RS58881B1 - Dugodelujući superagonisti glikoproteinskih hormona - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak uopšteno se odnosi na modifikovane glikoproteinske hormone koji imaju superagonističku aktivnost, i njihovu upotrebu u lečenju stanja povezanih sa aktivnošću glikoproteinskih hormona. Određenije, ovaj pronalazak odnosi se na modifikovane molekule glikoproteina koji sadrže aminokiselinske supstitucije i jedan ili više umetnutih peptida u alfa subjedinici u poređenju sa alfa subjedinicom divljeg tipa, pri čemu ti modifikovani molekuli pokazuju poboljšana farmakološka svojstva u poređenju sa glikoproteinima divljeg tipa.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Gonadotropini folitropin (folikularni stimulišući hormon, FSH) i horionski gonadotropin, (CG), lutropin (luteinizirajući hormon, LH), i tirotropin (tireostimulišući hormon, TSH) obuhvataju familiju glikoproteinskih hormona. Svaki hormon je heterodimer dve nekovalentno vezane subjedinice: alfa i beta. U okviru istih vrsta, aminokiselinska sekvenca alfa-subjedinice je identična u svim hormonima, dok je sekvenca beta-subjedinice specifična za hormon (Pierce, Ann. Rev. Biochem.50:465-495 (1981)). Činjenica da su sekvence subjedinica visoko očuvane od riba do sisara podrazumeva da su ovi hormoni evoluirali od proteina zajedničkog pretka (Fontaine, Gen. Comp. Endocrinol.32:341-347 (1977)).

[0003] Prethodne studije sa modifikovanim glikoproteinskim hormonima otkrili su ohrabrujuće podatke. Na primer, pored obezbeđivanja modifikovanih glikoproteinskih hormona sa povećanom aktivnošću, dalje mutacije demonstrirale su povećanje u vezivanju afinitetnom za receptor (videti npr. WO 2005/089445 i WO 2005/101000). Međutim, dok je afinitet povećan, studije su demonstrirale da su modifikovani glikoproteinski hormoni su očišćeni brzo ako ne i brže od njihovih dvojnika divljeg tipa. Kako bi se generisao klinički koristan superagonist sa poboljšanom aktivnošću, modifikovan glikoproteinski superagonist treba da ima poboljšan biološki poluživot pored poboljšan afinitet vezivanja receptora. Međutim, prethodni pokušaji da se dalje modifikuju glikoproteinski hormoni radi povećanja poluživota i poboljšanja bioraspoloživosti bili su manje od zadovoljavajućih i, umesto toga, modifikovani glikoproteinski hormoni demonstrirali su samo oslabljeni odgovor.

SUŠTINA PRONALASKA

[0004] Ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid alfa subjedinice odabrane iz grupe koju čine polipeptid goveđe alfa subjedinice divljeg tipa (SEQ ID NO:2), polipeptid ovčije alfa subjedinice divljeg tipa (SEQ ID NO:3), polipeptid konjske alfa subjedinice divljeg tipa (SEQ ID NO:4), i polipeptid svinjske alfa subjedinice divljeg tipa (SEQ ID NO:5), pri čemu pomenuti polipeptid alfa subjedinice obuhvata:

(A) aminokiselinski umetak koji obuhvata najmanje jednu aminokiselinu koja obezbeđuje potencijalno mesto glikozilacije, pri čemu je pomenuti umetak smešten neposredno nakon položaja 6, 7, ili 8 pomenutog polipeptida alfa subjedinice; i

(B) jednu ili više od sledećih supstitucija aminokiseline divljeg tipa pomenutog polipeptida alfa subjedinice sa osnovnom aminokiselinom:

(i) aminokiselina divljeg tipa na položaju 15 zamenjena je sa argininom (R),

(ii) aminokiselina divljeg tipa na položaju 17 iz SEQ ID NO: 2, 3 ili 5 zamenjena je sa argininom (R),

(iii) aminokiselina divljeg tipa na položaju 18 zamenjena je sa argininom (R), lizinom (K), ili histidinom (H),

(iv) aminokiselina divljeg tipa na položaju 20 zamenjena je sa argininom (R), i

(v) aminokiselina divljeg tipa na položaju 24 zamenjena je sa argininom (R).

[0005] Ovde je opisan modifikovani glikoproteinski hormon koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa najmanje jednom konzervativnom supstitucijom osnovnom aminokiselinom na Q13, E14, P16 ili Q20 i umetak VNVTINVT (SEQ ID NO: 20) između D3 i Q5 alfa subjedinice glikoproteinskog hormona.

[0006] Kao što je opisano ovde, modifikovan glikoproteinski hormon može da obuhvata najmanje dve ili najmanje tri supstitucije osnovnom aminokiselinom na Q13, P16 i Q20. U nekim primerima izvođenja, modifikovan glikoproteinski hormon dalje obuhvata supstituciju osnovnom aminokiselinom na E14. U nekim primerima izvođenja, osnovna aminokiselina je arginin.

[0007] Kao što je opisano ovde, alfa subjedinica može da obuhvata neku aminokiselinsku sekvencu sa najmanje 85% identiteta sa SEQ ID NO: 11 i dalje može da obuhvata beta subjedinicu luteinizirajućeg hormona (LH), horionskog gonadotropina (CG), folikularnog stimulišućeg hormona (FSH) ili tireostimulišućeg hormona (TSH). Alfa subjedinica može da se dobije iz humane alfa subjedinice (SEQ ID NO: 6).

[0008] Ovaj pronalazak obuhvata modifikovan glikoproteinski hormon koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa najmanje jednom konzervativnom supstitucijom osnovnom aminokiselinom na K15, K17, K20 ili K24 i umetak NVTINV (SEQ ID NO: 1) između F6 i T7 alfa subjedinice glikoproteinskog hormona.

[0009] U nekim primerima izvođenja, modifikovan glikoproteinski hormon obuhvata najmanje dve, ili najmanje tri, ili najmanje četiri supstitucije osnovnom aminokiselinom na K15, K17, K20 i K24. U nekim primerima izvođenja, modifikovan glikoproteinski hormon dalje obuhvata supstituciju osnovnom aminokiselinom na E18. U nekim primerima izvođenja, osnovna aminokiselina je arginin.

[0010] U nekim primerima izvođenja, alfa subjedinica obuhvata neku aminokiselinsku sekvencu sa najmanje 85% identiteta sa SEQ ID NO: 7 i dalje obuhvata beta subjedinicu luteinizirajućeg hormona (LH), horionskog gonadotropina (CG), folikularnog stimulišućeg hormona (FSH) ili tireostimulišućeg hormona (TSH). U nekim primerima izvođenja, alfa subjedinica je dobijena iz goveđe, svinjske, ili ovčije alfa subjedinice (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 3, respektivno).

[0011] Ovaj pronalazak obuhvata modifikovan glikoproteinski hormon koji obuhvata neku aminokiselinsku sekvencu sa najmanje jednom konzervativnom supstitucijom osnovnom aminokiselinom na K15, E18, K20 ili K24 i umetak NVTINV (SEQ ID NO: 1) između F6 i T7 ili alternativno umetak NV između F6 i T7 plus umetak INV između T7 i T8 alfa subjedinice glikoproteinskog hormona.

[0012] U nekim primerima izvođenja, modifikovan glikoproteinski hormon obuhvata najmanje dve, ili najmanje tri, ili najmanje četiri supstitucije osnovnom aminokiselinom na K15, E18, K20 i K24. U nekim primerima izvođenja, modifikovan glikoproteinski hormon uključuje umetak NVTINV (SEQ ID NO: 1) između F6 i T7 alfa subjedinice. U nekim primerima izvođenja, modifikovan glikoproteinski hormon uključuje umetak NV između F6 i T7 plus umetak INV između T7 i T8 alfa subjedinice. U nekim primerima izvođenja, osnovna aminokiselina je arginin ili histidin. U nekim primerima izvođenja, osnovna aminokiselina je arginin.

[0013] Kao što je opisano i/ili za šta je tražena zaštita ovde, alfa subjedinica obuhvata neku aminokiselinsku sekvencu sa najmanje 85% identiteta sa SEQ ID NO: 4 i dalje obuhvata beta subjedinicu luteinizirajućeg hormona (LH), horionskog gonadotropina (CG), folikularnog stimulišućeg hormona (FSH) ili tireostimulišućeg hormona (TSH). U nekim primerima izvođenja, alfa subjedinica je izvedena iz konjske alfa subjedinice (SEQ ID NO: 4).

[0014] Ovaj pronalazak takođe obuhvata medicinsku upotrebu koja obuhvata davanje gornjih modifikovanih glikoproteinskih hormona životinji. Ovaj pronalazak takođe obuhvata ne-terapeutski postupak za stimulisanje ovulacije kod ne-humane životinje, koji obuhvata davanje bilo kog od gornjih modifikovanih glikoproteinskih hormona pomenutoj životinji. U nekim primerima izvođenja, životinja je krava, ovca, svinja ili konj.

KRATAK OPIS NACRTA

Fig.1 prikazuje cAMP stimulacija u CHO-FSHR ćelijama sa odabranim bFSH analozima proizvedenim prolaznom transfekcijom. Fig.1A prikazuje poređenje Folltropin®-V (pFSH), bFSH-WT (divljeg tipa) sa bFSH-5R analogom. Fig.1B prikazuje atenuaciju in vitro bioaktivnosti hFSH-TR4402 analoga (Transient 4402) sa dva N-terminalna produžetka (ANITV, NITV) i jednom unutrašnjom neoglikozilacijom (V78N) (SPA cAMP ispitivanje). Fig.1C prikazuje poređenje bFSH-5R analoga sa Umetkom 1 (5R+Umetak 1) i Umetkom 2 (5R+Insert2).

Fig.2A i 2B prikazuju PK skrining ispitivanje različitih bFSH analoga posle jedne subkutane injekcije u miševe. U svakom eksperimentu, 5 miševa je korišćeno za svaki preparat. Uzorci krvi su uzimani 24, 32 i 48 h posle injekcije, nivoi u plazmi su oduzeti i podaci su izrađeni kao % ubrizgane doze (%ID). FSH nivoi u uzorcima plazme su ispitivani upotrebom FSH ELISA (Endodrine Technologies).

Fig.3A-D prikazuju analizu različitih lotova TR55601 proizvodnje. Fig.3A ilustruje analizu heterogenosti naelektrisanja upotrebom IEF, a nakon toga Western blot. Suboptimalno uvođenje sijalila Lota 3 (Trake 2 i 3) je u oštrom kontrastu sa optimalnim veoma kiselim izoformama detektovanim u Lotu 4 (Trake 5 i 6). Traka 1, IEF 3-10 marker; Traka 2, TR55601/Lot 3(8µg); Traka 3, TR55601/Lot 3(4µg); Traka 4 i 8, TR4401 (1µg); Traka 5, TR55601/Lot 4 (8µg); Traka 6, TR55601/Lot 4 (4µg); Traka 8, IEF 3-10 marker. Fig.3B ilustruje Analizu naelektrisanih izoformi korišćenjem neuraminidaze (Vibrio cholerae), IEF i Western blot. Netretiran TR55601/Lot 4 uzorak (Trake 2 i 3) i TR55601/Lot 4 uzorak tretiran sa neuraminidazom pre primene na 3-10 IEF gel (Trake 4-6). Traka 1, IEF 3-10 marker; Traka 2, netretiran TR55601/Lot 4 (8µg); Traka 3, netretiran TR55601/Lot 4 (4µg); Traka 4, tretiran TR55601/Lot 4(4µg); Traka 5, tretiran TR55601/Lot 4 (2µg); Traka 6, tretiran TR55601/Lot 4 (1µg). IEF profil za neuraminidazom digestovane izoforme pomeren je ka pI opsegu od 7.8 do 10.0. Prosečan pomeraj pI je oko 5 pH jediničnih i višestrukih traka (blizu 10 traka) transformisanih u jednu glavnu traku (pI ∼9.5) i tri manje trake (pI 7.8-10.0), koje ukazuju da je veći deo primećene heterogenosti naelektrisanja (Fig.3A - Lot 4) zavisan od terminalnih ostataka sijalinske kiseline sa malom komponentom ostalih modifikacija kao što je deamidacija i/ili proteolitička razgradnja. Preostale osnovne trake (pI 4.8-5.5) prikazane na 3B su nespecifične, dobijene od preparata neuraminidaze. Fig.3C prikazuje analizu naelektrisanih izoformi TR55601-Lot 5 pomoću IEF 3-10 u pI gradijentnom gelu (IEF 3-10) praćeno Western blotting. Traka 1, IEF 3-10 marker; Traka 2, TR55601-Lot 5 (4µg); Traka 3, TR55601-Lot 5 (4µg); Traka 4, TR55601-Lot 4 (4µg); Traka 5, TR55601-Lot 4 (8µg); Traka 6, TR55601-Lot 3 (4µg); traka 7, TR55601-Lot 3 (8µg). Fig.3D ilustruje SDS-Western Blot analizu TR55601 Lot 5 u poređenju sa TR55601 Lot 4 i Fol-V.

Traka 1, protein marker; Traka 2: Lot 4, 500 ng; Traka 3: Lot 5, 1ul; Traka 4: prazna traka; Traka 5: Lot 4, 4ug; Traka 6: Lot 5, 15 ul; Traka 7: Fol-V, 673 ng; Traka 8: protein marker.

Fig.4 prikazuje rezultate Classic Steelman-Pohley bioispitivanja sa hCG uvećanjem mase jajnika kod nezrelih (22 dana starih) Sprague-Dawley ženki pacova. Mase jajnika su izmerene 72 sata posle doziranja. Podaci su predstavljeni kao prosečna ukupna masa jajnika ovarian dva jajnika SEM (n=5 po dozi, po grupi). Pacovi su stimulisani sa samo jednom injekcijom testnog artikla ili nosača, obogaćenom sa 40 IU hCG. Korišćene su seledeće grupe doziranja: Grupa 1 je primila hCG samo (bez FSH), Grupe 2-5 su primile TR55601 Lot 4 (0.33 µg, 1.0 µg, 3.33 µg, i 10 µg, respektivno sa leva na desno), Grupe 6-8 su primile Folltropin-V® (3,333 µg, 10,000 µg, i 30,000 µg respektivno sa leva na desno), i Grupa 9-10 je primila TR4401 (1.0 µg i 3.33 µg).

Fig.5 demonstrira protokol sinhronizovanja folikularnog talasa za superovulaciju, indukciju ovulacije i veštačke inseminacije sa fiksnim vremenom.8 injekcija Folltropin-VR (Bioniche) je zamenjeno sa jednom ili dvostrukom injekcijom TR55601.

Fig.6 prikazuje srednji broj folikula (3 do 5 mm u prečniku) tokom tretmana superstimulacije kod tovnih krava tretiranih sa 60 µg rFSH datih putem jedne I.M. injekcijom ili 300 mg Folltropin-V (Kontrola) datih u I.M. injekcijama dvaput dnevno tokom 4 dana (3 kombinovana eksperimenta).

Fig.7 prikazuje srednji broj folikula 6 do 8 mm u prečniku tokom tretmana superstimulacije kod tovnih krava tretiranih sa 60 µg rFSH datih putem jedne I.M. injekcije ili 300 mg Folltropin-V (Kontrola) datih u I.M. injekcijama dvaput dnevno tokom 4 dana (3 kombinovana eksperimenta).

Fig.8 prikazuje srednji broj folikula >9 mm u prečniku tokom tretmana superstimulacije kod tovnih krava tretiranih sa 60 µg rFSH datih putem jedne I.M. injekcije ili 300 mg Folltropin-V (Kontrola) datih u I.M. injekcijama dvaput dnevno tokom 4 dana (3 kombinovana eksperimenta).

Fig.9 prikazuje profile srednjih prečnika svih folikula ≥3 mm u prečniku tokom tretmana superstimulacije kod tovnih krava tretiranih sa 60 µg rFSH datih putem jedne I.M. injekcije ili 300 mg Folltropin-V (Kontrola) datih u I.M. injekcijama dvaput dnevno tokom 4 dana (3 kombinovana eksperimenta).

Fig.10A prikazuje poređenje u cAMP proizvodnji za umetak u humanoj alfa subjedinici (A2), umetak bez amino-terminalnog valina (Umetak 2), 5 supstitucija argininom samo bez umetka (5R) i kontrolu podloge samo. Fig.10B prikazuje EC50 za tri testirana konstrukta.

Fig.11A prikazuje poređenje cAMP proizvodnje kao odgovor na humanu modifikovanu alfa subjedinicu sa umetkom SEQ ID NO: 1 i goveđe modifikovane alfa subjedinice koje nemaju umetak. Fig.11B prikazuje poređenje cAMP proizvodnje kao odgovor na humanu modifikovanu alfa subjedinicu i goveđe subjedinice sa i bez raznih umetaka.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0016] Ovaj pronalazak obezbeđuje modifikovane superaktivne molekule glikoproteinskih hormona koji pokazuju iznenađujuć poboljšanu potenciju i povećan biološki poluživot u poređenju sa nihovim dvojnicima divljeg tipa. Biti modifikovan znači da, dok protein sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje od glikoproteinskih hormona divljeg tipa, sekvenca je promenjena tako da nije identična poznatoj sekvenci glikoproteinskih hormona drugih vrsta. Superaktivnost može da se oceni prema različitim parametrima, uključujući potenciju i efikasnost. Potencija je parametar bioaktivnosti koji je odredđen merenjem polovine maksimalnog odgovora. Razlike u potenciji određene su poređenjem vrednosti odgovora glikoproteinskih hormona analoga na pola puta između osnovne linije i maksimuma (EC50) versus onog glikoproteinskih hormona divljeg tipa. Odgovori glikoproteinskih hormona mogu da se mere in vitro korišćenjem prečišćenih proteina, ili se mogu proceniti posle prolazne transfekcije nukleinske kiseline koja kodira modifikovani protein. Odgovori glikoproteinskih hormona mogu takođe da se izmere in vivo, tj. kod životinje koja reaguje na pomenuti analog glikoproteinskog hormona. Ti odgovori obuhvataju bilo koji poznati ćelijski ili biološki i kvantitativni ili kvalitativni odgovor glikoproteinskog hormona koji se vezuje za njegov receptor, npr. cAMP proizvodnja, sinteza proteina kao što su progesteron, brzina oplodnje, brzina formiranja blastocista, razvoj embriona po oplođenom oocitu, itd. Efikasnost (Vmax) ili maksimalni odgovor je drugi parametar bioaktivnosti. Kao što je opisano ovde, parametri bioaktivnosti mogu da variraju zavisno od broja receptora i vezivanja receptora u ispitivanoj ćelijskoj liniji. U sistemima sa nižim brojevima receptora ili oštećenim vezivanjem, razlike su jasnije u pogledu Vmax (efikasnost). U sistemima gde su receptori prekomerno eksprimirani, razlike u potenciji su vidljivije.

[0017] Na primer, u slučajevima gde modifikovan glikoproteinski hormon predstavlja modifikovan FSH ili CG molekul, in vivo kvantitativni i kvalitativni parametri kao što su količina oocita, brzina oplodnje i brzine formiranje blastocista i embriona mogu da se izmere pri maksimalnoj efektivnoj dozi za broj oocita. Maksimalna efektivna doza za broj oocita je optimalna količina superaktivnog FSH i za količinu i za kvalitet oocit. Maksimalna efektivna doza za broj oocita zavisi od mase životinje i brzine metabolizma. Na primer, maksimalna efektivna doza za veću životinju sa manjom brzinom metabolizma je veća od maksimalne efektivne doze za manju životinju sa većom brzinom metabolizma. Maksimalna efektivna doza je određena empirijski za svaku životinju.

[0018] Međutim, bez obzira na korišćen sistem, modifikovani proteini superaktivnih glikoproteinskih hormona ovog pronalaska mogu da demonstriraju najmanje oko 2- do 10-struko povećanje u potenciji ili najmanje oko 20-struko, 30-struko, 40-struko, 50-struko, 60-struko, 70-struko, 80-struko, 90-struko ili čak 100-struko povećanje u potenciji u odnosu na dvojnik divljeg tipa, ili oko 2 do 10% povećanje u maksimalnoj efikasnosti, ili najmanje 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ili čak 100% povećanje u maksimalnoj efikasnosti u odnosu na dvojnik divljeg tipa. Superaktivni analozi ovog pronalaska mogu takođe da obezbede oko petostruko do desetostruko povećanje u potenciji ili 5% do 10% povećanje u maksimalnoj efikasnosti u poređenju sa FSH divljeg tipa. Neki od modifikovanih proteina ovog pronalaska mogu da demonstriraju najmanje oko tridesetostruko do pedesetostruko povećanje u potenciji ili 30% do 50% povećanje u maksimalnoj efikasnosti u poređenju sa divljim tipom. Tako, modifikovani proteini glikoproteinskih hormona ovog pronalaska mogu da budu korisni za lečenje subjekata sa malim brojem receptora ili nedostacima u receptorskom odgovoru, budući da modifikovani proteini ovog pronalaska mogu da održe najmanje 10-struko povećanje u potenciji ili 10% povećanje u maksimalnoj efikasnosti čak u sistemima sa malim brojem ili odgovorom receptora.

[0019] Brzina apsorpcije modifikovanog superaktivnog glikoproteinskog hormona može da rezultuje povećanim trajanjem dejstva. Analog modifikovanog glikoproteinskog hormona sa smanjenom brzinom apsorpcije i povećanim trajanjem dejstva može da bude koristan za hiposenzitivne subjekte, kao što su oni koji boluju od poremećaja plodnosti. Brzina apsorpcije izmerena je pomoću Ka. Brzina eliminacije je izmerena pomoću Ke.

[0020] Modifikovani molekuli glikoproteinskih hormona ovog pronalaska uključuju modifikovane proteine vrsta odabranih iz grupe koju čine goveđi, konjski, svinjski, ovčiji. Glikoproteinski hormon riba (takođe poznat kao GTH-1) može da se koristi u akvakulturi, tj., kako bi se pomogao rast ugroženih ili ostalih vrsta riba u zarobljeništvu. Ostale vrste modifikovanih glikoproteinskih hormona mogu da se koriste u poljoprivrednom uzgoju, i dalje u laboratorijskom podešavanju za testiranje efekata različitih kombinovanih mutacija na razna glikoproteinski hormon-povezana stanja kod mužjaka i ženki.

[0021] Modifikovani molekuli glikoproteinskih hormona ostalih vrsta imaju supstitucije na položajima koji odgovaraju onima u modifikovanim humanim (npr. Tabela 1), goveđim (videti Tabelu 2), ovčijim, konjskim i svinjskim molekulima glikoproteinskih hormona opisanih ovde, koji mogu da se identifikuju upotrebom bilo kog programa poravnanja, uključujući, ali bez ograničenja na DNASIS, ALIONment, SIM i GCG programe kao što su Gap, BestFit, FrameAlign i Compare.

[0022] Modifikovani molekuli glikoproteinskih hormona ovog pronalaska obuhvataju najmanje modifikovanu alfa-subjedinicu za koju je tražena zaštita. Osnovne aminokiseline mogu da se uvedu na položajima koji odgovaraju položajima 15, 17, 20 i 24 goveđe alfa divljeg tipa (SEQ ID NO: 2), svinjske alfa divljeg tipa (SEQ ID NO: 5) i ovčije alfa divljeg tipa (SEQ ID NO: 3), i položajima 15, 20 i 24 konjske alfa divljeg tipa (SEQ ID NO: 4). Glutamatni ostatak na položaju 18 (goveđi, svinjski, ovčiji i konjski) može takođe da bude supstituisan sa osnovnom aminokiselinom. U nekim primerima izvođenja, osnovna aminokiselina može da bude arginin ili histidin. U nekim primerima izvođenja, osnovna aminokiselina može da bude arginin.

[0023] Peptid sa sekvencom NVTINV (SEQ ID NO: 1) ili TNVTINV (SEQ ID NO: 12) ili VNVTINVT (SEQ ID NO: 20) može da bude umetnut između aminokiselina D3 i Q5 humane alfa subjedinice (SEQ ID NO: 6) i između F6 i T7 goveđih, svinjskih, ovčijih i konjskih alfa subjedinica. Alternativno, goveđa, svinjska, ovčija ili konjska alfa subjedinica modifikovanog glikoproteinskog hormona može da uključuje umetak NV između F6 i T7 plus umetak INV između T7 i T8. Modifikovani proteini ovog pronalaska mogu takođe da sadrže dalje supstitucije, naročito konzervativne supstitucije koje ne menjaju poboljšana svojstva proteina. Obično, međutim, ti modifikovani proteini sadržaće manje od pet supstitucija na položajima koji se razlikuju od onih navedenih gore, i mogu da imaju potpuni identitet aminokiselinske sekvence sa odgovarajućom alfa glikoproteinski hormon divljeg tipa u položajima koji se razlikuju od položaja navedenih gore.

[0024] Osnovne aminokiseline obuhvataju aminokiseline lizin, arginin i histidin, i bilo koju drugu osnovnu aminokiselinu koja može da bude modifikacija bilo kojim od ove tri aminokiseline, sintetičke osnovne aminokiseline koje se ne nalaze normalno u prirodi, ili bilo koju drugu aminokiselinu koja je pozitivno naelektrisna u neutralnoj pH. Osnovne aminokiseline, među ostalima, odabrane su iz grupe koju čine lizin i arginin.

[0025] Primeri modifikovanih alfa molekula koji imaju supstitucije osnovnom aminokiselinom i umetak peptida navedene su u SEQ ID NO: 11 (humana), SEQ ID NO: 7 (goveđa), SEQ ID NO: 8 (ovčija), SEQ ID NO: 10 (svinjska), i SEQ ID NO: 9 (konjska). Ovaj pronalazak obezbeđuje za modifikovane glikoproteine sa aminokiselinskim sekvencama sa najmanje 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili većim identitetom sa bilo kojom od SEQ ID NO: 7 do 10.

[0026] Modifikovane alfa subjedinice modifikovanih proteina glikoproteinskih hormona, opisanih i/ili za koje je tražena zaštita ovde, mogu takođe da imaju alfa subjedinicu koja obuhvata dve, tri, četiri ili pet supstitucija osnovnom aminokiselinom. Supstituisane aminokiseline mogu da budu lizinski ostaci, glutamatni ostaci, prolinski ostaci ili glutaminski ostaci. Na primer, u goveđim alfa subjedinicima divljeg tipa, jedan ili više od lizina na položajima 15, 17, 20 i 24 može da bude supstituisano, kao i glutamat na položaju 18 sa osnovnom aminokiselinom, kao što je arginin i histidin. U humanim alfa subjedinicama divljeg tipa, jedan ili više od glutamina na položajima 13 i 20 može da bude supstituisano, kao i glutamat na položaju 14 i prolin na položaju 16 sa osnovnom aminokiselinom, kao što je arginin i histidin. U svinjskim alfa subjedinicama divljeg tipa, jedan ili više od lizina na položajima 15, 17, 20 i 24 može da bude supstituisano, kao i glutamat na položaju 18 sa osnovnom aminokiselinom, kao što je arginin i histidin. U ovčijim alfa subjedinicima divljeg tipa, jedan ili više od lizina na položajima 15, 17, 20 i 24 može da bude supstituisano, kao i glutamat na položaju 18 sa osnovnom aminokiselinom, kao što je arginin i histidin. U konjskim alfa subjedinicama divljeg tipa, jedan ili više od lizina na položajima 15, 20 i 24 može da bude supstituisano, kao i glutamat na položaju 18 sa osnovnom aminokiselinom, kao što je arginin i histidin.

[0027] Putem primera, dalje modifikovane goveđe alfa subjedinice predstavljene su u sekvencama kao što je navedeno u SEQ ID NO: 13 do 19 i 22. Ovaj pronalazak obezbeđuje modifikovane glikoproteine sa aminokiselinskim sekvencama sa najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili većim identitetom sa bilo kojom od SEQ ID NO: 13 do 19 i 22.

[0028] Putem primera, dalje modifikovane konjske alfa subjedinice predstavljene su u sekvencama kao što je navedeno u SEQ ID NO: 38 do 42. Ovaj pronalazak obezbeđuje modifikovane glikoproteine sa aminokiselinskim sekvencama sa najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili većim identitetom sa bilo kojom od SEQ ID NO: 43 do 44.

[0029] Dalje modifikovane alfa subjedinice mogu da budu konstruisane poređenjem aminokiselinskih sekvenci alfa subjedinica od interesa sa onima ostalih vrsta kako bi se identifikovali odgovarajući osnovni ostaci u proteinima ostalih vrsta. Ti postupci opisani su u U.S. Patent 6,361,992. Može takođe da se razmatra relativna biološka aktivnost glikoproteinskog hormona iz različitih vrsta kao koje vrste izabrati za poređenje i supstituciju. Dalje, modelovanje homologije na osnovu strukture povezanih glikoproteinskih hormona je korisno radi identifikovanja površinski izloženih aminokiselinih ostataka. Da bi se modifikovali dodatni položaji aminokiselina, sekvence glikoproteinskih hormona od ljudi i nehumane mogu da se poravnjaju upotrebom standardnih kompjuterskih softverskih programa kao što su DNASIS (Hitachi Software Engineering) ili bilo koji od ostalih programa za poravnanje navedenih gore, uključujući, ali bez ograničenja na, ALIONment, SIM i GCG programe kao što su Gap, BestFit, FrameAlign i Compare. Aminokiselinski ostaci koji se razlikuju između humanog i ne-humanog glikoproteinskog hormona onda mogu da budu supstituisani upotrebom jedne od gore navedenih tehnika, i dobijeni glikoproteinski hormon ispitivan na svoju potenciju upotrebom jednog od ovde navedenih ispitivanja.

[0030] Prema tome, ovaj pronalazak takođe obezbeđuje modifikovan FSH protein koji ima povećanu potenciju u odnosu na FSH divljeg tipa od istih vrsta koje obuhvataju modifikovane alfa subjedinice opisane ovde.

[0031] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje modifikovan LH protein koji ima povećanu potenciju u odnosu na LH divljeg tipa od istih vrsta koje obuhvataju modifikovane alfa subjedinice opisane ovde.

[0032] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje modifikovan TSH protein koji ima povećanu potenciju u odnosu na TSH divljeg tipa od istih vrsta koje obuhvataju modifikovane alfa subjedinice opisane ovde.

[0033] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje modifikovan CG protein koji ima povećanu potenciju u odnosu na CG divljeg tipa od istih vrsta koje obuhvataju modifikovane alfa subjedinice opisane ovde.

[0034] Ovaj pronalazak takođe obuhvata fragmente analoga opisanih ovde koji imaju aktivnost ili superagonista ili antagonista. Na primer, fragmenti modifikovanih alfa lanaca ovog pronalaska mogu da se koriste ili sami ili u kombinaciji sa ili fragmentom ili beta lancom cele dužine kako bi se obrazovala jedinjenja superagonista. U nekim slučajevima, fragmenti modifikovani molekuli alfa subjedinica ovog pronalaska mogu takođe da se koriste kao antagonisti, na primer, da se ograniči trajanje aktivnosti nekog terapeutika glikoproteinskog hormona posle davanja.

[0035] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju modifikovane glikoproteinske hormone opisane ovde. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptide sa konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama. Nukleinske kiseline ovog pronalaska mogu da kodiraju polipeptide koji transportuju šećer. Izolovane nukleinske kiseline mogu da imaju najmanje oko 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 85%, 90%, 95%, ili 99% identiteta sekvenci sa gore identifikovanim sekvencama. Izolovane nukleinske kiseline mogu da kodiraju neki polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, ili 99% identiteta sekvenci sa aminokiselinskim sekvencama kodiranim gore navedenim identifikacionim brojevima. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira neki transporter može da hibridizuje do gore identifikovanih sekvenci nukleinske kiseline.

[0036] Nukleinska kiselina koja kodira modifikovane proteine glikoproteinskih hormona može da bude genetski fuzirana sa kontrolnim sekvencama ekspresije radi ekspresije. Pogodne kontrolne sekvence ekspresije uključuju promotere koji mogu da se primene u ciljnom organizmu domaćina. Ti promoteri dobro su poznati stručnjacima u tehnici za različite domaćine od prokariotskih i eukariotskih organizama i opisani su u literaturi. Na primer, ti promoteri mogu da budu izolovani iz gena koji se javljaju u prirodi ili mogu da budu sintetički ili himerni promoteri.

[0037] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje ekspresione kasete za umetanje nukleinske kiseline koja kodira neki modifikovani protein glikoproteinskog hormona u ciljne molekule nukleinske kiseline kao što su vektori. Za ovu svrhu, ekspresiona kaseta je obezbeđena sa nukleotidnim sekvencama na 5'- i 3'-flankirajućim regionima da bi se olakšalo uklanjanje iz i umetanje u specifične položaje sekvenci poput, na primer, mesta prepoznavanja restrikcionih enzima ili ciljnih sekvenci za homologu rekombinaciju kao, npr. katalizovanu rekombinazama. Pored molekula nukleinske kiseline ili ekspresione kasete ovog pronalaska, vektor može da sadrži dalje gene kao što su marker geni koji omogućavaju selekciju pomenutog vektora u pogodnoj ćeliji domaćina i pod pogodnim uslovima. Uopšteno, vektor takođe sadrži jedno ili više porekla replikacije. Vektori mogu takođe da obuhvataju terminator sekvence da bi se ograničila dužina transkripcije izvan nukleinske kiseline koja kodira transportere ovog pronalaska.

[0038] Povoljno, molekuli nukleinske kiseline sadržani u vektorima radno su povezani sa kontrolnim sekvencama ekspresije omogućavajući ekspresiju, tj. osiguravajući transkripciju i sintezu translatabilne RNK, u prokariotskim ili eukariotskim ćelijama.

[0039] Pojam izolovan odnosi se na molekule odvojene od ostalih ćelijskih/tkivnih konstituenata (npr. DNK ili RNK), koji su prisutni u prirodnom izvoru makromolekula. Pojam izolovan kao što se ovde koristi takođe se odnosi na nukleinsku kiselinu ili peptid koji je suštinski bez ćelijskog materijala, virusnog materijala, i podloge za kulturu kada se proizvodi tehnikama rekombinantne DNK, ili koji je suštinski bez hemijskih prekursora ili ostalih hemikalija kada se hemijski sintetizuje. Štaviše, izolovana nukleinska kiselina ili peptid može da uključuje fragmente nukleinskih kiselinih ili peptida koji se ne javljaju u prirodi kao fragmenti i ne mogu se naći u prirodnom stanju.

[0040] Pojmovi plazmid i vektor koriste se naizmenično jer je plazmid najčešće korišćen oblik vektora. Međutim, namera je da ovaj pronalazak uključuje te ostale oblike ekspresionih vektora koji služe ekvivalentnim funkcijama i koji su poznati u tehnici kasnije tome. Vektor može da bude bilo koji od većeg broja nukleinskih kiselina u kojima željena sekvenca može da se umetne restrikcijom i ligacijom za transport između različitih genetskih sredina ili za ekspresiju u ćeliji domaćina. Vektori se obično sastoje od DNK, iako su RNK vektori takođe dostupni. Vektori uključuju, ali bez ograničenja na, plazmide i fagmide. Vektor za kloniranje je jedan koji može da se replikuje u ćeliji domaćian, i koji je dalje okarakterisan sa jednim ili više restrikcionih mesta endonukleaze na kojima vektor može d a bude isečen na određen način i u koji željena DNK sekvenca može da bude podvrgnuta ligaciji tako da novi rekombinantni vektor zadržava njegovu sposobnost da se replikuje u ćeliji domaćina. U slučaju plazmida, replikacija željene sekvence može da se javi više puta kako se plazmid povećava u broju kopija unutar bakterije domaćina ili samo jedanput po domaćinu pre nego domaćin reprodukuje mitozom. U slučaju faga, replikacija može da se javi aktivno tokom litične faze ili pasivno tokom lizogene faze.

[0041] Vektori mogu dalje da sadrže promoter sekvencu. Promoter može da uključuje neprevedenu sekvence nukleinske kiseline obično smeštenu uzvodno od kodirajućeg regiona koji sadrži mesto za inicijaciju transkripcije nukleinske kiseline. Promoter region može takođe da uključuje ostale elemente koji deluju kao regulatori genske ekspresije. U daljim primerima izvođenja ovog pronalaska, ekspresioni vektor sadrži dodatni region da pomogne u izboru ćelija koji imaju ekspresioni vektor inkorporiran. Promoter sekvenca je često vezana (zaključno) na svom 3' kraju mestom inicijacije transkripcije i prostire se uzvodno (5' smer) da uključi minimalan broj baza ili elemenata potrebnih da se započne transkripcija na nivoima detektabilnim iznad pozadine. Unutar promoter sekvence nalaziće se mesto inicijacije transkripcije, kao i vezujući domeni proteina odgovorni za vezivanje RNK polimeraze.

Eukariotski promoteri često će, ali ne uvek, da sadrže TATA boksove i CAT boksove. Aktivacija promotera može da bude specifična za određene ćelije ili tkiva, na primer faktorima transkripcije ekspresioniranim samo u određenim tkivima, ili promoter može da bude sveprisutan i može da se eksprimira u većini ćelija ili tkiva.

[0042] Vektori mogu dalje da sadrže jednu ili više marker sekvenci pogodnih za upotrebu u identifikaciji i selekciji ćelija koje su transformisane ili transfektovane vektorom. Markeri uključuju, na primer, gene koji kodiraju proteine koji povećavaju ili smanjuju ili otpornost ili osetljivost na antibiotike ili ostala jedinjenja, gene koji kodiraju enzime čije su aktivnosti detektabilne standardnim ispitivanjima poznatim u tehnici (npr., β-galaktozidaza ili alkalna fosfataza), i gene koji vidljivo utiču na fenotip transformisanih ili transfektovanih ćelija, domaćina, kolonija ili plakova. Vektori mogu da budu oni koji imaju sposobnost autonomne replikacije i ekspresije proizvoda strukturnog gena prisutnih u DNK segmentima sa kojima su radno spojeni. Ekspresioni vektor je jedan u koji željena sekvenca nukleinske kiseline može da se umetne restrikcijom i ligacijom tako da je radno spojena ili radno povezana sa regulatornim sekvencama i može da se eksprimira kao RNK transkript. Ekspresija se odnosi na transkripciju i/ili translaciju nekog endogenog gena, transgena ili kodirajućeg regiona u ćeliji.

[0043] Kodirajuća sekvenca i regulatorna sekvenca radno su spojene kada su kovalentno vezane na takav način da stave ekspresiju ili transkripciju kodirajuće sekvence pod uticaj ili kontrolu regulatornih sekvenci. Ako je poželjno da kodirajuće sekvence budu prevedene u funkcionalni protein, kaže se da su dve DNK sekvence radno spojene ako indukcija promotera u 5' regulatornim sekvencama rezultuje transkripcijom kodirajuće sekvence i ako priroda veze između dve DNK sekvence (1) ne rezultuje uvođenjem mutacije pomeranja okvira čitanja, (2) ne ometa sposobnost promoter regiona da usmeri transkripciju kodirajućih sekvenci, ili (3) ne ometa sposobnost odgovarajućeg RNK transkripta da se prevede u neki protein. Tako, promoter region biće radno vezan za kodirajuću sekvencu ako je promoter region bio sposoban izvrši transkripciju takve DNK sekvence tako da dobijeni transkript može da bude preveden u željeni protein ili polipeptid.

[0044] Neki aspekti ovog pronalaska uključuju transformaciju i/ili transfekciju nukleinskih kiselina.

Transformacija je uvođenje egzogene ili heterologe nukleinske kiseline u unutrašnjost prokariotske ćelije. Transfekcija je uvođenje egzogene ili heterologe nukleinske kiseline u unutrašnjost eukariotske ćelije. Transformacija ili transfekcija nukleinske kiseline može ili ne mora da bude integrisana (kovalentno vezan) u hromozomalnu DNK čineći genom ćelije. U prokariotama, na primer, transformacija nukleinske kiseline može da se održava na epizomalnom elementu kao što je plazmid ili virusni vektor. Što se tiče eukariotskih ćelija, stabilno transfektovana ćelija je ona u kojoj je transfektovanje nukleinske kiseline postalo integrisano u hromozom tako da je nasleđeno od strane ćelija ćerki preko replikacije hromozoma. Ova stabilnost je demonstrirana sposobnošću eukariotske ćelije da uspostavi ćelijske linije ili klonove koji se sastoje od populacije ćelija čerki koje sadrže transfektovanu nukleinsku kiselinu.

[0045] Postoje brojni E. coli (Escherichia coli) ekspresioni vektori poznati prosečnom stručnjaku u tehnici koji su korisni za ekspresiju umetka nukleinske kiseline. Ostali mikrobni domaćini pogodni za upotrebu uključuju bacile, kao što su Bacillus subtilis, i ostale enterobacteriaceae, kao što su Salmonella, Serratia, i različite vrste Pseudomonas. U ovim prokariotskim domaćinima mogu da se načine ekspresioni vektori, koji će obično da sadrže kontrolne sekvence ekspresije kompatibilne sa ćelijom domaćina (npr., poreklo replikacije). Dodatno, bilo koji broj različitih dobro poznatih promotera biće prisutan, kao što su laktozni promoter sistem, triptofan (Trp) promoter sistem, beta-laktamaza promoter sistem, ili promoter sistem iz fag lambda. Promoteri će obično da kontrolišu ekspresiju, opciono sa operator sekvencom, i imaju sekvence mesta vezivanja ribozoma na primer, za inicijaciju i završetak transkripcije i translacije. Po potrebi, amino terminalni metionin može da bude obezbeđen umetanjem Met kodona 5' i u okvir sa nizvodnim umetkom nukleinske kiseline. Takođe, karboksil-terminalni produžetak umetka nukleinske kiseline može da se ukloni upotrebom standardnih procedura oligonukleotidne mutageneze.

[0046] Dodatno, ekspresija kvasca može da se koristi. Postoji nekoliko prednosti ekspresionih sistema kvasaca. Prvo, opstoji dokaz da proteini proizvedeni u sekrecionim sistemima kvasaca pokazuju ispravno disulfidno uparivanje. Drugo, post-translaciona glikozilacija se efikasno izvodi sekrecionim sistemima kvasaca. Saccharomyces cerevisiae vodeći region pre-pro-alfa-faktora (kodiran MF"-1 genom) se routinski koristi da usmeri izlučivanje proteina iz kvasca. (Brake, Proc. Nat. Acad. Sci., 81:4642-4646 (1984)). Vodeći region pre-pro-alfa-faktora sadrži signalni peptid i pro-segment koji uključuje sekvencu prepoznavanja za proteazu kvasca kodiranu KEX2 genom: ovaj enzim cepa prekursor protein na karboksilnoj strani Lys-Arg dipeptidne signalne sekvence cepanja. FSH kodirajuća sekvenca može da bude fuzionisana u okviru sa vodećim regionom pre-pro-alfa-faktora. Ovaj konstrukt onda se stavlja pod kontrolu snažnog promotera transkripcije, kao što je promoter alkoholne dehidrogenaze I ili glikolitički promoter. Kodirajuća sekvenca nukleinske kiseline je praćena kodonom završetka translacije koji je praćen signalima završetka transkripcije. Alternativno, kodirajuće sekvence nukleinskih kiselina mogu da budu fuzionisane sa drugom proteinskom kodirajućom sekvencom, kao što je Sj26 ili beta.-galaktozidaza, koja može da se koristi da se olakša prečišćavanje fuzionog proteina afinitetnom hromatografijom. Umetanje mesta cepanja proteaze da se odvoje komponente fuzionog proteina je primenljivo na konstrukte korišćene za ekspresiju u kvascu. Efikasna post-translaciona glikozilacija i ekspresija rekombinantnih proteina takođe može da se postigne u sistemima Bakulovirusa.

[0047] Ćelije sisara dozvoljavaju ekspresiju proteina u sredini koja favorizuje značajane posttranslacione modifikacije kao što su savijanje i cisteinsko uparivanje, dodavanje složenih struktura ugljenih hidrata, i izlučivanje aktivnog proteina. Vektori korisni za ekspresiju aktivnih proteina u ćelijama sisara karakterišu se umetanjem coding sekvence koja kodira proteine između snažnog virusnog promotera i signala poliadenilacije. Vektori mogu da sadrže gene koji dodeljuju otpornost na higromicin, otpornost na gentamicin, ili ostale gene ili fenotipove pogodne za upotrebu kao selektabilni markeri, ili otpornost na metotreksat za gensku amplifikaciju. Sekvenca koja kodira himerni protein može da se uvede u ćelijsku liniju jajnika kineskog hrčka (CHO) upotrebom vektora koji kodira otpornost na metotreksat, ili ostale ćelijske linije upotrebom pogodnih selekcionih markera. Prisustvo vektora DNK u transformisanim ćelijama može da se potvrdi analizom Southern blot. Proizvodnja RNK koji odgovara umetanje kodirajuće sekvence može da se potvrdi analizom Northern blot. Brojne ostalie pogodne ćelijske linije domaćina koje mogu da izlučuju intaktne humane proteine su razvijene u tehnici, i uključuju CHO ćelijske linije, HeLa ćelije, ćelijske linije mijeloma, Jurkat ćelije, itd. Ekspresioni vektori za ove ćelije mogu da uključuju kontrolne sekvence ekspresije, kao što su poreklo replikacije, promoter, poboljšivač, i neophodna mesta obrade informacija, kao što su mesta vezivanja ribozoma, mesta RNK splajsovanja, mesta poliadenilacije, i terminator sekvence transkripcije. Primeri kontrolnih sekvenci ekspresije su promoteri dobijeni iz gena imunoglobulina, SV40, Adenovirusa, Goveđeg Papiloma Virusa, itd. Vektori koji sadrže segmente nukleinske kiseline od interesa mogu da se prenesu u ćeliju domaćina dobro poznatim postupcima, koji se menjaju zavisno od tipa ćelijskog domaćina. Na primer, transformacija kalcijum hlorida obično se koristi az prokariotske ćelije, dok kalcijum fosfat, DEAE dektran, ili transfekcija posredovana lipofekcijom ili elektroporacija može da se koristi za ostale ćelijske domaćine.

[0048] Alternativni vektori za ekspresiju gena u ćelijama sisara, oni slični onima razvijenim za ekspresiju humanog gama-interferona, tkivno plazminogenog aktivatora, Faktora VIII koagulacije, površinski antigen hepatitis B virusa, proteaza Nexinl, i eozinofilnog glavnog osnovnog proteina, mogu da se koriste. Dalje, vektor može da uključuje CMV promoter sekvence i signal poliadenilacije dostupan za ekspresiju umetnutih nukleinskih kiselina u ćelijama sisara (kao što je COS-7).

[0049] Ekspresija gena ili hibridnog gena može da bude ili in vivo ili in vitro. In vivo sinteza obuhvata transformisanje prokariotskih ili eukariotskih ćelija koje mogu da služe kao ćelije domaćina za vektor. Alternativno, ekspresija gena može da se javi u in vitro ekspresionom sistemu. Na primer, in vitro transkripcioni sistemi su komercijalno dostupni koji se rutinski koriste za sintezu relativno velikih količina mRNK. U zim in vitro transkripcionim sistemima, nukleinska kiselina koja kodira glikoproteinski hormon biće klonirana u ekspresionom vektoru susednom promoteru transkripcije. Na primer, Bluescript II kloniranje i ekspresioni vektori sadrže višestruka mesta za kloniranje koja su flankirana snažnim prokariotskim promoterima transkripcije (Stratagene). Dostupni su kompleti koji sadrže sve potrebne reagense za in vitro sintezu RNK iz DNK templata kao što su Bluescript vektori (Stratagene). RNK proizveden in vitro sistemom kao što je ovaj može dalje da se prevede in vitro kako bi se proizveo željeni glikoproteinski hormon (Stratagene).

[0050] Drugi postupak proizvodnje glikoproteinskog hormona je da se povežu peptidi ili polipeptidi zajedno tehnikama hemije proteina. Na primer, peptidi ili polipeptidi mogu da se hemijski sintetizuju upotrebom trenutno dostupne laboratorijske opreme upotrebom ili Fmoc (9-fluorenilmetiloksikarbonil) ili Boc (tert-butiloksikarbonoil) hemije (Applied Biosystems). Prosečan stručnjak u tehnici može lako da proceni da peptid ili polipeptid koji odgovara hibridnom glikoproteinskom hormonu može da se sintetizuje standardnim hemijskim reakcijama. Na primer, peptid ili polipeptid može da se sintetizuje i ne cepa se iz smole njegove sinteze dok drugi fragment hibridnog peptida može da se sintetizuje i naknadno cepa iz smole, pri čemu se izlaže terminalna grupa koja je funkcionalno blokirana na drugom fragmentu. Reakcijama peptidne kondenzacije, ova dva fragmenta mogu kovalentno da se spoje preko peptidne veze na njihovim karboksil i amino krajevima, respektivno, kako bi se obrazovao hibridni peptid. (Grant, Synthetic Peptides: A User Guide, W.H. Freeman (1992) i Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag (1993)). Alternativno, peptid ili polipeptid može nezavisno da se sintetizuje in vivo kao što je opisano gore. Jednom izolovani, ovi nezavisni peptidi ili polipeptidi mogu da se povežu kako bi se obrazovao glikoproteinski hormon preko sličnih reakcija peptidne kondenzacije. Na primer, enzimska ili hemijska ligacija kloniranih ili sintetičkih peptidnih segmenata može da omogući relativno kratke peptidne fragmente koji se spajaju kako bi se proizveli veći fragmenti peptida, polipeptidi ili celi domeni proteina (Abrahmsen, Biochemistry, 30:4151 (1991); Dawson, Science, 266:776-779 (1994)).

[0051] Modifikovani glikoproteinski hormoni ovog pronalaska mogu da budu rekombinantni proteini dobijeni kloniranjem nukleinskih kiselina koje kodiraju polipeptid u ekspresionom sistemu koji može da proizvodi njegove polipeptidne fragmente. Na primer, može da se odredi aktivni domen modifikovane alfa subjedinice koja, zajedno sa beta subjedinicom, može da uzajamno deluje sa receptorom glikoproteinskog hormona i izazove biološki efekat povezan sa glikoproteinskim hormonom. U jednom primeru, aminokiseline za koje je otkriveno da ne doprinose niti aktivnosti niti specifičnosti ili afinitetu vezivanja glikoproteinskog hormona mogu da se obrišu bez gubitka odgovarajuće aktivnosti.

[0052] Na primer, amino ili karboksil-terminalne aminokiseline mogu da se redom uklone ili iz prirodnog ili iz modifikovanog glikoproteinskog hormona, a odgovarajuća aktivnost testirana u jednom od mnogih dostupnih ispitivanja opisan gore. U drugom primeru, modifikovani proteini ovog pronalaska mogu da imaju deo ili amino terminalnih ili karboksil terminalnih aminokiselina, ili čak unutrašnji region hormona, zamenjen sa polipeptidnim fragmentom ili drugim ostatkom, kao što je biotin, koji može da olakša prečišćavanje modifikovanog glikoproteinskog hormona. Na primer, modifikovan glikoprotein može da bude fuziran za maltoza-vezujući protein, bilo putem hemije peptida kloniranja odgovarajućih nukleinskih kiselina koje kodiraju dva polipeptidna fragmenta u ekspresioni vektor tako da ekspresija kodirajućeg regiona rezultuje hibridnim polipeptidom. Hibridni polipeptid može da bude prečišćen prema afinitetu njegovim propuštanjem kroz amiloza-afinitetnu kolonu, i modifikovan glikoprotein može onda da se odvoji od maltoza-vezujućeg regiona cepanjem hibridnog polipeptida sa specifičnim faktorom proteaze Xa.

[0053] Aktivni fragmenti modifikovanih molekula glikoproteinskih hormona ovog pronalaska mogu takođe da se sintetizuju direktno ili dobiju hemijskim ili mehaničkim prekidom većeg glikoproteinskog hormona. Aktivni fragment je određen kao aminokiselinska sekvenca od najmanje oko 5 uzastopnih aminokiselina dobijenih iz aminokiselinske sekvence koja se javlja u prirodi, koja ima relevantnu aktivnost, npr., aktivnost vezivanja ili regulatornu aktivnost. Fragmenti, bilo da su vezani za ostale sekvence ili ne, mogu takođe da uključuju umetanja, delecije, supstitucije, ili ostale odabrane modifikacije određenih regiona ili specifičnih aminokiselinih ostataka, pod uslovom da aktivnost peptida nije značajno izmenjena ili pogoršana u poređenju sa modifikovanim glikoproteinskim hormonom. Ove modifikacije mogu da obezbede neko dodatno svojstvo, kao što su da se uklone/dodaju aminokiseline koje mogu da se disulfidno vezuju, da se poveća njihova bio-dugovečnost, itd. U bilo kom slučaju, peptid mora da ima bioaktivno svojstvo, kao što je aktivnost vezivanja, regulacija vezivanja na vezujućem domenu, itd. Funkcionalni ili aktivni regioni glikoproteinskog hormona mogu da se identifikuju mutagenezom specifičnog regiona hormona, praćeno ekspresijom i testiranjem eksprimiranog polipeptid. Ti postupci očigledni su prosečnom stručnjaku u tehnici i mogu da uključuju mesto-specifičnu mutagenezu nukleinske kiseline koja kodira receptor.

[0054] Ovaj pronalazak takođe obuhvata fuzione proteine i himerne proteine koji obuhvataju mutacije opisan ovde, uključujući, na primer, fuzije sa FSH glikoproteinom. Taj fuzioni protein može da bude izrađen ligacijom odgovarajućih sekvenci nukleinske kiseline koje kodiraju željene aminokiselinske sekvence međusobno postupcima poznatim u tehnici, u ispravnom kodirajućem okviru, i eksprimiranjem fuzionog proteina bilo kojim od sredstava opisanih gore. Alternativno, takav fuzioni protein može da bude izrađen tehnikama sinteze proteina, na primer, upotrebom sredstva za sintezu peptida. Analogi jednog lanca i himerni proteini ovog pronalaska mog uda ugrade peptidni linker između alfa i beta subjedinica, ili između različitih delova himernog proteina.

Karakterizacija superagonista glikoproteinskih hormona

[0055] Efekat modifikacije ili modifikacije glikoproteinskih hormona divljeg tipa opisanih ovde može se utvrditi na razne načine. Na primer, promene na drugim sistemima mesindžera unutar ćelija transfektovanih sa nukleinskom kiselinom koja kodira modifikovane glikoproteinske hormone može da se izmeri i uporedi sa sličnim ćelijama transfektovanih sa nekom nukleinskom kiselinom koja kodira glikoproteinski hormon divljeg tipa. Alternativno, aktivnost modifikovanog glikoproteinskog hormona može da se odredi iz ispitivanja vezivanja receptora, iz ispitivanja unosa timidina, iz ispitivanja proizvodnje progesterona, ili iz ispitivanja T4 sekrecije. Prosečan stručnjak u tehnici može lako da odredi bilo koje odgovarajuće ispitivanje da se koristi kako bi se odredila aktivnost ili glikoproteinskog hormona divljeg tipa ili modifikovanog glikoproteinskog hormona.

[0056] U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska, modifikovan glikoproteinski hormon ima potenciju koja je povećana u odnosu na potenciju glikoproteinskog hormona divljeg tipa. Ova povećana potencija može da se oceni bilo kojom od tehnika navedenih gore ili u bilo kom drugom odgovarajućem ispitivanju kao što jednostavno može da odredi stručnjak u tehnici. Povećana potencija ne mora da bude dosledna od ispitivanja do ispitivanja, ili od ćelijske linije do ćelijske linije, jer će one, naravno, da variraju.

[0057] U drugom primeru izvođenja ovog pronalaska, modifikovan glikoproteinski hormon ima maksimalnu efikasnost koja je povećan u odnosu na maksimalnu efikasnost glikoproteinskog hormona divljeg tipa. Ova povećana maksimalna efikasnost može da se oceni bilo kojom od tehnika navedenih gore ili u bilo kojem drugom pogodnom ispitivanju kao što jednostavno može da odredi stručnjak u tehnici. Povećana maksimalna efikasnost ne mora da bude dosledna od ispitivanja do ispitivanja, ili od ćelijske linije do ćelijske linije, jer će one, naravno, da variraju.

[0058] Ostala ispitivanja pogodna za karakterizaciju analoga opisanih ovde opisana su

u PCT/US99/05908. Na primer, razna imunoispitivanja mogu da se koriste uključujući, ali bez ograničenja na, kompetitivne i ne-kompetitivne sisteme ispitivanja upotrebom tehnika kao što su radioimunoispitivanja, ELISA, ispitivanja izoelektričnog fokusiranja (IEF), sendvič imunoispitivanja, imunoradiometrijska ispitivanja, reakcije precipitina sa difuzijom u gelu, ispitivanja imunodifuzije, in situ imunoispitivanja, western blot-ovi, reakcije taloženja, ispitivanja aglutinacije, ispitivanja fiksacije komplementa, ispitivanja imunofluorescencije, ispitivanja proteina A, i ispitivanja imunoelektroforeze, itd.

[0059] Na primer, kada je beta subjedinica ona od FSH, poboljšanja kvaliteta i kvantiteta oocita mogu da se ocene in vitro i in vivo ispitivanjima. Superaktivni FSH može da se koristi da se poboljša kvalitet i kvantitet oocita iz životinja, uključujući, ali bez ograničenja na, ljude, miša, pacova, primata, zeca, svinju, konja, ovcu, i psa. Poželjno, superaktivni FSH daje se čoveku ili bilo kojoj životinji. Uobičajeno je za poboljšanja kvantiteta i kvaliteta oocita da se odrede korišćenjem različitih krajnjih tačaka in vitro postupka oplođenja kao što su obrazovanje oocita, oplođenje oocita, i obrazovanje blastocista. In vitro eksperimenti oplođenja mogu da slede "protokol superovulacije " u kom se subjekti tretiraju sa analogom superaktivnog FSH prema ovom pronalasku, što dovodi do oslobađanja i sazrevanja višestrukih oocita . U in vitro eksperimentima oplođenja, FSH (superaktivni FSH i rekombinantni FSH divljeg tipa) može da se daje sa hCG da se izazove ovulacija. Kontrolna životinja može da se koristi a koja prima samo hCG ili serumski gonadotropin trudne kobile (PMSG). Kvalitet oocita može da se poboljša povećanjem brzine oplodnje oocita u životinji. Brzina oplodnje superaktivnog stimulišućeg hormona folikula može da se odredi in vivo ili in vitro poređenjem brzine oplodnje postignute sa superaktivnim FSH sa brzinom oplodnje postignutom sa istom količinom rekombinantnog FSH divljeg tipa. Kontrolna životinja može takođe da se koristi a koja prima hCG. Brzina oplodnje može da se izmeri kao procenat dvo-ćelijskih embriona koji se razvijaju po ukupnom broju oocita. Ako se oplođenje izvodi in vitro, dvoćelijski embrioni mogu da se izbroje u posudama za oplodnju. Kod miševa, dvo-ćelijski embrioni razvijaju se približno dvadeset četiri sata posle oplođenja. Brzina oplodnje varira na osnovu količine datog superaktivnog FSH. Životinja može da primi višestruke doze superaktivnog FSH. Brzina oplodnje raste za najmanje oko 10 procenata kao rezultat davanja superaktivnog FSH pri maksimalnoj efektivnoj dozi za broj oocita. Brzina oplodnje može da se poveća za najmanje oko 20 procenata, poželjno najmanje 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ili 100% kao rezultat davanja superaktivnog FSH pri maksimalnoj efektivnoj dozi za broj oocita. Superaktivni stimulišući hormon folikula može d a poboljša kvalitet oocita poboljšanjem brzine formiranja blastocista po oplođenom oocitu. Brzina formiranja blastocista može da se izmeri određivanjem procenta dvo-ćelijskih embriona koji obrazuju blastociste. Brzina formiranja blastocista raste bilo da se blastocist obrazuje in vivo ili in vitro. Brzina formiranja blastocista zavisi od količine datog superaktivnog stimulišućeg hormona folikula. Brzina formiranja blastocista raste za najmanje oko 10 procenata kao rezultat davanja nekog superaktivnog stimulišućeg hormona folikula pri maksimalnoj efektivnoj dozi za broj oocita. Brzina formiranja blastocista može da se poveća za najmanje oko 20 procenata, poželjno za najmanje 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ili 100% kao rezultat davanja superaktivnog FSH pri maksimalnoj efektivnoj dozi za broj oocita.

[0060] Superaktivni stimulišući hormon folikula može da poboljša kvalitet oocita povećanjem ukupnog broja embriona po oplođenom oocitu. Porast ukupnog broja embriona po oplođenom oocitu raste bilo da se oplođenje dešava in vivo ili in vitro. Porast ukupnog broja embriona po oplođenom oocitu zavisi od količine datog superaktivnog stimulišućeg hormona folikula. Ukupan broj embriona po oplođenom oocitu raste za najmanje oko 10 procenata kao rezultat davanja nekog superaktivnog stimulišućeg hormona folikula pri maksimalnoj efektivnoj dozi za broj oocita. Ukupan broj embriona po oplođenom oocitu može da se poveća za najmanje oko 20 procenata, poželjno najmanje 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ili 100% kao rezultat davanja superaktivnog FSH pri maksimalnoj efektivnoj dozi za broj oocita.

[0061] Na primer, kada je beta subjedinica ona od CG, snažne aktivnosti poput onih luteinizirajućeg hormona (LH) mogu da se odrede in vitro i in vivo bioispitivanjima. Superaktivni CG indukuje ovulaciju, produžava životni vek žutog tela, povećava sintezu progesterona i promoviše formiranje dopunskih žutih tela kod određenih vrsta. Takvo delovanje rezultuje efikasnijim prikupljanjem oocita, povećanjem kvaliteta oocita u određenim vrstama, porasta stope trudnoće i stope održavanja trudnoće.

Analogi glikoproteinskih hormona sa povećanim serumskim poluživotom

[0062] Modifikovani proteini glikoproteinskih hormona ovog pronalaska mogu takođe da se dalje modifikuju tako da je poluživot u plazmi half-life povećan u poređenju sa dvojnicima divljeg tipa.

Modifikovani proteini glikoproteinskih hormona ovog pronalaska mogu dalje da obuhvataju potencijalno mesto glikozilacije uključujući sekvence koje obuhvataju mesta N-glikozilacije i/ili O-glikozilacije. Na primer, postavljanje peptida NVTINV (SEQ ID NO: 1) ili VNVTINVT (SEQ ID NO: 20) u alfa subjedinici obezbeđuje potencijalno mesto glikozilacije alfa subjedinice. Peptidi SEQ ID NO: 20 ili SEQ ID NO: 1 mogu da se smeste u humane sekvence divljeg tipa između D3 i Q5. Peptidi SEQ ID NO: 20 ili SEQ ID NO: 1 mogu da se smeste u goveđe, konjske, svinjske i ovčije sekvence divljeg tipa između F6 i T7. Umetnuti peptid može dalje da obuhvata dodatni ostatak treonina na amino kraju. Dodatni peptidi koji se umeću kako bi se izmenila glikozilacija uključuju NV, INV, i TNV peptide, kao i TNVTINV (SEQ ID NO: 12). Na primer, modifikovana alfa subjedinica glikohormona može da uključuje umetak NV između F6 i T7 plus umetak INV između T7 i T8. Povećan poluživot može takođe da bude obezbeđen pegilacijom ili konjugacijom ostalih odgovarajućih hemijskih grupa ili konstruisanjem fuzionih proteina koji imaju povećan poluživot ili bilo kojim drugim postupkom. Ti postupci poznati su u tehnici, na primer kao što je opisano u U.S. Patent 5,612,034, U.S. Patent 6,225,449, i U.S. Patent 6,555,660.

[0063] Poluživot može takođe da se produži povećanjem broja negativno naelektrisanih ostataka unutar molekula, na primer, broja ostataka glutamata i/ili aspartata. Takve izmene mogu da se postignu mestousmerenom mutagenezom. Takva izmena može takođe da se postigne umetanjem aminokiselinske sekvence koja sadrži jedan ili više negativno naelektrisanih ostataka u modifikovanim proteinima glikoproteinskih hormona.

[0064] Poluživot proteina je mera stabilnosti proteina i ukazuje na vreme potrebno za polovinu smanjenja koncentracije proteina. Serumski poluživot modifikovanih proteina glikoproteinskih hormona opisanih ovde može da se odredi bilo kojim postupkom pogodnim za merenje nivoa hormona u uzorcima iz subjekta tokom vremena, na primer, ali neograničavajući se na, imunoispitivanja upotrebom antitela za merenje nivoa u uzorcima seruma uzimanim tokom nekog vremenskog perioda posle davanja modifikovanih proteina glikoproteinskih hormona, ili detekcijom obeleženih molekula hormona, tj., radioobeleženih molekula, u uzorcima uzetim iz subjekta posle davanja obeleženih glikoproteinskih hormona.

Medicinske upotrebe i Ne-Terapeutske upotrebe

Postupci lečenja

[0065] Modifikovani proteini glikoproteinskih hormona ovog pronalaska mogu da se koriste za lečenje nekog stanja povezanog sa aktivnošću glikoproteinskih hormona. Subjekt može da bude životinja, kao što je sisar, reptil, riba, ptica i vodozemac. Subjekt može da bude sisar, kao što je čovek, krava, ovca, svinja ili konj. Životinja uključuje stoku i kućne ljubimce, kao što su psi i maške. Ovde je obezbeđen modifikovan glikoproteinski hormon koji obuhvata alfa subjedinicu ovog pronalaska za upotrebu u lečenju ovulacijske disfunkcije, defekte lutealne faze, neobjačnjive neplodnosti, neplodnost muškog faktora, vremenski ograničeno začeće, malu ekspresiju FSH receptora, malu osetljivost FSH receptora, nedostatke kod vezivanja FSH receptora, nedostatke FSH nedostataka FSH receptorskog spajanja, malu proizvodnju testosterona, ćelavost kod muškaraca, ili nedostatak funkcije ili povredu hipofize. Takođe je obezbeđen ne-terapeutski postupak za stimulisanje ovulacije kod životinje, koji obuhvata davanje modifikovanog glikoproteinskog hormona ovog pronalaska pomenutoj životinji.

[0066] Na primer, kvantitet i kvalitet oocita može da bude poboljšan davanjem superaktivnog FSH analoga kao što je opisano ovde nekoj životinji. Na primer, iznenađujuć je otkriveno da se davanjem superaktivnog FSH koji sadrži modifikovanu alfa-subjedinicu, dobija dramatično povećanje kvantiteta i kvaliteta oocita. Efekti superaktivne FSH na kvantitet i kvalitet oocita može dalje da se poboljša povećanjem FSH serumskog poluživota superaktivnog FSH. FSH serumski poluživot može da se poveća daljim modifikovanjem superaktivnog FSH. Dalje modifikacije, uključujući, ali bez ograničenja na one prethodno opisane, mogu da se koriste da se poveća FSH serumski poluživot.

[0067] Modifikovani proteini glikoproteinskih hormona FSH, CG, LH ili TSH ovog pronalaska mogu takođe da se koriste u terapeutskim režimima potpomognute reprodukcije ili kod muškog ili kod ženskog subjekta, koji obuhvataju davanje pomoćne količine modifikovanih proteina glikoproteinskih hormona subjektu. U tim upotrebama, analozi mogu da se daju sami ili u kombinaciji sa ostalim terapeuticima, na primer, uključujući, ali bez ograničenja na Klomifen citrat i GnRH (gonotropin oslobađajući hormon). Modifikovani proteini glikoproteinskih hormona ovog pronalaska mogu da se daju kao kombinacija jednog ili više glikoproteina. Na primer, modifikovana alfa subjedinica može da se kombinuje sa FSH beta subjedinicom, CG beta subjedinicom, TSH beta subjedinicom, i/ili LH beta subjedinicom, zajedno ili odvojeno, i modifikovani glikoproteini onda se daju subjektu. Na primer, kod subjekta sa deficitom izolovanog gonadotropina (IGD), modifikovani FSH, CG, TSH, i LH mogu da se daju subjektu da se oporavi normalna gonadalna funkcija. Naširoko je poznato u tehnici da su glikoproteinski hormoni kao što su FSH, CG, TSH, LH sastavnni deo ženske reproduktivne fiziologije, i ovi glikoproteinski hormoni mogu da se daju subjektu da se prevaziđe broj reproduktivnih poremećaja i time da se pomogne reprodukcija.

[0068] Dozni režimi sa jednom i više injekcija testirani su za modifikovan konjski CG glikoprotein. Za superstimulaciju upotrebom eCG analoga kod konja, krava, ili svinja, jedna ili 2:1 podeljena eCG analog injekcija se koristi. Studije o rasponu doza za eCG analog uključuju jednu im. injekciju od 30, 45, 60, 75, 90, 105 i 120 mcg. Optimizovane doze testirane su u odnosu 2:1 i opciona druga podeljena doza poklopiđe se sa PGF2alfa tretiranjem na Dan 6 ili nekog drugog dana. Davanje modifikovanog eCG proizvodi superovulaciju kod konja, krava, i svinja.

[0069] Prosečan stručnjak u tehnici može lako da odredi efektivnu količinu glikoproteinskog hormona koja se daje i zavisiće od faktora kao što su masa, veličina, ozbiljnost specifičnog stanja, i tip samog subjekta. Terapeutski efektivna količina može lako da se odredi rutinskim procedurama za optimizaciju. Ovaj pronalazak obezbeđuje glikoproteinske hormone sa povećanom potencijom u odnosu na glikoproteinski hormon divljeg tipa. Ovi modifikovani glikoproteinski hormoni omogućiće da iskusni stručnjak daje manju dozu modifikovanog glikoproteinskog hormona u odnosu na glikoproteinske hormone divljeg tipa kako bi se postigao sličan terapeutski efekat, ili alternativno, daje neku dozu modifikovanog glikoproteinskog hormona sličnu dozi glikoproteinskog hormona divljeg tipa kako bi se postigao povećan terapeutski efekat.

[0070] Zavisno od toga da li se glikoproteinski hormon daje oralno, parenteralno, ili drugačije, davanje prostaglandina može da bude u čvrstim, polu-čvrstim, ili tečnim doznim oblicima, kao što su, na primer, tablete, pilule, kapsule, praškovi, tečnosti, kreme, i suspenzije, ili slično, poželjno u jediničnom doznom obliku pogodnom za dostavu precizne doze. Glikoproteinski hormon može da uključuje efektivnu količinu odabranog glikoproteinskog hormona u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem i, dodatno, može da uključuje ostale medicinske agense, farmaceutske agense, nosače, adjuvanse, razblaživače, itd. Pod "farmaceutski prihvatljiv" podrazumeva se materijal koji nije biološki ili drugačije nepoželjan, tj., material može da se daje pojedincu zajedno sa odabranim glikoproteinskim hormonom bez izazivanja neprihvatljivih bioloških efekata ili uzajamnog delovanja na neprihvatljiv način sa glikoproteinskim hormonom. Sadašnji postupci pripreme kao što su dozni oblici su poznati, ili će biti očigledni, prosečnim stručnjacima u tehnici; na primer, videti Remington’s Pharmaceutical Sciences, poslednje izdanje (Mack Publishing).

[0071] Sledeći primeri obezbeđeni su da opišu i ilustruju ovaj pronalazak. Kao takvi, ne treba ih tumačiti kao ograničenje obima ovog pronalaska. Stručnjaci u tehnici dobro će znati da mnogi drugi primeri izvođenja takođe podpadaju unutar obima ovog pronalaska, kao što je opisano ovde gore i u patentnim zahtevima.

PRIMERI

Konstrukcija analoga alfa subjedinica

[0072] Humani glikoprotein FSH superagonista sa modifikacijama na α-subjedinici na Q13R+E14R+P16R+Q20R (humani 4R) sa β-subjedinicom divljeg tipa demonstrirao je značajni superiornost vezivanja u odnosu na njegove dvojnike divljeg tipa.

[0073] Tabela 1 prikazuje poređenje humanog alfa divljeg tipa (WT) i odabrane primarne aminokiselinske strukture hFSH superagonista. N-terminalni delovi humane alfa divljeg tipa (ostaci aminokiselina 1-28 od 92 ukupnih ostataka) i mutirani oblici su poznati. Položaj 4 supstitucije superagonista sa argininom (R) je u osenčenom području. Odabrana 4 različita umetka koji se uvode u jedan ili dva dodatna N-povezana lanca ugljenih hidrata označeni su između aminokiselina D3 i Q5 sekvence divljeg tipa.

[0074] Segmenti u Tabeli 1 navedeni su kao što sledi: SEQ ID NO: 43: hFSH WT; SEQ ID NO: 33, hFSH alfa (4R); SEQ ID NO: 34, hFSH alfa (4R+Ins1); SEQ ID NO: 35, hFSH alfa (4R+Ins2); SEQ ID NO: 36, hFSH alfa (4R+Ins3); SEQ ID NO: 37, hFSH alfa (4R+Ins4).

[0075] Goveđe FSH (bFSH) supstitucije u nekim primerima izvođenja su visoko analogne sa ostacima prethodno mutagenizovanim u humanoj FSH alfa subjedinici i uključuju kombinaciju 5 mutacija koja se naziva "5R" (K15R+K17R+E18R+K20R+K24R). Npr. SEQ ID NO: 7. Kako bi se povećala verovatnoća da uvedene sekvence prepoznavanja glikozilacije (NXT ili NXS) dovedu do povezivanja N-povezanog lanca ugljenih hidrata, 18 različitih goveđih konstrukata alfa subjedinice je ustanovljeno i klonirano u prethodno razvijene ekspresione vektore.12 konstrukata sadržalo je N-terminalne peptidne sekvence ekstenzije ANITV, ANTTA, ANTSA, ANITVNITV, ANTSANTTA i ANTSANTSA.

[0076] Tabela 2 prikazuje poređenje goveđe alfa divljeg tipa (WT) i odabranih primarnih aminokiselinskih struktura bFSH superagonista. N-terminalni delovi goveđe alfa divljeg tipa (aminokiselina ostaci 1-32 od 96 ukupnih ostataka) i mutantna goveđa alfa su prikazani. Položaj 5 supstitucija superagonista sa argininom (R) ili lizinom (K) obeležen je u osenčenom području između aminokiselina C14 i P25, kodiran kao 5R od 4R+1K. Odabrana 4 različita umetka koji uvode jedan ili dva dodatna N-povezana lanca ugljenih hidrata obeleženi su između aminokiselina F6 i T8 sekvence divljeg tipa.

[0077] Segmenti u Tabeli 2 navedeni su kao što sledi: SEQ ID NO: 44, WT bFSH; SEQ ID NO: 23, bFSH alfa (5R); SEQ ID NO: 24, bFSH alfa (4R+1K); SEQ ID NO: 25, bFSH alfa (5R+Ins1); SEQ ID NO: 26, bFSH alfa (5R+Ins2); SEQ ID NO: 27, bFSH alfa (5R+Ins3); SEQ ID NO: 28, bFSH alfa (5R+Ins4); SEQ ID NO: 29, bFSH alfa (4R+1K+Ins1); SEQ ID NO: 30, bFSH alfa (4R+1K+Ins2); SEQ ID NO: 31, bFSH alfa (4R+1K+Ins3); SEQ ID NO: 32, bFSH alfa (4R+1K+Ins4).

[0078] Konjske alfa subjedinice glikoproteina koje uključuju mutacije takođe su proizvedene i neki primeri izvođenja uključuju supstituciju K15R, E18R, K20R, i K24R. Npr. SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 38-40. Dodatno, konjske alfa subjedinice glikoproteina koje imaju K15R, E18H, K20R, i K24R takođe su generisane (npr. SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42). Ove mutirane alfa subjedinice takođe sadrže umetak NVTINT između F6 i T7 subjedinice (npr. SEQ ID NO: 9, 40, i 42) ili NV umetak između F6 i T7 plus INV između T7 i T8 (npr. SEQ ID NO: 38, 39, i 41).

[0079] Prolazna transfekcija bFSH analoga upotrebom polietilenimina (PEI) rezultovala je povećanjem od 3.7-4.5 puta u ekspresiji bFSH analoga u poređenju sa lipofektamin-baziranim postupcima (podaci nisu prikazani). Ekspresioni nivoi različitih FSH analoga na osnovu heterodimer-specifične ELISA nisu indukovali glavni gubitak formiranja FSH dimera i ne podržavaju prethodne tvrdnje da je neophodan konstrukt jednog lanca da bi se postigla ekspresija visokog nivoa.

[0080] Izbor prolazno eksprimiranih bFSH analoga uključivao je cAMP-bazirana in vitro bioispitivanja i PK skrining ispitivanja (videti Fig.1 i 2). Postojalo je povećanje od 3-4 puta u potenciji bFSH sa 5R supstitucijama u poređenju sa svinjskim FSH (pFSH-Folltropin®-V) i bFSH kontrolama (Fig.1A).

Izvanredno, nasuprot mnogim prethodnim studijama (Fig.1B), (Heikopp, Eur. J. Biochem 261: 81-84, 1999; Trousdale, Fertil. Steril.91: 265-270, 2009) otkriveno je da novi umetci neoglikozilacije ne smanjuju in vitro bioaktivnost goveđeg FSH 5R analoga (Fig.1C). Identična mesta neoglikozilacije dodata na N-kraju smanjila su in vitro bioaktivnost bFSH, slično efektu slabljenja neoglikozilacije na suštinsku aktivnost eritropoietina (Elliott, Exp. Hematol.32: 1146-1155, 2004; Elliott, Nat. Biotechnol.21: 4144-421, 2003; Sinclair, J. Pharm. Sci.94: 1626-1635, 2005) i efekat mnogih drugih prolongacija pristupa poluživotu uključujući mesto-usmerenu pegilaciju (Fishburn, J. Pharm. Sci.97: 4167-4183,

2008; Uchiyama, Vet. J.184: 208-211, 2010). Dvodnevno PK skrining ispitivanje kod mmiševa ukazala je da svi neo-glikozilovani goveđi FSH "5R" analozi imali su povećan terminalni poluživot u poređenju sa bFSH-WT i Folltropin®-V (Fig.2A i 2B). Podaci iz PK skrining ispitivanja ukazala su da veoma produžen poluživot u plazmi zbog glikozilacije na jednom ili dva uvedena mesta neoglikozilacije (Umetak 1 i 2) u poređenju sa bFSH-WT, Folltropin®-V i TR4401 kontrolama. Primećeni nivoi su upoređeni sa bFSH-jednolančanim molekulom sa linkerom od 29 aminokiselina i 4-5 O-povezanim lancima ugljenih hidrata. Dva inicijalno testirana analoga izrađena kao kombinovani superagonist i umetci neoglikozilacije, koji se nazivaju "Umetak 1 i 2" imali su in vitro bioaktivnost uporedivu sa 5R kontrolom superagonista samo (Fig.1C) i još uvek produžen poluživot kod miševa (Fig.2B). Takvi dugodelujući analozi bez smanjenja superagonističke aktivnosti su bez presedana i prevode se u očekivanu impresivnu performansu in vivo kod krava.

[0081] Nekoliko stotina miligrama različitih humanih FSH i TSH je proizvedeno rekombinantno (rFSH ili rTSH) sa CHO ćelijama upotrebom boca, šejkera, valjkastih boca i bioreaktora. Tokom početnog rada sistem dicistronskih retrovirusnih vektora je optimizovan za ekspresiju visokog nivoa FSH i TSH analoga u CHO-DG44 ćelijama. Preparat humanog rFSH je testiran. Jedna 60 µg doza rFSH indukovala je razvoj folikula koji je rezultovao velikim brojem embriona dobrog kvaliteta što se podudaralo sa prethodnih optimizovanih osam injekcija Folltropin®-V (300 mg) davanih dvaput dnevno tokom 4 dana dalje podržavajući njegova jedinstvena svojstva kao što su odložena apsorpcija posle I.M. injekcije, kao i poboljšano vreme zadržavanja FSH receptora. Videti Fig.3 i 5-8. rFSH superagonist u dozi od 10 µg pokazao je izvanrednu sposobnost da regrutuje i održi tokom 12 dana poboljšan pul rastućih folikula, posebno folikule opsega veličine 3-5 mm, za koje je takođe poznato kod ljudi da imaju mali broj FSH receptora (podaci nisu prikazani). Ovo neočekivano poboljšanje i podrška malih folikula sa rFSH, koje nije primećeno sa prethodno optimizovanim doziranjem kontrolnog Folltropin®-V, obezbeđuje nov način da se regrutuju folikule kao odgovor na FSH u slučajnim fazama ciklusa i poboljša potencijalno za uspešnu IVF i superovulaciju kod brojnih ispitanika sa lošim odgovorom izazvanim smanjenim brojem ili funkcijom FSH receptora (Perez Mayorga, J. Clin. Endocrinology 152: 3268-3369, 2000; Levallet, Arch. Med. Red.30: 486-494, 1999; Rannikko, Mol. Hum. Reprod.8: 311-317, 2002; Cai, Feril. Steril.87: 1350-1356, 2007). Međutim, zbog razlike u 40 aminokiselina između goveđi FSH i humani FSH baziranih-alfa subjedinica sa 4 supstitucije argininom, uočeno je nekoliko efekata prenošenja iz prethodnih tretiranja sa rFSH kod istih krava, što je bilo u skladu sa prethodnim ispitivanjem podataka koje je pokazalo imunogena svojstva humanog FSH kod zečeva i Rezus majmuna (Cai, Int. J. Toxicol.30: 153-161, 2011; De Castro, Theriogenology 72: 655-662, 2009).

[0082] Uvođenje ostataka arginina (R) ili lizina (K) u odabrano područje koje dopušta modifikaciju uobičajene alfa-subjedinice prethodno je pokazalo da modulira aktivnost glikoproteinskih hormona tokom evolucije (Szkudlinski, Nat. Biotechnol.14: 1257-1263, 1996; Szkudlinski, Physiol. Rev.82: 473-502, 2002) i ima značajnu ulogu u elektrostatičkoj interakciji sa negativno naelektrisanim klasterom smeštenim u zglobnom regionu receptora glikoproteinskih hormona (Mueller, Trends Endocrinol.

Metab. 21: 111-122, 2010; Mueller, J. Biol. Chem.284: 16317-16324, 2009; Mueller, Endocrinol.152: 3268-3278, 2011). Specifični razvoj bFSH superagonista uključuje minimalne supstitucije sa 4-5 R i/ili K kako bi se proizveo potentniji i efikasniji molekul sa mogućom odloženom apsorpcijom radi povećanja trajanja dejstva kao što je prikazano u podacima ovde i ostalim ispitivanjima hFSH i ostalih analoga glikoproteinskih hormona (Szkudlinski, Physiol. Rev.82: 473-502, 2002). Aminokiselinski umetci minimalne dužine koji sadrže jedno ili više ugljovodoničnih mesta neoglikozilacije da se poveća poluživot kako bi se proizveo analog jedne injekcije bez smanjenja povećane potencije/efikasnosti superagonista takođe su ispitivani (videti Fig.4). Za dalju analizu, 8 konstrukti koji sadrže peptidne umetke NVTINV, NVTINVT, NV i NVT smaštene između aminokiselina 6 i 8 sekvence divljeg tipa mogu da se koriste. Kao što je prikazano u podacima ovde i nasuprot prethodnim ispitivanjima neoglikozilacije i pegilacije (Trousdale, Feril. Steril.91: 265-270, 2009; Uchiyama, Vet J.184: 208-211, 2010; Perlman, J. Clin.

Endocrinol. Metab.88: 3227-3235, 2003) moguće je da se konstruiše aminokiselinski umetak minimalne dužine koji sadrži složeni ugljeni hidrat kako bi se povećao poluživot bez smanjenja povećane potencije/efikasnosti superagonista. Ovi novi analozi mogu da se eksprimiraju pomoću prolazne transfekcije u CHO-K1 ćelijama upotrebom optimizovanog postupka sistema visoke ekspresije u kom se koriste PEI i valjkaste boce.

[0083] PRečišćavanje odabranih 4-6 analoga ekprimiranih prolaznom transfekcijom može da se izvede upotrebom faze hvatanja koja koristi SP Sefaroza kolone, što je praćeno odabirom analoga pomoću Mono Q jonoizmenjivačke hromatografije pre krajnjeg doterivanja upotrebom gel filtracije. Čistoća bFSH analoga može da bude veća od 98%. Kumulativni oporavak može da dostigne 50% sa ukupnim 50-strukim prečišćavanjem. Svi analozi mogu da se okarakterišu in vitro pomoću ELISA imunoispitivanja, snažnog in vitro cAMP bioispitivanja upotrebom CHO-FSHR ćelijske linije, SDS-PAGE elektroforeze i gel analize sa izoelektričnim fokusiranjem (IEF). Odabrani prečišćeni analozi mogu takođe da se analiziraju rigoroznom kvantifikacijom reverzno faznom HPLC, analizom sastava ugljenih hidrata i ocenjivanjima stabilnosti i stanja agregacije.

[0084] Dalji eksperimenti proizveli su goveđi FSH analog TR55601 (alfa subjedinica: SEQ ID NO: 7), koji uključuje supstitucije sa argininom (R) u 15K, 17K, 18K, 20K, i 24K alfa subjedinice kao i NVTINV (SEQ ID NO: 1) umetak između 6F i 7T alfa subjedinice. Nekoliko lotova TR55601 je generisano i testirano upotrebom IEF i Western blot analize. Fig.3A -D prikazuju primere rezultata analize. Fig.3A-3D demonstrira, delom, da TR55601/Lot 4 i Lot 5 pokazuju optimalnu distribuciju i potvrđuju efikasnost mutacija u ovom Lotu. Lotovi 4 i 5 i Lotovi koji imaju slične skrining rezultate korišćeni su u tretiranjima životinja. Na primer, IEF-Western Blot analiza ilustruje optimizovane kisele izoforme TR56001 Lota 4 i Lota 5 na Fig.3A-C. Sa druge strane, kao što je prikazano na Fig.3A i 3C, Lot 3 nije u potpunosti verifikovan i nije korišćen u tretiranjima životinja. bFSH analozi i posebno uzorci TR55601 takođe su ispitivani sa PK skrining ispitivanjima kod miševa. Miševi su subkutano injektirani sa odabranim bFSH uzorcima i uzimani su uzorci krvi 24, 32, i 48 sata posle injekcija. Plazme su izolovane i analizirane sa bFSH ELISA (Endocrine Technologies, Inc.). Produženi poluživot Lota 4 TR55601 uzoraka je potvrđen sa PK skrining ispitivanjima. Podaci nisu prikazani.

[0085] Potpuni farmakokinetički profil odabranih kandidat analoga može da se izvede sc davanjem jedne doze 10 µg po pacovu i 10 različitih vremena za prikupljanje krvi (1, 5, 15, 30 min i 1, 2, 6, 24 i 48h) koji obuhvataju i fazu distribucije i eliminacije. Goveđi FSH nivoi u plazmi mogu da se izračunaju u plazmi upotrebom bFSH-ELISA. Potpuna PK analiza može da se izvede.

[0086] Analozi su odabrani za konstrukciju bicistronskih ekspresionih vektora, i selekciju i amplifikaciju ekspresije analoga u CHO-DG44 ćelijama u pripremi za ispitivanja proizvodnje velikih razmera, prečišćavanja i superovulacije kod stoke. CHO-DHFR(-) DG44 ćelije su ko-transfektovane sa ekspresionim vektorima i podvrgnute genskoj amplifikaciji u podlozi za kulturu koja sadrži stepenasta povećanja metotreksata (MTX). Ćelije su kvalifikovane za sledeću fazu amplifikacije nakon ponovnog sticanja poligonalne morfologije (2-3 nedelje). Klonovi koji prikazuju nivo sekrecije > 2 pg/ćelija/dan mogu da budu podvrgnuti drugom tretiranju, usmerenom da amplifikuje GS marker gen (MSX). Dodatno povećanje od 2-5 puta može da se dobije, pri čemu se dostiže nivo sekrecije do 10 pg/ćelija/dan.

Priprema i eksperimentisanje sa analozima alfa subjedinica

[0087] Iako je rFSH indukovao superovulatorni odgovor posle jedne intramuskularne (I.M.) injekcije i čini se da je 60 µg veoma blizu optimalne doze, postojalo je značajno smanjenje u superovulatornom odgovoru kada su krave izložene sa rFSH tri puta ili više. Prema tome, eksperimenti su dizajnirani da se testira nova rFSH formulacija koja se naziva TR 55601 rFSH, koja uključuje alfa subjedinicu (SEQ ID NO: 7) koja ima "5R" supstituciju i umetak NVTINT između F6 i T7. Cilj je bio da se prvo odredi efekat tretiranja sa rFSH u jednoj ili podeljenoj dozi kako bi se indukovao superovulatorni odgovor kod tovnih krava i zatim da se dalje oceni superovulatorni odgovor na jednu injekciju rFSH i da se odredi da li je superovulatorni odgovor ostao visok kada su krave izložene sa rFSH dva ili tri puta.

[0088] TR55601 FSH uzorci su analizirani in vivo kod pacova klasičnim Steelman-Pohley FSH bioispitivanjem (Steelman et al., Endocrinol.53: 604-616, 1953). Ženke Sprague-Dawley pacova (200-220g) su injektirane sa jednom pojedinačnom dozom testnog artikla (npr. bFSH) ili nosača, obogaćenom sa 40 IU hCG. Mase jajnika su izmerene 72 sata posle doziranja. Videti Fig.4. Svaka grupa je tretirana sa hCG kako bi se obezbedila osnovna linija. TR55601 bFSH, u svim koncentracijama, značajno je povećala masu jajnika.

[0089] Fig.5 prikazuje protokol sinhronizovanja folikularnog talasa za superovulaciju, indukciju ovulacije i veštačku inseminaciju sa fiksnim vremenom, gde je 8 injekcija Folltropin-VR (Bioniche) zamenjeno sa jednom ili dvostrukom injekcijom TR55601. Tretiranje je uključivalo ubacivanje intravaginalnog sredstva koje oslobađa progesteron (P4) i davanje benzoat estradiola (BE) na Dan 0. Superovulatorna tretiranja započeta su na Dan 4 sa TR55601 datim kao jedna ili dvostruka injekcija. Druga injekcija podeljene doze podudarala se sa PGF2αtretiranjima na Dan 6. Sredstvo sa progesteronom je uklonjeno sa poslednjom FSH injekcijom na Dan 7. Na dan 8 donori su primili svinjski LH i osemenjeni su bez detekcije estrusa 12 i 24h kasnije, ili jedanput na Dan 8 (16h posle pLH). Jajne ćelije/embrioni su prikupljeni nehirurški na Dan 15 (2, 3). Folltropin-V® je korišćen kao kontrola; ukupno 300 mg* je davano u 8 intramuskularnih (IM) injekcija dvaput dnevno tokom 4 dana (mg* - bazirano na veoma nečistom Referentnom Standardu NIH-FSH-P1).

[0090] Posebno, 30 crvenih Angus krava bez laktacije je stratifikovano i blokirano na osnovu njihove prethodne istorije proizvodnje embriona i nasumično je dodeljeno jednoj od tri grupe tretiranja. Krave u Kontrolnoj grupi (n=10) primile su 300 mg Folltropin-V, I.M. u protokolu smanjujuće doze davane dvaput dnevno tokom 4-dnevnog perioda. Specifično: Dan 4, 3.0 mL (pre podne i posle podne); Dan 5, 2.5 mL (pre podne i posle podne); Dan 6, 1.5 mL (pre podne i posle podne) i Dan 7, 0.5 mL (pre podne i posle podne). Krave u grupi tretiranja sa rFSH 60µg primile su jednu I.M. injekciju sa 60 µg rFSH i krave u grupi tretiranja sa rFSH 40-20µg primile su I.M. injekciju sa 40 µg rFSH na Dan 4, praćeno drugom I.M. injekcijom sa 20 µg rFSH na Dan 6.

[0091] Zatim, 25 od 30 krava je superstimulisano ponovo sa Folltropin-V (Kontrola) ili jednom injekcijom sa 60 µg rFSH. Životinje u Kontrolnoj grupi (n=10) ostale su u Kontrolnoj grupi, a 8 od 10 krava u rFSH 60 µg u Eksperimentu 1 tretirano je ponovo sa jednom I.M. injekcijom rFSH. Dalje, 7 od 10 krava prethodno tretiranih sa podeljenom jednom injekcijom rFSH tretirano je sa jednom I.M. injekcijom rFSH. Interval između prikupljanja embriona bio je 29 dana.

[0092] 24 od 25 krava korišćenih u drugom eksperimentu je superstimulisano ponovo sa Folltropin-V (Kontrola) ili jednom injekcijom sa 60 µg rFSH. Ponovo, kontrolne krave ostale su u Kontrolnoj grupi, a rFSH krave ostale su u rFSH grupi. Interval između prikupljanja embriona bio je 30 dana.

[0093] Na Dan 0 (početak eksperimenta), sve životinje primile su 5 mg estradiol-17β plus 50 mg progesterona i intravaginalno sredstvo impregnirano sa progesteronom (Cue-Mate, Bioniche Animal Health). Na Dan 4 (očekivani dan nastanak talasa folikula), sve krave su superstimulisane prema grupama opisanim gore.60 µg doze za jednu I.M. injekciju rFSH konstituisan 7.5 mL i Folltropin-V je dat u 8 I.M. injekcija u protokolu smanjujuće doze. Sve životinje primile su 500 µg kloprostenola I.M.

(Cyclase, Syntex, Argentina) na Dan 6 ujutru i uveče. Cue-mates su uklonjeni uveče Dana 6. Ujutru Dana 8, krave su primile 100 µg gonadorelina (Gonasyn, Syntex Argentina) i osemenjene 12 i 24 sata kasnije. Sve krave su osemenjene sa zamrznutim semenom iz istog bika. Jajne ćelije/embrioni su prikupljeni nehirurški na Dan 15 i ocenjeni posle IETS preporuka.

[0094] Sve krave su ispitane ultrasonično na Dane 0, 4, 6 i 8 za prisustvo CL i veličinu i broj folikula i kako bi se odredili profili rasta folikula. Ovulatorni odgovor je potvrđen brojanjem broja CL i folikula >10 mm u prečniku ultrasonografijom i rektalnom palpacijom na Dan 15.

[0095] U svakom eksperimentu, tačke podataka su prvo ocenjene za normalnost i homogenost varijanse. Zbog toga što su se varijanse razlikovale među grupama, podaci su transformisani kvadratnim korenom i analizirani jednosmernom ANOVA. Analiza ukupnog odgovora posle zaključena tri eksperimenta biće izvedena pomoću dvosmerne ANOVA kako bi se detektovao efekat broja eksperimenata i tretiranje i njihova interakcija. Srednje vrednosti su upoređene zaštićenim LSD testom. Podaci o folikulama analizirani su pomoću MIXED procedure kako bi se detektovao efekat tretiranja, dan i njihova interakcija broja folikula i profila rasta. Sve analize izvedene su upotrebom Infostat analitičkog softvera (Universidad Nacional de Cordoba, Argentina).

[0096] Podaci o superovulatornim odgovorima i jajnim ćelijama/embrionima sumirani su u Tabeli 3. Iako se srednji broj CL i krava sa ≤2 CL na dan prikupljanja jajnih ćelija/embriona nisu razlikovali među grupama, podeljena-injekcija rFSH rezultovala je većim (P<0.05) brojem neovuliranih folikula. Srednji broj ukupnih jajnih ćelija/embriona, oplođenih jajnih ćelija i prenosivih embriona (Ocene 1, 2 i 3) takođe se nije razlikovao.

[0097] Tabela 3 prikazuje superovulaciju sa jednom dozom ili podeljenim pojedinačnim dozama TR55601 (rFSH).

[0098] Podaci o superovulatornim odgovorima i jajnim ćelijama/embrionima za drugo doziranje sumirani su u Tabelama 4 i 5. Srednji broj CL, folikula >10 mm i krava sa ≤2 CL na dan prikupljanja jajnih ćelija/embriona nisu se razlikovali među grupama. Srednji broj ukupnih jajnih ćelija/embriona, oplođenih jajnih ćelija i prenosivih embriona (Ocene 1, 2 i 3) takođe se nisu razlikovali među grupama.

[0099] Tabele 4 i 5 prikazuju superovulaciju sa jednom dozom TR55601 (rFSH).

[0100] Za eksperiment krajnje doze, samo podaci o folikulama su trenutno dostupni. Ne postoji značajna razlika u profilima rasta folikula i brojevima folikula na dan pre inseminacije između rFSH i Folltropin-V grupa. Podaci o ovulaciji i jajnim ćelijama/embrionima biće uskoro dostupni i biće predstavljeni odvojeno za Eksperiment 3 i zatim kombinovani sa Eksperimentima 1 i 2. Podaci o folikulama za Eksperiment 3 dostupni su i kombinovani su sa onima eksperimenata 1 i 2 i prikazani su u Tabeli 6.

[0101] Tabela 6 prikazuje tri superovulacije sa TR55601 (rFSH) u intervalima od 30 dana.

[0102] Karakteristike folikula od početka tretiranja do neposredno pre veštačke inseminacije prikazane su u Tabeli 7 i Fig.6-9.

[0103] Tabela 7 prikazuje brojeve folikula u modelu superovulacije kod krava bez laktacije. Razvoj folikula (srednja vrednost±SEM) detektovan je ultrasonografijom tovnih krava tretiranih sa 60 µg rFSH datih jednom i.m. injekcijom ili 300mg Folltropin®-V davanog i.m. injekcijama dvaput dnevno tokom 4 dana.

[0104] Brojevi folikula 3 do 5 mm u prečniku nisu se razlikovali među grupama tretiranja (Fig.6). Nisu se razlikovali ni brojevi folikula 6 do 8 mm u prečniku (Fig.7), folikula >9 mm (Fig.8) ili srednji prečnik folikula tokom dana tretiranja (Fig.9).

[0105] Rezultati dobijeni u serijama eksperimenata mogu da se protumače tako da ukazuju da rFSH proizvod indukuje superovulatorni odgovor kod tovnih krava koji nije drugačiji od onog sa Folltropin-V. Takođe, ne postoji dokaz smanjenja superovulatornog odgovora kada se uporedi sa Folltropin-V kada su krave tretirane tri puta uzastopno. Superovulatorni odgovor u krajnjem doziranju čini se da je sličan sa prva dva i ovo će biti potvrđeno posle prikupljanja jajnih ćelija/embriona. Postoji zabrinutost zbog većeg broja neovuliranih (>10 mm) folikula kod krava tretiranih sa rFSH (uglavnom zbog velikog broja neovuliranih folikula kod dve krave) što treba dalje da se ispita. Takođe je potrebno još ispitivanja da bi se ispitala optimalna doza rFSH za superovulaciju tovnih krava i krava muzara i da bi se odredili dugoročni efekti tretiranja uzastopno sa rFSH više od tri puta.

Specifičnost umetka za poboljšan poluživot

[0106] Kako bi se odredilo da li je primećen poboljšan poluživot specifičan za sekvencu umetka SEQ ID NO: 1, humana alfa subjedinica sa umetkom je modifikovana kako bi se uklonio amino terminalni valin. Dva su zatim testirana za njihovu sposobnost da proizvode cAMP, zajedno sa analogom koji nema umetak. Ispitivanja su pokazala da je umetak specifičan za sekvencu i daje superiorno vezivanje i poluživot na alfa subjedinici (videti Fig.9). Proizvodni uslovi su zatim ispitani u različitim uslovima rasta radi optimizacije za maksimalnu proizvodnju (videti Tabelu 8).

Tabela 8 prikazuje optimizaciju proizvodnje humane alfa subjedinice.

[0107] Umetak je zatim ispitan zajedno sa goveđim dvojnikom i potvrđeno je da je povećan poluživot specifičan za sekvencu umetka (videti Fig.11).

Claims (19)

Patentni zahtevi

1. Polipeptid alfa subjedinice odabran je iz grupe koju čine goveđi polipeptid alfa subjedinice divljeg tipa (SEQ ID NO:2), ovčiji polipeptid alfa subjedinice divljeg tipa (SEQ ID NO:3), konjski polipeptid alfa subjedinice divljeg tipa (SEQ ID NO:4), i svinjski polipeptid alfa subjedinice divljeg tipa (SEQ ID NO:5), pri čemu pomenuti polipeptid alfa subjedinice obuhvata:

(A) aminokiselinski umetak koji obezbeđuje potencijalno mesto glikozilacije, pri čemu je pomenuti umetak smešten neposredno posle položaja 6 ili 7 pomenutog polipeptida alfa subjedinice; i

(B) jednu ili više od sledećih supstitucija aminokiseline divljeg tipa pomenutog polipeptida alfa subjedinice sa osnovnom aminokiselinom:

(i) aminokiselina divljeg tipa na položaju 15 zamenjena je sa argininom (R),

(ii) aminokiselina divljeg tipa na položaju 17 iz SEQ ID NO: 2, 3 ili 5 zamenjena je sa argininom (R),

(iii) aminokiselina divljeg tipa na položaju 18 zamenjena je sa argininom (R), lizinom (K), ili histidinom (H),

(iv) aminokiselina divljeg tipa na položaju 20 zamenjena je sa argininom (R), i

(v) aminokiselina divljeg tipa na položaju 24 zamenjena je sa argininom (R).

2. Polipeptid alfa subjedinice prema zahtevu 1, kod kog je pomenuti umetak dužine jedne do osam aminokiselina.

3. Polipeptid alfa subjedinice prema zahtevu 1, kod kog je pomenuti umetak odabran iz grupe koju čine:

(A) Asparagin (N);

(B) Treonin (T);

(C) Cistein (C);

(D) Asparagin-Valin (NV);

(E) Treonin-Asparagin-Valin (TNV);

(F) Treonin-Izoleucin-Asparagin-Valin-Treonin (TINVT)

(G) Asparagin-Valin-Treonin-Izoleucin-Asparagin-Valin (NVTINV) (SEQ ID NO:1);

(H) Asparagin-Valin-Treonin-Izoleucin-Asparagin-Valin-Treonin (NVTINVT);

(I) Treonin-Asparagin-Valin-Treonin-Izoleucin-Asparagin-Valin (TNVTINV) (SEQ ID NO:12); i (J) Valin-Asparagin-Valin-Treonin-Izoleucin-Asparagin-Valin-Treonin (VNVTINVT) (SEQ ID NO:20).

4. Polipeptid alfa subjedinice prema zahtevu 1, kod kog je pomenuta osnovna aminokiselina histidin, lizin ili arginin.

5. Polipeptid alfa subjedinice prema zahtevu 1, kod kog je pomenuta osnovna aminokiselina arginin.

6. Polipeptid alfa subjedinice prema zahtevu 1, pri čemu pomenuti polipeptid alfa subjedinice obuhvata jednu, dve, tri, četiri ili pet supstitucija.

7. Polipeptid alfa subjedinice prema zahtevu 3, pri čemu pomenuti polipeptid alfa subjedinice obuhvata dva ili tri umetka.

8. Goveđi, ovčiji, svinjski ili konjski polipeptid alfa subjedinice prema zahtevu 1, pri čemu pomenuti polipeptid alfa subjedinice obuhvata:

(A) aminokiselinski umetak koji obezbeđuje potencijalno mesto glikozilacije, pri čemu je umetak smešten neposredno posle položaja 6 ili 7 pomenutog polipeptida alfa subjedinice, i gde je pomenuti umetak odabran iz grupe koju čine:

(a) Asparagin (N);

(b) Treonin (T);

(c) Cistein (C);

(d) Asparagin-Valin (NV);

(e) Treonin-Asparagin-Valin (TNV);

(f) Treonin-Izoleucin-Asparagin-Valin-Treonin (TINVT)

(g) Asparagin-Valin-Treonin-Izoleucin-Asparagin-Valin (NVTINV) (SEQ ID NO:1);

(h) Asparagin-Valin-Treonin-Izoleucin-Asparagin-Valin-Treonin (NVTINVT);

(i) Treonin-Asparagin-Valin-Treonin-Izoleucin-Asparagin-Valin (TNVTINV) (SEQ ID NO:12); i (j) Valin-Asparagin-Valin-Treonin-Izoleucin-Asparagin-Valin-Treonin (VNVTINVT) (SEQ ID NO:20); i

(B) najmanje jednu supstituciju aminokiseline divljeg tipa sa osnovnom aminokiselinom, gde je pomenuta supstitucija odabrana iz grupe koju čine:

(i) aminokiselina divljeg tipa na položaju 15 zamenjena je sa argininom (R),

(ii) aminokiselina divljeg tipa na položaju 17 iz SEQ ID NO: 2, 3 ili 5 zamenjena je sa argininom (R),

(iii) aminokiselina divljeg tipa na položaju 18 zamenjena je sa argininom (R), lizinom (K), ili histidinom (H),

(iv) aminokiselina divljeg tipa na položaju 20 zamenjena je sa argininom (R), i

(v) aminokiselina divljeg tipa na položaju 24 zamenjena je sa argininom (R).

9. Goveđi, ovčiji, svinjski ili konjski polipeptid alfa subjedinice prema zahtevu 1, kod kog jedna ili više od sledećih supstitucija nastaje:

(A) aminokiselina divljeg tipa na položaju 15 zamenjena je sa argininom (R),

(B) aminokiselina divljeg tipa na položaju 17 iz SEQ ID NO: 2, 3 ili 5 zamenjena je sa argininom (R),

(C) aminokiselina divljeg tipa na položaju 18 zamenjena je sa argininom (R), lizinom (K), ili histidinom (H),

(D) aminokiselina divljeg tipa na položaju 20 zamenjena je sa argininom (R), i

(E) aminokiselina divljeg tipa na položaju 24 zamenjena je sa argininom (R),

i kod kog je neposredno posle položaja 6 pomenutog polipeptida alfa subjedinice, jedan od sledećih polipeptida umetnut:

(a) Asparagin-Valin-Treonin-Izoleucin-Asparagin-Valin (NVTINV) (SEQ ID NO:1);

(b) Treonin-Asparagin-Valin-Treonin-Izoleucin-Asparagin-Valin (TNVTINV) (SEQ ID NO:12);

(c) Valin-Asparagin-Valin-Treonin-Izoleucin-Asparagin-Valin-Treonin (VNVTINVT) (SEQ ID NO:20); (d) Asparagin-Valin (NV); i

(e) Treonin-Asparagin-Valin (TNV).

10. Polipeptid alfa subjedinice prema zahtevu 1, zahtevu 3, ili zahtevu 8, pri čemu pomenuti polipeptid alfa subjedinice obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa najmanje 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sa sekvencom odabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, i SEQ ID NO:10.

11. Modifikovan glikoproteinski hormon koji obuhvata polipeptid alfa subjedinice prema zahtevu 1, zahtevu 3, zahtevu 8, ili zahtevu 9, i beta subjedinicu luteinizirajućeg hormona (LH), horionskog gonadotropina (CG), folikularnog stimulišućeg hormona (FSH) ili tireostimulišućeg hormona (TSH).

12. Modifikovan glikoproteinski hormon koji obuhvata polipeptid alfa subjedinice prema zahtevu 1, zahtevu 3, zahtevu 8, ili zahtevu 9, i beta subjedinicu folikularnog stimulišućeg hormona (FSH).

13. Modifikovan glikoproteinski hormon koji obuhvata polipeptid alfa subjedinice prema zahtevu 1, zahtevu 3, zahtevu 8, ili zahtevu 9 za upotrebu u lečenju ovulacijske disfunkcije, defekata lutealne faze, neobjašnjene neplodnosti, neplodnosti muškog faktora, vremenski ograničenog začeća, male ekspresije FSH receptora, male osetljivosti FSH receptora, nedostataka kod vezivanja FSH receptora, nedostataka FSH receptorskog spajanja, male proizvodnje testosterona, ćelavosti kod muškaraca, ili nedostatka funkcije ili povrede hipofize.

14. Modifikovan glikoprotein prema zahtevu 11 ili zahtevu 12 za upotrebu u lečenju ovulacijske disfunkcije, defekata lutealne faze, neobjašnjene neplodnosti, neplodnosti muškog faktora, vremenski ograničenog začeća, male ekspresije FSH receptora, male osetljivosti FSH receptora, nedostataka kod vezivanja FSH receptora, nedostataka FSH receptorskog spajanja, male proizvodnje testosterona, ćelavosti kod muškaraca, ili nedostatka funkcije ili povrede hipofize.

15. Ne-terapeutski postupak za stimulisanje ovulacije kod neke ne-humane životinje, koji obuhvata davanje modifikovanog glikoproteinskog hormona koji obuhvata polipeptid alfa subjedinice prema zahtevu 1, zahtevu 3, zahtevu 8, ili zahtevu 9 pomenutoj životinji.

16. Ne-terapeutski postupak za stimulisanje ovulacije kod neke ne-humane životinje, koji obuhvata davanje modifikovanog glikoproteina prema zahtevu 11 ili zahtevu 12 pomenutoj životinji.

17. Modifikovan glikoproteinski hormon za upotrebu prema zahtevu 13 ili zahtevu 14, ili ne-terapeutski postupak prema zahtevu 15 ili zahtevu 16, pri čemu je pomenuta životinja konj, krava, ovca ili svinja.

18. Polipeptid alfa subjedinice prema zahtevu 1, pri čemu je pomenuti polipeptid alfa subjedinice goveđi polipeptid alfa subjedinice divljeg tipa (SEQ ID NO:2) koji obuhvata:

(A) polipeptid Asparagin-Valin-Treonin-Izoleucin-Asparagin-Valin (NVTINV) (SEQ ID NO:1) umetnut neposredno posle položaja 6 pomenutog polipeptida alfa subjedinice; i

(b) supstitucije sa argininom (R) na položajima 15, 17, 18, 20, i 24.

19. Polipeptid alfa subjedinice prema zahtevu 1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:7.