RS58919B1 - Imunogeni sastav koji sadrži polipeptide izvedene iz panton-valentin leukocidina (pvl) - Google Patents

Description

Opis

POZADINA

Oblast obelodanjivanja

[0001] Ovo obelodanjivanje se odnosi na tretiranje i prevenciju Staphylococcus aureus (S. aureus) infekcije. Naročito, obelodanjivanje daje sastave i metode za prevenciju S. aureus infekcije i za tretiranje bolesti izazvane sa leukocidinom, npr. Panton-Valentin leukocidinom (PVL) ili i S. aureus infekcije koja ispoljava gama-hemolizin.

Pozadina obelodanjivanja

[0002] Staphylococcus aureus (SA) je gram pozitivni ljudski patogen koji je povezan sa ili izaziva široki opseg patologija koje su u opsegu od infekcija kože i mekog tkiva do sistemskih infekcija opasnih po život, npr. manje opasnih infekcija kože kao što su bubuljice, gnojni ekcem, čirevi (furunkule), cellulitis folliculitis, karbunkule, sindrom ljuštenja kože i apscesi, do infekcija opasnih po život kao što su pneumonija, sepsa, endokarditis, meningitis, infekcije rana nakon operacije, septikemija i sindrom toksičnog šoka (Nizet, V., J Allergy Clin Immunol, 2007. 120(1): str.13-22; Kotzin, i dr., Adv Immunol, 1993.54: str.99-166; Meyer i dr., Int J Infect Dis, 2001.5(3): str.163-6; Schuberth i dr., Vet Microbiol, 2001.82(2): str. 187-99; i Silverstein i dr., in Microbiology, Davis i dr., ured. (Lippincott, Philadelphia, 1990), str. 485-506).

[0003] Pneumonija je jedna od najozbiljnijih i istaknutijih komplikacija S. aureus infekcije koja, samo u SAD, dovodi do 50.000 slučajeva godišnje (Kuehnert, i dr., Emerg. Infect. Dis.

11:868-872, 2005). S. aureus pneumonija je tradicionalno bila povezani ventilator ali u poslednjih nekoliko godina je takođe prepoznata kao glavni uzrok pneumonije stečene u zajednici prevashodno kod zdrave dece i mladih pojedinaca.

[0004] Opseg patologija povezanih sa SA oslikava različite mogućnosti ovog mikroorganizma da zaobiđe urođeni i adaptivni imuni odgovor upotrebom više faktora virulencije uključujući koagulazu, kapsularne polisaharide, adhezine, proteaze, egzoproteine koji deaktiviraju sistem komplemenata, toksine koji formiraju pore i druga sredstva za posredovanje urođenog imunog odgovora (Nizet, V., J Allergy Clin Immunol, 2007.120(1): str.13-22; Tristan i dr., J Hosp Infect, 2007.65 Dopunj.2: str. 105-9). Brzo širenje SA otporne na metilicil (MRSA) podvlači značaj razvijanja vakcina za sprečavanje ili smanjenje ozbiljnosti MRSA infekcija. Većina prethodnih pristupa razvijanja vakcine je ignorisalo značaj uključivanja oslabljenih komponenti toksina kako bi se razoružale strategije SA za zaobilaženje imunog sistema.

[0005] Značajno povećanje S. aureus izolata koji pokazuju otpornost na većinu trenutno dostupnih antibiotika za tretiranje infekcije je primećeno u bolnicama širom sveta. Dok su MRSA sojevi početni ograničeni na zdravstvene ustanove, zabeležene su skorije epidemije S. aureus u zajednicama (CA-MRSA) koje izazivaju ozbiljne bolesti kod zdrave populacije. Do danas, pet CA-MRSA klonih rodova je povezano sa ovim pojavama: srednjozapadni klon (USA400, CC1), evropski klon (CC80), jugozapadni pacifički klon (CC30), pacifički klon (CC59) i pandemijski klon (USA300, CC8). Dodatno SCCmec IV, karakteristično svojstvo ovih glavnih CA-MRSA rodova je u tome što imaju lukPV operon koji kodira Panton Valentin Leukocidin (PVL) (Diep, B.A. i M. Otto, Trends Microbiol, 2008.16(8): str.361-9), nošen od strane lizogenih faga φSLT, φPVL, φSA2MW i φSA2usa (Diep i dr., Lancet, 2006.

367(9512): str.731-9; Kaneko i dr., Gene, 1998.215(1): str.57-67; Narita i dr., Gene, 2001.

268(1-2): str.195-206). Razvoj penicilina za borbu protiv S. aureus je glavno napredovanje za kontrolisanje i tretiranje. Nažalost, brzo su se pojavili organizmi otporni na penicilin i potreba za novim antibioticima je na svom vrhuncu. Uvođenjem svakog novog antibiotika, S. aureus je bila u stanju da se suprotstavi sa β-laktamazama, izmenjenim proteinima koji se vezuju za penicilin i mutiranim proteinima ćelijske membrane koji omogućavaju postojanje bakterije. Kao posledica, javile su se S. aureus otporne na meticilin (MRSA) i organizmi koji su otporni na više lekova i uspostavili su glavno uporište u bolnicama i staračkim domovima širom sveta. (Chambers, H. F., Clin Microbiol Rev., 1:173, 1988; i Mulligan, M. E., i dr., Am J Med., 94:313, 1993). Danas, skoro polovina stafilokoka sojeva koji izazivaju nozokomijalne infekcije su otporni na sve antibiotike osim na vankomicin i linezolid. Kako je u literaturi zabeleženo mnogo S. aureus otpornih na međujedinjenja vankomicina (VISA) među MRSA i nekoliko S. aureus otpornih na vankomicin, deluje da je samo pitanje vremena kada će vankomicin takođe postati nedelotvoran. (Appelbaum PC., Clin Microbiol Infect., 12 Dopunj.

1:16-23, 2006).

[0006] Prirodni imunitet na S. aureus infekcija ostaje slabo shvaćen. Obično, zdravi ljudi i životinje pokazuju visok stepen urođene otpornosti na S. aureus infekcije. Zaštita je pripisana nepromenjenim epitelnim i mukoznim barijerama i normalnim ćelijskim i humoralnim odgovorima. Titri antitela za S. aureus komponente su povišeni nakon nekoliko infekcija (Ryding i dr., J Med Microbiol, 43(5):328-334, 1995), međutim do danas ne postoji serološki dokaz korelacije između ovih titra stečenih antitela i ljudskog imuniteta.

[0007] Toksini koji formiraju pore koje S. aureus luče su od presudnog značaja za zaobilaženje imunog sistema. Ovi toksini mogu stvoriti prednosti pri preživljavanju za bakterije formiranjem pora u membrani ciljanih ćelija, uključujući smrt ćelija i oslabljenje domaćina za vreme trajanja prvih faza infekcije. Zbog ograničenih modaliteta tretiranja za S. aureus infekciju, pojavljivanje S. aureus otpornih na meticilin predstavlja ogromnu pretnju javnom zdravlju. Dok molekularna osnova bolesti ostaje nejasna, MRSA infekcija stečena u zajednici je blisko povezana sa prisustvom Panton-Valenin leukocidina (PVL), bipartit toksina koji se sastoji od 3~4 kDa LukF-PV i ∼32 kDa LukS-PV proteina (H. F. Chambers. The New England Journal of Medicine 352, 1485-1487, 2005). Funkcija ovde dve PVL komponente (LukF-PV i LukS-PV) je sinergička i zahteva niz događaja na površini membrane ciljane ćelije (J. Kaneko i Y. Kamio. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 68, 981-1003, 2004). U prvom koraku, izlučeni, rastvorljivi u vodu LukF-PV i LukS-PV monomeri se gomilaju na površini membrane i nakon toga se sakupljaju u heterodimere. Na postepeni način, ovi heterodimeri se dalje oligomerišu u heterotetramere koji su okarakterisani naizmeničnim LukF-PV i LukS-PV podjedinicama. Ovi heterotetrameri se dalje sakupljaju u oktamernu, strukturu nalik disku koja se sastoji od naizmeničnih LukS-PV i LukF-PV podjedinica u 1:1 stehiometriji (L. Jayasinghe i H. Bayley. Protein Sci 14, 2550-2561, 2005). U ovoj fazi, eksperimentalni podaci ukazuju da PVL postoji kao oktamer u konformaciji pre pora koji nije u potpunosti funkcionalan i ne prolazi ćelijsku membranu. Posle toga, struktura pre pora prolazi kroz glavne konformacione izmene što za rezultat daje formiranje jedne transmembranske pore koja omogućava priliv kalcijum jona, što dovodi do smrti ćelije (V. T. Nguyen, Y. Kamio, i H. Higuchi. The EMBO Journal 22, 4968-4979, 2003). PVL izaziva citolizu što za rezultat daje gubitak imunih ćelija kao što su neutrofili i takođe može izazvati oštećenje tkiva što pomaže bakterijsko širenje. Veruje se da je PVL uključen u patogenezu invazivne pneumonije i kožnih infekcija.

[0008] WO 2006/135912 i US 2009/0074755 obelodanjuju mutante LukS-PV i LukF-PV sa prekinutom oligomerizacijom. US 2010/0158871 obelodanjuje sastave i metode za ciljano isporučivanje sredstava protiv tumora kao što su nukleinske kiseline koje kodiraju PVL, upotrebom bolesnih eritrocita, njihovih nuklearnih prekursora i ćelija eritroleukemije.

[0009] U skladu sa time, u struci preostaje potreba za sastavima i metodama koje mogu bezbedno dodavati imunitet S. aureus koje ispoljavaju PVL.

KRATAK REZIME

[0010] Predmetno obelodanjivanje pruža metode za izazivanje imunog odgovora protiv S. aureus koja ispoljava PVL, metode za prevenciju ili tretiranje S. aureus infekcija koje ispoljavaju PVL, i sastave za prevenciju ili tretiranje S. aureus infekcija koje ispoljavaju PVL. U određenim otelotvorenjima, obelodanjivanje pruža oslabljene mutante LukS-PV i LukF-PV kao vakcine za S. aureus infekcije.

[0011] Neka otelotvorenja obelodanjivanja polipeptid izolovane mutirane stafilokokne leukocidin podjedinice koji sadrži stafilokokne leukocidin podjedinice divljeg tipa osim od jedne do pet aminokiselinskih zamena na konzervisanim ostacima, što smanjuje toksičnost mutirane leukocidin podjedinice relativno u odnosu na odgovarajuću leukocidin podjedinicu divljeg tipa; gde leukocidin podjedinica divljeg tipa sadrži tri uzastopna regiona označena A-B-C raspoređene od amino završetaka do karboksi završetaka i gde region B ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2.

[0012] Takođe je obelodanjena ovde opisana mutirana leukocidin podjedinica, gde region A leukocidin podjedinice divljeg tipa sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 i gde region C leukocidin podjedinice divljeg tipa sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3.

[0013] Takođe je obelodanjena ovde opisana mutirana leukocidin podjedinica koja sadrži aminokiselinsku zamenu na poziciji K24 SEQ ID NO: 2. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja, K24 je zamenjena sa alaninom.

[0014] Neka otelotvorenja obelodanjivanja obuhvataju mutiranu leukocidin podjedinicu kao što je ovde opisano, koja sadrži aminokiselinsku zamenu na poziciji S18 SEQ ID NO: 3. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja S18 je zamenjena sa alaninom.

[0015] Neka otelotvorenja obelodanjivanja obuhvataju mutirani leukocidin kao što je ovde opisano, koji sadrži aminokiselinsku zamenu na poziciji Y58 SEQ ID NO:2. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja Y58 je zamenjena sa alaninom.

[0016] Neka otelotvorenja obelodanjivanja obuhvataju mutiranu leukocidin podjedinicu kao što je ovde opisano, koja sadrži aminokiselinsku zamenu na poziciji T11 SEQ ID NO: 1. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja T11 je zamenjena sa fenilalaninom.

[0017] Neka otelotvorenja obelodanjivanja obuhvataju mutiranu leukocidin podjedinicu kao što je ovde opisano, koja sadrži aminokiselinsku zamenu na poziciji D28 SEQ ID NO: 2. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja D28 je zamenjena sa alaninom.

[0018] U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja leukocidin podjedinica divljeg tipa je Panton-Valentin leukocidin (PVL) LukS-PV. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja, leukocidin podjedinica divljeg tipa ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 15, i SEQ ID NO: 16. U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja mutirana LukS-PV podjedinica ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, i SEQ ID NO: 14. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja ovde opisana mutirana leukocidin podjedinica ima amino kiselinu sa SEQ ID NO: 14.

[0019] U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja mutirana leukocidin podjedinica kao što je ovde opisano ima izračunatu molekulsku energiju između 600 kcal/mol i 7500 kcal/mol, ili između 900 kcal/mol i 3900 kcal/mol, ili između 2000 kcal/mol i 3650 kcal/mol u kompleksu sa podjedinicom Panton-Valentin leukocidina (PVL) divljeg tipa LukF-PV.

[0020] Neka otelotvorenja obelodanjivanja polipeptid izolovane mutirane stafilokokne leukocidin podjedinice koji sadrži stafilokokne leukocidin podjedinice divljeg tipa osim od jedne do pet aminokiselinskih zamena na konzervisanim ostacima, što smanjuje toksičnost mutirane leukocidin podjedinice relativno u odnosu na odgovarajuću leukocidin podjedinicu divljeg tipa; gde leukocidin podjedinica divljeg tipa ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4.

[0021] U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja mutirana leukocidin podjedinicu kao što je ovde opisano, sadrži aminokiselinsku zamenu na poziciji K8. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja K8 je zamenjena sa alaninom.

[0022] U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja mutirana leukocidin podjedinicu kao što je ovde opisano, sadrži aminokiselinsku zamenu na poziciji D28. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja D28 je zamenjena sa alaninom.

[0023] U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja mutirana leukocidin podjedinicu kao što je ovde opisano, sadrži aminokiselinsku zamenu na poziciji E53. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja E53 je zamenjena sa alaninom.

[0024] U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja leukocidin podjedinica divljeg tipa je Panton-Valentin leukocidin (PVL) LukF-PV. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja, leukocidin podjedinica divljeg tipa ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, i SEQ ID NO: 27. U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja mutirana LukF-PV podjedinica ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, i SEQ ID NO: 20. U jednom otelotvorenju, mutirana LukF-PV podjedinica ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18.

[0025] U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja mutirana leukocidin podjedinica kao što je ovde opisano ima izračunatu molekulsku energiju između 900 kcal/mol i 1500 kcal/mol u kompleksu sa podjedinicom Panton-Valentin leukocidina (PVL) divljeg tipa LukS-PV.

[0026] Neka otelotvorenja obelodanjivanja obuhvataju mutiranu leukocidin podjedinicu kao što je ovde opisano, koja je manje toksična u probi toksičnosti neutrofila u poređenju sa odgovarajućom leukocidin podjedinicom divljeg tipa.

[0027] Neka otelotvorenja obelodanjivanja obuhvataju mutiranu leukocidin podjedinicu kao što je ovde opisano, koja se ne oligomerizuje sa komponentom leukocidina divljeg tipa. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja, komponenta leukocidina divljeg tipa je izabran iz grupe koju čine LukS-PV podjedinica, LukF-PV podjedinica, Gama hemolizin A, Gama hemolizin B, Gama hemolizin C, LukE i LukD podjedinica ili bilo koja njihova kombinacija.

[0028] Takođe je ovde obelodanjen polipeptidni kompleks koji sadrži mutirane leukocidin podjedinice kao što je ovde opisano.

[0029] Takođe je obelodanjen izolovani polinukleotid koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira ovde opisanu mutiranu leukocidin podjedinicu. U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja, polinukleotid dalje sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu. U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja, heterologna nukleinska kiselina sadrži promoter operativno povezan sa nukleinskom kiselinom koja kodira ovde opisani polipeptid.

[0030] Takođe je obuhvaćen vektor koji sadrži ovde opisani polinukleotid ili ćeliju domaćina koja sadrži vektor. U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja, vektor je plazmid. U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja, ćelija domaćina je bakterija, ćelija insekta, ćelija sisara, ćelija kvasca ili biljke. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja, bakterija je Escherichia coli.

[0031] Takođe je opisana metoda za proizvodnju polipeptida mutirane stafilokokne leukocidin podjedinice, koja obuhvata kultivisanje ovde opisane ćelije domaćina i dobijanje polipeptida.

[0032] Dalje je opisan sastav koji sadrži mutiranu leukocidin podjedinicu ili polipeptidni kompleks, kao što je ovde opisano, i nosač. Sastav može dalje sadržati adjuvans. Dalje je obelodanjen sastav koji sadrži dodatni stafilokokni antigen. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja, dodatni stafilokokni antigen je polipeptid alfa-hemolizin podjedinice.

[0033] Takođe je obelodanjena metoda izazivanja imunog odgovora kod domaćina protiv Staphylococcus aureus soja, koja obuhvata davanje ispitaniku koji ima potrebu za imunim odgovorom delotvorne količine ovde opisanog sastava. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja imuni odgovor je odgovor na antitelo. U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja imuni odgovor je izabran iz grupe koju čine urođeni odgovor, humoralni odgovor, odgovor na antitelo, T ćelijski odgovor i kombinacija dva ili više navedena takva imuna odgovora.

[0034] Takođe je obelodanjena metoda prevencije ili tretiranja stafilokokne bolesti ili infekcije kod ispitanika koja obuhvata davanje ispitaniku koji ima potrebu za time ovde opisanog sastava. Infekcija može biti lokalizovana ili sistemska infekcija kože, mekog tkiva, krvi ili organa ili je po prirodi autoimuna a bolest može biti respiratorna bolest, kao što je pneumonija. Ispitanik može biti životinja, kičmenjak, sisar ili čovek. Ovde opisani sastav se može davati intramuskularnom injekcijom, intradermalnom injekcijom, intraperitonealnom injekcijom, subkutanom injekcijom, intravenskom injekcijom, oralno, mukozno, intranazalno ili pulmonarno.

[0035] Takođe je obuhvaćena metoda za proizvodnju vakcine protiv S. aureus infekcije koja obuhvata izolovanje mutirane leukocidin podjedinice ili polipeptidnog kompleksa, kao što je ovde opisano, i kombinovanje mutirane leukocidin podjedinice ili polipeptidnog kompleksa sa adjuvansom. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja, metoda obelodanjuje dalje kombinovanje mutirane leukocidin podjedinice ili polipeptidnog kompleksa sa dodatnim stafilokoknim antigenom.

KRATAK OPIS SLIKA

[0036]

Slika 1-Interfejs interakcije između Thr28 od LukS-PV i Asn158 i Phe159 od LukF-PV.

Slika 2-Interfejs interakcije između Ser209 od LukS-PV i Lys102 od LukF-PV.

Slika 3-Procenat (%) preživljavanja HL-60 izvedenih neutrofila u prisustvu 3000 ili 300 ng/ml LukS-PV mutanata (K97A, D101A, S209A, T28F, T28F/Y131A, T28F/S209A, ili T28F/K97A/S209A) ili LukS-PV divljeg tipa zajedno sa istim koncentracijama LukF-PV divljeg tipa. Traka samo ćelije predstavlja kontrolu bez dodatog toksina. Podaci su prikazani kao srednja vrednost 3-5 eksperimenata sa standardnom devijacijom prikazanom kao trake sa greškama.

Slika 4-Procenat (%) preživljavanja HL-60 izvedenih neutrofila u prisustvu 3000 ili 300 ng/ml LukF-PV mutanata (K102A, D121A, ili E147A) ili LukF-PV divljeg tipa zajedno sa istim koncentracijama LukS-PV divljeg tipa ili trostrukim mutantom LukS-PV kao što je definisano na Slici 3. Traka samo ćelije predstavlja kontrolu bez dodatog toksina.

Slika 5-Poravnanje aminokiselinskih sekvenci S podjedinica leukocidina.

Slika 6-Procenat (%) preživljavanja polimorfonuklearnih neutrofila (PMN) u supernatantima PVL pozitivnih (USA300&400) i PVL negativnih (Newman, 8325-4) SA sojeva tretiranih sa anti-LukS-PV ili kontrolom (ukupni IgG kod zeca). PVL: prečišćeni PVL; BHI: srednja kontrola; i samo ćelije: kontrola bez dodatog toksina. Slika 7-(A) SDS-PAGE i (B) Western blot analiza za mutirane PVL podjedinice. M: MW marker; Traka 1: LukS-PV Mut9; Traka 2: LukF-PV Mut1. (C) SDS-PAGE (Traka 1) i Western blot (Traka 2) analiza za LukF-PV trostrukog mutanta (K102A/D121A/E147A); M: MW marker.

Slika 8-(A) Procenat (%) preživljavanja HL-60 izvedenih neutrofila tretiranih sa povećanim koncentracijama divljeg tipa ili mutanta LukS u kombinaciji sa LukF divljeg tipa. Rezultati su iz 5 nezavisnih eksperimenata. STDV je prikazana samo za divlji tip i trostrukog mutanta. (B) % preživljavanja HL-60 izvedenih neutrofila tretiranih sa povećanim koncentracijama divljeg tipa ili mutiranog LukF u kombinaciji sa LukS divljeg tipa ili LukS trostrukim mutantom (Mut9). (C) % preživljavanja HL-60 sa povećanim koncentracijama divljeg tipa ili trostrukog mutanta LukF ili LukF mutanta 1 u kombinaciji sa LukS divljeg tipa ili LukS trostrukim mutantom (Mut9). Slika 9-Termičko odvijanje LukS-PV i LukF-PV proteina kao što je praćeno sa termoflour probom upotrebom Sypro Orange boje. (A) Dijagram intenziteta fluorescencije za PVL proteine (LukS-PV divljeg tipa LukS-PV Mut 8, LukS-PV Mut 9, LukF-PV divljeg tipa i LukF-PV Mut 1) pri 588 nm u odnosu na temperaturu.

Podaci su sakupljeni za svakih 5°C. (B) Dijagram odvijenog dela izračunat iz krive termičke denaturacije za PVL proteine (LukS-PV divljeg tipa, LukS-PV Mut 8, LukS-PV Mut 9, LukF-PV divljeg tipa i LukF-PV Mut 1).

Slika 10-Imunogenost LukS-Mut9, LukS-PV divljeg tipa i kontrole (STEBVax) kod miševa sa različitim adjuvansima. Korišćene doze: antigeni: 10 ug; Al(OH)3: 34 ug, AlPO4: 70 ug, IDC-1001: 20 ug, i CpG: 10 ug/mišu. (A) Ukupni titri antitela određeni sa ELISA za pojedinačne serume miševa (EC50; tj. razblaženje seruma sa 50% maksimalnog signala na ELISA pločama obloženim sa LukS-PV divljeg tipa). (B) Neutralizacija određena u HL-60 probi neutralizacije toksina upotrebom LukS-PV divljeg tipa i LukF-PV toksina. Procenat neutralizacije toksina divljeg tipa je prikazan pri razblaženju seruma od 1:100 od vakcinisanog miša (serum dobijen od 5 miševa u svakoj grupi).

Slika 11-Bakterijski CFU u krvi i organima (jetra, slezina, pluća i bubrezi) nakon tretiranja miševa sa 2 mg naivnog IgG (N), 2 mg AT62-IgG (AT) ili kombinacijom 2mg AT62-IgG i 0.25 mg LukS-PV IgG (AT+S).

Slika 12-Krive preživljavanja koje prikazuju zaštitu protiv (A) bakteremije/sepse i (B) pneumonije sa Luk (LukS Mut 9, LukF Mut1, i LukS Mut 9 LukF Mut1) i Hla (AT-62aa) kandidata za vakcinu kao i kombinacija LukS Mut 9 LukF Mut1 AT-62aa i BSA kontrole. Dalja smrtnost nije primećena nakon prikazanih vremenskih tački. Slika 13-(A) Specifičnost LukS-PV mutanta-9 seruma miševa sa homolognim antigenom, (B) Unakrsna reaktivnost LukS-PV mutanta-9 seruma miševa sa HlgB antigenom, (C) Unakrsna reaktivnost LukS-PV mutanta-9 seruma miševa sa HlgC antigenom. (D) Efikasnost neutralizacije LukS-PV mutanta 9 seruma miševa u odnosu na 200 ng/ml PVL i ili gama-hemolizin toksina u invitro XTT probi citotoksičnosti na osnovu ljudske neutrofilne ćelijske linije HL-60.

Slika 14-(A) MPD zasnovana proba oligomerizacije. Traka 1: Marker za molekulsku masu; Traka 2: LukS wt+LukFwt; Traka 3: LukS wt Lukf mut1; Traka 4: LukS wt+ Gama B; Traka 5: LukF wt+ LukS mut9; Traka 6: LukS mut9 LukF mut1; Traka 7: LukS mut9 Gama B. (B) Suzbijanje oligomerne veze sa anti LukS specifičnim poliklonalnim antitelom. Traka 1: Marker; Trake 2-8: LukS+LukF anti-LukS pAbs pri 2-puta smanjenim koncentracijama (5,5mg/ml do 0,85mg/ml); Traka 9:

LukS+LukF bez pAbs; Traka 10: LukS+LukF+ pAbs bez MPD; Traka 11: pAbs samo MPD. (C) Suzbijanje oligomerne veze formirane sa LukS-PV hlgB sa anti LukS specifičnim poliklonalnim antitelom. Traka 1: Marker; Trake 2-8: LukS-PV hlgB (940 ng each) anti-LukS pAbs pri 2-puta smanjenim koncentracijama (34,5 ug/ml do 0,5mg/ml); Traka 9: LukS-PV hlgB bez pAbs; Traka 10: LukS-PV hlgB pAbs bez MPD; Trake 11-14 naivni pAbs zeca (34,5 ug/ml do 4,3 mg/ml) LukS-PV hlgB (940 ng svaki) i Traka 15: Naivni pAbs zeca+ samo MPD.

DETALJNI OPIS

[0037] Pronalazak je definisan priloženim patentnim zahtevima. Bilo koje otelotvorenje koje nije u okviru priloženih patentnih zahteva ne čini deo pronalaska.

[0038] Ovde su opisani polipeptidi mutiranih stafilokoknih leukocidin podjedinica, npr. peptid mutirane LukS-PV podjedinice ili polipeptid mutirane LukF-PV podjedinice, sastavi koji sadrže jednu ili više mutiranih leukocidin podjedinica kao što je ovde obelodanjeno i metode za izazivanje imunog odgovora protiv stafilokoka, npr. S. aureus ili za tretiranje ili prevenciju stafilokokne infekcije kod ispitanika, koja obuhvata davanje ispitaniku delotvorne količine polipeptida mutirane stafilokokne leukocidin podjedinice kao što je ovde obelodanjeno.

[0039] Potrebno je napomenuti da se termin „a“ ili „an“ entiteta [članovi u engleskom jeziku] u potpunosti odnose na jedan ili više od tih entiteta; na primer, „polipeptid“ se prihvata da predstavlja jedan ili više polipeptida. Kao takvi, termini „a“ (ili „an“), „jedan ili više“ i „bar jedan“ mogu se ovde naizmenično koristiti.

[0040] Termini „nukleinska kiselina“ ili „fragment nukleinske kiseline“ se odnose na jedan ili više segmenata nukleinske kiseline, npr. fragmente DNK ili RNK, prisutne u polinukleotidu ili konstruktu. Dve ili više nukleinskih kiselina obelodanjivanja može biti prisutno u jednom polinukleotidnom konstruktu, npr. u jednom plazmidu ili u odvojenim (neidentičnim) polinukleotidnim konstruktima, npr. na odvojenim plazmidima. U nastavku, bilo koja nukleinska kiselina ili fragment nukleinske kiseline može kodirati jedan polipeptid, npr. jedan antigen, citokin ili regulatorni polipeptid ili može kodirati više od jednog polipeptida, npr. nukleinska kiselina može kodirati dva ili više polipeptida. Dodatno, nukleinska kiselina može kodirati regulatorni element kao što je promoter ili terminator transkripcije, ili može kodirati specijalizovani element ili motiv polipeptida ili proteina, kao što je sekretorni signalni peptid ili funkcionalni domen.

[0041] Termin „polinukleotid“ je namenjen da obuhvati pojedinačnu nukleinsku kiselinu ili fragment nukleinske kiseline kao i više nukleinskih kiselina ili fragmenata nukleinske kiseline i odnosi se na izolovani molekul ili konstrukt, npr. virusni genom (npr. neinfektivni virusni genom), informaciona RNK (iRNK), plazmidna DNK (pDNA), ili derivati pDNA (npr. minijaturni krugovi kao što je opisano u (Darquet, A-M i dr., Gene Therapy 4:1341-1349, 1997) koji sadrže polinukleotid. Polinukleotid može biti u pravolinijskom (npr. mRNK), kružnom (npr. plazmid) ili granatom obliku kao i u dvolančanom ili jednolančanom obliku. Polinukleotid može imati konvencionalnu fosfodiester vezu ili nekonvencionalnu vezu (npr. amidnu vezu, kao što se pronalazi u peptidnim nukleinskim kiselinama (PNA)).

[0042] Kako se ovde koristi, termin „polipeptid“ je namenjen da obuhvati pojedinačni „polipeptid“ kao i više „polipeptida“ i ima bilo koji lanac ili lance od dve ili više amino kiselina. Zbog toga, kako se ovde koristi, „peptid“, „oligopeptid“, „dipeptid“, „tripeptid“, „protein“, „aminokiselinski lanac“, „aminokiselinska sekvenca“ ili bilo koji drugi termin koji se koristi u vezi sa lancem ili lancima od dve ili više amino kiselina obuhvaćeni su u definiciji „polipeptida“ (čak iako svaki od ovih termina može imati preciznije značenje) i termin „polipeptid“ se može koristiti umesto ili naizmenično sa bilo kojim od ovih termina. Termin dalje obuhvata polipeptide koji su prošli kroz modifikacije nakon translacije, na primer, glikozilaciju, acetilaciju, fosforilaciju, amidaciju, derivatizaciju sa poznatim zaštitnim/blokirajućim grupama, proteolitičko deljenje ili modifikaciju sa amino kiselinama koje se ne javljaju u prirodi.

[0043] Termini „stafilokokna leukocidin podjedinica“, „LukS-PV polipeptid“ i „LukF-PV polipeptid“ kako se ovde koristi, obuhvataju stafilokokne leukocidin podjedinice pune dužine (npr. LukS-PV ili LukF-PV) i fragmente, varijante ili derivate zrelih ili stafilokoknih leukocidin podjedinica pune dužine (npr. LukS-PV i LukF-PV) i himerne i fuzione polipeptide koji obuhvataju zrele ili stafilokokne leukocidin podjedinice pune dužine (npr. LukS-PV i LukF-PV) ili jedan ili više fragmenata zrelih ili stafilokoknih leukocidin podjedinica pune dužine (npr. LukS-PV i LukF-PV). U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja, stafilokokne leukocidin podjedinice kao što je ovde obelodanjeno su mutirane stafilokokne leukocidin podjedinice, koje ima redukovanu toksičnost relativno u odnosu na odgovarajuće leukocidin podjedinice divljeg tipa. Pod „odgovarajućom leukocidin podjedinicom divljeg tipa“ označava se izvorna leukocidin podjedinica iz koje je izvedena mutirana leukocidin podjedinica.

[0044] Toksini koji formiraju pore, npr. alfa-hemolizin sa jednom komponentom i dvokomponenti hemolizini i leukotoksini, imaju značajnu ulogu u stafilokoknom zaobilaženju imunog sistema. Ovi toksini ubijaju ključne imune ćelije i izazivaju uništavanje tkiva, time često oslabljujući domaćina za vreme trajanja prve faze infekcije i promovišući širenje bakterija i metastatički rast. Dve PVL komponente, LukS-PV i LukF-PV, luče se odvojeno i formiraju oktamerne komplekse koji formiraju pore nakon vezivanja LukS-PV za svoj receptor i potonjeg vezivanja LukF-PV za LukS-PV (Miles i dr., Protein Sci, 2002.11(4): str.

894-902; Pedelacq i dr., Int J Med Microbiol, 2000.290(4-5): str.395-401). Ciljevi PVL obuhvataju, npr. polimorfonuklearne neutrofile (PMN), monocite i makrofage.

[0045] Drugi dvokomponentni toksini su okarakterisani u S. aureus: S komponentama HlgA i HlgC i F komponenti HlgB za γ-hemolizin; lukE (S) i lukD (F); i lukM (S) i lukF-PV-nalik (F). Zbog njihove bliske sličnosti, ove S komponente se mogu kombinovati sa F komponentom i formirati aktivni toksin sa različitom specifičnošću cilja (Ferreras i dr., Biochim Biophys Acta, 1998.1414(1-2): str.108-26;Prevost i dr., Infect Immun, 1995.

63(10): str.4121-9). γ-Hemolizin je jako hemolitički i 90% manje leukotoksičan od PVL, dok PVL nije hemolitički. Međutim, HlgA ili HlgC uparen sa lukF-PV promoviše leukotoksičnu aktivnost (Prevost i dr., Infect Immun, 1995.63(10): str. 4121-9). Luk i PVL vrši lizu neutrofila, i Hlg je hemolitički (Kaneko i dr., Biosci Biotechnol Biochem, 2004.68(5): str. 981-1003) je takođe zabeležen da vrši lizu neutrofila (Malachowa i dr., PLoS One, 2011.6(4): str. e18617). Dok su PVL podjedinice izvedene iz faga (F&S leukocidin), Hlg proteini su izvedeni iz Hlg lokusa (hlg) i pronalaze se u 99% kliničkih izolata (Kaleko i dr.). Hlg podjedinice su snažno regulisan na gore za vreme rasta S aureus u krvi (Malachowa i dr.), i Hlg je pokazano da je uključen u preživljavanju S. aureus u krvi (Malachowa i dr., Virulence, 2011. 2(6)). Mutirani USA300 Δ-hlgABC ima redukovani kapacitet kako bi se izazvao mortalitet u modelu bakteremije kod miševa (Malachowa i dr., PLoS One, 2011.6(4): str. e18617). Alonzo i dr. su pokazali da je LukED toksin od ključne važnosti za infekciju krvotoka kod miševa (Alonzo i dr., Mol Microbiol, 2012.83(2): str.423-35). Još jedan novi S. aureus leukotoksin, LukGH, je takođe opisan, koji se sinergiše sa PVL kako bi se poboljšala PMN liza kod ljudi (Ventura i dr., PLoS One, 2010.5(7): str. e11634).

[0046] Termini „fragment“, „analog“, „derivat“, ili „varijanta“ kada se odnose na stafilokoknu leukocidin podjedinicu (npr. LukS-PV ili LukF-PV) predmetnog obelodanjivanja obuhvataju bilo koji polipeptid koji sadržava bi bar neku količinu imunogenosti ili antigenosti izvornog proteina. Fragmetni stafilokoknih leukocidin podjedinica (npr. LukS-PV ili LukF-PV) kao što je ovde opisano, obuhvataju proteolitičke fragmente, fragmente brisanja i naročito fragmente stafilokoknih leukocidin podjedinica (npr. LukS-PV ili LukF-PV) koji pokazuju povećanu rastvorljivost za vreme ispoljavanja, prečišćavanja ili davanja životinji. Fragmenti stafilokoknih leukocidin podjedinica

(npr. LukS-PV ili LukF-PV) kao što je ovde opisano dalje obuhvataju proteolitičke fragmente ili fragmente brisanja koji pokazuju smanjenu patogenost ili toksičnost kada se daju ispitaniku. Polipeptidni fragmenti dalje obuhvataju bilo koji deo polipeptida koji sadrži antigeni ili imunogeni epitop izvornog polipeptida, uključujući kako linearne tako i trodimenzionalne epitope.

[0047] „Fragment epitopa“ polipeptidnog antigena je deo antigena koji sadrži epitop.

„Fragment epitopa“ može, ali ne obavezno, sadržati aminokiselinsku sekvencu dodatno jednom ili više epitopa.

[0048] Termin „varijanta“ kako se ovde koristi, odnosi se na polipeptid koji se razlikuje od navedenog polipeptida u aminokiselinskim zamenama, brisanjima, uvođenjima i/ili modifikacijama. Varijante koje se ne javljaju u prirodi se mogu proizvesti tehnikama mutageneze poznatim u tehnici. U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja, varijantni polipeptidi se razlikuju od identifikovane sekvence po zameni, brisanju ili dodavanju tri amino kiseline ili manje. Takve varijante se uopšteno mogu identifikovati modifikovanjem polipeptidne sekvence i procenjivanjem antigenih ili patogenih svojstava modifikovanog polipeptida primenom, na primer, ovde opisanih reprezentativnih postupaka. U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja, varijante stafilokokne leukocidin podjedinice divljeg tipa (npr. LukS-PV, ili LukF-PV, ili obe) formiraju proteinski kompleks koji je manje toksičan od kompleksa divljeg tipa.

[0049] Ovde obelodanjene polipeptidne varijante pokazuju bar oko 85%, 90%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 99.9% identičnosti sekvence sa identifikovanim polipeptidom. Varijantni polipeptidi mogu imati konzervativne ili ne-konzervativne aminokiselinske zamene, brisanja ili uvođenja. Varijante mogu sadržati stafilokokne leukocidin podjedinice (npr. LukS-PV ili LukF-PV, ili obe) identične sa onim kod leukocidin podjedinica divljeg tipa u bar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, ili više aminokiselinskih zamena, gde zamene prikazuju leukocidin kompleks koji sadrži varijantu leukocidin podjedinice koja je manje toksična od odgovarajućeg proteinskog kompleksa divljeg tipa. Derivati stafilokoknih leukocidin podjedinica (npr. LukS-PV i LukF-PV) kao što je ovde opisano su polipeptidi koji su izmenjeni tako da pokazuju svojstva koja se ne pronalaze kod prirodnih polipeptida.

Primeri obuhvataju fuzione proteine. Analog je drugi oblik ovde opisane stafilokokne leukocidin podjedinice (npr. LukS-PV i LukF-PV). Primer je proprotein koji može biti aktiviran deljenjem proproteina kako bi se proizveo aktivni zreli polipeptid.

[0050] Varijante takođe mogu, ili alternativo, sadržati druge modifikacije, gde, na primer, polipeptid može biti konjugovan ili spojen, npr. spojen sa heterolognom aminokiselinskom sekvencom, npr. signalnom (ili vodećom) sekvencom na N-terminalnom završetku proteina koji ko-translatorno ili post-translatorno usmerava transfer proteina. Polipeptid takođe može biti konjugovan ili proizveden da bude spojen sa veznom ili drugom sekvencom radi pojednostavljenja sinteze, prečišćavanja ili identifikacije polipeptida (npr.6-His), ili radi poboljšanja vezivanja polipeptida za čvrstu podlogu. Na primer, polipeptid se može konjugovati ili spojiti sa Fc regionom imunoglobulina. Polipeptid može takođe biti konjugovan ili spojen sa sekvencom koja daje ili modulira imuni odgovor polipeptidu (npr. T-ćelijski epitop, B-ćelijski epitop, citokin, hemokin ,itd.) i/ili poboljšava preuzimanje i/ili obradu polipeptida ćelijama koje predstavljaju antigen ili drugim ćelijama imunog sistema. Polipeptid takođe može biti konjugovan ili spojen sa drugim polipeptidima/epitopima od Staphylococcus sp. i/ili drugih bakterija i/ili virusa kako bi se stvorio hibridni imunogeni protein koji samostalno ili u kombinaciji sa različitim adjuvansima može izazvati zaštitni imunitet protiv drugih patogenih organizama. Polipeptid takođe može biti konjugovan ili spojen sa delovima koji dodeljuju veću stabilnost ili poboljšavaju poli život, ali bez ograničenja na, albumin, Fc region imunoglobulina, polietilen glikol (PEG) i slično.

Polipeptid takođe može biti konjugovan ili spojen sa delovima (npr. imunogeni ugljeni hidrati, npr. kapsularni polisaharid ili površinski polisaharid) od Staphylococcus sp. i/ili od drugih bakterija i/ili drugih virusa kako bi se stvorio modifikovani imunogeni protein koji samostalno ili u kombinaciji sa jednim ili više adjuvansa može poboljšati i/ili uzrokovati sinergiju zaštitnog imuniteta. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja, ovde opisani polipeptid dalje sadrži imunogeni ugljeni hidrat. U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja, imunogeni ugljeni hidrat je saharid.

[0051] Termin „saharid“ u ovoj specifikaciji može ukazivati na polisaharid ili oligosaharid i obuhvata oba. Polisaharidi prema predmetnom obelodanjivanju mogu biti izolovani iz bakterije i veličina im može biti prilagođena poznatim metodama. Na primer, veličina polisaharida cele dužine može biti „prilagođena“ (npr. njihova veličina može biti smanjena različitim metodama kao što je tretiranje kiselom hidrolizom, tretiranje vodonik peroksidom, prilagođavanje veličine sa EMULSIFLEX® što je praćeno tretiranjem sa vodonik peroksidom kako bi se stvorili fragmenti oligosaharida ili mikrofluidizacija). Veličina polisaharida se može prilagoditi u cilju smanjenja njihove viskoznosti u uzorcima polisaharida i/ili u cilju poboljšanja sposobnosti filtriranje za konjugovane proizvode. Oligosaharidi imaju mali broj jedinica ponavljanja (npr.5-30 jedinica ponavljanja) i obično su hidrolizovani polisaharidi. Polisaharidi prema predmetnom obelodanjivanju se mogu proizvesti rekombinantno.

[0052] S. aureus kapsularni antigeni su povezani sa površinom, ograničeni u vidu antigene specifičnosti i visoko konzervisani među kliničkim izolatima. U jednom otelotvorenju obelodanjivanja, imunogeni ugljeni hidrat prema predmetnom obelodanjivanju je kapsularni polisaharid (CP) od S. aureus. U jednom otelotvorenju obelodanjivanja, kapsularni saharid može biti polisaharid cele dužine, međutim, u drugim otelotvorenjima može biti jedna jedinica oligosaharida, ili kraći od lanca prirodne dužine saharida ponavljajućih jedinica oligosaharida. Ispitivanja serotipova stafilokoknih izolata su otkrila nekoliko navodnih kapsularnih serotipova, gde su tipovi 5 i 8 (CP5 i CP8) preovlađujući od izolata kod kliničkih infekcija, što odgovara 25% i 50% izolata dobijenih od ljudi, respektivno (O'Riordan i Lee, Clinical Microbiology Reviews, Januar 2004, str.218-234, Tom. 17, No.1; Poutrel i Sutra , J Clin Microbiol.1993 Feb;31(2):467-9). Isti izolati su takođe dobijeni od živine, krava, konja i svinja (Tollersrud i dr., J Clin Microbiol.2000 Aug;38(8):2998-3003; Cunnion KM i dr., Infect Immun. 2001 Nov;69(11):6796-803). Tipovi 5 i 8 kapsularnih polisaharida prečišćenih iz prototipskih sojeva Reynolds i Becker, respektivno, su međusobno strukturno veoma slično i sa jednom kapsulom napravljenom od soja T, prethodno opisanom od strane Wu i Park (Wu i Park.1971. J. Bacteriol.108:874-884). Tip 5 ima strukturu (→4)-3-O-Ac-β-D-MaaNAcA-(1→4)-α-L-FucNAc-(1→3)-β-D-FucNAc-(1→)n(Fournier, J. M., i dr., 1987. Ann. Inst. Pasteur Microbiol.138:561-567; Moreau, M., i dr., 1990. Carbohydr. Res.201:285-297), i tip 8 ima strukturu (→3)-4-O-Ac-β-D-ManNAcA-(1→3)-α-L-FucNAc-(1→3)-β-D-FucNAc-(1→)n(Fournier, J. M., i dr., 1984. Infect. Immun. 45:87-93). Tipovi 5 i 8 polisaharida se razlikuju samo u vezama između šećera i na mestima O-acetilacije ostataka manosaminuronske kiselina, ali su serološki različiti.

[0053] Tipovi 5 i 8 CP konjugovani za detoksifikovani rekombinantni Pseudomonas aeruginosa egzotoksin A nosač su pokazali da su veoma imunogeni i protektivni u modelu kod miševa (A Fattom i dr., Infect Immun. 1993 March; 61(3): 1023-1032; A Fattom i dr., Infect Immun. 1996 May; 64(5): 1659-1665) i pasivni transfer CP5-specifičnih antitela iz imunizovanih životinja je uzrokovao zaštitu protiv sistemske infekcije kod miševa (Lee i dr., Infect Immun. 1997 October; 65(10): 4146-4151) i protiv endokarditisa kod pacova izazvanih sa serotipom 5 S. aureus (Shinefield H i dr., N Engl J Med.2002 Feb 14;346(7):491-6).

Vakcine bivalentnih CP5 i CP8 konjugata (StaphVAX®, Nabi Biopharmaceutical) su razvijene koje pružaju 75% zaštitu kod miševa protiv S. aureus izazova. Vakcine su testirane na ljudima (Fattom AI i dr., Vaccine.2004 Feb 17;22(7):880-7; Maira-Litrán T i dr., Infect Immun. 2005 Oct;73(10):6752-62). U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja, oligopeptid predmetnog obelodanjivanja je kombinovan sa ili konjugovan sa imunogenim ugljenim hidratom (npr.CP5, CP8, CP fragment ili njihova kombinacija).

[0054] Imunizacija sa poli-N-acetilglukozaminom (PNAG) (McKenney D. i dr., Science. 1999 May 28;284(5419):1523-7) ili poli-N-sukcinil glukozaminom (PNSG) (Tuchscherr LP. i dr., Infect Immun. 2008 Dec;76(12):5738-44. Epub 2008 Sep 22), oba S. aureus površinski ugljeni hidrati, su pokazali da stvaraju bar delimičnu zaštitu protiv S. aureus izazova u eksperimentalnim modelima kod životinja. PNSG je identifikovan kao hemijski oblik S. epidermidis kapsularnog polisaharida/adhezina (PS/A) koji posreduje adheziju stafilokoka negativnih na koagulazu (CoNS) za biomaterijale, služi kao kapsula za sojeve CoNS koji ispoljavaju PS/A, i cilj je zaštitna antitela. PNSG je takođe napravljen sa S. aureus, gde je regulisan u okruženju, in vivo-ispoljen površinski polisaharid i slično služi kao cilj za zaštitni imunitet (McKenney D. i dr., J. Biotechnol.2000 Sept 29;83(1-2): 37-44). U određenim otelotvorenjima predmetnog pronalaska, imunogeni ugljeni hidrat je površinski polisaharid, npr. poli-N-acetilglukozamin (PNAG), poli-N-sukcinil glukozamin (PNSG), fragment površinskog polisaharida ili njihova kombinacija.

[0055] Teihoinska kiselina vezana za ćelijski zid (WTA) je istaknuti polisaharid koji se široko ispoljava kod S. aureus sojeva (Neuhaus, F.C. i J. Baddiley, Microbiol Mol Biol Rev, 2003.

67(4):686-723) i pokazano je da antiserum za WTA izaziva opsonofagocitno ubijanje samostalno i u prisustvu komplementa ((Thakker, M., i dr., Infect Immun, 1998.66(11):5183-9), i Fattom i dr, US Patent 7,754,225). WTA je povezan za peptidoglikane i isturen je kroz ćelijski zid i time postaje istaknuto izložen kod sojeva koji nisu kapsulirani kao što su USA300 koji su odgovorni za veći broj slučajeva MRSA dobijene u zajednici (CA MRSA) u SAD (Hidron, A.I., i dr., Lancet Infect Dis, 2009.9(6):384-92).

[0056] Lipoteihoinska kiselina (LTA) je konstituent ćelijskog zida Gram-pozitivne bakterije, npr. Staphylococcus aureus. LTA se može vezati za ciljane ćelije ne-specifično preko fosfolipida membrane, ili specifično za CD14 i tolične receptore. LTA vezana za cilj može interagovati sa cirkulišućim antitelima i aktivirati kaskadu komplementa kako bi se izazvao fenomen ubijanja pasivnog imuniteta. Takođe izaziva oslobađanje neutrofila i makrofaga vrsta reaktivnog kiseonika i azota, kisele hidrolaze, visoko katjonskih proteinaza, bakterijinih katjonskih peptida, faktora rasta i citotoksičnih citokina, što se može ispoljiti u sinergiji kako bi se pojačalo uništavanje ćelija.

[0057] U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja, površinski polisaharid je kombinovan ili konjugovan sa polipeptidom obelodanjivanja. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja površinski polisaharid je, npr. poli-N-acetilglukozamin (PNAG), poli-N-sukcinil glukozamin (PNSG), teihoinska kiselina vezana za ćelijski zid WTA, lipoteihoinska kiselina (LPA, fragment bilo kog od navedenih površinskih polisaharida ili kombinacija dva ili više navedena površinska polisaharida.

[0058] Termin „identičnost sekvence“ kako se ovde koristi se odnosi na vezu između dve ili više polinukleotidnih sekvenci ili između dve ili više polipeptidnih sekvenci. Kada je pozicija u jednoj sekvenci zauzeta sa istom bazom nukleinske kiseline ili nukleinskom kiselinom na odgovarajućoj poziciji komparatorske sekvence, kaže se da su sekvence „identične“ na toj poziciji. Procenat „identičnosti sekvence“ se računa određivanjem broja pozicija na kojima se identična baza nukleinske kiseline ili nukleinska javlja u obe sekvence kako bi se dobio broj „identičnih“ pozicija. Broj „identičnih“ pozicija se zatim deli sa ukupnim brojem pozicija u okviru za poređenje i množi sa 100 kako bi se dobio procenat „identičnosti sekvence“.

Procenat „identičnosti sekvence“ se određuje poređenjem dve optimalno poravnate sekvence u okviru za poređenje i homolognog polipeptida iz drugog izolata. I cilju optimalnog poravnanja sekvenci za poređenje, deo polinukleotidne ili polipeptidne sekvence u okviru za poređenje može sadržati praznine dodavanja ili brisanja dok se referentna sekvenca održava konstantnom. Optimalno poravnanje je ono poravnanje koje, čak i sa prazninama, daje najveći mogući broj „identičnih“ pozicija između referentne i komparatorske sekvence. Procenat „identičnosti sekvence“ između dve sekvence se može odrediti upotrebom verzije programa „BLAST2 Sequences“ koji je dostupan od National Center for Biotechnology Information od 1. septembra, 2004. gde taj program obuhvata programe BLASTN (za poređenje nukleotidnih sekvenci) i BLASTP (za poređenje polipeptidne sekvence), gde su ti programi zasnovani na algoritmu od Karlin i Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(12):5873-5877, 1993). Kada se „BLAST 2 Sequences“ koristi, parametri koji su uobičajeni parametri od 1. septembra, 2004. se mogu upotrebiti za veličinu reči (3), kaznu za otvorenu prazninu (11), kaznu za produženu prazninu (1), odbacivanje praznine (50), očekivanu vrednost (10) i bilo koji drugi potrebni parametar uključujući ali bez ograničenja opciju matrice.

[0059] Termin „epitop“ kako se ovde koristi se odnosi na delove polipeptida koji imaju antigenu ili imunogenu aktivnost kod životinje, na primer, sisara, na primer, čoveka.

„Imunogeni epitop, kako se ovde koristi, je definisan kao deo proteina koji izaziva imuni odgovor od životinje, kao što je određeno bilo kojom metodom poznatom u struci. Termin „antigeni epitop“ kako se ovde koristi je definisan kao deo proteina za koji antitelo ili T-ćelijski receptor može imunospecifično vezati svoj antigen kao što je određeno bilo kojom metodom poznatom u struci. Imunospecifično vezivanje isključuje ne-specifično vezivanje ali ne isključuje nužno unakrsnu reaktivnost sa drugim antigenima. Dok su svi imunogeni epitopi antigeni, antigeni epitopi ne moraju biti imunogeni.

[0060] Kako se ovde koristi, „kodirajući region“ je deo nukleinske kiseline koji se sastoji od kodona prenetih u amino kiseline. Iako „zaustavni kodon“ (TAG, TGA ili TAA) nije prenet u amino kiselinu, može se smatrati delom kodirajućeg regiona, ali bilo koje bočne sekvence, na primer, promoteri, mesta vezivanja ribozoma, transkripcioni terminatori i slično, su van kodirajućeg regiona.

[0061] Termin „optimizacija kodona“ je ovde definisan kao sekvence nukleinske kiseline koja vrši modifikaciju za pojačano ispoljavanje u ćelijama domaćina od interesa zamenjivanjem bar jednog, više od jednog ili značajan broj kodona izvorne sekvence sa kodonima koji se učestalije ili najučestalije koriste kod gena tog domaćina. Različite vrste pokazuju naročite greške za određene kodone određene amino kiseline.

[0062] Termin „sastav“ ili „farmaceutski sastav“ može obuhvatati sastave koji sadrže imunogene polipeptide obelodanjivanja zajedno sa npr. adjuvansima ili farmaceutski prihvatljivim nosačima, ekscipijensima ili razblaživačima, koji se daju pojedincu koji već boluje od S. aureus infekcije ili pojedincu koji ima potrebu za imunizacijom protiv S. aureus infekcije.

[0063] „Farmaceutski prihvatljiv“ se odnosi na one sastave koje su, unutar okvira zdrave medicinske procene, pogodni za kontakt sa tkivima ljudi i drugih životinja bez prekomerne toksičnosti ili drugih komplikacija proporcionalnim sa prihvatljivim odnosom koristi/rizika. U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja, ovde obelodanjeni polipeptidi, polinukleotidi, sastavi i vakcine su farmaceutski prihvatljive.

[0064] „Delotvorna količina“ je ona količina davanja koja je kod pojedinca, ili u pojedinačnoj dozi ili kao deo grupe, delotvorna za tretiranje ili sprečavanje. Količina je delotvorna, na primer, kada njeno davanje za rezultat da smanjenu učestalost S. aureus infekcije relativno u odnosu na pojedinca koji nije tretiran, kao što je određeno npr. nakon infekcije ili izazova sa infektivnim S. aureus uključujući, ali bez ograničenja smanjenu bakteremiju, smanjenu toksemiju, smanjenu sepsu, smanjene simptome, povećani imuni odgovor, izmenjeni imuni odgovor ili smanjeno vreme koje je potrebno za oporavak. Ova količina je promenljiva u zavisnosti od zdravstvenog i fizičkog stanja pojedinca koji se tretira, taksonomske grupe pojedinca koji se tretira (npr. čovek, primat koji nije čovek, primat, itd.), kapaciteta za odgovor imunog sistema pojedinca, željenog okvira tretiranja ili zaštite, formulacije vakcine, profesionalne procene medicinske situacije i drugih relevantnih faktora. Očekuje se da će delotvorna količina pasti u relativno širok opseg koji se može odrediti rutinskim probama. Obično je pojedinačna doza od 10 µg do 10 mg/kg telesne mase prečišćenog polipeptida ili količina modifikovanog nosećeg organizma ili virusa, ili njegovo fragmenta ili ostatka, dovoljna da pruži uporedivu količinu rekombinantno ispoljene mutirane stafilokokne leukocidin podjedinice (npr. LukS-PV ili LukF-PV, ili oba), kao što je ovde opisano. Termin „peptidna vakcina“ ili „vakcina podjedinice“ se odnosi na sastav koji sadrži jedan ili više ovde opisani polipeptid, koji je ,kada se da životinji, od koristi za stimulisanje imunog odgovora protiv stafilokokne (npr. S. aureus) infekcije.

[0065] Termin „ispitanik“ označava bilo kojeg ispitanika, naročito ispitanika koji je sisar, za koga je dijagnoza, prognoza, imunizacija ili terapija poželjna. Ispitanici koji su sisari obuhvataju, ali nisu ograničeni na, ljude, domaće životinje, životinje na farmama, životinje u zoološkim vrtovima, kao što su medvedi, životinje u sportu, životinje koje su ljubimci kao što su psi, mačke, zamorci, zečevi, pacovi, miševi, konji, goveda, medvedi, krave. primate kao što su čovekoliki majmuni, majmuni, orangutani i šimpanze; rod pasa kao što su psi i vukovi; rod mačaka kao što su mačke, lavovi i tigrovi; rod konja kao što su konji, magarci i zebre; životinje za ishranu kao što su krave, svinje i ovce; ungulatni sisari kao što su jeleni i žirafe; glodari kao što su miševi, pacovi i hrčci i zamorci; i tako dalje. U jednom otelotvorenju obelodanjivanja, ispitanik je čovek.

[0066] Kako se ovde koristi, „ispitanik koji ima potrebu za time“ se odnosi na pojedinca kod kojeg je poželjno da se tretira tj. spreči, leči, usporava ili smanji ozbiljnost simptoma stafilokokne (npr. S. aureus) bolesti ili da se kao rezultat ne dobije pogoršanje bolesti od S. aureus u naznačenom vremenskom periodu, ili oba.

[0067] Termini „prajmiranje“ ili „primarni“ i „pojačati“ ili „pojačavanje“, kako se ovde koriste, odnose se na početnu i kasniju imunizaciju, tj. u skladu sa normalnim definicijama ovih termina koje imaju u imunologiji. Međutim u određenim otelotvorenjima obelodanjivanja, npr. kada su komponenta prajmiranja i komponenta pojačavanja u jednoj formulaciji, početna i kasnija imunizacija ne moraju se nužno „primarni“ i „pojačani“ sastavi davati istovremeno.

Polipeptidi

[0068] Obelodanjen je polipeptid izolovane mutirane stafilokokne leukocidin podjedinice koji sadrži, sastoji se ili stafilokokne leukocidin podjedinice divljeg tipa osim 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ili više aminokiselinskih zamena na konzervisanim ostacima, koji smanjuje toksičnost mutirane leukocidin podjedinice relativno u odnosu na leukocidin podjedinicu divljeg tipa; gde leukocidin podjedinica divljeg tipa sadrži, sastoji se ili se suštinski sastoji od tri uzastopna regiona označena A-B-C raspoređena od amino završetaka do karboksi završetaka i gde region B ima aminokiselinsku konsenzus sekvencu ovde predstavljenu kao SEQ ID NO: 2:

FQYNIX1LX2X3X4DX5X6X7X8LINX9X10X11LPKX12KIX13X14X15X16VX17QX 18LGYNX19GX20X21X22X23X24X25X26X27X28X29GX30GX31FX32YSK; gde X1=Glicin(G), Serin(S) ili Alanin(A)

X2=Lizin(K),Treonin(T), Serin(S) ili Metionin(M)

X3=Treonin(T) ili Serin(S)

X4=Asparagin(N) ili Lizin(K)

X5=Prolin(P), Lizin(K), Serin(S) ili Glutamin(Q)

X6=Asparagin(N) ili Tirozin(i)

X7=Valin(V), treonin(T) ili Izoleucin(I)

X8=Asparaginska kiselina(D),Serin(S) ili Fenilalanin(F)

X9=Serin(S) ili bez amino kiseline

X10=Izoleucin(I) ili bez amino kiseline

X11=Tirozin(i), Histidin(H) ili treonin(T)

X12=Asparagin(N) ili treonin(T)

X13=Asparaginska kiselina(D) ili Glutaminska kiselina (E)

X14=Serin(S) ili treonin(T)

X15=Valin(V), treonin(T), Alanin(A) ili Izoleucin(I)

X16=Asparagin(N) ili Asparaginska kiselina(D)

X17=Serin(S) ili Glicin(G)

X18=treonin(T) ili Lizin(K)

X19=Izoleucin(I) ili Valin(V)

X20= Glicin(G)ili bez amino kiseline

X21= Asparagin(N), Lizin(K) ili bez amino kiseline

X22= Fenilalanin(F) ili bez amino kiseline

X23= Asparagin(N), Glutamin(Q) ili bez amino kiseline

X24=Serin(S), treonin(T) ili bez amino kiseline

X25=Glicin(G), Alanin(A), Valin(V) ili bez amino kiseline

X26=Prolin(P) ili bez amino kiseline

X27=Serin(S), Leucin(L) ili bez amino kiseline

X28=treonin(T), Leucin(L), Izoleucin(I) ili bez amino kiseline

X29=Glicin(G), Alanin(A) ili bez amino kiseline

X30=Asparagin(N), Serin(S) ili Lizin(K)

X31=Serin(S), Alanin(A) ili Glutaminska kiselina (E); i

X32=Asparagin(N) ili Serin(S).

[0069] U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja, region A leukocidin podjedinice divljeg tipa ima aminokiselinsku konsenzusnu sekvencu ovde predstavljenu kao: 1:

gde

X1=Glutaminska kiselina (E), Glutamin(Q) ili bez amino kiseline X2=Asparaginska kiselina(D), Glicin(G)ili bez amino kiseline

X3=Treonin(T), Lizin(K), izoleucin(I), Valin(V)ili bez amino kiseline X4=Serin(S), Treonin(T), Alanin(A) ili bez amino kiseline

X5=Asparaginska kiselina(D), Lizin(K), Asparagin(N), Arginin(R) ili bez amino kiseline

X6=Lizin(K), Arginin(R) ili bez amino kiseline

X7=Triptofan(W), Leucin(L) ili bez amino kiseline

X8=Glicin(G), Alanin(A) ili bez amino kiseline

X9=Valin(V), izoleucin(I) ili bez amino kiseline

X10=Izoleucin(I),Valin(V) ili bez amino kiseline

X11=Asparaginska kiselina(D), Glicin(G) ili bez amino kiseline

X12=Valin(V) ili Metionin(M)

X13=Lizin(K), Treonin(T) ili Prolin(P)

X14=Asparaginska kiselina(D), Asparagin(N) ili Valin(V)

X15=Izoleucin(I) ili Valin(V)

X16=Leucin(L), Valin(V) ili izoleucin(I)

X17=Asparagin(N), Serin(S) ili Lizin(K)

X18=Lizin(K) ili Arginin(R)

X19=Treonin(T), Serin(S) ili Alanin(A)

X20=Tirozin(i) ili Fenilalanin(F)

X21=Tirozin(i), Serin(S), Asparagin(N) ili Treonin(T)

X22=Asparagin(N) ili Asparaginska kiselina(D)

X23=Tirozin(i),Valin(V), Leucin(L), Fenilalanin(F) ili Serin(S) X24=Asparagin(N), Lizin(K), Glicin(G) ili Glutamin(Q)

X25=Treonin(T), Tirozin(i), Serin(S), Asparagin(N), Lizin(K) ili Arginin(R) X26=Glicin(G) ili bez amino kiseline

X27=Tirozin(i) ili bez amino kiseline

X28=Asparaginska kiselina(D), Asparagin(N), Glutaminska kiselina (E), Prolin(P) ili Arginin(R)

X29=Histidin(H), Tirozin(i), Leucin(L) ili Alanin(A)

X30=Izoleucin(I), Treonin(T),Valin(V) ili Asparagin(N)

X31=Alanin(A), Arginin(R) ili Serin(S)

X32=Metionin(M), izoleucin(I) ili Leucin(L); i

X33=Arginin(R), izoleucin(I), Valin(V) ili Leucin(L).

[0070] U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja, region C leukocidin podjedinice divljeg tipa ima aminokiselinsku konsenzusnu sekvencu ovde predstavljenu kao: 3:

FX1X2X3X4X5LPPLX6X7SGFNPSFIX8TX9SHEX10X11X12X13X14X15X16X17X1 8X19X20X21X22YGRNX23DX24TX25AX26X27X28X29X30X31X32X33X34X35X3 6; gde

X1=Valin(V) ili Alanin(A)

X2=Prolin(P) ili Asparaginska kiselina(D)

X3=Asparaginska kiselina(D) ili Asparagin(N)

X4=Asparagin(N), Serin(S) ili Asparaginska kiselina(D)

X5=Glutaminska kiselina (E) ili Glutamin(Q)

X6=Valin(V) ili Izoleucin(I)

X7=Histidin(H), Glutamin(Q) ili Treonin(T)

X8=Alanin(A) ili Treonin(T)

X9=Valin(V) ili Leucin(L)

X10=Lizin(K) ili Arginin(R)

X11=Glicin(G) ili Asparaginska kiselina(D)

X12=Serin(S), Lizin(K) ili Treonin(T)

X13=Glicin(G), Serin(S) ili Lizin(K)

X14=Asparaginska kiselina(D), Glutaminska kiselina (E) ili Leucin(L) X15=Treonin(T), Lizin(K) ili Izoleucin(I)

X16=Arginin(R)ili bez amino kiseline

X17=Serin(S) ili Valin(V)

X18=Glutaminska kiselina (E), Asparaginska kiselina(D) ili Asparagin(N) X19=Fenilalanin(F) ili Leucin(L)

X20=Glutaminska kiselina (E) ili Lizin(K)

X21=Izoleucin(I) ili Fenilalanin(F)

X22=Treonin(T), Serin(S) ili Alanin(A)

X23=Metionin(M) ili Leucin(L)

X24=Valin(V), Alanin(A), Izoleucin(I) ili Treonin(T)

X25=Histidin(H) ili Tirozin(i)

X26=Treonin(T), Izoleucin(I) ili Tirozin(i)

X27=Arginin(R), Lizin(K), Valin(V), Leucin(L) ili Fenilalanin(F) X28=Arginin(R), Treonin(T), Fenilalanin(F) ili Leucin(L) X29=Treonin(T), Serin(S), Arginin(R) ili Prolin(P)

X30=Treonin(T), Histidin(H), Arginin(R), Lizin(K) ili Prolin(P) X31=Histidin(H), Arginin(R), Treonin(T), Leucin(L) ili Glutamin(Q) X32=Tirozin(i) ili bez amino kiseline

X33=Glicin(G) ili bez amino kiseline

X34=Asparagin(N) ili bez amino kiseline

X35=Serin(S) ili bez amino kiseline; i

X36=Tirozin(i) ili Glicin(G).

[0071] U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja mutirana leukocidin podjedinica sadrži aminokiselinske zamene na pozicijama T11, K24, D28, Y58, S18, ili bilo kojim njihovim kombinacijama. U određenim otelotvorenjima, zamene mogu biti sa bilo kojom amino kiselinom koja održava antigenost mutirane stafilokokne leukocidin podjedinice. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja T11, K24, D28, Y58, ili S18 su zamenjeni sa alaninom ili fenilalaninom.

[0072] Takođe je obelodanjena ovde opisana mutirana leukocidin podjedinica koja sadrži aminokiselinsku zamenu na poziciji K24 SEQ ID NO: 2. Zamena može biti sa bilo kojom amino kiselinom koja održava antigenost mutirane stafilokokne leukocidin podjedinice. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja K24 je zamenjena sa alaninom.

[0073] Takođe je obelodanjena ovde opisana mutirana leukocidin podjedinica koja sadrži aminokiselinsku zamenu na poziciji S18 SEQ ID NO: 3. Zamena može biti sa bilo kojom amino kiselinom koja održava antigenost mutirane stafilokokne leukocidin podjedinice. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja S18 je zamenjena sa alaninom.

[0074] Neka otelotvorenja obuhvataju mutiranu leukocidin podjedinicu kao što je ovde opisano, koja sadrži aminokiselinsku zamenu na poziciji Y58 od SEQ ID NO:2. Zamena može biti sa bilo kojom amino kiselinom koja održava antigenost mutirane stafilokokne leukocidin podjedinice. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja Y58 je zamenjena sa alaninom.

[0075] Neka otelotvorenja obelodanjivanja obuhvataju mutiranu leukocidin podjedinicu kao što je ovde opisano, koja sadrži aminokiselinsku zamenu na poziciji T11 SEQ ID NO: 1. Zamena može biti sa bilo kojom amino kiselinom koja održava antigenost mutirane stafilokokne leukocidin podjedinice. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja T11 je zamenjena sa fenilalaninom.

[0076] Neka otelotvorenja obelodanjivanja obuhvataju mutiranu leukocidin podjedinicu kao što je ovde opisano, koja sadrži aminokiselinske zamene na poziciji T11 i Y58. Zamene mogu biti sa bilo kojom amino kiselinom koja održava antigenost mutirane stafilokokne leukocidin podjedinice. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja T11 i Y58 su zamenjene sa fenilalaninom i alaninom, respektivno.

[0077] Neka otelotvorenja obelodanjivanja obuhvataju mutiranu leukocidin podjedinicu kao što je ovde opisano, koja sadrži aminokiselinske zamene na poziciji T11 i S18. Zamene mogu biti sa bilo kojom amino kiselinom koja održava antigenost mutirane stafilokokne leukocidin podjedinice. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja T11 i S18 su zamenjene sa fenilalaninom i alaninom, respektivno.

[0078] Neka otelotvorenja obelodanjivanja obuhvataju mutiranu leukocidin podjedinicu kao što je ovde opisano, koja sadrži aminokiselinske zamene na poziciji T11, K24 i S18. Zamene mogu biti sa bilo kojom amino kiselinom koja održava antigenost mutirane stafilokokne leukocidin podjedinice. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja T11 je zamenjena sa fenilalaninom, a K24 i S18 su zamenjene sa alaninom.

[0079] Takođe je obelodanjena ovde opisana mutirana leukocidin podjedinica koja sadrži aminokiselinsku zamenu na poziciji D28 SEQ ID NO: 2. Zamena može biti sa bilo kojom amino kiselinom koja održava antigenost mutirane stafilokokne leukocidin podjedinice. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja D28 je zamenjena sa alaninom.

[0080] Takođe je obelodanjen je polipeptid izolovane mutirane stafilokokne leukocidin podjedinice koji sadrži, sastoji se ili se suštinski sastoji od stafilokokne leukocidin podjedinice divljeg tipa osim 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ili više aminokiselinskih zamena na konzervisanim ostacima, koji smanjuje toksičnost mutirane leukocidin podjedinice relativno u odnosu na leukocidin podjedinicu divljeg tipa; gde je leukocidin divljeg tipa je Panton-Valentin leukocidin (PVL) LukS-PV. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja, LukS-PV divljeg tipa ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 15, i SEQ ID NO: 16. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja, LukS-PV divljeg tipa ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5:

(prekursor proteinska sekvenca za LukS-PV. GenBank pristupni broj: NP_058465.1; signalni peptid sa 28 amino kiselina (amino kiseline 1-28) je podvučen).

[0081] U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja mutirana LukS-PV podjedinica ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, i SEQ ID NO: 14. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja ovde opisana mutirana leukocidin podjedinica ima amino kiselinu sa SEQ ID NO: 14.

[0082] Takođe je obelodanjen je polipeptid izolovane mutirane stafilokokne leukocidin podjedinice koji sadrži, sastoji se ili se suštinski sastoji od stafilokokne leukocidin podjedinice divljeg tipa osim 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ili više aminokiselinskih zamena na konzervisanim ostacima, koji smanjuje toksičnost mutirane leukocidin podjedinice relativno u odnosu na leukocidin podjedinicu divljeg tipa; gde leukocidin podjedinica divljeg tipa sadrži, sastoji se ili se suštinski sastoji od aminokiselinske konsenzus sekvence ovde predstavljene kao SEQ ID NO: 4:

NX1VX2YAPKNQNEEFQVQX3TX4GYX5X6GGDIX7IX8X9GLX10GGX11NGX12 X13X14FSETINYKQESYRX15X16X17X18; gde

X1=Valin(V), izoleucin(I) ili Alanin(A)

X2=Asparaginska kiselina(D) ili Histidin(H)

X3=Asparagin(N) ili Glutamin(Q)

X4=Leucin(L) ili Valin(V)

X5=Serin(S) ili Treonin(T)

X6=Fenilalanin(F) ili Tirozin(i)

X7=Serin(S) ili Asparagin(N)

X8=Serin(S), Izoleucin(I), Asparagin(N) ili treonin(T)

X9=Lizin(K) ili Asparagin(N)

X10=Serin(S) ili treonin(T)

X11=Leucin(L) ili Glicin(G)

X12=Serin(S) ili Asparagin(N)

X13=Glutaminska kiselina (E), treonin(T) ili Lizin(K)

X14=Serin(S) ili Alanin(A)

X15=Treonin(T) ili bez amino kiseline

X16=Treonin(T) ili Serin(S)

X17=Izoleucin(I) ili Leucin(L); i

X18=Asparaginska kiselina(D) ili Serin(S).

[0083] U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja mutirana leukocidin podjedinica sadrži aminokiselinske zamene na pozicijama K8, D28, E53, ili bilo kojim njihovim kombinacijama. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja, zamene mogu biti sa bilo kojom amino kiselinom koja održava antigenost mutirane stafilokokne leukocidin podjedinice. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja K8, D28 ili E53 je zamenjen sa alaninom.

[0084] Takođe je obelodanjen je polipeptid izolovane mutirane stafilokokne leukocidin podjedinice koji sadrži, sastoji se ili se suštinski sastoji od stafilokokne leukocidin podjedinice divljeg tipa osim 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ili više aminokiselinskih zamena na konzervisanim ostacima, koji smanjuje toksičnost mutirane leukocidin podjedinice relativno u odnosu na leukocidin podjedinicu divljeg tipa; gde je leukocidin divljeg tipa je Panton-Valentin leukocidin (PVL) LukF-PV. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja, LukF-PV divljeg tipa ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, i SEQ ID NO: 27. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja, LukF-PV divljeg tipa ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16:

(prekursor proteinska sekvenca za LukF-PV. GenBank pristupni broj: NP_058466.1; signalni peptid sa 24 amino kiselina (amino kiseline 1-24) je podvučen).

[0085] U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja mutirana LukF-PV podjedinica ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, i SEQ ID NO: 136. U određenim otelotvorenjima, mutirana LukF-PV podjedinica ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18. U određenim otelotvorenjima, mutirana LukF-PV podjedinica ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136.

[0086] Takođe je ovde obelodanjen polipeptidni kompleks koji sadrži mutirane leukocidin podjedinice kao što je ovde opisano. Zamena može biti bilo koja amino kiselina koja održava strukturu i konformaciju kompleksa mutirane leukocidin podjedinice.

[0087] U drugom otelotvorenju obelodanjivanja, mutirana stafilokokna leukocidin podjedinica (npr. LukS-PV ili LukF-PV ili oba), kao što je ovde opisano, se može povezati za heterologni polipeptid. Različiti heterologni polipeptidi se mogu koristiti, uključujući, ali bez ograničenja N- ili C-terminalni peptid koji ometa stabilizaciju, lučenje, ili pojednostavljeno prečišćavanje, kao što su heksa-histidin-oznaka, ubikvintin oznaka, NusA oznaka, domen koji se vezuje za hitin, ompT, ompA, pelB, DsbA, DsbC, c-myc, KSI, poliasparaginsku kiselinu, (Ala-Trp-Trp-Pro)n, polifenilalanin, policistein, poliarginin, B-oznaku, HSB-oznaku, zeleni fluorescentni protein (GFP), hemagglutinin influenca virusa (HAO), protein koji vezuje kalmodulin (CBP), protein koji vezuje galaktozu, protein koji vezuje maltozu (MBP), domene koji vezuju celulozu (CBD), dihidrofolat reduktazu (DHFR), glutation-S-transferazu (GST), streptokokni protein G, stafilokokni protein A, T7gen10, kompleks avidin/streptavidin/Strepoznake, trpE, hloramfenikol acetiltransferazu, lacZ (β-Galaktosidaza), His-ispunjeni tioredoksin, tioredoksin, FLAG™ peptid (Sigma-Aldrich), S-oznaku ili T7-oznaku. Videti, npr. Stevens, R.C., Structure, 8:R177-R185 (2000). Heterologni polipeptidi takođe mogu obuhvatati bilo koju pre- i/ili pro- sekvencu koja olakšava transport, translokacije, obradu i/ili prečišćavanje LukS-PV i/ili LukF-PV polipeptida kao što je ovde opisano iz ćelije domaćina ili bilo koju korisnu imunogenu sekvencu, uključujući ali bez ogranićenja sekvence koje kodiraju T-ćelijski epitop mikrobnog patogena, ili drugih imunogenih proteina i/ili epitopa.

[0088] U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja, mutirana stafilokokna leukocidin podjedinica (npr. LukS-PV ili LukF-PV, ili oba) povezana sa heterolognim polipeptidom, kao što je ovde opisano, može obuhvatati sekvence za spajanje peptidne vezne sekvence koje obuhvataju dva ili više peptidna regiona. Pogodne peptidne vezne sekvence se mogu izabrati na osnovu njihove sposobnosti da prihvate fleksibilnu, produženi, konformaciju ili sekundarnu strukturu koja bi interagovala sa spojenim epitopima, ili na osnovu njihove sposobnosti da povećaju opštu rastvorljivost fuzionog polipeptida, ili na osnovu njihovih nedostatka elektrostatičkih ili efekata interakcije sa vodom koji utiču na spojene peptidne regione.

[0089] U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja, mutirana stafilokokna leukocidin podjedinica (npr. LukS-PV ili LukF-PV, ili oba), kao što je ovde opisano, je izolovana.

„Izolovani“ polipeptid je onaj koji je uklonjen iz svog prirodnog okruženja. Termin „izolovani“ ne označava naročiti nivo prečišćavanja. Rekombinantno proizvedene mutirane stafilokokne leukocidin podjedinice (npr. LukS-PV ili LukF-PV, ili oba), kao što je ovde opisano, ispoljene kod ćelija domaćina koje nisu prirodne se smatraju izolovane za svrhe obelodanjivanja, kao i polipeptid koji je odvojen, podeljen na frakcije ili delimično ili suštinski prečišćen bilo kojom pogodnom tehnikom, uključujući filtraciju, hromatografiju, centrifugiranje i slično.

[0090] Proizvodnja mutirane stafilokokne leukocidin podjedinice (npr. LukS-PV ili LukF-PV, ili oba), kao što je ovde opisano, se može postići kultivisanjem ćelije domaćina koja sadrži polinukleotid koji operativno kodira polipeptid obelodanjivanja, i kao rezultat daje polipeptid. Određivanje uslova za kultivisanje takve ćelije domaćina i ispoljavanje polinukleotida je uopšteno specifično za ćeliju domaćina i sistem ispoljavanja i u okviru je znanja stručne osobe u ovoj oblasti. Slično tome, odgovarajuće metode za dobijanje polipeptida obelodanjivanja su poznate stručnima u ovoj oblasti, ali nisu ograničene na, hromatografiju, filtraciju, taloženje ili centrifugiranje.

[0091] U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja, mutirana stafilokokna leukocidin podjedinica, kao što je ovde opisano, sadrži izračunatu molekulsku energiju manju od 7000 kcal/mol, ili manju od 4000 kcal/mol, ili manju od 2000 kcal/mol, ili između 600 kcal/mol i 7500 kcal/mol, ili između 900 kcal/mol i 3900 kcal/mol, ili između 900 kcal/mol i 1500 kcal/mol, ili između 2000 kcal/mol i 3650 kcal/mol. Specifične izračunate molekulske energije za strukturu heterodimerskog kompleksa za LukS-PV i LukF-PV mutante su predstavljene u Tabeli 1. Ova merenja su detaljno objašnjena u odeljku sa primerima.

Tabela 1: Izračunate molekulske energije za strukturu heterodimerskog kompleksa za LukS-PV i LukF-PV mutante

Polinukleotidi

[0092] Obelodanjivanje se dalje odnosi na izolovani polinukleotid koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid izolovane mutirane stafilokokne leukocidin podjedinice koji sadrži, sastoji se ili se suštinski sastoji od stafilokokne leukocidin podjedinice divljeg tipa osim 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ili više aminokiselinskih zamena na konzervisanim ostacima, koji smanjuje toksičnost mutirane leukocidin podjedinice relativno u odnosu na leukocidin podjedinicu divljeg tipa; gde leukocidin podjedinica divljeg tipa sadrži, sastoji se ili se suštinski sastoji od tri uzastopna regiona označena A-B-C raspoređena od amino završetaka do karboksi završetaka i gde region B ima aminokiselinsku konsenzus sekvencu ovde predstavljenu kao SEQ ID NO: 2.

[0093] Takođe je obelodanjen izolovani polinukleotid koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid izolovane mutirane stafilokokne leukocidin podjedinice koji sadrži, sastoji se ili se suštinski sastoji od stafilokokne leukocidin podjedinice divljeg tipa osim 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ili više aminokiselinskih zamena na konzervisanim ostacima, koji smanjuje toksičnost mutirane leukocidin podjedinice relativno u odnosu na leukocidin podjedinicu divljeg tipa; gde leukocidin podjedinica divljeg tipa sadrži, sastoji se ili se suštinski sastoji od aminokiselinske konsenzusne sekvence ovde predstavljene kao SEQ ID NO: 4.

[0094] U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja, izolovani polinukleotid kao što je ovde opisano dalje sadrži ne-kodirajuće regione kao što su promoteri, operatori ili transkripcioni terminatori kao što je ovde opisano na drugom mestu. U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja, obelodanjivanje se odnosi na polinukleotid kao što je ovde opisano, i dalje sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu. Heterologna nukleinska kiselina može, u nekim otelotvorenjima obelodanjivanja, kodirati heterologni polipeptid spojen sa polipeptidom kao što je ovde opisano. Na primer, izolovani polinukleotid kao što je ovde opisano može sadržati dodatne kodirajuće regione koji kodiraju npr. heterologni polipeptid spojen sa polipeptidom kao što je ovde opisano, ili kodirajuće regione koji kodiraju heterologne polipeptide odvojene od polipeptida kao što je ovde opisano kao što su, ali bez ograničenja, selektabilni markeri, dodatni imunogeni, pojačivači imuniteta i slično.

[0095] Takođe su dati ekspresioni konstrukti, vektori i/ili ćelije domaćina koje sadrže ovde opisane polinukleotide.

[0096] Primer izolovanog polinukleotida je rekombinantni polinukleotid koji se nalazi u vektoru. Sledeći primeri izolovanog polinukleotida obuhvataju rekombinantne polinukleotide koji se održavaju u heterolognim ćelijama domaćina ili prečišćene (delimično ili suštinski) polinukleotide u rastvoru. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja polinukleotid je „rekombinantni“. Izolovani polinukleotidi ili nukleinske kiseline u skladu sa obelodanjivanjem dalje obuhvataju one molekule koji su veštački proizvedeni. Relativni stepen prečišćenosti ovde opisanog polinukleotida ili polipeptida se lako određuje dobro poznatim metodama.

Optimizacija kodona

[0097] Takođe su obuhvaćeni u okviru pronalaska genetski projektovani polinukleotidi koji kodiraju mutiranu stafilokoknu leukocidin podjedinicu (npr. LukS-PV ili LukF-PV, ili oba), kao što je ovde opisano. Modifikacija nukleinskih kiselina koje kodiraju mutirane stafilokokne leukocidin podjedinice (npr. LukS-PV ili LukF-PV, ili oba), kao što je ovde opisano, se lako može ostvariti od strane stručnjaka u ovoj oblasti, na primer, mutagenezom specifičnom za mesto sa oligonukleotidom ili de novo sintezom nukleinske kiseline.

[0098] Neka otelotvorenja obelodanjivanja obelodanjuju izolovani polinukleotid koji sadrži fragment nukleinske kiseline koji kodira mutiranu stafilokoknu leukocidin podjedinicu (npr. LukS-PV ili LukF-PV, ili oba) kao što je ovde opisano, gde je kodirajući region koji kodira polipeptid optimizovan kodonom. Kao što je uvaženo od strane stručnjaka u ovoj oblasti, različiti regioni kodiranja nukleinske kiseline će kodirati isti polipeptid zbog redundanse genetskog koda. Devijacije nukleotidne sekvence koja sadrži kodone koji kodiraju amino kiseline polipeptidnog lanca omogućavaju varijacije sekvence kodirajućeg regiona. Kako se svaki kodon sastoji od tri nukleotida, svi nukleotidi koji sadrže DNK su ograničeni na četiri specifične baze, postoje 64 moguće kombinacije nukleotida, od kojih 61 kodira amino kiseline (preostala tri kodona kodiraju signale koji završavaju translaciju). „Genetski kod“ koji pokazuje koji kodoni kodiraju koje amino kiseline je ovde reprodukovan u Tabeli 2. Kao rezultat, mnoge amino kiseline su označene sa više od jednog kodona. Na primer, amino kiseline alanin i prolin su kodirane za četiri tripleta, serin i arginin za šest, dok su triptofan i metionin kodirani samo jednim tripletom. Ova degeneracija omogućava da bazni sastav DNK varira u širokom opsegu bez promene aminokiselinske sekvence polipeptida koje kodira DNK.

TABELA 2: Standardni genetski kod

[0099] Biće uvaženo da bilo koji polinukleotid koji kodira polipeptid u skladu sa obelodanjivanjem pada u okviru ovog obelodanjivanja, bez obzira na to koji se kodoni koriste.

[0100] Mnogi organizmi pokazuju grešku za upotrebu naročitih kodona za kodiranje uvođenja naročite amino kiseline u rastućem polipeptidnom lancu. Preferencije kodona ili greška kodona, razlike u upotrebi kodona između organizama, se postižu degeneracijom genetskog koda, i dobro je zabeleženo kod mnogo organizama.

[0101] Različiti faktori su predloženi da doprinose preferencijama upotrebe kodona, uključujući translatorni odabir, GC sastav, mutacijske greške specifične za soj, konzervisanje amino kiseline, hidropatiju proteina, transkripcioni odabir i čak RNK stabilnost. Jedan faktor koji određuje upotrebu kodona je mutacijska greška koja oblikuje genomski GC sastav. Ovaj faktor je najznačajniji kod genoma sa ekstremnim baznim sastavom: vrste sa visokim sadržajem GC (npr. gram pozitivna bakterija). Mutacijska greška je odgovorna ne samo za međugene razlike u upotrebu kodona već takođe za grešku upotrebe kodona u istom genomu (Ermolaeva M, Curr. Issues Mol. Biol.3(4):91-97, 2001).

[0102] Greška kodona često odgovara efikasnosti translacije informacione RNK (iRNK) za koju se veruje da je zauzvrat zavisna od, između ostalog, svojstava kodona koji se prenose i dostupnosti određenih transfer RNK (tRNK) molekula. Predominantnost izabranih tRNK u ćeliji je uopšteno odraz kodona najčešće korišćenih u sintezi peptida. U skladu sa time, geni se mogu krojiti za optimalno ispoljavanje gena u datom organizmu na osnovu optimizacije kodona.

[0103] Predmetno obelodanjivanje se odnosi na polinukleotid koji sadrži kodirajući region sa optimizovanim kodonom koji kodira mutirani polipeptid stafilokokne leukocidin podjedinice (npr. LukS-PV ili LukF-PV, ili oba) kao što je ovde opisano. Upotreba kodona je adaptirana za optimizovano ispoljavanje u datim ćelijama prokariotskih ili eukariotskih domaćina.

[0104] Polinukleotidi sa optimizovanim kodonom su pripremljeni ugrađivanjem kodona poželjnih za upotrebu u genima za datu vrstu u DNK sekvencu. Takođe su dati konstrukti za ispoljavanje polinukleotida, vektori, ćelije domaćina koje sadrže polunukleotide koji sadrže kodirajuće regione sa optimizovanim kodonom koji kodiraju mutirani polipeptid stafilokokne leukocidin podjedinice (npr. LukS-PV ili LukF-PV, ili oba) kao što je ovde opisano.

[0105] S obzirom na veliki broj sekvenci gena dostupnih za širok opseg životinjskih, biljnih i mikrobnih vrsta, moguće je izračunati relativne učestalosti upotrebe kodona. Tabele upotrebe kodona su lako dostupne, na primer, kod „Codon Usage Database“ dostupno na http://www.kazusa.or.jp/codon/ (posećeno 12. oktobra, 2011), i ove tabele se mogu adaptirati na više načina. (Nakamura, Y., i dr., „Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000“ Nucl. Acids Res. 28:292, 2000).

[0106] Upotrebom dostupnih tabela, stručna osoba u ovoj oblasti može primeniti učestalosti za bilo koju datu polipeptidnu sekvencu i proizvesti fragment nukleinske kiseline kodirajućeg regiona optimizovanog kodonom koji kodira željeni polipeptid, ali koji koristi kodone optimalne za datu vrstu. Na primer, u nekim otelotvorenjima obelodanjivanja, kodirajući region je optimizovan za kodon za ispoljavanje kod E. coli.

Sinteza DNK

[0107] Dostupan je veliki broj opcija za sintezu kodiranih regiona sa optimizovanim kodonom bilo kojim od gore opisanih postupaka, koristeći standardne i rutinske molekularno-biološke manipulacije koje su dobro poznate stručnjaku u ovoj oblasti. Dodatno, sinteza gena je lako dostupna komercijalno.

Vektori i ekspresioni sistemi

[0108] Dalje je obelodanjen vektor koji sadrži polinukleotid kao što je ovde opisano. Termin „vektor“ kako se ovde koristi, se odnosi na npr. bilo koji broj nukleinskih kiselina u koje se željena sekvenca može uvesti, npr. restrikcijom i ligacijom, za transport između različitih genetskih okruženja ili za ispoljavanje u ćeliji domaćina. Vektori nukleinske kiseline mogu biti DNK ili RNK. Vektori obuhvataju, ali nisu ograničeni na, plazmide, fage, fagemide, bakterijske genome i virusne genome. Vektor za kloniranje je onaj koji je u stanju da izvrši replikaciju u ćeliji domaćina, i koji je dalje naznačen sa jednim ili više mesta restrikcije endonukleaze na kojima se vektor može podeliti na odrediv način i na kojima se može izvršiti ligacija željene DNK sekvence tako da novi rekombinantni vektor zadržava svoju sposobnost replikacije u ćeliji domaćina. U slučaju plazmida, replikacija željene sekvence se može pojaviti veliki broj puta dok se plazmid povećava u brojevima kopija u bakterijama domaćina ili samo jednom po jednom domaćinu pre nego što domaćin izvrši reprodukciju mitozom. U slučaju faga, replikacija se može aktivno pojaviti za vreme litičke faze ili pasivno za vreme lizogene faze. Određeni vektori su u stanju da izvrše autonomnu replikaciju u ćeliji domaćina u koju su uvedeni. Drugi vektori su integrisani u genomu ćelije domaćina nakon uvođenja u ćeliju domaćina i time vrše replikaciju zajedno sa genomom domaćina.

[0109] Bilo koji od širokog opsega pogodnih vektora za kloniranje koji se može koristiti sa odgovarajućim domaćinom je poznat u struci i komercijalno dostupan. Kako se ovde koristi, termin "plazmid“ se odnosi na kruži, dvolančani konstrukt napravljen od genetskog materijala (tj. nukleinskih kiselina, gde je genetski materijal ekstrahromozomni a u nekim slučajevima, vrši autonomnu replikaciju. Ovde opisani polinukleotid može biti u kružnom ili linearizovanom plazmidu ili u bilo kojoj drugoj vrsti vektora. Postupci za uvođenje nukleotidne sekvence u vektor, npr. ekspresioni vektor i transformisanje ili transfekcija u odgovarajuću ćeliju domaćina i kultivisanje pod uslovima pogodnim za ispoljavanje su uopšteno poznati u struci.

[0110] U skladu sa jednim aspektom obelodanjivanja, dat je vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mutiranu stafilokoknu leukocidin podjedinicu (npr. LukS-PV ili LukF-PV, ili oba), kao što je ovde opisano. U određenim otelotvorenjima vektor je ekspresioni vektor koji je u stanju da ispolji mutiranu stafilokoknu leukocidin podjedinicu (npr. LukS-PV ili LukF-PV, ili oba), kao što je ovde opisano, u pogodnoj ćeliji domaćina. Termin „ekspresioni vektor“ se odnosi na vektor koji je u stanju da izvrši ispoljavanje ovde opisanog polipeptida, tj. sekvenca vektora sadrži regulatorne sekvence koje su neophodne za transkripciju i translaciju polipeptida, uključujući, ali bez ograničenja, promotere, operatore, mesta određivanja transkripcije, mesta vezivanja ribozoma i slično. Termin „ispoljavanje“ se odnosi na biološku proizvodnju proizvoda kodiranog sekvencom za kodiranje. U većini slučajeva DNK sekvenca, uključujući sekvencu za kodiranje, je transkribovana kako bi se formirala informaciona RNK (iRNK). Informaciona RNK se zatim prenosi kako bi se formirao proizvod polipeptida koji ima značajnu biološku aktivnost. Takođe, postupak ispoljavanja može uključiti dalje korake postupka za RNK proizvod transkripcije kao što je slajsovanje i uklanjanje introna, i/ili post-translatorno obrađivanje proizvoda polipeptida.

[0111] Sistemi vektor-domaćin obuhvataju, ali nisu ograničeni na, sisteme kao što su ćelijski sistemi bakterija, sisara, kvasca, insekta ili biljke, ili in vivo, npr. u životinji ili in vitro, npr. u bakteriji ili ćelijskim kulturama. Odabir odgovarajućeg domaćina smatra se da je u okviru znanja stručnjaka u oblasti ovde opisanih saznanja. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja, ćelija domaćina je bakterija npr. E. coli.

[0112] Ćelije domaćina su genetski izmenjen (inficirane, transdukovane, transformisane ili transfektovane) sa vektorima obelodanjivanja. Prema tome, jedan aspekt obelodanjivanja je usmeren na ćelije domaćina koje sadrže vektor koji sadrži polinukleotid kao što je ovde opisano. Projektovane ćelije domaćina mogu biti kultivisane u konvencionalnom nutritivnom okruženju izmenjenom na pogodan način za aktiviranje promotera, odabir transformanata ili pojačavanje polinukleotida. Uslovi kulture, kao što su temperatura, pH i slično, su oni prethodno korišćeni sa ćelijom domaćina izabranom za ispoljavanje, i biće očigledni stručnjaku u ovoj oblasti. Termin „transfekt“ kako se ovde koristi, se odnosi na bilo koji postupak gde se eukariotska ćelija uvodi kako bi prihvatila i uključila u svoj genom izolovanu DNK uključujući ali bez ograničenja DNK u obliku plazmida. Termin „transform“ kako se ovde koristi, se odnosi na bilo koji postupak gde se bakterijska ćelija uvodi kako bi prihvatila i uključila u svoj genom izolovanu DNK uključujući ali bez ograničenja DNK u obliku plazmida.

[0113] Sistemi bakterijskih ekspresionih vektora za domaćina obuhvataju, ali nisu ograničeni na, prokariote (npr. E. coli) transformisane sa rekombinantnom DNK bakteriofaga, DNK plazmida ili DNK kozmida. U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja, plazmidi koji se koriste sa E. coli koriste sistem navođen sa T7 promoterom koji je regulisan sa LacI proteinom putem IPTG indukcije. Veliki broj pogodnih vektora je poznat stručnjacima u ovoj oblasti i komercijalno su dostupni. Sledeći bakterijski vektori su dati putem primera: pET (Novagen), pET28, pBAD, pTrcHIS, pBR322,pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), phagescript, psiX174, pBluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene), ptrc99a, pKK223-3, pKK243-3, pDR540, pBR322, pPS10, RSF1010, pRIT5 (Pharmacia); pCR (Invitrogen); pLex (Invitrogen), i derivati pUC plazmida.

[0114] Pogodni ekspresioni vektor sadrži regulatorne sekvence koje mogu biti operativno spojene za uvedenom nukleotidnom sekvencom koja kodira mutiranu stafilokoknu leukocidin podjedinicu (npr. LukS-PV ili LukF-PV, ili oba), kao što je ovde opisano. Kako se ovde koristi, termin „regulatorne sekvence“ označavaju nukleotidne sekvence koje su neophodne za ili su sprovodne za transkripciju uvedene sekvence koja kodira mutiranu stafilokoknu leukocidin podjedinicu (npr. LukS-PV ili LukF-PV, ili oba), kao što je ovde opisano od strane ćelije domaćina i/ili koje su neophodne za ili sprovodne za translaciju od strane ćelije domaćina dobijenog transkripta u željenu mutiranu leukocidin podjedinicu (npr. LukS-PV ili LukF-PV, ili oba). Regulatorne sekvence obuhvataju, ali nisu ograničene na, 5’ sekvence kao što su operatori, promoteri i sekvence koje vezuju ribozom, i 3’ sekvence kao što su signali poliadenilacije ili transkripcioni terminatori. Regulatorne sekvence takođe mogu obuhvatati sekvence za pojačavanje ili uzvodne sekvence za aktiviranje.

[0115] Uopšteno, bakterijski vektori obuhvataju izvor replikacije i selektabilne markere, npr. ampicilin, tetraciklin, kanamicin, gene otpora od E. coli koji omogućavaju transformaciju ćelije domaćina i promotera izvedenog iz visoko ispoljenog gena u direktnu transkripciju nizvodne strukturne sekvence. Pogodni promoteri obuhvataju, ali nisu ograničeni na, T7 promoter, lambda (λ) promoter, T5 promoter, i lac promoter, ili promotere izvedene iz operona koji kodiraju glikolitične enzime kao što su 3-fosfoglicerat kinaza (PGK), kisela fosfataza, ili proteini toplotnog šoka, ili promoteri koji se mogu uzrokovati kao što su kadmijum (pcad) i beta-laktamaza (pbla).

[0116] Kada se ekspresioni vektor izabere, polinukleotid kao što je ovde opisano može biti kloniran nizvodno od promotera, na primer, polilinker region. Vektor je transformisan u odgovarajući bakterijski soj i DNK je pripremljena upotrebom standardnih tehnika.

Orijentacija i DNK sekvenca polinukleotida kao i svih drugih elemenata uključenih u vektoru, su potvrđene upotrebom restrikcionog mapiranja, analize DNK sekvence i/ili PCR analize. Bakterijske ćelije koje primaju ispravne plazmide se mogu smestiti kao ćelijske banke.

Imunogeni i farmaceutski sastavi

[0117] Dalje su obelodanjeni sastavi, npr. imunogeni ili farmaceutski sastavi, koji sadrže delotvornu količinu mutirane stafilokokne leukocidin podjedinice (npr. LukS-PV ili LukF-PV, ili oba), kao što je ovde opisano, ili polinukleotid koji kodira polipeptid obelodanjivanja. Sastavi kao što je ovde opisano mogu dalje sadržati dodatne imunogene komponente npr. kao što su multivalentne vakcine, takođe i nosači, ekscipijensi ili adjuvansi.

[0118] Sastavi kao što je ovde opisano mogu biti formulisani u skladu sa poznatim metodama. Pogodne metode za pripremanje su opisane, na primer, u Remington's Pharmaceutical Sciences, 19. izdanje, A.R. Gennaro, ured., Mack Publishing Co., Easton, PA (1995), što je ovde obuhvaćeno u potpunosti sa referencom. Sastav može biti u različitim oblicima, uključujući, ali bez ograničenja vodeni rastvor, emulziju, gel, suspenziju, liofilizovani oblik ili bilo koju drugi oblik poznat u struci. Dodatno, sastav može sadržati farmaceutski prihvatljive aditive uključujući, na primer, razblaživače, sredstva za vezivanje, stabilizatore i konzervanse. Kada se formulišu, sastavi obelodanjivanja mogu direktno dati ispitaniku. Ispitanici koji se tretiraju mogu biti životinje; naročito, ljudski ispitanici mogu biti tretirani.

[0119] Nosači koji se mogu koristiti sa sastavima obelodanjivanja su dobro poznati u struci, i obuhvataju, bez ograničenja, npr. tiroglobulin, albumine kao što je ljudski serum albumin, tetanus toksoid i poliamino kiseline kao što su poli L-lizin, poli L-glutaminska kiselina, influenca, hepatitis B virus izvorni protein i slično. Različiti vodeni rastvarači se mogu koristiti, npr. voda, puferisana voda, 0,8% slani rastvor, 0,3% glicin, hijaluronska kiselina i slično. Sastavi mogu biti sterilisani konvencionalnim, dobro poznatim tehnikama sterilizacije, ili mogu biti sterilno filtrirani. Dobijeni sastavi mogu biti zapakovani za upotrebu u izvornom obliku, ili liofilizovanim gde se liofilizovano pripremanje kombinuje sa sterilnim rastvorom pre davanja. Sastavi mogu sadržati farmaceutski prihvatljive pomoćne supstance po potrebi za procenjivanje fizioloških stanja, kao što su sredstva za podešavanje pH i puferisanje, sredstva za podešavanje toničnosti, sredstva za kvašenje i slično, na primer, natrijum acetat, natrijum hlorid, kalijum hlorid, kalcijum hlorid, sorbitan monolaurat, trietanolaminoleat, itd.

[0120] Određeni sastavi kao što je ovde opisano dalje obuhvataju jedan ili više adjuvansa, supstancu dodatu imunogenom sastavu za, na primer, pojačavanje, održavanje, lokalizovanje, ili modulisanje imunog odgovora na imunogen. Termin „adjuvans“ se odnosi na bilo koji materijal koji ima sposobnost da (1) izmeni ili poveća imuni odgovor na određeni antigen ili (2) pojača ili pomogne delovanje farmakološkog sredstva. Bilo koje jedinjenje koje može povećati ispoljavanje, antigenost ili imunogenost polipeptida je potencijalni adjuvans. Termin „imunogeni nosač“ kako se ovde koristi se odnosi na prvi deo, npr. polipeptid ili fragment, varijantu, ili njegov derivat koji pojačava imunogenost drugog polipeptida ili fragmenta, varijante ili njegovog derivata.

[0121] Pokazalo se da veliki broj materijala ima adjuvansnu aktivnost kroz različite mehanizme. Na primer, povećanje humoralnog imuniteta se obično ispoljava značajnim povećanjem titra antitela podignutih do antigena, a povećanje aktivnosti T-ćelija se obično ispoljava u povećanoj proliferaciji ćelija, ili ćelijskoj citotoksičnosti, ili lučenju citokina. Adjuvans može takođe da promeni ili modulira imuni odgovor, na primer, promenom primarno humoralnog ili Th2odgovora u primarno ćelijski ili Th1odgovor. Imuni odgovori na dati antigen mogu se testirati različitim imunološkim probama koje su dobro poznate stručnoj osobi u ovoj oblasti i/ili su ovde opisane.

[0122] Veliki broj adjuvanasa je poznat osobama stručnim u ovoj oblasti i opisani su u brojnim referencama. Adjuvansi koji se mogu koristiti u ovde opisanim sastavima obuhvataju, ali nisu ograničeni na: inertne nosače, kao što su alaun, bentonit, lateks i akrilne čestice; nekompletni Freundov adjuvans, kompletni Freundov adjuvans; soli bazirane na aluminijumu, kao što je aluminijum hidroksid; Alhidrogel (Al(OH3)); aluminijum fosfat(AlPO4); soli bazirane na kalcijumu; silika; bilo koji TLR biološki ligand; IDC-1001 (takođe poznat kao GLA-SE; glukopiranozil lipid adjuvans stabilna emulzija) (Coler i dr., PLoS One, 2010.

5(10): str. e13677; Coler i dr., PLoS One, 2011.6(1): str. e16333); CpG (Mullen i dr., PLoS One, 2008.3(8): str. e2940), ili bilo koju njihovu kombinaciju. Količina adjuvansa, kako je formulisa i kako se daje svi parametri koji su u okviru nadležnosti stručne osobe u ovoj oblasti.

[0123] U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja, sastav obelodanjivanja dalje sadrži lipozom ili druge nosače čestica, koji mogu služiti, npr. za stabilizovanje formulacije, za ciljanje formulacije na određeno tkivo, kao što je limfoidno tkivo, ili za povećanje polu raspada polipeptidnog sastava. Takvi nosači čestica obuhvataju emulzije, pene, micele, nerastvorljive monoslojeve, tečne kristale, fosfolipidne disperzije, lamelarne slojeve, izokome i slično. U ovim pripremanjima, ovde opisani polipeptid može biti uključen kao deo lipozoma ili druge čestice, ili može biti izveden u konjunkciji sa lipozomom. Lipozomi za upotrebu u skladu sa obelodanjivanjem mogu biti formulisani iz standardnih lipida koji formiraju sredstvom za prenošenje, koji uopšteno obuhvataju neutralne i negativno naelektrisane fosfolipide sa sterolom, kao što je holesterol. Sastav koji sadrži lipozom ili druge čestične suspenzije kao i polipeptide kao što je ovde opisano može biti dat intravenozno, lokalno, topikalno, itd. u dozi koja može biti različita u zavisnosti od, između ostalog, načina davanja, polipeptida koji se isporučuje i stadijuma bolesti koja se tretira.

[0124] Za čvrste sastave, konvencionalni čvrsti nosači koji nisu toksični se mogu koristiti koji obuhvataju, na primer, manitol farmaceutskog kvaliteta, laktozu, skrob, magnezijum stearat, natrijum saharin, talk, celulozu, glukozu, sukrozu, magnezijum karbonat i slično. Za oralno davanje, farmaceutski prihvatljiv sastav koji nije toksičan se formira uključivanjem bilo kojih ekscipijenasa koji se obično koriste, kao što su oni nosači koji su prethodno navedeni, i uopšteno 10-95% aktivnog sastojka, koji je, polipeptid kao što je ovde opisano, često pri koncentraciji od 25%-75%.

[0125] Za aerosol ili mukozno davanje, polipeptid kao što je ovde opisano može biti dat u sitno odvojenom obliku, opciono zajedno sa površinski aktivnim sredstvom i propelantom i/ili mukoadhezivom, npr. hitozan. Surfaktant naravno mora biti farmaceutski prihvatljiv, i u nekim otelotvorenjima obelodanjivanja rastvorljiv u propelantu. Takva reprezentativna sredstva su esteri ili delimični esteri masnih kiselina koje sadrže od 6 do 22 atoma ugljenika, kao što su heksanska, oktanska, laurinska, palmitinska, stearinska, linoleinska, linolenska, olesterinska i oleinske kiseline sa alifatičnim polihidričnim alkoholom ili njegovim cikličnim anhidridom. Pomešani esteri, kao što su pomešani ili prirodni gliceridi se mogu upotrebiti. Površinski aktivna sredstva mogu činiti 0,1%-20% po masi sastava, u nekim otelotvorenjima obelodanjivanja 0,25-5% po masi. Ravnoteža sastava je obično propelant, mada se može koristiti raspršivač u kome nije potreban potisni gas i drugi procenti su podešeni na odgovarajući način. U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja, imunogeni polipeptidi se mogu uključiti u aerodinamičnu laku česticu, kao što su čestice opisane u pat SAD br.

6,942,868 ili obj. pat. SAD br.2005/0008633. Nosač takođe može biti uključen, npr. lecitin za intranazalno isporučivanje.

[0126] Obelodanjivanje je takođe usmereno na metodu za proizvodnju sastava u skladu sa obelodanjivanjem. U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja, metoda za proizvodnju sastava obuhvata (a) izolovanje polipeptida u skladu sa obelodanjivanjem; i (b) dodavanje adjuvansa, nosača i/ili ekscipijensa izolovanom polipeptidu. Neka otelotvorenja obelodanjivanja obelodanjuju sledeću kombinaciju polipeptida sa drugim stafilokoknim antigenima.

[0127] Neka otelotvorenja obelodanjivanja obuhvataju multivalentnu vakcinu. Multivalentna vakcina predmetnog obelodanjivanja sadrži mutiranu stafilokoknu leukocidin podjedinicu (npr. LukS-PV ili LukF-PV ili oba), kao što je ovde opisano ili polinukleotid koji kodira jednu ili obe podjedinice i jednu ili više dodatnih imunogenih komponenti. Takve komponente mogu biti dodatni imunogeni istog infektivnog sredstva, npr. S. aureus, ili iz drugih stafilokoka, ili mogu biti imunogeni izvedeni iz drugih infektivnih sredstava koja se mogu dati efikasno, pogodno i na ekonomičan način zajedno. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja, mutirana stafilokokna leukocidin podjedinica (npr. LukS-PV ili LukF-PV ili oba) kao što je ovde opisano, može biti kombinovana sa drugim toksinima ili drugim vakcinama zasnovanim na virusnim komponentama kako bi se napravila široka multivalentna vakcina zasnovana na toksinu koja je u stanju da cilja više bakterijski determinanti virulencije. U drugim otelotvorenjima obelodanjivanja, mutirana stafilokokna leukocidin podjedinica (npr. LukS-PV ili LukF-PV ili oba) kao što je ovde opisano, se mogu spojiti sa drugim imunogenim, biološki značajnim ili zasitnim polipeptidima koji sadrže epitop kako bi se stvorila multivalentna vakcina u jednom lancu i izazvao imuni odgovor protiv više antigena. U još jednom otelotvorenju obelodanjivanja, mutirana stafilokokna leukocidin podjedinica (npr. LukS-PV ili LukF-PV ili oba) kao što je ovde opisano, se može spojiti sa jednim ili više T ćelijskih epitopa kako bi se izazvao imunitet T ćelija zajedno sa PVl antitelima.

Metode tretiranja/prevencije i režimi

[0128] Takođe je data metoda za tretiranje ili prevenciju Staphylococcus infekcije, npr. S. aureus infekcije ili za tretiranje ili sprečavanje bolesti izazvane sa Staphylococcus, npr, S. aureus kod ispitanika, koja obuhvata davanje ispitaniku koji ima potrebu za time sastav kao što je ovde opisano koji sadrži mutiranu stafilokoknu leukocidin podjedinicu (npr. LukS-PV ili LukF-PV, ili oba), kao što je ovde opisano, ili polinukleotide, vektore ili ćelije domaćina koje kodiraju istu. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja, ispitanik je životinja, npr. kičmenjak, npr. sisar, npr. čovek. Neka otelotvorenja obelodanjivanja obuhvataju metodu za izazivanje imunog odgovora protiv S. aureus soja, koja obuhvata davanje ispitaniku koji ima potrebu za navedenim imunim odgovorom delotvorne količine sastava kao što je ovde opisano koji sadrži mutiranu stafilokoknu leukocidin podjedinicu (npr. LukS-PV ili LukF-PV, ili oba), kao što je ovde opisano, ili polinukleotide, vektore ili ćelije domaćina koje kodiraju istu.

[0129] U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja, ispitaniku se daje sastav kao što je ovde opisano koji sadrži mutiranu stafilokoknu leukocidin podjedinicu (npr. LukS-PV ili LukF-PV, ili oba), kao što je ovde opisano, ili polinukleotide, vektore ili ćelije domaćina koje kodiraju isti profilaktički, npr. kao profilaktička vakcina, kako bi se uspostavio ili pojačao imunitet protiv Staphylococcus, npr. S. aureus, kod zdrave životinje pre potencijalnog ili stvarnog izlaganja Staphylococcus, npr. S. aureus ili sticanja simptoma povezanih sa Staphylococcus, time vršeći prevenciju bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje simptoma ili smanjenje ozbiljnosti simptoma bolesti. U jednom otelotvorenju obelodanjivanja bolest je respiratorna bolest, npr. pneumonija. Druge bolesti ili stanja koja se tretiranju ili sprečavaju obuhvataju, ali nisu ograničene na, bakteremiju, sepsu, infekcije kože, infekcije rane, endokarditis, infekcije kostiju i zglobova, osteomijelitis i/ili meningitis. Jedan ili više sastava, polipeptida, polinukleotida, vektora ili ćelija domaćina kao što je ovde opisano se mogu koristiti za tretiranje ispitanika koji je već izložen Staphylococcus, npr. S. aureus, ili već boluje od simptoma povezanih sa Staphylococcus kako bi se dalje stimulisao imuni sistem životinje, smanjujući ili uklanjajući simptome povezane sa tim izlaganjem. Kao što je ovde definisano, „tretiranje životinje“ se odnosi na upotrebu jednog ili više sastava, polipeptida, polinukleotida, vektora ili ćelija domaćina obelodanjivanja kako bi se sprečila, izlečila, usporila ili smanjila ozbiljnost S. aureus simptoma kod životinje, i/ili kako bi se ispoljilo bez daljeg pogoršanja S. aureus simptoma u naznačenom vremenskom periodu. Nije potrebno da bilo koji sastav, polipeptid, polinukleotid, vektor ili ćeliju domaćina kao što je ovde opisano pruži potpunu zaštitu protiv stafilokokne infekcije ili potpuno izleči ili ukloni sve simptome povezane sa Staphylococcus.

[0130] Kako se ovde koristi, „ispitanik koji ima potrebu za terapeutskim i/ili preventivnim imunitetom“ se odnosi na ispitanika kod kojeg je poželjno da se tretira tj. spreči, leči, usporava ili smanji ozbiljnost simptoma povezanih sa (Staphylococcus) ili da se kao rezultat ne dobije pogoršanje simptoma povezanih sa Staphylococcus u naznačenom vremenskom periodu. Kako se ovde koristi, „ispitanik koji ima potrebu za imunim odgovorom“ se odnosi na ispitanika kod koga je poželjan imunološki odgovor protiv soja Stafilokoka koji ispoljava PVL.

[0131] Tretiranje farmaceutskim sastavima koji sadrže imunogeni sastav, polipeptid ili polinukleotid kao što je ovde opisano se može vršiti odvojeno ili u konjunkciji sa drugim tretiranjima, kada je to pogodno.

[0132] Kod terapeutskih primena, sastav, polipeptid ili polinukleotid obelodanjivanja se daje pacijentu u količini dovoljnoj da izazove efikasni urođeni, humoralni ili ćelijski odgovor, ili oba, na polipeptide izvedene iz S. aureus PVL kako bi se izlečili ili bar delimično zaustavili simptomi ili komplikacije.

[0133] Adekvatna količina za postizanje ovoga je definisana kao „terapeutski delotvorna doza“ ili „jedinična doza“. Količina delotvorna za ovu upotrebu će zavisiti od, npr. polipeptidnog ili polinukleotidnog sastava, načina davanja, faze ili ozbiljnosti bolesti koja se tretira, težine i opšteg zdravstvenog stanja pacijenta, i procene lekara koji propisuje terapiju, ali je uopšteno u opsegu za početnu imunizaciju za polipeptidne vakcine (za terapeutsko ili profilaktičko davanje) od oko, npr. 0,1 µg do oko 5000 µg polipeptida, u zavisnosti od odgovora pacijenta i stanja merenjem, na primer, nivoa antitela u krvi pacijenta. U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja, prajmer doza je praćena sa pojačanom dozom u vremenskom periodu.

[0134] U neograničavajućim otelotvorenjima obelodanjivanja, delotvorna količina sastava kao što je ovde obelodanjeno proizvodi povećanje titra antitela bar 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10^4, 5x10^4, ili 10^5 puta u odnosu na titar antitela pre davanja.

[0135] U alternativnim otelotvorenjima obelodanjivanja, uopšteno za ljude se daje početna imunizacija (za terapeutsko ili profilaktičko davanje) praćena sa pojačanim dozama u istom opsegu doza u skladu sa pojačanim režimom u periodu od nekoliko nedelja do meseci u zavisnosti od odgovora pacijenta i stanja merenjem odgovora antitela ili T limfocita u krvi pacijenta.

[0136] Potrebno je imati na umu da se polipeptidi i sastavi kao što je ovde opisano uopšteno mogu upotrebiti kod ozbiljnih faza bolesti, koje su situacije koje ugrožavaju ili potencijalno ugrožavaju život. U tim slučajevima, u pogledu minimiziranje stranih supstanci i relativne netoksične prirode polipeptida, moguće je i može se osetiti poželjnim od strane lekara koji propisuje tretiranje da se izvrši davanje suštinskih viškova ovih polipeptidnih sastava.

[0137] Za terapeutsku upotrebu, davanje bi trebalo da počine sa prvim znakom S. aureus infekcije ili faktora rizika. U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja, početna doza je praćena pojačanim dozama sve dok se, npr. simptomi suštinski ne smanje u određenom vremenskom periodu posle toga. U učestaloj infekciji, početne doze praćene sa pojačanim dozama su možda potrebne.

[0138] U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja, sastav kao što je ovde opisano se isporučuje ispitaniku ovde opisanim metodama, time postižući delotvorni imuni odgovor i/ili delotvorni terapeutski ili preventivni imuni odgovor. Bilo koji režim davanja se može koristiti sve dok se režim ispoljava u isporučivanju i/ili ispoljavanju željenih polipeptida u željeno tkivo, u količinama dovoljnim da stvore imuni odgovor na Staphylococcus, npr. S. aureus, i/ili stvore profilaktički ili terapeutski delotvorni imuni odgovor na Staphylococcus, npr. na S. aureus, kod životinje koja ima potrebu za takvim odgovorom. U skladu sa obelodanjenim metodama, ovde opisani sastav može biti dat mukoznom isporukom, transdermalnom isporukom, subkutanom injekcijom, intravenoznom injekcijom, oralnim davanjem, plućnim davanjem, intramuskularnim (i.m.) davanjem ili intraperitonealnom injekcijom. Drugi pogodni načini davanja obuhvataju, ali nisu ograničeni na intratrahealno, transdermalno, intraokularno, intranazalno, inhalacijsko, intrakavitalno, intraduktalno (npr. u pankreas) i intraparenhimalno (tj. u bilo koje tkivo) davanje. Transdermalno isporučivanje obuhvata, ali nije ograničeno na intradermalno (npr. u dermis ili epidermis), transdermalno (npr. perkutano) i transmukozno davanje (tj. u ili kroz tkivo kože ili sluzokože).

Intrakavitalno davanje obuhvata, ali nije ograničeno na davanje u oralne, vaginalne, rektalne, nazalne, peritonealne, ili crevne šupljine kao i na, intratekalno (tj. u kičmeni kanal), intraventrikularno (tj. u moždane ventrikule ili srčane ventrikule), intra-arterijalno (tj. u srčanu pretkomoru) i sub arahnodijalno (tj. u subarahnoidalni prostor u mozgu) davanje.

[0139] Bilo koji režim davanja se može koristiti sve dok se režim ispoljava u isporučivanju i/ili ispoljavanju željenog polipeptida, u količinama dovoljnim da stvore imuni odgovor na Staphylococcus, npr. S. aureus, i/ili stvore profilaktički ili terapeutski delotvorni imuni odgovor na Staphylococcus, npr. npr. S. aureus, kod životinje koja ima potrebu za takvim odgovorom. Davanje kao što je ovde opisano može biti npr. injekcijom sa iglom ili drugim uređajima za isporučivanje poznatim u struci.

[0140] U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja, sastav koji sadrži mutiranu stafilokoknu leukocidin podjedinicu (npr. LukS-PV ili LukF-PV ili oba) kao što je ovde opisano, ili polinukleotid, vektori ili ćelija domaćina koja kodira istu, stimulišu odgovor antitela ili imuni odgovor posredovan ćelijom koji je dovoljan za zaštitu životinje protiv Staphylococcus, npr. S. aureus infekcije. U drugim otelotvorenjima obelodanjivanja, sastav koji sadrži mutiranu stafilokoknu leukocidin podjedinicu (npr. LukS-PV ili LukF-PV ili oba) kao što je ovde opisano, ili polinukleotid, vektori ili ćelija domaćina koja kodira istu, stimulišu oba, humoralni i odgovor posredovan ćelijom koji je dovoljan za zaštitu životinje

protiv Staphylococcus, npr. S. aureus infekcije. U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja, sastav koji sadrži mutiranu stafilokoknu leukocidin podjedinicu (npr. LukS-PV ili LukF-PV ili oba) kao što je ovde opisano, ili polinukleotide, vektore ili ćeliju domaćina koja kodira istu, dalje stimuliše urođeni, antitela i/ili ćelijski imuni odgovor.

[0141] U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja, sastav koji sadrži mutiranu stafilokoknu leukocidin podjedinicu (npr. LukS-PV ili LukF-PV ili oba), kao što je ovde opisano ili polinukleotide, vektore ili ćeliju domaćina koja kodira istu, izazivaju odgovor antitela na S. aureus PVL. U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja, komponente koje izazivaju odgovore T ćelija (npr. T ćelijskih epitopa) su kombinovane sa komponentama kao što su polipeptidi kao što je ovde opisano koji prevashodno izazivaju odgovor antitela.

[0142] Dalje je obelodanjena metoda za stvaranje, pojačavanje ili izmenjivanje zaštitnog i/ili terapeutskog imunog odgovora na S. aureus infekciju kod ispitanika, koja obuhvata davanje ispitaniku koji ima potrebu za terapeutskim i/ili zaštitnim imunitetom jednog ili više sastava kao što je ovde opisano.

[0143] Sastavi kao što je ovde opisano se mogu dati životinji u bilo koje vreme životnog ciklusa životinje kojoj se daju. Kod ljudi, davanje sastava kao što je ovde opisano može, i često se povoljno vrši, dok se druge vakcine daju, npr. kao multivalentna vakcina kao što je ovde opisano .

[0144] U nastavku, sastav kao što je ovde opisano se može koristiti u bilo kom režimu imunizacije ili davanja; npr. kao jedno davanje ili alternativno kao deo režima periodične vakcinacije kao što su godišnje vakcinacije, ili kao prajmer-pojačanom režim u kojima se sastav ili polipeptid ili polinukleotid obelodanjivanja daju ili pre ili posle davanja istog ili različitog polipeptida ili polinukleotida. Nedavno ispitivanje je ukazalo da je prajmerpojačanom protokol često pogodna metoda za davanje vakcina. U prajmer-pojačanom protokolu, jedan ili više sastava kao što je ovde opisano se mogu iskoristiti u „prajmerpojačanom“ režimu. Primer „prajmer-pojačanog“ režima se može pronaći u Yang, Z. i dr. J. Virol. 77:799-803, 2002, što je ovde obuhvaćeno u potpunosti sa referencom.

[0145] Infekcije koje se tretiraju obuhvataju, ali nisu ograničene na lokalizovane ili sistemske infekcije kože, mekog tkiva, krvi ili organa ili od autoimune bolesti. Specifične bolesti ili stanja koja se tretiraju ili sprečavaju obuhvataju, ali nisu ograničena na, respiratorne bolesti, npr. pneumoniju, sepsu, stanja kože, infekcije rana, endokarditis, infekcije kostiju i zglobova, osteomijelitis i/ili meningitis.

Imuni korelati

[0146] Više životinjskih modela za S. aureus infekciju je poznato u struci, i mogu se upotrebiti sa ovde obelodanjenim metodama bez dodatnog ispitivanja. Na primer, model hrčka za Staphylococcus aureus otpornu na meticilin (MRSA) je opisan za testiranje antimikroba. (Verghese A. i dr., Chemotherapy.34:497-503 (1988), Kephart PA. i dr. J Antimicrob Chemother. 21:33-9, (1988)). U nastavku, model pneumonije uzrokovane sa S. aureus kod odraslih, opisan je imunokompetentni C57BL/6J miš, koji blisko oslikava klinička i patološka svojstva pneumonije kod ljudskih pacijenata. (Bubeck-Wardenburg J. i dr., Infect Immun. 75:1040-4 (2007)). Dodatno, virulencija je testirana u modelu pacova za S. aureus pneumoniju kao što je opisano u McElroy i dr. (McElroy MC. i dr., Infect Immun. 67:5541-4 (1999)). Na kraju, standardizovani i reproduktivni model MRSA-uzrokovane septičke pneumonije za procenjivanje novih terapija je uspostavljen za ovce. (Enkhbaatar str. i dr., Shock.29(5):642-9 (2008)).

[0147] Praksa obelodanjivanja će upotrebiti, ukoliko nije drugačije ukazano, konvencionalne tehnike biologije ćelija, ćelijskih kultura, molekularne biologije, transgene biologije, mikrobiologije, rekombinantne DNK i imunologije, koje su u okviru znanja stručne osobe. Takve tehnike objašnjene su u potpunosti u literaturi. Videti, na primer, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2. izd., Sambrook i dr., izd., Cold Spring Harbor Laboratory Press:

(1989); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook i dr., izd., Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1992), DNA Cloning, D. N. Glover izd., Tomovi I i II

(1985); Oligonucleotide Synthesis, M. J. Gait izd., (1984); Mullis i dr. pat. SAD.. br:

4,683,195; Nucleic Acid Hybridization, B. D. Hames & S. J. Higgins ured.

(1984); Transcription And Translation, B. D. Hames & S. J. Higgins ured. (1984); Culture Of Animal Cells, R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., (1987); Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press, (1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984);

studija, Methods In Enzymology, Academic Press, Inc., N.Y.; Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, J. H. Miller i M. str. Calos izd., Cold Spring Harbor Laboratory (1987); Methods In Enzymology, Tom.154 i 155 (Wu i dr. izd.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology, Mayer i alker, izd., Academic Press, London

(1987); Handbook Of Experimental Immunology, tomovi I-IV, D. M. Weir i C. C. Blackwell, itd., (1986); Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); i u Ausubel i dr., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989).

[0148] Standardni referentni radovi koji sadrže opšte principe imunologije uključuju Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein, J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, New York (1982); Roitt, I., Brostoff, J. i Male D., Immunology, 6. izd. London: Mosby (2001); Abbas A., Abul, A. i Lichtman, A., Cellular and Molecular Immunology, Izd.5, Elsevier Health Sciences Division (2005); i Harlow i Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988).

PRIMERI

[0149] Primeri koji nisu u okviru priloženih patentnih zahteva ne čine deo pronalaska.

Primer 1: Molekulsko modeliranje i projektovanje kandidata za vakcinu

[0150] Ovaj primer opisuje tehnike molekularnog modeliranja (zasnovane na računaru) za izvlačenje, analiziranje i manipulisanje strukturom Panton-Valentin leukocidin (PVL) LukF-PV i LukS-PV podjedinica u cilju dizajniranja kandidata za vakcinu.

[0151] Kako bi se razvila vakcina koja se sastoji od oslabljenih oblika LukF-PV i/ili LukS-PV, podjedinice su modifikovano kako bi se izbeglo in vivo stvaranje pora i citolitičkih i inflamatornih efekata koji se javljaju nakon formiranja pora. Za identifikovanje regiona na površinama LukF-PV i LukS-PV proteina koji mogu biti podložni mutacijama koje uništavaju formirane pore bez prekidanja strukturnog integriteta svake podjedinice, struktura LukF-PV/LukS-PV heterodimera i oktamera je modelirana kao što je opisano u Aman i dr. J Biomol Struct Dyn 28, 1-12, 2010. Ukratko, LukF-PV i LukS-PV monomeri su izvučeni iz 1PVL i 1T5R kristalnih struktura, respektivno. Nedostajući ostaci u svakoj strukturi su modifikovani u polipeptide. Dobijene strukture su energetski rafinisane upotrebom minimizacije sa automatskim povezivanjem. Kako svaka podjedinica poseduje dva naličja za interakciju u oktamerskoj strukturi nalik prstenu, bilo je neophodno konstruisati dva različita LukF-PV/LukS-PV heterodimerna modela kako bi se u potpunosti objasnile vezujuće interakcije na svakoj podjedinici. Ova dva molekularna modela su identifikovana kao FR-SL, i SL-FR. Ova nomenklatura je zasnovana na vezi rame-uz-rame LukF-PV i LukS-PV konstituenata u oktamerskoj strukturi nalik prstenu. F i S predstavljaju dve klase a indeksi R i L označavaju desno i levo naličje, respektivno. Ukoliko jedna gleda na dve podjedinice sa unutrašnje strane lumena kanala, u FR-SL modelu, desna strana LukF-PV (FR) je vezana sa leve strane LukS-PV (SL) i alternativno, u SL-FRmodelu, desna strana LukS-PV (SL) je vezana sa leve strane LukF-PV (FR). Discovery Studio 2.1 (Accelrys, Inc) program pokrenut na Dell Precision 690 sa Red Hat Enterprise Linux 4 je korišćen za izradu, prikaz i analizu proteinskih modela. Simulacije su izvršene in vacuo upotrebom dielektrične konstante vrednosti 1 zavisne od udaljenosti i nevezanih interakcija ograničenih u okviru 14 Å u CHARMM u polju sile.

Šablon u izradi model je obelodanjen u Aman i dr.

[0152] FR-SLmodel pokazuje da je Thr28 bočni lanac usko nabijen pored polipeptidnog glavnog lanca ostataka Asn158 i Phe159 u susednoj LukF-PV podjedinici (Slika 1).

[0153] Za identifikovanje drugih mesta interakcije koje mogu biti ključne za oligomerizaciju, molekularno modeliranje kao što je opisano iznad je korišćeno za skeniranje FR-SLi SR-FLpovršina u PVL oktamerskom modelu za žarišta koja, ukoliko dođe do mutacije, bi značajno pomerila konstantu ravnoteže monomer-dimer u korist monomera. Kod zrelih LukS-PV, ova mesta su bila Tyr131 i Ser209, koja su identifikovana iz FR-SLmodela površine i Lys97 i Asp101 iz SR-FLmodela. Odgovarajuća mesta u zrelom LukF-PV su bila Lys102 i Asp121 u FR-SLmodelu i Glu147 i Asn220 u SR-FLmodelu.

[0154] Kao jedna od korišćenih metrika za određivanje uticaja svake mutacije na dimerizaciju, pozicije su mutirane u alanin in silico za ostatke van Thr28 i fenilalanin za Thr28. Jednotačkasti i dvotačkasti kompleksi mutacije su minimizovani u pogledu energije, i njihove molekulske energije su izračunate relativno u odnosu na divlji tip. Slične alanin mutacije za Lys97, Asp101 i Tyr131 u LukS-PV i za Lys102, Asp121, i Glu147 u LukF-PV u molekularnom modelima su kao rezultat pokazale značajna povećanja u izračunatoj energiji kompleksa relativno u odnosu na divlji tip (videti Tabelu 1 iznad). Najdrastičnije povećanje u destabilizaciji energije je primećeno za Ser209Ala mutant kod LukS-PV. Ser209 strukture petlje i lanca u LukS-PV i nalazi se blizu sredine površine dimera između Ser209 kod LukS-PV i Lys 102 kod LukF-PV (Slika 2).

[0155] Jednotačkaste mutacije iznad opisanih mesta su predviđene da će pomeriti monomerheterodimer ravnotežu PVL u korist monomera, i ovi mutanti su izabrani kao kandidati za razvoj vakcine.

[0156] Thr28 na LukS-PV je zabeležen u literaturi da ima ulogu u dimerizaciji (V. Guillet i dr., The Journal of Biological Chemistry 279: 41028-41037 (2004)). Potencijalna upotreba Thr28 kod dvostrukih mutanata je ispitana. U ovoj preliminarnoj analizi, dvostruki mutanti Thr28Phe/Tyr131Ala i Thr28Phe/Ser209Ala kao i trostruki mutant Thr28Phe/Tyr131Ala/Ser209Ala su ispitivani in silico. Na osnovu energetskih proračuna, Thr28Phe/Ser209Ala mutant praćen sa trostrukim mutantom je imao najznačajniji uticaj. Tabela 1 takođe daje spisak izračunatog povećanja energije u strukturi heterodimernog kompleksa kao rezultat različitih predloženih pojedinačnih i dvostrukih mutacija LukS-PV.

Primer 2: Stvaranje LukS-PV i LukF-PV mutanata

[0157] Mutacije su dizajnirane na osnovu oktamernih modela i uvedeni su u cDNK konstrukte za LukS-PV i LukF-PV koji su nosili N-Terminalnu 6xHis oznaku za svrhe prečišćavanja. LukS-PV i LukF-PV DNA fragmenti divljeg tipa koji kodiraju odgovarajuće zrele proteinske sekvence su sintetisani sa PCR, tretirani sa BamHI i Kpnl restrikcionim enzimima kako bi se stvorili kohezivni krajevi, i klonirali u pQE30 vektor (Qiagen) digestiran sa BamHI i Kpnl restrikcionim enzimima. Mutacije su uvedene u DNK upotrebom QickChange<R>II kompleta za mutagenezu usmerenu na mestu (Stratagene). Nukleotidna sekvenca plazmidnog konstrukta koji kodira LukS-PV divljeg tipa je predstavljena kao SEQ ID NO: 123. Nukleotidna sekvenca plazmidnog konstrukta koji kodira mutirani (K97A) LukS-PV je predstavljena kao SEQ ID NO: 124. Nukleotidna sekvenca plazmidnog konstrukta koji kodira mutirani (D102A) LukS-PV je predstavljena kao SEQ ID NO: 125. Nukleotidna sekvenca plazmidnog konstrukta koji kodira mutirani (Y131A) LukS-PV je predstavljena kao SEQ ID NO: 126. Nukleotidna sekvenca plazmidnog konstrukta koji kodira mutirani (S209A) LukS-PV je predstavljena kao SEQ ID NO: 127. Nukleotidna sekvenca plazmidnog konstrukta koji kodira mutirani (T28F) LukS-PV je predstavljena kao SEQ ID NO: 128. Nukleotidna sekvenca plazmidnog konstrukta koji kodira mutirani (T28F/Y131A) LukS-PV je predstavljena kao SEQ ID NO: 129. Nukleotidna sekvenca plazmidnog konstrukta koji kodira mutirani (T28F/S209A) LukS-PV je predstavljena kao SEQ ID NO: 130. Nukleotidna sekvenca plazmidnog konstrukta koji kodira mutirani (T28F/K97A/S209A) LukS-PV je predstavljena kao SEQ ID NO: 131. Nukleotidna sekvenca plazmidnog konstrukta koji kodira LukF-PV divljeg tipa je predstavljena kao SEQ ID NO: 132. Nukleotidna sekvenca plazmidnog konstrukta koji kodira mutirani (K102A) LukF-PV je predstavljena kao SEQ ID NO: 133. Nukleotidna sekvenca plazmidnog konstrukta koji kodira mutirani (D121A) LukF-PV je predstavljena kao SEQ ID NO: 134. Nukleotidna sekvenca plazmidnog konstrukta koji kodira mutirani (E147A) LukF-PV je predstavljena kao SEQ ID NO: 135.

[0158] Plazmidni konstrukt koji kodira LukF-PV trostruki mutant (K102A/D121A/E147A) naveden u Tabeli 1 je takođe stvoren kao što je opisano iznad. Sekvenca zrelog proteina za LukF-PV trostrukog mutanta (Lys102Ala (K102A)/Asp121Ala (D121A)/Glu147Ala (E147A)) je prikazana ispod za mutiranim amino kiselinama podvučenim i predstavljena je kao SEQ ID NO: 136:

[0159] Nukleotidna sekvenca plazmidnog konstrukta koji kodira trostrukog mutanta (K102A/D121A/E147A) LukF-PV je prikazana ispod (mesta kloniranja BamHI i Kpnl su podvučena, mutacije su dvostruko podvučene, i terminacijski kodon je u kurzivu) i predstavljena je kao SEQ ID NO: 137:

[0160] Mutanti, koji su izabrani na osnovu strukturne analize opisane iznad, obuhvatali su pet jednostrukih, dva dvostruka i jedan trostruki mutant LukS-PV kao i četiri jednostruka i jedan trostruki mutant LukF-PV (Tabela 1). Mutirani proteini zajedno sa His-označenim podjedinicama divljeg tipa su proizvedeni u E.coli soju XL1-plava [recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F' proAB LacIqZΔM15 Tn10 (Tetr)] i prečišćeni na HisTrap™ HP koloni (GE Healthcare Cat#17-5248-02) upotrebljenoj u skladu sa uputstvima proizvođača. Svi proteini su kontrolisani u pogledu kvaliteta sa SDS-PAGE (elektro foreza sa natrijum dodecil sulfat-poliakrilamid gelom) upotrebom tehnika kolone i western blot analize sa odgovarajućim antitelima (LukS-PV: V5184 poliklonalno Ab zeca (Genscript), LukF-PV: 1A11 mA (IBT)).

[0161] SDS-PAGE i Western blot analiza za LukS-PV Mut9, LukF-PV Mut1 i LukF-PV trostrukog mutanta (K102A/D121A/E147A) su prikazani na Slikama 7A-C.

Primer 3: Slabljenje LukS-PV i LukF-PV mutanata

[0162] Svaki od LukS-PV i LukF-PV mutanata je testiran u probi toksičnosti neutrofila u kombinaciji sa LukF-PV ili LukS-PV divljeg tipa, respektivno. Upotrebom ploče za kulturu tkiva sa 96 udubljenja i okruglim dnom, divlji tip ili mutirani LukS-PV ili LukF-PV proteini su bili semi-log razblaženi u duplikatima u ploči u podloži za probu (RPMI, 2% FBS, 5mM glutamin) što je bilo praćeno dodavanjem 5 x 10<5>DMSO indukovanih HL-60 ćelija. HL-60 ćelije su diferencirane u neutrofile tretiranjem sa DMSO. Suspenzija je blago protapkana i ploče su inkubirane u trajanju od 48 sati na 37°C sa 5% CO2i 95% vlažnosti. Za određivanje ćelijske održivosti, 20 µL 2mg/mL razblaženog XTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) je dodato u svako udubljenje, inkubirano je u trajanju od 6 sati na 37°C sa 5% CO2i 95% vlažnošću, centrifugirano i supernatant je prenet u ELISA ploču i očitan do 470nm. Procenat (%) održivosti je određen kao što sledi: % Održivosti = (OD vrednost za udubljenje sa eksperimentalnim uzorkom/OD vrednost za HL-60 ćelije bez PVL toksina) x 100. Podaci su predstavljeni kao % ćelijskog preživljavanja na Slikama 3 i 4.

[0163] Podaci za mutirani LukS-PV su pokazali da dok svaki od pojedinačnih mutanata ili dvostrukih mutanata blago smanjuje toksičnost LukS-PV u kompleksu sa LukF-PV divljeg tipa, da je trostruki mutant u kombinaciji sa mutacijama T28F, K97A, i S209A doveo do skoro potpunog oslabljenja. U prisustvu trostrukog mutanta kombinovanog sa LukF-PV divljeg tipa, preko 90% ćelija je ostalo održivo (Slika 3).

[0164] Mutirani LukF-PV proteini su testirani u probi toksičnosti neutrofila kao što je opisano iznad, u kombinaciji sa LukS-PV divljeg tipa ili LukS-PV trostrukim mutantom (T28F, K97A, i S209A). Kao što je prikazano na Slici 4, svaka od pojedinačnih mutacija je smanjila toksičnost LukF-PV kada je kombinovana sa LukS-PV divljeg tipa. Od tri testirana LukF-PV mutanta, K102A mutant je pokazao najveći stepen oslabljenja sa potpunim gubitkom toksičnosti pri 300 ng/ml i oko 50% smanjene toksičnosti pri 3000 ng/ml. Kada su kombinovani sa LukS-PV trostrukim mutantom sva tri LukF-PV mutanta (LukF K102A, LukF D121A i LukF E147A) su pokazala potpuno deaktivaciju.

Primer 4: Poliklonska antitela za PVL zaštitu kod miševa od smrtonosnog izazova sa S. aureus sojem stečenim u zajednici USA300 (LAC).

[0165] Testirana je sposobnost zaštite anti-PVl poliklonalnih antitela protiv bakteremije izazvane sa S. aureus USA300 kod miševa. Za ovo ispitivanje poliklonalna antitela su stvorena u zečevima vršenjem imunizacije sa His-označenim proteinom koji je sadržao sekvencu divljeg tipa LukS-PV predstavljene sa SEQ ID NO: 6 i N-terminalnu 6xHis oznaku. Poliklonalna antitela (ukupni IgG) su prečišćena iz hiperimunog seruma na protein G koloni. U nastavku, specifična anti-LukS-PV antitela su prečišćena iz ukupnog IgG upotrebom AminoLink® Plus kompleta za imobilizaciju (Thermoscientific). Komplet je obuhvatao reagense, kolonu u pufere potrebne za pakovanje kolone za afinitet sa zrnima. Zrna spojena sa LukS-PV proteinom i prečišćavanje afiniteta poliklonalnog anti-LukS-PV antitela je izvršeno u skladu sa protokolom proizvođača. U nastavku, za testiranje sposobnosti anti-LukS-PV antitela da se sinergišu sa anti-α-hemolizin antitelima (Hla), ispitane su kombinacije anti-LukS-PV i anti Hla poliklonalnih antitela. Model obelodanjen u Fattom i dr., Infect Immun 64, 1659-1665, 1996, u kojem su BALB/c miševi intraperitonealno izazivani sa S. aureus gde je Hog-Mucin primenjen. Miševi su prethodno tretirani sa ukazanim antitelima 24 sata pre izazivanja. IgG naivnih miševa je korišćen kao kontrola. Nakon izazivanja sa 5x10<4>USA300 i 3% Hog-Mucin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), miševi su praćeni za morbiditet i mortalitet u trajanju od 5 dana. Kao što je prikazano na Tabeli 3, svi miševi tretirani sa naivnim mišijim IgG su uginuli u vremenskom periodu 16-20 sati nakon izazivanja. Kao kontrast, 3 od 5 miševa koji su primili 50 ug prečišćenog anti-LukS-PV i 2 od 5 miševa koji su primili 2 mg anti-Hla ukupni IgG su preživeli što predlaže da svaka komponenta doprinosi zaštiti. Kada je 2 mg anti-Hla IgG kombinovano sa 50 ili 25 µg prečišćenih anti LukS-PV antitela, primećeno je 100% preživljavanje. Niže doze prečišćenog anti-LukS-PV (12.5µg) kada se dodaju u anti-Hla dovode do 80% preživljavanja što je više nego preživljavanje postignuto sa bilo kojom komponentom samostalno. Ovi podaci predlažu da vakcinacija sa kombinacijom LukS-PV ili Hla vakcine mogu dovesti do dodatnih ili sinergičkih zaštitnih dejstava protiv S.

aureus bakteremije.

Tabela 3: Zaštita protiv USA300 bakteremije sa antitelima za LukS-PV i Hla

Primer 5: Identičnost sekvence za stafilokokne dvokomponentne toksine koji formiraju pore

[0166] Identičnost sekvence između LukS, LukM, LukM, LukE i HIgA/S je poređena. S. aureus γ-hemolizin (Hlg), leukocidin (Luk) i PVL su povezana dvakomponenta toksina koji formiraju pore (Kaneko i dr., Biosci Biotechnol Biochem, 2004.68(5): str. 981-1003).

[0167] LukS-PV ima visoku identičnost sekvence sa LukS, LukM, LukE i HIgA/C u rasponu od 65% do 81% kao što je prikazano na Slici 5. Sva tri mesta mutagenisana u oslabljenom mutantiranom LukS-PV kandidatu za vakcinu ovde testiranom su pokazala da su konzervisana preko familije (prikazano na kutiji sa * na Slici 5). Slično, Luk-PV je pokazan da je visoko homologan za LukF, LukD, LukDV i HlgB i mesta mutirana u LukS-PV vakcinama ovde testiranim su konzervirana. U skladu sa ovom homologijom, pokazano je da su LukS-PV poliklonalna antitela suzbila citotoksičnu aktivnost prema PMN u supernatantu ne samo kod PVL-pozitivnih sojeva (USA300&400) već takođe i kod PVL deficijentnih sojeva kao što su Newman i 8325-4 (Slika 6). Ovi podaci su pokazali da su antitela izazvana protiv PVL podjedinica pokazala širu reaktivnost i neutralizovane ne-PVL leukocidine.

Primer 6: In vitro strukturna i funkcionalna karakterizacija mutiranih proteina [0168] Funkcionalna aktivnost LukS-PV i LukF-PV mutanata ovde obelodanjenih je testirana u probi citotoksičnosti upotrebom HL-60 ćelija diferenciranih do neutrofila (Romero-Steiner i dr., Clin Diagn Lab Immunol, 1997.4(4): str.415-22). Za obezbeđivanje strukturnog integriteta mutanata, ovi proteini zajedno sa suprotnim delovima divljeg tipa su analizirani spektrometrijom sa cirkularnim dihroizmom (CD). U nastavku, termalna stabilnost proteina je određena upotrebom diferencijalne skenirajuće fluorimetrije (DSF).

[0169] Analiza citotoksičnosti Ćelijska citotoksičnost je testirana upotrebom kombinacije svake mutirane podjedinice sa oblikom divljeg tipa drugih podjedinica upotrebom HL-60 ćelija (ATCC, kataloški broj CCL-240) diferenciranih in vitro u neutrofile (Romero-Steiner i dr.). HL-60 ćelije su propagirane u RPMI/15% FBS i 1.6% dimetilsulfoksidu (DMSO) u trajanju od 6 dana. Diferencirane ćelije nalik neutrofila su sakupljene i prenete u ploče sa 96 udubljenja za probu PVL toksičnosti pri krajnjoj gustini od 5x10<5>ćelija/udubljenju. Svaka PVL podjedinica (mutirana ili divljeg tipa) je korišćena pri 200 ng/ml. Ćelije su inkubirane u trajanju od 48 sati na 37°C i ćelijska održivost je procenjena nakon 16 sati dalje inkubacije sa 100 µg/ml XTT (Sigma-Aldrich) i kolorimetrijskim merenjem pri OD470 nm. Procenat održivost ćelija je zatim izračuna u poređenju sa otvorima bez toksina.

[0170] Kao što je prikazano na Slici 8A, pojedinačni mutanti LukS-PV nisu imali značajan uticaj na toksičnost PVL kada su mutanti kombinovani sa LukF divljeg tipa a dvostruki mutanti su blago smanjili PVL toksičnost. Međutim, trostruki mutirani LukS-PV_T28F/K97A/S209A (označen kao Mut9) je u potpunosti oslabljen uprkos kombinovanju sa LukF divljeg tipa (Slika 8A). Sva tri pojedinačna mutanta LukF su izazvala desno pomeranje na krivi odgovora na dozu sa najvećim oslabljenjem postignutim sa LukF_K102A (označeno kao Mut1) (Slika 8B). Kada je ovaj mutant kombinovan sa LukS Mut9 nije primećena toksičnost (Slika 8B). Niska toksičnost je primećena kod LukF mut1 kada su kombinovani sa LukS divljeg tipa prema visokoj koncentraciji. Trostruki LukF mutant (K102A/D121A/E147A) je konstruisan i testiran. Kao što je prikazano na Slici 8C, trostruki LukF mutant je u potpunosti oslabljen kada je kombinovan sa LukS divljeg tipa i takođe sa LukS mut9.

[0171] Analiza termalne stabilnosti: Termička stabilnost LukS-PV i LukF-PV mutiranih proteina je procenjena sa Termoflour (diferencijalna skenirajuća fluorimetrija) upotrebom Sypro Orange kao spoljašnje fluorescentne probe, koja se vezuje za hidrofobne ostatke vršeći detekciju njihovog izlaganja za vreme odvijanja proteina. Kada se zagreju preko kritične temperature (>70°C za LukS i LukF-PV), proteini teže da se odviju. Ovo se ispoljava u povećanoj fluorescenciji, ali ukoliko odvijanje dovede do agregacije rezultat je povećana fluorescencija. Ovo povećanje i smanjenje fluorescentnog signala je način za praćenje odvijanja proteina, izračunavanje temperatura topljenja i poređenje termičke stabilnosti različitih proteina pod različitim eksperimentalnim uslovima (Ericsson i dr., Anal Biochem, 2006. 357(2): str.289-98; He i dr., J Pharm Sci, 2010.99(4): str.1707-20). Rezultati su prikazani na Slici 9.

[0172] Slika 9A prikazuje izmene u fluorescentnom signalu proteina za vreme termičkog odvijanja u prisustvu boje dok Slika 9B prikazuje dijagram dela odvijenog proteina na osnovu poklapanja svake krive topljenja proteina upotrebom jednačine za dva stanja kao što je opisano u Devi i dr., Biochemistry, 2006.45(6): str.1599-607. Divljeg tipa i mutirani proteini obe podjedinice su pokazali veoma nisku fluorescenciju u pozadini kada su se ispravno savili na 25°C i zadržali intenzitet do 55°C pokazujući da su proteini stabilni.

Topljenje preko 55°C je izazvalo povećanje u fluorescentnom signalu, što je usled odvijanja proteina. Ovo naglo povećanje je takođe podržalo visoko ko-operativni proces odvijanja. Kriva za LukS-PV divljeg tipa je blago pomerena na desno što ukazuje na njegovu veću stabilnost. Maksimalni intenzitet fluorescencije je primećen pri 75°C za LukS-PV divljeg tipa dok je bio pri 70°C za druge mutante. Kada se zagreju do ovih temperatura, intenzitet fluorescencije je pao za sve proteine što ukazuje da je došlo do pojave agregacije. Prema tome, vrednosti intenziteta samo do 75°C su razmatrane za stvaranje dijagrama dela odvijenog proteina (Slika 9B). Očigledne Tm vrednosti iz Boltzmann Sigmoid poglapanja podataka su pokazale da su Tm za sve testirane mutante bile u opsegu od 62,6 i 63,6, što je bilo slično kod LukS divljeg tipa (64,8) i LukF divljeg tipa (62,9) i predlaže da mutacije nisu uticale na termalnu stabilnost proteina.

Primer 7: Ispitivanja imunogenosti kod miševa upotrebom različitih klinički relevantnih adjuvansa

[0173] Ispitivanja imunogenosti i adjuvansa Ispitivanje imunogenosti je izvršeno kod miševa upotrebom različitih klinički relevantnih adjuvanasa uključujući dva oblika adjuvanasa baziranih na alaunu, Alhidrogelu (Al(OH)3) i aluminijum fosfatu (AlPO4), kao i dva nova adjuvansa trenutno u kliničkim ispitivanjima IDC-1001 (takođe poznati kao GLA-SE; glukopiranozil lipid adjuvans stabilna emulzija) (Coler i dr., PLoS One, 2010.5(10): str. e13677; Coler i dr., PLoS One, 2011.6(1): str. e16333) i CpG (Mullen i dr., PLoS One, 2008.

3(8): str. e2940).

[0174] Grupe od 5 ženki BALB/c miševa je vakcinisano intramuskularno (IM) tri puta sa 5 µg LukS-PV T28F/K97A/S209A (LukS-Mut9) gde je svaki adjuvans bio u intervalima od 2 nedelje. Kao kontrole, divlji tip (wt) LukS-PV kao i irelevantni antigen (STEBVax; staf enterotoksin B vakcina) su kombinovani sa Alhidrogelom. Miševi su iskrvarili na dane 21 i 35. Svi testirani adjuvansi su uzrokovali robusni ukupni odgovor antitela jedan log više u odnosu na slučaj bez adjuvansa (Slika 10A). Titer neutrališućeg antitela je određen upotrebom HL-60 izvedenih neutrofila kao što je opisano iznad. Kao što je prikazano na Slici 10B, najviši neutrališući titer je postignut nakon tri vakcinacije upotrebom adjuvansa baziranom na alaunu i IDC-1001. Odgovor antitela na LukS-Mut9 je upoređen sa odgovorom LukS-PV divljeg tipa i rezultati su podržali konzervaciju imunoloških epitopa u mutantu.

Primer 8: Efikasnost kandidata za PVL vakcinu kod modela pneumonije i intraperitonealne sepse kod miševa

[0175] Ispitivanja efikasnosti su izvršena kod modela pneumonije i intraperitonealne sepse kod miševa Ispitivanja su izvršena za procenjivanje efikasnost kandidata za PVL vakcinu samostalno i u kombinaciji sa podjediničnom vakcinom za α-hemolizin, AT-62 (Adhikari i dr., PLoS One, 2012.7(6): str. e38567). Na početku, ispitivanja pasivne imunizacije su izvršena sa smrtnošću i bakterijskim opterećenjem kao krajnjim tačkama upotrebom mišijeg modela za bakteremiju. Posle toga, dokazivanje koncepta ispitivanja aktivne imunizacije kod oba modela, bakteremije/sepse kao i pneumonije je izvršeno.

[0176] Opis životinjskih modela: U mišijem modelu za pneumoniju, ženke BALB/c miševa su anestezirane sa izofluranom i inokulisane intranazalno (IN) sa smrtnom dozom (∼2x10<8>) USA300 u 50µl PBS i postavljene u kaveze u ležećem položaju i praćeni za morbiditet (masa, pogrbljeni položaj, otežano disanje, naborane dlake, oslabljeno kretanje) i mortalitet 4 puta na dan prvih 48 sati i zatim jednom na dan do završetka ispitivanja. U modelu za bakteremiju, ženke BALB/c miševa su izazivane intra-peritonealnom (IP) injekcijom sa USA300 u 3% rastvoru mucina kao što je prethodno opisano u Fattom i dr., Infect Immun, 1996.64(5): str.

1659-65. Ukratko, liofilizovani micin tipa III od svinja je rastvoren do 6% u PBS, sterilisan autoklaviranjem i brzo ohlađen na ledu. Isprane sa PBD, bakterije gajene preko noći su suspendovane u PBS pri 2 x 10<5>CFU/ml. Rastvor bakterija i mucina je pomešan kako bi se postigla namerena doza za izazivanje (videti Tabela 4 ispod) u 0.5ml 3% mucina svinje. Miševi su praćeni za morbiditet i mortalitet dva puta na dan u trajanju od 7-14 dana. Miševi su bili starosti od 6 nedelja za aktivno i 10 nedelja za pasivno ispitivanje imunogenosti. Za određivanje bakterijskog širenja na organe, miševi su eutanazirani 12h nakon izazivanja i krv i organi (jetra, kombinovani bubrezi, pluća i slezina) su aseptički uklonjeni, homogenizovani i stavljeni u 500 µl PBS. Uzorci krvi i homogenati organa su postavljeni u različite rastvore na PHI agar pločama i CFU je izbrojan nakon ON inkubiranja pri 37°C.

[0177] Ispitivanja pasivne imunizacije: Efikasnost zečijih poliklonalnih antitela na LukS-PV (LukS-IgG) i Hla (AT62-IgG) samostalno i u kombinaciji je ispitivano u modelu za bakteremiju. Grupe od 5 miševa su ubrizgane IP sa različitim dozama antitela, izazivane 24 sata kasnije i praćene u periodu od 7 dana. Kao što je prikazano na Tabeli 4 (Pr.1), niska vrednost poput 0,25 mg LukS-IgG je pružila potpunu zaštitu. U suprotnosti, 4 mg AT62-IgG je bilo potrebno za pružanej 100% zaštite sa delimičnom efikasnošću pru 2,5 mg (videti Tabela 4 (Pr.2)).

Tabela 4: Efikasnost pasivne imunizacije sa zečijim poliklonalnim antitelima protiv LukS i Alfa toksina kod modela USA300 bakteremije.

[0178] Posle toga, afinitet prečišćenog LukS-IgG je kombinovan sa suboptimalnom dozom (2 mg) AT62-IgG. Kao što je prikazano na Tabeli 5, 50µg LukS-IgG sa prečišćenim afinitetom ili 2 mg AT62-IgG je pružilo delimičnu zaštitu dok je kombinacija dva antitela pri ovim dozama u potpunosti zaštititla miševe. Potpuna zaštita je takođe primećena sa 2 mg AT62-IgG i 25 µg LukS-IgG sa prečišćenim afinitetom i 4 od 5 miševa je preživelo sa 12,5 µg LukS antitela u kombinaciji sa 2 mg AT62-IgG.

Tabela 5: Ispitivanja kombinovane pasivne imunizacije za zečije pAb protiv LukS i Alfa toksina u modelu USA300 bakteremije.

[0179] U postavci sličnih ispitivanja, sinergistički uticaj prethodnog tretiranja (24 sata pre izazivanja) sa AT62-IgG i LukS-IgG na bakterijsko širenje je određen 12 sati nakon što je USA 300 izazivanje testirano. Kao što je prikazano na Slici 11, dva antitela su pokazala snažnu sinergiju pri smanjenju bakterijskog opterećenja na krv i organe. Ovi podaci u velikom podržavaju da antitela na LukS i alfa toksin deluju sinergički pri zaštiti od smrtne bakteremije i sepse.

[0180] Efikasnost LukS-PV mut9 i LukF-PV mut1 u kombinaciji sa alfa toksin vakcinom AT-62 je testirana u BALB/c miševima. Grupa od 10 miševa je imunizovana tri puta IM sa 10µg svake vakcine ili BSA (kao kontrola) pojedinačno ili u dvostrukim ili trostrukim kombinacijama u intervalima od dve nedelje sa AlPO4u 1:8 odnosu. Za model bakteremije/sepse, miševi su izazivani IP na dan 42 sa 1xLD90 USA300 (5x10<4>CFU) u 3% mucinu i praćeni u periodu od 7 dana. Kao što je prikazano na Slici 12A, S i F mutanti su pružili 60% i 40% zaštitu, respektivno, i kombinacija dve mutirane podjedinice je povećala zaštitu do 80%, što je bilo slično sa samim AT-62. Potpuna zaštita je praćena kada su tri antigena kombinovana zajedno. Slično ispitivanje je izvršeno u modelu za pneumoniju sa visokom dozom za izazivanje (2x10<8>CFU) od USA300. Dok ni jedna od pojedinačnih komponenti nije pružila značajnu zaštitu, kombinacija dva leukocidina sa AT-62 je dovela do 50% zaštite (P=0,0021) (Slika 12B).

Primer 9: Unakrsno-reaktivna i unakrsno-neutrališuća antitela stvorena sa LukS-PV mut9 in vivo

[0181] Imunogena proba je izvršena vršenjem imunizacije LukS-PV mutanta 9 (LukS-PV T28F/K97A/S209A) u grupi od 4 miša. Uzorci seruma su sakupljeni nakon četiri imunizacije i titer antitela u odnosu na LukS-PV divljeg tipa (Slika 13A), HlgC (Slika 13B) i HlgB (Slika 13C) je određen. Ovi rezultati su jasno pokazali prisustvo unakrsno reaktivnih antitela za oba, HlgB i C indukovane imunizacijom sa LukS-PV mut9. Na osnovu probe neutralizacije zasnovane na HL-60 ćeliji, poliklonalno anti-LukS-PV mut9 antitelo je pokazano da vrši neutralizaciju leukotoksina za oba, PVL (LukS-PV divljeg tipa LukF-PV) i gama hemolizin (HlgB divljeg tipa HlgC) (Slika 13D). Ovi eksperimenti su dalje potvrdili indukovanje unakrsno zaštitnih anti-leukotoksin antitela vršenjem imunizacije sa LukS-PV mut9 i podržavanjem širokog spektra primena ove mutirane vakcine.

Primer 10: Leukocidin oligomerizacija i suzbijanje oligomerizacije sa antitelima za LukS-PV

[0182] Oligomerizacija leukocidin komponenti je potrebni korak za citotoksičnost ovih proteina. U ovde opisanim ispitivanjima, ispitivano je da li (i) mutacije u LukS-PV ili LukF-PV međusobno deluju sa homolognom i/ili heterolognom oligomerizaciju leukocidin komponenti, i (ii) da li antitela za LukS suzbijaju homolognu i/ili heterolognu oligomerizaciju. Proba oligomerizacije za Leukocidin komponente (PVL i gama hemolizini) je izvršena upotrebom 2-metil-2,4-pentandiol (MPD) zasnovane probe kao što je opisano u Yamashita i dr., Proc Natl Acad Sci U S A, 2011.108(42): str.17314-9. Ukratko, jednake količine obe komponente zajedno su inkubirane u prisustvu 40% MPD u trajanju od 24 sata na sobnoj temperaturi. Uzorci su postavljeni na SDS PAGE bez ključanja i gelovi su označeni sa Gel Code Blue™ reagensom. Za suzbijanje PVL oligomerizacije, LukS-PV je prethodno inkubiran sa zečijim anti-LukS-PV poliklonalnim antitelima (pAbs) pri sniženoj koncentraciji u trajanju od 30 minuta. Jednaka količina LukF-PV je dodata u smešu i inkubirana na sobnoj temperaturi u prisustvu 40% MPD u trajanju od 24 sata. Uzorci su analizirani na SDS PAGE bez ključanja i gelovi su označeni sa Gel Code Blue™ reagensom.

[0183] Kao što je prikazano Slici 14A (Traka 2), oblici divljeg tipa (wt) LukS-PV i LukF-PV su formirali oligomernu grupu sa >160 kd. Slična oligomerna grupa je primećena sa LukF-PV mutantom 1 u kombinaciji sa LukS-PV divljeg tipa (Slika 14A, Traka 3). Unakrsna oligomerizacija između LukS-PV divljeg tipa i gama hemolizin komponente B je prikazana (Slika 14A, Traka 4). Međutim, LukS-PV mutant 9 nije izvršio oligomerizaciju ni sa LukF-PV divljeg tipa ni sa LukF-PV mutantom 1 (Slika 14A, Trake 5 i 6), što je u skladu sa oslabljenom toksičnošću primećenom za LukS-PV mutant 9. Ovaj mutant takođe nije izvršio oligomerizaciju sa gama hemolizin B podjedinicom divljeg tipa (Slika 14A, Traka 7), što dalje potvrđuje njegovu bezbednost za upotrebu kao kandidat za vakcinu. Slika

14B, prikazuje suzbijanje oligomerizacije LukS-PV/LukF-PV divljeg tipa sa zečijim poliklonalnim anti-LukS antitelom na način u zavisnosti od doze. Slika 14C, je pokazala da su zečija poliklonalna anti-LukS antitela takođe bila u stanju da unakrsno suzbiju heterolognu oligomerizaciju LukS-PV hlgB.

Claims (14)

Patentni zahtevi

1. Izolovani mutant polipeptida stafilokokne leukocidin podjedinice divljeg tipa koji sadrži SEQ ID NO: 5, 6 ili 15,

gde mutirani polipeptid stafilokokne leukocidin podjedinice sadrži aminokiselinsku zamenu na poziciji koja odgovara K97 kod SEQ ID NO: 6

koji smanjuje toksičnost mutirane leukocidin podjedinice relativno u odnosu na odgovarajuću leukocidin podjedinicu divljeg tipa;

ili

izolovani mutant polipeptida stafilokokne leukocidin podjedinice divljeg tipa koji sadrži SEQ ID NO: 16, 17, 21, 22, 23, 24, 25 ili 26,

gde mutirani polipeptid stafilokokne leukocidin podjedinice sadrži aminokiselinsku zamenu na poziciji koja odgovara K102 kod SEQ ID NO: 17,

koji smanjuje toksičnost mutirane leukocidin podjedinice relativno u odnosu na odgovarajuću leukocidin podjedinicu divljeg tipa.

2. Mutirana leukocidin podjedinica prema patentnom zahtevu 1, gde je položaj koji odgovara K97 kod SEQ ID NO: 6 ili K102 kod SEQ ID NO: 17 zamenjen sa alaninom.

3. Mutirana leukocidin podjedinica prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde je mutirana leukocidin podjedinica Panton-Valentin leukocidin (PVL) LukS-PV koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 7 ili 14 ili gde je mutirana leukocidin podjedinica Panton-Valentin leukocidin (PVL) LukF-PV koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18 ili 136.

4. Polipeptidni kompleks koji sadrži mutiranu leukocidin podjedinicu prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 3 ili njihovu kombinaciju.

5. Mutirana leukocidin podjedinica prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 3 koja dalje sadrži heterolognu aminokiselinsku sekvencu.

6. Mutirana leukocidin podjedinica prema patentnom zahtevu 5, gde heterologna aminokiselinska sekvenca kodira:

(a) peptid izabran iz grupe koju čine His-oznaka, ubikvitin oznaka, NusA oznaka, domen koji vezuje hitin, B-oznaka, HSB-oznaka, zeleni fluorescentni protein (GFP), protein koji vezuje kalmodulin (CBP), protein koji vezuje galaktozu, protein koji vezuje maltozu (MBP), domeni koji vezuju celulozu (CBD), avidin/streptavidin/Strepoznaka, trpE, hloramfenikol acetiltransferaza, lacZ(β-Galaktozidaza), FLAG™ peptid, S-oznaka, T7-oznaka, fragment bilo kod od navedenih heterolognih peptida i kombinacija dva ili više navedena heterologna peptida; ili

(b) gde heterologna aminokiselinska sekvenca kodira imunogen, T-ćelijski epitop, B-ćelijski epitop, fragment bilo kog od navedenih heterolognih peptida i kombinaciju dva ili više navedena heterologna peptida.

7. Izolovani polinukleotid koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira mutiranu leukocidin podjedinicu prema bilo kom od patentnih zahteva od 1-3 ili 5-6.

8. Vektor koji sadrži polinukleotid prema patentnom zahtevu 7.

9. Ćelija domaćina koja sadrži polinukleotid prema patentnom zahtevu 7 ili vektor prema patentnom zahtevu 8.

10. Metoda za proizvodnju mutiranog polipeptida stafilokokne leukocidin podjedinice, koja obuhvata kultivisanje ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 9 i dobijanje polipeptida.

11. Sastav koji sadrži mutiranu leukocidin podjedinicu prema bilo kom od patentnih zahteva od 1-3 ili 5-6, ili polipeptidni kompleks prema patentnom zahtevu 4 i nosač.

12. Sastav prema patentnom zahtevu 11 za upotrebu u metodi za izazivanje imunog odgovora kod domaćina protiv Staphylococcus aureus soja, koja obuhvata davanje ispitaniku koji ima potrebu za imunim odgovorom delotvorne količine navedenog sastava.

13. Sastav koji sadrži mutiranu leukocidin podjedinicu prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 3 ili 5 do 6, ili polipeptidni kompleks prema patentnom zahtevu 4, za upotrebu u metodi za prevenciju ili tretiranje Stafilokokne bolesti ili infekcije kod ispitanika koja obuhvata davanje sastava ispitaniku koji ima potrebu za time.

14. Metoda za proizvodnju vakcine protiv S. aureus infekcije koja obuhvata:

(a) izolovanje mutirane leukocidin podjedinice prema bilo kom od patentnih zahteva od 1-3 ili 5-6 ili polipeptidnog kompleksa prema patentnom zahtevu 4; i

(b) kombinovanje mutirane leukocidin podjedinice ili polipeptidnog kompleksa sa adjuvansom.