RS58891B1 - Uslovno replicirajući citomegalovirus kao vakcina za cmv - Google Patents

Description

OBLAST PRONALASKA

Predmetni pronalazak se odnosi na postupke za indukovanje imunog odgovora na citomegalovirus (CMV) upotrebom genetički modifikovanog CMV sa uslovno defektnom replikacijom. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na CMV koji je rekombinantno promenjen tako da omogući spoljšanju kontrolu virusne replikacije. Kompozicije koje sadrže CMV sa defektnom replikacijom su takođe obuhvaćene predmetnim pronalaskom.

OSNOVA PRONALASKA

Citomegalovirus (CMV), takođe poznat kao humani herpesvirus 5 (HHV-5), je herpes virus klasifikovan kao član beta subfamilije herpesvirida. Prema Centrima za kontrolu i prevenciju bolesti, CMV infekcija je prilično sveprisutna u ljudskoj populaciji, sa procenjenih 40-80% inficiranih u adultnoj populaciji SAD-a. Virus se primarno širi preko telesnih tečnosti i često prolazi sa trudnih majki na fetus ili novorođenče. Kod večine individua, CMV infekcija je latentna, iako aktivacija virusa može da rezultira u povišenoj temperaturi, groznici, umoru, glavoboljama, mučnini i splenomegaliji.

Iako su većina humanih CMV infekcija asimptomatske, CMV infekcije kod imunokompromitovanih individua, (kao što su HIV-pozitivni pacijenti, pacijenti sa alogenim transplantom i pacijenti sa kancerom) ili osobe čiji imuni sistem još uvek nije potpuno razvijen (kao što su novorođenčad) mogu biti naročito problematični (Mocarski et al., Cytomegalovirus, in Field Virology, 2701-2772, Editor: Knipes and Howley, 2007). CMV infekcija kod takvih individua može da izazove težak morbiditet, uključujući pneumoniju, hepatitis, encefalitis, kolitis, uveitis, retinitis, slepilo i neuropatiju, pored ostalih štetnih stanja. Pored toga, CMV infekcija u toku trudnoće je vodeći uzrok oštećenja koja se detektuju prilikom rođenja (Adler, 2008 J. Clin Virol, 41:231; Arvin et al, 2004 Clin Infect Dis, 39:233; Revello et al, 2008 J Med Virol, 80:1415). CMV inficira različite ćelije in vivo, uključujući monocite, makrofage, dendritske ćelije, neutrofile, endotelijalne ćelije, epitelijalne ćelije, fibroblaste, neurone, ćelije glatkih mišića, hepatocite, i stromalne ćelije (Plachter et al. 1996, Adv. Virus Res.46:195). Iako se klinički CMV izolati repliciraju u različitim ćelijskim tipovima, laboratorijski sojevi AD169 (Elek & Stern, 1974, Lancet 1:1) i Towne (Plotkin et al., 1975, Infect. Immun. 12:521) se repliciraju skoro isključivo u fibroblastima (Hahn et al., 2004, J. Virol.78:10023). Ograničenje u tropizmu, koje rezultira iz nekoliko pasaža i konačne adaptacije virusa u fibroblastima, je utvrđeno kao marker atenuacije (Gerna et al., 2005, J. Gen. Virol. 86:275; Gerna et al, 2002, J. Gen Virol. 83:1993; Gerna et al, 2003, J. Gen Virol. 84:1431; Dargan et al, 2010, J. Gen Virol.

91:1535). Mutacije koje izazivaju gubitak tropizma epitelijalne ćelije, endotelijalne ćelije, leukocita i dendritske ćelije u humanim laboratorijskim sojevima CMV su mapirane na tri otvorena okvira čitanja (ORFs): UL128, UL130 i UL131 (Hahn et al., 2004, J. Virol.78:10023; Wang and Shenk, 2005 J. Virol. 79:10330; Wang and Shenk, 2005 Proc Natl Acad Sci USA.

102:18153). Biohemijske i rekonstitucione studije pokazuju da se UL128, UL130 i UL131 sklapaju na gH/gL osnovu tako da formiraju pentamerni gH kompleks (Wang and Shenk, 2005 Proc Natl Acad Sci USA. 102:1815; Ryckman et al, 2008 J. Virol. 82:60). Obnova ovog kompleksa u virionima obnavlja virusni epitelijalni tropizam u laboratorijskim sojevima (Wang and Shenk, 2005 J. Virol.79:10330).

Sumnja se na gubitak endotelijalnog i epitelijalnog tropizma kao nedostatak u prethodno procenjenim kao vakcinama kao što je Towne (Gerna et al, 2002, J. Gen Virol. 83:1993; Gerna et al, 2003, J. Gen Virol. 84:1431). Neutralizujuća antitela u serumima iz humanih subjekata prirodne CMV infekcije imaju više od 15-puta veću aktivnost protiv ulaska virusa kroz epitelijum nego protiv ulaska u fibroblast (Cui et al, 2008 Vaccine 26:5760). Ljudi sa primarnom infekcijom brzo razvijaju neutralizujuća antitela na ulazak virusa u endotelijum i epitelijum, ali samo sporo razvijaju neutralizujuća antitela na ulazak virusa u fibroblast (Gerna et al, 2008 J. Gen. Virol. 89:853). Pored toga, neutralizujuća aktivnost protiv ulaska virusa u epitelijum i endotelijum je odsutna u imunim serumima iz humanih subjekata koji su primali Towne vakcinu (Cui et al, 2008 Vaccine 26:5760). Nedavno, opisan je panel humanih monoklonskih antitela iz četiri davaoca sa HCMV infekcijom, i potentniji neutralizujući klonovi iz panela prepoznali su antigene pentamernog gH kompleksa (Macagno et al, 2010 J. Virol.84:1005).

Citomegalovirus sa uslovno defektnom replikacijom sa jednim destabilizovanim proteinom izabranim od IE1/2, IE1/3, UL51 i UL77 opisan je za svrhu olašavanja analize genskih funkcija (Glass et al., 2009 Nature Methods 6:577).

REZIME PRONALASKA

Predmetni pronalazak je usmeren na CMS sa uslovno defektnom replikacijom (rdCMV) i upotrebu rdCMV u kompozicijama i postupcima za lečenje i/ili smanjenje verovatnoće infekcije sa CMV ili patologije povezane sa infekcijom kod pacijenta. rdCMV koji je ovde opisan sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira jedan ili više fuzionih proteina koji sadrže esencijalni protein fuzionisan za destabilizujući protein. U odsustvu stabilizujućeg sredstva, fuzioni protein je razložen. Na taj način, rdCMV može biti uzgajan u kulturi tkiva pod uslovima koji omogućavaju replikaciju (tj., u prisustvu stabilizujućeg sredstva), ali replikacija je smanjena, i poželjno sprečena, kada je primenjen na pacijenta (u odsustvu stabilizujućeg sredstva).

Jedan primer izvođenja predmetnog pronalaska je CMV. rdCMV sadrži nukleinsku ksielinu koja kodira jedan ili više fuzionih proteina koji sadrže esencijalni protein fuzionisan za destabilizujući protein. Nukleinske kiseline koje kodiraju divlji tip esencijalnog proteina više nisu prisutne u rdCMV i na taj način fuzioni protein je potreban za virusnu replikaciju. U poželjnim primerima izvođenja, esencijalni proteini su izabrani iz grupe koja se sastoji od IE1/2, UL51, UL52, UL79 i UL84 i destabilizujući protein je FKBP ili njegov derivat.

Sledeći primer izvođenja predmetnog pronalaska je kompozicija koja sadrži izolovani rdCMV i farmaceutski prihvatljiv nosač. Kompozicija može dalje da sadrži ađuvans uključujući, ali bez ograničenja na ISCOMATRIX® ađuvans i aluminijum fosfatni ađuvans.

Sledeći primer izvođenja prema predmetnom pronalasku je upotreba rdCMV kompozicije za indukovanje imunog odgovora protiv CMV kod pacijenta. Pacijenti mogu biti tretirani profilaktički ili terapeutski primenom rdCMV prema predmetnom pronalasku. Profilaktički tretman obezbeđuje dovoljan zaštitni imunitet za smanjenje verovatnoće ili težine CMV infekcije, uključujući primarne infekcije, povratne infekcije (tj., one koje su rezultat reaktivacije latentnog CMV) i super-infekcije (tj., one koje su rezultat infekcije sa različitim sojem CMV nego što je prethodno pacijent imao). U specifičnim primerima izvođenja, žene u reproduktivnom dobu, naročito žene u ranom adolescentnom dobu, su vakcinisane radi smanjenja verovatnoće CMV infekcije (bilo primarne, povratne ili super-infekcije) u toku trudnoće i na taj način smanjenja verovatnoće prenošenja CMV na fetus. Terapeutski tretman može biti izveden tako da se smanji dužina/težina trenutne CMV infekcije.

Sledeći primer izvođenja predmetnog pronalaska su postupci za pripremu rdCMV prema pronalasku koji sadrže umnožavanje rdCMV na epitelijalnim ćelijama, kao što su ARPE-19 ćelije (ATCC pristupni br. CRL-2302), u prisustvu Shield-1. U nekim primerima izvođenja, rdCMV je umnožavan na epitelijalnim ćelijama na mikronosačima ili drugim sistemima ćelijske kulture visoke gustine.

KRATAK OPIS CRTEŽA

SL. 1A-1B prikazuju šematski dijagram kontrukcije soja CMV sa obnovljenom ekspresijom pentamernog gH kompleksa. (A) Strategija za generisanje samo-uklanjajućeg bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC) za manipulaciju AD169 virusnog genoma. (B) Popravka mutacije sa premeštanjem okvira u UL131 da bi se obnovila njegova ekspresija. (C) Zamena GFP sa genom za cre rekombinazu da bi se stvorio samo-uklanjajući CMV BAC.

SL. 2A-2D prikazuju efekat konvencionalnih postupaka inaktivacije na imunogenost gH kompleksa. γ-zračenje (A, B) i β-propiolaktonE (BPL) (C, D) su korišćeni za inaktivaciju gH kompleksa koji eksprimira CMV. Kinetika inaktivacije je određivana pomoću analize formiranja plakova (A, C) dok je imunogenost određivana procenom seruma iz miševa koji su primali CMV za neutralizacionu aktivnost protiv ulaska virusa u epitelijalne ćelije (B, D).

SL. 3 prikazuje proizvodnju virusnog potomstva, zavisnu od koncentracije Shield 1, CMV-a koji eksprimira kompleks gH sa različitim esencijalnim proteinima fuzionisanim za FKBP derivat. ARPE-19 ćelije su inficirane sa rdCMV virusima u multiplicitetu od 0.01 PFU/ćeliji za 1 čas, isprane dva puta svežim medijumom i inkubirane u medijumu za rast koji sadrži 0, 0.05, 0.10.5 ili 2 µM Shield-1. Sedam dana posle infekcije, virus bez ćelija je sakupljen i titri virusa su određivani pomoću TCID50 analize na ARPE-19 ćelijama u prisustvu 2 µM Shield 1.

SL. 4A-4D prikazuju kinetiku rasta rdCMV u ARPE-19 ćelijama. Ćelije su inficirane sa virusima koji sadrže (A) IE1/2, (B) UL51, (C) IE1/2-UL51 fuzione proteine ili (D) roditeljski beMAD virus na multiplicitetu od 0.01 PFU/ćeliji. Posle jednog časa, ćelije su isprane dva puta sa svežim medijumom, i inkubirane u odsustvu (prazan krug) ili prisustvu (obojen krug) 2 µM Shield-1. Virus bez ćelija je sakupljen u naznačenim vremenskim tačkama posle infekcije, i infektivan virus je kvantitativno određivan pomoću TCID50 analize na ARPE-19 ćelijama u medijumu koji sadrži 2 µM Shield-1.

SL. 5A-5E Kinetika rasta IE1/2-UL51 rdCMV u različitim ćelijskim tipovima. (A) MRC-5 (B) HUVEC (C) AoSMC (D) SKMC (E) CCF-STTG1 ćelije su inficirane sa rdCMV virusom i inkubirane jedan čas. Ćelije su isprane dva puta svežim medijumom, i zatim inkubirane u odsustvu (prazan krug) ili prisustvu (obojeni krug) 2 µM Shield-1. Virus bez ćelija je sakupljen u naznačenim vremenskim tačkama posle infekcije, i infektivan virus je kvantitativno određivan pomoću TCID50 analize na ARPE-19 ćelijama u medijumu koji sadrži 2 µM Shield-1.

SL. 6A-6C Analiza imunogenosti IE1/2-UL51 rdCMV kod miševa, zečeva i rezus makaki majmuna. (A) Miševi su imunizovani u nedelji 0 i 4 sa beMAD (prazan krug) ili IE 1/2-UL51 rdCMV(obojeni krug). (B) Zečevi su imunizovani u nedelji 0, 3 i 8 sa 10 µg beMAD ili naznačenim rdCMV. (C) Rezus makaki majmuni su imunizovani u nedelji 0 i 8 sa 100 µg beMAD ili IE1/2-UL51rdCMV. U svakom slučaju, uzorci seruma su sakupljeni i analizirani pomoću CMV mikro-neutralizacione analize na ARPE-19 ćelijama. Linije ukazuju na geometrijsku sredinu titara neutralizacije (NT50) u svakoj grupi.

SL. 7 prikazuje longitudinalne neutralizujuće titre kod rezus makaki majmuna vakcinisanih sa dvostrukim fuzionim virusom IE1/2-UL51. Grupe rezus makaki majmuna (n=5) su vakcinisane sa naznačenom dozom vakcine ili formulacijama u nedelji 0, 8 i 24 (prikazane kao crveni trouglovi), dok je jedna grupa primala gb/mf59 (30 mg/dozi) u nedelji 0, 4 i 24. Imuni serumi su sakupljeni u naznačenim vremenskim tačkama i procenjivani u analizi neutralizacije virusa. GMT NT50 titara je prikazan na grafikonu longitudinalno sa standardnom greškom za grupu. AAHS: amorfni aluminijum hidroksilfosfat sulfat; IMX: ISCOMATRIX; HNS: bazni pufer. SL. 8A-8D prikazuju IFN-γ ELISPOT kod rezus makaki majmuna sa dvostrukim fuzionom virusnom IE1/2-UL51 vakcinacijom sa 100µg (A) ili 10 µg (B-D) po dozi. Nije korišćen ađuvans (A-B), ili je korišćen AAHS (C) ili ISCOMATRIX (D). PBMC su stimulisane sa peptidnim pulovima koji predstavljaju HCMV antigene. Sivi stubovi koji predstavljaju GMT za svaki antigen grupe (n=5). Stopa odgovora za svaki antigen je prikazana na vrhu svakog antigena unutar panela.

SL. 9A-9B prikazuju da je vakcinacija virusom sa dvostrukom fuzijom IE1/2-UL51 sposobna da indukuje T-ćelijske odgovore oba CD8+ (A) i CD4+ (B) fenotipa kod rezus makaki majmuna. PBMC su sakupljeni iz majmuna kojima je davana 100 µg ili 10 µg doza vakcine sa ISCOMATRIX® kao ađuvansom. PBMCs su stimulisane sa peptidnim pulovima koji predstavljaju HCMV antigene, nakon čega sledi bojenje za IFN-γ i CD4+/CD8+ površinske T-ćelijske markere. Rezultati su predstavljeni kao broj CD4+/CD8+ pozitivnih, IFN-γ pozitivnih ćelija na milion PBMC. Linije predstavljaju geometrijske sredine (GMT) grupe koja prima istu vakcinu (n=5). Brojevi na dnu grafikona predstavljaju GMT obe vakcinisane grupe (n=10). CMV: prečišćeni virus; SEB: mitogen korišćen kao pozitivno kontrolno sredstvo; IMX: ISCOMATRIX.

SL. 10 prikazuje da Merck aluminijum fosfatni ađuvans (MAPA) može da poveća titre neutralizujućeg antitela kod majmuna. Rezus majmuni su imunizovani sa 30 µg dozom vakcine virusa sa dvostrukom fuzijom formulisane u HNS (bazni pufer), AAHS ili MAPA u nedelji 0 i 8. Uzorci seruma su sakupljeni u nedelji 12 i procenjivani za titre neutralizacije. Linije predstavljaju geometrijske sredine za grupu.

SL. 11A-11B prikazuje stabilnost CMV koji eksprimira gH u Hankovom ravnotežnom rastvoru soli (HBSS) na različitim temperaturama. (A) Uzorci CMV u HBSS su čuvani na naznačenim temperaturama u trajanju od 4 dana pre merenja stabilnosti CMV virusa upotrebom analize ulaska virusa. (B) EC50 vrednosti su izračunavane za uzorke upotrebom rezultata analize ulaska virusa. * pokazuje da se EC50 nije mogla izračunati kao posledica potpunog gubitka infektivnosti.

SL. 12A-12B pokazuju efekat pH na stabilnost CMV koji eksprimira gH na sobnoj temperaturi. (A) CMV uzorci u puferima sa različitom pH su čuvani na sobnoj temperaturi u trajanju od 4 dana pre merenja stabilnosti CMV virusa upotrebom analize ulaska virusa. (B) EC50 vrednosti su izračunavane za uzorke upotrebom rezultata analize ulaska virusa.

SL. 13A-13B prikazuju efekat samo uree ili u kombinaciji sa natrijum hloridom na CMV virus koji eksprimira gH. (A) 2% urea pojedinačno ili u kombinaciji sa 150mM NaCl je dodata u CMV u 25 mM histidinskom puferu, pH 6 na sobnoj temperaturi u trajanju od 4 dana pre merenja stabilnosti CMV virusa upotrebom analize ulaska virusa. (B) EC50 vrednosti su izračunavane za uzorke upotrebom rezultata analize ulaska virusa.

SL. 14A-14B prikazuju efekat jonske snage na stabilnost CMV virusa koji eksprimira gH. (A) Rastuće koncentracije NaCl (0 mM, 75 mM, 150 mM i 320 mM NaCl) su dodavane u CMV u 25 mM histidinskom puferu, pH 6 na sobnoj temperaturi u trajanju od 4 dana pre merenja stabilnosti CMV virusa upotrebom analize ulaska virusa. (B) EC50 vrednosti su izračunavane za uzorke upotrebom rezultata analize ulaska virusa.

SL. 15 prikazuje efekat krioprotektanata na stabilnost CMV koji eksprimira gH protiv ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja. Naznačeni krioprotektanti su dodati u CMV u 25 mM histidinski pufer, pH 6 i podvrgnuti tri ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja pre merenja stabilnosti CMV virusa upotrebom analize ulaska virusa. EC50 vrednosti su izračunavane za uzorke upotrebom rezultata analize ulaska virusa.

SL. 16A-16B prikazuju efekat temperature čuvanja na indukciju CMV neutralizujućih antitela u studiji imunogenosti miševa. Miševi su imunizovani na dan 0 i data im je buster injekcija na dan 21, nakon čega sledi na dan 28 vađenje krvi. Mišji serum je testiran za neutralizaciona antitela protiv CMV koji eksprimira gH upotrebom ARPE-19 ćelija. NT50 titri su dobijeni pomoću aproksimacije ne-linearne krive. (A) Uzorci CMV su čuvani na različitim temperaturama u trajanju od 3 meseca pre studije imunogenosti. (B) Uzorci CMV su čuvani na različitim temperaturama u trajanju od 8 časova posle odmrzavanja i pre studije imunogenosti.

DETALJAN OPIS PRONALAKA

Predmetni pronalazak je usmeren na CMV sa uslovno defektnom replikacijom (rdCMV) i upotebu rdCMV u kompozicijama i postupcima za lečenje i/ili smanjenje verovatnoće infekcije sa CMV ili patologije povezane sa takvom infekcijom kod pacijenta. rdCMV koji je ovde opisan kodira jedan ili viuše fuzionih proteina koji sadrže esenmcijalni protein fuzionisan sa destabilizujućim proteinom umesto divljeg tipa esencijalnog proteina. U odsustvu stabilizujućeg sredstva, fuzioni protein je razložen pomoću mašinerije ćelije domaćina. U prisustvu stabilizujućeg sredstva, fuzioni protein je stabilizovan i nije razložen.

Pogodni fuzioni proteini za upotrebu u predmetnom pronalasku zadržavaju dovoljnu aktivnost esencijalnog proteina da bi se olakšala virusna replikacija u ćeliji domaćinu u prisustvu stabilizujućeg sredstva i izazvalo smanjenje (poželjno veće od 50%, 75%, 90%. 95% ili 99% smanjenja) u replikaciji CMV u odsustvu stabilizujućeg sredstva. Poželjno, esencijalni protein za upotrebu u fuzionom proteinu kodira nestrukturne proteine i na taj način nisu pakovani u rdCMV virione. Pogodni esencijalni proteini koji su ovde identifikovani obuhvataju CMV proteine kodirane od strane sencijalnih gena IE1/2, UL51, UL52, UL79 i UL84.

Primer destabilizujućeg proteina i stabilizujućeg sredstva je opisan u SAD patentnoj objavi 2009/0215169 koja opisuje kompozicije, sisteme i postupke za modulaciju stabilnosti proteina upotrebom malog molekula. Ukratko, protein je fuzionisan za protein koji utiče na stabilnost, FKBP ili njegov derivat. Egzogeno dodat, ćelijski permeabilan mali molekul, Shield-1 (Shld-1), interaguje sa FKBP ili njegovim derivatom i stabilizuje fuzioni protein. U odsustvu Shield-1, FKBP ili njegov derivat usmerava fuzioni protein da se razloži pomoću mašinerije ćelije domaćina.

U primeru izvođenja predmetnog pronalaska, esencijalni CMV protein je fuzionisan sa FKBP ili njegovim derivatom. U prisustvu Shield-1, fuzioni protein je stabilizovan. Međutim, u odsustvu Shield-1, FKBP ili njegov derivat usmerava fuzioni protein da se razloži pomoću mašinerije ćelije domaćina.

U odsustvu fuzionog proteina, replikacija rdCMV je smanjena (poželjno za više od 50%, 75%, 90%. 95% ili 99% u poređenju sa CMV koji ne sadrži destabilizovani esencijalni protein) ili sprečena.

Rekombinantni virus koji se koristi u postupku prema pronalasku takođe ispoljava imunogeni pentamerni gH kompleks na svom virionu.

Primeri izvođenja takođe obuhvataju rekombinantni CMV ili njegove kompozicije, opisane ovde, ili vakcinu koja sadrži ili se sastoji od navedenog CMV ili kompozicija (i) za upotrebu u, (ii) za upotrebu kao lek za, ili (iii) za upotrebu u pripremi leka za: (a) terapiju (npr., ljudskog tela); (b) medicinu; (c) inhibiciju replikacije CMV; (d) lečenje ili profilaksu infekcije sa CMV ili, (e) lečenje ili profilaksu, ili odlaganje početka ili napredovanja bolesti (jedne ili više) povezane sa CMV. U ovim upotrebama, rekombinantni CMV, njegove kompozicije, i/ili vakcine koje sadrže ili se sastoje od navedenog CMV ili kompozicija može izborno biti korišćen u kombinaciji sa jednim ili više anti-virusnih sredstava (npr., anti-virusnih jedinjenja ili antivirusnih imunoglobulina; kombinacija vakcina, opisanih u daljem tekstu).

Kao što je ovde korišćen, termin "indukuje imuni odgovor" označava sposobnost CMV sa uslovno defektnom replikacijom da proizvodi imuni odgovor kod pacijenta, poželjno sisara, poželjnije čoveka, na koga se primenjuje, pri čemu odgovor obuhvata, ali bez ograničenja na, proizvodnju elemenata (kao što su antitela) koja specifično vezuju, i poželjno neutralizuju, CMV i/ili izazivaju T ćelijsku aktivaciju. "Zaštitni imuni odgovor" je imuni odgovor koji smanjuje verovatnoću da će pacijent doći u kontakt sa CMV infekcijom (uključujući primarnu, povratnu i/ili super-infekciju) i/ili poboljšava najmanje jednu patologiju povezanu sa CMV infekcijom i/ili smanjuje težinu/dužinu CMV infekcije.

Kao što je ovde korišćen, termin "imunološki efikasna količina" označava količinu imunogena koja može da indukuje imuni odgovor protiv CMV kada je primenjena na pacijenta koja može da štiti pacijenta od CMV infekcije (uključujući primarne, povratne i/ili super-infekcije) i/ili poboljšava najmanje jednu patologiju povezanu sa CMV infekcijom i/ili smanjuje težinu/dužinu CMV infekcije kod pacijenta. Količina bi trebalo da je dovoljna da značajno smanji verovatnoću ili težinu CMV infekcije. Životinjski modeli poznati u stanju tehnike mogu biti korišćeni za procenu zaštitnog efekta primene imunogena. Na primer, imuni serumi ili imune T ćelije od individua na koje je primenjivan imunogen mogu biti analizirani za neutralizaciju kapaciteta antitelima ili citotoksičnim T ćelijama ili kapaciteta proizvodnje citokina od strane imunih T ćelija. Analize uobičajeno korišćene za takve procene obuhvataju, ali bez ograničenja na analizu neutralizacije virusa, ELISA anti-virusnog antigena, ELISA interferon-gama citokina, ELISPOT interferon-gama, unutarćelijsko multi-citokinsko bojenje (ICS), i analizu citotoksičnosti sa oslobađanjem<51>hroma. Životinjski modeli sa stimulacijom antigenom takođe mogu biti korišćeni za određivanje imunološki efikasne količine imunogena.

Kao što je ovde korišćen, termin "virus sa uslovno defektnom replikacijom" označava virusne čestice koje mogu da se repliciraju u određenim sredinama, ali ne druge. U poželjnim primerima izvođenja, virus je napravljen virusom sa uslovno defektnom replikacijom putem destabilizacije jednog ili više proteina esencijalnih za virusnu replikaciju. Nukleinske kiseline koje kodiraju divlji tip, ne-destabilizovane esencijalne proteine nisu više prisutne u virusu sa uslovno defektnom replikacijom. Pod uslovima gde su jedan ili više esencijalnih proteina destabilizovani, virusna replikacija je smanjena za poželjno više od 50%, 75%, 90%. 95%, 99% ili 100% u poređenju sa virusom sa nedestabilizovanim esencijalnim proteinima. Međutim, pod uslovima koji stabilizuju destabilizovane esencijalne proteine, virusna replikacija može da se javi na poželjno najmanje 75%, 80%, 90%, 95%, 99% ili 100% od količine replikacije CMV koji ne sadrži destabilizovani esencijalni protein. U poželjnijim primerima izvođenja, jedan il više esencijalnih proteina su destabilizovani fuzijom sa destabilizujućim proteinom kao što je FKBP ili njegov derivat. Takvi fuzioni proteini mogu biti stabilizovani preko prisustva stabilizujućeg sredstva kao što je Shield-1. Kao što je ovde korišćen, termin "rdCMV" označava citomegalovirus sa uslovno defektnom replikacijom.

U poželjnim primerima izvođenja, imuni odgovor indukovan virusom sa defektnom replikacijom u poređenju sa njegovim živim virusnim parnjakom je isti ili značajno sličan u stepenu i/ili širini. U drugim poželjnim primerima izvođenja, morfologija virusa sa defektnom replikacijom pomoću elektron-mikroskopske analize se ne može razlikovati ili je značajno slična njegovom živom virusnom parnjaku.

Kao što je ovde korišćen, termin "FKBP" označava destabilizujući protein od SEQ ID NO:11. Fuzioni proteini koji sadrže FKBP su razloženi pomoću mašinerije ćelije domaćina. Kao što je ovde korišćen, termin "FKBP derivat" označava FKBP protein ili njegov deo koji je promenjen sa jedom ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija i/ili adicija. FKBP derivati zadržavaju značajno sve od destabilizujućih osobina FKBP kada su fuzionisani za protein i takođe zadržavaju uglavnom svu sposobnost FKBP da budu stabilizovani pomoću Shield-1. Poželjni FKBP derivati imaju jednu ili više od sledećih supstitucija na označenim aminokiselinskim položajima F15S, V24A, H25R, F36V, E60G, M66T, R71G, D100G, D100N, E102G, K105I i L106P. FKBP derivat koji ima F36V i L106P supstitucije (SEQ ID NO:12) je naročito poželjan. U poželjnim primerima izvođenja, nukleinska kiselina koja kodira FKBP ili FKBP derivat sadrži najmanje neke kodone koji nisu uobičajeno korišćeni kod ljudi za endogeni FKBP. Ovo smanjuje verovatnoću da će FKBP ili FKBP derivat fuzionog proteina da se preuredi ili rekombinuje sa njegovim parnjakom u humanom genomu. Nukleinsko kiselinska sekvenca od SEQ ID NO:13 kodira SEQ ID NO:12 upotrebom takvih kodona.

Kao što su ovde korišćeni, termini "Shield-1" ili "Shld1" označavaju sintetički mali molekul koji se vezuje za divlji tip FKBP i njegov derivat i deluje kao stabilizujuće sredstvo. Vezivanje je oko 1,000-puta čvršće za F36V derivat u poređenju sa divljim tipom FKBP (Clackson et al., 1998, PNAS 95:10437-42). Shield-1 može biti sintetisan (esencijalno kao što je opisano u Holt et al., 1993, J. Am. Chem. Soc.115:9925-38 i Yang et al., 2000, J. Med. Chem. 43:1135-42 i Grimley et al., 2008, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 18:759) ili je komercijalno dostupan iz Cheminpharma LLC (Farmington, CT) ili Clontech Laboratories, INC. (Mountain View, CA). Soli Shield-1 takođe mogu biti korišćene u postupcima prema pronalasku. Shield-1 ima sledeću strukturu:

Kao što su ovde korišćeni, termini "fuzionisan" ili "fuzioni protein" označavaju dva polipetida uređena u okviru kao deo iste kontinuirane sekvence aminokiselina. Fuzija može biti usmerena tako da nema dodatnih aminokiselinskih ostataka između polipeptida ili indirektna tako da je prisutan mali aminokiselinski linker za poboljšanje učinka ili dodavanje funkcionalnosti. U poželjnim primerima izvođenja, fuzija je direktna.

Kao što su ovde korišćeni, termini "pentamerni gH kompleks" ili "gH kompleks" označavaju kompleks od pet virusnih proteina na površini CMV viriona. Kompleks je napravljen od proteina kodiranih sa UL128, UL130, i UL131 sklopljenih na gH/gL osnovu (Wang and Shenk, 2005 Proc Natl Acad Sci USA. 102:1815; Ryckman et al, 2008 J. Virol. 82:60). Sekvence složenih proteina iz CMV soja AD 169 su prikazane u GenBank pristupnim br. NP_783797.1 (UL128), NP_040067 (UL130), CAA35294.1 (UL131), NP_040009 (gH, takođe poznat kao UL75) i NP_783793 (gL, takođe poznat kao UL115). Neki atenuisani CMV sojevi imaju jednu ili više mutacija u UL131 tako da protein nije eksprimiran i prema tome gH kompleks nije formiran. U takvim slučajevima, UL131 bi trebalo da je popravljen (upotrebom postupaka kao što su oni u Wang and Shenk, 2005 J. Virol.79:10330) tako da je gH kompleks eksprimiran u rdCMV prema pronalasku. Virusi predmetnog pronalaska eksprimiraju pet virusnih proteina koji grade pentamerni gH kompleks i sklapaju pentamerni gH kompleks na virusnom omotaču.

Kao što je ovde korišćen, termin "esencijalni protein" označava virusni protein koji je potreban za virusnu replikaciju in vivo i u kulturi tkiva. Primeri esencijalnih proteina u CMV obuhvataju, ali bez ograničenja na, IE1/2, UL37x1, UL44, UL51, UL52, UL53, UL56, UL77, UL79, UL84, UL87 i UL105.

Kao što je ovde korišćen, termin "destabilizovani esencijalni protein" označava esencijalni protein koji je eksprimiran i izvršava svoju funkciju u virusnoj replikaciji i razložen je u odsustvu stabilizujućeg sredstva. U poželjnim primerima izvođenja, esencijalni protein je fuzionisan za destabilizujući protein kao što je FKBP ili njegov derivat. Pod normalnim uslovima rasta (tj., bez prisutnog stabilizujućeg sredstva) fuzioni protein je eksprimiran, ali razložen pomoću mašinerije ćelije domaćina. Razlaganje ne omogućava da esencijalni protein funkcioniše u virusnoj replikaciji na taj način esencijalni protein je funkcionalno „knocked out“. Pod uslovima gde je stabilizujuće sredstvo kao što je Shield-1, prisutno fuzioni protein je stabilizovan i može da izvede svoju funkciju na nivou koji može da održi virusnu replikaciju koja je poželjno najmanje 75%, 80%, 90%, 95%, 99% ili 100% od količine replikacije CMV koji ne sadrži destabilizovani esencijalni protein.

CMV sa defektnom replikacijom

Postupci prema predmetnom pronalasku koriste CMV sa defektnom replikacijom (rdCMV) koji eksprimira pentamerni gH kompleks. Bilo koji atenuirani CMV virus koji eksprimira pentamerni gH kompleks može biti napravljen tako da ima defektnu replikaciju prema postupcima pronalaska. U jednom primeru izvođenja, atenuisani CMV je AD 169 koji je povratio ekspresiju gH kompleksa zahvaljujući obnovi mutacije u UL131 genu (videti Primer 1).

Virusi sa uslovno defektnom replikacijom su mutanti u kojima su jedan ili više esencijalnih virusnih proteina zamenjeni destabilizovanim parnjakom esencijalnih proteina. Destabilizovani parnjak je kodiran nukleinskom kiselinom koja kodira fuzioni protein između esencijalnog proteina i destabilizujućeg proteina. Destabilizovani esencijalni protein može samo da funkcioniše tako da podrži virusnu replikaciju kada je prisutno stabilizujuće sredstvo. U poželjnim primerima izvođenja, postupci opisani u SAD patentnoj objavi 2009/0215169 su korišćeni za obezbeđivanje fenotipa sa uslovno defektnom replikacijom eksprimirajućeg pentamernog gH kompleksa CMV. Ukratko, jedan ili više proteina esencijalnih za replikaciju CMV su fuzionisani za destabilizujući protein, FKBP ili FKBP derivat. Nukleinske kiseline koje kodiraju divlji tip esencijalnog proteina nisu više prisutne u rdCMV. U prisustvu egzogeno dodatog, ćelijski permeabilnog malog molekula stabilizujućeg sredstva, Shield-1 (Shld-1), fuzioni protein je stabilizovan i esencijalni protein može da funkcioniše tako da podržava virusnu replikaciju. Replikacija rdCMV u prisustvu stabilizujućeg sredstva je poželjno najmanje 75%, 80%, 90%, 95%, 99% ili 100% od količine replikacije CMV koji ne sadrži destabilizujući fuzioni protein (npr., roditeljski atenuisani CMV korišćen za konstrukciju rdCMV). U odsustvu Shield-1, destabilizujući protein fuzionog proteina usmerava fuzioni protein da bude značajno razložen pomoću mašinerije ćelije domaćina. Bez ili sa prisutnim minimalnim količinama esencijalnog proteina, CMV ne može da se replicira u količini takvoj da se proizvede ili održava CMV infekcija kod pacijenta. Replikacija rdCMV u odsustvu stabilizujućeg sredstva se ne odigrava ili je smanjena poželjno za više od 50%, 75%, 90%.95% ili 99% u poređenju sa CMV koji ne sadrži destabilizujući fuzioni protein (npr., roditeljski atenuisani CMV korišćen za konstrukciju rdCMV).

Upotrebom postupaka rekombinantne DNK dobro poznatih u stanju tehnike, nukleinska kiselina koja kodira esencijalni protein za replikaciju CMV i/ili uspostavljanje/održavanje infekcije CMV je vezana za nukleinsku kiselinu koja kodira FKBP ili njegov derivat. Kodirani fuzioni protein sadrži FKBP ili FKBP derivat fuzionisan u okviru za esencijalni protein. Kodirani fuzioni protein je stabilan u prisustvu Shield-1. Međutim, kodirani fuzioni protein je destabilizovan u odsustvu Shield-1 i na njega se ciljno deluje radi uništenja. U poželjnim primerima izvođenja, FKBP je SEQ ID NO:11. U drugim poželjnim primerima izvođenja, FKBP derivat je FKBP koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija izabranih iz grupe koja se sastoji od: F15S, V24A, H25R, F36V, E60G, M66T, R71G, D100G, D100N, E102G, K105I i L106P. U poželjnijem primeru izvođenja, FKBP derivat sadrži F36V i/ili L106P supstitucije (SEQ ID NO:12). U poželjnijem primeru izvođenja, FKBP derivat je kodiran pomoću SEQ ID NO:13.

Esencijalni proteini namenjeni za destabilizaciju fuzijom sa FKBP ili njegovim derivatom 1) su esencijalni za virusnu replikaciju; 2) mogu da izdrže fuziju destabilizujućeg proteina bez značajne prekidajuće funkcije esencijalnog proteina; i 3) mogu da izdrže inserciju nukleinske kiseline koja kodira FKBP ili njegov derivat na 5' ili 3' kraju virusnog ORF koji kodira esencijalni protein bez značajnog prekida ORFs drugih okolnih virusnih gena. U poželjnim primerima izvođenja, esencijalni proteini namenjeni za destabilizaciju fuzijom sa FBBP ili njegovim derivatom kodiraju ne-strukturne proteine i, kao takvi, imaju smanjenu verovatnoću da su upakovani u rekombinantne CMV virione. Tabela 1 prikazuje CMV gene koji ispunjavaju gore navedene kriterijume.

Tabela 1: Virusni geni izabrani za konstrukciju FKBP fuzije

Predmetni pronalazak obuhvata rdCMV koji sadrži fuzione proteine sa esencijalnim proteinom ili njegovim derivatom fuzionisanim za destabilizujući protein. Derivati esencijalnog proteina sadrže jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, adicija i/ili delecija u odnosu na divlji tip esencijalnog proteina koji još uvek može da obezbedi aktivnost esencijalnog proteina najmanje dovoljno dobro da podrži virusnu replikaciju u prisustvu Shield-1. Primeri merenja aktivnosti virusa su obezbeđeni u Primerima u daljem tekstu. Postupci poznati u stanju tehnike mogu biti korišćeni za određivanje stepena razlike između CMV esencijalnog proteina od interesa i derivata. U jednom primeru izvođenja, identičnost sekvenci je korišćena za određivanje srodnosti. Derivati prema pronalasku će biti poželjno najmanje 85% identični, najmanje 90% identični, najmanje 95% identični, najmanje 97% identični, najmanje 99% identični osnovnoj sekvenci. Procenat identičnosti je određen kao broj identičnih ostataka podeljen sa ukupnim brojem ostataka i pomnožen sa 100. Ako su sekvence u poravnanju različitih dužina (kao posledica praznina ili produženja), dužina najduže sekvence će biti korišćena u izračunavanju, koja predstavlja vrednost za ukupnu dužinu.

U nekim primerima izvođenja, jedan ili više virusnih proteina esencijalnih za virusnu replikaciju namenjen za destabilizaciju su izabrani iz grupe koja se sastoji od IE1/2, UL51, UL52, UL84, UL79, UL87, UL37x 1, UL77 i UL53 ili njihovih derivata. U specifičnom primeru izvođenja, jedan ili više virusnih proteina esencijalnih za virusnu replikaciju namenjenu za destabilizaciju su izabrani iz grupe koja se sastoji od IE1/2, UL51, UL52, UL84, UL79, UL87. U specifičnijem primeru izvođenja, jedan ili više virusnih proteina esencijalnih za virusnu replikaciju namenjenih za destabilizaciju su izabrani iz grupe koja se sastoji od IE1/2, UL51, UL52, UL79 i UL84.

Više od jednog esencijalnog proteina mogu biti destabilizovani fuzijom za FKBP ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, esencijalni proteini funkcionišu na različitim stadijumima CMV replikacije i/ili infekcije (uključujući, ali bez ograničenja na, neposredni rani, rani ili kasni stadijum). U poželjnim primerima izvođenja, kombinacija virusnih proteina za virusnu replikaciju namenjenu za destabilizaciju su izabrani iz grupe koja se sastoji od IE1/2 i UL51, IE1/2 i UL52, IE1/2 i UL79, IE1/2 i UL84, UL84 i UL51 i UL84 i UL52. U poželjnijem primeru izvođenja, IE 1/2 i UL51 su namenjeni za destabilizaciju u istom rekombinantnom CMV. U najpoželjnijem primeru izvođenja, fuzioni protein koji sadrži IE1/2 je SEQ ID NO:1 i fuzioni protein koji sadrži UL51 je SEQ ID NO:3. SEQ ID NOS:1 i 3 mogu biti kodirani sa SEQ ID Nos:2 i 4, respektivno. Genom rdCMV sa destabilizovanim IE1/2 i UL51 je prikazan u SEQ ID NO:14.

FKBP ili njegov derivat može biti fuzionisan za esencijalni protein bilo direktno ili indirektno. U poželjnim primerima izvođenja, FKBP ili njegov derivat je fuzionisan za esencijalni protein direktno.

FKBP ili njegov derivat može biti fuzionisan za esencijalni protein svaki na N- ili C-terminusu esencijalnog proteina. U poželjnim primerima izvođenja, FKBP je fuzionisan za N-terminus esencijalnog proteina.

Više od jednog FKBP ili njegovog derivata može biti fuzionisano za esencijalni protein. U primerima izvođenja gde postoji više od jednog FKBP ili njegovog derivata fuzionisanih za esencijalni protein, svaki od pojedinačnog FKBP ili njegovih derivata može biti isti ili različit. U poželjnim primerima izvođenja, postoji jedan FKBP ili njegov derivat fuzionisan za esencijalni protein.

Dodatni postupci inaktivacije

U nekim primerima izvođenja, rdCMV opisan u prethodnom tekstu je inaktiviran dalje upotrebom hemijske ili fizičke inaktivacije. Primeri takvih obuhvataju tretman toplotom, inkubaciju sa formaldehidom, ß-Propiolaktonom (BPL), ili binarnim etileniminom (BEI), ili gama zračenje. Poželjni postupci ne prekidaju ili ne prekidaju značajno imunogenost, uključujući, ali bez ograničenja na, imunogenost indukovanu pentamernim gH kompleksom. Kao takav, imuni odgovor izazvan pomoću CMV koji je dalje inaktiviran je očuvan ili značajno očuvan u poređenju sa rdCMV bez dodatnog inaktivacionog tretmana. U poželjnim primerima izvođenja, sposobnost dalje inaktiviranog CMV da indukuje neutralizujuća antitela je slična onima indukovanim sa rdCMV bez dodatnog inaktivacionog tretmana. Inaktivacioni režim pomoću bilo kog ili kombinacije hemijskih ili fizičkih postupaka je određen empirijski tako da osigurava imunogenost CMV, uključujući pentamerni gH kompleks.

Procena virusne replikacije

Stručnjak iz date oblasti tehnike može da koristi analize virusne replikacije da odredi korist određenog esencijalnog proteina fuzionisanog za FKBP ili njegov derivat. Kako na gensku ekspresiju/funkciju kodiranog proizvoda ne bi trebalo da utiče vezivanje FKBP ili njegovog derivata za esencijalni protein u prisustvu Shield-1, rdCMV bi trebalo da se replicira na stopi koja je slična roditeljskom CMV u prirustvu Shield-1 (poželjno najmanje 75%, 80%, 90%, 95%, 99% ili 100% od roditeljskog nivoa virusa). Replikacija rdCMV je značajno promenjena od roditeljskog CMV u odsustvu Shield-1 (smanjena za poželjno više od 50%, 75%, 90%. 95%, 99% ili 100% u poređenju sa CMV koji ne sadrži destabilizujući fuzioni protein).

U poželjnim primerima izvođenja, rdCMV u prisustvu najmanje 2 µM Shield-1 se replicira najmanje 90%, poželjnije najmanje 95%, najpoželjnije najmanje 99%, od količine koju replicira ne-rdCMV.

U jednom primeru izvođenja, kompozicija koja sadrži rdCMV prema pronalasku ima titar virusa od najmanje 105 pfu/ml, poželjnije najmanje 10<7>pfu/ml, u prisustvu najmanje 2 µM Shield-1.

Suprotno tome, rdCMV ne bi trebalo značajno da se replicira značajno u odsustvu Shield-1. Kvalitet mehanizma defektne replikacije je procenjen prema tome kako je stroga kontrola pod uslovima koji ne dozvoljavaju virusnu replikaciju, tj., infektivni titri potomstva viriona pod ovim uslovima. rdCMV prema predmetnom pronalasku ne može da se replicira značajno (bilo u ćelijskoj kulturi ili unutar pacijenta) bez prisutnog Shield-1. Njegova replikacija u ARPE-19 ćelijama i drugim tipovima humanih primarnih ćelija je uslovna, i molarna koncentracija Shield-1 veća od 0.1 µM, poželjno najmanje 2 µM, u medijumu kulture je potrebna da bi se održala virusna replikacija.

U jednom primeru izvođenja, kompozicija koja sadrži rdCMV prema pronalasku ima titar virusa manji od 2 pfu/ml, poželjnije manji od 1 pfu/ml, u odsustvu Shield-1.

Postupci za procenu replikacije CMV mogu biti korišćeni za procenu replikacije rdCMV bilo u odsustvu ili prisustvu Shield-1. Međutim, u poželjnim primerima izvođenja, korišćen je TCID50. U sledećem primeru izvođenja, titri rdCMV su određeni pomoću analize 50% infektivne doze kulture tkiva (TCID50). Ukratko, ova analiza razblaženja kvantitativno određuje količinu virusa potrebnu da ubije 50% inificranih domaćina. Ćelije domaćini (npr., ARPE-19 ćelije) su zasejane i dodata su serijska razblaženja virusa. Posle inkubacije, procenat ćelijske smrti (tj. inficiranih ćelija) je posmatran i zabeležen za svako razblaženje virusa. Rezultati su korišćeni za matematičko izračunavanje TCID50.

U sledećem primeru izvođenja, titri rdCMV su određeni upotrebom analize plakova. Analize virusnih plakova određuju broj jedinica koje forimiraju plakove (pfu) u uzorku virusa. Ukratko, konfluentan monosloj ćelija domaćina (npr., ARPE-19 ćelija) je inficiran sa rdCMV na različitim razblaženjima i pokriven polu-čvrstim medijumom, kao što je agar ili karboksimetil celuloza, da bi se sprečilo neselektivno širenje virusne infekcije. Virusni plak je formiran kada virus inficira ćeliju unutar fiksiranog ćellijskog monosloja. Ćelija inficirana virusom će se lizirati i širiti infekciju na susedne ćelije gde se ponavlja ciklus infekcije-do-lize. Inficirana površina ćelije će stvoriti plak (površina infekcije okružena neinficiranim ćelijama) koja se može videti vizuelno ili sa optičkim mikroskopom. Plakovi su brojani i rezultati, u kombinaciji sa faktorom razblaženja korišćenim za pripremu ploče, su korišćeni za izračunavanje broja jedinica koje formiraju plakove po jediničnoj zapremini uzorka (pfu/mL). pfu/mL rezultat predstavlja broj infektivnih čestica unutar uzorka i zasnovan je na pretpostavci da je svaki formirani plak reprezentativan za jednu infektivnu virusnu česticu.

U sledećem primeru izvođenja, hu-SCID mišji model je korišćen za procenu sposobnosti rdCMV da se replicira in vivo. Ukratko, delovi humanih fetusnih tkiva (kao što su timus i jetra) su hirurški implantirani u kapsule bubrega SCID miševa. rdCMV je inokulisan 2-3 meseca kasnije kada su humana tkiva vaskularizovana. Titri virusa su procenjeni 3-4 nedelje posle inokulacije u analizama plakova. Eksperimenti na životinjama mogu biti izvedeni u odsustvu ili prisustvu Shield-1.

Procena imunog odgovora

Primena rdCMV prema pronalasku na pacijenta izaziva imuni odgovor na CMV, poželjno zaštitni imuni odgovor, koji može da leči i/ili smanji verovatnoću infekcije sa CMV ili patologiju povezanu sa takvom infekcijom kod pacijenta. Imuni odgovor je, najmanje delimično, na pentamerni gH kompleks.

Imuni odgovor izazvan sa rdCMV može biti procenjivan upotrebom postupaka poznatih u stanju tehnike.

Životinjski modeli poznati u stanju tehnike mogu biti korišćeni za procenu zaštitnog efekta primene rdCMV. U jednom primeru izvođenja, imuni serumi iz individua na koje je primenjen rdCMV mogu biti analizirani za kapacitet neutralizacije, uključujući, ali bez ograničenja na, blokadu virusnog vezivanja ili ulaska u ćeliju domaćina. U drugim primerima izvođenja, T ćelije iz individua na koje je primenjivan rdCMV mogu biti analizirane za kapacitet proizvodnje citokina uključujući, ali bez ograničenja na, interferon gama, u prisustvu antigena od interesa. Životinjski modeli sa stimulacijom antigenom takođe mogu biti korišćeni za određivanje imunološki efikasne količine imunogena.

Virusna neutralizacija označava virusna specifična antitela sposobna da prekinu ulazak virusa i/ili replikaciju u kulturama. Uobičajena analiza za merenje neutralizujućih aktivnosti je analiza redukcije virusnog plaka. Analize neutralizacije u ovom pronalasku označavaju titracije virusa koje mogu da blokiraju ulazak virusa u ćelije. NT50 titri su definisani kao recipročna razblaženja seruma za blokiranje 50% ulaznog virusa u analizama neutralizacije virusa. NT50 titri su dobijeni iz aproksimacije nelinearne logističke četvoro-parametarske krive.

Proizvodnja CMV sa defektnom replikacijom

Predmetni pronalazak obuhvata postupke za pripremu rdCMV. rdCMV prema pronalasku su umnožavani u prisustvu stabilizujućeg sredstva kao što je Shield-1 na epitelijalnim ćelijama, poželjno humanim epitelijalnim ćelijama, i poželjnije humanim retinalnim pigmentisanim epitelijalnim ćelijama. U dodatnim primerima izvođenja, humane retinalne pigmentisane epitelijalne ćelije su ARPE-19 ćelije deponovane u American Type Culture Collection (ATCC) kao pristupni br. CRL-2302. U nekim primerima izvođenja, Shield-1 je prisutan u koncentraciji od najmanje 0.5 µM u medijumu kulture tkiva. U poželjnim primerima izvođenja, Shield-1 je prisutan u koncentraciji od najmanje 2.0 µM u medijumu kulture tkiva.

U nekim primerima izvođenja, ćelije korišćene za umnožavanje rdCMV su gajene na mikronosačima. Mikronosač je potporni matriks koji omogućava rast prilepljenih ćelija u spinner flakonima ili bioreaktorima (kao što su rotirajući zidni mikrogravitacioni bioreaktori i bioreaktori sa fludnim slojem). Mikronosači su tipično sfere od 125 - 250 µM sa gustinom koja im omogućava da se održavaju u suspenziji uz pažljivo mešanje. Mikronosači mogu biti napravljeni od određenog broja različitih materijala uključujući, ali bez ograničenja na, DEAE-dekstran, staklo, polistirensku plastiku, akrilamid i kolagen. Mikronosači mogu imati različite površinske materijale uključujući, ali bez ograničenja na, ekstracelularne matriksne proteine, rekombinantne proteine, peptide i naelektrisane molekule. Drugi sistemi ćelijske kulture visoke gustine, kao što su Corning HyperFlask® i HyperStack® sistemi takođe mogu biti korišćeni.

Medijum kulture tkiva bez ćelija može biti sakupljen i rdCMV može biti prečišćen iz njega. CMV virusne čestice su oko 200 nm u prečniku i mogu biti odvojene od drugih proteina prisutnih u sakupljenom medijumu upotrebom tehnika poznatih u stanju tehnike uključujući, ali bez ograničenja na ultracentrifugiranje preko gradijenta gustine ili „uloška“ 20% Sorbitola. Proteinska masa vakcina može biti određena pomoću Bradford analize.

Shield-1 može biti korišćen za kontrolu replikacije rdCMV zajedno sa FKBP. Pošto je željena količina virusnog umnožavanja u ćelijama kulture tkiva postignuta, sposobnost za replikaciju više nije željena. Shield-1 je povučen iz rdCMV kako bi se virusna replikacija napravila deficijentnom (npr., u cilju primene na pacijenta). U jednom primeru izvođenja, rdCMV je prečišćen iz Shield-1 ispiranjem jednom ili više puta. U sledećem primeru izvođenja, rdCMV je prečišćen iz Shield-1 preko ultracentrifugiranja. U sledećem primeru izvođenja, rdCMV je prečišćen iz Shield-1 preko diafiltracije. Diafiltracija je uobičajeno korišćena za prečišćavanje virusnih čestica. U jednom primeru izvođenja, filteri su korišćeni sa veličinom pora od približno 750 kilodaltona koja bi samo omogućila da Shield-1 prođe kroz pore.

Posle prečišćavanja rdCMV iz Shield-1, može postojati mala količina rezidualnog Shield-1 koji ostaje u kompoziciji rdCMV. U jednom primeru izvođenja, nivo Shld-1 u CMV kompoziciji posle prečišćavanja je najmanje 100-puta ispod nivoa potrebnog da se replikacija održi u kulturi tkiva. U sledećem primeru izvođenja, nivo Shield-1 u kompoziciji rdCMV posle prečišćavanja je 0.1 µM ili manje. U sledećem primeru izvođenja, nivo Shield-1 u kompoziciji rdCMV posle prečišćavanja je nedetektabilan.

Određivanje nivoa Shield-1 u kompoziciji može biti detektovano upotrebom LC/MS (tečne hromatografije-masene spektroskopije) ili HPLC/MS (tečne hromatografije visokog učinkamasene spektroskopije) analiza. Ove tehnike kombinuju sposobnosti fizičkog odvajanja LC ili HPLC sa sposobnostima masene analize i mogu da detektuju hemikalije od interesa u složenim smešama.

Ađuvansi

Ađuvansi su supstance koje mogu da pomognu imunogenu u proizvodnju imunog odgovora. Ađuvansi mogu da funkcionišu pomoću različitih mehanizama kao što su jedan ili više od sledećih: povećanje biološkog ili imunološkog polu-života antigena; poboljšanje isporuke antigena na antigen-prikazujuće ćelije; poboljšanje obrade antigena i prikazivanja od strane antigen-prikazujućih ćelija; postizanje uštede doze, i, indukovanje proizvodnje imunomodulatornih citokina (Vogel, 2000, Clin Infect Dis 30:S266). U nekim primerima izvođenja, kompozicije prema pronalasku sadrže rdCMV i ađuvans.

Niz različitih tipova ađuvanasa može biti korišćen za pomoć u prozvodnji imunog odgovora. Primeri određenih ađuvanasa obuhvataju aluminijum hidroksid; aluminijum fosfat, aluminijum hidroksifosfat, amorfni aluminijum hidroksifosfat sulfat ađuvans (AAHSA) ili druge soli aluminijuma; kalcijum fosfat; DNK CpG motive; monofosforil lipid A; toksin kolere; E. coli toksin osetljiv na toplotu; toksin velikog kašlja; muramil dipeptid; Freund-ov nekompletni ađuvans; MF59; SAF; imunostimulatorne komplekse; lipozome; biorazgradive mikrosfere; saponine; nejonske blok kopolimere; analoge muramil peptida; polifosfazen; sintetičke polinukleotide; IFN-γ; IL-2; IL-12; i ISCOMS. (Vogel, 2000, Clin Infect Dis 30:S266; Klein et al., 2000, J Pharm Sci 89:311; Rimmelzwaan et al., 2001, Vaccine 19:1180; Kersten, 2003, Vaccine 21:915; O'Hagen, 2001, Curr. Drug Target Infect. Disord.1:273.)

U nekim primerima izvođenja, ađuvansi na bazi ulja uključujući, ali bez ograničenja na, nekompletni Freund-ov ađuvans i MF59, nisu korišćeni u kompozicijama prema pronalasku. U drugim primerima izvođenja, čestični ađuvansi uključujući, ali bez ograničenja na, ISCOMATRIX® ađuvans i/ili aluminijum fosfatni ađuvans su korišćeni u kompozicijama prema pronalasku.

Farmaceutske kompozicije

Dodatna karakteristika pronalaska je upotreba rekombinantnog CMV koji je ovde opisan u kompoziciji, poželjno imunogenoj kompoziciji ili vakcini, za lečenje pacijenata sa CMV infekcijom i/ili smanjenje verovatnoće za CMV infekciju. Pogodno, kompozicija sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač.

"Farmaceutski prihvatljiv nosač" je određen tako da označava tečni punilac, razblaživač ili inkapsulirajuću supstancu koja može biti bezbedno korišćena u sistemskoj primeni. U zavisnosti od određenog puta primene, mogu biti korišćeni različiti farmaceutski prihvatljivi nosači, koji su dobro poznati u stanju tehnike. Ovi nosači mogu biti izabrani iz grupe koja uključuje šećere, skrobove, celulozu i njene derivate, slad, želatin, talk, kalcijum sulfat, biljna ulja, sintetička ulja, poliole, alginsku kiselinu, fosfatno puferisane rastvore uključujući fosfatno puferisani slani rastvor, emulgatore, izotonični slani rastvor i vodu bez pirogena. Naročito, farmaceutski prihvatljivi nosači mogu da sadrže različite komponente kao što su pufer, sterilna voda za injekciju, normalni slani rastvor ili fosfatno puferisani slani rastvor, saharoza, histidin, soli i polisorbat. Termini kao što su "fiziološki prihvatljiv", "razblaživač" ili "ekscipijens" mogu biti korišćeni naizmenično.

Postupci za formulacije vakcine su opisani, na primer, u New Generation Vaccines (1997, Levine et al., Marcel Dekker, Inc. New York, Basel, Hong Kong), koji je obuhvaćen ovde referencom.

Formulacije

U nekim primerima izvođenja, rdCMV prema pronalasku je primenjen na pacijenta da bi se izazvao imuni odgovor. Poželjno je minimizirati ili izbeći gubitak potencije rdCMV kompozicije u toku čuvanja imunogene kompozicije. Uslovi koji podržavaju takav cilj obuhvataju, ali bez ograničenja na (1) produženu stabilnost prilikom čuvanja, (2) otpornost na stresne cikluse zamrzavanja-odmrzavanja, (3) stabilnost na temperaturama sredine tokom do nedelje dana, (4) održavanje imunogenosti, (5) kompatibilnost sa ađuvantnom strategijom. Uslovi koji utiču na stabilnost rdCMV obuhvataju, li bez ograničenja na, pH pufera, pufersku josnku snagu, prisustvo/odsustvo određenih ekscipijenasa i temperature. Kompozicije sadrže pufere za povećanje stabilnosti prečišćenih rdCMV virusnih čestica pogodnih kao kompozicija vakcine. Očuvanje celovitosti virusnih čestica može biti procenjeno pomoću analiza imunogenosti kod miševa i/ili analiza ulaska virusa. Događaji ulaska virusa zavise od celovitosti i funkcija virusnih glikoproteina, uključujući pentamerni gH kompleks. Pentamerni gH kompleks takođe obezbeđuje značajnu imunogenost rdCMV, na taj način su dve osobine vezane.

U nekim primerima izvođenja, rdCMV je čuvan u puferu koji sadrži 15-35 mM Histidina i 100-200 mM NaCl na pH od između 5 i 7. U specifičnijem primeru izvođenja, pufer sadrži 25 mM Histidin i 150 mM NaCl na pH 6.

U drugim primerima izvođenja, šećeri mogu biti dodati da bi se obezbedila dodatna stabilnost, kao što su polioli (uključujući, ali bez ograničenja na, manitol i sorbitol); monosaharidi (uključujući, ali bez ograničenja na, glukozu, manozu, galaktozu i fruktozu); disaharidi (uključujući, ali bez ograničenja, laktozu, maltozu, saharozu, laktulozu i trehalozu) i trisaharidi (uključujući, ali bez ograničenja na, rafinozu i melezitozu). U specifičnijem primeru izvođenja, šećer je saharoza. U čak specifičnijem primeru izvođenja, saharoza je između 5-15%.

U poželjnim primerima izvođenja, rdCMV je čuvan u puferu koji sadrži 25 mM Histidina, 150 mM NaCl, 9% saharozu na pH 6.

Primena

rdCMV koji je ovde opisan može biti formulisan i primenjen na pacijenta upotrebom vodiča koji je ovde obezbeđen zajedno sa tehnikama koje su dobro poznate u stanju tehnike. Vodiči za farmaceutsku primenu generalno su dati u, na primer, Vaccines Eds. Plotkin and Orenstein, W.B. Sanders Company, 1999; Remington's Pharmaceutical Sciences 20th Edition, Ed. Gennaro, Mack Publishing, 2000; i Modern Pharmaceutics 2nd Edition, Eds. Banker and Rhodes, Marcel Dekker, Inc., 1990.

Vakcine mogu biti primenjivane preko različitih puteva kao što su subkutani, intramuskularni, intravenski, mukozni, parenteralni, transdermalni ili intradermalni. Subkutana i intramuskularna primena mogu biti izvedene upotrebom, na primer, igala ili mlaznih-injektora. U primeru izvođenja, vakcina prema pronalasku je primenjena intramuskularno. Transdermalna ili intradermalna primena mogu biti postignute preko intradermalne injekcije pomoću šprica sa iglom, ili omogućavajućih uređaja kao što su mikronske-igle ili mikronski flasteri u nizu.

Kompozicije opisane ovde mogu biti primenjivane na način kompatibilan sa formulacijom doze, i u takvoj količini koja je imunogeno efikasna za lečenje i/ili smanjenje verovatnoće od CMV infekcije (uključujući primarnu, rekurentnu i/ili super infekciju). Doza primenjena na pacijenta, u kontekstu predmentog pronalaska, bi trebalo da je dovoljna da se postigne koristan odgovor kod pacijenta tokom vremena kao što je smanjenje u nivou CMV infekcije, poboljšanje simptoma bolesti povezane sa CMV infekcijom i/ili smanjenje dužine i/ili težine CMV infekcije, ili smanjenje verovatnoće infekcije sa CMV (uključujući primarnu, rekurentnu i/ili super infekciju). Pogodni režini doziranja mogu biti lako određeni od strane stručnjaka iz date oblasti tehnike i poželjno su određeni uzimanjem u obzir faktora koji su dobro poznati u tehnici kao što su starost, telesna težina, pol i medicinsko stanje pacijenta; put primene; željeni efekat; i određena kompozicija koja je korišćena. U određivanju efikasne količine rdCMV koja će biti primenjena u lečenju ili profilaksi protiv CMV, lekar može da proceni cirkulišuće nivoe virusa u plazmi, napredovanje bolesti i/ili proizvodnju anti-CMV antitela. Doza za kompoziciju vakcine se sastoji od opsega od 103 do 1012 jedinica formiranja plakova (pfu). U različitim primerima izvođenja, opseg doza je od 104 do 1010 pfu, 105 do 109 pfu, 106 do 108 pfu, ili bilo koja doza unutar navedenih opsega. Kada se primenjuje više od jedne doze (tj., u kombinovanim vakcinama), količina svakog sredstva vakcine je unutar njihovih propisanih opsega.

Kompozicija vakcine može biti primenjivana u formatu jedne doze ili više-doznom formatu. Vakcine mogu biti pripremljene sa ađuvansom nekoliko časova ili dana pre primene, uz iudentifikaciju stabilizujućeg pufera (jednog ili više) i pogodne kompozicije ađuvansa. Vakcine mogu biti primenjivane u zapreminama koje se uobičajeno koriste, u opsegu od 0.1 mL do 0.5 mL.

Vreme doziranja zavisi od faktora koji su dobro piznati u tehnici. Posle početne primene, jedna ili više dodatnih doza mogu biti primenjene da bi se održavali i/ili povećali titri antitela i T ćelijski imunitet. Dodatne buster vakcine mogu biti potrebne za održavanje zaštitnih nivoa imunih odgovora, reflektovanih u titrima antitela i T ćelijskom imunitetu kao što je ELISPOT. Nivoi takvih imunih odgovora su predmet kliničkih ispitivanja.

Za kombinovane vakcinacije, svaki od imunogena može biti primenjen zajedno u jednoj kompoziciji ili posebno u različitim kompozicijama. rdCMV koji je ovde opisan je primenjen istovremeno sa jednim ili više željenih imunogena. Termin "istovremeno" nije ograničen na primenu terapeutskih sredstava u tačno isto vreme, već pre označava da se rdCMV koji je opisan ovde i drugi željeni imunogen(i) primenjuju na subjekta u nizu i unutar vremenskog intervala tako da mogu da deluju zajedno tako da obezbede povećanu korist u odnosu na to ako bi se primenjivali drugačije. Na primer, svako terapeutsko sredstvo može biti primenjivano u isto vreme ili u nizu po bilo kom redosledu na različitim vremenskim tačkama; međutim, ako nisu primenjeni istovremeno, trebalo bi da se primene dovoljno blizu u vremenu tako da se obezbedi željeni terapeutski efekat. Svako terapeutsko sredstvo može biti primenjivano posebno, u bilo kom odgovarajućem obliku i pomoću bilo kog pogodnog puta.

Populacija pacijenata

"Pacijent" označava sisara koji sposoban da bude inficiran sa CMV. U poželjnom primeru izvođenja, pacijent je čovek. Pacijent može biti tretiran profilaktički ili terapeutski. Profilaktički tretman obezbeđuje dovoljan zaštitni imunitet za smanjenje verovatnoće ili težine CMV infekcije, uključujući primarne infekcije, rekurentne infekcije (tj., one koje su rezultat reaktivacije latentnog CMV) i super-infekcije (tj., one koje su rezultat infekcije sa različitim sojem CMV od onog koji je pacijent prethodno imao). Terapeutski tretman može biti izveden za smanjenje težine CMV infekcije ili smanjenje verovatnoće/težine rekurentne ili super- infekcije.

Tretman može biti izveden upotrebom farmaceutske kompozicije koja sadrži rdCMV kao što je ovde opisano. Farmaceutske kompozicije mogu biti primenjene na opštu populaciju, naročito na one osobe sa povećanim rizikom od CMV infekcije (bilo primarne, rekurentne ili superinfekcije) ili za koju bi CMV infekcija bila naročito problematična (kao što su imunokompromitovane individue, pacijenti sa transplantom ili trudne žene). U jednom primeru izvođenja, žene u reproduktivnom dobu, naročito žene u ranom adolescentnom dobu, su vakcinisane za smanjenje verovatnoće od CMV infekcije (bilo primarne, rekurentne ili superinfekcije) u toku trudnoće.

Oni kod kojih postoji potreba za tretmanom obuhvataju one koji već imaju infekciju, kao i one podložne infekciji ili kod kojih je željena redukcija verovatnoće od infekcije. Tretman može da poboljša simptome bolesti povezane sa CMV infekcijom i/ili skrati dužinu i/ili težinu CMV infekcije, uključujući infekciju kao posledicu reaktivacije latentnog CMV.

Osobe sa povećanim rizikom od CMV infekcije (bilo primarne, rekurentne ili super-infekcije) obuhvataju pacijente sa oslabljenim imunitetom ili pacijente koji primaju terapiju koja dovodi do oslabljenog imuniteta (npr., koji se podvrgavaju hemoterapiji ili radijacionoj terapiji za kancer ili uzimaju imunosupresivne lekove). Kao što je ovde korišćen, "oslabljeni imunitet" označava imuni sistem koji je manje sposoban da se bori protiv infekcija zbog imunog odgovora koji ne funkcioniše prikladno ili ne funkcioniše na nivou normalnog zdravog adulta. Primeri pacijenata sa oslabljenim imunitetom su pacijenti koji su bebe, mala deca, starije osobe, trudnice ili pacijent sa bolešću koja pogađa funkciju imunog sistema kao što je HIV infekcija ili SIDA.

PRIMERI

Primeri su dati u daljem tekstu za dalju ilustraciju različitih karakteristika predmetnog pronalaska. Primeri takođe ilustruju korisnu metodologiju za izvođenje pronalaska. Ovi primeri ne ograničavaju pronalazak za koji se traži zaštita.

Primer 1: Obnova pentamernog gH kompleksa

Infektivni klon CMV sa bakterijskim veštačkim hromozomom je konstruisan tako da je kodiran virion koji eksprimira pentamerni gH kompleks koji se sastoji od UL128, UL130 i UL131 sklopljenih na gH/gL osnovu.

CMV soj AD 169 je originalno izolovan iz adenoida devojčice starosti 7 godina (Elek and Stern, 1974, Lancet, 1:1). Virus je pasažiran 58 puta u nekoliko tipova humanih fibroblasta da bi se virus atenuisao (Neff et al, 1979, Proc Soc Exp Biol Med, 160:32), sa poslednjih 5 pasaža u WI38 humanim fibroblastima. Ova pasažirana varijanta AD169 virusa, označena u ovoj studiji kao Merck AD169 (MAD169), je korišćena kao roditeljski virus za konstrukciju infektivnog BAC klona. Niti roditeljski virus AD169 niti pasažirana varijanta virusa MAD169 nije eksprimirala UL131 ili pentamerni gH kompleks.

MAD169 je korišćen kao roditeljski virus za konstrukciju klona sa infektivnim bakterijskim veštačkim hromozomom (BAC). BAC vektor je molekularni alat koji omogućava genetičku manipulaciju velikog DNK fragmenta, kao što je CMV genom (∼230Kb), u E. coli. BAC element zajedno sa GFP marker genom je inseriran neposredno posle stop kodona US28 otvorenog okvira čitanja (između US28 i US29 ORF u virusnom genomu) sa LoxP mestom stvorenim na oba kraja fragmenta (SL. 1A). Ukratko, DNK fragment koji sadrži GFP ekspresionu kasetu flankiranu sa dva loxP mesta i CMV US28-US29 sekvence su sintetisani i klonirani u pBeloBAC11 vektor. BAC vektor je linearizovan sa restrikcionim enzimom Pme I, i kontransficiran u MRC-5 ćelije sa MAD169 DNK ekstrahovanom iz prečišćenih viriona. Rekombinantne varijante, identifikovane pomoću ekspresije zelene fluorescencije, su prečišćene od plakova. Posle jedne runde amplifikacije, kružni oblik virusnog genoma je ekstrahovan iz inficiranih ćelija, i elektroporisan u E. coli DH10 ćelije. Bakterijske kolonije su ispitivane pomoću PCR-a za prisustvo US28 i US29 regiona. Klonovi kandidati su dalje ispitivani pomoću EcoR I, EcoR V, Hind III, Spe I i Bam HI restrikcionih analiza. Posle ispitivanja, jedan klon, bMAD-GFP, je pokazao identičan restrikcioni obrazac sa roditeljskim MAD 169 virusom.

Mutacija sa premeštanjem okvira u prvom egzonu UL131 koja je u osnovi deficijencije epitelijalnog tropizma u MAD169 je popravljena genetički u E. coli (SL. 1B). Specifično, deletiran je jedan adeninski nukleotid (nt) iz 7 nt A-lanca u UL131 genu (SL. 1B). Delecija 1 nt je bila dovoljna da spasi epitelijalan i endotelijalan ćelijski tropizam zahvaljujući UL 131, i na taj način pentamerni gH kompleks, koji je sada eksprimiran. Ekspresija je potvrđena pomoću ELISA i western blot-a (podaci nisu prikazani). Ovaj klon je dodatno modifikovan uklanjanjem BAC segmenta pomoću LoxP/Cre rekombinacije. BAC DNK je transficiran u ARPE-19 ćelijama, humanim retinalnim pigmentisanim epitelijalnim ćelijama (ATCC pristupni br. CRL-2302), da bi se dobio infektivni virus (SL.1C). Rezultirajući infektivni virus, označen terminom BAC-izveden epitelijali-tropički MAD169 virus (beMAD), se razlikuje od MAD169 samo u dva lokusa, (1) UL131 ORF gde je jedan adeninski nukleotid deletiran i (2) 34bp LoxP mesto inserirano između US28 i US29 ORFs (videti Tabelu 2).

Genom BAC klona beMAD je potpuno sekvenciran. Ukupna struktura genoma beMAD je identična onoj objavljenoj u ATCC AD169 varijanti (GenBank pristupni br. X17403), koja se sastoji od dva jedinstvena regiona, jednistveni dugi (UL) i jedinstveni kratak (US). Svaki od jedinstvenih regiona ograničen sa dve ponavljajuće sekvence, terminalni ponavljajući dugi (TRL)-unutrašnji ponavljajući dugi (IRL), terminalni ponavljajući kratak (TRS)-unutrašnji ponavljajući kratak (IRS). Kinetika rasta pasažirane varijante MAD169 i virusa izvedenog od beMAD se ne mogu razlikovati kod MRC-5 ćelija, humane ćelijske linije fibroblasta (ATCC pristupni br. CCL-171) (podaci nisu prikazani). Kako gH kompleks nije potreban za rast na ćelijama fibroblasta, razlike u ekspresiji gH kompleksa između MAD169 i beMAD nisu relevantne.

Tabela 2: Molekularna razlika CMV virusa

Primer 2: Efekat konvencionalnih postupaka inaktivacije na gH kompleks

Efekat dva konvencionalna postupka virusne inaktivacije, γ-zračenja i β-Propiolaktona (BPL), je ispitivan na CMV koji eksprimira gH. γ-zračenje je izvedeno na liofilizovanim virionima. Rekombinantna CMV vakcina u koncentraciji od 0.15 mg/mL u HNS (25 mM Histidin, 150 mM NaCl, 9% tež./zapr. saharoze, pH 6.0) formulaciji je liofilizovana upotrebom konzervativnog liofilizacionog ciklusa (zamrzavanje na -50°C i primarno sušenje na -35°C u trajanju od ∼30 časova, nakon čega sledi sekundarno sušenje na 25°C u trajanju od 6 časova) da bi se dobio suvi prašak. Vakcina je liofilizovana u 3 mL staklenom flakonu sa 0.5ml napunjenih u svakom flakonu. Na kraju liofilizacije, flakoni su zatvoreni u atmosferi azota i uzorci su uklonjeni, etiketirani, pokriveni i čuvani na -70°C do gama zračenja. Flakoni su zračeni pod Co uređajem za zračenje za željenu dozu zračenja. Za BPL tretman, BPL stok rastvor je dodat u supernatant sirove virusne kulture iz rasta na ARPE-19 ćelije da bi se dostigle krajnje koncentracije od 0.01 % ili 0.1 % (zapr./zapr.). Reakcija je završena sa natrijum tiosulfatom na različitim vremenskim tačkama. BPL-tretirani CMV koji eksprimira gH su zatim prečišćeni ultracentrifugiranjem.

Kinetika inaktivacije za oba postupka je određena pomoću analize plakova u ARPE-19 ćelijama. Ukratko, serijska razblaženja virusnih uzoraka u PBS su pripremljena i 0.1 mL je korišćen za inokulaciju svake komorice 6-komorne ploče koja je zasejana sa ARPE-19 ćelijama. Ploče su inkubirane na 37°C u trajanju od 1 časa pre dodavanja 6 mL po komorici prekrivajućeg medijuma koji sadrži 0.5% agarozu. Ploče su inkubirane 18 dana na 37°C. Da bi se plakovi vizuelizovali, u svaku komoricu je dodato 0.5 mL MTT rastvora na 5 mg/mL (tizolil plavi tetrazolijum bromid, Sigma M5655). Ploče su inkubirane na 37°C u trajanju od 2-4 časa i plakovi su brojani pod svetlosnom kutijom. (SL.2A i 2C).

Imunogenost inaktiviranih CMV koji eksprimiraju gH je analizirana određivanjem neutralizujućih titara antitela indukovanih kod miševa. Ukratko, ženke Balb/c miševa (n=10) su imunizovane sa 2.5 µg CMV po dozi u nedelji 0 i 3. Serumi su sakupljeni u nedelji 4 i procenjivani za neutralizujuću aktivnost protiv virusnog epitelijalnog ulaska. Neutralizacioni titar (NT50) je definisan kao recipročno razblaženje seruma koje izaziva 50% smanjenje u virusnom epitelijalnom ulasku u poređenju sa negativnom kontrolom. Rezultati iz studija mišje imunogenosti su pokazali da su oba konvencionalna postupka za inaktivaciju imala negativne efekte na neutralizujuće titre antitela indukovane pomoću CMV koji eksprimira gH (SL. 2B i 2D). Redukcija NT50 titara bila je u korelaciji sa trajanjem tretmana pomoću γ-zračenja ili BPL. Produženi tretmani su učinili CMV koji eksprimira pentamerni gH kompleks sličniji roditeljskom AD169 CMV prema imunogenosti kod miševa. Slični rezultati su zabeleženi kod zečeva i rezus majmuna kada su testirane vakcine inaktivirane sa γ-zračenjem ili BPL (podaci nisu prikazani). Ova zapažanja su pokazala da je pentamerni gH kompleks osetljiv na oba postupka inaktivacije pod izabranim uslovima inaktivacije.

Primer 3: Konstrukcija i skrining FKBP-esencijalnih proteinskih fuzija

CMV je konstruisan upotrebom osnove atenuisanog AD169 soja koji ponovo stiče svoj epitelijalni tropizam dok ima uslovno defektnu replikaciju. Postupci opisani u Primeru 1 su korišćeni za vraćanje epitelijalnog tropizma.

Virusni proteini koji će biti fuzionisani sa FKBP derivatom su izabrani na bazi dva kriterijuma. Prvo, proteini od interesa nisu detektovani u CMV virionima pomoću analize proteomike (Varnum et al., 2004, J. Virol. 78:10960), na taj način, smanjujući verovatnoću da će FKBP fuzioni protein biti ugrađen u virus. Drugo, proteini od interesa su esencijalni za virusnu replikaciju u kulturi tkiva.

Upotrebom beMAD kao roditeljskog virusa, FKBP derivat (SEQ ID NO:12) je fuzionisan sa 12 esencijalnih virusnih proteina pojedinačno, uključujući IE1/2 (SEQ ID NO:1), pUL37x1, pUL44, pUL51 (SEQ ID NO:3), pUL52 (SEQ ID NO:5), pUL53, pUL56, pUL77, pUL79 (SEQ ID NO:7), pUL84 (SEQ ID NO:9), pUL87 i pUL105. Takođe je konstruisan virus sa dva različita esencijalna proteina fuzionisana za FKBP, pri čemu je svaki od IE1/2 i UL51 fuzionisan sa FKBP derivatom (genom rdCMV sa destabilizovanim IE1/2 i UL51 je prikazan u SEQ ID NO:14). Posle konstrukcije, sve rekombinantne BAC DNK su transficirane u ARPE-19 ćelije, i kultivisane u medijumu koji sadrži Shld-1.

Ispitivana je zavisnost virusnog rasta od Shld-1. IE1/2, UL51, UL52, UL84, UL79 i UL87 fuzioni virusi su lako spašeni u 2 µM Shld-1 u analizama plakova (podaci nisu prikazani). UL37x 1, UL77 i UL53 virusi su takođe proizveli plakove, ali su plakovi bili mali, i rasli su značajno sporije, u poređenju sa roditeljskim beMAD. Povećanje koncentracije Shld-1 do 10 µM nije značajno ubrzalo rast virusa (podaci nisu prikazani). UL56 i UL105 fuzije nisu oporavljene, što sugeriše da obeležavanje ovih proteina prekida funkciju ovih proteina, ili ekspresiju susednih gena.

Različite koncentracije Shld-1 su korišćene u dodatnim eksperimentima da bi se dodatno procenila virusna replikacija u prisustvu ili odsustvu Shld-1. ARPE-19 ćelije su inficirane sa CMV koji eksprimira gH koji je takođe sadržao FKBP derivat fuzionisan za esencijalni protein u MOI od 0.01 pfu/ml. Posle infekcije od 1 časa, ćelije su isprane dva puta sa svežim medijumom da bi se uklonio Shld-1 iz inokuluma. Inokulumi su zatum dodati u ARPE-19 ćelije kultivisane u medijumu koji sadrži 0.05, 0.1, 0.5 ili 2 µM Shield-1. Sedam dana posle infekcije, virus potomak bez ćelija u supernatantu je sakupljen i titriran na ARPE-19 ćelijama dopunjenim sa 2 mM Shield-1. Titri viruaa su određivani pomoću analize 50% infektivne doze kulture tkiva (TCID50). Ukratko, ova analiza raublaživanja kvantitativno određuje količinu virusa koja je potrebna da ubije 50% inficiranih domaćina. ARPE-19 ćelije su zasejane i dodata su serijska razblažena virusa. Posle inkubiranja, procenat ćelijske smrti (tj. inficiranih ćelija) je uglavnom primećen i zabeležen za svako razblaženje virusa. Rezultati su korišćeni za matematičko izračunavanje TCID50.

Kao što je prikazano na SL.3, efikasna replikacija svog CMV, koji sadrži proizvod fuzije FKBP, zavisi od koncentracije Shield-1, iako u različitom stepenu. Niža koncentracija Shield-1 uopšteno je smanjila titar proizvedenog potomstva virusa. Među virusima sa jednom fuzijom, samo UL51 i UL52 su apsolutno zahtevali Shield-1 za replikaciju. Drugi virusi sa jednom fuzijom, IE1/2, UL84, UL79 i UL87, bi mogli da proizvedu detektabilno potomstvo virusa u odsustvu Shield-1. Regulacija je bila stroga kada je FKBP derivat fuzionisan sa UL51 ili UL52.

Kinetika rasta virusa sa IE1/2, UL51, IE1/2-UL51 fuzijama je upoređivana sa roditeljskim beMAD virusom u prisustvu ili odsustvu 2 µM Shld-1. Kao što je prikazano na SL. 4, u prisustvu Shld-1, jedna ili dvostruke fuzije su imale kinetiku rasta sličnu roditeljskom beMAD.

Međutim, u odsustvu Shld-1, samo IE1/2 je mogao da se replicira, iako na nižoj ili sporijoj stopi od roditeljskog beMAD.

Stepen kontrole virusne replikacije u virusu sa dvostrukom fuzijom je takođe testiran u različitim ćelijskim tipovima (SL.5). Ove ćelije su obuhvatale humane ćelije umbilikalne vene (HUVECs), MRC-5 fibroblaste, ćelije glatkih mišića aorte (AoMCs), ćelije skeletnih mišića (SKMCs) i CCF-STTG1 ćelije astrocitoma. Ćelije su inficirane sa IE1/2-UL51 fuzionim virusom u MOI od 0.01 pfu/ćeliji (osim za CCF-STTG1 koji je inficiran sa MOI od 5 pfu/ćeliji), i zatim inkubirane u medijumu u prisustvu ili odsustvu Shield-1. Svi ćelijski tipovi su sposobni da podrže litičku virusnu replikaciju u prisustvu Shield-1. Nije zabeležena proizvodnja virusa u odsustvu Shield-1.

Primer 4: Imunogenost virusa sa dvostrukom fuzijom IE1/2-UL51 kod životinja

Imunogenost virusa sa dvostrukom fuzijom IE1/2-UL51 je procenjivana kod miševa, zečeva i rezus majmuna. Prvo je upoređivan neutralizujući odgovor zavistan od doze protiv virusa sa dvostrukom fuzijom IE1/2-UL51 ili roditeljskog beMAD virusa kod miševa (SL. 6A). Ženke BALB/c miševa starosti šest nedelja su imunizovani u nedelji 0 i 4 sa beMAD ili virusom sa dvostrukom fuzijom IE1/2-UL51 u dozama u opsegu od 0.12 µg do 10 ug. Uzorci seruma iz nedelje 6 su sakupljeni i analizirani pomoću CMV mikro-neutralizacione analize na ARPE-19 ćelijama kao što je prethodno opisano (Tang et al, Vaccine, "A novel throughput neutralization assay for supporting clinical evaluations of human cytomegalovirus vaccines" e-published August 30, 2011 at doi:10.1016/j.vaccine.2011.08.086). Odgovori su upoređivani u dozama od 0.12, 0.37, 1.1, 3.3 i 10 µg. U niskom opsegu doza (0.12 do 1.1 µg), beMAD je malo imunogeniji sa neutralizujućim antitelima stalno detektovanim kada su nivoi doze bili iznad 0.37 µg. Na visokom opsegu doza (3.3 i 10 µg), neutralizujući titri antitela indukovani sa dva virusa bili su slični.

Sledeće, upoređivana je imunogenost različitih virusa kod zečeva u dozi od 10 µg. Ženke NZW zečeva su imunizovane u nedelji 0, 3 i 8 sa 10 µg beMAD ili sa naznačenim fuzionim virusima. Serumi iz nedelje 10 su sakupljeni i analiziran pomoću mikro-neutralizacione analize CMV na ARPE-19 ćelijama (SL. 5B). beMAD, virusi sa jednom fuzijom IE1/2 ili UL51 i virusi sa dvostrukom fuzijom IE1/2-UL51 bi mogli da indukuju značajno više titre neutralizujućih antitela od MAD169, virusa sličnog AD169 i kome nedostaje pentamerni gH kompleks. Ovo je potvrdilo da je ekspresija gH kompleksa od strane virusa značajno povećala imunogenost rekombinantnog CMV.

Sledeće, imunogenost 100 µg virusa sa dvostrukom fuzijom IE1/2-UL51 ili roditeljskog beMAD virusa je testirana kod rezus makaki majmuna. Serumi iz nedelje 12 su sakupljeni i analizirani pomoću mikro-neutralizacione analize CMV na ARPE-19 ćelijama. GMT NT50 titri u nedelji 12 (posle doze 3) bili su 11500 ili 15600, respektivno. Ovi titri su slični NT50 titrima zabeleženim kod prirodno inficiranih individua (SL.5C).

Dugovečnost imunog odgovora indukovanog CMV vakcinom virusa sa dvostrukom fuzijom IE1/2-UL51 CMV je demonstrirana kod rezus makakija. Životinje su vakcinisane sa 10 µg/dozi ili 100 µg/dozi virusa sa dvostrukom fuzijom IE1/2-UL51 (na bazi ukupne mase proteina). Formulacije vakcine 10 µg/dozi sa amorfnim aluminijum hidroksifosfat sulfatom (AAHS) ili ISCOMATRIX® ađuvansom takođe su uključene. Vakcine su primenjivane u nedeljama 0, 8 i 24 kod rezus makakija (n=5). Za poređenje, kontrolna grupa je primala rekombinantni gB u 30 µg/dozi formulisan sa MF59 ađuvansom u nedeljama 0, 4 i 24. Geometrijske sredine za recipročne NT50 titre (GMT) za sve grupe su predstavljene longitudinalno (SL. 7). Pre vakcinacije, nije bilo detektabilnog titra neutralizujućeg antitela >40 za bilo kog od majmuna. Minimalna neutralizujuća aktivnost je detektovana posle prve doze u nedelji 4 za sve grue sa titrima neutralizujućeg antitela koji dostižu pik oko nedelje 12 i nedelje 28 (četiri nedelje posle druge i treće vakcinacije, respektivno). Maksimalni GMT u nedelji 28 za grupu sa 100 µg/dozi bio je 14,500 (oko 3-struko viši od titra 4,660 za grupu sa 10 µg/dozi). ISCOMATRIX® ađuvans, ali ne AAHS, dao je ađuvantnu korist u poređenju sa grupom sa 10 µg/dozi. GMT u nedelji 28 za ISCOMATRIX® grupu je izmeren 15,800, dok je za grupu AAHS bio 3,000 i za grupu sa 10 µg/dozi je bio 4,660. Minimalna neutralizujuća aktivnost je detektovana za kontrolnu (gB/MF59) grupu, sa maksimalnim GMT koji nikada ne prelazi 200. U nedelji 72 studije, blizu 1 godine posle završetka režima vakcinacije u nedeljama 0, 8 i 24, GMT za grupu sa 100 µg/dozi i grupu sa ISCOMATRIX® formulacijom su održavani na 1400 i 3000, respektivno. U to vreme, GMT za grupu sa 10 µg/dozi i AAHS grupu bio je oko 200.

Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) iz rezus makakija su sakupljene u nedelji 28 (4 nedelje posle doze 3) režima vakcinacije i procenjivane su u IFN-γ ELISPOT analizi. Majmuni su vakcinisani sa 100 µg/dozi (SL.8A) ili 10 µg/dozi (SL.8B-8D) virusa sa dvostrukom fuzijom IE1/2-UL51. Dodatno, 10 µg/dozi je formulisano bilo bez ađuvansa (SL. 8B) ili sa AAHS (SL.

8C) ili ISCOMATRIX® (SL. 8D) ađuvansom. Antigeni sakupljenih preklapajućih peptida koji predstavljaju pet HCMV antigena su korišćeni za stimulaciju proizvodnje IFN-γ ex-vivo. Korišćeni HCMV antigeni bili su IE1 i IE2 (oba virusni regulatorni proteini) i pp65, gB i pp150 (predominantni virusni strukturni antigeni). Kvalitet T-ćelijskih odgovora je procenjivan pomoću magnitude (geometrijskih sredina) ELISPOT odgovora kao i stope odgovora na virusne antigene. Pre vakcinacije, nije bilo antigen-specifičnog ELISPOT titra ni u jednom majmunu (podaci nisu prikazani).

U nedelji 28, geometrijske sredine za ELISPOT odgovore za pet HCMV antigena (tj., IE1, IE2, pp65, gB i pp150) bile su 186, 132, 253, 87, 257 ćelija koje formiraju tačke (SFC)/10<6>PBMC za grupu sa 100 µg/dozi naspram 21, 24, 107, 111, 33 SFC/106 PBMC za grupu sa 10 µg/dozi, respektivno (SL. 8A i 8B). Odgovori u svakoj grupi (n=5) su ocenjivani na bazi graničnog kriterijuma od više od 55 SFC/10<6>PBMC i više od 3-strukog povećanja u antigen-specifičnom odgovoru u odnosu na odgovor sa dimetil sulfoksidom (DMSO). Broj individua koje su imale odgovor na pet HCMV antigena (tj., IE1, IE2, pp65, gB i pp150) bio je 4, 4, 5, 1, 3 za grupu sa 100 µg/dozi naspram 1, 1, 5, 4, 0 za grupu sa 10 µg/dozi.

Efekat ISCOMATRIX® ađuvansa na T- ćelijske odgovore na 10 µg/dozi virusa sa dvostrukom fuzijom IE1/2-UL51 je prikazan na SL. 8D. Geometrijske sredine ELISPOT odgovora na pet HCMV antigena (tj., IE1, IE2, pp65, gB i pp150) bile su 114, 53, 491, 85, 113 SFC/106 PBMC, respektivno, i broj individua koje su imale odgovor u grupi (n=5) je 3, 2, 5, 3, 3, respektivno. Magnituda i širina T-ćelijskih odgovora u grupi sa ISCOMATRIX® ađuvansom bili su slični onima u grupi sa 100 µg/dozi.

PBMC iz životinja vakcinisanih sa 10 µg/dozi ili 100 µg/dozi virusa sa dvostrukom fuzijom IE1/2-UL51 (na bazi ukupne mase proteina) sa ISCOMATRIX® su dalje analizirane pomoću intracelularnog bojenja citokina posle stimulacije sa HCMV antigenima (pp65, IE1, IE2 ili ceo HCMV virion). Negativna kontrola je bila jedan intaktni majmun koji nije vakcinisan virusom sa dvostrukom fuzijom IE1/2-UL51, dok je pozitivna kontrola bila enterotoksin B stafilokoka (SEB). SL.9 prikazuje da je negativna kontrola pokazala minimalne odgovore na sve stimulacije antigenom, ali da je imala odgovor na pozitivno kontrolno sredstvo enterotoksin B stafilokoka (SEB) kao što je očekivano. Svih deset vakcinisanih majmuna iz obe grupe imalo je odgovor na HCMV-specifične antigene sa sličnom magnitudom i obrascima. Vrednosti geometrijske sredine za svaki antigen su izračunavane za svih deset majmuna. Svi majmuni su pokazali slične CD8+ (SL. 9A) i CD4+ (SL.9B) T-ćelijske odgovore kada su njihove PBMC stimulisane sa pulovima peptida CMV antigena (tj., pp65, IE1 i IE2), ali su preferencijalno pokazali CD4+ T-ćelijske odgovore kada su stimulisani sa celim HCMV virionima. Ovo nije očekivano s obzirom na to da su celi virioni proteinski antigeni i verovatno su obrađeni kao egzogeni antigeni i predstavljeni sa MHC klasom II molekula za CD4+ T-ćelije. Virus sa dvostrukom fuzijom IE1/2-UL51 može da izazove T-ćelijske odgovore oba CD4+ i CD8+ fenotipa, slične onima koji se uobičajeno beleže kod zdravih subjekata sa HCMV infekcijom.

Različite formulacije virusa sa dvostrukom fuzijom IE1/2-UL51 sa solima aluminijuma su upoređivane za njihovu sposobnost da generišu neutralizujuća antitela u rezus makakijima (SL.

10). 30 µg/dozi virusa sa dvostrukom fuzijom IE1/2-UL51 je formulisano sa HNS (bazni pufer), amorfnim aluminijum hidroksilfosfat sulfatom (AAHS) ili Merck Aluminum Phosphate Adjuvant (MAPA) i primenjivano u nedelji 0 i 8. Uzorci seruma sakupljeni u nedelji 12 pokazali su iako je MAPA pojačala indukciju neutralizujućeg antitela, pojačanje nije bilo statistički značajno (dvostruki nespareni t-test).

Primer 5: Identifikacija pufera za čuvanje

CMV virus u HBSS (Hank-ovom ravnotežnom rastvoru soli) je čuvan na -70°C do upotrebe razblažen ∼10x sa odgovarajućim puferom. Rezidualne komponente HBSS pufera u svakom uzorku uključivale su kalijum hlorid 0.533 mM, kalijum fosfat monobazni 0.044 mM, natrijum fosfat dvobazni 0.034 mM, natrijum hlorid 13.79 mM, natrijum bikarbonat 0.417 mM i glukozu 0.1 % tež./zapr. Uzorci su zatim čuvani na sobnoj temperaturi ili temperaturama između 2°C-8°C u trajanju od 4 dana ili zamrzavani-odmrzavani. Za zamrzavanje-odmrzavanje, uzorak je čuvan na -70°C najmanje 1 čas i odmrzavan na sobnoj temperaturi u trajanju od 30 minuta tokom jednog ili tri ciklusa. Stabilnost uzoraka je testirana na dan 4 upotrebom analize ulaska virusa. Ukratko, analiza je izvedena upotrebom nekoliko različitih razblaženja uzorka da bi se dobila kriva odgovora i EC50 (µg/mL) vrednosti su dobijene iz rezultata analize ulaska virusa pomoću aproksimacije ne-linearne krive. Niže EC50 vrednosti predstavljaju bolju stabilnost. EC50 vrednosti stabilnosti uzoraka su upoređivane protiv kontrolnog uzorka zamrznutog na -70°C. Analiza ulaska virusa meri sposobnost CMV da inficira ARPE-19 ćelije i eksprimira IE1 (neposredni rani protein 1). Analiza je izvedena u providnim 96-komornim pločama. IE1 specifična primarna antitela i biotinilovana sekundarna antitela su korišćena za detekciju ciljnih proteina u fiksiranim ćelijama i fluorescentni signal iz svake komorice je kvantitativno određivan upotrebom IR Dye 800CW Streptavidina zajedno sa Sapphire 700/DRAQ5 (za normalizaciju ćelijskog ulaza). Rezultati su prikazani na grafikonu kao 800/700 integrisani odnos intenziteta (Integ. odnos) naspram koncentracije CMV (ukupni protein, µg/mL). EC50 vrednosti su takođe dobijene iz rezultata analize infektivnosti upotrebom aproksimacije ne-linearne krive. S obzirom na to da se virusna infekcija ARPE-19 ćelija oslanja na integritet virusnih glikoproteinskih antigena, naročito pentamernog gH kompleksa, EC50 vrednosti reflektuju kako dobro su virusne čestice očuvane pod ovim uslovima.

Kao što je prikazano na SL. 11, CMV gubi infektivnost kada je čuvan četiri dana u HBSS na sobnoj temperaturi. Pored toga, 3 ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja u HBSS dovodi do potpunog gubitka infektivnosti kada se procena vrši pomoću analize ulaska virusa. Na taj način, HBSS nije bio optimalan pufer za čuvanje CMV.

Efekat pH na stabilnost CMV na sobnoj temperaturi je ispitivan upotrebom opega pH od 3 do 8. Korišćeni su sledeći puferi: Citratni pufer (25 mM), pH 3.0; acetatni pufer (25 mM), pH 4; acetatni pufer (25 mM), pH 5; histidinski pufer (25 mM), pH 6; HEPES pufer (25 mM), pH 7; Hank-ov ravnotežni rastvor soli (HBSS), pH 7.5 i Tris pufer (25 mM), pH 8.

Uzorci su pripremljeni razblaživanjem matičnog rastvora virusa 10 puta sa odgovarajućim puferom. Uzorci su čuvani na sobnoj temperaturi (25°C) u trajanju od 4 dana. Na dan 4, stabilnost uzoraka je merena upotrebom analize ulaska virusa. CMV u HBSS čuvan zamrznut na -70°C je tretiran kao kontrola. UV-Vis spektri za svaki od uzoraka su dobijeni u vreme 0 i na dan 4 da bi se ispitale strukturne promene i agregacija koja se javila u toku čuvanja.

Kao što je prikazano na SL.12, 25 mM Histidinski pufer na pH 6 dao je bolju stabilnost za CMV zadržavanjem veće infektivnosti na sobnoj temperaturi u poređenju sa drugim testiranim pH. Drugi derivat UV-spektra pokazao je sličan strukturni profil virusa na svim pH vrednostima (podaci nisu prikazani). Nije zabeležena značajna agregacija na bilo kojoj od testiranih pH kao što je mereno pomoću optičke gustine na 350 nm (podaci nisu prikazani).

Efekat same uree ili u kombinaciji sa natrijum hloridom na stabilnost CMV virusa je testiran u 25 mM Histidinskom puferu, pH 6. Dodavanje samo 2% uree nije imalo efekat na stabilnost CMV. Međutim, 2% urea u kombinaciji sa 150 mM NaCl poboljšala je stabilnost CMV na sobnoj temperaturi (SL.13).

Efekat jonske jačine na stabilnost CMV ispitivan je na pH 6. Rastuće koncentracije NaCl (0 mM, 75 mM, 150 mM i 320 mM NaCl) su dodavane u 25 mM Histidinski pufer na pH 6. Stabilnost CMV je bila zavisna od jonske jačine gde je veća jonska jačina dovela do bolje stabilnosti (SL.

14). Prisustvo uree nije imalo nikakav ili je imalo minimalan efekat na stabilnost CMV (podaci nisu prikazani).

Pored toga, nekoliko drugih ekscipijenasa (saharoza, sorbitol, glicerol i prolin) su ispitivani za njihov efekat na stabilnost CMV koji eksprimira gH na sobnoj temperaturi. Ekscipijensi koji će se testirati su dodati u CMV u 25 mm Histidinskom puferu, pH 6 na sobnoj temperaturi u trajanju od 4 dana pre merenja stabilnosti CMV virusa upotrebom analize ulaska virusa. EC50vrednosti su izračunavane za uzorke. Među svim testiranim ekscipijensima, samo 150 mM NaCl ili u kombinaciji sa 9% tež./zapr. saharoze obezbedilo je bolju stabilnost na pH 6 (podaci nisu prikazani). Prema tome, preporučeni pufer za čuvanje CMV na sobnoj temperaturi je 25 mM Histidina (pH 6) sa 150 mM NaCl sa ili bez 9% tež./zapr. saharoze.

Ispitivan je efekat krioprotektanata na stabilnost CMV u toku zamrzavanja-odmrzavanja. Kao što je naznačeno prethodno (SL. 11), CMV u HBSS je potpuno izgubio svoju infektivnost kada je podvrgnut tri ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja. Nekoliko krioprotektanata (uključujući saharozu, sorbitol, glicerol) su ispitivani za sposobnost da umanje stres od zamrzavanjaodmrzavanja na CMV. Za svaki ciklus zamrzavanja-odmrzavanja, uzorci su zamrznuti na -70°C na najmanje 1 čas i odmrznuti na sobnoj temperaturi u trajanju od 30 minuta. Dodavanje krioprotektanata je dovelo do povećane stabilnosti virusa. Pored toga, 9% tež./zapr. saharoze u kombinaciji sa 150 mM natrijum hloridom dovelo je do značajno povećane stabilnosti virusa u poređenju sa drugim testiranim krioprotektantima (SL. 15). Prema tome, preporučena kompozicija pufera za čuvanje CMV na -70°C ili do 3 ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja je 25 mM Histidin, 150 mM NaCl i 9% saharoza (HNS pufer).

HNS pufer je upoređivan sa HBSS puferom za zaštitu stabilnosti CMV u toku tri ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja, hlađenja u frižideru (2-8°C) i na sobnoj temperaturi (25°C). HNS pufer je dao bolju stabilnost zha CMV živi virus na svim testiranim uslovima čuvanja (podaci nisu prikazani).

Primer 6: Stabilnost CMV u HNS puferu

Stok virusa sa dvostrukom fuzijom IE1/2-UL51 CMV je nabavljen u HNS puferu i čuvan na -70°C do upotrebe. Studija stabilnosti je izvedena na koncentraciji od 100 µg/mL (na bazi ukupnog sadržaja proteina izmerenog pomoću Bradford analize). Matični rastvor virusa je razblažen sa HNS puferom da bi se dobila krajnja koncentracija virusa. Uzorci su zatim čuvani na odgovarajućim temperaturama i testirani kao što je opisano za do 3 meseca. Za zamrzavanjeodmrzavanje, uzorci su zamrznuti na -70°C u trajanju od najmanje 1 časa i odmrznuti na sobnoj temperaturi u trajanju od 30 minuta. Uzorci su izabrani u različitim vremenskim tačkama i držani zamrznuti na -70°C do analize.

Ukupan sadržaj proteina uzoraka je meren uporebom Bradford analize. Ukupan sadržaj proteina uzoraka nije se promenio tokom perioda od 3 meseca (podaci nisu prikazani).

Veličina čestica CMV u uzorcima u vremenu je praćena merenjem hidrodinamičkog prečnika uzorka upotrebom DLS postupka. Ovaj postupak pratio svaklu agregaciju ili prekid virusnih čestica u vremenu i na različitim temperaturama čuvanja. Nije zabeležen stvaran trend sa sporadičnim promenama u veličini čestica određenih uzoraka (podaci nisu prikazani). Rezultati su ukazali na to da su virusne čestice intaktne i nisu agregirane na povišenim temperaturama.

Primer 7: Efekat uslova čuvanja na ulazak virusa i imunogenost

Značajne promene u titrima ulaska virusa (EC50 vrednosti) su zabeležene podvrgavanjem CMV uzoraka različitim temperaturama čuvanja (podaci nisu prikazani). Čuvanje na -20°C je rezultiralo u nižim titrima ulaska virusa u poređenju sa 2-8°C i 25°C. Nađeno je da su titri uzoraka sa 2-8°C niži titri ulaska virusa u poređenju sa čuvanjem na 25°C. Na bazi EC50 vrednosti temperature čuvanja su rangirane po sledećem redosledu (od najstabilnije do najmanje stabilne): 25°C > 2-8°C > -20°C do vremenske tačke od 1 meseca. Titri ulaska virusa nisu bili detektabilni na vremenskoj tački od 3 meseca za uzorke čuvane na -20°C, 2-8°C i 25°C.

Studija mišje imunogenosti je započeta na kraju studije stabilnosti da bi se odredio efekat temperature čuvanja na sposobnost CMV da indukuje CMV neutralizujuća antitela. Miševi su imunizovani sa 2.5 µg po dozi vakcine i.m. na dan 0 i primili buster injekciju na dan 21 nakon čega je usledilo vađenje krvi na dan 28. Mišji serum je testiran za neutralizujuća antitela protiv CMV koji eksprimira gH upotrebom ARPE 19 ćelija i NT50 titri su dobijeni pomoću aproksimacije nelinearne krive.

Procenjivan je efekat čuvanja na različitim temperaturama u trajanju od 3 meseca na imunogenost CMV sa dvostrukom fuzijom IE1/2-UL51. NT50 titri su bili zavisni od temperature čuvanja, sa višim temperaturama koje rezultiraju u smanjenim titrima u poređenju sa kontrolom zamrznutom na -70°C iako ne značajno (p=0.2584, one way ANOVA) (SL.16A). NT50 titar za formulacije čuvane na -20°C bio je niži za manje od 2-puta, ali titri iz analize ulaska virusa za ove uzorke su bili značajno pogođeni u poređenju sa kontrolom zamrznutom na -70°C. Trend NT50 titara za uzorke za analizu stabilnosti na -20°C, 2-8°C i 25°C prati titre CMV dobijene iz masene ELISA ovih uzoraka.

Procenjivan je efekat čuvanja na različitim temperaturama u trajanju od 8 časova posle odmrzavanja na imunogenost CMV sa dvostrukom fuzijom IE1/2-UL51. NT50 titri formulacija su upoređivani sa kontrolom zamrznutom na -70°C. NT50 titri nisu pogođeni (p=0.5865, one way ANOVA) čuvanjem uzoraka u trajanju od 8 časova na bilo kojoj od testiranih temperatura (SL. 16B).

Efekat čuvanja CMV sa dvostrukom fuzijom IE1/2-UL51 na 25°C za različite vremenske tačke posle odmrzavanja uzoraka je procenjivan u studiji mišje imunogenosti. NT50 titri ovih formulacija su upoređivani sa kontrolom zamrznutom na -70°C. NT50 titri nisu pogođeni (p=0.1848, nespareni dvostruki t-test) čuvanjem uzoraka na 25°C do jedne nedelje. U 3. mesecu, NT 50 titri su pali za malo preko 2-puta, što ukazuje na moguće probleme sa stabilnošću formulacije na 25°C za duže vreme (podaci nisu prikazani).

Efekat 3 ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja na CMV sa dvostrukom fuzijom IE1/2-UL51 formulisanom u HNS puferu je procenjivan pomoću mišje imunogenosti. Tri ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja (F/T) formulacije CMV sa dvostrukom fuzijom nisu uticala na imunogenost (p=0.2103, nespareni dvostruki t-test) u poređenju sa kontrolom zamrznutom na -70°C (podaci nisu prikazani).

Ostali primeri izvođenja su unutar sledećih patentnih zahteva.

NUMERISANI PRIMERI IZVOĐENJA

Predmetna objava se odnosi na sledeće numerisane primere izvođenja:

1. Citomegalovirus sa uslovno defektnom replikacijom koji sadrži:

(a) pentamerni gH kompleks koji sadrži UL128, UL130, UL131, gH i gL; i

(b) nukleinsku kiselinu koja kodira fuzioni protein između esencijalnog proteina i destabilizujućeg proteina, pri čemu je esencijalni protein izabran iz grupe koja se sastoji od IE1/2, UL51, UL52, UL79 i UL84.

2. CMV sa uslovno defektnom replikacijom prema primeru izvođenja 1, pri čemu je destabilizujući protein FKBP ili derivat FKBP, pri čemu je derivat FKBP - FKBP koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija izabranih iz grupe koja se sastoji od: F15S, V24A, H25R, F36V, E60G, M66T, R71G, D100G, D100N, E102G, K105I i L106P.

3. CMV sa uslovno defektnom replikacijom prema primeru izvođenja 2, pri čemu derivat FKBP je FKBP koji sadrži aminokiselinske supstitucije F36V i L106P.

4. CMV sa uslovno defektnom replikacijom prema bilo kom od primera izvođenja 1-3, pri čemu, esencijalni protein je IE1/2.

5. CMV sa uslovno defektnom replikacijom prema bilo kom od primera izvođenja 1-3, pri čemu, esencijalni protein je UL51.

6. CMV sa uslovno defektnom replikacijom prema bilo kom od primera izvođenja 1-3, pri čemu, CMV sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira najmanje dva fuziona proteina, pri čemu su esencijalni proteini u svakom od fuzionih proteina različiti.

7. CMV sa uslovno defektnom replikacijom prema primeru izvođenja 6, pri čemu jedan od fuzionih proteina sadrži IE1/2.

8. CMV sa uslovno defektnom replikacijom prema primeru izvođenja 6, pri čemu, jedan od fuzionih proteina sadrži UL51.

9. CMV sa uslovno defektnom replikacijom prema primeru izvođenja 6, pri čemu prvi fuzioni protein sadrži IE1/2 i drugi fuzioni protein sadrži UL51.

10. CMV sa uslovno defektnom replikacijom prema primeru izvođenja 9, pri čemu

(a) prvi fuzioni protein je SEQ ID NO:1 ili aminokiselina koja je najmanje 95% identična sa SEQ ID NO:1; i

(b) drugi fuzioni protein je SEQ ID NO:3 ili aminokiselina koja je najmanje 95% identična sa SEQ ID NO:3.

11. CMV sa uslovno defektnom replikacijom prema primeru izvođenja 10, pri čemu, prvi fuzioni protein je SEQ ID NO:1 i drugi fuzioni protein je SEQ ID NO:3.

12. CMV sa uslovno defektnom replikacijom prema primeru izvođenja 10, pri čemu

(a) prvi fuzioni protein je kodiran sa SEQ ID NO:2 ili nukleinskom kiselinom koja je najmanje 95% identična sa SEQ ID NO:2; i

(b) drugi fuzioni protein je kodiran sa SEQ ID NO:4 ili nukleinskom kiselinom koja je najmanje 95% identična sa SEQ ID NO:4.

13. CMV sa uslovno defektnom replikacijom prema primeru izvođenja 12, pri čemu prvi fuzioni protein je kodiran sa SEQ ID NO:2 i drugi fuzioni protein je kodiran sa SEQ ID NO:4.

14. CMV sa uslovno defektnom replikacijom prema primeru izvođenja 9, pri čemu, genom CMV je SEQ ID NO:14.

15. Kompozicija koja sadrži CMV sa uslovno defektnom replikacijom prema bilo kom od primera izvođenja 1-14 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

16. Kompozicija prema primeru izvođenja 15 koja dalje sadrži ađuvans.

17. Kompozicija prema primeru izvođenja 16, pri čemu je ađuvans ISCOMATRIX®.

18. Postupak za indukciju imunog odgovora protiv CMV kod pacijenta koji sadrži primenu na pacijenta imunološki efikasne količine kompozicije prema bilo kom od patentnih zahteva 15-17.

19. Postupak prema primeru izvođenja 18, pri čemu je imuni odgovor zaštitni imuni odgovor kod pacijenta protiv CMV infekcije.

20. Postupak prema bilo kom od primera izvođenja 18-19, pri čemu je CMV infekcija primarna infekcija, rekurentna infekcija ili super-infekcija.

21. Postupak prema primeru izvođenja bilo kog od primera izvođenja 18-20, pri čemu je pacijent čovek.

22. Postupak prema primeru izvođenja 21, pri čemu pacijent ima oslabljeni imunitet.

23. Postupak prema primeru izvođenja 22 pri čemu pacijent koji ima oslabljeni imunitet ima HIV ili SIDA-u ili je primalac transplanta.

24. Postupak prema primeru izvođenja 21, pri čemu je pacijent žena u reproduktivnom dobu. 25. Upotreba CMV sa uslovno defektnom replikacijom prema bilo kom od primera izvođenja 1-14 u proizvodnji leka za indukciju zaštitnog imunog odgovora kod pacijenta protiv CMV infekcije.

26. CMV sa uslovno defektnom replikacijom prema bilo kom od primera izvođenja 1-14 za upotrebu u medicini za lečenje CMV infekcije kod pacijenta.

27. Postupak za pripremu CMV sa uslovno defektnom replikacijom prema bilo kom od primera izvođenja 2-14 koji sadrži umnožavanje rekombinantnog CMV u epitelijalnim ćelijama u prisustvu Shield-1.

28. Postupak prema primeru izvođenja 27, pri čemu, epitelijalne ćelije su humane pigmentirane retinalne epitelijalne ćelije.

29. Postupak prema primeru izvođenja 28, pri čemu su humane retinalne pigmentisane ćelije ARPE-19 ćelije deponovane kod American Type Culture Collection (ATCC) kao pristupni br. CRL-2302.

30. Postupak prema primeru izvođenja 27, pri čemu je Shield-1 prisutan u koncentraciji od najmanje 0.5 µM.

31. Postupak prema primeru izvođenja 30, pri čemu je Shield-1 prisutan u koncentraciji od najmanje 2 µM

32. Postupak za pripremu kompozicije prema bilo kom od patentnih zahteva 15-17 koji sadrži: (a) umnožavanje CMV sa uslovno defektnom replikacijom u epitelijalnim ćelijama sa Shield-1 dodatim u medijum;

(b) sakupljanje CMV sa uslovno defektnom replikacijom iz medijuma;

(c) značajno uklanjanje Shield-1 iz CMV sa uslovno defektnom replikacijom; i

(d) dodavanje farmaceutski prihvatljivog nosača u CMV sa uslovno defektnom replikacijom. 33. Postupak prema primeru izvođenja 32, pri čemu su epitelijalne ćelije humane pigmentisane retinalne epitelijalne ćelije.

34. Postupak prema primeru izvođenja 33, pri čemu, humane retinalne pigmentisane epitelijalne ćelije su ARPE-19 ćelije deponovane kod American Type Culture Collection (ATCC) kao pristupni br. CRL-2302.

35. Postupak prema primeru izvođenja 32, pri čemu je Shield-1 prisutan u koncentraciji od najmanje 0.5 µM u medijumu u toku koraka (a).

36. Postupak prema primeru izvođenja 35, pri čemu je Shield-1 prisutan u koncentraciji od najmanje 2 µM u medijumu u toku koraka (a).

37. Postupak prema primeru izvođenja 32, pri čemu je uklanjanje preko ultracentrifugiranja ili diafiltracije.

38. Postupak prema primeru izvođenja 32, pri čemu uklanjanje smanjuje Shield-1 do ispod 0.1 µM.

39. Kompozicija koja sadrži CMV sa uslovno defektnom replikacijom prema bilo kom od patentnih zahteva 1-14 u puferu na pH između 5-7 koja sadrži:

(a) između 15-35 mM histidina; i

(b) između 100-200 mM NaCl.

40. Kompozicija prema primeru izvođenja 39 koja dalje sadrži između 5-15% saharoze.

41. Kompozicija prema bilo kom od primera izvođenja 38-39 pri čemu pufer sadrži 25 mM histidina sa 150 mM NaCl na pH od 6.

42. Kompozicija prema primeru izvođenja 41 koji dalje sadrži 9% tež./zapr. saharoze.

43. Nukleinska kiselina prema SEQ ID NO:14.

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Citomegalovirus (CMV) sa uslovno defektnom replikacijom sa destabilizovanim IE1/2 i UL51 proteinima, naznačen time što je genom CMV predstavljen sa SEQ ID NO: 14.

2. Kompozicija koja sadrži imunološki efikasnu količinu CMV sa uslovno defektnom replikacijom prema patentnom zahtevu 1 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

3. Kompozicija prema patentnom zahtevu 2 koja dalje sadrži ađuvans.

4. Imunološki efikasna količina kompozicije prema patentnom zahtevu 2 ili 3 za upotrebu u postupku za indukciju imunog odgovora protiv CMV kod pacijenta.

5. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, naznačena time što imuni odgovor je zaštitni imuni odgovor kod pacijenta protiv CMV infekcije.

6. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 4 ili 5, naznačena time što pacijent ima oslabljeni imunitet.

7. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 4 ili 5, naznačena time što pacijent je žena u reproduktivnom dobu.

8. Upotreba CMV sa uslovno defektnom replikacijom prema patentnom zahtevu 1 u proizvodnji leka za indukciju zaštitnog imunog odgovora kod pacijenta protiv CMV infekcije.

9. CMV sa uslovno defektnom replikacijom prema patentnom zahtevu 1 za upotrebu u medicini za lečenje CMV infekcije kod pacijenta.

10. Postupak za pripremu CMV sa uslovno defektnom replikacijom koji sadrži umnožavanje rekombinantnog CMV prema patentnom zahtevu 1 u epitelijalnim ćelijama u prisustvu Shield-1, pri čemu je Shield-1 prisutan u koncentraciji od najmanje 0.5 µM.

11. Postupak prema patentnom zahtevu 10, naznačen time što epitelijalne ćelije su humane pigmentisane retinalne epitelijalne ćelije.

12. Postupak prema patentnom zahtevu 11, naznačen time što humane retinalne pigmentisane epitelijalne ćelije su ARPE-19 ćelije deponovane kod American Type Culture Collection (ATCC) kao pristupni br. CRL-2302.

13. Kompozicija koja sadrži imunološki efikasnu količinu CMV sa uslovno defektnom replikacijom prema patentnom zahtevu 1 u puferu na pH između 5-7 koja sadrži:

(a) između 15-35 mM histidina; i

(b) između 100-200 mM NaCl.

14. Kompozicija prema patentnom zahtevu 13 naznačena time što pufer sadrži 25 mM histidina sa 150 mM NaCl na pH od 6.

15. Kompozicija prema patentnom zahtevu 14 koja dalje sadrži 9% tež./zapr. saharoze.