RS58879B1 - Analiza genoma fetusa iz majčinskog biološkog uzorka - Google Patents

Analiza genoma fetusa iz majčinskog biološkog uzorka

Info

Publication number
RS58879B1
RS58879B1 RS20190421A RSP20190421A RS58879B1 RS 58879 B1 RS58879 B1 RS 58879B1 RS 20190421 A RS20190421 A RS 20190421A RS P20190421 A RSP20190421 A RS P20190421A RS 58879 B1 RS58879 B1 RS 58879B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
genome
maternal
fetal
allele
loci
Prior art date
Application number
RS20190421A
Other languages
English (en)
Inventor
Yuk Ming Dennis Lo
Kwan Chee Chan
Wai Kwun Rossa Chiu
Charles Cantor
Original Assignee
Univ Hong Kong Chinese
Sequenom Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Hong Kong Chinese, Sequenom Inc filed Critical Univ Hong Kong Chinese
Publication of RS58879B1 publication Critical patent/RS58879B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G16B20/10—Ploidy or copy number detection
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G16B20/20—Allele or variant detection, e.g. single nucleotide polymorphism [SNP] detection
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • G16B30/10—Sequence alignment; Homology search
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Software Systems (AREA)
  • Artificial Intelligence (AREA)
  • Bioethics (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • Data Mining & Analysis (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Evolutionary Computation (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Ultra Sonic Daignosis Equipment (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Description

Opis
[0001] Predmetnа prijava zahteva prioritet od Privremene patentne prijave US No. 61/258567, pod naslovom "Fetalna genomska analiza" podnetе 5. Novembrа, 2009; privremene patentne prijave US No. 61/259075, pod naslovom " Fetal Genomic Analysis from a Maternal Biological Sample" podnete 6. Novembra 2009; i Privremene patentne prijave US No. 61/381854, pod naslovom "Fetal Genomic Analysis from a Maternal Biological Sample" podnete 10. Septembra 2010., čiji je celokupni sadržaj ovde inkorporiran referencom za sve svrhe.
[0002] Ovaj zahtev se odnosi i na Prijavu US No. 12/178,181, pod nazivom "Diagnosing Fetal Chromosamal Aneuploidy Using Massively Parallel Genomic Sequencing" podnetu 23. Jula 2008. (Advokatska kancelarija br. 016285-005220US); Prijavu US No. 12/614350, pod nazivom "Diagnosing Fetal Chromosamal Aneuploidy Using Genomic Sequencing With Enrichment"(Advokatska kancelarija br. 016285-005221 US), i trenutno podnetu US prijavu pod nazivom “Size-Based Genomic Analysis (Advokatska kancelarija No. 016285-006610US), čiji je celokupan sadržaj ovde inkorporiran referencom za sve svrhe.
[0003] Predmetni pronalazak se generalno odnosi na analizu fetalnog genoma baziranu na uzorku majke, a konkretnije na određivanje svih delova fetalnog genoma na osnovu analize genetskih fregmenata u uzorku majke
[0004] Otkriće slobodnih (bez-ćelijskih) nukleinskih kiselina fetusa u plazmi majke 1997 je otvorilo nove mogućnosti za neinvazivnu prenatalnu dijagnostiku (Lo YMD et al Lancet 1997; 350: 485-487; i US Patent 6,258,540). Ova tehnologija je brzo prevedena na kliničke primene, uz detekciju od fetusa dobijenih, paternalno-nasleđenih gena ili sekvenci, na primer za određivanje pola fetusa, određivanje fetalnog RhD statusa, i određivanje da li je fetus nasledio paternalno-naslednu mutaciju (Amicucci P et al. Clin Chem 2000; 46: 301-302; Saito H et al. Lancet 2000; 356: 1170 i Chiu RWK et al Lancet 2002; 360: 998-1000). Nedavni napredak na ovom polju je omogućio prenatalnu dijagnozu fetalnih hromozomskih aneuploidija, poput trizomije 21, na osnovu analize nukleinske kiseline u plazmi majke (Lo YMD et al Nat Med 2007; 13: 218-223; Tong YK et al Clin Chem 2006; 52: 2194-2202; US Patent publication 2006/0252071; Lo YMD et al Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104: 13116-13121; Chiu RWK et al Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105: 20458-20463; Fan HC et al Proc Natl Acad Sci 2008; 105: 16266-16271; US Patent publication 2007/0202525; i US Patent publication 2009/0029377).
[0005] Druga oblast značajnog nedavnog napretka je upotreba metoda brojanja pojedina čnih molekula, kao što su digitalna PCR, za neinvazivnu dijagnostiku bolesti pojedinačnih gena u kojima oba roditelja nose istu mutaciju. Ovo je postignuto analizom relativnog doziranja mutacija (RMD) u majčinoj plazmi (US Patentna prijava 2009/0087847; Lun FMF et al Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105: 19920-19925 i Chiu RWK et al. Trends Genet 2009; 25: 324-331).
[0006] Ding et al (Proceedings of the National Academy of Science of the United States, vol 101. br.
29 p10762-10767) opisuje postupak zasnovan reakcije ekstenzije na bazi pojedinačnog alela i masenoj spektrometriji za detekciju fetalno-specifičnih alela, uključujući tačkaste mutacije i jedno-nukleotidne polimorfizme, u plazmi majke.
[0007] WO-A-2007/100911 opisuje tandemske jedno-nukleotidne polimorfizme i metode za njihovo korišćenje. WO-A-2009/013492 opisuje metode, sisteme i aparate za utvrđivanje da li u biološkom uzorku postoji disbalans sekvence nukleinske kiseline.
[0008] WO-A-2004/078999 opisuje identifikaciju fetalno specifičnih nukleinskih kiselina i markera fetalnih ćelija u majčinoj plazmi ili serumu.
[0009] Reed i saradnici (Bone Marrow Transplantation, Nature Publishing Group, tom. 29, br. 6, str.
527-529) opisuju neinvazivno određivanje paternalno nasleđenog fetalnog HLA haplotipa.
[0010] Chiu i saradnici (Trends in Genetics, Elsevier Science Publishers, tom. 25 br. 7, str. 324-331) opisuju analitičke postupke za neinvazivnu detekciju monogenskih bolesti i hromozomskih aneuploidija kod fetusa.
[0011] Lun i saradnici (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, tom. 105, br. 50, strane 19920-19925) opisuju digitalni pristup relativnog doziranja mutacija u neinvazivnoj dijagnostici monogenskih bolesti.
[0012] Fan i saradnici (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, tom. 105, br. 42, str. 16266-16271) opisuju “shotgun” sekvenciranje za otkrivanje fetusa sa trizomijom 21, trizomijom 18 i trizomijom 13.
[0013] Chiu i saradnici (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, tom. 105, br. 51, str 20458-20463) opisuju neinvazivnu dijagnostiku fetalne hromozomske aneuploidije.
[0014] Međutim, takvi postupci koriste prethodno znanje mogućih mutacija za analizu konkretnih delova genoma, i na taj način ne mogu identifikovati latentne ili neuobičajene mutacije ili genetske bolesti. Stoga je poželjno obezbediti nove metode, sisteme i aparate koje neinvazivnim tehnikama mogu identifikovati ceo ili delove genoma fetusa.
[0015] Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za određivanje prve proporcije fetalnog genoma koji se sekvencira iz biološkog uzorka dobijenog od trudnice, fetus ima oca i majku koja je trudna žena, otac ima paternalni genom, a majka ima majčinski genom, naznačeno time što uzorak sadrži smešu nukleinskih kiselina majke i fetusa, ovaj postupak obuhvata: dobijanje rezultata sekvenciranja mnoštva molekula nukleinske kiseline iz biološkog uzorka dobijenog od trudnice; analizu rezultata sekvenciranja, analizu za molekul nukleinske kiseline, koja uključuje: identifikovanje lokacije molekula nukleinske kiseline u humanom genomu; i određivanje odgovarajućeg alela molekula nukleinske kiseline; određivanje prvog mnoštva lokusa, gde je genom fetusa heterozigotan na svakom lokusu prvog mnoštva tako da genom fetusa ima odgovarajući prvi i drugi alel na tom lokusu, i gde je genom majke homozigotan na svakom lokusu prvog mno štva tako da majčin genom ima dva od odgovarajućeg drugog alela na tim lokusima, prvi alel je različit od drugog alela; utvrđivanje, pomoću kompjuterskog sistema, druge proporcije lokusa prvog mnoštva lokusa na kom je odgovarajući prvi alel detektovan iz rezultata sekvenciranja; i na osnovu druge proporcije, određivanje prvu proporcije genoma fetusa koji je sekvenciran iz biolo škog uzorka.
[0016] Druge realizacije ovog pronalaska su usmerene na sisteme, aparat, i kompjuterski čitljiv medijum povezan sa postupcima koji su ovde opisani. U jednoj realizaciji, kompjuterski čitljiv medijum sadrži instrukcije za primanje podataka i analizu podataka, ali ne instrukcije za usmeravanje mašine da kreira podatke (npr. sekvenciranje molekula nukleinske kiseline). U sledećoj realizaciji, kompjuterski čitljiv medijum ne sadrži instrukcije za usmeravanje mašine da kreira podatke. U jednoj realizaciji, kompjuterski program proizvoda obuhvata kompjuterski čitljiv medijum sa mnoštvom uputstava za kontrolu procesora za izvršavanje operacije za ovde opisane metode. Realizacije su takođe usmerene na računarske sisteme konfigurisane za izvršavanje koraka bilo koje od ovde opisanih metoda, potencijalno sa različitim komponentama koje obavljaju odgovarajući korak ili odgovarajuću grupu koraka.
[0017] Pozivanje na ostale delove specifikacije, uključujući crteže i zahteve, će realizovati druge karakteristike i prednosti realizacija predmetnog pronalaska. Dalje karakteristike i prednosti, kao i struktura i funkcionisanje različitih realizacija ovog pronalaska su detaljno opisane u nastavku u odnosu na priložene crteže. Na crtežima, slični referentni brojevi mogu ukazivati na identične ili funkcionalno slične elemente.
Sl. 1 predstavlja dijagram toka za metodu 100 za određivanje najmanje jednog dela genoma nerođenog fetusa trudnice prema primenama ovog pronalaska.
Sl. 2 prikazuje dva haplotipa za oca i dva haplotipa za majku za određeni segment njihovog odgovarajućeg genomskog koda prema primenama ovog pronalaska.
Sl. 3 prikazuje dva tipa SNP-a u parentalnim haplotipovima sa Sl. 2 prema primenama ovog pronalaska.
Sl. 4A i 4B prikazuju analizu za utvrđivanje haplotipova fetusa za dve vrste SNP-a prema primenama ovog pronalaska.
Sl. 5A i 5B prikazuju analizu poređenja relativnih količina (npr. brojanja) fragmenata za svaki lokus i da li je rezultat poređenja klasifikacija određenog haplotipa kao da je nasleđen ili ne prema primenama ovog pronalaska.
Sl. 6 ilustruje uticaj promene odnosa verovatnoće za SPRT klasifikaciju prema primenama ovog pronalaska.
Sl. 7 je dijagram toka metode 700 za određivanje najmanje dela genoma nerođenog fetusa trudnice nasleđenog od oca prema primenama ovog pronalaska.
Sl. 8 je dijagram toka metode 800 za odredjivanje makar dela genoma nerođenog fetusa u regionu u kojem su majka i otac heterozigoti prema primenama predmetnog pronalaska.
SL. 9 prikazuje haplotipove oca i majke koji su, oboje heterozigoti u određenom regionu genoma prema primenama predmetnog pronalaska.
Sl. 10 je dijagram toka koji ilustruje metodu 1000 za određivanje frakcione koncentracije fetalnog materijala u uzorku majke prema primenama ovog pronalaska.
SL. 11 je dijagram toka metode za utvrđivanje da li je lokus informativan prema primenama ovog pronalaska.
Sl. 12A i 12B prikazuju predviđenu raspodelu rezultata brojanja za alel T (manje zastupljen alel u scenarijima (a) i (c)) za tri scenarija sa pretpostavljenom frakcionom koncentracijom fetalne DNK od 20% i 5%, respektivno, prema realizacijama predmetnog pronalaska.
Sl. 13A, 13B i 14 prikazuju predviđene raspodele za rezultate brojanja manje zastupljenog alela za frakcionu koncentraciju fetalne DNK od 20%, svaka za različit ukupan broj “total counts” molekula koji odgovaraju SNP prema primenama ovog pronalaska.
Sl. 15A i 15B prikazuju primere referentnih haplotipova, parentalnih haplotipova uzetih iz referentnih haplotipova, i rezultujuće fetalne haplotipove prema primenama predmetnog pronalaska.
Sl. 16 je dijagram toka metode 1600 za određivanje bar dela genoma fetusa kada je poznat skup referentnih haplotipova, ali roditeljski haplotipovi nisu poznati, prema primenama ovog pronalaska. Sl. 17 prikazuje primer određivanja informativnih lokusa iz analize DNK fragmenata iz uzorka majke prema primenama ovog pronalaska.
Sl. 18 prikazuje tri referentna haplotipa (Hap A, Hap B i Hap C) i paternalne alele.
Sl. 19 prikazuje određivanje parentalnog haplotipa iz paternalnih alela prema primenama ovog pronalaska.
Sl. 20 prikazuje određivanje majčinih genotipova iz analize majčinog uzorka prema primenama ovog pronalaska.
Sl. 21 prikazuje primenu za utvrđivanje haplotipova majke iz majčinih genotipova i referentnih haplotipova prema primenama ovog pronalaska.
Sl. 22 prikazuje utvrđene haplotipove majke i paternalno nasleđen haplotip prema primenama ovog pronalaska.
Sl. 23 prikazuje različite tipove lokusa (alfa (A) i beta (B)) za majčine haplotipove u odnosu na paternalni haplotip prema primenama ovog pronalaska.
Sl. 24 je dijagram toka koji ilustruje metodu 2400 za identifikovanje de novo mutacije u genomu nerođenog fetusa trudnice.
Sl. 25A prikazuje apsolutni broj i procente SNP prikazujući različite kombinacije genotipa za oca, majku i fetus (CVS) prema varijantama ovog pronalaska.
Sl. 25B je tabelarni prikaz statistike poravnanja za prvih 20 protočnih ćelija.
Sl. 26 je tabela koja prikazuje frakcione koncentracije fetalne DNK izračunate za SNP-e pomoću dve metode prema primenama ovog pronalaska.
Sl. 27A prikazuje grafik koji ilustruje uočeni procenat SNP-a u ovoj podgrupi u kojoj se fetalni alel može videti iz podataka sekvenciranja za prvih 20 analiziranih protočnih ćelija, a Sl. 27B je grafički prikaz pokrivenosti u odnosu na broj očitavanja prema primenama ovog pronalaska.
Sl. 28A i 28B prikazuju grafike korelacije između pokrivenosti paternalno-nasleđenih alela i broja očitavanja sekvenci koji se mogu mapirati i broja sekvenci protočnih ćelija, respektivno, prema primenama ovog pronalaska.
Sl. 29A prikazuje korelaciju između procenta lažno-pozitivnih i broja sekvencioniranih protočnih ćelija, a Sl. 29B korelaciju između procenta lažno-pozitivnih i broja sekvencioniranih protočnih ćelija prema primenama ovog pronalaska.
Sl. 30 prikazuje pokrivenost fetalno-specifičnih SNP-a za različit broj protočnih ćelija analiziranih prema primenama ovog pronalaska.
Sl. 31 prikazuje tačnost analize Tipa A kada su korišćeni podaci za 10 protočnih ćelija prema primenama ovog pronalaska.
Sl. 32 prikazuje tačnost analize Tipa B kada su korišćeni podaci za 10 protočnih ćelija prema primenama ovog pronalaska.
Sl. 33 prikazuje Tačnost analize Tipa A kada su korišćeni podaci za 20 protočnih ćelija prema primenama ovog pronalaska.
Sl. 34 prikazuje tačnost analize Tipa B kada su korišćeni podaci za 20 protočnih ćelija prema primenama ovog pronalaska.
Sl. 35A i 35B prikazuju očitavanja sa mutacijama i sekvencama divljeg tipa na kodonima 41/42 prema primenama ovog pronalaska.
Sl. 36 prikazuje tabelu RHDO analizu Tipa A, dok je RHDO analiza tipa B prikazana na Sl. 37 prema primenama ovog pronalaska.
Sl. 38A i 38B prikazuju rezultate SPRT klasifikacije za slučaj PV226, kao primer.
Sl. 39 prikazuje tabelu koja sumira rezultate RHDO analize za pet slučajeva prema primenama predmetnog pronalaska.
Sl. 40 prikazuje grafik dubine sekvenciranja u odnosu na broj protočnih ćelija sekvenciranih prema primenama ovog pronalaska.
Sl. 41 prikazuje grafički prikaz veličina fetalnih i totalnih sekvenci za ceo genom, a Sl. 42A-42C prikazuju slične grafike pojedinačno za svaki hromozom prema primenama ovog pronalaska.
Sl. 43 prikazuje blok dijagram primera kompjuterskog sistema 4300 koji se može koristiti sa sistemom i metodama prema primenama ovog pronalaska.
[0018] Izraz "biološki uzorak" kako je ovde korišćen, odnosi se na bilo koji uzorak koji se uzima od subjekta (npr. čovek, kao što je trudnica) i sadrži jedan ili više molekula nukleinske kiseline(a) od značaja.
[0019] Izraz "nukleinska kiselina" ili "polinukleotid" se odnosi na dezoksiribonukleinsku kiselinu (DNK) ili ribonukleinsku kiselinu (RNK) i njihove polimere u obliku jednostrukog ili dvostrukog lanca. Ukoliko nije specifično ograničen, izraz obuhvata nukleinske kiseline koje sadrže poznate analoge prirodnih nukleotida koje imaju slične osobine vezivanja kao referentna nukleinska kiselina i metabolišu se na način sličan nukleotidima koji se prirodno javljaju. Ukoliko nije drugačije naznačeno, određena sekvenca nukleinske kiseline implicitno obuhvata i njene konzervativno modifikovane varijante (npr. supstitucije degenerisanog kodona), alele, ortologe, SNP-e i komplementarne sekvence, kao i eksplicitno naznačene sekvence. Konkretno, supstitucije degenerisanog kodona mogu biti ostvarene generisanjem sekvenci u kojima je tre ća pozicija jednog ili više odabranih (ili svih) kodona supstituisana reziduama me šovite-baze i/ili deoksiinozin (Batzer et al., Nucleic Acids Res 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985) i Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). Pojam nukleinska kiselina se naizmenično koristi sa gen, cDNK, iRNK, malu nekodirajuću RNK, mikro RNK (miRNK), Piwi-interagujuću RNK, “short hairpin” RNK (shRNA) kodiranu genom ili lokusom.
[0020] Izraz "gen" označava segment DNK uključen u proizvodnju polipeptidnog lanca ili transkribovanog RNK proizvoda. On može uključivati regione koji prethode i koji slede kodirajući region (lider i trejler) kao i nekodirajuće sekvence (introne) između individualnih kodirajućih segmenata (eksona).
[0021] Izraz "klinički relevantna sekvenca nukleinske kiseline" (takođe označena kao ciljna sekvenca ili hromozom) kako je ovde korišćen se odnosi na polinukleotidnu sekvencu koja odgovara segmentu veće genomske sekvence čiji potencijalni disbalans se testira ili toj većoj genomskoj sekvenci. Jedan primer je sekvenca hromozoma 21. Drugi primeri uključuju hromozome 18, 13, X i Y. Još neki primeri uključuju mutirane genetske sekvence ili genetske polimorfizme ili varijacije broja kopija koje fetus može naslediti od jednog ili oba roditelja, ili kao de novo mutacije u fetusu. U nekim izvođenjima, višestruke klinički relevantne sekvence nukleinske kiseline ili ekvivalentni višestruki proizvođači klinički relevantne sekvence nukleinske kiseline, mogu da se koriste da se obezbede podaci za detektovanje disbalansa. Na primer, podaci iz pet ne-uzastopnih sekvenci na hromozomu 21 se mogu koristiti na aditivni način za određivanje mogućeg disbalansa hromozoma 21, efektivno smanjujući potrebnu količinu uzorka na 1/5.
[0022] Izraz "na bazi" kako je ovde korišćen znači "bar delimično na bazi" i odnosi se na jednu vrednost (ili rezultat) koji se koristi za određivanje druge vrednosti, kao što se dešava u odnosu ulaza metode i izlaza te metode. Termin "izveden", kako je ovde kori šćen se odnosi na odnos ulaza te metode i izlaza te metode, što se javlja kada izvođenje predstavlja izračunavanje formule.
[0023] Izraz "parametar" kako je ovde korišćen označava numeričku vrednost koja karakteriše kvantitativni set podataka i/ili numerički odnos između kvantitativnih skupova podataka. Na primer, parametar je odnos (ili funkcija odnosa) između prve količine prve sekvence nukleinske kiseline i druge količine druge sekvence nukleinske kiseline.
[0024] Kako kako je ovde korišćen, termin "lokus" ili njegov oblik množine "lokusi" je lokacija ili adresa bilo koje dužine nukleotida (ili baznih parova) koji ima varijacije u genomu.
[0025] Izraz "disbalans sekvence" kako je ovde korišćen označava bilo koje značajno odstupanje kako je definisano sa najmanje jednom graničnom vrednosti u količini klinički relevantne sekvence nukleinske kiseline od referentne količine. Disbalans sekvence može uključivati disbalans doziranja hromozoma, alelski disbalans, disbalans doziranja mutacije, disbalans doziranja haplotipa i druge slične disbalanse. Kao primer, alelski ili disbalans doziranja mutacije se može javiti kada fetus ima različit genotip od majčinog, čime se stvara odstupanje na odredjenom lokusu u uzorku.
[0026] Izraz "hromozomska aneuploidija" kako je ovde korišćen označava kvantitativno odstupanje količine hromozoma od one kod diploidnog genoma. Odstupanje može biti višak ili gubitak. Može uključivati celinu jednog hromozoma ili neki region hromozoma.
[0027] Izraz "haplotip" kako je ovde korišćen se odnosi na kombinaciju alela na susednim lokacijama (lokusima) koji se prenose zajedno, na istom hromozomu ili region hromozoma. Hapolotip se mo že odnositi i na nekoliko i na samo par lokusa ili na region hromozoma, ili na ceo hromozom. Termin "aleli" se odnosi na alternativne DNK sekvence na istom fizičkom lokusu genoma, koje mogu ali ne moraju da rezultiraju u različitim fenotipskim osobinama. U svakom konkretnom diploidnom organizmu, sa dve kopije svakog hromozoma (izuzev hromozoma kod muškog humanog subjekta), genotip za svaki gen obuhvata par alela prisutnih na tom lokusu, koji su isti kod homozigota a različiti kod heterozigota. Populacija ili vrsta organizma obično uključuje više alela na svakom lokusu među različitim jedinkama. Genomski lokus u kojem se nalazi više od jednog alela u populaciji se naziva polimorfno mesto. Alelna varijacija na lokusu je merljiva kao broj alela (t.j. stepen polimorfizma) prisutan ili kao odnos heterozigota (t.j. stepen heterozigotnosti) u populaciji. Kako je ovde korišćen, termin "polimorfizam" se odnosi na bilo koju unutar-individualnu varijaciju u ljudskom genomu, bez obzira na frekvenciju. Primeri takvih varijacija uklju čuju, ali nisu ograničeni na, jednonukleotidni polimorfizam, polimorfizam jednostavnih tandemskih duplikacija, insercionodelecione polimorfizme, mutacije (koje mogu biti uzročnici bolesti) i varijacije broja kopija.
[0028] Sklapanje delimične genetske mape ili potpune genomske sekvence nerođenog fetusa se može ostvariti na osnovu haplotipova polimorfnih sekvenci njegovih roditelja. Termin "hapolotip" kako je ovde korišćen se odnosi na kombinaciju alela na višestrukim lokusima, koji se zajedno prenose na isti hromozom ili hromozomski region. Na primer, realizacije mogu analizirati DNK fragmente iz uzorka majke (koji sadrži DNK majke i fetusa) da se identifikuju aleli na određenom lokusu (eng. landmarks). Količine DNK fragmenata odgovarajućih alela na ovim lokusima mogu zatim biti analizirani zajedno da odrede relativne količine haplotipova za te lokuse i time utvrdi koje haplotipove je fetus nasledio od majčinskog i/ili očinskog genoma. Identifikovanjem haplotipova fetusa se može odrediti genotip fetusa na individualnom lokusu unutar odgovaraju ćeg genomskog regiona, uključujući navedene lokuse. U različitim varijantama, lokusi gde su roditelji specifična kombinacija homozigota i heterozigota se može analizirati na način da se odrede regioni fetalnog genoma. U jednoj primeni se koriste referentni haplotipovi koji su reprezentativi haplotipova zajedničkih u populaciji, zajedno sa analizom DNK fragmenata iz uzorka majke za određivanje maternalnih i paternalnih genoma.
[0029] Primer realizacije za određivanje najmanje dela genoma fetusa može biti testiranje očinstva poređenjem utvrđenog genotipa ili haplotipa fetusa sa genotipom ili haplotipom potencijalnog oca. Drugi primer je da se otkrije jedna ili više de novo mutacija koje je fetus stekao, ili otkriju događaji mejotičke rekombinacije koji su se javili tokom produkcije gameta roditelja. To su gameti koji su oplođeni, a rezultujući zigot se razvio u fetus.
[0030] Pored toga, neke realizacije mogu omogućiti da se genomska sekvenca nerođenog fetusa odredi pri bilo kojoj željenoj rezoluciji. Na primer, u nekim primenama, realizacije mogu omogu ćiti da se odredi kompletna ili skoro kompletna genomska sekvenca fetusa. U jednoj relizaciji, rezolucija genomske sekvence fetusa koja se može odrediti zavisi od rezolucije poznavanja genoma oca i majke, u konjunkciji sa informacijama sekvenciranja majčinog biološkog uzorka koji sadrži fetalne nukleinske kiseline. U slučaju da su poznate kompletne ili skoro kompletne genomske sekvence oca i majke može se zaključiti kompletna ili skoro kompletna genomska sekvenca nerođenog fetusa.
[0031] U drugim realizacijama, samo genomske sekvence odabranih regiona u genomu su razjašnjene, npr. za prenatalnu dijagnozu odabranih genetskih, epigenetskih (kao što je poremećaj utiskivanja (imprinting)) ili hromozomskih poremećaja. Primeri genetskih poremećaja na koje se varijanta može primeniti uključuju hemoglobinopatije (kao što je beta-talasemija, alfa-talasemija, anemija srpastih ćelija, bolest hemoglobina E), cistična fibroza, i polno-povezani poremećaji (poput hemofilije i Duchenne mišićne distrofije). Dalji primeri mutacija koje mogu biti detektovane korišćenjem izvođenja se mogu naći iz Onlajn Mendelijanskog nasleđivanja kod Čoveka (www.ncbi.nlm.nih. gov/omim/getmorbid.cgi).
[0032] Neke realizacije se takođe mogu koristiti za određivanje frakcione koncentracije fetalne DNK, što se može uraditi bez ikakvog prethodnog poznavanja specifičnih genoma roditelja. Slična analiza se može koristiti i za određivanje potrebne dubine pokrivenosti za tačno određivanje genoma fetusa. Prema tome, ovo određivanje pokrivenosti može da se koristi za procenu količine podataka koje treba analizirati za dobijanje tačnog rezultata.
I. UVOD
[0033] Kada se koristi majčin uzorak (npr. plazma ili serum) kao materijal za određivanje haplotipa fetusa, mogu postojati dva glavna izazova. Prvi izazov je to što se plazma ili serum majke sastoji od smeše DNK fetusa i DNK majke, pri čemu je fetalna DNK manjinska populacija. Utvrđeno je da fetalna DNK predstavlja srednju/median koncentraciju od oko 5% do 10% od ukupne DNK u maj činoj plazmi u prva dva trimestra trudnoće (Lo YMD et al. Am J Hum Genet 1998; 62: 768-775; Lun FMF et al. Clin Chem 2008; 54: 1664-1672). Pošto se DNK oslobađa iz majčinih krvnih ćelija tokom procesa zgrušavanja krvi, frakciona koncentracija fetalne DNK u serumu majke mo že biti još niža nego u majčinoj plazmi. Prema tome, u nekim realizacijama, majčina plazma je bolja od seruma.
[0034] Drugi izazov je da se fetalna DNK i majčina DNK u majčinoj plazmi sastoji od kratkih fragmenata (Chan KCA et al. Clin Chem 2004; 50: 88-92). Zaista DNK fetusa je generalno kraća od DNK majke u majčinoj plazmi. Većina fetalne DNK u majčinoj plazmi je manja od 200 bp po dužini. Korišćenje samo tih kratkih DNK fragmenata plazme, može biti izazovno za sklapanje haplotipa genetskih polimorfizama na velikim genomskim rastojanjima. Gore pomenuti izazovi za maj činu plazmu i serum se odnose i na detekciju fetalne DNK u majčinom urinu (Botezatu I et al Clin Chem 2000; 46: 1078-1084). Fetalna DNK predstavlja manju DNK frakciju u urinu trudnice, i fetalna DNK u urinu majke se takođe sastoji od kratkih fragmenata DNK.
A. Sekvenciranje i Analiziranje Majčinog Uzorka
[0035] Pristup da se neke realizacije uzmu za rešavanje prvog izazova je da se upotrebi metod koji omogućava kvantitativnu genotipizaciju nukleinskih kiselina dobijenih iz maj činog biološkog uzorka sa visokom preciznošću. U jednoj realizaciji ovog pristupa, preciznost se postiže analizom većeg broja (na primer, milioni ili milijarde) molekula nukleinske kiseline. Osim toga, preciznost mo že biti poboljšana analizom pojedinačnih molekula nukleinske kiseline ili amplifikacijom molekula pojedinačne nukleinske kiseline kloniranjem. Jedna realizacija koristi masivno paralelno sekvenciranje DNK, kao što su, ali ne ograničavajući se na ono koje se izvodi na Illumina Genome Analyzer platformi (Bentley DR et al. Nature 2008; 456: 53-59). Roche 454 platformi (Margulies M et al. Nature 2005; 437: 376-380), ABI SOLiD platformi (McKernan KJ et al. Genome Res, 2009; 19: 1527-1541) Helicos platformi za sekvenciranje pojedinačnih molekula (Harris TD et al. Science 2008; 320:106-109), sekvenciranje u realnom vremenu korišćenjem molekula polimeraze (Science 2009; 323: 133-138) i sekvenciranje kroz nanopore (Clarke J et al. Nat Nanotechnol. 2009; 4: 265-70). U jednom izvođenju, masivno paralelno sekvenciranje se vrši na slučajnoj podgrupi molekula nukleinske kiseline u biološkom uzorku.
[0036] U nekim izvođenjima, može biti korisno da se iz svakog molekula dobije što je moguće duže očitana sekvenca. Jedno ograničenje dužine očitavanja sekvenciranja koja se može postići je priroda molekula nukleinske kiseline u majčinom biološkom uzorku. Na primer, poznato je da se većina DNK molekula u majčinoj plazmi sastoji od kratkih fragmenata (Chan KCA et al Clin Chem 2004; 50: 88-92). Osim toga, dužina čitanja mora biti u ravnoteži sa tačnošću sistema za sekvenciranje pri većim dužinama očitavanja. Za neke od ranije pomenutih sistema, možda bi bilo bolje da se dobiju sekvence sa oba kraja molekula, tzv. sekvenciranje uparenih krajeva. Kao ilustracija, jedan pristup je da se izvrši 50 bp sekvenciranja sa svakog kraja DNK molekula, što daje ukupno 100 bp sekvenci po molekulu. U još jednom izvođenju, može da se izvede po 75 bp sekvenciranja sa svakog kraja DNK molekula, što daje ukupno 150 bp sekvenci po molekulu.
[0037] Nakon što se izvrši sekvenciranje, sekvence se zatim poravnavaju u referentni ljudski genom. Pošto realizacije razjašnjavaju genomske varijacije koje je nerođeni fetus nasledio od svojih roditelja, algoritam za poravnavanje treba da bude u stanju da se izbori sa varijacijama sekvence. Jedan primer takvog softverskog paketa je Efficient Large-Scale Alignment of Nucleotide Databases (ELAND) softver koji je proizvela Illumina. Drugi primer takvog softverskog paketa je SOAP (program za poravnavanje kratkih oligonukleotida) i SOAP2 softver (Li R et al. Bioinformatics 2008; 24: 713-714; Li R et al. Bioinformatics 2009; 25: 1966-1967).
[0038] Količina DNK sekvenciranja koje može biti potrebno izvršiti može zavisiti od rezolucije sa kojom genetska mapa fetusa ili genomska sekvenca fetusa treba da budu sklopljene. Generalno, što je više molekula koji treba da budu sekvencirani veća je rezolucija. Druga odrednica rezolucije fetalne genetske mape ili genomske sekvence fetusa na datom nivou, odnosno dubine DNK sekvenciranja je frakciona koncentracija fetalne DNK u majčinom biološkom uzorku. Uopšteno, što je veća frakciona koncentracija fetalne DNK, veća je rezolucija genetske mape fetusa ili genomske sekvence fetusa koja može biti određena na datom nivou DNK sekvenciranja. Pošto je frakciona koncentracija fetalne DNK u majčinoj plazmi veća nego u serumu majke, plazma majke je za neka izvođenja poželjniji biološki uzorak od seruma majke.
[0039] Propusnost gore navedenih metoda na bazi sekvenciranja se može povećati upotrebom indeksiranja ili barcoding. Tako, za uzorak ili pacijenta specifi čan indeks ili barkod se može dodati fragmentima nukleinske kiseline u određenoj biblioteci sekvenciranih nukleinskih kiselina. Zatim, nekoliko takvih biblioteka, svaka sa indeksom ili barkodom specifičnim za uzorak ili pacijenta, se pomešani zajedno i sekvencira zajedno. Nakon reakcija sekvenciranja, podaci sekvenciranja se mogu dobiti za svaki uzorak ili svakog pacijenta na osnovu barkoda ili indeksa. Ova strategija mo že da poveća propusnost, a tako i ekonomičnost realizacija ovog pronalaska.
[0040] U jednom izvođenju, molekuli nukleinske kiseline u biološkom uzorku mogu da budu izabrani ili frakcionirani pre kvantitativne genotipizacije (npr. sekvenciranja). U jednoj varijanti, molekuli nukleinske kiseline se tretiraju pomoću uređaja (npr. mikronizovi) koji može da veže prevashodno molekule nukleinske kiseline iz izabranih lokusa u genomu (npr. region na hromozomu 7 koji sadr ži CFTR gen). Zatim se sekvenciranje poželjno može izvesti na molekulima nukleinske kiseline uhvaćenim od strane ovog uređaja. Ova šema će omogućiti da se sekvenciranje usmeri prema genomskom regionu od interesa. U jednoj realizaciji ove šeme mogu se koristiti Nimblegen sequence capture sistem (www.nimblegen.com/products/sekcap/indek.html) ili Agilent SureSelect Target Enrichment System (www.opengenomics.com/ SureSelect_Target_Enrichment_Sistem), ili slične platforme. U nekim izvođenjima, molekuli nukleinske kiseline iz odabranih regiona genoma se podvrgavaju nasumičnom sekvenciranju.
[0041] U sledećoj realizaciji, genomski region od interesa u biološkom uzorku prvo može biti amplifikovan sa jednim setom ili sa više setova prajmera za amplifikaciju. Zatim može da se izvede kvantitativna genotipizacija, npr. sekvenciranje na amplifikovanim proizvodima. U jednoj realizaciji ove šeme, može da se koristi sistem RainDance (www.raindancetech.com/technologi/pcr-genomicsresearch.asp). U nekim izvođenjima, amplifikovani molekuli nukleinske kiseline se podvrgavaju nasumičnom sekvenciranju.
[0042] Korak veličine frakcionacije može biti izveden na molekulima nukleinske kiseline u biološkom uzorku. Pošto je poznato da je fetalna DNK kraća od majčine DNK u majčinoj plazmi (Li et al. Clin Chem 2004; 50: 1002-1011; US Patentna Prijava 20050164241; US Patentna prijava 20070202525), frakcija manje molekulske mase može biti prikupljena, a zatim korišćena za kvantitativnu genotipizaciju, na primer, sekvenciranje. Takva frakcija će sadržati veću koncentraciju fetalne frakcije DNK nego originalni biološki uzorak. Dakle, sekvenciranje frakcije obogaćene na fetalnoj DNK može omogućiti sklapanje genetske mape fetusa ili utvrđivanje fetalne genomske sekvence sa većom rezolucijom na određenom nivou analize (npr. dubini sekvenciranja), nego sa neoboga ćenim uzorkom. Ovo stoga može da učini ovu tehnologiju ekonomičnijom. Kao primeri metoda za frakcionaciju po veličini, mogu se koristiti (i) gel elektroforeza praćena ekstrakcijom molekula nukleinske kiseline iz određenih gel frakcija; (ii) vezujući matriks za nukleinske kiseline sa diferencijalnim afinitetom za molekule nukleinskih kiselina različite veličine; ili (iii) filtracioni sistemi sa diferencijalnom retencijom za molekule nukleinske kiseline različite veličine.
[0043] U još jednoj realizaciji, preferencijalno se mogu analizirati molekuli nukleinske kiseline određene veličine ili opsega veličina nakon sekvenciranja nukleinske kiseline. Na primer, moglo bi se izvesti sekvenciranje uparenih-krajeva u kome se sekvenciraju oba kraja DNK molekula. Zatim se genomske koordinate oba ova kraja mogu mapirati nazad u referentni ljudski genom. Zatim se mo že utvrditi veličina molekula oduzimanjem genomskih koordinata oba kraja. Jedan od na čina da se izvrši takvo sekvenciranje uparenih-krajeva je da se koristi protocol za sekvenciranje uparenihkrajeva Illumina Genome Analyzer. Drugi metod za utvrđivanje veličine DNK molekula je sekvenciranje celog DNK molekula. Ovo se najlakše vrši pomoću platformi za sekvenciranje sa relativno velikim dužinama čitanja, poput platforme Roche 454 (Marguelis et al. Nature 2005; 437: 376-380) i Pacific Biosciences single molecule, real-time (SMRT™) technology (Eid et al Science 2009; 323: 133-138). Nakon određivanja veličine molekula nukleinske kiseline, neko može odlučiti da kasniju analizu usmeri na molekule manje od određene granične veličine (cutoff), čime se obogaćuje frakciona koncentracija fetalne DNK. Analiza ove podgrupe molekula mo že omogućiti da genetska mapa fetusa ili fetalna genomska sekvenca nakon odabira veličine, bude određena pomoću manjeg broja analiziranih molekula, nego ako se ova procedura ne sprovede. U jednoj realizaciji, se koristi granična vrednost veličine od 300 bp. U nekim drugim realizacijama, može da se koristi granična vrednost veličine od 250 bp, 200 bp, 180 bp, 150 bp, 125 bp, 100 bp ili 75 bp.
B. Korišćenje Roditeljskih Genoma kao Okvira (eng. Scafold)
[0044] U odgovoru na drugi izazov, neke realizacije mogu koristiti haplotipove hromozoma majke kao "okvir". Haplotipovi hromozoma oca se takođe mogu koristiti kao drugi "okvir". Ovi okviri se mogu uporediti sa genetskim informacijama fetusa dobijenim iz uzorka majke koji sadr ži DNK fetusa. Ova genetska informacija fetusa može da se koristi da se utvrdi kako su okviri majke i/ili oca podignuti u genomu fetusa, pri čemu se pomoću sastavnih delova okvira određuje nastali genom fetusa.
[0045] Parentalni haplotipovi mogu biti sklopljeni od genomske DNK oca i majke i drugih članova familije, na primer brata fetusa u aktuelnoj trudnoći. Moguće je da dostupnost roditeljskih haplotipova može postati sve uobičajenija, s obzirom na smanjenje troškova genomskog sekvenciranja. U jednom scenariju, ukoliko jedan ili oba roditelja ve ć imaju sekvencirane genome i njihovi haplotipovi su utvrđeni na jednom ili više hromozomskih regiona, onda ova informacija može da se koristi kao gore pomenuti okvir.
[0046] Bilo koja platforma za genotipizaciju poznata stručnjacima u tehnici koja može da ispituje varijacije sekvenci u genomu se može koristiti, uključujući sekvenciranje DNK, microarrays, hibridizacija probe, tehnike na bazi fluorescencije, opti čke tehnike, molekulski barkodovi i snimanje pojedinačnih molekula (Geiss GK et al. Nat Biotechnol 2008; 26: 317-325), analiza pojedinačnih molekula, PCR, digitalna PCR, masena spektrometrija (poput Sequenom MassARRAY platform) itd. Kao ekstremniji primer, DNK sekvenca oca i majke se mogu odrediti sekvenciranjem DNK celog genoma pomoću metode masivnog paralelnog sekvenciranja (npr. Nature 2008 Bentley DR et al. 456: 53-59; McKernan KJ et al. Genome Res 2009; 19: 1527-1541). Primer varijacija sekvence koje mogu biti od interesa su jednonukleotidni polimorfizmi (SNP). Posebno po željan metod za određivanje roditeljskih genotipova jeste mikronizovana analiza SNP-a celog genoma ili odabranih genomskih regiona, na primer onih koji sadrže gene čije mutacije mogu izazvati genetske bolesti (kao što su geni u betaglobin klasteru, ili gen za regulator cistično fibrozne transmembranske provodljivosti (CFTR)). Osim varijacija u sekvencama, takođe se mogu koristiti varijacije broja kopija. Varijacije u sekvencama i varijacije broja kopija se obe nazivaju polimorfne genetske karakteristike (PMF).
[0047] U jednom aspektu, majčinski genotipovi na hromozomima ili hromozomskim regionima od interesa mogu biti sklopljeni u haplotipove. Jedan od načina na koji se to može izvesti je pomoću analize ostalih članova familije u srodstvu sa majkom, npr. sina ili ćerke majke, roditelja, brata ili sestre, itd. Drugi način na koji se haplotipovi mogu sklopiti je pomoću drugih postupaka dobro poznatih stručnjaku sa iskustvom u tehnici koji su gore navedeni.
[0048] Genotipska informacija se zatim može proširiti u informaciju o haplotipu roditelja poređenjem sa informacijama genotipa drugih članova familije, na primer, brat fetusa iz trenutne trudnoće, ili iz genotipova dede i babe itd. Haplotipovi roditelja mogu biti sklopljeni drugim metodama koje su dobro poznate onima koji su verzirani u stanje tehnike. Primeri takvih postupaka obuhvataju postupke zasnovane na analizi pojedinačnih molekula kao što su digitalna PCR (Ding C i Cantor CR Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100: 7449-7453; Ruano G et al. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: 6296-6300), sperm haplotyping (Lien S et al. Curr Protoc Hum Genet 2002; Chapter 1:Unit 1.6) i tehnike snimanja (Xiao M et al. Hum Mutat 2007; 28: 913-921). Drugi postupci uključuju one na bazi PCR specifične za alel (Michalatos-Beloin S et al. Nucleic Acids Res 1996; 24: 4841-4843; Lo YMD et al. Nucleic Acids Res 1991; Nucleic Acids Res 19: 3561-3567), kloniranje i digestiju restrikcionih enzima (Smirnova AS et al. Immunogenetics 2007; 59: 93-8), itd. Neke druge metode su zasnovane na distribuciji i strukturi disekvilibrijum linkaže haplotip blokova u populaciji koje omogućavaju da se iz statističkih procena izvede haplotip majke (Clark AG Mol Biol Evol 1990; 7:111-22; 10:13-9; Salem RM et al. Hum Genomics 2005; 2:39-66).
C. Sklapanje Okvira Pomoću Genomske Informacije Uzorka Majke
[0049] U jednoj realizaciji, da bi se utvrdilo koji od majčinih hromozoma su preneti na fetus, korišćena je metoda relativnog doziranja haplotipa (RHDO). Opšti princip ovog pristupa je sledeć i u primeru gde je majka heterozigot za svaki od genetskih polimorfizama. Prema tome, postoje dva haplotipa i relativno doziranje ovih haplotipova može biti 1:1. Međutim, u uzorku majke, prisustvo malog udela fetalne DNK može izmeniti relativno doziranje haplotipa. To je zbog toga što bi fetus mogao imati nasleđenu polovinu svog komplementa haplotipa od majke, a drugu polovinu od oca. Osim toga, za svaki hromozom, fetus bi mogao da nasledi ’patchwork’ haplotipova koji su nastali iz jednog ili drugog homolognog hromozoma svakog od roditelja, u zavisnosti od pojave mejoti čke rekombinacije. Svi ovi faktori bi mogli da odmaknu relativnu dozu haplotipa od odnosa 1:1 u majčinoj konstitucionalnoj DNK. Tako, za dati hromozom ili hromozomski region, konstitutivni aleli ovih haplotipova se mogu tražiti iz analitičkih podataka (npr. podataka sekvenciranja) dobijenih iz uzorka majke.
[0050] Zatim se može obaviti statistička procedura da se utvrdi relativno doziranje haplotipa, ili da li je jedan od ovih haplotipova značajno više zastupljen u odnosu na drugi haplotip. Klasifikacioni prag ove statističke procedure može se podesiti u zavisnosti od frakcione koncentracije fetalne DNK. Generalno, veća frakciona koncentracija fetalne DNK može omogućiti da se prag dostigne sa manje molekula. Klasifikacioni prag može da se podešava i u zavisnosti od broja uspešno klasifikovanih fragmenata koji se želi postići u celom genomu ili genomskim regionima od interesa. U jednoj realizaciji, može se koristiti sekvencijalni test odnosa verovatnoće (SPRT).
[0051] U jednoj realizaciji se može koristiti relativno doziranje mutacija (RMD), kako je opisano u US Patentnoj Prijavi 2009/0087847), za određivanje relativne količine alela kod pojedinih polimorfizama majke. Ove relativne količine se mogu koristiti u određivanju haplotip fetusa (na primer, kada su polimorfizmi na uzastopnim ili povezanim lokusima). U jednoj realizaciji ovog ciljanog pristupa je upotreba lančane reakcije polimeraze (PCR) za amplifikaciju specifičnih sekvenci iz odabranih delova genoma za RMD analizu. Da se proširi ovaj RMD pristup da bi se odredilo nasleđivanje fetusa u velikom regionu genoma ili na celom genomu, potrebna je velika količina uzorka majke.
[0052] U jednoj realizaciji koristeći nasumično sekvenciranje genomski regioni od interesa nisu posebno ciljani. Tako, broj sekvenci dobijenih u genomskim regionima od interesa ne mora biti veliki kao kod ciljanog pristupa (osim ako se vrši jako duboko sekvenciranje). Međutim, brojanja mogu biti objedinjena za više povezanih polimorfizama da se postigne potrebna statistička moć za dijagnostičke svrhe. Praktična implikacija korišćenja ove varijante sekvenciranja je da se mogu smanjiti troškovi izbegavanjem potrebe za preterano dubokim sekvenciranjem. Ona takođe zahteva unošenje manjeg uzorka majke nego pristupi na bazi digitalne PCR.
[0053] Dalje, može biti poželjno da se izvede takva RHDO analiza u blokovima. Drugim rečima, svaki hromozom se može analizirati u jednom, ili poželjno više od jednog bloka. U jednom aspektu, ovo poslednje može omogućiti da se uoči mejotička rekombinacija. Na primer, može izgledati da hapolotip segmenta određenog hromozoma fetusa potiče od jednog od majčinskih homolognih hromozoma, a da drugi segment istog fetusa hromozoma poseduje haplotip drugog homolognog hromozoma majke. SPRT analiza može omogućiti da ova segmentacija bude izvedena.
[0054] Na primer, SPRT analiza može biti izvedena na susednim SNP koji demonstriraju potrebnu konfiguraciju parentalnog genotipa (t.j. otac je homozigotan, a majka heterozigotna) polaze ći od jednog kraja hromozoma. Ovo se nastavlja sve dok SPRT analiza ne pokaže da je jedan od haplotipa majke predominantan u analitičkim podacima majčine plazme (npr. podacima sekvenciranja). Zatim SPRT analiza može biti "resetovana" i početi ispočetka od sledećeg susednog SNP-a koji pokazuje potrebnu konfiguraciju parentalnog genotipa. Ovo se može ponovo nastaviti dok SPRT analiza još jednom ne pokaže da je jedan od haplotipova majke predominantan u analiti čkim podacima majčine plazme (npr. podaci sekvenciranja). Ovaj proces može da se nastavi do poslednjeg izabranog SNP-a u navedenom hromozomu. Zatim se ovi različiti SPRT-analizom određeni segmenti haplotipa na hromozomu mogu porediti sa haplotipovima dva homologna hromozoma u maj činom genomu. Mejotska rekombinacija se vidi kada se čini da su segmenti haplotipa u fetusu prešli sa jednog homolognog hromozoma na drugi. Ovaj sistem može da funkcioniše čak i ako postoji više od jedne mejotičke rekombinacije na hromozomu.
[0055] Kao što je kasnije opisano, RHDO analiza se takođe može izvesti u genomskim regionima u kojima su i otac i majka oba heterozigotni za konstituentne genetske polimorfizme. Ovaj scenario je posebno koristan za situacije kada otac i majka dele mutant kopiju gena bolesti poreklom od istih predaka, kao kada su oni krvni srodnici, ili kada je predominantna mutacija za bolest posledica velikog uticaja osnivača (t.j. većina pojedinaca sa mutacijom je naslijedila isti haplotip od zajedničkog pretka osnivača populacije). Dakle, haplotipi oca i majke u ovom regionu mogu da se koriste da se odredi haplotip fetusa.
III. SKLAPANJE FETALNOG GENOMA IZ GENOMA MAJKE
[0056] Sada je opisano sklapanje genetske mape fetusa ili određivanje genomske sekvence fetusa sa eksplicitnim poznavanjem roditeljskih genoma.
A. Metoda
[0057] Sl. 1 predstavlja dijagram toka metode 100 za određivanje najmanje jednog dela genoma nerođenog fetusa trudnice. Fetus ima oca i majku koja je trudna žena. Otac ima parentalni genom sa dva haplotipa, a majka ima majčin genom sa dva haplotipa. Metoda 100 analizira molekule nukleinske kiseline (fragmente) iz biološkog uzorka dobijenog od trudnice da utvrdi genom fetusa. Metoda 100 je opisana prvenstveno kao primer kada je otac homozigotan a majka heterozigotna za veliki broj lokusa, dok ostali primeri opisuju druge varijante.
[0058] Metoda 100 i bilo koja od metoda koje su ovde opisane mogu biti potpuno ili delimi čno izvedene sa kompjuterskim sistemom koji ima procesor, koji se može konfigurisati za izvođenje tih koraka. Prema tome, rešenja se odnose na računarske sisteme konfigurisane za obavljanje koraka bilo koje od ovde opisanih metoda, potencijalno sa različitim komponentama koje obavljaju odgovarajući korak ili odgovarajuću grupu koraka. Iako prisutni kao numerisani koraci, koraci metoda ovde mogu biti izvedeni istovremeno ili u različitom redosledu. Dodatno, delovi ovih koraka se mogu koristiti sa delovima drugih koraka iz drugih metoda. Takođe, koraci ili njihovi delovi mogu biti opcioni. Pored toga, bilo koji od koraka bilo koje metode se mo že izvoditi sa modulima, kolima, ili drugim sredstvima za obavljanje ovih koraka.
[0059] U koraku 110 se identifikuje prvo mnoštvo lokusa za koje je genom majke heterozigotan. U jednom rešenju, ovo određivanje se može izvesti kod dela genotipizacije oca i majke na nivou celog genoma ili na izabranim genomskim lokusima od interesa. U drugim izvođenjima, određivanje prvog mnoštva lokusa se može izvesti tokom analize majčinog uzorka, što je opisano u kasnijim poglavljima.
[0060] U koraku 120 se određuju oba majčina haplotipa koji pokrivaju prvo mnoštvo lokusa. Kao što je pomenuto, genom majke se može dobiti direktnim sekvenciranjem. U drugim realizacijama, genotipizacija se može obaviti na mnoštvu lokusa, a zatim upotrebiti mapiran genom nekoga za koga se očekuje da ima sličan genom, npr. od članova familije ili iz referentnog genoma koji je zajednički kod iste ili slične populacije. U jednoj realizaciji, korak 120 se može prvo izvršiti za ceo ili za delove genoma majke a zatim se genom majke može ispitati da se nađu lokusi na kojima je majka heterozigotna.
[0061] U jednom aspektu, nije neophodno izgraditi haplotipove hromozoma oca. Me đutim, ako paternalni haplotipovi mogu biti izgrađeni onda se dodatne informacije mogu dobiti iz rezultata sekvenciranja. Jedna takva dodatna informacija uključuje činjenicu da se relativna analiza doziranja hapolotipa može obaviti za područja za koja su oba roditelja heterozigotna. Još jedna dodatna informacija koja se može obezbediti ako je dostupan paternalni hapolotip je informacija u vezi mejotičke rekombinacije koja uključuje jedan ili više paternalnih hromozoma i da se utvrdi da li su aleli bolesti koji su povezani sa takvim polimorfizmima preneti na fetus.
[0062] U koraku 130 se utvrđuje alel koji je fetus nasledio od oca u svakom iz prvog mnoštva lokusa. Neke realizacije koriste genomske lokuse koji su homozigotni za oca, ali heterozigotni za majku (kao što je pomenuto u koraku 110). Prema tome, ako je otac homozigotan na lokusima, onda je poznat alel koji je nasledio od oca. Genotipizacija oca da se odrede lokusi na kojima je otac homozigotan se može izvesti na neki od ovde opisanih načina. U jednom izvođenju, određivanje prvog mnoštva lokusa se može izvesti na osnovu genotipa oca i majke kako bi se prona šli lokusi na kojima je otac homozigotan i na kojima je majka heterozigotna.
[0063] U sledećoj varijanti, drugo mnoštvo lokusa očevog genoma koji su heterozigotni se može upotrebiti da se odredi paternalni haplotip koji je fetus nasledio na prvom mno štvu lokusa na kojem je otac homozigot. Na primer, ako je genom majke homozigotan na drugom mno štvu lokusa, mogu se identifikovati aleli koji su prisutni u paternalnom genomu u onim odgovarajuć im iz drugog mnoštva lokusa i odsutni u genomu majke. Nasleđen očinski haplotip onda može da se identifikuje kao haplotip sa utvrđenim alelima, i koristi za određivanje alela nasleđenih od oca na prvom mnoštvu lokusa. Ovi aspekti određivanja haplotipa oca su detaljnije razmatrani u nastavku.
[0064] U koraku 140, je analizirano mnoštvo molekula nukleinske kiseline iz biološkog uzorka trudnice. Uzorak sadrži mešavinu nukleinskih kiselina majke i fetusa. Može se uzeti biološki uzorak majke i primiti na analizu. U jednoj realizaciji se koristi plazma i serum majke. U drugim realizacijama se može koristiti, majčina krv, majčin urina, majčina saliva, fluid ispiranja materice ili fetalne ćelije dobijene iz majčine krvi.
[0065] U jednoj realizaciji, analiza molekula nukleinske kiseline obuhvata identifikaciju lokacije molekula nukleinske kiseline u ljudskom genomu, i određivanje alela od molekula nukleinske kiseline na pojedinačnom lokusu. Prema tome, jedna realizacija može izvoditi kvantitativnu genotipizaciju korišćenjem utvrđenih alela molekula nukleinske kiseline iz istog lokusa. Može se koristiti svaka metoda koja će omogućiti određivanje genomske lokacije i alela (informacije o genotipu) od molekula nukleinske kiseline u majčinom biološkom uzorku. Neke od takvih metoda su opisane u US aplikacijama 12/178,181 i 12/614350, i primena pod nazivom "Size-Based genomic Analysis."
[0066] U koraku 150, na osnovu utvrđenih alela od molekula nukleinskih kiselina, utvrđene su količine odgovarajućih alela na svakom od prvog mnoštva lokusa. U jednom izvođenju, količine mogu biti broj alela svakog tipa na prvom lokusu. Na primer, šest A i četiri T. U drugoj realizaciji, količina može biti distribucija veličine molekula nukleinske kiseline koju ima određeni alel. Na primer, relativna količina može uključivati raspodelu veličine fragmenata sa određenim genotipom, koji mogu da prenesu relativnu količinu fragmenata određenih dužina. Takve relativne količine takođe mogu da pruže informaciju o tome koji genotip je u genomu fetusa, po što fetalni fragmenti imaju tendenciju da budu manji od fragmenata majke. Neki primeri koli čina i metoda su opisani u US prijavama 12/178,181 i 12/614350, i prijavi pod naslovom "Size-Based Genomic Anayisis."
[0067] U jednoj realizaciji, relativne količine alela na lokusu mogu pružiti informacije o tome koji genotip je nasledio fetus (npr. nakon što set podataka dostigne dovoljnu statističku moć). Na primer, relativne količine se mogu koristiti za utvrđivanje da li se disbalans u sekvenci javlja u odnosu na majčine genotipove na lokusu. Odgovarajuće gore citirane patentne prijave pružaju primere realizacija za detekciju disbalansa u sekvenci na određenom lokusu ili regionu.
[0068] U koraku 160 se porede relativne količine odgovarajućih alela molekula nukleinske kiseline na više od jednog lokusa iz prvog mnoštva lokusa. U nekim realizacijama, količine svakog alela na svakom lokusu iz prvog mnoštva lokusa koji sadrže haplotipove se sabiraju pre nego što se vrši poređenje. Sabrane količine roditeljskih haplotipova se onda mogu porediti da se odredi da li je hapolotip značajno više zastupljen, ravnopravno zastupljen ili značajno manje zastupljen. U drugim realizacijama, se porede količine alela na lokusu, i koriste se poređenja na više lokusa. Na primer, vrednost separacije (npr. razlika ili odnos) mogu biti sabrani, što se može koristiti u poređenju sa graničnom vrednošću. Svako od ovih izvođenja se može primeniti na bilo koji od koraka koji su ovde opisani.
[0069] U različitim realizacijama, relativne količine mogu biti rezultati brojanja svakog fragmenta sa određenim alelom na određenom lokusu, rezultati brojanja fragmenata na bilo kojem lokusu (ili bilo kojem lokusu u regionu) na određenom hapolotipu, i statistička vrednost brojanja (npr. srednja vrednost) na određenom lokusu ili određenom haplotipu. Prema tome, u nekoj realizaciji, poređenje može biti određivanje vrednosti razdvajanja (npr. razlika ili odnos) jednog alela u odnosu na drugi alel na svakom lokusu.
[0070] U koraku 170, na bazi poređenja se može odrediti haplotip koji nerođeni fetus nasleđuje od majke na delu genoma koji prekriva prvo mnoštvo lokusa. U jednoj realizaciji, da bi se utvrdilo koji od majčinih hromozoma su preneti na plod, koristi se metoda relativnog doziranja hapolotipa (RHDO), na primer, kako je gore pomenuto. Pošto je majka heterozigotna za svaki od prvih lokusa, prvi lokusi odgovaraju dvoma haplotipovima za genomski region prvih lokusa. Relativno doziranje ovih haplotipova bi bilo 1:1 ako je uzorak samo od majke. Odstupanja ili izostanak odstupanja od ovog odnosa može da se upotrebi za određivanje haplotipa fetusa koji je nasleđen od majke (i oca, što će detaljnije biti razmatrano kasnije). Tako, za dati hromozom ili region hromozoma, konstitutivni aleli ovih haplotipova se mogu tražiti iz analitičkih podataka (npr. podataka sekvenciranja) generisanih u koraku 130.
[0071] Pošto je analizirano mnoštvo lokusa i poređeno sa haplotipom majke, sekvence između lokusa mogu biti pripisane određenom haplotipu. U jednoj realizaciji, ako nekoliko lokusa odgovara određenom haplotipu, onda se može pretpostaviti da su segmenti sekvenci između lokusa isti kao oni u haplotipu majke. Zbog pojave mejotičke rekombinacije, konačan haplotip koji je fetus nasledio se može sastojati od patchworka "segmenata haplotipa” poreklom od jednog od ova dva homologna hromozoma. Realizacije mogu detektovati takvu rekombinaciju.
[0072] Rezolucija u kojoj bi takva rekombinacija mogla biti detektovana zavisi od broja i distribucije genetskih markera nađenih u konstitucionalnoj DNK oca i majke, i praga koji se koristi u kasnijoj bioinformatičkoj analizi (koristeći npr. SPRT). Na primer, ukoliko poređenje ukazuje da alel nasleđen od majke na svakom od prvog seta uzastopnih lokusa odgovara prvom haplotipu, onda je utvr đeno da je prvi haplotip nasleđen za genomsku lokaciju koja odgovara prvom setu lokusa. Ako drugi set uzastopnih lokusa ukazuje da je drugi hapolotip nasleđen, onda je utvrđeno da je drugi haplotip nasleđen za genomsku lokaciju koja odgovara drugom setu lokusa.
[0073] U jednoj varijanti, pošto se analizira mnoštvo lokusa, haplotip se može odrediti sa većom preciznošću. Na primer, statistički podaci za jedan lokus možda neće biti odlučujući, ali kada se kombinuju sa statističkim podacima ostalih lokusa, može se utvrditi čiji hapolotip se nasleđuje. U sledećoj realizaciji svaki lokus se može analizirati nezavisno da se izvrši klasifikacija, a zatim klasifikacije mogu biti analizirane da se utvrdi čiji hapolotip je nasleđen u datom regionu.
[0074] U jednoj realizaciji se može izvršiti statistički postupak da se odredi relativno doziranje haplotipa (npr. da li je neki od ovih haplotipova značajno više zastupljen u odnosu na drugi haplotip). Klasifikacioni prag ove statističke procedure se može podesiti u zavisnosti od frakcione koncentracije fetalne DNK. Uopšteno, veća frakciona koncentracija fetalne DNK može omoguć iti dostizanje praga sa manjim brojem molekula. Prag klasifikacije može da se podešava u zavisnosti od broja uspešno klasifikovanih segmenata koji se želi postići u genomu ili genomskim regionima od interesa.
[0075] Pozivajući se ponovo na Sl. 1, u koraku 180, genom fetusa može da se analizira za mutacije. Na primer, realizacije se mogu koristiti za pretragu panela mutacija koje uzrokuju genetska oboljenja u određenoj populaciji. Primeri mutacija koje se mogu detektovati kori šćenjem realizacija mogu se naći iz Onlajn Mendelovsko Nasleđivanje kod Čoveka (www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/getmorbid.cgi). Ove mutacije se mogu pretraživati u koracima 140-160; ili kao poseban korak kao što je ovde opisano. Na primer, u familijama, u kojima je otac nosilac jedne ili više mutacija koje su odsutne kod majke, onda se mutacija(e) mogu pretra živati iz analitičkih podataka (npr. podataka sekvenciranja) dobijenih iz biolo škog uzorka majke.
[0076] Pored otkrivanja aktuelne mutacije, mogu se pretraživati polimorfni genetski markeri spojeni sa mutiranim ili alelima divljeg tipa oca ili majke. Na primer, RHDO analiza mo že otkriti da je fetus nasledio haplotip od majke za koju se zna da nosi mutaciju za bolest. Realizacije ovog pronalaska se takođe mogu koristiti za neinvazivnu dijagnostiku oboljenja izazvanih delecijama hromozomskih regiona, npr. delecija Jugoistočna Azija izaziva alfa-talasemija. U scenariju u kojem su i otac i majka nosioci delecije, ukoliko je fetus homozigotan za deleciju, i ako se masivno paralelno sekvenciranje vrši na DNK majčine plazme, onda bi trebalo da se javi smanjenje učestalosti DNK sekvenci poreklom iz regiona delecije u majčinoj plazmi.
B. Primer
[0077] Ovaj odeljak opisuje primer realizacija (npr. metode 100) primenjenih na jednonukleotidni polimorfizam (SNP) u kojim je majka heterozigotna. SNP aleli na istom hromozomu formiraju haplotip, sa majkom koja ima homologni par svakog hromozoma, a tako i dva haplotipa. Da bi ilustrovali kako se izvodi to određivanje, razmotrimo segment na hromozomu 3, na primer, kao što je prikazano na Sl. 2.
[0078] Sl. 2 prikazuje dva haplotipa za oca i dva haplotipa za majku za određeni segment njihovog odgovarajućeg genomskog koda. Pet SNP-a je pronađeno na ovom segmentu u kojem su otac i majka homozigotni i heterozigotni, odnosno, za svih 5 od ovih SNP-a. Dva homologna hromozoma oca su posedovala isti haplotip (HAP), t.j. A-G-A-A-G (odozgo ka dole na Sl. 2). Radi jednostavnosti, o čevi haplotipovi se nazivaju Hap I i Hap II, imajući u vidu da su oba identična za ovaj set od 5 SNP-a. Kod majke su uočena dva haplotipa, naime Hap III, A-A-A-G-G i Hap IV, G-G-G-A-A.
[0079] SNP-i u ovom primeru mogu dalje biti klasifikovani u dva tipa. Sl. 3 prikazuje dva tipa SNP-a prema realizacijama ovog pronalaska. Tip A se sastoji od onih SNP-a u kojima su očevi aleli bili isti kao oni na majčinom haplotipu III. Tip B se sastoji od onih SNP-a u kojima su očevi aleli bili isti kao oni na majčinom haplotipu IV.
[0080] Ova dva tipa SNP-a mogu zahtevati malo drugačiju matematičku obradu. Tako, u scenariju tipa A, fetalno nasleđivanje haplotipa III bi dovelo do značajno veće zastupljenosti haplotipa III, u odnosu na hapolotip IV u majčinoj plazmi (Sl. 4A). Na primer gledajući samo jedan SNP 410 radi lakše diskusije, alel A se nasleđuje od oca, a ako se Hap III nasleđuje od majke, fetusu će onda doprineti dva A alela u uzorku, koji će prouzrokovati značajno veću zastupljenost A. Ako fetus nasleđuje haplotip IV onda neće biti prevelike značajno veće zastupljenosti, pošto bi fetus takođe bio heterozigotan sa A i G na lokusu.
[0081] S druge strane, u scenariju tipa B, fetalno nasleđivanje haplotipa III bi dovelo do jednake zastupljenosti haplotipa III i haplotipa IV u majčinoj plazmi (Sl. 4B). Na primer, kada se posmatra SNP 420, nasleđivanje G od oca i A kao dela Hap III bi uzrokovalo da fetusu doprinose jednake količine A i G u SNP 420, baš kao i majka. Ako je fetus nasledio Haplotip IV, onda bi se uočila značajno veća zastupljenost što se vidi iz prethodne diskusije.
[0082] Sl. 5A i 5B prikazuju analizu poređenja relativnih količina (npr. brojanje) fragmenata za svaki lokus i da li je rezultat poređenja da određeni haplotip bude klasifikovan kao nasleđen ili ne. Svaka genomska lokacija na kojoj se nalazi SNP koji se uklapa u jednu od ovih konfiguracija genotipa oca i majke (npr. scenariji Tipa A ili Tipa B) može da se koristi za ovaj primer. Iz podataka sekvenciranja majčine plazme, može se fokusirati na broj sekvenciranih molekula koji odgovaraju određenom alelu SNP-a. SPRT analiza (ili druga metoda poređenja) može da se koristi za određivanje da li postoji alelni disbalans između ovih alela (Lo YMD et al. Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104: 13116-13121).
[0083] Sl. 5A prikazuje analizu za SNP-e tipa A. Kao što je prikazano, za svaki SNP, SPRT poređenje relativnih količina (npr. kako je definisano pomoću vrednosti separacije) sa graničnom vrednošću obezbeđuje klasifikaciju. U jednoj realizaciji, kada je bio dostignut klasifikacioni prag za SPRT tada je zaključeno nasleđivanje određenog majčinog haplotipa od strane fetusa. Brojanje za SPRT analizu onda može da bude resetovano. Zatim se analiza može prebaciti na susedni SNP koji odgovara potrebnoj konfiguraciji genotipa, iz telomernog u centromernom pravcu, ili obrnuto; i sa ovim sledećim SNP-om se može započeti nova SPRT analiza.
[0084] Sa druge strane, u jednoj realizaciji, ako klasifikacija za SPRT nije dostignuta sa SNP, onda se takođe na sličan način možemo pomeriti na susedni SNP, osim što rezultati brojanja za naredni SNP mogu da se dodaju na onaj prethodni, a zatim može ponovo da se sprovede SPRT. Ovaj proces može da se nastavi dok se ne dostigne prag klasifikacije. Sl. 5A i Sl. 5B ilustruju operisanje ovog procesa za analize Tipa A i Tipa B. U jednoj realizaciji, klasifikacije se analiziraju zajedno da se napravi potpuna klasifikacija za region. Na primer, ako se klasifikacija dobije za prvu grupu SNP-a i za narednu grupu SNP-a, ove dve klasifikacije se mogu porediti da se proveri kozistentnost klasifikacije.
[0085] Sl. 6 ilustruje efekat promene faktora rizika za SPRT klasifikaciju (Zhou W et al. Nat Biotechnol 2001;19:78-81; Karoui NE et al. Statist Med 2006;25:3124-33). Generalno niži odnos verovatnoće za klasifikaciju, npr. 8, može olakšati klasifikaciju. To može dovesti do većeg broja klasifikovanih regiona u okviru genoma. Međutim, može se očekivati da nekoliko takvih regiona bude pogrešno klasifikovano. S druge strane, veća verovatnoća za klasifikaciju, na primer, 1200, može da omogući klasifikaciju samo kada je pogođeno više SNP-a. To može dovesti do manjeg broja klasifikovanih regiona u genomu. Može se očekivati da broj i udeo pogrešno klasifikovanih regiona bude manji u poređenju sa situacijama kada je korišćen niži klasifikacioni prag.
[0086] U jednoj varijanti, klasifikacija se vrši samo ako dve uzastopne SPRT klasifikacije rezultuju u istom haplotipu (naziva se algoritam "dva uzastopna bloka"). U jednom aspektu, algoritam "dva uzastopna bloka" može povećati tačnost klasifikacije. U nekim realizacijama, za bilo koji deo sekvence, pri realizaciji se može prvo izvršiti SPRT analiza za SNP-e Tipa A, a onda još jedna SPRT analiza za SNP-e Tipa B. U jednoj realizaciji se može razmotriti scenario za deo sekvence za koji SNP-i Tipa A i Tipa B formiraju dve grupe genetičkih obeležja koja se prepliću (npr. SNP). U realizacijama u kojima se koristi algoritam "dva uzastopna bloka" ova dva bloka mogu biti razli čitog tipa.
[0087] Rezultati SPRT iz analize Tipa A i Tipa B mogu omogućiti proveru slaganja ili neslaganja njihovih rezultata klasifikacije. Kako bi se povećala tačnost klasifikacije, jednaka realizacija ("interlacing approach") bi mogla da izvrši klasifikaciju samo ako obe analize Tipa A i Tipa B za dati genomski region daju konzistentne rezultate. Ukoliko ove dve analize daju neusagla šene rezultate, možemo da pregledamo rezultate klasifikacija za dva susednog regiona, jedan na centromernom kraju, a drugi na telomernom kraju. Ukoliko ova dva susednog regiona daju usagla šene rezultate, onda se prvi region može klasifikovati kao kontinualni haplotip sa ova dva regiona. Ako ova dva suseDNK regiona ne daju usaglašene rezultate, onda možemo da pređemo na sledeća dva susedna regiona dok se ne dođe do poklapanja. Jedna varijanta ove teme je da se pomera samo u jednom smeru i da se uzimaju klasifikacioni rezultati za sledeći, ili dva, ili čak i više susednih regiona kao i rezultati originalnog regiona koji je u pitanju. Opšti princip je da se koriste rezultati klasifikacija susednih genomskih regiona da se potvrde rezultati klasifikacije za određeni region.
II. ODREĐIVANJE PATERNALNIH ALELA KOJE JE FETUS NASLEDIO
[0088] Sl. 7 je dijagram toka metode 700 za određivanje najmanje dela genoma nerođenog fetusa trudnice nasleđenog od oca. Metoda 700 analizira molekule nukleinske kiseline (fragmente) iz biološkog uzorka trudnice da se utvrdi genom fetusa. Uzorak sadrži smešu nukleinskih kiselina majke i fetusa.
[0089] U koraku 710, svaki od brojnih molekula nukleinske kiseline iz biološkog uzorka je analiziran da se utvrdi lokacija molekula nukleinske kiseline u ljudskom genomu, i odredi tip alela molekula nukleinske kiseline. Prema tome, genotipovi molekula nukleinske kiseline na određenoj lokaciji (lokusu) mogu biti određeni u jednoj realizaciji. Za ovu analizu se može koristiti bilo koja od gore i na drugom mestu opisanih metoda.
[0090] U koraku 720 se određuje prvo mnoštvo lokusa na kojem je paternalni genom heterozigotan a genom majke homozigotan. U jednom izvođenju, prvo mnoštvo lokusa se dobija određivanjem paternalnog i maj
inog genoma. Genomi mogu biti rudareni “mined” za genomske lokuse u kojima je otac heterozigotan, a majka homozigotna.
[0091] U koraku 730, haplotip koji nerođeni fetus nasleđuje od oca u delu genoma pokrivenim prvim mnoštvom lokusa se određuje na osnovu utvrđenih genotipa na prvom mnoštvu lokusa. U jednoj realizaciji, alel svakog od ovih lokusa kojih poseduje otac, a koji je odsutan u genomu majke, se pretražuje u analitičkim podacima (npr. podaci sekvenciranja). Kombinacija ovih alela bi ukazivala na haplotipove hromozoma koje je fetus nasledio od oca.
[0092] U sledećoj realizaciji, ako su poznati haplotipovi svakog od hromozoma ili hromozomskih regiona od interesa u genomu oca, onda se takođe može utvrditi gde se javila mejotička rekombinacija tokom spermatogeneze kod oca. Prema tome, paternalna mejoti čka rekombinacija se uočava kada se haplotip dela DNK u paternalno-nasleđenom hromozomu razlikuje kod fetusa i oca. Uključivanje takvih informacija o rekombinaciji može biti korisno kada se koriste analitički podaci (npr. podaci sekvenciranja) za dijagnostiku genetske bolesti povezivanjem analize sa genetskim polimorfizmima.
III. OTAC I MAJKA SU HETEROZIGOTNI ZA GENOMSKI REGION
[0093] Izvođenja se mogu odnositi na scenario u kojem su otac i majka heterozigotni za genomski region. Ovaj scenario može biti od posebnog značaja u familijama u kojima su otac i majka krvni srodnici. Takođe može biti relevantan kada je bolest povezana sa predominantnom mutacijom koja je rezultat velikog efekta osnivača. U takvim okolnostima, treba očekivati da ako su otac i majka nerođenog fetusa oboje nosioci mutiranih gena, onda haplotip hromozoma koji nosi mutiranu kopiju gena može suštinski biti identičan, osim u slučaju pojave mejotičke rekombinacije. Ova vrsta analize može biti posebno korisna za autozomne recesivne bolesti kao što je cistična fibroza, betatalasemija, anemija srpastih ćelija i bolest hemoglobina E.
[0094] Sl. 8 je dijagram toka metode 800 za odredjivanje najmanje dela genoma nerođenog fetusa u regionu u kojem su majka i otac heterozigotni prema primenama ovog pronalaska.
[0095] U koraku 810 se određuje prvo mnoštvo lokusa na kojima su otac i majka heterozigotni. U jednoj realizaciji, prvi lokusi se mogu odrediti bilo kojom od metoda koje su ovde pomenute. Na primer, celi ili regioni roditeljskih genoma mogu biti sekvencirani ili razli čiti delovi genotipizovani da se nađu prvi lokusi. Prema tome, svaki od dva paternalna i svaki od dva majčina haplotipa u prvom mnoštvu lokusa mogu biti poznati.
[0096] Kao primer, Sl. 9 prikazuje haplotipove oca i majke koji su oboje heterozigotni u odre đenom regionu genoma. Kao što je prikazano, oba roditelja imaju mutirani gen (alel) u regionu 1. Konkretno, Hap I oca i Hap III majke imaju mutirani gen. Takođe, kao što je prikazano, i otac i majka mogu imati drugu kopiju hromozoma koji nosi kopiju gena divljeg tipa. Konkretno, Hap II oca i Hap IV majke imaju gen divljeg tipa. Prema tome, ovaj primer ima zna čaj u određivanju da li je fetus nasledio mutirani gen. Hromozomi od oca i majke koji nose gen divljeg tipa imaju identi čan haplotip u neposrednoj blizini gena, ali mogu imati divergentne haplotipove dalje od tog gena. Pošto bi ovaj hromozom verovatno imao različito poreklo, ovaj hromozom ne bi imao identične haplotipove između oca i majke u celom hromozomu.
[0097] U koraku 820, se utvrđuje drugo mnoštvo lokusa na kojima je otac heterozigotan, a na kojima je majka homozigotna. Kao što je prikazano, prvo i drugo mnoštvo lokusa su na istom hromozomu. Region 2 pokazuje takve druge lokkuse. Region 2 može biti izabran tako da je otac heterozigotan za jedan ili više SNP-a u ovom regionu dok je majka homozigotna u ovom regionu.
[0098] U koraku 830, fragmenti iz uzorka trudnice se mogu analizirati da se identifikuje lokacija u ljudskom genomu i genotip. Ta lokacija se može upotrebiti da se utvrdi da li fragment (molekul nukleinske kiseline) obuhvata jedan ili više prvih lokusa ili jedan ili više drugih lokusa. Ova informacija se zatim može koristiti da se utvrdi haplotip nasleđen od oca i haplotip nasleđen od majke.
[0099] U koraku 840 se, analizom utvrđenih genotipova mnoštva molekula nukleinske kiseline iz biološkog uzorka na najmanje jednom od drugih lokusa, određuje koji od dva paternalna haplotipa je fetus nasledio. Na primer, SNP aleli koji su prisutni jedino u genomu oca, ali odsutni u maj činom genomu, kao što je T alel obeležen sa<*>i A alel obeležen sa<+>na Sl. 9, mogu se pretraživati iz analitičkih podataka (npr. lokacija i genotipa iz koraka 710) iz biološkog uzorka majke. Kao što može biti urađeno za metodu 700, ako se T alel označen sa * detektuje u majčinoj plazmi, onda to znači da fetus od oca nasleđuje haplotip II (Hap II). Nasuprot tome, ako se alel A obeležen sa detektuje u majčinoj plazmi, onda to znači da fetus od oca nasleđuje Hap I.
[0100] U koraku 850 se porede relativne količine utvrđenih genotipova molekula nukleinske kiseline na više od jednog prvog mnoštva lokusa. U jednom izvođenju, količine na svakom lokusu se sabiraju i porede se relativne količine haplotipova majke. Relativne količine može da se odnosi na izbrojane brojeve, distribucije veličina, i bilo koji drugi parametar koji može da prenese informacije o tome koji genotip je u genomu fetusa na određenom lokusu.
[0101] U koraku 860, na bazi paternalnog haplotipa za koji je utvrđeno da ga je fetus nasledio i na bazi poređenja relativnih količina, utvrđuje se haplotipa koji nerođeni fetus nasleđuje od majke na delu genoma prekrivenog prvim mnoštvom lokusa. Tako, RHDO analiza (npr. kako je gore opisano) SNP-a u Regionu 1 iz analitičkih podataka iz biološkog uzorka majke se može izvesti da se utvrdi koji od ova dva majčina haplotipa je fetus nasledio, uzimajući u obzir paternalni haplotip koji je fetus nasledio u Regionu 2. U jednoj realizaciji se pretpostavlja da nema rekombinacije izme đu Regiona 1 i 2 kada se ovi regioni prenose sa roditelja na fetus.
[0102] Na primer, razmotrimo scenario kada je analizom Regiona 2 utvrđeno da je fetus nasledio Hap I od oca. Zatim, fetalno nasleđivanje Hap III (koji je identičan kao HAP I u Regionu 1) od majke će dovesti do značajno veće zastupljenosti Hap III u odnosu na Hap IV u majčinoj plazmi. Sa druge strane, ako bi fetus nasledio Hap IV od majke, u majčinoj plazmi bi bila jednaka zastupljenost Hap III i Hap IV.
[0103] Kao sledeći primer, razmotrimo scenario kada je je analizom Regiona 2 utvrđeno da je fetus nasledio Hap II od oca. Zatim, fetalno nasleđivanje Hap IV (koji je identičan Hap II u Regionu 1) od majke će dovesti do značajno veće zastupljenosti Hap IV u odnosu na Hap III u majčinoj plazmi. Nasuprot tome, ako bi fetus nasledio Hap III od majke, tada će u majčinoj plazmi biti jednaka zastupljenost Hap III i Hap IV.
[0104] U prethodnim poglavljima smo odredili genom fetusa i frakcionu koncentraciju fetalne DNK korišćenjem podataka dobijenih sekvenciranjem DNK iz majčine plazme, kao i genotipskih informacija roditelja fetusa. U narednim poglavljima, opisujemo realizacije za odre đivanje frakcione koncentracije fetalne DNK i genotipa fetusa bez prethodne informacije o genotipu/haplotipu majke i oca.
V. ODREĐIVANjE FRAKCIONE KONCENTRACIJE FETALNE DNK
[0105] U nekim izvođenjima, opcioni korak je utvrđivanje frakcione koncentracije fetalne DNK. U različitim aspektima, ova frakciona koncentracija može da odredi količinu analize (npr. potrebnu količinu sekvenciranja) ili da omogući da se proceni tačnost analize za datu količinu podataka (npr. dubina pokrivenosti sekvence genoma). Određivanje frakcione koncentracije fetalne DNK može biti korisno za određivanje granične vrednosti za utvrđivanje klasifikacije koji hapolotip i/ili genotip je nasleđen.
[0106] U jednoj realizaciji, frakciona koncentracija fetalne DNK se mo že odrediti rudarenjem analitičkih podataka (npr. dobijenih u koraku 140 i 710) za lokuse, koji su homozigotni za oca i za majku, ali sa različitim alelima. Na primer, za SNP sa dva alela, A i G; otac može biti AA, a majka može biti GG i obrnuto. Za takve lokuse, fetus bi obavezno bio heterozigotan. U gornjem primeru, fetalni genotip će biti AG, a proporcija alela A u uzorku majke se može koristiti za određivanje frakcione koncentracije fetalne DNK. U sledećoj realizaciji može biti izvršena statistička analiza da se odredi lokus gde je majka homozigotna a fetus heterozigotan. Na ovaj način, nije potrebna prethodna informacija o majčinom, odnosno očevom genomu.
[0107] Kao alternativa rudarenju “mining” analitičkih podataka, frakciona koncentracija fetalne DNK takođe može biti određena prema drugom pristupu, kao što je upotreba PCR testova, testova digitalne PCR ili testova zasnovanih na masenoj spektrometriji, na panelu polimorfnih geneti čkih markera (Lun FMF et al. Clin Chem 2008; 54: 1664 -1672). Druga alternativa je da se upotrebi jedan ili više genomskih lokusa koji pokazuju različitu metilaciju DNK između fetusa i majke (Poon LLM et al. Clin Chem 2002; 48: 35-41; Chan KCA et al. Clin Chem 2006; 52: 2211-2218; US Patent 6,927,028). Kao još jedna alternativa je da se upotrebi aproksimativna frakciona koncentracija fetalne DNK određena od referentne populacije, npr. u sličnom gestacijskom dobu. Međutim, pošto frakciona koncentracija fetalne DNK može da varira od uzorka do uzorka, može se očekivati da ovaj drugi pristup bude manje precizan nego ako se koncentracija meri posebno za uzorak koji se testira. A. Određivanje Frakcione Koncentracije za Obligatni Heterozigot
[0108] U izvođenjima gde je fetus obligatno heterozigotan, može se odrediti frakciona koncentracija fetalne DNK korišćenjem sledećeg niza proračuna (npr. korišćenjem masivnog paralelnog sekvenciranja). Neka je p rezultat brojanja fetalnog alela koji je odsutan u maj činom genomu. Neka je q rezultat brojanja drugog alela, odnosno alela koji je zajednički u genomu majke i fetusa. Frakciona koncentracija fetalne DNK je data sledećom jednačinom:
jednoj primeni, ova kalkulacija se može izvesti na kumulativnim podacima na različitim
polimorfnim genetskim lokusima ili polimorfnim genetskim karakteristikama koje ispunjavaju parentalnu genotipsku konfiguraciju (npr. oba roditelja su homozigotni, ali za razli čite alele).
B. Određivanje na bazi Informativnih SNP-a
[0110] Frakciona Koncentracija fetalne DNK takođe može biti određena za svaki lokus na kojem je majka homozigotna a fetus heterozigotan, a ne samo kada je majka homozigotna za jedan alel a otac homozigotan za različit alel. Obe metode daju odgovor da li je lokus informativan. Termin "informativni SNP-a" može da se koristi u različitim kontekstima zavisno od informacije koja se želi. U jednom kontekstu, informacija je alel u genomu fetusa na određenom lokusu koji nije prisutan u majčinom genomu na tom lokusu. Prema tome, podskup SNP-a gde je majka homozigotna a fetus heterozigotan može se označiti kao "informativni SNP-i" u kontekstu utvrđivanja koncentracije fetalne DNK. Slučajevi kada su i majka i fetus heterozigotni, ali za najmanje jedan razli čit alel, mogu se koristiti i kao informativni SNP. Međutim, trialelni SNP-i su relativno retki u genomu.
[0111] Sl. 10 je dijagram toka koji ilustruje metodu 1000 za određivanje frakcione koncentracije fetalnog materijala u uzorku majke prema primenama ovog pronalaska. U koraku 1010, fragmenti iz uzorka trudnice se mogu analizirati za identifikaciju lokacije u ljudskom genomu i tip alela ( što može dovesti do određivanja genotipa na toj lokaciji). U jednoj realizaciji, fragmenti se analiziraju sekvenciranjem velikog broja molekula nukleinske kiseline iz biološkog uzorka dobijenog od trudne žene. U drugim realizacijama, može se koristiti PCR u realnom vremenu ili digitalna PCR.
[0112] U koraku 1020 se određuje jedan ili više prvih lokusa da su informativni. U nekim izvođenjima, genom majke je homozigotan, ali ne-maternalni alel je detektovan u uzorku na informativnom lokusu. U jednom izvođenju, genom fetusa je heterozigotan na svakom prvom lokusu a majčin genom homozigotan na svakom prvom lokusu. Na primer, genom fetusa može imati odgovarajuću prvi i drugi alel (npr TA) na prvom lokusu, a genom majke može imati dva odgovarajuća druga alela (npr. AAA) na prvom lokusu. Međutim, takvi lokusi ne mogu biti a priori poznati, na primer, u situacijama kada fetus nije obligatno heterozigotan.
[0113] U jednoj realizaciji za određivanje informativnog lokusa, razmatraju se SNP-i gde je majka homozigotna. Za SNP-e gde je majka homozigotna, fetus je ili homozigotni za isti alel ili heterozigotni. Na primer, ako je SNP polimorfan za A i T, a majka ima genotip AA genotip fetusa je ili AA ili TA. U tom slučaju, prisustvo T alela u uzorku majčine plazme bi ukazivao da je fetalni genotip TA umesto AA. Neke realizacije mogu da odgovore koliko prisustvo T alela ukazuje na genotip AA izračunavanjem potrebne granične vrednosti, kako je opisano u nastavku.
[0114] U koraku 1030, za najmanje jedan od prvih lokusa se odredjuju prvi broj p rezultat brojanja odgovarajućeg prvog alela i drugi broj q rezultat brojanja odgovarajućeg drugog alela. U jednoj realizaciji, rezultati brojanja fetalno specifičnog (T alela) i deljenog (A alela) alela u majčinoj plazmi se mogu dobiti različitim postupcima, na primer, ali ne ograničavajući se na PCR u realnom vremenu, digitalnu PCR i masivno paralelno sekvenciranje.
[0115] U koraku 1040 frakciona koncentracija se izračunava na osnovu prvog i drugog broja. U jednoj realizaciji, kod trudnice sa genotipom AA i genotipom njenog ploda koji je TA, frakciona koncentracija fetalne DNK (f) može se izračunati pomoću jednačine: f = 2 x p / (p q), u kojoj p predstavlja rezultat brojanja za fetalno specifičan alel (alel T) a q predstavlja rezultat brojanja za alel koji dele majka i plod (alel A).
[0116] U sledećoj varijanti, upotrebom višestrukih informativnih SNP-a frakciona koncentracija fetalne DNK u majčinoj plazmi može biti procenjena sa povećanom preciznošću. Za potrebe brojanja alela za više SNP-ova (ukupno n SNP- ova) frakciona koncentracija fetalne DNK (f) se mo že izračunati pomoću jenačine
pipredstavlja rezultat brojanja fetalno-specifičnog alela za informativnu SNPi; qipredstavlja
rezultat brojanja alela koji dele majka i fetus za informativni SNPi; a n predstavlja ukupan broj informativnih SNP-a. Primena brojanja alela za više SNP-ova može da poveća tačnost procene frakcione koncentracije fetalne DNK.
C. Frakciona Koncentracija Bez Eksplicitne Genetske Informacije o Roditeljima
[0117] Sada se opisuje postupak za određivanje frakcione koncentracije fetalne DNK u uzorku majčine plazme koji ne zahteva prethodnu informaciju u vezi genotipova fetusa i majke. U jednom aspektu, identifikacija informativnih SNP-a je izvr šena na osnovu brojanja različitih alela na ovim SNP lokusima u majčinoj plazmi. Prema tome, metoda 1000 se može koristiti uporedo sa određivanjem informativnih SNP-a na osnovu realizacija opisanih dalje u tekstu. Prvo, obezbe đen je opis verovatnoća da se olakša razumevanje proračuna granične vrednosti koja se koristi da se identifikuju informativni SNP.
[0118] U jednoj realizaciji, verovatnoća otkrivanja fetalno-specifičnog alela prati Poasonovu distribuciju (raspodelu). Verovatnoća (P) za detekciju fetus-specifičnog alela se može izračunati pomoću sledeće jedačine: P = 1 – exp (-f x N/2), u kojoj f predstavlja frakcionu koncentraciju fetalne DNK u uzorku majčine plazme, N predstavlja ukupan broj molekula koji odgovara SNP lokusu koji se analizira; i exp () predstavlja eksponencijalnu funkciju. U jednom aspektu, P se mo že smatrati očekivanom raspodelom jer nije raspodela koja je rezultat merenja količine molekula u većem broju uzoraka. U drugim realizacijama, mogu se koristiti druge raspodele.
[0119] Pod pretpostavkom da je frakciona koncentracija fetalne DNK 5% (tipična vrednost za prvi trimestar trudnoće) i da se analizira 100 molekula (majčini fetalni) koji odgovaraju ovom SNP lokusu (ekvivalentno iznosu sadržanom u 50 diploidnih genoma), verovatnoća otkrivanja fetalnospecifičnog alela (T alel) je 1 - exp (-0.05 x 100/2) = 0.92. Verovatnoća za detekciju fetalnospecifičnog alela bi se povećala sa frakcionom koncentracijom fetalne DNK i brojem molekula koji se analiziraju za SNP lokus. Na primer, ako je koncentracija fetalne DNK 10% i analizira se 100 molekula, verovatnoća otkrivanja fetalno specifičnog alela je 0.99.
[0120] Prema tome, u SNP lokusu za koji je majka homozigotna, prisustvo alela različitog od onog u majčinoj plazmi može ukazivati da je SNP "informativan" za izračunavanje frakcione koncentracije fetalne DNK. Verovatnoća izostajanja neke informativne SNP može da zavisi od broja analiziranih molekula. Drugim rečima, za bilo koje željeno poverenje otkrivanja informativne SNP, broj molekula koji treba analizirati da se dobije željena tačnost se može izračunati prema Poasonovoj funkciji verovatnoće.
[0121] Korišćenjem gornje analize, neke realizacije mogu utvrditi da li je lokus informativan ili ne, kada nije poznat genotip majke. U jednom izvođenju su identifikovani lokusi na kojima su detektovana dva različita alela u majčinom uzorku plazme. Na primer, za SNP lokus sa dva moguća alela A i T, i A i T aleli su detektovani u plazmi majke.
[0122] SI. 11 je dijagram toka metode 1100 za utvrđivanje da li je lokus informativan prema primenama ovog pronalaska. U jednoj realizaciji, metoda 1100 se može koristiti za implementaciju koraka 1020 metode 1000. U još jednom izvođenju, jedan korak metode 1100 je da se utvrdi granična vrednost na osnovu statističke raspodele, a drugi koristi graničnu vrednost da odredi da li je lokus (SNP) informativan.
[0123] U koraku 1110, granična vrednost se određuje za određeni broj predviđenih brojanja dotičnog prvog alela na specifičnom lokusu. U jednoj primeni, granična vrijednost predviđa da li je majčin genom homozigotan a genom fetusa heterozigotan. U jednoj realizaciji, grani čna vrednost se određuje na osnovu statističke distribucije rezultata brojanja za različite kombinacije homozigotnosti i heterozigotnosti na specifičnom lokusu. Na primer, raspodela učestalosti alela se može predvideti pomoću Poasonove funkcije distribucije.
[0124] U koraku 1120, na osnovu analize molekula nukleinskih kiselina iz uzorka majke (npr. iz koraka 1010), prvi alel i drugi alel nisu detektovani na lokusu. Na primer, set fragmenata se mo že mapirati u lokus koji se analizira i prvi alel odnosno drugi alel je detektovan. Prvi alel mo že odgovarati nekom od odgovarajućih prvih alela iz koraka 1020, a drugi alel može odgovarati nekom od odgovarajućih drugih alela. U jednom aspektu, ako dva različita alela nisu otkrivena, onda se zna da lokus nije informativan.
[0125] U koraku 1130, broj aktualnih brojanja odgovarajućeg prvog alela lokusa se određuje na osnovu analize molekula nukleinskih kiselina. Na primer, rezultati sekvenciranja velikog broja molekula nukleinskih kiselina se mogu brojati za određivanje koliko je puta fragment koji ima genotip prvog alela mapiran na lokusu.
[0126] U koraku 1140, lokus je identifikovan kao jedan od prvih lokusa na bazi poređenja broja aktualnih brojanja sa graničnom vrednošću. U jednom aspektu, granična vrednost se može koristiti za razlikovanje između tri mogućnosti: (a) majka je homozigotna (AA) a fetus je heterozigotan (AT); (b) majka je heterozigotna (AT) i fetus je heterozigotan (AT); i (c) majka je heterozigotna (AT) a fetus homozigotan za (AA) ili (TT). Radi ilustracije, primeri ispod pretpostavljaju da je genotip fetusa AA u scenariju (c). Međutim, kalkulacija će biti ista ukoliko je genotip fetusa TT. Informativni lokus bi imao mogućnost (a).
[0127] U jednoj realizaciji, lokus je identifikovan kao jedan od prvih lokusa kada je broj aktualnih brojanja manji od granične vrednosti. U sledećoj realizaciji se može koristiti niži prag kako bi se osiguralo da ne dođe do lažnog mapiranja.
[0128] Sada se opisuje varijanta za određivanje granične vrednosti. Na osnovu fiziološki moguće frakcione koncentracije fetalne DNK (ovi podaci se dobijaju iz prethodnih razmatranja), i ukupnog broja molekula koji odgovaraju SNP lokusu, može se predvideti distribucija rezultata brojanja alela za gornja tri moguća scenarija. Na bazi predvidjene distribucije može da se odredi granična vrednost za interpretaciju posmatranih rezultata brojanja alela u maj činoj plazmi da se utvrdi da li je SNP "informativan" (t.j. scenario (a)) ili ne.
[0129] Frakciona koncentracija fetalne DNK je obično u rasponu od 5% do 20% u ranoj trudnoći i kreće se od 10% do 35% u kasnoj trudnoći (Lun et al., Microfluidics digital PCR reveals a higher than expected fraction of fetal DNK in maternal plasma. Clin Chem 2008; 54:1664-72). Prema tome, u jednom aspektu su utvrđene predviđene distribucije tih rezultata brojanja alela za frakcionu koncentraciju fetalne DNK od 5% i 20%.
[0130] Sl. 12A prikazuje predviđenu raspodelu rezultata brojanja alela T (manje zastupljen alel u scenarijima (a) i (c)) za tri scenarija sa pretpostavljenom frakcionom koncentracijom fetalne DNK od 20%. Sl. 12B prikazuje predviđenu raspodelu rezultata brojanja alela T (manje zastupljen alel za scenarije (a) i (c)) za tri scenarija pod pretpostavkom od 5% fetalne DNK. Pretpostavlja se da se u oba predviđena modela analizira ukupno 200 molekula za SNP lokus.
[0131] Korišćenjem prisustva od 40 brojanja manje zastupljenog alela (T alela), kao granične vrednosti, statistički se mogu razlikovati tri mogućnosti. Drugim rečima, za bilo koji SNP lokus sa dva alela detektovanа u majčinoj plazmi i ukupno 200 molekula koji se analiziraju, ukoliko je učestalost alela manjinskog alela (manje zastupljen alel) manja od 40, SNP lokus se može smatrati "informativnim". Za frakcione koncentracije fetalne DNK od 5% i 20%, diferencijacija "informativnih" SNP-a (scenario (a)) od SNP-a za koje je majka heterozigotna (scenario (b) i (c)) će biti 100% tačan.
[0132] U praksi, ukupan broj detektovanih molekula može biti različit za različite SNP. Za svaki SNP lokus, specifična kriva predviđene raspodele može biti konstruisana uzimajući u obzir ukupan broj molekula detektovanih u majčinom uzorku plazme koji pokrivaju SNP lokus. Drugim rečima, granična vrednost brojanja za utvrđivanje da li je SNP informativan ili ne, može da varira između SNP-ova i zavisi od toga koliko je puta SNP lokus bio brojan counted.
[0133] Sledeća tabela prikazuje rezultate brojanja alela za tri SNP lokusa u uzorku majčine plazme koja je sekvencirana. Za svaki od tri SNP-a dva različita alela su detektovana u uzorku majčine plazme. Ukupni rezultati brojanja detektovanih u majčinoj plazmi koji odgovaraju za ova tri SNP-a su različiti.
[0134] Predviđene distribucije za brojanja manje zastupljenog alela za frakcionu koncentraciju fetalne DNK od 20% i različita ukupna brojanja molekula koji odgovaraju SNP su prikazani na Sl. 13A, 13B i 14. Predviđene raspodele su nacrtane korišćenjem pretpostavljene koncentracije fetalne DNK od 20% pošto ona predstavlja viši limit koncentracije fetalne DNK u prvom trimestru. Što je veća koncentracija fetalne DNK, očekuje se veće preklapanje između krivih raspodele manjinskog alela za koji je majka homozigotna za većinski alel nego kada je majka heterozigotna. Prema tome, preciznije je izvesti granične vrednosti za brojanja manjinskog alela korišćenjem veće koncentraciju fetalne DNK za predviđanje informativnih SNP-ova.
[0135] Sl. 13A prikazuje predviđenu raspodelu za brojanja manje zastupljenog alela sa ukupnim brojem od 173 molekula i frakcionom koncentracijom fetalne DNK od 20%. U jednoj realizaciji, na bazi ove raspodele, kriterijum granične vrednosti manji od 40 za brojanja manje zastupljenog alela, može biti pogodan za identifikovanje informativnih SNP-a. Po što je alel A izbrojan 10 puta, SNP lokus br.1 se smatra "informativnim" za izračunavanje frakcione koncentracije fetalne DNK.
[0136] SL. 13B prikazuje predviđenu raspodelu za brojanja manje zastupljenog alela sa ukupnim brojem od 121 molekula i frakcionom koncentracijom fetalne DNK od 20%. U jednoj realizaciji, na osnovu ove raspodele, granična vrednost manja od 26 za brojanja manje zastupljenog alela može biti pogodna za identifikovanje informativnih SNP-a. Po što je alel T izbrojan 9 puta, SNP lokus br. 2 se smatra "informativnim" za izračunavanje frakcione koncentracije fetalne DNK.
[0137] SL. 12 prikazuje predviđenu raspodelu za brojanja manje zastupljenog alela sa ukupnim brojem od 134 molekula i frakcionom koncentracijom fetalne DNK od 20%. U jednom aspektu, na osnovu ove raspodele, granična vrednost manja od 25 za brojanja manje zastupljenog alela može biti pogodna za identifikovanje informativnih SNP-a. Kako je brojanje za T alel 62, SNP lokus br. 3 se ne smatra "informativnim" i ne treba ga koristiti za izračunavanje frakcione koncentracije fetalne DNK.
[0138] U nekim realizacijama, upotrebom jednačine f = 2 x p / (p q) frakciona koncentracija fetalne DNK se može izračunati brojanjem alela za SNP 1 i 2 i kombinovano. Rezultati su prikazani u nastavku.
D. Određivanje Dubine Pokrivanja Fetalnog Genoma
[0139] Pored određivanja frakcione koncentracije, realizacije mogu da odrede procenat pokrivanja fetalnog genoma koji je postignut u analitičkom postupku (npr. sekvenciranje) u koraku 1010. U nekim realizacijama, informativni lokus se može koristiti za određivanje procenta pokrivanja. Na primer, bilo koji od primera odozgo može da se koristi. U jednom izvođenju se mogu koristiti lokusi na kojima je fetus obligatno heterozigotan. U sledećoj realizaciji se mogu koristiti lokusi na kojima je utvrđeno da je fetus heterozigotan i majka homozigotna (npr. pomoću metode 1100).
[0140] Fragmenti koji su mapirani u informativne lokuse se mogu koristiti za određivanje procenta pokrivanja. U jednoj realizaciji se određuje proporcija lokusa prvog mnoštva lokusa u kojoj je odgovarajući prvi alel detektovan iz rezultata sekvenciranja. Na primer, ako je fetus TA na lokusu, a majka je AA na lokusu, onda alel T treba da bude detaktovan u rezultatima sekvenciranja ako je sekvenciran taj lokus. Tako se na osnovu ove proporcije može izračunati proporcija fetalnog genoma koji je sekvencioniran iz biološkog uzorka. U jednoj realizaciji se proporcija prvog lokusa gde je uočen fetalno-specifičan alel može uzeti kao procenat pokrivanja fetalnog genoma. U drugim realizacijama, odnos se može modifikovati na bazi mesta gde se nalaze lokusi. Na primer, procenat pokrivanja se može utvrditi za svaki hromozom. Kao drugi primer, procenat može biti procenjen na manje od proporcije ako prvi lokusi ne formiraju dobar prikaz genoma. Kao drugi primer, opseg može biti obezbeđen kada je proporcija jedan kraj opsega. Dok visok procenat, npr. koji se približava 100%, znači skoro kompletno pokrivanje genoma fetusa, većina genetskih bolesti može biti dijagnostikovana sa pokrivanjem mnogo manjim od 100% npr. 80% ili 50% ili manje.
VII. BEZ PRETHODNE INFORMACIJE O GENOMU MAJKE I OCA
[0141] U prethodnim poglavljima, neke realizacije su odredile genetsku mapu fetusa (ili deo genoma fetusa) kada su poznati haplotipi majke i genotipi oca. Druge realizacije su pokazale da se frakciona koncentracija fetalne DNK može odrediti analizom DNK majčine plazme bez prethodnog znanja o genotipovima majke, oca ili fetusa. U nekim drugim realizacijama, sada opisujemo postupak za određivanje genetske mape fetusa (ili dela genoma fetusa) korišćenjem RHDO analizu bez informacija o majčinim i očevim genotipovima/haplotipovima.
[0142] U jednoj realizaciji se koriste informacije o referentnim (npr. naju čestaliji ili poznati) haplotipovima populacije kojoj roditelji pripadaju. Ova informacija se mo že koristiti za određivanje haplotipova majke i oca. Primer se koristi za ilustraciju principa ove metode. Informacije o takvim referentnim haplotipovima se mogu dobiti, na primer, sa sajta Međunarodnog HapMap Projekta (hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/).
[0143] Kao deo ilustrativnog primera, pretpostavimo da su u populaciji prisutna tri referentna haplotipa (Hap A, Hap B i Hap C kao što je prikazano na Sl. 15A). Svaki od ova tri haplotipa se sastoji od 14 SNP lokusa i, za svaki lokus, postoje dva moguća alela. U ovom primeru, otac poseduje Hap B i Hap C dok majka poseduje Hap A i Hap B, kao što je prikazano na Sl. 15B. Ovaj primer pretpostavlja da fetus nasleđuje Hap A od majke i Hap C od oca. Prema tome, fetus poseduje Hap A i Hap C, kao što je prikazano na Sl. 15B.
[0144] SL. 16 je dijagram toka metode 1600 za određivanje najmanje dela genoma fetusa kada je poznat skup referentnih haplotipova, ali roditeljski haplotipovi nisu poznati, prema primenama ovog pronalaska.
[0145] U koraku 1610, majčin uzorak može biti analiziran da se identifikuju SNP-ovi na kojima je majka homozigotna a fetus heterozigotan. Ova analiza se može uraditi slično kao za utvrđivanje da li je lokus informativan, kao što je opisano gore. Prema tome, u jednoj realizaciji se mogu koristiti metode 1000 i/ili 1100. U drugim gore opisanim varijantama, majčin i očev genom se može analizirati da se odrede informacije za mapiranje genoma fetusa.
[0146] Sl. 17 prikazuje primer određivanja informativnih lokusa na osnovu analize DNK fragmenata majčinog uzorka. Za svaki od 14 lokusa su prebrojana pojavljivanja dva alela na svakom lokusu. Brojevi pojavljivanja ovih alela se mogu odrediti, na primer, ali ne ograničavajući se na, korišćenje PCR u realnom vremenu, digitalne PCR, i masivnog paralelnog sekvenciranja. Za svaki od ovih lokusa u majčinoj plazmi bi bila otkrivena dva različita alela. Za razliku od onih SNP-a kada je majka heterozigotna, odnos dva alela bi bio znatno drugačiji. Za fetus specifičan alel (alel koji fetus nasleđuje od oca) bi bio mnogo manje zastupljen u odnosu na majčin alel. Informativni lokusi 1710 su označeni na Sl. 17.
[0147] U koraku 1620 se utvrđuje jedan ili više alela očevog haplotipa koje fetus nasleđuje. U jednoj realizaciji, svaki od lokusa 1710 se može koristiti za određivanje haplotipa nasleđenog od oca. Na primer, paternalni alel koji je fetus nasledio može biti identifikovan kao fetus specifičan alel za lokuse 1720, pošto je fetus-specifičan alel značajno manje zastupljen od alela majke u majčinom uzorku.
[0148] U koraku 1630 se aleli oca porede sa referentnim haplotipovima da se odrediti haplotip nasleđen od oca. U nekim realizacijama može biti izveden jedan broj mogućih haplotipova fetusa, svaki sa svojim verovatnoćom. Jedan ili više najverovatnijih haplotipova fetusa se zatim može koristiti za naknadnu analizu, ili kliničku dijagnozu.
[0149] U primeru prikazanom na Sl. 18, postoje tri moguća haplotipa (Hap A, Hap B i Hap C) u populaciji. Iz analize majčine plazme četiri SNP su identifikovani kao homozigotni za majku i heterozigotni za fetus, predstavljajući tako alele oca koje fetus nasleđuje. Genotipovi u ova četiri SNP-a odgovaraju obrascu Hap C. Dakle, fetus je nasledio Hap C od oca, kao što je prikazano na Sl.
19. Drugim rečima, za sve SNP-e u okviru istog haplotipskog bloka, mogu biti izvedeni utvrđeni aleli koje je fetus nasledio od oca.
[0150] U koraku 1640 se mogu utvrditi lokusi (npr. SNP-ovi), na kojima je majka heterozigotna. U jednoj realizaciji, analiza uzorka majke može obezbediti SNP-ove kada je majka heterozigotna. Na primer, u svakom od ovih SNP-a se mogu detektovati dva različita alela u majčinoj plazmi. Za razliku od SNP-a gde je majka homozigotna a fetus heterozigot koji fetalno-specifični alel samo doprinosi malom udelu ukupnih alela u majčinoj plazmi, brojevi pojavljivanja ova dva alela bi bili slični za SNP-ove kada je majka heterozigotna. Samim tim, kompletan genotip majke za sve SNP lokuse u okviru haplotipskog bloka može biti određen analizom majčine plazme, na primer kao što je prikazano na Sl. 20
[0151] U koraku 1650, majčini haplotipovi se određuju iz majčinih genotipova iz koraka 1640 poređenjem genotipova na lokusima sa haplotipnim informacijama relevantne populacije. Sl. 21 prikazuje realizaciju za utvrđivanje majčinih haplotipova iz majčinih genotipova i referentnih haplotipova. U primeru se koristi, homozigotna majka za G alel na trećem SNP lokusu. Pošto samo Hap A i Hap B ispunjavaju ovaj kriterijum, to ukazuje da majka ima jednu od tri haplotipne kombinacije, odnosno Hap A / Hapa, Hap A / Hap B ili Hap B / Hap B. Pored toga, kako je majka heterozigotna za A i C za prvi SNP, možemo zaključiti da majka ima kombinaciju Haplotipa HAp A / Hap B. U jednoj realizaciji, se može javiti više mogućnosti, a svaka mogućnost se može testirati u sledećem koraku. Iz navedenih analiza, utvrđeni su haplotip majke i haplotip koji fetus nasleđuje od oca. Sl. 22 prikazuje utvrđene haplotipove majke i paternalno nasleđen haplotip.
[0152] U koraku 1660, majčin haplotip koji je fetus nasledio se određuje iz majčinih haplotipova identifikovanih u koraku 1650 i paternalno nasleđenog haplotipa identifikovanog u koraku 1630. Koristeći ove informacije, realizacija može koristiti RHDO analizu da se utvrdi koji majčin hapolotip je prenet na fetus. RHDO analiza se može izvesti u skladu sa bilo kojom od realizacija koje su ovde opisane.
[0153] U jednoj realizaciji, za RHDO analizu, SNP-i na kojima je majka heterozigotna se mogu podeliti u dve grupe, naime tip alfa i tip beta (npr. kao što je prikazano na Sl. 23 i gore opisano). SNP-i tipa alfa se odnose na one lokuse gde je paternalni alel koji je prenet na fetus identi čan sa majčinim alelom koji se nalazi na Hap A. Za SNP-e tipa alfa, ukoliko fetus nasleđuje Hap A od majke, alel na Hap A će biti značajno više zastupljen u majčinoj plazmi. S druge strane, ako fetus nasleđuje Hap B od majke, dva majčina alela će biti ravnopravno zastupljeni u majčinoj plazmi.
[0154] SNP-i tipa beta se odnose na one lokuse gde je paternalni alel koji je prenet na fetus, identičan sa majčinim alelom koji se nalazi na Hap B. Za tip beta SNP-e, ukoliko fetus nasleđuje Hap B od majke, alel na Hap B će biti značajno više zastupljen u majčinoj plazmi. Međutim, ukoliko fetus nasleđuje Hap A od majke, dva majčina alela će biti ravnopravno zastupljeni u majčinoj plazmi. Potencijalna značajno veća zastupljenost Hap A ili Hap B alela se može utvrditi pomoću RHDO analize.
[0155] U nekim realizacijama, da bi se primenila RHDO analiza na određeni region bez prethodne informacije o majčinim haplotipovima i očevim genotipovima, može biti potrebna relativna višestruka pokrivenost SNP-a u okviru haplotipnog bloka, na primer, u jednoj realizaciji mo že biti potrebno da se analizira 200 molekula koji odgovaraju SNP lokusu. Ova informacija se može dobiti, na primer, ali ne ograničavajući se na, PCR u realnom vremenu, digitalnu PCR i masivno paralelno sekvenciranje. U jednoj realizaciji se za dobijanje reprezentativne i ta čne kvantitativne informacije različitih alela u okviru ciljanog regiona, može koristiti ciljano sekvenciranje (npr, kombinacija ciljanog obogaćivanja i masivnog paralelnog sekvenciranja). Donji primer opisuje ciljano sekvenciranje. Prema tome, ova RHDO analiza se može primeniti na podatke ciljanog sekvenciranja DNK u majčinoj plazmi da se odredi koji majčini aleli/hapolotip su/je preneti na fetus bez prethodne informacije o parentalnim genotipovima/haplotipovima.
VI. DETEKCIJA DE NOVO MUTACIJE
[0156] Neka izvođenja mogu detektovati mutaciju koju je fetus stekao. De novo mutacija je mutacija koju ne nose otac ili majka, ali se proizvodi, na primer, tokom gametogeneze bilo od oca ili majke ili oboje. Takva detekcija ima kliničku korist pošto de novo mutacije igraju značajnu ulogu u izazivanju niza genetskih oboljenja npr. hemofilije A i ahondroplazije.
[0157] SL. 24 je dijagram toka koji ilustruje metodu 2400 za identifikovanje de novo mutacije u genomu nerođenog fetusa trudnice. Fetus ima oca i majku koja je trudna žena, a otac ima očinski genom sa dva haplotipa а majka ima majčinski genom sa dva haplotipa, ovaj metod uključuje:
U koraku 2410, mnoštvo molekula nukleinske kiseline iz biološkog uzorka dobijenog od trudnice se sekvencira. Uzorak sadrži mešavinu majčinih i fetalnih nukleinskih kiselina.
[0158] U koraku 2420 se identifikuje lokacija svakog od sekvenciranih molekula nukleinske kiseline u humanom genomu. U jednoj realizaciji, mapiranje sekvenci mo že biti izvedeno sekvenciranjem jednog kraja ili uparenih krajeva. U jednom aspektu, mapiranje u humani genom da se prona đe lokacija ne zahteva egzaktno poklapanje svakog od nukleotida sa lokacijom koja se traži.
[0159] U koraku 2430, za svaku od najmanje dela lokacija, majčina sekvenca i očeva sekvenca se određuju na lokaciji koja je u pitanju. Na primer, ako se 100 lokacija određuju u koraku 2420, onda može biti određen majčin i očev genom na ovih 100 lokacija. U jednoj realizaciji, očeva sekvenca se određuje iz uzorka oca za razliku od korišćenja referentnih haplotipova kako je prethodno opisano. Tako se može detektovati i mutacija koja nije u referentnom genomu. U razli čitim varijantama, majčine sekvence se mogu dobiti iz uzorka koji obuhvata samo majčinu DNK, ili se takođe može dobiti iz biološkog uzorka, npr. korišćenjem ovde opisanih metoda.
[0160] U koraku 2440 se identifikuje prva sekvenca u mnoštvu molekula nukleinske kiseline koja nije prisutna u utvrđenim sekvencama majke ili oca. U jednom izvođenju, poređenje prve sekvence sa određenim sekvencama majke ili oca zahteva egzaktno poklapanje. Tako, ako poklapanje nije egzaktno, smatra se da prva sekvenca nije prisutna u utvrđenim sekvencama majke ili oca. Na ovaj način mogu se identifikovati čak i male de novo mutacije, jer de novo mutacija može biti samo jednaka promena nukleotida. U još jednom izvođenju, neophodan je izvestan broj DNK fragmenata koji pokazuju ne-majčinske i ne-paternalne sekvence da bi se sekvenca mogla smatrati de novo mutacijom. Na primer, granična vrednost za 3 DNK fragmenata se može koristiti da se odredi da li je sekvenca, odnosno de novo mutacija, prisutna ili ne.
[0161] U koraku 2450, se određuje prva frakciona koncentracija prve sekvence u biolo škom uzorku. Na primer, broj DNK fragmenata koje pokazuje prva sekvenca može biti izražen kao proporcija svih DNK fragmenata otkrivenih na tom lokusu.
[0162] U koraku 2460, se određuje druga frakciona koncentracija fetalnih nukleinskih kiselina u biološkom uzorku korišćenjem molekula nukleinske kiseline koji fetus nasledio od oca, a koji je prisutan u očevog genomu, ali nije prisutan u majčinom genomu. Takav molekul nukleinske kiseline može sadržati prvi alel na mestu gde je otac homozigotan i majka takođe homozigotna, ali za različit alel, zbog čega je i fetus obligatno heterozigotan. Informativni lokusi kako je gore opisano, mogu da se koriste za određivanje molekula nukleinske kiseline da bi se odredila druga frakciona koncentracija.
[0163] U drugim realizacijama, druga frakciona koncentracija se može odrediti korišćenjem drugih pristupa, kao što je upotreba PCR testova, testova digitalne PCR ili testova na bazi masene spektrometrije, na Y hromozomu, panela genetskih polimorfizama, t.j. jednonukleotidnih polimorfizama, ili polimorfizama insercija-delecija (Lun FMF et al. Clin Chem 2008; 54: 1664-1672). Druga alternativa je korišćenje jednog ili više genomskih lokusa koji pokazuju različitu DNK metilaciju kod fetusa i majke (Poon LLM et al. Clin Chem 2002; 48: 35-41; Chan KCA et al. Clin Chem 2006; 52: 2211-2218 ; US Patent 6,927,028).
[0164] U jednoj realizaciji, različit epigenetski status se odražavao u različitim obrascima DNK metilacije. Različiti obrasci DNK metilacije mogu uključivati “RAS association domain familly 1A” (RASSF1A) ili gen holokarboksilazna sintetaza (biotin-(proprionil-Koenzim A-karbokilaza (ATP-hidrolizu)) ligaza (HLCS). Količina DNK fragmenata sa fetalno-specifičnim profilom metilacije DNK može biti eksprimiran kao proporcija svih DNK fragmenata poreklom iz različito metilovanog lokusa.
[0165] U koraku 2470, prva sekvenca se klasifikuje kao de novo mutacija ukoliko su prva i druga frakciona koncentracija otprilike iste. Ne-majčinska i ne-paternalna sekvenca poreklom iz grešaka u procesu analize, npr. greška sekvenciranja, je slučajan događaj i ima malu verovatnoću rekurence. Prema tome, višestruki DNK fragmenti koji pokazuju istu ne-majčinsku i ne-paternalnu sekvencu u količinama sličnim izmerenim frakciom koncentracijama fetalne DNK za uzorak verovatno predstavljaju de novo mutaciju prisutnu u fetalnom genomu, a ne gre šku sekvenciranja. U jednom aspektu, granična vrednost može da se koristi da se odredi da li su frakcione koncentracije iste. Na primer, ako su koncentracije u okviru određene vrednosti međusobno, onda se prva sekvenca klasifikuje kao mutacija de novo. U različitim realizacijama, navedena vrednost može biti 5%, 10% ili 15%.
PRIMERI
I. Primer 1
[0166] U cilju ilustrovanja realizacija ovog pronalaska, analiziran je sledeći slučaj. Regrutovan je par koji je posećivao akušersku kliniku zbog dijagnoze beta-talasemije. Otac je bio nosilac -CTTT 4 delecije baznih parova kodona 41/42 humanog beta-globinskog gena. Trudnica je bila nosilac A → G mutacije na nukleotidu -28 humanog beta-globinskog gena. Uzorci krvi su uzimani od oca i majke. Od majke je uzet uzorak krvi pre biopsije horionskih čupica (CVS) kod 12 nedelja gestacije. Nakon CVS, jedan deo je sačuvan za eksperiment. Cilj eksperimenta je bio da se sklopi genetska mapa celog genoma ili da se odredi parcijalna ili kompletna genomska sekvenca fetusa pomo ću masivnog paralelnog sekvenciranja DNK majčine plazme.
1. Određivanje parentalnih genotipova
[0167] DNK je ekstrahovana iz “buffy coat” sloja oca i majke, i iz CVS uzorka. Ovi uzorci DNK su podvrgnuti analizi pomoću sistema Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0. Ovaj sistem sadrži 1.8 miliona genetskih markera, uključujući -900,000 jednonukleotidnih polimorfizama (SNP-a) i više od -950.000 proba za detekciju varijacija broja kopija. Apsolutni broj i procenti SNP koji prikazuju različite kombinacije genotipa za oca, majke i ploda (CVS) su prikazani u tabeli sa Sl.25A.
[0168] Iako je u ovom primeru korišćen Affymetrix sistem, u praksi se može koristiti bilo koja platforma za genotipizaciju poznata stručnjacima u tehnici. Zaista, pored genotipizacije, DNK iz “buffi coat” sloja oca i majke može biti podvrgnut sekvenciranju, bilo na bazi celog genoma ili za izabrane genomske regione. Osim toga, bilo koji izvor konstitucionalne DNK (npr. DNK bukalnih ćelija, DNK folikule kose, itd.) oca i majke se može koristiti za utvrđivanje roditeljskih genotipova.
[0169] CVS uzorak je analiziran da se obezbedi standard za poređenje sa genetskom mapom fetusa izvedenom iz analize majčine plazme. Pored toga, za ovaj eksperiment, genotip CVS uzorka se takođe može koristiti za konstruisanje haplotipa majke za RHDO analizu. U ovom scenariju, upotreba CVS genotipa za svrhe konstruisanja takvog hapolotipa je kori šćen samo za ilustraciju. U kliničkoj primeni realizacije, majčin haplotip se može konstruisati analizom ostalih pojedinaca u familiji, na primer, prethodni potomak, brat, roditelji ili drugi ro đaci majke. Maternalni haplotipovi hromozomskih regiona od interesa takođe mogu biti konstruisani i drugim metodama koje su dobro poznate stručnjacima, od kojih su neke ovde pominju.
[0170] Za odabrane realizacije, takođe može biti određen haplotip oca nerođenog fetusa koji treba analizirati. Ova informacija može biti posebno korisna za relativno doziranje haplotipa za hromozomske regione u kojima su i otac i majka heterozigotni.
2. Masivno paralelno sekvenciranje DNK majčine plazme
[0171] DNK iz majčine plazme je podvrgnuta masovnom paralelnom sekvencioniranju pomoću Illumina Genome Analyzer platforme. Izvršeno je sekvenciranje uparenih krajeva DNK molekula plazme. Svaki molekul je sekvenciran sa oba kraja na dužini od 50 bp, što ukupno iznosi 100 bp po molekulu. Dva kraja svake sekvence su poravnata sa referentnim nemaskiranim humanim genomom (Hg18 NCBI.36 preuzet sa UCSC http://genome.ucsc.edu) korišćenjem programa SOAP2 Pekinškog Genomskog Instituta u Šenženu (soap.genomics.org.cn) (Li R et al. Bioinformatics 2009, 25(15):1966-7) Tabela, Sl. 25B, prikazuje statistiku poravnanja prvih 20 protočnih ćelija. Prema tome, sa 20 protočnih ćelija preko 3.932 biliona očitavanja je poravnato sa referentnim humanim genomom. 3. Izračunavanje frakcionih koncentracija fetalne DNK
[0172] Kao što je pomenuto, frakciona koncentracija fetalne DNK u maj činoj plazmi uzorka može se izračunati iz podataka sekvenciranja. Jedan od načina je da se analiziraju SNP-i u kojima su otac i majka oboje homozigotni, ali za različite alele. Za takve SNP-e, fetus će biti obligatno heterozigotan za jedan paternalno-nasleđeni i jedan maternalno-nasleđeni alel. U jednoj realizaciji se može koristiti bilo koja od metoda proračuna opisanih u odeljku V. U ovom primeru, proračuni su obavljeni na kumulativnim podacima na različitim polimorfnim genetskim lokusima koji ispunjavaju konfiguraciju roditeljskog genotipa (t.j. oba roditelja su homozigotni, ali za razli čite alele) na različitim hromozomima. Frakcione koncentracije fetalne DNK izračunate za SNP-e locirane na različitim hromozomima su navedene u desnoj koloni na Sl. 26. Kao što se može videti iz tabele, frakcione koncentracije određene za SNP-e locirane na različitim hromozomima su međusobno u vrlo bliskoj korelaciji.
[0173] Kao eksperiment kontrole kvaliteta, SNP-i u kojima je majka bila homozigotna a otac heterozigotan su takođe istraženi pomoću Affimetrix SNP 6.0 analize uzoraka sloja “buffi coat” (srednja kolona sa Sl. 26). Može se videti da su pri dovoljnoj dubini sekvenciranja DNK, frakcione koncentracije fetalne DNK merene iz ovih analiza bile veoma slične onima koje su izmerene za SNP-e u kojima su i otac i majka homomozigotni ali za različite alele.
[0174] Kada su u jednoj realizaciji uočene skoro podudarne frakcione koncentracije fetalne DNK iz ove dve vrste SNP-a, moglo bi se zaključiti da se bilo blizu potpune pokrivenosti sekvenciranja genoma fetusa. U jednom aspektu, na manjoj dubini pokrivanja frakcione koncentracije fetalne DNK merene u SNP-ima u kojima je majka bila homozigotna a otac heterozigotan, bi bile ve će od onih merenih za SNP-e u kojima su i otac i majka homomozigotni, ali za različite alele. Pri tako manjoj dubini pokrivanja odsustvo paternalno-jedinstvenog alela iz rezultata sekvenciranja mo že imati dva moguća uzroka: (i) da fetus nije nasledio alel od oca; i/ili (ii) da je fetus je nasledio ovaj alel od oca, ali je ovaj alel izostao u rezultatima sekvenciranja po što dubina sekvenciranja nije bila dovoljna.
4a. Izračunavanje procentualne pokrivenosti fetalnog genoma
[0175] Takođe, kako je gore navedeno, procenat fetalnog genoma koji je analiziran sekvenciranjem DNK majčine plazme se može odrediti posmatranjem podgrupe SNP-a u kojoj su otac i majka oboje homozigotni, ali za različite alele. U ovoj familiji, 45,900 SNP-a na Affimetrix SNP 6.0 array je pripadalo ovoj podgrupi. Procentna pokrivenost fetalnog genoma se mo že izvesti analizom podataka sekvenciranja DNK plazme da se vidi u kom procentu se u ovoj podgrupi SNP-a fetalni alel mo že detektovati sekvenciranjem.
[0176] Dijagram na Sl. 27A ilustruje zabeleženi procenat SNP-a u ovoj podgrupi u kojoj se fetalni alel može videti iz podataka sekvenciranja za prvih 20 protočnih ćelija koje su analizirane. Prema tome, fetalni alel se može posmatrati u 94% takvih SNP-a. Ovaj stepen sekvenciranja odgovara broju od preko 3.932 biliona očitavanja, svako sa 100 bp sekvenci. Grafik na Sl. 27B prikazuje pokrivenost u odnosu na broj očitavanja, umesto broja protočnih ćelija. Sa porastom kapaciteta protoka različitih platformi za sekvenciranje, očekuje se da bi broj protočnih ćelija ili prolaza koji bi se koristili ili bili potrebni da generišu ovaj broj očitavanja sekvence ili dužine sekvenci, u budućnosti mogli biti smanjeni.
[0177] U nekim rešenjima, pošto su detektovani višestruki SNP-i u svakom hromozomalnom regionu ili hromozomima, pokrivenost fetalnog genoma može biti znatno niža od 94% a da i dalje pruža tačno mapiranje genoma. Na primer, pretpostavimo da ima 30 informativnih SNP-a u regionu hormozoma, a da je alel fetusa detektovan samo za 20 SNP-a od 30-SNP. Međutim, hromozomski region može ipak biti precizno identifikovan i sa 20 SNP-a. Prema tome, u jednoj realizaciji, ekvivalentna tačnost se može obezbediti sa pokrivenosti manjom od 94%.
4b. Pokrivenost genetičke mape alela koje je fetus nasledio od oca
[0178] Ova ilustrativna analiza je fokusirana na SNP alela u kojima je otac bio heterozigotan a majka homozigotna. U ovoj familiji, 131,037 SNP-a na Affimetrix SNP 6.0 platformi je pripadalo ovoj kategoriji. Podgrupa ovih SNP-a se sastojala od 65,875 SNP-a u kojima je majka bila homozigotna, a otac i fetus heterozigotni. Pomoću 20 protočnih ćelija paternalno-nasleđeni aleli se mogu posmatrati u 61.875 ovih SNP-a, što ukazuje na pokrivenost od 93.9%. Ovaj poslednji procenat odgovara podacima o procentnoj pokrivenosti izvedenim u prethodnom pasusu. Korelacija izme đu pokrivanja paternalno-nasleđenih alela i broja očitavanja sekvenci koje mogu biti mapirane i broja sekvenci protočnih ćelija prikazani su na Sl. 28A i Sl.28B, respektivno.
[0179] Da bi se objasnila specifičnost ovog pristupa za detektovanje ispravnih paternalno-nasleđenih alela kod fetusa, analizirano je 65,162 (t.j. 131.037 - 65.875) SNP-a u kojima je fetus nasledio alele koji su isti kao i oni koje posjeduje majka. Za takve SNP-e, detekcija alela razli čitih od onih koje poseduje majka bi predstavljala lažno-pozitivne. Tako, od 65,162 SNP-a, uočeno je samo 3.225 lažno-pozitivnih (4.95%) kada je analizirano 20 protočnih ćelija. Ovi lažno-pozitivni mogu biti rezultat grešaka sekvenciranja ili grešaka genotipizacije DNK oca ili majke, ili de novo mutacija kod fetusa. Korelacija između procenta lažno-pozitivnih i broja sekvenciranih protočnih ćelija je prikazana na Sl. 29A.
[0180] Procenat lažno-pozitivnih može takođe biti procenjen razmatranjem podgrupe SNP-a kod kojih su i otac i majka homomozigotni i sa istim alelom. Prisustvo bilo kog alternativnog alela na određenom lokusu se smatra lažno-pozitivnim. Ovi lažno-pozitivni mogu biti rezultat grešaka sekvenciranja ili grešaka genotipizacije DNK oca ili majke, ili de novo mutacija kod fetusa. U ovoj podgrupi je bilo 500,673 SNP-a. Sa podacima o sekvencama iz 20 protočnih ćelija, lažno-pozitivni rezultati su detektovani u 48,396 SNP-a (9.67%). Korelacija između procenta lažno-pozitivnih i broja sekvenciranih protočnih ćelija je prikazana na Sl. 29B. Ovaj procenat lažno pozitivnih je bio veći nego procena za podgrupu SNP-a gde su majka i fetus homomozigotni a otac heterozigotni. To je zbog toga što se u drugoj podgrupi SNP-a, lažno-pozitivnim smatralo samo prisustvo paternalno nasleđenih alela u majčinoj plazmi, dok se u prethodnoj podgrupi bilo koji alel osim zajedničkog alela koji dele otac i majka smatrao lažno-pozitivnim rezultatom.
[0181] SL. 30 prikazuje pokrivenost fetalno-specifičnog SNP-a za različit broj analiziranih protočnih ćelija. SNP-i gde su i otac i majka bili homozigotni, ali sa različitim alelima su uključeni ovu analizu. X-osa je dubina pokrivanja fetalno-specifičnih SNP-a, a Y-osa predstavlja procenat SNP-a sa određenom dubinom pokrivanja. Sa povećanjem broja protočnih ćelija koje se analiziraju, prosečan broj puta pokrivanja (npr. 1x; 2x; 3x; itd.) za fetalno-specifične SNP-e raste. Na primer, kada je analizirana jednaka protočna ćelija, prosečna pokrivenost SNP-a je bila 0.23 puta. Prosečna pokrivenost je porasla na 4.52 puta kada je analizirano 20 protočnih ćelija.
5. Tačnost genetske mape nasleđene od majke
[0182] Sl. 31 prikazuje tačnost analize Tipa A kad su korišćeni podaci iz 10 protočnih ćelija. Odeljak II.B opisuje realizacije analize Tipa A i Tipa B (takođe se nazivaju alfa i beta). Tačnost je za pravilno određivanje haplotipa nasleđenog od majke. Tačnost je predstavljena posebno za svaki hromozom.
[0183] Kada je korišćen faktor verovatnoće 1,200 za SPRT analizu (Zhou W et al. Nat Biotechnol 2001; 19: 78-81; Karoui NE et al. Statist Med 2006; 25: 3124-33), tačnost se kretala od 96% do 100%. Kao što je prikazano, čak i sa tako visokim faktorom verovatnoće za SPRT klasifikaciju, moglo je biti klasifikovano ukupno 2.760 segmenata u genomu. Ovaj stepen rezolucije je dovoljan u većini slučajeva, kada se uzme u obzir da se mejotička rekombinacija odvija sa frekvencijom od jedan do malog jednocifrenog broja po hromozomskoj ruci po generaciji. Pored toga, moglo se videti da su sve pogrešne klasifikacije mogu se sprečiti kada se koristi pristup preplitanja “interlacing approach” (desna-strana na Sl. 31.). Kao što je opisano u prethodnom tekstu, pristup preplitanja“interlacing” koristi analizu oba tipa, Tipa A i Tipa B.
[0184] Sl. 32 prikazuje tačnost analize Tipa B kada su korišćeni podaci iz 10 protočnih ćelija. Kada je korišćen faktor verovatnoće 1.200 za SPRT analizu, tačnost se kretala od 94.1% do 100%. Sve pogrešne klasifikacije mogu se sprečiti kada se koristi pristup preplitanja (desna strana na Sl. 32), kao što je prikazano na Sl. 31.
[0185] Sl. 33 prikazuje tačnost analize Tipa A kada su korišćeni podaci iz 20 protočnih ćelija. Sa faktorom verovatnoće 1.200 za SPRT analizu i algoritmom "dva uzastopna bloka", izvršeno je ukupno 3.780 klasifikacija i samo 3 (0.1%) klasifikacije su bile netačne. Sl. 34 prikazuje tačnost analiza Tipa B kad su korišćeni podaci iz 20 protočnih ćelija. Sa faktorom verovatnoće 1.200 za SPRT analizu i algoritmom "dva uzastopna bloka", izvršeno je ukupno 3.355 klasifikacija i samo 6 (0.2%) klasifikacija je bilo netačno. U ovim primerima izvođenja, SPRT se vrši preko niza genetskih markera, kao što su SNP-i.
III. PRENATALNO ODREĐIVANJE RIZIKA ZA BETA-TALASEMIJU
[0186] U jednoj realizaciji, za određivanje rizika fetusa za beta-talasemiju (autozomno recesivno oboljenje) može se utvrditi da li je fetus nasledio mutirane alele koje nose njegovi otac i majka. U slučaju koji je gore pomenut, otac je nosilac -CTTT 4 baznih parova delecija kodona 41/42 humanog beta-globinskog gena. Trudna majka je nosilac A → G mutacije na nukleotidu -28 humanog betaglobinskog gena.
[0187] Da bi se odredilo da li je fetus nasledio mutaciju paternalnih kodona 41/42, podaci sekvenciranja DNK majčine plazme korišćenjem prvih 10 protočnih ćelija su pretraživani za ovu mutaciju. Nađeno je ukupno 10 očitavanja sa ovom mutacijom (Sl. 35A). Dakle, fetus je nasledio paternalnu mutaciju. Osim toga, utvrđeno je da 62 očitavanja sadrže sekvencu divljeg tipa kodona 41/42 (Sl. 35B). Prema tome, procenat očitavanja koja sadrže mutaciju u ovom regionu je 0.1389. Ova cifra je veoma blizu frakcionoj koncentraciji fetalne DNK utvrđene na Sl.26. U jednom aspektu, rizik fetusa za nasleđivanje paternalne mutacije može biti određen razjašnjavanjem njegovog nasleđivanja genetskih polimorfizama vezanih za paternalnu mutaciju.
[0188] U jednoj realizaciji, za utvrđivanje rizika da je fetus nasledio majčinu -28 mutaciju, izvršena je RHDO analiza. U ovoj familiji mutacija -28 se nalazila na haplotipu IV dok se alel divljeg tipa nalazio na haplotipu III. Rezultati RHDO analize Tipa A su prikazani na Sl. 36 dok su rezultati RHDO analize Tipa B prikazani na Sl. 37. U oba tipa analize, fetalno nasleđivanje haplotipa III od majke je zaključeno. Drugim rečima, fetus je od majke nasledio alel divljeg tipa. Konačna dijagnoza fetusa je da je nasledio mutacije kodona 41/42 od oca i alel divljeg tipa od majke. Prema tome, fetus je heterozigotni nosilac beta talasemije i stoga treba da je klinički zdrav.
II. CILJANO-OBOGAĆIVANJE I CILJANO SEKVENCIRANJE
[0189] Kao što je razmatrano u prethodnim odeljcima, tačnost procene koncentracije fetalne frakcije DNK i rezolucija genetske mape utvrđene iz analize DNK majčine plazme može zavisiti od dubine pokrivenosti lokusa od interesa. Na primer, mi smo pokazali da bi ukupno 200 molekula koji odgovaraju SNP lokusu moglo biti potrebno da se sa visokom preciznošću utvrdi frakciona koncentracija fetalne DNK bez prethodne informacije o maj činom genotipu. Brojevi alela za SNP u majčinoj plazmi se mogu dobiti pomoću, na primer, ali ne ograničavajući se na, PCR u realnom vremenu, digitalne PCR i masivnog paralelnog sekvenciranja.
[0190] Pošto masivno paralelno sekvenciranje DNK majčine plazme može istovremeno da utvrdi broj pojavljivanja alela “allele counts” za milione SNP u celom genomu, ono je idealna platforma za analizu čitavog genoma na različitim lokusima. Bazni format masivnog paralelnog sekvenciranja omogućava da različiti regioni unutar genoma budu pokriveni sa sličnim dubinama. Međutim, da bi se sekvencirao određeni region od interesa pri visokoj dubini sekvenciranja kori šćenjem nasumičnog masivnog paralelnog sekvenciranja preostali delovi genoma (koji nisu namenjeni da se analiziraju) moraju biti sekvencirani u istoj meri. Zbog toga, ovaj pristup mo že biti skup. Da bi se povećala isplativost pristupa masivnog paralelnog sekvenciranja, jedan od načina je da se pre procedure sekvenciranja obogati ciljni region. Ciljano sekvenciranje se mo že izvesti hvatanjem faze rastvora (Gnirke A, et al. Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing. Nat Biotechnol 2009;27:182-9), microarray capture (e.g. pomo ću NimbleGen platforme) ili ciljanom amplifikacijom (Tewhey R, et al. Microdroplet-based PCR enrichment for large-scale targeted sequencing. Nat Biotechnol 2009;27:1025-31).
[0191] Ciljano sekvenciranje je prvobitno primenjeno da se otkriju genetske varijacije stanovni štva, npr za studije genetskih udruženja. Prema tome, njegova trenutna primena u istra živanju genoma ima za cilj rešavanje kvalitativnih problema (npr. genotipizacija ili detekcija mutacija). Me đutim, primena ciljanog sekvenciranja DNK u majčinoj plazmi za neinvazivne prenatalne dijagnostičke svrhe uključuje kvantitativna razmatranja, čija izvodljivost je bila nejasna. Na primer, upotreba ciljanog sekvenciranja može uvesti kvantitativni bias u detekciju fetalne i majčine DNK u majčinoj plazmi. Pored toga, prethodni rad je pokazao da je fetalna DNK kraća od majčine DNK (Chan KCA et al. Size distributions of maternal and fetal DNK in maternal plasma. Clin Chem 2004; 50: 88-92). Ova razlika u veličini može takođe uvesti kvantitativni bias ili diferencijalnu efikasnost u hvatanju fetalne i majčine DNK u majčinoj plazmi. Takođe je postojala sumnja u efikasnost kojom ovakvi usitnjeni molekuli DNK mogu biti uhvaćeni. U sledećim opisima, pokazujemo da ciljano sekvenciranje može biti postignuto ciljanim obogaćivanjem nakon kojeg sledi masivno paralelno sekvenciranje. Takođe smo pokazali da ciljano obogaćivanje predstavlja efikasan način procene frakcione koncentracije fetalne DNK u poređenju sa sekvenciranjem kompletnog genoma.
A. Određivanje Frakcione Koncentracije Korišćenjem Ciljanog obogaćivanja
1. Materijali i Postupci
[0192] Regrutovane su četiri (M6011, M6028, M6029 i M6043) trudnice sa jednoplodnim ženskim fetusima. Uzorci periferne krvi majki su sakupljeni u EDTA epruvete za krv pre elektivnog carskog reza u trećem trimestru, dok su uzorci posteljice uzimani posle elektivnog carskog reza. Posle centrifugiranja, je ekstrahovana DNK iz perifernih krvnih ćelija upotrebom Blood Mini Kit (Qiagen). DNK iz 2.4 mL plazme je ekstrahovana pomoću DSP DNK Blood Mini Kit (Qiagen). Majčina genomska DNK je ekstrahovana iz „buffi coat“ sloja, a fetalna genomska DNK je ekstrahovana iz placentalnih tkiva. Uzorci iz trećeg trimestra su korišćeni u ovom primeru samo za ilustrativne svrhe. JeDNKko se mogu koristiti i uzorci iz prvog i drugog trimestra.
[0193] Majčinski i fetalni genotipovi su određeni pomoću Genome-Wide Human SNP Array 6.0 (Affymetrix). Za svaki od ovih slučajeva je korišćeno 5-30 ng DNK iz plazme za formiranje DNK biblioteke pomoću kompleta za pripremu uzoraka sa uparenim krajevima (Illumina) prema protokolu proizvođača Chromatin Immunoprecipitation Sequencing. Adapter-ligirana DNK je pre čišćena direktno upotrebom spin kolone predviđene u QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen), bez dalje selekcije veličine. Adapter-ligirana DNK je zatim amplifikovana korišćenjem PCR sa 15 ciklusa sa standardnim prajmerima. Prajmeri su bili PCR Prajmer PE 1.0 i 2.0 Illumina. Biblioteke DNK su kvantifikovane pomoću NanoDrop ND-1000 spektrofotometra (NanoDrop Technologies) i pokrenute na 2100 Bioanalyzer-u, korišćenjem DNK 1000 kompleta (Agilent), za proveru distribucije veličina.
0.6 ~ 1 µg amlifikovane biblioteke DNK iz plazme je generisano za svaki uzorak u prosečnoj dužini od oko 290 bp. Capture library je dobijena od Agilenta i pokrivala je 85% eksona na humanom hromozomu X (kataloški broj: 5190-1993). Za sva četiri slučaja u ovoj studiji, 500 ng amplifikovane biblioteke DNK iz plazme u svakom slučaju je inkubirano 24 sata na 65 °C sa probama za hvatanje, prema uputstvu proizvođača. Posle hibridizacije, uhvaćeni ciljevi su selektirani obaranjem biotinilizirane probe/cilja hibrida pomoću streptavidinom presvučenih magnetičnih perli (Dinal DinaMag-2 Invitrogen), i prečišćeni sa MinElute PCR Purification Kita (Qiagen). Kona čno, ciljane DNK biblioteke su obogaćene amplifikacijom sa 12 ciklusa PCR sa SureSelect GA PE prajmerima Agilent. PCR produkti su prečišćeni pomoću QIAquick PCR Purification Kita (Qiagen). DNK biblioteke pripremljene sa ili bez ciljnog obogaćivanja su onda podvrgnute nasumičnom masivnom paralelnom sekvenciranju pomoću uređaja Illumina Genome Analyzer IIx. Jednaka traka sekvencirana na standardnoj protočnoj ćeliji je korišćena za sekvenciranje svake DNK biblioteke.
2. Frakciona koncentracija DNK fetusa bez ciljanog obogaćivanja
[0194] Frakciona koncentracija fetalne DNK se može izračunati na osnovu broja pojavljivanja alela u informativnim SNP-ima (t.j. SNP gde je majka homozigotna a fetus heterozigotan). Donja tabela pokazuje da je za ova četiri slučaja u
elom genomu identifikovano 120184, 110730, 107362 i 110321 informativnih SNP-a, a 63, 61, 69 i 65 (respektivno u istom redosledu slučajeva) je bilo u okviru ciljanog regiona na hromozomu X. Bez ciljanog obogaćivanja, frakcione koncentracije fetalne DNK su bile 33.4%, 31.3%, 29.2% i 34.4% na osnovu podataka svih informativnih SNP u genomu.
3. Poređenje uzoraka sa i bez ciljanog obogaćivanja
[0195] U nekim izvođenjima, dubina pokrivanja sekvence je predstavljala srednju vrednost brojeva sekvenciranja svake baze u određenom regionu. U ovom izvođenju smo izračunali dubinu sekvenciranja ciljanog regiona deljenjem ukupnog broja sekvencioniranih baza unutar ciljanog regiona sa dužinom ciljanog regiona (3.05 MB). U regionima pokrivenim kompletom za obogaćivanje, srednja vrednost pokrivanja sekvenci je bila 0.19 puta za neobogaćene uzorke i 54.9 puta za obogaćene uzorke, što ukazuje na srednju vrednost obogaćenja od 289-puta. Kod ove dubine sekvenciranja, samo 4.0% fetalno-specifičnih alela unutar ciljanog regiona je detektovano pre ciljanog obogaćivanja (vidi donju tabelu). U poređenju, 95.8% od njih su postali detektabilni posle ciljang obogaćivanja (vidi donju tabelu). Prema tome, ciljano obogaćivanje je značajno poveć alo procenat detekcije specifičnih fetalnih alela unutar ciljanog regiona.
[0196] Zatim, smo uporedili frakcione koncentracije fetalne DNK na osnovu brojanja očitavanja svih informativnih SNP-a u okviru ciljanog regiona za svaki uzorak, sa i bez obogaćivanja. Bez ciljanog obogaćivanja, broj fetalno specifičnih očitavanja se kretao od 0 do 6 za četiri uzorka (vidi donju tabelu). Zbog niskog pokrivanja sekvence, neadekvatno uzorkovanje molekula fetalne DNK bi sprečilo tačnu procenu koncentracije frakcije fetalne DNK. Sa ciljanim oboga ćivanjem, je uočen mnogo veći broj fetalno-specifičnih alela (511~776) i broj deljenih alela je izbrojan (2570~3922) u okviru ciljanog regiona (vidi donju tabelu). Procenti fetalne DNK su izra čunati kao 35.4%, 33.2%, 26.1% i 33.0%, što je u skladu sa procentima fetalne DNK procenjenim prema podacima iz citavog genoma neobogaćenih uzoraka (vidi donju tabelu). Ovi rezultati ukazuju da su majčinski i fetalni molekuli DNK u okviru ciljanog regiona obogaćeni u sličnoj meri.
B. Određivanje Fetalnog Genoma Korišćenjem Ciljanog Obogaćivanja
[0197] Jednaka od primena RHDO metode je za neinvazivnu prenatalnu detekciju genetskih bolesti naslednih od majke. Koristeći masivno paralelno sekvenciranje majčine plazme bez ciljanog obogaćivanja RHDO analiza može precizno odrediti koji hapolotip majke se prenosi na fetus sa srednjom vrednošću od 17 SNP-ova kada je dubina sekvenciranja DNK iz majčine plazme otprilike 65-tostruka pokrivenost ljudskog genoma. Da se poveća ekonomičnost ovakvog pristupa, može se izvršiti selektivno usmeravanje sekvenciranja na određene regione od interesa unutar genoma, a zatim i RHDO analiza podataka sekvenciranja. Kao primer, smo pokazali koncept ciljanog sekvenciranja i RHDO analize hromozoma X. Međutim, ciljano sekvenciranje i RHDO analiza se takođe mogu primeniti na sve hromozome, npr. autozome. U jednoj realizaciji, RHDO analiza se, kao što je gore opisano, može koristiti za ciljana izvođenja.
[0198] Regrutovano je pet (PW226, PW263, PW316, PW370 i PW421) trudnica sa jednoplodnim muškim fetusima. Uzorci periferne krvi majki su sakupljeni u EDTA epruvete za krv pre biopsije horionskih čupica u prvom trimestru. Posle centrifugiranja je ekstrahovana DNK iz perifernih krvnih ćelija upotrebom Blood Mini Kita (Qiagen). DNK iz 3.2 ml plazme je ekstrahovana pomo ću DSP DNK Blood Mini Kita (Qiagen). Majčina genomska DNK je ekstrahovana iz “buffy coat“ sloja a fetalna genomska DNK je ekstrahovana iz horionskih čupica. Uzorci su pripremljeni i analizirani kao što je gore opisano. Svaki uzorak je zatim sekvenciran nasumično pomoću jedne trake na Illumina protočnoj ćeliji (eng. flow cell).
[0199] U ovom primeru smo koristili fetalni genotip, zajedno sa informacijama sekvenciranja nukleinskih kiselina majke, da bi utvrdili haplotipove majki za hromozom X i da bi zaključili koji hapolotip je nasleđen od majke. Za svaki SNP na hromozomu X gde je majka bila heterozigotna (t.j. informativnni SNP) alel koji je nasledio fetus je definisan kao da dolazi iz majčinog haplotipa 1 (Hap I), dok je alel majke, koji nije prenet na fetus, definisan kao da dolazi iz maj činog haplotipa 2 (Hap II). U nekim izvođenjima, za kliničku primenu, fetalni genotip možda neće biti unapred dostupan a majčini haplotipovi mogu biti utvrđeni ili zaključeni pomoću metoda dobro poznatih onima koji su verzirani u stanje tehnike i postupaka koji su ovde opisani. Hromozom X se ovde koristi samo za potrebe ilustracije. Ostali hromozomi, npr autozomi, se takođe mogu koristiti u takvoj analizi.
[0200] Svih pet slučajeva koji su ovde opisani su nosili jednoplodni muški fetus. Pošto muški plod nasleđuje samo jedan hromozom X od majke, ali ne i hromozom X od oca, X hromozom majke koji se prenosi na plod će biti zastupljen u majčinoj plazmi. RHDO analiza je izvedena od pter do qter hromozoma X. Počev od SNP najbližeg pter hromozoma X, SPRT analiza može utvrditi da li je alel na Hap I ili Hap II statistički značajno više zastupljen u majčinoj plazmi. Ako nijedan od dva haplotipa nije statistički značajno više zastupljen, izbrojani aleli za naredni SNP mogu biti kombinovani za dalju SPRT analizu. Dodatni SNP-i mogu biti kombinovani radi analize sve dok SPRT proces identifikuje jedan od haplotipova kao statistički značajno više zastupljen. Proces klasifikacije se zatim može ponovo pokrenuti kod narednog SNP-a.
[0201] SI. 38A i 38B pokazuju rezultate SPRT klasifikacije npr. za slučaj PW226. Bilo je ukupno devet uspešnih SPRT klasifikacija za hromozom X u ovom slučaju. Za svaku SPRT klasifikaciju, je bilo pokazano da su aleli na Hap I bili značajno više zastupljeni u uzorku plazme majke, što ukazuje da je fetus nasledio Hap I od majke. Kao što smo definisali da je Hap I haplotip koji sadrži alele prenete na fetus, rezultati svih ovih SPRT klasifikacija su bili tačni.
[0202] Rezultati RHDO analize za ovih pet slučajeva su prikazani na Sl. 39. Broj uspešnih SPRT klasifikacija je bio u rasponu od 1 do 9. Sve SPRT klasifikacije su bile tačne. Veća frakciona koncentracija fetalne DNK je bila povezana sa većim brojem klasifikacija. To je bilo zato što alelni disbalans zbog prisustva fetalne DNK može lakše biti detektovan kada je frakciona koncentracija fetalne DNK veća. Zbog toga, manje SNP-a može biti potrebno da se postigne uspešna RHDO klasifikacija. Definisani hromozomski region može opet biti podeljen na više RHDO blokova. Naši rezultati potvrđuju da se RHDO analiza može izvršiti sa podacima koji su dobijeni masivnim sekvenciranjem nakon ciljanog obogaćivanja.
[0203] Naši podaci dalje pokazuju da je ciljani pristup ekonomičniji način obavljanja RHDO analize. Bez ciljanog obogaćivanja, za uzorke sa sličnim fetalnim koncentracijama DNK, bilo je potrebno sekvenciranje sa približno 5 protočnih ćelija (t.j. 40 traka sekvenciranja) (Sl. 40) da se dostigne prosečna dubina ostvarena za uzorke prikazane na Sl. 39. Ovde smo pokazali da sa ciljanim obogaćivanjem, sekvenciranje pomoću samo jedne trake već dostiže prosečnu dubinu sekvenciranja od nekih 15 do 19 puta za uspešnu RHDO klasifikaciju. Alternativno, čak i višestruko veći nivo pokrivenosti sekvenciranja se može postići uz relativno male dodatne troškove kada se koristi ciljano obogaćivanje. Viši nivo pokrivenosti sekvenciranja može efikasno smanjiti veličinu genomskog regiona koja je potrebna za uspešnu RHDO klasifikaciju i time poboljšati rezoluciju analize.
IV. CILJANO-OBOGAĆIVANJE
[0204] Od 2004. je poznato da su cirkulišući fetalni DNK molekuli obično kraći od majčine DNK u majčinoj plazmi (Chan KCA et al Clin Chem 2004; 50: 88-92; Li et al Clin Chem 2004). Međutim, molekularna osnova ovog zapažanja je ostala nerešena. U ovoj našoj studiji, generisali smo 3.931x10<9>očitavanja u uzorku plazme i koristili 1-bp binove u našoj bioinformatičkoj analizi. Veličina svakog sekvenciranog molekula DNK iz plazme je određena na osnovu genomskih koordinata krajeva iz očitavanja uparenih-krajeva.
[0205] Za ovu analizu fokusirali smo se na polimorfizme pojedinačnih nukleotida (SNP) u kojima su otac i majka oboje homozigotni, ali za različite alele. Za takve SNP-ove, fetus je obligatno heterozigotan. Aleli za svaki SNP koji je fetus nasledio od oca može da se koristi kao fetalnospecifični marker. Veličine fetalne (korišćenjem paternalno-nasleđenih fetalno-specifičnih alela) i ukupne sekvence su određene za ceo genom (Sl. 41) i pojedinačno za svaki hromozom (Sl. 42A-42C).
[0206] Uočili smo da je najznačajnija razliku između fetalne i majčine DNK u majčinoj plazmi smanjenje pika 166 bp u odnosu na 143 bp pik (SI. 41). Najzastupljenije ukupne sekvence (prete žno majčine) su imale dužinu 166 bp. Najznačajnija razlika u raspodeli veličina između fetusa i ukupne DNK je što je fetalna DNK ispoljila smanjenje pika 166 bp (Sl. 41) i relativnu izraženost pika 143 bp. Ovo poslednje verovatno odgovara skraćivanju ~20-bp linker fragmenta sa nukleazoma do njegove čestice jezgra od ~146 bp (Lewin B in Gene IX, Jones and Bartlett, Sudbury, 2008, pp.757-795).
[0207] Od približno 143 bp i manje, distribucije fetalne i ukupne DNK su pokazale periodičnost od 10 bp koja podseća na nukleazama cepane nukleozome. Ovi podaci ukazuju da su fragmenti DNK iz plazme dobijeni apoptoznom enzimskom obradom. Nasuprot tome, analiza veličina očitavanja koja su mapirana u ne-histonski vezani mitohondrijalni genom nije pokazala taj nukleozomski obrazac (Sl. 41). Ovi rezultati obezbeđuju ranije nepoznato molekulsko objašnjenje za poznate razlike u veličini između fetalne i majčine DNK korišćenjem Y hromozoma i odabranih polimorfnih genetskih markera (Chan KCA et al Clin Chem 2004; 50: 88-92; Li et al Clin Chem 2004; 50: 1002-1011; US Patentna prijava 20050164241; US Patentna prijava 20070202525) i pokazuju da takve razlike veličina postoje u celom genomu. Najverovatnije obja šnjenje za ove razlike je da se cirkulišući molekuli fetalne DNK sastoje od više molekula u kojima je -20 bp linker fragment skraćen sa nukleazoma.
[0208] Imajući u vidu ova zapažanja, postoji veliki broj načina na koji uzorak može biti obogaćen na fetalnoj DNK. U jednoj realizaciji, mogu se koristiti reagensi koji se preferencijalno vezuju za linker fragment. Za takve reagense se očekuje da u majčinoj plazmi vezuju prvenstveno DNK koja potiče od majke u odnosu na DNK koja potiče od fetusa. Jedan primer takvih reagenasa je antitelo. Jedaka meta takvog antitela je ona koja se vezuje za histon H1. Poznato je da se Histon H1 vezuje za linker fragment. JeDNK primena takvog antitela je za obavljanje obogaćivanja fetalne DNK negativnom selekcijom, odnosno putem preferencijalne imunoprecipitacije maj činske DNK u majčinoj plazmi koja sadrži linker, fragment koji sadrži histon H1. Osim toga, poznato je da H1 ima više varijanti, a neke od njih pokazuju tkivno-specifične varijaciju u ekspresiji (Sancho M et al. PLoS Genet 2008; 4: e1000227). Ove varijante mogu biti dodatno iskorišćene za diferenciranje fetalne (pretežno placentalne) i majčine (pretežno hematopetske) (Lui YYN et al. Clin Chem 2002; 48: 421-427) DNK. Na primer, može da se cilja histon H1 varijanta, koji pretežno eksprimiraju tropoblastne ćelije, da se postigne preferencijalna i pozitivna selekcija DNK dobijane od fetusa, u maj činoj plazmi. Ova strategija se može primeniti i za druge histon proteine ili druge nukleozomalne proteine koji pokazuju tkivnu-specifičnost, posebno trofoblast-specifične obrasce ekspresije.
[0209] S obzirom na oštar 166 bp pik za majčinu DNK, druga mogućnost za obogaćivanje fetalne DNK je da se konstruiše sistem za negativnu selekciju fragmenata DNK koji su dužine od 166 ± 2 bp. Na primer, sistem zasnovan na kapilarnoj elektroforezi ili tečnoj hromatografiji visoke performanse može omogućiti precizno merenje veličine i razdvajanje DNK molekula. Drugi način za negativnu selekciju je da se to uradi in silico tokom bioinformatičke analize podataka sekvenciranja.
[0210] Kao i druge vrste DNK u plazmi, npr. DNK tumora (Vlassov VV et al Curr Mol Med 2010; 10:.
142-165) i DNK iz presađenog organa (Lo IMD et al. Lancet 1998; 351: 1329-1330), takođe se očekuje da deli takve karakteristike sa fetalnom DNK u majčinoj plazmi, strategije navedene u (1) i (2) iznad takođe mogu da se koriste za obogaćivanje tih vrsta DNK.
[0211] Prema jednoj realizacijije obezbeđen je metod za diferencijalno obogaćivanje DNK vrsta u humanoj plazmi ili serumu, pomoću ciljanja linker fragmenta na nukleozomima. U jednoj realizaciji, obogaćivanje se vrši uklanjanjem jednog od sledećeg: majčinski-izvedene DNK ili DNK izvedene od hematopoetskih ćelija. U drugoj realizaciji, ciljanje uključuje reagens (kao što je antitelo ili druga vrsta proteina) koji bi se prvenstveno vezivao za protein ili komponentu nukleinske kiseline linker fragment nukleazoma. U sledećoj realizaciji, reagens za ciljanje će selektivno vezati za histon H1 ili drugi protein koji se vezuje za linker fragment nukleazoma. U sledećoj realizaciji, reagens za ciljanje će se vezati za majčine ili hematološke varijante histona H1 ili drugog proteina koji se vezuje za linker fragmenta nukleazoma. U jednom izvođenju, uklanjanje DNK se vrši imunoprecipitacijom ili vezivanjem za čvrstu površinu.
[0212] Prema drugoj realizaciji, postupak za diferencijalno obogaćivanje fetalne DNK u majčinoj plazmi ili serumu sadrži: (a) upotrebu antitela koja bi se vezivala za jednu ili vi še komponenata linker fragmenta nukleazoma; (B) uklanjanje vezane frakcije imunoprecipitacijom ili hvatanjem za čvrstu površinu; i (c) sakupljanje nevezane frakcije koja sadrži povećanu frakcionu koncentraciju fetalne DNK.
[0213] Bilo koja od komponenata softvera ili funkcija opisanih u ovoj prijavi, mo že se primeniti kao softverski kod koji treba da izvršava procesor pomoću bilo kojeg pogodnog programskog jezika kao što je koišćenje, na primer, Java, C++ ili Perl, na primer, konvencionalnim ili na objekat usmerenim tehnikama. Softverski kod se može čuvati kao niz instrukcija, ili komandi na medijumu čitljivom za računar, za čuvanje i/ili prenos, pogodan medijum uključuje Random Access Memory (RAM), read only memory (ROM), magnetni medijum kao npr. hard disk ili disketa, ili optički medijum kao što je kompakt disk (CD) ili DVD (Digital versatile disk), fleš memorije, i slično. Za računar čitljiv medijum može biti bilo koja kombinacija takvih uređaja za memorisanje ili prenos.
[0214] Takvi programi takode mogu biti kodirani i prenošeni pomoću nosećih signala adaptiranih za prenos preko žične, optičke, i/ili bežične mreže u skladu sa različitim protokolima, uključujući i internet. Kao takav, kompjuterski čitljiv medijum prema jednom izvođenju predmetnog pronalaska može se napraviti pomoću signala za podatke kodiranog sa takvim programima. Kompjuterski čitljivi medijumi kodirani programskim kodom mogu biti u paketu sa kompatibilnim uređajem ili nabavljeni odvojeno od drugih uređaja (npr, preko Interneta). Svaki takav računarski čitljiv medijum se može nalaziti na ili unutar jednog računarskog proizvoda (npr. hard disk ili ceo računarski sistem), a može biti prisutan na ili u okviru različitih računarskih programa proizvoda unutar sistema ili mreže. Kompjuterski sistem može uključivati monitor, štampač, ili drugi displej pogodan za pružanje bilo kog ovde pomenutog rezultata korisniku.
[0215] Primer kompjuterskog sistema je prikazan na Sl. 43. Podsistemi prikazani na Sl. 43 su povezani preko sistemske magistrale 4375. Prikazani su dodatni podsistemi kao što je štampač 4374, tastatura 4378, hard disk 4379, monitor 4376, koji se spaja sa displej adapterom 4382, i ostali. Periferni i ulazni/izlazni (I/O) uređaji koji se uparuju sa I/O kontrolerom 4371, mogu se povezati sa kompjuterskim sistemom pomoću bilo kojeg broja sredstava poznatih u struci, poput serijskog porta 4377. Na primer, serijski port 4377 ili eksterni interfejs 4381 može da se koristi za povezivanje računara sa mrežom širokog područja, kao što je Internet, ulaznim uređajem mišom, ili skenerom. Vezu preko sistemske magistrale omogućava centralni procesor 4373 za komunikaciju sa svakim podsistemom i za kontrolu izvršenja instrukcija iz sistemske memorije 4372 ili hard diska 4379, kao i razmenu informacija između podsistema. Sistemska memorija 4372 i/ili hard disk 4379 mogu da sadrže kompjuterski čitljiv medijum. Bilo koja od ovde pomenutih vrednosti se može poslati sa jedne komponente na drugu komponentu i može se poslati korisniku.
[0216] Računarski sistem može obuhvatati mnoštvo istih komponenata ili podsistema, npr. povezanih spoljnim interfejsom 4381 ili internim interfejsom. U nekim varijantama, ra čunarski sistemi, podsistem ili aparati mogu da komuniciraju preko mreže. U takvim slučajevima, jedan računar se može smatrati klijentom i drugi računar serverom, pri čemu svaki može biti deo istog računarskog sistema. I klijent i server mogu obuhvatati više sistema, podsistema ili komponenata.
[0217] Specifični detalji posebnih realizacija se mogu kombinovati na bilo koji pogodan na čin ili menjati u odnosu na ovde prikazane i opisane bez odstupanja od obima realizacija ovog pronalaska.
[0218] Prethodni opis primera izvođenja pronalaska je prikazan za potrebe ilustracije i opisa. Nije namera da bude iscrpan ili da ograniči pronalazak na preciznu formu koja je opisana, i mnoge modifikacije i varijacije su moguće u svetlu gornjeg izlaganja. Realizacije su izabrane i opisane kako bi najbolje objasnili principe pronalaska i njegove praktične primene kako bi na taj način, omogućili drugima koji su verzirani u stanje tehnike da najbolje iskoriste pronalazak u različitim realizacijama i sa različitim modifikacijama koje su pogodne za određene primene koje su razmatrane.

Claims (14)

Patentni zahtevi
1. Postupak za određivanje prve proporcije fetalnog genoma koji je sekvenciran iz biološkog uzorka dobijenog od trudne žene, fetus koji ima oca i majku koja je trudna žena, otac koji ima paternalni genom i majka koja ima majčinski genom, pri čemu uzorak sadrži smešu majčinske i fetalne nukleinske kiseline, a metoda sadrži:
dobijanje rezultata sekvenciranja dobijenih sekvenciranjem velikog broja molekula nukleinske kiseline iz biološkog uzorka dobijenog od trudne žene;
analiziranje rezultata sekvenciranja, a analiziranje molekula nukleinske kiseline uklju čuje:
identifikaciju lokacije molekula nukleinske kiseline u humanom genomu; i
određivanje odgovarajuć eg alela molekula nukleinske kiseline;
određivanje prvog mnoštva lokusa, pri čemu je fetalni genom heterozigotan na svakom lokusu prvog mnoštva tako da fetalni genom ima odgovarajuć i prvi i drugi alel na tim lokusima, i pri čemu je majčinski genom na svakom lokusu prvog mnoštva homozigotan tako da majčinski genom ima dva od odgovarajuć eg drugog alela na tim lokusima, a prvi alel je različit od drugog alela;
određivanje, pomoću kompjuterskog sistema, druge proporcije lokusa prvog mnoštva lokusa u kojima se odgovarajući prvi alel detektuje iz rezultata sekvenciranja; i
na bazi druge proporcije, određivanje prve proporcije fetalnog genoma koji se sekvencira iz biološkog uzorka.
2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što identifikacija lokacije molekula nukleinske kiseline u humanom genomu uključuje mapiranje sekvence molekula nukleinske kiseline u humani genom.
3. Postupak prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačen time što određivanje prvog mnoštva lokusa obuhvata:
za svaki lokus iz prvog mnoštva:
određivanje genoma oca koji je homozigotan za odgovaraju ć i prvi alel; i
određivanje majčinskog genoma koja je homozigotna za odgovarajuć i drugi alel.
4. Postupak prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, nazna čen time što određivanje specifičnog lokusa da bude jedan od lokusa iz prvog mnoštva lokusa uključuje:
određivanje granične vrednosti broja predviđenih brojanja odgovarajuć eg prvog alela na specifičnom lokusu,
granična vrednost koja predviđa da li je majčinski genom homozigotan, a genom fetusa heterozigotan, pri čemu se granična vrednost određuje na osnovu očekivane raspodele rezultata brojanja za različite kombinacije homozigotnosti i heterozigotnosti na određenom lokusu;
detektovanje odgovarajuć eg prvog i drugog alela na specifičnom lokusu, na osnovu analize rezultata sekvenciranja;
određivanje broja aktualnih brojanja odgovarajuć eg prvog alela na osnovu sekvenciranja mnoštva molekula nukleinske kiseline iz biološkog uzorka; i
određivanje fetalnog genoma koji je heterozigotan za odgovarajuć i prvi i drugi alel, a majčinski genom homozigotan za odgovarajuć i drugi alel kada je broj aktualnih brojanja manji od granične vrednosti.
5. Postupak prema patentnom zahtevu 4, naznačen time što je statistička raspodela zavisna od frakcione koncentracije molekula nukleinske kiseline u biološkom uzorku dobijenom od fetusa.
6. Postupak prema patentnom zahtevu 5, naznačen time, što statistička raspodela zavisi i od broja mnoštva molekula nukleinske kiseline, koji odgovaraju specifičnom lokusu.
7. Postupak prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, nazna čen time što su odgovarajuć i prvi aleli iz najmanje dva lokusa prvog mnoštva različiti jedan od drugog.
8. Postupak prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, nazna čen time, što je prva proporcija jednaka drugoj proporciji.
9. Postupak prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, nazna čen time, što je prva proporcija procentna.
10. Postupak prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, nazna čen time, što je prva proporcija raspon, gde je druga proporcija jedan kraj raspona.
11. Postupak prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, nazna čen time što je prvo mnoštvo lokusa na prvom hromozomu, i time što je prva proporcija, proporcija prvog hromozoma koji je sekvenciran iz biološkog uzorka.
12. Postupak prema patentnom zahtevu 11, koji dalje sadrži;
određivanje proporcije svakog hromozoma genoma fetusa koji je sekvenciran iz biolo škog uzorka.
13. Postupak prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, koji dalje obuhvata:
izvođenje više sekvenciranja u odgovoru na prag sekvenciranja koji jo š nije postignut.
14. Kompjuterski program koji sadrži softverski kod koji je, pomoću procesora računarskog sistema, sposoban za izvršenje kompjuterskog programa koji je konfigurisan da obavlja, tokom izvršenja, postupak prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva.
RS20190421A 2009-11-05 2010-11-05 Analiza genoma fetusa iz majčinskog biološkog uzorka RS58879B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US25856709P 2009-11-05 2009-11-05
US25907509P 2009-11-06 2009-11-06
US38185410P 2010-09-10 2010-09-10
EP17168527.4A EP3241914B1 (en) 2009-11-05 2010-11-05 Fetal genomic analysis from a maternal biological sample

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS58879B1 true RS58879B1 (sr) 2019-08-30

Family

ID=43500337

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230090A RS63944B1 (sr) 2009-11-05 2010-11-05 Analiza genoma fetusa iz biološkog uzorka majke
RS20190421A RS58879B1 (sr) 2009-11-05 2010-11-05 Analiza genoma fetusa iz majčinskog biološkog uzorka

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230090A RS63944B1 (sr) 2009-11-05 2010-11-05 Analiza genoma fetusa iz biološkog uzorka majke

Country Status (24)

Country Link
US (5) US8467976B2 (sr)
EP (5) EP2496717B1 (sr)
JP (3) JP5540105B2 (sr)
CN (2) CN105779280B (sr)
AU (1) AU2010315037B9 (sr)
BR (1) BR112012010694B8 (sr)
CA (1) CA2779695C (sr)
CY (1) CY1122003T1 (sr)
DK (3) DK2496717T3 (sr)
EA (1) EA033752B1 (sr)
ES (3) ES2628874T3 (sr)
FI (1) FI3783110T3 (sr)
HR (2) HRP20230134T1 (sr)
HU (3) HUE061110T2 (sr)
IL (3) IL219521A (sr)
LT (2) LT3241914T (sr)
MX (3) MX2012005214A (sr)
PL (3) PL2496717T3 (sr)
PT (3) PT3783110T (sr)
RS (2) RS63944B1 (sr)
SI (2) SI3241914T1 (sr)
SM (2) SMT201900229T1 (sr)
TW (1) TWI458976B (sr)
WO (1) WO2011057094A1 (sr)

Families Citing this family (214)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9424392B2 (en) 2005-11-26 2016-08-23 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals
US10081839B2 (en) 2005-07-29 2018-09-25 Natera, Inc System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US11111544B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US11111543B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US10083273B2 (en) 2005-07-29 2018-09-25 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US8532930B2 (en) 2005-11-26 2013-09-10 Natera, Inc. Method for determining the number of copies of a chromosome in the genome of a target individual using genetic data from genetically related individuals
WO2007100911A2 (en) 2006-02-28 2007-09-07 University Of Louisville Research Foundation Detecting fetal chromosomal abnormalities using tandem single nucleotide polymorphisms
US8609338B2 (en) 2006-02-28 2013-12-17 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Detecting fetal chromosomal abnormalities using tandem single nucleotide polymorphisms
EP2029779A4 (en) 2006-06-14 2010-01-20 Living Microsystems Inc HIGHLY PARALLEL SNP GENOTYPING UTILIZATION FOR FETAL DIAGNOSIS
US20080050739A1 (en) 2006-06-14 2008-02-28 Roland Stoughton Diagnosis of fetal abnormalities using polymorphisms including short tandem repeats
US9218449B2 (en) 2007-07-23 2015-12-22 The Chinese University Of Hong Kong Methods for analyzing massively parallel sequencing data for noninvasive prenatal diagnosis
US20110033862A1 (en) * 2008-02-19 2011-02-10 Gene Security Network, Inc. Methods for cell genotyping
AU2009223671B2 (en) * 2008-03-11 2014-11-27 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for prenatal gender determination
US20110092763A1 (en) * 2008-05-27 2011-04-21 Gene Security Network, Inc. Methods for Embryo Characterization and Comparison
CN104732118B (zh) * 2008-08-04 2017-08-22 纳特拉公司 等位基因调用和倍性调用的方法
US8962247B2 (en) * 2008-09-16 2015-02-24 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non invasive prenatal diagnoses
US8476013B2 (en) 2008-09-16 2013-07-02 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based acid enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
US9524369B2 (en) 2009-06-15 2016-12-20 Complete Genomics, Inc. Processing and analysis of complex nucleic acid sequence data
US20120185176A1 (en) 2009-09-30 2012-07-19 Natera, Inc. Methods for Non-Invasive Prenatal Ploidy Calling
PL2496717T3 (pl) 2009-11-05 2017-11-30 The Chinese University Of Hong Kong Analiza genomowa płodu z matczynej próbki biologicznej
EP2504448B1 (en) * 2009-11-25 2016-10-19 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for detecting genetic material
EP2516680B1 (en) 2009-12-22 2016-04-06 Sequenom, Inc. Processes and kits for identifying aneuploidy
ES2704701T3 (es) 2010-01-19 2019-03-19 Verinata Health Inc Nuevo protocolo de preparación de bibliotecas de secuenciación
US9260745B2 (en) 2010-01-19 2016-02-16 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation
US9323888B2 (en) 2010-01-19 2016-04-26 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation
WO2011090556A1 (en) 2010-01-19 2011-07-28 Verinata Health, Inc. Methods for determining fraction of fetal nucleic acid in maternal samples
US10662474B2 (en) 2010-01-19 2020-05-26 Verinata Health, Inc. Identification of polymorphic sequences in mixtures of genomic DNA by whole genome sequencing
US10388403B2 (en) 2010-01-19 2019-08-20 Verinata Health, Inc. Analyzing copy number variation in the detection of cancer
WO2011091063A1 (en) 2010-01-19 2011-07-28 Verinata Health, Inc. Partition defined detection methods
US20120100548A1 (en) 2010-10-26 2012-04-26 Verinata Health, Inc. Method for determining copy number variations
US20110312503A1 (en) 2010-01-23 2011-12-22 Artemis Health, Inc. Methods of fetal abnormality detection
US20190010543A1 (en) 2010-05-18 2019-01-10 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US10316362B2 (en) 2010-05-18 2019-06-11 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11326208B2 (en) 2010-05-18 2022-05-10 Natera, Inc. Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA
US12221653B2 (en) 2010-05-18 2025-02-11 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US9677118B2 (en) 2014-04-21 2017-06-13 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US12152275B2 (en) 2010-05-18 2024-11-26 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
CA3037126C (en) 2010-05-18 2023-09-12 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11332785B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11322224B2 (en) * 2010-05-18 2022-05-03 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11408031B2 (en) 2010-05-18 2022-08-09 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal paternity testing
US12545960B2 (en) 2010-05-18 2026-02-10 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11332793B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11339429B2 (en) 2010-05-18 2022-05-24 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11939634B2 (en) 2010-05-18 2024-03-26 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
EP2596127A2 (en) * 2010-07-23 2013-05-29 Esoterix Genetic Laboratories, LLC Identification of differentially represented fetal or maternal genomic regions and uses thereof
US11031095B2 (en) 2010-08-06 2021-06-08 Ariosa Diagnostics, Inc. Assay systems for determination of fetal copy number variation
US11203786B2 (en) 2010-08-06 2021-12-21 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of target nucleic acids using hybridization
US10533223B2 (en) 2010-08-06 2020-01-14 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of target nucleic acids using hybridization
US20130261003A1 (en) 2010-08-06 2013-10-03 Ariosa Diagnostics, In. Ligation-based detection of genetic variants
US20140342940A1 (en) 2011-01-25 2014-11-20 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of Target Nucleic Acids using Hybridization
US20120034603A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Tandem Diagnostics, Inc. Ligation-based detection of genetic variants
US20130040375A1 (en) 2011-08-08 2013-02-14 Tandem Diagnotics, Inc. Assay systems for genetic analysis
US10167508B2 (en) 2010-08-06 2019-01-01 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of genetic abnormalities
US8700338B2 (en) 2011-01-25 2014-04-15 Ariosa Diagnosis, Inc. Risk calculation for evaluation of fetal aneuploidy
EP4269623A3 (en) 2010-11-30 2024-03-06 The Chinese University Of Hong Kong Analysis of a biological sample of an organism for chromosomal deletions or amplifications associated with cancer
WO2012078792A2 (en) * 2010-12-07 2012-06-14 Stanford University Non-invasive determination of fetal inheritance of parental haplotypes at the genome-wide scale
BR112013016193B1 (pt) 2010-12-22 2019-10-22 Natera, Inc. método ex vivo para determinar se um suposto pai é o pai biológico de um feto que está em gestação em uma gestante e relatório
US10131947B2 (en) 2011-01-25 2018-11-20 Ariosa Diagnostics, Inc. Noninvasive detection of fetal aneuploidy in egg donor pregnancies
US8756020B2 (en) * 2011-01-25 2014-06-17 Ariosa Diagnostics, Inc. Enhanced risk probabilities using biomolecule estimations
US20120190020A1 (en) * 2011-01-25 2012-07-26 Aria Diagnostics, Inc. Detection of genetic abnormalities
US9994897B2 (en) 2013-03-08 2018-06-12 Ariosa Diagnostics, Inc. Non-invasive fetal sex determination
US11270781B2 (en) 2011-01-25 2022-03-08 Ariosa Diagnostics, Inc. Statistical analysis for non-invasive sex chromosome aneuploidy determination
EP3483285B1 (en) 2011-02-09 2021-07-14 Bio-Rad Laboratories, Inc. Analysis of nucleic acids
BR112013020220B1 (pt) 2011-02-09 2020-03-17 Natera, Inc. Método para determinar o estado de ploidia de um cromossomo em um feto em gestação
CA2827873C (en) 2011-02-24 2022-08-16 The Chinese University Of Hong Kong Molecular testing of multiple pregnancies
RS63008B1 (sr) * 2011-04-12 2022-03-31 Verinata Health Inc Rešavanje frakcija genoma koristeći brojanje polimorfizma
GB2484764B (en) 2011-04-14 2012-09-05 Verinata Health Inc Normalizing chromosomes for the determination and verification of common and rare chromosomal aneuploidies
US9411937B2 (en) 2011-04-15 2016-08-09 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation
US20140235474A1 (en) 2011-06-24 2014-08-21 Sequenom, Inc. Methods and processes for non invasive assessment of a genetic variation
US9679103B2 (en) 2011-08-25 2017-06-13 Complete Genomics, Inc. Phasing of heterozygous loci to determine genomic haplotypes
US8712697B2 (en) 2011-09-07 2014-04-29 Ariosa Diagnostics, Inc. Determination of copy number variations using binomial probability calculations
EP2764458B1 (en) 2011-10-06 2021-04-07 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US10196681B2 (en) 2011-10-06 2019-02-05 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US9984198B2 (en) 2011-10-06 2018-05-29 Sequenom, Inc. Reducing sequence read count error in assessment of complex genetic variations
US10424394B2 (en) 2011-10-06 2019-09-24 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US9367663B2 (en) 2011-10-06 2016-06-14 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
PL2805280T3 (pl) 2012-01-20 2022-11-21 Sequenom, Inc. Procesy diagnostyczne będące czynnikiem warunków doświadczalnych
US9238836B2 (en) 2012-03-30 2016-01-19 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and compositions for sequencing modified nucleic acids
WO2013130848A1 (en) * 2012-02-29 2013-09-06 Natera, Inc. Informatics enhanced analysis of fetal samples subject to maternal contamination
US9605313B2 (en) * 2012-03-02 2017-03-28 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US9892230B2 (en) 2012-03-08 2018-02-13 The Chinese University Of Hong Kong Size-based analysis of fetal or tumor DNA fraction in plasma
PL2851431T3 (pl) * 2012-05-14 2018-04-30 Bgi Genomics Co., Ltd. Sposób, system i odczytywalny komputerowo nośnik do określania informacji o zasadach we wcześniej określonym obszarze genomu płodu
US10289800B2 (en) 2012-05-21 2019-05-14 Ariosa Diagnostics, Inc. Processes for calculating phased fetal genomic sequences
US9920361B2 (en) 2012-05-21 2018-03-20 Sequenom, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid
US10504613B2 (en) 2012-12-20 2019-12-10 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
WO2013177581A2 (en) * 2012-05-24 2013-11-28 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Whole genome sequencing of a human fetus
US11261494B2 (en) 2012-06-21 2022-03-01 The Chinese University Of Hong Kong Method of measuring a fractional concentration of tumor DNA
US10497461B2 (en) 2012-06-22 2019-12-03 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
JP2015521862A (ja) 2012-07-13 2015-08-03 セクエノム， インコーポレイテッド 非侵襲性の出生前診断に有用な母体サンプル由来の胎児核酸のメチル化に基づく富化のためのプロセスおよび組成物
EP2872650A2 (en) * 2012-07-13 2015-05-20 Life Technologies Corporation Human identifiation using a panel of snps
EP2875156A4 (en) 2012-07-19 2016-02-24 Ariosa Diagnostics Inc SEQUENTIAL LIGATION-BASED MULTIPLEX DETECTION OF GENETIC VARIANTS
US20140100126A1 (en) 2012-08-17 2014-04-10 Natera, Inc. Method for Non-Invasive Prenatal Testing Using Parental Mosaicism Data
US20140065621A1 (en) * 2012-09-04 2014-03-06 Natera, Inc. Methods for increasing fetal fraction in maternal blood
EP2893478A1 (en) * 2012-09-06 2015-07-15 Ancestry.com DNA, LLC Using haplotypes to infer ancestral origins for recently admixed individuals
US10706957B2 (en) 2012-09-20 2020-07-07 The Chinese University Of Hong Kong Non-invasive determination of methylome of tumor from plasma
BR112015006183B1 (pt) * 2012-09-20 2022-04-26 The Chinese University Of Hong Kong Métodos para analisar uma amostra biológica de um organismo, para determinar um primeiro perfil de metilação de uma amostra biológica de um organismo, para detecção de uma anormalidade cromossômica de uma amostra biológica de um organismo e para estimar um nível de metilação do dna em uma amostra biológica de um organismo, produto de computador, e, kit para análise de dna fetal
US9732390B2 (en) 2012-09-20 2017-08-15 The Chinese University Of Hong Kong Non-invasive determination of methylome of fetus or tumor from plasma
US10482994B2 (en) 2012-10-04 2019-11-19 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US9213947B1 (en) 2012-11-08 2015-12-15 23Andme, Inc. Scalable pipeline for local ancestry inference
US9977708B1 (en) * 2012-11-08 2018-05-22 23Andme, Inc. Error correction in ancestry classification
US10643738B2 (en) * 2013-01-10 2020-05-05 The Chinese University Of Hong Kong Noninvasive prenatal molecular karyotyping from maternal plasma
WO2014113204A1 (en) 2013-01-17 2014-07-24 Personalis, Inc. Methods and systems for genetic analysis
US20130309666A1 (en) 2013-01-25 2013-11-21 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
SG10201609080WA (en) 2013-02-28 2016-12-29 Univ Hong Kong Chinese Maternal plasma transcriptome analysis by massively parallel rna sequencing
US11060145B2 (en) 2013-03-13 2021-07-13 Sequenom, Inc. Methods and compositions for identifying presence or absence of hypermethylation or hypomethylation locus
KR20150132216A (ko) 2013-03-15 2015-11-25 더 차이니즈 유니버시티 오브 홍콩 다태 임신에 대한 태아 게놈의 결정
HUE061261T2 (hu) 2013-04-03 2023-05-28 Sequenom Inc Eljárások és folyamatok genetikai variánsok nem invazív értékelésére
CN105189787A (zh) * 2013-05-09 2015-12-23 豪夫迈·罗氏有限公司 使用hla标志物测定母体血液中的胎儿dna的分数的方法
IL309903A (en) 2013-05-24 2024-03-01 Sequenom Inc Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
AU2014284180B2 (en) 2013-06-21 2020-03-19 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US20150004601A1 (en) * 2013-06-28 2015-01-01 Ariosa Diagnostics, Inc. Massively parallel sequencing of random dna fragments for determination of fetal fraction
GB201318369D0 (en) * 2013-10-17 2013-12-04 Univ Leuven Kath Methods using BAF
EP3965111B8 (en) 2013-08-30 2025-06-11 Personalis, Inc. Methods for genomic analysis
WO2015048535A1 (en) 2013-09-27 2015-04-02 Natera, Inc. Prenatal diagnostic resting standards
US10262755B2 (en) 2014-04-21 2019-04-16 Natera, Inc. Detecting cancer mutations and aneuploidy in chromosomal segments
US10577655B2 (en) 2013-09-27 2020-03-03 Natera, Inc. Cell free DNA diagnostic testing standards
GB2535066A (en) 2013-10-03 2016-08-10 Personalis Inc Methods for analyzing genotypes
PL3053071T3 (pl) 2013-10-04 2024-03-18 Sequenom, Inc. Metody i procesy nieinwazyjnej oceny zmienności genetycznych
CN105874082B (zh) 2013-10-07 2020-06-02 塞昆纳姆股份有限公司 用于非侵入性评估染色体改变的方法和过程
EP3736344A1 (en) 2014-03-13 2020-11-11 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US12492429B2 (en) 2014-04-21 2025-12-09 Natera, Inc. Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments
CA2945962C (en) 2014-04-21 2023-08-29 Natera, Inc. Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments
US20180173845A1 (en) 2014-06-05 2018-06-21 Natera, Inc. Systems and Methods for Detection of Aneuploidy
WO2016011414A1 (en) * 2014-07-18 2016-01-21 Illumina, Inc. Non-invasive prenatal diagnosis of fetal genetic condition using cellular dna and cell free dna
US20160026759A1 (en) * 2014-07-22 2016-01-28 Yourgene Bioscience Detecting Chromosomal Aneuploidy
KR102696857B1 (ko) 2014-07-25 2024-08-19 유니버시티 오브 워싱톤 무세포 dna를 생성하는 조직 및/또는 세포 유형을 결정하는 방법 및 이를 사용하여 질환 또는 장애를 확인하는 방법
US11783911B2 (en) 2014-07-30 2023-10-10 Sequenom, Inc Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
CN104182655B (zh) * 2014-09-01 2017-03-08 上海美吉生物医药科技有限公司 一种判断胎儿基因型的方法
CN104232778B (zh) * 2014-09-19 2016-08-17 天津华大基因科技有限公司 同时确定胎儿单体型及染色体非整倍性的方法及装置
US10612080B2 (en) * 2014-09-22 2020-04-07 Roche Molecular Systems, Inc. Digital PCR for non-invasive prenatal testing
US10125399B2 (en) 2014-10-30 2018-11-13 Personalis, Inc. Methods for using mosaicism in nucleic acids sampled distal to their origin
CN105648044B (zh) * 2014-11-13 2019-10-11 天津华大基因科技有限公司 确定胎儿目标区域单体型的方法和装置
CN105648045B (zh) * 2014-11-13 2019-10-11 天津华大基因科技有限公司 确定胎儿目标区域单体型的方法和装置
CN104561309B (zh) * 2015-01-04 2017-04-19 北京积水潭医院 一种来自人辅助生殖囊胚植入前进行出生安全性预测的试剂盒
CN104561311B (zh) * 2015-01-04 2016-08-17 北京大学第三医院 一种来自人辅助生殖胚胎发育早期出生安全性预测的试剂盒
US10364467B2 (en) 2015-01-13 2019-07-30 The Chinese University Of Hong Kong Using size and number aberrations in plasma DNA for detecting cancer
CN107109324B (zh) * 2015-01-16 2019-11-08 深圳华大基因股份有限公司 确定胎儿核酸含量的方法和装置
PT3256605T (pt) * 2015-02-10 2022-03-17 Univ Hong Kong Chinese Deteção de mutações para rastreio de cancro e análise fetal
US10424396B2 (en) * 2015-03-27 2019-09-24 Sentieon Inc. Computation pipeline of location-dependent variant calls
WO2016183106A1 (en) 2015-05-11 2016-11-17 Natera, Inc. Methods and compositions for determining ploidy
EP4450636A3 (en) 2015-05-18 2025-01-01 Karius, Inc. Compositions and methods for enriching populations of nucleic acids
WO2017004612A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Arima Genomics, Inc. Accurate molecular deconvolution of mixtures samples
EP3325663B1 (en) * 2015-07-20 2020-08-19 The Chinese University Of Hong Kong Methylation pattern analysis of haplotypes in tissues in dna mixture
TWI730973B (zh) 2015-07-23 2021-06-21 香港中文大學 游離ｄｎａ(ｃｅｌｌ-ｆｒｅｅ ｄｎａ)之片段化模式分析
CN115433769A (zh) 2015-08-12 2022-12-06 香港中文大学 血浆dna的单分子测序
TWI767888B (zh) * 2015-09-22 2022-06-21 香港中文大學 藉由母體血漿ｄｎａ之淺深度測序以準確定量胎兒ｄｎａ含量
GB201518665D0 (en) 2015-10-21 2015-12-02 Singapore Volition Pte Ltd Method for enrichment of cell free nucleosomes
CN105335625B (zh) * 2015-11-04 2018-02-16 和卓生物科技（上海）有限公司 胚胎植入前的遗传学检测装置
ES2913468T3 (es) 2016-04-15 2022-06-02 Natera Inc Métodos para la detección del cáncer de pulmón.
CN105926043B (zh) * 2016-04-19 2018-08-28 苏州贝康医疗器械有限公司 一种提高孕妇血浆游离dna测序文库中胎儿游离dna占比的方法
US12416047B2 (en) * 2016-05-06 2025-09-16 Myriad Women's Health, Inc. Noninvasive prenatal diagnostic methods
US11299783B2 (en) 2016-05-27 2022-04-12 Personalis, Inc. Methods and systems for genetic analysis
WO2018003220A1 (ja) * 2016-06-29 2018-01-04 トヨタ自動車株式会社 Ｄｎａライブラリーの作製方法及びｄｎａライブラリーを用いたゲノムｄｎａ解析方法
EP3491560A1 (en) 2016-07-27 2019-06-05 Sequenom, Inc. Genetic copy number alteration classifications
WO2018064486A1 (en) 2016-09-29 2018-04-05 Counsyl, Inc. Noninvasive prenatal screening using dynamic iterative depth optimization
US11485996B2 (en) 2016-10-04 2022-11-01 Natera, Inc. Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing
WO2018081130A1 (en) 2016-10-24 2018-05-03 The Chinese University Of Hong Kong Methods and systems for tumor detection
GB201618485D0 (en) 2016-11-02 2016-12-14 Ucl Business Plc Method of detecting tumour recurrence
MY208464A (en) * 2016-11-18 2025-05-11 Univ Hong Kong Chinese Universal haplotype-based noninvasive prenatal testing for single gene diseases
US10011870B2 (en) 2016-12-07 2018-07-03 Natera, Inc. Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules
WO2018140521A1 (en) 2017-01-24 2018-08-02 Sequenom, Inc. Methods and processes for assessment of genetic variations
EP4421489B1 (en) 2017-01-25 2026-03-11 The Chinese University of Hong Kong Diagnostic applications using nucleic acid fragments
US10894976B2 (en) 2017-02-21 2021-01-19 Natera, Inc. Compositions, methods, and kits for isolating nucleic acids
IL317916A (en) 2017-03-17 2025-02-01 Sequenom Inc Methods and processes for assessing genetic mosaicism
EP3602359A4 (en) 2017-03-24 2021-01-06 Myriad Women's Health, Inc. COPY NUMBER VARIANT CALLER
EP3622660B1 (en) 2017-05-12 2023-08-30 Massachusetts Institute of Technology Systems and methods for crowdsourcing, analyzing, and/or matching personal data
JP7056012B2 (ja) 2017-05-19 2022-04-19 トヨタ自動車株式会社 ランダムプライマーセット、及びこれを用いたｄｎａライブラリーの作製方法
KR102145417B1 (ko) * 2017-05-24 2020-08-19 지니너스 주식회사 무세포 핵산으로부터 수득된 서열 분석 데이터에 대한 배경 대립인자의 빈도 분포를 생성하는 방법 및 이를 이용하여 무세포 핵산으로부터 변이를 검출하는 방법
US11655498B2 (en) * 2017-07-07 2023-05-23 Massachusetts Institute Of Technology Systems and methods for genetic identification and analysis
EP3652740A2 (en) * 2017-07-12 2020-05-20 ANDE Corporation Pattern recognition system
CN109280697B (zh) * 2017-07-20 2022-04-26 天昊生物医药科技（苏州）有限公司 利用孕妇血浆游离dna进行胎儿基因型鉴定的方法
KR20250171389A (ko) 2017-07-26 2025-12-08 더 차이니즈 유니버시티 오브 홍콩 세포-무함유 바이러스 핵산을 사용하는 암 스크리닝의 증강
EP3662085B1 (en) 2017-08-04 2022-06-22 Billiontoone, Inc. Sequencing output determination and analysis with target-associated molecules in quantification associated with biological targets
US11519024B2 (en) 2017-08-04 2022-12-06 Billiontoone, Inc. Homologous genomic regions for characterization associated with biological targets
US11646100B2 (en) 2017-08-04 2023-05-09 Billiontoone, Inc. Target-associated molecules for characterization associated with biological targets
CN107545153B (zh) * 2017-10-25 2021-06-11 桂林电子科技大学 一种基于卷积神经网络的核小体分类预测方法
CA3085933A1 (en) 2017-12-14 2019-06-20 Tai Diagnostics, Inc. Assessing graft suitability for transplantation
JP7047373B2 (ja) 2017-12-25 2022-04-05 トヨタ自動車株式会社 次世代シーケンサー用プライマー並びにその製造方法、次世代シーケンサー用プライマーを用いたｄｎａライブラリー並びにその製造方法、及びｄｎａライブラリーを用いたゲノムｄｎａ解析方法
CA3087046A1 (en) 2018-01-05 2019-07-11 Billiontoone, Inc. Quality control templates for ensuring validity of sequencing-based assays
WO2019161244A1 (en) 2018-02-15 2019-08-22 Natera, Inc. Methods for isolating nucleic acids with size selection
EP3781714B1 (en) 2018-04-14 2026-01-07 Natera, Inc. Methods for cancer detection and monitoring by means of personalized detection of circulating tumor dna
TWI854979B (zh) * 2018-05-03 2024-09-11 香港中文大學 用於測量游離(cell-free)混合物之特性之經尺寸標記之偏好末端及取向感知分析
US11814750B2 (en) 2018-05-31 2023-11-14 Personalis, Inc. Compositions, methods and systems for processing or analyzing multi-species nucleic acid samples
US10801064B2 (en) 2018-05-31 2020-10-13 Personalis, Inc. Compositions, methods and systems for processing or analyzing multi-species nucleic acid samples
US12234509B2 (en) 2018-07-03 2025-02-25 Natera, Inc. Methods for detection of donor-derived cell-free DNA
US12071651B2 (en) 2018-08-06 2024-08-27 Billiontoone, Inc. Dilution tagging for quantification of biological targets
EP3847275A4 (en) * 2018-09-03 2022-06-15 Ramot at Tel-Aviv University Ltd. METHOD AND SYSTEM FOR IDENTIFICATION OF GENE DISORDER IN MATERNAL BLOOD
WO2020051542A2 (en) * 2018-09-07 2020-03-12 Illumina, Inc. A method to determine if a circulating fetal cell isolated from a pregnant mother is from either the current or a historical pregnancy
EP4617383A3 (en) 2018-12-17 2025-12-24 Natera, Inc. Methods for analysis of circulating cells
CN109887548B (zh) * 2019-01-18 2022-11-08 臻悦生物科技江苏有限公司 基于捕获测序的ctDNA占比的检测方法及检测装置
CN111560424A (zh) * 2019-02-13 2020-08-21 广州医科大学附属第一医院 可检测的目标核酸、探针、确定胎儿f8基因单体型的方法及应用
CA3130810A1 (en) 2019-03-25 2020-10-01 The Chinese University Of Hong Kong Determining linear and circular forms of circulating nucleic acids
BR112021020684A2 (pt) * 2019-04-22 2021-12-07 Personal Genome Diagnostics Inc Métodos e sistemas para análise genética
WO2020247263A1 (en) 2019-06-06 2020-12-10 Natera, Inc. Methods for detecting immune cell dna and monitoring immune system
WO2021016114A1 (en) 2019-07-19 2021-01-28 23Andme, Inc. Phase-aware determination of identity-by-descent dna segments
DK3916105T3 (da) * 2019-08-14 2023-04-17 Bgi Genomics Co Ltd Fremgangsmåde og indretning til bestemmelse af en føtal nukleinsyrekoncentration i blodet af en gravid kvinde
CA3110884A1 (en) 2019-08-16 2021-02-25 The Chinese University Of Hong Kong Determination of base modifications of nucleic acids
CN112466397A (zh) * 2019-09-09 2021-03-09 深圳乐土生物科技有限公司 一种用于亲缘关系检测的方法和装置
JP7470787B2 (ja) 2019-11-05 2024-04-18 パーソナリス，インコーポレイティド 単一試料からの腫瘍純度の推定
CN115004304A (zh) * 2019-11-18 2022-09-02 伊姆巴克兽医公司 确定祖先亲缘关系的方法和系统
EP4069864A4 (en) * 2020-02-05 2023-01-25 The Chinese University Of Hong Kong MOLECULAR ANALYZES USING LONG CELL-FREE FRAGMENTS IN PREGNANCY
CN111312332B (zh) * 2020-02-13 2020-10-30 国家卫生健康委科学技术研究所 基于hla基因的生物信息处理方法、装置及终端
US11817176B2 (en) 2020-08-13 2023-11-14 23Andme, Inc. Ancestry composition determination
US12322509B2 (en) * 2020-11-08 2025-06-03 The Johns Hopkins University Methods and related aspects for analyzing chromosome number status
CN112575077A (zh) * 2020-12-23 2021-03-30 东莞市妇幼保健院 一种胎儿显性遗传病新发突变的无创基因检测方法及应用
CA3226132A1 (en) 2021-04-22 2022-10-27 Natera, Inc. Methods for determining velocity of tumor growth
CA3225014A1 (en) 2021-08-02 2023-02-09 Georgina GOLDRING Methods for detecting neoplasm in pregnant women
WO2023059654A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Personalis, Inc. Customized assays for personalized cancer monitoring
CA3244958A1 (en) 2022-01-04 2023-07-13 Natera, Inc. CANCER DETECTION AND MONITORING METHOD
WO2023183812A2 (en) 2022-03-21 2023-09-28 Billion Toone, Inc. Molecule counting of methylated cell-free dna for treatment monitoring
WO2025208288A1 (zh) * 2024-04-01 2025-10-09 深圳华大生命科学研究院 基因预测方法、装置、计算机设备及计算机可读存储介质
CN119007813B (zh) * 2024-09-29 2025-11-07 漳州片仔癀药业股份有限公司 一种基于mtDNA的高海拔饲养林麝的种源鉴定及遴选方法
CN120412715B (zh) * 2025-03-17 2025-11-28 上海蓝沙生物科技有限公司 一种通过多态性位点连锁区域块评估孕期母本游离血液中胎儿DNA浓度（cffDNA）的方法

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9704444D0 (en) 1997-03-04 1997-04-23 Isis Innovation Non-invasive prenatal diagnosis
US6664056B2 (en) * 2000-10-17 2003-12-16 The Chinese University Of Hong Kong Non-invasive prenatal monitoring
US6927028B2 (en) * 2001-08-31 2005-08-09 Chinese University Of Hong Kong Non-invasive methods for detecting non-host DNA in a host using epigenetic differences between the host and non-host DNA
JP2006523082A (ja) 2002-03-01 2006-10-12 ラブジェン， インコーポレイテッド ゲノム内の変異の迅速分析
US6977162B2 (en) * 2002-03-01 2005-12-20 Ravgen, Inc. Rapid analysis of variations in a genome
RU2200761C1 (ru) 2002-04-01 2003-03-20 Московский НИИ педиатрии и детской хирургии Набор рекомбинантных плазмидных днк рyai 11-19, рyai 2-45, рys 37 и рyai 7-29 для определения происхождения добавочных или маркерных (мини-) хромосом человека
US7727720B2 (en) * 2002-05-08 2010-06-01 Ravgen, Inc. Methods for detection of genetic disorders
US20070178478A1 (en) * 2002-05-08 2007-08-02 Dhallan Ravinder S Methods for detection of genetic disorders
CA2517017A1 (en) 2003-02-28 2004-09-16 Ravgen, Inc. Methods for detection of genetic disorders
EP1599608A4 (en) * 2003-03-05 2007-07-18 Genetic Technologies Ltd Identification of fetal DNA and fetal cell marker in maternal plasma or serum
ATE435301T1 (de) 2003-10-16 2009-07-15 Sequenom Inc Nicht invasiver nachweis fötaler genetischer merkmale
EP1859050B1 (en) * 2005-03-18 2012-10-24 The Chinese University Of Hong Kong A method for the detection of chromosomal aneuploidies
US20070122823A1 (en) 2005-09-01 2007-05-31 Bianchi Diana W Amniotic fluid cell-free fetal DNA fragment size pattern for prenatal diagnosis
GB0523276D0 (en) * 2005-11-15 2005-12-21 London Bridge Fertility Chromosomal analysis by molecular karyotyping
EP3002338B1 (en) 2006-02-02 2019-05-08 The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University Non-invasive fetal genetic screening by digital analysis
WO2007100911A2 (en) * 2006-02-28 2007-09-07 University Of Louisville Research Foundation Detecting fetal chromosomal abnormalities using tandem single nucleotide polymorphisms
EP2029779A4 (en) 2006-06-14 2010-01-20 Living Microsystems Inc HIGHLY PARALLEL SNP GENOTYPING UTILIZATION FOR FETAL DIAGNOSIS
KR20220146689A (ko) 2007-07-23 2022-11-01 더 차이니즈 유니버시티 오브 홍콩 핵산 서열 불균형의 결정
US12180549B2 (en) * 2007-07-23 2024-12-31 The Chinese University Of Hong Kong Diagnosing fetal chromosomal aneuploidy using genomic sequencing
CN104732118B (zh) * 2008-08-04 2017-08-22 纳特拉公司 等位基因调用和倍性调用的方法
US9051602B2 (en) 2008-12-22 2015-06-09 Celula, Inc. Methods and genotyping panels for detecting alleles, genomes, and transcriptomes
PL2496717T3 (pl) 2009-11-05 2017-11-30 The Chinese University Of Hong Kong Analiza genomowa płodu z matczynej próbki biologicznej
MX357692B (es) * 2009-11-06 2018-07-19 Univ Hong Kong Chinese Analisis genomico a base de tamaño.
US9260745B2 (en) 2010-01-19 2016-02-16 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation
CA3037126C (en) 2010-05-18 2023-09-12 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US20120190020A1 (en) 2011-01-25 2012-07-26 Aria Diagnostics, Inc. Detection of genetic abnormalities
CA2827873C (en) 2011-02-24 2022-08-16 The Chinese University Of Hong Kong Molecular testing of multiple pregnancies
KR20150132216A (ko) 2013-03-15 2015-11-25 더 차이니즈 유니버시티 오브 홍콩 다태 임신에 대한 태아 게놈의 결정

Also Published As

Publication number Publication date
EP2496717A1 (en) 2012-09-12
US8467976B2 (en) 2013-06-18
EA033752B1 (ru) 2019-11-21
IL219521A (en) 2015-02-26
EP3498863B1 (en) 2020-11-04
PT3783110T (pt) 2023-01-02
HUE043574T2 (hu) 2019-08-28
PL2496717T3 (pl) 2017-11-30
US20220325344A1 (en) 2022-10-13
CN105779280B (zh) 2018-09-25
DK2496717T3 (en) 2017-07-24
HK1222413A1 (zh) 2017-06-30
EP3241914B1 (en) 2019-03-06
EA201200690A1 (ru) 2013-05-30
EP3498863A1 (en) 2019-06-19
EP2496717B1 (en) 2017-06-07
TW201122470A (en) 2011-07-01
ES2934941T3 (es) 2023-02-28
MX2012005214A (es) 2012-09-21
LT3241914T (lt) 2019-04-25
BR112012010694A2 (en) 2018-09-11
US11401551B2 (en) 2022-08-02
IL237175A (en) 2017-05-29
MX2022004800A (es) 2022-05-16
DK3241914T3 (en) 2019-04-23
JP6023117B2 (ja) 2016-11-09
FI3783110T3 (fi) 2023-03-02
JP5540105B2 (ja) 2014-07-02
US20130253844A1 (en) 2013-09-26
PT2496717T (pt) 2017-07-12
ES2720282T3 (es) 2019-07-19
ES2628874T3 (es) 2017-08-04
CN102770558B (zh) 2016-04-06
JP2016195598A (ja) 2016-11-24
LT3783110T (lt) 2023-01-25
AU2010315037B9 (en) 2015-04-23
US20130323731A1 (en) 2013-12-05
JP2013509884A (ja) 2013-03-21
CA2779695C (en) 2016-05-24
BR112012010694B1 (pt) 2020-11-17
JP2014193165A (ja) 2014-10-09
EP3783110B1 (en) 2022-11-23
HRP20230134T1 (hr) 2023-03-31
AU2010315037A1 (en) 2012-06-07
AU2010315037B2 (en) 2014-09-18
SMT201900229T1 (it) 2019-05-10
HUE034854T2 (en) 2018-03-28
CN105779280A (zh) 2016-07-20
WO2011057094A1 (en) 2011-05-12
RS63944B1 (sr) 2023-02-28
US10093976B2 (en) 2018-10-09
PL3241914T3 (pl) 2019-08-30
US20110105353A1 (en) 2011-05-05
AU2010315037A8 (en) 2012-07-12
IL237179A (en) 2016-05-31
PL3783110T3 (pl) 2023-05-08
HRP20190601T1 (hr) 2019-10-04
IL219521A0 (en) 2012-06-28
JP6386494B2 (ja) 2018-09-05
CY1122003T1 (el) 2020-10-14
US9512480B2 (en) 2016-12-06
HUE061110T2 (hu) 2023-05-28
CN102770558A (zh) 2012-11-07
CA2779695A1 (en) 2011-05-12
EP3783110A1 (en) 2021-02-24
MX355132B (es) 2018-04-06
EP3241914A1 (en) 2017-11-08
US20180282807A1 (en) 2018-10-04
DK3783110T3 (da) 2023-02-06
SMT202300034T1 (it) 2023-03-17
SI3241914T1 (sl) 2019-07-31
PT3241914T (pt) 2019-04-30
BR112012010694B8 (pt) 2021-07-27
SI3783110T1 (sl) 2023-02-28
TWI458976B (zh) 2014-11-01
EP4170043A1 (en) 2023-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11401551B2 (en) Identifying a de novo fetal mutation from a maternal biological sample
HK40092153A (en) Fetal genomic analysis from a maternal biological sample
AU2013203448B2 (en) Determining fraction of fetal dna in maternal biological sample
HK40047861A (en) Fetal genomic analysis from a maternal biological sample
HK40047861B (en) Fetal genomic analysis from a maternal biological sample
HK40007427A (en) Fetal genomic analysis from a maternal biological sample
HK40007427B (en) Fetal genomic analysis from a maternal biological sample
HK1222413B (zh) 由母本生物样品进行胎儿基因组的分析
HK1239754B (en) Fetal genomic analysis from a maternal biological sample
HK1239754A1 (en) Fetal genomic analysis from a maternal biological sample
EA050163B1 (ru) Анализ генома плода из материнского биологического образца
HK1175504A (en) Fetal genomic analysis from a maternal biological sample
HK1175504B (en) Fetal genomic analysis from a maternal biological sample