (23 do 61 godina). Genotipska identifikacija je prikupljena za sedam ispitanika; inverzija introna 22 je prijavljena kod šest ispitanika; a defekt promene okvira je zabeležen kod jednog ispitanika. Genotip je bio nepoznat za devet ispitanika. Trinaest ispitanika imalo je antitela na hepatitis C, od kojih su četiri pozitivna na HIV.
[0261] Bezbednost - Četrdeset četiri AE-a koja su se pojavila u lečenju prijavljeno je kod 11 (69%) ispitanika tokom perioda lečenja i praćenja. Ovo je uključivalo dan doziranja sa Advate ili rFVIIIFc kroz 28-dnevni period praćenja nakon doziranja. Većina događaja se smatrala blagom i nijedna nije dovela do povlačenja iz ispitivanja. Jedan događaj, disgeuzija, se pojavio prolazno kod jednog ispitanika dok je primao dozu od 65 IU/kg rFVIIIFc i smatrao se da je povezan sa rFVIIIFc.
[0262] Jedan ispitanik je imao napad anksioznosti nakon što je primio 65 IU/kg rFVIIIFc, što je rezultiralo sa 21 AE, od kojih je 19 ocenjeno kao blago, a dva od njih (glavobolja i fotofobija) su ocenjeni kao umereni. Istražitelj nije smatrao ni da je povezan sa rFVIIIFc.
[0263] Nisu prijavljene ozbiljne epizode krvarenja. Nije otkriven dokaz alergijskih reakcija na injekcije. Svi uzorci plazme su bili negativni na FVIII inhibitore i anti-rFVIIIFc antitela. Nisu primećeni znakovi reakcija na mestu iniciranja. Nisu prijavljene klinički značajne promene u abnormalnim laboratorijskim vrednostima.
[0264] Farmakokinetici: veza između aPTT i hromogene aktivnosti za rFVIIIFc u plazmi -ADVATE® i rFVIIIFc aktivnostima određena je u istim testovima koristeći komercijalno dostupne reagense i kalibraciju u odnosu na normalne standarde plazme kod ljudi. Postojala je jaka korelacija između rezultata dobijenih testom zgrušavanja u jednoj fazi i hromogenog testa u uzorcima koji su imali aktivnost iznad LLOQ. Koeficijenti korelacije (Pearson R<2>) od 0,94 i 0,95 uočeni su između dva rezultata ispitivanja za 151 uzorak nakon ADVATE® doziranja i 185 uzoraka nakon doziranja rFVIIIFc, respektivno. U poređenju sa rezultatima aPTT, hromogene aktivnosti FVIII su u proseku bile 21% veće za ADVATE® i 32% više za rFVIIIFc, koje nisu bile statistički značajne (Slika 9). Ovo zapažanje je dovelo do nešto veće procene parametara izloženosti hromogenom procenom za oba leka. Očigledno viši oporavak FVIII hromogenim testom je tipičan za rekombinantne FVIII proizvode testirane u kliničkim testovima i slažu se sa većinom drugih FVIII proizvoda koji se prodaju na tržištu.
[0265] Poboljšane farmakokinetike za rFVIIIFc - Primarne PK procene su izvedene iz podataka o aktivnostima analize testa zgrušavanja u jednoj fazi (aPTT). Kod ispitanika koji su primili 25 ili 65 IU/kg ADVATE®, praćeno jednakom dozom rFVIIIFc, aktivnost FVIII u plazmi naglo je porasla i dostigla Cmaxunutar prvog sata nakon doziranja. Naknadni pad uočene aktivnosti FVIII pokazao je monoeksponentne karakteristike raspadanja dok se ne postigne osnovna aktivnost FVIII (Slika 10). Cmaxse povećao proporcionalno dozi, ali je bio uporediv između jednakih doza ADVATE® i rFVIIIFc (Tabela 8). Ukupna izloženost (AUCINF) takođe se povećavala proporcionalno sa dozom. Međutim, AUCINFrFVIIIFc bio je 1.48 i 1.56 puta veći od ADVATE® na 25 IU/kg (p=0.002) i 65 IU/kg (p<0.001), respektivno (Tabela 8).
Tabela 8. PK parametri pomoću jedne faze (aPTT) za rFVIIIFc i ADVATE® grupu po doznoj grupi
[0266] Čini se da su t1/2, MRT, CL i Vssnezavisni od doze (Tabela 8). Geometrijska srednja vrednost t<1/2>rFVIIIFc bila je 18.8 sati za obe dozne grupe od 25 IU/kg i 65 IU/kg. Ovo predstavlja 1.54 i 1.70-struko poboljšanje u odnosu na ADVATE® (12.2 sati i 11.0 sati) u ekvivalentnim dozama (p <0.001), respektivno (Tabela 8). Isto poboljšanje unutar ispitanika uočeno je u MRT rFVIIIFc (27.0 sati za obe grupe doza) u poređenju sa ADVATE® (17.5 sati za 25 IU/kg i 15.8 sati za 65 IU/kg) (p<0.001). U skladu sa poboljšanjem t1/2i MRT, došlo je do odgovarajućeg 1.49 i 1.56-strukog smanjenja intra-subjektivnog CL u dozama od 25 IU/kg (p=0.002) i 65 IU/kg (p<0.001), redom. Nije bilo značajnih razlika u Vssi inkrementalnom oporavku između ADVATE® i rFVIIIFc. Stoga, unutar svakog ispitanika , rFVIIIFc je pokazao poboljšani PK profil u poređenju sa ADVATE®. Takođe je primećeno da su pacijenti sa kraćim polu-raspadom na ADVATE® imali kraći polu-raspad na rFVIIIFc, a pacijenti sa dužim polu-raspadom na ADVATE® imali su duži polu-raspad na rFVIIIFc.
1
[0267] Poboljšani PK profil rFVIIIFc rezultirao je povećanim vremenom post-doziranja na 1% FVIII aktivnost koja je bila 1.53 i 1.68 puta duža, odnosno sa ADVATE® na 25 IU/kg (p<0.001) i 65 IU/kg (p < 0.001) (podaci nisu prikazani), što ukazuje na potencijalno duže trajanje terapije za rFVIIIFc.
[0268] Povoljan PK profil rFVIIIFc u odnosu na ADVATE® je takođe pokazan aktivnošću FVIII merenom u hromogenom testu (Tabela 9), koja je bila uporediva sa podacima dobijenim iz aPTT testova. Međutim, procena izloženosti, tj. Cmaxi AUCINF, bila je nešto veća, zasnovana na hromogenom testu, nego na testu zgrušavanja u jednoj fazi (aPTT) za ADVATE® i rFVIIIFc.
Tabela 9. PK parametri pomoću jedne faze (aPTT) za rFVIIIFc i ADVATE® grupu po doznoj grupi
2
[0269] Korelacija između von Willebrandovog faktora i dispozicije rFVIIIFc-Budući da je većina FVIII u cirkulaciji u kompleksu sa VWF<33>i zbog toga što je studija na nivou genoma identifikovala da genetske determinante FVIII nivoa prvenstveno zavise od VWF nivoa,<34>ispitali smo povezanost između VWF i rFVIIIFc. Uočena je jaka korelacija između nivoa VWF i CL i t1/2za rFVIIIFc i ADVATE®. Kao što je prikazano na Slici 10, kako je nivo VWF povećan, CL rFVIIIFc (p=0.0016) i ADVATE® (p=0.0012) su smanjeni.
[0270] Suprotan odnos je uočen između nivoa VWF i t1/2. Kako se nivo VWF povećao, povećao se t1/2rFVIIIFc (p=0.0003) i ADVATE® (p<0.0001). Ova korelacija sugeriše da Fc ostatak rFVIIIFc ne menja ulogu VWF u zaštiti FVIII od klirensa.
[0271] Efekti produžene PK rFVIIIFc na ROTEM® celokupne krvi - Pre primene ispitivanog leka, krv iz jednog ispitanika u svakoj doznoj grupi je dopunjena sa jednakom dozom rFVIIIFc ili ADVATE® i analizirana ROTEM-om iz pune krvi. Vreme zgrušavanja (CT) je bilo linearno u odnosu na dozu u opsegu od približno 1% do 100% normale, a odgovor na dozu bio je uporediv između rFVIIIFc i ADVATE® kod istog ispitanika (podaci nisu prikazani), što ukazuje na sličnu jačinu rFVIIIFc i ADVATE® u formiranju ugruška.
[0272] Uprkos varijabilnom baznom CT zbog rezidualnih FVIII nivoa pre primene ADVATE® ili rFVIIIFc, oba proizvoda su efikasno korigovala CT do uporedivih nivoa 30 minuta posle doziranja (Slika 12). Poboljšanje CT je bolje održavano rFVIIIFc nego ADVATE® nakon 3 sata nakon doze od 25 IU/kg (Slika 12A), i nakon 24 sata nakon doze od 65 IU/kg (Slika 12B).
[0273] rFVIIIFc je dobro tolerisan od strane ispitanika u obe doze. Nije bilo klinički značajnih promena u hematologiji, hemiji krvi ili parametrima analize urina. Većina AEs bila je blaga, nevezana za rFVIIIFc, i razrešavala se bez posledica. Tokom studije nije bilo ozbiljnih neželjenih efekata ili smrtnih slučajeva, a nijedan ispitanik niti u jednoj dozi nije razvio neutralizujuća ili vezujuća antitela na rFVIIIFc.
[0274] rFVIIIFc je pokazao značajno poboljšan profil PKV aktivnosti FVIII u odnosu na ADVATE®, pri čemu su t1/2 i MRT preko nivoa doza bili 1,54 do 1,71 puta duži, što je mereno testom zgrušavanja u jednoj fazi (aPTT) i 1,59 do 1,84 puta duže. dvostepenim hromogenim testom. Produžena aktivnost rFVIIIFc predviđa moguću produženu efikasnost, dozvoljavajući ređe doziranje u profilaktičkom tretmanu pacijenata sa hemofilijom A.
[0275] Usvajanjem PK parametara izvedenih iz ove studije, Monte Carlo simulacija predviđa da će veći procenat pacijenata koji primaju rFVIIIFc održati nivoe FVIII iznad 1% ili 3% u poređenju sa pacijentima koji primaju jednake doze ADVATE® (Tabela 10). Na primer, u dozi od 25 IU/kg, 12.2% ADVATE® pacijenata naspram 71.2% pacijenata sa rFVIIIFc predviđa se da imaju najniže nivoe FVIII iznad 1% na dan 4; u dozi od 65 IU/kg, 11.0% ADVATE® pacijenata naspram 66.4% pacijenata sa rFVIIIFc predviđa se da imaju najniže nivoe FVIII iznad 3% na dan 4; Klinička ispitivanja u većem broju pacijenata su planirana da potvrde rezultate iz ove faze 1/2a studije i iz Monte Carlo simulacijskih predviđanja.
4
Tabela 10. Predviđeni procenat ispitanika koji su dostigli nivoe FVIII iznad 1% i 3% od normalne u određenom doznom režimu ADVATE® ili rFVIIIFc
[0276] Uprkos uspehu Fc fuzione tehnologije u produženju cirkulacije t1/2za različite proteinske terapeutike, rFVIII se smatrao prevelikim da bi uspešno proizveo dimerne fuzije Fc. Tako smo stvorili monomerni Fc fuzioni protein, pri čemu je jedan efektorski molekul kovalentno vezan za dimerni Fc, omogućavajući vezivanje za intracelularni FcRn i naknadno recikliranje.<21,22>In vitro testovi koagulacije ne pokazuju gubitak specifične aktivnosti za rFVIIIFc, u poređenju sa izbrisanim B-domenom ili prirodnim FVIII, bilo zgrušavanjem ili hromogenim analizama, koristeći komercijalno dostupne reagense i uobičajeno korišćene FVIII referentne standarde (JAD, TL, SCL, i dr., rukopis dostavljen avgusta, 2011). Pored toga, ovi rezultati ukazuju na to da se rFVIIIFc može pouzdano analizirati u kliničkom okruženju bilo u jednom stadijumu ili hromogenom postupkom.
[0277] Ukratko, ovo kliničko ispitivanje faze 1/2a je prvo ispitivanje koje je pokazalo sigurnost i produženo t1/2rFVIIIFc u bolesnika sa teškom hemofilijom A. U toku je faza 3 faze studije sa rFVIIIFc za uspostavljanje efikasnog režima doziranja za profilaksu kod osoba sa hemofilija A.
Primer 11
[0278] Nova jedno-lančana (SC) izoforma faktora VIII (FVIII), koja je rezultat nepotpune proteolize na ostatku R1648 tokom biosinteze, može da obezbedi superiornu proizvodnost i stabilnost u odnosu na prirodni FVIII. Jedna rekombinantna molekula faktora VIII koja je izbrisana sa B domena i koja je fuzionisana sa Fc domenom imunoglobulina (rFVIIIFc) i njegovim prečišćenim SC partnerom (SC-rFVIIIFc), pokazala je sličnu specifičnu aktivnost u analizama zgrušavanja u jednoj fazi korišćenjem plazma osiromašenog von Willebrandovog faktora (VWF), ali SC -rFVIIIFc pokazuje manju specifičnu aktivnost u prisustvu VWF. Ova studija je sprovedena kako bi se utvrdilo da li se rFVIIIFc, SC-rFVIIIFc i rBDD-FVIII (XYNTHA®, REFACTO AF®) vezani za VWF razlikuju u odnosu na proteolitičko oslobađanje posredovano od trombina iz VWF.
[0279] Ekvimolarne količine rFVIIIFc, SC-rFVIIIFc i rBDD-FVIII su uhvaćene na optičkom biosenzorskom čipu na kojem je ljudski VWF bio imobilizovan aminskom vezom. Humani atrombin u rasponu koncentracija je infundiran preko površine čipa, a brzine oslobađanja FVIII iz imobiliziranog VWF su praćene u realnom vremenu. Polovina maksimalne efikasne koncentracije (EC50) a-trombina je određena za svaku vrstu FVIII.
[0280] EC50vrednosti α-trombina za rFVIIIFc i rBDD-FVIII bile su uporedive (3.7 ± 0.2 U/mL i 3.2 ± 0.3 U/mL, respektivno), dok je EC50vrednost za SC-rFVIIIFc bila veća od 3 puta veća (11.7 ± 0.9 U/mL). Ovo otkriće da se SC-rFVIIIFc oslobađa sporije od VWF nego što je to rFVIIIFc ili rBDD-FVIII je u skladu sa prethodno zapaženim nalazom u vezi aktivnosti rFVIIIFc i SC-rFVIIIFc u testu zgrušavanja u jednoj fazi (aPTT) u kome je SC-FVIIIFc je imao manju očiglednu aktivnost samo kada je VWF bio prisutan u uzorku plazme testa. Međutim, svi uzorci poseduju ekvivalentne aktivnosti u modelu mišjeg krvarenja, što ukazuje da odziv FVIII preparata na trombin u oslobađanju FVIII iz VWF ne korelira sa efikasnošću in vivo.
TABELA 1:Polinukleotidne sekvence
�
(ii) Fc (ista sekvenca kao A (ii) (SEQ ID NO:3))]
Tabela 2:Polipeptidne sekvence
A. FVIII-Fc monomerni hibrid sa izbrisanim B-domenom (BDD FVIIIFc monomerni dimer):stvoren zajedničkom ekspresijom BDD FVIIIFc i Fc lanaca.
Konstrukt=HC-LC-Fc fuzija. Fc ekspresiona kaseta je zajednički transfektovana sa BDDFVIII-Fc da generiše BDD FVIIIFc monomer-. Za BDD FVIIIFc lanac, Fc sekvenca je prikazana podebljanim slovima; HC sekvenca je prikazana dvostruko podvučeno; preostali niz B domena je prikazan kurzivom. Signalni peptidi su podvučeni.
1 1
B. FVIIIFc monomerni hibrid pune dužine (FVIIIFc monomerni dimer pune dužine):stvoren zajedničkom ekspresijom FVIIIFc i Fc lanaca.
Konstrukt=HC-B-LC-Fc fuzija. Fc ekspresiona kaseta je zajednički transfektovana sa puna dužina FVIII-Fc da generiše puna dužina FVIIIFc monomer. Za FVIIIFc lanac, Fc sekvenca je prikazana podebljanim slovima; HC sekvenca je prikazana dvostruko podvučeno;
Sekvenca B domena je prikazan kurzivom. Signalni peptidi su podvučeni.
1 2
ii) Fc lanac (20 aminokiselinski heterologni signalni peptid iz mišjeg Igκ lanca podvučen)
Citirane reference
[0281]
4. Aledort L. i dr., J Intern Med.:236:391-399 (1994)
5. Petrini P. i dr., Am J Pediatr Hematol Oncol. 13:280-287 (1991).
6. Aznar J. i dr., Haemophilia 6(3):170-176 (2000).
7. Feldman B. i dr., J Thromb Haemost.4:1228-1236 (2006).
8. Kreuz W. i dr., Haemophilia 4:413-417 (1998).
9. Liesner R. i dr., B J Haem. 92:973-978 (1996).
10. Ljung R., Haemophilia. 4(4):409-412 (1998).
11. Löfquist T, i dr., J Intern Med 241:395-400 (1997).
12. Nilsson I, i dr., B. J Int Med 232:25-32 (1992).
13. Risebrough N. i dr., Haemophilia.14:743-752 (2008).
14. Van Den Berg H. i dr., Haemophilia 9 (Suppl.1):27-31 (2003).
15. Van Den Berg H. i dr., Haematologica 89(6):645-650 (2004).
16. Molho P. i dr., Haemophilia 6(1):23-32 (2000).
17. Coppola A. i dr., Blood Transfus. 6(2):4-11 (2008).
18. Geraghty S. i dr., Haemophilia 12:75-81 (2006).
19. Hacker M. i dr., Haemophilia 7(4):392-396 (2001).
20. Lillicrap D., Current Opinion in Hematology 17:393-397 (2010).
21. Dumont J.A. i dr., BioDrugs 20(3):151-60 (2006).
22. Dumont J.A. i dr., "Monomeric Fc fusion technology:an approach to create long lasting clotting factors," in:Kontermann R., ed., Therapeutic Proteins - Strategies to Modulate Half-Life, Chapter 11, Wiley VCH publisher; in press.
23. Roopenian D.C. i dr., Nat Rev Immunol.7(9):715-25 (Epub 2007 Aug 17).
1
24. Lencer W.I. and Blumberg R.S., Trends Cell Biol.15(1):5-9 (2005).
25. Huang C., Curr Opin Biotechnol.20(6):692-9. (Epub 2009 Nov 4).
26. Schmidt S.R., Curr Opin Drug Discov Devel.12(2):284-295 (2009).
27. Dumont J. i dr., Blood.116(21) Abstract 545 (2009).
28. Liu T. i dr., J Thromb Haemost. 9(S2):561 (2011).
29. Rosen S., Scand JHaematol Suppl.33(Suppl 40):139-45 (1984).
30. Lee C.A. i dr., Thromb Haemost.82(6):1644-7 (Dec.1999).
31. Mikaelsson M. and Oswaldsson U., Semin Thromb Hemost. 28(3):257-64 (June 2002).
32. Stroobants A.K. i dr., J Thromb Haemost.9 (Suppl 2) (2011).
33. Lenting P.J. i dr., J Thromb Haemost.5:1353-60 (2007).
34. Smith N.L. i dr., Circulation 121:1382-1392 (2010).
1 4
SPISAK SEKVENCI [0282]
1
1
�
1
1
11
11
11
11
11
11
11
��
��
��
��
��
��
��
�
11
12
1
14
1

Claims (14)

Patentni zahtevi
1. Farmaceutski sastav koji sadrži (i) himerni polipeptid, koji sadrži deo Faktora VIII (FVIII) i drugi deo i (ii) najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, pri čemu 15% do 25% FVIII dela himernog polipeptida je jednolančani FVIII i 75% do 85% FVIII dela himernog polipeptida je obrađeni FVIII, pri čemu jednolančani FVIII sadrži FVIII teški lanac i FVIII laki lanac na jednom polipeptidnom lancu i obrađeni FVIII sadrži FVIII teški lanac i FVIII laki lanac na dva polipeptidna lanca.
2. Farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 1, gde je (a) 25% FVIII dela himernog polipeptida jednolančani FVIII i 75% FVIII dela himernog polipeptida je obrađeni FVIII, (b) 20% FVIII dela himernog polipeptida je jednolančani FVIII i 80% FVIII dela himernog polipeptida je obrađeni FVIII, ili (c) 15% FVIII dela himernog polipeptida je jednolančani FVIII i 85% FVIII dela himernog polipeptid je obrađeni FVIII.
3. Farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde himerni polipeptid koji sadrži jednolančani FVIII ima FVIII aktivnost uporedivu sa himernim polipeptidom koji sadrži obrađeni FVIII.
4. Farmaceutski sastav prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, gde je himerni polipeptid dugo-delujući FVIII polipeptid.
5. Farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 4, gde himerni polipeptid ima polu-raspad duži od polipeptida koji se sastoji iz dela FVIII.
6. Farmaceutski sastav prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, gde drugi deo sadrži Fc region, albumin, PAS sekvencu, transferin, CTP (C-terminalni peptid od 28 aminokiselina (CTP) hCG sa 4 O-glikana) polietilen glikol (PEG), hidroksietil skrob (HES), albumin vezujući polipeptid, mali molekuli koji vezuju albumin ili dve ili više njihovih kombinacija.
7. Farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 6, gde je himerni polipeptid FVIIIFc monomerni dimer hibrid.
8. Farmaceutski sastav prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, gde deo FVIII sadrži FVIII izbrisani B-domen ili punu dužinu, zreli FVIII, ili gde ostatak 1645 odgovara punoj dužini, zreli FVIII, ostatak 1648 koji odgovara punoj dužini, zreli FVIII, ili oba ostatka u jednolančanom FVIII je supstituisan ili mutiran u poređenju sa divljim tipom FVIII.
9. Farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 8, gde deo FVIII sadrži FVIII koji je izbrisan iz B-domena.
10. Farmaceutski sastav prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, koji je pogodna za subkutano, intradermalno, intravaskularno, intravenozno, intramuskularno, spinalno, intrakranijalno, intratekalno, intraokularno, periokularno, intraorbitalno, intrasinovijalno ili intraperitonealno injektiranje čoveku.
11. Farmaceutski sastav prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10, gde je za upotrebu u prevenciji, smanjenju ili lečenju epizode krvarenja kod ispitanika, profilaktičko lečenje epizode krvarenja kod ispitanika, lečenje epizode krvarenja na zahtev, kod pacijenta ili u održavanju homeostata kod ispitanika kome je potrebna operacija.
12. Farmaceutski sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, gde je epizoda krvarenja povezana sa bolešću ili stanjem koje se sastoji iz hemartroze, krvarenja mišića, oralnog krvarenja, krvarenja, krvarenja u mišiće, oralnog krvarenja, traume, traume capitis (traume glave), gastrointestinalnog krvarenja intrakranijalno krvarenje, intraabdominalnog krvarenja, intratorakalnog krvarenja, frakture kostiju, krvarenja u centralnom nervnom sistemu, krvarenja u retrofaringealnom prostoru, krvarenja u retroperitonealnom prostoru ili krvarenja u bočnoslabinskom mišiću karlice.
13. Farmaceutski sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, gde je operacija mala operacija, velika operacija, vađenje zuba, tonzilektomija, ingvinalna herniotomija, sinovijektomija, totalna zamena kolena, kraniotomija, osteosinteza, traumatska hirurgija, intrakranijalna hirurgija, intraabdominalna hirurgija, intratorakalna operacije, hitne operacije ili operacije zamene zglobova.
14. Farmaceutski sastav prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10 ili farmaceutski sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 11-13, koji je liofilizovan.
1
RS20190355A 2011-07-08 2012-07-06 Faktor viii himernih i hibridnih polipeptida i postupci za njihovu upotrebu RS58578B1 (sr)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161506015P 2011-07-08 2011-07-08
US201161522647P 2011-08-11 2011-08-11
US201161541561P 2011-09-30 2011-09-30
US201161569158P 2011-12-09 2011-12-09
US201261586443P 2012-01-13 2012-01-13
US201261622789P 2012-04-11 2012-04-11
US201261657641P 2012-06-08 2012-06-08
EP12811808.0A EP2729161B1 (en) 2011-07-08 2012-07-06 Factor viii chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
PCT/US2012/045784 WO2013009627A2 (en) 2011-07-08 2012-07-06 Factor viii chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS58578B1 true RS58578B1 (sr) 2019-05-31

Family

ID=47506823

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190355A RS58578B1 (sr) 2011-07-08 2012-07-06 Faktor viii himernih i hibridnih polipeptida i postupci za njihovu upotrebu
RS20220491A RS63241B1 (sr) 2011-07-08 2012-07-06 Faktor viii himernih i hibridnih polipeptida i postupci za njihovu upotrebu

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220491A RS63241B1 (sr) 2011-07-08 2012-07-06 Faktor viii himernih i hibridnih polipeptida i postupci za njihovu upotrebu

Country Status (26)

Country Link
US (4) US10010622B2 (sr)
EP (3) EP3513804B1 (sr)
JP (5) JP2014522838A (sr)
KR (2) KR101829603B1 (sr)
CN (2) CN103796670A (sr)
AR (1) AR087091A1 (sr)
AU (3) AU2012282875B2 (sr)
CA (1) CA2841066C (sr)
CL (1) CL2014000024A1 (sr)
CO (1) CO6940381A2 (sr)
CY (1) CY1122900T1 (sr)
DK (2) DK3513804T3 (sr)
EA (1) EA029045B1 (sr)
ES (2) ES2722209T3 (sr)
HR (2) HRP20190535T1 (sr)
HU (1) HUE043763T2 (sr)
IL (2) IL230333B (sr)
LT (2) LT3513804T (sr)
MX (1) MX350581B (sr)
MY (1) MY180714A (sr)
PL (2) PL3513804T3 (sr)
PT (2) PT2729161T (sr)
RS (2) RS58578B1 (sr)
SI (2) SI2729161T1 (sr)
TW (3) TWI626947B (sr)
WO (1) WO2013009627A2 (sr)

Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2333598T5 (es) * 2003-05-06 2013-09-04 Biogen Idec Hemophilia Inc Proteinas quimericas del factor de coagulacion fc para tratar la hemofilia.
AU2007333049B2 (en) 2006-12-15 2014-02-20 Takeda Pharmaceutical Company Limited Factor VIIa-(poly)sialic acid conjugate having prolonged in vivo half-life
US12203113B2 (en) 2009-07-09 2025-01-21 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US8637640B2 (en) 2009-07-27 2014-01-28 Baxter International Inc. Blood coagulation protein conjugates
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
RU2744370C2 (ru) 2009-07-27 2021-03-05 Баксалта Инкорпорейтед Конъюгаты белков свертывания крови
WO2011012850A2 (en) 2009-07-27 2011-02-03 Lipoxen Technologies Limited Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
WO2011069164A2 (en) * 2009-12-06 2011-06-09 Biogen Idec Ma Inc. Factor viii-fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
PL2654794T3 (pl) 2010-12-22 2020-07-27 Baxalta GmbH Materiały i sposoby sprzęgania rozpuszczalnej w wodzie pochodnej kwasu tłuszczowego z białkiem
AU2012282875B2 (en) 2011-07-08 2016-04-21 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor VIII chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
SMT201800586T1 (it) * 2012-01-12 2019-01-11 Bioverativ Therapeutics Inc Riduzione dell'immunogenicita' contro il fattore viii negli individui che si sottopongono alla terapia con fattore viii
US10317376B2 (en) 2012-04-11 2019-06-11 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of detecting glycosaminoglycans
EP2863940A4 (en) 2012-06-08 2016-08-10 Biogen Ma Inc Chimeric clotting factors
AU2013270682A1 (en) 2012-06-08 2014-12-11 Biogen Ma Inc. Procoagulant compounds
EP3404105A1 (en) 2012-07-06 2018-11-21 Bioverativ Therapeutics Inc. Cell line expressing single chain factor viii polypeptides and uses thereof
EP3446700A1 (en) * 2012-10-30 2019-02-27 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of using fviii polypeptide
FI3889173T3 (fi) 2013-02-15 2023-10-02 Bioverativ Therapeutics Inc Optimoitu tekijä viii:n geeni
ES2926798T3 (es) * 2013-03-15 2022-10-28 Bioverativ Therapeutics Inc Formulaciones de polipéptido de factor VIII
US8989053B1 (en) 2013-11-29 2015-03-24 Fedex Corporate Services, Inc. Association management in a wireless node network
SG11201605242YA (en) 2014-01-10 2016-07-28 Biogen Ma Inc Factor viii chimeric proteins and uses thereof
US10453023B2 (en) 2014-05-28 2019-10-22 Fedex Corporate Services, Inc. Methods and node apparatus for adaptive node communication within a wireless node network
WO2016004113A1 (en) 2014-06-30 2016-01-07 Biogen Ma Inc. Optimized factor ix gene
EA201791275A1 (ru) * 2014-12-10 2017-12-29 Опко Байолоджикс Лтд. Способы получения ctp-модифицированных полипептидов длительного действия
US11238397B2 (en) 2015-02-09 2022-02-01 Fedex Corporate Services, Inc. Methods, apparatus, and systems for generating a corrective pickup notification for a shipped item using a mobile master node
US10057133B2 (en) 2015-07-08 2018-08-21 Fedex Corporate Services, Inc. Systems, apparatus, and methods of enhanced monitoring for an event candidate associated with cycling power of an ID node within a wireless node network
PE20231949A1 (es) 2015-10-30 2023-12-05 Spark Therapeutics Inc VARIANTES DEL FACTOR VIII REDUCIDO CON CpG, COMPOSICIONES Y METODOS Y USOS PARA EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS DE LA HEMOSTASIA
KR20180118659A (ko) 2016-02-01 2018-10-31 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. 최적화된 viii 인자 유전자
CN108780538A (zh) 2016-03-23 2018-11-09 联邦快递服务公司 用于自调整无线节点网络中的节点的广播设定的系统、设备和方法
CN107759696A (zh) 2016-08-19 2018-03-06 安源医药科技（上海）有限公司 人白介素7融合蛋白及其制备方法
WO2018032638A1 (zh) 2016-08-19 2018-02-22 安源医药科技（上海）有限公司 用于构建融合蛋白的连接肽
CN106279437B (zh) * 2016-08-19 2017-10-31 安源医药科技（上海）有限公司 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途
MX2019006444A (es) 2016-12-02 2019-10-30 Bioverativ Therapeutics Inc Métodos de tratamiento de artropatía hemofílica utilizando factores de coagulación quiméricos.
JP2019536794A (ja) * 2016-12-02 2019-12-19 バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド 凝固因子に対する免疫寛容を誘導する方法
CA3082043A1 (en) 2017-11-07 2019-05-16 Rani Therapeutics, Llc Clotting factor preparations for delivery into tissue of the intestinal tract using a swallowable drug delivery device
US12492230B2 (en) 2018-03-16 2025-12-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antigenic peptides deriving from secretogranin V and uses thereof for the diagnosis and treatment of type 1 diabetes
US12098179B2 (en) 2018-03-16 2024-09-24 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Antigenic peptides deriving from urocortin 3 and uses thereof for the diagnosis and treatment of type 1 diabetes
US20210023209A1 (en) 2018-03-16 2021-01-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antigenic peptides deriving from pcsk2 and uses thereof for the diagnosis and treatment of type 1 diabetes
US20210024631A1 (en) * 2018-03-28 2021-01-28 Orionis Biosciences, Inc. Bi-functional proteins and construction thereof
SI3793588T1 (sl) 2018-05-18 2025-07-31 Bioverativ Therapeutics Inc. Postopki zdravljenja hemofilije A
KR20220004148A (ko) * 2019-05-03 2022-01-11 라니 테라퓨틱스, 엘엘씨 삼킬 수 있는 약물 전달 장치를 사용하여 장관 조직으로 전달하기 위한 응고인자 제제
EP3736286A1 (en) * 2019-05-09 2020-11-11 Biotest AG Single chain factor viii molecule
BR112021025426A2 (pt) 2019-06-19 2022-06-21 Bioverativ Therapeutics Inc Fator recombinante viii-fc para tratamento de hemofilia e baixa densidade mineral óssea
US12403164B2 (en) 2019-09-30 2025-09-02 Bioverativ Therapeutics Inc. Lentiviral vector formulations
US11981718B2 (en) 2020-05-27 2024-05-14 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Dual-function protein for lipid and blood glucose regulation
KR20230074703A (ko) 2020-06-24 2023-05-31 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. 유리 인자 viii을 상기 단백질이 발현되도록 변형된 렌티바이러스 벡터의 제제로부터 제거하는 방법

Family Cites Families (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4757006A (en) 1983-10-28 1988-07-12 Genetics Institute, Inc. Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
AU5772886A (en) 1985-04-12 1986-11-05 Genetics Institute Inc. Novel procoagulant proteins
KR910006424B1 (ko) 1985-08-21 1991-08-24 인코텍스 비.브이 편성브리프(brief) 제조방법
JP2525022B2 (ja) 1986-01-03 1996-08-14 ジェネティックス・インスチチュ−ト・インコ−ポレ−テッド ▲ＶＩＩＩ▼：ｃ因子型タンパク質の改良生産方法
US5595886A (en) 1986-01-27 1997-01-21 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US5543502A (en) 1986-06-24 1996-08-06 Novo Nordisk A/S Process for producing a coagulation active complex of factor VIII fragments
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
CA1331157C (en) 1987-04-06 1994-08-02 Randal J. Kaufman Method for producing factor viii:c-type proteins
US6060447A (en) 1987-05-19 2000-05-09 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US6346513B1 (en) 1987-06-12 2002-02-12 Baxter Trading Gmbh Proteins with factor VIII activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
IE69026B1 (en) 1987-06-12 1996-08-07 Immuno Ag Novel proteins with factor VIII activity process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
DE3720246A1 (de) 1987-06-19 1988-12-29 Behringwerke Ag Faktor viii:c-aehnliches molekuel mit koagulationsaktivitaet
FR2619314B1 (fr) 1987-08-11 1990-06-15 Transgene Sa Analogue du facteur viii, procede de preparation et composition pharmaceutique le contenant
US4994371A (en) 1987-08-28 1991-02-19 Davie Earl W DNA preparation of Christmas factor and use of DNA sequences
US5171544A (en) 1988-02-02 1992-12-15 Lang John S Method of mixing fluids in packing media for reactors
US5004803A (en) 1988-11-14 1991-04-02 Genetics Institute, Inc. Production of procoagulant proteins
WO1990006952A1 (fr) 1988-12-22 1990-06-28 Kirin-Amgen, Inc. Facteur de stimulation de colonies de granulocytes modifies chimiquement
ATE148171T1 (de) 1989-02-21 1997-02-15 Univ Washington Modifizierte formen von fortpflanzungshormonen
SE465222C5 (sv) 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning
US6552170B1 (en) 1990-04-06 2003-04-22 Amgen Inc. PEGylation reagents and compounds formed therewith
GEP20033082B (en) 1991-03-15 2003-10-27 Amgen Inc Pegylation of Polypeptides
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US5364771A (en) 1992-04-07 1994-11-15 Emory University Hybrid human/porcine factor VIII
US6376463B1 (en) 1992-04-07 2002-04-23 Emory University Modified factor VIII
US5859204A (en) 1992-04-07 1999-01-12 Emory University Modified factor VIII
US5563045A (en) 1992-11-13 1996-10-08 Genetics Institute, Inc. Chimeric procoagulant proteins
SE504074C2 (sv) 1993-07-05 1996-11-04 Pharmacia Ab Proteinberedning för subkutan, intramuskulär eller intradermal administrering
SE9503380D0 (sv) 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
US6458563B1 (en) 1996-06-26 2002-10-01 Emory University Modified factor VIII
CA2225189C (en) 1997-03-06 2010-05-25 Queen's University At Kingston Canine factor viii gene, protein and methods of use
US6200560B1 (en) 1998-10-20 2001-03-13 Avigen, Inc. Adeno-associated virus vectors for expression of factor VIII by target cells
JP5179689B2 (ja) 2000-02-11 2013-04-10 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 抗体ベース融合タンパク質の循環系内半減期の増強
ATE417618T1 (de) * 2001-10-05 2009-01-15 Expression Therapeutics Llc Faktor-viii-polypeptide auf hohem expressionsniveau codierende nukleinsäure- und aminosäuresequenzen und verwendungsverfahren
PT1463751E (pt) 2001-12-21 2013-08-26 Human Genome Sciences Inc Proteínas de fusão de albumina
US7041635B2 (en) 2003-01-28 2006-05-09 In2Gen Co., Ltd. Factor VIII polypeptide
ES2333598T5 (es) 2003-05-06 2013-09-04 Biogen Idec Hemophilia Inc Proteinas quimericas del factor de coagulacion fc para tratar la hemofilia.
US7348004B2 (en) * 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US7211559B2 (en) 2003-10-31 2007-05-01 University Of Maryland, Baltimore Factor VIII compositions and methods
KR101468345B1 (ko) 2004-11-12 2014-12-03 바이엘 헬스케어 엘엘씨 Ｆｖｉｉｉ의 부위 지향 변형
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
SG123635A1 (en) 2004-12-28 2006-07-26 Nanoscience Innovation Pte Ltd Nanostructured zinc oxide and a method of producing the same
US7855279B2 (en) 2005-09-27 2010-12-21 Amunix Operating, Inc. Unstructured recombinant polymers and uses thereof
US8048848B2 (en) 2006-02-03 2011-11-01 Prolor Biotech Ltd. Long-acting interferons and derivatives thereof and methods thereof
DK2402754T4 (da) 2006-03-06 2023-08-28 Amunix Operating Inc Ustrukturerede rekombinante polymerer og anvendelser deraf
CA2673459C (en) * 2006-12-22 2016-09-13 Stefan Schulte Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life
JP5351889B2 (ja) 2007-06-21 2013-11-27 テクニシェ ユニバーシタット ミュンヘン インビボおよび／またはインビトロ安定性が増大した生物学的に活性なタンパク質
MX2010001684A (es) 2007-08-15 2010-04-21 Amunix Inc Composiciones y metodos para modificar propiedades de polipeptidos biologicamente activos.
US8239182B2 (en) 2007-12-04 2012-08-07 Spansion Llc Data transmission system-on-chip memory model based validation
CN108530543B (zh) 2009-02-03 2023-06-23 阿穆尼克斯制药公司 延伸重组多肽和包含该延伸重组多肽的组合物
CL2012001463A1 (es) 2009-12-06 2014-02-07 Bioverativ Therapeutics Inc Uso de un polipeptido factor viii de larga duracion para disminuir la incidencia de episodio de sangrado en sujetos humanos y mantener la homeostasis en un sujeto humano que requiere cirugia.
WO2011069164A2 (en) * 2009-12-06 2011-06-09 Biogen Idec Ma Inc. Factor viii-fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
EP3508573A1 (en) * 2010-07-09 2019-07-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Systems for factor viii processing and methods thereof
HRP20191305T1 (hr) 2010-07-09 2019-10-18 Bioverativ Therapeutics Inc. Preradive jednolančane molekule i polipeptidi izrađeni koristeći iste
AU2012282875B2 (en) 2011-07-08 2016-04-21 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor VIII chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
JP2022003096A (ja) 2022-01-11
ES2913994T3 (es) 2022-06-07
TW202042838A (zh) 2020-12-01
CN107261122A (zh) 2017-10-20
CA2841066C (en) 2023-09-26
US10881742B2 (en) 2021-01-05
MX2014000202A (es) 2014-10-06
US20140294821A1 (en) 2014-10-02
IL230333B (en) 2020-05-31
NZ619438A (en) 2016-06-24
CA2841066A1 (en) 2013-01-17
TWI764092B (zh) 2022-05-11
AU2012282875A1 (en) 2013-05-02
JP7636481B2 (ja) 2025-02-26
WO2013009627A3 (en) 2013-03-07
JP2017088623A (ja) 2017-05-25
BR112014000466A2 (pt) 2017-02-21
WO2013009627A2 (en) 2013-01-17
HRP20220639T1 (hr) 2022-07-08
US20210220476A1 (en) 2021-07-22
TWI626947B (zh) 2018-06-21
TWI687226B (zh) 2020-03-11
PT2729161T (pt) 2019-04-01
AU2012282875B2 (en) 2016-04-21
LT3513804T (lt) 2022-05-25
AR087091A1 (es) 2014-02-12
MX350581B (es) 2017-09-11
EP3513804B1 (en) 2022-03-23
HUE043763T2 (hu) 2019-09-30
TW201315480A (zh) 2013-04-16
AU2018202936B2 (en) 2020-07-02
EP2729161A4 (en) 2015-06-24
ES2722209T3 (es) 2019-08-08
KR20180020305A (ko) 2018-02-27
CN103796670A (zh) 2014-05-14
TW201822788A (zh) 2018-07-01
EP2729161B1 (en) 2018-12-19
KR102110736B1 (ko) 2020-05-14
US12186375B2 (en) 2025-01-07
EP2729161A2 (en) 2014-05-14
LT2729161T (lt) 2019-04-10
AU2018202936A1 (en) 2018-05-17
US10010622B2 (en) 2018-07-03
JP2019048877A (ja) 2019-03-28
IL271870B (en) 2022-04-01
HRP20190535T1 (hr) 2019-05-17
JP2023134851A (ja) 2023-09-27
IL271870A (en) 2020-02-27
AU2016204986B2 (en) 2018-05-10
KR20140066157A (ko) 2014-05-30
EP4169525A1 (en) 2023-04-26
CO6940381A2 (es) 2014-05-09
US20250195620A1 (en) 2025-06-19
PL2729161T3 (pl) 2019-08-30
RS63241B1 (sr) 2022-06-30
SI2729161T1 (sl) 2019-05-31
JP7273487B2 (ja) 2023-05-15
US20180360982A1 (en) 2018-12-20
DK2729161T3 (en) 2019-04-08
SI3513804T1 (sl) 2022-07-29
KR101829603B1 (ko) 2018-02-19
EA029045B1 (ru) 2018-02-28
CY1122900T1 (el) 2021-05-05
EA201490039A1 (ru) 2014-06-30
CL2014000024A1 (es) 2014-11-21
AU2016204986A1 (en) 2016-08-04
JP2014522838A (ja) 2014-09-08
PL3513804T3 (pl) 2022-07-11
MY180714A (en) 2020-12-07
PT3513804T (pt) 2022-06-02
DK3513804T3 (da) 2022-06-20
EP3513804A1 (en) 2019-07-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7636481B2 (ja) 第ｖｉｉｉ因子キメラおよびハイブリッドポリペプチドならびにその使用法
JP7700164B2 (ja) 第ｖｉｉｉ因子ポリペプチド製剤
JP6641340B2 (ja) 第ＶＩＩＩ−Ｆｃ因子キメラおよびハイブリッドポリペプチドならびにその使用法
CN103140237A (zh) 因子ix多肽及其使用方法
HK40091851A (en) Factor viii chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
HK40011493B (en) Factor viii chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
HK40011493A (en) Factor viii chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
HK1197805B (en) Factor viii chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
HK1197805A (en) Factor viii chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
HK40087935A (en) Factor viii polypeptide formulations
HK40129141A (en) Methods of treating hemophilia a
HK40032761B (en) Factor viii polypeptide formulations
HK40032761A (en) Factor viii polypeptide formulations
HK1220617B (en) Factor viii polypeptide formulations