RS58906B1

RS58906B1 - Hrana za ribe i njena upotreba u profilaksi i lečenju hemoragičnog sindroma smolta (hss) kod riba iz porodice salmonidae

Info

Publication number: RS58906B1
Application number: RS20190663A
Authority: RS
Inventors: Jim Roger Nordly; Arthur Lyngøy; Claudio Retamal Mansilla
Original assignee: Europharma As
Priority date: 2014-09-23
Filing date: 2015-09-22
Publication date: 2019-08-30
Also published as: RU2017111885A3; CL2020001642A1; HRP20201981T8; PL3858149T3; EP3808188B1; RU2708168C2; SMT201900321T1; DK3197290T3; US20210120846A1; CA2958777A1; PL3808188T3; CL2019000494A1; DK3197290T1; SI3398449T1; CA2958777C; HUE044905T2; US20170208840A1; ES2836054T3; DK3516965T2; DK3808188T2

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Pronalazak se odnosi na uzgoj ribe, naročito na uzgoj riba iz porodice Salmonidae, a posebno na novu hranu za ribe i njenu upotrebu u postupku profilakse i lečenja sindroma hemoragičnog smolta (HSS) kod riba iz porodice Salmonidae, poželjno tokom postupka smoltifikacije ili tokom postupka za sprečavanje desmoltifikacije.

Osnova pronalaska

[0002] Salmo sp., Onchorhynchus sp. i Salvelinus sp. su rodovi unutar porodice Salmonidae, koji imaju anadromni životni ciklus. Anadromni životni ciklus znači da riba tokom svog života boravi i u slatkoj i u morskoj vodi. Salmonide u slatkoj vodi, koje odluče da migriraju u morsku vodu, podležu fiziološkom procesu nazvanom smoltifikacija.

[0003] U prirodi, procesom smoltifikacije upravljaju endogeni procesi u ribi, a oni su usklađeni sa spoljnim signalima iz okruženja ribe (na primer, mrak, svetlost, temperatura vode, itd.). Smolt je naziv za ribu lososa u slatkoj vodi, spremnu za migraciju u morsku vodu. Proces smoltifikacije uključuje nekoliko endokrinih signalnih supstanci, kao što su melatonin, oslobađajući hormoni hipofize, tireostimulirajući hormon (TSH), prolaktin (PRL), hormon rasta (GH) i adrenokortikotropni hormon (ACTH). Ove supstance utiču na nekoliko ciljnih organa u telu ribe (na primer, tiroidnu žlezdu i adrenalne žlezde), koji luče signalne supstance koje zatim menjaju izgled, ponašanje, rast i metabolizam, sastav tela i kapacitet ribe da održi osmotsku ravnotežu u morskoj vodi.

[0004] U slatkoj vodi Salmonide pumpaju jone (Cl- , Na+ , K+ , Ca2+) iz okruženja u telo (na primer, kroz škrge), reapsorbuju jone iz urina (na primer, Ca<2+>, Mg<2+>), i istovremeno izlučuju jako razblažen urin, da bi se suprotstavile višku vode u telu. Kada se riba adaptira na morsku vodu, ova fiziološka aktivnost mora da se okrene u suprotnom smeru. Kroz proces smoltifikacije, salmonide postaju sposobne da ispumpavaju so iz tela (na primer, Na+ i Cl- kroz škrge), izlučuju višak jona kroz koncentrovani urin (primeri su Ca2+ , Mg2+), i reapsorbuju vodu iz urina u bubregu.

[0005] Zapaženo je da gajeni losos, koji u slatkoj vodi podleže smoltifikaciji, povremeno ispoljava letargično ponašanje, nakostrešenu krljušt, blede škrge i brojna krvarenja u unutrašnjim organima, kao što je srčani i skeletni mišić, jetra i visceralno masno tkivo. Grupa riba može da ima umereno povećan mortalitet. Opisano stanje se naziva hemoragični sindrom smolta (HSS). Uzrok bolesti nije u potpunosti shvaćen. Naučna literatura ukazuje na nepravilnu ishranu, genetski poremećaj, kao i prisustvo virusnih čestica u tkivu, kao moguća objašnjenja.

[0006] Smolt koji ostaje u slatkoj vodi nakon procesa smoltifikacije ima tendenciju razvoja nepričvršćene dermalne krljušti (nepričvršćena krljušt). Nepričvršćena krljušt predstavlja izazov pri rukovanju i transportu ribe, budući da lako dovodi do oštećenja kože. Takva oštećenja mogu da budu put prodiranja infekcija (na primer, Saprolegnia sp, Moritella viscosa, Tenacibaculum maritimum), i uzrokuju ulkuse i poremećenu osmotsku ravnotežu, u slatkoj vodi i morskoj vodi.

[0007] U slučaju kada riba ostaje u slatkoj vodi kada dostigne status smolta, proces smoltifikacije će se preokrenuti, i riba će ponovo pokušati da uspostavi fiziološku ravnotežu, pogodnu za život u slatkoj vodi. Proces, koji se naziva desmoltifikacija, može da bude praćen smanjenim apetitom, nepričvršćenom krljušti, i povremeno umereno povećanim mortalitetom.

[0008] Upotreba tradicionalnog zimskog signala (manipulacija svetlošću sa 12-časovnim svetlom, 12-časovnim mrakom u toku dana) u proizvodnji smolta lososa, donosi nekoliko izazova. Zimski signal snižava dnevni unos hrane i rast za oko 30%. Zimski signal se daje tokom oko 7 nedelja, praćen letnjim signalom (24 časa svetlosti tokom dana) do postizanja statusa smolta. Dalje, zahvaljujući velikoj gustini ribe (primer > 70 kg/m<3>), kakva se javlja u mrestilištima u uslovima intenzivne proizvodnje, dolazi do toga da ribe primaju različite količine letnjeg signala, što zauzvrat dovodi do toga da ribe podležu smoltifikaciji u različito vreme. Verovatnije je da će ribe koje žive na dnu dubokih tankova, sa zidovima tamnih boja, primiti nedovoljno letnjeg signala.

[0009] Prevelika biomasa u tankovima, može negativno da utiče na kvalitet vode (primer je povišen nivo CO2, > 15 mg/litru), pri nedovoljnoj preradi vode ili izmenama vode. Loš kvalitet vode utiče negativno na proces smoltifikacije.

[0010] Dalje, velike ribe podležu smoltifikaciji pre manjih riba, a slično je i kod desmoltifikacije. U mrestilištima sa uslovima intenzivne proizvodnje, teško je držati ribe približno iste veličine u svakom tanku, zbog ograničenog broja dostupnih tankova. Na taj način, grupa riba obično sadrži ribe različite veličine, i smoltifikacija i desmoltifikacija se odvijaju u različita vremena unutar grupe.

[0011] Kako se proces smoltifikacije odvija, riba postaje sve manje sposobna da ostane u slatkoj vodi, jer se fiziologija ribe prilagođava morskoj vodi. Ovo se može ispoljiti kroz umereno povećan mortalitet u grupi riba. U ovom stadijumu proizvodnje, uobičajeno se javlja riba sa HSS, kao što se zapaža i smanjen apetit i rast.

[0012] Ukupno uzevši, ova stanja predstavljaju izazov i za proizvodnju u slatkoj vodi i u morskoj vodi. Kod proizvodnje u slatkoj vodi, to je smanjeni rast i određeni mortalitet, a kod proizvodnje u morskoj vodi, prebacivanje u morsku vodu grupa smolta sa nehomogenim statusom smolta. To znači da neke ribe u morskoj vodi ugibaju zbog problema sa osmoregulacijom, ili preživljavaju, ali slabo jedu i podložnije su dugotrajnom stresu, praćenom sekundarnim bolestima. Prosečna stopa mortaliteta u proizvodnji norveškog lososa, od vremena premeštanja do izlova, bila je tokom nekoliko godina približno 20%. Nadzor koji je sprovela Norveška agencija za sigurnost hrane (2013) pokazuje da oko 40% ove stope mortaliteta potiče od smanjenog kvaliteta smolta.

[0013] Organi koji su uključeni u proces smoltifikacije (na primer, epifiza, hipotalamus, hipofiza, bubreg, creva, škrge i koža,) imaju na spoljašnjoj strani ćelijske membrane tip receptora koji se naziva receptori za detekciju kalcijuma (CaSR). Na CaSR mogu da utiču različiti modulatori, uključujući jone (kao što su Ca<2+>, Mg<2+>, Cl-, Na<+>, H<+>) i slobodne aminokiseline (kao što je triptofan). Stimulacija receptora CaSR daje ushodnu regulaciju ili nishodnu regulaciju različitih ćelijskih intracelularnih aktivnosti. Kontrolisana stimulacija CaSR može da obezbedi odgovor koji se podudara sa procesom smoltifikacije.

[0014] Primer takve kontrolisane stimulacije je metod SuperSmolt®, u kome se joni dodaju u radnu vodu (Ca2+ , Mg2+ , Cl-), u kombinaciji sa hranom za ribe koja sadrži dodate Na<+>-jone, Cl--jone i triptofan. Metod SuperSmolt® je opisan u međunarodnoj patentnoj prijavi WO 02/30182. Izraz "hrana za ribe", u značenju povezanom sa metodom SuperSmolt®, i kako se dalje koristi u predmetnoj prijavi, označava hranu sastavljenu od proteina, masti, ugljenih hidrata, vitamina i minerala, namenjenu salmonidama u stadijumu mladog lososa (engl. parr) i smolta u slatkoj vodi. Sastav takve hrane za rast može da obuhvata ove sirovine, ili delove ovih sirovina. Stručnjaci iz ove oblasti su upoznati sa vrstama hrane koje su namenjene za ovu svrhu, u odnosu na hranu koja je namenjena drugim vrstama, ili fazama rasta. Primer hrane za ribe koja se koristi u metodu SuperSmolt® ilustrovan je na proizvodnom listu prikazanom na sl.1.

[0015] Metod SuperSmolt® omogućava da se salmonide smoltifikuju bez upotrebe zimskog i letnjeg signala (mrak/svetlost), već pre upotrebom kontinuiranog svetla (24 časa/dan) sve do vremena prebacivanja u morsku vodu, čime se izbegava upotreba zimskog signala koji redukuje rast. Osim toga, upotreba ovog metoda omogućava zadržavanje ribe u okviru smolta, čime se sprečava desmoltifikacija, što omogućava normalan rast i tokom procesa smoltifikacije u slatkoj vodi.

[0016] Metod SuperSmolt® obezbeđuje ukupne očigledne prednosti u efikasnosti proizvodnje, i u slatkoj vodi i u morskoj vodi. Moguće je održati normalan rast u slatkoj vodi i morskoj vodi, preneti grupe smolta u more gde ribe imaju homogeni status smolta, i tako smanjiti proizvodne gubitke zbog mortaliteta, gubitka apetita i povećanog rizika od bolesti.

[0017] Međutim, metod SuperSmolt® ima nekoliko nedostataka. Taj metod zahteva dodavanje velikih količina soli (jona) u radnu vodu, tokom dugog perioda vremena (3-6 nedelja). Ovo je zahtevan praktičan problem i on znatno povećava troškove proizvodnje. Prema tome, metod se retko koristi za držanje ribe u slatkoj vodi tokom dugog perioda vremena (< 6 nedelja), jer ga troškovi i praktični uslovi čine nepogodnim.

Rezime pronalaska

[0018] Predmetni pronalazak, prema tome, ima za cilj da u skladu sa jednim aspektom obezbedi hranu za ribe i metod koji eliminiše ili smanjuje nedostatke SuperSmolt® metoda. Ovo se postiže formulisanjem hrane za ribe koja sama po sebi može da smoltifikuje ribu bez upotrebe soli u procesnoj vodi, i u isto vreme, omogućava zadržavanje ribe u okviru smolta tokom dugog perioda vremena. Predmetni opis obezbeđuje pojednostavljeni proces smoltifikacije u poređenju sa metodom SuperSmolt®, budući da nema potrebe za dodavanjem soli u procesnu vodu, i on lako može da se primeni kao dodatni stimulans pri upotrebi zimskog i letnjeg signala, ili neadekvatnog zimskog i letnjeg signala, u procesu smoltifikacije. Osim toga, verovatno je da će losos moći da se drži u slatkoj vodi, a da ne dođe do desmoltifikacije, stradanja ili pojave niske stope rasta ribe, bez pojave hemoragičnog sindroma smolta ili nepričvršćenih krljušti na koži, sve do postizanja veličine za izlov ribe (> 200 grama, najčešće 4-6 kg).

[0019] Takođe je opisan metod u kome riba može da se drži u slatkoj vodi do postizanja veličine za izlov.

[0020] Prema jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje hranu za ribe prema patentnom zahtevu 1, koja sadrži protein, mast, ugljeni hidrat, vitamine, minerale i vodu, Na+ od 3.934 - 39.340 g/kg po težini, sa dodatim modulatorom receptora za polivalentne katjone (PVCR), u obliku triptofana ili fenilalanina, 1-10 g/kg, Mg2 od 0.026 - 25.530 g/kg po težini, i Ca2+ od 0.036 - 36.110 g/kg po težini, pri čemu je modulator receptora za polivalentne katjone u obliku slobodnih aminokiselina. Pronalazak se dalje ogleda u priloženim patentnim zahtevima.

Kratak opis crteža

[0021] Slika 1 je proizvodni list za hranu za ribe prema prethodnom stanju tehnike koja se koristi u metodu SuperSmolt®.

Detaljan opis pronalaska

[0022] Prema jednom aspektu, predmetna prijava između ostalog opisuje hranu za ribe kojoj su dodate soli (joni) i modulatori PVCR (slobodne aminokiseline) prema sledećoj tabeli 1. Treba uzeti u obzir da svi navedeni brojni opsezi uključuju različite intermedijarne opsege kao da su ovi intermedijarni opsezi eksplicitno pomenuti, npr., opseg 1-10 treba shvatiti tako da uključuje 1-9, 1-8, 1-7 (itd); 2-10, 3-10, 4-10 (itd); 1-9, 2-8, (itd).

[0023] Modulatori PVCR uključuju slobodne aminokiseline kao što je ovde pomenuto, bilo da se koriste same ili u kombinaciji: triptofan, tirozin, fenilalanin, serin, alanin, arginin, histidin, leucin, izoleucin, asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu, glicin, lizin, metionin, prolin, glutamin, asparagin, treonin, valin i cistein, u koncentracijama između 1-10 grama/kg hrane za ribe.

[0024] "Hrana za ribe" se ovde shvata kao hrana sačinjena od proteina, masti, ugljenih hidrata, vitamina, minerala, pigmenata i vode, pogodna za mladog lososa i smolta salmonida u slatkoj vodi. Sastav takve hrane za rast može da sadrži ove sirovine ili delove ovih sirovina:

Izvori proteina:

[0025] Koncentrat sojinog proteina (na primer, SPC65), sojin protein (na primer, HiPro Soy), proteinsko brašno graška, suncokretovo brašno, pšenični gluten, kukuruzni gluten, zrnevlje boba, krupno brašno od repice, obrnika, živinsko krupno brašno, mesno koštano krupno brašno, krvno krupno brašno, brašno guar gume, proteini koji potiču iz mikroorganizama (od fermentacije različitih supstrata), protein algi, brašno životinjskih ljuštura uopšte, kril brašno, kril hidrolizat, riblji hidrolizat, riblje krupno brašno (na primer od norveške haringe, skuše, šaruna, peščara, kapelina, sardela, velike haringe i drugo)

Izvori ugljenih hidrata:

[0026] Pšenica ili drugi pogodni izvor ugljenih hidrata poznat u struci

Izvori masti:

[0027] Riblje ulje (npr. od norveške haringe, skuše, šaruna, peščara, kapelina, sardela, velike haringe i drugo), ulje uljane repice, ulje lanenog semena

Minerali i vitamini:

[0028] Dodato nakon aktuelnog saveta o ishrani za mladog lososa i smolta salmonida u slatkoj vodi Pigmenti:

[0029] Astaksantin ili drugi pigmenti poznati u struci

[0030] Stručnjak u ovoj oblasti je upoznat sa takvom hranom i neophodnim sastavom, u cilju proračuna za obezbeđivanje rasta mladog lososa i smolta salmonida u slatkoj vodi.

[0031] Hrana za ribe prema pronalasku, iznenađujuće omogućava:

• Proizvodnju smolta anadromnih salmonida za prebacivanje u morsku vodu (10-150 g)

• Održavanje normalne jonske ravnoteže i osmoregulacije za anadromne salmonide u slatkoj vodi, uključujući ali bez ograničenja,

o Sprečavanje desmoltifikacije salmonida u slatkoj vodi,

o Sprečavanje i/ili lečenje poremećaja hemoragičnog sindroma smolta (HSS) kod anadromnih salmonida,

o Sprečavanje i/ili lečenje edema krljušti koji dovodi do gubitka krljušti.

• Proizvodnju post-smolta anadromnih salmonida u slatkoj vodi, za prebacivanje u morsku vodu (> 150 g).

• Proizvodnju anadromnih salmonida u slatkoj vodi do dostizanja veličine za konzumiranje na tržištu (> 100 grama, najčešće 5000 g)

• Proizvodnju matičnog jata anadromnih salmonida u slatkoj vodi, u vezi sa dobijnjem jaja/ikre.

[0032] Pronalazak obuhvata, prema jednom aspektu, kombinovanje ekvivalenta hrane SuperSmolt®, sa dodatim solima magnezijuma i/ili solima kalcijuma u hrani, ali bez umešavanja ovih soli u radu sa vodom, kao kod metoda SuperSmolt®.

[0033] Predmetni opis obezbeđuje postupak za:

• Održavanje normalne jonske ravnoteže i osmoregulacije za anadromne salmonide u slatkoj vodi, u cilju postizanja, uključujući, ali bez ograničenja,

o Sprečavanja desmoltifikacije salmonida u slatkoj vodi,

o Sprečavanja, izlečenja ili lečenja poremećaja hemoragičnog sindroma smolta (HSS) kod anadromnih salmonida,

o Sprečavanja, izlečenja ili lečenja poremećaja edema krljušti koji dovodi do gubitka krljušti.

• Proizvodnju matičnog jata anadromnih salmonida u slatkoj vodi, u vezi sa dobijanjem jaja/ikre.

[0034] Postupak obuhvata izvođenje sledećih koraka:

a. Obezbeđivanje hrane za ribe za mladog lososa ili smolta, koja sadrži protein, mast, ugljeni hidrat, vitamine, minerale i vodu, NaCl od 10-100 g/kg, sa dodatim modulatorom receptora za polivalentne katjone (PVCR), u obliku triptofana ili fenilalanina, 1-10 g/kg, i dodate soli kalcijuma (Ca2 ), na primer CaCl2između 0.1-100 g/kg, i soli magnezijuma (Mg2+), kao što je MgCl2između 0.1-100 g/kg.

b. Davanje hrane ribi u skladu sa apetitom, dok je u slatkoj vodi ili brakičnoj vodi, dok ne dođe do smoltifikacije.

c. Prebacivanje ribe u morsku vodu nakon smoltifikacije.

[0035] Alternativno, riba može da se drži u slatkoj vodi nakon smoltifikacije, u tom slučaju postupak može da obuhvata posle koraka a i b:

d. Držanje ribe u slatkoj vodi nakon što je došlo do smoltifikacije,

e. Nastavljanje sa davanjem hrane za ribe ribi dok ne postigne željenu težinu u slatkoj vodi i bude pogodna je za ljudsku upotrebu, ili dok ne dostigne starost/težinu pogodnu za uvođenje polnog sazrevanja, čime se mogu dobiti riblja jaja za novu proizvodnju ribe ili za konzumiranje.

[0036] Pronalazak će biti detaljnije opisan uz pozivanje na sledeće primere.

Materijali i metode

Biološki materijal, uslovi sredine i postavka eksperimenta

[0037] Sprovedeno je šest terenskih studija, upotrebom vrsta atlantski losos (Salmo salar) i kalifornijska pastrmka (Onchorhynchus mykiss). Ribe su u vreme pokretanja ogleda vakcinisane uljanom vakcinom i ponovo su stekle apetit nakon vakcinacije. Prosečna težina riba na početku bila je najmanje 40 grama, a na kraju boravka u slatkoj vodi najviše 180 grama. Ispitivane dijete su korišćene pod normalnim proizvodnim uslovima, u Norveškoj i Čileu, 2012 i 2013. Riba je hranjena ispitivanim dijetama, najmanje 3 nedelje, do najviše 11 nedelja, i samo dok je bila u slatkoj vodi.

Tabele 2 i 3 prikazuju podatke o vrsti, stadijumu, uslovima svetlosti, temperaturi vode, broju riba, veličini riba, ispitivanoj hrani i postavci eksperimenta.

Tabela 2: Pregled terenskih studija, uslova osvetljenja, temperature vode i tipa ispitivanih dijeta.

Tabela 3: Pregled terenske studije, uslova osvetljenja, temperature vode i tipa ispitivanih dijeta.

Sastav ispitivanih dijeta

[0038] Hrana za ribe se ovde shvata kao hrana sačinjena od proteina, masti, ugljenih hidrata, vitamina i minerala, pogodna za stadijume mladog lososa i smolta salmonida u slatkoj vodi.

[0039] Ispitivana dijeta 1 (odgovara hrani SuperSmolt®) :

a. Hrana za ribe u koju je dodato 7% NaCl

b. Hrana za ribe u koju je dodato 0,4% L-triptofana

[0040] Ispitivana dijeta 2 (odgovara primeru izvođenja hrane za ribe prema predmetnom pronalasku):

a. Hrana za ribe u koju je dodato 6% NaCl

b. Hrana za ribe u koju je dodato 0,75% CaCl2

c. Hrana za ribe u koju je dodato 0,25% MgCl2

d. Hrana za ribe u koju je dodato 0,4% L-triptofana

[0041] Kontrolne dijete:

a. Hrana za rast za stadijum mladog lososa i smolta proizvođača Skretting AS

b. Hrana za rast za stadijum mladog lososa i smolta proizvođača Ewos AS

Parametri za praćenje dejstva ispitivane i kontrolne dijete

[0042] Uzorkovanje je sprovedeno neposredno pre nego što je riba dobila ispitivanu dijetu/kontrolnu dijetu i neposredno pre prebacivanja ribe u morsku vodu. Pored toga, izvršeno je uzorkovanje između početnog i krajnjeg uzorkovanja.

Aktivnost enzima Na+-K+-ATPaze u tkivu škrga

[0043] Uzorkovanje je sprovedeno neposredno pre nego što je riba nahranjena ispitivanom dijetom i neposredno pre prebacivanja ribe u morsku vodu. Uzorkovanje je takođe, u različitim stepenima, sprovedeno između početnog i krajnjeg uzorkovanja.

[0044] Tokom smoltifikacije, normalno je zapaziti rastuću količinu enzima Na<+>-K<+>-ATPaze u tkivu škrga. Glavna uloga ovog enzima je da ispumpava soli van tela ribe, što je neophodno za održavanje osmotske ravnoteže u morskoj vodi. Tkivo škrga iz drugog luka škrge prebačeno je u epruvetu, odmah zatim zamrznuto u tečnom azotu (-180 °C), da bi se u njemu ispitala količina enzima iz škrga pomoću FishGuard AS, Leknes (ranije MultiLab AS), prema postupku opisanom kod McGormick (1993).

Broj kopija alfa 1a iRNK (ATPaza slatke vode):

[0045] Uzorkovanje je sprovedeno neposredno pre hranjenja ribe ispitivanom dijetom i neposredno pre prebacivanja ribe u morsku vodu. Uzorkovanje je takođe, u različitim stepenima, sprovedeno između početnog i krajnjeg uzorkovanja.

[0046] Glavna uloga enzima, koji kodira alfa 1a iRNK, je da pumpa soli iz slatke vode u telo ribe. Prilagođavanje na život u morskoj vodi znači da ta enzimska aktivnost mora da se smanji, a slično važi i za ekspresiju gena. Tokom procesa smoltifikacije, broj kopija alfa 1a iRNK u škrgama ribe opada. Tkivo škrga iz trećeg luka škrge prebačeno je u epruvetu sa reagensom mRNA-later da bi se u njemu ispitao broj kopija alfa 1a iRNK, prema postupku koji je razvio FishGuard AS (2013).

Indikator smolta

[0047] Tokom procesa smoltifikacije, zapaža se promena izgleda ribe (morfološke promene). Ova promena se meri pomoću vrednosti indikatora smolta i zasniva se na vizuelnom bodovanju od 1-4 za svaki od parametara posrebrenja kože, oznaka stadijuma mladog lososa i crnih ivica peraja, videti tabelu 4. Vrednost indikatora smolta predstavlja prosek rezultata za ova tri parametra zajedno. Indikator smolta je zabeležen u isto vreme kao i uzorkovanje tkiva škrga za ispitivanje enzima Na<+>-K+-ATPaze.

Tabela 4. Pregled rezultata indikatora smolta

Test za hlorid u krvnoj plazmi ribe u morskoj vodi.

[0048] Kada je postojala mogućnost izvođenja testa u morskoj vodi, uzorkovana je riba za prebacivanje u morsku vodu od 34‰ i držana u njoj 96 časova, tokom procesa smoltifikacije. Zatim su sakupljeni uzorci krvi ribe, i ispitivan je sadržaj hloridnih jona (Cl-) u krvnoj plazmi prema postupku koji se koristi u Centralnoj laboratoriji u norveškoj školi veterinarskih nauka (2012). To je način da se odredi da li je losos u slatkoj vodi zadovoljavajuće smoltifikovan. Ako riba ima normalnu osmoregulaciju u morskoj vodi (nivo hlorida u krvnoj plazmi između 120-150 mmol/l) u morskoj vodi od 34‰ posle 96 časova, to je znak da se riba nalazi u okviru stadijuma smolta.

Joni u krvnoj plazmi ribe u slatkoj vodi

[0049] U dve terenske studije sakupljeni su uzorci krvi od riba u slatkoj vodi, za analizu Ca, Mg i Cl u krvnoj plazmi. Ispitivanje je sprovela Centralna laboratorija u norveškoj školi veterinarskih nauka (2012).

Stopa mortaliteta u slatkoj vodi i morskoj vodi

[0050] U slatkoj vodi, sprovođeno je beleženje procenta uginuća tokom upotrebe ispitivane hrane i kontrolne hrane do prebacivanje ribe u morsku vodu. Posmatrana je stopa mortaliteta u morskoj vodi u grupi kojoj je data kontrolna hrana, naspram grupe kojoj je data ispitivana hrana u slatkoj vodi. Beležena je stopa smrtnosti nakon 30, 60 i 90 dana, kao i ukupni mortalitet pri izlovu (jedna morska farma).

Statistika

[0051] Deo materijala je statistički obrađen, da bi se odredilo da li promena između dve merne tačke u test grupi ima statističku značajnost (p = 0.05, i p = 0.01). Sprovedeno je slično ispitivanje za kontrolnu grupu.

Rezultati

Terenska studija 1

Aktivnost enzima Na+-K+-ATPaze u tkivu škrga

[0052] Dijagram 1 prikazuje kretanje aktivnosti enzima Na+-K+-ATPaze u tkivu škrga u terenskoj studiji 1, kada se ispitivana dijeta 1 uporedi sa kontrolnom dijetom a, koja predstavlja hranu za rast za juvenile proizvođača Skretting AS. Rezultati predstavljaju prosek rezultata uzorkovanja iz 4 tanka za test (n = 24/uzorkovanju) i 4 tanka za kontrolu (n = 24/uzorkovanju).

[0053] Između 19.03.12. i 12.04.12, postojala je značajna promena ATPaze (p = 0.05) u kontrolnoj grupi, dok kod test grupe nije bilo značajne promene ATPaze (p = 0.05). Između 26.04.12. i 09.05.12, postojala je značajna promena ATPaze u kontrolnoj grupi u intervalu poverenja od 99% (p = 0.05 i p = 0.01), dok je test grupa imala samo značajnu promenu ATPaze u intervalu poverenja od 95% (p = 0.05). Tabela 5 prikazuje pregled ovog predmeta diskusije.

Tabela 5 : Značajna promena između dve tačke uzorkovanja za ATPazu unutar grupe (p = 0.05 ili p = 0.01). One su zatim upoređene između kontrolne grupe i test grupe. Ostala poređenja između tačaka uzorkovanja u kontrolnoj i test grupi nisu dala takvu razliku posmatrane značajnosti.

Broj kopija alfa 1a iRNK (ATPaza slatke vode)

[0054] Nije bilo uzoraka za analizu broja kopija alfa 1a iRNK, ATPaze slatke vode.

Indikator smolta

[0055] Dijagram 2 prikazuje razvoj indikatora smolta u terenskoj studiji 1, u kojoj je ispitivana dijeta 1 upoređena sa kontrolnom dijetom a, hranom za rast za juvenile proizvođača Skretting AS. Rezultati su prosečna vrednost uzoraka uzetih iz 4 tanka za test (n = 24/uzorkovanju) i 4 tanka za kontrolu (n = 24/uzorkovanju). Između 19.03.12. i 26.04.12, postojala je značajna promena indikatora smolta (p = 0.01) u kontrolnoj grupi, dok test grupa nije ispoljila značajnu promenu indikatora smolta (p = 0.01). Između 12.04.12 i 26.04.12, postojala je značajna promena indikatora smolta (p = 0.05 i 0.01) u kontrolnoj grupi, dok test grupa nije ispoljila značajnu promenu indikatora smolta (p = 0.05 i 0.01). Tabela 6 daje pregled ovog predmeta diskusije.

Tabela 6: Značajna promena između dve tačke uzorkovanja za indikator smolta unutar grupe (p = 0.05 ili p = 0.01). One su zatim upoređene između kontrolne grupe i test grupe. Ostala poređenja između tačaka uzorkovanja u kontrolnoj i test grupi, nisu dala takvu razliku posmatrane značajnosti.

Hlorid u krvnoj plazmi ribe u testu opterećenja morskom vodom.

[0056] Dijagram 3 prikazuje kretanje hlorida u plazmi u terenskoj studiji 1, sa upotrebom ispitivane dijete 1, i u poređenju sa kontrolnom dijetom a, hranom za rast za juvenile proizvođača Skretting AS. Rezultati su prosečna vrednost uzetih uzoraka iz 2 tanka za test (n = 15/uzorkovanju) i 2 tanka za kontrolu (n = 15/uzorkovanju).

Joni u krvnoj plazmi ribe u slatkoj vodi

[0057] Dijagrami 4 i 5 prikazuju merenje u jednoj tački 11. aprila 2012, za magnezijum u plazmi, kalcijum u plazmi i hlorid u plazmi, u slatkoj vodi u terenskoj studiji 1, za ispitivanu dijetu 1 u poređenju sa kontrolnom dijetom a. Rezultati su prosečna vrednost za ribu koja pati od hemoragičnog sindroma smolta (HSS) u test tankovima (n = 6) i kontrolnim tankovima (n = 6). Ovo se poredi sa prosečnom vrednošću za normalnu ribu u kontrolnoj grupi (n = 6), normalnu ribu u slatkoj vodi iz terenske studije 3 (n = 19) i referentnom vrednošću iz literature (Jakobsen, 2013). U literaturi nisu mogle da budu nađene referentne vrednosti za normalnu vrednost kalcijuma u plazmi kod atlantskog lososa.

Stopa mortaliteta u slatkoj vodi

[0058] Mortalitet tokom eksperimentalnog perioda u slatkoj vodi, ilustrovan je na dijagramu 6. Najviša stopa mortaliteta bila je oko 10. aprila 2012. Riba je imala klasične nalaze autopsije, kompatibilne sa hemoragičnim sindromom smolta (HSS), uključujući blede škrge i blede unutrašnje organe, višestruko petehijalno krvarenje u mišićima, u abdominalnom adipoznom tkivu i visceri (Halse, 2012).

Terenska studija 2

Aktivnost enzima Na+-K+-ATPaze u tkivu škrga.

[0059] Dijagram 7 prikazuje kretanje aktivnosti enzima Na -K -ATPaze u tkivu škrga u terenskoj studiji 2, pri upotrebi ispitivane dijete 2, upoređene sa kontrolnom dijetom a, koja predstavlja hranu za rast za juvenile proizvođača Skretting as. Rezultati su prosečna vrednost uzorkovanja iz 4 kaveza u slatkoj vodi iz test grupe (n = 25/uzorkovanju) i 4 kaveza u slatkoj vodi za kontrolnu grupu (n = 25/uzorkovanju).

[0060] Između tačaka uzorkovanja 30.08.12. i 06.09.12, 30.08.12. i 20.09.12, 30.08.12. i 27.09.12, postojao je značajan porast ATPaze (p = 0.01) u test grupi, dok kontrolna grupa nije ispoljila značajnu promenu ATPaze ni u jednom od intervala poverenja od 99% ili 95% (p =0.01 i p = 0.05). Između 06.09.12. i 12.09.12, postojao je značajan porast ATPaze u kontrolnoj grupi u intervalu poverenja od 99% (p = 0.01), zapažen nedelju dana kasnije nego kod test grupe. Između 12.09.12. i 20.09.12, dogodio se značajan pad ATPaze u kontrolnoj grupi u intervalu poverenja od 99%, dok test grupa nije ispoljila značajnu promenu ATPaze. Tabela 7 daje pregled predmeta diskusije.

Tabela 7: Značajna promena između dve tačke uzorkovanja za ATPazu unutar grupe (p = 0.05 ili p = 0.01). One su zatim upoređene između kontrolne grupe i test grupe. Ostala poređenja između tačaka uzorkovanja u kontrolnoj i test grupi nisu dala takvu razliku posmatrane značajnosti.

Broj kopija alfa 1a iRNK (ATPaza slatke vode)

[0061] Nije bilo uzoraka za analizu broja kopija alfa 1a iRNK, ATPaze slatke vode.

Indikator smolta

[0062] Nema uzorkovanja za pregled indeksa smolta u ovoj studiji.

Hlorid u krvnoj plazmi ribe u testu opterećenja morskom vodom

[0063] Mrestilište smolta nije imalo mogućnost da izvede test u morskoj vodi, i uzorci nisu uzeti. Joni u krvnoj plazmi ribe u slatkoj vodi

[0064] Nisu uzeti uzorci jona u plazmi ribe u slatkoj vodi.

Stopa mortaliteta u slatkoj vodi i morskoj vodi

[0065] Mortalitet u fazi slatke vode bio je normalan. Posle 60 dana u moru, stopa smrtnosti bila je 0.62% za ribu kojoj je davana ispitivana dijeta 2 i 0.71% za ribu kojoj je davana kontrolna dijeta a, u slatkoj vodi.

Terenska studija 3

Aktivnost enzima Na+-K+-ATPaze u tkivu škrga.

[0066] Dijagram 8 prikazuje prosečno kretanje aktivnosti enzima Na<+>-K<+>-ATPaze u tkivu škrga u terenskoj studiji 3, sa upotrebom ispitivane dijete 2, upoređene sa kontrolnom dijetom a. Rezultati predstavljaju prosečne vrednosti uzorkovanja iz 3 tanka u slatkoj vodi u test grupi (n = 30/uzorkovanju) i 3 tanka u slatkoj vodi u kontrolnoj grupi (n = 30/uzorkovanju).

[0067] Između tačaka uzorkovanja 11.09.12. i 12.10.12, 11.09.12. i 05.11.12, postojao je značajan porast ATPaze (p = 0.05) u test grupi, dok kontrolna grupa nije ispoljila značajnu promenu ATPaze u intervalu poverenja od 95% (p = 0.05). Između 12.10.12. i 05.11.12, postojala su značajna smanjenja ATPaze u kontrolnoj grupi u intervalu poverenja od 95% (p = 0.05), dok test grupa nije ispoljila značajnu promenu. Tabela 8 daje pregled predmeta diskusije.

Tabela 8: Značajna promena između dve tačke uzorkovanja za ATPazu unutar grupe (p = 0.05 ili p = 0.01). One su upoređene između kontrolne grupe i test grupe. Ostala poređenja između tačaka uzorkovanja u kontrolnoj i test grupi nisu pokazala nikakvu razliku posmatrane značajnosti.

Broj kopija alfa 1a iRNK (ATPaza slatke vode)

[0068] Uzorkovanje je delimično izvedeno za analizu broja kopija alfa 1a iRNK, ATPaze slatke vode, u replikatu 1 i replikatu 2. Rezultati su prikazani na dijagramu 9 i 10. Replikat 1 pokazuje da ispitivana dijeta 2 daje posle dvonedeljne upotrebe (01.10.12,) varijaciju između 441000 – 501 000 kopija alfa-1a iRNK (ATPaza slatke vode). Ovo je znatno ispod granične vrednosti od 1186 000 kopija. Za kontrolnu dijetu a, vidimo da riba eksprimira veliki broj kopija alfa 1a iRNK 12.10.12, a nakon ovoga, ona nishodno reguliše ekspresiju do istog nivoa kao ispitivana dijeta 2.

[0069] Između tačaka uzorkovanja 01.10.12. i 12.10.12, postoji značajan porast eksprimirane alfa 1a iRNK (p = 0.05) u kontrolnoj grupi, dok test grupa nije ispoljila značajnu promenu alfa 1a iRNK u intervalu poverenja od 95% (p = 0.05). Između 01.10.12. i 06.12.12. postoji značajan pad broja kopija alfa 1a iRNK u kontrolnoj grupi u intervalu poverenja od 99% (p = 0.01), dok test grupa nije ispoljila značajnu promenu. Isto važi za poređenje između 12.10.12. i 05.11.12. (u intervalu poverenja od 95%), 12.10.12. i 06.12.12, kao i za poređenje između 05.11.12. i 06.12.12. Test grupa nije pokazala bilo kakve slične promene između tačaka uzorkovanja. Tabela 9 daje pregled predmeta diskusije.

Tabela 9: Značajna promena između dve tačke uzorkovanja za broj kopija alfa 1a iRNK unutar grupe (p = 0.05 ili p = 0.01). One su zatim upoređene između kontrolne grupe i test grupe. Ostala poređenja između tačaka uzorkovanja u kontrolnoj i test grupi nisu pokazala nikakvu razliku posmatrane značajnosti.

[0070] Replikat 2, pokazuje da kontrolna hrana daje od druge nedelje upotrebe (01.10.12.), varijaciju između 1 517 000 do 786000 kopija alfa 1a iRNK (ATPaza slatke vode). Ovo je iznad granične vrednosti tolerancije za morsku vodu (postavljene na 1 186 000 kopija) za prva tri uzorkovanja, dok je poslednje uzorkovanje ispod granične vrednosti. Za ispitivanu dijetu 2, vidimo da riba eksprimira nizak broj kopija alfa 1a iRNK, 05.11.12. i 06.12.12, između 413000 i 396000 kopija. Dijagram 10 daje pregled rezultata.

[0071] Između tačaka uzorkovanja 12.10.12. i 06.12.12, postoji značajan pad ekspresije broja kopija alfa 1a iRNK (p = 0.01) u kontrolnoj grupi. Između 05.11.12. i 06.12.12, nema značajnog smanjenja broja kopija alfa 1a iRNK u kontrolnoj grupi u intervalu poverenja od 95% (p = 0.01), niti u test grupi. Tabela 10 daje pregled predmeta diskusije.

Tabela 10: Značajna promena između dve tačke uzorkovanja za broj kopija alfa 1a iRNK unutar grupe (p = 0.05 ili p = 0.01). One su zatim upoređene između kontrolne grupe i test grupe.

Broj kopija alfa 1a iRNK (ATPaza slatke vode) u odnosu na temperaturu vode

[0072] Rezultati za alfa 1a iRNK iz test grupe i kontrolne grupe su u korelaciji sa temperaturom slatke vode. Dijagram 11 prikazuje procenat udela ovih uzoraka koji su ispod granične vrednosti tolerancije za morsku vodu, 1186 000 kopija alfa 1a iRNK. Grafikon takođe prikazuje temperaturu vode u istom periodu. Pri temperaturama vode između 8.1 i 8.9 °C, 90 i 100% vrednosti u uzorcima u test grupi su ispod granice tolerancije za morsku vodu. Ovaj udeo je bio stabilan tokom procesa smoltifikacije, na isti način na koji je temperatura bila stabilna. Odgovarajuće vrednosti u kontrolnoj grupi bile su između 20% i 100%, i najniži udeo je zapažen na početku perioda posmatranja.

Indikator smolta

[0073] Dijagram 12 prikazuje kretanje indikatora smolta u terenskoj studiji 3, pri upotrebi ispitivane dijete 2, upoređene sa kontrolnom dijetom a, hranom za rast za juvenile proizvođača Skretting as. Rezultati su prosečna vrednost uzorkovanja iz 3 tanka u testu (n = 30/uzorkovanju) i 3 tanka u kontroli (n = 30/uzorkovanju).

[0074] Između 11.09.12. i 01.10.12, postojalo je značajno povećanje indikatora smolta (p = 0.01) u test grupi, dok kontrolna grupa nije ispoljila značajnu promenu indikatora smolta (p = 0.05). Između 01.10.12. i 12.10.12, postojalo je značajno povećanje indikatora smolta (p = 0.05) u kontrolnoj grupi, dok je test grupa ispoljila značajno snažnije povećanje indikatora smolta (p = 0.01). Između 12.10.12. i 06.12.12, postojalo je značajno povećanje indikatora smolta (p = 0.01) u kontrolnoj grupi, dok test grupa nije ispoljila značajnu promenu indikatora smolta (p = 0.05). Tabela 11 daje pregled predmeta diskusije.

Tabela 11: Značajna promena između dve tačke uzorkovanja za indikator smolta unutar grupe (p = 0.05 ili p = 0.01). One su zatim upoređene između kontrolne grupe i test grupe. Ostala poređenja između tačaka uzorkovanja u kontrolnoj i test grupi nisu dala takvu razliku posmatrane značajnosti.

Hlorid u krvnoj plazmi ribe u testu opterećenja morskom vodom

[0075] Dijagrami 13 i 14 prikazuju status hlorida u plazmi u terenskoj studiji 3, nakon izlaganja ribe morskoj vodi od 34‰ tokom 144 časa, sa upotrebom ispitivane dijete 2, upoređen sa kontrolnom dijetom a, 11 nedelja pre izlaganja morskoj vodi. Rezultati su prosečna vrednost uzorkovanja iz 3 tanka u testu (n = 30/uzorkovanju) i 3 tanka iz kontrole (n = 20/uzorkovanju). Prosečne vrednosti u kontrolnoj grupi bile su 139.6 mmol/l hlorida u plazmi, a u test grupi 139.0 mmol/l hlorida u plazmi.

Drugi joni u krvnoj plazmi ribe u slatkoj vodi i morskoj vodi

[0076] Nije zapažena riba sa hemoragičnim sindromom smolta u terenskoj studiji 3. Dijagram 15 prikazuje prosečne nivoe magnezijuma i kalcijuma u krvnoj plazmi lososa u slatkoj vodi i morskoj vodi.

Stopa mortaliteta u slatkoj vodi i morskoj vodi

[0077] Nije zapažen abnormalni mortalitet. Posle 144 časa u morskoj vodi, riba je uništena.

Terenska studija 4

Aktivnost enzima Na+-K+-ATPaze u tkivu škrga

[0078] Dijagram 16 prikazuje kretanje aktivnosti enzima Na -K -ATPaze u tkivu škrga u terenskoj studiji 4, u kojoj je upotreba ispitivane dijete 2 upoređena sa kontrolnom dijetom b, koja predstavlja hranu za rast za juvenile, proizvođača Ewos AS. Rezultati su prosečna vrednost uzorkovanog materijala iz kaveza u slatkoj vodi u testu (n = 20/uzorkovanju), nasuprot kavezu u slatkoj vodi kao kontroli (n = 20/uzorkovanju). Eksperiment je izveden pod uslovima prirodne svetlosti, uglavnom posle jesenje ravnodnevice.

[0079] Između 10.09.12. i 01.10.12, postojala je značajna promena ATPaze (p = 0.01) u test grupi, dok kontrolna grupa tokom istog perioda nije ispoljila značajnu promenu ATPaze (p = 0.05). Između 10.09.12. i 15.10.12, postojala je značajna promena ATPaze u test grupi u intervalu poverenja od 99% (p = 0.01), dok kontrolna grupa nije ispoljila značajnu promenu ATPaze u intervalu poverenja od 95% (p = 0.05). Tabela 12 daje pregled predmeta diskusije.

Tabela 12: Značajna promena između dve tačke uzorkovanja za ATPazu unutar grupe (p = 0.05 ili p = 0.01). One su zatim upoređene između kontrolne grupe i test grupe. Ostala poređenja između tačaka uzorkovanja u kontrolnoj i test grupi nisu dala takvu razliku posmatrane značajnosti.

Broj kopija alfa 1a iRNK (ATPaza slatke vode)

[0080] Uzorkovanje je sprovedeno za analizu broja kopija alfa 1a iRNK, ATPaze slatke vode. Rezultati su prikazani na dijagramu 17. On pokazuje da ispitivana dijeta 2 daje sniženu ekspresiju ATPaze slatke vode, u poređenju sa kontrolnom dijetom b. Kod ispitivane dijete 2, vidimo smanjenje broja kopija alfa 1a iRNK sa 2.59 miliona na 0.67 miliona kopija, znatno ispod granične vrednosti od 1186 000 kopija. Razlika između tačaka uzorkovanja je značajna u intervalu poverenja od 99% (p = 0.01). Upotreba kontrolne dijete b daje marginalno smanjenje broja kopija, sa 2.59 miliona na 2.57 miliona kopija na poslednjoj tački uzorkovanja. Pad nije značajan između tačaka uzorkovanja. Tabela 13 daje pregled predmeta diskusije.

Tabela 13: Značajna promena između dve tačke uzorkovanja za broj kopija alfa 1a iRNK unutar grupe (p = 0.05 ili p = 0.01). One su zatim upoređene između kontrolne grupe i test grupe.

Indikator smolta

[0081] Dijagram 18 prikazuje kretanje indikatora smolta u terenskoj studiji 4, sa upotrebom ispitivane dijete 2, upoređene sa kontrolnom dijetom b. Rezultati su prosečna vrednost uzorkovanog materijala iz kaveza u testu (n = 20/uzorkovanju) i iz kaveza za kontrolu (n = 20/uzorkovanju).

[0082] Između 10.09.12. i 15.10.12, postojalo je značajno povećanje indikatora smolta (p = 0.05) u test grupi, dok kontrolna grupa tokom istog perioda nije ispoljila značajnu promenu indikatora smolta (p = 0.05). Tabela 14 daje pregled predmeta diskusije.

Tabela 14: Značajna promena između dve tačke uzorkovanja za indikator smolta unutar grupe (p = 0.05 ili p = 0.01). One su zatim upoređene između kontrolne grupe i test grupe. Ostala poređenja između tačaka uzorkovanja u kontrolnoj i test grupi nisu dala takvu razliku posmatrane značajnosti.

Hlorid u krvnoj plazmi ribe u testu opterećenja morskom vodom.

[0083] U ovoj terenskoj studiji nije sproveden test opterećenja morskom vodom

Joni u krvnoj plazmi ribe u slatkoj vodi

[0084] Nije bilo uzoraka za analizu jona u krvnoj plazmi, dok je riba ostala u slatkoj vodi.

Stopa mortaliteta u slatkoj vodi i morskoj vodi

[0085] Nije zapažen abnormalni mortalitet u slatkoj vodi. Riba koja je dobijala ispitivanu dijetu 2, prethodno je bila označena zasecanjem masnog peraja. Ova riba je prebačena u isti kavez u moru, kao grupa koja je podvrgnuta manipulaciji svetlošću (različit od kontrolne grupe u slatkoj vodi). Zapažena je stopa mortaliteta od 0.08% od izlaganja do klanja ribe. Stopa mortaliteta javila se odmah nakon izlaganja morskoj vodi.

Terenska studija 5

Aktivnost enzima Na+-K+-ATPaze u tkivu škrga

[0086] Dijagram 19 prikazuje kretanje aktivnosti enzima Na+-K+-ATPaze u tkivu škrga u terenskoj studiji 5, sa upotrebom ispitivane dijete 2, naspram kontrolne dijete b, koje je hrana za rast za juvenile proizvođača Ewos AS. Rezultati su prosečna vrednost uzorkovanog materijala iz 3 tanka u testu, i 2 tanka u kontroli. Pregled broja tankova i broja riba pri svakom uzorkovanju, može se naći u tabeli 15.

Tabela 15: Pregled broja tankova i broja riba, u svakoj tački uzorkovanja u terenskoj studiji 5.

[0087] Između 09.10.12. i 31.10.12, postojalo je značajnije povećanje (p = 0.01) ATPaze u test grupi, dok je kontrolna grupa imala manje značajno povećanje ATPaze (p = 0.05). Slično tome, bilo je između tačaka uzorkovanja 20.11.12. i 04.12.12. Između 20.11.12. i 04.12.12, postojalo je značajno povećanje ATPaze u kontrolnoj grupi u intervalu poverenja od 95% (p = 0.05), dok test grupa nije imala značajno povećanje ATPaze u intervalu poverenja od 95% (p = 0.05). Između 04.12.12. i 18.12.12, obe grupe su imale p-vrednost koja je vrlo slična (p = 0.01), ali je samo kontrolna grupa imala značajno povećanje ATPaze u intervalu poverenja od 99%. Test grupa ima značajno povećanje između tačaka uzorkovanja u intervalu poverenja od 95% (p = 0.05). Osim toga, vidimo da test grupa ima značajno povećanje (p = 0.01) ATPaze između 12.12.12. i 18.12.12, dok kontrolna grupa nema značajno povećanje ni u jednom od intervala poverenja od 95 ili 99% (p = 0.05 i 0.01). Tabela 16 daje pregled predmeta diskusije.

Tabela 16: Značajna promena između dve tačke uzorkovanja za ATPazu unutar grupe (p = 0.05 ili p = 0.01). One su zatim upoređene između kontrolne grupe i test grupe. Ostala poređenja između tačaka uzorkovanja u kontrolnoj i test grupi nisu dala takvu razliku posmatrane značajnosti.

Aktivnost enzima Na+-K+-ATPaze u tkivu škrga u svakom replikatu

[0088] Dijagram 20 prikazuje kretanje aktivnosti enzima Na -K -ATPaze u tkivu škrga u replikatu 1, sa upotrebom ispitivane dijete 2, u poređenju sa kontrolnom dijetom b.

[0089] Između 09.10.12. i 31.10.12, postojalo je značajno povećanje (p = 0.01) ATPaze u test grupi, dok je kontrolna grupa jedino imala značajno povećanje ATPaze u intervalu poverenja od 95% (p = 0.05). Između tačaka uzorkovanja 31.10.12. i 27.11.12, kao i između 20.11.12. i 27.11.12, postojalo je značajno povećanje u intervalu poverenja od 99% u test grupi, dok kontrolna grupa nije imala nikakvo značajno povećanje. Tabela 17 daje pregled predmeta diskusije.

Tabela 17: Značajna promena između dve tačke uzorkovanja za ATPazu unutar grupe (p = 0.05 ili p = 0.01). One su zatim upoređene između kontrolne grupe i test grupe. Ostala poređenja između tačaka uzorkovanja u kontrolnoj i test grupi nisu dala takvu razliku.

[0090] Dijagram 21 prikazuje kretanje aktivnosti enzima Na -K -ATPaze u tkivu škrga u replikatu 2a, sa upotrebom ispitivane dijete 2, upoređene sa kontrolnom dijetom b.

[0091] Između 09.10.12. i 31.10.12, postojalo je značajno povećanje (p = 0.05) ATPaze u test grupi, dok kontrolna grupa nije imala značajno povećanje ATPaze (p = 0.05). Slično tome je bilo između tačaka uzorkovanja 20.11.12. i 04.12.12. Tabela 18 daje pregled predmeta diskusije.

Tabela 18: Značajna promena između dve tačke uzorkovanja za ATPazu unutar grupe (p = 0.05 ili p = 0.01). One su zatim upoređene između kontrolne grupe i test grupe. Ostala poređenja između tačaka uzorkovanja u kontrolnoj i test grupi nisu dala takvu razliku posmatrane značajnosti.

[0092] Dijagram 22 prikazuje kretanje aktivnosti enzima Na -K -ATPaze u tkivu škrga u replikatu 2b, pri upotrebi ispitivane dijete 2, u poređenju sa kontrolnom dijetom b.

[0093] Između 20.11.12. i 18.12.12, postojalo je značajno povećanje u intervalu poverenja od 99% (p = 0.01) ATPaze u test grupi, dok je kontrolna grupa imala značajno povećanje ATPaze u intervalu poverenja od 95% (p = 0.05). U tačkama uzorkovanja 12.12.12. i 18.12.12. test grupa je imala značajno povećanje u intervalu poverenja od 95% (p = 0.05), dok u kontrolnoj grupi nije bilo značajnog povećanja (p = 0.05). Tabela 19 daje preglede teme.

Tabela 19: Značajna promena između dve tačke uzorkovanja za ATPazu unutar grupe (p = 0.05 ili p = 0.01). One su zatim upoređene između kontrolne grupe i test grupe. Ostala poređenja između tačaka uzorkovanja u kontrolnoj i test grupi nisu dala takvu razliku posmatrane značajnosti.

Broj kopija alfa 1a iRNK (ATPaza slatke vode) u odnosu na temperaturu vode.

[0094] Uzorkovanje je sprovedeno samo u test grupi, koja je dobijala ispitivanu dijetu 2. Analiziran je broj kopija alfa 1a iRNK, (ATPaza slatke vode). Dijagram 23 prikazuje udeo ovih uzoraka koji su ispod granične vrednosti tolerancije za morsku vodu, 1 186 000 kopije alfa 1a iRNK. Dijagram takođe prikazuje temperaturu vode u istom periodu. Prve dve nedelje, temperatura vode bila je iznad 6 °C. Posle 2 nedelje hranjenja, 83 i 100% uzoraka bilo je ispod granice tolerancije za morsku vodu. Ovaj udeo je dalje opadao tokom procesa smoltifikacije, što se poklapa sa opadajućom temperaturom vode.

Indikator smolta

[0095] Dijagram 24 prikazuje kretanje indikatora smolta u terenskoj studiji 5, u kojoj je korišćena ispitivana dijeta 2, upoređena sa kontrolnom dijetom b. Rezultati su prosečna vrednost uzorkovanja iz 3 tanka u testu i 2 tanka u kontroli. Tabela 14 daje pregled broja tankova, i broja riba, u svakoj tački uzorkovanja.

[0096] Između 20.11.12. i 12.12.12, postojalo je značajno povećanje indikatora smolta u intervalu poverenja od 99% (p = 0.01) u kontrolnoj grupi, dok je test grupa u istom periodu imala značajno povećanje indikatora smolta u intervalu poverenja od 95% (p = 0.05). Između 04.12.12. i 12.12.12, postojalo je značajno povećanje indikatora smolta u intervalu poverenja od 99% (p = 0.01) u kontrolnoj grupi, dok test grupa u istom periodu nije imala značajno povećanje indikatora smolta u intervalu poverenja od 95% (p = 0.05). Tabela 20 daje pregled predmeta diskusije.

Tabela 20: Značajna promena između dve tačke uzorkovanja za indikator smolta unutar grupe (p = 0.05 ili p = 0.01). One su zatim upoređene između kontrolne grupe i test grupe. Ostala poređenja između tačaka uzorkovanja u kontrolnoj i test grupi nisu dala takvu razliku posmatrane značajnosti.

Hlorid u krvnoj plazmi ribe u testu opterećenja morskom vodom

[0097] U ovoj studiji, test opterećenja morskom vodom nije sproveden.

Joni u krvnoj plazmi ribe u slatkoj vodi

[0098] U ovoj studiji, nije bilo uzorkovanja za analizu jona u krvnoj plazmi

Stopa mortaliteta u slatkoj vodi i morskoj vodi

[0099] Nije zapažen nikakav abnormalni mortalitet u slatkoj vodi. Nije zapažena ni riba obolela od HSS. Pregled mortaliteta za proizvodnju u morskoj vodi naveden je u tabeli 21, za one tankove koji se mogu pratiti do upotrebe ispitivane i kontrolne dijete u slatkoj vodi.

Tabela 21: Pregled mortaliteta u morskoj vodi nakon prebacivanja, za deo eksperimentalnog materijala u slatkoj vodi.

Terenska studija 6

Aktivnost enzima Na+-K+-ATPaze u tkivu škrga

[0100] Dijagram 25 prikazuje kretanje aktivnosti enzima Na+-K+-ATPaze u tkivu škrga u terenskoj studiji 6, sa upotrebom ispitivane dijete 2, upoređene sa kontrolnom dijetom b, koja predstavlja hranu za rast za juvenile proizvođača Ewos AS. Rezultati su prosečna vrednost uzorkovanje iz jednog kaveza u slatkoj vodi u testu (n = 20/uzorkovanju), nasuprot jednom kavezu u slatkoj vodi kao kontroli (n = 20/uzorkovanju). Eksperiment je poređenje dva proizvodna postupka, budući da riba u test grupi dobija kontinuirano svetlo i ispitivanu dijetu 2, dok riba u kontrolnoj grupi dobija klasičnu manipulaciju svetlom (prvo zimski signal, praćen letnjim signalom) u kombinaciji sa kontrolnom dijetom b (uobičajena hrana za rast).

[0101] Najviša izmerena prosečna vrednost ATPaze javila se oko 5 nedelja ranije u test grupi nego u kontrolnoj grupi. Test grupa reaguje značajnim povećanjem (p = 0.01) ATPaze, dve nedelje nakon što je dobila ispitivanu dijetu 2. Kontrolna grupa je odgovorila značajnim povećanjem (p = 0.01) ATPaze 6 nedelja nakon što je primila letnji signal. Tabela 22 daje pregled predmeta diskusije.

Tabela 22: Značajna promena između dve tačke uzorkovanja za ATPazu unutar grupe (p = 0.05 ili p

= 0.01).

Broj kopija alfa 1a iRNK (ATPaza slatke vode)

[0102] Sprovedeno je uzorkovanje za analizu broja kopija alfa 1a iRNK (ATPaze slatke vode). Rezultati su prikazani na dijagramu 26. On pokazuje da ispitivana dijeta 2 kombinovana sa kontinuiranim svetlom, daje nižu ekspresiju ATPaze slatke vode, u poređenju sa kontrolnom dijetom b i klasičnom manipulacijom svetlošću. Kod ispitivane dijete 2 vidimo smanjenje broja kopija alfa 1a iRNK sa 6.07 miliona u prvom uzorkovanju, na 0.75 miliona kopija u poslednjem uzorkovanju, znatno ispod granične vrednosti za toleranciju morske vode od 1,186 miliona kopija. Razlike između tačaka uzorkovanja u test grupi su značajne u intervalu poverenja od 99% (p = 0.01), i podudaraju se sa povećanjem aktivnosti enzima ATPaze.

[0103] Upotreba kontrolne dijete b daje povećanje broja kopija, sa 2.49 miliona u prvom uzorkovanju, na 2.98 miliona kopija u poslednjem uzorkovanju. Najniža prosečna vrednost zabeležena je 23.10.13, sa 1.76 miliona kopija, podudarajući se sa značajnim povećanjem aktivnosti enzima ATPaze. Smanjenje između 26.08.13. i 23.10.13. je u intervalu poverenja od 99% (p = 0.01), dok smanjenje od 12.09.13. (što je početak letnjeg signala) do 23.10.13. nije značajno (p = 0.05). Tabela 23 daje preglede teme.

Tabela 23: Značajna promena između dve tačke uzorkovanja za broj kopija alfa 1a iRNK unutar grupe (p = 0.05 ili p = 0.01).

Indikator smolta

[0104] Dijagram 27 prikazuje kretanje indikatora smolta u terenskoj studiji 6. Rezultati su prosečna vrednost uzorkovanja iz jednog kaveza u slatkoj vodi kao test (n = 20/uzorkovanju), nasuprot jednog kaveza u slatkoj vodi kao kontrola (n = 20/uzorkovanju).

[0105] I test grupa i kontrolna grupa imaju značajno povećanje indikatora smolta u intervalu poverenja od 99% (p = 0.01) između tačaka uzorkovanja 26.08.13. i 23.09.13. Test grupa je prebačena u morsku vodu posle 23.09.13, dok je kontrolna grupa prebačena u morsku vodu pet nedelja nakon test grupe. Tokom ovog perioda, zapaženo je nekoliko značajnih povećanja indikatora smolta između nekoliko tačaka uzorkovanja u kontrolnoj grupi. Tabela 24 daje pregled predmeta diskusije.

Tabela 24: Značajna promena između dve tačke uzorkovanja za indikator smolta unutar grupe (p =

0.05 ili p = 0.01).

Hlorid u krvnoj plazmi ribe u testu opterećenja morskom vodom.

[0106] U ovoj studiji nije sproveden test opterećenja morskom vodom.

Joni u krvnoj plazmi ribe u slatkoj vodi

[0107] U ovoj studiji nije sprovedeno uzorkovanje za analizu jona u krvnoj plazmi

Stopa mortaliteta u slatkoj vodi i morskoj vodi

[0108] Nije zapažen nikakav abnormalni mortalitet u slatkoj vodi. Nije zapažena ni riba obolela od HSS. Tabela 25 daje pregled mortaliteta za proizvodnju u morskoj vodi.

Tabela 25: Pregled mortaliteta u morskoj vodi nakon prebacivanja iz slatke vode.

Diskusija

Izbor metoda i evaluacija procesa smoltifikacije

[0109] Prisustvo CaSR u različitim organima udruženim sa osmoregulacijom i endokrinom aktivnošću povezanom sa procesom smoltifikacije, pokazano je u metodu SuperSmolt®, i poznat je način na koji je moguće uticati na ove ćelije upotrebom jona i aminokiselina koje stimulišu CaSR. Metod SuperSmolt® takođe obezbeđuje povećanje aktivnosti enzima Na<+>-K<+>-ATPaze, povećanje indikatora smolta, ponašanje smolta u slatkoj vodi, normalnu osmoregulaciju u morskoj vodi (34 ‰), i dobro preživljavanje (1% mortaliteta < nakon 30 dana) i rast u proizvodnji u morskoj vodi. Sve ovo su tradicionalni parametri kojima se procenjuje da li je riba zadovoljavajuće smoltifikovana, ili nije. Iskustvo iz 2002. do 2014, sa više od 300 miliona supersmoltifikovanih lososa, podržava stav da ovaj postupak koji uključuje dodavanje soli u radnu vodu može da funkcioniše kao proces smoltifikacije.

[0110] U proceni efikasnosti hrane za ribe predmetnog pronalaska, primenjen je pristup sličan pristupu korišćenom za procenu efikasnosti metoda SuperSmolt®, upotrebom znanja povezanog sa CaSR, kombinovanog sa tradicionalnim parametrima smoltifikacije.

[0111] U tri od šest terenskih eksperimenata, ispitivane hrane su korišćene u kombinaciji sa tradicionalnom manipulacijom svetlošću. U ovim slučajevima, moramo da pretpostavimo da riba ima endokrinu aktivnost koja odgovara normalnom procesu smoltifikacije. U ostalim eksperimentima, korišćeno je kontinuirano svetlo ili prirodno svetlo posle jesenje ravnodnevice, pri čemu oba od ovih uslova predstavljaju izazov za dobijanje zadovoljavajućeg procesa smoltifikacije, i sposobnosti za normalnu osmoregulaciju, preživljavanje i rast posle prebacivanja u morsku vodu.

[0112] Kada se pojam "smoltifikacija" koristi u vezi sa upotrebom ispitivane dijete 2, on podrazumeva da endokrina aktivnost u eksperimentalnom materijalu nije ispitana, već se oslanja na promene u tradicionalnim parametrima smolta. Prema tome, priroda rada ima praktičan pristup smoltifikaciji u proizvodnji smolta, pre nego potpuni uvid u fiziološke faktore vezane za stvarni proces smoltifikacije.

Dejstvo ispitivane dijete 1 i 2 na proces smoltifikacije, u poređenju sa klasičnom manipulacijom svetlošću

[0113] U terenskoj studiji 1, ispitivana dijeta 1 se koristi u kombinaciji sa uobičajenom manipulacijom svetlošću, dok se u terenskoj studiji 2 i 5, ispitivana dijeta 2 koristi u kombinaciji sa uobičajenom manipulacijom svetlošću.

Terenska studija 1:

[0114] Ispitivana dijeta 1 nije dala značajna povećanja aktivnosti enzima Na<+>-K<+>-ATPaze, a slično je bilo i u kontrolnoj grupi. Slični rezultati su zapaženi za povećanje indikatora smolta. Nisu zapažene značajne promene hlorida u plazmi, posle 96 časova testa opterećenja morskom vodom u morskoj vodi sa 35‰. I kontrolna grupa i test grupa bile su u normalnom opsegu hlorida u plazmi, 120-150 mmol/l. Međutim, zapaženo je da je riba koja je dobijala ispitivanu dijetu 1 u periodu smoltifikacije, imala prosečno više od 20 puta viši mortalitet udružen sa bolešću HSS, u poređenju sa kontrolnom grupom. Eksperimenti su sprovedeni na temperaturi vode od 3-5 °C, koja bi trebalo da dovede do prosečnog unosa hrane od 0.2-0.4% dnevno, za ribu ove veličine (tabela ishrane Skretting, 2009).

[0115] Međutim, unos hrane je dovoljno veliki da bi se uočila povećana smrtnost u test grupi, i nije verovatno da bi povećana temperatura vode, sa povećanim unosom hrane, trebalo da bude korisna za preživljavanje u test grupi. Ukupno uzevši, opservacije pružaju osnovu da se tvrdi da sama ispitivana hrana 1 nije pogodna dijeta za stimulaciju procesa smoltifikacije kod salmonida. Ispitivana ishrana 1 je vrsta hrane koja se koristi u metodi SuperSmolt®, ali u kombinaciji sa Ca2+ i Mg2+ dodatim u radnu vodu.

Terenska studija 5:

[0116] Ispitivana dijeta 2 je korišćena u terenskoj studiji 5. U ovom eksperimentu, temperatura vode bila je između 8-6 °C tokom prve dve nedelje u procesu smoltifikacije (nakon datog letnjeg signala), zatim je temperatura vode prvo opala na 4 °C, a zatim na 3 °C. Pad temperature se smatra signalom spoljašnje sredine koji ometa proces smoltifikacije. Smanjenje temperature vode rezultovalo je smanjenim uzimanjem hrane, ali izgleda da su prve dve nedelje sa najvišim temperaturama i relativno visok unos hrane ispitivane dijete 2, bili kritični za to kako će se proces smoltifikacije odvijati. Povećanje enzimske aktivnosti ATPaze bilo je znatno veće između tačaka uzorkovanja, rano u procesu smoltifikacije, kod ribe koja je dobila ispitivanu dijetu 2 (značajno u intervalu poverenja od 99%), u poređenju sa kontrolnom grupom (značajno u intervalu poverenja od 95%). Indikator smolta nije pokazao odgovarajuće povećanje u korist ispitivane dijete 2. Rezultat indikatora smolta je u izvesnom stepenu subjektivno procenjivan i varijacija rezultata između različitih uzorkivača u mrestilištu-domaćinu je mogla da odigra ulogu. Materijal uzorka u drugom delu perioda smoltifikacije bio je takođe ograničen (n = 10) u svakoj grupi. Indikator smolta se retko koristi za odlučivanje o vremenu prebacivanja u morsku vodu, već je pre dodatni parametar u procesu smoltifikacije.

[0117] Zbog zadovoljavajućeg statusa smolta kod ribe koja je dobila ispitivanu dijetu 2, test grupa u replikatima 1 i 2a prebačena je u morsku vodu, respektivno 3 i 2 nedelje ranije od kontrolnih grupa. Test grupa u replikatu 2b, prebačena je u isto vreme kao kontrolna grupa. Međutim, na osnovu vrednosti ATPaze, prebacivanje u morsku vodu test grupe bilo je moguće 4 nedelje pre kontrolne ribe.

[0118] Procentni udeo uzoraka alfa 1a iRNK (ATPaza slatke vode) u test grupi, sa nižom vrednošću od 1.186 miliona kopija, raste značajno od početka i do druge tačke uzorkovanja (oko 2 nedelje) (dijagram 23). Ovo je period sa temperaturom vode od 6 °C. Kako temperatura vode pada, procentualni udeo ribe sa alfa 1a iRNK (ATPaza slatke vode) nižom od 1.186 miliona kopija, takođe opada. Ovo zapažanje može direktno da se poveže sa unosom hrane kod ribe, budući da smanjenje temperature vode smanjuje unos hrane. U isto vreme, vidimo da ispitivana dijeta 2 daje dodatni stimulans ribi u test grupi, koji se pokazao kao dodatni podsticaj u proizvodnji enzima ATPaze, u odnosu na kontrolnu grupu.

[0119] U praktičnom uzgoju, prebacivanja u kasnu jesen mogu da budu problematična u odnosu na postizanje zadovoljavajuće veličine ribe u moru pre zimske sezone. Takve ribe imaju veću sklonost ka nastanku rana prouzrokovanih zimom, nego ribe koje su došle u more ranije u jesen. Prebacivanja u ranu jesen omogućavaju da se u većoj meri iskoriste veće temperature morske vode početkom jeseni, i da se dobiju veće stope rasta i skraćeno vreme proizvodnje od prebacivanja do klanja. Prebacivanja u kasnu jesen, povezana sa padom temperature slatke vode i teškoćama u procesu smoltifikacije, uobičajena su u proizvodnji smolta. Test dijeta 2 je sredstvo za postizanje ranijeg vremena prebacivanja, pri padu temperature vode u jesen.

[0120] Stopa mortaliteta u morskoj vodi, redom, 30, 60 i 90 dana nakon prebacivanja, bila je zadovoljavajuća i za test grupu i za kontrolnu grupu. Međutim, riba kojoj je davana ispitivana dijeta 2 u slatkoj vodi, imala je niže stope mortaliteta nego kontrolna grupa. Što je duže bilo vreme boravka u morskoj vodi, to je veća bila procentna razlika u mortalitetu. Status smolta može da utiče na preživljavanje u morskoj vodi, i postoji povećan rizik za sekundarne probleme povezane sa slabom sposobnošću osmoregulacije. Osim toga, ovi rezultati podržavaju stav da je ispitivana dijeta 2 bezbedna za upotrebu, i ne utiče negativno na proizvodnju.

Terenska studija 2:

[0121] Terenska studija 2 je sprovedena na kalifornijskoj pastrmci. Ova riba je dobila zimski signal upotrebom prirodnog zimskog svetla na južnoj hemisferi (pre prolećne ravnodnevice). Nakon toga je dobila dodatno svetlo, koje je služilo kao letnji signal. Ispitivana dijeta 2 je korišćena kao dodatni stimulans u periodu letnjeg signala. Nije uobičajeno govoriti o procesu smoltifikacije kod kalifornijske pastrmke, ali je činjenica da kalifornijska pastrmka mora da odgovori istim fiziološkim odgovorima kao losos, kada se prebacuje u morsku vodu. Preadaptacija u slatkoj vodi, pre prebacivanje ribe u morsku vodu, izgleda kao mudra strategija za smanjenje stresa osmoregulacije kod kalifornijske pastrmke. Test grupa prikazuje značajno povećanje enzimske aktivnosti ATPaze jednu nedelju ranije, u poređenju sa kontrolnom grupom.

[0122] Mrestilište ima proceduru za izdvajanje razvrstavanjem najmanje ribe u grupi riba, pre prebacivanja u more. Ova praksa izaziva stres kod ribe i dovodi do pada enzimske aktivnosti ATPaze, i tako potvrđuje prethodno iskustvo. I test grupa, i kontrolna grupa odgovorile su numeričkim smanjenjem količine enzima ATPaze nakon stresora. Međutim, samo kontrolna grupa ima pad ATPaze, koji je značajan u intervalu poverenja od 99%. Pad u enzimskoj aktivnosti ATPaze u test grupi nije značajan. Porast ATPaze poslednje nedelje pre prebacivanja u morsku vodu u kontrolnoj grupi nije značajan, ali se može smatrati mogućim oporavkom nakon stresora. Kalifornijska pastrmka se prvi put nakon prebacivanja u more izlaže mršavljenju (nazvanom „glava čiode“). Takve ribe mogu dugo da prežive u morskoj vodi, ali jedu loše i ne rastu normalno. Nije ih lako ukloniti iz kaveza; obično prate proizvodnju sve do vremena izlova. Tada se broje sve ribe, i otkriva se prava razmera problema sa „glavom čiode“. Ovo stanje bolesti nije u potpunosti shvaćeno. Međutim, pretpostavlja se da je loša osmoregulacija u morskoj vodi glavni faktor. U ovoj terenskoj studiji, stopa mortaliteta u morskoj vodi 60 dana nakon prebacivanja bila je zadovoljavajuća i za test i za kontrolnu grupu, ali je najniža smrtnost uočena u test grupi.

[0123] Terenska studija 2 ukazuje da ispitivana dijeta 2 predstavlja sredstvo za bolju preadaptaciju kalifornijske pastrmke na život u morskoj vodi, u poređenju sa tradicionalnim metodom proizvodnje.

Dejstvo ispitivane dijete 2 na proces smoltifikacije bez upotrebe manipulacije svetlošću, kao i dejstvo ispitivane dijete 2 na desmoltifikaciju.

[0124] Terenske studije 3, 4 i 6 su eksperimenti sprovedeni bez upotrebe manipulacije svetlošću u procesu smoltifikacije.

Terenska studija 3

[0125] Riba u terenskoj studiji 3, smeštena u tank van zgrade mrestilišta, bila je izložena kontinuiranoj veštačkoj svetlosti. Zatim je riba premeštena unutra, i nastavila je da dobija veštačko svetlo 24 časa/dan. Eksperiment je sproveden dok je riba bila unutra. Kontinuirano svetlo je normalno nedovoljno za postizanje zadovoljavajućeg procesa smoltifikacije, ali je poznato da takvi uslovi kombinovani sa višom temperaturom vode (> 8 °C), mogu da obezbede ribu sa visokom enzimskom aktivnošću ATPaze u škrgama. Takva riba može da ostvari normalnu osmoregulaciju u morskoj vodi. Međutim, takve grupe ribe često imaju nehomogeni status smolta u grupi, nepogodan za prebacivanje u more.

[0126] Jedan aspekt koji može da bude značajan je to da se riba drži u avgustu i septembru pod tamnim noćnim nebom. Ovo bi moglo da bude shvaćeno kao zimski signal, uprkos snabdevanju relativno skromnom količinom svetla iz veštački dodatog svetla u tanku, u poređenju sa mrakom noćnog neba. Pri prebacivanju u mrestilište u zgradi i u uslovima kontinuirano stabilnog svetla bez varijacije, riba prihvata stimulans kao letnji signal. Slično, to doprinosi procesu smoltifikacije. Bez obzira na uslove osvetljenja, sa razumnom sigurnošću, smatra se da je ova riba dobila suboptimalni režim upravljanja svetlošću, u poređenju sa onim što je standard za upravljanje svetlošću kod smolta.

[0127] Ispitivana dijeta 2 obezbeđuje raniju i višu enzimsku aktivnost ATPaze, u poređenju sa kontrolnom grupom. Ovo važi tokom eksperimentalnog perioda od 11 nedelja. Postoji značajno povećanje u test grupi rano u procesu smoltifikacije (između prve i treće tačke uzorkovanja), dok je jedina značajna promena u kontrolnoj grupi pad ATPaze između treće i četvrte tačke uzorkovanja. Kod ispitivane dijete 2, postoji odgovarajući odgovor ATPaze kao onaj koji je zapažen u terenskoj studiji 2 i 5.

[0128] Dodatno, vidimo da se indikator smolta u test grupi povećava značajno između prve i druge tačke uzorkovanja, dok kontrolna grupa nije ispoljila nikakvu značajnu promenu. Između druge i treće tačke uzorkovanja postoji jače značajno povećanje u test grupi (u intervalu poverenja od 99%), nego u kontrolnoj grupi (u intervalu poverenja od 95%). U ovom slučaju, porast indikatora smolta u test grupi, javlja se ranije nego u kontrolnoj grupi i podudara se sa povećanjem enzimske aktivnosti ATPaze. Procenu indikatora smolta radi ista osoba pri svakom uzorkovanju (osim prvog uzorkovanja) i materijal koji čine podaci je 3 puta veći nego u terenskoj studiji 5 (n = 30 nasuprot n = 10). Ovo pojačava ovo zapažanje, u poređenju sa nedostatkom dejstva ispitivane dijete 2, koje ona očigledno ima na indikator smolta u terenskoj studiji 5.

[0129] U materijalima koji su ispitivani na broj kopija alfa 1a iRNK (ATPaza slatke vode) vidimo da je udeo testova koji imaju niže brojeve od 1,186 miliona kopija, praktično stabilan tokom eksperimentalnog perioda od 11 nedelja, u poređenju sa kontrolnom grupom (grafikon 11). Nažalost, nema polaznog uzorkovanja u eksperimentu, ali drugo uzorkovanje replikata 2, ukazuje na visok broj kopija pre početka studije. Nasuprot terenskoj studiji 5, koja ima temperaturu vode koja opada ispod 6 °C, ovde imamo stabilnu temperaturu vode između 8.3-8.9 °C. Temperatura vode ima uticaj na uzimanje hrane, i na 8 °C uzimanje hrane je stabilno, što se ponekad ne postiže u terenskoj studiji 5. Razumno je pretpostaviti da ovo ima veliki značaj za stabilan procentni udeo uzoraka koji imaju nižu vrednost od 1,186 miliona kopija alfa 1a iRNK (granična vrednost za toleranciju morske vode). Ovaj rezultat je izgleda direktno povezan sa uzimanjem ispitivane dijete 2, i ne može se postići upotrebom uobičajene hrane za rast. Ovo ilustruje postojanje mogućnosti da se riba održava u okviru stadijuma smolta, dok ostaje u slatkoj vodi tokom dužeg perioda. Ovo ima svoju specifičnu primenu u praktičnoj proizvodnji smolta, zahvaljujući činjenici da riba ne podleže desmoltifikaciji, što je praćeno usklađenim statusom smolta u celoj ribljoj populaciji u tanku. Ovaj aspekt je značajan za rast i preživljavanje u morskoj vodi, ali obezbeđuje i fleksibilno vreme prebacivanja smolta u morsku vodu. S obzirom na pravilnu temperaturu vode, vodenu sredinu i dobro zdravlje ribe, verovatno će biti moguće proizvesti stadijum post-smolta (1-2 kg) u slatkoj vodi za isporuku pomorskim objektima, ili proizvodnju lososa u slatkoj vodi sve do veličine za izlov (> 2 kg).

[0130] Vidimo da je kontrolna grupa kroz eksperimentalni period imala značajno povećanje i smanjenje ATPaze slatke vode, dok test grupa nije ispoljila nikakve značajne promene. Ovo je verovatno zbog činjenice da prva tačka uzorkovanja nedostaje za oba replikata 1 i 2 za ovu vrstu analize, i da ispitivana dijeta 2 održava ribu na stabilnom niskom nivou ATPaze slatke vode (grafikon 9 i 10). Međutim, kontrolna grupa snižava nivo ATPaze slatke vode do oko istog nivoa kao test grupa posle 11 nedelja eksperimenta. Ovo je možda zbog toga što je riba ušla u proces smoltifikacije koji je trajao oko 654 dana° od vremena kada je riba premeštena u zgradu mrestilišta (pretpostavljeni početak letnjeg signala). Normalno, riba dostiže okvir stadijuma smolta posle 350 dana° pri letnjem signalu. Poredeći enzimsku aktivnost ATPaze sa ATPazom slatke vode u istom periodu, vidimo da je enzimska aktivnost ATPaze 7.7 u kontrolnoj grupi, dok test grupa ima vrednost od 9.2 pri poslednjem uzorkovanju. Nivo kontrolne grupe ukazuje na desmoltifikaciju, alternativno, riba je bila izložena negativnom uticaju sredine, a u takvim slučajevima uobičajeno je značajno smanjenje enzimske aktivnosti ATPaze. Nivoi ATPaze slatke vode ne podržavaju desmoltifikaciju, pre je suprotno. Najverovatniji razlog pada enzimske aktivnosti ATPaze je stresor. Takav stresor može da bude velika gustina u malim eksperimentalnim tankovima. Ovo je slično zapažanju nastalom pri razvrstavanju kalifornijske pastrmke u terenskoj studiji 2, u kojoj riba hranjena ispitivanom dijetom 2 održava viši nivo ATPaze uprkos dodatnom stresoru, u poređenju sa kontrolnom grupom.

[0131] Riba u terenskoj studiji 3 nije prebačena u morsku vodu za dalju proizvodnju. Međutim, pre uništavanja riblje grupe, sproveden je test opterećenja morskom vodom. Ovaj test pokazuje zadovoljavajuće nivoe hlorida u plazmi (120-150 mmol/l) i u kontrolnoj grupi i u test grupi (dijagram 14). Vidimo da trend u materijalu iz kontrolne grupe u osnovi pokazuje da veličina ribe utiče pozitivno na nivo hlorida u plazmi, u poređenju sa onim što je zapaženo u test grupi (dijagram 13). Ovo je zapažanje koje podržava stav da ispitivana dijeta 2 povećava sposobnost ribe za osmoregulaciju u morskoj vodi..

Terenska studija 4

[0132] Terenska studija 4 se sprovodi pri opadajućoj temperaturi vode i pri opadajućoj dužini dana posla jesenje ravnodnevice. Riba je više izložena mraku nego svetlu tokom dana, i proporcija mraka raste svakog dana tokom test perioda. I temperatura vode i smanjena dužina dana su negativni signali za proces smoltifikacije. Postoji značajno povećanje u intervalu poverenja od 99% u enzimskoj aktivnosti ATPaze kod ribe hranjene ispitivanom dijetom 2, dok kontrolna riba ne pokazuje nikakvu značajnu promenu enzimske aktivnosti ATPaze. Kod ispitivane dijete 2, ovi nalazi su slični onima zapaženim u terenskoj studiji 3.

[0133] Postoji značajno povećanje indikatora smolta između prvog i poslednjeg uzorkovanja kod ribe hranjene ispitivanom dijetom 2, dok kod kontrolne ribe nema promena indikatora smolta u istom periodu. Kod ispitivane dijete 2, ovo je sličan odgovor kao onaj koji je zapažen u terenskoj studiji 3.

[0134] Uzorci analizirani na alfa 1a iRNK (ATPaza slatke vode), pokazuju za ispitivanu dijetu 2, značajno smanjenje u intervalu poverenja od 99% između tačaka uzorkovanja. Ovaj pad nije zapažen u kontrolnoj grupi. Drugo uzorkovanje u test grupi (oko 2 nedelje nakon početka) je ispod granične vrednosti za toleranciju morske vode, od 1.186 miliona kopija ATPaze slatke vode. Ovaj odgovor je zapažen u terenskoj studiji 3, kao i u terenskoj studiji 5.

[0135] Pri prebacivanju u morsku vodu, stopa mortaliteta bila je veoma niska tokom cele proizvodnje, sve do izlova.

[0136] Ukupno uzevši, ovaj eksperiment pokazuje da je ispitivana dijeta 2 sigurna za upotrebu u uobičajenoj proizvodnji, kao i da ispoljava dejstvo na smoltifikaciju, uprkos odsustvu uobičajenih signala za smoltifikaciju. U praktičnom uzgoju, riba će povremeno primati nepotpune signale za smoltifikaciju (nedostajući/nepotpuni zimski signal i letnji signal), i u takvim situacijama, ispitivana dijeta 2 može da se koristi da to kompenzuje.

Terenska studija 6:

[0137] Terenska studija 6 je sprovedena da bi se uporedila dva različita metoda proizvodnje, kontinuirano svetlo u kombinaciji sa ispitivanom dijetom 2, u poređenju sa tradicionalnom manipulacijom svetlošću i običnom hranom za rast. Ova proizvodnja se odvija na otvorenom, u kavezima u slatkoj vodi. Riba u test grupi je dobijala kontinuirano svetlo. Pored toga, proces smoltifikacije se završava pre jesenje ravnodnevice. Prema tome, riba je izložena dužim danima nego noćima. Riba u kontrolnoj grupi dobijala je prirodno svetlo do 12. septembra 2012, a mrak tokom noći u ovom periodu služio je kao zimski signal. Kada se izloži veštačkom svetlu, riba će ovo prihvatiti kao letnji signal. Glavna svrha ovog eksperimenta je procena da li je moguće prebacivanje ribe u morsku vodu u ranijem stadijumu, u poređenju sa onim što je moguće kod manipulacije svetlošću. Dodatno, svrha je i ispitivanje dejstva ispitivane dijete 2 na smoltifikaciju, i preživljavanje ribe posle prebacivanja u morsku vodu.

[0138] Eksperiment pokazuje da ispitivana dijeta 2 u ovom slučaju može da omogući prebacivanje smolta u morsku vodu 5 nedelja ranije nego kod proizvodnje sa manipulacijom svetlošću. Glavni razlog za ovo je taj što riba ne dobija zimski signal, i stoga može da održi normalan unos hrane. Na taj način, riba dostiže veličinu za vakcinaciju ranije nego riba koja prima zimski signal. Smoltifikacija se odvija nakon sprovođenja vakcinacije. Ovo postrojenje za uzgoj smolta ne može da pruži veštački zimski signal, budući da ima spoljne kaveze u slatkovodnom jezeru. Postrojenje za uzgoj smolta mora da čeka dovoljan broj dana koji daju mrak tokom noći (u avgustu i septembru), i veštački letnji svetlosni signal u procesu smoltifikacije će biti podešen u mesecu septembru, posle zimskog signala. Između prvog i drugog uzorkovanja u test grupi, postoji značajno povećanje enzimske aktivnosti ATPaze u intervalu poverenja od 99%, dok kontrolna grupa nije pokazala nikakvu značajnu promenu ATPaze, u istom periodu (dijagram 25). Kod ispitivane dijete 2, ovo je sličan odgovor kao što je onaj zapažen u terenskoj studiji 3 i 4.

[0139] Indikator smolta ima jednak razvoj u test i kontrolnoj grupi u ovom eksperimentu. Ovo može da bude zbog činjenice da su i test grupa i kontrolna grupa primale više prirodnog dnevnog svetla nego u terenskoj studiji 3, 4 i 5. Poznato je da intenzitet svetla utiče na stepen indikatora smolta. Jako svetlo rezultira većim indikatorom smolta, nego slabo svetlo.

[0140] Uzorci analizirani za alfa 1a iRNK (ATPaza slatke vode) pokazuju za ispitivanu dijetu 2, značajan pad u intervalu poverenja od 99%, između tačaka uzorkovanja. Do ovog pada dolazi i u kontrolnoj grupi, između prvog i drugog uzorkovanja, ali je pad u test grupi brojčano veći nego u kontrolnoj grupi. Pad u test grupi je sa 6.07 miliona na 1.48 miliona kopija između prvog i drugog uzorkovanja. Uporedivo, smanjenje u kontrolnoj grupi je sa 2.5 miliona na 2.23 miliona kopija. Između druge i treće tačke uzorkovanja, nema značajne promene u kontrolnoj grupi, ali u test grupi se pad nastavlja do 0.75 miliona kopija. Promena u test grupi odgovara onoj zapaženoj u terenskoj studiji 3, 4 i 5, ali je donekle odložena u odnosu na ovu drugu. Ovo može da bude zbog velikog broja kopije alfa 1a iRNK koji je zapažen na početku u test grupi, i zbog toga što je potrebno duže vreme da se nishodno reguliše ova ekspresija. Kontrolna grupa nije pala ispod granične vrednosti za toleranciju morske vode, 1,186 miliona kopija alfa 1a iRNK, pri prebacivanju u morsku vodu. Poznato je i da korelacija između enzimske aktivnosti ATPaze i alfa 1a iRNK u ribi izloženoj manipulaciji svetlošću obrazuje krivu u-oblika. Za vrednosti ATPaze od 1-9, javlja se sniženi broj kopija iRNK, dok se za vrednosti ATPaze od 9-22, javlja rastući broj kopija iRNK. Verovatno je da riba funkcioniše sa dualnom strategijom u oblasti vrednosti ATPaze između 9-20, i postiže i desmoltifikaciju u slatkoj vodi, i život u morskoj vodi. Ovo stvara teškoće u pronalaženju donjeg nivoa ATPaze slatke vode pri uzorkovanju i to može da bude slučaj u ovom eksperimentu. U isto vreme, vidimo da riba nema nivo enzima ATPaze veći od 8,29, i ovo ukazuje na to da nije bila spremna za morsku vodu u vreme prebacivanja. Pa ipak, kontrolna grupa je pokazala dobro preživljavanje i rast u morskoj vodi. Tada se može smatrati da je enzimska aktivnost ATPaze suprimirana stresorom i "oslobođena" pri prebacivanju u morsku vodu.

[0141] Stopa mortaliteta ribe hranjene ispitivanom dijetom 2 u slatkoj vodi bila je veoma niska prvih 8 meseci u morskoj vodi, 0.36% mortaliteta.

[0142] Ukupno uzevši, ovaj eksperiment prikazuje da je ispitivana dijeta 2 sigurna za upotrebu u regularnoj proizvodnji, i da riba može da smoltifikuje bez upotrebe manipulacije svetlošću, samo uz pomoć ispitivane dijete 2. Međutim, iskustvo u ovom tipu proizvodnje je ograničeno, u poređenju sa upotrebom metoda SuperSmolt®, koji kombinuje upotrebu kontinuiranog svetla. Prema tome, stoga je prirodno koristiti oprez, odabrati povoljne uslove proizvodnje (visoka temperatura vode, zdrava riba i dobar kvalitet vode) i steći postepeno iskustvo sa opisanim postupkom pre nego što se poveća obim proizvodnje.

Fiziološke procene povezane sa hemoragičnim sindromom smolta (HSS) kod atlantskog lososa, i upotreba ispitivane dijete 2 protiv HSS

[0143] HSS je poremećaj koji je relativno uobičajen tokom stadijuma smoltifikacije kod atlantskog lososa. Nylund et al. (2003) su povezali bolest sa virusnom infekcijom, ali nisu dokazani nikakvi uzročnici. Takođe je sugerisano da su mogući uzroci nepravilna ishrana ili genetska bolest (Rodgers and Richards, 1998). Tipično, od HSS oboljeva najveća riba u grupi riba, i to je riba koja je najdalje napredovala u procesu smoltifikacije.

[0144] Fiziološki, smolt u slatkoj vodi će aktivno ispumpavati Na<+>i Cl<->preko škrga, i izlučivati Mg2+ i Ca2+ preko bubrega. Ako je losos u stadijumu mladog lososa, preuzimaće Na<+>, Cl-, Ca<2+>i Mg2+ iz okruženja. Problemi povezani sa HSS nastaju kada je riba smolt prilagođena na morsku vodu, ali je još uvek u slatkoj vodi, i nastavljaju se kada se riba hrani sadržajem koji povećava stopu pijenja. Ispitivana dijeta 1 uzrokuje povećanu prevalenciju HSS, dovodeći do više od 20 puta veće stope mortaliteta nego kod ribe koja je dobijala uobičajenu hranu za rast. Ispitivana dijeta 1 uključuje samo Na<+>i Cl-, a ne i slobodni Mg<2+>i Ca<2+>. Može se pretpostaviti da sadržaj od 7% NaCl u hrani dovodi kod ribe do povećane stope pijenja slatke vode, i pojačava već uspostavljenu povećanu stopu pijenja u grupi ribe. Na primer, vidimo da HSS riba iz terenske studije 1, hranjena ispitivanom dijetom 1, ima 90,5 mmol/l hlorida u plazmi, dok HSS riba hranjena kontrolnom dijetom ima 102.8 mmol/l hlorida u plazmi. Normalne vrednosti za hlorid u plazmi u slatkoj vodi kod zdrave ribe su između 120-135 mmol/l. Ovo ukazuje na to da je lučenje hlorida u plazmi iz ribe sa HSS, hranjene ispitivanom dijetom 1, pojačano, u odnosu na ribu sa HSS hranjenu hranom za rast. Hlorid u plazmi kod ribe sa HSS u poređenju sa normalnom ribom je nesumnjivo niži, ukazujući na to da je povećano izlučivanje Cl<->deo patološkog obrasca. Verovatno zbog ovoga, enzimska aktivnost Na+-K+-ATPaze je stimulisana snabdevanjem hloridnim jonima kod ribe koja ga dodatno dobija u hrani. Riba sa HSS ima vrednosti enzima ATPaze uporedive sa statusom smolta (ATPaza oko 10 ili iznad), što se podudara sa dobrom sposobnošću da ispumpava soli iz tela (MultiLab, 2012).

[0145] U isto vreme dok riba aktivno luči soli iz tela u bubreg i preko škrga, osmotski gradijent između ribe i vode funkcioniše tako da voda ulazi u ribu i soli izlaze iz ribe. Gubitak soli kroz osmotski gradijent nadovezuje se na to što riba podjednako aktivno ispumpava soli. U bubrezima ribe odvija se visoka diureza kako bi se izdvojio višak vode, u isto vreme smanjuje se mogućnost za reapsorpciju jona kao što su Ca<2+>i Mg<2+>, što odgovara onome što losos radi u morskoj vodi. Tako, ovi joni se gube, što predstavlja nedostatak kada je riba u slatkoj vodi. Dolazi do toga da riba ulazi u stanje hipokalcemije i hipomagnezemije. Ovo je ilustrovano na dijagramima 4 i 15. Riba sa HSS (test i kontrolna grupa) ima redom 1.04 i 1.08 mmol/l magnezijuma u plazmi. Normalna vrednost za slatku vodu iz literature je 2 mmol/l (Jakobsen, 2013), dok je riba u terenskoj studiji 3 pokazala 1.44 mmol/l.

[0146] Slično, za kalcijum u plazmi, referentna vrednost za zdravu ribu u terenskoj studiji 3 je 3.8 mmol/l, dok HSS riba (test i kontrolna grupa) ima redom 2.42 i 2.2 mmol/l. Ca2+ i Mg2+ učestvuju u sposobnosti ribe da izvodi normalne mišićne kontrakcije. Poznato je da hipokalcemija/ hipomagnezemija kod drugih vrsta, kao što je stoka, dovodi do mišićne slabosti, smanjenog broja otkucaja srca i letargije. Intravensko davanje kalcijuma i magnezijuma može da popravi ovaj poremećaj. Posmatrajući kliničku sliku ribe sa HSS, može se uočiti letargija kao tipičan nalaz. Riba pliva sporo, i ovo se može protumačiti kao mišićna slabost (u srčanom i skeletnim mišićima) zbog hipokalcemije/hipomagnezemije. Empirijsko iskustvo pokazuje da dodavanje morske vode u slatku vodu, redukuje ili uklanja ovu vrstu mortaliteta. Morska voda je veoma bogata magnezijumom.

[0147] Još jedan važan nalaz autopsije kod HSS je ascit (tečnost u abdominalnoj šupljini). Ako je srčani mišić nesposoban da obavlja normalne kontrakcije i broj otkucaja srca opada, krvna tečnost se blokira u sistemu krvnih sudova. Ovo može da uzrokuje transudat u abdominalnoj šupljini ribe, koji vidimo kao ascit. U situaciji kada ribi nedostaju soli, fiziološki je adaptirana na život u morskoj vodi, ali je u slatkoj vodi, ona će početi da pije kako bi nadoknadila gubitak soli. Ovo može da se primeni na Ca2+ , Mg2+ , kao i na Na+ ili Cl- . Ono što bi trebalo da bude morska voda (budući da je u pitanju smolt), predstavlja slatku vodu bez soli. Ovo omogućava da stopa pijenja bude nezaustavljiva, i postepeno se razvija hipervolemija. Tipično, pogled na autopsiju ribe sa HSS, daje edem u skeletnim mišićima, što ukazuje na višak tečnosti u perifernoj cirkulaciji. Klinički, vidi se riba sa nakostrešenim krljuštima, i to je verovatno zbog edema kože/šupljine krljušti, izazvanog hipervolemijom. Drugi značajni nalaz pri autopsiji ribe sa ovim poremećajem je višestruko petehijalno krvarenje u visceri i u mišićima. Krvni sudovi imaju glatke mišiće koji zavise od Ca<2+>i Mg2+ da bi se normalno kontrahovali. Nedostatak ovih jona daje smanjenu sposobnost kontrakcije, i u stanju sa hipervolemijom, verovatno je da to može dovesti do pucanja krvnih sudova i krvarenja. Kod kalifornijske pastrmke u morskoj vodi, oštećenje funkcije piloričnog sfinktera (opstrukcija), može da vodi neravnoteži osmoregulacije, jer creva ne dobijaju dovoljno vode iz želuca. Ovo stanje izaziva potrebu za vodom, i da bi se sprečilo isušivanje, riba počinje da pije morsku vodu. Ona će je piti u takvim količinama da to izaziva poremećaj nazvan "vodeni stomak". To je abnormalno uvećan želudac ispunjen morskom vodom. Poremećaj može da dobije takav obim, da se abdominalni mišići kidaju, dok je riba još uvek živa. Ovo je analog HSS, gde losos pije slatku vodu da bi dobio soli, do stepena koji stvara hipervolemiju, koja dovodi do pucanja krvnih sudova i ekstenzivnog krvarenja u različite organe. Transudat (ascit) koji se može naći kod HSS, očigledno izazvan smanjenom sposobnošću srca da pumpa krv koja dolazi do njega, može da bude pojačan stanjem hipervolemije koje riba ima.

[0148] Hrana za ribe prema predmetnom pronalasku sadrži Na<+>, Cl-, Ca<2+>i Mg<2+>, i može da se koristi uvezi sa smoltifikacijom, periodom kada se HSS najčešće javlja. Hrana za ribe prema predmetnom pronalasku je za upotrebu u postupku za sprečavanje i lečenje stanja HSS kod salmonida. Hranjenjem hranom za ribu prema predmetnom pronalasku, riba nema potrebu da pije slatku vodu kako bi zamenila ovde navedene jone, i zbog toga se ne javlja hipervolemija, krvarenje, ascit, slabost mišića ili edem krljušti, i izbegava HSS kao proizvodni problem. Ovo će se primenjivati i u proizvodnji velikog lososa u slatkoj vodi (sve do veličine za izlov) gde su gubitak apetita, HSS, edem krljušti i gubitak krljušti uobičajeni poremećaji pri proizvodnji.

Razlike između metoda SuperSmolt i hrane za ribe prema predmetnom pronalasku

[0149] Prema metodu SuperSmolt®, katjonski modulatori Ca2+ , Mg2+ se dodaju u radnu vodu, u kombinaciji sa Na+ , Cl- i slobodnim triptofanom u hrani za ribe za salmonide. Svrha metoda SuperSmolt® je prebacivanje ribe lososa u morsku vodu.

[0150] Nasuprot metodu SuperSmolt®, hrana za ribe prema predmetnom pronalasku ima sve katjonske modulatore u samoj hrani, i ne zahteva odvojeno dodavanje modulatora u radnu vodu za ribu. Svrha hrane za ribe i postupka prema predmetnom pronalasku je prebacivanje ribe lososa u morsku vodu, ali da se pri tome riba zadrži u okviru stadijuma smolta u cilju proizvodnje velikih salmonida u slatkoj vodi tokom dugog perioda, i u isto vreme kontrolisanja poremećaja HSS i desmoltifikacije. Hrana za ribe, postupak za smoltifikaciju i oblasti primene su stoga nove u odnosu na metod SuperSmolt®.

[0151] Dalje, vidimo da upotrebom samo modulatora Na+ , Cl- i triptofana u hrani (kao u slučaju hrane prema metodu SuperSmolt®), pojava poremećaja HSS kod atlantskog lososa raste. Ovo naglašava stav da dijeta koju obezbeđuje hrana SuperSmolt® nije dovoljna da sprovede zadovoljavajući proces smoltifikacije, bez dodatka toj metodi u vidu modulatora Ca<2+>, Mg<2+>u slatkoj vodi.

Oblast primene hrane za ribe prema predmetnom pronalasku

[0152] Hrana za ribe prema predmetnom pronalasku može da se koristi kao:

1. Dodatni signal za smoltifikaciju u kombinaciji sa tradicionalnom manipulacijom svetlošću kod salmonida.

2. Postupak za smoltifikaciju u kombinaciji sa kontinuiranim svetlom, prirodnim svetlom ili nepotpunom manipulacijom svetlošću u smoltifikaciji.

3. Sinhronizaciju grupa smolta u slatkoj vodi.

4. Sprečavanje desmoltifikacije kod salmonida u slatkoj vodi.

5. Profilaksu i lečenje HSS, edema krljušti i gubitka krljušti.

6. Kompozicija hrane za proizvodnju post-smolta i ribe veličine za izlov u slatkoj vodi, kod različitih vrsta salmonida, u pogledu prevencije pojave bolesti pomenutih u tačkama 4 i 5 iznad, kao i za održavanje normalnog rasta, slično onome što se viđa u morskoj vodi.

7. Kompozicija hrane za proizvodnju matičnog jata u slatkoj vodi, kod različitih vrsta salmonida, do veličine u kojoj je poželjno/moguće dati signal za polno sazrevanje i sakupljati riblja jaja za konzumiranje, ili za dalju proizvodnju ribe, i sprečavanje pojave bolesti pomenutih u tačkama 4 i 5 iznad, kao i za održavanje normalnog rasta, slično onome što se viđa u morskoj vodi.

Claims

Patentni zahtevi

1. Hrana za ribe, koja sadrži protein, mast, ugljene hidrate, vitamine, minerale i vodu, NAZNAČENA TIME, ŠTO hrana za ribe dodatno sadrži Na+ od 3.934 – 39.340 g/kg po težini, modulator receptora za polivalentne katjone (PVCR) u obliku triptofana ili fenilalanina od 1-10 g/kg po težini, Mg2 od 0.026 – 25.530 g/kg po težini i Ca2+ od 0.036 – 36.110 g/kg po težini, pri čemu je modulator receptora za polivalentne katjone u obliku slobodnih aminokiselina.

2. Hrana za ribe prema patentnom zahtevu 1, u kojoj je modulator receptora za polivalentne katjone triptofan.

3. Hrana za ribe prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, u kojoj su Na+ , Mg2 i Ca2+ obezbeđeni kao soli u opsezima od 10 -100 g/kg, 0.1 - 100 g/kg i 0.1 - 100 g/kg, respektivno.

4. Hrana za ribe prema patentnom zahtevu 3, u kojoj su soli natrijuma NaCl.

5. Hrana za ribe prema patentnom zahtevu 3, u kojoj su soli magnezijuma MgCl2.

6. Hrana za ribe prema patentnom zahtevu 3, u kojoj su soli kalcijuma CaCl2.

7. Hrana za ribe prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva pri čemu hrana za ribe sadrži Clod 6.202 – 199.020 g/kg po težini.

8. Hrana za ribe prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva koja sadrži 6% po težini NaCl, 0,75 % po težini CaCl2, 0,25 % po težini MgCl2 i 0,4 % po težini L-triptofana.

9. Hrana za ribe prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, u kojoj je hrana za ribe pogodna za indukciju smoltifikacije i/ili sprečavanje desmoltifikacije riba iz porodice Salmonidae.

10. Hrana za ribe prema bilo kom od patentnih zahteva 1 - 9, za upotrebu kao lek.

11. Hrana za ribe za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, gde upotreba predstavlja upotrebu u profilaktičkom i/ili terapijskom lečenju hemoragičnog sindroma smolta (HSS) kod riba iz porodice Salmonidae.

12. Hrana za ribe za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 10 ili 11, pri čemu se upotreba odvija tokom postupka smoltifikacije riba iz porodice Salmonidae, gde postupak obuhvata davanje kompozicije u obliku hrane mladom lososu (engl. parr) ili desmoltifikovanoj ribi, u odsustvu manipulacije veštačkim svetlosnim zimskim signalom.

13. Hrana za ribe za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 10 ili 11, pri čemu se upotreba odvija tokom postupka sprečavanja desmoltifikacije riba iz porodice Salmonidae, gde postupak obuhvata davanje kompozicije u obliku hrane populaciji smoltifikovane ribe, u slatkoj vodi.