RS58912B1 - Sirnk i njihova primena u metodama i kompozicijama za lečenje i/ili prevenciju stanja oka - Google Patents

Description

Opis

OBLAST TEHNIKE PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na obezbeđivanje siRNK proizvoda i njihovu primenu u metodama i kompozicijama za lečenje i/ili prevenciju stanja oka povezanih sa visokim nivoima ekspanzije i ili aktivnosti tranzitornog potencijala vaniloidnog receptora (TRPV1) primenom RNK interferencije. Između ostalih, stanja oka povezana sa bolom u oku kao što su nelagodnost i promenjena osetljivost rožnjače posle refraktivne hirurgije, upotrebe kontaktnioh sočiva, sindrom suvog oka, i Sjogrenov sindrom, trebalo bi da se ublaže.

STANJE TEHNIKE PRONALASKA

[0002] RNK interferencija (RNKi) je prirodni regulatorni mehanizam većine eukariotskih ćelija koji koristi male dvolančane RNK (dsRNK) molekule da usmere utišavanje gena zavisno od homologije. Njeno otkriće od strane Fire i Mello u crvu C. elegans {Fire, 1998} je nagrađeno Nobelovom nagradom u 2006. Ubrzo posle njenog prvog opisa, za RNKi je takođe pokazano da se javlja u ćelijama sisara, ne preko dugih dsRNK već sredstvima dvolančanih malih interferirajućih RNK (siRNK) dugih 21 nukleotida {Elbashir, 2001}.

[0003] Smatra se da je proces RNK interferencije evoluciono-sačuvan ćelijski odbrambeni mehanizam korišćen da spreči ekspresiju stranih gena i obično ga dele raznovrsni filumi i flora, gde se naziva post-transkripciono utišavanje gena. Od otkrića RNKi mehanizma došlo je do eksplozije istraživanja da bi se otkrila nova jedinjenja koja mogu selektivno da menjaju ekspresiju gena kao nov način lečenja bolesti ljudi ciljanjem meta koje inače "ne deluju na lek" (undruggable) sa tradicionalnim farmaceutskim pristupima koji uključuju male molekule ili proteine.

[0004] Prema trenutnom znanju, mehanizam RNKi je iniciran kada su dugačke dvolančane RNK obrađene pomoću RNaza III-sličnog proteina koji je poznat kao Dicer. Protein Dicer tipično sadrži N-terminalni RNK helikazni domen, RNK-vezujući takozvani Piwi/Argonaute/Zwille (PAZ) domen, dva RNaza III domena i vezujuća domena dvolančane RNK (dsRBD) {Collins, 2005} i njihova aktivnost vodi obrađivanju dugačkih dvolančanih RNK u dvolančane siRNK sa 21-24 nukleotida sa 3'- prepustima (overhangs) od 2 baze i 5' fosfatnom i 3' hidriksilnom grupom. Dobijeni siRNK dupleksi su zatim inkorporirani u efektorski kompleks poznat kao RNK-indukovani utišavajući kompleks (RISC – RNA -induced silencing complex), gde antisens ili vodeći lanac siRNK usmerava RISC da prepozna i cepa ciljne mRNK sekvence {Elbashir, 2001} nakon adenozin-trifosfat (ATP)-zavisnog odmotavanja molekula dvolančane siRNK kroz aktivnost RNK helikaze {Nykanen, 2001}. Katalitička aktivnost RISC, koja vodi do mRNK degradacije, je posredovana endonukleazom Argonaut 2 (AGO2) {Liu, 2004; Song, 2004}. AGO2 pripada visoko konzervisanoj Argonaut familiji proteina. Argonaut proteini su od ∼100 KDa visoko bazni proteini koji sadrže dva uobičajena domena, naime PIWI i PAZ domene {Cerutti, 2000}. PIWI domen je ključan za interakciju sa Dicer-om i sadrži nukleaznu aktivnost odgovornu za cepanje mRNKs {Song, 2004}. AGO2 koristi jedan lanac siRNK dupleksa kao vodič da nađe informacione RNK koje sadrže komplementarne sekvence i cepa fosfodiestarsku kičmu između baza 10 i 11 u odnosu na 5' kraj vodećeg lanca {Elbashir, 2001}. Značajan korak tokom aktivacije RISC je cepanje sens ili putnik lanaca pomoću AGO2, ukljanjanjem ovog lanaca iz kompleksa {Rand, 2005}. Kristalografske studije koje analiziraju interakciju između siRNK vodećeg lanaca i PIWI domena otkrivaju da su to samo nukleotidi 2 do 8 koji konstituišu "seme sekvencu" koja usmerava prepoznavanje ciljne mRNK pomoću RISC, i da neusklađenost jednog nukleotid u sekvenci može drastično uticati na utišavajuću sposobnost molekula {Ma, 2005; Doench 2004; Lewis, 2003}. Jednom kada se mRNK pocepa, i usled prisustva nezaštićenih RNK krajeva u fragmentima, mRNK se dalje cepa i degradira unutarćelijskim nukleazama i neće više biti prevedena u proteine {Orban, 2005} dok će RISC biti reciklovana za naredne krugove {Hutvagner, 2002}. Ovo uspostavlja katalitički proces koji vodi do selektivne redukcije specifičnih mRNK molekula i odgovarajućih proteina. Moguće je eksploatisati ovaj nativi mehanizam za utišavanje gena sa svrhom regulisanja bilo kog (kojih) gena po izboru direktnim isporučivanjem siRNK efektora u ćelije ili tkiva, gde će aktivirati RISC i proizvesti specifično utišavanje ciljne mRNK.

[0005] Mnoge studije su objavljene opisujući idealne osobine koje siRNK treba da ima da se postigne maksimalna efikasnost, u pogledu dužine, strukture, hemijskog sastava i sekvence. Početne parametre za dizajn siRNK su postavili Tuschl i saradnici u WO02/44321, iako su mnoge naknadne studije, algoritmi i/ili poboljšanja objavljeni od tada. Na primer, US 2008/085998 opisuje listu poboljšanja siRNK kiselina, kitove i metode za primenu navedenih siRNK, gde navedene siRNK imaju povećanu efikasnost, naročito u sistemima sisara.

[0006] Takođe, značajan napor je uložen u poboljšanje stabilnosti siRNK jer se to shvata kao jedna od glavnih prepreka za terapiju zasnovanu na siRNK, uzimajući u obzir sveprisutnu prirodu RNAza u biološkim tečnostima. Jedna od glavnih strategija koja je praćena za poboljšanje stabilnosti je bila primena modifikovanih nukleotida kao što su 2'-O-metil nukleotidi, 2'-amino nukleotidi, nukleotidi koji sadrže 2'-O ili 4'-C metilen mostove. Takođe, opisana je modifikacija ribonukleotide kičme koja povezuje susedne nukleotide, uglavnom uvođenjem fosforotionatom modifikovanih nukleotida. Čini se da je poboljšana stabilnost često obrnuto proporcionalna efikasnosti (Parish, 2000), i samo određeni broj, pozicija i/ili kombinacija modifikovanih nukleotida može da da stabilno jedinjenje za utišavanje. Kako je ovo važna prepreka u tretmanim zasnovanim na siRNK, objavljene su različite studije koje opisuju određene modifikacione šablone pokazujući dobre rezultate, primeri takvih uključuju EP1527176, WO2008/050329, WO2008/104978 ili WO2009/044392, iako se mnogo više može naći u literaturi. Kao primer, Czauderna et al, 2003 (Nucleic Acids Research 2003, Tom. 31, Br. 11, strane 2705-2716) opisuje 2'-O-metil modifikacije, ali ne molekule sa terminalnim modifikacijama, koje su zaštićene od nukleaza izvedenih iz seruma. Autori opisuju ove modifikovane molekule kao siRNK kiseline druge generacije koje su verovatno bolje prilagođene za potencijalnu terapijsku primenu sintetičkih siRNK in vivo. Međutim, ovaj dokument ne stavlja na uvid javnosti ni jedan cilj siRNK kiselina prema TRPV1, niti dokument spekuliše da ove siRNK druge generacije mogu biti primenjene za to.

[0007] Vaniloidni receptor tranzitnog potencijala (TRPV1 - Transient Receptor Potential Vanilloid-1), takođe nazvan Vaniloidni receptor 1 (VR-1), je kapsaicin-reagujući ligandomkontrolisan katjonski kanal, koji je prvi put otkriven u 1997 (Caterina, 1997). TRPV1 je uglavnom eksprimiran na senzornim neuronima i služi kao molekularni detektor za toplotu, kapscain, protone, i endovaniloide (Caterina, 2001; Montell, 2002; Baumann, 2000). Mada su pronalazači predmetne prijave takođe pronašli TRPV1 ekspresiju u tkivima iz sluzne žlezde i cilijarnog tela.

[0008] Kada se TRPV1 aktivira agonistom kao što je kapsaicin ili drugim faktorima kao što su toplota, acidoza, proizvodi lipoksigenze ili anandamid, kalcijum ulazi u ćeliju i signali bola su inicirani. Aktivacija kanala izaziva oslobađanje neuropeptida iz centralnih i perifernih senzornih nevrnih završetaka, što dovodi do osećaja bola, neurogene inflamacije, i ponekad, do kontrakcije glatkih mišića i kašlja. Zapravo, skorašnji dokaz ukazuje na ulogu TRPV1 u bolu, kašlju, astmi i urinarnoj inkontinenciji (Jia, 2005). U stvari, TRPV1 je poznata meta za tretmane pomoću analgezije u odgovoru na bolne stimulse. Povrh toga, tretmani formulisani da redukuju nivoe ekspresije TRPV1 primenom različitih tehnologija su takođe opisani u WO2004/042046, ili (Schubert, 2005), sa fokusaom na lečenje bola. Na primer, US2006/122136 opisuje primenu DNK enzima tipa 10-23 za cepanje VR1 mRNK, gde ti enzimi pokazuju veću stabilnost prema nukleolitičkoj degradaciji. Međutim, ovaj dokument ne stavlja na uvid javnosti primenu visoko efikasnog TRPV1 specifičnih siRNK, kao što je stavljeno na uvid javnosti u predmetnom pronalasku.

[0009] Polimodalni nociceptori su najobilniji tip nociceptora koji se nalazi u rožnjači. Postoji farmakoločki dokaz da ova receptorska vlakna eksprimiraju TRPV1 receptor jer ona reaguju na kapsaicin, toplotu i kiselinu. Štaviše, visoke doze kapsaicina inaktiviraju odgovor polimodalnih nociceptora rožnjače na toplotu i kiselinu pri čemu mehanički odziv ostaje nepromenjen. Ovo ukazuje da su TRPV1 receptori prisutni u polimodalnim nervnim završecima rožnjače bili selektivno inaktivirani. Prema tome, verovatno je da važan deo akutnog nociceptivnog odgovora na povredu rožnjače i stalni osećaji bola koji preta inflamatorne i iritativne procese u ovom tkivu su posredovani TRPV1 aktivacijom.

[0010] US2006/122136 takođe opisuje primenu TRPV1 specifičnih siRNK za lečenje bola i drugih patoloških stanja povezanih sa VR1. Osim toga, WO2007/045930 opisuje primenu TRPV1 specifičnih siRNK za lečenje okularne patolofije u vezi sa bolom u oku i sindromom suvog oka. WO2009/023025 dalje opisuje primenu TRPV1 specifičnih siRNK u kombinaciji sa siRNK kiselinama usmerenim protiv NOX3 u nastojanju da takođe smanje ekspresiju reaktivnih vrsta kiseonika za sprečavanje ototoksičnosti. Međutim, predmetni pronalazak obezbeđuje poboljšane proizvode za smanjenje TRPV1 ekspresije i posledične nelagodnosti oka. Prednost lečenja ovih stanja sa siRNK proizvodima naspram tradicionalnih hemijskimh inhibitora je u tome što će lečenje zasnovana na siRNK imati dugotrajniji efekat. Ovaj rezultat je zbog činjenice da jednom kada efektorski molekul više nije prisutan, ćelija će morati da sintetiše nove receptore od samog početka; dok tradicionalni tretmani će ostaviti nivoe receptora na ćelijskoj membrani netaknutim.

[0011] Zbog trenutnog načina života, broj ljudi pogođen okularnim patologijama povezanih sa izmenjenim očnom senzitivnošću je dosta visok, i očekuje se da će se povećati sa starenjem stanovništva. Refraktivna hirurgija i upotreba kontaktnih sočiva često dovode do izmenjene osetljivosti rožnjače i osećaja suvog oka kod pacijenta. Ovo je dodatno pogoršano gledanjem u kompjuterske ekrane tokom dugog radnog vremena i upotrebom sistema za klimatizaciju koji obično dodatno suše vazduh. Takođe, količina i kvalitet suza se smanjuju sa godinama. Simptomi koji prate sindrome suvog oka uključuju svrab, peckanje i iritaciju očnih tkiva. Teži oblik suvog oka se javlja kod pacijenata sa Sjogrenovim sindromom. Prisustvo jedne ili različitih kombinacija ovih senzacija se naziva bol u očima u smislu predmetnog teksta. Trenutno je procenjeno da sindrom suvog oka pogađa više od 10 miliona Amerikanaca.

OPIS SLIKA NACRTA

[0012]

Slika 1 je dijagram koji prikazuje vremenski ekspresioni profil TRPV1, korišćenjem Qrt-PCR, posle transfekcije HeLa ćelija sa različitim siRNK koje ciljaju TRPV1: jedinjenje prema predmetnom pronalasku (SEK ID BR: 2), prethodno opisano jedinjenje koje cilja različit region (SEK ID BR: 7), i druge četiri siRNK (SEK ID BR: 17 do 20) dizajnirane da ciljaju TRPV1 i skremblovana sekvenca korišćena kao negativna kontrola. Dva alternativna prikaza istih rezultata su prikazana da obezbede jasnoću.

Slika 2 je dijagram koji pokazuje vremenski ekspresioni profil TRPV1, korišćenjem Qrt-PCR, posle transfekcije HeLa ćelija sa različitim siRNK predmetnog pronalaska: SEK ID BR: 2 do SEK ID BR: 6, i SEK ID BR: 8 do SEK ID BR: 16, i skremblovana sekvenca korišćena kao negativna kontrola.

Slika 3 prikazuje vremensku liniju sa palpebralnim otvaranjem merenim u mm u očima zečeva tretiranih sa jedinjenjem predmetnog pronalaska (SEK ID BR: 2) u poređenju sa kapsazepinom, prihvaćenim specifičnim analgetikom za TRPV1 zavisnim bolom, posle stimulacije sa kapsaicinom.

Slika 4 je grafikon koji pokazuje odnos (%) uzimajući u obzir vrednosti iz prethodnog testa, palpebralnog otvaranja posle indukovanja bola sa kapsaicinom, koji nastaje iz tretmana sa jedinjenjem predmetnog pronalaska (SEK ID BR: 2) i kapsazepinom.

Slika 5 je grafikon koji pokazuje količinu intaktnog proizvoda (%) koji preostaje nakon izlaganja 10% plazmi tokom 24 sata.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0013] U prvom aspektu, objava se odnosi na obezbeđivanje siRNK molekula pri čemu navedeni molekul specifično cilja SEK ID BR: 1 i smanjuje ekspresiju TRPV1 gena kada je uveden u ćeliju.

[0014] Gen je "ciljan" pomoću siRNK prema predmetnim pronalaskom kada, na primer, siRNK molekul selektivno smanjuje ili inhibira ekspresiju gena. Fraza "selektivno smanjuje ili inhibira" kao što je korišćeno ovde obuhvata siRNK kiseline koje deluju na ekspresiju jednog gena, u ovom slučaju TRPV1. Alternativno, siRNK cilja gen kada siRNK hibridizuje pod strogim uslovima za genski transkript, tj. njegovu mRNK. Sposoban za hibridizaciju "pod strogim uslovima" označava vezivanje za ciljni mRNK region, pod standardnim uslovima, npr., visoka temperatura i/ili nizak sadržaj soli koji teže da ometaju hibridizaciju. Pogodan protokol (koji uključuje 0.1 ×SSC, 68 °C tokom 2 sata) je opisan u Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, na stranama 387-389.

[0015] Sekvence nukleinske kiseline citirane ovde su napisane u 5' ka 3' smeru ukoliko nije naznačeno drugačije. Termin "nukleinska kiselina" se odnosi na ili DNK ili RNK ili njihov modifikovan oblik koji sadrži purinske ili pirimidinske baze prisutne u DNK (adenin "A", citozin "C", guanin "G", timin "T") ili RNK (adenin "A", citozin "C", guanin "G", uracil "U"). Interferirajuće RNK obezbeđene ovde mogu da sadrže "T" baze, na primer na 3' krajevima, čak iako "T" baze se ne javljaju prirodno u RNK. U nekim slučajevima ove baze mogu se pojaviti kao "dT" da se razlikuju deoksiribonukleotidi prisutni u lancu ribonukleotida.

[0016] Ciljna sekvenca kao što je definisano ovde je opisana kao ciljna DNK sekvenca kao što je korišćeno za definiciju varijanti transkripta u bazama podataka korišćenim za svrhe dizajniranja siRNK kiselinama, gde specifična jedinjenja koja će se koristiti će biti RNK sekvence definisane kao takve.

[0017] Različite varijante transkripta koje odgovaraju TRPV1 su identifikovane. Pristupni brojevi banke gena (GenBank Accession Numbers) odgovarajući za četiri TRPV1 transkripta proizvedenih pomoću alternativnog spajanja su: NM_080704 (NM_080704.3, GI:117306161), NM_018727 (NM_018727.5, GI:117306160), NM_080706 (NM_080706.3, GI:117306163) i NM_080705 (NM_080705.3, GI:117306162). Osim toga, ENSEMBL (MBL-EBI/Wellcome Trust Sanger Institute) ima 5 dodatnih TRPV1 transkripta objavljenih: ENST00000174621, ENST00000310522, ENST00000344161, ENST00000399752, ENST00000399756, ENST00000399759, ENST00000425167.

[0018] Objava obezbeđuje siRNK kiseline koje inhibiraju TRPV1 ekspresiju gena, ove siRNK koje su posebno efikasne u poređenju sa onima koje su već stavljene na uvid javnosti u oblasti tehnike. Posebno efikasne znači da one postižu više stepene inhibicije i/ili produženiji efekat u vremenu.

[0019] Ove nove siRNK su dizajnirane za ciljnu sekvencu zajedničku za sve varijante transkripta TRPV1 opisanih u prethodnom paragrafu, i prema tome posreduju u degradaciji posredovanoj sa RISC svih mogući mRNK prisutnih u ćeliji koja kodira TRPV1 protein. Navedeni poželjni ciljni region identifikovan objavom je identifikovan u SEK ID BR: 1 (5'-AAGCGCATCTTCTACTTCA-3').

[0020] Prema tome, siRNK u skladu sa objavom će poželjno sadržati molekul dvolančane RNK, čiji antisens lanac će sadržati RNK sekvencu koja je suštinski komplementarna SEK ID BR: 1, i njen sens lanac će sadržati RNK sekvencu komplementarnu antisens lancu, gde su oba lanca hibridizovana standardnim baznim uparivanjem između nukleotida.

[0021] U okviru značenja objave "suštinski komplementaran" sa ciljnom mRNK sekvencom, može takođe da se shvati kao "suštinski identičan" navedenoj ciljnoj sekvenci. "Identičnost" kao što je poznato prosečnom poznavaocu iz oblasti tehnike, je stepen srodnosti sekvence između nukleotidnih sekvenci kao što je određeno podudaranjem redosleda i identiteta nukleotida između sekvenci. U jednom aspektu antisens lanac siRNK koji ima 80%, i između 80% do 100% komplementarnosti, na primer, 85%, 90% ili 95% komplementarnosti, sa ciljnom mRNK sekvencom se smatra suštinski komplementarnim i može biti primenjen u predmetnom pronalasku. Procenat komplementarnosti opisuje procenat susednih nukleotida u prvom molekulu nukleinske kiseline koji može zasnovati par u Votson-krikovom smislu sa nizom susednih nukleotidia u drugom molekulu nukleinske kiseline.

[0022] Kao što je poznato iz oblasti tehnike, mnoge različite strukture su predložene za postizanje RNK interferencija. Uopšteno ovi dvolančani molekuli su od oko 19 do oko 25 nukleotida u dužini, i uključuju strukture sa tupim krajevima kao i one sa prepustima. Za prepuste je opisano da su povoljni i mogu biti prisutni na 5' krajevima ili na 3' krajevima oba lanaca jer oni smenjuju prepoznavanje od strane RNAze i imitiraju Dicerov prirodni supstrat. Neki autori preporučuju uključivanje prepust na oba 3' kraja molekula, dok drugi smatraju da je jedan prepust dovoljan. Drugi su opisali primenu struktura sa tupim krajevima sa specifičnim šablonima modifikacije (EP 1527176, WO 2008/104978, i mnogi drugi).

[0023] Prepusti mogu biti sačinjeni od između 1 i 5 nukleotida, tipično prepusti su napravljeni od dinukleotida. Klasični molekuli korišćeni u oblasti, sadrže dvolančani molekul od 19 nukleotida koji dalje sadrži 3' dinukleotidne prepuste koji poželjno sadrže deoksinukleotide kako je podučavano u početnim studijama od strane Tuschl (WO02/44321). Za ove prepuste se navodi da dalje poboljšavaju otpornost na degradaciju nukleazeom (RNazom). Later, Kim et al 2005 opisuje da 21-merni proizvodi (koji sadrže dinukleotidne prepuste) su neophodni za dodavanje na RISC. Dalje, Bramsen et al. 2009 opisuje uvođenje mogućih destabilizujućih modifikacija za prepuste za dalje povećanje efikasnosti utišavanja.

[0024] Kao takav, jedan aspekt objave se odnosi na molekule siRNK koji ciljaju SEK ID BR: 1 koja sadrži najmanje jedan prepust.

[0025] Drugi alternativni aspekt predmetne objave obezbeđuje molekule sa tupim krajem.

[0026] Dalje, poželjni aspekt objave se odnosi na siRNK koja sadrži ili se sastoji od dvolančane structure od 19 nukleotida koja cilja SEK ID BR: 1. Iznenađujuće, za navedene dvolančane RNK od 19 nukleotida se pokazalo da su otpornije na degradaciju nego prethodno opisani proizvodi sa 21 nukleotida i 3' prepusta kao što se može videti na slici 5.

[0027] Naročit aspekt objave se odnosi na dvolančanu siRNK sa tupim krajem od 19 nukleotida koje cilja SEK ID BR: 1. U daljem posebnom tehničkom rešenju ovo jedinjenje je identifikovano kao SEK ID BR: 2 (5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3'). U dodatnom poželjnom aspektu, antisens lanac ove siRNK je najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, komplementarn sa SEK ID BR: 1.

[0028] Osim toga, kao što je opisano u delu pod nazivom stanje tehnike, važno pitanje sa siRNK molekulima je njihova nestabilnost u biološkim tečnostima zbog sveobuhvatne prirode RNAza. Stoga, primena mnogih različitih hemijskih modifikacija nukleotida je opisana sa svrhom poboljšanja stabilnosti jedinjenja.

[0029] Drugi nerazdvojiv problem siRNK molekula je njihova imunogenost, pri čemu je za siRNK kiseline pronađeno da indukuju nespecifičnu aktivaciju urođenog imunog sistema, uključujući pozitivnu regulaciju određenih citokina, npr. interferona tip I i/ili tip II kao i proizvodnju IL-12, IL-6 i/ili TNF-alfa. Mislilo se da je poreklo ovih efekata aktivacija Tolsličnih receptora kao što su TLR7, TLR8 i/ili TLR3 sa siRNK.

[0030] Oba ova efekta, prepoznavanje od strane RNaze i imunogenost, su takođe opisani da su zavisni od sekvence.

[0031] Neke od hemijskih modifikacija koje pospešuju stabilnost jedinjenja smanjivanjem osetljivosti na RNAze su takođe sposobne da redukuju indukciju imunog prepoznavanja naknadnog odgovora. Međutim, umetanje hemijski modifikovanih nukleotida u siRNK može takođe rezultovati u smanjenju efikasnosti utišavanja kao što je opisano u prethodnom delu, i stoga se mora pristupiti sa oprezom.

[0032] Stoga, u poželjnom aspektu predmetne objave, siRNK dalje sadrži najmanje jedan nukleotid sa hemijskom modifikacijom.

[0033] Poželjne hemijske modifikacije koje pospešuju stabilnost i redukuju imunogene efekte uključuju 2'-O-metil nukleotide, 2'-fluoro nukleotide 2'-amino nukleotide, 2'-deoksi nukleotide, nukleotide koji sadrže 2'-O ili 4'-C metilen mostove. Takođe, modifikacija ribonukleotidne kičme koja povezuje susedne nukleotide uvođenjem fosforotioatom modifikovanih nukleotida. Dalja poželjna hemijska modifikacija u smislu objava se odnosi na supstituciju uracil ribonukleotida sa deoksitimidinom (deoksiribonukleotidi). U drugom poželjnom aspektu objava, najmanje jedan hemijski modifikovan nukleotid je na sens lanacu, na antisens lanacu ili na oba lanca siRNK.

[0034] Prema tome, u jednom tehničkom rešenju, siRNK je odabrana od SEK ID. BR.3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili 16.

siRNK molekuli kao što je opisano gore mogu biti dostavljeni u unutrašnjost ćelija u svojoj prirodnoj strukturi primenom metode poznate u oblasti tehnike. Na primer, prilikom proučavanja in vitro utišavanje gena, ova jedinjenja se administriraju korišćenjem standardnih reagensa za transfekciju. Da bi se postigli efekti in vivo ova jedinjenja se mogu administrirati čista ili korišćenjem agenasa za poboljšanje isporučivanje kao što su na primer lipozomi ili konjugacijom sa specifičnom grupom. iako su mnoge druge alternative poznate u oblasti tehnike, i koriste se različito u zavisnosti od željenog ciljnog mesta unutar tela.

[0035] Alternativno, siRNK molekuli pronalaska mogu biti eksprimirani unutar ćelija iz eukariotskih promotera. Rekombinantni vektori sposobni da eksprimiraju siRNK molekula mogu biti isporučeni i postojati u ciljnim ćelijama. Alternativno, vektori mogu biti korišćeni da obezbede prolaznu ekspresiju molekula nukleinske kiseline. Takvi vektori se mogu iznova administrirani ako je potrebono. Jednom eksprimiran, siRNK molekul stupa u interakciju sa ciljnom mRNK i generiše RNK interferirajući odgovor. siRNK molekuli proizvedeni na ovaj način često se nazivaju shRNK (short hairpin RNK – mala RNK u obliku ukosnice), jer su njihovi sens i antisens lanci spojeni malom petljom nukleotida. Isporuka vektora koji eksprimiraju siRNK molekula može biti sistemska, kao što je intravenska ili intramuskularna administracija, pomoću administracije u ciljne ćelije eksplantirani iz subjekta praćeno ponovnim uvođenjem u subjekt, ili pomoću bilo kojih drugih sredstava koji bi dozvolili uvođenje u željenu ciljnu ćeliju.

1

[0036] Dalji aspekt se odnosi na primenu siRNK koja cilja SEK ID BR.1 u pripremanju leka za primenu u metodi lečenja stanja oka okarakterisanog povećanom ekspresijom i/ili aktivnosti TRPV1. Metoda obuhvata inhibiranje ekspresije TRPV1 kod pacijenta. Termin iinhibicija je korišćen da ukaže smanjenje ili negativnu regulaciju ekspresije ili aktivnosti. Poželjno, stanja oka je okularni bol. U jednom tehničkom rešenju, stanje oka je obabrano iz grupe koje obuhvata nelagodnost u oku i promenjenu osetljivost rožnjače posle refraktivne hirurgije, upotrebe kontaktnih sočiva, sindrom suvog oka, Sjogrenov sindrom i druge patologije oka.

[0037] Očekuje se da će terapijsko lečenje sa siRNK kiselinama usmerenim protiv TRPV1 mRNK biti korisnije od topikalnih kapi za oči u vidu malih molekula produžavanjem vremena tokom koga se posmatra efekat, time omogućavajući manje učestalo doziranje i bolju komplijansu pacijenta. Ovo je naročito važno u slučajevima kao što su sindrom suvog oka i promenjena osetljivost rožnjače jer su to često hronična stanja.

[0038] Imajući u vidu pripremanje takvog leka, siRNK predmetnog pronalaska može biti formulisana. Poželjno, kompozicije i formulacije navedenih siRNK mogu se administrirati topikalno na organ od interesa. U još poželjnijem aspektu one mogu biti formulisane za topikalnu administraciju na oko, poželjno na površinu rožnječe oka. Primena na površinu rožnjače može, na primer biti u obliku kapi za oči, gela, losiona, kreme ili očnih umetaka. Drugi oblici administracije u oko mogu uključivati injekciju u oko.

[0039] Dalji poželjni aspekt objave se odnosi na siRNK koja specifično cilja SEK ID BR: 1 kao što je opisano u prethodnim paragrafima, za primenu kao lek za lečenje stanja oka okarakterisanog povećanom ekspresijom i/ili aktivnosti TRPV1. Kao što je opisano iznad, može biti siRNK koja sadrži ili se sastoji od dvolančane structure od 19 nukleotida koja cilja SEK ID BR: 1. Ova siRNK može biti sa tupim krajem. Poželjno, siRNK je SEK ID BR: 2. Druga siRNK za primenu prema objavi može biti odabrana od SEK ID. NO. 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili 16.

[0040] U sklopu konteksta objave, "specifično ciljati" sekvencu siRNK objave mora da sadrži najmanje istu seme sekvencu. Prema tome, bilo koja sekvenca prema objavi koja specifično ciljna SEK ID BR.1 mora poželjno biti identična na položajima 2-8 antisens lanca.

[0041] Bez obzira na iznad navedeno, siRNK kiseline objave mogu biti primenjene da utišaju TRPV1 ekspresiju u tkivima različitim od oka. Stoga, navedene siRNK treba formulisati shodno tome.

[0042] Na primer, siRNK molekul može da sadrži transporter za isporuku, uključujuči lipozome, za administraciju subjektu. Nosači i razblaživači i njihove soli mogu biti prisutni u farmaceutski prihvatljivim formulacijama. Molekuli nukleinske kiseline mogu se administrirati ćelijama raznim metodama poznatim prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike, uključujući, ali ne ograničeno na, enkapsulaciju u lipozome, pomoću jontoforeze, ili inkorporacijom u druče nosače, kao što su biorazgradivi polimeri, hidrogelovi, mikrosfere poli (mlečne-ko-glikolne) kiseline (PLGA) i PLCA sa ciklodekstrinima, biorazgradive nanokapsule, i bioadhezivne mikrosfere, ili pomoću proteinskih vektora. U drugom aspektu, molekuli nukleinske kiseline pronalaska mogu takođe biti formulisani ili u kompleksu sa polietileniminom ili njegovim derivatima, kao što su polietilenimin-polietilenglikol-N-acetilgalaktozamin (PEI-PEG-GAL) ili polietillenimin-polietilenglikol-tri-N-acetilgalaktozamin (PEI-PEG-triGAL) derivati.

[0043] siRNK molekul pronalaska može biti u kompleksu sa agensima koji remete membranu i/ili katjonskim lipidom ili pomoćnim lipidnim molekulom.

[0044] Sistemi za isporuku koji se mogu koristiti sa pronalaskom uključuju, na primer, vodene i ne-vodene gelove, kreme, višestruke emulzije, mikroemulzije, lipozome, masti, vodene i ne-vodene rastvore, losione, aerosole, ugljovodonične baze i praškove, i mogu sadržati ekscipijense kao što su kao solubilizatori, sredstva koja poboljšavaju propuštanje (npr. masne kiseline, estri masnih kiselina, masni alkoholi i aminokiseline), i fidrofilni polimeri (npr. , polikarbofil i polivinilpirolidon). U jednom aspektu, farmaceutski prihvatljiv nosač je je lipozom ili transdermalni pojačivač.

[0045] Farmaceutska formulacija pronalaska je u obliku pogodnom za administraciju, npr., sistemsku ili lokalnu administraciju, u ćeliju ili subjektu, uključujući na primer čoveka. Pogodni oblici, delimično, zavise od primene ili puta unosa, na primer oralno, transdermalno, ili injekcijom. Drugi faktori su poznati u oblasti, i uključuju razmatranja kao što su toksičnost i oblici koji sprečavaju da kompozicija ili formulacija izvrše svoj efekat.

[0046] Predmetni pronalazak takođe uključuje kompozicije pripremljene za čuvanje ili administraciju koje uključuju efikasnu količinu željenih jedinjenja u farmaceutski prihvatljivom nosaču ili razblaživaču. Prihvatljivi nosači ili razblaživači za terapijsku primenu su dobro poznati u farmaceutskoj oblasti. Na primer, konzervansi, stabilizatori, boje i agesni za podešavanje ukusa mogu biti obezbeđeni. Ovi uključuju natrijum benzoat, sorbinsku kiselinu i estre p-hidroksibenzoeve kiseline. Dodatno, antioksidansi i agensi za suspendovanje mogu se koristiti.

[0047] Farmaceutski efikasna doza je ona doza potrebna da spreči, inhibira pojavu, ili leči (ublaži simptom do neke mere, poželjno sve simptome) stanje bolesti. Farmaceutski efikasna doza uglavnom zavisi od tipa bolesti, upotrebljene kompozicije, puta adminsitracije, vrste sisara koji se tretira, fizičkih karakteristika određenog sisara koji se uzima u obzir, leka koji se uzima istovremeno, i drugih faktora koje će prepoznati prosečni poznavaoci medicinskih oblasti.

[0048] Formulacije ili siRNK pronalaska mogu se administrirati u jediničnim doznim formulacijama koje sadrže konvencionalne netoksične farmaceutski prihvatljive nosače, adjuvanse i/ili transportere. Formulacije može biti u obliku pogodnom za oralnu primenu, na primer, kao tablete, pastile, lozenge, vodene ili uljane suspenzije, disperzivni praškovi ili granule, emulzije, tvrde ili meke kapsule, ili sirupi ili eliksiri. Kompozicije nameravana za oralnu primenu može se pripremiti prema bilo kojoj metodi poznatoj u oblasti tehnike za proizvodnju farmaceutskih kompozicija i takve kompozicije mogu da sadrže jedan ili više zaslađivača, agenasa za podešavanje ukusa, agenasa za bojenje ili konzervanasa da bi se obezbedili farmaceutski elegantni i ukusni preparati. Tablete sadrže aktivan sastojak u smeši sa netoksičnim farmaceutski prihvatljivim ekscipijensima koji su pogodni za proizvodnju tableta.

[0049] Ovi ekscipijensi mogu biti, na primer, inertni razblaživači; kao što su kalcijum karbonat, natrijum karbonat, laktoza, kalcijum fosfat ili natrijum fosfat; agensi za granulisanje i raspadanje, na primer, kukuruzni skrob, ili alginska kiselina; agensi za vezivanje, na primer skrob, želatin ili akacija; i lubrikanti, na primer magnezijum stearat, stearinska kiselina ili talk. Tablete mogu biti bez premaza ili mogu biti premazane poznatim tehnikama. U nekim slučajevima ovakvi premazi mogu biti pripremljeni poznatim tehnikama da bi se odložilo raspadanje i apsorpcija u gastrointestinalnom traktu i time obezbedilo kontinuirano delovanje tokom dužeg perioda. Na primer, može se upotrebiti materijal za vremensko odlaganje kao što je gliceril monostearat ili gliceril distearat.

[0050] Formulacije za oralnu primenu mogu takođe biti prisutne kao tvrde želatinske kapsule u kojima se aktivni sastojak meša sa inertnim čvrstim razblaživačem, na primer, kalcijum karbonatom, kalcijum fosfatom ili kaolinom, ili kao meke želatinske kapsule u kojima je aktivni sastojak pomešan sa vodom ili uljanim medijumom, na primer uljem od kikirikija, tečnim parafinom ili maslinovim uljem.

[0051] Vodene suspenzije sadrže aktivne materijale u smeši sa ekscipijensima pogodnim za proizvodnju vodenih suspenzija. Takvi ekscipijensi su agensi za suspendovanje, na primer

1

natrijum karboksimetilceluloza, metilceluloza, hidropropil-metilceluloza, natrijum alginat, polivinilpirolidon, guma tragakant i guma akacija; agensi za dispergovanje ili vlaženje mogu biti fosfatid koji se javljaju u prirodi, na primer, lecitin, ili proizvodi kondenzacije alkilen oksida sa masnim kiselinama, na primer polioksietilen stearat, ili proizvodi kondenzacije etilen oksida sa alifatičnim alkoholima dugog lanca, na primer heptadekaetilenoksicetanol, ili kondenzacioni proizvodi etilen oksida sa parcijalnim estrima izvedenim iz masnih kiselina i heksitola kao što je polioksietilen sorbitol monooleat, ili kondenzacioni proizvodi etilen oksida sa parcijalnim estrima izvedenim iz masnih kiselina i anhidrida heksitola, na primer polietilen sorbitan monooleat. Vodene suspenzije mogu takođe da sadrže jedan ili više konzervanasa, na primer etil, ili n-propil p-hidroksibenzoat, jedan ili više agenasa za bojenje, jedan ili više agenasa za podešavanje ukusa, i jedan ili više zaslađivača, kao što su saharoza ili saharin.

[0052] Uljane suspenzije mogu biti formulisane suspendovanjem aktivnih sastojaka u biljnom ulju, na primer ulju kikirikiju, maslinovom ulju, susamovom ulju ili kokosovom ulju, ili u mineralnom ulju kao što je tečni parafin. Uljane suspenzije mogu sadržati agens za zgušnjavanje, na primer pčelinji vosak, tvrdi parafin ili cetil alkohol. Zaslađivači i agensi za podešavanje ukusa mogu se dodati da se obezbede ukusni oralni preparati. Ove kompozicije se mogu konzervirati dodavanjem antioksidansa kao što je askorbinska kiselina.

[0053] Disperzibilni praškovi i granule pogodni za priremanje vodene suspenzije dodavanjem vode obezbeđuju aktivni sastojak u smeši sa agensom za dispergovanje iili vlaženje, agensom za suspendovanje i jednim ili više konzervanasa. Pogodni agensi za dispergovanje ili vlaženje ili agensi za suspendovanje su ilustrovani onima koji su već pomenuti gore. Dodatni ekscipijensi, na primer zaslađivači, agensi za podešavanje ukusa i agensi za bojenje, mogu takođe biti prisutni.

[0054] Pogodni emulgatori mogu biti gume koje se javljaju u prirodi, na primer guma akacija ili guma tragakant, fosfatidi koji se javljaju u prirodi, na primer soja, lecitin, i estri ili parcijalni estri izvedeni iz masnih kiselina i heksitola, anhidridi, na primer sorbitan monooleat, i proizvodi kondenzacije navedenih parcijalnih estara sa etilen oksidom, na primer polioksietilen sorbitan monooleat. Emulzije mogu takođe sadržati zaslađivače i agense za podešavanje ukusa.

[0055] Sirupi i eliksiri mogu biti formirani sa zaslađivačima, na primer glicerolom, propilen glikolom, sorbitolom, glukozom ili saharozom. Takve formulacije mogu takođe da sadrže demulcent, konzervans i agense za podešavanje ukusa i bojenje. Farmaceutske kompozicije siRNK pronalaska mogu biti u obliku sterilne injektabilne vodene ili uljaste suspenzije.

[0056] Ova suspenzija može biti formulisana prema poznatoj oblasti tehnike korišćenjem pogodnih agenasa za dispergovanje ili vlaženje i agenasa za suspendovanje koji su pomenuti iznad.

[0057] Sterilna injektibilni praparat može takođe biti sterilni injektibilni rastvor ili suspenzija u netoksičnom parentalno prihvatljivom razblaživaču ili rastvaraču, na primer kao rastvor u 1,3-butandiolu. Među prihvatljivim transporterima i rastvaračima koji mogu biti korišćeni su voda, Ringerov rastvor i izotonični rastvor natrijum hlorida. Dodatno, sterilna, fiksna ulja su konvencionalno korišćena kao rastvarač ili medijum za suspendovanje. U ovu svrhu, bilo koje blago fiksno ulje se može koristiti uključujući sintetske mono-ili digliceride. Pored toga, masne kiseline kao što je oleinska kiselina nalaze primenu u pripremanju injekcija.

[0058] Molekuli nukleinske kiseline pronalaska mogu se takođe administrirati u obliku supozitorija, npr., za rektalnu administraciju leka. Ove kompozicije mogu biti pripremljene mešanjem leka sa pogodnim neiritirajućim ekscipijensom koji je čvrst na uobičajenim temperaturama ali tečan na rektalnoj temperaturi i iz tog razloga će se topiti u rektumu kako bi se oslobodio lek. Takvi materijalo uključuju kakao puter i polietilen glikole.

[0059] Molekuli nukleinske kiseline pronalaska mogu se administrirati parenteralno u sterilnom medijumu. Lek, u zavisnosti od transportera i koncentracije koji su korišćeni, može biti ili suspendovan ili rastvoren u transporteru. Povoljno, adjuvansi kao što su lokalni anestetici, konzervansi i agensi za puferovanje mogu se rastvoriti u transporteru.

[0060] Kao takav, dalji poželjni aspekt objave se odnosi na farmaceutsku kompoziciju gde navedena kompozicija sadrži najmanje siRNK koja cilja SEK ID BR: 1, kao što je opisano u prethodnim paragrafima.

[0061] Podrazumijeva se da specifični dozni nivo za bilo koji određeni subjekat zavisi od različitih faktora uključujući aktivnost korišćenog specifičnog jedinjenja, starost, telesnu težinu, opšte zdravlje, pol, dijetu, vreme administracije, put administracije, i stopu izlučivanja, kombinaciju leka i ozbiljnost pojedine bolesti koja se podvrgava terapiji.

[0062] Molekuli nukleinske kiseline predmetnog pronalaska mogu biti administrirani subjektu u kombinaciji sa drugim terapijskim jedinjenjima da se poveća ukupan terapijski efekat. Primena višestrukih jedinjenja da leče indikacije može povećati korisne efekte uz smanjenje prisustva neželjenih efekata.

1

[0063] Pronalazak je dalje opisan u sledećim neograničavajućim primerima.

PRIMERI

In vitro analiza

[0064] Da bi se pronašla narošito efikasna ciljna sekvenca za siRNK kiseline da se utiša TRPV1 (koje postižu važnu inhibiciju ekspresije gena), šest različitih siRNK su testirane. Ove siRNKs su opisane kao SEK ID BR: 2, SEK ID BR: 7 (samo kao referenca) i SEK ID BR: 17 do 20 (samo kao referenca).

[0065] SEK ID BR: 2 je siRNK koja cilja SEK ID BR: 1 prema objavi koja ima sledeću sekvencu:

Sens: 5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3'

Antisens: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'

[0066] SEK ID BR: 7 (samo kao referenca) (5'-UCGCCACGACAUGCUCUUGdTdT-3') odgovara klasičnom siRNK molekulu (21 nukleotida u dužini koji sadrže 3' prepuste napravljene od deoksitimidina) prethodno opisanom u WO 2007/045930 da efikasno cilja TRPV1 i redukuje odgovor oka na stimususe kapsaicina. SEK ID BR: 17 do 19 odgovaraju siRNKs dizajniranoj za TRPV1 prema različitim algoritmima dostupnim u oblasti tehnike kao što su oni koje su opisali Reynolds et al.2004 ili Ui-Tei et al 2004, i drugi. SEK ID BR: 20 (samo kao referenca) je komercijalno dostupna siRNK obezbeđena od Ambion-a i dizajnirana za TRPV1.

SEK ID BR: 17 (samo kao referenca)

Sens: 5'-CGCAUCUUCUACUUCAACU-3'

Antisens: 5'-AGUUGAAGUAGAAGAUGCG-3'

SEK ID BR: 18 (samo kao referenca)

Sens: 5'-GCGCAUCUUCUACUUCAAC-3'

Antisens: 5'-GUUGAAGUAGAAGAUGCGC-3'

SEK ID BR: 19 (samo kao referenca)

Sens: 5'-AAAGCCAUGCUCAACCUGC-3'

Antisens: 5'-GCAGGUUGAGCAUGGCUUU-3'

1

SEK ID BR: 20 (samo kao referenca)

Sens: 5'- UGAUCGCAGGAGUAUCUUUdTdT-3'

Antisens: 5'- AAAGAUACUCCUGCGAUCAdTdT-3'

[0067] Kao model da se testira efikasnost gore opisane siRNK, HeLa (humanog adenokarcinoma grlića materice) ćelijske kulture su korišćene. HeLa ćelije su transfektovane sa 100nM različitih jedinjenja i Lipofektaminom 2000 kao agensom za transfekciju. Sve transfekcije su izvršene praćene standardnih proizvođačkih uslova. U istoj transfekciji različita skremblovana siRNK je korišćena kao kontrola. Ćelijski peleti su sakupljeni na 24, 48, i 72 sat da bi se procenila moguće varijacije u nivoima protein i obrađeni pomoću PCR u realnom vremenu. Da bi se kvantifikovali rezultati dobijeni pomoću Qrt-PCR u realnom vremenu, koristili smo komparativnu metodu praga (Comparative Threshold Method).

[0068] Kao što pokazuju rezultati (slika 1), siRNK usmerena na ciljnu sekvenca SEK ID BR: 1, je mnogo efikasnija u smislu TRPV1 utišavanja gena nego prethodno opisani siRNK proizvodi usmereni na različit region istog gena. Štaviše ovaj efekat se održava u vremenu, jer 72 sata posle transfekcije postoji još uvek značajna negativna regulacija mRNK nivoa. Ovo trajanje efekta je nepredvidivo i specifično za sekvencu.

[0069] U cilju pružanja daljih poboljšanih proizvoda, različite hemijske modifikacije su uvedene na gore naveden proizvod, prema opisu ispod:

SEK ID BR: 3,

Sens: 5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3'

Antisens: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'

SEK ID BR: 4,

Sens: 5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3'

Antisens: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'

SEK ID BR: 8,

Sens: 5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3'

Antisens: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'

SEK ID BR: 9

Sens: 5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3'

Antisens: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'

SEK ID BR: 10 Sens: 5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3'

1

Antisen: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'

SEK ID BR: 11

Sens: 5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3'

Antisens: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'

[0070] Gde podvučeno predstavlja baze koje sadrže 2'-Ometil grupu.

SEK ID BR: 5,

Sens: 5'-AAGCGCAdTCdTdTCdTACdTdTCA-3'

Antisens: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'

SEK ID BR: 6,

Sens: 5'-AAGCGCAdTCdTdTCdTACdTdTCA-3'

Antisens: 5'-dTGAAGdTAGAAGAdTGCGCdTdT-3'

SEK ID BR: 12 Sens: 5'-AAGCGCAdTCUdTCdTACdTdTCA-3'

Antisens: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'

SEK ID BR: 13

Sens: 5'-AAGCGCAdTCUdTCdTACUdTCA-3'

Antisen: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'

SEK ID BR: 14

Sens: 5'-AAGCGCAdTCUUCdTACUdTCA-3'

Antisens: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'

SEK ID BR: 15

Sens: 5'-AAGCGCAdTCUUCUACUdTCA-3'

Antisens: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'

SEK ID BR: 16,

Sens: 5'-AAGCGCAdTCUUCUACUdTCA-3'

Antisens: 5'-UGAAGdTAGAAGAdTGCGCUU-3'

[0071] Gde su neki ili svi uracil nukleotidi supstituisani deoksitimidine nukleotidima.

[0072] Ova jedinjenja su testirana u testovima imunogenosti zajedno sa SEK ID BR: 2 (isto jedinjenje bez bilo kakvih modifikovanih nukleotida). Rezultati su pokazali da sva ova jedinjenja značajno redukuju indukciju imunološkog odgovor u mononuklearnim ćelijama periferne krvi. Povrh toga, većina jedinjenja je indukovala odgovor koji je bio na svojim

1

najvišim nivoima, niskim kao onaj proizveden od siRNK kiselina koje su napredovale kroz kliničke studije na ljudima (bevasiranib i SiRNK-027) koje su uključene u testove kao kontrola.

[0073] Kako varirajući stepeni modifikacija mogu menjati sposobnost utišavanje gena siRNK kiselina, ova jedinjenja su dalje testirana za njihov RNK kapacitet interferencije sa transfekcijijom u HeLa ćelije, i rezultujući TRPV1 mRNK nivoi su mereni prema metodi opisanoj u prethodnim paragrafima.

[0074] Kao što se može videti na slici 2, sva jedinjenja zadržavaju sposobnost da efikasno smanje TRPV1 mRNK nivoe u varirajućim stepenima.

[0075] Dalji neočekivani korisni efekat izveden iz gore opisanih jedinjenja je njihova poboljšana otpornost na degradaciju pomoću RNKaza kao što se može videti na slici 5.

[0076] Za ove eksperimente, jedinjenja su suspendovana u 10% humanoj plazmi u PBS-u na konačnoj koncentraciji od 2 µM i inkubirana tokom 24 sata na 37°C. Uzorci su zatim analizirani primenom HPLC-UV i količina preostalog intaktnog proizvoda je određena.

Kao što se može primetiti u slici 5, dvolančana jedinjenja od 19 nukleotida sa SEK ID BR: 2 (bez bilo kakve hemijske modifikacije) je skoro 3 puta više rezistentan na degradaciju nego prethodno opisana SEK ID BR: 21: (samo kao referenca) 5'-CAAGAUCGCACAGGAGAGCdTdT-3' (takođe opisana u WO 2007045930) koja sadrži 3' prepusta. Ovaj efekat je dalje poboljšan za jedinjenje sa SEK ID BR: 3, koje uključuje neke hemijske modifikovane nukleotide kao što je opisano u prethodnim paragrafima.

In vivo analiza

[0077] Životinjski modeli suvog oka i bola u oku često koriste zečeve, u ovom slučaju novozelenadske bele zečeve. U tom cilju, dalje prednosti siRNK kiselina objave je u tome što je ciljna sekvenca, SEK ID BR: 1, je visoko konzerviran region TRPV1 gena, kroz različite sekvence životinja. U stvari, ova sekvenca je identična između čoveka i zeca, čineći ovaj životinjski model naročito pogodnim za proučavanje navedenih bolesti.

[0078] Eksperiment opisan u nastavku je izveden korišćenjem standardnog modela bola u oku poznatog prosečnom poznavaocu u oblasti (Gonzalez et al. 1993). Ukratko, bol je indukovan primenom instilacije 30µl rastvora 1% kapsaicina (poznatog agonista TRPV1) u oku korišćenjem odgovarajuće mikropipete. Zbog etičkih razmatranja, životinje koje će se

1

tretirati sa kapsaicinom su prethodno primile dozu kapsazepina od 5mM, poznatog agonista kapsaicina, ili 40 µl rastvora koji sadrži jedinjenje koje se testira. Prema tome analgetski efekat je meren u poređenju sa kapsazepinom kao referentnim tretmanom.

[0079] Test i referentne stavke su ukapavani jednom dnevno od dana 1 do dana 3 i dva puta na dan 4 (tempo od 60 min) u desne oči. Na dan 4, 15 minuta posle poslednjeg ukapavanja, bol u rožnjači je indukovan u desnom oku životinja jednim ukapavanjem 1% kapsaicina. U kontralateralno oko ukapan je PBS tokom studije i služilo je kao kontrola.

[0080] Da se izmerio odgovor na bol, palpebralno otvaranje je mereno. Smatra se da je oko zatvoreno kao odgovor na bol, i pošto osećaji bola opadnu palpebralno otvaranje će se povećati nazad na normalne nivoe. Palpebralno otvaranje je mereno pre tretmana (osnovna linija), malo pre indukcije bola i zatim 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, minuta posle indukcije bola.

[0081] Kao što se može videti sa slika 3 i 4, jedinjenje prema predmetnom pronalasku je testirano, specifičnije jedinjenje sa SEK ID BR: 2, i primećeno je da indukuje viši analgetski efekat nego kapsazepin (oporavak oka meren stepenom parpebralnog otvaranja). Prema tome ovo jedinjenje je dokazalo da je efikasan terapijski tretman za nelagodnost u oku.

[0082] Osim toga, drugi in vivo eksperiment je izveden u kojem jedinjenja objave (SEK ID BR: 2, SEK ID BR: 4 iSEK ID BR: 5) su administrirani u oči zečeva, sajedno sa SEK ID BR: 21 (samo kao referenca), prethodno opisanim u WO 2007045930.

U ovom slučaju, zečevi (6 aživotinja po grupi tretmana) su primili dnevnu administraciju jedinjenje tokom 3 uzastopna dana. Trećeg dana, dva sata posle poslednjeg ukapavanja, životinje su žrtvovane. Očna tkiva ovih zečeva su oporavljena i prisustvo TRPV1 specifične mRNK je analizirano primenom RT-PCR. Sledeća tabela prikazuje nivoe TRPV1 utišavanja gena postignuto u datom tkivu izraženo kao odnos % inhibicije postignute sa SEK ID BR: 21 referentnog jedinjenja (samo kao referenca).

[0083] Kao što je jasno iz ovih rezultata, jedinjenja predmetnog pronalaska su mnogo efikasnija kada se utišava TRPV1 ekspresija gena u očnim tkivima nego prethodno opisana jedinjenja.

2

Visoka efikasnost zajedno sa dužim trajanjem efekta jedinjenja, trebalo bi da obezbede povoljne režime doziranja, jer omogućavanje više vremena između doza bi značajno poboljšalo kvalitet života pacijenta.

REFERENCE

[0084]

Baumann TK & Martenson ME. (2000). "Extracellular protons both increase the activity and reduce the conductance of capsaicin-gated channels." J Neurosci 20:RC80.

Caterina et al. (1997). "The kapsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway." Nature 389(6653):816-24.

Caterina et al. (2001). "The vanilloid receptor: a molecular gateway to the pain pathway." Annu Rev Neurosci.24:487-517.

Cerutti, L., N. Mian, et al. (2000). "Domens in gene silencing and cell differentiation proteins: the novel PAZ domain and redefinition of the Piwi domain." Trends Biochem Sci 25(10): 481-2.

Collins, R. E. and X. Cheng (2005). "Structural domains in RNAi." FEBS Lett 579(26): 5841-9.

Doench, J.G. Sharp, P.A. "specificity of microRNA target selection in translational repression" Gens Dev.18, 504-511; 2004

Elbashir, S. M., W. Lendeckel, et al. (2001). "RNA interference is mediated by 21-and 22-nukleotide RNAs." Gens Dev 15(2): 188-200.

Fire, A., S. Xu, et al. (1998). "Potent and specific genetic interference by doublestranded RNA in Caenorhabditis elegans." Nature 391 (6669): 806-11.

Gonzalez, G. G., Garcia, P. et al. (1993). "Reduction of capsacin-induced ocular pain and neurogenic inflammation by calcium antagonists." Invest Ophthalmol Vis Sci 34(12):3329-3335.

Hutvagner, G. and P. D. Zamore (2002). "A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex." Science 297(5589): 2056-60.

Jia et al. (2005). "TRPV1 receptor: a target for the treatment of pain, cough, airway disease and urinary incontinence." Drug News Perspect 18(3):165-71.

Lewis, B.P., Shih I. Et al. "prediction of mammalian micro RNA targets" Cell 115:787-798; 2003

Liu, J., M. A. Carmell, et al. (2004). "Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi." Science 305(5689): 1437-41.

Ma, J. B., Y. R. Yuan, et al. (2005). "Structural basis for 5'-end-specific recognition of guide RNA by the A. fulgidus Piwi protein." Nature 434(7033): 666-70.

Montell et al. (2002). "Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells." Gens Dev 16(8):948-58.

Nykanen, A., B. Haley, et al. (2001). "ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway." Cell 107(3): 309-21.

Orban, T. I. and E. Izaurralde (2005). "Decay of mRNAs targeted by RISC requires XRN1, the Ski complex, and the exosome." Rna 11(4): 459-69.

Parrish, S., J. Fleenor, et al. (2000). "Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference." Mol Cell 6(5): 1077-87.

Rand, T. A., S. Petersen, et al. (2005). "Argonaute2 cleaves the anti-guide strand of siRNA during RISC activation." Cell 123(4): 621-9.

Reynolds, A., Leake, D., et al. (2004). "Odnosnal siRNA design for RNA interference " Nat Biotechnol 22(3):326-30.

Schubert, S. et al. (2005). "Local RNA target structure influences siRNA efficacy: systematic analysis of intentionally designed binding regions." J Mol Biol 348:883-893. Song, J. J., S. K. Smith, et al. (2004). "Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity." Science 305(5689): 1434-7.

Ui-Tei, K., Naito, Y., et al. (2004). "Guidelines for the selection of highly effective siRNA sequence for mammalian and chick RNA interference." Nucleic Acids Res 32(3): 936-48.

2

2

2

2

2

2

1

2

4

4

4

Claims (6)

Patentni zahtevi

1. siRNK, koja se sastoji od nukleotidne sekvence odabrane od SEK ID BRojevima: 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili 16, za primenu u lečenju stanja bolesti okarakterisanog povećanom ekspresijom i/ili aktivnošću TRPV1 gde pomenuti molekul specifično cilja SEK ID BR: 1, i gde primena pomenute siRNK smanjuje ekspresiju i/ili aktivnost TRPV1.

2. siRNK za primenu u skladu sa patentnim zahtevom 1, gde pomenuto stanje oka je okularni bol.

3. siRNK za primenu u skladu sa patentnim zahtevima 1 ili 2, gde pomenuto stanje oka je odabrano od promenjene osetljivosti posle refraktivne hirurgije, upotrebe kontaktnih sočiva, sindroma suvog oka, i Sjogrenovog sindroma.

4. Primena siRNK, koja se sastoji od nukleotidne sekvence odabrane od SEK ID BRojevima: 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili 16, u proizvodnji leka za lečenje stanja oka okarakterisanog povećanom ekspresijom i/ili aktivnošću TRPV1, i gde primena pomenute siRNK smanjuje ekspresiju i/ili aktivnost TRPV1.

5. Primena u skladu sa patentnim zahtevom 4 gde pomenuto stanje oka je okularni bol.

6. Primena u skladu sa patentnim zahtevom 4 ili 5 gde pomenuto stanje oka je odabrano od promenjene osetljivosti nakon refraktivne hirurgije, upotrebe kontaktnih sočiva, sindroma suvog oka, i Sjogrenovog sindroma.

4