RS58901B1 - Oblici kisele soli konjugata polimer-lek - Google Patents

Description

Gen fukoziltransferaze

Pronalazak se odnosi na polinukleotide koji kodiraju za fukoziltransferazu. Pronalazak se dalje odnosi na delove sekvenci ovih polinukleotida kao i vektora sa ovim polinukleotidima, rekombinantne ćelije domaćina, biljke i insekte, koji su transfektirani - ovim polinukleotidima, odnosno sa DNK koja od toga potiče, kao i glikoproteina koji su u ovim sistemima proizvedeni.

Glikoproteini pokazuju raznovrsnost i kompleksnost ugljeno-hidratnih jedinica pri čemu je sastav i uredjenje ugljenih hidrata karakteristično za različite organizme. Oligosaharidne jedinice" glikoproteina imaju niz zadataka, tako su one npr. važne u regu-laciji razmene materija, one učestvuju u posredovanju kod naizm-eničnog delovanja ćelija - ćelija, one odredjuju cirkulaciona vremena proteina u krvotoku i one su presudne za prepoznavanje epitopa u reakcijama antigen - antitelo.

Glikozilovanje glikoproteina počinje u endoplazmatičnom retikulumu (ER), gde oligo saharidi bivaju vezani ili N-glikozidnim vezama na asparaginse bočne lance ili O-glikozidnim vezama na serin- ili treonin- bočne lance. N- vezani oligosaharidi sadrže zaje-dničko jezgro od jedne pentasaharidne jedinice, koja se sastoji od tri manoze i dva N-acetilglikozaminska ostatka. Za dalju modifi-kaciju jedinica ugljenih hidrata proteini se transportuju od ER ka Golgi- kompleksu. Struktura N- vezanih oligosaharidnih jedinica glikoproteina odredjena je njihovom konformacijom i sastavom glikoziltransferaza Golgi- kompartimenata u kojima se procesiraju.

Pokazalo se da se pentasaharidna jedinica jezgra Golgi-kompleksa nekih biljaka i insekata supstituiše ksilozom i al,3-vezanom fukozom (P. Lerouge et al. 1998 Plant Mol. Biol. 38, 31-48; Rayon et al. 1998 L. Exp. Bot. 49, 1463-1472). Nastali heptasaharid "MMXF<3>" predstavlja glavni oligosaharidni tip u biljkama (Kurosaka et al. 1991 J. Biol. Chem., 266, 4168-4172). Tako sadrže peroksidaze rena, (3- fruktozidaze šargarepe i lecitin eritrina kristagali, kao i pčelinji otrov fosfolipaza A2 ili neuronalni membranski glikoproteini embriona insekata otl-3- fukozne ostatke koji su vezani za glikanska jezgra. Ove strukture se još nazivaju kompleksni glikani odnosno manoza deficitarni ili trunkirani N-glikani. a- manozil- ostaci se dalje mogu zameniti sa GIcNAc, nakoje su vezane galaktoza i fruktoza tako da se uspostavlja struktura koja odgovara humanom Lewis a epitop (Melo et al. 1997, FEBS Lett. 415, 186-191; Fitchette-Laine et al. 1997 Plant J. 12, 1411-1417).

Ni ksiloza ni al,3- vezana fukoza se ne nalaze u glikoproteinima sisara. Ispostavilo se da jezgro al,3- fukoze igra važnu ulogu u prepoznavanju epitopa antitela koja su usmerena protiv N-vezanih oligosaharida biljaka i insekata (I.B.H. VVilson et al., Glycobiology Vol. 8, Nr. 7, S. 651-661, 1998) i time pokreće imune reakcije protiv ovih oligosaharida u ljudskom ili životinjskom telu. Izgleda da je al,3- ostatak fukoze jedan od glavnih razloga za široko rasprostranjenu unakrsnu reaktivnost izmedju različitih ? biljnih alergena i alergena insekata (Tretter et al., Int. Arch. Allergv Immunol. 1993; 102: 259-266) i označava se kao "unakrsno-reaktivna determinanta ugljenog hidrata" (CCD).

U jednoj studiji epitopa paradajza i polena trave utvrdjeni su takodje vezani al,3- fukozni ostaci kao zajedničke determinante što je izgleda razlog za često zajedničko pojavljivanje alergija kod pacijenata na polen trave i paradajz (Petersen et al. 1996, J. Allergy Clin. Immunol., Vol. 98, 4; 805-814). CCD-ovi onemogu-ćavaju dalje dijagnoze alergija čestom pojavom imunoloških unakrsnih reakcija.

Ove imunološke reakcije koje u ljudskom telu pokreću biljni proteini su glavni problem u medicinskoj primeni rekombinovanih ljudskih proteina proizvedenih u biljkama. Da bi se ovi problemi zaobišli, moralo se sprečiti al,3- fukozilovanje jezgra. U jednoj studiji je moglo da se pokaže da su oligosaharidi, koji umesto L-fukoze (6-deoksi-L-galaktoza) imaju L- galaktozu, ipak potpuno biološki aktivni (E. Zablackis et al. 1996 Science, Vol. 272). Prema jednoj drugoj studiji izolovan je mutant biljkearabidopsis thaliana,kome nedostaje N-acetil-glukozaminil-transferaza I, prvi enzim u bio-sintezi kompleksnih glikana. Bio-sinteza kompleksnih glikoproteina je time u ovim mutantima ometena. Ipak su ove mutirane biljke sposobne da se pod odredjenim uslovima normalno razvijaju (A.Schaevven etal. 1993, Plant Phvsiol. 102; 1109-1118)

Da bi se ciljno sprečilo vezivanje jezgra al,3- fukoze u oligosaharidu bez zadiranja u druge korake glikozilovanja, moraju se isključiti samo enzimi koji su direktno odgovorni za ovo speci-fično glikozilovanje, naime jezgro al,3- glukoziltransferaze. Ono je po prvi put bilo izolovano i karakterisano iz mango mahune pri čemu se utvrdilo da aktivitet ovog enzima zavisi od prisustva neredukujućih krajeva GIcNAc (Staudacher et al., 1995, Glvcoconjugate J. 12, 780-786). Ova transferaza, koja se nalazi samo u biljkama i insektima, a ne i kod ljudi i kičmenjaka, morala je da se ciljno inaktivira ili potisne tako da ljudski proteini, koji se stvaraju u biljkama, odnosno biljnim ćelijama, odnosno insektima i ćelijama insekata, ne poseduje kao do sada ovaj epitop koji pokre-će imune reakcije.

Spis Dzona M. Burk-a (John M. Burke) "Clearing the way for ribozymes" (Nature Biotechnology 15: 414-415; 1997) se odnosi na generalni način funkcionisanja ribozima.

Spis Pug-a (Poog et al.) "Cell penetrating PNA constructs regulate galanin receptor levels and modify pain transmission in vivo" (Nature Biotechnology 16: 857-861; 1998) se odnosi na PNA molekule uopšte i specifično jedan PNA molekul, koji je komplementaran humanom galanin- receptor- tipu 1 mRNA.

US 5 272 066 A se odnosi na postupak za pramenu eukario-tskih i prokariotskih proteina, da bi se produžila njihova in vivo cirkulacija. Pri tome se vezani oligosaharidi menjaju uz pomoć različitih enzima izmedju ostalih takodje GIcNAc- al,3 (4)-fukoziltransferaze.

EP 0 643 132 Al se odnosi na kloniranje al,3- fukozoltrans-feraze, koja se izoluje iz humanih ćelija (THP-1). U ovim spisima opisani ugljovodonicni lanci odgovaraju ljudskim Sialvl Levvis x- i Sialvl Levvis a- oligosaharidima. Specifičnost enzima iz humane ćelije je sasvim drugačija nego fukoziltransferaze iz biljnih ćelija.

Cilj predloženog pronalaska je stvaranje gena, koji kodira za biljnu fokuziltransferazu, kloniranje i sekvenciranje, vektorsko okruženje ovog gena, DNK delova od toga ili izmenjene ili od toga izvedene DNK, biljke i insekte, kao i ćelije od toga transfektirati jednim od ovih vektora, stvoriti glikoproteine koji ne obuhvataju normalno postojeće jezgro al,3- fukoze kao i stavljanje na raspolaganje odgovarajućih postupaka.

Zadatak prema pronalasku se rešava DNK molekulom, koji obuhvata sekvencu prema SEQ ID No:l (u ovom spisu primenjuje se IUPAC nomenklatura, pri čemu "N" stoji za inozin) sa otvorenim čitačkim okvirom od baznog para 211 do baznog para 1740 ili poseduje najmanje 50% homologije prem gore navedenoj sekvenci, ili hibridizuje pod stringentnim uslovima sa gore navedenom sekvencom ili obuhvata sekvencu koja je usled genetskog koda prema gore navedenoj DNK sekvenci degenerisana, pri čemu je sekvenca kodirana za biljni protein sa aktivitetom fukoziltransferaze ili tome komplementarna.

Ova sekvenca koja predhodno još nije bila opisana, izuzetno je podesna za raznovrsne eksperimente, analize i postupke proizvodnje itd. koji se odnose na aktivitet biljne fukoziltransferaze.

Pri tome je od interesa kako DNK sekvenca tako i od ove sekvence kodirani protein pri čemu je naročito privlačna DNK sekvenca za sprečavanje aktiviteta fukoziltransferaze.

Otvoreni čitački okvir sekvence sa SEQ ID No:l kodiran za protein sa 510 aminokiselina i teoretskom molekulskom težinom od 56,8 kDa, pri čemu u područiju izmedju Asn 36 i Gli 54 verovatno postoji jedan transmembranski deo. Izračunata pl vrednost ko-diranog proteina sekvence prema SEQ ID No:l iznosi 7,51.

Aktivitet biljne fukoziltransferaze se utvrdjuje i meri postupkom pri kome se fukoziltransferaza dodaje probi koja sadrži marki-ranu fukozu i akceptor vezan za nosač, npr. sefaroza (npr. glikoprotein). Posle reakcionog vremena proba se pere i sadržaj vezane fukoze meri. Aktivitet fukoziltransferaze se pri tom smatra pozitivnim, ako merenje aktiviteta leži najmanje za 10-20% naroči-to najmanje 30-50% više nego merenje aktiviteta negativne kontrole. Struktura proteina se može dodatno verifikovati uz po-moć HPLC. Ovakvi protokoli su stanje tehnike (Staudacher et al. 1998, Anal. Biochem. 246, 96-101; Staudacher et al. 1991, Eur. J. Biochem. 199, 745-751).

Fokuziltransferaza se npr. dodaje u probu koja obuhvata radioaktivnu fukozu i jedan akceptor, npr. GlcNAcpl-2Manal-3(GlcNAcpl-2Manal-6)Man(31-4GlcNAcpl-4GlcNAcpi-Ans. Posle reakcionog vremena proba se prečišćava anjonsko-izmenjivačkom hromatografijom i meri sadržaj vezane fukoze. Iz razlike izmere-nog radioaktiviteta probe sa akceptorom i negativne kontrole bez akceptora može se izračunati aktivitet. Aktivitet fukoziltransferaze se već onda pozitivno ocenjuje kada izmerena radioaktivnost leži najmanje 30-40% više nego izmerena radioaktivnost negativne probe.

Parovanje dva molekula DNK može se menjati izborom tem-perature i jonske sile probe. Pod stringentnim uslovima podrazu-mevaju se uslovi prema pronalasku, koji omogućavaju egzaktnu stringentnu vezu. DNK molekuli se npr. hibridizuju u 7% natrijum-dodecilsulfatu (SDS), 0,5M Na3P04pH 7,0 ; lmM EDTA na 50°C

i isperu sa 1% SDS na 42°C.

Da li sekvence poseduju najmanje 50% homologije prema SEQ ID No:l može se ustanoviti programom FastDB ili EMBL-om ili SVVISSPORT bankom podataka.

Sekvenca DNK molekula prema pronalasku kodira prevashodno za protein sa GlcNAc-al,3- aktivitetom fukoziltransferaze nar-očito sa jezgrom al,3- fukoziltransferaze aktiviteta. Kako je već gore opisano jezgro al,3- fukoziltransferaze se nalazi u biljkama i insektima, ali ne i u ljudskom organizmu tako da su naročito pode-sne one DNK sekvence, koje se primenjuju u fukoziltransferazi specifičnim analizama i eksperimentima kao i proizvodnim postu-pcima. Pod jezgrom al,3- fukoziltransferaze se naročito podra-zumeva GDP-L-Fuk:Ans vezana GlcNAc-al,3- fukoziltransferaza.

U okviru predloženog pronalaska pod oznakom al,3- fukoziltransferaza po pravilu se naročito misli na jezgro al,3- fukozil-transferaze. Za gore opisana merenja aktiviteta, pri tome služe naročito akceptori sa neredukovanim GIcNAc- krajem. Takvi akceptori su npr. GlcNAcpi-2Manal-3(GlcNAcpl-2Manal-6) Manpi-4GlcNAcpi-4GlcNAcpl-Ans, GlcNAcpi-2Manal-3(GlcNAcpi-2Manal-6) Manpi-4GlcNAcpi-4(fukal-6GlcNAcpi-Ans i GIcNAcpi-2Manal-3[Manal-3(Manal-6) Manal-6] Manpi-4GlcNAcpi-4GlcNAcpl-Ans. Da li je fukoza vezana, može se utvrditi merenjem neosetljivosti prema N- glikozidazi F, što se utvrdjuje uz pomoć masene spektrometije.

DNK molekul prema pronalasku poseduje prvenstveno najmanje 70-80% naročito najmanje 95% homologije od sekvence prema SEQ ID No:l. Ova sekvenca kodira za jednu naročito aktivnu GIcNAc- od,3- fokuziltransferazu. Pošto DNK sekvenca, već prema biljci odnosno isektu može manje ili više da se menja, pokazuje sekvenca, koja npr. ispoljava 70% homologije sekvence prema SEQ ID No:l, takodje aktivitet fukoziltransferaze koja je dovoljna da se primeni za analize, eksperimente ili postupke proizvodnje kako je gore opisano.

Prema jednoj daljoj povoljnoj formi izvodjenja obuhvata DNK molekul 2150-2250, naročito 2198, baznih parova. Ovaj DNK molekul poseduje 100-300 prvenstveno 210 baznih parova uz pre startnog kodona kao i 350-440, naročito 458, baznih parova niz, posle stop kodona otvorenog čitačkog rama, pri čemu kraj DNK-molekula obuhvata prevashodno jedan 3'-poly(A)- rep. Na ovaj način je osigurana nepogrešiva regulacija na nivou translacije, te se tako stavlja na raspolaganje DNK molekul koji naročito eficijentno i bez problema kodira za aktivnu GlcNAc-al,3-fukoziltransferazu.

Predloženi pronalazak se odnosi dalje.na DNK molekul koji obuhvata sekvencu prema SEQ ID No:3 ili obuhvata sekvencu koja poseduje najmanje 85%, naročito povoljno najmanje 95%, naročito najmanje 99%, homologije prema gore navedenoj sekvenci ili pod stringentnim uslovima sa gore navedenom sekvencom hibridizuje ili zbog genetskog koda prema gore navedenoj DNK sekvenci je degenerisana. Homologija se odredjuje prevashodno jednim programom koji prepoznaje ubacivanje i brisanje i ove ne uzima u obzir kod obračuna homologije.

Ova nukleotidna sekvenca kodira za jedan konzervirani peptidni motiv, što znači da većina aktivnih i funkcionirajućih GIcNAc- al,3-fukoziltransferaza obuhvata tako kodirane aminokiselinske sekvence. Sekvenca pri tom može da poseduje, kako iste veličine kao sekvenca prema SEQ ID No:3, ili po sebi razumljivo takodje i veće. Ova sekvenca poseduje manju dužinu nego sekvenca koja kodira ukupni protein, i zbog toga je manje podložna za rekombinacije, brisanja ili druge mutacije. Na osnovu konzerviranog motiva i svog povećanog stabiliteta ova sekvenca je podesna za test prepoznavanja sekvenci.

SEQ ID No:3 poseduje sledeće sekvence:

S<s>- gaagccctgaagcactacaaatttagcttagcgtttgaaaattcgaatgaggaaga ttatgtaactgaaaaattcttccaatcccttgttgctggaactgtccct- 3'

Prema jednom drugom aspektu predloženi pronalazak se odnosi na DNK molekul koji obuhvata deo sekvence jednog gore navedenog DNK molekula i ima veličinu od 20-200, prvenstveno 30-50 baznih parova. DNK molekul može npr. da se upotrebi kao sonda za vezivanje na komplementarne sekvence od GIcNAc- od,3

- fukoziltransferaze, tako da se ova može izdvojiti iz probe. Na ovaj način mogu druge GIcNAc- al,3 - fukoziltransferaze iz raličitih

biljaka i insekata da budu selektovane, izolovane i karakterisane. Mogu biti primenjene bilo koja ili više različitih delimičnih sekvenci naročito deo već gore opisanih konzerviranih motiva. Pri tome je naročito povoljno, ako je jedan od gore navedenih DNK molekula kovalentno vezan sa supstancom za markiranje koja se može dokazati. Kao supstanca za markiranje u obzir dolazi svaki uobičajni marker, tako npr. fluoriscirajući, luminiscirajući, radioaktivni marker, neizotopna markiranja, kao biotin, itd.

Time se proizvode reagensi koji su korisni za selekciju i kvantifi kova nje odgovarajućih DNK molekula u čvrstim probama tkiva (npr. od biljaka) ali takodje i u tečnim probama kroz postupak hibridizacije.

Dalji aspekt pronalaska se odnosi na biološki funkcionalan vektor, koji obuhvata jedan od gore navedenih DNK molekula ili delove različitih dužina od toga, sa najmanje 20 baznih parova. Za transfekciju u ćeliji domaćina je potreban samostalan, za razmno-žavanje sposoban vektor pri čemu već prema ćeliji domaćina transfekcionom mehanizmu zadatku i veličini DNK molekula biva primenjen odgovarajući vektor. Pošto je poznat veći broj različitih vektora, nabrajanje bi razbilo okvir prijave, tako da se ovde odustalo od toga, naročito, pošto su vektori stručnjaku dobro poznati (što se tiče vektora, kao i svih u ovom spisu primenjenih tehnika i pojmova, koje su stručnjaku poznati, pogledati takodje Sambrook Maniatis). U idealnom slučaju vektor poseduje malu molekulsku masu i treba da ima za selekciju sposobne gene, da bi u ćeliji doveo do lako prepoznatljivog fenotipa, tako da je moguće jednostavna selekcija ćelija domaćina sa i bez vektora. Da bi se dobio visok prinos DNK i odgovarajućih genskih proizvoda, vektor treba da poseduje jak promotor, pojačivač, amplifikator signala gena i regulatorske sekvence. Za autonomnu replikaciju vektora je dalje važno replikantno poreklo. Mesta poliadeniliranja su odgovorna za korektno procesiranje mRNK i isprekidne signale prenosioca. Upotrebe li se fagen, virusi ili delova virusa kao vektori upravljaju signali omota, omot vektora DNK. Za prenos u biljkama su npr. podesni Ti - plazmidi, a za prenos u ćelijama insekata bakulo- virusi, odnosno u insektima transpozoni, kao P element.

Ako se gore opisani vektor prema pronalasku uvuče u biljku ili biljnu ćeliju, to se postiže posttranskripciono suzbijanje genske ekspresije endogenog gena al,3- fukoziltransferaze, transkripcijom jednog prema ovim homolozima transgena ili delova toga u Sense- orijentaciju. Za ovu Sense- tehniku se upućuje dalje na spise Baulcombe 1996, Plant. Mol. Biol.. 9:373-382 i Brigneti et al 1998, EMBO J. 17:6739-6746

Ova strategija "Gen- Silencing"-a predstavlja delotvornu mogućnost za suzbijanje ekspresija gena al,3- fukoziltransferaze vidi takodje VVaterhouse et al.1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:13959-13946

Dalje pronalazak se odnosi na biološki funkcionalni vektor, koji obuhvata DNK molekul prema jednoj gore navedenoj formi izvodjenja ili delove od toga različite dužine u inverznoj orijentaciji prema promotoru. Ako se ovaj vektor transfektira u ćeliju doma-ćina očita se jedna "antisense- mRNK" koja je komplementarna prema mRNK GlcNAc-al,3- fukoziltransferaze i ovu kompleksira. Ova veza ili sprečava korektno procesiranje, transport, stabilitet ili sprečavanjem pripajanja ribozoma, translaciju i time normalnu ekspresiju gena GlcNAc-al,3-fukoziltransferaze. Iako je ukupna sekvenca DNK molekula mogla da se ugradi u vektor, delovi sekvenci od toga mogu biti podesni za odrdjenu svrhu na osnovu manje veličine. Važno je npr. kod antisense- aspekta, da je DNK molekul dovoljno velik da bi stvorio dovoljno veliku antisense- mRNK, koja se vezuje na transferzau mRNK. Na prime obuhvata jedan podesni antisense- mRNK-molekul 50-200 nukleotida, jer mnogi od poznatih antisense- RNK molekula koji se nalaze u prirodi obuhvatajau oko 100 nukleotida.

Za jednu naročito efikasnu inhibiciju ekspresije aktivne al,3-fukoziltransferaze podesna je kombinacija sense tehnike i anti sense tehnike (VVaterhouse et al. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:13959-13964).

Brzo inhibirajući RNK- molekuli se prvenstveno upotreblja-vaju. Sposobnost anti sense- RNK- molekula koji imaju veličinu od preko 50 nukleotida zavisi od kinetike pripajanja in vitro. Tako pokazuju brzo pripajajući antisense RNK- molekuli jaču inhibiciju protein eksprimacije nego lagano hibridizujući RNK- molekuli (VVagner et al. 1994, Annu. Rev. Microbiol., 48:713-742; Rittner et al. 1993, Nucl. Acids Res, 21:1381-1387). Ovakvi brzo hibridizujući antisense- RNK- molekuli sadrže naročito veći broj eksternih baza (slobodni krajevi vezanih sekvenci) i veći broj strukturalnih subdomena (komponente), kao i mali stepen traka (Patzel et al. 1998; Natur Biotechnologv, 16:64-68). Hipotetične sekundarne strukture antisense- RNK- molekula mogu se istražiti uz pomoć kompjuterskog programa koji se odabere prema podesnoj antisense- RNK DNK- sekvenci.

U vektor mogu biti ugradjeni različiti regioni sekvenci DNK-molekula. Jedna se mogućnost sastoji u tome, da se u vektor ugradi samo de odgovoran za pripajanje ribozoma. Blokirane u toj oblasti mRNK je dovoljno da zaustavi ukupnu translaciju. Naročito visoka sposobnost antisense molekula pridaje se takodje 5'- i 3'-netransliranim regionima gena.

DNK- moleku prema pronalasku prvenstveno ima sekvencu koja obuhvata mutaciju brisanja, ubacivanja i/ili substitucionu mutaciju.

Broj mutiranih nukleotida je pri tom varijabilan i proteze se od jednog jedinog sve do više deletiranih, inseriranih, ili substituisanih nukleoproteida. Takodje je moguće da je čitački ram mutacijom pomeren. Važno kod "Knockout- gen"-a ovakve vrste je samo da je ekspresija GlcNAc-al,3- fukoziltransferaze ometena i da se sprečava stvaranje aktivnog, funkcionalnog enzima. Pri tome je mesto mutacije varijabilno dokle god je eksprimacija enzimski aktivnog proteina sprečena. Povoljna je mutacija u katalitičkom područiju enzima, koji se nalazi u C- terminalnom područiju. Postupci za uvodjenje mutacija u DNK- sekvence su stručnjaku dobro poznate, tako da će se ovde odustati od toga da se bliže objašnjavaju različite mogućnosti mutageneze. Ovde može doći do primene kako slučajne mutageneze, tako i naročito ciljno usmerene mutageneze, npr. site-directed-mutagenesis, oligonukleotidno usmerene mutageneze ili mutageneze uz pomoć restriktivnih enzima.

Pronalazak stavlja dalje na raspolaganje DNK- molekul koji kodira za ribozin, koji sadrži dva sekvenciona odsečka sa najmanje 10-15 baznih parova u svakom, sekvencijalne odsečke DNK-molekula prema pronalasku kao gore opisano komplementarni su, tako da ribozom kompleksira i seče mRNK koja od jednog prirodnog GlcNAc-al,3- fukoziltransferaze DNK- molekula biva transkribovana. Ribozim prepoznaje mRNK GlcNAc-al,3-fukoziltransferaze komplementarnim baznim parovanjem sa mRNK. Nakon toga ribozim seče i razara RNK na jedan, sekvenci specifičan način, pre nego što enzim bude translatiran. Posle diso-cijacije isečenog substrata, ribozim ponovo hibridizuje sa RNK-molekulima i deluje kao specifična endonukleaza. Generalno se mogu proizvesti ribozomi za specifično inaktiviranje odredjene RNK, čak i ako nije poznata ukupna DNK- sekvenca koja kodira za protein. Ribozimi su naročito onda delotvorni, kada ribozomi lagano klize duž mRNK. U tom slučaju je za ribozim lakše da pronadje jedno ribozom- slobodno mesto na mRNK. Iz toga razloga su spori ribozom- mutanti takodje podesni kao sistem za ribozome (J.Burke,1997, Nature Biotechnologv; 15, 414-415). Ovaj DNK- molekul naročito je prikladan za suzbijanje, odnosno prekidanje eksprimiranja biljne GlcNAc-al,3- fukoziltransferaze.

Jedna mogućnost se satoji i u tome da se upotrebi prome-njena forma ribozoma, naime minizim. Naročito za rezanje većih mRNK molekula minizini su delotvorni. Minizin je ribozin čekićaste glave koji na mesto Stem/Loop II, poseduje jedan kratki oligonu-kleotidni linker. Naročito delotvorni su Dimer- minizimi (Kuvvabara et al. 1998, Nature Biotechnologv, 16; 961-965). Prema ovome pronalazak se odnosi takodje na biološki funkcionalni vektor koji obuhvata jedan od dva prethodno navedena DNK- molekula (Mutations ili ribozim-DNK-molekul). Pri tome važi, što se tiče vektora, već gore opisano. Jedan takav vektor može npr. biti ubačen u mikroorganizam i primenjen za dobijanje visoke koncentracije gore opisanog DNK- molekula. Dalje, jedan ovakav vektor je naročito dobar za ubacivanje specifičnog DNK- molekula u biljni organizam ili organizam insekta, da bi ograničio produkciju GlcNAc-al,3- fukoziltransferaze u ovim organizmima ili je potpuno prekinuo. Prema pronalasku stavlja se na raspolaganje postupak za dobijanje cDNK obuhvaćenog DNK molekula prema pronalasku, pri čemu se RNK izoluje iz ćelija insekata odnosno biljnih ćelija naročito iz hipokotilnih ćelija sa kojima se po dodatku reversne transferaze i primera sprovodi reversna transskripcija. Pojedini koraci ovog postupka se izvode prema protokolu kako je po sebi poznato. Za reversnu transskripciju postoji sa jedne strane mogućnost, uz pomoć oligo (dT)- primera prizvesti cDNK ukupne mRNK pa tek potom sa izabranim primerima izvesti PCR, da bi se dobio gen GlcNAc-al,3- fukoziltransferaze okružen DNK molekulima. S druge strane mogu se izabrani primeri upotrebiti direktno za reversnu transskripciju, da bi se dobila jedna kraća, specifična cDNK. Podesni primeri se mogu npr. dobiti sintetički prema uzorku cDNK sekvenci transferaze. Uz pomoć ovo postupka mogu se brzo i jednostavno, malom kvotom greške proizvesti velike količine cDNK molekula prema pronalasku.

Pronalazak se odnosi dalje na postupak kloniranja GIcNAc-al,3- fukoziltransferaze naznačen time sto se DNK- molekul prema pronalasku klonira u vektor koji se potom transfektira u ćeliju domaćina, odnosno nekog domaćina, pri čemu se selekcijom i amplifikacijom dobijaju ćeliske linije od transfektiranih ćelija domaćina, koje eksprimiraju aktivnu GlcNAc-al,3- fukoziltransferazu. Molekul DNK se npr. uvodi u vektor uz pomoć restriktivnih endonukleaza. Za vektor opet važi već gore navedeno. Važno je kod ovog postupka da se izabere delotvorni sistem domaćin-vektor. Da bi se dobio aktivni enzim naročito su potrebne eukariotske ćelije domaćina. Jedna mogućnost se sastoji u tome da se vektor transfektira u ćeliju insekta. Pri tome bi trebalo naro-čito pomenuti viruse insekata, tako npr.baku/ o virus.

Samo se po sebi razume da ljudske, ili ćelije drugih kičmenjaka, mogu biti transfektirane pri čemu ove bivaju ekspri-mirane u strani enzim. Na raspolaganje se stavlja favorizovani postupak za proizvodnju rekombinantnih ćelija domaćina, naročito ćelija biljaka i ćelija insekata, odnosno biljke i insekti sa suzbijenom, odnosno potpuno prekinutom produkcijom GIcNAc-od,3- fukoziltransferaze, koji je naznačen time što najmanje jedan od vektora prema pronalasku, naime onaj koji obuhvata DNK molekul prema pronalasku, mutirani DNK molekul ili DNK molekul koji kodira za ribozom ili obuhvata DNK molekul u inverznoj orijentaciji prema promotoru, biva ubačen u ćeliju domaćina odnosno biljku ili insekt. Ovde takodje važi za transfekciju već gore opisano.

Kao ćelije domaćina mogu biti upotrebljene biljne ćelije, pri čemu npr. ovde dolaze u obzir Ti- plazmidi sa agrobakterijskim sistemom. Sa agrobakterijskim sistemom moguće je direktno transfektirati biljku: agrobakterije izazivaju kod biljke žuticu korenovog vrata. Kad agrobakterije inficiraju povredjenu biljku, sama bakterija ne dospeva u biljku, već ona ubacuje rekombinovani DNK- isečak, takozvani T-DNK iz prstenastog, ekstra-hromozomalnog, tumor-indukujućeg plazmida, u biljnu ćeliju. T-DNK a time i u njoj umetnuti DNK- molekul, ugradjuje se stabilno u hromozomalnu DNK ćeliju, tako da geni T-DNK bivaju eksprimovani u biljci.

Postoje brojni poznati, delotvorni mehanizmi transfekcije za različite sisteme domaćina. Neki primeri su elektroporacija, metoda kalcijumsulfata, mikroinjektiranje, metoda lipozoma.

Transfektirne ćelije se potom selektuju, npr. na osnovu

rezistencije prema antibioticima za koje vektor sadrži gene ili druge marker gene. Potom se trnsfektirana ćelijska linija amplifikuje ili u manjim količinama npr. u Petrijevim šoljama, ili u većim količinama kao u fermentorima. Biljke pokazuju dalje posebnu osobinu, one su naime u stanju da se iz (transfektirane) ćelije odnosno iz protoplasta razvijaju ponovo u potpunu biljku koja se može gajiti.

Već prema upotrebljenom vektoru u domaćinu, dolazi do procesa tako da ekspresija enzima može biti potisnuta ili potpuno prekinuta:

Ako vektor koji obuhvata DNK molekul bude transfektiran

sa mutacijom ubacivanja ili mutacijom brisanja ili supstitucionom mutacijom to dolazi do homologe rekombinacije: mutirani DNK-molekul prepoznaje uprkos mutacije identičnu sekvencu u genomu ćelije domaćina i biva ugradjen tačno na to.mesto tako da nastaje "Knockout gen".

Na ovaj način se unosi mutacija za GlcNAc-al,3- fukoziltransferazu u gen, koja inhibira nepogrešivu ekspresiju GlcNAc-al,3-fukoziltransferaze. Kao što je gore već izloženo kod ove tehnike je važno da mutacija bude dovoljna da prekine ekspresiju aktivnog proteina. Posle selekcije i amplifikacije gen se može sekvencionisati, kao dodatno preispitivanje da bi se utvrdio uspeh homologe rekombinacije odnosno stepen mutacije.

Ako se vektor koji obuhvata DNK- molekul, a kodira za ribozim, transfektira to se u ćeliji domaćina eksprimira aktivni ribozim. Ribozim kompleksira komplementarnu mRNK sekvencu GlcNAc-al,3- fukoziltransferaze, najmanje na jednom odredjenom mestu, seče ovo mesto i na taj način može da inhibira translaciju enzima. U ovoj ćeliji domaćina kao i u od nje nastale linije ćelija odnosno u datom slučaju biljke, ne eksprimuje se GlcNAc-al,3-fokuziltransferaza. U slučaju vektora koji obuhvata DNK molekul prema pronalasku u sense- ili inverznom pravcu prema promotoru, u transfektiranoj ćeliji (odnosno biljci) se eksprimuje sense- ili antisense- mRNK. Antisense- mRNK je komplementarna najmanje sa jednim delom mRNK- sekvence GlcNAc-al,3- fokuziltransferaze i može takodje da inhibira translaciju enzima. Kao primer postupka za suzbijanje ekspresije gena antisense- tehnikom upućuje se na spis Smith et al. 1990, Mol. Gen. Genet. 224: 477-481 pri čemu se u ovom spisu inhibira ekspresija gena involviranog u toku procesa sazrevanja paradajza.

U svim sistemima se ekspresija GlcNAc-al,3- fukoziltransferaze najmanje suzbija, čak prvenstveno potpuno prekida. Stepen smetnje ekspresije gena zavisi od stepena kompleksiranja, homologe rekombinacije od eventualne potonje slučajne mutacije i ostalih procesa u oblasti genoma. Transfektira ne ćelije se preispi-tuju na aktivitet <3lcNAc-al,3- fukoziltransferaze i selektuju.

Dalje postoji mogućnost da se gore opisano suzbijanje i ekspresija al,3- fukoziltransferaze još više pojača tako da se dodatno ubacivanju jednog od gore opisanih vektora, ubaci u domaćina vektor koji obuhvata gen koji kodira za protein sisara npr. [31,4-galaktoziltransferaza. Fukozilovanje se može smanjiti deistvom drugih enzima sisara pri čemu je kombinacija inhibicije eksprimiranja aktivne al,3- fukoziltransferaze uz pomoć vektora prema pronalasku i uz pomoć vektora enzima sisara naročito efika-sno.

Za transfekciju se mogu upotrebiti svakojake biljne vrste npr. mango- mahune, biljke duvana, paradajz i/ili biljka krompira.

Jedan drugi, povoljni postupak za dobijanje rekombinantnih ćelija domaćina, naročito biljnih ćelija i ćelija insekata odnosno biljaka i insekata se sastoji u tome da se DNK- molekul koji obuhvata mutaciju ubaci u genom ćelije domaćina odnosno biljke ili insektana mesto ne mutirane homologe sekvence (Schaefer et al. 1997, Plant J.; 11 (6): 1195-1206). Ovaj postupak ne funkci-oniše prema tome sa vektorom, već sa čistim DNK- molekulom. DNK- molekul se ubacuje u domaćina npr. bombardovanjem gena, mikroinjektiranjem ili elektroporacijom, neka budu navedena samo tri primera. Kako je gore već izloženo, pripaja se DNK- molekul na homologu sekvencu u genomu domaćina tako da dolazi do homologe rekombinacije i time do preuzimanja mutacije brisanja, mutacije ubacivanja, odnosno substitucione mutacije u genomu: eksprimacija GlcNAc-al,3-fukoziltransferaze se suzbija odnosno potpuno prekida.

Dalji aspekt pronalaska se odnosi na biljke odnosno biljne ćelije kao i insekte odnosno ćelije insekata kod kojih njihov aktivitet GlcNAc-cđ,3- fukoziltransferaze iznosi ispod 50%, naročito ispod 20%, naročito povoljno 0%, od aktiviteta GlcNAc-ocl,3-fukoziltransferaze koja se nalazi u prirodnim biljkama odnosno biljnim ćelijama i insektima i ćelijama isekata. Prednost ovih biljaka odnosno biljnih ćelija leži u tome da glikoproteini koje one proizvode nemaju odnosno imaju veoma malo al,3- vezanu fukozu. Kada se sada produkti ovih biljaka odnosno insekata preuzmu od ljudi odnosno kičmenjaka ne dolazi do reakcije prema epitopu al,3- fukoze. Prvenstveno se na raspolaganje stavljaju rekombinantne biljke odnosno biljne ćelije, koje su proizvedene prema jednom od gore navedenih načina i u kojima je produkcija GlcNAc-al,3- fukoziltransferaze suzbijena odnosno potpuno prekinuta.

Pronalazak se odnosi takodje na rekombinantne insekte odnosno ćelije insekata, koje su proizvedene prema jednom od gore navedenih načina i u kojima je produkcija al,3-fukoziltransferaze suzbijena ili potpuno prekinuta tako da takodje ne dolazi do imune reakcije prema epitopu al,3- fukoze.

Pronalazak se odnosi takodje na PNK-. molekul koji obuhvata baznu sekvencu, koja je komplementarna sekvenci DNK- molekula prema pronalasku kao i delovima sekvenci od toga. PNK (peptid-nukleinska kiselina) je sekvenca slična DNK, kod koje su nukleobaze vezane za jedan pseudo kičmeni stub. PNK hibridizuje u opšte sa komplementarnim DNK-, RNK-, ili PNK- oligomerima VVatson-Crick baznim parovanjem i heliksnom formacijom. Peptidna kičma osigurava veliku otpornost prema enzimatskoj degeneraciji. PNK- molekul predstavlja tako poboljšani antisense-agens. Ni protoaze ni nukleaze nisu u stanju da napadnu PNK-moleku. Stabilnost PNK- molekula kada je vezan za komplementarnu sekvencu pokazuje dovoljno sterno blokiranje DNK i RNK polimeraza reversne transkriptaze, telomeraze i ribozoma.

Ako PNK- molekul sadrži gore navedenu sekvencu onda se vezuje na DNK, odnosno na mesto na DNK koje kodira za GIcNAc-al,3- fukoziltransferazu, i na taj način može da inhibira transkripciju ovih enzima. Pošto se PNK molekul niti transkribuje niti translira, proizvodi se sintetički, npr. uz pomoć t-Boc-tehnike.

Prvenstveno se stavlja na raspolaganje PNK- molekul, koji obuhvata baznu sekvencu, koja odgovara sekvenci DNK molekula prema pronalasku kao i delovi sekvenci od toga. Ovaj PNK-molekul kompleksira mRNK odnosno mesto GlcNAc-al,3-fukoziltransferze mRNK tako da je translacija enzima inhibrana. Ovde važi slično kao i za RNK. Tako je npr. naročito delotvorno područije kompleksiranja region starta translacije ili takodje 5" netranslirani region mRNK.

Dalji aspekt predloženog pronalaska se odnosi na postupak za dobijanje biljaka ili insekata odnosno ćelija, naročito ćelija insekata i ćelija biljaka koje pokazuju blokiranu ekspresiju GIcNAc-al,3- fokuziltransferaze na nivou transkripcije odnosno translacije, stoje naznačeno time, da PNK- molekul odnosno PNK- molekuli prema pronalasku ubacuju u ćelije. Da bi se PNK molekul, odnosno PNK- molekuli ubacili u ćelije primenjuju se opet uobičajne metode kao npr. elektroporacija ili mikroinjektiranje. Naročito delotvorno je ubacivanje kada su PNK- oligomeri vezani na ćelije penetracionih peptida na transportan ili pAntp, (Pooga et al. 1998, Nature Biotechnologv, 16; 857-861).

Pronalazak stavlja na raspolaganje postupak za dobijanje rekombinantnih glikoproteina, koji je naznačen time da prema pronalasku rekombinantne viljke odnosno biljne ćelije kao i insekti odnosno ćelije insekata, čija je produkcija GlcNAc-al,3-fukoziltransferaze suzbijena ili potpuno obustavljena, ili biljaka ili insekata odnosno ćelija u koje su prema postupku prema pronalasku ubačeni PNK molekuli sa genomom koji kodira za glikoprotein, transfektirani tako da rekombinantni glikoproteini bivaju eksprimirani. Pri tome se kao već gore opisani vektori koji okružuju gene za željenje proteine transfektiraju u domaćinu odnosno u ćelijama domaćina takodje kako je gore već opisano. Transfektira ne biljne ćelije odnosno ćelije insekata eksprimiraju željene proteine pri čemu ne sadrže ili sadrže veoma malo cd,3-vezanu fukozu. Time ne pokreću gore već spomenute imune reakcije u ljudskom organizmu i telima kičmenjaka. U tim sistemima mogu biti proizvedeni svakakvi proteini.

Prvenstveno se stavlja na raspolaganje postupak za proizvodnju rekombinantnih humanih glikoproteina koji je naznačen time da prema pronalasku rekombinantne biljke odnosno biljne ćelije kao i rekombinantni insekti odnosno ćelije insekata čija je produkcija GlcNAc-al,3- transferaze suzbijena odnosno potpuno prekinuta, ili biljaka ili insekata odnosno ćelija u koje je postupkom prema pronalasku ubačen PNK- molekul sa genom koji kodira za glikoprotein su transfektirani tako da rekombinantni glikoproteini bivaju eksprimirani. Ovim postupkom postaje moguće proizvoditi ljudski protein u buljkama (ćelijama) koje, kad budu preuzete u ljudsko telo, ne izazivaju imune reakcije usmerene prema cd,3-vezane fukoze. Pri tome postoji mogućnost upotrebe biljnih vrsta za proizvodnju rekombinantnih glikoproteina koje služe u ishrani npr. banane, krompir i/ili paradajz. Tkiva ovih biljaka obuhvataju rekombinantni glikoprotein tako da se npr. ekstrakcijom rekombi-nantnog glikoproteina iz tkiva i potonjeg davanja, odnosno dire-ktnim trošenjem biljnog tkiva rekombinovani glikoprotein preuzima od ljudskog tela.

Pri tom se predpostavlja postupak za proizvodnju rekombi-nantnog humanog glikoproteina za medicinske svrhe tako da su prema pronalasku, rekombinantne biljke odnosno biljne ćelije, kao i rekombinantni insekti odnosno ćelije insekata, čija je produkcija GlcNAc-al,3- fukoziltransferaze suzbijena odnosno upotpunosti prekinuta, u koje postupkom prema pronalasku ubačeni PNK- molekuli sa genom, koji kodira za glikoprotein, transfektirani, tako da rekombinantni glikoproteini bivaju eksprimirani. Pri tome u obzir dolazi svi protein koji su medicinski interesantni.

Pronalazak se odnosi dalje na rekombinantne glikoproteine, pri čemu su oni proizvedeni u prema gore opisanom postupku, i čija peptidna sekvenca sadrži najmanje do 50%, posebno manje od 20%, a posebno je povoljno 0%, al,3- vezanih fukoznih ostataka koji se nalaze u proteinima eksprimovanim u nefukoziltransferazom redukovanim biljnim sistemima i sistemima insekata. Količina al,3- vezane fukoze je zavisna od stepena gore opisanog suzbijanja GIcNAc- al,3- fukoziltransferaze.

Pronalazak obuhvata prvenstveno rekombinantne humane glikoproteine koji su prema jednom od gore opisanih postupaka proizvedeni u biljnim sistemima ili sistemima insekata i koji u svojoj peptidnoj sekvenci sadrže najmanje ispod 50%, posebno manje od 20%, naročito povoljno 0% al,3- vezanih ostataka, koji se nalaze u proteinima eksprimovanim u nefukoziltransferazom redukovanim biljnim sistemima i sistemima insekata.

Gliko proteini prema pronalasku mogu da sadrže druge vezane oligosaharidne- jedinive koje su specifične za biljke odnosno insekte, čome se oni- u slučaju humanih glikoproteina razlikuju od ovih prirodnih glikoproteina. Baš uprkos tome glikoproteini pokreću veoma malu, odnosno nikakvu imunu reakciju u čovečijem telu, pošto su, kao što je već u opisnom uvodu izloženo, al,3- vezani fukozni ostaci glavni izvor imunih reakcija, odnosno unakrsnih imunih reakcija prema biljnim glikoproteinima i glikoproteinima insekata.

Jedan drugi aspekt obuhvata farmaceutski sastav koji obuhvata glikoproteine prema pronalasku. Glikoproteinima prema pronalasku farmaceutski sastav obuhvata, druge za ovakve sas-tave uobičajne dodatke. To su npr. podesna sredstva za razb-laživanje različitog sadržaja pufera (npr. Tris-HCI, acetat, fosfat), pH i jonske snage, aditive kao što su tenzidi, omogućivači rastvaranja (npr. tvin 80, polisorbat 80) sredstva za konzerviranje (npr. trimerosal, benzil-alkohol), adjuvanti, anti-oksidaciona sredstva (npr. askorbinsak kiselina, natrijummetabisulfit), emulgatori, punioce, (npr. laktoza, manitol), kovalentne veze polimera, kao što je polietilenglikol na protein, ugradnja materijala u pripremama u obliku delića polimernih jedinjenja kao što je poli-mlečna kiselina, poli-glikolna kiselina itd... ili lipozoma pomoćnim materijalima i/ili nosive materije koje su kod dotičnog tretiranja korisne. Ovi sastavi utiču na fizičko stanje, stabilnost, brzinu in vivo oslobadjanja i brzinu in-vivo izlučivanja glikoproteina prema pronalasku.

Pronalazak stavlja na raspolaganje postupak za selekciju glikoprteina DNK- molekula koji kodiraju za GIcNAc- al,3-fukoziltransferazu u probi u koju se dodaju markirani DNK-molekuli prema pronalasku koji se vezuju na DNK- molekule koji kodiraju GIcNAc- al,3- fukoziltransferazu. Hibridizovani DNK-molekuli mogu se detektovati, kvantif i kovati i selektirati. Da bi proba imala jediničnu DNK nit sa kojom markirani DNK- molekuli mogu da hibridizuju, proba se denaturiše, npr. zagrevanjem.

Druga mogućnost se sastoji u tome da se ispitivana DNK eventualno po dodatku endonukleaza, razdvoji na agaroza-gelu, gel-elektroforezom. Posle prevodjenja na membranu od nitro-celuloze, dodaju se markirani DNK- molekuli prema pronalasku, koji hibridizuju na odgovarajući DNK- molekul("Southern Blotting").

Jedna druga mogućnost se sastoji u tome da se homologi geni pronadju u rugim posebnim vrstama uz pomoć PCR- zavisnog postupka uz primenu specifičnih i/ili degenerativnih primera izvedenih iz DNK- molekula prema pronalasku.

Proba obuhvata prvenstveno za gore navedeni pronalački postupak genomske DNK- biljnog organizma odnosno organizma insekata. Ovim postupkom se na veoma brz i efikasan način ispituje veliki broj biljaka i insekata na prisustvo gena GIcNAc-al,3- fukoziltransferaze. Na ovaj način mogu da se izaberu takve biljke i takvi insekti koji ne sadrže ovaj gen, odnosno, može se u ovakve biljke i insekte, koji sadrže ovaj gen, jednim gore nave-denim postupkom prema pronalasku, suzbiti eksprimovanje GIcNAc- al,3- fukoziltransferaze odnosno potpuno prekinuti, tako da se potom one mogu upotrebiti za proizvodnju i transfekciju (humanih) glikoproteina.

Pronalazak se odnosi takodje na DNK- molekule koji kodiraju za GIcNAc- cd,3- fukoziltransferazu, koji su prema dva poslednje navedena postupka izabrani i potom izdvojeni iz probe. Ovi molekuli se mogu upotrebiti za dalja ispitivanja. Oni mogu biti sekvencionisani i sa svoje strane upotrebljeni kao sonde za pronalaženje GlcNAc-cd,3- fukoziltransferaze. Ovi markirani DNK-molekuli mogu da fungiraju za organizme, koji su organizmima iz kojih su izolovani funkcionalniji kao sonde nego DNK- molekuli prema pronalasku.

Dalji aspekt pronalaska se odnosi na preparaciju, prema pronalasku klonirane GlcNAc-cd,3- fukoziltransferaze koja poseduje izoforme sa pl vrednostima izmedju 6,0 i 9,0 naročito izmedju 6,8 i 8,2. Vrednost pl proteina je ona pH vrednost pri kojoj njegov neto naboj iznosi nula, i zavisan je od sekvence aminokiseline, šeme glikoziliranja kao i od prostorne strukture proteina. GIcNAc- cd,3- fukoziltransferaza obuhvata najmanje sedam izoformi koje pokazuju pl vrednost u ovoj obalsti. Razlog za različite izoforme transferaze je npr. različito glikozi lova nje kao i limitirana protoliza. Probe su pokazale, da semenke mango mahuna različitih biljaka, imaju različite odnose izozima. Vrednost pl proteina može se utvrditi izoelektričnim fokusiranjem koje je stručnjaku poznato.

Glavna izoforma enzima ima aparentnu molekulsku težinu od 54kDa.

Preparacija prema pronalasku naročito sadrži izoforme sa vrednostima pl od 6.8, 7.1, i 7.6 .

Pronalazak se takodje odnosi i na postupak za proizvodnju "presadljivih" jedinica ugljenih hidrata glikoproteina ljudi i drugih kičmenjaka, pri čemu se probi koja obuhvata jednu jedinicu ugljenog hidrata odnosno glikoproteina, dodaje fukozna jedinica kao i jedna GIcNAc- cd,3- fukoziltransferaza koja kodira jedan DNK-molekul, tako da se fukoza vezuje u cd,3 položaju na jedinicu ugljenog hidrata odnosno glikoproteina kroz GIcNAc- od,3- fukozil transferazu.

Postupakom prema pronalasku moguće je proizvesti velike količine prečišćenog enzima kloniranjem GIcNAc- cd,3- fukozil-transferaze. Da bi se dobila potpuno aktivna fukoziltransferaza uspostavljaju se podesni reakcioni uslovi. Pokazalo se da transferaza ima naročito visok aktivitet kod pH- vrednosti od oko 7 ako se kao pufer primeni 2-(N-morfolino) etansulfonska kiselina- HCI. U prisustvu bivalntnih katjona naročito Mn<2+>pjačava se aktivitet rekombinantne transferaze. Ugljenohidratna jedinica se dodaje probi ili u nevezanoj formi ili

u formi kada je vezana za protein. Rekombinantna transferaza je aktivna za obe forme.

Pronalazak će biti objašnjen na osnovu primera koji slede i dijagrama, na koje se samo po sebi razumljivo, ne ograničava. Pojedinčno pokazuju na crtežu dijagrami la i lb izmerene količine proteina i aktivitet enzima u pojedinačnim frakcijama kao krive; dijagram 2 sliku gela elektroforeze GIcNAc- al,3- fokuziltransferaze; dijagram 3 rezultat izoelektričnog fokusiranja i izmereni aktivitet transferaze pojedinih izoformi; dijagram 4 N-terminalne sekvence 4triptičnih peptida 1-4 kao i DNK sekvencu tri primera SI, A2, i A3; dijagrami 5a i 5b su cDNK- sekvence cd,3-fukoziltransferaze; dijagrami 6a i 6b iz toga proizvedena amino-kiselinsak sekvenca cd,3- fukoziltransferaze; dijagram 7 shemazski predstavlja od,3- fukoziltransferazu kao i hidrofobnost amino-kiselinskih ostataka; dijagram 8 poredjenje konzerviranih motiva različitih fukoziltransferaza; dijagram 9 poredjenja aktiviteta fukoziltransferaze ćelija insekata transfektiranih od,3- fukoziltransferazom sa negativnom kontrolom; dijagrami 10a i 10b strukture različitih akceptora cd,3- fukoziltransferaze; dijagrami 11 i 12 masene spektre i dijagram 13 različite HPLC.

Primer 1:

Izolovanje jezgra al, 3- fukoziltransferaze

Svi koraci se izvode na 4°C. Seme mango- mahuna se homogenizuje u mikseru, pri čemu je primenjeno 0,75 volumena pufera za ekstrakciju po kilogramu mahuna. Homogenizat je potom filtrovan kroz dva sloja pamučne tkanine, a fitrat centrifu-giran 40 min. pri 30000 xg. Tečnost je odbačena a ostatak uz sta-lno mešanje ekstrahovan preko noći puferskim rastvaračem.

Tritonski ekstrakt je prečišćavan kako sledi:

Korak 1: Tritonski ekstrakt je nanesen na mikrogranulisani dietilaminoetil- celulozni anjoski izmenjivač DE52 celuloznu kolonu (5x28 cm Fa. VVhatman) koja je prethodno kalibrisana puferom A. Nevezana frakcija je dalje tretirana u koraku 2.

Korak 2: Proba je nanesena na kolonu Affi-Gel-Blue(2,5x32) kalibrisanu puferom A. Posle ispiranja kolone puferom, adsorbovani proizvod obuhvaćen puferom A eluiran je 0,5M NaCI.

Korak 3: Posle dijalize eloata iz koraka 2 prema puferu B, ovaj se nanosi na kolonu S-sefaroze tretirane istim puferom. Vezani protein se eluira linearnim gradijentom od 0 do 0,5M HCI u puferu B. Frakcije sa GIcNAc- al,3- fukoziltransferazom se izvlače i dijalizuju prema puferu C.

Korak 4: Dijalizovana proba se nanosi na kolonu GnGn-sefaroze kalibrisanu puferom C. Vezani protein se eluira sa puferom C koji obuhvata IM NaCI namesto MnCI2.

Korak 5: Enzim se nakon toga dijalizuje prema puferu B

i nanosi na kolonu GDP- heksanolamin-sefaroze. Posle ispiranja kolone puferom D eluira se transferaza, zamenom MnCI2i NaCI, sa 0,5mM GDP. Aktivne frakcije se izvuku dijalizuju prema 20mM tris-HCI puferu pH 7,3 i liofilizuju.

Enzimska ektivnost GIcNAc- al,3- fukoziltransferaze se odredjuje uz primenu GnGn-peptida i GDP-L-[IT<14>C] fukoze pri koncentraciji substrata od 0,5 i 0,25 u prisustvu 2-(N-morfolin)-etanolsulfonska kiselina- HCI pufera, tritona X-100, MnCI2, GIcNAc i AMP (prema Staudacher et al. 1998 Glvcoconjugate J. 15, 355-360; Staudacher et al. 1991 Eur. J. Biochem. 199, 745-751).

Koncentracija proteina odredjena je uz pomoć metode bihinhoninske kiseline (Pierce) ili, kod poslednjih koraka prečišćavanja enzima uz pomoć analize aminokiselina (Altmann 1992 Anal. Biochem. 204, 215-219).

Na dijagramu la i lb su kao krive predstavljene izmerene količine proteina i izmereni aktivitet enzima u poslednjim frakcijama eluata. Diajgram la pokazuje gore opisano razdvajanje na koloni S- sefaroze, dijagram lb razdvajanje na koloni GnGn-sefaroze, pri čemu krug predstavlja protein, crni puni krug GIcNAc-<xl,3- fokuziltransferazu, a četvorougao N-acetil-p-glukoza-minidazu. U je definisano kao ona količina enzima koja prenosi lfimol fukoze u minuti na akceptor. Tabela 1 pokazuje pojedinačne korake prečišćavanja transferaze.

Ekstakcioni pufer:

0,5mM ditiotreit lmM EDTA

0,5% Polivinilpolipirolidon 0,25M saharoza 50mM tris-HCI pufer, pH 7,3

Rastvarački pufer:

0,5mM ditiotreit 1 mM EDTA

1,5% triton X-100

50mM tris-HCI pufer, pH 7,3

Pufer A:

25mM tris-HCI pufer, pH 7,3 sa: 0,1% triton X-100 i 0,02% NaN3

Pufer B:

25mM Na- citrat pufer, pH 5,3 sa: 0,1% triton X-100 i 0,02% NaN3

Pufer C:

25mM tris-HCI pufer, pH 7,3 sa:

5mM MnCI2i

0,02% NaN3

Pufer D:

25mM tris-HCI pufer, pH 7,3 sa:

lOmM MgCI2

0,1M NaCI i

0,02 NaN3

Primer 2:

SDS- strana i izoelektrično fokusiranie

SDS- strana se izvodi u biorad-mini-proteinskoj ćeliji sa 12,5%

akrilamida i 1% bisakrilamida. Gelovi se boje ili Coomassie Briliant Balu R-250 ili srebrom. Izoelektično fokusiranje fokuziltransferaze izvedeno je na prethodno pripremljenim gelovima sa pl opsegom izmedju 6-9 (Servalvt precotes 6-9, Serva). Gelovi se prema protokolu proizvidjača boje srebrom. Za dvodimenzionalnu elektroforezu iseku se trake iz gela za fokusiranje, tretiraju sa S-alkilujućim reagensima i SDS-om i podvrgnu SDS- strani kako je gore opisano.

Diajagram predstavlja sliku jednog gela za elektroforezu GIcNAc- al,3- fokuziltransferaze gde su levo predstavljene dve dvodimezionalne elektroforeze, a desno jednodimenzionalna SDS-strana. Pri tome je sa A obeležena traka standard, sa B obeležena traka GIcNAc- cd,3- fukoziltransferaza sa GnGn-sefarozne kolone, i sa C obeležena traka "prečišćena" GlcNAc-cd,3- fukoziltransferaze, što znači frakcija kolone GDP- heksanolaminsefaroze. Dve trake na 54 i 56kDa predstavljaju izoforme transferaze.

Dijagram 3 pokazuje rezultat izoelektričnog fokusiranja. Traka A je obojena srebrom, na traci B testiran je aktivitet izoformi transferaze. Aktivitet je naveden kao % fukoze na substrat transferisane GDP- fukoze.

Primer 3:

Sekvenciranie peptida

Za sekvenciranje proteina iseku se trake iz sa Coomassie obojenog SDS-poliakrilamidnog gela karboksimetilovane i razdvojene triptozom prema Gorg et al. 1988, Electrophoresis, 9, 681-692. Triptični peptidi se razdvajaju sa reversnom fazom HPLC na jednoj l,0x250mm Vydac C18 pri 40°C sa protokm od 0,05ml/min pri čemu je primenjen HP 1100 (Hevvlett-Packard). Izolovani peptidi su sekvencionisani sa Hevvlett-Packard G 1105a protein-sekvencionim sistemom prema protokolu proizvodjača. Dalje je peptidna smeša analizirana na Ingel-Verdau i sa MALDI-TOF MS. -( vidi dole )-

Dijagram 4 pokazuje n-terminalne sekvence od 4 triptična peptida 1-4 ( SEQ ID No: 5-8). Polazeći od prva tri peptida proizvedeni su primeri SI, A2, i A3 (identifikacioni brojevi sekvenci od 9 do 11)

Primer 4:

RT- PCR i cDNK kloniranje

Ukupna RNK izolovana je iz tri dana starog hipokotila mango-mahune, pri čemu je primenjen SVTotal RNK sistem za izolovanje od Promega. Za dobijanje prve niti cDNK, inkubirana je celokupna RNK jedan čas na 48°C sa AMV reversnom transkriptazom i oligo-(dT) primerom, pri čemu je primenjen Reverse Transkription Svstem od Promega.

cDNK prvog konca podvrgnuta je PCR pri čemu je primenjena kombinacija sense- i antisense- primera: U IO41I reversne Transkription Reaktion dodato je sledeće: 5O41I sa 0,ljuM od svakog primera, 0,lmM dNTPs, 2mM MgCI2, lOmM tris- HCI pufera pH 9.0, 50mM KCI, i 0,1% triton X-100.

Posle prvog denaturacionog koraka na 95°C za 2 minuta, protekla su 40 ciklusa od 1 min. na 95°C, jedan min na 49°C i dva min na 72°C. Poslednji ekstenzioni korak sproveden je na 72°C 8 min. PCR produkti su subklonirani u pCR 2.1 vektor pri čemu je primenjen TA Cloning Kit od Invitrogen-a i sekvencionirani. Proizvod ovog PCR-a su bila dva DNK- fragmenta od 744 bp i 780 bp pri čemu oba DNK- fragmenta sadrže iste 5'- krajeve (vidi takodje dijagram 7).

Polazeći od ova dva DNK- fragmenta nedostajući 5^3" regioni dobijaju se 5<v>i 3' rapidnom amplifikacijom cDNK- krajeva (RACE), pri čemu se upotrebljava RACE Kit od Gibco-BRLV. Kao antisense- primer primenjen je univerzalni antisense- primer kita, kao sense primer ili 5<X->CTGGAACTGTCCCTGTGGTT - 3<V>(SEQ ID No: 12) ili 5" - AGTGCACTAGAGGGCAAGAA - 3' (SEQ ID No: 13). Kao sense primer su primereni skraćeni kotva- primeri kita, a kao antisense primeri 5' - TTCGAGCACCACAATTGGAAAT - 3'(SEQ ID No: 14) ili 5<V->GAATGCAAAGACGGCACGATGAAT - 3^(SEQ ID No: 15).

PCR se izvodi sa Annealing temperaturom od 55°C i pod gore opisanim uslovima. 5<v>i 3" proizvodi se subkloniraju u pCR 2.1 vektor i sekvenciraju: sekvence subkloniranih fragmenata se uz pomoć didezoksinukleotidne metode sekvencionišu (ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready reaktion Kit i ABI PRISM 310 Genetic Analyser(Perkin Elmer)). T7 i M13 napred- primeri primenjuju se za sekvenciranje produkata kloniranih u PCR 2.1 vektor. Oba konca kod regije kodiranja sekvencionisana su od Vienna VBC Genomics- Sequencing Service pri čemu su primenjeni infracrveno markirani primer (IRD 700 i IRD 800) i LI-COR Long Read IR 4200 Sequencierer(Lincoln NE).

Dijagrami 5a i 5b pokazuju ukupnu cDNK koja ima veličinu od 2198 bp i otvoreni čitački okvir od 1530 bp (SEQ ID No: 1). Otvoreni čitački ram (startni kodon kod baznih parova 211-213, stop kodon kod baznog para 1740-1743) kodiran za protein od 510 amino kiselina sa molekulskom težinom 56,8kDA i teoretskom pl- vrednošću od 7,51.

Dijagrami 6a i 6b pokazuju sekencu aminokiseline dobijenu od cDNK GlcNAc-al,3- fukoziltransferaze (SEQ ID No: 2). Mesta za glikozilovanje vezano za asparagin su kod Asn 346 i Asn 429.

U dijagramu 7 je shematski predstavljena GIcNAc- al,3-fukoziltransferaza cDNK (gore) i izvedeni indeks hidrofobnosti ko-diranog proteina (dole) pri čemu pozitivan indeks hidrofobnosti znači povećanu hidrofobnost. Iznedju toga su prikazane veličine oba gore navedena PCR- proizvoda u relaciji prema kompletnoj cDNK. Oblast kodiranja je predstavljena gredom, pri čemu, "C" kodira za postuliranu citoplazmatičnu oblast, te za postuliranu transmembransku oblast i G za postuliranu Golgi-Lumen katalitičku oblast. Analiza DNK sekvenci "TMpred" (od EMBnet, Svveiz) dala je verovatni transmembranski region izmedju Asn 36 i Gly 54. C terminalna oblast enzima obuhvata verovatno katalitički region i treba sledstveno tome da upućuje u Lumen-Golgi aparat. Prema tome izgleda da je ova transferaza transmembranski protein tipa II kao sve do sada analizirane glikoziltransferaze koje igraju ulogu u biosintezi glikoproteina (Jociasse, 1992 Glycobiology 2, 271-277). Sive oblasti predstavljaju četiri triptična peptida, šetouglovi potencijalna mesta N- glikozilovanja. Jedno, preko NCBI pristupačno BU\STP pretraživanje svi banaka podataka pokazuje sličnost izmedju GIcNAc- al,3- fukoziltransferaze i drugih al,3/4-fukoziltransferaza npr. humane fukoziltransferaze 4. Sa 18-21%

(ispitano od SIM-LALNVIEVV, Expase, Svveitz) ukupna sličnost je bila sa one strane svakog značaja. I pored toga sekvencioni opseg

od 35 aminokiselina(SEQ ID No: 4) ima upadljivu visoku homologiju prema drugim 0*1,3/4 - fukoziltransferazama (dijagram 8). Ovo sekvenciono područije nalazi se izmedju Glu 267 i Pro 301 SEQ ID No: 2.

Primer 5:

Ekspresija rekombinantne GlcNAc- al, 3- fukoziltransferaze u

ćelijama insekata

Kodirajući region verovatne GlcNAC-al,3-fukoziltransferaze zajedno sa citoplazmatičnim i transmembranskim regionom amplifikovan je sa napred- primerom 5'- CGGCGGATCCGCAA-TTGAATGATG^ (SEQ ID No: 16) i nazad primer 5^- CCGGCT-GCAGTACCATTTAGCGCAT-3<*>(SEQ ID No: 17) sa Expand High Fidelity PCR Svstem od Boehringer Mannheim. PCR- proizvod je sa Pstl i BamHI dvostruko liziran i subkloniran u transfer-vektor Bakulo virusa pVL 1393 tretiranog alkalnom fosfatazom koji je prethodno bio liziran sa Pstl i BamHI. Da bi se osigurala homologa rekombinacija, kotransfektirana je sa transfer-vektorom, Bakulo Gold viralna DNK (PharMingen, San Diego CA.) u Sf 9 ćelije insekata u IPL-41 medijumu sa lipofektinom. Posle inkubacije od 5 dana na 27°C, upotrebljene su različite zapremine tečnosti iznad sa rekombinantnim virusom za infekciju Sf 21 ćelija insekata. Posle inkubacije od 4 dana na 27°C u IPL-40 medijumu sa 5%-FCS-om obrane su Sf 1 ćelije i dva puta isprane soni.m ratvorom puferova-nim fosfatom. Ćelije su resuspendovane u 20mM tris-HCI pufera pH 7,4 sa 2% triton X-100 i sonifikacijom razbijene na ledu.

Primer 6:

Assav za aktivitet GlcNAc- cd, 3- fukoziltransferaze

Homogenat i tečnost iznad ćelija testirana je na GIcNAc-al,3-fukoziltransferazu. Šlepa proba izvedena je rekombinantnim Bakulo virusom koji kodira za GIcNAc transferazu i duvana (Starsser et al. 1999, Glycobiology, u štampi).

Dijagram 9 pokazuje izmereni aktivitet GlcNAc-al,3-fukoziltransferaze kao i onaj negativne probe. U najboljem slučaju aktivitet enzima kotranfektirnih ćelija i tečnosti iznad njih bio je trideset puta veći nego kod negativne probe. Ovaj endogeni aktivitet koji je merljiv u odsustvu rekombinantne transferaze, dolazi uglavnom od al,6-fukoziltransferaze insekata a samo u manjem procentu od GlcNAc-al,3-fukoziltransferaze. Prema tome povećanje GlcNAc-al,3-fukoziltransferaze koja potiče od rekombinantnih Bakulo- virusa iznosi daleko preko sto puta.

Enzim je pokazao široki maksimalni aktivitet oko pH vrednosti 7,0 kada se aktivitet merio u 2-(N-morfolin)etansulfonska kiselina - HCI puferu. Kako se u tabeli vidi podstiče dodatak bivalentnih katjona, naročito Mn<2+>aktivitet rekombinantne transferaze.

Tabela 3 pokazuje da medju upotrebljenim akceptorima, GnGn- peptid pokazuje pri standardnim uslovima eksperimenta najveću ratu inkorporacije tesno praćen od GnGnF<6->peptida i m5Gn-Asn. Na MM-peptidu nije utrvdjen transfer koji na 3-vezanoj manozi nema redukujuće GIcNAc-krajeve. Ova struktura je izgleda potrebna za jezgro fukoziltransferaze. Rekombinantna transferaza je dalje bila neaktivna u pogledu uobičajnih akceptora, onih za odredjivanje cđ,3/4-fukoziltransferaza krvnih grupa, koji transferišu fukozu na GIcNAc neredukujuće krajeve oligo saharida. Prividne Kmvrednosti za substrate akceptora GnGn- peptida, GnGnF<6->peptida, M5Gn- Asn i za substrat donora GDP- fukoze su procenjeni na 0,19 , 0,13 , 0,23 , odnosno 0,11. Struktura molekula je predstavljena na dijagramima 10a i 10b.

Primer 7:

Masena spektrometija proizvoda fu kozi I- transferaze

Dabsilirani GnGn-heksapeptid (2mM) inkubiran je sa homogenatom ćelija insekata koji obuhvata rekombinantnu GIcNAc-al,3-fukoziltransferazu (0,08mll) u prisustvu neradioaktivne GDP-L-fukoze (lOnM), 2-(N-morfolin)etansulfonska kiselina -HCI pufer, triton X-100, MnCI2/GIcNAc i AMP. Negativna kontrola je izvedena sa homogenatom za slepe probe inficiranim ćelijama insekata. Probe su inkubirane 16 sati na 37°C i analizirane uz pomoć MALDI TOF masene spektrometije.

Masena spektrometija je bila uradjena na DYNAMO (Therrmo BioAnalvsis, Santa Fe NM.), MALDI-TOF MS-u koji je sposoban za dimačku ekstrakciju (sinonim za zakasnelu ekstrakciju). Upotrebljene su dve vrste preparacija probnih matrica: peptidi i dapsilirani glikoproteidi su rastvoreni u mravljoj kiselini, i alikvoti naneseni na metu, osušeni na vazduhu, i prekriveni sa 1% a-cijano-4-hidroksi-cimetnom kiselinom. Piridil aminovani glikani redukujući oligosaharidi i nederivatisani glikoproteidi se razblaže vodom, nanesu na metu i suše na vazduhu. Po dodatku 2% 2,5-dihidroksi-benzoeve kiseline probe se odmah suše priključivanjem na vakuum.

Dijagram 11 pokazuje maseni spektar ove probe gde A predstavlja negativnu kontrolu: glavni pik (S) pokazuje Dabsvl-Val-Gly-Glu-(GlcNAc4Man3)Asn-Arg-Thr substrat, pri čemu izračunata [M+H]<+>vrednost iznosi 2262,3. Ovaj substrat se pojavljuje na (S<*>) takodje kao natrijum-adicioni proizvod i kao manji jon, nastao fragmentacijom azo-funkcije Dabsyl- grupe. Mala količina proizvoda (P, [M+H]<+>=2408,4) se odnosi na endogene al,6-fukoziltransferaze. Pik na m/z=2424,0 pokazuje nepotpuno degalaktosiliranje substrata. Maseni spektar B pokazuje probu sa rekombinantnom al,3-fukoziltransferazom. Glavni pik (P) predstavlja fukozilovani proizvod, (P<*>) njegov fragmentirani jon.

Dodatno su alikvoti obe probe medjusobno pomešani da bi se dobile slične koncentracije substrata i proizvoda (proba A). Ova smeša je razblažena sa 0,1M amonijumacetatom koji sadrži lOnll N-glikozidaze A (proba B) ili sa 50mM tris/HCI, pH 8,5 koji sadrži lOOfiU (1U hidrolizuje l^m substrata u minuti) N-glikozidaze F (proba C). Posle dva i dvadeset sati uzeti su mali alikvoti iz ove smeše i uz analizirani uz pomoć MALDI-TOF MS-a.

Na dijagramu 12 su predstavljena tri masena spektra proba A, B, i C. Nelizirana proba A pokazuje dva glavna pika: substrat na 2261,4 m/z i fokuzilirani proizod na 2407,7 m/z. Srednja kriva pokazuje maseni spektar probe B, tretiran sa N-glikozidazom A, oba glikoproteina hidrolizovana. Pik na 963,32 predstavlja degliko-zilovani proizvod. Donja kriva pokazuje maseni spektar probe C. N-glikozidaza nije u stanju da hidrolizuje al,3-fukozilovane substrate tako da spektar pokazuje na 2406,7 m/z pik fokuzilovanog proizvoda, dok se pik hidrolizovanog substrata pojavljuje na 963,08 m/z.

Primer 8:

HPLC analiza pirimidilaminovanog proizvoda fukoziltransferaze

Obe gore opisane probe (fukozilovani proizvod i negativna kontrola) se analiziraju s N-glikozidazom A. Dobijeni oligosaharidi se piridilaminuju i uz pomoć reversne faze HPLC analiziraju (VVilson et al. 1998, Glycobiology 8, 651-661; Kubelka et al. 1994

Arch. Biochem. Biophvs. 308, 148-157; Hase et al. 1984 1 Biochem. 95, 197-203).

U dijagramu 13 predstavljena je u gornjem dijagramu B negativna kontrola pri čemu se dodatno uz ostatak substrata (GnGn-peptid) vidi al,6-fukozilovani ostatak. A sadrži pik pri bitno manjem retencionom vremenu što je specifično za na redukujuću-GIcNAc-a 1,3-,vezanu fukozu.

U donjem dijagramu se izolovani proizvod transferaze pre (kriva A) i posle liziranja sa N-acetil-(3-glukozamidazom (kriva B) poredi sa MMF<3>fosfolipazo A2 iz pčele (kriva C)

Claims (26)

1. DNK molekul, naznačen time, što obuhvata sekvencu prema SEQ ID NO 1 sa otvorenim ramom za čitanje od baznog para 211 do baznog para 1740, ili je bar 50% homologa sa gornjom sekvencom, ili hibridizuje sa gornjom sekvencom pod stringentnim uslovima, ili sadrži sekvencu koja se degerisala prema gornjoj DNK sekvenci usled genetskog koda, sa sekvencom koja kodira za biljni protein koji ima aktivnost fukozil transferaze ili je komplentarna tome.

2. DNK molekul prema zahtevu 1, naznačen time, što kodira za protein koji ima aktivnost GlcNAc-cđ, 3-fukozil transferaze, naročito aktivnost jezgra-cđ, 3-fukozil transferaze.

3. DNK molekul prema zahtevima 1 ili 2, naznačen time, stoje bar 70-80%, prvenstveno bar 95% homologna sa sekvencom prema SEQ ID NO 1.

4. DNK molekul prema ma kom od zahteva 1 do 3, naznačen time, đto sadrži 2150 do 2250, posebno 2198 baznih parova.

5. DNK molekul, naznačen time, što sadrži sekvencu prema SEQ ID NO 3, ili sadrži sekvencu koja je bar 85%>, naročito 95% homologna sa gornjom sekvencom ili hibridizuje sa gornjom sekvencom pod stringentnim uslovima ili se degenerisala u gornju DNK sekvencu usled genetskog koda.

6. DNK molekul, naznačen time, što sadrži parcijalnu sekvencu DNK molekula prema ma kom od zahteva 1 do 4 i bar je 80% homnologna sa sekvencom prema SEQ ID NO 1 i ima veličinu od 20 do 200, prnenstveno 30 do 50 baznih parova.

7. DNK molekul prema bilo kom od zahteva 1 do 6, naznačen time, što je kovalentno vezan sa marker supstancom koja može da se detektuje.

8. Biološki funkcionalan vektor, naznačen time, što sadrži DNK molekul prema ma kom od zahteva 1 do 7 ili delove istoga različite dužine pri čemu ima bar 20 baznih parova.

9. Biološki funkcionalan vektor, naznačen time, što sadrži DNK molekul prema bilo kom od zahteva 1 do 7 ili delove istih različite dužine pri čemu je inversno orijentisan u pogledu na promotor.

10. DNK molekul koji kodira za ribozim, naznačen time, što ima dva sekvencna otsečka, od kojih svaki ima dužinu od bar 10 do 15 baznih parova i koji su komplementarni sa sekvencnim otsečcima DNK molekula prema ma kom od zahteva 1 do 7 tako da ribozom komplerksira i seče mRNK koja je transkribovana prirodnom GlcNAc-cđ, 3-fukozil transferazom DNK molekula.

11. Biološki funkcionalni vektor, naznačen time, što sadrži DNK molekul prema zahtevu 10.

12. Postupak za izradu cDNK koja sadrži DNK molekul prema bilo kom od zaheva 1 do 5, naznačen time, što se iz ćelija insekata ili biljnih ćelija izoluje RNK, naročito iz hipokotilnih ćelija, i pomoću RNK se izvrši reversna transkripcija posle dodavanja reversne transkriptaze i prajmera.

13. Postupak kloniranja GlcNAc-al,3-fukozil, naznačen time, što se DNK molekul prema bilo kom od zahteva 1 do 5 klonira u vektor koji se zatim transficira u ćeliju domaćina ili domaćina, sa ćelijskim linijama dobijenim pomoću selekcije i amplifikacije transficiranih ćelija domaćina, koje ćelijske linije ekprimaju aktivnu GlcNAc-al,3-fukozil transferazu.

14. Postupak za izradu rekombinantnih ćelija domaćina, naročito biljnih i ćelija insekata, u kojima je proizvodnja GlcNAc-al,3-fukozil transferaze suzbijena ili potpuno zaustavljena, naznačen time, što se bar jedan od vektora prema zahtevima 8, 9 ili 11 i vektor koji sadrži DNK sekvencu prema bilo kom od zahteva 1 do 7, pri čemu DNK sekvenca sadrži mutaciju brisanja, umetanja i/ili supstitucije, umeće u ćeliju domaćina, ili biljku ili insekt.

15. Postupak za izradu rekombinatnih ćelija domaćina, naročito biljnih i ćelija insekata, ili biljaka ili insekata, naznačen time, što se DNK sekvenca prema bilo kom od zahteva 1 do 7 pri čemu DNK sekvenca sadrži mutaciju brisanja, umetanja i/ili supstitucije, umeće u genom ćelije domaćina, ili biljke ili insekta, na mestu ne-mutirane, homologne sekvence.

16. Rekombinantne biljne ćelije, naznačene time, što se izradjuju po postupku prema zahtevima 14 ili 15 i što je njihova proizvodanja GlcNAc-al,3-fukozil transferaze suzbijena ili potpuno obustavljena.

17. Rekombinatni insekti ili ćelije insekata, naznačene time, što se izradjuju po postupku prema zahtevina 14 ili 15 i stoje njihova proizvodnja GLcNAc-al,3-fukozil transferaze suzbijena ili potpuno obustavljena.

18. PNK (peptid nukleinska kiselina) molekul, naznačen time, što sadrži baznu sekvencu komplementarnu sekvenci DNK molekula prema bilo kom od zahteva 1 do 6 i parcijalnim sekvencama istih.

19. PNK molekul, naznačen time, što sadrži baznu sekvencu koja odgovara sekvenci DNK molekula prema bilo kom od zahteva 1 do 6 i parcijalnim sekvencama istih.

20. Postupak za proizvodnju biljaka ili insekata, ili ćelija, naročito biljnih i ćelija insekata, koje imaju blokiranu ekspresiju GIcNAc- al ,3-fukozil transferaze na nivo transkripcije ili translacije, naznačen time, što se u ćelije umeću PNK molekuli prema zahtevima 18 ili 19.

21. Postupak za proizvodnju glikoproteina, naznačen time, što se sistem prema zahtevu 16 ili 17 ili biljke ili insekti, ili ćelije, koje su izradjene po postupku prema zahtevu 20, transficirafju) sa genom koji eksprimuje glikoprotein tako da se eksprimuju rekombinatni glikoproteini.

22. Postupatk za proizvodnju rekombinantnih humanih glikoproteina, naznačen time, što se sistem prema zahtevima 16 ili 17 ili biljke ili insekti, ili ćelije, koje su izradjene po postupku prema zahtevu 20, transficira(ju) sa genom koji eksprimuje glikoproteine tako da se eksprimuju rekombinantni glikoproteini.

23. Postupak za proizvodnju rekombinantnih humanih glikoproteina za medicinsku upotrebu, naznačen time, što se sistem prema zahtevima 16 ili 17 ili biljke ili insekti, ili ćelije, koje su izradjene po postupku prema zahtevu 20, transficira(ju) sa genom koji eksprimuje glikoproteine tako da se eksprimuju rekombinantni glikoproteini.

24. Postupak za selekciju DNK molekula koji kodira za GlcNAc-al, 3-fukozil transferazu, u uzorku, naznačen time, što se DNK molekuli prtema zahtevu 7 dodaju uzorku, pri čemu se molekuli vezuju za DNK molekule koji kodiraju za GlcNAc-al, 3-fukozil transferazu.

25. Postupak prema zahtevu 24, naznačen time, što uzorak sadrži genomsku DNK biljnog ili organizma insekta.

26. DNK molekuli koji kodiraju za GlcNAc-al, 3-fukozil transferazu, naznačeni time, što su oni izdvojeni po postupku prema zahtevima 24 ili 25 i zatim su izoliovani iz uzorka.