RS58599B1 - Postupak za neinvazivno određivanje genetičkih varijacija - Google Patents

Description

GELOVI SA USPORENIM PODRŽANIM OSLOBAĐANJEM

OBLAST TEHNIKE

Pronalazak spada u oblast preparativne hernije.

TEHNIČKI PROBLEM

Ovaj pronalazak se odnosi na formulacije podržanog oslobađanja korišćenjem usporenih gelova alginata i njihove postupke.

STANJE TEHNIKE

Sa napretkom u tehnologijama genetike i inženjeringa ćelije, raspoloživost rekombinantnih proteina prouzrokovala je napredak u primeni proteina kao lekova za terapeutske primene. Mnoge bolesti ili stanja tretirani su sa farmaceutskim proteinima koji zahtevaju podržane nivoe da se postigne najefikasniji terapeutski rezultat. Ali, kod većine farmaceutskih proteina, generalno kratak biološki polu-život zahteva često unošenje. Ove ponovljene injekcije se daju u različitim nivoima što rezultira u flukutuacijama nivoa lečenja sa značajnim fizičkim i finansijskim opterećenjem za pacijente. Kako mnoga stanja odgovaraju bolje na kontrolisane nivoe leka, postoji potreba za kontrolisanim oslobađanjem leka da se obezbede duži periodi skladnog ioslobađanja. Takvi lekovi podržanog oslobađanja mogli bi da obezbede pacijentu ne samo pojačane profilaktičke, terapeutske ili dijagnostičke efekte, već takođe smanjenje u frekvenciji injekcija isto kao u ukupnim troškovima.

Današnji pokušaji da se podrže nivoi leka kod ljudi ili životinja između doza uključili su primenu biorazgradljivih polimera kao matrica za kontrolu oslobađanja leka. Na primer, patent Velike Britanije br. 1,388,580 opisuje primenu hidrogela za podržano oslobađanje insulina. SAD patent br. 4,789,550 opisuje primenu mikrokapsula alginata prevučenih polilsinom za isporuku proteina sa živim ćelijama kapsuliranja. Pokušaji podržanog oslobađanja takođe su koristili preparate anjonskih ili katjonskih polimera okruženih sa jonskim polimerima suprotnog opterećenja za ćelije kapsuliranja sposobne za proizvodnju biološki aktivnih preparata. SAD patent br. 4,744,933. Slično, višestruke prevlake anjonskih ili katjonskih ukrštenih polimera takođe su opisane kao sredstvo za dobijanje kontrolisanog oslobađanja. SAD patenti br. 4,690,682 i 4,789,516. Dalje, sledeći pokušaji opisuju primenu samih alginata, ili alginata prevučenih sa drugim biorazgradljivim polimerima, za kontrolisano oslobađanje polipeptid preparata ili njihovih katojnskih taloga. PCT WO 96/00081, PCT WO 95/29664 i PCT 96/03116.

Ovi pokušaji, međutim, nisu obezbedili dovoljno sredstvo za dobijanje isporuke podržanog oslobađanja željenih farmaceutskih proteina. Generalno je poznato da primena nekih biorazgradljivih polimera, n.p., poliaktid ko-glikolida, pod in vivo uslovima, pokazuje visoke početne prodore oslobađanja leka. Johnson, O. et al., Nature Med., 2/7: 795 (1996). Dalje, generalno je poznato da proteini korišćeni sa tekućim oblicima preparata podržanog oslobađanja mogu da se podvrgnu promeni prirode i gubitku njihove bioaktivnosti posle izlaganja agensima kapsuliranja. Takvi preparati koriste organske rastvarače koji mogu da imaju škodljive efekte na izabrani protein. Finalno, kako je diskutovano niže, primena samog alginata nije obezbedila željeno kontrolisano oslobađanje proteina potrebno za efikasne terapeutske rezultate.

Generalno, alginati su dobro poznati, javljaju se prirodno, anjonski, gde se polisaharidi sastoje od l,4-vezan-/3-D-manuronske kiseline i a-L-guluronske kiseline. Smidsrod, O. et al., Trends in Biotechnologv, 8: 71-78 (1990); Aslani, P. et al., J. Microencapsulation, 13/5: 601-614 (1996). Alginati tipično variraju od 70% manuronske kiseline i 30% guluronske kiseline, do 30% manuronske kiseline i 70% guluronske kiseline. Smidsrod, supra. Alginska kiselina je nerastvorljiva u vodi dok su soli formirane sa monovalentnim jonima sličnim natrijumu, kalijumu i amonijumu rastvorljive u vodi. McDovvel, R. H., "Properties of Alginates" (London, Alginate Industries Ltd., 4th edition 1977). Poznato je da polivalentni katjoni reaguju sa alginatima radi dpontanog formiranja gelova.

Alginati imaju veliko mnoštvo primena takvih kao aditivi hrane, adhezivi, farmaceutske tablete, uzorci za novi razvoj ćelije, i obloge za povijanje. Alginati su takođe preporučeni za tehnike izdvajanja proteina. Na primer, Gray, C. J. et al., in Biotechnologv and Bioemgineering, 31: 607-612 (1988) uhvatili su insulin u gelovima cink/kalcijum alginata za izdvajanje insulina od drugih serum proteina.

Matrice alginata takođe su dobro argumentovane za sistem isporuke leka, videti na primer SAD patent br. 4,695,463 koji opisuje alginat baziran na sistemu oslobađanja gume za žvakanje i farmaceutske preparate. Zrna alginata su korišćena za kontrolisano oslobađanje raznih proteina takvih kao: receptor faktora nekroze rumora u katjon-alginat zrnima prevučenim sa polikatjonima, Wee, S. F, Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 21: 730-31

(1994); faktor transformacije razvoja kapsuliran u zrnima alginata, Puolakkainen, P. A. et al., Gastroenterology, 107: 1319-1326 (1994); angiogenski faktori uhvaćeni zrnima kalcijum-alginata, Downs, E. C. et al., J. of Cellular Physiology, 152: 422-429 (1992); albumin uhvaćen u citosan-alginat mikrokapsulama, Polk, A. et al., J. Pharmaceutical Sciences, 83/2: 178-185 (1994), ili zrna citosan-kalcijum alginata prevučena sa polimerima, Okhamafe, A. O. et al., J. Microencapsulation, 13/5: 497-508 (1996): hemoglobulin kapsuliran sa zrnima citosan-kalcijum alginata, Hueguet, M.L. et. al., J. Applied Polymer Science, 51: 1427-1432 (1994), Huguet, M. L. et al., Process Biochemistry, 31: 745-751 (1996); i interleukin-2 kapsuliran u mikrosferama alginat-citosana, Liu, L. S. et al., Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater, 22: 542-543 (1995).

Sistemi koji koriste zrna alginat gela, ili zrna alginat/kalcijum gela, za hvatanje proteina imaju nedostatak efektra bilo kog podržanog oslobađanja zbog brzog oslobađanja prteina iz zrna alginata. Liu, L. et al., J. Control. Rel., 43: 65-74 (1997). Da bi se izbeglo tako brzo oslobađanje, više gornjih sistema pokušava da koristi prevlake polikatjon polimera (n.p., polilsin, citosan) da se uspori oslobađanje zrna protein alginata. Videti, n.p., Wheatley, M. A. et al., J. Applied Polymer Science, 43: 2123-2135 (1991); Wee, S. F. et al. supra; Liu, L. S. et al. supra; Wee, S. F. et al., Controlled Release Society, 22: 566-567 (1995) i Lim, et al., supra.

Polikatjoni, takvi kao polilsin, su pozitivno opterećeni polielektroliti koji međusobno reaguju sa negativno opterećenim molekulima alginata radi formiranja polielektrolit kompleksa koji deluju kao difuziona pregrada na površini zrna. Problemi se mogu javiti sa primenom polikatjona tako da: (1) takve formulacije mogu da budu citotoksične zbog polikatjona (Hueguet. M. L. et al., supra; Zimmermann, Ulrich, Elektrophosphoresis, 13: 269 (1992); Bergmann, P. et al., Clinical Science, 67: 35 (1984)); (2) polikatjoni su naklonjeni oksidaciji; (3) zrna sa polikatjon prevlakama teže da ne budu erozivna i ugrađena u telo; (4) takve formulacije su napravljene preko radnih postupaka prevlačenja koje uključuju više prevlaka polikatjon polilsina (Pado), et al., Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater, 2: 216

(1986) i (5) jonske interakcije između proteina i polikatjona može da rezultira u gubitku aktivnosti proteina ili da uzrokuje nestabilnost proteina.

Dodatno gornjim sistemima, takođe postoje sistemi za oslobađanje koji prelaze u gel posle injekcije, koji su ili organsko bazirani i/ili tiksotropno bazirani. Skladišta gela koja posle injekcije prelaze u gel u telu mogu da podrže oslobađanje uhvaćenih lekova. Ova bi mogla da uključe temperaturu izazvanu želatiniranjem polaksomera, (n.p., Pluronics, SAD patent br. 2,741,573). To su tečnosti na niskim temperaturama ali gel na povišenim temperaturama takvim kao telesne temperature. Ove sisteme je teško kontrolisati zbog varijacija stanja ambijentne temperature, i varijacija u anatomskim temperaturama posebno ako se koriste potkožne injekcije.

Kao za organsko bazirane sisteme želatiniranja, takvi sistemi nisu podesni za lomljive lekove proteina koji se destabilišu u prisustvu organskih rastvarača ili u ne-fiziološkim uslovima. Tiksotropni gelovi aluminum stearata u uljima takođe su korišćeni za produženje aktivnosti penicilina. Buckwalter, et. al, J. Am. Pharm Assoc, 137: 472 (1948); Thompson, R. E., American Journal Clinical Nutrition, 7: 311 (1959); Thompson, Robert E., Sustainded Release of Parenteral Drugs, Bulletin of Parenteral Drug Assoc, 14: 6-17,

(1960); Chen, Y., Journal of Parenteral Scisnce & Tech., 35: 106 (1981). Proteini teže da budu destabilizovani u prisustvu sistema koji sadrže ovaj tip ulja.

Sistemi isporuke za podržano oslobađanje leka koji uključuju kontrolisano vremensko kašnjenje za želatiniranje u telu generalno nisu poznati u tehnici. Ovi tipovi sistema usporenog prevođenja u gel su, međutim, poznati u kontekstu nasade kulture tkiva, imobilizacije ćelija, formiranja mikrosfere, oslobađanja insekticida i industrije hrane. Na primer, alginati su korišćeni sa kompleksima nerastvorljivog kalcijuma a <5-glukonolakton kao proton donor za oslobađanje jona kalcijuma u rastvoru za želatiniranje. Videti Draget, et al, Appl Microbiol. Biotechnol, 31:79-83 (1989). Nadalje, slični sistemi su korišćeni za formiranje zrna alginata sa emulgiranje/internim želatiniranjem. Mikrosfere alginata su dobijene korišćenjem alginata rasejanih unutar biljnog ulja i želatiniranjem koje započinje sa redukcijom radi oslobađanja kalcijuma od nerastvorljivog kompleksa. Videti Poncelet, D. et al. Appl. Microbiol. Biotechnol., 43: 664-650 (1995). Alginat sistemi su takođe korišćeni da se učine nepokretnim ćelije. Burke, C. opisuje, u Methods of Enzymology, 135: 175-189 (1987), da se dikalcijum fosfat i 5-glukonolakton mogu koristiti sa alginatima za usporeno želatiniranje ćelija. SAD patent br. 4,053,627 opisuje primenu gel diskova za kontrolu oslobađanja insekticida u vodenom ambijentu. Ove napred pomenute primene nisu namenjene za skladišta gelova u telu za podržano oslobađanje biološki aktivnih agenasa, posebno proteina.

Sledstveno, potreba postoji za razvoj usporenih farmaceutskih gela formulacija koje postižu bolje sredstvo podržanog oslobađanja za kliničke primene. Brojni rekombinantni ili prirodni proteini mogli bi da se koriste od konstantnog dugog uslova oslobađanja do usporenih formulacija gela čime se obezbeđuju efikasniji klinički rezultati.

Ovaj pronalazak obezbeđuje takve prednosti. Usporeni farmaceutski gel preparati iz ovog pronalaska su sposobni da obezbede zaštitu proteina, smanjeno razlaganje i da uspore rastvaranje sa povećanom stabilnošću i jačinom proteina. Takođe, farmaceutski preparati iz ovog pronalaska obezbeđuju jednostavno, brzo i jevtino sredstvo kontrolisanog oslobađanja rekombinantnog proteina za efikasne profilaktičke, terapeutske ili dijagnostičke rezultate.

OPIS REŠENJA TEHNIČKOG PROBLEMA

Ovaj pronalazak se odnosi na formulacije podržanog oslobađanja koje koriste alginat usporene gelove, i na njihove postupke. Posebno, formiranje gelova usporenog podržanog oslobađanja uključuje tiksotropne alginat gelove sa biološki aktivnim agensom. Ovaj postupak obezbeđuje prednost proizvodnje efikasnog i visoko opterećujućeg biološki aktivnog agensa unutar alginat usporenog gela za isporuku podržanog oslobađanja dok se postiže zaštita proteina, smanjeno razlaganje, povećana stabilnost i jačina agensa koji treba da se isporuči. Dalje, vremensko želatiniranje obezbećuje veću kontrolu osobina želatiniranja i njegovog unošenja.

Sledstveno, jedan aspekt ovog pronalaska obezbeđuje preparat gela usporenog podržanog oslobađanja, koji sadrži hidrofilni preparat; biološki aktivni agens i bar jedan vezan polivalentni metalni jon. Brzina želatiniranja je kontrolisana sa nivoom slobodnog kalcijuma, n.p., nevezani polivalentni metalni jon. Biološki aktivni agens može da bude u kompleksnom obliku. Formiranje kompleksnih molekula i bilo kojih odnosnih kompleksnih agenasa isto su tako poznati stručnjacima. Dodatno, gornji preparat može dalje da sadrži polivalentni metalni jon koji je smeša vezanih i nevezanih polivalentnih metalnih jona. Zbog prirode kontrolisanog vremena ovih usporenih gelova, ove smeše mogu se postaviti u telo gde one mogu da pređu u gel posle injekcije. Dodatno, zbog toksotropne prirode preparata u gel stanju, ove smeše se mogu ubrizgati dok su u stanju gela, n.p., sa pritiskom iz štrcaljke, gde one mogu da se opet prevedu u gel u telu.

Drugi aspekt ovog pronalaska obezbeđuje preparat gela usporenog podržanog oslobađanja, koji sadrži hidrofilni polimer; biološki aktivni agens; bar jedan vezan polivalentni metalni jon i dalje sadrži bar jedan proton donor sposoban da oslobodi vezan polivalentni metalni jon. Oslobađanje protona iz proton donora oslobađa katjon iz vezanog polivalentnog metalnog jona.

Drugi aspekt obezbeđuje postupke za dobijanje preparata gela usporenog podržanog oslobađanja iz ovog pronalaska. Jedan postupak obuhvata faze mešanja biološki aktivnog agensa i hidrofilnog polimera sa rastvaračem radi formiranja prve smeše i mešanje prve smeše sa bar jednim vezanim polivalentnim metalnim jonom radi formiranja druge smeše. Alternativni postupak obuhvata faze mešanja biološki aktivnog agensa i hidrofilnog polimera sa rastvaračem radi formiranja prve smeše; mešanje prve smeše sa bar jednim vezanim polivalentnim metalnim jonom radi formiranja druge smeše; i mešanje sa drugom smešom na bar jednom proton donoru sposobnom da oslobodi vezani polivalentni metalni jon. Vezani polivalentni metalni jon i proton domor mogu takođe da budu dodani u prvu smešu zajedno, ili proton donor donor može da bude dodan u prvu smešu pre vezanog polivalentnog metalnog jona. Dodatno, faza za izolovanje preparata gela usporenog podržanog oslobađanja takođe je razmatrana.

Kako je ovde korišćeno termin vezani polivalentni metalni jon odnosi se na polivalentni metalni jon u soli ili šelat obliku ili jon kompleksu. Vezani polivalentni metalni jon može da uključi smešu vezanog i nevezanog polivalentnog metalnog jona. Ovo može da uključi kako je gore primećeno oslobađanje vezanog prema nevezanom polivalentnom metalnom jonu. Kako je ovde korišćeno proton donor sposoban za oslobađanje vezanog polivalentnog metalnog jona odnosi se na jake kiseline, slabe kiseline, ili mataerijale sposobne za generisanje kiseline, n.p., laktone ili estre (sa vodenom hidrolizom), ili slabo rastvorljive kiseline ili sporo rastvorljive kiseline takve kao adipinska kiselina.

Kako je korišćeno ovde, termin rastvarač odnosi se na vodene ili nevodene bazne rastvarače sposobne za raspršivanje ili rastvaranje biološki aktivnih agenasa, hidrofilnih polimera, polivalentnih metalnih jona, proton donora ili izabranih kompleksnih agenasa. Takvi rastvarači su dobro poznati stručnjacima. Dodaci formiranju prve smeše i druge smeše mogu se uraditi sa postupcima dobro poznatim stručnjacima, uključujući ali bez ograničavanja na sipanje i trešenje, dodavanje ukapavanjem, raspršivanje, praćenje ili mešanje korišćenjem mlaza praha ili mlaza vazduha, atomiziranje, i električna polja. Termin raspršivanje za potrebe ovog pronalaska može da označi tečna, čvrsta ili gasovita raspršivanja. Kako je ovde korišćeno, termin izolovanje odnosi se na postupak za izolovanje preparata gela usporenog podržanog oslobađanja iz ovog pronalaska. Takvi postupci izolovanja i prečišćavanja dobro su poznati u tehnici.

U još drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje preparat gela usporenog podržanog oslobađanja dobijen sa gornjim postupcima. Sledeći aspekti uključuju usporene gel farmaceustke formulacije gornjih preparata u farmaceutski prihvatljivom nosaču ili pomoćnom sredstvu. Dodatno, preparat gela usporenog podržanog oslobađanja može da bude smešten u štrcaljku.

U još drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje postupke za tretiranje indikacija sa preparatima gela usporenog podržanog oslobađanja koji sadrže željene biloški aktivne agense.

Preparati

Hidrofilni derivati uključujući alginate i njihove derivate, mogu se dobiti od raznih komercijalnih, prirodnih ili sintetičkih izvora dobro poznatih u tehnici. Kako je ovde korišćeno, termin hidrofilni polimer odnosi se na u vodi rastvorljive polimere koji imaju afinitet za absorbovanje vode. Hidrofilni polimeri su dobro poznati stručnjacima. Ovi uključuju, ali nisu na njih ograničeni, polianjone, uključujući anjonske polisaharide takve kao alginat, gelan, karboksimetil amilozu, soli poliakrilne kiseline, soli polimetakrilne kiseline, etilen maleinski anhidrid kopolimer (polovina estra), karboksimetil celulozu, dekstran sulfat, heparin, karboksimetil dekstran, karboksi celulozu, 2,3-dikarboksicelulozu, trikarboksicelulozu, karboksi arabisku gumu, karboksi karaginan, karboksi pektin, karboksi targakant gumu, karboksi ksantan gumu, pentosan polisulfat, karboksi škrob, karboskimetil hitin/hitosan, kurdlan, inositol heksasulfat,j3-ciklodekstrin sulfat, hialuronsku kielinu, hondroitin-6-sulfat, dermatan sulfat, heparin sulfat, karboksimetil škrob, karaginan, poligalakturonat, karboksi guar gumu, polifosfat, polialdehido-karbonsku kiselinu, poli-l-hidroksi-l-sulfonat-propen-2, kopolistiren maleinsku kiselinu, agarosu, mezoglikan, sulfopropilne polivinil alkohole, celulozu sulfat, protamin sulfat, fosfo guar gumu, poliglutaminsku kiselinu, poliasparaginsku kiselinu, poliamino kiseline, njihove derivate ili kombinacije. Stručnjak će primetiti da su drugi hidrofilni polimeri unutar obima ovog pronalaska.

Slično, vezani polivalentni metalni joni mogu da budu dobijeni od raznih komercijalnih, prirodnih ili sintetičkih izvora koji su dobro poznati u tehnici. Vezani ili izdvojeni polivaletni metalni joni unutar predmeta ovog pronalaska uključuju, ali nisu na njih ograničeni, stroncijum, gvožđe, magnezijum, kalcijum, barijum, bakar, aluminijum ili cink. Metalni joni mogu se dobiti od rastvorljivih soli kompleksnog agensa, acetata, fosfata, laktata, tartrata, citrata, sulfata, hlorida, karbonata, hidroksida, ili anjona masne kiseline, takvih kao oleati. Stručnjak će primetiti da su razni drugi vezani polivalentni metalni/joni kompleksi unutar predmeta iz pronalaska. Vezani polivalentni metalni joni mogu da uključe smešu vezanih i nevezanih polivalentnih metalnih jona.

Proton donori kako je ovde uključeno, odnose se na materijal koji može da generiše kiseline. Proton donori su sposobni da oslobode vezani ili izdvojen polivalentni metalni jon. Proton donori su dobro poznati u tehnici, i uključuju ali nisu ograničeni na laktone takve kao glukbnolaktone, estre, pufere i druge sporo rastvorljive kiseline. Kako je ovde korišćeno sporo rastvorljive kiseline odnose se na kiseline takve kao čvrste kiseline koje su male rastvorljivosti u rastvaraču. Dodatno, sporo rastvorljive kiseline elemente ili prevučene materijale koji sporo oslobađaju kiseline. Dobro poznate kiseline unutar predmeta tehnike uključuju sirćetnu, adipinsku, limunsku, fumarinsku, glukonsku, mlečnu, malinsku, forfornu i vinsku kiselinu. Stručnjak će primetiti da su drugi razni proton donori unutar predmeta ovog pronalaska.

Kako je ovde korišćeno, termin pufer ili pufer rastvor odnosi se na primenu neorganskih ili organskih kiselina ili baza ili njihovih kombinacija da se dobije pufer rastvor kako je poznato u tehnici. Ovi takođe uključuju amfoterne materijale ili amino kiseline. Neorganske kiseline unutar predmeta ovog pronalaska uključuju vodonik halid (n.p., hlorovodonična kiselina), fosfornu, azotnu ili sumpornu kiselinu. Druge neorganske kiseline mogle bi da budu dobro poznate stručnjaku i tako se ovde smatra. Organske kiseline unutar predmeta pronalaska uključuju alifatične karboksilne kiseline i aromatične kiseline takve kao mravlja, ugljenična, akrilna, malonska, sukcinska, glutarinska, adipinska, maleinska, fumarinska, glicinska ili fenol sulfonska kiselina. Druge organske kiseline mogle bi da budu dobro poznate stručnjaku. Organske baze uključuju TRIS<R>, piridin, PIPES<R>, i HEPES<R>.

Puferi amino kiseline uključuju glicin i smeše glicin/fosforne kiseline.

Kako je ovde korišćeno, biološki aktivni agensi odnose se na rekombinantne ili proteine koji se prirodno nalaze, ljudske ili životinjske, korisne za profilaktičku, terapeutsku ili dijagnostičku primenu, isto kao ne-protein bazne agense, takve kao mali molekuli, oligonukleotidi, i neorganski ili organski agensi. Biološki aktivni agens može da bude prirodan, sintetički, polusintetički ili njihovi derivati. Dodatno, biološki aktivni agensi iz ovog pronalaska mogu se taložiti. Razmatran je širok opseg biološki aktivnih agenasa. Ovi uključuju, ali nisu na njih ograničeni, hormone, citokine, hematopoietske faktore, faktore rasta, faktore protiv gojaznosti, prehrambene faktore, anti-zapaljive faktore, i enzime (videti tako}e SAD patent br. 4,695,463 za dodatne primere korisnih biološki aktivnih agenasa). Stručnjak će lako moći da adaptira željeni biološki aktivni agens preparatima iz ovog pronalaska.

Takvi proteini mogli bi da uključe ali nisu ograničeni na interferone (videti SAD patente br. 5,372,808, 5,541,293, 4,897,471, i 4,695,623 koji su ovde uključeni kao referenca uključujući crteže), interleukine (videti SAD patent br. 5,075, koji je uključen ovde kao referenca uključujući crteže), eritropoproteine (videti SAD patente br. 4,703,008, 5,441,868, 5,618,698, 5.547, 933, i 5,621,080 koji su ovde uključeni kao referenca uključujući crteže), faktore stimulisanja kolonije granulocita (videti SAD patente br. 4,810,643, 4,999,291, 5,581,476, 5,582,823 i PCT publikacija br. 91/17185 koji su ovde uključeni kao referenca uključujući crteže) faktor oslobađanja ćelije (PCT publikacije br. 91/05795, 92/17505 i 95/17206, koji su ovde uključeni kao referenca uključujući crteže), i OB protein (videti PCT PCT publikacije br. 96/40912, 96/05309, 97/00128, 97/01010 i 97/06816 koje su ovde uključene kao referenca uključujući slike). Dodatno, biološki aktivni agensi mogu takođe da uključe, ali nisu na njih ograničeni, proizvode koji su protiv gojaznosti, insulin, gastrin, prolaktin, adrenokortikotropni hormon (ACTH), tiroidni stimulišući hormon (TSH), hormon luteiniziranja (LH), hormon stimulisanja komušine (FSH), ljudski hlorionski gonadotropin (HCG), motilin, interferone (alfa, beta, gama), interleukine (IL-1 do IL-12), faktor nekroze tumora (TNF), protein vezivanja faktora nekroze tumora (TNF-bp), neutrofni faktor koji potiče iz mozga (BDNF), glialni izvedeni neutrofni faktor (GDNF), neurotrofni faktor 3 (NT3), faktore rasta snopa vlakana (FGF), faktor neutrofnog rasta (NGF), faktore rasta kosti takve kao osteoprotegerin (OPG), faktore rasta slične insulinu (IGFs), faktor stimulisanja kolonije makrofaga (M-CSF), faktor stimulisanja granulocita kolonije makrofaga (GM-CSF), faktor rasta izveden iz megakariocita

(MGDF), faktor rasta keratinocita (KGF), trombopoietin, faktor rasta izveden iz čestica krvi (PGDF), faktore rasta simuliranja kolonije (CSFs), morfogenetski faktor kosti (BMP), superoksid dismutazu SOD), aktivator plasminogen tkiva (TPA), urokinazu, streptokinazu i kalikrein. Termin proteini, kako je ovde korišćeno uključuju peptide, polipetide, saglasne molekule, njihove analoge, derivate ili kombinacije.

Derivati biološki aktivnih agenasa mogu da uključe vezivanje jednog ili više hemijskih delova na protein deo. Nađeno je da hemijska modifikacija biološki aktivnih agenasa obezbeđuje dodatne prednosti pod izvesnim okolnostima, takvim kao povećanje stabilnosti i vremena cirkulacije terapeutskog proteina i smanjenje imunosti. Stručnjak će moći da odabere željenu hemijsku modifikaciju baziranu na željenom doziranju, vremenu cirkulacije, otpornosti na proteolizu, terapeutskim primenama i drugim razmatranjima. Derivati takvi kao polietilen glikol i Fc fuzioni proteini su poželjni.

Kompleksi

Biološki aktivni agens može da bude u kompleksnoj formi. Ovo bi moglo da uključi staložene oblike, strukturne oblike, i udruživanje sa drugim molekulima. Ovi kompleksni oblici agensa mogu da smanje brzinu difuzije agensa izvan gela i tako da podrže oslobađanje agensa. Ovi kompleksni oblici uključuju, ali nisu na njih ograničeni, biološki aktivni agens kompleksiran sa antitelima, supstrate, receptore. lipide, polimere, i taloge.

Na primer biološki aktivni agensi, analog ili derivati mogu se unositi kompleksni na preparatu vezivanja. Takav preparat vezivanja dodatno prednostima gore mogu takođe da imaju uticaj produženja vremena cirkulacije agensa, analoga ili derivata ili pojačanje aktivnosti biološki aktivnog agensa. Takvi preparati mogu da budu protein (ili srodno, peptid), derivat, analog ili kobinacija ili agens neptotein.

Pomoću ilustracije, protein vezivanja za OB protein je OB protein receptor ili njegov deo. Drugi proteini vezivanja mogu da budu utvrđeni sa ispitivanjem OB proteina, ili izabranog proteina, u serumu, ili da budu empirijski ekranizovani radi prisustva vezivanja. Takvo vezivanje tipično neće da utiče na sposobnost OB proteina ili analoga ili derivata radi vezivanja endogenog OB protein receptora i/ili efekat signala transdukcije. Dodatno OB proteinu, kompleksi vezivanja će takođe biti primenljivi na druge terapeutske proteine iz ovog pronalaska. Stručnjaci će moći da utvrde podesne proteine vezivanja za primenu sa ovim pronalaskom.

Takođe, agensi taloženja korišćeni za taloženje biološki aktivnog jedinjenja mogu da se dobiju od raznih komercijalnih , prirodnih ili sintetičkih izvora koji su dobro poznati u tehnici. Taloženje agenasa uključuje, ali nije ograničeno na, polivalentne metalne jone takve kao acetati, citrati, hloridi, karbonati, hidroksidi, oksalati, tartrati, ili njihovi hidroksidi, kiseline ili u vodi rastvorljive polimere.Posebno, metalni joni mogu da uključe, ali nisu ograničeni na, aluminijum, barijum, kalcijum, gvožđe, manganeze magnezijum, stroncium i cink. Poželjno metalni jon je cink ili njegove soli, slične solima acetat hlorida. U vodi rastvorljivi mali molekuli i soli mogu da takođe da budu korišćeni takvi kao amonijum sulfat, aceton, etanol i glicerol.

Kao za polimere rastvorljive u vodi ovi uključuju, ali nisu ograničeni na polietilen glikol, etilen glikol/prpilen glikol kopolimere, hidroksietilcelulozu, amilozu, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-1, 3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, kopolimere etilen/maleinskog anhidrida, poliaminokiseline, dekstran, poli (n-vinil pirolidon), polietien glikola, propilen glikol homopolimere, polipropilen oksid/etilen oksid kopolimere, polioksietilovane poliole, polivinil alkohol sukcinata, glicerin, etilen okside, propilen okside, poloksamere, alkoksilatne kopolimere, u vodi rastvorljive polianjone, derivate ili njihgove kombinacije, u vodi rastvorljive polianjone, derivata ili kobinacije. U vodi rastvorljiv polimer može da bude bilo koje molekulske težine, i može da se grana ili da se ne grana. Na primer, poželjna molekulska težina polietilen glikola je između oko 700 i oko 100 kDa za pogodnost u rukovanju i efikasnosti taloženja.

Druge veličine i tipovi agenasa za taloženje mogu se koristiti zavisno od željenog terapeutskog profila (n.p., trajanje željenog podržanog oslobađanja, efekti, ako su na bilo kojoj biološkoj aktivnosti, pogodnost rukovanja, stepen ili neostatak antigena i drugi poznati efekti željenog agensa taloženja prema terapeutskom proteinu ili analogu). Stručnjak će primetiti da su drugi agensi taloženja unutar predmeta pronalaska.

Dodatno, preparati iz ovog pronalaska mogu, takođe da uključe ekstra ekscipijente potrebne da se stabilizuje biološki aktivni agens i/ili hidrofilni polimer. Ovi mogu da budu sadržani u puferu i mogu da uključe ali nisu ograničeni na prezervative.

Farmaceutski preparati

Farmaceutski preparati podržanog oslobađanja iz ovog pronalaska mogu da se unose sa oralnim (n.p., tečni preparati koji omogućavaju želatiniranje u želucu ili crevima) i neoralnim dobijanjima (n.p., intramuskularno, potkožno, transdermalno, preko utrobe, IV (intravenski), IP (intraperitonealno), intraartikularno, postavljanjem u oko, ICV (intracerebralventrikularno), IP (intraperitonealno), intraarterijski, intratekalno, intrakapsularno, intraorbiralno, sa ubrizgavanjem, plućno, nosno, reaktalno, i uterin-transmukosalno dobijanje). Generalno, u pronalasku su sadržani usporeni farmaceutski gel preparati sa podržanim oslobađanjem koji sadrže efikasne količine proteina, ili proizvoda derivata, sa preparatima podržanog oslobađanja iz pronalaska zajedno sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačima, prezervativima, rastvaračima, emulgatorima, pomoćnim sredstvima i/ili nosačima potrebnim za unošenje. (Videti PCT 97/01331 koja je ovde uključena kao referenca). Optimalna farmaceutska formulacija za željeni biološki aktivni agens će biti određen od stručnjaka zavisno od puta unošenja i željenog doziranja. Primeri farmaceutskih preparata su opisani u Remington's Pharmaceutical Science (mask Publishing Co., 18thEd., Easton, PA, strane 1435-1712 (1990)).

Zbog tiksotropne prirode usporene formulacije gela, štrcaljke se mogu koristiti za potkožno unošenje. Preparat se može prevesti u gel u štrcaljki za kasniju injkeciju. Ovo želatiniranje može da- se vrši na način vremenskog usporenja. Vreme je kontrolisano sa razumnim podešavanjem količine agensa prevođenja u gel, i proton donora ako se koristi, isto kao veličine čestica polivalentnon metalnog jona i temperature smeše. Takvo dobijanje bi moglo da se koristi za kasnije ponovno želatiniranje u telu posle injekcije. Termin tiksotropni kako je ovde korišćeno odnosi se na viskoznost smeše gela koja se smanjuje pod pritiskom, n.p., od klipa štrcaljke, na kojoj tački smeša može da teče, n.p., preko igle štrcaljke, i zatim se ponovo oblikuje u gel na mestu injkecije.

Koncept usporenog želatiniranja može takođe da se primeni u punjenju štrcaljke gde je preparat gela podržanog oslobađanja napunjen u štrcaljku i u podešeno vreme gelovi u štrcaljku, n.p., od nekoliko minuta do više sati posle punjenja. Ovo izbegava problem punjenja, štrcaljke sa sa materijalom koji je već preveden u gel. Ove prethodno napunjene štrcaljke mogu se skladištiti za kasnije injekcije u pacijenta.

Komponente koje mogu da budu potrebne za unošenje uključuju razblaživače ili pufere raznih pH i jonske jačine (n.p., Tris-HCl, acetat); aditivi takvi kao surfaktanti i agensi rastvaranja (n.p., Tween 80, HCO-60, Polvsorbat 80), lipide, liposome, antioksidante (n.p., askorbinska kiselina, glutation, natrijum metabisulfit), dodatne polisaharide (n.p., karboksimetilceluloza, natrijum alginat, natrijum hialuronat, protamin sulfat, polietilen glikol_, prezervative (n.p., Thimersol, benzil alkohol, metil paraben, propil paraben) i supstance građenja (n.p., laktoza, manitol); uključivanje materijala sa posebnim dobijanjima polimernih jedinjenja takvih kao polimeri ili kopolimeri polimlečne/poliglikolne kiseline, itd. ili kombinovani sa liposomima. Hilauronska kiselina može takođe da se koristi kao komponenta unošenja i ovo može da ima efekat pomaganja čak sledećeg podržanog trajanja u cirkulaciji. Dodatno, preparati podržanog oslobađanja iz ovog pronalaska mogu se takođe raspršiti sa uljima (n.p., ulje sezama, ulje žita, biljno), ili njenom smešom sa fosfolipidom (n.p., lecitin), ili trigliceridi masne kiseline srednjeg lanca (n.p., Miglvol 812) za obezbeđenje uljne suspenzije. Preparati iz ovog pronalaska mogu se takođe raspršiti sa agensima raspršivanja takvim kao polisaharidi rastvorljivi u vodi (n.p., manitol. laktoza, glukoza, škrobovi), hialuronska kiselina, glicin, fibrin, kolagen i neorganske soli (n.p., natrijum hlorid).

Dodatno, takođe razmatrani za primenu u unošenju preparata podržanog oslobađanja iz ovog pronalaska su mehanički uređaji namenjeni za plućnu isporuku terapeutskih proizvoda, uključujući ali bez ograničenja nebulizere, inhalatore izmerene doze, i inhalatore praha, od kojih su svi poznati stručnjacima.

Komponente za unošenje mogu da utiču na fizičko stanje, stabilnost, brzinu in vivo oslobađanja, i brzinu in vivo čišćenja iz ovog proteina i derivata. Stručnjak će oceniti podesne komponente za unošenje i/ili podesne mehaničke uređaje za primenu zavisno od terapeutske primene, puta unošenja, željenog doziranja, vremena cirkulacije, otpornosti na proteolizu, stabilnosti proteina i drugih razmatranja.

Postupci primene

Terapeutika

Terapeutske primene zavise od korišćenog biološki aktivnog agensa. Stručnjak će lako moći da adaptira željeni biološki aktivni agens u ovom pronalasku za njegove namenjene terapeutske primene. Terapeutske primene za takve agense su date sa više detalja u sledećim publikacijama koje su ovde uključene kao referenca uključujući crteže. Terapeutske primene uključuju, ali nisu ograničene na, primene priteina slične interferonima (videti, SAD patente br. 5,372,808, 5,541,293, 4,897,471, i 4,695,623 koje su ovde uključene kao referenca uključujući crteže), interleukine (videti, SAD patent br. 5,075,222, koja je ovde uključena kao referenca uključujući crteže), eritropoietine (videti, SAD patente br. 4,703,008, 5,541,293, 5,441,868, 5,618,698, 5,547,933, i 5,621,080 koje su ovde uključene kao referenca uključujući crteže), faktore stimulisanja kolonije granulocita (videti, SAD patente br. 4,999,291, 5,581,476, 5,582,823, 4,810,643, i PCT publikacija br. 94/17185, koje su ovde uključene kao referenca uključujući crteže), faktor osnove ćelije (PCT publikacije br. 91/05795, 92/17505 i 95/17206, koje su ovde uključene kao referenca uključujući crteže), i OB protein (PCT publikacije br. 96/40912, 96/05309, 97/00128, 97/01010 i 97/06816, koje su ovde uključene kao referenca uključujući slike).

Dodatno, terapeutske primene iz ovog pronalaska uključuju primene biološki aktivnih agenasa uključujući, ali bez ograničenja na, proizvode koji su protiv gojaznosti, insulin, gastrin, prolaktin, adrenokortikotropni hormon (ACTH), tiroidni stimulišući hormon (TSH), hormon luteiniziranja (LH), hormon stimulisanja komušine (FSH), ljudski hlorionski gonadotropin (HCG), motilin, interferone (alfa, beta, gama), interleukine (IL-1 do IL-12), faktor nekroze tumora (TNF), protein vezivanja faktora nekroze tumora (TNF-bp), neutrofni faktor koji potiče iz mozga (BDNF), glialni izvedeni neutrofni faktor (GDNF), neurotrofni faktor 3 (NT3), faktore rasta snopa vlakana (FGF), faktor neutrofnog rasta (NGF), faktore rasta kosti takve kao osteoprotegerin (OPG), faktore rasta slične insulinu (IGFs), faktor stimulisanja kolonije makrofaga (M-CSF), faktor stimulisanja granulocita kolonije makrofaga (GM-CSF), faktor rasta izveden iz megakariocita (MGDF), faktor rasta keratinocita (KGF), trombopoietin, faktor rasta izveden iz čestica krvi (PGDF), faktore rasta simuliranja kolonije (CSFs), morfogenetski faktor kosti (BMP), superoksid dismutazu SOD), aktivator plasminogen tkiva (TPA), urokinazu, streptokinazu i kalikrein. Termin proteini, kako je ovde korišćeno uključuju peptide, polipetide, saglasne molekule, njihove analoge, derivate ili kombinacije. Dodatno, ovi preparati mogu se tsakođe koristiti za proizvodnju jednog ili više lekova za tretman ili poboljšanje stanja biološki aktivnog agensa namenjenog za tretiranje.

Terapije kombinacije

Ovi preparati i postupci mogu se koristiti u vezi sa drugim terapijama, takvim kao izmenjena dijeta i vežbanje. Drugi lekovi su, takvi kao oni korisni za tretman dijadetesa (n.p., insulin, i moguće amilin), lekovi za snižavanje holesterola i krvnog pritiska (takvi kao oni koji redukuju nivoe lipida krvi ili drugi kardiovaskularni lekovi), lekovi za povećanje aktivnosti (n.p., ametamini), diuretici (za eliminisanje tečnosti), i potiskivači apetita. Takvo unošenje može da bude istovremeno ili može da bude in seriatim. Dodatno, ovi postupci mogu se koristiti u vezi sa hirurškim postupcima, takvim kao kozmetička hirurgija koja je namenjena da se promeni ukupni izgled tela (n.p., liposukcija ili laserska hirurgija namenjena da se redukuje masa tela, ili hirurgija usađivanja namenjena da se poveća izgled mase tela. Zdravstevi dobici hirurgije srca, takvi kao hirurgija bajpasa ili druge hirurgije namenjene su da se olakša štetno stanje uzrokovano sa blokadom krvni sudova sa masnim naslagama, takvim kao arterijska ploča, mogu se povećati sa pratećom primenom ovih preparata i postupaka. Postupci za eliminisanje kamena u žuči, takvi kao ultrasonični ili laserski postupci, mogu se takođe koristiti ili pre, za vreme ili posle toka ovih terapeutskih postupaka. Dalje, ovi postupci mogu se takođe koristiti kao dodatak operacijama i terapijama za slomljene kosti, oštećene mišiće, ili druge terapije koje bi mogle da budu poboljšane u povećanju mase mišićnog tkiva.

Doziranja

Stručnjak će moći da oceni efikasna doziranja sa unošenjem i zapažanjem željenog terapeutskog efekta. Doziranje preparata podržanog oslobađanja je količina potrebna da se postigne efikasna koncentracija biološki aktivnog agensa in vivo, za dati period vremena. Doziranje i poželjno frekventno unošenje menja se sa tipom biološki aktivnog agensa, željenim trajanjem oslobađanja, ciljnim obolenjem, frekvencijom željenog unošenja, vrstama životnja subjekta i drugim faktorima. Poželjno, formulacija molekula će biti takva da će između oko 0.10/^g/kg/dan i 100 mg/kg/dan dati željeni terapeutski efekat.

Efikana doziranja mogu se odrediti korišĆenjem dijagnostičkog alata tokom vremena. Pomoću primera, ovaj pronalazak obezbeđuje doziranja OB proteina. Na primer, dijagnostika za merenje količine OB proteina u krvi (ili plazma ili serum) može prvo da se koristi da se odrede endogeni nivoi OB proteina. Takav dijagnostički alat može da bude u obliku ogleda antitela, takvih kao ogled sendviča antitela. Količina endgogenog OB proteina može se kvantifikovati početno, i određena je osnovna linija. Terapeutska doziranja određena kao kvantifikacija endogenog i eksogenog ptoteina (što znači proteina, analoga ili derivata nađenog unutar tela, ili samo-proizveden ili unet) nastavljena su tokom terapije, na primer, relativno velika doziranja mogu da budu potrebna početno, dok se ne vidi terapeutski dobitak, a zatim se koriste niža doziranja da se održe terapeutski dobici.

Materijali i postupci

Materijal

Alginat u obliku soli alginata može se naći iz izvora, ili se dobija sa postupcima dobro poznatim u tehnici. Leptin, GCSF i saglasni interferon su od Amgen Inc. Druge hemikalije su iz izvora dobro poznatih u tehnici Uvođenje - dobijanja usporenog gela

Usporeni gel je dobijen sa kombinovanjem biološki aktivnog agensa i smeše anjonskog polimera (n.p., alginat) sa soli polivalentnog katjona (n.p., CaC03) i protona donora (n.p., zakišeljen pufer ili izvor kiseline koja se polako oslobađa ili rastvara takav kao 0-glukonoklakton), ako se koristi. Za sve slučajeve, anjonski polimer, protein i bilo koji talozi/ekscipijenti mogu da se dobiju kao smeša. Želatiniranje je započeto sa dodavanjem soli polivalentnog katjona i izvora protona, ako se koristi, u ovu smešu. Dodavanje protona, polivalentnog metalnog jona u smešu polimera biološki aktivnog agensa može da bude istovremeno, ili izdvojeno sa proton donorom prvo ili polivalentnim metalnim jonom prvo. Za pufer - izazvano želatiniranje so polivalentnog katjona i izvor protona mogu da se izmešaju kao vodena suspenzija dosta ranije u odnosu na vreme želatiniranja. Posle startovanja želatiniranja, štrcaljke su napunjenje pre nego se desi želatiniranje (tipično 5 do 10 minuta). Ubrizgavanja se mogu izvršiti pre nego što se materijal prevede u gel za in situ želatiniranje, ili posle kada materijal pređe u gel.

Smeše protein-alginat

Smeša rastvarača i taloga/ekscipijenta (n.p., soli cinka, puferi, itd.) se dobija. U brzom nizu, rastvor proteina (n.p., leptin u 10 mM Tris HC1, pH 8) i sterilni alginat (n.p., 10% rastvor u autoklavu) brzo se izmešaju. Gde se biološki aktivni agens dobija kao fina suspenzija (n.p., cink-leptin tipično se formira na 10-15 mg/ml), može da bude poželjno da se koncentriše suspenzija.

So kalcijuma

So kalcijuma može da se dobije kao suspenzija finog praha u vodi u autoklavu (n.p., 9.1% CaC03u vodi).

Izvor proton

Za pufer izazvane gelove, suspenzija soli kalcijuma može da se kombinuje sa puferom, takvim kao 1 M Tris HC1, pH 7.0 ili 0.5 M PIPES, pH 6.7.

Za polako rastvaranje ili polako oslobađanje izvora kiseline(j3-glukonolakton), data težina praha je rastvorena u vodi sa vremenom izabranim kratko pre primene (n.p., 1 minut pre mešanja). Prethodno izmerena smeša suvog, sterilnog praha izvora kiseline i soli kalcijuma može se takođe koristiti da se uprosti postupak.

Rastvarač

Rastvarač može da bude voden, nevoden ili njihove smeše. Primeri nevodenih rastvarača su dimetil sulfoksid, dimetil formamid, glicerol, polietilen glikoli, Pluronics<R>i tako dalje.

Želatiniranje

Želatiniranje smeše polimer-lek može da počne sa dodavanjem soli kalcijuma. Temperatura smeše, i količina i veličina čestica soli mogu se koristiti za kontrolu brzine želatiniranja. Ako se dodatno koristi proton donor, želatiniranje može da počne sa dodavanjem 1) soli kalcijuma i suspenzije zakišeljneog pufera (posebno ili zajedno), ili 2) suspenzije soli kalcijuma praćeno sa svežiim rastvor/suspenzijom izvora protona koji se sporo oslobađa ili suprotno, ili 3) praha soli kalcijuma i izvora protona zajedno ili posebno. Posle dodavanja soli kalcijuma, drugi talozi/ekscipijenti (n.p., soli cinka, puferi, itd) mogu se dodati u smešu. Posle brzog mešanja, smeša gela može da se izvuče u štrcaljku pre nego što pređe u gel.

Smeštanje gela

Generalno, smeštanje proteina je poznato. Smeštanje nepoznatog gela može se odrediti kako sledi.

Postupak razbijanja

Oko 0.1 - 0.2 ml (tačno uzeta težina) je bačeno u Eppendorf cev, zatim je rastvoreno u 1 ml 0.1 M natrijum citrata. Smeša je inkubirana na sobnoj temperaturi sa blagim trešenjem dok se gel ne dezintegriše (generalno oko 2 sata preko noći). Posle je rezultujuća suspenzija centrifugirana na 8K rpm tokom 2 min. (Eppendorf, 5415 C), uzeta je absorbansa na 280 nm supernatanta. Bilo koji čvrsti delovi su rastvoreni u 1 ml od 7M urea; absorbansa ovog rastvora je zabeležena. Iz ovih absorbansi mogu se izračunati miligrami proteina po gramu.

Kumulativni postupak

Ovaj postupak se koristi u vezi sa ispitivanjima in vivo oslobađanja. Količina proteina oslobođenog na kraju ispitivanja je nađena. Za detalje, videti sekciju ispitivanja oslobađanja in vitro.

Ispitivanja oslobađanja in vitro

Gel je ili formiran u Eppendorf cevi ("bačeni" uzorci) ili u štrcaljki zatim je izbačen u Eppendorf cev ("izbačeni" uzorci). Generalno, oko 0.1 - 0.2 ml gela je bačeno ili izbačeno (tačna količina je izmerena). Oslobađanje je započelo sa dodavanjem pufera (10 mM Tris HC1, pH 8 za leptin, pH 7.4 za GCSF) u svaku cev i njegovim postavljanjem u inkubator tresač (New Brunsvvick Scientific) na 37°C i 100-200 rpm. U odabranim vremenskim intervalima, uzorak je uklonjen iz inkubatora. Ako je gel netaknut, supernatant je uklonjen i centrifugiran (Eppendorf, 8000 rpm, 2 min.) i supernatant je sakupljen. Bilo koji čvrsti delovi su suspendovani u 1 ml svežeg Tris pufera i vraćeni su u originalnu cev oslobađanja za preuzimanje oslobađanja. Ako je gel široko razbijen, sadržaj cevi je centrifugiran, supernatant je sakupljen i čvrsti delovi su ponovo suspendovani u 1 ml pufer za preuzimanje oslobađanja. Supernatant "vremenske tačke" može da zahteva dalje centrifugiranje (8000 - 13000 rpm, 8 minuta) da se oni prečiste za UV skeniranje. Količina oslobođenog proteina određena je iz absorbanse supernatanta. Posle finalnog oslobađanja uzorka uzeta je ostavljena količina u zrnu i određena je sa postupkom razbijanja (gore). Procenat oslobađanja u datom vremenu određen je iz kumulativnog oslobođenog proteina izraženog kao frakcija originalnpog smeštanja proteina u gelu (poznata iz težine gela i kako je formulisana) ili finalnog ukupnog proteina oslobođenog (uključujući finalno razbijanje citrat-urea).

In vivo ispitivanja

Gubitak težine miševa

Šest do osam nedelja ženke miševa, tipa C57/BLC dobijene su od Charles River and Taconic Inc. One su tipično težile 20 grama. Svaka dozna grupa

sastoji se od 5 miševa, Injekcije su potkožne.

Ispitivanje PK pacova

Mužjaci pacova su korišćeni u ovom ispitivanju i oni su tipično težili 250-300 grama. Injekcije su davane na sličan način sa onim opisanim za eksperimente gubitka težine miševa. Krv je uzorkovana sa kateterom za sakupljanje u raznim vremenskim intervalima posle injekcije i uzorci su analizirani za leptin sa ELISA ogledom.

Primeri

Sledeći primeri su ponuđeni da potpunije ilustruju pronalazak, ali oni ne treba da budu smatrani kao ograničenje njegovog obima. Dodatno, sa respektom na gornji opis ili primere niže, stručnjak će moći da napravi potrebne izmene u opisima za proizvodnju velikog obima.

Primer 1

Ovaj in vivo primer pokazuje daje leptin puferom izazvanog usporenog gela aktivan i da pokazuje podržano oslobađanje u poređenju sa leptinom. Ovaj primer takođe ilustruje sistem koji prelazi u gel posle injekcije u životinju. Sterijlna suspenzija kalcijum karbonata je dobijena od rasejanih čvrstih delova gde su čestice manje od 75 mikrona. Smeša ovog sa Tris pH 7 je dodana u leptin u alginatu (u 10 mM Tris pH 8) tako da su finalne koncentracije sastojaka bile: 2% alginata (sterilno filtriran), 10 mg/ml leptina, 7 mM Tris pH 8, 150 mM Tris pH 7 i 24 mM CaC03 (podrazumeva se potpuno rastvaranje). Takva smeša je želatinirana unutar 8 do 9 minuta. Kada je leptin ispušten, vreme želatiniranja bilo je neznatno duže (10-12 minuta). Ovo je dalo vreme da se opterete štrcaljke.

Formulacija usporenog gela je ubrizgana (dok je još neželatinirana) u jednu grupu miševa u alternativnim danima na 100 mg/kg/dan (2 dana rada na50 mg/kg). Druga grupa je dobila injekciju sa rastvorom leptina (u Tris puferu na 10 mg/ml) dnevno a treća grupa je primila rastvor leptina u alternativnim danima na 100 mg/kg. Miševi su mereni dnevno a promene težine su izražavane kao procenat početnih težina miševa.

Raspored doziranja alternativnog dana sa usporenim gelom dao je skoro isti gubitak težine kao rastvor leptina koji je ubrizgavan dnevno (8-9%). Suprotno, rastvor leptina unet u alternativnim danima pokazao je manji gubitak težine (6%) kraćeg trajanja. Ova poslednja grupa vratila se na osnovnu težinu za 8 dana, dok su ostale grupe povratile njihove originalne težine za 10-11 dana.

Primer 2

Ovaj primer pokazuje da proizvodnja usporenog gela puferom izazvanog kalcijum alginata može da produži in vitro podržano oslobađanje u poređenju sa neželatiniranim formulacijama. Suspenzija kalcijum karbonata je dobijena kao 100 mg/ml suspenzija vrlo finog praha. Smeša ovog sa pH 6.7 PIPES puferom dodana je u suspenziju cink leptina u alginatu (Tris puferovan na pH 8) koji je generisan iz koncentrovanog rastvora leptina (83 mg/ml u Tris pH 8 u vremenu kada je dodan cink). Jedan ml takve smeše je bačen u 10 ml u kupu. Finalne koncentracije svih sastojaka bile su: 2% alginata (iz autoklava 10% rastvora Keltone LCVR), 15 mM Tris pH 8, 50 mg/ml leptin, 1 mM ZnCU2, 10 mM CaC03 (podrazumeva se kompletno rastvaranje) i 93 mM PIOPES pH 6.7. U odsustvu leptina, takva smeša je želatinirana u 7 minuta. Posle želatiniranja preko no}i, 0.2 g komada gela je izmereno i postavljeno u boce za iskrenje radi oslobađanja, na 37°C u tresaču. Ovo oslobađanje je poređeno sa oslobađanjem iz iste formulacije bez kalcijuma i PIPES (nema gela kalcijum alginata). Kada se zgusnuo cink leptin alginata formulacija (neželatinirana) se oslobodila, u tački 5 sati bilo je 75% i tu je bilo postepeno oslobađanje na 90% tokom oko 3 dana. Ali, cink leptin u usporenom gelu kalcijum alginata je pokazao mnogo podržanije oslobađanje 35% na 5 sati, 60% na jedan dan, zatim postepenije oslobađanje od 70% na 5 dana.

Primer 3

Ovaj primer pokazuje da 5-glukonolaktonom izazvan gel koji sadrži leptin kao fini talog cinka, podržava oslobađanje leptina. Leptin (oko 14 mg/ml u Tris pH 8) dodan je u rastvor PIPES pH 6.7 i rastvor ZnC12 je odmah tu izmešan, sa brzim praćenjem rastvora alginata (autoklav 10%) tako da su finalne koncentracije sastojaka bile: 1.1 mM ZnC12, 2.2% alginata, 10 mM Tris (pH 8) i 22 mM PIPES (pH 6.7). Ova smeša je koncentrovana sa centrifugiranjem dok nivo leptina nije bio 46 mg/ml. Smeša gela je zatim napravljena sa mešanjem u CaC03 suspenziji (fini prah) sa brzim praćenjem rastvora 5-glukonolaktona. Finalne koncentracije komponenata su bile 2% alginata, 20 mM PIPES, 9 mM Tris, 1 mM ZnC12, 16 mM (podrazumeva se kompletno rastvaranje) CaC03 i 79 mM 5-glukonolaktona. Smeša je izvučena u štrcaljke pre želatiniranja, a želatiniranje se desilo u štrcaljkama posle 10 minuta. Posle skladištenja preko noći (3 sata na sobnoj temperaturi i zatim na 4°C), gelovi su ubrizgani u miševe. Gubitak težine je pokazan u poređenju sa kontrolnim puferom.

Tokom pet dana leptin je ubrizgan na 50 mg/kg/dan, n.p., 250 mg/kg velike pilule u gelu, i poređeno je sa istom velikom pilulom koja je pokazala samo umeren maksimalni gubitak težine od 4.4-4.8% na 2 do 4 dana, gde je cink leptin u gelu proizveo gubitak težine 9%. Na pet dana, gubitak težine za gel bio je još 5%, i ostao je iznad osnovne (održavani gubitak težine) kada je eksperiment završen na 7 dana.

Primer 4

Ovaj primer pokazuje da ako je koncentracija proteina u smeši alginat-leptin-cink dovoljno visoka, smeša formira gel u odsustvu kalcijuma koji pokazuje podržano oslobađanje. Leptin (oko 14 mg/ml u Tris pH 8) je dodan u rastvor pufera i rastvor ZnC12 je tu odmah izmešan, sa brzim praćenjem rastvora alginata (autoklav 10%) tako da su finalne koncentracije sastojaka bile 1.1 mM ZnC12, 1.1 ili 2.2% alginata, 10 mM Tris (pH 8) i 22 mM PIPES pH 6.7 (ako je prisutan).

Ova smeša je koncentrovana sa centrifugiranjem dok se ne postigne želejena koncentracija čvrstih delova leptina. Formulacija od oko 50 mg/ml imala je PIPES i 2.2% alginata. Formulacija od oko 100 mg/ml imala je PIPES i 1.1 % alginata.

Finalne koncentracije komponenata za 50 mg/ml kalcijum gela iz primera 3 bile su 2% alginata, 20 mM PIPES, 9 mM Tris, 1 mM ZnC12, 16 mM (podrazumeva se kompletno rastvaranje) CaC03 i 79 mM 5-glukonolaktona. Za 100 mg/ml kalcijum gela, formulacija je bila slična osim što su finalne koncentracije komponenata bile 1% alginata, PIPES je ispušten, 13 mM CaC03 i 67 mM 5-glukonolaktona.

Za gelove sa kalcijumom, smeše su izvučene u štrcaljke pre želatiniranja, a želatiniranje se desilo u štrcaljkama posle 10 minuta. Gde kalcijum nije uključen u gel, smeša Zn-leptin-alginat je izvučena u štcaljke i ostavljena da pređe u gel. Ispostavilo se da formulacija od 50 mg/ml bez kalcijuma nije prešla u gel. Posle skladištenja preko noći (3 sata na spbnoj temperaturi i zatim na 4°C, gelovi su ubrizgani u miševe. Gubitak težine je prikazan u poređenju sa kontrolnim puferom.

U toku pet dana leptin je ubrizgan na 50 mg/kg/dan. n.p., 250 mg/kg velike pilule u gelu. Gelovi kalcijuma iz primera 3 dali su 9% gubitak težine unutar 2-4 dana; na pet dana, gubitak težine za gel još je bio 5 %, i on je ostao iznad osnovne (održavani gubitak težine) kada je eksperiment završen na 7 dana, U poređenju, 50 mg/ml formulacije bez kalcijuma dalo je 3% gubitak težine tokom 2 do 4 dana, ali, gubitak težine je pao na nulu petog dana. Suprotno, 100 mg/ml formulacije leptina bez kalcijuma bilo je bar aktivno kao 100 mg/ml formulacije leptina sa kalcijumom. Vršni gubitak težine za 100 mg/ml gela bez kalcijuma bio je 9% na dan 4, vršni gubitak težine za 100 mg/ml gela, sa kalcijumom bio je 6% takođe na dan 4. Obe formulacije počele su da dobijaju težinu na dan 9.

Primer 5

Ovaj primaer pokazuje da in vitro podržano oslobađanje leptina iz alginat usporenog gela može da bude dobijeno bez prvog formiranja finog taloga leptin-cink. Leptin (100 mg/ml; 10 mM Tris HC1, pH 8.8; pH podešen od 8.0 do 8.8 sa IM NaOH) i 6% alginata (10 mM Tris HC1, pH 8.6) sakupljeni su u kadi s ledom. Leptin (0.5 ml) je dodan u 6% alginat (0.18 ml) i smeša je mešana u kadi s ledom tokom 10-15 minuta; finalni pH bio je 8.6-8.8. U ovu smešu dodana je suspenzija od 1 M GaC03 (16 mcl) i rezultujuća suspenzija je dobro izmešana. U ovu suspenziju dodan je sa ukapavanjem, sa mešanjem, rastvor od 0.1 M ZnC12 (100 mcl); voda je zatim dodana da se dobije zapremina od 1 ml. Suspenziona smeša je potpuno izmešana i držana u kadi s ledom tokom 10-20 minuta. Zatim je pažljivo izmešan rastvor od 1.68 6-glukonolaktona (56 mcl) u ovu smešu. Količina od 0.1 ml finalne smeše (50 mg/ml leptina, 1 % alginata) bačena je unutar eppendorf cevi i ostavljena preko noći na 4°C.

Posle skladištenja preko noći in vitro oslobađanje je izvršeno u 10 mM histidina, pH 7.4. Bačeni gel pokazao je malo razbijanje i jasno konstantno oslobađanje leptina sa 50% oslobađanja tokom 6 dana.

Primer 6

Ovaj primer pokazuje da 6-glukonolaktonom izazvan gel koji sadrži leptin kao fini talog cinka, daje podržanije oslobađanje leptina od iste cink suspenzije u alginatu koji nije preveden u gel. Gel sa cink leptinom je dobijen kao u primeru 3. Suspenzija cink leptin u alginatu koja nije prevedena u gel dobijena je na isti način, sim što su ispušteni CaCO, i 5-glukonolakton. Miševi su dozirani sa injekcijama velike pilule od 250 mg/kg i ekepsrimen gubitka težine je izvršen kako je opisano u primeru 3. Suspenzija koja nije prevedena u gel dala je samo 3% gubitka težine u danima 2-4, dok je suspenzija prevedena u gel donela oko 9% gubitka težine tokom istog perioda. Gubitak težine za suspenziju koja nije prevedena u gel vratio se na osnovnu na dan 5, dok je gubitak težine za suspenziju prevedenu u gel ostao iznad osnovne u 7 dana, kada je eksperiment završen.

Primer 7

Ovaj primer pokazuje kinetiku oslobađanja nultog reda u farmakokinetsko/farmakodinamičkom ispitivanju kod mužjaka pacova, koji pokazuje i podržano oslobađanje i istovremeno podržani efekat leptina (n.p., gubitak težine) isporučenog sa preparatom gela opisanom u primeru 3. Koncentracija leptina bila je 47 mg/ml, i bila je prethodno prevedena u gel u štcaljkama kako je opisano u primeru 3. Pacovima je data doza velike pilule od 0 mg/kg (kontrola), 50 mg/kg i 250 mg/kg, zatim su prikazivani nivoi krvi i gubitka težine tokom 6 dana. Talog gela bez leptin-cinka takođe je ubrizgan u pacove u dozi od 100 mg/kg.

Grupa visoke doze leptin gela pokazala je nepromenljiv nivo krvi od oko 2000 ng/ml tokom perioda, dok je grupa sa manjom dozom leptin gela imala nivo od oko 1/5 tog nivoa tokom 4 dana. Suprotno, grupa gela bez leptina pokazala je nivo krvi od 2300 ng/ml koja je imala vršnu vrednost na 12 sati a zatim se smanjila sa faktorom 100 tokom istog perioda vremena. Težina pacova (prema kontrolnom nosaču) smanjivana je stalno tokom ovog perioda za grupu visoke doze leptin gela. Težina grupe manje doze leptin gela praćena je sa istim tokom skoro 5 dana; u toj tački, nivo krvi grupe manje doze leptina je spušten.

Bioraspoloživost leka leptina ispitivana je sa poređenjem područja normalizovane doze ispod krive formulacije leptin gela, formulacije gela bez leptina i leptina unetog intravenski. Bioraspoloživost formulacije leptin gela bila je 80% u poređenju sa 63% bioraspoloživosti formulacije gela bez leptina.

Primer 8

Ovaj primer pokazuje in vitro podržano oslobađanje G-CSF iz usporenih nosača gela. Ipsitivani su i "izbačeni" i "istisnuti" materijali. G-CSF u pH 3.4 vodi pomešan je sa koncentrovanim alginatom (10%) radi formiranja maglovite, viskozne suspenzije. Ova smeša je prevedena u gel sa CaCO, i5-glukonolaktonom, sa 16 mM i 79 mM, respektivno. Pre želatiniranja alikvoti materijala su ubačeni u tube ili izvučeni u štcaljke. Posle 1 sata na sobnoj temperaturi gelo su uskaldišteni na 4°C (preko noći). Pre izvršavnja ispitivanja oslobađanja, gelovi u štcaljkama su istisnuti u cevi i ostavljeni da se podese tokom 20 minuta. Zatim je dodan pufer za oslobađanje. Istisnuti gel je pokazao oslobađanje GCSF tokom perioda od 3 dana, n.p., 11% na 1 sat, 35% na 1 dan; 75% na 2 dana i oko 90% na 3 dana. Bačeni gel se oslobađao 22% na 1 sat, 80% na 1 dan i 94% na 2 dana.

Primer 9

Ovaj primer pokazuje in vitro podržano oslobađanje leptina iz usporenog gela alginata dobijenog iz soli kalcijuma (CaS04) bez dodavanja proton donora. Nepuferovan leptin sa pH 8 je korišćen da se formira cink-leptin suspenzija u 2% alginata. Finalne koncentracije od ZnCl2i leptina su bile 1 mM i 55 mg/ml, respektivno. Fini prah od CaS04je izmešan sa suspenzijom cink-leptin-alginat tako da je finalna smeša bila 10 mM u CaS04. Alikvoti ovog materijala su bačeni na zidove eppendorf cevi. SmeSa je prešla u gel tokom 4-5 minuta.

Posle skladištenja tokom noći na sobnoj temperaturi, izvršeno je ispitivanje oslobađanja. Oslobađanje proteina iz gela pokazalo je malo razbijanje (_<_ 5%) na 1 sat. Na 1 dan oslobođeno je 11% leptina. Oslobađanje leptina je postepeno, 1.1% po danu, za sledećih 7 dana.

Primer 10

Ovaj primer pokazuje in vitro podržano oslobađanje leptina iz usporenog gela alginata dobijenog iz soli kalcijuma u nevodenom rastvaraču bez dodavanja proton donora. Liofilizovan prah leptina je suspendovan u 2% alginata suvom dimetil sulfoksidu. Fini prah kalcijum oleata je izmešan sa suspenzijom alginat-leptina tako da je finalna koncentracija 10 mM u kalcijumu. Alikvoti materijala su bačeni na zidove cevi za testiranje. Smeša prelazi u gel sa vremenom.

Posle skladištenja preko noći na sobnoj temperaturi, izvršeno je ispitivanje oslobađanja. Oslobađanje proteina iz gela je postepeno i podržano, tokom sledećih 7 dana.

Primer 11

Ovaj primer pokazuje in vitro podržano oslobađanje leptina iz usporenog gela alginata dobijenog iz soli kalcijuma kako je opisano u primeru 10. Ispitivanje gubitka težine kod miševa je izvršeno posle jedne injekcije ovog gela koji sadrži leptin na 250 mg/kg. Gubitak težine je meren tokom nekoliko dana.

Primer 12

Ovaj primer pokazuje in vitro podržano oslobađanje G-CSF iz usporenog gela alginata dobijenog iz soli kalcijuma u nevodenom rastvaraču bez dodavanja proton donora. Liofilizovan prah G-CSF je suspendovan u 2% alginata u suvom dimetil sulfoksidu. Fini prah kalcijum oleata je izmešan sa suspenzijom alginat-G-CSF tako da je finalna smeša 10 mM u kalcijumu. Alikvoti materijala su bačeni na zidove cevi za testiranje. Smeša prelazi u gel sa vremenom.

Posle skladištenja preko noći na sobnoj temperaturi, izvršeno je ispitivanje oslobađanja. Oslobađanje ptoteina iz gela je postepeno i podržano.

Primer 13

Ovaj primer pokazuje in vitro podržano oslobađanje saglasnog einterferona, kako je opisano u SAD patentu br. 4,695,623, supra, iz usporenih gelova alginata. Voda, ZnCl2, Tris pufer i saglasni interferon (u 10 mM TRis pH 7.5) izmešani su sa rastvorom alginata, zati su izmešani sa CaC03i <5-glukonolaktonom, tako da su finalne koncentracije komponenata bile 1 mg/ml saglasnog interferona, 10 mM ZnCl2, 1% alginata, 20 mM TRis, 10 mM CaC03i 40 mM 5-glukonolaktona.Smeša je bačena na eppendorf cev (0.4 ml po cevi), prevedena u gel na sobnoj temperaturi i skladištena preko noći na 4°C. Posle skladištenja preko noći izvreno je in vitro oslobađanje u 10 mM histidin puferu, pH 7.4. Bačeni gel je pokazao malo razbijanje, procenat razbijanja bio je 3% na 1 sat, 14% na 1 dan. Za 4 dana oslobođeno je 70%. U danima 5-6, brzina oslobađanja je usporena na <5% po danu.

Primer 14

Ovaj primer pokazuje da se usporeni gelovi alginata mogu koristiti za podržano oslobađanje saglasnog interferona. Usporeni gel alginata saglasnog interferona je dobijen u skladu sa primerom 13 osim što su finalne koncentracije bile kako sledi: 0.2 mg/ml saglasnog interferona, 10 mM ZnCl2, 2% alginata, 20 mM Tris, 10 mM Cac03i 40 ml S-glukonolaktona. Druga formulacija je dobijena sa istim sastavom, osim što je koncentracija saglasnog interferona bila 1 mg/ml. Smeša je izvučena u štrcaljkama i prešla je u gel posle 2 sata. Formulacija od 0.2 mg/ml je ubrizgana potkožno na 1 mg/kg i 1 mg/ml formulacija na 1 mg/kg i 5 mg/kg doza u mužjake sirijskog hrčka. Krv je sakupljena sa srčanom punkturom i ispitano je za saglasni interferon radi zapažanja podržanog oslobađanja leka.

Claims (50)

1. Preparat gela usporenog podržanog oslobađanja naznačen time što sadrži: a) hidrofilni polimer; b) biološki aktivni agens; i c) bar jedan vezan polivalentni metalni jon.

2. Preparat podržanog oslobađanja iz zahteva 1 naznačen time što dalje sadrži (d) bar jedan proton donor sposoban da oslobodi vezani polivelentni metalni jon.

3. Preparat podržanog oslobađanja iz zahteva 1 ili 2 naznačen time što vezani polivalentni metalni jon je smeša vezanog i nevezanog polivalentnog metalnog jona.

4. Preparat podržanog oslobađanja iz zahteva 1 ili 2 naznačen time što dalje sadrži supstancu za stabilisanje biološki aktivnog agensa ili hidrofilnog polimera.

5. Preparat iz zahteva 1 ili 2 naznačen time što vezani polivalentni metalni jon je so odabrana iz grupe koja sadrži acetate, fosfate, laktate, tartrate, citrate, hloride, sulfate, karbonate, hidrokside ili njihove anjone masne kiseline.

6. Preparat iz zahteva 5 naznačen time što metalni jon je odabran iz grupe koja sadrži mangan, stroncijum, gvožđe, magnezijum, kalcijum, barijum, bakar, alumimjum ili cink.

7. Preparat iz zahteva 6 naznačen time što metalni jon je kalcijum.

8. Preparat iz zahteva 1 ili 2 naznačen time. što hidrofilni polimer je polianjon.

9. Preparat iz zahteva 1 ili 2 naznačen time što hidrofilni polimer je polisaharid.

10. Preparat iz zahteva 9 naznačen time što polisaharid je kiseli polisaharid.

11. Preparat iz zahteva 10 naznačen time što polisaharid je alginat.

12. Preparat iz zahteva 11 naznačen time što alginat sadrži 30% guluronsku kiselinu.

13. Preparat iz zahteva 11 naznačen time što se alginat sastoji od bar 0.05% težinskih.

14. Preparat iz zahteva 1 ili 2 naznačen time što biološki aktivni agens sadrži protein.

15. Preparat iz zahteva 14 naznačen time što se protein sastoji od bar 0.001 mg/ml.

16. Preparat iz zahteva 14 naznačen time što protein je odabran iz grupe koja sadrži hematopoetske faktore, faktore stimulisanja kolonije, faktore protiv gojaznosti, faktore rasta, trofne faktore i antizapaljive faktore.

17. Preparat iz zahteva 14 naznačen time što protein je odabran iz grupe koja sadrži leptin, G-CSF, SCF, BDNF, GDNF, NT3, GM-CSF, IL-lra, IL2, TNF-bp, MDGF, OPG, interferone, eritropoietin, KGF, insulin i njihove analoge ili derivate.

18. Preparat iz zahteva 1 ili 2 naznačen time što biološki aktivni agens je kompleksiran.

19. Preparat iz zahteva 18 naznačen time što kompleksni biološki aktivni agens je staložen protein.

20. Preparat iz zahteva 19 naznačen time što staložen protein je talog cink leptina.

21. Preparat iz zahteva 2 naznačen time što proton donor je izvor kiseline.

22. Preparat iz zahteva 21 naznačen time što izvor kiseline je odabran iz grupe koja sadrži pufere, estre, sporo rastvorljive kiseline ili laktone.

23. Postupak dobijanja preparata gela usporenog podržanog oslobađanja, naznačren time što sadrži faze: a) mešanja biološki aktivnog agensa i hidrofilnog polimera u rastvaraču radi formiranja prve smeše; i b) mešanja u prvoj smeši bar jednog polivalentnog metalnog jona radi formiranja druge smeše.

24. Postupak iz zahteva 23 naznačen time što dalje sadrži fazu c) mešanja u drugoj smeši bar jednog proton donora sposobnog za oslobađanje vezanog polivalentnog metalnog jona.

25. Postupak iz zahteva 23 ili 24 naznačen time što vezani polivalentni metalni jon je so odabrana iz grupe koja sadrži acetate, fosfate, laktate, tartrate, citrate, hloride, sulfate, karbonate, hidrokside ili njihove anjone masne kiseline.

26. Postupak iz zahteva 25 naznačen time što metalni jon je odabran iz grupe koja sadrži mangan, stroncijum, gvožđe, magnezijum, kalcijum, barijum, bakar, aluminijum ili cink.

27. Postupak iz zahteva 26 naznačen time što metalni jon je kalcijum.

28. Postupak iz zahteva 23 ili 24 naznačen time što hidrofilni polimer je polianjon.

29. Postupak iz zahteva 23 ili 24 naznačen time što hidrofilni polimer je polisaharid.

30. Postupak iz zahteva 29 naznačen time što polisaharid je kiseli polisaharid.

31. Postupak iz zahteva 30 naznačen time što polisaharid je alginat.

32. Postupak iz zahteva 31 naznačen time što alginat sadrži 30% guluronsku kiselinu.

33. Postupak iz zahteva 31 naznačen time što se alginat sastoji od bar 0.05% težinskih.

34. Postupak iz zahteva 23 ili 24 naznačen time što biološki aktivni agens sadrži protein.

35. Postupak iz zahteva 34 naznačen time što se protein sastoji od bar 0.001 mg/ml.

36. Postupak iz zahteva 34 naznačen time što protein je odabran iz grupe koja sadrži hematopoetske faktore, faktore stimulisanja kolonije, faktore protiv gojaznosti, faktore rasta, trofne faktore i antizapaljive faktore.

37. Postupak iz zahteva 34 naznačen time što protein je odabran iz grupe koja sadrži leptin, G-CSF. SCF, BDNF. GDNF. NT3, GM-CSF, IL-lra, IL2, TNF-bp, MDGF, OPG. interferone. eritropoietin, KGF, insulin i njihove analoge ili derivate.

38. Postupak iz zahteva 23 ili 24 naznačen time što biološki aktivni agens je kompleksni biološki aktivni agens.

39. Postupak iz zahteva 38 naznačen time što kompleksni biološki aktivni agens je staložen protein.

40. Postupak iz zahteva 39 naznačen time što staložen protein je talog cink leptina.

41. Postupak iz zahteva 23 ili 24 naznačen time što dalje sadrži fazu izolovanja preparata podržanog oslobađanja.

42. Postupak iz zahteva 24 naznačen time što proton donor je iz izvora kiseline.

43. Postupak iz zahteva 42 naznačen time što izvor kiseline je odabran iz grupe koja sadrži pufere, estre. sporo rastvorljive kiseline ili laktone.

44. Preparat podržanog oslobađanja naznačen time što je dobijen postupkom iz zahteva 23, 24 ili 41.

45. Farmaceutska formulacija naznačena time što sadrži preparat podržanog oslobađanja u skladu sa zahtevima 1 ili 2 u farmaceutski prihvatljivom nosaču, razblaživaču ili pomoćnom sredstvu.

46. Farmaceutska formulacija iz zahteva 45, naznačena time što formulacija je u štrcaljki.

47. Postu pak za primenu preparata podržanog oslobađanja u skladu sa zahtevima 1 ili 2 u lai maccuiski pi ihvađjivom nosaču, razblaživaču ili pomoćnom sredstvu za tretiranje određenih simptoma.

48. Postupak za primenu preparata<p>održanog oslobađanja u skladu sa zahtevima I ili 2 u farmaceutski piihvati|ivom nosaču, razblaživaču ili pomoćnom sredstvu za. tretiranje oboljenja odabranog iz grupe koja sadrži višak težine, dijabetes, visok nivoa lipiđa u ki\i. arieri|sku alerosklerozu, arterijsku pločicu, redukciju ili prevenciju lormirania žučnog kamena, nedovoljnu masu nemasnog tkiva, nedovoljni osetljivosi na insulin. i udar. naznačen time, što biološki aktivni agens je leptin ili njegov analog ili derivat.

49. Postupak za primenu piepaiata podržanog oslobađanja u skladu sa zahtevima I ili 2 u !arma<Tiit«kL|>iihvail|ivom nosaču, razblaživaču ili pomoćnom sredstvu za tretiranje oboljenja odabranog iz grupe koja sadrži nedostatke hematopoietske čelne i neutroieum naznačen time. što biološki aktivni agens je G-CSF il'i njegov analog ili đen'\ni

50. Postupak za primenu prepniain podržanog oslobađanja u skladu sa zahtevima 1 ili 2 u farmaceutski pi ih\ail|ivoni nosaču, razblaživaču ili pomoćnom sredstvu za tretiranje zapaljenja naznačen ume. što biološki aktivni agens je 1L-Ira ili njegov analog ili derivat.