RS58756B1 - Derivat tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazina kao bace inhibitor - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na nove kristalne inhibitore BACE, farmaceutske oblike koji sadrže kristalne inhibitore BACE, kristalne inhibitore BACE za primenu u lečenju fizioloških poremećaja i postupke koji su korisni za njihovu sintezu.

[0002] Ovaj pronalazak je iz oblasti lečenja Alchajmerove bolesti i drugih bolesti i poremećaja koji uključuju amiloidni β (Abeta) peptid, neurotoksični i visoko agregatorni peptidni segment amiloidnog prekursornog proteina (APP). Alchajmerova bolest predstavlja razorni neurodegenerativni poremećaj, koji pogađa milione pacijenata širom sveta. S obzirom na to da trenutno odobreni agensi na tržištu, pružaju samo prolazne, simptomatske koristi pacijentu, postoji značajna nezadovoljena potreba u lečenju Alchajmerove bolesti.

[0003] Alchajmerova bolest se odlikuje generisanjem, agregacijom i taloženjem Abete u mozgu. Pokazalo se da potpuna ili delimična inhibicija β-sekretaze (enzim razlaganja beta-mesta amiloidnog prekursornog proteina; BACE) ima značajan efekat na patologije koje su povezane sa plakom i zavisne od plaka kod modela miša, što ukazuje na to da čak i male redukcije nivoa Abeta peptida mogu da rezultuju značajnim dugoročnim smanjenjem opterećenja plakom i sinaptičkih deficita, čime se postižu značajne terapeuste koristi, naročito u lečenju Alchajmerove bolesti.

[0004] Američki patent br.8,158,620 prikazuje kondenzovane derivate aminodihidrotiazina, koji poseduju inhibitornu aktivnost prema BACE i koji su dalje predstavljeni kao korisni terapeutski agensi za neurodegenerativnu bolest izazvanu Aβ peptidom, kao što je demencija Alchajmerovog tipa. Dodatno, J. Neuroscience, 31(46), stranice 16507-16516 (2011) predstavlja (S)-4-(2,4-difluor-5-pirimidin-5-il-fenil)-4-metil-5,6-dihidro-4H-[1,3]tiazin-2-ilamin, kao oralno primenjiv inhibitor BACE, koji deluje na centralni nervni sistem.

[0005] Poželjni su kristalni oblici inhibitora BACE, kako bi se obezbedila jednostavna priprema farmaceutskih preparata i poboljšala stabilnost farmaceutskih oblika.

[0006] Prema tome, ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje Formule I:

koje je kristalno.

[0007] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje postupak lečenja Alchajmerove bolesti kod pacijenta, koji se sastoji od davanja pacijentu, kome je potreban takav tretman, efikasne količine jedinjenja Formule I, koje je kristalno. Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje postupak za sprečavanje progresije blagog kognitivnog poremećaja u Alchajmerovu bolest, kod pacijenta, koji se sastoji od davanja pacijentu, kome je potreban takav tretman, efikasne količine jedinjenja Formule I, koje je kristalno. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje postupak inhibicije BACE kod pacijenta, koji se sastoji od davanja pacijentu, kome je potreban takav tretman, efikasne količine jedinjenja Formule I, koje je kristalno. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje postupak za inhibiciju cepanja amiloidnog prekursornog proteina posredovanog beta sekretazom, koji se sastoji od davanja pacijentu, kome je potreban takav tretman, efektivne količine jedinjenja Formule I, koje je kristalno. Pronalazak dalje obezbeđuje postupak za inhibiciju proizvodnje Abeta peptida, koji se sastoji od davanja pacijentu, kome je potreban takav tretman, efikasne količine jedinjenja Formule I koje je kristalno.

[0008] Osim toga, ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje Formule I, koje je kristalno, za primenu u terapiji, a posebno u lečenju Alchajmerove bolesti ili za prevenciju progresije blagog kognitivnog poremećaja u Alchajmerovu bolest. Dodatno, ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje Formule I, koje je kristalno, za proizvodnju leka za terapiju Alchajmerove bolesti ili prevenciju progresije blagog kognitivnog poremećaja u Alchajmerovu bolest.

[0009] Pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutski oblik, koji sadrži jedinjenje Formule I, koje je kristalno, zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, rastvarača ili ekscipijenasa. Opisani su intermedijeri i postupci dobijanja jedinjenja Formule I, koje je kristalno.

[0010] Blagi kognitivni poremećaj se definiše kao potencijalna prodromalna faza demencije povezane sa Alchajmerovom bolešću, na osnovu kliničke slike i dalje progresije kod pacijenata sa blagim kognitivnim poremećajem u Alchajmerovu demenciju, tokom vremena (Morris, et al., Arch. Neurol., 58, 397-405 (2001); Petersen, et al., Arch. Neurol., 56, 303-308 (1999)). Pojam "prevencija progresije blagog kognitivnog poremećaja u Alchajmerovu bolest” uključuje usporavanje, zaustavljanje i preokretanje progresije blagog kognitivnog poremećaja u Alchajmerovu bolest, kod pacijenta.

[0011] Ovde korišćeni pojam “lečenje” ili “lečiti” obuhvata kontrolu, usporavanje, zaustavljanje ili preokretanje napredovanja ili intenziteta postojećeg simptoma ili poremećaja.

[0012] Ovde korišćeni pojam "pacijent" se odnosi na čoveka.

[0013] Pojam "inhibicija proizvodnje Abeta peptida" označava smanjenje, in vivo, nivoa Abeta peptida kod pacijenta.

[0014] Ovde korišćeni pojam "efektivna količina" se odnosi na količinu ili dozu jedinjenja pronalaska ili farmaceutski prihvatljive soli istog, koja nakon davanja pacijentu, u obliku jedne ili više doza, obezbeđuje željeni efekat kod pacijenta sa dijagnozom ili koji je pod terapijom.

[0015] Delotvornu količinu može lako da odredi prisutni dijagnostičar, kao stručnjak u ovoj oblasti, primenom poznatih metoda ili posmatranjem rezultata dobijenih u analognim okolnostima. Prilikom određivanja delotvorne količine za pacijenta, prisutni dijagnostičar uzima u obzir brojne faktore, koji uključuju, ali bez ograničenja, vrstu pacijenta, njegove mere, starost i opšte zdravlje, specifičnu bolest ili poremećaj, koji su uključeni, stepen uključenosti ili ozbiljnost poremećaja ili bolesti, odgovor pojedinačnog pacijenta, posebno jedinjenje koje se daje, način primene, karakteristike biodostupnosti primenjenog preparata, odabrani režim doziranja, primenu pratećih lekova i druge relevantne okolnosti.

[0016] Jedinjenja ovog pronalaska su uglavnom efikasna u širokom opsegu doza. Na primer, dnevne doze su obično u opsegu od oko 0.01 do oko 20 mg/kg telesne težine. U nekim slučajevima nivoi doziranja ispod donje granice gore navedenog opsega mogu biti više nego adekvatni, dok u drugim slučajevima još veće doze mogu biti upotrebljene sa prihvatljivim sporednim efektima, i zbog toga namena prethodno navedenog opsega doza nije da ograniči okvir ovog pronalaska na bilo koji način.

[0017] Poželjno je da jedinjenja ovog pronalaska budu formulisana u vidu farmaceutskih oblika, koji se primenjuju na bilo koji način koji čini jedinjenje biodostupnim, uključujući oralni, transdermalni ili parenteralni put. Najpoželjnije je da takvi oblici budu za oralnu ili transdermalnu primenu, a naročito je poželjna oralna primena. Takvi farmaceutski oblici i postupci njihovog dobijanja su dobro poznati u struci (vidi, npr., Remington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, Editor, 21st Edition, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006).

[0018] Kristalna jedinjenja Formule I su naročito korisna u postupcima lečenja navedenim u okviru opisa, ali su poželjni određeni oblici. Takvi oblici opisani su u narednim pasusima. Podrazumeva se da su ove preference primenjive i na postupke lečenja i na nova jedinjenja pronalaska.

[0019] Kristalni oblik 1 N-[3-[(4aR,7aS)-2-Amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluor-fenil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamida;

[0020] Kristalni oblik 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-Amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluor-fenil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamida;

[0021] Kristalni oblik 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-Amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluor-fenil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamida, koji se odlikuje značajnim pikom u spektru difrakcije X zraka, na uglu difrakcije 2-teta od 11.8°, u kombinaciji sa jednim ili više pikova odabranih iz grupe koju čine 18.6°, 19.3°, i 26.7°; sa tolerancijom za uglove difrakcije od 0.2 stepena.

[0022] Kristalni oblik 3 N-[3-[(4aR,7aS)-2-Amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluor-fenil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamida; i

[0023] Kristalni oblik 3 N-[3-[(4aR,7aS)-2-Amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluor-fenil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamida, koji se odlikuje značajnim pikom u spektru difrakcije X zraka, na uglu difrakcije 2-teta od 15.7°, u kombinaciji sa jednim ili više pikova odabranih iz grupe koju čine 18.1°, 27.0°, i 19.7°; sa tolerancijom za uglove difrakcije od 0.2 stepena, je poželjan.

[0024] Kristalni oblik N-[3-[(4aR,7aS)-2-Amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluor-fenil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamida je naročito poželjan.

[0025] Kristalni oblik 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-Amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluor-fenil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamida, koji se odlikuje značajnim pikom u spektru difrakcije X zraka, na uglu difrakcije 2-teta od 11.8°, u kombinaciji sa jednim ili više pikova odabranih iz grupe koju čine 18.6°, 19.3°, i 26.7°; sa tolerancijom za uglove difrakcije od 0.2 stepena, je naročito poželjan.

[0026] Stručnjak u ovoj oblasti će uvideti da mogu da postoje tautomerni oblici jedinjenja pronalaska, kao što je prikazano na Šemi A. Kada se u ovom pronalasku poziva na jedan od posebnih tautomera jedinjenja pronalaska, podrazumeva se da su obuhvaćena oba tautomerna oblika kao i sve njihove smeše.

Šema A

[0027] Dodatno, određeni intermedijeri opisani u narednim šemama mogu da sadrže jednu ili više zaštitnih grupa za azot. Varijabilna zaštitna grupa može biti ista ili različita u svakoj pojavi, u zavisnosti od specifičnih reakcionih uslova i određenih transformacija koje treba izvršiti. Uslovi protekcije i deprotekcije su dobro poznati stručnjacima i opisani su u literaturi (vidi na primer "Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis", Fourth Edition, by Peter G.M. Wuts and Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007).

[0028] U narednim šemama, određeni stereohemijski centri nisu definisani i određeni supstituenti su eliminisani, radi jasnoće i nisu namenjeni da ograniče izučavanje šema na bilo koji način. Osim toga, pojedinačne izomere, enantiomere i dijastereoizomere stručnjak u ovoj oblasti može izdvojiti i razdvojiti u bilo kojem pogodnom trenutku sinteze jedinjenja pronalaska, postupcima kao što su metoda selektivne kristalizacije ili hiralna hromatografija (vidi na primer, J. Jacques, et al., "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981, and E.L. Eliel and S.H. Wilen," Stereochemistry of Organic Compounds", Wiley-Interscience, 1994). Oznake "izomer 1" i "izomer 2" odnose se na jedinjenja koja se eluiraju hiralnom hromatografijom redom prvo i drugo i ako je hiralna hromatografija inicirana rano u sintezi, ista oznaka se primenjuje na naredne intermedijere i primere.

[0029] Određene skraćenice se definišu na sledeći način: "APP" se odnosi na amiloidni prekursorni protein; "CSF" se odnosi na cerebrospinalnu tečnost; "DCM" se odnosi na dihlormetan; "DIPEA" se odnosi na diizopropiletilamin ili N-etil-N-izopropil-propan-2-amin; "DMEM" se odnosi na medijum “Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium”; "DMF" se odnosi na dimetilformamid; "DMSO" se odnosi na dimetil sulfoksid; "EDCI" se odnosi na 1-(3-dimetilaminopropil)-3etilkarbodiimid hidrohlorid; "ee" se odnosi na enantiomerni višak; "EtOAc" se odnosi na etil acetat; "Ex" se odnosi na Primer; "F12" se odnosi na medijum “Ham’s F12 medium”; "FBS" se odnosi na fetalni goveđi serum; "FRET" se odnosi na transfer fluorescentne rezonantne energije; "HEK" se odnosi na humane embrionalne ćelije bubrega; "HOAc" se odnosi na sirćetnu kiselinu; "HOBt" se odnosi na 1-hidroksilbenzotriazol hidrat; "HPLC’ se odnosi na tečnu hromatografiju visokih performansi; "IC50" se odnosi na koncentraciju agensa koja proizvodi 50% maksimalnog inhibitornog odgovora koji je moguć za taj agens; "min" se odnosi na minut ili minute; "MTBE" se odnosi na metil terc-butiletar; "PDAPP" se odnosi na amiloidni prekursorni protein dobijen iz trombocita; "Prep" se odnosi na Postupak dobijanja; "RFU" se odnosi na relativnu jedinicu fluorescencije; "SCX" se odnosi na snažnu katjonsku izmenu; "Rt" se odnosi na vreme zadržavanja; i "THF" se odnosi na tetrahidrofuran.

[0030] Jedinjenja ovog pronalaska se mogu dobiti različitim metodama poznatim u struci, od kojih su neke prikazane u narednim Postupcima dobijanja i Primerima. Posebni koraci sinteze za svaki opisani put se mogu kombinovati na različite načine, zajedno sa koracima iz drugih postupaka, kako bi se dobila jedinjenja pronalaska. Proizvodi iz svakog koraka se mogu izdvojiti konvencionalnim metodama poznatim u struci, koje uključuju ekstrakciju, evaporizaciju, precipitaciju, hromatografiju, filtraciju, trituraciju ili kristalizaciju. Reagensi i polazni materijali su lako dostupni stručnjaku.

Postupak dobijanja 1

2-Brom-1-(5-brom-2-fluorfenil)etan-1-on

[0031]

[0032] N-bromsukcinimid (984 g, 5.53 mol), je dodat u porcijama, u rastvor 1-(5-brom-2-fluorfenil)etan-1-ona (1000 g, 4.6 mol) i p-toluen sulfonske kiseline (1315 g, 7.64 mol) u DCM (7 L) na 35 °C. Smeša je mešana i zagrevana do 40 °C. Smeša je ohlađena do 24 °C, i dodat je 7% NaHCO3(5 L). Slojevi su razdvojeni i organski sloj je ispran sa 10% Na2SO3(5 L) i vodom (5 L). Organski sloj je koncentrovan na 2-3 zapremine, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova, koje se koristi bez dodatnog prečišćavanja.

Postupak dobijanja 2

5-Alil-6a-(5-brom-2-fluorfenil)-1-(4-metoksibenzil)heksahidro-1H-pirolo[3,4-c]izoksazol

[0033]

[0034] U rastvor 2-brom-1-(5-brom-2-fluorfenil)etan-1-ona (1363 g, 4.61 mol) u toluenu (10 L) dodati su dialilamin (537 g, 5.53 mol) i DIPEA (2381 g, 18.42 mol). Smeša je mešana 4 sata na 40 °C, da bi se dobio 1-(5-brom-2-fluorfenil)-2-(dialilamino)etan-1-on, koji nije izolovan. N-(4-metoksibenzil)hidroksilamin (847 g, 5.53 mol) i Ti(OiPr)4(1965 g, 6.91 mol) su dodati u smešu koja sadrži sirovi 1-(5-brom-2-fluorfenil)-2-(dialilamino)etan-1-on. Smeša je mešana na 90 °C tokom 2 sata. Smeša je ohlađena do 20 °C, i dodati su 50% monohidrat limunske kiseline (4 L) i zasićeni Na2CO3(4 L). Slojevi su razdvojeni i vodeni sloje je ekstrahovan pomoću MTBE (5 L). Organski ekstrakt je ispran vodom (5 L), i filtriran kroz dijatomejsku zemlju i koncentrovan do suvog. U ostatak su dodati EtOAc (10 L) i oksalna kiselina (580 g) i ostatak je filtriran i dodat u 1 N NaOH (13 L). Dodat je MTBE (5 L) i smeša je filtrirana kroz dijatomejsku zemlju. Slojevi su razdvojeni i organski sloj je koncentrovan na 2 zapremine. Dodat je heptan (3 L) i rastvor je ohlađen do 10 °C. Dobijeni talog je filtriran, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (1330 g, 64%).

<1>H NMR(400 MHz, CDCl3) δ 2.51-2.49(m, 3H), 3.09-3.04(m,3H), 3.78-3.41(m, 6H), 4.01(m, 1H), 5.24-5.01(m, 2H), 5.89-5.85(m, 1H), 6.82-6.80(m, 2H), 7.51-7.13(m, 3H), 7.63-7.62(m, 1H), 7.65-7.64(m, 1H).

Postupak dobijanja 3

5 -Alil-6a-(5-brom-2-fluorfenil)heksahidro-1H-pirolo [3,4-c]izoksazol hidrohlorid

[0035]

[0036] Trifluorsirćetna kiselina (4 L, 52.9 mol) je dodata, kap po kap, u rastvor 5-alil-6a-(5-brom-2-fluorfenil)-1-(4-metoksibenzil)heksahidro-1H-pirolo[3,4-c]izoksazola (1990 g, 4.45 mol) u DCM (12 L) brzinom kojom se temperatura održava ispod 35 °C. Po završetku dodavanja, smeša je zagrejana do 33-43 °C i mešana tokom 6 sati. Dodat je NaOH (20%, 10 L), brzinom kojom se temperatura održava ispod 35 °C. Slojevi su razdvojeni i organski sloj je ispran vodom (6 L). Rastvor je koncentrovan, dodat je etanol (16 L) i smeša je filtrirana kroz dijatomejsku zemlju. Filtrat je koncentrovan i dodat je EtOAc (10 L). Dodata je 4 M HCl u EtOAc (8 L) a dobijeni talog je filtriran i osušen, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (1385 g, 85.6%). ES m/z 327.1 (M+1)

Postupak dobijanja 4

(1-Alil-4-amino-4-(5-brom-2-fluorfenil)pirolidin-3-il)metanol

[0037]

[0038] Zasićeni vodeni rastvor natrijum karbonata je dodat u rastvor 5-alil-6a-(5-brom-2-fluorfenil)heksahidro-1H-pirolo[3,4-c]izoksazol hidrohlorida (1400 g, 3.85 mol) u DCM (7 L), kako bi se dostigla pH>9. Slojevi su razdvojeni a organski ekstrakt je koncentrovan na 1.5 zapreminu. Dodata je sirćetna kiselina (1.38 L) i rastvor je koncentrovan do 2 L. Dodati su sirćetna kiselina (7 L) i cink u prahu (2.5 kg, 38.5 mol) i smeša je zagrejana do 40-50°C i mešana tokom 3 sata. Dodat je EtOAc (9.8L) i smeša je filtrirana kroz dijatomejsku zemlju. Filtraciona pogača je isprana sa EtOAc (4 L). Filtrat je izdvojen, a u pomešane organske faze je dodata voda (7 L). Dodat je amonijum hidroksid kako bi se dostigla pH ≥9. Slojevi su razdvojeni i organski sloj je koncentrovan do 2 L. Dodat je etanol (2.8 L) i rastvor je koncentrovan do 2 L. Dodat je etanol (19 L) i smeša je filtrirana kroz dijatomejsku zemlju, kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova, u obliku rastvora u etanolu, koje se koristi bez dodatnog prečišćavanja.

Postupak dobijanja 5

[(3S,4R)-1-alil-3-(5-brom-2-fluor-fenil)-4-(hidroksimetil)pirolidin-3-il]amonijum;(2S,3S)-4-hidroksi-2,3-bis[(4-metilbenzoil)oksi]-4-okso-butanoat

[0039]

[0040] Monohidrat di-p-toluoil-L-tartarne kiseline (1.04 kg, 2.69 mol) je dodat u rastvor (1-alil-4-amino-4-(5-brom-2-fluorfenil)pirolidin-3-il)metanola (1264 g. 3.85 mmol) u etanolu (21 L). Smeša je zagrejana do 65-75 °C i mešana tokom 3 sata. Smeša je ohlađena do 5-10 °C, dodat je zrnasti kristal [(3S,4R)-1-alil-3-(5-brom-2-fluorfenil)-4-(hidroksimetil)-pirolidin-3-il]amonijum; (2S,3S)-4-hidroksi-2,3-bis[(4-metilbenzoil)oksi]-4-okso-butanoata (1.0 g), i smeša je mešana tokom 3 sata. Talog je filtriran a filtraciona pogača isprana hladnim etanolom (1.4 L). Filtraciona pogača je osušena, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova, u obliku bele čvrste supstance. Hiralna analiza drugog eluiranog izomera: Kolona: IC Chiralpak, 4.6 mm * 250 mm * 5 µm; eluent: 90% heksan (0.3% dietilamin): 10% etanol (0.3% dietilamin); protok od 1.0 mL/min na UV 270 nm potvrđuje enantiomerno obogaćen (99% ee) enantiomer sa Rt= 7.4 minuta, (1050 g, 38%).<1>H NMR(400 MHz, CD3OD) δ 2.40(s, 6H), 3.05-3.04(m, 1H), 3.57-3.31(m, 3H), 3.66-3.58(m,4H), 3.75-3.74(m, 2H), 5.38-5.36(m, 1H), 5.50-5.46(m, 1H), 5.88(s, 2H), 5.97-5.91(m, 1H), 7.10-7.05(m, 1H), 7.29(d, J=8.0 Hz, 4H), 7.53-7.51(m, 1H), 7.80-7.78(m, 1H), 8.01(d, J=8.0 Hz, 4H).

Postupak dobijanja 6

((3R,4S)-1-Alil-4-amino-4-(5-brom-2-fluorfenil)pirolidin-3-il)metanol

[0041]

[0042] 1 N HCl (500 mL, 500 mmol) je dodata u rastvor [(3S,4R)-1-alil-3-(5-brom-2-fluor-fenil)-4-(hidroksimetil)pirolidin-3-il]amonijum; (2S,3S)-4-hidroksi-2,3-bis[(4-metil-benzoil)oksi]-4-okso-butanoata (100 g, 139.4 mmol) u EtOAc (500 mL) na 0 °C. Smeša is je mešana 1 sat. Vodeni sloj je izdvojen i pH vrednost je podešena na 8 pomoću 1 N NaOH. Vodeni sloj je ekstrahovan pomoću EtOAc (350 mL x 2). Organski slojevi su pomešani, isprani vodom (500 mL) i koncentrovani, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (40 g, 87%). Hiralna analiza drugog eluiranog izomera: Kolona: IC Chiralpak, 4.6 mm * 250 mm * 5 µm; eluent: 90% heksan (0.3% dietilamin): 10% etanol (0.3% dietilamin); protok od 1.0 mL/min na UV 270 nm potvrđuje enantiomerno obogaćen (99.7% ee) enantiomer sa Rt= 7.4 minuta.<1>H NMR(400 MHz, CDCl3) δ 2.78-2.70(m, 5H), 3.16-3.00(m, 3H), 3.87-3.75(m, 1H), 3.90-3.84(m, 1H), 5.24-5.11(m, 2H), 5.91-5.87(m, 1H), 6.95-6.91(m, 1H), 7.35-7.32(m, 1H), 7.67-7.65 (m, 1H).

Postupak dobijanja 7

N-(((3S,4R)-1-Alil-3-(5-brom-2-fluorfenil)-4-(hidroksimetil)pirolidin-3-il)carbamothioyl)-benzamid

[0043]

[0044] Benzoil izotiocijanat (15.0 g, 91.9 mmol) je dodat u rastvor ((3R,4S)-1-alil-4-amino-4-(5-brom-2-fluorfenil)pirolidin-3-il)metanola (30 g, 91.1 mmol) u THF (400 mL) na 0 °C. Rastvor je zagrejan do 25 °C i mešan 1 sat, kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova, u obliku rastvora u THF, koje se koristi bez dodatnog prečišćavanja.

Postupak dobijanja 8

N-((4aR,7aS)-6-Alil-7a-(5-brom-2-fluorfenil)-4,4a,5,6,7,7a-heksahidropirolo[3,4-d][1,3]-tiazin-2-il)benzamid, dihidrohlorid

[0045]

[0046] Trifenilfosfin (36.8 g, 140.3 mmol) je dodat u rastvor N-(((3S,4R)-1-alil-3-(5-brom-2-fluorfenil)-4-(hidroksimetil)pirolidin-3-il)karbamotioil)benzamida (91.1 mmol) u THF (400 mL). Dodat je di-t-butil azodikarboksilat (31.6 g, 137.2 mmol) u THF (100 mL). Smeša je mešana na 20-30 °C tokom 2 sata. Smeša je koncentrovana i dodat je MTBE (400 mL). Rastvor je filtriran kroz dijatomejsku zemlju i talog je ispran sa MTBE (130 mL). Filtrati su pomešani i dodata je 1 N HCl u EtOAc (200 mL). Smeša je mešana tokom 2 sata, a zatim koncentrovana do 500 mL. Dodat je MTBE (320 mL) i rastvor je filtriran i ispran heptanom (130 mL). Talog je suspendovan u EtOAc (650 mL) i mešan na 50-60 °C tokom 2 sata. Vruća suspenzija je filtrirana i talog je ispran sa EtOAc (130 mL) i heptanom (130 mL). Talog je ponovo suspendovan u EtOAc (650 mL) i mešan tokom 2 sata na 50-60°C. Vruća suspenzija je filtrirana i isprana sa EtOAc (130 mL) i heptanom (130 mL). Talog je osušen, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova, u obliku di-HCl soli (40 g, 80%, 99.5% ee). Hiralna analiza prvog eluiranog izomera: Kolona: IC Chiralpak, 4.6 mm * 250 mm * 5 µm; eluent: 85% heksan (0.1% dietilamin): 15% izopropil alkohol (0.1% dietilamin); protok od 1.0 mL/min na UV 282 nm potvrđuje enantiomerno obogaćen (99.5% ee) enantiomer sa Rt= 12.5 minuta.

Postupak dobijanja 9

N-((4aR,7aS)-6-Alil-7a-(2-fluor-5-(2,2,2-trifluoracetamido)fenil)-4,4a,5,6,7,7a-heksahidropirolo [3,4-d][1,3]tiazin-2-il)benzamid

[0047]

[0048] 15% Natrijum karbonat (440 mL) je dodat u rastvor N-((4aR,7aS)-6-alil-7a-(5-brom-2-fluorfenil)-4,4a,5,6,7,7a-heksahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il)benzamid dihidrohlorida (495 g, 717.88 mmol) u EtOAc (3 L) i vodi (784 mL). Smeša je mešana tokom 1-2 sata. Slojevi su razdvojeni i organski sloj je filtriran kroz silika gel (40 g) i ispran sa EtOAc (600 mL). Filtrat je koncentrovan do suvog, da bi se dobio N-((4aR,7aS)-6-alil-7a-(5-brom-2-fluorfenil)-4,4a,5,6,7,7a-heksahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il) benzamid. Trifluoracetamid (136.7 g, 1.21 mol), NaI (182.5 g, 1.22 mol), 4 A molekularna sita (342 g), i K2CO3(170.9 g, 1.24 mol) su dodati u rastvor N-((4aR,7aS)-6-alil-7a-(5-brom-2-fluorfenil)-4,4a,5,6,7,7a-heksahidro-pirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il)benzamida (341 g, 494.54 mmol) u DMSO (525 mL) i 1,4-dioksanu (1.025 L). Trans-N,N’-dimetilcikloloheksan (81.6 g, 573.66 mmol) i bakar jodid (27.3 g, 143.34 mmol) u DMSO (500 mL) su dodati u reakcionu smešu. Smeša je mešana tokom 5 minuta. Smeša je zagrejana do 100 °C i mešana tokom 8 sati i ohlađena do 24 °C. Dodati su voda (5.9 L) i DCM (5.91), smeša je filtrirana, a slojevi su razdvojeni. Organski sloj je ispran vodom (5.9 L), kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova, u obliku rastvora u DCM, koje se koristi bez dodatnog prečišćavanja.

Postupak dobijanja 10

N-((4aR,7aS)-6-Alil-7a-(5-amino-2-fluorfenil)-4,4a,5,6,7,7a-heksahidropirolo[3,4-d][1,3]-tiazin-2-il)benzamid, hidrohlorid

[0049]

[0050] Natrijum hidroksid (28.7 g) i voda (2.7 L) su dodati u rastvor N-((4aR,7aS)-6-alil-7a-(2-fluor-5-(2,2,2-trifluoracetamido)fenil)-4,4a,5,6,7,7a-heksahidro-pirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il) benzamida (250 g, 494.4 mmol) u DCM i smeša je mešana na 24 °C tokom 68 sati.1 N HCl (3.5 L) je dodata kako bi se postigla pH vrednost od 1-3. Slojevi su razdvojeni i vodeni sloj je ispran sa DCM (680 mL). U vodeni sloj je dodat DCM (4 L), a nakon toga 21% amonijum hidroksid, kako bi se postigla pH vrednost od 8-10. Slojevi su razdvojeni, a organski ekstrakti pomešani, filtrirani kroz silika gel (170 g) i isprani sa DCM (1.4 L). Rastvarač je koncentrovan do suvog i razblažen sa EtOAc (4 L). Dodata je 1 N HCl u EtOAc (700 mL) na temperaturi nižoj od 25 °C i smeša je mešana 1 sat. Smeša je koncentrovana na približno 7-8 zapremina i dodat je EtOAc (2.8 L). Dobijeni talog je filtriran i ispran sa EtOAc (400 mL). Talog je osušen da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. (246 g, 52%).

Postupak dobijanja 11

N-((4aR,7aS)-7a-(5-Acetamido-2-fluorfenil)-6-alil-4,4a,5,6,7,7a-heksahidropirolo[3,4-d]

[1,3]-tiazin-2-il)benzamid

[0051]

[0052] Anhidrid sirćetne kiseline (23.5g, 0.23 mol) je dodat u rastvor N-((4aR,7aS)-6-alil-7a-(5-amino-2-fluorfenil)-4,4a,5,6,7,7a-heksahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il)benzamid hidrohlorida (100 g, 0.153 mol) i trietillamina (54.3 g, 0.535 mol) u DCM (800 mL). Nakon mešanja tokom 1 sata na 20 - 25 °C, dodati su NaHCO3(700 mL) i voda (600 mL). Slojevi su razdvojeni da bi se dobilo jedinjenje iz naslova, koje se koristi bez dodatnog prečišćavanja, u obliku rastvora u DCM.

Postupak dobijanja 12

N-((4aR,7aS)-7a-(5-Acetamido-2-fluorfenil)-4,4a,5,6,7,7a-heksahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il) benzamid

[0053]

[0054] Trifenilfosfin (4.0g, 0.015 mol) i 1,3-dimetilbarbiturna kiselina (15.2 g, 0.097 mol) su dodati u rastvor N-((4aR,7aS)-7a-(5-acetamido-2-fluorfenil)-6-alil-4,4a,5,6,7,7a-heksahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il)benzamida (0.153 mol) u DCM. Dodat je paladijum acetat (1.7g, 7.7 mmol) i smeša je mešana na 20 do 30 °C tokom 1 sata. Dodat je 25% amonijum hidroksid i slojevi su razdvojeni. Organski sloj je ispran sa HOAc (3.0 equiv u 500 mL vode) i pH vrednost je podešena na 8-9 pomoću 25% amonijum hidroksida. Vodeni sloj je ekstrahovan pomoću DCM (2 x 500 mL). Organski ekstrakti su pomešani i koncentrovani do 3-4 zapremine. Dodat je MTBE (1 L) i smeša je filtrirana. Smeša je koncentrovana i dodat je heptan (1 L). Dobijeni talog je filtriran, sakupljen i osušen, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (48 g, 76%).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.15 (s, 3H), 2.87-2.83(m, 1H), 3.43-3.23(m, 5H), 3.70-3.67(m, 1H), 7.12-7.07 (m, 1H), 7.28-7.27 (m, 1H), 7.52-7.41(m, 4H), 7.79(m, 1H), 8.18-8.16(m, 2H). ES m/z 413.1 (M+1).

Postupak dobijanja 13

N-((4aR,7aS)-7a-(5-Acetamido-2-fluorfenil)-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,6,7,7a-heksahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il) benzamid

[0055]

[0056] 2-Hlor-5-fluorpirimidin (28.9 g, 218 mmol) i kalijum karbonat (33.46 g, 242.1 mmol) su dodati u rastvor N-((4aR,7aS)-7a-(5-acetamido-2-fluorfenil)-4,4a,5,6,7,7a-heksahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il)benzamida (50 g, 121.22 mmol) u DMF (100 mL). Smeša je zagrevana na 80-85 °C tokom 8 sati. Smeša je ohlađena do 24 °C, filtrirana, i isprana sa DMF (100 mL). Talozi su suspendovani u vodi (2 L) i filtrirani, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (68.5g, 98%). LC-MS: m/z=509.2 (M+1)+,<1>H NMR (400 MHz, d6-DMSO) δ ppm 1.22 (t, J= 7.28 Hz, 2 H) 1.92 - 2.07 (m, 6 H) 2.89 - 3.20 (m, 2 H) 3.36 - 3.44 (m, 1 H) 3.67 (t, J=9.54 Hz, 1 H) 3.84 (br. s., 1 H) 4.16 (br. s., 2 H) 7.23 (br. s., 2 H) 7.35 - 7.61 (m, 8 H) 7.77 (br. s., 2 H) 7.85 - 8.18 (m, 4 H) 8.48 (s, 4 H) 10.15 (br. s., 1 H) 10.46 - 10.59 (m, 1 H).

Postupak dobijanja 14

(4aR,7aS)-7a-(5-Amino-2-fluorfenil)-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,6,7,7a-heksahidropirolo[3,4-d] [1,3]tiazin-2-amin

[0057]

[0058] Litijum hidroksid (8.6 g, 204.9 mmol) je dodat u rastvor N-((4aR,7aS)-7a-(5-acetamido-2-fluorfenil)-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,6,7,7a-heksahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il)benzamida (80 g, 157.3 mmol) u metanolu (400 mL). Smeša je zagrevana na 60-70 °C tokom 4 sata. Dodata je koncentrovana HCl (132 g) i smeša je mešana na 55 °C tokom 18 sati. Smeša je ohlađena do 30 °C i koncentrovana, kako bi se uklonio metanol. Dodata je voda i vodeni sloj je ekstrahovan pomoću DCM (3x), kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova, u obliku vodenog rastvora mase 920 g, pri čemu 5.6% od ukupne mase čini jedinjenje iz naslova, koje se koristi bez dodatnog prečišćavanja.

Postupak dobijanja 15

Benzil N-alil-N-(2,2-dimetoksiethyl)karbamat

[0059]

[0060] Rastvor benzil N-(2,2-dimetoksietil)karbamata (50 g, 208.9 mmol) u toluenu (180 mL) je tretiran čvrstim kalijum hidroksidom (51.6 g, 919.69 mmol) pod azotom. Nakon 10 minuta, dodat je benziltrietilamonijum hlorid (0.8 g, 3.1 mmol). Nakon još 10 minuta, dodat je rastvor alil bromida (33 g, 272.8 mmol) u toluenu (50 mL), kap po kap, tokom 10 minuta. Dobijena smeša je mešana na 50 °C tokom 48 sati. Smeša je ohlađena do sobne temperature i dodata je voda. Organski sloj je izdvojen, ispran koncentrovanim slanim rastvorom, osušen preko magnezijum sulfata i koncentrovan do suvog, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (44 g, 75%). ES/MS (m/e): 280 (M+H).

Postupak dobijanja 16

Benzil N-alil-N-(2-oksoetil)karbamat

[0061]

[0062] Rastvor benzil N-alil-N-(2,2-dimetoksietil)karbamata (30 g, 107 mmol) u mravljoj kiselini (36.8 mL, 860 mmol) i vodi (4.84 mL) je mešan na sobnoj temperaturi, preko noći. Smeša je koncentrovana i razblažena sa heksani/EtOAc (1:2) i vodom. Organski sloj je izdvojen, ispran koncentrovanim slanim rastvorom do dostizanja pH=6, i osušen preko natrijum sulfata. Rastvarač je evaporisan, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (25 g, 99%). ES/MS (m/e): 234 (M+H).

Postupak dobijanja 17

Benzil N-alil-N-[2-hidroksiiminoethyl]karbamat

[0063]

[0064] Rastvor benzil N-alil-N-(2-oksoetil)karbamata (25 g, 107 mmol) u acetonitrilu (150 mL) je tretiran hidroksilamin hidrohloridom (9.68 g, 139 mmol) i rastvorom natrijum acetat trihidrata (16 g, 117.9 mmol) u vodi (75 mL). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Acetonitril je evaporisan, a vodeni rastvor ekstrahovan pomoću EtOAc. Organski sloj je izdvojen i osušen preko magnezijum sulfata i koncentrovan pod vakuumom, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (24 g, 90%). ES/MS (m/e): 249 (M+H).

Postupak dobijanja 18

Benzil 3 ,3a,4,6-tetrahidropirolo[3 ,4-c]izoksazol-5-karboksilat

[0065]

[0066] Rastvor benzil N-alil-N-[2-hidroksiiminoetil]karbamata (24 g, 96.6 mmol) u DCM (338 mL) je tretiran, kap po kap, tokom 10 minuta 5% w/w vodenim rastvorom natrijum hipohlorita (106.08 mmol, 143.06 mL). Dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi, preko noći. Reakcija je zaustavljena dodatkom 40 % vodenog rastvora natrijum bisulfita (7 g). Organski sloj je izdvojen, osušen preko magnezijum sulfata i koncentrovan pod vakuumom. Sirovi proizvod je prečišćen pomoću silika gela, eluiranjem sa 5 % EtOAc u heksanima, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (18 g, 75 %). ES/MS (m/e): 247 (M+H).

Postupak dobijanja 19

Benzil 6a-(5-brom-2-fluor-fenil)-3,3a,4,6-tetrahidro-1H-pirolo[3,4-c]izoksazol-5 karboksilat

[0067]

[0068] 1.6 M rastvor n-butil litijuma (25.4 mL, 40.6 mmol) u heksanima, je dodat, kap po kap, u rastvor temperature -78 °C 4-brom-1-fluor-2-jodbenzena (12.22 g, 40.6 mmol) u THF (60 mL), da bi se dobio žuti rastvor, koji je mešan na -78 °C tokom 15 minuta. Bor trifluorid eterat (5.14 mL, 40.6 mmol) je dodat u poseban rastvor, temperature -78 °C, benzil 3,3a,4,6-tetrahidro-pirolo[3,4-c]izoksazol-5-karboksilata (5 g, 20.3 mmol) u THF (60 mL) i smeša je mešana na -78 °C tokom 5 minuta. Ovaj rastvor je dodat u prethodno pripremljenu organolitijumsku smešu temperature -78 °C, putem kanile. Kombinovana smeša je mešana tokom 30 minuta na -78 °C. U smešu je dodat zasićeni vodeni amonijum hlorid i zagrejana je do sobne temperature. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (3 x) i organski ekstrakti su pomešani, osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani, a rastvarač je uklonjen pod vakuumom. Sirovi proizvod je prečišćen pomoću silika gela, gradijentom od 5% do 100% EtOAc u heksanima, tokom 35 minuta, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (2.27 g, 27%). ES/MS (m/e): (<79>Br/<81>Br) 421/423 (M+H).

Postupak dobijanja 20

Benzil 1-(benzoilkarbamotioil)-6a-(5-brom-2-fluor-fenil)-3,3a,4,6-tetrahidropirolo[3,4-c]izoksazol-5-karboksilat

[0069]

[0070] Benzoil izotiocijanat (2.87 mL, 21.28 mmol) je dodat, kap po kap, u rastvor benzil 6a-(5-brom-2-fluorfenil)-3,3a,4,6-tetrahidro-1H-pirolo[3,4-c]izoksazol-5-karboksilata (5.977 g, 14.2 mmol) u THF (95 mL) i smeša je mešana preko noći, pod azotom. Rastvarač je uklonjen pod vakuumom. Sirovi proizvod je prečišćen pomoću silika gela, gradijentom od 5% do 100% EtOAc u heksanima, tokom 30 minuta, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (6.05 g, 73%). ES/MS (m/e): (<79>Br/<81>Br) 584/586 (M+H).

Postupak dobijanja 21

Benzil 3-(benzoilkarbamotioilamino)-3-(5-brom-2-fluor-fenil)-4-(hidroksimetil)pirolidin-1-karboksilat

[0071]

[0072] Smeša benzil 1-(benzoilkarbamotioil)-6a-(5-brom-2-fluor-fenil)-3,3a,4,6-tetrahidropirolo[3,4-c]izoksazol-5-karboksilata (6.05 g 10.4 mmol) i cinka (prašina, <10 mikrona) (6.77 g, 103.5 mmol) je mešana u sirćetnoj kiselini (52 mL) na sobnoj temperaturi, preko noći, pod azotom. Reakciona smeša je razblažena sa EtOAc i filtrirana kroz dijatomejsku zemlju. Rastvarač je uklonjen pod vakuumom, a ostatak je razblažen sa EtOAc, vodon, i zasićenim vodenim natrijum bikarbonatom. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (3 x), pomešani organski slojevi su osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani i rastvarač je uklonjen pod vakuumom. Sirovi proizvod je prečišćen pomoću silika gela, gradijentom od 5% do 100% EtOAc u heksanima, tokom 30 minuta, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (5.222 g, 86%). ES/MS (m/e): (<79>Br/<81>Br) 586/588 (M+H).

Postupak dobijanja 22

Benzil 2-benzamido-7a-(5-brom-2-fluor-fenil)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-6-karboksilat

[0073]

[0074] 1,1’-karbonildiimidazol (2.87 g, 17.7 mmol) je dodat u rastvor benzil 3-(benzoilkarbamotioilamino)-3-(5-brom-2-fluor-fenil)-4-(hidroksimetil)pirolidin-1-karboksilata (5.198 g, 8.86 mmol) u THF (52 mL). Smeša je mešana tokom 1.5 sati, na sobnoj temperaturi, nakon čega je reakciona smeša zagrevana uz refluks preko noći, pod azotom. Reakciona smeša je ohlađena, razblažena vodom i ekstrahovana sa EtOAc (3 x). Organski slojevi su pomešani, osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani, a rastvarač je uklonjen pod vakuumom. Sirovi proizvod je prečišćen pomoću silika gela, gradijentom od 5% do 100% EtOAc u heksanima, tokom 30 minuta, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (2.93 g, 58%). ES/MS (m/e): (<79>Br/<81>Br).568/570 (M+H).

Postupak dobijanja 23

N-[7a-(5-Brom-2-fluor-fenil)-4a,5,6,7-tetrahidro-4H-pirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamid

[0075]

[0076] Jodtrimetilsilan (2.21 mL, 15.46 mmol) je dodat, kap po kap, u rastvor, sobne temperature, benzil 2-benzamido-7a-(5-brom-2-fluor-fenil)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3] tiazin-6-karboksilata (2.93 g, 5.15 mmol) u acetonitrilu (44 mL). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi, tokom dva sata, a rastvarač je uklonjen pod vakuumom. Sirovi proizvod je prečišćen u SCX koloni, primenom 3:1 DCM:metanol a zatim 2:1 DCM:7 N amonijak u metanolu, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (2.098 g, 94%). ES/MS (m/e): (<79>Br/<81>Br) 434/436 (M+H).

Postupak dobijanja 24

terc-Butil 2-benzamido-7a-(5-brom-2-fluor-fenil)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-6-karboksilat

[0077]

[0078] Di-t-butildikarbonat (1.16 g, 5.31 mmol) i trietilamin (1.01 mL, 7.25 mmol) su dodati u rastvor N-[7a-(5-brom-2-fluor-fenil)-4a,5,6,7-tetrahidro-4H-pirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamida (2.098 g, 4.83 mmol) u DCM (48 mL). Reakciona smeša je mešana tokom 1 sata, na sobnoj temperaturi, pod azotom. Rastvarač je uklonjen pod vakuumom i sirovi proizvod je prečišćen pomoću silika gela, gradijentom od 5% do 100% EtOAc u heksanima, tokom 30 minuta, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (2.556 g, 99%). ES/MS (m/e): (<79>Br/<81>Br) 534/536 (M+H).

Postupak dobijanja 25

terc-Butil 7a-(5-amino-2-fluor-fenil)-2-benzamido-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-6-karboksilat

[0080] Rastvor terc-butil 2-benzamido-7a-(5-brom-2-fluor-fenil)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d] [1,3]tiazin-6-karboksilata (2.556 g, 4.8 mmol) i trans-N,N’-dimetil-1,2-cikloloheksandiamina (150 mg, 1.1 mmol) u etanolu (50 mL) je tretiran natrijum azidom (933 mg, 14.3 mmol). Dodati su vodeni rastvor natrijumove soli L-askorbinske kiseline (0.66 M, 3.2 mL, 2.1 mmol) i voda (1 mL) i vrh flaše je prečišćen azotom. Smeša je tretirana vodenim rastvorom bakar(II)sulfat pentahidrata (0.33 M, 3.2 mL, 1.1 mmol) i smeša je odmah zagrevana na ploči, prethodno zagrejanoj na 80 °C, tokom 1.5 sati, pod azotom. Nakon zagrevanja dobijena je homogena smeša. Reakciona smeša je ohlađena, razblažena ledenom vodom i ekstrahovana pomoću EtOAc (3 x). Organski ekstrakti su pomešani i osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani, i rastvarač je uklonjen pod vakuumom, da bi se dobio sirovi azidni proizvod. Sirovi azidni proizvod je pomešan sa 10% paladijumom na ugljeniku (1 g) u hladnom etanolu (150 mL) i smeša je prečišćena pomoću vakuuma/azota a zatim vakuuma/vodonika. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi, pod 30 psi vodonika, tokom 5 sati. Reakcioni sud je otvoren, a reakciona smeša filtrirana kroz dijatomejsku zemlju i filtraciona pogača je isprana sa DCM. Rastvarač je uklonjen iz filtrata pod vakuumom, a sirovi proizvod je prečišćen pomoću silika gela, primenom 50% EtOAc u DCM, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (2.014 g, 89%). ES/MS (m/e): 471 (M+H).

Postupak dobijanja 26

N-[7a-(5-Amino-2-fluor-fenil)-4a,5,6,7-tetrahidro-4H-pirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il] benzamid

[0081]

[0082] Trifluorsirćetna kiselina (10 mL) je dodata u rastvor terc-butil 7a-(5-amino-2-fluor-fenil)-2-benzamido-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-6-karboksilata (2.013 g, 4.28 mmol) u DCM (30 mL) i smeša je mešana na sobnoj temperaturi pod azotom tokom 4 sata. Rastvarač je uklonjen pod vakuumom i sirovi proizvod je prečišćen u SCX koloni, pomoću 3:1 DCM:metanol a zatim 2:1 DCM:7 N amonijak u metanolu, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (1.555 g, 98%). ES/MS (m/e): 371 (M+H).

Postupak dobijanja 27

N-[7a-(5-Amino-2-fluor-fenil)-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamid

[0083]

[0084] Rastvor N-[7a-(5-amino-2-fluor-fenil)-4a,5,6,7-tetrahidro-4H-pirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il] benzamida (705 mg, 1.90 mmol), 5-fluor-2-hlorpirimidina (1.01 g, 7.61 mmol), i DIPEA (1.66 mL, 9.52 mmol) je zagrevan u 1,4-dioksanu (20 mL), uz refluks, tokom to 4 sata, pod azotom. Reakciona smeša je ohlađena, razblažena vodom i ekstrahovana pomoću EtOAc (3 x). Organski slojevi su pomešani, osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani i rastvarač je uklonjen pod vakuumom, da bi se dobio sirovi proizvod. Sirovi proizvod je prečišćen pomoću silika gela, gradijentom od 5% do 100% EtOAc u heksanima, tokom 25 minuta, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (590 mg, 66%). ES/MS (m/e): 467 (M+H).

Postupak dobijanja 28

N-[(4aR,7aS)-7a-(5-Amino-2-fluor-fenil)-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d] [1,3]tiazin-2-il]benzamid, (izomer 1)

[0085]

[0086] Racemski N-[7a-(5-amino-2-fluor-fenil)-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo [3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamid (1.694 g, 3.63 mmol) je prečišćen pomoću hiralne HPLC (Kolona: Chiralcel OJ, 8 x 35 cm; eluent: 90 % metanol (0.2 % dimetiletilamin) i 10% acetonitril; protok 400 mL/min na UV 280 nm). Analiza prvog eluiranog izomera (Kolona: Chiralcel OJ-H 0.46 x 15 cm; eluent: 10:90 acetonitril:metanol (sa 0.2% dimetiletilamina); protok: 0.6 mL/min na UV 280 nm) potvrđuje enantiomerno obogaćen (99% ee) enantiomer sa Rt= 6.70 minuta, (723 mg, 43%). ES/MS (m/e): 467 (M+H).

Postupak dobijanja 29

N-[3-[(4aR,7aS)-2-Benzamido-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluorfenil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamid, (izomer 1)

[0088] N-[(4aR,7aS)-7a-(5-Amino-2-fluor-fenil)-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo [3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamid, izomer 1 (0.361 g, 0.77 mmol) je rastvoren u smeši DCM (4 mL) i DMF (0.5 mL). U smešu su dodati 5-metoksipirazin-2-karboksilna kiselina (240 mg, 1.55 mmol), HOBT (210 mg, 1.55 mmol) i EDCI (300 mg, 1.55 mmol) i smeša je mešana preko noći, na sobnoj temperaturi. Reakcioni rastvor je dodat direktno u kolonu napunjenu sa 12 g silika gela i prečišćen korišćenjem kolone sa 40 g silika gela, eluiranjem gradijentom 0-100% EtOAc/heksani. Proizvod je rastvoren u EtOAc (200 mL), ispran sa 1 N NaOH (2 x 50 mL), i zasićenim slanim rastvorom (1 x 50 mL). Prečišćavanje pomoću silika gela je ponovoljeno na prethodno opisan način, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (350 mg, 74%). ES/MS (m/e): 603 (M+H).

Postupak dobijanja 30

5-Alil-6a-(2-fluorfenil)-3,3a,4,6-tetrahidro-1H-pirolo[3,4-c]izoksazol

[0089]

[0090] Korak hemijske reakcije u protočnom reaktoru: Bešavni, cevasti reaktor od nerđajućeg čelika, zapremine 343 ml (S.P=1/8 inča) je postavljen u gasno hromatografsku peć (GH) i ispiran toluenom, protokom od 20 mL/min, tokom 20 minuta. Primeniti povratni pritisak azota (720 psig) i podesiti temperaturu GH na 210 °C. Nakon dostizanja temperature od 210 °C, rastvor 2-(dialilamino)-1-(2-fluorfenil)etanon oksima (480.51 g, 1.74 mol) u toluenu (5.81 L) se upumpava kroz reaktor protokom od 22.866 mL/min, pomoću para špric pumpi visokog pritiska, koje rade u kontinualnom režimu, kako bi se postiglo vreme zadržavanja od 15 minuta. Kada se potroši sav rastvor, reaktor se ispira toluenom, protokom od 22.866 mL/min, tokom 30 minuta. Temperatura GH peći se podešava na 25 °C i kompletan rastvor se sakuplja i koncentruje pod vakuumom. Rastvarač se evaporiše, a ostatak rastvara u metilen hloridu (2.5 L) i vodi (5 L). pH vrednost se podešava na 1, pomoću hlorovodonične kiseline, a vodeni sloj se izdvaja i neutrališe pomoću natrijum hidroksida, kako bi se pH vrednost podesila na 10. Vodeni sloj se ekstrahuje pomoću MTBE (3 x 2.5 L). Organski ekstrakti se mešaju, suše preko natrijum sulfata, filtriraju, i evaporišu do suvog, da bi se dobilo sirovo jedinjenje iz naslova (248 g, 47%), koje se koristi bez dodatnog prečišćavanja. ES/MS (m/e): 249 (M+1).

Postupak dobijanja 31

1-Alil-4-amino-4-(2-fluorfenil)pirolidin-3-il]metanol

[0091]

[0092] Cink u obliku prašine (590 g, 9 mol), je dodat u rastvor 5-alil-6a-(2-fluorfenil)-3,3a,4,6-tetrahidro-1H-pirolo[3,4-c]izoksazola (3559 g, 1.29 mol) u smeši metanola (2.85 L) i zasićenog vodenog rastvora amonijum hlorida (3.56 L) i smeša je zagrevana tokom 16 sati na 70 °C. Reakciona smeša je ohlađena do 60 °C, razblažena sa THF (2.85 L), i filtrirana dok je vruća, kroz dijatomejsku zemlju. Filtrat je evaporisan, kako bi se uklonio organski rastvarač, a vodena smeša je razblažena 10% w/w vodenim rastvorom limunske kiseline (4 L) i EtOAc (3.5 L). Organski sloj je izdvojen, a vodeni sloj ispran sa EtOAc (2 x 2 L). Vodeni sloj je neutralisan pomoću natrijum hidroksida 50% w/w, kako bi se pH vrednost podesila na 10, a zatim je ekstrahovan pomoću EtOAc (2 x 1.5 L). Organski ekstrakti su pomešani, osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani, i evaporisani do suvog, kako bi se dobilo sirovo jedinjenje iz naslova (299 g, 92%). ES/MS (m/e): 251 (M+1).

Postupak dobijanja 32

[(3R,4S)-1-Alil-4-amino-4-(2-fluorfenil)pirolidin-3-il]metanol;2,3-bis[(4-metilbenzoil)-oksi] butandionska kiselina

[0093]

[0094] Rastvor di-p-toluoil-L-tartarne kiseline (348.6 g, 884 mmol) u 1-metoksi-2-propanolu (1.13 L) je dodat u rastvor [(3R,4S)-1-alil-4-amino-4-(2-fluorfenil)pirolidin-3-il]metanola (225.9 g, 902 mmol), u 1-metoksi-2-propanolu (1.13 L), koji je prethodno zagrejan na 40 °C. Reakciona smeša je ohlađena do 22 °C i mešana tokom 18 sati. Beli talog je sakupljen filtracijom i ispran 1-metoksi-2-propanolom (600 ml). Sakupljeni talog je osušen, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (183.01 g, 31.8%). ES/MS (m/e): 251 (M+1).

Postupak dobijanja 33

[(3R,4S)-1-Alil-4-amino-4-(2-fluorfenil)pirolidin-3-il]metanol

[0095]

[0096] [(3R,4S)-1-Alil-4-amino-4-(2-fluorfenil)pirolidin-3-il]metanol;2,3-bis[(4-metilbenzoil)oksi] butandionska kiselina (211 g, 331 mmol) je rastvorena u vodi (2.1 L) i EtOAc (2.3 L). Dodata je 35% w/w hlorovodonična kiselina, kako bi se pH vrednost podesila na 1. Vodeni sloj je izdvojen, pH vrednost je podešena na 10 pomoću 50% w/w natrijum hidroksida, i ekstrahovan je pomoću EtOAc (2x). pH vrednost vodenog sloja je podešena na 10 pomoću vodenog NaOH, i ekstrahovana sa MTBE (3x), pri čemu je pH vrednost vodenog rastvora održavana na pH=10. Organski ekstrakti su pomešani, osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani, i koncentrovani do suvog, da bi se dobilo sirovo jedinjenje iz naslova, (73 g, 88%, 94.8% ee). Proizvod je analiziran pomoću hiralne hromatografije: Kolona AS-H, eluent 10% izopropil alkohol, 2% izopropil amin; protok od 3 mL/min na UV 220; pritisak 100 bar na 35 °C, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova, kao drugi eluirani izomer Rt= 2.26 minuta. ES/MS (m/e): 251 (M+1).

Postupak dobijanja 34

N-[(4aR,7aS)-6-Alil-7a-(2-fluorfenil)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il] benzamid

[0097]

[0098] Rastvor [(3R,4S)-1-alil-4-amino-4-(2-fluorfenil)pirolidin-3-il]metanola (129.7 g, 414 mmol) u THF (2,3L) je ohlađen do 0 °C, u atmosferi azota. Dodat je benzoil izotiocijanat (61.5 mL, 456 mmol), pri čemu je temperatura održavana ispod 5 °C. Reakciona smeša je zagrejana do sobne temperature i tako držana 3 sata, dodat je 1,1’-karbonildiimidazol (87.4 g, 538.9 mmol) i reakciona smeša je mešana na 22 °C tokom 1 sata, nakon čega je zagrevana na 70 °C, tokom 16 sati. Reakciona smeša je ohlađena do 22 °C i rastvarač je evaporisan. Ostatak je podeljen između EtOAc (1 L) i vode (1 L). Organski sloj je izdvojen, a vodeni sloj je ekstrahovan pomoću EtOAc (2 x 400 mL). Organski slojevi su pomešani, osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani, i evaporisani do suvog, kako bi se dobilo sirovo jedinjenje iz naslova. Sirovi sloj je prečišćen pomoću hromatografije, sa silika gelom, eluiranjem gradijentom EtOAc / DCM od 0-40% DCM, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova, u vidu svetložute čvrste supstance (170 g, 99%), koja sadrži zaostali rastvarač. ES/MS (m/e): 396 (M+1).

Postupak dobijanja 35

N-[(4aR,7aS)-7a-(2-Fluorfenil)-4a,5,6,7-tetrahidro-4H-pirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il] benzamid

[0100] 2-merkapto-benzoeva kiselina (122 g, 793 mmol), bis(dibenzilidenaceton)paladijum (4.15 g, 7.21 mmol), i 1,4-bis(difenilfosfino)butan (3.14 g, 7.21 mmol) su dodati u rastvor N-[(4aR,7aS)-6-alil-7a-(2-fluorfenil)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamida (178.21 g, 360 mmol) u anhidrovanom 2-metiltetrahidrofuranu (1.96 L), u atmosferi azota. Rastvor je degaziran u ciklusima pod vakuumom / azotom, tri puta, a zatim je kroz reakcionu smešu propuštan azot, tokom 15 minuta. Reakciona smeša je zagrejana do 40 °C, dok je kroz nju propuštan azot. Kada je temperatura reakcione smeše dostigla 40 °C, propuštanje je završeno, a reakciona smeša je mešana na 40 °C tokom 3 sata, u atmosferi azota. Reakciona smeša je ohlađena do 22 °C i razblažena vodom (2 L). Dodat je rastvor HCl (5 M) kako bi se pH vrednost podesila na 1. Vodeni sloj je izdvojen i ispran dodatnim EtOAc (2 x 800 mL). pH vrednost vodenog sloja je podešena na 10 pomoću natrijum hidroksida 50% w/w, a nakon toga je ekstrahovana pomoću EtOAc (10 L). Vodeni sloj je ispran dodatnim EtOAc (2 x 750 mL). Organski ekstrakti su pomešani, isprani zasićenim slanim rastvorom, osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani, i evaporisani do suvog, da bi se dobilo sirovo jedinjenje iz naslova, u obliku svetložute čvrste supstance (124.7 g, 97%). ES/MS (m/e): 356 (M+1).

Postupak dobijanja 36

N-[(4aR,7aS)-7a-(2-Fluorfenil)-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamid

[0101]

[0102] Rastvor N-[(4aR,7aS)-7a-(2-fluorfenil)-4a,5,6,7-tetrahidro-4H-pirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il] benzamida (124.7 g, 256 mmol), DIPEA (67 mL), 5-fluor-2-hlorpirimidina (29.3 ml, 307 mmol) u N-metilpirolidonu (997 mL) je zagrevan na 100 °C tokom 16 sati. Reakciona smeša je ohlađena do 22 °C i sipana u vodu ohlađenu na 10 °C (10 L), uz održavanje temperature ispod 15 °C. Svetlobež čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i dodatno isprana vodom. Vlažni talog je rastvoren u EtOAc (2 L) i prebačen u separacioni levak. Dodat je 5% w/w vodeni rastvor natrijum hlorida (1 L) i organski sloj je izdvojen, osušen preko natrijum sulfata i filtriran, a filtrat je evaporisan pod sniženim pritiskom. Proizvod je prečišćen hromatografijom, uz upotrebu silika gela, gradijentom od 0-40% EtOAc/isoheksan, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova, u obliku svetložute čvrste supstance (116 g, 70%). ES/MS (m/e): 452 (M+1).

Postupak dobijanja 37

(4aR,7aS)-7a-(2-fluorfenil)-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]-tiazin-2-amin

[0103]

[0104] Litijum hidroksid (9.26 g, 386 mmol) je dodat u smešu N-[(4aR,7aS)-7a-(2-fluorfenil)-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamida (158.6 g, 351.6 mmol), u metanolu (1.6 L). Smeša je zagrevana na 70 °C tokom 4 sata, a zatim ohlađena do 22 °C.

Reakciona smeša je evaporisana pod vakuumom, do žutog taloga. Talog je podeljen između vode (1 L) i EtOAc (750 mL). Dodata je HCl (5 M vodeni rastvor), kako bi se pH vrednost podesila na 1. Vodeni sloj je izdvojen, a organski sloj ispran sa EtOAc (2 x 200 mL). pH vrednost vodenog sloja je podešena na pH=10, pomoću 50% w/w vodenog rastvora natrijum hidroksida i ekstrahovan je pomoću EtOAc (3 x 1 L). Organski ekstrakti su pomešani, osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani, i evaporisani pod sniženim pritiskom, da bi se dobilo sirovo jedinjenje iz naslova, u obliku svetložute čvrste supstance (133.3 g, 99%, sadrži 12% ostatnog EtOAc). ES/MS (m/e): 348 (M+1).

Postupak dobijanja 38

(4aR,7aS)-7a-(5-Amino-2-fluorfenil)-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3] tiazin-2-amin

[0105]

[0106] Sumporna kiselina (33.4 ml, 626.6 mmol) je dodata u rastvor (4aR,7aS)-7a-(2-fluorfenil)-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-amina (45.8 g, 125,3 mmol) u trifluorsirćetnoj kiselini (626 mL). Smeša je ohlađena do 0 °C i mešana tokom 20 minuta. Dodata je pušljiva azotna kiselina (6.2 mL, 144.1 mmol) i reakciona smeša je zagrejana do 22 °C and i mešana tokom 3 sata. Reakciona smeša je evaporisana, dodat je MTBE (250 mL) i još dva puta je evaporisana. Ostatak je osušen pod vakuumom do konstantne težine, a zatim rastvoren u vodi (147 mL) i etanolu (885 mL) i degaziran ubrizgavanjem azota tokom 15 minuta. Rastvor je prebačen u reaktor pod pritiskom i dodat je 10% Pd/C u obliku paste 87L (6.6 g, 6.27 mmol). Smeša je dodatno razblažena etanolom (700 mL) i održavana pod pritiskom vodonika od 80 psi tokom 16 sati.

Reakciona smeša is filtrirana, a zatim je dodata druga šarža katalizatora 10% Pd/C u obliku paste 87L (6.6 g, 6.27 mmol) i smeša je održavana pod pritiskom od 80 psi i mešana 3 dana u reaktoru pod pritiskom. Reakciona smeša je prečišćena azotom i filtrirana kroz dijatomejsku zemlju. Filtrat is evaporisan, a ostatak podeljen između vode (200ml) i EtOAc (200 ml). Vodeni sloj je izdvojen, ohlađen do 5 °C, i neutralisan amonijum hidroksidom 15% w/w. Vodeni sloj je ekstrahovan pomoću EtOAc (3 x 150 mL). Organski slojevi su pomešani, osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani i evaporisani pod sniženim pritiskom, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova, u obliku svetlosmeđe čvrste supstance (47.7 g, 99% sadrži zaostali EtOAc). ES/MS (m/e): 363 (M+1).

Primer 1

N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7ail]-4-fluor-fenil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamid hidrohlorid.

[0107]

[0108] N-[3-[(4aR,7aS)-2-Benzamido-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d] [1,3]tiazin-7a-il]-4-fluor-fenil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamid, izomer 1 (0.350 g, 0.58 mmol) je rastvoren u THF (2 mL), nakon čega su dodati metanol (4 mL) i etanol (4 mL). Dodati su O-metilhidroksilamin hidrohlorid (495 mg, 5.81 mmol) i piridin (470 µL, 5.81 mmol) i reakciona smeša je zagrejana na 50 °C i mešana preko noći. Dodat je silika gel (~10 g) i reakciona smeša je koncentrovana. Uzorak, osušen na silika gelu, je ubačen u prazni kertridž i prečišćen eluiranjem gradijentom od 0-10% 7 N rastvor amonijaka u metanolu u DCM. Proizvod je prečišćen drugi put u SCX koloni, primenom 3:1 DCM:metanol, a zatim 2:1 DCM:7 N rastvor amonijaka u metanolu.

Proizvod je poslednji put prečišćen pomoću silika gela, gradijentom od 0% do 10% 7 N rastvora amonijaka u metanolu u DCM, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova u obliku slobodne baze. Ova materija je rastvorena u DCM (5 mL) i dodat je 1 M hlorovodonik u dietil etru (0.20 mL, 660 mmol). Rastvarač je uklonjen pod vakuumom, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (71 mg, 23%). ES/MS (m/e): 498 (M+H).

Rendgenska difrakcija praha (XRD)

[0109] XRD spektri kristalnih čvrstih supstanci su dobijeni pomoću Bruker D4 Endeavor rendgenskog difraktometra praha, opremljenog izvorom CuKa λ = 1.54060 Å i Vantec detektorom, koji radi sa 35 kV i 50 mA. Uzorak je skeniran između 4 i 40° u 2θ, sa veličinom koraka od 0.009° u 2θ i brzinom skeniranja od 0.5 sekundi/koraku, divergencijom od 0.6 mm, fiksiranom rešetkom za sprečavanje rasejanog zračenja od 5.28 i detekcionim prorezima od 9.5 mm. Suvi prah je postavljen na kvarcni držač uzoraka, a ravna površina je dobijena pomoću staklene pločice. Difrakcioni spektri kristalne supstance su dobijeni na sobnoj temperaturi i relativnoj vlažnosti. U kristalografiji je dobro poznato da za bilo koji dati kristalni oblik, relativni intenziteti difrakcionih pikova mogu varirati usled poželjne orijentacije, koja je rezultat faktora kao što su morfologija i habitus kristala. Kada su prisutni efekti poželjne orijentacije, intenziteti pikova su izmenjeni, ali su karakteristične pozicije pikova neizmenjene. Vidi, npr., The United States Pharmacopeia #23, National Formulary #18, strane 1843-1844, 1995. Osim toga, u kristalografiji je dobro poznato da za svaki dati kristalni oblik, ugaone pozicije pikova mogu neznatno da variraju. Na primer, pozicije pikova se mogu pomeriti usled varijacija temperature ili vlažnosti, pri kojima se analizira uzorak, pomeranja uzorka ili prisustva ili odsustva internog standarda. U ovom slučaju, varijabilnost položaja pika od ± 0.2 u 2θ, uzima u obzir ove potencijalne varijacije, a ne utiče na nedvosmislenu identifikaciju naznačenog kristalnog oblika. Kristalni oblik se može potvrditi na osnovu jedinstvene kombinacije karakterističnih pikova (u jedinicama ° 2θ), obično najistaknutijih pikova. Difrakcioni spektri kristalnog oblika, dobijeni na sobnoj temperaturi i relativnoj vlažnosti su podešene na osnovu NIST 675 standardnih pikova na 8.853 i 26.774 stepeni 2-teta.

Primer 1a

Kristalni oblik 1 N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d] [1,3]tiazin-7a-il]-4-fluor-fenil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamida

[0110]

[0111] N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]-tiazin-7a-il]-4-fluor-fenil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamid (201 mg, 403.20 mmol) je pomešan sa 4 mL butil acetata i mešan na ploči za mešanje na 120°C. Talog se rastvara nakon približno 5 minuta, dajući transparentan, bezbojan rastvor. Uzorak se zatim hladi do sobne temperature i bela čvrsta supstanca se taloži iz rastvora. Uzorak se zatim suspenduje na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta, dajući gustu suspenziju bele čvrste supstance. Bela čvrsta supstanca se izdvaja filtracijom pod vakuumom i suši pod strujom vazduha tokom 5 minuta. Dobijeni talog bele čvrste supstance se prebacuje u tariranu bočicu, koja se drži u vakuumskoj peći na 60°C, preko vikenda, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (110 mg). Kristalni oblik 1 N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluor-fenil]-5-metoksipirazin-2-karboksamida je u stabilnoj kristalnoj formi na sobnoj temperaturi i pri relativnoj vlažnosti manjoj od približno 15%.

Primer 1b

Kristalni oblik 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d] [1,3]tiazin-7a-il]-4-fluor-fenil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamida (hidratisanog)

[0112] Oksalil hlorid (888 µL, 10.2 mmol) je dodat u rastvor 5-metoksipirazin-2-karboksilne kiseline (1.6 g, 10.2 mmol) u acetonitrilu (53 mL) i DMF (848 µL). Nakon 15 minuta, sveže pripremljen rastvor se dodaje u rastvor (4aR,7aS)-7a-(5-amino-2-fluorfenil)-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-amina (2.65 g, 7.3 mmol) u smeši vode (53 mL) i etanola (53 mL), koji je prethodno zagrejan na 50 °C. Reakciona smeša se meša na 50 °C 1 sat, hladi do 22 °C, a zatim meša preko noći, na ovoj temperaturi. Organski ratsvarač se evaporiše pod vakuumom a vodena smeša tretira 50% w/w vodenim rastvorom natrijum hidroksida, da bi se podesila vrednost pH=10. Izdvaja se svetlobež čvrsta supstanca, koja se dodatno ispira vodom. Talog se razblažuje izopropil alkoholom (2 x) i rastvarač se evaporiše. Sirova materija se prečišćava hromatografijom uz primenu silika gela, gradijentom amonijak u metanolu (2 N) / metilen hlorid. Frakcije koje sadrže željeni proizvod se mešaju, a rastvarač evaporiše, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova, u obliku prljavo bele čvrste supstance (1.9 g, 52%). ES/MS (m/e): 499 (M+1).

Alternativni postupak dobijanja kristalnog oblika 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluorfenil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamida (hidratisanog)

[0113] Acetonitril (500 mL) je dodat u DMF (19.2 mL, 248.9 mmol). Oksalil hlorid (39.3 g, 309.63 mmol), a zatim 5-metoksipirazin-2-karboksilna kiselina (46.0 g, 298.4 mmol) su dodati u rastvor DMF/acetonitril. U posebnom sudu, vodeni rastvor (4aR,7aS)-7a-(5-amino-2-fluorfenil)-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-amin (56.8 g, 156.75 mmol) je dodat u acetonitril (500 mL) i pH vrednost je podešena na 9 pomoću amonijum hidroksida (95 mL). Ova smeša je zatim zagrejana do 50-55 °C. Dodat je rastvor oksalil hlorida, kap po kap, i smeša je mešana tokom 3 sata. pH vrednost je podešena na is 8-9 pomoću amonijum hidroksida. Dobijeni talog je filtriran, ispran vodom i osušen, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (123 g). Talog je suspendovan u acetonu (250 mL) tokom 1.5 sati i filtriran. Vlažni talog je ispran acetonom, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (110 g, čistoće 90.5%, pomoću HPLC.). U talog su dodati THF (1 L) i aktivni ugljenik (9 g) i smeša je zagrevana uz refluks, preko noći. Smeša je filtrirana kroz dijatomejsku zemlju i isprana sa THF (150 mL). Organski rastvor je koncentrovan do 10 zapremina i zagrejan do 60 °C. Dodata je voda (430 mL) i smeša je mešana na 60 °C tokom 8 sati. Smeša je ohlađena do sobne temperature i mešana 10 sati. Dobijeni talog je filtriran, ispran sa THF/voda (7:6) i osušen, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (69 g, 88%) LC-MS: m/z=499 (M+1), čistoća: 98.3%.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.99 - 3.07 (m, 2 H) 3.07 - 3.14 (m, 1 H) 3.58 - 3.67 (m, 1 H) 3.68 - 3.76 (m, 1 H) 3.76 - 3.84 (m, 1 H) 4.02 (s, 3 H) 4.07 (d, J=10.92 Hz, 1 H) 6.08 (s, 2 H) 7.19 (dd, J=11.98, 8.72 Hz, 1 H) 7.78 - 7.89 (m, 2 H) 8.41 (s, 1 H) 8.44 (s, 2 H) 8.88 (s, 1 H) 10.60 (s, 1 H).

Opšta procedura za dobijanje Kristalnog oblika 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-Amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluorfenil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamida (hidratisanog)

[0114] Suspendovati N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo [3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluor-fenil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamid u THF na približno 23 °C do koncentracije od približno 71 mg/mL rastvarača. Zagrejati suspenziju uz mešanje do rastvaranja, do kojeg dolazi na približno 60 °C do oko 63 °C. Dodati vodu u vrući rastvor, kako bi se postigao odnos rastvarača THF:voda od približno 95:5. Dodaju se zrnasti kristali oblika 2 N-[3-[(4aR, 7aS)-2-amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluorfenil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamida (punjenje približno 3 masena %). Dobijena retka suspenzija se održava na oko 60 °C do oko 63 °C tokom približno 20 minuta, nakon čega se dodaje približno 5.3 do približno 5.5 zapremina vode tokom približno 2 do približno 4 sata, čime se dobija odnos rastvarača THF:voda od približno 69:31. Suspenzija se zatim održava na oko 60 °C do približno 63 °C oko 30 minuta, a zatim hladi na približno 23 °C tokom približno 1 sata, a zatim meša oko 8-12 sati. Suspenzija se zatim filtrira, blago ispira sa THF:voda (35:65) i suši približno 8-12 sati pod vakuumom, na oko 40 °C, da bi se dobio željeni Kristalni oblik 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluorfenil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamida, koji je hidratisan.

[0115] Pripremljeni uzorak Kristalnog oblika 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluorfenil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamida se odlikuje XRD šarom, dobijenom primenom CuKa radijacije, sa difrakcionim pikovima (2-teta vrednosti) koji su navedeni u narednoj Tabeli 1. Konkretno, šara sadrži pik na 11.8° u kombinaciji sa jednim ili više pikova odabranih iz grupe koja se sastoji od 18.6°, 19.3° i 26.7°; sa tolerancijom za uglove difrakcije od 0.2 stepena.

Tabela 1: Pikovi rendgenske difrakcije praha Kristalnog oblika 2 iz Primera 1b.

[0116] Kristalni oblik 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetra-hidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluor-fenil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamida je u stabilnoj kristalnoj formi na sobnoj temperaturi i pri relativnoj vlažnosti većoj od približno 15%.

Primer 1c

Kristalni oblik 3 N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluor-fenil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamida

[0117] Napunite posudu za termogravimetrijsku analizu N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluorfenil]-5-metoksipirazin-2-karboksamidom, zagrejte je do približno 170 °C i držite na 170 °C oko 5 minuta. Ohladite do sobne temperature, da biste dobili jedinjenje iz naslova.

Alternativni postupak dobijanja kristalnog oblika 3 N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluorfenil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamida

[0118] Pomešajte N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo [3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluor-fenil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamid (121 mg) sa acetonitrilom (5 mL) u bočici i zagrevajte na 90 °C, na ploči za mešanje. Nakon približno 30 minuta, najveći deo čvrste susptance se rastvara, pri čemu nastaje mutni rastvor. Dodaju se zrna Oblika 3 i uzorak se meša oko sat vremena na približno 90 °C. Prestaje se sa zagrevanjem i smeša se meša, kako bi se dobila sjajna čvrsta supstanca, bele boje. Čvrsta supstanca se izdvaja pomoću filtracije pod vakuumom, suši pod strujom vazduha tokom približno 10 minuta, a zatim pod vakuumom na oko 80 °C približno 8 do 12 sati, kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova.

[0119] Pripremljeni uzorak kristalnog oblika 3 N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluorfenil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamida se odlikuje XRD šarom, dobijenom primenom CuKa radijacije, sa difrakcionim pikovima (2-teta vrednosti) koji su navedeni u narednoj Tabeli 2. Konkretno, šara sadrži pik na 15.7° u kombinaciji sa jednim ili više pikova odabranih iz grupe koja se sastoji od 18.1°, 27.0° i 19.7°; sa tolerancijom za uglove difrakcije od 0.2 stepena.

Tabela 2: Pikovi rendgenske difrakcije praha Kristalnog oblika 3 iz Primera 1c.

Procedure ispitivanja in vitro:

[0120] Za in vitro enzimske i ćelijske analize, ispitivana jedinjenja su pripremljena u DMSO, kako bi se dobio 10 mM koncentrovani rastvor. Koncentrovani rastvor je serijski razblažen u DMSO, kako bi se dobila kriva razblaženja sa 10 tačaka, sa konačnim koncentracijama jedinjenja u opsegu od 10 mM do 0.05 nM, u pločama sa 96 pozicija sa okruglim dnom, pre sprovođenja in vitro analiza enzima i celih ćelija.

In vitro ispitivanja inhibicije proteaze:

Ekspresija humane BACE1

[0121] Humana BACE1 (pristupni broj: AF190725) je klonirana iz ukupne moždane cDNK pomoću RT-PCR. Nukleotidne sekvence koje odgovaraju aminokiselinskim sekvencama # 1 do 460 ubacuju se u cDNK koja kodira humani IgG1(Fc) polipeptid (Vasser, et al., Science, 286, 735-741 (1999)). Ovaj fuzioni protein BACE1 (1-460) i humanog Fc, nazvan huBACEl: Fc, konstruisan je u pJB02 vektor. Humani BACE1 (1-460): Fc (huBACEl: Fc) je tranzijentno izražen u HEK293 ćelijama. 250 mg cDNK svakog spoja je pomešano sa Fugene 6 i dodato u 1 litar HEK293 ćelija. Četiri dana nakon transfekcije, kondicionirana podloga se sakuplja radi prečišćavanja.

Prečišćavanje f huBACE1:Fc.

[0122] huBACE1:Fc je prečišćen pomoću hromatografije sa medijumom na bazi Proteina A. Enzim se čuva na - 80 °C u malim alikvotima.

Ispitivanje FRET BACE1

[0123] Serijska razblaženja ispitivanih jedinjenja su pripremljena na prethodno opisan način. Jedinjenja su dodatno razblažena 20x u KH2PO4puferu. Po 10 µL svakog razblaženja je dodato u svaku poziciju u redu A do H odgovarajuće crne ploče, sa svojstvom slabog vezivanja proteina, koja sadrži reakcionu smešu (25 µL 50 mM KH2PO4, pH 4.6, 1 mM TRITON® X-100, 1 mg/mL albumina goveđeg seruma, i 15 µM FRET supstrata) (vidi Yang, et. al., J. Neurochemistry, 91(6) 1249-59 (2004)). Sadržaj je dobro promešan pomoću mešača za mikrotitar ploče, tokom 10 minuta. Petnaest µL 200 pM humanog BACE1(1-460):Fc (vidi Vasser, et al., Science, 286, 735-741 (1999)) u KH2PO4puferu je dodato u ploču koja sadrži supstrat i ispitivana jedinjenja, kako bi se inicirala reakcija. RFU smeše, u trenutku 0, je snimljena na talasnoj dužini ekscitacije od 355 nm i talasnoj dužini emisije od 460 nm, nakon kratkog mešanja pomoću mešača za mikrotitar ploče. Reakciona ploča je prekrivena aluminijumskom folijom i čuvana u tamnoj, ovlaženoj peći, na sobnoj temperaturi, tokom 16 do 24 h. RFU na kraju inkubacije je snimljena pod istim uslovima ekscitacije i emisije, kao u trenutku 0. Razlika između RFU u trenutku 0 i na kraju inkubacije predstavlja aktivnost BACE1 pod uticajem jedinjenja. Razlike RFU su prikazane u odnosu na koncentraciju inhibitora, a kriva je fitovana pomoću jednačine sa četiri parametra, da bi se dobile vrednosti EC50i IC50. (vidi Sinha, et al., Nature, 402, 537-540 (2000)).

[0124] Jedinjenje iz Primera 1 je u suštini ispitano na prethodno opisan način i pokazalo je IC50za BACE1 od 0.615 nM (± 0.101, n=5) [Srednja vrednost SEM; SEM = standardna greška srednje vrednosti]. Ovi podaci pokazuju da jedinjenje iz Primera 1 inhibira enzimsku aktivnost prečišćene rekombinantne BACE1, in vitro.

PDAPP ispitivanje primarnih neurona

[0125] Potvrdno ispitivanje celih ćelija se takođe vrši u primarnim neuronskim kulturama generisanim iz embriona PDAPP transgenih miševa. Primarni neuroni iz moždane kore se pripremaju iz PDAPP embriona 16. dana embrionalnog razvoja i uzgajaju se u pločama sa 96 pozicija (15 x 10<4>ćelija/poziciji u DMEM/F12 (1:1) plus 10% FBS). Nakon 2 dana in vitro, medijum sa kulturama je zamenjen sa DMEM/F12 (1:1) bez seruma, koji sadrži suplement B27 i 2 µM (konačna) Ara-C (Sigma, C1768). Petog dana in vitro, neuroni su inkubirani na 37 °C, tokom 24 h, u prisustvu/odsustvu željene koncentracije inhibitora (razblaženog u DMSO). Na kraju inkubacije, pripremljeni medijum je analiziran, kako bi se dokazala aktivnost beta-sekretaze, na primer, analizom Abeta peptida. Ukupni Abeta peptidi (Abeta 1-x) su mereni pomoću „sendvič“ ELISA testa, primenom monoklonskog 266, kao antitela hvatača i biotinisanog 3D6 kao detekcionog antitela. Opciono, Abeta 1-40 i Abeta 1-42 peptidi su izmereni pomoću „sendvič“ ELISA testa, primenom monoklonskog 2G3 kao antitela hvatača za Abeta 1-40 i monoklonskog 21F12 kao antitela hvatača za Abeta 1-42. U ELISA testu, kao detekciono antitelo i za Abeta 1-40 i za Abeta 1-42, koristi se biotinisani 3D6. Koncentracija Abeta, koja se oslobađa u pripremljenoj podlozi nakon tretmana jedinjenjem, odgovara aktivnosti BACE1, pod takvim uslovima. Kriva inhibicije sa 10 tačaka, je iscrtana i fitovana pomoću logističke jednačine sa četiri parametra, kako bi se dobile vrednosti EC50i IC50za efekat snižavanja Abeta. Jedinjenje iz Primera 1 je u suštini ispitano na prethodno opisan način i pokazalo je narednu aktivnost u snižavanju Abeta:

Tabela 3

Srednja vrednost ± SEM; SEM = standardna greška srednje vrednosti

[0126] Ovi podaci pokazuju da jedinjenje iz Primera 1 inhibira proizvodnju Abeta u celim ćelijama.

In vivo inhibicija beta-sekretaze

[0127] Nekoliko životinjskih modela, uključujući model miša, zamorca, psa i majmuna, mogu se koristiti za ispitivanje inhibicije aktivnosti beta-sekretaze in vivo, nakon tretmana jedinjenjem. Životinje koje se koriste u ovom pronalasku mogu biti divlje vrste, transgene ili životinje sa genskim nokautom. Na primer, PDAPP mišji model, pripremljen kao što je opisano u Games et al., Nature 373, 523-527 (1995) i druge ne-transgene životinje ili životinje sa genskim nokautom su korisne za in vivo analizu inhibicije proizvodnje Abeta i sAPPbeta u prisustvu inhibitornih jedinjenja. Obično se PDAPP miševima starosti od 2 do 12 meseci, miševima sa nokautom gena ili ne-transgenim životinjama, daju jedinjenja formulisana sa nosačima, kao što su kukuruzno ulje, ciklodekstran, fosfatni puferi, PHARMASOLVE® ili drugi pogodni nosači. Životinje se žrtvuju jedan do dvadeset četiri sata nakon primene jedinjenja, a mozgovi, kao i cerebrospinalna tečnost i plazma se uklanjaju radi analize Abeta, C99 i sAPP fragmenata (vidi Mai, et al., Journal of Neuroscience, 31, 16507-16516 (2011)).

[0128] U toku standardnih farmakoloških ispitivanja in vivo, životinjama se daju doze jedinjenja različitih koncentracija i vrši se poređenje sa kontrolnom grupom, koja se u isto vreme tretira dozom nosača. Za neke vremenske studije, moždano tkivo, plazma ili cerebrospinalna tečnost se dobijaju od odabranih životinja, počevši od trenutka 0, da bi se uspostavila osnovna linija. Jedinjenje ili odgovarajući nosač se daje drugim grupama, koje se žrtvuju u različitim trenucima nakon doziranja. Tkivo mozga, plazma ili cerebrospinalna tečnost se dobijaju od odabranih životinja i analiziraju na prisustvo proizvoda razlaganja APP, uključujući Abeta peptide, sAPPbeta i druge fragmente APP, na primer, pomoću specifičnih „sendvič“ ELISA testova. Na kraju perioda ispitivanja, životinje se žrtvuju, a moždana tkiva, plazma ili cerebrospinalna tečnost se analiziraju na prisustvo Abeta peptida, C99 i sAPPbeta, prema potrebi. Tkiva mozga APP transgenih životinja se takođe mogu analizirati, kako bi se utvrdila količina beta-amiloidnih plakova nakon tretmana jedinjenjem. Pojam "Abeta 1-k peptid", koji se ovde koristi, odnosi se na sumu vrsta Abeta, koje počinju sa ostatkom 1 i završavaju sa C-terminusom većim od ostatka 28. Ovo detektuje većinu vrsta Abeta i često se naziva "totalna Abeta".

[0129] Kod životinja (PDAPP ili drugi APP transgeni ili ne-transgeni miševi), kojima su data inhibitorna jedinjenja, može se pokazati smanjenje Abeta ili sAPPbeta u moždanom tkivu, plazmi ili cerebrospinalnoj tečnosti i smanjenje beta amiloidnih plakova u moždanom tkivu, u poređenju sa kontrolama, koje su tretirane nosačem ili kontrolama nultog vremena. U slučaju Primera 1, tri sata nakon davanja 0.3, 1, ili 3 mg/kg oralne doze jedinjenja, nivoi Abeta 1-x peptida su sniženi za približno 31%, 39% i 61% u hipokampusu mozga, i približno za 28%, 42% i 64% u moždanoj kori, u poređenju sa miševima tretiranim nosačem.

[0130] Imajući u vidu aktivnost Primera 1 protiv enzima BACE, in vitro, ovi efekti smanjenja Abeta su dosledni inhibiciji BACE in vivo i dalje pokazuju prodiranje N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluor-fenil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamida u centralni nervni sistem.

[0131] Ove studije pokazju da jedinjenja pronalaska inhibiraju BACE i da su, prema tome, korisna za smanjenje nivoa Abeta.

Claims (7)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje formule:

   koje je kristalno.
2. 2. Kristalno jedinjenje prema zahtevu 1, naznačeno time što u spektru difrakcije X zraka, ima značajan pik pri uglu difrakcije 2-teta od 11.8°, u kombinaciji sa jednim ili više pikova odabranih iz grupe koja se sastoji od 18.6°, 19.3° i 26.7°; sa tolerancijom za uglove difrakcije od 0.2 stepena.
3. 3. Kristalno jedinjenje prema zahtevu 1, naznačeno time što u spektru difrakcije X zraka, ima značajan pik pri uglu difrakcije 2-teta od 15.7°, u kombinaciji sa jednim ili više pikova odabranih iz grupe koja se sastoji od 18.1°, 27.0° i 19.7°; sa tolerancijom za uglove difrakcije od 0.2 stepena.
4. 4. Jedinjenje prema bilo kojem od zahteva 1 do 3, za primenu u terapiji.
5. 5. Jedinjenje prema bilo kojem od zahteva 1 do 3, za primenu u lečenju Alchajmerove bolesti.
6. 6. Jedinjenje prema bilo kojem od zahteva 1 do 3, za primenu u prevenciji progresije blagog kognitivnog poremećaja u Alchajmerovu bolest.
7. 7. Farmaceutski oblik, koji sadrži jedinjenje prema bilo kojem od zahteva 1 do 3, sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, rastvarača ili ekscipijenasa. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5