RS58780B1 - Postupak za umnožavanje kvasca koji može da fermentiše glukozu i ksilozu - Google Patents

Description

Opis

STANJE TEHNIKE

[0001] Fermentacija monomernih šećera u alkohol pomoću kvasca veoma dobro je poznata hiljadama godina. Naime, pivo je proizvođeno od strane gotovo svih kultura i populacija u istoriji ljudskog roda. U oblasti biogoriva, sirovi materijali prve generacije sa visokim skrobnim sadržajem, kao što je kukuruz, uspešno su korišćeni u idustrijskom obimu za proizvodnju etanola. Fermentacioni postupci prve tehnološke generacije usmereni su da se koristi mogućnost da se hidrolizuje sirovi materijal za proizvodnju hidrolizovane mešavine sa vrlo visokom koncentracijom monomernih C6 šećera, prevashodno glukoza, i vrlo malo ili potpuno bez inhibitora kvasca, kao što je sirćetna kiselina. Pored toga, šećeri porekla iz hemiceluloze, kao što je ksiloza, nisu prisutni u sirovom materijalu prve generacije.

[0002] Upotreba hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala predstavlja seriju zahtevnih problema, od koji većina proističe iz sprovođenja postupka u idustrijskom obimu. Najviše problema povezano je da se postupak učini ekonomski izvodljivim, ostali su povezani sa specifičnim karakteristikama hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala, koje čine upotrebu hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala težom nego u slučaju hidrolizata prve gereracije.

[0003] Prvi nedostatak u fermentaciji hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala je prisustvo C5 monomernih šećera, uglavnom ksiloze. Ksiloza je poznata kao teška ili nemoguća da bude konvertovana prirodnim enzimima i kvascima, i osmišljeni su posebni kokteli genetski modifikovanog enzima i kvasaca radi konvertovanja hemiceluloznog dela. Čak i sa genetski modifikovanim kvascem koji može da fermentiše i glukozu i ksilozu, konverzija ksiloze je spora.

[0004] Drugi nedostatak u fermentisanju hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala je niska koncentracija šećera hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala, koja je tipično manja od 100gr ukupnih šećera po kg hidrolizata, na vlažnoj osnovi. Pri niskoj koncentraciji šećera, brzina iskorišćavanja šećera kvascem je spora i na taj način je omogućeno umnožavanje bioloških kantaminanata, kao što su bakterije, koje konzumiraju relevantni deo raspoloživih šećera za proizvodnju neželjenih bioproizvoda, kao što je mlečna kiselina. Ovaj problem je dalje uvećan malom brzinom konverzije ksiloze kvascem. Na taj način, često se praktikuje sterilizacija hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala pomoću hemijskih ili biohemijskih agenasa, kao što su antibiotici, ili pomoću fizičkih agenasa, kao što je toplota ili svetlo, povećavajući ukupne troškove.

[0005] Treći nedostatak u fermentaciji hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala je prisustvo inhibirajućih jedinjenja u hidrolizatu. Jedinjenja kao što je sirćetna kiselina, mravlja kiselina, furfurol, koja su tipično proizvodi iz prethodne obrade ili hidrolizovanja ligno-celuloznog sirovog materijala, umanjuju sposobnost kvasca za iskorišćavanjem šećera, ili najmanje brzinu iskorišćavanja. Uklanjanje inhibirajućih jedinjenja u raznim fazama pre konverzije kvasca često se praktikuje, ponovo povećavajući ukupne troškove.

[0006] Jedan glavni problem u postupku fermentacije hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala je da se umanju količina kvasca ukupno potrebna, koja ima veliki uticaj na krajnju cenu proizvod. Da bi se rešio taj problem, obično se praktikuje faza umnožavanja, pri čemu je kvasac unet u sredinu za umnožavanje pod uslovima koji pospešuju rast kvasca, i na taj način dozvoljavaju proizvodnju više ćelija kvasca da budu korišćene u sledećem postupku fermentacije. Umnožavanje može biti sprovedeno na šaržni, šaržni sa prihranom i kontinuiran način. Iako umnožavanje kvasca u sredini za umnožavanje, koja obuhvata sintetičke šećere -i ksilozu i glukozu- pokazala je da je bila efektivna u laboratorijskom obimu, predloženi su različiti pristupi da se umnoži kvasac u hidrolizatu ligno-celuloznog sirovog materijala radi umanjenja troškova sredine za umnožavanje.

[0007] Tipično, čitav postupak za konverziju hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala u fermentacione proizvode je podeljen u jednoj ili više faza umnožavanja, praćene jednom ili više faza fermentacije. To umnožavanje i faza fermentacije su specijalizovane za proizvodnju specifičnog proizvoda. Ta faza umnožavanja sprovedena da posveti maksimalnu dozvoljenu količinu ugljenika u sredini za umnožavanje za proizvodnju ćelija kvasca, minimizirajući količinu ugljenika konvertovane u drugi proizvodi, kao što je etanol, koj se smatraju sporednim proizvodima u toj fazi umnožavanja. Faza fermentacije je umesto toga sprovedena da maksimizuje količinu ugljenika u fermentacionoj sredini za proizvodnju etanola koji je finalni fermentacioni proizvod, pomoću kvasca umnoženog u toj fazi umnožavanja. Ta faza umnožavanja sprovedena u aerobnim uslovima,i na taj način mora se uvesti vazduh u velikom protoku u hidrolizat ligno-celuloznog sirovog materijala i hidrolizat ligno-celuloznog sirovog materijala mora biti mešan pri visokom intenzitetu za promociju kontakta kvasca sa vazduhom. Hidrolizat ligno-celuloznog sirovog materijala često se proizvod u obliku suspenzije, i na taj način teško je i skupo da budu mešan. Suspenzija hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala može biti podeljena u tečnu komponentu koja obuhvata vodu i glukozu rastvornu u vodi i ksilozu, i čvrstu komponentu koja obuhvata u vodi nerastvoran prethodno obrađen ligno-celulozni sirov materijal, ponovo sa povećanjem troškova postupka.

[0008] WO2009155633A1 opisuje upotrebu supstrata, koji obuhvata materijal koji sadrži C5 jedinjenje, u rastu Saccharomyces kvasca ili proizvodnji proizvoda Saccharomyces kvasca, pri čemu taj materijal koji sadrži C5 jedinjenje je: (a) materijal koji sadrži C5 jedinjenje dobijen iz ligno-celuloznog hidrolizata; (b) materijal koji sadrži C5 jedinjenje dobijen iz fermentacije ligno-celuloznog hidrolizata; ili (c) mešavinu (a) i (b). Ta prijava patenta takođe opisuje postupak za proizvodnju biomase Saccharomyces kvasca ili proizvoda Saccharomyces kvasca upotrebom supstrata, pri čemu taj postupak obuhvata inkubiranje supstrata koji obuhvata materijal koji sadrži C5 jedinjenje sa Saccharomyces kvascom u uslovima koji izazivaju rast Saccharomyces kvasca ili proizvodnju proizvoda. Zbog toga, ta prijava patenta ne pominje specifične probleme i poovezana rešenja koji su uključeni u umnožavanje kvasca na ligno-celuloznom hidrolizatu.

[0009] WO2014072232A1 opisuje postupak za aerobno umnožavanje kvasca, pri čemu se kvasac gaji u reaktoru, koji obuhvata faze : a) punjenje reaktora izvorom ugljenika i početnom populacijom kvasca, b) opciono uzgajanje početne populacije kvasca u reaktoru na šaržni način, c) merenje pH u reaktoru, d) dodavanje ligno-celuloznog hidrolizata u reaktor na šaržni način sa prihranom brzinom radi podešavanja pH u reaktoru na preodređenu vrednost, i e) posle dovoljnog umnožavanja, izolovanje kvasca iz reaktora. Izvor ugljenika iz faze a) može biti razblažen ligno-celulozni hidrolizat, pri čemu razblaživanje ligno-celuloznog hidrolizata je obezbeđeno za smanjivanje efekata inhibitornih jedinjenja iz lignoceluloznog hidrolizata. Kontrolisanje rasta u šaržnom načinu sa prihranom je teško u idustrijskom obimu, i povećava troškovi, kao i održavanje aerobnih uslova u postupku umnožavanja u lignoceluloznom hidrolizatu, što zahteva intenzivno mešanje i visok protok vazduha. Pored toga, ta prijava patenta ne prepoznaje prisustvo biološkog kantaminanata kao kritično u toj fazi umnožavanja. Naime, rečeno je da je bakterijska ili kontaminacija divljim kvascem redak problem tokom umnožavanja jer su rezeroari za umnožavanje kvasca su manji i mogu se lakše čistiti nego rezervoari za fermentaciju. Pored čišćenja, antibakterijski proizvodi mogu biti dodati radi sprečavanja rasta neželjenih mikroba.

[0010] US8450094 opisuje postupak umnožavanja kvasca u sredini za umnožavanje, pri čemu se ksiloza dovodi u sredinu kao izvor ugljenika za rast ćelijske mase. Prva ćelijska masa umnožena je pod aerobnim uslovima sa protokom vazduha od najmanje 1,0 zapremine vazduha po zapremini sredine, po minutu, u drugu ćelijsku masu, koja je opciono umnožena u sledećoj fazi u treću ćelijsku masu. Sekvencijalni postupak opisan u tom patentu za proizvodnju značajne količine kvasca zahteva dugo vreme umnožavanja u uslovima pogodnim za biološke kantaminante, i na taj način zahteva sterilizaciju izvora ugljenika.

[0011] Elìa Tomás-Pejó i Lisbeth Olsson "Influence of the propagation strategy for obtaining robust Saccharomyces cerevisiae cells that efficiently co-ferment xylose and glucose in lignocellulosic biomass hydrolysates" Microbial Biotechnology vol.82015 strane 999-1005 opisuje da dodavanje lignoceluloznog hidrolizata tokom umnožavanja ćelija prilagođenih inhibitorima, rezultuje sa više tolerantnih ćelija sa kraćim zastojim između faza i visokim specifičnim brzinama rasta u minimalnoj sredini koja sadrži sirćetnu kiselinu i vanilin u odnosu na neprilagođene ćelije.

[0012] Time postoji potreba za industrijskim postupkom proizvodnje fermentacionog proizvoda iz hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala u obliku suspenzije, pri čemu jednovremeno on proizvodi većinu potrebnog kvasca. Veruje se da opisani postupak prevazilazi gore pomenute nedostatke u korišćenju suspenzije hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala, obezbeđujući jeftino rešenje za proizvodnju fermentacionog proizvoda od hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala u idustrijskom obimu.

KRATAK SADRŽAJ

[0013] Ovaj opis opisuje postupak za proizvodnju fermentacionog proizvoda iz suspenzije hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala koji obuhvata vodu, glukozu rastvornu u vodi i ksilozu rastvornu u vodi i u vodi nerastvoran prethodno obrađen lignocelulozni sirov materijal, pri čemu pomenuti postupak obuhvata faze: pripremanje prve konvertujuće sredine koja obuhvata prvi deo suspenzije hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala i kvasac koji može da konvertuje glukozu i ksilozu u umnožavanje kvasca i fermentacioni proizvod; omogućavanja kvascu da konvertuje najmanje 50% glukoze rastvorne u vodi i manje od 20% ksiloze rastvorne u vodi prve konvertujuće sredine, do prvog umnoženog kvasca i prvog dela proizvoda fermentacije u prvoj fazi konverzije, koja ima prvi odnos konverzije šećer-premaćelijama u opsegu od 5% to 25%, pri čemu je prvi odnos konverzije šećer-prema-ćelijama procentualni maseni odnos glukoze i ksiloze konvertovanih u umnoženom kvascu u prvoj fazi konverzije u glukozu rastvornu u vodi i ksilozu potpuno konvertovanu u prvoj konvertujućoj sredini, na bazi ugljenika; pripremanje druge konvertujuće sredine koji obuhvata najmanje deo prvog umnoženog kvasca i drugi deo suspenzije hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala; omogućavanja kvascu da konvertuje najmanje deo glukoze rastvorne u vodi i ksilozu u drugoj konvertujućoj sredini do najmanje drugog umnoženog kvasca i drugog dela proizvoda fermentacije u drugoj fazi konverzije sa drugim odnosom konverzije šećer-prema-ćelijama koji je manji od prvog odnosa konverzije šećer-prema-ćelijama, pri čemu je drugi odnos konverzije šećer-prema-ćelijama procentualni maseni odnos glukoze rastvorne u vodi i ksiloze konvertovanih u umnoženom kvascu u drugoj fazi konverzije u potpuno konvertovanu glukozu rastvornu u vodi i ksilozu u drugoj konvertujućoj sredini, na bazi ugljenika.

[0014] Takođe je opisano da prva faza konverzije može da obuhvata najmanje prvu fazu koja je aerobna faza i drugu fazu koj je anaerobna faza, pri čemu je aerobna faza izvedena tokom vremena u opsegu od 3 časa do 12 časova.

[0015] Dalje je opisano da prva faza konverzije može biti izvedena tokom prvog vremena konverzije koje je manje od vrednosti izabrane iz grupe koju čine 30 časova, 20 časova, 15 časova, i 10 časova.

[0016] Dalje je opisano da prva faza konverzije može biti sprovedena uvođenjem vazduha u protoku koji je u opsegu grupe koja se sastoji od 0.1vvh do 10 vvh, od 0.1vvh do 5 vvh, i od 0.5vvh do 3 vvh.

[0017] Dalje je opisano da prva faza konverzije može biti sproveden mešanjem prve konvertujuće sredine pri gustini snage prema masi od manje od 100W/t prve konvertujuće sredine, na vlažnoj osnovi.

[0018] Dalje je opisano da prvi odnos konverzije šećer-prema-ćelijama može biti u opsegu grupe koja se sastoji od 5% do 20%, i od 10% do 20%.

[0019] Dalje je opisano da druga faza konverzije može biti sprovedena u anaerobnim uslovima tokom najmanje 80% drugog vremena konverzije.

[0020] Dalje je opisano da druga faza konverzije može biti izvedena tokom drugog vremena konverzije koj je veće od prvog vremena konverzije i manje od vrednosti izabrane iz grupe koju čine 72 časa, 60 časova, i 50 časova.

[0021] Dalje je opisano da najmanje 80% glukoze rastvorne u vodi i ksiloza rastvorna u vodi mogu biti konvertovane u drugoj fazi konverzije.

[0022] Dalje je opisano da drugi odnos konverzije šećer-prema-ćelijama može biti veći od 2%.

[0023] Dalje je opisano da suva materija prve i druge konvertujuće sredine može biti manja od 30% i veća od procentualne vrednosti izabrane iz grupe koju čine 5%, 10%, 15%, i 20%.

[0024] Dalje je opisano da prva konvertujuća sredina i druga konvertujuća sredina mogu dalje da obuhvataju izvor azota.

[0025] Dalje je opisano da vitamini i/ili elementi u tragovima ne mogu biti dodati u postupak.

[0026] Dalje je opisano da suspenzija hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala može da ne bude izložena bilo kojoj sterilizaciji.

[0027] Dalje je opisano da prva faza konverzije može da ima početnu gustinu kvasca između 1 x 10<6>i 1x 10<8>ćelija kvasca po miligramu prve konvertujuće sredine, na vlažnoj osnovi.

[0028] Dalje je opisano da prva faza konverzije može da ima konačnu gustinu kvasca, koja je između 1 x 10<7>i 1x 10<9>ćelija kvasca po miligramu prve konvertujuće sredine, na vlažnoj osnovi.

[0029] Dalje je opisano da druga faza konverzije može da ima početnu gustinu kvasca koj je veće od početne gustine kvasca u prvoj fazi konverzije.

[0030] Dalje je opisano da prva faza konverzije i druga faza konverzije mogu biti sprovedene u podeljenoj posudi.

[0031] Dalje je opisano da proizvod fermentacije može biti etanol.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0032]

FIG.1 je kriva zasićenja kiseonikom u prvoj fazi konverzije dva eksperimentalna testa u laboratorijskom obimu

FIG.2 je kriva zasićenje kiseonikom u drugoj fazi konverzije dva eksperimentalna testa u laboratorijskom obimu

DETALJAN OPIS

[0033] Ovaj opis opisuje postupak koji obuhvata najmanje dve sekvencijalne faze konverzije suspenzije hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala u fermentacioni proizvod pomoću kvasca, pri čemu je jednovremeno u svakoj fazi deo ukupne količine glukoze rastvorne u vodi i ksiloze hidrolizata lignoceluloznog sirovog materijala konvertovan u ćelije kvasca korišćenim opisanog postupka. Proizvedene ćelije kvasca u prvoj fazi konverzije nazivaju se prvi umnoženi kvasac, a zatim su korišćene u drugoj fazi konverzije. U svakoj fazi, proizvod fermentacije je na taj način glavni proizvod konverzij, ali prva faza konverzije sprovedena je u uslovima koji su pogodniji za umnožavanje kvasca nego u drugoj fazi konverzije. Na taj način, u prvoj fazi konverzije procenat ukupne količine glukoze rastvorne u vodi i ksiloze rastvorne u vodi konvertovane u kvasac, veći je od procenta ukupne količine glukoze rastvorne u vodi i ksiloze rastvorne u vodi konvertovane u kvasac u drugoj fazi konverzije. U svakoj fazi konverzije, postoji odnos konverzije šećer-prema-ćelijama. Taj odnos konverzije šećer-prema-ćelijama je procentualni maseni odnos količine glukoze rastvorna u vodi i ksiloze rastvorne u vodi koje su konvertovane u kvasac, prema količini glukoze rastvorna u vodi i ksiloze rastvorne u vodi koje su potpuno konvertovanu u toj fazi na bazi ugljenika i izražen kao procenat, a ne prema količini glukoze rastvorna u vodi i ksiloze ukupno raspoloživih u toj fazi. Razumevanja radi, taj odnos konverzije šećerprema-ćelijama količine glukoze rastvorne u vodi i ksiloze koje su potpuno konvertovane u prvoj fazi konverzije, može biti manji od onog u drugoj fazi konverzije. Ovo može da se dešava, na primer, u slučaju da je prva faza konverzije izvedena tokom prvog vremena konverzije koje je kraće nego vreme konverzije od druge faze konverzije:ali, u odnosu na respektivnu konvertovanu frakciju glukoze rastvorne u vodi i ksiloze, umnožavanje kvasca u prvoj fazi konverzije je pogodniji nego u drugoj fazi konverzije. Glukoza rastvorna u vodi i ksiloza, koje nisu konvertovane u prvoj fazi konverzije, nisu izgubljene, jer su one poželjno uvedene i konvertovane u drugoj fazi konverzije.

[0034] Prema jednom aspektu, opisani postupak obezbeđuje rešenje koje može biti implementirano u idustrijskom obimu, prevazilazeći probleme koji se događaju u stvarnom pogonu za konverziju.

[0035] Prema drugom aspektu, opisani postupak dozvoljava proizvodnju kvasca potrebnu za proizvodnju proizvoda fermentacije, polazeći od male količine kvasca, na taj način osetno smanjujući troškove fermentacije.

[0036] Prema daljem aspektu, u opisanom postupku umnožavanje kvasca dešava u suspenziji hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala već raspoloživoj u pogonu za konverziju, na taj način izbegavajući ili znatno smanjujući troškove povezane sa skupim izvorima ugljenika.

[0037] Prema daljem aspektu, opisani postupak omogućava upotrebu suspenzije hidrolizata lignoceluloznog sirovog materijala, koja može da sadrži biološke kantaminante u ne-nezanemarljivom nivo, bez upotrebu bilo kog sterilišućeg agensa ili procedure.

[0038] Prema daljem aspektu, opisani postupak može biti sproveden bez upotrebe vitamina i drugih skupih nutritienata.

[0039] U kontekstu ovog opisa, izraz "konvertuje u vodi rastvoran šećer" korišćen je da označi postupak za proizvodnju opšteg proizvoda od u vodi rastvornog šećera; taj opšti proizvod obuhvata proizvod umnožavanja, koji je nova biomasa kvasca, i fermentacioni proizvod, kao što je etanol.

[0040] Pod "umnožavanje kvasca", ili "rast kvasca", ili "prozvodnja kvasca", "prevođenje u kvasac", i "prevođenje u umnoženi kvasac" podrazumeva se postupak povećanja količine kvasca, ili biomase kvasca, dobijene hranjenjem početne količine kvasca izvorom ugljenika i opciono drugim nutritientima pod odgovarajućim uslovima. Povećanje biomase kvasca ili količine kvasca dešava se povećanjem broja ćelija kvasca ukupno proizvodih, a to može biti utvrđeno određivanjem gustine ćelija na početku i na kraju faze(a) umnožavanja ili fazi(ama) konverzije, ili tokom umnožavanja ili faze konverzije ili faza. Gustina ćelija može biti određena brojanjem ćelije kvasca prisutnih u reprezentativnim uzorcima konvertujuće sredine u različitim vremenima faze umnožavanja ili faza.

[0041] Kvasac iz opisanog postupka može da fermentiše ne samo glukozu, već takođe i ksilozu. Kako kvasac koji se javlja u prirodi tipično nije onaj koji može da preuzima ksilozu, kvasac korišćen u opisanom postupku je poželjno neki kvasac koji se ne javlja u prirodi ili je izveden od nekog kvasca koji se ne javlja u prirodi.

[0042] Izraz kvasac "koji se ne javlja u prirodi" znači da mikrobni organizam ima najmanje jednu genetsku promenu koja se normalno ne nalazi u normalnom soju referentne vrste, uključujući normalne sojeve referentne vrste, kako bi se načinio kvasac koji se javlja u prirodi i koji može da fermentiše i glukozu i ksilozu. Genetske promene mogu da uključe, na primer, modifikacije koje uvode ekspresibilne nukleinske kiseline koje kodiraju metaboličke polipeptide, druge adicije nukleinske kiseline, delecije nukleinske kiseline i/ili drugo funkcionalno cepanje genetskog materijala kvasca. Takve modifikacije mogu da uključe, na primer, regione za kodiranje i njihove funkcionalne fragmente, za heterologne, homologne ili i heterologne i homologne polipeptide za referentnu vrstu. Dodatne modifikacije mogu da uključe, na primer, nekodirajuće regulatorne regione u kojima ta modifikacije menja izraz gena ili operona.

[0043] Kvasac koji se ne javlja u prirodi iz ovog opisa može da sadrži stabilne genetske promene, a koji se odnosi na kvasac koji može biti umnožen za više od pet gereracija bez gubitka promena. Uopšteno, stabilne genetske promene uključuju modifikacije koje perzistiraju više od 10 gereracija, naročito stabilne modifikacije će perzistirati više nego oko 25 gereracija, i posenbo naročito, stabilne genetske modifikacije biće veće od 50 gereracija, uključujući beskonačno.

[0044] Kvasac iz ovog opisa može biti odabran od bilo kog poznatg roda i vrste kvasaca. Kvasci su opisani na primer od strane N. J. W. Kreger-van Rij, "TheYeasts," Vol.1 of Biology of Kvasacs, Ch.2, A. H. Rose i J. S. Harrison, Eds. Academic Press, London, 1987. U jednom primeru izvođenja kvasac je izabran iz grupe koju čine Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Debaromyces, Nadsonia, Lipomyces, Torulopsis, Kloeckera, Pichia, Schizosaccharomyces, Trigonopsis, Brettanomyces, Cryptococcus, Trichosporon, Aureobasidium, Lipomyces, Phaffia, Rhodotorula, Yarrowia, i Schwanniomyces. Poželjno kvasac je odabran od Saccharomyces cerevisiae sojeva.

[0045] U opisanom postupku, glavni upotrebljeni izvor ugljenika je hidrolizat u obliku suspenzije izvedene od ligno-celuloznog sirovog materijala. Detaljan opis ligno-celuloznog sirovog materijala može biti nađen u WO2015028156A1,str.11-14,. Poželjan ligno-celulozni sirovi materijal izabran je iz grupe poljoprivrednih ostaka, naročito slame, kao što je pšenična slama, pirinčana slama, ili refuz, kao što je refuz šećerne trske. Takođe tvrdo i meko drvo imaju koristi od ovog postupka. Opciono, drugi izvor ugljenika, kao što je melasa ili sintetički šećeri mogu takođe da budu korišćeni, ali monomernih šećera hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala je poželjno najmanje 80mas.%, poželjnije najmanje 90%, i najpoželjnije najmanje 95% od ukupnog izvora ugljenika korišćenog u ovom postupku. U čak najpoželjnijem primeru izvođenja, hidrolizat ligno-celuloznog sirovog materijala je jedini izvor ugljenika korišćen u opisanom postupku za umnožavanje kvasca.

[0046] Suspenzija hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala je poželjno izveden od ligno-celuloznog sirovog materijala pomoću višefaznog postupka koji obuhvata prethodnu obradu ligno-celuloznog sirovog materijala za proizvodnju prethodno obrađenog ligno-celuloznog sirovog materijala i izlaganje prethodno obrađenog ligno-celuloznog sirovog materijala enzimskoj hidrolizi. Ta prethodna obrada povećava pristupnost u njemu cadržanih ugljenih hidrata dejstvu enzima. Poželjna prethodna obrada obuhvata hidrotermalnu obradu ligno-celuloznog sirovog materijala vodom u parnoj fazi u reaktoru pod pritiskom, a para izaziva eksploziju hidrotermalno tretiranog sirovog materijala brzim ispuštanjem the pritiska primenjenog na sirovi materijal. Hidrotermalna obrada sprovodi se poželjno na temperaturi u opsegu od 130°C to 230°C za vreme od 1 minut do 180 minuta. Reaktor je poželjno pod pritiskom parom na pritisku od najmanje 10 bar za dobijanje efektivnog razbijanja sirovog materijala.

[0047] U jednom primeru izvođenja, ligno-celulozni sirovi materijal je izložena postupu natapanja ili fazi radi uklanjanja dela ne-ligno-celuloznih jedinjenja sadržanih u sirovom ligno-celuloznom sirovom materijalu, kao što su neorganske soli, voskovi, i organske kiseline, pre hidrotermalnog tretiranja u reaktoru pod pritiskom. U fazi natapanja ili postupku, eksterni zagađivači, kao što je zemlja, kamenje i žetveni ostaci mogu takođe biti odvojeni. Taj postupak natapanja poželjno obuhvata uvođenje lignoceluloznog sirovog materijala u tečnost za natapanje, koja obuhvata vodu na temperaturi od 20°C do 100°C, poželjnije od 40°C i 70°C, i vreme natapanja koj je od 30 sekundi do 30 minuta, poželjnije od 3 minuta do 15 minuta.

[0048] Opciono, ligno-celulozni sirovi materijal je izložen preliminarnoj hidrotermalnoj obradi u vodu ili tečnost koja obuhvata vodu radi rastvaranja dela u vodi nerastvornih ugljenih hidrata sadržanih u lignoceluloznom sirovom materijalu pre nego što je uveden u reaktorsku posudu pod pritiskom. Preliminarna hidrotermalna obrada sprovedena je u uslovima pod pritiskom u prisustvo vodu, u parnoj ili tečnoj fazi, ili njihovoj mešavini, na temperaturi od 100°C do 190°C, poželjno od 130°C do 180°C, i najpoželjnije od 140°C do 170°C. Ta preliminarna hidrotermalna obrada je izvedena tokom vremena u opsegu od 10 minuta do 3 časa, poželjno od 15 minuta do 3 časa, i najpoželjnije od 20 minuta do 60 minuta. Ta preliminarna hidrotermalna obrada rastvara uglavnom hemiceluloznu komponentu ligno-celuloznog sirovog materijala koji može da bude izložen razgradnji toplotom pri višoj temperaturi, a tečnost koja obuhvata vodu i polimere i oligomere ksiloze rastvorne u vodi, i opciono druge iz hemiceluloze izvedene šećere, je na taj način razdvojena od čvrstog ligno-celuloznog sirovog materijala.

[0049] Prethodno obrađen ligno-celulozni sirovi materijal je izložen enzimskoj hidrolizi koja hidrolizuje polimerne i oligomerne šećeri do monomernih šećera, koji obuhvataju glukozu i ksilozu. Enzimska hidroliza obuhvata dovođenje u kontakt prethodno obrađene ligno-celuloznog sirovog materijala u obliku suspenzije sa enzimom ili kombinacijom enzima pri uslovima za promociju enzimske aktivnosti. Na taj način, suspenzija prethodno obrađenog ligno-celuloznog sirovog materijala obezbeđena mešanjem prethodno obrađenog ligno-celuloznog sirovog materijala sa tečnošću koja obuhvata vodu da bi imala sadržaj suve materije poželjno između 10% i 25%; opciono, kada se izvodi preliminarna hidrotermalna obrada, najmanje deo tečnosti koja obuhvata vodu i u njoj rastvorene polimere i oligomere, taj proizvod može takođe da bude korišćen. Enzimska hidroliza je tipično sprovedena pri pH između 4.5 i 5.0, na temperaturi između 45°C i 55°C, i tokom vremena hidrolize od 24 časa do 72 časova, pod agitacionim mešanjem.

[0050] Enzimska hidroliza može biti sproveden u jednoj ili više faza. Poželjno, enzimska hidroliza sprovedena je u dve faze u podeljenim posudama za hidrolizu. U prvoj fazi hidrolize fazas, koja je izvedenoj tokom vremena između 12 časova i 30 časova u prvoj posuda, dobijena je delimična hidroliza prethodno obrađenog ligno-celuloznog sirovog materijala za dobijanje the likvefakcije prethodno obrađenog ligno-celuloznog sirovog materijala, i na taj način je dobijena delimično hidrolizovana mešavina sa viskoznošću nižoj od one početne suspenzije. Delimično hidrolizovana mešavina je zatim premeštena u drugu posudu za hidrolizu, pri čemu je druga faza hidrolize je nastavljena za vreme između 12 časova i 60 časa do dobijanja suspenzije hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala koja obuhvata vodu, rezidual u vodi nerastvornog prethodno obrađenog ligno-celuloznog sirovog materijala i glukozu rastvornu u vodi i ksilozu, koji obuhvata glukozu i ksilozu. Ta suspenzija hidrolizata lignoceluloznog sirovog materijala može dalje da obuhvataju druge C6 i C5 rastvorane u vodi monomerne šećera, tipično pri koncentraciji nižoj nego one glukoze i ksiloze,respektivno.

[0051] Čak i poželjnije, enzimska hidroliza je sprovedena prema uputstvu iz WO2010113130. Deo zaostalog u vodi nerastvornog prethodno obrađenog ligno-celuloznog sirovog materijala može biti uklonjen iz suspenzije hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala. Razdvajanje zaostalog u vodi nerastvornog prethodno obrađenog ligno-celuloznog sirovog materijala može biti izvedeno, na primer, dekantovanjem, centrifugiranjem ili presovanjem suspenzije hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala, ili neke njegove kombinacije. Ipak, čak i ako prisustvo zaostalog u vodi nerastvornog prethodno obrađenog ligno-celuloznog sirovogog materijala u opisanom postupku umnožavanja može da oteža mešanje, neki od u vodi rastvornih monomernih šećera natopljenih u the zaostal čvrstom materijalu, mogu biti izgubljeni u fazi razdvajanja, te na taj način u poželjnom primeru izvođenja nije praktikovano uklanjanje čvrstog materijala.

1

[0052] Gore opisani postupak ili postupci da se stvori suspenzija hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala od ligno-celuloznog sirovog materijala su uzorni i poželjni primeri izvođenja za obezbeđivanje suspenzije hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala korišćene kao glavni izvor ugljenika za proizvodnju fermentacionog proizvoda prema opisanom postupku, i treba razumeti da nisu ni na koji način namenjeni ograničavanju obima ovog pronalaska.

[0053] Suspenzija hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala može da ima sadržaj suve materije između 5% i 30%, poželjno između 10% i 20%.

[0054] Suspenzija hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala ima koncentraciju glukoze koja može biti od 20g/Kg do 100g/Kg suspenzije hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala na vlažnoj osnovi, poželjno od 30g/Kg do 70g/Kg, i najpoželjnije od 40g/Kg do 50g/Kg.

[0055] Suspenzija hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala ima koncentraciju ksiloze koja može biti od 10g/Kg do 40g/Kg suspenzije hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala na vlažnoj osnovi, poželjno od 15g/Kg do 30g/Kg, i najpoželjnije od 20g/Kg do 25g/Kg.

[0056] Suspenzija hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala može dalje da obuhvata inhibiraorna jedinjenja odabrana iz grupe koju čine sirćetna kiselina, mravlja kiselina, furfurol i hidroksimetil furfurol (5-HMF), koja su formirana u prethodnim fazama ili postupcima prethodne obrade, i koja inhibiraju rast kvasca, uzrokujući najmanje kašnjenje u brzini rasta.

[0057] Naročito, sirćetna kiselina može da ima koncentraciju koj je u opsegu od 2g/Kg do 7g/Kg suspenzije hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala na vlažnoj osnovi.

[0058] Suspenzija hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala može dalje da sadrži biološke kantaminante, kako se tipično dešava u proizvodnji u idustrijskom obimu. Biološki kantaminanti su mikrobni organizami različiti od kvasca koji treba da bude umnožen prema opisanom postupku, a čije prisustvo je uopšteno veoma štetno za prinos prema opisanom postupaku, konzumirajuči deo monomernih šećera ukupno raspoloživih za rast of željenog kvasca. Biološki kantaminanti mogu da obuhvataju bakterije i gljive, kao i kvasce različite od željenog kvasca koji treba da bude umnožen, kao što su kvasci divljeg tipa. Bakterije mlečne kiseline, naročito Lactobacillus vrste, su primarni bakterijski zagađivači. Koncentracija mlečne kiseline fermentacionih mešavina obično se uzima kao mera stepena kontaminacije. Biološka kontaminacija kontrolisana je pomoću sterilizacije hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala, konvertujuće sredine, i opreme korišćene u ovom postupku, koja može biti postignuta dodavanjem anti-bakterijskih agenasa, kao što su antibiotici ili drugi aseptični agensi, ili procedurama sterilizacije, kao što je pasterizacija, primenom fizičkih agenasa, uključujući između ostalih, toplotu, svetlo izračenje, pre, između ili tokom proticanja tura fermentacije/umnožavanja. Pod "sterilizacija" ovde se podrazumeva smanjenje gustine bioloških kontaminanata faktorom najmanje 100. Upotrebu anti-bakterijskih agenasa i procedura sterilizacije, koja uvodi dodatne troškove, je poželjno izbegnuta u opisanom postupku, jednovremeno zadržavajući rast bioloških kontaminanata na značajno niskom nivou.

[0059] Poželjno, hidrolizat ligno-celuloznog sirovog materijala nije podvrgut bilo kakvoj fazi ili proceduri sterilizacije, koja bi bila teška i skupa za izvođenje u idustrijskom obimu.

[0060] Poželjno, nisu korišćeni anti-bakterijski agensi u opisanom postupku, niti su oni dodati u hidrolizat ligno-celuloznog sirovog materijala pre opisanog postupka.

[0061] Opisani postupak obuhvata najmanje dve faze konverzije, koje mogu biti sprovedene u jedinoj posudi ili u dve razdvojene posude. Kako bi se minimizirali troškovi, posuda ili posude poželjno nisu izložene bilo kojoj sterilizaciji i/ili čišćenju između i/ili tokom faza konverzije. Poželjno, sva faza konverzije sprovedena je na šaržni način, pri čemu je suspenzija hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala dodata pre početka faze konverzije, ili na početku faze konverzije.

[0062] Prva konvertujuća sredina koja obuhvata prvi deo hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala i polazna količina kvasca se prvo priprema. Radi ograničavanja efekta kompetitivnog rasta bioloških kontaminanata, u poželjnom primeru izvođenja suspenzija hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala je održavana na temperaturi od 45°C do 55°C pre nego što bude korišćena u opisanom postupku, i najpoželjnije pri temperaturi enzimske hidrolize ili finalne faze enzimske hidrolize. Pri ovoj temperaturi, aktivnost bioloških kantaminanata značajno je umanjena. Temperatura dela suspenzije hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala korišćenog u prvoj fazi konverzije je umanjena do temperature prva faze konverzije, koja je poželjno u opsegu od 28°C do 35°C. Izmenjivači toplote mogu biti korišćeni radi hlađenja prvog dela suspenzije hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala do temperature prve faze konverzije u prvoj konvertujućoj posudi ili pre ulaska u prvu konvertujuću posudu.

[0063] Voda ili tečnost koja obuhvata vodu, i opciono ograničene količine dodatnog izvora ugljenika različitih od suspenzije hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala može biti korišćena da se postigne željeni sadržaj suve materije. Jedna od prednosti koju nudi opisani postupak je mogućnost da bude sproveden pri višoj količini suve materije nego drugi poznati postupci koji koriste suspenziju lignoceluloznog hidrolizata kao glavni izvor ugljenika. Sadržaj suve materije po masi prve konvertujuće sredine je poželjno manji od 30%, a kako ne bi bilo teško da bude mešan, i poželjno je veći od 5%, poželjnije veći od 10%, čak i poželjnije veći od 15%, najpoželjnije veći od 20%. Voda ili tečnost koja obuhvata vodu mogu biti dodati na temperaturi koja je manja od prve temperature konverzije radi hlađenja prvog dela suspenzije hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala.

[0064] Zbog toga, gustina bioloških kontaminanata u prvoj konvertujućoj sredini na početku prve faze konverzije može biti držana na značajnom nivou, koji može biti u opsegu 10<0>CFU/ml do 10<6>CFU/ml, poželjno od 10<1>CFU/ml do 10<5>CFU/ml, i najpoželjnije od 10<2>CFU/ml do 10<3>CFU/ml prve konvertujuće sredine.

[0065] Prva konvertujuća sredina može dalje da obuhvataju izvor azota, tipično urea, koja je jeftin hranljivi izvor za kvasac, ali je poželjno bez dodatih vitamina i/ili elemenata u tragovima, koji se tipično koriste u laboratorijskom obimu kao suplementi rasta ali su mnogo skupi. Drugačije rečeno, poželjno je da se ne dodaju vitamini i/ili elementi u tragovima u suspenziju hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala i u konvertujuću sredinu tokom postupka ili u fazi pre postupka.

[0066] Poželjno, pH prve konvertujuće sredine je podešena na vrednost od 5.0 do 5.5, na primer dodavanjem odgovarajuće količine baze (NaOH rastvor). Ako je potrebn da se održi pH u željenom opsegu, dodatni alikvoti baze mogu biti dodati tokom prve faze konverzije.

[0067] Kvasac je dodat u prvu konvertujuću sredinu, ili u komponente korišćene za formiranje prve konvertujuće sredine. U jednom primeru izvođenja, kvasac je dodat u prvi deo suspenzije hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala korišćenog za formiranje prve konvertujuće sredine. Količina kvasca koja kontaktira prvu konvertujuću sredinu variraće prema ukupnoj zapremini prve konvertujuće sredine. Kvasac može biti sveži kvasac ili može biti kvasac proizvoden u prethodnim fazama umnožavanja ili konverzije. Poželjno, u prvoj fazi konverzije dodata je količina kvasca da ima početnu gustinu kvasca koja je između 1 x 10<6>i 1x 10<8>ćelija kvasca po miligramu prve konvertujuće sredine na vlažnoj osnovi.

[0068] U prvoj fazi konverzije, kvasac je održavan pod uslovima koji pospešuju konverziju glukoze rastvorne u vodi i ksiloze prve konvertujuće sredine do prvog umnoženog kvasca i prvog dela proizvoda fermentacije, pri čemu određena procentna količina potpuno konvertovane glukoze rastvorne u vodi i ksiloze je namenjena za rast biomase kvasca. Na taj način, prva faza konverzije je karakterisana prvim odnosom konverzije šećer-prema-ćelijama, koji je procentualni maseni odnos po masi glukoze rastvorne u vodi i ksiloze rastvorne u vodi konvertovane do prvog umnoženog kvasca, prema ukupnoj količini glukoze rastvorne u vodi i ksiloze potpuno konvertovanih u prvoj konvertujućoj sredini, na bazi ugljenika, a kako je to procentualni maseni odnos on je izražen kao procenat. Prvi odnos konverzije šećer-prema-ćelijama je u opsegu od 5% do 25%, poželjno od 5% do 20%, i najpoželjnije od 10% do 20%.

[0069] Radi izračunavanja odnosa konverzije šećer-prema-ćelijama faze konverzije, količina potpuno konvertovane glukoze rastvorne u vodi i ksiloze može biti izračunata oduzimanjem koncentracije glukoze rastvorne u vodi i ksiloze prisutnih u konvertujućoj sredini na kraju te faze konverzije od koncentracije glukoze rastvorne u vodi i ksiloze prisutnih u konvertujućoj sredini na početku te faze konverzije. Koncentracija šećera može biti određena standardnom HPLC analizom. Jasno je, ako je neka komponenta dodata u ili uklonjena iz konvertujuće sredine tokom te faze konverzije, ona mora biti uzeta u obračun utvrđivanja gustine, kao što je dobro poznato u analitičkoj hemiji. Na primer, voda može biti dodata u određeno vreme radi razblaživanja konvertujuće sredina, ali je potrebna korekcija pH, ili se dodaje dodatni šećer. U poželjnom primeru izvođenja, suspenzija hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala dalje obuhvata zaostali enzim iz faze ili faza hidrolize, čiji je deo još uvek aktivan. Čak ako uslovi konverzije nisu optimalni za enzimsku aktivnost, deo ugljenih hidrata nerastvornih u vodi u rezidualu u vodi rastvornog prethodno obrađenog ligno-celuloznog sirovog materijala može biti hidrolizovan dodavanjem u vodi rastvorne glukoze i ksiloze koje na taj način postaju raspoloživ kvascu. Takođe u ovom slučaju, ukupna količina glukoze i ksiloze konvertovana kvascem uzeće u obzir dodatnu u vodi rastvornu glukozu i ksilozu, što se može izračunati iz merenja količine u vodi nerastvoranih šećera

1

u rezidualu u vodi nerastvoranog prethodno obrađenog ligno-celuloznog sirovog materijala na kraju i na početku faze konverzije. Potpuno konvertovana glukoza rastvorna u vodi i ksiloza uzimaju u obzir takođe i iskorišćavanje šećera od strane bioloških kantaminanata.

[0070] Gustina ćelija kvasca u pogledu broja ćelija kvasca po jedinici zapremine može se odrediti brojem ćelija, ili alternativno pomoću merenja optičke transmitance. Kada je gustina kvasca poznata, srednja masa ćelija kvasca može se lako izračunati merenjem mase ćelija kvasca u referentnom uzorku koji ima referentnu gustinu kvasca.

[0071] Odnos konverzije šećer-prema-ćelijama faze konverzije izražen je na bazi ugljenika, a to je odnos između ugljenika sadržanog u biomasi kvasca na suvoj osnovi na kraju faze konverzije prema ugljeniku sadržanom u potpuno konvertovanoj u vodi rastvorna glukozi i ksilozi na suvoj osnovi.

[0072] Ugljenik sadržan u potpuno konvertovanoj u vodi rastvornoj glukozi i ksilozi može biti obračunat pomoću sadržaja ugljenika u u vodi rastvornoj glukozi i ksilozi prisutnih u konvertujućoj sredini na kraju i na početku faze konverzije, izmeren standardnom elementarnom analizom. Alternativno, on može biti izračunat iz koncentracije u vodi rastvorne glukoze i ksiloze konvertovanih kvascem koje su prisutne u konvertujućoj sredini na kraju i na početku faze konverzije, uzimajući u obzir stehiometrijske formule u vodi rastvorne glukoze i ksiloze.

[0073] Sadržaj ugljenika u kvascu može biti izmeren standardnom elementarnom analizom suvog kvasca. Alternativno, on se može smatrati referencom odnosa konverzije šećer-prema-ćelijama koji se obično koristi u struci [videti na primer The Alcohol Textbook, Fifth Edition, W.M. Ingledew et al., Nottingham University Press, Ethanol Technology Institute, 2009, p.133), koja je 0.50 g kvasca na suvoj osnovi po gram šećera. Na taj način, ako se 2 gr glukoze konvertuju samo u kvasac, proizvodi se 1 gr kvasca na suvoj osnovi. Na primer, ako se proizvede 1 gr kvasca i 10 gr glukoze su potpuno konvertovani, odnos konverzije šećer-prema-ćelijama je:

odnos konverzije šećer-prema-ćelijama = (1gr kvasca x 2gr glukoze po gramu kvasca)/10gr glukoze = 20%.

[0074] Isti referentni odnos konverzije 0.50 g kvasca na suvoj osnovi po gramu šećera takođe važi u slučaju ksiloze. Na taj način, dovoljno je izmeriti masu proizvedenog kvasca, na suvoj osnovi, i količinu ukupnih šećera, uključujući glukozu i ksilozu, radi lakog izračunavanja odnosa konverzije šećer-premaćelijama svake faze konverzije.

[0075] Kao što je poznato u ovoj struci, aerobni uslovi povećavaju količinu proizvedenog umnoženog kvasca. Aerobni uslovi karakterišu se srednjom zasićenošću kiseonikom u konvertujućoj sredini, koja je veća od 10%. Zasićenje kiseonikom je odnos koncentracije rastvorenog kiseonika (O2) u konvertujućoj sredini prema maksimalnoj količini kiseonika koja se rastvara u konvertujućoj sredini na temperaturi i pritisku stabilne ravnoteže. Na taj način, protok kiseonika, vazduha ili druge gasne mešavine koja sadrži kiseonik u protoku od 1 vvm ili većem obično se uvodi u konvertujuću sredinu. Da bi se pospešila difuzija kiseonika u konvertujućoj sredini, agitacija ili mešanje konvertujuće sredine se takođe tipično primenjuje, što je teško ili skupo pri visokoj količini suve materije, zbog visoke viskoznosti konvertujuće sredine.

[0076] U opisanom postupku, prvi odnos konverzije šećer-prema-ćelijama na kraju prve faze konverzije je poželjno dobijen održavanjem aerobnih uslova samo za deo prve faze konverzije. Drugačije rečeno, u odnosu na sreednju zasićenost kiseonikom u konvertujućoj sredini, prva faza konverzije obuhvata najmanje dve faze, prvu fazu koja je aerobna faza, praćenu drugom fazom koja je anaerobna faza. U poželjnom primeru izvođenja, aerobna faza je na početku prve faza konverzije, i postiže se uvođenjem vazduha umerenim protokom koji je u opsegu od 0.1vvh do 10 vvh, poželjno od 0.1vvh do 5 vvh, i najpoželjnije od 0.5vvh do 3 vvh. Prvi deo suspenzije hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala je uveden u prvu konvertujuću posudu gravitacijom iz ulaza smeštenog na dovoljnoj visini da se formiraju mehurovi u suspenziji hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala ili konvertujućoj sredini koja je već prisutna u prvoj konvertujućoj posudi. Prvi deo suspenzije hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala može biti uveden kako bi se formirala kaskada radi iskorišćavanja prirodne oksigenacije suspenzije hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala do koje dolazi tokom transfera u prvu konvertujuću posudu. Početni nivo zasićenja kiseonikom ima visoku vrednost, koja je poželjno veća od 40%, i najpoželjnije veća od 80%, i opada tokom prve faze konverzije, zbog umerene brzine protoka vazduha. umerena brzina protoka vazduha koristi se za usporavanje prirodnog smanjenja početnog nivoa zasićenja kiseonikom, da bi se dobila aerobna faza koja je poželjno od 3 časa do 12 časova, poželjnije od 5 časa do 10 časova, i najpoželjnije od 7 časa do 8 časova. Tokom prve faze konverzije, prva konvertujuća sredina je održavana umerenim mešanjem tokom najmanje dela prvog vremena konverzije kako bi poboljšala difuzija kiseonika. Agitacija može se izvesti pomoću mehaničkih sredstava za mešanje. Mešanje je obezbeđeno da uspori i homogenizuje prirodno smanjenje početnog nivoa zasićenja kiseonikom, i umerena snaga je dovoljna za dobijanje aerobnih uslova tokom vremena u željenim opsezima, čak i u slučaju suspenzije visokog sadržaja suve materije. Korišćena snaga za mešanje prve konvertujuće sredine može biti izmerena u pogledu električne snage korišćene za mešanje jedne tone prve konvertujuće sredine na vlažnoj osnovi, koja je potrošnja snage po masi, a srednja potrošnja sange po masi je manja od 100W/toni prve konvertujuće sredine na vlažnoj osnovi poželjno korišćenoj u opisanom postupku.

[0077] Brzine iskorišćavanja glukoze i ksilozu su važan parametar opisanog postupka, naročito u slučaju da hidrolizat ligno-celuloznog sirovog materijala obuhvata neke biološke kantaminante i da nisu korišćeni sterilizacija i anti-bakterijski agensi, jer u tim uslovima povećava kompetitivni rast bioloških kontaminanata. Iskorišćavanje glukoze kvascem favorizovano je u odnosu na iskorišćavanje ksiloze, čime se koncentracija glukoze smanjuje u konvertujućoj sredini, dok iskorišćavanje ksiloze neće biti značajno dok se koncentracija glukoze ne smanji ispod određene kritične vrednosti. Kako se afinitet kvasca prema preostalim šećerima (glukoza i ksiloza) u konvertujućoj sredini smanjuje, ukupna kombinovana brzina iskorišćavanja glukoze i ksiloze kvascem vremenom će se smanjivati, omogućavajući kompetitivni rast

1

bioloških kontaminanata. Na taj način, u opisanom postupku, prva faza konverzije je produžena dovoljno vremena za konzumiranje najmanje 50% glukoze sadržane u polaznoj konvertujućoj sredini, i manje od 20% ksiloze sadržane u polaznoj konvertujućoj sredini. Smatra se da je konzumiranje glukoze i ksiloze ukupno konzumiranje koje se odigrava tokom faze konverzije, i može se utvrditi merenjm odgovarajuće koncentracije šećera u konvertujućoj sredini. Na taj način, ukupno kombinovano konzumiranje glukoze i ksiloze do koga dolazi u prvoj fazi konverzije uključuje i kombinovano iskorišćavanje glukoze i ksiloze od strane bioloških kantaminanata, koje se smatra minimiziranim u opisanom postupku, a šećer je na kraju konvertovan u proizvod fermentacije. Radi poboljšanja prinosa ovog postupka u pogledu proizvedene biomase kvasca, poželjno je da se prva faza konverzije izvodi tokom prvog vremena konverzije dovoljnog za konzumiranje najmanje 70% glukoze polazne konvertujuće sredine, i najpoželjnije najmanje 80%. Jednovremeno, za izbegavanje da ukupna brzina iskorišćavanja šećera dostigne kritičnu vrednost za kompetitivni rast bioloških kontaminanata, poželjno prva faza konverzije se produžava za prvo vreme konverzije dovoljno za konzumiranje manje od 10% ksiloze u polaznoj konvertujućoj sredini, najpoželjnije manje od 5%. Dalje se smatra da je ukupna količina konzumirane ksiloze u prvoj fazi konverzije poželjno veća od 0, u neki slučajevima ksiloza ne može biti značajnije konzumirana najmanje u prvoj fazi konverzije. Prva faza konverzije može biti izvedena tokom prvog vremena konverzije koje je kraće od 30 časova, ali poželjno kraće od 20 časova, poželjnije kraće od 15 časova, i najpoželjnije kraće od 10 časova.

[0078] Na kraju prve faze konverzije, dobija se bujon prve konverzije koji obuhvata vodu, prvi umnoženi kvasac i prvi deo proizvoda fermentacije. Količina prvog umnoženog kvasca koja može biti od 5 do 15 puta odgovarajuća polazna količina kvasca, rezultat je aerobnih uslova stvorenih tokom dela prvog vremena konverzije. Isti poželjan opseg se primenjuje na gustinu ćelija kvasca. Poželjno, u prvoj fazi konverzije konačna gustina kvasca je između 1 x 10<7>i 1x 10<9>ćelija kvasca po miligramu prve konvertujuće sredine na vlažnoj osnovi. Bujon prve konverzije dalje obuhvata u vodi rastvornu glukozu i ksilozu koje nisu konzumirane od strane kvasca, i zaostali u vodi nerastvorni prethodno obrađeni lignocelulozni sirovi materijal.

[0079] Prvi umnoženi kvasac je zatim korišćen u drugoj fazi konverzije radi konvertovanja drugog dela suspenzije hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala. U poređenju sa prvom fazom konverzije, druga faza konverzije se fokusira na proizvodnju proizvoda fermentacije, ali jednovremeno konvertuje malu količinu u vodi rastvorne glukoze i ksiloze u drugu biomasu kvasca. Za razliku od prve faze konverzije, druga faza konverzije konvertuje većinu raspoložive u vodi rastvorne glukoze i ksiloze, i moguće svu u vodi rastvornu glukoza i ksilozu, zbog čega je drugoj fazi konverzije potrebno duže vreme nego prvoj fazi konverzije. Druga faza konverzije se sprovedi radi postizanja većeg prinosa konverzije šećera nego prva faza konverzije, i druga biomasa kvasca se zbog toga proizvodi kako bi se vreme druge konverzije održalo što je moguće kraćim, što ograničava rast bioloških kontaminanata. Druga faza konverzije je sprovedena da ima drugi odnos konverzije šećer-prema-ćelijama koji je manji od prvog

1

odnosa konverzije šećer-prema-ćelijama. Drugi odnos konverzije šećer-prema-ćelijama je poželjno veći od 2%. Čak i ako neka ograničena količina kvasca eksterna u odnosu na opisan postupak može biti dodata u drugoj fazi konverzije, poželjno je da se koristi samo prvi umnoženi kvasac, ili najmanje njegov deo. Vreme druge konverzije je veće od vremena prve konverzije i poželjno kraće od 72 časova, poželjnije kraće od 60 časova, i najpoželjnije kraće od 50 časova. U bilo kom slučaju, poželjno je da se najmanje 80% u vodi rastvorne glukoze i ksiloze ukupno raspoložive u drugoj konvertujućoj sredini konvertuje u drugoj fazi konverzije.

[0080] Druga konvertujuća sredina priprema se od najmanje dela prvog umnoženog kvasca i drugog dela suspenzije hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala. Procedura korišćena za formiranje druge konvertujuće sredine je slična proceduri za formiranje prve konvertujuće sredine, i isti poželjni primeri izvođenja primenjuju mutatis mutandis za pripremu druge konvertujuće sredine. U poželjnom primeru izvođenja, prvi umnoženi kvasac nije razdvojen od bujona prve konverzije pre njegovog korišćenja za stvaranje druge konvertujuće sredine, i najmanje deo prvog naseljenog bujona i drugi deo suspenzije hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala su umešani zajedno u drugoj konvertujućoj posudi kako bi se formirala druga konvertujuća sredina. Zaostale u vodi rastvorne glukoza i ksiloza koje nisu konvertovane u prvoj fazi konverzije su zato raspoložive da budu konvertovane u drugoj fazi konverzije i nisu izgubljene. U ovom primeru izvođenja, druga konvertujuća sredina pre početka druge faze konverzije i dalje će sadržati prvi deo proizvoda fermentacije proizvedenog u prvoj fazi konverzije. Poželjno, količina bujona prve konverzije i drugog dela suspenzije hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala odabrani su da imaju početnu gustinu kvasca u drugoj fazi konverzije koja je veća od početne gustine kvasca u prvoj fazi konverzije. Visoka polazna gustina kvasca je poželjna za skraćenje vremena druge konverzije. Početna gustina kvasca u drugoj fazi konverzije može biti između 1 x 10<6>i 1x 10<8>ćelija kvasca po miligramu druge konvertujuće sredine na vlažnoj osnovi. Bujon prve konverzije i drugi deo suspenzije hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala su poželjno u masenom odnosu na vlažnoj osnovi koji je od 1:2 do 1:10, i najpoželjnije od 1 : 3 do 1 : 8.

[0081] Kao u prvoj fazi konverzije, takođe u drugoj fazi konverzije drugi deo suspenzije hidrolizata lignoceluloznog sirovog materijala poželjno se održava na temperaturi od 45°C do 55°C pre nego što bude korišćen za stvaranje druge konvertujuće sredine, radi ograničavanja efekta kompetitivnog rasta bioloških kontaminanata.

[0082] Zbog toga, gustina bioloških kontaminanata u drugoj konvertujućoj sredini pre poćetka druge faze konverzije može da se održava na značajnom nivou, koji može biti u u opsegu 10<0>CFU/ml do 10<6>CFU/ml, poželjno od 10<1>CFU/ml do 10<5>CFU/ml, i najpoželjnije od 10<2>CFU/ml do 10<3>CFU/ml druge konvertujuće sredine.

[0083] Kako bi se drugi odnos konverzije šećer-prema-ćelijama održao niskim, druga faza konverzije sprovodena je u anaerobnim uslovima, ili prevashodno u anaerobnim uslovima, to jest anaerobni uslovi su održavaju za najmanje 80% vremena druge konverzije. Ako je prisutna, aerobna faza može biti

1

prisutna poželjno na početku druge faze konverzije. Naime, slično prvoj fazi konverzije, drugi deo suspenzije hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala i/ili prvi naseljeni bujon su poželjno uvedeni u prvu konvertujuću posudu gravitacijom iz ulaza smeštenog na dovoljnoj visini da se formiraju mehurovi u suspenziji hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala i/ili konvertujućoj sredini koja je već prisutna u drugoj konvertujućoj posudi. Suspenzija hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala može biti uvedena kako bi se formirala kaskada radi iskorišćavanja prirodne oksigenacije suspenzije hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala do koje dolazi tokom transfera u drugu konvertujuću posudu.

Poželjno, vazduh nije uveden u drugoj fazi konverzije.

[0084] Tokom druge faze konverzije, druga konvertujuća sredina može biti održavana umerenim mešanjem tokom najmanje dela vremena druge konverzije kako bi se poboljšala homogenost suspenzije. Agitacija može da se postigne pomoću mehaničkih sredstava za mešanje. Mešanje je obezbeđeno da uspori i homogenizuje prirodno smanjenje početnog nivoa zasićenja kiseonikom.

Korišćena je snaga za mešanje druga konvertujuće sredine. Srednja potrošnja sange po masi koja je manja od 100W/toni druge konvertujuće sredine na vlažnoj osnovi je poželjno korišćena.

[0085] Druga faza konverzije proizvodi drugi bujon fermentacije u obliku suspenzije, koji obuhvata vodu, proizvod fermentacije i zaostali u vodi nerastvoran prethodno obrađen ligno-celulozni sirov materijal. Proizvod fermentacije može biti odvojen i izvučen iz bujona druge fermentacije.

Eksperimentalni deo

Pripremanje hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala

[0086] Pšenična slama je odabrana za dokazivanje opisanog postupka.

[0087] Prvo, sirovi materijal je izložen u postupku prethodne obrade, primenom preliminarne hidrotermalne obrade na temperaturi od 158°C tokom 65 minuta, sa prvim rastvaranjem sirovog materijala. Postupak je proizveo suspenziju predhodno obrađenog sirovog materijala, koja je podeljena u tečni deo, koji obuhvata uglavnom ksilooligomere, i čvrsti deo pomoću presovanja. Čvrsti deo je izložen hidrotermalnoj obradi parom na 204°C tokom 4 minuta, praćeno eksplozijom pare, kako bi se pripremio čvrst prethodno obrađeni ligno-celulozni sirovi materijal.

[0088] Čvrst prethodno obrađen ligno-celulozni sirovi materijal i tečni deo koji obuhvata ksilooligomere umešani su u bioreaktoru, i dodata je voda za dobijanje suspenzije prethodno obrađenog lignoceluloznog sirovog materijala sa sadržaj suve materije od 15mas.%, pH je podešen na 5,0±0,2 dodavanjem NaOH, zatim je suspenzija prethodno obrađenog ligno-celuloznog sirovog materijala izložena enzimskoj hidrolizi.

[0089] Komercijalni enzimski koktel CTec3 od Novozymes, koji može da hidrolizuje i C6 i C5 šećere, dodat je tako da odgovara dozi od 7% proteina mg po gramima glukana u prethodno obrađenom ligno-

1

celuloznom sirovom materijalu i suspenzija je hidrolizovana na 50°C uz kontinuirano mešanje tokom 72 časova.

[0090] Dobijeni hidrolizat ligno-celuloznog sirovog materijala bila je suspenzija, sa suvom materijom od 15mas.%, koja obuhvata tečnu frakciju i zaostali u vodi nerastvoran prethodno obrađeni ligno-celulozni sirov materijal.

[0091] Suspenzija hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala je održavana na temperaturi od 50°C do njene upotrebe u sledećim eksperimentima umnožavanja. Nisu uvedeni antibiotici.

Eksperimenti konverzije

[0092] Opisan postupak dokazan je i u laboratorijskom obimu i u idustrijskom obimu. Eksperimenti su izvedeni bez bilo koje sterilizacije između faza konverzije, i između eksperimenata.

Laboratorijski obim

Prvi laboratorijski eksperiment

[0093] U prvoj fazi konverzije, prva konvertujuća sredina je formirana uvođenjem zapremine od 1.21 vruće suspenzije hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala u prvi bioreaktor i obogaćenjem sa rastvorom uree pri 1.5 g/l. pH je podešen na 5,2±0,1 NaOH kontrolom. Nisu korišćeni vitamini i drugi nutritijenti. Konvertujuća sredina je ohlađena do 32°C pre uvođenja kvasca. Suve materije je bilo oko 15%. Sastav na vlažnoj osnovi prve konvertujuće sredine, koji približno odgovara sastavu suspenzije hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala, je dat u tabeli 1. Sastavi su dati u pogledu komponenata rastvornih u vodi koje su relevantne za ovaj postupak i zaostali u vodi nerastvoran prethodno obrađen ligno-celulozni sirovi materijal je podeljen na svoje glavne komponente (nerastvorane glukane, nerastvorne ksilane i lignin i ostale nerastvorne supstance). Sirćetna kiselina, mravlja kiselina, furfurol, hidroksimetil furfurol su inhibirajuća jedinjenja za umnožavanje kvasca.

[0094] Mlečna kiselina je proizvod bakterijske kontaminacije i zbog toga se smatra kao marker bakterijskog prisustva. Na taj način, određena biološka kontaminacija je prisutno u hidrolizatu lignoceluloznog sirovog materijala.

[0095] Prva faza konverzije je sprovedena uz agitaciju mešanjem sredine za uzgajanje propelerom pri 300 o/min u šaržnoj konfiguraciji, uz uvođenje protoka vazduha od 1 VVh. VVh odgovara količini gasa koji protiče po zapremini konvertujuće sredine po času.

[0096] Gustina ćelija kvasca ej određena brojanjem ćelija (Neubauer cell counting chamber) i sastav prve konvertujuće sredine je analiziran pomoću HPLC radi određivanja koncentracije zaostale glukoze i ksiloze i kritičnih jedinjenja za svako umnožavanje kvasca. Oba merenja su izvedena na početku i na kraju faze konverzije.

1

[0097] Komercijalni genetski modifikovan kvasac CelluX™2 nabavljen od Leaf Technologies, koji može da fermentiše glukozu i ksilozu, unet je u prvu konvertujuću sredinu pri početnoj gustini kvasca od 1,3 x 10<7>ćelija kvasca po miligramu prve konvertujuće sredine, što odgovara 0.2 g kvasca na suvoj osnovi po gramu prve konvertujuće sredine.

[0098] Prva faza konverzije izvedena je tokom prvog vremena konverzije od 14 časova radi uzimanja u obzir početnu fazu pauze potrebnu da se kvasac prilagodi konvertujućoj sredini. Zasićenje kiseonikom, pO2, izmereno je tokom faze konverzije pomoću pO2sonde Mettler Toledo InProbe 6820 uronjene u konvertujuću sredinu posle kalibracije i prikazan je na Fig.1. pO2je ostao na gotovo stabilnom nivou biskom oko 70% tokom oko 3 časa, što ukazuje da je kvasac bio gotovo neaktivan kao što se očekivalo tokom te faze pauze, a zatim se progresivno smanjuje do 10% tokom oko 6.5 časova.

[0099] Koncentracija ćelija kvasca od 1.5 x 10<8>ćelija kvasca po miligramu postignuta je u bujonu prve konverzije. Performanse rasta su procenjene izračunavanjem faktora rasta, koji je odnos između koncentracije ćelija kvasca na kraju i na početku te konverzije. Dobijen je faktor rasta od oko 11.5 u prvoj fazi konverzije, što odgovara oko 2 g kvasca na suvoj osnovi po Kg prve konvertujuće sredine.

[0100] Sastav bujona prve konverzije je iznet u tabeli 1. Uprkos prisustva zaostalih enzima iz prethodne faze hidrolize, visoka koncentracija šećera u bujonu konverzije inhibirala je dalju hidrolizu oligomernih šećera i nerastvornih glukana i ksilana.

[0101] Oko 33.9 g/Kg konvertovane glukoze (što odgovara oko 76 % početne glukoze) i oko 1.3 g/Kg ksiloze (što odgovara oko 7 % početne ksiloze) su konzumirani u prvoj fazi konverzije. Uzimajući u obzir referentni odnos konverzijae od 0.50 g kvasca po gramu šećera, oko 4.2 gr šećera iz prve konvertujuće sredine je na ovaj način konvertovano u kvasac, po Kg sredine za uzgajanje, sa odnosom konverzije šećer-prema-ćelijama od oko 11%.

2

[0102] Koncentracija mlečne kiseline nije se značajno povećala, što ukazuje da je umnožavanje bakterijskih kontaminanata bilo na razum,nim nivoima. Takođe je proizvedena izvesna količina etanola.

[0103] U drugoj fazi konverzije, alikvot od 960 ml vrućeg hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala je uvedeno u drugi bioreaktor, identičan prvom bioreaktoru, ohlađen do oko 32°C, zatim je dodata zapremina od 240 ml bujona prve konverzije da bi se formirala druga konvertujuća sredina. pH je podešeno na 5±0,1 rastvorm NaOH i obogaćeno rastvorom uree sa 1.0 g/l. Na taj način, u drugoj fazi konverzije, zapremin bujona prve konverzije bila je oko 1:5 ukupne zapremine druge konvertujuće sredine. Sastav druge konvertujuće sredine dat je u Tabeli 1. Zapaža se da druga konvertujuća sredina sadrži nešto etanola iz bujona prve konverzije razblažen sa svežom suspenzijom hidrolizata lignoceluloznog sirovog materijala; koncentracija etanola bila je dovoljno niska da ne stvara probleme fazi druge konverzije. Polazne koncentracije glukoze i ksiloze bile su niže nego u fazi prve konverzije, a nešto šećera je konzumirano.

[0104] Početna gustina kvasca bila je oko 3,2 x 10<7>ćelija kvasca po miligramu druge konvertujuće sredine, što odgovara oko 0.5 g kvasca na suvoj osnovi po gramu druge konvertujuće sredine. PO2 koncentracija druge faze konverzije, date na Fig.1, smanjena je od 50% do 10% tokom oko 2 časa.

[0105] Druga konverzija izvedena je tokom 48 časova u odsustvu toka vazduhe, u šaržnoj konfiguraciji, uz održavanje temperature od 32°C pod mešanjem pri 300 o/min. U drugoj fazi konverzije, enzimska hidroliza zaostalog u vodi nerastvornog prethodno obrađenog ligno-celuloznog sirovog materijala je nastavljena enzimima sadržanim u hidrolizatu ligno-celuloznog sirovog materijala, a kvascu su bile dostupni izvesni dodatni šećeri.

[0106] Koncentracija ćelija kvasca od 1.6 x 10<8>ćelija kvasca po miligramu postignuta je u bujonu druge konverzije, čime je dobijen faktor rasta od oko 5, što odgovara oko 2.5 g kvasca na suvoj osnovi po Kg druge konvertujuće sredine.

[0107] Sastaci bujona druge konverzije pokazuju da su gotovo svi monomerni šećeri konzumirani u drugoj konvertujućoj sredini umnožavanjem kvasca, kao i dodatni monomerni šećeri hidrolizovani u fazi druge konverzije, koja je zadržala sposobnost da fermentiše i glukozu i ksilozu. Oko 55 gr šećera/Kg prve konvertujuće sredine je na taj način konvertovano u kvasac, sa odnosom konverzije šećer-premaćelijama od oko 9%.

[0108] Bakterijska kontaminacija bila je vrlo niska ili zanemarljiva, što je evidentirano koncentracijom mlečne kiseline, koja je bila stabilna.

[0109] Efikasnost celog postupka konverzije tipično je opisan putem faktora konverzije šećer-premaetanolu na bazi ugljenika. Kao što je u ovoj struci poznato, idealan faktor konverzije šećer-premaetanolu je 0.51. Ovo odgovara maksimalnoj konverziji šećera u etanol, bez umnožavanja kvasca, kao što je opisano stehiometrijskim formulacijama. Ukupni faktor konverzije šećer-prema-etanolu je oko 0.43, što pokazuje da opisani postupak dostiže visok prinos etanola sa vrlo malom količinom kvasca eksterno u odnosu na postupak.

Drugi laboratorijski eksperiment

[0110] Drugi eksperiment je izveden kao prvi eksperiment, ali zaostali alikvot bujona prve konverzije u prvom eksperimentu je upotrebljen kao inokulum umesto svežeg suvog kvasca. Pored toga, prva faza konverzije izvedena je tokom 6 časova, jer je kvasac već bio adaptiran na konvertujuću sredinu. Sastav konvertujuće sredine i bujona dat je u Tabeli 1. Sadržaj glukoze u prvoj konvertujućoj sredini bio je nešto niži nego u prvom eksperimentu, jer je nešto glukoze u zaostalom alikvotu iz prvog eksperimenta bilo konvertovano. Pored toga, nešto etanola bilo je prisutno ali ne do problematičnog nivoa. pO2faze prve konverzije dat je na FIG.1. pO2faze druge konverzije bio je gotovo identičan odgovarajućoj fazi prvog eksperimenta.

[0111] Glavni parametri i rezultat faze prve konverzije:

Polazna gustina kvasca : 5.3 x 10<7>ćelija kvasca po miligramu

Finalna gustina ćelija kvasca: 1.7 x 10<8>ćelija kvasca po miligramu

Faktor rasta: oko 3.2

Masa proizvoda kvasca: 1.8 g kvasca na suvoj osnovi po Kg

Ukupni konvertovani šećeri: 26g/Kg

Odnos konverzije šećer-prema-ćelijama: 13.4%.

[0112] Glavni parametri i rezultat faze druge konverzije:

Polazna gustina kvasca : 3.4 x 10<7>ćelija kvasca po miligramu

Finalna gustina ćelija kvasca: 1.5 x 10<8>ćelija kvasca po miligramu

Faktor rasta: oko 4.4

Masa proizvoda kvasac: 1.8 g kvasca na suvoj osnovi po Kg

Ukupni konvertovani šećeri: 59g/Kg

Odnos konverzije šećer-prema-ćelijama: 8%.

Ukupni faktor konverzije šećer-prema-etanol čitavog postupka: 0.43.

Validacija u idustrijskom obimu

[0113] Postupak konverzije testiran je na opremi u idustrijskom obimu. Korišćena procedura je transponovana od eksperimenata u laboratorijskom obimu.

[0114] Faza prve konverzije je sprovedena u prvoj cilindričnoj posudi. Agitacija je obezbeđena propelerom koaksijalnim sa osom posude, rotiran pri 38 o/min.

[0115] Faza druge konverzije je sprovedena u drugoj cilindričnoj posudi. Agitacija je obezbeđena propelerom koaksijalnim sa osom posude, rotiran pri 20 o/min.

[0116] pO2 je izmereno pomoću skupa sondi smeštenim u različitim položajima unutar konvertujuće sredine.

[0117] pO2krive pokazuju profile slične eksperimenata u laboratorijskom obimu.

[0118] Prva konvertujuća posuda je napunjena sa 350 m<3>prve sredine za uzgajanje i faza prve konverzije je sproveden za 18 časova. Faza druge konverzije je sprovedena za 60 časova na 1200 m<3>ukupne druge sredine za uzgajanje, koja je formirana prema odnosu 4:1 (svež hidrolizat : prvi konvertovani bujon).

[0119] Oba eksperimenta u laboratorijskom obimu povećani su na idustrijski obim.

[0120] Glavni parametri i rezultat faze prve konverzije:

2

[0121] Srednja potrošnja električne energije bila je oko 90W/toni prve konvertujuće sredine na vlažnoj osnovi tokom čitavog postupka.

[0122] Različite izvedbe su sprovedene, sa srednjom potrošnjom električne energije manja od 100W/toni prve konvertujuće sredine. U nekim slučajevima, postignuta je srednja potrošnja električne energije manja od 80W/toni.

[0123] Validacija u idustrijskom obimu pokazuje da opisani postupak može da dostigne visok prinos etanola sa minimalnom količinom kvasca eksternom u odnosu na postupak, malom bakterijskom kontaminacijom i veoma malom potrošnjom energije.

Claims (19)

Patentni zahtevi

1. Postupak za proizvodnju fermentacionog proizvoda iz suspenzije hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala koji obuhvata vodu, glukozu rastvornu u vodi i ksilozu rastvornu u vodi, i u vodi nerastvoran prethodno obrađen lignocelulozni sirov materijal, pri čemu pomenuti postupak obuhvata faze:

pripremanje prve konvertujuće sredine, koja obuhvata prvi deo suspenzije hidrolizata lignoceluloznog sirovog materijala i kvasac koji može da konvertuje glukozu i ksilozu, do umnožavanja kvasca i fermentacionog proizvoda;

omogućavanja kvascu da konvertuje najmanje 50% glukoze rastvorne u vodi i manje od 20% ksiloze rastvorne u vodi prve konvertujuće sredine do prvog umnoženog kvasca i prvi deo proizvoda fermentacije u prvoj fazi konverzije izvedenoj tokom prvog vremena konverzije i ima prvi odnos konverzije šećer-prema-ćelijama u opsegu od 5% do 25%, pri čemu je prvi odnos konverzije šećer-prema-ćelijama procentualni maseni odnos glukoze i ksiloze konvertovanih u umnoženom kvascu u prvoj fazi konverzije u glukozu rastvornu u vodi i ksilozu potpuno konvertovanu u prvoj konvertujućoj sredini, na bazi ugljenika;

pripremanje druge konvertujuće sredine koja obuhvata najmanje deo prvog umnoženog kvasca i drugi deo suspenzije hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala;

omogućavanja kvascu da konvertuje najmanje deo glukoze rastvorne u vodi i ksilozu u drugoj konvertujućoj sredini do najmanje drugog umnoženog kvasca i drugog dela proizvoda fermentacije u drugoj fazi konverzije izvedenoj tokom drugog vremena koje je veće od prvog vremena konverzije i ima drugi odnos konverzije šećer-prema-ćelijama koj je manji od prvog odnosa konverzije šećer-prema-ćelijama, pri čemu je drugi odnos konverzije šećer-premaćelijama procentualni maseni odnos glukoze rastvorne u vodi i ksiloze konvertovanih u umnoženom kvascu u drugoj fazi konverzije u potpuno konvertovanu glukozu rastvornu u vodi i ksilozu u drugoj konvertujućoj sredini, na bazi ugljenika.

2. Postupak prema zahtevu 1, pri čemu prva faza konverzije obuhvata najmanje prvu fazu koja je aerobna faza i drugu fazu koja je anaerobna faza, pri čemu je aerobna faza izvedena tokom vremena u opsegu od 3 časa do 12 časova.

3. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 2, pri čemu je prva faza konverzije izvedena tokom prvog vremena konverzije koje je manje od 30 časova..

2

4. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri čemu je prva faza konverzije sprovedena uvođenjem vazduha u protoku koj je u opsegu od 0.1vvh do 10 vvh.

5. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu je prva faza konverzije sprovedena mešanjem prve konvertujuće sredine pri gustini snage prema masi od manje od 100W/t prve konvertujuće sredine na vlažnoj osnovi.

6. Postupak prema bilo kom od zahteva 4 do 5, pri čemu je prvi odnos konverzije šećer-prema-ćelijama u opsegu od 5% do 20%..

7. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri čemu je druga faza konverzije izvedena tokom drugog vremena konverzije, koje je manje od 72 časa.

8. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 7, pri čemu je druga faza konverzije sprovedena u anaerobnim uslovima tokom najmanje 80% drugog vremena konverzije.

9. Postupak prema zahtevu 8, pri čemu su najmanje 80% glukoze rastvorne u vodi i ksiloza konvertovane u drugoj fazi konverzije.

10. Postupak prema bilo kom od zahteva 7 do 8, pri čemu je drugi odnos konverzije šećer-premaćelijama veći od 2%.

11. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 10, pri čemu prva konvertujuća sredina i druga konvertujuća sredina imaju sadržaj suve materije, koji je manji od 30% i veći od 5%.

12. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 11, pri čemu prva konvertujuća sredina i druga konvertujuća sredina dalje obuhvataju izvor azota.

13. Postupak prema zahtevu 12, pri čemu u postupku nisu dodati vitamini i/ili elementi u tragovima.

14. Postupak prema bilo kom od zahteva 12 do 13, pri čemu suspenzija hidrolizata ligno-celuloznog sirovog materijala nije podvrguta bilo kakvoj sterilizaciji.

15. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 14, pri čemu prva faza konverzije ima početnu gustinu kvasca između 1 x 10<6>i 1x 10<8>ćelija kvasca po miligramu prve konvertujuće sredine na vlažnoj osnovi.

16. Postupak prema zahtevu 15, pri čemu prva faza konverzije ima konačnu gustinu kvasca, koja je između 1 x 10<7>i 1x 10<9>ćelija kvasca po miligramu prve konvertujuće sredine na vlažnoj osnovi.

17. Postupak prema bilo kom od zahteva 15 do 16, pri čemu druga faza konverzije ima početnu gustinu kvasca koja je veće od početne gustine kvasca u prvoj fazi konverzije.

18. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 17, pri čemu se prva faza konverzije i druga faza konverzije šprovode u razdvojenim sudovima.

19. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 18, pri čemu je proizvod fermentacije etanol.

2