RS59093B1 - Anti-cd26 antitela i njihova primena - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PREDMETNOG PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na nova antitela koja se mogu vezati za CD26, kao i na njihovu upotrebu kao leka. Osim toga, predmetni pronalazak se odnosi na antitela za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji bar jedne od bolest kalem protiv domaćina (GvHD - Graft-versus-Host Disease) ili aplastične anemije, kao i na antitela za upotrebu u podsticanju kalemljenja posle transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija.

STANJE TEHNIKE PREDMETNOG PRONALASKA

[0002] CD26 je široko rasprostranjen glikoprotein od 110 kDa na površini ćelije, inicijalno definisan kao antigen za aktivaciju T-ćelije (Fox et al. (1984) J. Immunol. 133, 1250-1256, Fleischer (1987) J. Immunol. 138, 1346-1350, i Morimoto et al. (1989) J. Immunol. 143, 3430-3439). Pokazano je da ovaj molekul ima aktivnost dipeptidil peptidaze IV (DPPIV; EC3.4.14.5) u svom ekstracelularnom domenu, i ima široku rasprostranjenost u tkivima (Hegen et al. (1990) J. Immunol. 144, 2908-2914 i Ulmer et al. (1990) J. Immunol. 31, 429-435; WO 2007/014169 A2). CD26 ima višestruke funkcije u fiziologiji humane T-ćelije. Na primer, dokazi sugerišu da CD26 može da isporuči kostimulatorni signal za aktivaciju T-ćelije (Morimoto et al. (1994) Immunologist 2: 4-7 i Fleischer (1994) Immunol. Today 15:180-184). Dalje, CD26 je identifikovan kao ADA vezujući protein, a CD26/ADA kompleks može igrati ključnu ulogu u regulaciji funkcije imunog sistema (Dong et al. (1996) J Immunol. 156(4):1349-55, Kameoka et al. (1993) Science. 261(5120):466-9, i Morrison et al. (1993) J Exp Med. 177(4):1135-43). Funkcionalna povezanost između CD26 i ćelijskog proteina topoizomeraze II α takođe je prijavljena (Aytac et al. (2003) British Journal of Cancer 88:455-462). Anti-CD26 antitela su npr. poznata iz WO 2007/014169 A2.

[0003] Transplantacija hematopoetskih matičnih ćelija (HSCT - Haematopoietic stem cell transplantation) predstavlja važnu terapiju za mnoge hematološke i brojne epitelne malignitete, kao i za značajan broj nemalignih bolesti (Ferrara et al., 2009, Lancet.; 373: 1550-1561; Sun et al., 2007, Transl. Res.; 150: 197-214). Bolest kalem protiv domaćina (GvHD) je glavna komplikacija alogene transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija (HSCT) i stoga ograničava upotrebu ovih važnih terapija.

[0004] Postoje dve glavne vrste transplantacije hematopoetskih ćelija: autologna i alogena. Autologna transplantacija podrazumeva izolaciju hematopoetskih matičnih ćelija (HSC) iz pacijenta, skladištenje matičnih ćelija, medicinski tretman pacijenta koji uništava matične ćelije koje ostaju u telu i vraćanje pacijentovih sopstvenih uskladištenih matičnih ćelija u njegovo telo. Autologne transplantacije imaju prednost manjeg rizika od odbacivanja kalema, infekcije i drugih koreliranih bolesti. Alogena transplantacija uključuje dve osobe: jedna je zdrav donor a jedna je pacijent ili primalac. Alogeni HSC donori moraju imati tip tkiva (HLA humani leukocitni antigeni) koji odgovara primaocu i, pored toga, primalac zahteva imunosupresivne lekove. Postoje tri moguća izvora hematopoetskih matičnih ćelija za transplantaciju: koštana srž (Bone Marrow (BM)), periferna krv (Peripheral Blood (PB)) i krv iz pupčane vrpce (Umbilical Cord Blood (UCB)).

[0005] Razvoj novih strategija je pomogao da se prošire indikacije za alogenu HSCT u poslednjih nekoliko godina (Sun et al.,2007, gore). Poboljšanja u infektivnoj profilaksi, imunosupresivnim lekovima, podršci i tipizaciji tkiva na osnovu DNK doprinela su poboljšanju ishoda nakon alogene HSCT (Ferrara et al., 2009, supra). Iz ovih razloga, broj alogenih transplantacija hematopoetskih ćelija nastavlja da raste. Međutim, bolest kalema protiv domaćina (GvHD) ostaje glavna komplikacija alogene HSCT.

[0006] GvHD nastaje kada donorske T ćelije prepoznaju genetski definisane proteine na ćelijama domaćina kao strane i pokrenu imuni odgovor da bi ih uništile (Ferrara et al., 2009, gore). U zavisnosti od vremena u kome se to javi nakon HSCT, GvHD može biti bilo akutna ili hronična. Akutna GvHD (aGvHD) je odgovorna za 15% do 40% smrtnosti i glavni je uzrok morbiditeta nakon alogene HCT, dok se hronična GvHD (cGvHD) javlja kod do 50% pacijenata koji prežive tri meseca nakon HCT (Sun et al., 2007, Transl. Res. ; 150: 197-214).

[0007] Akutna Bolest kalem protiv domaćina se obično javlja nakon alogene HSCT kao reakcija donorskih imunih ćelija na tkivo domaćina. Tri glavna tkiva koja su pogođena akutnom GvHD su koža, jetra i gastrointestinalni trakt. Klinički, dijagnoza je suspektna kad primalac HSCT-e razvije bilo koji ili sve od sledećih znakova ili simptoma: dermatitis (kožni osip), kožne plikove, bol u abdomenu sa ili bez dijareje, upornu mučninu i povraćanje, hepatitis (sa povećanjem bilirubina i/ili enzima jetre). Simptomi najčešće počinju sa donorskim prihvatanjem kalema, pre 100. dana nakon HSCT, ali se mogu pojaviti i kasnije. Akutna GvHD je klinička dijagnoza potvrđena histološkim dokazima.

[0008] Akutna GvHD se može odrediti brojem i opsegom uključenosti organa. Trenutni sistem rangiranja izveden je iz Glucksbergove prve aGvHD klasifikacije iz 1974. godine (Glucksberg et al., 1974, Transplantation; 18:4295-304). Najnoviji podaci podržavaju upotrebu sistema gradacije, jer je u stanju da dalje podeli pacijente u kategorije rizika za komplikacije i smrtnost. U ovom sistemu, pacijenti su podeljeni u jedan od četiri stepena (I-IV) u zavisnosti od nivoa ili stadijuma uključenosti u tri organa. Koža je rangirana procentom uključene površine tela , jetra je rangirana nivoom povišenja bilirubina, i gastrointestinalni trakt je rangiran količinom dijareje. Koristeći ove kriterijume, svakom pacijentu se dodeljuje jedan stepen (Jacobsohn et al., 2007, Orphanet J. of Rare Diseases; 2:35).

[0009] Poznate su različite kliničke manifestacije GvHD. Najranija i najčešća manifestacija je kožna GvHD. To je u suštini makulopopularni osip koji može da počne bilo gde u telu ali često počinje uključivanjem dlana i stopala. Pacijent može da se žali na kožni svrab ili osetljivost u zahvaćenim područjima. U teškim slučajevima, mogu nastati plikovi. Gastrointestinalne manifestacije uključuju proliv, koji može postati krvav, grčeve, mučninu, povraćanje i neadekvatni gubitak telesne mase (failure to thrive). Dalje, žutica od hiperbilirubinemije je znak GvHD jetre (Jacobsohn et al., 2007, gore), mada je prepoznata hepatična varijanta GvHD sa porastom enzima jetre kao što je akutni virusni hepatitis (Akpek et al., 2002, Blood; 100: 3903-3907). Čak i ako metilprednizolon nije registrovan ni u jednoj Evropskoj Državi za ovu indikaciju, trenutno se smatra standardom nege u prvoj liniji lečenja akutne GvHD.

[0010] Prva linija lečenja akutne GvHD, sa metilprednizolonom 2 mg/kg/dan je efikasna kod preko 50% pacijenata, ali daje trajne odgovore samo kod 1/3 pacijenata. Onima koji ne reaguju nudi se terapija druge linije, koja se zasniva na kombinacijama imunosupresivnih agenasa koji nisu registrovani u ovoj indikaciji. Terapija druge linije je u velikoj meri nezadovoljavajuća sa jednogodišnjem preživljavanjem od 30% u većini velikih kliničkih ispitivanja. Nijedna od ovih strategija nije postigla nivo uspeha koji je potreban da bi postao standard nege. Nakon 30 godina iskustva u transplantaciji, akutna steroid-refraktorna GvHD (aGvHD), ostaje u velikoj meri neizlečiva bolest. Mora da se naglasi da aGvHD pacijenti rezistentni na steroidnu terapiju imaju veoma ograničavajuće terapijske mogućnosti i trenutno ne postoje dozvoljena lečenja za ovaj klinički slučaj. Ovo stanje ugrožava život naročito zbog povećane smrtnosti kod ove populacije pacijenata, uglavnom od sekundarne infekcije. Hatano et al. stavljaju na uvid javnosti lečenje GvHD putem blokade CD26 upotrebom humanizovanog monoklonskog antitela (Blood 2009, tom 114, Apstrakt 3548)

[0011] Bilo koji klinički relevantan rezultat u ovoj populaciji pacijenata bio bi od značajne koristi jer bi pružio klinički relevantnu predost za pacijente sa aGvHD koja je otporna na steroide.

[0012] Osim toga, korisni su pristupi koji olakšavaju kalemljenje nakon transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija. Kalemljenje je proces u kome transplantirane matične ćelije pronalaze svoj put do prostora koštane srži u centru velikih kostiju tela. Tek tada transplantirane matične ćelije mogu da počnu da proizvode nove ćelije krvi. Stručnjaci nisu potpuno sigurni kako se ovaj proces dešava ali se generalno zna da je to dug proces: potrebno je oko dve do četri nedelje nakon ulaska u koštanu srž da bi došlo do kalemljenja. Dok se matične ćelije krvi ne nakaleme, pacijent će biti u riziku od razvoja infekcije. To je zato što je tranplantirani pacijent redovno bio izložen zračenju i/ili hemoterapiji, čiji je rezultat uništavanje belih krvnih zrnaca u telu pacijenta. Dok se čeka kalemljenje, transplantirani pacijent može patiti od ozbiljne komplikacije usled infekcije (uzrokovane bakterijom, virusom ili gljivicom), što je jedan od glavnih uzroka smrtnosti povezane sa transplantacijom nakon transplantacije koštane srži (BMT - Bone Marrow Transplantation). Prema tome, postoji potreba u oblasti za agensom koji može da poboljša kalemljenje. Takav agens će imati značajnu vrednost za BM transplantirane pacijente. Ako se udomljavanje i kalemljenje mogu poboljšati, vreme za oporavak hematopoetskih linija može da se smanji što dovodi do manje neuspeha kalemljenja i boljeg opšteg preživljavanja, posebno u UCB transplantaciji (Broxmeyer, H. E. (2006). Umbilical Cord Blood Stem Cells: Collection, Processing, and Transplantation. Blood Banking and Transfusion Medicine: Basic Principles and Practice. C. D. Hillyer et al., Churchill Livingston, izdanje Elsevier, Inc.: 823-832; Lewis, 2002, Intern Med J 32(12): 601-9).

[0013] Aplastična anemija je tip anemije, u kojoj koštana srž ne uspeva da proizvede dovoljne količine ćelija krvi za obnavljanje ćelija krvi. Posebno, može da postoji urođena i stečena forma aplastične anemije. Stečena aplastična anemija (acquired aplastic anemia - AA) je retko stanje insuficijencije koštane srži koje se karakteriše hipocelularnošću koštane srži i malim brojem perifernih krvnih ćelija [Young NS, Maciejewski JP. The pathophysiology of acquired aplastic anemia. N Eng J Med 1997, 336:1365-1372]. Dokaz o autoimunoj patogenezi su uglavnom indirektan i karakterizacija osnovnog imunološkog odgovora je nepotpuna uglavnom zbog tehničkih poteškoća koje proističu iz hipocelularnosti specifične za bolest. Stečena aplastična anemija se smatra imunoposredovanom bolešću, a trenutna standardna netransplantacijska terapija je anti-timocitni globulin (ATG) plus ciklosporin A (CsA). Neuspesi uključuju pacijente koji ne reaguju na prvu liniju (30%) i pacijente sa relapsom nakon prvog odgovora (30%), tako da preživljavanje bez nepoželjnih događaja i komplikacija (event free survival) ne prelazi 30-40% (Bacigalupo A., Passweg J., 2009, Hematol Oncol Clin North Am.23: 159-70).

[0014] Nelečena aplastična anemija može dovesti do smrti, u nekim slučajevima čak u kratkom periodu od samo nekoliko meseci. Postojeća lečenja aplastične anemije obuhvataju na primer transplantaciju koštane srži ili terapije imunosupresivnim lekom. Imunosupresivne terapije u značajnom broju slučajeva ne uspevaju i transplantacija koštane srži nije moguća u odsustvu odgovarajućeg donora. Prema tome, takođe postoji potreba u oblasti da se obezbede alternativni agens(i) za lečenje aplastične anemije, koji poželjno mogu biti efikasni za lečenje pacijenata koji ne reaguju ni na jednu drugu terapiju.

KRATAK OPIS PREDMETNOG PRONALASKA

[0015] Predmetni pronalazak se odnosi na obezbeđivanje agensa koji se može koristiti za lečenje i/ili prevenciju bolesti, poremećaja i stanja, posebno bolesti, poremećaja i stanja koji su u vezi sa imunim sistemom. Posebno, predmetni pronalazači su imali za cilj da obezbede agens koji se može koristiti za lečenje i/ili prevenciju najmanje jedne od bolesti kalem protiv domaćina (GvHD) i aplastičnu anemiju ili koji se može koristiti da se podstakne kalemljenje nakon transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija. Poželjno je da se ovaj agens u suštini dobro podnosi od strane pacijenata. Posebno, predmetni pronalazači su nastojali da obezbede agens koji sprečava i/ili leči najmanje jednu od GvHD i aplastičnu anemiju ili podstiče kalemljenje, kod pacijenata, posebno u jednoj ili više grupa pacijenata, koji ne reaguju na drugo lečenje, posebno na drugo lečenje imunosupresivnim agensom, na primer lečenje steroidom, ili pokazuju nedovoljan odgovor na isti.

[0016] Kao rešenje ovih problema, predmetni pronalazači obezbeđuju između ostalog antitelo, farmaceutsku kompoziciju, izolovani molekul nukleinske kiseline, vektor, kompoziciju koja sadrži smešu antitela, rekombinantnu ćeliju domaćina, komplet delova i proces za proizvodnju antitela.

[0017] Prema prvom aspektu, obezbeđeno je antitelo prema patentnom zahtevu 1, tj. izolovano monoklonsko antitelo koje specifično vezuje humani CD26, navedeno antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca, pri čemu navedeni varijabilni region teškog lanca sadrži VH CDR1 koji sadrži sekvencu prikazanu u SEQ ID NO (SEK ID BR): 133, VH CDR2 koji sadrži sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 134, i VH CDR3 koji sadrži sekvencu u SEQ ID NO: 1, i pri čemu navedeni varijabilni region lakog lanca sadrži VL CDR1 koji sadrži sekvencu u SEQ ID NO: 129, VL CDR2 koji sadrži sekvencu u SEQ ID NO: 130, i VL CDR3 koji sadrži sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 2, pri čemu navedeni varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 4 i 6 do 21 i gde navedeni varijabilni region teškog lanca sadrži sekvencu amino kiselina izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 22 do 47.

[0018] Ovde je dalje stavljen na uvid javnosti izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži (a) sekvencu nukleotida koja kodira antitelo predmetnog pronalaska; ili (b) sekvencu nukleotida komplementarnu sa (a). Prema još jednom aspektu, obezbeđen je izolovani molekul nukleinske kiseline, koji sadrži sekvencu nukleotida izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 50 do 128 i njenu varijantu, pri čemu navedena varijanta ima najmanje 90% identiteta sekvence sa sekvencom nukleotida izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 50 do 128. Prema još jednom aspektu, ova predmetna objava obezbeđuje ekspresioni vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline iz ove predmetne objave, pri čemu je navedeni molekul nukleinske kiseline operativno vezan za sekvencu kontrole ekspresije. Prema još jednom aspektu, obezbeđena je rekombinantna ćelija domaćina, koja sadrži molekul nukleinske kiseline ove predmetne objave.

[0019] Prema još jednom aspektu, obezbeđeno je antitelo, koje je proizvedeno pomoću hibridomske ćelijske linije deponovane 11. septembra 2012. pod Budimpeštanskim ugovorom u Centru za napredne biotehnologije (Centro di Biotecnologie Avanzate (CBA) - Interlab Kolekcija ćelijske linije (Interlab Cell Line Collection (ICLC)) u Đenovi (L.go R. Benzi, 10, Đenova, Italija) kao PD 12002 ili derivat navedene hibridomske ćelijske linije. Deponovani materijal hibridomske ćelijske linije takođe se ovde navodi ukratko kao depozit PD 12002 hibridoma. Sva ograničenja u pogledu dostupnosti ovih depozita će biti povučena nakon prve objave ove prijave ili druge prijave koja zahteva prvenstvo od ove prijave. Prema još jednom aspektu, predmetni pronalazači obezbeđuju antitelo koje vezuje epitop vezan antitelom proizvedenim od hibridomske ćelijske linije deponovane u CBA-ICLC u Đenovi (Italija) kao PD 12002.

[0020] Prema još jednom aspektu, obezbeđen je proces proizvodnje antitela predmetnog pronalaska.

[0021] Prema još jednom aspektu, predmetni pronalazači obezbeđuju farmaceutsku kompoziciju koja sadrži najmanje jedno antitelo predmetnog pronalaska i po izboru najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipiens. Prema još jednom aspektu, obezbeđena je farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska za upotrebu kao lek. Prema još jednom aspektu, predmetni pronalazači obezbeđuju farmaceutsku kompoziciju predmetnog pronalaska za upotrebu u podsticanju kalemljenja nakon transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija, i/ili za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju bolesti kalem protiv domaćina (GvHD), posebno nakon transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija, i/ili za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju aplastične anemije.

[0022] Prema još jednom aspektu, obezbeđeno je antitelo za koje se traži zaštita u predmetnom pronalasku prema bilo kom od zahteva 1 do 8, za upotrebu kao lek, i za upotrebu u podsticanju kalemljenja nakon transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija, i/ili za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju bolesti kalem protiv domaćina (GvHD), poželjno posle transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija, i/ili za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju aplastične anemije, poželjno teške aplastične anemije. Prema još jednom aspektu, obezbeđen je komplet delova (kit), koji sadrži: (i) najmanje jedno antitelo predmetnog pronalaska i dodatno (ii) a) najmanje jedan imunosupresivni lek ili b) najmanje jedan kortikosteroid i/ili najmanje jedan antihistaminik.

OPIS SLIKA

[0023]

SL. 1a pokazuje punu CD26 humanu sekvencu.

SL. 1b pokazuje punu CD26 svinjsku sekvencu.

SL. 1c pokazuje poravnatu punu CD26 humanu i svinjsku sekvencu.

SL. 2a pokazuje CDR3 sekvence od CD26 specifičnih antitela.

SL. 2b pokazuje listu sekvenci od VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od CD26 specifičnih antitela.

SL. 2c pokazuje listu sekvenci od VH ABR1, VH ABR2, VH ABR3, VL ABR1, VL ABR2, i VL ABR3 od CD26 specifičnih antitela.

SL. 3 pokazuje sličnost sekvence viđenu u raznim VH i VL regionima, koja može biti prisutna u antitelu u skladu sa predmetnim pronalaskom. VH sekvence unutar VH grupe 1, i VL sekvence unutar VL grupe 1 sadrže identične CDR-ove.

SL. 4a pokazuje dijagram koji ilustruje gradiranje GvHD kože pacijenata uključenih u studiju koja se bavi administracijom CDina26.

SL. 4b pokazuje dijagram koji ilustruje gradiranje GvHD jetre pacijenata uključenih u studiju koja se bavi administracijom CDina26.

SL. 4c pokazuje dijagram koji ilustruje gradiranje GvHD creva pacijenata uključenih u studiju koja se bavi administracijom CDina26.

SL. 5 pokazuje dijagram koji ilustruje apsolutno CD4 brojanje.

SL. 6 pokazuje dijagram koji ilustruje predviđenu kumulativnu učestalost smrtnosti vezane za transplantaciju od 13 kontrolnih pacijenata sa akutnom GvHD stepena III-IV, tretiranih steroidima, ciklosporinom i drugim imunosupresivnim lekovima, u poređenju sa 9 pacijenata koji su tretirani sa steroidima, ciklosporininom i CDina26.

SL. 7 pokazuje dijagram koji ilustruje predviđeno aktuarsko preživljavanje 13 kontrolnih pacijenata sa akutnom GvHD stepena III-IV, tretiranih steroidima, ciklosporinom i drugim imunosupresivnim lekovima, u poređenju sa 9 pacijenata koji su tretirani sa steroidima, ciklosporinom i CDina26.

SL. 8 ilustruje strukturu poželjnih antitela prema predmetnom pronalasku. Slika pokazuje dve različite grupe lakog lanca koje mogu formirati antitelo predmetnog pronalaska (VL grupa 1 i VL grupa 3).

SL. 9 ilustruje protočnu citometrijsku analizu koja se koristi za određivanje sposobnosti CDina26 da se veže za CD26 eksprimiran na površini ćelije.

SL. 10 Rezime za SEQ ID NOs.. Svaka od VL aminokiselinskih sekvenci može biti prisutna u kombinaciji sa jednom od VH aminokiselinskih sekvenci u okviru definicije iz patentnog zahteva 1 u antitelu iz predmetnog pronalaska, po izboru dalje u kombinaciji sa CL aminokiselinskom sekvencom koja ima SEQ ID NO:48 i CH1-CH2-CH3 sekvencom koja ima SEQ ID NO:49. SL.10 takođe označava nukleotidne sekvence koje imaju SEQ ID NOs: 50 do 128, koje odgovaraju aminokiselinskim sekvencama koje imaju SEQ ID NOs: 4 do 49.

SL. 11 pokazuje vezivanje humanog (levog) i svinjskog (desnog) antigena (Ag) na uhvaćenom CDina26, mereno Biakor® Rezonantnim Jedinicama (Resonance Units (RU)). SL. 12 pokazuje poređenje CDina26 vezivanja za 7 identifikovanih regiona diskontinuiranog vezivanja u CD26 pomoću grafikona stubića: DYDESSGRWNCLVAR (SEQ ID NO: 146); DVTWATQERISLQWL (SEQ ID NO: 147); TTGWVGRFRPSEPHF (SEQ ID NO: 153); TFITKGTWEVIG (SEQ ID NO: 155); DYLYYISNE (SEQ ID NO: 156); SCELNPERCQYY (SEQ ID NO: 157); i SGPGLP (SEQ ID NO: 158).

DETALJNI OPIS PREDMETNOG PRONALASKA

[0024] Tokom brojnih eksperimenata koji vode do predmetnog pronalaska, pronalazači su izneneđujuće pronašli antitelo koje može da se koristi sa veoma korisnim i obećavajućim rezultatima kao lek, posebno za lečenje i/ili sprečavanje najmanje jedne od bolesti kalem protiv domaćina (GvHD) i aplastične anemije, kao i za podsticanje kalemljenja nakon transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija. Antitelo predmetnog pronalaska pokazuje specifično vezivanje za CD26, naročito za humani CD26, posebno humani CD26 prisutan na matičnoj ćeliji ili koji je eksprimiran na aktiviranom T limfocitu. Vezivanjem antitela predmetnog pronalaska za humani CD26 eksprimiranom na aktiviranim T limfocitima (posebno subpopulacijama CD16 CD3 T i CD56 CD3 T) je posebno povoljna osobina antitela predmetnog pronalaska, kao što je razmotreno u nastavku. Objašnjenje za upotrebu murinskog monoklonskog antitela protiv CD26 za lečenje aGvHD rezistentne na steroid je uglavnom podržano njegovom sposobnošću da blokira aktivnost CD26. Experimenti koje su izveli predmetni pronalazači pokazuju da je CD26 prekomerno eksprimiran u stimulisanim T ćelijama i prekomerno eksprimiran ali u manjoj količini u stimulisanim Ćelijama Prirodnim Ubicama (Natural Killer). Obratno, ovaj molekul je malo eksprimiran na ćelijama u mirovanju. B ćelije, monociti i dendritske ćelije nikada ne eksprimiraju CD26, niti mezemhimske matične ćelije, endotelne ćelije i fibroblasti eksprimiraju CD26. Anti-CD26 predmetnog pronalaska specifično se vezuje za aktivirane regulatorne T ćelije, ometajući njihovu ekspanziju i njihovu ulogu u modulaciji imunog odgovora. Iako se ne želi vezivanje ni za jednu teoriju, trenutno se pretpostavlja da su aktivirani limfociti meta za anti-CD26 i da parcijalno osiromašenje aktiviranih limfocita može dovesti do klinički značajne modulacije najmanje jedne od GvHD, posebno aGvHD, naročito aGvHD otporne na steroide, aplastične anemije, i bolesti, poremećaja i/ili stanja prisutnih pre i/ili tokom i/ili posle transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija, kao i da mogu podsticati kalemljenje nakon transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija. Iako se ne želi vezivanje ni za jednu teoriju, trenutno se pretpostavlja da T limfociti donora još uvek mogu da postave reakciju direktno protiv tumorskih ćelija.

[0025] Transplantacija hematopoetskih matičnih ćelija (HCT) predstavlja standardno lečenje za hematološke bolesti i malignitete.

[0026] Iako se ne želi vezivanje ni za jednu teoriju, trenutno se pretpostavlja da inhibicija ili osiromašenje CD26 na donorskim ćelijama primenom jednog ili više antitela iz predmetnog pronalaska, posebno CDina26, može poboljšati kalemljenje, posebno kratkoročno kalemljenje, kao i poboljšati repopulaciju, posebno konkurentnu repopulaciju, sekundarnu transplantaciju i preživljavanje tretiranog subjekta, na primer ljudi i miševa. Dalje, iako se ne želi vezivanje ni za jednu teoriju, trenutno se pretpostavlja da ako se poboljša udomljavanje i kalemljenje, posebno primenom najmanje jednog antitela predmetnog pronalaska, posebno CDina26, vreme oporavka hematopoetskih linija se može smanjiti što rezultira u manje neuspeha kalemljenja i boljem opštem preživljavanju, naročito u transplantaciji hUCB (humana ćelija krvi iz pupčane vrpce- human umbilical cord blood cell). Antitelo predmetnog pronalaska za primenu kao lek ili terapija koja koristi ovo antitelo mogu obezbediti za više pacijenata najbolje šanse za uspešan ishod nakon transplantacije hematopoetskih ćelija. Dalje, jedno ili više antitela predmetnog pronalaska protiv CD26 antigena, posebno, CDina26, može dati važnu kliničku korist kod pacijenata koji su podvrgnuti transplantaciji hematopoetskih matičnih ćelija za najmanje jedno od lečenja akutne GvHD otporne na steroide i poboljšanja kalemljenja koje je povezano, direktno, sa ukupnim preživljavanjem.

[0027] Iako se ne želi vezivanje ni za jednu teoriju, trenutno se pretpostavlja da padministriranje najmanje jednog antitela predmetnog pronalaska, posebno CDina26, može obezbediti korisnu aktivnost, posebno promovisanje kalemljenja nakon transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija i/ili prevenciju i/ili lečenje najmanje jedne od bolesti kalem protiv domaćina i aplastične anemije, preko vezivanje za CD26 kao membranski glikoprotein koji posreduje signalni put.

[0028] Iznenađujuće, predmetni pronalazači obezbeđuju jedno ili više antitela, posebno CDina26, rešavajući prethodno pomenute probleme.

[0029] Prema jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo, koje se može specifično vezati za CD26 glikoprotein. Posebno, ovo antitelo se može specifično vezati za humani CD26, naročito za humani CD26 prisutan na matičnoj ćeliji(ćelijama) (posebno humanoj matičnoj ćeliji(ćelijama) i/ili za humani CD26 eksprimiran na T limfocitima (posebno subpopulacije od CD16 CD3 T i CD56 CD3 T) naročito na aktiviranom T limfocitu(limfocitima) (posebno subpopulacije od CD16 CD3 T i CD56 CD3 T). Ukoliko nije izričito drugačije naznačeno, termini CD26 i CD26 glikoprotein se ovde koriste naizmenično.

[0030] Ovo antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca kao što je definisano u patentnom zahtevu 1.

[0031] Prema jednom aspektu, antitelo, koje može specifično da se veže za CD26, sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR3 (SEQ ID NO: 1) i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR3 (SEQ ID NO: 2), gde sekvenca amino kiselina od CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca je ona od varijabilnog regiona teškog lanca antitela koje je proizvedeno pomoću hibridomske ćelijske linije deponovane u CBA-ICLC u Đenovi (Italija) kao PD 12002, i sekvenca amino kiselina od CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca je ona od varijabilnog regiona lakog lanca antitela koje je proizvedeno pomoću hibridomske ćelijske linije deponovane kao PD 12002. Posebno, antitelo, koje se specifično može vezati za CD26, može da sadrži teški lanac koji sadrži ovaj varijabilni region teškog lanca i laki lanac koji sadrži ovaj varijabilni region lakog lanca. Gore pomenute CDR3 sekvence su navedene na SL.2a.

[0032] Prema drugom aspektu, antitelo, koje može specifično da se veže za CD26, sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1, CDR2, i CDR3 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1, CDR2, i CDR3, pri čemu aminokiselinske sekvence od CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca su one od varijabilnog regiona teškog lanca antitela proizvedenog od hibridomske ćelijske linije deponovane u CBA-ICLC u Đenovi (Italija) kao PD 12002, i aminokiselinske sekvence od CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca su one od varijabilnog regiona lakog lanca antitela proizvedenog pomoću hibridomske ćelijske linije deponovane kao PD 12002. Posebno, ovo antitelo koje može specifično da se veže za CD26, može da sadrži teški lanac koji sadrži ovaj varijabilni region teškog lanca i laki lanac koji sadrži ovaj varijabilni region lakog lanca. Gore pomenute sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 su navedene na SL.

2b.

[0033] Prema drugom aspektu, antitelo, koje može specifično da se veže za CD26, sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca, pri čemu su aminokiselinske sekvence od varijabilnog regiona teškog lanca one od varijabilnog regiona teškog lanca od antitela proizvedenog pomoću hibridomske ćelijske linije deponovane u CBA-ICLC u Đenovi (Italija) kao PD 12002, i aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca su one od verijabilnog regiona lakog lanca ovog antitela proizvedenog pomoću hibridomske ćelijske linije deponovane kao PD 12002. Posebno, antitelo, koje može da se specifično veže za CD26, može da sadrži teški lanac koji sadrži ovaj varijabilni region teškog lanca i laki lanac koji sadrži ovaj varijabilni region lakog lanca. Posebno, aminoiselinske sekvence teškog lanca mogu biti one od teškog lanca od antitela proizvedenog pomoću hibridomske ćelijske linije deponovane kao PD 12002, i/ili aminokiselinske sekvence lakog lanca mogu biti one od lakog lanca ovog antitela proizvedenog pomoću hibridomske ćelijske linije deponovane kao PD 12002. Posebno, antitelo, koje se može specifično vezati za CD26, može da sadrži iste sekvence teškog lanca i iste sekvence lakog lanca kao antitelo proizvedeno pomoću hibridomske ćelijske linije deponovane kao PD 12002.

[0034] Prema jednom aspektu, antitelo, koje može specifično da se veže za CD26, sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca, pri čemu su aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca one od varijabilnog regiona teškog lanca od antitela proizvedenog pomoću hibridomske ćelijske linije deponovane u CBA-ICLC u Đenovi (Italija) kao PD 12002, i aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca su one od varijabilnog regiona lakog lanca od antitela proizvedenog pomoću hibridomske ćelijske linije deponovane kao PD 12002. U specifičnom tehničkom rešenju, antitelo predmetnog pronalaska može da sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu ID NO: 26 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu ID NO: 4. Posebno, antitelo, koje može specifično da se veže za CD26, može da sadrži teški lanac koji sadrži ovaj varijabilni region teškog lanca i laki lanac koji sadrži ovaj varijabilni region lakog lanca. Posebno, amino kiselinske sekvence teškog lanca su one iz teškog lanca antitela proizvedenog od hibridomske ćelijske linije deponovane kao PD 12002, i/ili amino kiselinske sekvence lakog lanca su one iz lakog lanca antitela proizvedenog od hibridomske ćelijske linije deponovane kao PD 12002.

[0035] Prema poželjnom tehničkom rešenju, antitelo iz predmetnog pronalaska može da se veže za region aminokiselinskih položaja 290-550 humane CD26 sekvence, pozivajući se na humanu CD26 sekvencu kao što je objavljeno u stanju tehnike.

[0036] Prema daljem tehničkom rešenju, antitelo iz predmetnog pronalaska se ne vezuje specifično za svinjski CD26. Prema jednom tehničkom rešenju, epitop od anti-humanog CD26 antitela iz predmetnog pronalaska sadrži najmanje jedan, na primer, jedan, dva, tri, četiri, pet ili više od 358 aminokiselinskih ostataka dobijenih od razlike između humanog i svinjskog CD26. Prema tome, u skladu sa ovim tehničkim rešenjem predmetnog pronalaska, antitelo stoga prepoznaje tako različit region između humanog i svinjskog CD26.

[0037] Prema jednom tehničkom rešenju ovog predmetnog pronalaska, smeša antitela ne sadrži antitelo koje se ne vezuje specifično za humani CD26.

[0038] Dodatno ili alternativno, antitelo, koje može specifično da se veže za CD26, može da sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži ABR1, ABR2, i ABR3 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži ABR1, ABR2 i ABR3, pri čemu aminokiselinske sekvence od ABR1, ABR2, i ABR3 od varijabilnog regiona teškog lanca su one od varijabilnog regiona teškog lanca od antitela proizvedenog od hibridomske ćelijske linije deponovane na CBA-ICLC u Đenovi (Italija) kao PD 12002, i aminokiselinske sekvence od ABR1, ABR2,i ABR3 od varijabilnog regiona lakog lanca su one od varijabilnog regiona lakog lanca od antitela proizvedenog od hibridomske ćelijske linije deponovane kao PD 12002. Gore navedene ABR1, ABR2 i ABR3 sekvence su navedene na SL.

2c.

[0039] Prema jednom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, sledeći antigen vezujući regioni (Antigen Binding Regions (ABRs)) su prisutni u antitelu predmetnog pronalaska:

ABR1 (laki lanac) sadrži sekvencu amino kiselina: SSVSYMN (SEQ ID NO: 135), ABR2 (laki lanac) sadrži sekvencu amino kiselina: LWIYSTSNLAS (SEQ ID NO: 136), ABR3 (laki lanac) sadrži sekvencu amino kiselina: QQRSSYPN (SEQ ID NO: 137), Pri čemu je poželjno ABR3 uključen u SEQ ID NO:2,

[0040] Prema daljem tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, sekvence ABR1 do 3 ili ABR1* do 3* su prisutne u antitelu pronalaska zajedno sa sledećim antigen vezujućim regionima (Antigen Binding Regions (ABRs)):

ABR1 (teški lanac) koji sadrži sekvencu amino kiselina: YTFRSYDIN (ABR1h) (SEQ ID NO: 141),

ABR2 (teški lanac) koji sadrži sekvencu amino kiselina: WIGWIFPGDGSTKY (ABR2h) (SEQ ID NO: 142),

ABR3 (teški lanac) koji sadrži sekvencu amino kiselina: RWTVVGPGYFDV (ABR3h) (SEQ ID NO: 143),

Pri čemu je poželjno ABR3 (teški lanac) uključen u SEQ ID NO:1.

[0041] Prema jednom tehničkom rešenju, ABR-ovi su određeni prema "Paratome alatu" kako je objavljeno u Kunik V, Peters B, Ofran Y (2012) "Structural Consensus among Antibodies Defines the Antigen Binding Site", PLoS Comput Biol 8(2): e1002388.doi:10.1371/journal.pcbi.1002388; Urednik: Brian Baker, Univerzitet Notr Dam, Sjedinjene Američke Države; Objavljeno 23. februara 2012; videti takođe http://ofranservices.biu.ac.il/site/services/paratome/indeks.html. VH/VLABR gore pomenute sekvence su navedene na SL.2b.

[0042] Termin"antitelo" kako se koristi u kontekstu predmetne prijave može obuhvatiti molekule celog antitela, molekule imunoglobulina pune dužine, naročito prirodne molekule imunoglobulina pune dužine ili molekule imunoglobulina pune dužine formirane rekombinatornim procesima fragmenata imunoglobulinskog gena, kao i fragmente antitela. Fragmenti antitela mogu biti posebni fragmenti antitela koji sadrže najmanje jedno antitelo-antigen vezujuće mesto. Fragmenti antitela mogu posebno pokazati specifično vezivanje za CD26, posebno humani CD26, koji može na primer biti prisutan na matičnoj ćeliji (posebno humanoj matičnoj ćeliji) i/ili eksprimiran na T limfocitu(limfocitima) (posebno subpopulacijama od CD16 CD3 T i CD56 CD3 T), posebno na aktiviranom T limfocitu(limfocitima). Dalje, termin"antitelo" kako se koristi u kontekstu ove prijave može obuhvatiti fuzione proteine, posebno koji pokazuju specifično vezivanje za CD26, posebno humani CD26, koji može biti prisutan na matičnoj ćeliji i/ili eksprimiran na T limfocitu(limfocitima), posebno na aktiviranom T limfocitu(limfocitima). Antitelo-antigen vezujuće mesto može biti posebno antigen vezujuće mesto antitela koje sadrži najmanje jednu CDR sekvencu.

[0043] Termin"antitelo" može da uključi npr. monoklonska, poliklonska, multispecifična (na primer bispecifična), rekombinanta, humana, himerna i humanizovana antitela. Dalje, termin "antitelo" takođe može obuhvatiti rekombinantno eksprimirane antigen vezujuće proteine i antigen vezujuće sintetičke peptide. Posebno, termin "antitelo" može npr. obuhvatiti minitela, i diatela, od kojih svi mogu poželjno pokazati specifično vezivanje za CD26, posebno humani CD26. Dalje, termin"antitelo", kako se ovde koristi, može obuhvatiti imunoglobuline proizvedene in vivo, kao i one proizvedene in vitro, posebno hibridomom. Povrh toga, termini "antitelo" ili "najmanje jedno antitelo" mogu obuhvatiti smeše antitela. Termin "smeša antitela" posebno obuhvata smešu koja sadrži ili se sastoji od dva ili više antitela koja pokazuju specifično vezivanje za CD26, naročito humani CD26, posebno koja sadrži najmanje jedno antitelo predmetnog pronalaska. Dva ili više antitela prisutna u smeši mogu biti dva ili više različitih antitela, na primer dva ili više antitela koji nemaju identične sekvence amino kiselina. Posebno, antitelo različito od drugog antitela može biti antitelo koje ima sekvencu amino kiselina, pri čemu je najmanje jedan amino kiselinski ostatak izbrisan, umetnut ili zamenjen sa drugačijim amino kiselinskim ostatkom, u poređenju sa sekvencom amino kiselina navedenog drugog antitela. Posebno korisna smeša antitela prema predmetnom pronalasku sadrži ili se sastoji od antitela proizvedenih pomoću hibridomske ćelijske linije deponovane kao PD 12002, ili sadrži najmanje jedno od antitela proizvedenih pomoću hibridomske ćelijske linije deponovane kao PD 12002.

[0044] Antitelo prema predmetnom pronalasku može biti rekombinantno proizvedeno antitelo. Antitelo predmetnog pronalaska može biti monoklonsko i/ili murinsko antitelo, posebno murinsko monoklonsko antitelo. Kao što je gore pomenuto, najmanje jedno antitelo predmetnog pronalaska može biti smeša antitela koja sadrži najmanje jedno antitelo predmetnog pronalaska, posebno koja sadrži ili se sastoji od antitela proizvedenih od PD 12002 depozita hibridoma, CDina26.

[0045] Termin "monoklonsko antitelo" se odnosi na suštinski homogenu populaciju antitela uključenu u visoko specifično prepoznavanje i vezivanje jedne antigenske determinante ili epitopa. Ovo je u suprotnosti sa poliklonskim antitelima koja tipično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti antigena. Termin "monoklonsko antitelo" obuhvata oba intaktna i monoklonska antitela pune dužine kao i fragmente antitela (kao što su Fab, Fab', F(ab')2, Fv), jednolančane mutante (scFv), fuzione proteine koji sadrže deo anitela, i bilo koji drugi modifikovani molekul imunoglobulina koji sadrži mesto prepoznavanja antigena. Dalje, "monoklonsko antitelo" se odnosi na takva antitela napravljena na bilo koji od brojnih načina uključujući ali ne i ograničeno na pomoću hibridoma, selekcije faga, rekombinante ekspresije, i transgenih životinja.

[0046] Termin "humanizovano antitelo" se odnosi na forme nehumanih (npr.murinskih) antitela koja su specifični lanci imunoglobulina, himerni imunoglobulini, ili njihovi fragmenti koji sadrže minimalne nehumane (npr.murinske) sekvence. Tipično, humanizovana antitela su humani imunoglobulini u kojima su ostaci iz komplementarnog determinišućeg regiona (complementary determining region (CDR)) zamenjeni ostacima iz CDR iz nehumanih vrsta (npr. miš, pacov, zec, i hrčak) koji imaju željenu specifičnost, afinitet, i sposobnost (Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239: 1534-1536). U nekim slučajevima, ostaci Fv okvirnog regiona (FR) humanog imunoglobulina se zamenjuju sa odgovarajućim ostacima u antitelu iz nehumanih vrsta koje imaju željenu specifičnost, afinitet, i sposobnost. Humanizovano antitelo se može dalje modifikovati zamenom dodatnih ostataka bilo u Fv okvirnom regionu i/ili unutar zamenjenih nehumanih ostataka da bi se poboljšala i optimizovala specifičnost antitela, afinitet, i/ili sposobnost antitela. Generalno, humanizovano antitelo će sadržati suštinski sve od najmanje jednog, i tipično dva ili tri, varijabilna domena koji sadrže sve ili suštinski sve CDR regione koji odgovaraju nehumanom immunoglobulinu dok su svi ili uglavnom svi FR regioni oni iz humane immunoglobulinske konsenzus sekvence. Humanizovano antitelo može takođe da sadrži bar deo konstantnog regiona imunoglobulina ili domena (Fc), tipično onog za humani immunoglobulin.

[0047] Termin "himerna antitela" se odnosi na antitela gde je sekvenca amino kiselina molekula imunoglobulina izvedena iz dve ili više vrsta. Tipično, varijabilni region oba lanca lakog i teškog odgovara varijabilnom regionu antitela koja potiču od jedne vrste od 60 sisara (npr.miš, pacov, zec, itd) sa željenom specifičnošću, afinitetom, i sposobnošću dok su konstantni regioni homologni sa sekvencama u antitelima koja potiču od drugih (obično humanih) kako bi se izbeglo izazivanje imunog odgovora kod ovih vrsta. Tipično himerna antitela koriste varijabilne regione glodara (VH i VL) i humane konstantne regione, da bi se proizvelo antitelo sa pretežno humanim domenima. Proizvodnja takvih himernih antitela je dobro poznata u oblasti, i može se postići standardnim sredstvima. Sekvence humanih konstantnih regiona biće očigledne stručnjaku iz oblasti i/ili su dostupne u javnim bazama podataka (npr. Nacionalni centar za Biotehnološke Informacije (NCBI), Američka nacionalna medicinska biblioteka).

[0048] Termin " fragment antitela " može se odnositi na fragment, kao što je F(ab')2, Fab, F(ab)2, Fab', Fv, dAb, scFv, varijabilni region teškog lanca CDR1, varijabilni region teškog lanca CDR2, varijabilni region teškog lanca CDR3, varijabilni region lakog lanca CDR1, varijabilni region lakog lanca CDR2, varijabilni region lakog lanca CDR3, jednolančani varijabilni fragment (scFv), VH, VL, i slično, od kojih svi poželjno mogu pokazivati specifično vezivanje za CD26, posebno humani CD26. "Fragment antitela" se može specifično vezati sa istim antigenom koji je prepoznat od celog antitela ili antitela pune dužine. "Fragment antitela" može biti posebno deo intaktnog antitela.

[0049] Fragmenti antitela koji prepoznaju specifične epitope, posebno koji se specifično vezuju za CD26, mogu biti generisani od strane stručnjaka iz oblasti koji primenjuje tehnike poznate u oblasti. Fragmenti antitela, posebno fragmenti antitela koji se mogu specifično vezati za CD26, posebno humani CD26, kao što je npr. fragmenti jednog ili više anti-CD26 antitela proizvedenih od depozita PD 12002 hibridoma, CDina26, mogu biti npr. dobijeni enzimskim tretiranjem antitela da se dobiju fragmenti antitela. Dalje, fragment antitela može biti proizveden eksprimiranjem DNK koja kodira fragment u domaćinu, kao što je npr. E. coli, B. subtilis, P. pastoris, K. lactis. Fragment antitela može biti npr. dobijen proteolitičkom hidrolizom antitela pune dužine. Enzimi, posebno proteolitički enzimi, za dobijanje fragmenata antitela poznati su stručnjaku iz oblasti i uključuju, ali nisu ograničeni na, npr. papain, pepsin i/ili plazmin. Posebno, fragment antitela može biti npr. dobijen pepsinskom ili papainskom digestijom antitela pune dužine primenom procedura znanim stručnjaku, kao što je pomenuto npr. u US 2010/0196266 A1. Takve procedure su opisane, na primer, u Goldenberg, američki patenti sa brojevima 4,036,945 i 4,331,647, kao i u referencama koje su tamo citirane. Procedure za dobijanje fragmenata antitela su znane u oblasti i opisane su u npr. u Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys.

89: 230 (1960); Porter, Biochem. J. 73: 119 (1959), Edelman, METHODS IN ENZYMONOLOGY tom 1, strana 422 (Akademska štampa 1967), i Coligan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, tom 1, (John Wiley & Sons 1991), str.2.8.1-2.8.10 i 2.10.-2.10.4.

[0050] Kako se ovde koristi, termin "teški lanac" uključuje teški lanac u punoj dužini i njegove fragmente, koji su poželjno sposobni za specifično vezivanje za CD26, posebno humani CD26. Teški lanac u punoj dužini može uključiti varijabilni region teškog lanca, VH, i tri regiona, CH1, CH2 i CH3.

[0051] Kako se ovde koristi, termin "laki lanac" se može posebno odnositi na laki lanac u punoj dužini i njegove fragmente, koji su poželjno sposobni za specifično vezivanje za CD26, posebno humani CD26. Laki lanac u punoj dužini može da sadrži varijabilni region lakog lanca, VL, i konstantni region lakog lanca, CL.

[0052] Kako se ovde koristi, termin "varijabilni region" antitela može da se odnosi na varijabilni region lakog lanca antitela ili na varijabilni region teškog lanca antitela ili na kombinaciju prethodno pomenutih varijabilnih regiona. Svaki od varijabilnih regiona lakog i teškog lanca može da sadrži četiri okvirna okvirna regiona (FR) povezana sa tri komplementarna determinišuća regiona (complementarity determining regions (CDRs)). Dve definicije CDR lokacije se trenutno koriste u oblasti. Prva je definicija "varijabilnosti sekvence" od Kabata et al. ("Sequences of Proteins of Immunological Interest ", 4. izdanje, Vašington, D.C., Public Health Service, N.I.H). Prema poželjnom tehničkom rešenju, definicija od Kabata et al. je korišćena u ovoj prijavi. Alternativno, CDR regioni se mogu takođe definisati korišćenjem definicije strukturne varijabilnosti od Chothia i Lesk (Chothia et al., J. Mol. Biol.1987, 196(4):901-17).

[0053] Kako se ovde koristi, termin "konstantni region" antitela se odnosi na konstantni region lakog lanca antitela ili konstantni region teškog lanca antitela ili na kombinaciju prethodno pomenutih konstantnih regiona.

[0054] Za dobijanje antitela, posebno humanih, humanizovanih, himernih antitela, i njihovih fragmenata, može se koristiti na primer bilo koja od metoda stavljenih na uvid javnosti u US 2010/0196266 A1.

[0055] Fragmenti antitela mogu biti dobijeni pomoću nekoliko metoda uključujući, ali ne ograničavajući se na, sledeće metode, kao što je npr. opisano u US 2010/0196266 A1: F(ab')2fragmenti mogu biti proizvedeni pepsinskom digestijom molekula antitela. Fab' fragmenti mogu biti na primer dobijeni redukcijom disulfidnog mosta(mostova) od F(ab')2fragmenata. Alternativno, Fab' eksprimirajuće biblioteke mogu biti na primer konstruisane kao što je opisano npr. od Huse et al. (Science 1989, 246:1274-1281). Fab' eksprimirajuće biblioteke omogućavaju identifikaciju monoklonskih Fab' fragmenata koji imaju specifičnost interesa, posebno fragmenata koji se vezuju za CD26.

[0056] F(ab)2fragmenti mogu biti dobijeni papainskom digestijom antitela. Fab fragmenti mogu biti dobijeni redukcijom disulfida. "Fab fragment" predstavlja poseban fragment koji se sastoji od jednog lakog lanca i CH1 i varijabilnih regiona od jednog teškog lanca. Teški lanac od Fab molekula ne može da se veže preko disulfidne veze za drugi molekul teškog lanca.

[0057] Dalje, fragment antitela takođe može biti jedan varijabilni region ili peptid koji se sastoji ili sadrži jedan komplimentarno-determinišući region (CDR).

[0058] Povrh toga, antitelo predmetnog pronalaska može biti diatelo. Kako se ovde koristi, "diatela" mogu opisati posebno male fragmente antitela sa dva antigen-vezujuća mesta, čiji fragmenti sadrže varijabilni domen teškog lanca (VH) povezan sa varijabilnim regionom lakog lanca (VL) u istom polipeptidnom lancu (VH-VL). Ukoliko nije izričito navedeno suprotno, termini varijabilni domen i varijabilni region se ovde koriste naizmenično. Diatela i tehnike za njihovo dobijanje su razmatrane na primer u EP 404097, WO 93/11161, i u Hollinger et al., 1993, Proc. Natl. Acad Sci. SAD 90: 6444-6448.

[0059] Dalje, antitelo predmetnog pronalaska može biti molekul jednolančanog Fv. Jednolančani Fv molekul (skraćeno kao scFv - single chain Fv) sadrži VL domen i VH domen, koji se mogu udružiti da formiraju mesto vezivanja, posebno za CD26. Ova dva domena su dalje kovalentno povezana peptidnim linkerom, kao što je npr. peptid koji sadrži 1 do 25 amino kiselinskih ostataka.

Ukoliko nije izričito navedeno suprotno, termini VL domen i VL region se ovde koriste neizmenično. Štaviše, ukoliko nije izričito navedeno suprotno, termini VH domen i VH region se ovde koriste neizmenično. Postupci za dobijanje scFv molekula su na primer opisani u US 4,704,692, US 4,946,778, R. Raag i M. Whitlow, "Single Chain Fvs." FASEB tom 9:73-80 (1995) i R. E. Bird i B. W. Walker, " Single Chain Antibody Variable Regions," TIBTECH, tom 9: 132-137 (1991).

[0060] Dalje, termin antitelo kako se ovde koristi takođe obuhvata antitela sa jednim domenom. Metode za dobijanje antitela sa jednim domenom (DAB-ova) su poznate stručnjaku iz oblasti i opisane su na primer u Cossins et al. (2006, Prot Express Purif 51 :253-259).

[0061] Prema jednom aspektu stavljenom na uvid javnosti, antitelo ili njegov fragment može sadržati najmanje CDR3 teškog lanca, i najmanje CDR3 lakog lanca; posebno, antitelo ili njegov fragment prema predmetnom pronalasku mogu sadržati sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 1, kao i najmanje jednu od sekvenci predstavljenu u SEQ ID NO: 2 i 3.

[0062] Fragmenti antitela mogu sadržati najmanje 4 amino kiseline, najmanje 5 amino kiselina, najmanje 7 amino kiselina, najmanje 9 amino kiselina, posebno najmanje 15 amino kiselina. Fragment antitela predmetnog pronalaska može imati bilo koje gornje ograničenje veličine, i može imati na primer samo jedan aminokiselinski ostatak manje od antitela u punoj dužini od koga se dobija.

[0063] Antitelo predmetnog pronalaska može biti bispecifično antitelo, koje je sposobno da se veže za CD26, posebno humani CD26. Bispecifična antitela se mogu dobiti pomoću nekoliko metoda uključujući npr. fuziju hibridoma ili vezivanje Fab' fragmenata. Takve metode su opisane npr. u Songsivilai et a/., 1990, Clin. Exp. Immunol.79: 315-321; Kostelny et a/., 1992, J. Immunol.

148: 1547-1553.

[0064] Prema tehničkom rešenju, antitelo predmetnog pronalaska može biti monoklonsko antitelo. Metode za dobijanje monoklonskog antitela protiv ciljnog antigena su poznate u oblasti, kao što se može videti na primer kod Coligan et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, tom 1, strane 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991), Kohler i Milstein, Nature 256: 495 (1975), i US 2010/0196266 A1. Monoklonska antitela se na primer mogu dobiti metodama znanim stručnjaku iz oblasti, kao što je stavljeno na uvid javnosti u US 2010/0196266 A1. Posebno, monoklonska antitela koja se mogu dobiti metodama koje obuhvataju jedan ili više, poželjno sve, od sledećih koraka: injektovanje sisaru(sisarima), na primer mišu kompozicije koja sadrži antigen, uklanjanje slezine iz ovog(ovih) injektovanih sisara da bi se dobili B-limfociti, spajanje tako dobijenih B-limfocita sa ćelijama mijeloma da bi se proizveli hibridomi, kloniranje hibridoma, odabir najmanje jednog pozitivnog klona koji proizvodi antitela za antigen, kultivisanje najmanje jednog pozitivnog klona koji proizvodi antitela na antigen, i izolovanje antitela iz kultura hibridoma.

[0065] MAbs (monoklonska antitela) se mogu izolovati i prečistiti iz kultura hibridoma korišćenjem poznatih procedura, kao što je stavljeno na uvid javnosti u US 2010/0196266 A1. Posebno, mogu se primeniti jedna ili više procedura izolacije i/ili prečišćavanja izabranih od grupa koje se sastoje od ekskluzione hromatografije, afinitetne hromatografije, posebno sa Protein-A Sefarozom i jonizmenjivačke hromatografije. Tehnike izolacije i/ili prečišćavanja antitela su na primer stavljene na uvid javnost u Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," i u METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, tom 10, strane 79-104 (The Humania Press, Inc.

1992), kao i u Coligan et al., supra, strane 2.7.1-2.7.12 i strane 2.9.1-2.9.3.

[0066] Termin "monoklonsko antitelo" može posebno opisati antitelo dobijeno od populacije u suštini homogenih antitela, pri čemu su individualna antitela identična osim mogućih prirodno nastalih mutacija koje mogu biti prisutne u malim količinama.

[0067] Nakon početnog nastanka antitela na imunogen, posebno nakon početnog nastanka antitela koja se specifično vezuju za CD26, antitela se mogu sekvencirati i onda proizvesti upotrebom rekombinantnih tehnika. Humanizacija i himerizacija nehumanih antitela sisara (npr.murinskih) i fragmenata antitela su dobro poznati stručnjaku iz oblasti.

[0068] Antitelo iz predmetnog pronalaska može biti humanizovano antitelo, posebno humanizovano monoklonsko antitelo. Termin "humanizovano antitelo" može posebno obuhvatati antitela proizvedena tehnikama rekombinantne DNK, u kojima neke ili sve amino kiseline humanog imunoglobulinskog lakog ili teškog lanca koje nisu potrebne za antigen vezivanje (kao npr. neke ili sve amino kiseline konstantnih regiona i okvirnih regiona varijabilnih domena) su korišćene u zameni odgovarajućih amino kiseline iz lakog ili teškog lanca nehumanog antitela sisara (npr.murinskog) antitela. Metode za dobijanje humanizovanog monoklonskog antitela su poznate u oblasti i opisane su na primer u sledećim publikacijama: Jones et al., Nejčer 321: 522 (1986), Carter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992), Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988), Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988), Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12: 437 (1992), i Singer et al., J. Immun.150: 2844 (1993). Antitelo, kao što je npr. himerno ili nehumano od sisara (npr.murinsko) monoklonsko antitelo, posebno himerno ili nehumano od sisara (npr.murinsko) monoklonsko antitelo ovog predmetnog pronalaska, može biti humanizovano prenošenjem nehumanih (npr.mišijih) CDR-ova sisara iz lakih i teških varijabilnih lanaca nehumanog imunoglobulina sisara, na primer imunoglobulina miša, u odgovarajuće varijabilne domene humanog antitela, kao što je opisano npr. u US 2010/0196266 A1. Nehumani okvirni regioni (FR) sisara, na primer okvirni regioni (FR) miša, u himernom monoklonskom antitelu mogu se takođe zameniti sa FR sekvencama. Na primer, antitelo predmetnog pronalaska koje je humanizovana verzija nehumanog (npr.murinskog) antitela sisara na CD26 može imati i na njegovom teškom i lakom lancu konstantne regione humanog antitela i/ili okvirne regione iz varijabilnih domena humanog antitela, i/ili CDR-ove iz nehumanog (npr.murinskog) antitela sisara.

[0069] Za poboljšanje afiniteta humanizovanog antitela, posebno za poboljšanje njegove sposobnosti vezivanja za CD26, mogu se izvršiti dodatni koraci modifikacije, kao što je opisano npr. u US 2010/0196266 A1. Posebno, jedan ili više amino kiselinskih ostataka u humanim FR regionima mogu biti zamenjeni sa ostacima amino kiselina prisutnim na odgovarajućim pozicijama u nehumanom, posebno murinskom, antitelu u cilju održanja ili poboljšanja afiniteta vezivanja humanizovanog antitela za antigen. Metode koje može primeniti stručnjak iz oblasti su na primer opisane u Tempest et al., Biotechnology 9:266 (1991), i Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988). Na primer, amino kiselinski ostaci humanog FR (okvirni region) koji se razlikuju od njihovih nehumanih duplikata, na primer murinskih duplikata, su locirani blizu ili direktno uz jedan ili više CDR ostataka amino kiselina i mogu predstavljati kandidate za supstituciju.

[0070] Antitelo predmetnog pronalaska može biti humano antitelo. Termin "humano antitelo" može posebno obuhvatiti antitelo, koje ima sekvencu amino kiselina koja odgovara onom antitelu proizvedenom pomoću humanog i/ili je napravljeno korišćenjem poznatih tehnika za dobijanje humanih antitela. Posebno, termin "humani antitelo" može uključiti antitela koja sadrže najmanje jedan humani polipeptid teškog lanca ili najmanje jedan humani polipeptid lakog lanca.

[0071] Posebno, antitelo predmetnog pronalaska može biti potpuno humano antitelo. U kontekstu ove prijave, termin "potpuno humano antitelo" može se posebno odnositi na antitelo koje sadrži polipeptide humanog teškog lanca i humanog lakog lanca. Postupci za dobijanje humanih antitela, posebno potpuno humanih antitela, korišćenjem na primer kombinatornih pristupa ili transgenih životinja transformisanih sa humanim imunoglobulinskim lokusima, su poznati stručnjaku iz oblasti, kao što se može videti npr. u US 2010/0196266 A1. Takvi postupci su na primer opisani u Conrad i Scheller, 2005, Comb. Chem. High Throughput Screen.8:117-26; Mancini et al., 2004, New Microbiol. 27:315-28; Brekke i Loset, 2003, Curr. Opin. Pharmacol. 3:544-50). Potpuno humano antitelo se na primer takođe može dobiti upotrebom genetskih ili hromozomskih metoda transfekcije ili korišćenjem tehnike fagnog displeja. Metode genetske ili hromozomske transfekcije, kao i tehnika fagnog displeja poznate su u oblasti i opisane su na primer u McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-553. Posebno, humana antitela se takođe mogu dobiti uvođenjem humanih imunoglobulinskih lokusa u transgene životinje, kao što su npr. miševi, koze ili krave, gde su endogeni imunoglobulinski geni potpuno ili delimično inaktivirani. Takve procedure su opisane npr. u US 5,545,806, US 5,633,425, i US 5,661,016. Prema alternativnoj proceduri, humano antitelo se može dobiti imortalizacijom humanih B limfocita koji proizvode antitelo usmereno protiv ciljanog antigena, posebno koji proizvode antitelo za CD26. Takve procedure su poznate u oblasti i opisane su npr. u Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, str.77 (1985); Boerner et al., 1991, J. Immunol.,147 (I):86-95.

[0072] Posebno, tehnika fagnog displeja može se koristiti za generisanje humanog antitela, kao što je poznato u oblasti i kao što je opisano npr. u Dantas-Barbosa et al., 2005, Genet. Mol. Res.4:126-40 i US 2010/0196266 A1. Humana antitela se mogu generisati od zdravih ljudi ili od ljudi koji imaju određeno stanje bolesti (Dantas-Barbosa et al., 2005). Ova tehnika omogućava građenje humanog antitela od obolele osobe.

[0073] Na primer, može se konstruisati biblioteka fagnog displeja fragmenata humanih Fab antitela od pacijenata sa osteosarkomom, kao što je stavljeno na uvid javnosti u Dantas-Barbosa et al. (2005, gore) i kao što je diskutovano npr. u US 2010/0196266 A1. Posebno, ukupna RNK se može dobiti iz limfocita (Id.) cirkulišuće krvi. Rekombinanti Fab može biti kloniran iz repertoara µ, γ i κ lanca antitela i ubačen u biblioteku fagnog displeja (Id.). RNK kiseline se mogu konvertovati u komplementarne DNK kiseline (cDNKs) i koristiti za dobijanje Fab cDNK biblioteka upotrebom specifičnih prajmera protiv imunoglobulinskih sekvenci teškog i lakog lanca (Marks et al., 1991, J. Mol. Biol.222:581-97). U sledećem koraku, konstrukcija biblioteke može da se izvede kao što je poznato stručnjaku iz oblasti i kao što je opisano na primer od strane Andris-Widhopf et al. (2000), Phage Display Laboratory Manual, 1. izdanje, Cold Spring Harbor Laboratory Press, str.9.1 do 9.22). Konačni Fab fragmenti mogu biti digestirani sa restrikcionim endonukleazama i umetnuti u genom bakteriofaga da bi se dobila biblioteka fagnog displeja.

Konačno, tako dobijene biblioteke mogu se pregledati korišćenjem standardnih metoda fagnog displeja, kao što je poznato u oblasti i kao što je opisano npr. u Pasqualini i Ruoslahti, 1996, Nature 380:364-366; Pasqualini, 1999, The Quart. J. Nucl. Med. 43:159-162). Fagni displej može biti izveden u nekoliko formata, kao što se može videti npr. iz Johnson i Chiswell, 1993, Current Opinion in Structural Biology 3:5564-571.

[0074] Povrh toga, humana antitela se mogu generisati pomoću in vitro aktiviranih B ćelija. Ovaj postupak je opisan npr. u US 5,567,610 i US 5,229,275.

[0075] Antitelo predmetnog pronalaska može biti himerno antitelo. Posebno, himerno antitelo može biti rekombinantni protein, pri čemu su varijabilni regioni humanog antitela zamenjeni varijabilnim regionima nehumanih antitela sisara, kao što su npr. antitelo miša ili antitelo zeca, uključujući komplementarne determinišuće regione (complementarity-determining regions (CDRs)) od nehumanog antitela sisara, npr. antitela miša ili antitela zeca. Postupci za kloniranje varijabilnih domena nehumanih imunoglobulina sisara, posebno varijabilnih regiona murinskog imunoglobulina, poznati su u oblasti i opisani su na primer od strane Orlandi et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. SAD 86: 3833 (1989), i US 2010/0196266 A1. Metode za dobijanje himernih antitela su poznate stručnjaku iz oblasti, kao što se može npr. videti od Leung et al., Hybridoma 13:469 (1994), gde je opisana proizvodnja LL2 Himere.

[0076] Antitela ovog predmetnog pronalaska mogu dalje da sadrže jedan ili više dodatnih segmenata da bi se ostvarile željene funkcije. Posebno, antitela mogu da uključuju jedan ili više segmenata toksina (kao što je npr. tetanus toksid) ili radionuklid(e), i/ili jedan ili više segmenata (kao što su npr. biotin, fluorescentna grupa, radioaktivna grupa, histidinska oznaka ili druge peptidne oznake) za olakšavanje izolacije i/ili detekcije i/ili ciljanja, pri čemu navedena oznaka poželjno ne menja ili u suštini ne menja specifičnost vezivanja pomenutog antitela.

[0077] Izrazi "ima specifičnost za", "pokazuje specifično vezivanje za", "sposoban za specifično vezivanje za" i "specifično se vezuje za" se koriste naizmenično u ovoj prijavi i mogu posebno naznačiti da antitelo reaguje ili se udružuje češće, brže, duže, sa većim afinitetom, ili sa nekom kombinacijom gore navedenog, sa epitopom ili proteinom nego sa alternativnim supstancama, uključujući nesrodne proteine. Prema jednom tehničkom rešenju, "vezivanje" i "specifično vezivanje", kao i " vezivanje antitela za" i " specifično vezivanje antitela za" mogu se koristiti naizmenično u kontekstu ovog predmetnog pronalaska.

[0078] U određenim tehničkim rešenjima, anti-CD26 koji se ovde stavlja na uvid javnosti vezuje se za humani CD26 sa kinetičkom brzinom disocijacije (Koff) od oko 1.e<-3>do 1.e<-5>s<-1>, poželjno 5·e<-3>do 5·e<-4>s<-1>, poželjnije 8·e<-3>do 3·e<-4>s<-1>posebno oko 1.32·e<-4>s<-1>.

U određenim tehničkim rešenjima, anti-CD26 koji se ovde stavlja na uvid javnosti vezuje se za humani CD26 sa kinetičkom konstantom disocijacije (KD) od oko 5·e<-8>do 5·e<-10>M, poželjno 2·e<-9>do 1·e<-10>M, poželjnije 3·e<-9>do 7·e<-9>M, posebno oko 5.02·e<-9>M.

U određenim tehničkim rešenjima, anti-CD26 koji se ovde stavlja na uvid javnosti vezuje se za humani CD26 sa kinetičkom konstantom asocijacije (Kon) od oko 5·e<3>do 1·e<5>1/Ms, poželjno 1·e<4>do 5·e<4>1/Ms, poželjnije 1.5·e<4>do 3.5·e<4>1/Ms, posebno oko 2.63·e<4>1/Ms.

[0079] U određenim tehničkim rešenjima, anti-CD26 antitelo koje se ovde stavlja na uvid javnosti vezuje se za humani CD26 sa konstantom disocijacije od oko 1 nM ili manje, oko 3 nM ili manje, oko 6 nM ili manje, oko 12 nM ili manje, oko 30 nM ili manje, oko 60 nM ili manje, oko 200 nM ili manje.

[0080] U nekim tehničkim rešenjima anti-CD26 antitelo koje se ovde stavlja na uvid javnosti vezuje se za humani CD26 sa konstantom disocijacije od oko 0,1 nM do oko 10 nM, oko 0,1 nM do oko 6 nM, oko 0,1 nM do oko 3 nM, ili oko 0,1 nM do oko 1 nM.

[0081] Antitela predmetnog pronalaska mogu se testirati za specifično vezivanje bilo kojom metodom poznatom stručnjaku iz oblasti, uključujući, ali ne ograničavajući se na, kompetitivne i nekompetitivne sisteme testiranja koristeći tehnike kao što su Biacore® analiza, FACS analiza, imunofluorescencija, imunocitohemija, Western blotovi, radioimunotestovi, ELISA, "sendvič" imunotestovi, imunoprecipitacioni testovi, reakcije taloženja, imunodifuzioni testovi, testovi aglutinacije, testovi vezivanja komplementa, imunoradiometrijski testovi, fluorescentni imunotestovi, i imunotestovi proteina A. Takvi testovi su opisani npr. u Ausubel et al., eds., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, tom 1, John Wiley & Sons, Inc., Njujork i US 7,982,013 B2. Radije, Biacore® analiza može biti izvedena.

[0082] Prirodna antitela mogu biti sastavljena od dve ili više heterodimernih podjedinica od kojih svaka sadrži jedan težak (heavy (H)) i jedan lak (light (L)) lanac. Pojedinačno prirodno antitelo može imati jedan tip L lanca i jedan tip H lanca, koji se drže zajedno disulfidnim vezama kako bi formirali heterodimernu podjedinicu.

[0083] Termin "peptid" se može posebno odnositi na jedinjenje koje uključuje dve ili više amino kiselina. Amino kiseline mogu biti zajedno povezane peptidnom vezom. Peptid može da sadrži amino kiseline koje se javljaju u prirodi i/ili amino kiseline koje se ne pojavljuju u prirodi; posebno peptid može da sadržati L-amino kiseline i/ili D-amino kiseline. Kratki peptidi, npr., peptidi koji imaju manje od deset jedinica amino kiselina, ponekad se nazivaju "oligopeptidi". Drugi peptidi koji imaju veliki broj amino kiselinskih ostataka, npr. do 100 ili više, mogu se označiti kao "polipeptidi". Kako se ovde koristi, termin "polipeptid" može se odnositi na bilo koji peptid koji sadrži tri ili više amino kiselina. Kako se ovde koristi, bilo koje pozivanje na "polipeptid" takođe uključuje oligopeptid, i svako pozivanje na "peptid" uključuje polipeptide, oligopeptide i proteine.

[0084] Antitelo predmetnog pronalaska može biti antitelo bilo koje klase. Posebno, antitelo predmetnog pronalaska može imati izotip antitela izabran od grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD i IgE. Posebno antitelo predmetnog pronalaska može biti IgG2 klase, posebno IgG 2B klase. Termin "izotip", kako se ovde koristi, može se posebno odnositi na klasu antitela (kao npr.IgG) koja je kodirana genima konstantnog regiona teškog lanca. Sekvence konstantnih regiona humanih imunoglobulina biće očigledne stručnjaku iz oblasti i/ili su dostupne u javnim bazama podataka (npr. Nacionalni Centar za Biotehnološke Informacije (NCBI), U.S. National Library of Medicine).

[0085] Dalje, antitelo predmetnog pronalaska specifično vezuje CD26 i može imati varijabilni region lakog lanca, čiji varijabilni region lakog lanca sadrži varijantu od VL CDR1, VL CDR2, ili VL CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca antitela koje je proizvedeno iz hibridomske ćelijske linije deponovane kao PD 12002. Štaviše, antitelo predmetnog pronalaska specifično vezuje CD26 i može imati varijabilni region teškog lanca, čiji varijabilni region teškog lanca sadrži varijantu od VH CDR1, VH CDR2, ili VH CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca antitela proizvedenog iz hibridomske ćelijske linije deponovane kao PD 12002. U jednom tehničkom rešenju, varijanta VH ili VL CDR može imati najmanje 90%, poželjno najmanje 98%, poželjnije najmanje 99% identiteta sekvence sa odgovarajućim VH ili VL CDR antitela proizvedenog iz hibridomske ćelijske linije deponovane kao PD 12002. Alternativno, varijanta VH ili VL CDR može biti VH ili VL CDR antitela proizvedenog hibridomskom ćelijskom linijom koja je deponovana kao PD 12002, pri čemu ne više od 5, 4, 3, 2, poželjnije 1 aminokiselinski ostatak(ostataka), redom, je izbrisano, umetnuto ili zamenjeno aminokiselinskim ostatkom koji je različit od zamenjenog aminokiselinskog ostatka. U jednom tehničkom rešenju, zamena amino kiselina je konzervativna promena. U jednom tehničkom rešenju, VH i VL CDR regioni od antitela proizvedenog pomoću hibridomske ćelijske linije deponovane kao PD 12002 navedeni su na Slici 2b.

[0086] Povrh toga, antitelo predmetnog pronalaska specifično vezuje CD26 i može imati varijabilni region lakog lanca, čiji varijabilni region lakog lanca sadrži sekvencu amino kiselina izabranu od varijanti aminokiselinske sekvence izabranih iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 6 do 21. "Konzervativna aminokiselinska promena" je promena, pri čemu je jedan amino kiselinski ostatak zamenjen sa drugim amino kiselinskim ostatkom koji ima sličan bočni lanac. Termin se naizmenično koristi sa "konzervativna aminokiselinska supstitucija" ili "konzervativna aminokiselinska varijacija". Porodice aminokiselinskih ostataka koje imaju slične bočne lance su poznate u oblasti, uključujući osnovne bočne lance, kisele bočne lance, nenaelektrisane polarne bočne lance, nepolarne bočne lance, beta-razgranate bočne lance i aromatične bočne lance, kao što je razmatrano npr. u US 7,982,013 B2, posebno u koloni 22 istog. Na primer, zamena fenilalanina sa tirozinom je konzervativna supstitucija. Poželjno, antitelo dobijeno nakon konzervativne supstitucije specifično se vezuje za CD26, posebno humani CD26. Metode za identifikaciju nukleotidnih i aminokiselinskih konzervativnih supstitucija koje ne eliminišu vezivanje antigena su poznate u oblasti (videti, npr., Brummell et al., Biochem.32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); i Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 94:412-417 (1997)).

[0087] U varijantama aminokiselinskih sekvenci koje sadrže jednu ili više CDR sekvenci, sve CDR sekvence ili najmanje sve CDR3 sekvenca(e) mogu ostati nepromenjene. Posebno, u varijantama aminokiselinskih sekvenci koje sadrže jednu ili više sekvenci predstavljenih u SEQ ID NOs: 1, 2 i 3, jedna ili više sekvenci amino kiselina predstavljenih u SEQ ID NOs: 1, 2 i 3 mogu ostati nepromenjene. U varijantama sekvenci nukleotida koje sadrže odeljke koji kodiraju jednu ili više CDR sekvenci, svi odeljci koji kodiraju CDR sekvence ili najmanje svi odeljci nukleotidnih sekvenci koji kodiraju CDR3 sekvencu(e) mogu ostati nepromenjeni. Posebno, u varijantama sekvenci nukleotida koje sadrže jednu ili više sekvenci koje kodiraju jednu ili više sekvenci predstavljenih u SEQ ID NOs: 1, 2 i 3, najmanje odeljci sekvence nukleotida koji kodiraju jednu ili više od SEQ ID NOs: 1, 2 i 3 mogu ostati nepromenjeni. U antitelu koje sadrži varijantu aminokiselinske sekvence izabrane od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 4 do 21, varijabilni region lakog lanca može da sadrži aminokiselinske ostatake 8 - 104 od SEQ ID NO: 4 ili 5 i/ili u antitelu koje sadrži varijantu aminokiselinske sekvence izabrane od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 22 do 47, varijabilni region teškog lanca može sadržati aminokiselinske ostatake 7 - 112 od SEQ ID NO: 26.

[0088] "Procenat (%) identiteta sekvence amino kiselina" u odnosu na polipeptidnu sekvencu kako je ovde predstavljeno definiše se kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidata od interesa za poređenje koji su identični sa aminokiselinskim ostacima u određenoj polipeptidnoj sekvenci kao što je ovde i predstavljeno (npr. određena polipeptidna sekvenca okarakterisana pomoću SEQ. ID. NO. u listama sekvenci), nakon poravnanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da se postigne maksimalni procenat identiteta sekvence, i ne uzimajući u obzir bilo koju konzervativnu supstituciju kao deo identiteta sekvence. Poravnavanje sekvenci izvedeno zbog određivanja procenta identiteta aminokiselinskih sekvenci može biti sprovedeno prema postupcima poznatim u oblasti, kao što je opisano na primer u EP 1 241 179 B1, uključujući posebno stranu 9, red 35 do strane 10, red 40 sa definicijama koje se tamo koriste i Tabelu 1 u vezi sa mogućim konzervativnim supstitucijama. Na primer, stručnjak iz oblasti može da koristi javno dostupni kompjuterski program. Komjuterske programske metode za određivanje identiteta sekvenci uključuju, ali nisu ograničene na BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) program. Prema jednom poželjnom tehničkom rešenju, program koji se koristi za poravnanje može biti BLAST. Stručnjak iz oblasti može da odredi odgovarajuće parametre za merenje poravnanja, uključujući i sve algoritme potrebne za postizanje maksimalnog poravnanja u celoj dužini sekvenci podvrgnutih poređenju. Prema poželjnom tehničkom rešenju, vrednosti % identiteta mogu biti generisane korišćenjem WU-BLAST-2 kompjuterskog programa (Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology 266:460-480), kao što je opisano npr. u EP 1 241 179 B1. Prema poželjnom tehničkom rešenju, koriste se sledeći parametri, kada se izvodi WU-BLAST-2 kompjuterski program: Većina WU-BLAST-2 parametara pretrage postavljena je na uobičajene vrednosti. Podesivi parametri postavljeni su sa sledećim vrednostima: raspon preklapanja= 1, frakcija preklapanja= 0.125, prag reči (T) = 11, i matrica bodovanja = BLOSUM62. HSP S i HSP S2 parametri, koji su dinamičke vrednosti koje koristi BLAST-2, uspostavlja sam program u zavisnosti od sastava sekvence od interesa i sastava baze podataka u odnosu na koju se sekvenca pretražuje. Kako god, vrednosti se mogu podesiti da povećaju osetljivost. % vrednost identiteta sekvence može se odrediti deljenjem (a) broja podudarnih identičnih aminokiselinskih ostataka između određene aminokiselinske sekvence kao što je predstavljeno ovde koja je podvrgnuta poređenju (npr. određena polipeptidna sekvenca okarakterisana pomoću SEQ. ID. NO. u listama sekvenci) i aminokiselinske sekvence kandidata od interesa koja treba da se uporedi, na primer broj podudarnih identičnih aminokiselinskih ostataka kao što je određeno u WU-BLAST-2, sa (b) ukupnim brojem aminokiselinskih ostataka sekvence polipeptida kako je predstavljeno ovde koja je podvrgnuta poređenju (npr. određena sekvenca polipeptida okarakterisanana pomoću SEQ. ID. NO. u listama sekvenci).

[0089] "Procenat (%) identiteta sekvence nukleinske kiseline" u odnosu na sekvencu nukleinske kiseline kao što je predstavljeno ovde definisan je kao procenat nukleotida u sekvenci od interesa kandidata za poređenje koji su identični sa nukleotidima u određenoj sekvenci nukleinske kiseline kao što je ovde predstavljeno (npr. određena sekvenca polipeptida okarakterisana pomoću SEQ. ID. NO. u listama sekvenci), nakon poravnanja sekvenci i uvođenjem praznina, ako je potrebno, kako bi se postigao maksimalni procenat poravnatih sekvenci. Poravnanje u svrhu određivanja procenta identiteta sekvenci nukleinske kiseline može biti sprovedeno prema procedurama poznatim u oblasti, kao što je opisano na primer u EP 1241 179 B1. Na primer, stručnjak iz oblasti može koristiti javno dostupni kompjuterski program, kao što je koriščenje javno dostupnih komjuterskih programa kao što su BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) programi. Stručnjak iz oblasti može odrediti ogovarajuće parametre za merenje poravnanja, uključujući sve algoritme potrebne za postizanje maksimalnog poravnanja preko cele dužine sekvenci podvrgnutih poređenju. Prema poželjnom tehničkom rešenju, vrednosti % identiteta mogu biti generisane korišćenjem WU-BLAST-2 kompjuterskog programa, kao što je opisano na primer u EP 1241 179 B1. Prema poželjnom tehničkom rešenju, koriste se sledeći kompjuterski program i parametri: Vrednosti identiteta koje su ovde korišćene generisane su pomoću BLASTN modula od WU-BLAST-2 postavljenog na podrazumevane parametre, sa rasponom preklapanja i frakcijom preklapanja podešenim na 1 i 0.125, redom. Vrednost % identiteta sekvence nukleinske kiseline može biti dobijena deljenjem (a) broja podudarnih identičnih nukleotida između određene sekvence nukleinske kiseline kao što je ovde izloženo, koja je podvrgnuta poređenju (npr. određena sekvenca nukleinske kiseline okarakterisana pomoću SEQ. ID. NO. u listama sekvenci) i poredbenog molekula nukleinske kiseline od interesa za poređenje, na primer broja podudarnih identičnih nukleotida kao što je određeno pomoću WU-BLAST-2, sa (b) ukupnim brojem nukleotidnih ostataka određene sekvence nukleinske kiseline, kao što je ovde izloženo koja je podvrgnuta poređenju (npr. određena sekvenca nukleinske kiseline okarakterisana pomoću SEQ. ID. NO. u listama sekvenci).

[0090] Posebno, identitet sekvence se može odrediti preko pune dužine odgovarajuće sekvence amino kiseline kako je predstavljeno u jednoj od SEQ ID NO: 1 do 49 ili preko pune dužine odgovarajuće sekvence nukleotida kako je predstavljeno u jednoj od SEQ ID NO: 50 do 128.

[0091] Termin "pozitivni", u kontekstu poređenja sekvence izvedenog kao što je opisano gore i u EP 1241 179 B1, uključuje ostatake u sekvencama koje se porede i koje nisu identične ali imaju slične osobine (npr. kao rezultat konzervativne supstitucije). % vrednost pozitivnih je određena pomoću frakcije ostataka sa pozitivnom vrednošću u BLOSUM 62 matriksu podeljeno sa ukupnim brojem ostataka u poravnatom regionu.

[0092] Povrh toga, antitelo predmetnog pronalaska specifično vezuje CD26 i ima varijabilni region teškog lanca, taj varijabilni region teškog lanca sadrži sekvencu amino kiselina izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 22 do 47. Varijanta sekvence amino kiseline izabrane od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 22 do 47 može imati najmanje 90%, poželjno najmanje 98%, poželjnije najmanje 99% identiteta sekvence sa sekvencom amino kiseline izabrane od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 22 do 47. Alternativno, varijanta sekvence amino kiselina izabrane od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 22 do 47 može biti sekvenca amino kiselinea, pri čemu je ne više od 8, poželjno ne više od 5, poželjnije 1 ostatak(ostataka) amino kiselina, redom, izbrisano, umetnuto ili zamenjeno ostatkom amino kiseline drugačijim od zamenjenog ostatka amino kiseline. U jednom tehničkom rešenju, zamena amino kiselina je konzervativna promena. Posebno, anti-CD26 antitelo predmetnog pronalaska može biti antitelo, pri čemu varijabilni region teškog lanca može da sadrži ili da se sastoji od sekvence amino kiselina izabrane od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 22 do 47. Dalje, antitelo predmetnog pronalaska specifično vezuje CD26 i može imati varijabilni region teškog lanca, taj varijabilni region teškog lanca sadrži ostatke amino kiselina 7 - 112 od SEQ ID NO: 26. U jednom tehničkom rešenju, antitelo predmetnog pronalaska može biti himerno antitelo koje sadrži humani laki lanac i konstantne regione teškog lanca.

[0093] Dalje, antitelo predmetnog pronalaska može da sadrži konstantni region lakog lanca, navedeni konstantni region lakog lanca sadrži sekvencu amino kiselina izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 48 i varijante(i) iste. Varijanta aminokiselinske sekvence kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 48 može imati najmanje 90%, poželjno najmanje 98%, poželjnije najmanje 99% identiteta sekvence sa SEQ ID NO: 48. Alternativno, varijanta od SEQ ID NO: 48 može biti sekvenca amino kiselina od SEQ ID NO: 48, pri čemu je ne više od 8, poželjno ne više od 5, poželjnije 1 amino kiselinski ostatak(ostaci), redom, izbrisano, umetnuto ili zamenjeno ostatkom amino kiseline drugačijim od zamenjenog ostatka amino kiseline. U jednom tehničkom rešenju, zamena amino kiselina je konzervativna promena. Posebno, antitelo predmetnog pronalaska može biti antitelo, gde konstantni region lakog lanca može da sadrži ili da se sastoji od sekvence amino kiselina predstavljene u SEQ ID NO: 48 ili njene varijante.

[0094] U alternativnom tehničkom rešenju, antitelo predmetnog pronalaska može biti himerno antitelo koje sadrži konstantne regione humanog lakog lanca.

[0095] Povrh toga, antitelo predmetnog pronalaska može da sadrži sekvencu amino kiselina predstavljenu u SEQ ID NO: 49, ili njenu varijantu. Varijanta sekvence amino kiselina kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 49 može imati najmanje 90%, poželjno najmanje 98%, poželjnije najmanje 99% identiteta sekvence sa SEQ ID NO: 49. Alternativno, varijanta od SEQ ID NO: 49 može biti sekvenca amino kiselina, pri čemu je ne više od 8, poželjno ne više od 5, poželjnije 1 ostatak(ostataka) amino kiselina, respektivno, izbrisano, umetnuto ili zamenjeno ostatkom amino kiseline različitim od zamenjenog ostatka amino kiseline. U jednom tehničkom rešenju, zamena amino kiselina je konzervativna promena. Posebno, antitelo predmetnog pronalaska može biti antitelo, gde lanac CH1-CH2-CH3 može da sadrži ili se sastoji od sekvence amino kiselina predstavljene u SEQ ID NO: 49 ili njene varijante.

[0096] U alternativnom tehničkom rešenju, antitelo predmetnog pronalaska može biti himerno antitelo koje sadrži konstantni region humanog teškog lanca.

[0097] Posebno, antitelo predmetnog pronalaska može biti IgG 2B klase, i može da sadrži sekvencu amino kiselina predstavljenu u SEQ ID NO: 49, ili njenu varijantu, kao što je gore definisano.

[0098] Kao što se može videti iz priloženih listi sekvenci, identifikovana je grupa sekvenci za varijabilni region teškog lanca (VH), i identifikovane su 2 različite grupe sekvenci za varijabilni region lakog lanca (VL). Poravnanja sekvenci svake grupe, pokazuju njihovu sličnost i prikazana su na SL.3. VL sekvenca (SEK. ID. NO: 4) prisutna sa visokom učestalošću u antitelu predmetnog pronalaska je identifikovana i prepoznata je odgovarajuća CL sekvenca (SEK. ID. NO: 48). VH sekvenca prisutna sa visokom učestalošću je identifikovana (SEK. ID. NO: 26) i odgovarajuća CH1-CH2-CH3 sekvenca (SEK. ID. NO: 49) je prepoznata.

[0099] Antitelo predmetnog pronalaska može biti antitelo koje se specifično vezuje za CD26, sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 4 i sadrži konstantni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 48 ili njenu varijantu. Antitelo predmetnog pronalaska može biti antitelo koje specifično vezuje CD26, sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 26 i sadrži CH1-CH2-CH3 lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 49 ili njenu varijantu. Dalje, antitelo predmetnog pronalaska može biti antitelo koje specifično vezuje CD26, sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 4 i po izboru dalje sadrži konstantni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 48 ili njenu varijantu i po izboru dalje sadrži CH1-CH2-CH3 lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 49 ili njenu varijantu i po izboru dalje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 26. Posebno, antitelo predmetnog pronalaska može da sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 4, konstantni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku asekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 48 ili njenu varijantu, CH1-CH2-CH3 lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 49 ili njenu varijantu i varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 26. Alternativno, antitelo predmetnog pronalaska može biti himerno antitelo koje sadrži humani laki lanac i/ili konstantni region teškog lanca.

[0100] Posebno, antitelo predmetnog pronalaska može biti antitelo koje se specifično vezuje za CD26, sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinske ostatake 8 - 104 od SEQ ID NO: 4, konstantni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 48 ili njenu varijantu, CH1-CH2-CH3 lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 49 ili njenu varijantau i varijabilni region teškog lanac sadrži aminokiselinske ostatake 7 - 112 od SEQ ID NO: 26. Alternativno, antitelo predmetnog pronalaska može biti himerno antitelo koje sadrži humani laki lanac i/ili konstantni region teškog lanca.

[0101] Antitelo predmetnog pronalaska može biti posebno antitelo koje se specifično vezuje za CD26, sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 i sadrži konstantni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 48 ili njenu varijantu i sadrži CH1-CH2-CH3 lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 49 ili njenu varijantu; po izboru, ovo antitelo dalje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47. Alternativno, antitelo predmetnog pronalaska može biti himerno antitelo koje sadrži humani laki lanac i/ili konstantni region teškog lanca.

[0102] Antitelo predmetnog pronalaska može biti posebno antitelo koje se specifično vezuje za CD26, sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 4 i sadrži konstantni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 48 ili njenu varijantu i sadrži CH1-CH2-CH3 lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 49 ili njenu varijantu; po izboru, ovo antitelo dalje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47. Alternativno, antitelo predmetnog pronalaska može biti himerno antitelo koje sadrži humani laki lanac i/ili konstantni region teškog lanca.

[0103] Antitelo predmetnog pronalaska može biti posebno antitelo koje se specifično vezuje za CD26, sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 26 i sadrži konstantni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 48 ili njenu varijantu i sadrži CH1-CH2-CH3 lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 49 ili njenu varijantu; ovo antitelo može po izboru dalje sadržati varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. Alternativno, antitelo predmetnog pronalaska može biti himerno antitelo koje sadrži humani laki lanac i/ili konstantni region teškog lanca.

[0104] Varijanta bilo koje od sekvenci izabranih od grupe sekvenci SEQ ID NO: 1 do 128 može imati najmanje 90%, poželjno najmanje 98%, poželjnije najmanje 99% identiteta sekvence sa navedenom sekvencom izabranom od pomenute grupe sekvenci.

[0105] Šta više, antitelo ovog predmetnog pronalaska specifično vezuje CD26 i može da sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca, pri čemu su aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca one od varijabilnog regiona teškog lanca od antitela dobijenog od hibridomske ćelijske linije deponovane u CBA-ICLC u Đenovi (Italija) kao PD 12002, i aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca su one od varijabilnog regiona lakog lanca od jednog ili ovog antitela proizvedenog od hibridomske ćelijske linije deponovane kao PD 12002. Posebno, aminokiselinske sekvence teškog lanca mogu biti one od teškog lanca antitela proizvedenog pomoću hibridomske ćelijske linije deponovane kao PD 12002, i/ili aminokiselinske sekvence od lakog lanca mogu biti one od lakog lanca od jednog ili ovog antitela proizvedenog od hibridomske ćelijske linije deponovane kao PD 12002. Posebno, antitelo ovog predmetnog pronalaska koje se specifično vezuje za CD26 može da sadrži iste sekvence teškog lanca i iste sekvence lakog lanca kao antitelo proizvedeno od hibridomske ćelijske linije deponovane kao PD 12002. Alternativno, antitelo ovog predmetnog pronalaska može biti himerno antitelo koje sadrži humani laki lanac i/ili konstantni region teškog lanca.

[0106] Anti-CD26 antitelo predmetnog pronalaska (npr. antitelo koje specifično vezuje CD26 i sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO:1, i obuhvata varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO:2) može biti antitelo, pri čemu pored toga što aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca mogu biti one od varijabilnog regiona teškog lanca antitela proizvedenog od hibridomske ćelijske linije deponovane u CBA-ICLC u Đenovi (Italija) kao PD 12002, i aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca mogu biti one od varijabilnog regiona antitela proizvedenog od hibridomske ćelijske linije deponovane kao PD 12002. Po izboru, aminokiselinska sekvenca CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca može biti ona od varijabilnog regiona teškog lanca antitela koji proizvodi hibridomska ćelijska linija deponovana kao PD 12002. Po izboru, aminokiselinska sekvenca CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca može biti ona od varijabilnog regiona lakog lanca antitela proizvedenog od hibridomske ćelijske linije deponovane kao PD 12002. Alternativno, antitelo predmetnog pronalaska može biti himerno antitelo koje sadrži humani laki lanac i/ili konstantni region teškog lanca.

[0107] Termin "hibridomska ćelijska linija" takođe uključuje potomstvo od hibridomske ćelijske linije, bez obzira da li je potomstvo identično u morfologiji ili u genetskom sastavu. Pošto se mogu pojaviti određene modifikacije, na primer zbog mutacije i/ili uticaja okoline, takvo potomstvo ne mora biti identično sa roditeljskom ćelijskom linijom. Poželjno, ćelijsko potomstvo ove hibridomske ćelijske linije će proizvesti antitelo, ili fragment antitela, sposobno za vezivanje za CD26, posebno za humani CD26, posebno će proizvesti antitelo iz ovog predmetnog pronalaska. Štaviše, termin "hibridomska ćelijska linija" može takođe obuhvatiti smeše hibridomskih ćelijskih linija, koje proizvode smešu antitela.

[0108] Prema drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje smešu antitela. Ovaj predmetni pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju, posebno izolovanu kompoziciju, koja sadrži smešu antitela. Ova smeša antitela može da sadrži najmanje dva različita antitela, gde najmanje dva različita antitela poželjno mogu specifično da se vežu za CD26, posebno humani CD26. Po izboru, najmanje jedno antitelo koje ne vezuje CD26 može biti prisutno u smeši antitela. Prema jednom tehničkom rešenju, najmanje dva ili sva antitela kompozicije mogu se specifično vezati za CD26, posebno humani CD26. Posebno, jedno ili više ili sva antitela prisutna u smeši antitela mogu biti antitela ovog predmetnog pronalaska i mogu po izboru imati dodatne karakteristike antitela predmetnog pronalaska kako je stavljeno na uvid javnosti iznad. Ova smeša antitela može da sadrži prvo antitelo, navedeno prvo antitelo koje sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 2 i/ili sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 3, posebno u SEQ ID NO: 3, i drugo antitelo, navedeno drugo antitelo koje sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 2. Prvo antitelo i/ili drugo antitelo mogu biti antitela predmetnog pronalaska i mogu po izboru imati jednu ili više dodatnih karakteristika antitela predmetnog pronalaska kako je detaljno objašnjeno iznad. U jednom tehničkom rešenju, smeša antitela sadrži ili se sastoji od antitela koja imaju varijabilni region teškog lanca i sadrži VH CDR1 od SEQ ID NO: 133, VH CDR2 od SEQ ID NO: 134, i VH CDR3 od SEQ ID NO: 1.

[0109] Prema poželjnom tehničkom rešenju predmetne objave, smeša antitela sadrži najmanje jedno ili sadrži ili se sastoji od dva antitela koja imaju sledeću kombinaciju sekvenci (svako antitelo sadrži jednu od sekvenci lakog lanca koja je niže navedena zajedno sa sekvencom teškog lanca takođe niže navedenom ):

Jedan od sledeća dva različita laka lanca koji sadrži

a) Varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 4, ili varijantu od SEQ ID NO: 4, posebno bilo koju od SEQ ID NO: 6 do SEQ ID NO: 21, zajedno sa konstantnim regionom lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 48; ili

b) Varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 5,

[0110] Zajedno sa teškim lancem koji sadrži:

Varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 26 ili varijantu od SEQ ID NO: 26, posebno bilo koju sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 22 do SEQ ID NO: 25 i SEQ ID NO: 27 do SEQ ID NO: 47, zajedno sa konstantnim regionom teškog lanca (CH1-CH2-CH3) koji sadrži SEQ ID NO: 49.

[0111] U jednom tehničkom rešenju, smeša antitela sadrži ili se sastoji od antitela proizvedenog pomoću depozita PD 12002 hibridoma. U jednom tehničkom rešenju, izolovana kompozicija sadrži najmanje jedno od antitela proizvedenih pomoću PD 12002 depozita hibridoma, posebno sadrži antitela proizvedena pomoću PD 12002 depozita hibridoma.

[0112] Tokom brojnih eksperimenata koje su izveli predmetni pronalazači, antitela proizvedena pomoću depozita PD 12002 hibridoma pokazala su da imaju iznenađujuće korisne aktivnosti za upotrebu kao lek, posebno za podsticanje kalemljenja nakon transplantacije hematopoetske matične ćelije i/ili prevenciju i/ili lečenje najmanje jedne od bolesti Kalem protiv domaćina ili Aplastične Anemije.

[0113] PD 12002 hibridomska ćelijska linija kao deponovana je stabilna tokom skladištenja i u kulturi i kultivisana i proverena na stabilnost i identitet tokom više od 5 godina.

[0114] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje agens (posebno antitelo ili njegov fragment) koji se takmiči za specifično vezivanje za CD26, posebno za humani CD26, sa antitelom u testu kompetitivnog vezivanja (npr., u in vitro testu kompetitivnog vezivanja), pri čemu antitelo je antitelo iz predmetnog pronalaska; posebno, ovaj agens može da se takmiči za specifično vezivanje za CD26, posebno za humani CD26, sa antitelom koje može da sadrži

a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu predstavljen u SEQ ID NO: 1 i/ili varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 2 i/ili sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 3;

b) varijabilni region teškog lanca antitela proizvedenog pomoću hibridomske ćelijske linije deponovane na CBA-ICLC, Đenova, Italija kao PD12002 i varijabilni region lakog lanca navedenog antitela proizvedenog pomoću navedene hibridomske ćelijske linije deponovane na CBA-ICLC, Đenova, Italija kao PD12002. Prema jednom tehničkom rešenju, antitelo može biti antitelo koje može da sadrži

a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 22 do 47 i njihove varijante(i), i/ili varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 4, 5, 6 do 21, i njihove varijante(i), ili antitelo koje može da sadrži

b) teški lanac i laki lanac antitela proizvedenog od hibridomske ćelijske linije deponovane na CBA-ICLC, Đenova, Italija kao PD12002. Prema poželjnom tehničkom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje agens (posebno antitelo ili njegov fragment) koji se takmiči za specifično vezivanje za CD26, posebno za humani CD26, u testu kompetitivnog vezivanja (npr., u in vitro testu kompetitivnog vezivanja) sa antitelom koje sadrži sekvencu ID NO: 26 varijabilnog regiona teškog lanca i sekvencu ID NO: 4 i/ili sekvencu ID NO: 5 varijabilnog regiona lakog lanca. Test kompetitivnog vezivanja može se koristiti da se odredi da li dva antitela vezuju isti epitop prepoznavanjem identičnih ili sternih preklapajućih epitopa (Dong et.al 1998). Bilo koji test kompetitivnog vezivanja poznat stručnjaku iz oblasti može da se koristi za identifikaciju agenasa koji se takmiče za specifično vezivanje za CD26 sa antitelom predmetnog pronalaska. Na primer, korišćeni su testovi u kojima je CD26 antigen imobilisan na ploči sa više bunarića i može se meriti sposobnost neobeleženog antitela da blokira vezivanje obeleženog antitela. Uobičajeni obeleživači za takve testove nadmetanja su radioaktivni ili enzimski obeleživači.

[0115] Prema drugom aspektu, pronalazači su obezbedili izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži (a) sekvencu nukleotida koja kodira antitelo predmetnog pronalaska ili (b) sekvencu nukleotida komplementarnu sa (a).

[0116] U kontekstu predmetnog pronalaska, termin "molekul nukleinske kiseline" se koristi kao što je poznato u oblasti i može se posebno odnositi na dva ili više nukleotida ili nukleotidnih analoga povezanih kovalentnom vezom. Termin "molekul nukleinske kiseline" obuhvata oligonukleotide, koji obično sadrže ne više od pedeset nukleotida, i polinukleotide, koji mogu imati u suštini bilo koju dužinu. Dalje, termin "molekul nukleinske kiseline" može obuhvatiti DNK, kao što je cDNK ili gen, ili RNK. Nukleotidi sadrže molekul nukleinske kiseline koji se može izabrati na primer od grupe koja sadrži prirodne dezoksiribonukleotide, ribonukleotide i nukleotidne analoge, kao što su sintetički nukleotidi koje se ne javljaju u prirodi ili modifikovani nukleotidi koji se prirodno pojavljuju. Nukleotidni analozi su poznati u oblasti i opisani su npr. u Lin et al., 1994, Nucl. Acids Res. 22:5220-5234; Jellinek et al., 1995, Biochem. 34:11363-11372; Pagratis et al., 1997, Nature Biotechnol. 15:68-73.

[0117] "Izolovano" jedinjenje ili kompozicija, kao što je npr. polipeptid, antitelo, molekul nukleinske kiseline, vektor, ćelija, ili njhova smeša, može biti posebno jedinjenje ili kompozicija koja je prisutna u obliku koji se ne nalazi u prirodi. Izolovana jedinjenja (npr. polipeptidi, molekuli nukleinske kiseline, antitela, vektori, ćelije) ili kompozicije uključuju one koji su prečišćeni do te mere da više nisu u obliku u kojem se nalaze u prirodi.

[0118] Ova predmetna objava takođe obezbeđuje izolovan molekul nukleinske kiseline koji sadrži sekvencu nukleotida izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 50 do 128 i njihove varijante. Varijanta sekvence nukleotida izabrana od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 50 do 128 može imati najmanje 90%, poželjno najmanje 98%, poželjnije najmanje 99% identiteta sekvence prema sekvenci nukleotida izabranoj od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 50 do 128. Sekvenca nukleotida izabrana od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 50 do 77 ili njihova varijanta može kodirati varijabilni region lakog lanca (VL) ili njegov deo. Alternativno, varijanta sekvence nukleotida izabrana od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 50 do 128 može biti sekvenca nukleotida izabrana od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 50 do 128, pri čemu ne više od 12, poželjno ne više od 5, poželjnije ne više od 1 ostatka(ostataka) nukleotida, redom, je izbrisano, umetnuto ili zamenjeno nukleotidnim ostatkom koji se razlikuje od zamenjenog nukleotidnog ostatka. Sekvenca nukleotida izabrana od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 78 do 126 ili njihova varijanta može kodirati varijabilni region teškog lanca (VH) ili njegov deo. Sekvenca nukleotida predstavljena u SEQ ID NO: 127 ili njena varijanta mogu kodirati konstantni region lakog lanca (CL) ili njegov deo. Sekvenca nukleotida predstavljena u SEQ ID NO: 128 ili njena varijanta može kodirati CH1-CH2-CH3 lanac ili njegov deo. Prema tehničkom rešenju, sekvenca nukleotida koja kodira VL lanac može biti reorganizovana sekvenca produktivnog IGK (Ig kappa položaj) (spoj u okviru i bez stop kodona). Prema tehničkom rešenju, sekvenca nukleotida koja kodira VH lanac može biti reorganizovana sekvenca produktivnog IGH (gen Ig teškog lanca) (spoj u okviru i bez stop kodona).

[0119] Prethodno pomenute varijante molekula nukleinskih kiselina mogu se na primer dobiti pomoću "parsimonije mutageneze" (Shier, R., et al., 1996, Gene 169: 147) ili drugim metodama slučajne ili usmerene mutageneze sekvence nukleotida predmetnog pronalaska (Marks, J. D., et al., 1992, J. Biol. Chem.267: 16007) koja je izvedena kako bi se poboljšala neka svojstva antitela, kao na primer afinitet, dok je poželjno da se održi specifičnost vezivanja za CD26.

[0120] Molekuli nukleinske kiseline ovde stavljeni na uvid javnost mogu se klonirati u vektore koji su pogodni za njihovo pojačanje, dalju mutagenezu ili modifikaciju ili eksprimiranje. Ova predmetna objava takođe obezbeđuje da vektor sadrži sekvencu nukleotida za kodiranje antitela predmetnog pronalaska. Poželjno, vektor je sposoban da efikasno eksprimira antitelo prema predmetnom pronalasku. Posebno, vektor nukleinske kiseline može da sadrži prvi molekul nukleinske kiseline kovalentno i operativno povezan sa drugim molekulom nukleinse kiseline tako da domaćin koji sadrži vektor eksprimira polipeptid kodiran prvim molekulom nukleinske kiseline, pri čemu je prvi molekul nukleinske kiseline molekul nukleinske kiseline prema ovoj patentnoj objavi, posebno molekul nukleinske kiseline koji sadrži sekvencu nukleotida izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 50 do 128 i njihovu varijantu(e). Ovi vektori se mogu koristiti za pripremu rekombinantnih antitela ili himernih proteina u odgovarajućem domaćinu i daljim postupcima znanim u oblasti.

[0121] U skladu sa trenutno poželjnim tehničkim rešenjem predmetnog pronalaska, rekombinantna antitela su poželjno klonirana i eksprimirana u prokariotskim ćelijama ili eukariotskim ćelijama domaćina: posebno poželjna je E. coli, ali se mogu koristiti i druge prokariotske ćelije, kao što je B. subtilis, P. pastoris, K. lactis, ili eukariotske ćelije biljnog ili životinjskog porekla, posebno murinskog porekla.

[0122] Prema još jednom aspektu, obezbeđen je ekspresioni vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline ove predmetne objave, pri čemu je navedeni molekul nukleinske kiseline operativno povezan sa sekvencom kontrole eksprimiranja.

[0123] Termin "vektor" može posebno da se odnosi na molekul, na primer molekul nukleinske kiseline, plazmid, ili virus, koji se koristi za prenos kodiranih informacija u ćeliju domaćina. Posebno, "vektor" može biti molekul nukleinske kiseline, poželjno samo-replicirajući, koji može da prenese umetnut molekul nukleinske kiseline u i/ili između ćelija domaćina. Primeri vektora uključuju, ali nisu ograničeni na, virusni vektor, pri čemu se dodatni segment(i) DNK može povezati u virusni genom, gole DNK i RNK ekspresione vektore, DNK ili RNK ekspresione vektore inkapsulirane u lipozome, plazmid, kao što je na primer kružna dvolančana DNK petlja u koju može da se veže dodatni segment(i) DNK, vektor kosmida ili faga, vektor koji je sposoban za autonomnu replikaciju u ćeliji domaćina u koju je vektor uveden, i vektori ekspresije DNK ili RNK povezani sa katjonskim kondenzacionim agensima. Posebno, vektor može biti integrisan u genom ćelije domaćina nakon uvođenja u ćeliju domaćina, što dozvoljava da se naknadno replicira zajedno sa genomom domaćina. Posebno, termin "vektor" obuhvata ekspresione vektore. Kako se ovde koristi, termin "ekspresioni vektor" se može posebno odnositi na vektor koji je sposoban da usmeri ekspresiju jednog ili više gena za koje je ekspresioni vektor operativno vezan. Ekspresioni vektori koji sadrže sekvencu nukleotida kao što je opisano ovde mogu biti optimizovani za eksprimiranje u ćeliji domaćina, posebno umetanjem pogodnih regulatornih regiona, promotera, transkripcionih terminatora ili aktivatora, ili replikaciono poreklo.

[0124] U kontekstu ove prijave, komponente koje su "operativno povezane" mogu biti posebne komponente koje su u relaciji koja dozvoljava komponentama da funkcionišu na svoj način. Sekvenca kontrole eksprimiranja koja je operativno vezana za sekvencu kodiranja može biti posebno vezana tako da se eksprimiranje kodirajuće sekvence postiže pod uslovima koji su kompatibilni sa jednom ili više sekvenci kontrole eksprimiranja. Termin "sekvenca kontrole eksprimiranja" obuhvata, ali nije ograničen na jednu ili više sekvenci nukleotida koje regulišu eksprimiranje sekvence nukleotida za koju je sekvenca kontrole eksprimiranja operativno vezana. Operativno vezane sekvence kontrole eksprimiranja mogu uključiti, ali nisu ograničene na, sekvence kontrole eksprimiranja koje su susedne genu od interesa i sekvence kontrole eksprimiranja koje deluju u trans položaju ili na distanci za kontrolisanje gena od interesa.

[0125] Prema jednom tehničkom rešenju, sekvenca kontrole eksprimiranja operativno povezana sa sekvencom nukleinske kiseline može da kontroliše i reguliše transkripciju i, kada je pogodno, translaciju sekvence nukleinske kiseline. Sekvence kontrole eksprimiranja mogu uključiti, ali nisu ograničene na, jednu ili više sekvenci izabranih od grupe koja se sastoji od promoter sekvenci, sekvenci pojačivača, transkripcionih terminatora, splajsing signala za intron(e), ako je intron(i) prisutan, početnog kodona, posebno ispred gena za kodiranje proteina, sekvenci koje obezbeđuju pravilnu translaciju iRNK i stop kodona. Prema jednom tehničkom rešenju, ekspresioni vektor može na primer da sadrži poreklo replikacije, promoter, i po izboru jedan ili više gena koji dozvoljavaju fenotipsku selekciju transformisanih ćelija.

[0126] Prema još jednom aspektu, ova predmetna objava obezbeđuje rekombinantnu ćeliju domaćina koja sadrži molekul nukleinske kiseline ove predmetne objave.

[0127] U kontekstu ove prijave, termin "ćelija domaćina" se može posebno odnositi na ćeliju koja je transformisana, ili je sposobna da bude transformisana, sa sekvencom nukleinske kiseline. Nakon što je transformisana ćelija domaćina može da eksprimira gen od interesa. Termin "ćelija domaćina" ne samo da obuhvata ćeliju dobijenu nakon transformacije, već takođe uključuje potomstvo ćelije dobijene nakon transformacije, bez obzira da li je potomstvo identično u morfologiji ili u genskom sastavu originalne roditeljske ćelije. Pošto se mogu pojaviti određene modifikacije, na primer zbog mutacije i/ili uticaja okoline, takvo potomstvo ne mora biti identično sa roditeljskom ćelijom. Poželjno, potomstvo proizvodi antitelo ili fragment antitela, koji su sposobni za vezivanje za CD26, posebno humani CD26. Termin "ćelija domaćina" može takođe obuhvatiti smeše ćelija domaćina. U smešama ćelija domaćina, ćelije domaćina mogu proizvesti jedno antitelo ili jedan njegov fragment ili dva ili više različita antitela ili njihove fragmente.

[0128] Antitelo predmetnog pronalaska može biti antitelo proizvedeno iz hibridomske ćelijske linije deponovane u CBA-ICLC u Đenovi (Italija) kao PD 12002 ili derivat navedene hibridomske ćelijske linije. Posebno, derivat hibridomske ćelijske linije deponovane kao PD 12002 je ćelijska linija koja sadrži polinukleotid koji sadrži sekvencu, koja je varijanta jedne ili više od SEQ ID NOs: 50 do 128. Antitelo predmetnog pronalaska može biti antitelo koje vezuje epitop vezan antitelom proizvedenim pomoću hibridomske ćelijske linije deponovane na CBA-ICLC u Đenovi (Italija) kao PD 12002. Kako se ovde koristi, termin "epitop" se može posebno odnositi na deo antigena koji može biti prepoznat i specifično vezan od određenog antitela. Obično, epitop može uključiti najmanje 3, i običnije, najmanje 4, ili 8 do 10 amino kiselina u određenoj prostornoj konformaciji. Pošto antitelo može da prepozna antigenski peptid ili polipeptid u svojoj tercijernoj strukturi, amino kiseline koje čine epitop ne moraju biti susedne, i u nekim slučajevima, čak ne moraju biti na istom peptidnom lancu. U predmetnom pronalasku, peptidni ili polipeptidni epitop prepoznat od antitela iz predmetnog pronalaska sadrži sekvencu od najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9, najmanje 10, najmanje 15, najmanje 20, najmanje 25, ili između oko 5 do oko 30, oko 10 do oko 30 ili oko 15 do oko 35 susednih ili nesusednih aminokiselina od CD26.

[0129] U jednom tehničkom rešenju, anti-CD26 monoklonsko antitelo predmetnog pronalaska je sposobno zavezivanje CD26 epitopa koji sadrži jednu ili više sekvenci amino kiselina izabranih od grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 146-159. U specifičnim prikazima epitop može biti kontinuirani epitop ili diskontinuirani epitop. U jednom tehničkom rešenju, anti-CD26 monoklonsko antitelo predmetnog pronalaska je sposobno za vezivanje CD26 epitopa koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih sekvenci izabranih od grupe koja se sastoji SEQ ID NO: 146-148, 152, 154, 158, i 159. U jednom tehničkom rešenju, anti-CD26 monoklonsko antitelo predmetnog pronalaska je sposobno za vezivanje CD26 epitopa koji sadrži aminokiselinske sekvence izabrane od grupe koja se sastoji SEQ ID NO: 146-148, 152, 154, 158, i 159. U drugom tehničkom rešenju, anti-CD26 monoklonsko antitelo predmetnog pronalaska je sposobno za vezivanje CD26 epitopa koji sadrži SEQ ID NO: 146. U daljem tehničkom rešenju, anti-CD26 monoklonsko antitelo predmetnog pronalaska je sposobno za vezivanje CD26 epitopa koji sadrži SEQ ID NO: 146 i/ili više aminokiselinskih sekvenci izabranih od grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 147, 148, 152, 154, i 159. U određenom tehničkom rešenju, anti-CD26 monoklonsko antitelo predmetnog pronalaska je sposobno za vezivanje CD26 epitopa koji sadrži SEQ ID NOs: 146, 147, i 148; ili SEQ ID NOs 146, 147, i 152; ili SEQ ID NOs 146 i 147; ili SEQ ID NOs 146 i 152.

[0130] Prema još jednom aspektu, predmetni pronalazači obezbeđuju antitelo proizvedeno pomoću hibridomske ćelijske linije deponovane na CBA-ICLC u Đenovi (Italija) kao PD 12002 ili derivat navedene hibridomske ćelijske linije.

[0131] Prema drugom aspektu, obezbeđeno je antitelo koje vezuje epitop vezan antitelom proizvedenim pomoću hibridomske ćelijske linije deponovane na CBA-ICLC u Đenovi (Italija) kao PD 12002.

[0132] Prema još jednom aspektu, obezbeđen je proces proizvodnje antitela predmetnog pronalaska. Ovaj poces obuhvata korake:

(i) obezbeđivanja ćelije domaćina predmetnog pronalaska, posebno hibridomske ćelijske linije deponovane na CBA-ICLC u Đenovi (Italija) kao PD 12002;

(ii) kultivisanja ćelije domaćina predmetnog pronalaska u kultivacionom medijumu; i (iii) dobijanja antitela iz medijuma;

(iv) po izboru prečišćavanja antitela, na primer filtracijom i/ili nanofiltracijom.

[0133] Prema jednom tehničkom rešenju, transgene životinje koje su genetski konstruisane da proizvode antitela, posebno humana antitela, mogu se koristiti za generisanje antitela za imunogenu metu kao što je pomenuto u ovoj prijavi, posebno antitelo za CD26. Transgene životinje i antitela proizvedena pomoću ovih transgenih životinja se mogu dobiti korišćenjem tehnika poznatih u oblasti, posebno koristeći standardne protokole imunizacije, kao što je opisano npr. u US 2010/0196266 A1. Metode za dobijanje humanog antitela od transgenih životinja, posebno transgenog miša, su opisane npr. u Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994), Lonberg et al., Nature 368:856 (1994), i Taylor et al., Int. Immun.6:579 (1994). Neograničavajući primer za transgenu životinju koja proizvodi antitela, posebno humana antitela, je transgeni miš, posebno XenoMouse® od Abgenix (Fremont, Kalif., SAD), kao što je opisano na primer u Green et al., 1999, J. Immunol. Methods 231:11-23). U transgenoj životinji, kao što je XenoMouse®, geni antitela od nehumanog sisara podvrgnutog genetskom inženjeringu, na primer geni mišjeg antitela, su inaktivirani i zamenjeni funkcionalnim genima za humano antitelo, dok ostatak imunog sistema nehumanog sisara podvrgnutog genetskom inženjeringu, na primer imuni sistem miša, ostaje netaknut.

[0134] Humana antitela proizvedena pomoću transgenih životinja mogu pokazati terapijski potencijal, zadržavajući farmakokinetička svojstva normalnih humanih antitela (Green et al., 1999, supra, US 2010/0196266 A1). Upotreba XenoMouse® sistema za proizvodnju antitela je samo kao primer pomenuta u ovoj prijavi. Na osnovu opšteg znanja u oblasti, stručnjak u oblasti može takođe koristiti drugu transgenu životinju, posebno npr. transgene glodare, ovce, koze ili krave, za proizvodnju antitela predmetnog pronalaska, posebno humanih antitela.

[0135] Ukoliko nije izričito drugačije naznačeno, sve ranije pomenute tehnike su tipične tehnike i može se koristiti bilo koja poznata metoda za proizvodnju antitela ili fragmenata antitela. Za izvođenje predmetnog pronalazska, ukoliko nije drugačije naznačeno, mogu se koristiti konvencionalne tehnike ćelijske biologije, organske hemije, biohemije, molekularne biologije, kultivisanja ćelija, mikrobiologije, proteinske hemije, rekombinantne DNK, i imunologije. Takve konvencionalne tehnike su na primer opisne u: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. izdanje (Sambrook et al., Eds.), 1989; Oligonucleotide Synthesis, (M. J. Gait, Ed.), 1984; US 4,683,195 (Mullis et a/.); Nucleic Acid Hybridization, (B. D. Hames et al.), 1984; Methods in Enzymology, tomovi 154 i 155 (Wu et al.), Academic Press, Njujork; Transcription and Translation, (B. D. Hames and S. J. Higgins), 1984; Culture of Animal Cells (R. I. Freshney, ed.), 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos, Eds.), 1987; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer i Walker, urednici), 1987; Handbook of Experiment Immunology, tomovi I-IV (D. M. Weir i C. C. Blackwell, urednici), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, 1986.

[0136] Ako se drugačije ne zahteva u kontekstu, pojmovi u jednini će uključiti množinu i izrazi u množini uključuju jedninu.

[0137] Prema drugom aspektu, antitela predmetnog pronalaska su antitela za upotrebu kao lek. Posebno, antitela predmetnog pronalaska su antitela za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju Bolesti kalem protiv domaćina (GvHD), poželjno nakon transplantacije hematopoetske matične ćelije. Dalje, antitela predmetnog pronalaska su antitela za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju Aplastične anemije, poželjno teške aplastične anemije. Štaviše, antitelo predmetnog pronalaska može biti antitelo za upotrebu u podsticanju kalemljenja nakon transplantacije hematopoetske matične ćelije. Antitelo predmetnog pronalaska može takođe biti antitelo koje se koristi u prevenciji i/ili lečenju Bolesti kalem protiv domaćina (GvHD), poželjno nakon transplantacije hematopoetske matične ćelije, i za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju Aplastične anemije, poželjno Teške Aplastične anemije, i za upotrebu u podsticanju kalemljenja nakon transplantacije hematopoetske matične ćelije.

[0138] Bolest kalem protiv domaćina, Aplastična anemija i stanje subjekta pre i/ili tokom i/ili nakon transplantacije hematopoetske matične ćelije se smatraju da su bolest(i) poremećaj(i) ili stanje(a) posredovani sa CD26, tj. bolest(i), poremećaj(i) ili stanje(a) koji mogu biti lečeni i/ili sprečeni primenom agensa(agenasa), posebno jednog ili više antitela koja se mogu specifično vezati za CD26, posebno humani CD26.

[0139] Povrh toga, ova predmetna objava takođe obezbeđuje antitelo, posebno kompoziciju, posebno izolovanu kompoziciju, koja sadrži antitelo predmetnog pronalaska, za upotrebu kao lek. Posebno, antitelo, posebno izolovana kompozicija sadrži antitelo iz predmetnog pronalaska, može biti za upotrebu u podsticanju kalemljenja posle transplantacije hematopoetske matične ćelije, i/ili za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju Bolesti kalem protiv domaćina (GvHD), poželjno posle transplantacije hematopoetske matične ćelije, i/ili za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju Aplastične anemije, poželjno Teške Aplastične anemije. Smeša antitela može da sadrži prvo antitelo predmetnog pronalaska, navedeno prvo antitelo koje sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 2, i drugo antitelo predmetnog pronalaska, navedeno drugo antitelo koje sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 2. U jednom tehničkom rešenju, smeša antitela sadrži ili se sastoji od antitela prodizvedenog od depozita PD 12002 hibridoma. Dalje, smeša antitela može da sadrži antitelo (npr., humano ili humanizovano antitelo) predmetnog pronalaska koje sadrži svih 6 CDR sekvenci antitela proizvedenog pomoću hibridomske ćelijske linije deponovane kao PD12002.

[0140] Stečena aplastična anemija (AA) je retko stanje zatajenja koštane srži koje karakteriše hipocelularnost koštane srži i nizak broj perifernih krvnih ćelija [Young N.S. et al., 1997 N Eng J Med 336:1365-1372]. Slično drugim autoimunim bolestima, antigen-specifične T ćelije mogu da se prošire iz koštane srži od AA pacijenata i verovatno bi posredovale organ-specifičnu citotoksičnost na hematopoetske matične ćelije i progenitor ćelije [Nakao S. et al., Blood 1997, 89:3691-3699].

[0141] Diferencijalno eksprimirani geni, koji su isključivo pronađeni u T-ćelijama koje infiltriraju BM, su klasifikovani u nekoliko funkcionalnih kategorija. Ovi diferencijalno eksprimirani geni uključuju molekule uključene u imune odgovore kao PF-4, CD26, Ncf-1, CCR2 i druge hemokinske receptore i ligande. Štaviše, pretpostavljeno je da AA rezultira iz autoagresivnog uništenja hematopoetskih matičnih ćelija i progenitora posredovano T-ćelijama koje prepoznaju inicirajuće ciljne antigene [Young N.S. et al., 1997, iznad]. Nekoliko grupa je identifikovalo ekspanziju klonirane T-ćelije [Zeng W. et al., Blood 1999, 93(9):3008-3016; Zeng W. et al., J Clin Invest 2001, 108(5):765-773; Risitano A.M. et al., Blood 2002, 100(1): 178-183], proinflamatornu produkciju citokina [Maciejewski J.P. et al., Blood 1995, 85:3183-3190] i citotoksičnost posredovanu T-ćelijama prema CD34+ matičnim ćelijama [Nakao S. et al., 1997, gore; Maciejewski J.P., Selleri C., Sato T. et al., Br J Haematol 1995, 91:245-252] podržavajući T-ćelijski odgovor izazvan antigenom. Regulacija 483 gena takođe pokazuje da nedostatak koštane srži pre nastaje kao rezultat genetskog programa koji uključuje hemokine, citokine, faktore rasta, njihove receptore. Franzke i kolege identifikuju indukciju nekoliko molekula koji igraju ključne uloge u regulaciji Th1 imunih odgovora [Anke Franzke et al., BMC Genomics 2006, 7:263], kao što su CCR2 i CX3CR1 [Charo I.F. et al., Microcirculation 2003, 10(3-4):259-264;Fraticelli P. et al., J Clin Invest 2001, 107(9):1173-1181], koji su takođe važni u drugim autoimunim bolestima kao što je multipla skleroza [Lock C. et al., Nat Med 2002, 8(5):500-508; Jee Y. et al., J Neuroimmunol 2002, 128(1-2):49-57], i CD26, površinski vezane ektopeptidaze ekprimirane u visokom nivou na Th1 diferenciranim T-ćelijama [Dang N.H. et a/., Histol Histopathol 2002, 17(4):1213-1226; Willheim M. et al., J Allergy Clin Immunol 1997,100:348-255].

[0142] Iako se ne želi vezivanje ni za jednu teoriju, trenutno se pretpostavlja da antitelo predmetnog pronalaska sposobno za vezivanje za CD26, posebno sposobno za specifično vezivanje za CD26, posebno za humani CD26, može igrati kjučnu ulogu u imunopatogenezi AA i oporavku hematopoeze nakon imunosupresije.

[0143] Monoklonsko antitelo protiv CD26 antigena može se stoga koristiti za lečenje aplastične anemije (posebno kongenitalne ili stečene aplastične anemije), posebno teške aplastične anemije.

[0144] Izrazi "lečenje" i "prevencija" kako se koristi u ovoj prijavi mogu se posebno odnositi na na bilo koji tip lečenja ili prevencije koji donose korist subjektu pogođenom bolešću, poremećajem ili stanjem ili rizikom od razvijanja bolesti, poremećaja ili stanja, posebno najmanje jednom od Bolesti kalem protiv domaćina (GvHD) i Aplastičnom anemijom. Štaviše, izrazi "lečenje" i "prevencija" mogu se takođe odnositi na bilo koju vrstu lečenja ili prevencije koje donose korist osobi u pogledu kalemljenja nakon transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija. Korist koju daje lečenje ili prevencija može biti korist koja obezbeđuje poboljšanje stanja subjekta (na primer u jednom ili više simptoma), korist obezbeđivanja odlaganja napredovanja bolesti, poremećaja ili stanja koje se leči i/ili prevenira, korist odgađanja početka jednog ili više simptoma, korist ublažavanja bolesti, poremećaja ili stanja koje se leči i/ili prevenira i/ili korist omogućavanja sporijeg napredovanja simptoma, itd. Povrh toga, izrazi "lečenje" i "prevencija" kako se koristi u ovoj prijavi ne moraju nužno da podrazumevaju lečenje ili potpuno ukidanje simptoma.

[0145] Termin "kalem protiv domaćina" obuhvata akutnu i/ili hroničnu bolest kalem protiv domaćina, posebno Bolest kalem protiv domaćina nakon transplantacije hematopoetske matične ćelije. Termin "Aplastična anemija" obuhvata obe stečenu i kongenitalnu aplastičnu anemiju, kao i tešku aplastičnu anemiju.

[0146] Upotreba antitela predmetnog pronalaska može obezbediti lečenje i/ili prevenciju za humane subjekte, posebno za medicinske svrhe, i za životinjske subjekte, posebno za veterinarske i svrhe ispitivanja leka i svrhe razvoja. Pogodni životinjski subjekti uključuju sisare, kao što su na primer zečevi, primati, goveda, itd. Humani subjekti su najpoželjniji. Humani subjekti uključuju subjekte u neonatalnom dobu, bebe, mlade i odrasle subjekte. Izrazi "pacijent" i "subjekt" se ovde koriste naizmenično. Kako se ovde koristi, termin "pacijent" može da se odnosi na ljude, ali nije ograničen na ljude.

[0147] Prema drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži najmanje jedno antitelo predmetnog pronalaska (na primer jedno antitelo, ili dva ili više, ili tri ili više antitela predmetnog pronalaska) ili smešu antitela koja sadrži najmanje jedno antitelo predmetnog pronalaska ili izolovanu kompoziciju koja sadrži najmanje jedno antitelo predmetnog pronalaska, i po izboru najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipijens. U jednom tehničkom rešenju, farmaceutska kompozicija može da sadrži antitelo (npr, humano ili humanizovano antitelo) koje sadrži 6 CDR sekvenci antitela proizvedenog pomoću hibridomske ćelijske linije deponovane kao PD 12002. U drugom tehničkom rešenju, farmaceutska kompozicija može da sadrži antitelo (npr., himerno antitelo) koje sadrži VH i VL regione antitela proizvedenog pomoću hibridomske ćelijske linije deponovane kao PD 12002. U daljem tehničkom rešenju, farmaceutska kompozicija može da sadrži smešu antitela koja sadrži prvo antitelo predmetnog pronalaska, navedeno prvo antitelo koje sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 2 i/ili sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 3, posebno sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 3, i drugo antitelo predmetnog pronalaska, navedeno drugo antitelo koje sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 2. Prvo i drugo antitelo mogu biti različita antitela, posebno drugo antitelo može imati sekvencu amino kiselina, gde je najmanje jedan amino kiselinski ostatak izbrisan, umetnut ili zamenjen različitim amino kiselinskim ostatkom, u poređenju sa aminokiselinskom sekvencom prvog antitela. Farmaceutska kompozicija može da sadrži najmanje jedno antitelo predmetnog pronalaska, na primer antitelo predmetnog pronalaska ili smešu antitela, ili izolovanu kompoziciju predmetnog pronalaska, kao efikasan sastojak. Posebno, farmaceutska kompozicija može da sadrži najmanje jedno antitelo predmetnog pronalaska u količini efikasnoj za lečenje i/ili prevenciju najmanje jedne od Bolesti kalem protiv domaćina, poželjno nakon transplantacije hematopoetske matične ćelije, i Aplastične anemije, poželjno teške Aplastične anemij. Osim toga, farmaceutska kompozicija može da sadrži najmanje jedno antitelo predmetnog pronalaska u količini efikasnoj za podsticanje kalemljenja nakon transplantacije hematopoetske matične ćelije.

[0148] Farmaceutska kompozicija koja sadrži najmanje jedno antitelo predmetnog pronalaska je farmaceutska kompozicija za upotrebu kao lek. Posebno, farmaceutska kompozicija koja sadrži najmanje jedno antitelo predmetnog pronalaska je farmaceutska kompozicija za upotrebu u podsticanju kalemljenja nakon transplantacije hematopoetske matične ćelije, i/ili za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju Bolesti kalem protiv domaćina (GvHD), poželjno nakon transplantacije hematopoetske matične ćelije, i/ili za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji Aplastične anemije, poželjno Teške Aplastične anemije.

[0149] Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može po izboru da sadrži jedan ili više ekscipijenasa, poželjno farmaceutski prihvatljive ekscipiense, posebno jedan ili više razblaživača, poželjno farmaceutski prihvatljive razblaživače. Odgovarajući ekscipijens(i), posebno farmaceutski prihvatljivi ekscipiens(i), mogu biti izabrani od stručne osobe na osnovu opšteg znanja u oblasti i na osnovu razmatranja koja su data u ovoj prijavi. Razblaživač može biti na primer farmaceutski prihvatljiv rastvarač ili farmaceutski prihvatljiva smeša rastvarača, kao što je na primer voda. Primeri pogodnih ekscipijenasa, posebno razblaživača, dobro su poznati u oblasti i mogu biti birani od npr.grupe koja sadrži fluide koji sadrži farmaceutski prihvatljiv sistem za puferovanje, posebno rastvore koji sadrže farmaceutski prihvatljiv sistem za puferovanje, na primer slane rastvore fosfatnog pufera, vodu, slani rastvor, posebno fiziološki rastvor, emulzije, kao što su ulje/voda emulzije, jedan ili više agenasa za vlaženje, sterilne rastvore, itd. Farmaceutska kompozicija može takođe da sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatljiva nosača.

[0150] Prema jednom tehničkom rešenju, farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može da sadrži najmanje jedno antitelo predmetnog pronalaska, kao što je najmanje jedno npr. monoklonsko ili npr. murinsko ili npr. monoklonsko i murinsko anti-CD26 antitelo prema predmetnom pronalasku, i vodu i fosfatni pufer, poželjno pufer koji sadrži M'H2PO4i M"M"'HPO4, pri čemu M', M" i M'" mogu biti nezavisno izabrani od grupe koja se sastoji od Na i K. Ova farmaceutska kompozicija može po izboru da sadrži jedan ili više NaCl, KCl i smeše koje sadrže NaCl i KCl. Najmanje jedno antitelo predmetnog pronalaska može da sadrži ili se sastoji od antitela proizvedenih od depozita PD 12002 hibridoma ili najmanje jedno njegovo antitelo. Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može biti za intravensko davanje, posebno intravenska injekcija ili intravenska infuzija. U određenom tehničkom rešenju, farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može da sadrži ili se sastoji od antitela prozvedenog od depozita PD 12002 hibridoma i DPBS.

[0151] Prema jednom tehničkom rešenju, farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može da sadrži najmanje jedno antitelo predmetnog pronalaska, npr. monoklonsko antitelo anti CD26 prema predmetnom pronalasku, posebno prozvedeno od depozita PD 12002 hibridoma. U jednom tehničkom rešenju, farmaceutska kompozicija može da sadrži najmanje jedno antitelo predmetnog pronalaska, npr. proizvedeno od depozita PD 12002 hibridoma, jedan ili više kortikosteroida, jedan ili više antihistaminika i slani rastvor, npr. fiziološki rastvor (poseban slani rastvor koji sadrži 0.9% m/v NaCl). Posebno, ove vodene farmaceutske kompozicije mogu biti primenjene infuzijom, posebno sporom infuzijom, posebno intravenskom primenom.

[0152] U jednom tehničkom rešenju, farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska sadrži antitelo predmetnog pronalaska u rasponu koncentracija od 1 mg/ml do 10 mg/ml, 1 mg/ml do 50 mg/ml, 1 mg/ml do 100 mg/ml, 10 mg/ml do 100 mg/ml, ili 50 mg/ml do 100 mg/ml, Posebno tehničko rešenje, farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može da sadrži najmanje oko 1 mg/ml, najmanje oko 1 mg/ml, najmanje oko 5 mg/ml, najmanje oko 10 mg/ml, najmanje oko 20 mg/ml, najmanje oko 30 mg/ml, najmanje oko 40 mg/ml, najmanje oko 50 mg/ml, ili najmanje oko 100 mg/ml antitela predmetnog pronalaska.

[0153] U jednom tehničkom rešenju, farmaceutske kompozicije mogu da sadrže najmanje jedno antitelo predmetnog pronalaska u količini između 1 mg navedenog najmanje jednog antitela/m<2>površine tela na dan i 4.5 mg navedenog najmanje jednog antitela/m<2>površine tela na dan za primenu u lečenju i/ili prevenciji Bolesti kalem protiv domaćina ili mogu da sadrže najmanje jedno antitelo predmetnog pronalaska u količini između 1 mg navedenog najmanje jednog antitela/m<2>površine tela na dan i 2 mg navedenog najmanje jednog antitela/m<2>površine tela na dan za primenu u lečenju i/ili prevenciji Aplastične anemije. Štaviše, prema jednom tehničkom rešenju farmaceutske kompozicije mogu da sadrže trenutno poželjne opsege količina i količine najmanje jednog antitela predmetnog pronalaska kako je ovde razmatrano.

[0154] Termin "farmaceutski prihvatljiv" kako se ovde koristi može posebno da naznači da je "farmaceutski prihvatljivo" jedinjenje ili "farmaceutski prihvatljiva" kompozicija pogodna za davanje subjektu da se postigne izlečenje i/ili prevencija bolesti, poremećaja ili stanja, posebno najmanje jedne od Bolesti kalem protiv domaćina i Aplastične anemije ili da se postigne podsticanje kalemljenja nakon transplantacija hematopoetske matične ćelije, bez nepotrebno štetnih sporednih efekata u svetlu ozbiljnosti bolesti i neophodnosti lečenja.

[0155] Termin "efikasna količina" kako se ovde koristi može posebno ukazati na količinu najmanje jednog antitela predmetnog pronalaska, na primer antitela ili smeše antitela, dovoljnu da proizvede željeni efekat kod pacijenta koji je pogođen bolešću, poremećajem ili stanjem, posebno najmanje jednom od Bolesti kalem protiv domaćina i Aplastične anemije, ili da proizvede željeni efekat kod pacijenta uzimajući u obzir kalemljenje nakon transplantacija hematopoetske matične ćelije, uključujući poboljšanje stanja pacijenta (npr., kod jednog ili više simptoma), kašnjenje u progresiji bolesti, itd. Efikasna količina antitela ovde opisana može posebno da bude količina dovoljna da ublaži, obrne, stabilizuje, uspori i/ili odloži progresiju Bolesti kalem protiv domaćina i/ili Aplastične anemije.

[0156] Kao što je poznato u oblasti, efikasna količina, na primer, antitela prema predmetnom pronalasku može da varira, u zavisnosti od, između ostalog, istorije pacijenta, administracije u svrhu prevencije ili lečenja, ciljane indikacije (Bolest kalem protiv domaćina, Aplastična anemija, itd.), kao i drugih faktora, kao što je tip (i/ili doza) antitela.

[0157] Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može biti u čvrstom ili tečnom stanju i može biti, između ostalog, u obliku jednog ili više praškova, jedne ili više tabeleta, jednog ili više fluida, posebno jednog ili više rastvora, ili jednog ili više aerosola. Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može takođe da sadrži jedan ili više dopunskih biološki aktivnih agenasa, kao što je na primer aktivni agens(i) za primenu u lečenju i/ili prevenciji najmanje jedne Bolesti kalem protiv domaćina i Aplastične anemije ili aktivni agens(i) za podsticanje kalemljenja nakon transplantacije hematopoetske matične ćelije. Primena farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska može biti na primer primena izabrana od grupe koja se sastoji od intraperitonealne, intravenske, parenteralne, intrarenale, supkutane, topikalne, intrabronhijalne, intrapulmonalne i intranazalne primene i, po želji, za lokalno lečenje, intralezionalna primena. Parenteralna primena može biti na primer intraperitonealna, intradermalna, intramuskularna, supkutana, intravenska ili intraarterijalna primena. Kompozicije predmetnog pronalaska mogu takođe biti primenjene direktno na ciljno mesto, npr., putem biolističke isporuke na ciljno mesto, kao što je specifičan organ pogođen bolešću, poremećajem ili stanjem, posebno Bolešću kalem protiv domaćina.

[0158] Posebno, navedena primena može biti sprovedena injekcijom i/ili infuzijom i/ili isporukom, kao što je npr. intravenska ili intraperitonealna injekcija ili infuzija. Farmaceutska kompozicija može biti prisutna u obliku injektabilne dozne forme ili doznog oblika za primenu infuzijom, posebno u obliku injektabilne dozne forme za intravensku ili intraperitonealnu injekciju ili infuzionog doznog oblika za intravensku ili intraperitonealnu primenu.

[0159] Farmaceutska kompozicija, posebno farmaceutska kompozicija u obliku injekcione dozne forme, može da sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatljivih rastvarača, kao što je na primer voda, i/ili može biti u obliku fluida, na primer u obliku suspenzije, emulzije ili rastvora.

[0160] Farmaceutska kompozicija prema predmetnom pronalasku može takođe da sadrži konzervanse i druge aditive, kao što su na primer konzervansi i drugi aditivi izabrani od grupe koja se sastoji od antimikrobnih sredstava, antioksidanasa, helatnih agenasa, aktivnog agensa(agenasa) za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji najmanje jedne od Bolesti kalem protiv domaćina i Aplastične anemije ili aktivnog agensa(agenasa) za podsticanje kalemljenja nakon transplantacije hematopoetske matične ćelije i inertnih gasova i slično, i/ili proteinskih nosača, kao npr. serumski albumin ili imunoglobulin, posebno humanog porekla.

[0161] Farmaceutska kompozicija prema predmetnom pronalasku može biti administrirana subjektu u odgovarajućoj dozi. Dozni režim može biti na primer određen od strane lekara. Kao što je dobro poznato u oblasti, doze za pacijenta mogu zavisiti od mnogo faktora, kao što su veličina pacijenta, površina tela, starost, težina, primena u svrhu prevencije ili lečenja, ciljna indikacija (Bolest kalem protiv domaćina, Aplastična anemija, itd.), određeno jedinjenje koje se daje, opšte zdravstveno stanje, i drugi lekovi koji se primenjuju istovremeno. Prema jednom tehničkom rešenju, najmanje jedno antitelo predmetnog pronalaska (npr. jedno ili dva ili tri ili više antitela predmetnog pronalaska), posebno za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji Bolesti kalem protiv domaćina, može se primeniti na pacijenta u količini između 1 mg navedenog najmanje jednog antitela/m<2>površine tela na dan i 4.5 mg navedenog najmanje jednog antitela/m<2>površine tela na dan, posebno u količini između 2 mg navedenog najmanje jednog antitela/m<2>površine tela na dan i 4.5 mg navedenog najmanje jednog antitela/m<2>površine tela na dan. Posebno, količina od oko 2 mg navedenog najmanje jednog antitela/m<2>površine tela na dan ili količina od oko 3 mg navedenog najmanje jednog antitela/m<2>površine tela na dan ili količina od oko 4.5 mg navedenog najmanje jednog antitela/m<2>površine tela na dan može biti administrirana pacijentu. Najmanje jedno antitelo predmetnog pronalaska može biti prisutno u gore navedenim količinama u farmaceutskoj kompoziciji. Kako se ovde koristi, termin "najmanje jedno antitelo" obuhvata jedno antitelo ili dva ili više (npr. tri ili više) antitela.

[0162] Prema jednom tehničkom rešenju, farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može biti farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo proizvedeno pomoću depozita PD 12002 hibridomske ćelijske linije, i po izboru najmanje jednog farmaceutski prihvatljivog ekscipijensa.

[0163] Farmaceutska kompozicija može - prema jednom tehničkom rešenju - obuhvatiti antitela proizvedena od depozita PD 12002 hibridomske ćelijske linije, posebno za primenu u lečenju i/ili prevenciji Bolesti kalem protiv domaćina za primenu na pacijentu u količini između 1 mg navedenog antitela (proizvedenog od strane depozita PD 12002 hibridomske ćelijske linije)/m<2>površine tela na dan i 4.5 mg navedenog antitela (proizvedenog od strane depozita PD 12002 hibridomske ćelijske linije) /m<2>površine tela na dan, posebno u količini između 2 mg navedenog antitela (proizvedenog od strane depozita PD 12002 hibridomske ćelijske linije)/m<2>površine tela na dan i 4.5 mg navedenog antitela (proizvedenog od strane depozita PD 12002 hibridomske ćelijske linije)/m<2>površine tela na dan. Prema jednom tehničkom rešenju, količina od oko 2 mg navedenog antitela /m<2>površine tela na dan ili količina od oko 3 mg navedenog antitela /m<2>površine tela na dan ili količine od oko 4.5 mg navedenog antitela /m<2>površine tela na dan može biti administrirano pacijentu. Količine od: 2, 3, ili 4.5 mg antitela proizvedenog od strane depozita PD 12002 hibridomske ćelijske linije / m<2>površine tela na dan uspešno se koriste u kliničkom okruženju. Prema daljem tehničkom rešenju, farmaceutska kompozicija za primenu na pacijentu sadrži antitelo u količini između 0.1 i 10 mg/ m<2>površine tela na dan.

[0164] Prema jednom tehničkom rešenju, administracija farmaceutskih kompozicija predmetnog pronalaska je intravenska administracija, npr. intravenska infuzija ili intravenska injekcija. Po potrebi dodatno najmanje jedan imunosupresivni lek, npr. najmanje jedan imunosupresivni lek izabran od grupe koja se sastoji od kortikosteroida, i ciklosporina (posebno ciklosporin A) može biti administriran pacijentu, zajedno sa antitelom ili odvojeno.

[0165] Površina tela (Body surface area (BSA)) može biti izračunata prema bilo kojoj poznatoj metodi. Na primer, površina tela (BSA) pacijenta može biti izračunata prema Mosteller formuli od BSA (m<2>) = ([Visina (cm) x Masa (kg)]/3600)<1/2>(Mosteller R D., N Engl J Med 1987 Oct. 22; 317(17):1098, koji je ovde inkorporiran referencom) ili prema DuBois i DuBois formuli od BSA (m<2>) = 0.20247 x Visina (m)<0.725>x Masa (kg)<0.425>(DuBois D; DuBois E F., Arch Int Med 1916 17:863-71, koji je ovde inkorporiran referencom). Prema poželjnom tehničkom rešenju, Mosteller formula se koristi za izračunavanje površine tela (BSA) pacijenta.

[0166] Farmaceutska kompozicija za upotrebu u lečenju Aplastične anemije može da sadrži najmanje jedno antitelo predmetnog pronalaska, i po izboru najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipijens. Navedeno najmanje jedno antitelo (npr.jedno ili dva ili više antitela) predmetnog pronalaska može biti administrirano pacijentu u količini između 1 mg navedenog najmanje jednog antitela/m<2>površine tela na dan i 2 mg navedenog najmanje jednog antitela/m<2>površine tela na dan, posebno u količini od oko 2 mg navedenog najmanje jednog antitela/m<2>površine tela na dan za upotrebu u lečenju Aplastične anemije. Najmanje jedno antitelo predmetnog pronalaska može biti prisutno u farmaceutskoj kompoziciji u gore navedenim količinama ili rasponima količina. Posebno, farmaceutske kompozicije mogu biti primenjene intravenskom primenom, npr. infuzijom ili injekcijom. Po izboru, dodatno najmanje jedan imunosupresivni lek, posebno ciklosporin A, može biti administriran pacijentu, zajedno sa najmanje jednim antitelom ili odvojeno. Prema jednom tehničkom rešenju, farmaceutska kompozicija za upotrebu u lečenju Aplastične anemije može da sadrži antitelo proizvedeno pomoću depozita PD 12002 hibridomske ćelijske linije, i po izboru najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

[0167] Prema jednom tehničkom rešenju, antitelo proizvedeno pomoću depozita PD 12002 hibridomske ćelijske linije može biti primenjeno za upotrebu u lečenju Aplastične anemije kod pacijenta u količini između 1 mg navedenog antitela (proizvedeno pomoću depozita PD 12002 hibridomske ćelijske linije) /m<2>površine tela na dan i 2 mg navedenog antitela (proizvedeno pomoću depozita PD 12002 hibridomske ćelijske linije) /m<2>površine tela na dan, posebno u količini od oko 2 mg navedenog antitela (proizvedeno pomoću depozita PD 12002 hibridomske ćelijske linije) /m<2>površine tela na dan.

[0168] Pored toga, doze antitela predmetnog pronalaska ispod ili iznad gore naznačenih primera mogu biti primenjene, npr.za lečenje i/ili prevenciju najmanje jedne od Bolesti kalem protiv domaćina i Aplastične anemije ili za podsticanje kalemljenja nakon transplantacije hematopoetske matične ćelije, posebno uzimajući u obzir gore navedene faktore. Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može biti formulisana tako da bude kratko delujuća, brzo oslobađajuća, dugotrajno ili kontinuirano oslobađajuća.

[0169] Pored toga, farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može da sadrži dodatne biološki aktivne agense, u zavisnosti od nameravane upotrebe farmaceutske kompozicije.

[0170] Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može dodatno da sadrži najmanje jedan imunosupresivni lek, posebno efikasnu količinu najmanje jednog imunosupresivnog leka. Imunosupresivni lek može biti na primer najmanje jedan lek izabran od grupe koja se sastoji od kortikosteroida, posebno 6-metilprednizolona, i ciklosporina, posebno ciklosporina A. Pored toga, farmaceutska kompozicija može da sadrži kombinaciju terapije gde drugi aktivni sastojak nije uključen u istu kompoziciju kao anti-CD26 antitelo.

[0171] U jednom tehničkom rešenju, farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska (npr.za lečenje i/ili prevenciju najmanje jedne od Bolesti kalem protiv domaćina i Aplastične anemije ili za podsticanje kalemljenja nakon transplantacije hematopoetske matične ćelije) koja sadrži najmanje jedno antitelo predmetnog pronalaska, posebno smešu antitela predmetnog pronalaska, može da sadrži jedan ili više kortikosteroida, jedan ili više antihistaminika, vodu i natrijum hlorid. Posebno, farmaceutska kompozicija može dalje da sadrži jedan ili više kortikosteroida, jedan ili više antihistaminika i slani rastvor, npr. fiziološki rastvor (poseban slani rastvor koji sadrži oko 0.9%m/v NaCl). Naročito, ove vodene farmaceutske kompozicije mogu biti administrirane infuzijom, posebno sporom infuzijom, posebno intravenskom administracijom. Najmanje jedno antitelo predmetnog pronalaska, posebno antitela proizvedena pomoću depozita PD 12002 hibridomske ćelijske linije, jedan ili više kortikosteroida, jedan ili više antihistaminika, svaki pojedinačno ili u kombinaciji, poželjno mogu biti prisutni u terapijski efikasnoj količini. Posebno, farmaceutska kompozicija može da sadrži najmanje jedno antitelo predmetnog pronalaska u količini između 1 mg navedenog najmanje jednog antitela/m<2>površine tela na dan i 4.5 mg navedenog najmanje jednog antitela/m<2>površine tela na dan za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji Bolesti kalem protiv domaćina ili može da sadrži za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji Aplastične anemije najmanje jedno antitelo predmetnog pronalaska u količini između 1 mg navedenog najmanje jednog antitela/m<2>površine tela na dan i 2 mg navedenog najmanje jednog antitela/m<2>površine tela na dan. Pored toga, farmaceutska kompozicija može da sadrži trenutno poželjne opsege količina i količine najmanje jednog antitela predmetnog pronalaska, naročito smešu antitela kako je ovde diskutovano. Pored toga, farmaceutska kompozicija može da sadrži kombinaciju terapija gde drugi aktivni sastojak nije uključen u istu kompoziciju kao anti-CD26 antitelo.

[0172] Kortikosteroidi su dobro poznati u oblasti i mogu da sadrže posebno mineralokortikoide i glukokortikoide. Glukokortikoidi mogu biti anti-inflamatorni agensi. Kako se ovde koristi, termin kortikosteroidi može da uključuje steroide koji mogu biti posebno proizvedeni u kori nadbubrežnih žlezda kičmenjaka, kao što mogu obuhvatiti sintetičke kortikosteroide ili sintetičke ili prirodne kortikosteroidne analoge, uključujući jedinjenja koja oponašaju aktivnost prirodnih steroidnih hormona, kao što su npr. kortizon i hidrokortizon. Analozi kortikosteroida mogu posebno obuhvatiti sintetička ili prirodna hemijska jedinjenja koja po strukturi i/ili funkciji podsećaju na bilo koji od prirodnih steroida koje proizvodi kora nadbubrežne žlezde.

[0173] Jedan ili više kortikosteroida mogu biti izabrani od grupe koju čine alklometazon dipropionat, amcinonid, amcinafel, amcinafid, beklametazon, betametazon, betametazon dipropionat, betametazon valerat, klobetazon propionat, hloroprednizon, klokortelon, kortizol, kortizon, kortodokson, difluorozon diacetat, descinolon, desonid, defluprednat, dihidroksikortizon, dezoksimetazon, deksametazon, deflazakort, diflorason, diflorason diacetat, dihlorizon, estri betametazona, fluazakort, flucetonid, flukloronid, fludrotizon, fluorokortizon, flumetazon, flunisolid, fluocinonid, fluocinolon, fluocinolon acetonid, flukortolon, fluperolon, fluprednizolon, fluroandrenolon acetonid, fluocinolon acetonid, flurandrenolid, fluorometolon, flutikazon propionat, hidrokortizon, hidrokortizon butirat, hidrokortizon valerat, hidrokortamat, loteprendol, medrizon, meprednizon, metilprednizon, metilprednizolon, 6-metilprednizolon, mometazon fuorat, parametazon, parametazon acetat, prednizon, prednizolon, prednidon, prednikarbat, triamcinolon acetonid, triamcinolon heksakatonid, tiksokortol prednizolon, i triamcinolon, njihove farmaceutski prihvatljive soli, njihovi derivati, i njihove smeše.

[0174] Antihistaminici su poznati u oblasti i mogu biti posebni farmaceutski lekovi koji mogu da smanje ili se suprotstave dejstvu histamina. Posebno, antihistaminik može biti antagonist H1-receptora.

[0175] Jedan ili više antihistaminskih lekova mogu biti posebno izabrani od grupe koju čine astemizol, azelastin, buklizin, bromfeniramin, hlorfeniramin, cetirizin, klemastin, ciklizin, desloratidin, deksbromfeniramin, difenhidramin, doksilamin, ebastin, emedastin, epinastin, feksofenadin, hidroksizin, ketotifen, levokabastin, levocetirizin, loratidin, meksuitazin, mizolastin, olopatadin, oksatomid, fenindamin, feniramin, pirilamin, terfenidin, triprolidin, njihove farmaceutski prihvatljive soli, izomeri ili prolekovi.

[0176] Prema drugom aspektu, predmetni pronalazako bezbeđuje komplet koji sadrži: (i) najmanje jedno antitelo predmetnog pronalaska, posebno smešu antitela ili kompoziciju koja sadrži smešu antitela; i dodatno (ii) a) najmanje jedan imunosupresivni lek, npr. najmanje jedan imunosupresivni lek izabran od grupe koja se sastoji od kortikosteroida, i ciklosporina, posebno ciklosporin A ili b) najmanje jedan kortikosteroid i najmanje jedan antihistaminik. Najmanje jedno antitelo može da sadrži ili se sastoji od antitela prodizvedenog pomoću depozita PD 12002 hibridomske ćelijske linije. Posebno, komplet može da sadrži najmanje jedno antitelo predmetnog pronalaska u količini između 1 mg navedenog najmanje jednog antitela/m<2>površine tela na dan i 4.5 mg navedenog najmanje jednog antitela/m<2>površine tela na dan za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji Bolesti kalem protiv domaćina ili može da sadrži za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji Aplastične anemije najmanje jedno antitelo predmetnog pronalaska u količini 1 mg navedenog najmanje jednog antitela/m<2>površine tela na dan i 2 mg navedenog najmanje jednog antitela/m<2>površine tela na dan. Pored toga, farmaceutska kompozicija može da sadrži trenutno poželjne opsege količina i količine najmanje jednog antitela predmetnog pronalaska kao što je ovde diskutovano.

[0177] Komplet može biti komplet za upotrebu kao lek, posebno komplet za prevenciju i/ili lečenje Bolesti kalem protiv domaćina (GvHD), poželjno nakon transplantacije hematopoetske matične ćelije, i/ili komplet za upotrebu u lečenju Aplastične anemije, poželjno Teške Aplastične anemije, i/ili komplet za podsticanje kalemljenja nakon transplantacije hematopoetske matične ćelije. Izrazi komplet delova i komplet se ovde koriste naizmenično.

[0178] In vivo i in vitro proizvodnja antitela predmetnog pronalaska u transgenim životinjama, dobijenim genetskom manipulacijom nehumanih životinja, posebno nehumanih sisara, koristeći najmanje jednu od sekvenci nukleotida opisanih u predmetnom pronalasku metodama poznatim stručnjaku iz oblasti, takođe je obuhvaćena obimom ovog pronalaska.

[0179] U nastavku, predmetni pronalazak će biti detaljnije opisan u odnosu na sledeće neograničavajuće primere. Međutim, razume se da ovaj predmetni pronalazak nije ograničen sledećim primerima.

PRIMERI

Primer 1

Određivanje sekvenci nukleotida

[0180] Ovaj proces se može sažeti u tri faze:

Faza I- Kloniranje gena koji kodiraju lance antitela

[0181]

• Ekstrakcija ukupne RNK iz ćelija hibridoma koje proizvode CDina26 (depozit hibridomske ćelijske linije pod referentnim PD 12002, videti gore);

• Reverzna transripcija;

• Pojačanje gena od interesa upotrebom specifičnih oligonukleotida kao prajmera;

• Kloniranje gena upotrebom prokariotskog vektora;

• Bakterijska transformacija;

• Kontrola postupka kloniranja, birajući odgovarajuće transformisane klonove.

Faza II-Sekvenciranje gena koji kodiraju varijabilne lance antitela i bioinformatička analiza:

[0182]

• Sakupljanje i sekvenciranje 100 kolonija za i VH i VL lance;

• Bioinformatička analiza sekvenci;

• Generisanje konseznusne sekvence, ako je potrebno, za VL i VH lance i indikacija različitih baza konsenzusne sekvence i njihovog procenta.

Faza III-Sekvenciranje gena koji kodiraju Konstantne lance antitela:

[0183]

• Sekvenciranje odgovarajućeg CL lanca za VL lanac;

• Sekvenciranje odgovarajućeg lanca CH1-CH2-CH3 za VH lanac.

[0184] Rezultati pokazuju prisustvo u iRNK uzorcima tri grupe sekvenci VL lanca (VL grupa 1, VL grupa 2 i VL grupa 3) i dve grupe sekvenci VH lanca (VH grupa 1 i VH grupa 2).

Određivanje sekvence amino kiselina

[0185] Analiza Masene spektrometrije i N-terminalno sekvenciranje su korišćeni da potvrde aminokiselinsku sekvencu prisutnu u CDina26 uzorku. U CDina26 uzorku je potvrđeno prisustvo VL grupe 1 i njene srodne CL sekvence, lanca VL grupe 3 i VH grupe 1 vezano za njen CH1-CH2-CH3 lanac. Ni sekvence VL grupe 2 ni sekvence VH grupe 2 nisu detektovane kao aminokiselinske sekvence u uzorku CDina26 antitela.

Primer 2

CDina26 vezivanje za humani i svinjski CD26

[0186] Vezivanje CDina26 za humani CD26 upoređeno je sa njegovim vezivanjem za CD26 minisvinje pomoću Biacore® testa i multiparametrijske protočne citometrije. CDina26 nije u stanju da prepozna Svinjski Antigen ni kao rastvorljiv protein ni kao transmembranski protein eksprimiran na T limfocitima.

1. Protočna citometrijska analiza je korišćena da bi se odredila sposobnost CDina26 da se veže za eksprimirani CD26 na ćelijskoj površini.

Limfociti su izolovani iz humanih ili uzoraka periferne krvi minisvinja centrifugiranjem u gradijentu gustine. Vezivanje CDina26 za humane T Limfocite je analizirano multiparametrijskom protočnom citometrijom.

Više od 45% Humanih T limfocita koji eksprimiraju CD3 marker se vezuje za CDina26. Nasuprot tome samo 2% svinjskih T limfocita koji eksprimiraju CD3 marker se vezuje za CDina26. Ovo se može videti na SL.9.

2. Vezivanje CDina26 bilo za Humani ili Svinjski Antigen (kupljeno od Sigma CAT# D4943 i D 7052) analizirano je pomoću Biacore®.

CDina26 je uhvaćen na matrici pomoću poliklonskog anti-mišjeg Ig antitela prethodno imobilisanog na protočnoj ćeliji Biacore® T100 senzorskog čipa. Bilo Humani bilo Svinjski Antigen su ubrizgani u rastvor preko imobilisanog CDina26.

Humani antigen, injektiran u dve koncentracije preko imobilisanog CDina26, dao je dozno zavisni odgovor sa visokim afinitetom vezivanje, što je pokazano kinetičkom brzinom disocijacije od 2.8 x 10<-5>s<-1>.

Svinjski antigen, injektiran preko imobilisanog CDina26, nije dao vezivanje.

[0187] Sl. 11 pokazuje vezivanje Humanog (levog) i Svinjskog (desnog) Antigena (Ag) na zarobljenom CDina26, mereno u Biacore® Rezonantnim Jedinicama (Resonance Units (RU)).

Primer 3

Proizvodnja Antitela

[0188] CDina26 je proizveden pomoću depozita hibridomske ćelijske linije sa CBA-ICLC Đenova (Italija) pod referentnim PD 12002. Hibridomi se mogu kultivisati u medijumu bez seruma. CDina26 sadrži smešu murinskog antitela. Posebno, CDina26 sadrži murinsko, monoklonsko antitelo, koje je IgG 2B klase i specifično se vezuje za humani CD26.

[0189] Farmaceutska kompozicija koja sadrži CDina26 je prisutna u obliku bistrog bezbojnog rastvora koji sadrži CDina26, čiji rastvor se može koristiti za intravensku infuziju (npr. 1 mg CDina26/1 ml rastvora; rastvor se može nalaziti u bočici).

Primer 4

Farmakodinamička in vitro studija

[0190] In vitro farmakodinamičke studije su izvedene radi karakterizacije murinskog monoklonskog antitela protiv CD26, posebno radi karakterizacije antitela koja su proizvedena depozitom PD 12002 hibridomske ćelijske linije, naznačen ovde kao CDina26. Cilj ovih studija je bio da se proceni eksprimiranje i specifično vezivanje za CD26 na površini ćelijske populacije uključene u imuni odgovor, posebno:

• T limfocita

• B limfocita

• Prirodnih Ćelija ubica (NK (natural killer))

• Monocita

• Dendritskih ćelija

Primer 4a

[0191] Eksprimiranje CDina26 antigena je procenjeno u mirnim T, B i NK ćelijama (T0) koje su prečišćene iz 5 zdravih donora (što odgovara sa "ESP.1" do "ESP.5" u Tabeli 1) a zatim u ćelijama aktiviranim preko alogenih stimulusa (mešana limfocitna kultura - mixed lymphocyte culture (MLC)), mitogenskih stimulusa (fitohemaglutinin - phytohemagglutinin (PHA)) ili antigenskih stimulusa (Candida albicans).

[0192] U ovoj prijavi, skraćenica MFIR se koristi kao skraćenica za srednji relativni intenzitet fluorescencije (mean Relative Fluorescence Intensity) kao što je poznato u oblasti.

[0193] Kao što se može videti iz Tabele 1, eksprimiranje CD26 na aktiviranom limfocitu pokazala je povećan procenat CD26+ćelija nakon stimulacije sa PHA u poređenju sa T0sa izuzetkom T CD3+CD4+ i T CD3+CD8+ u eksperimentu broj 1 ("ESP 1"). Nivo eksprimiranja (vrednost indeksa MFRI) varirao je među različitim T, B i NK subpopulacijama i 5 zdravih dobrovoljaca. Osim toga, čini se da mitogeni stimulusi umereno povećavaju vrednosti MFIR (Tabela 1).

Primer 4b

[0194] Analiza rezultata prikazanih u Tabeli 2 pokazala je da u svim analiziranim podskupovima, sa izuzetkom CD3 CD4 T subpopulacija svih zdravih dobrovoljaca, postoji porast u procentu limfocita koji eksprimiraju antigen CDina26 nakon antigenskih stimulusa.

[0195] U svim eksperimentima, osim jednog ("ESP.5"), postoji povećanje vrednosti MFIR. Može se takođe primetiti da je povećanje vrednosti MFIR u poređenju sa vremenom 0 veće u kulturama stimulisanim sa Kandidom od onih stimulisanih sa PHA. Stimulacija Candida antigenom značajno povećava eksprimiranje CD26 molekula na ćelijskoj membrani, posebno u subpopulacijama T CD3 CD16+ i T CD56 CD3 .

Primer 4c

[0196] Tabela 3 pokazuje da je u svim eksperimentima, procenat limfocita pozitivnih na CDina26 antigen povećan u svim subpopulacijama limfocita prisutnim nakon stimulacije sa mešanom limfocitnom kulturom sa izuzetkom CD3 CD4 T subpopulacije.

[0197] MFIR indeks je povećan nakon stimulacije u poređenju sa vremenom 0 u svim podskupovima i svim eksperimentima, sa izuzetkom subpopulacije CD4 CD3 T u eksperimentima broj 2 ("ESP.2") i broj 5 ("ESP.5").

[0198] Slično stimulaciji sa Kandidom, alogena stimulacija stalno povećava ekspresiju CDina26 antigena i MFIR indeksa na većini subpopulacija limfocita. Značajno povećanje opaženo je uglavnom u subpopulacijama CD16 CD3 T i CD56 CD3 T eksperiment broj 3 ("ESP.3").

Primer 4d

[0199] Konačno, ispitivano je eksprimiranje CDina26 antigena na subpopulacijama leukocita kod pacijenata nakon alo-HSCT. Posebno, dva pacijenta su procenjena tokom ranih testova za praćenje imunološke rekonstrukcije nakon transplantacije, dok četiri pacijenta koja su razvila akutnu GvHD, bilo je moguće sprovesti procenu i tokom početka GvHD i nakon rezolucije. U poređenju sa kontrolama, pacijenti su pokazali veoma varijabilnu distribuciju T, NK i B subpopulacija (Tabela 4), koja je kompatibilna sa procesom hematopoetske rekonstrukcije koja se javlja u mesecima nakon transplantacije.

Tabela 4

[0200] Analizom procenta CD26 (Tabela 5) kod svih pacijenata došlo je do povećanje ekspresije ovog molekula u subpopulacijama T CD16 CD3 i T CD56 CD3 i NK u poređenju sa kontrolnim opsegom.

Tabela 5

[0201] Kod pacijenata koji su razvili aGvHD, u nekim slučajevima, vrednost procenta je veća nego kod dva pacijenta bez ove komplikacije (CK, IP). DF pacijent je pokazao značajno veće procente CD26 u svim podskupovima, indeks ćelijske aktivacije je bio veoma izražen i nije bilo moguće proceniti indeks molekula CD26 MFIR.

[0202] Kod dva pacijenta koji nisu razvili aGvHD, indeks je pokazao da vrednosti MFIR padaju u opsegu kontrole, dok su kod tri pacijenta sa aGvHD u toku, MFIR vrednosti bile povećane u skoro svim podskupovima, i posebno u sub-T CD3 CD16 i CD3 T CD56 (Tabela 6).

Tabela 6

Primer 4e

[0203] Ekspresija CD26 je takođe proučavana na mezenhimalnim matičnim ćelijama, endotelijalnim ćelijama i fibroblastima.

[0204] Postavljena su tri eksperimenta koristeći Mezenhimalne Matične Ćelije (MSCs), razmnožene in vitro dobijene iz koštane srži od tri zdrave odrasle osobe. Analiza protočnom citometrijom pokazala je da su ćelije pozitivne na CD13 i CD73, markeri karakteristični za MSC-ove su, međutim, negativni za ekspresiju CD26 (CDina26 antigen). Postavljena su tri eksperimenta koristeći endotelne ćelije (DC) iz pupčane vrpce tri zdrava subjekta. Endotelne ćelije su negativne za ekspresiju CD26 (CDina26 antigen).

[0205] Postavljena su tri eksperimenta korišćenjem fibroblasta kože dobijenih od tri zdrave odrasle osobe. Analiza protočnom citometrijom pokazala je da 40% fibroblasta eksprimira CD26 (opseg 32%-45%) sa MFIR indeksom od 4 do 13.

[0206] Postavljena su tri eksperimenta korišćenjem dendritskih ćelija diferenciranih in vitro. Analiza protočnom citometrijom pokazala je da su ćelije pozitivne na CD1a, marker karakterističan za DC diferencirane in vitro, ali su međutim, negativne za ekspresiju CD26.

[0207] Protočna citometrija je pokazala da su ćelije monocita pozitivne na CD14 pozitivne i za ekspresiju CD26 (opseg 97%-100%), MFIR varijabilni indeks od 1 do 17.

[0208] Ovi podaci pokazuju da su subpopulacije T i NK povećale i procenat i ekspresiju antigena CDina26 (MFIR) na površini ćelijske membrane.

[0209] Kod pacijenata sa aGvHD povećana ekspresija CD26 može se primetiti u T CD3+CD16+, T CD3+CD56+ i NK u poređenju sa zdravim donorima.

[0210] Ovi podaci sumiraju sposobnost monoklonskih antitela anti CD26 od CDina26 da se specifično vežu za aktivirane regulatorne T ćelije, ometajući njihovo širenje i njihovu ulogu u modulaciji imunog odgovora u aGvHD.

Primer 5

Kliničke Studije: Lečenje Bolesti kalem protiv domaćina (GvHD)

[0211] Sprovedena je klinička studija za utvrđivanje sigurnosti i efikasnosti CDina26 kod pacijenta sa aGvHD (akutna Graft-versus-Host Disease).

Rezime

[0212] Pacijenti uključeni u studiju primili su fiksnu dozu CDina26 od 2 mg/dan (što odgovara proseku od 1,11 mg/m<2>dnevno) tokom 5 uzastopnih dana. Kompozicija koja se daje pacijentima uključuje antitelo ovog predmetnog pronalaska u rasponu između 2 i 10 mg u odnosu na površinu tela rastvoreno u 100ml sterilnog slanog rastvora zajedno sa kortikosteroidima i antihistaminikom. Pacijenti su nastavili sa primanjem svog standardnog GvHD tretmana (6-metilprednizolon 1-2mg/kg/dan i.v., i ciklosporin). Podržavajuća nega bila je konvencionalna antibakterijska, antifungalna i antivirusna terapija. U ovoj prijavi, jedinice mg/m<2>i mg/(m<2>površina tela) se koriste neizmenično.

[0213] Glavna procena ove studije bila je učestalost pacijenata koji su "reagovali" na ispitivani tretman, procenjena na dan 10 nakon 5 dana terapije.

[0214] Definicija reagovanja je zasnovana na sledećim kriterijumima:

• KOMPLETAN ODGOVOR (COMPLETE RESPONSE (CR) → Rezolucija svih znakova GvHD

• PARCIJALNI ODGOVOR (PR) → poboljšanje u gradiranju GvHD

• STABILNOST → nema promene u gradiranju GvHD

• POGORŠANJE → pogoršanje u gradiranju GvHD

[0215] Pacijenti sa kompletnim ili parcijalnim delimičnim odgovorom se smatraju onim koji reaguju.

Tabela 7

Tabela 8

[0216] Status izvođenja Istočne Kooperativne Onkološke grupe (ECOG Eastern Cooperative Oncology Grupa):

Dodatne procene uključuju sledeće:

• rangiranje GvHD, organ za organ (Ova procena se vrši na dan 10 i dan 30.);

• pojava komplikacija kao što su: infekcija, krvarenje, neophodnost transfuzije (Ova procena se vrši do kraja hospitalizacije na dan 30.);

• prilikom posete nakon godinu dana, sledeći parametri se evidentiraju: status preživljavanja, Karnofski indeks, hronična GvHD, mogući relaps hematološke bolesti za koju je izvršena transplantacija, mogući pojava novog tumora.

Demografske i Druge Osnovne Karakteristike

[0217] Jedanaest pacijenata je uključeno u skup podataka za procenu efikasnosti. Sedam pacijenata je imalo stepen III aGvHD, jedan pacijent je imao IV stepen GvHD i jedan pacijent je imao II stepen GvHD.

Srednje vreme do početka aGvHD je bilo 10 dana (raspon 4-73 dana).

Svi ovi pacijenti su imali aGvHD i bili su izloženi visokom riziku zbog uključivanja visceralnih organa.

[0218] Procena Efikasnosti: učestalost pacijenata koji "reaguju" na 2 mg CDina26 i.v. dnevno, administrirano tokom pet uzastopnih dana, na trenutnom srednjem praćenju od 433 dana je 11 na 12 (90%): šest (6) kompletnih odgovora, pet (5) delimičnih odgovora i jedan (1) bez odgovora.

[0219] Praćenje podataka kod četiri pacijenta (pt.01, 03, 12, 14) u Glucksberg gradiranju akutne GvHD. Sledeće skraćenice se koriste u narednoj Tabeli:

pre CDina26 označava stepen GvHD pacijenata pre tretmana sa CDina26; najbolji CDina26 označava najbolju vrednost stepena GvHD pacijenta nakon tretmana sa CDina26; konačni CDina26 označava najskoriju vrednost stepena GvHD pacijenta; Vrednosti praćenja predstavljaju dane nakon tretmana sa CDina26.

Tabela 9

[0220] Slika 4a pokazuje gradiranje GvHD Kože, dan 1, 10, 30 i poslednji dan ("poslednji" na Sl.

4a) pacijenta u studiji. Slika 4b prikazuje gradiranje GvHD Jetre, dan 1, 10, 30 i poslednji dan pacijenta u studiji. Slika 4c pokazuje gradiranje GvHD Creva, dan 1, 10, 30 i poslednji dan pacijenta u studiji.

Imunološki oporavak

[0221] Imunodeficijencija je uobičajena kod pacijenata sa akutnom GvHD, posebno nakon dugotrajnog lečenja steroidima, a infekcije su posledica jake kombinovane imunodeficijencije. SL.

5 ukazuje na apsolutno CD4 brojanje kod 6 pacijenata. CD4 brojanje ima tendenciju povećanja ili ostaje u suštini stabilno nakon CDina26 terapije, umesto da pokazuje pad, kao što bi se očekivalo u slučaju jake citolitičke aktivnosti antitela. Jedinica "brojanje/ul" označava brojanje po mikrolitru krvi pacijenta.

Kratak pregled neželjenih događaja

[0222] Sigurnost CDina26 je ispitivana kroz pregled neželjenih događaja. Ozbiljne toksičnosti koje uključuju hematološki i respiratorni sistem smatrane su očekivanim posledicama režima kondicioniranja i transplantacijskog procesa. Ukupno 8 ozbiljnih i 26 ne tako ozbiljnih neželjenih događaja prijavljeno je kao da nisu povezani sa CDina26 tretmanom. Najčešće prijavljivani neželjeni događaji su se odnosili na Klase Sistema Organa SOCs (System Organ Classes) "Infekcije i infestacije" (n=5), "Bubrežni i urinarni poremećaji" (n=5), "Respiratorni, torakalni i medijastinalni poremećaji" (n=5) i "Poremećaji kože i podkožnog tkiva" (n=4).

Infekcije su česta komplikacija terapije akutne GvHD i steroidne terapije. Zbog toga nije bilo neočekivano videti brojne epizode infekcije kod pacijenata.

[0223] Osam fatalnih neželjenih događaja dogodilo se nakon Dana 100. Nijedno od njih se nije smatralo povezanim sa tretmanom sa CDina26.

[0224] Zbog činjenice da akutna Bolest kalem protiv domaćina rezistentna na steroide nakon alogene transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija je povezana sa visokom stopom smrtnosti, procenjena je smrtnost povezana sa transplantacijom (smrt usled komplikacija povezanih sa transplantacijom, od kojih je većina povezana sa aGvHD).

Uzimajući u obzir sve pacijente koji su tretirani sa CDina26 incidenca smrtnosti povezana sa transplantacijom (Transplant Related Mortality (TRM)) nakon 6 meseci od tretmana je 25% (3 od 12). Među TRM, dva pacijenta su umrla od GvHD. Nijedno od njih nije bilo povezano sa tretmanom sa CDina26.

Slika 6 prikazuje predviđenu kumulativnu učestalost smrtnosti koja je povezana sa transplantacijom kod 13 kontrolnih pacijenata sa stepenom III-IV akutne GvHD, tretiranih steroidima, ciklosporinom i drugim imunosupresivnim lekovima, u poređenju sa 9 pacijenata tretiranih steroidima ciklosporinom i CDina26.

Kumulativna učestalost smrtnosti povezane sa transplantacijom kod 9 pacijenata koji su primali CDina26 trenutno je 12%, u poređenju sa 62% za uparene kontrole koje ne primaju CDina26 (p=0.02) .

Slika 7 prikazuje predviđeno aktuarsko preživljavanje 13 kontrolnih pacijenata sa stepenom III-IV akutne GvHD, tretiranih sa steroidima, ciklosporinom i drugim imunosupresivnim lekovima, u poređenju sa 9 pacijenata tretiranih steroidima, ciklosporinom i CDina26. Vrednost p je 0,2.

[0225] U zaključku, pacijenti sa CDina26 pokazuju manju smrtnost nego pacijenti bez CDina26, tj. pacijenti koji nisu tretirani sa CDina26.

Zaključci

[0226] Rezultati terapije murinskim monoklonskim antitelom protiv CD26 za steroidnu refraktornu akutnu GvHD kod 11 pacijenata bili su izuzetno ohrabrujući, kako u smislu odgovora tako i preživljavanja. S obzirom na nedostatak bilo koje efikasne terapijske mere u ovim okolnostima, i s obzirom na nedostatak bilo kakvog poboljšanja u terapiji i ishodu u protekle 3 decenije CDina26 je rezultirala visokom stopom odgovora i visokim udelom preživelih pacijenata. Treba istaći da je transplantacijska smrtnost (transplant mortality (TRM)) direktno pripisana transplantaciji, njena komplikacija je 62% za kontrolne pacijente sa GvHD III-IV koji ne primaju murinsko monoklonsko antitelo protiv CD26, i 25% za pacijente koji primaju CDina26. Smatramo da su ovi rezultati veoma obećavajući za kliničare.

Primer 6

[0227] Farmaceutska kompozicija koja sadrži najmanje jedno antitelo ovog predmetnog pronalaska, posebno sadrži antitela proizvedena pomoću PD 12002 depozita hibridomske ćelijske linije, CDina26, ima na primer sledeći sastav:

Tabela 10

Komponenta Količina po

[0228] Ova farmaceutska kompozicija može biti primenjena posebno intravenskom injekcijom.

Primer 7

Lečenje Teške aplastične anemije (SAA-Severe aplastic anemia)

[0229] Jedan pacijent sa stečenom SAA razvio je pancitopeniju nakon alogene HSCT. Pacijent je imao mešani CD3 himerizam (37% autologni) koji ukazuje na postojanost auto-agresivnih T ćelija, uzrokujući aplaziju. Donorski himerizam na ćelijama koštane srži bio je 100% donorski. Pacijent je primio tok anti-CD26 monoklonskih antitela CDina26, 2 mg/dan i.v. (2 mg CDina26 obezbeđeno u obliku rastvora za intravensku primenu) tokom 5 dana, ambulantno, u Dnevnoj Bolnici. Lečenje je dobro tolerisano bez neželjenih efekata.

[0230] Rezultati krvi pacijenta nakon lečenja su sledeći:

[0231] Tokom pet dana izvršen je tretman sa anti-CD26 antitelima.

[0232] (Rezultati krvi su dobijeni 87 dana nakon lečenja, tj. skoro 3 meseca nakon lečenja, sa anti-CD26 antitelom). Korišćene su sledeće skraćenice: Hb (Hemoglobin), WBC (Bela krvna zrnca -White Blood Cells), Pt (krvne pločice - Platelet). Gore navedeni podaci pokazuju da inhibicija CD26 može biti korisna kod pacijenata sa stečenom SAA, zbog njegovog imunomodulatornog efekta, i uloge u udomljavanju matičnih ćelija.

Primer 8

Mapiranje PD 12002 epitopa

[0233] Epitopi koje prepoznaje CDina26 antitelo proizvedeno pomoću hibridomske ćelijske linije deponovane kao PD 12002 identifikovani su sa CLIPS™ tehnologijom za mapiranje epitopa. Videti, npr., US 7863239 i US 7972993, predmetne objave ovde inkorporirane referencom u celini. Ukratko, CLIPS™ tehnologija strukturno fiksira peptide u definisane trodimenzionalne strukture. To dovodi do funkcionalne imitacije čak i najsloženijih mesta vezivanja. Reakcija CLIPS™ odvija se između bromo grupa CLIPS™ skele i tiol bočnih lanaca cisteina. Reakcija je brza i specifična u blagim uslovima (Timmerman et al., J. Mol. Recognit.2007; 20: 283-29).

[0234] Skeniranje CLIPS™ biblioteke počinje sa konverzijom humanog CD26 ciljnog proteina u biblioteku preklapajućih peptidnih konstruktora, koristeći konstrukciju kombinatorne matrice. Na čvrstom nosaču, sintetiše se matrica linearnih peptida, koja se kasnije oblikuje u prostorno definisane CLIPS™ konstrukte. Konstrukti koji predstavljaju nekoliko delova diskontinuiranog epitopa u ispravnoj konformaciji vezuju antitelo sa visokim afinitetom, što je detektovano i kvantifikovano. Konstrukti koji predstavljaju nepotpun epitop vezuju antitelo sa nižim afinitetom, dok konstrukti koji ne sadrže epitop uopšte ne. Informacije o afinitetu se koriste u iterativnim ekranima da bi se detaljno definisala sekvenca i konformacija epitopa.

[0235] Prvo, domen za vezivanje adenozin deaminaze (ostataci 356 do 522 od SEQ ID NO: 144) od humane CD26 proteinske sekvence je izabran za dublju analizu. Ovaj region od CD26 je proširen i podeljen u dva preklapajuća domena, od ostataka 260 do 400, i 380 do 538 od SEQ ID NO: 144. Testovi kompetitivnog vezivanja su pokazali da CDina26 prepoznaje epitop lokalizovan blizu ostatka R358 od humanog CD26 (SEQ ID NO: 144).

[0236] Drugo, ukupno je sintetisano 5833 preklapajućih peptida od CD26 i testirano na specifično vezivanje sa CDina26. Analiza linearnih peptida identifikovala je više regiona koji su specifično prepoznati od strane CDina26. Četiri regiona od CD26 su pokazala značajno vezivanje:

WWSPNGTFLAYAQ (SEQ ID NO: 148 koja odgovara ostacima 215 do 227 od SEQ ID NO: 144),

QLRCSGPGLPLYTLH (SEQ ID NO: 149 koja odgovara ostacima 466 do 483 od SEQ ID NO: 144)

LNETKFWYQMILP (SEQ ID NO: 150 koja odgovara ostacima 519 do 531 od SEQ ID NO: 144)

MGFVDNKRIAIWGWSY (SEQ ID NO: 151 koja odgovara ostacima 616 do 631 od SEQ ID NO: 144)

[0237] Ova 4 regiona od CD26 izgleda da su razmaknuti na objavljenoj kristalnoj strukturi i stoga ne moraju svi da formiraju jedan diskontinuirani epitop za CDina26. Osim toga, na osnovu objavljene kristalne strukture CD26, čini se da su 3 od 4 regiona gotovo potpuno zatvorena unutar CD26. Izuzetak je WWSPNGTFLAYAQ (SEQ ID NO: 148), koji je izložen na površini najmanje na PNGTF (SEQ ID NO: 152 koja odgovara ostacima 218 do 222 od SEQ ID NO: 144) ostacima.

[0238] Treće, tri posebna površinska regiona od CD26 su odabrana za analizu diskontinuiranih epitopa. Matrica 1 pokriva katalitičko područje i N-terminalne regione u blizini katalitičke oblasti (koja odgovara ostacima 260 do 400 od SEQ ID NO: 144). Matrica 2 pokriva katalitičko područje i C-terminalne regione u blizini katalitičke oblasti koja se delimično preklapa sa matricom 1 skupa (koja odgovara ostacima 380 do 538 od SEQ ID NO: 144). Konačno, Matrica 3 pokriva specifičnu ispupčenu petlju od CD26, koja formira imuno-dominantnu strukturu (koja odgovara ostacima 226 do 252 od SEQ ID NO: 144).

U poređenju sa linearnim peptidima, diskontinuirani peptidi su pokazali relativno niže signale, ali su signali bili konzistentniji. Kada su rezultati dobijeni sa sve tri matrice uzeti zajedno, identifikovano je više CDina26 vezujućih regiona od CD26.

[0239] Matrica 3, koja se fokusirala na ispupčenu petlju CD26 koja odgovara ostacima 226 do 252 od SEQ ID NO: 144, nije identifikovala ni jedan region sa značajnim CDina26 vezivanjem.

[0240] Matrica 1 (N-kraj regiona fokusa koji odgovara ostacima 260 do 400 od SEQ ID NO: 144) daje 3 CDina26 vezujuća regiona:

DYDESSGRWNCLVAR (SEQ ID NO: 146 koja odgovara ostacima 329 do 343 od SEQ ID NO: 144).

DVTWATQERISLQWL (SEQ ID NO: 147 koja odgovara ostacima 302 do 316 od SEQ ID NO: 144)

TTGWVGRFRPSEPHF (SEQ ID NO: 153 koja odgovara ostacima 350 do 364 od SEQ ID NO: 144)

[0241] Najjače vezivanje je zabeleženo za DYDESSGRWNCLVAR (SEQ ID NO: 146). Kada su razmatrani samo peptidi koji sadrže DYDESSGRWNCLVAR (SEQ ID NO: 146), najbolji vezujući peptidi su bili oni koji su takođe obuhvatili RFRPSEPHF (SEQ ID NO: 154 koja odgovara ostacima 356 do 364 od SEQ ID NO: 144). RFRPSEPHF (SEQ ID NO: 154) uključuje specifičan R358 ostatak naveden gore. Specifični aditivni efekat na vezivanje je bio konzistentan sa CDina26 antitelom koje cilja diskontinuirani epitop koji uključuje DYDESSGRWNCLVAR (SEQ ID NO: 146) i TTGWVGRFRPSEPHF (SEQ ID NO: 153). U drugom tehničkom rešenju, epitop dalje sadrži DVTWATQERISLQWL (SEQ ID NO: 147).

Matrica 2 je dala 4 vezujuća regiona:

[0242] TFITKGTWEVIG (SEQ ID NO: 155 koja odgovara ostacima 395 do 406 od SEQ ID NO: 144) DYLYYISNE (SEQ ID NO: 156 koja odgovara ostacima 413 do 421 od SEQ ID NO: 144) SCELNPERCQYY (SEQ ID NO: 157 koja odgovara ostacima 446 do 457 od SEQ ID NO: 144) SGPGLP (SEQ ID NO: 158 koja odgovara ostacima 473 do 478 od SEQ ID NO: 144)

[0243] CDina26 vezivanje za regione Matrice 2 je bilo slabije nego vezivanje za DYDESSGRWNCLVAR (SEQ ID NO: 146). Na osnovu objavljene kristalne strukture CD26, regioni DYLYYISNE (SEQ ID NO: 156) i SGPGLP (SEQ ID NO: 158) su uglavnom sakriveni unutar proteina. Regioni TFITKGTWEVIG (SEQ ID NO: 155) i SAELNPERCQYY (SEQ ID NO: 157) su površinski izloženi i dostupni antitelu.

[0244] Vizuelno poređenje CDina26 vezivanja za 7 identifikovanih diskontinuiranih regiona vezivanja u CD26 7 je prikazano na Slici 12 koja pokazuje prosečno vezivanje za sve diskontinuirane peptide koji sadrže jednu od identifikovanih sekvenci vezivanja. Ovde je DYDESSGRWNCLVAR (SEQ ID NO: 146) bio najjače vezujuće sredstvo, dok je DVTWATQERISLQWL (SEQ ID NO: 147) bio nešto jači od TTGWVGRFRPSEPHF (SEQ ID NO: 153).

[0245] Najjači region vezivanja, DYDESSGRWNCLVAR (SEQ ID NO: 146), je uglavnom izložen na površini što se vidi iz objavljene kristalne strukture CD26. Region TTGWVGRFRPSEPHF (SEQ ID NO: 153) je skoro potpuno sakriven unutar proteina. Region DVTWATQERISLQWL (SEQ ID NO: 147) je delimično izložen na površini kod ATQER (SEQ ID NO: 159 koja odgovara ostacima 306 do 310 od SEQ ID NO: 144), i lociran je pored DYDESSGRWNCLVAR (SEQ ID NO: 146).

[0246] Rezultati mapiranja epitopa su bili u skladu sa CDina26 koje specifično vezuje diskontinuirani epitop od CD26 koji sadrži DYDESSGRWNCLVAR (SEQ ID NO: 146). U jednom tehničkom rešenju, diskontinuirani epitop dalje sadrži jedan ili oba od DVTWATQERISLQWL (SEQ ID NO: 147) i PNGTF (SEQ ID NO: 152). Dok je PNGTF (SEQ ID NO: 152) konzervirana između humanog i svinjskog CD26, razlike u sekvenci u drugoj komponenti epitopa (kao što je DYDESSGRWNCLVAR (SEQ ID NO: 146), koja nije konzervirana između humane i svinjske) je dovoljna da ukine vezivanje CDina26 za izvorni CD26 svinje. U drugom tehničkom rešenju, epitop dalje sadrži WWSPNGTFLAYAQ (SEQ ID NO: 148).

Primer 9

Afinitet Vezivanja CDina26 za CD26

[0247] Sistem površinske plazmonske rezonance (Biacore®) je korišćen za određivanje afiniteta CDina26 za humani CD26 prema standardnim protokolima. Merenja afiniteta su izvršena na 25°C, imobilizacijom na čip karboksimetil dekstrana (CM5) 10.000 RU anti-IgG2b antitela (GE Healthcare, 22-0648-97 AC). CDina26 je pripremljen kao štok u HBS-EP (0.01M HEPES, pH 7.4, 0.15M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% Surfaktant P20) radnom puferu u finalnoj koncentraciji od 50 µg/ml, i za svaki eksperiment 2.000 RU je bilo reverzibilno imobilizovano na čip ubrizgavanjem sa protokom od 10 µl/min u periodu od 180 sekundi.

[0248] Prečišćeni rekombinantni humani CD26 (rhDipeptidil peptidaza IV; Creative BioMart; CAT# DPP4-116H) je pripremljen u štoku koncentracije od 5,8x10-6 M. CD26 je injektiran u rastućim koncentracijama od 30x10<-9>, 90x10<-9>M, 270x10<-9>M i 810x10<-9>M. Uzorci CD26 su ubrizgani sa protokom od 10µl/minut; sa HBS-EP puferom koji se koristi kao radni pufer. Tipično snimanje je ukjučivalo period od 3 minuta injektiranja CD26 nakon čega je sledio period od 8 minuta disocijacije. Sirovi podaci vezivanja su analizirani prema standardnim metodama. CM5 čip sa imobilisanim anti-IgG2b antitelom regenerisan je injekcijom od 10 mM Glicin-HCI pH 1.7 sa protokom injektiranja od 20 µl/min i u periodu od 60 sekundi.

[0249] Rezultati merenja afiniteta za CDina26 su prikazani ispod. Podnosioci prijave veruju da CDina26 poseduje superiorna vezujuća svojstva u poređenju sa antitelima iz stanja tehnike, i stoga predstavljaju značajno poboljšanje u odnosu na stanje tehnike.

REFERENCE

[0250]

Akpek G, Boitnott JK, Lee LA, et al. Hepatitic variant of graft versus host disease after donor lymphocyte infusion. Blood 2002; 100: 3903-3907.

Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology 266:460-480.

Andris-Widhopf et al. (2000), Phage Display Laboratory Manual, 1. izdanje, Cold Spring Harbor Laboratory Press, str. 9.1-9.22.

Anke Franzke, Robert Geffers, J Katrin Hunger, Susanne Pförtner, Wenji Piao, Philipp Ivanyi, Jens Grosse, Michael Probst-Kepper, Arnold Ganser i Jan Buer. Identification of novel regulators in T-cell differentiation of aplastic anemia patients. BMC Genomics 2006, 7:263

Ausubel et al., urednici, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, tom 1, John Wiley & Sons, Inc., Njujork.

Aytac et al. (2003) British Journal of Cancer 88:455-462.

Bacigalupo A, Passweg J. Diagnosis and treatment of acquired aplastic anemia. Hematol Oncol Clin North Am. 2009; 23: 159-70.

Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, tom 10, strane 79-104 (The Humana Press, Inc.1992).

Bird RE i Walker BW, "Single Chain Antibody Variable Regions," TIBTECH, tom 9: 132-137 (1991).

Boerner et al., 1991, J. Immunol.,147 (I):86-95.

Brekke i Loset, 2003, Curr. Opin. Pharmacol.3:544-50.

Broxmeyer, H. E. (2006). Umbilical Cord Blood Stem Cells: Collection, Processing, and Transplantation. Blood Banking and Transfusion Medicine: Basic Principles and Practice.

C. D. Hillyer, Silberstein, L.E., Ness, P.M., Anderson, K.C., i Roback, J., Churchill Livingston, Elsevier štampa, Inc.: 823-832.

Broxmeyer, H. E., G. Hangoc, S. Cooper, T. Campbell, S. Ito i C. Mantel (2007). AMD3100 and CD26 modulate mobilization, engraftment, and survival of hematopoietic stem and progenitor cells mediated by the SDF-1/CXCL12- CXCR4 axis. Ann N Y Acad Sci 1106: 1-19. Eobjava 14. mart 2007. PubMed PMID: 17360804.

Brummell et al., Biochem.32: 1180-1187 (1993).

Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 94:412-417 (1997).

Busso N, Wagtmann N, Herling C et al. Circulating CD26 is negatively associated with inflammation in human and experimental arthritis. Am J Pathol 2005; 166: 433-442. Campbell TB, Broxmeyer HE. CD26 inhibition and hematopoiesis: a novel approach to enhance transplantation. Front Biosci. 1. jan 2008;13:1795-805. pregled PubMed PMID: 17981668.

Campbell TB, Hangoc G, Liu Y, Pollok K, Broxmeyer HE. Inhibition of CD26 in human cord blood CD34+ cells enhances their engraftment of nonobese diabetic/severe combined immunodeficiency mice. Stem Cells Dev. Jun 2007;16(3):347-54. PubMed PMID: 17610364.

Carter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. SAD 89: 4285 (1992).

Charo IF, Peters W. Chemokine receptor 2 (CCR2) in atherosclerosis, infectious diseases, and regulation of T-cell polarization. Microcirculation 2003, 10(3-4):259-264.

Chothia et al., J. Mol. Biol.1987, 196(4):901-17).

Christopherson KW 2-gi, Hangoc G, Broxmeyer HE. Cell surface peptidase CD26/dipeptidylpeptidase IV regulates CXCL12/stromal cell-derived factor-1 alphamediated chemotaxis of human cord blood CD34+ progenitor cells. J Immunol. 15. dec 2002;169(12):7000-8. PubMed PMID: 12471135.

Christopherson KW 2-gi, Cooper S, Broxmeyer HE. Cell surface peptidase CD26/DPPIV mediates G-CSF mobilization of mouse progenitor cells. Blood. 15. jun 2003;101(12):4680-6. Eobjava 6. feb 2003. PubMed PMID: 12576320.

Christopherson KW, Cooper S, Hangoc G, Broxmeyer HE. CD26 is essential for normal G-CSF-induced progenitor cell mobilization as determined by CD26-/- mice. Exp Hematol. Nov 2003;31(11):1126-34. PubMed PMID: 14585379.

Christopherson KW II, Hangoc G, Mantel CR, Broxmeyer HE. Modulation of haematopoietic stem cell homing and engraftment by CD26. Science 2004; 305: 1000-1003. PubMed PMID: 15310902.

Christopherson II, K. W., L. A. Paganessi, S. Napier i N. K. Porecha (2007). CD26 Inhibition on CD34(+) or Lineage() Human Umbilical Cord Blood Donor Hematopoietic Stem Cells/Hematopoietic Progenitor Cells Improves Long-Term Engraftment into NOD/SCID/Beta2(null) Immunodeficient Mice. Stem Cells Dev 16(3): 355-60.

Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, str.77 (1985); Coligan et al. urednici. (1991) CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, John Wiley & Sons, t.1, str.2.5.1-2.6.7, 2.7.1-2.7.12, 2.8.1-2.8.10, 2.9.1-2.9.3 i 2.10.-2.10.4. Conrad i Scheller, 2005, Comb. Chem. High Throughput Screen.8:117-26.

Cossins et al. (2006, Prot Express Purif 51: 253-259.

Dang NH, Morimoto C. CD26: An expanding role in immune regulation and cancer. Histol Histopathol 2002, 17(4):1213-1226.

Dantas-Barbosa et al., 2005, Genet. Mol. Res.4:126-40.

Dong et al. (1998), "Correlation of the Epitopes Defined by Anti-CD26 mAbs and CD26 Function", Molecular Immunology 35(1):13-21.

Dong et al. (1996) J Immunol. 156(4):1349-55.

Drucker DJ. Dipeptidyl peptidase-4 inhibition and the treatment of type 2 diabetes. Diabetes Care 2007; 30: 1335-1341.

DuBois D; DuBois E F., Arch Int Med 191617:863-71.

Durinx C, Lambeir AM, Bosmans E et al. Molecular characterization of dipeptidylpeptidase activity in serum: soluble CD26/dipeptidylpeptidase IV is responsible for the release of X-Pro dipeptides. Eur J Biochem 2000;267:5608-5613.

Edelman et al. (1967) in Methods in enzymology, t.1, str.422.

Ferrara JLM, Levine JE, Reddy P i Holler E. Graft-versus-Host Disease. Lancet 2009; 373: 1550-1561.

Fleischer B, Sturm E, De-Vries JE, Spits H. Triggering of cytotoxic T lymphocytes and NK cells via the Tp103 pathway is dependent on the expression of the T cell receptor/CD3 complex. J Immunol 1988, 141:1103-1107.

Fleischer (1987) J. Immunol.138, 1346-1350. Fleischer (1994) Immunol. Today 15:180-184.

Fox et al. (1984) J. Immunol. 133, 1250-1256.

Fraticelli P, Sironi M, Bianchi G, D'Ambrosio D, Albanesi C, Stoppacciaro A, Chieppa M, Allavena P, Ruco L, Girolomoni G, Sinigaglia F, Vecchi A, Mantovani A. Fractalkine (CX3CL1) as an amplification circuits of polarized Th1 resonses. J Clin Invest 2001, 107(9):1173-1181.

Freshney RI, ed. (1987) Culture of Animal Cells, AR Liss Inc.

Gait MJ, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis.

Glucksberg H, Storb R, Fefer A, et al. Clinical manifestations of graft-versus-host disease in human recipients of marrow from HL-A-Matched sibling donors. Transplantation 1974; 18: 295-304.

Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994).

Green et al., 1999, J. Immunol. Methods 231:11-23.

Guo Y, Hangoc G, Bian H, Pelus LM, Broxmeyer HE. SDF-1/CXCL12 enhances survival and chemotaxis of murine embryonic stem cells and production of primitive and definitive hematopoietic progenitor cells. Stem Cells. Okt 2005;23(9):1324-32. Erratum in: Stem Cells. Jan 2006;24(1):211. PubMed PMID: 16210409.

Hames BD et al. (1984) Nucleic Acid Hybridization.

Hegen et al. (1990) J. Immunol. 144, 2908-2914.

Hogan B (1986) Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory.

Hollinger et al., 1993, Proc. Natl. Acad Sci. SAD 90: 6444-6448.

Hopsu-Havu i Glenner, 1966, Histochemie; 7: 197-201

Huse et al. (Science 1989, 246:1274-1281).

Inhibition of CD26 preserves pancreatic islet transplants through a pathway involving modulation of splenic CD4(+) T-cell migration in mice. Diabetes 2010; 59(7):1739-50 Inhibition of CD26 down regulates activated T cells and prevents lung graft rejection in rats. J Heart Lung Transplant 2006; 25(9):1109-16

Inhibition of CD26 suppresses autoimmune encephalomyelitis (EAE) in mice. J Immunol 2001; 166(3): 2041-8

Jacobsohn DA i Vogelsang GB. Acute graft versus host disease. Orphanet Journal of Rare Diseases 2007; 2: 35-44.

Jee Y, Yoon WK, Okura Y, Tanuma N, Matsumoto Y. Upregulation of monocyte chemotactic protein-1 and CC chemokine receptor 2 in the central nervous system is closely associated with relapse of autoimmune encephalomyelitis in Lewis rats. J Neuroimmunol 2002, 128(1-2):49-57.

Jellinek et al., 1995, Biochem.34:11363-11372.

Johnson i Chiswell, 1993, Current Opinion in Structural Biology 3:5564-571.

Jones et al., Nature 321: 522 (1986).

Kabat et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izdanje., Vašington, D.C., Public Health Service, N.I.H.

Kahne T, Lendeckel U, Wrenger S et al. Dipeptidyl peptidase IV: a cell surface peptidase involved in regulating T cell growth (pregled). Int J Mol Med 1999; 4: 3-15.

Kameoka et al. (1993) Science.261(5120):466-9.

Kawai, T., U. Choi, P. C. Liu, N. L. Whiting-Theobald, G. F. Linton i H. L. Malech (2007). Diprotin A Infusion into Nonobese Diabetic/Severe Combined Immunodeficiency Mice Markedly Enhances Engraftment of Human Mobilized CD34(+) Peripheral Blood Cells. Stem Cells Dev 16(3): 361-370.

Kobayashi et al., Protein Eng.12(10):879-884 (1999).

Kobayashi et al., Protein Eng.12(10):879-884 (1999).

Kohler i Milstein, Nature 256: 495 (1975).

Kostelny et al., 1992, J. Immunol.148: 1547-1553.

Leung et al., Hybridoma 13:469 (1994).

Lewis, I. D. (2002). Clinical and experimental uses of umbilical cord blood. Intern Med J 32(12): 601-9.

Lin et al., 1994, Nucl. Acids Res.22:5220-5234.

Lock C, Hermans G, Pedotti R, Brendolan A, Schadt E, Garren H, Langer-Gould A, Strober S, Cannella B, Allard J, Klonowski P, Austin A, Lad N, Kaminski N, Galli SJ, Oksenberg JR, Raine CS, Heller R, Steinman L. Gene-microarray analysis of multiple sclerosis lesions yields new targets validated in autoimmune encephalomyelitis. Nat Med 2002, 8(5):500-508.

Lonberg et al., Nature 1994368:856.

Maciejewski JP, Selleri C, Anderson S, Young NS. Fas antigen expression on CD34+ human marrow cells is induced by interferon gamma and tumor necrosis factor alpha and potentiates cytokine mediated hematopoietic suppression in vitro. Blood 1995, 85:3183-3190.

Maciejewski JP, Selleri C, Sato T, Anderson S, Young NS. Increased expression of Fas antigen on bone marrow CD34+ cells of patients with aplastic anemia. Br J Haematol 1995, 91:245-252.

Mancini et al., 2004, New Microbiol.27:315-28.

Marks et al., 1991, J. Mol. Biol.222:581-97.

Marks, J. D., et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 16007

Mayer i Walker, urednici (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology.

McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-553.

Menthlein, 1999, Regulatory Peptides; 85: 9-24

Miller JH i Calos MP, urednici (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Cold Spring Harbor Laboratory

Morimoto et al. (1989) J. Immunol. 143, 3430-3439.

Morimoto et al. (1994) Immunologist 2: 4-7.

Morrison et al. (1993) J Exp Med.177(4):1135-43).

Mosteller R D., N Engl J Med 22. okt 1987; 317(17):1098.

Nakao S, Takami A, Takamatsu H, Zeng W, Sugimori N, Yamazaki H,Miura Y, Ueda M, Shiobara S, Yoshioka T, Kaneshige T, Yasukawa M, Matsuda T. Isolation of a T cell clone showing HLADRB1* 0405-restricted cytotoxicity for hematopoietic cells in a patient with aplastic anemia. Blood 1997, 89:3691-3699.

Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89: 230 (1960).

Orlandi et al., 1989, Proc. Nat'l Acad. Sci. SAD 86: 3833.

Pagratis et al., 1997, Nature Biotechnol. 15:68-73.

Pasqualini i Ruoslahti, 1996, Nature 380:364-366.

Pasqualini, 1999, The Quart. J. Nucl. Med.43:159-162.

Perbal B (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons Inc.

Peranteau WH, Endo M, Adibe OO et al. CD26 inhibition enhances allogeneic donor-cell homing and engraftment after in utero hematopoietic-cell transplantation. Blood 2006; 108: 4268-4274.

Porter, Biochem. J.73: 119 (1959).

Raag R i Whitlow M, "Single Chain Fvs." FASEB tom 9:73-80 (1995)

Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323.

Risitano AM, Kook H, Zeng W, Chen G, Young NS, Maciejewski JP. Oligoclonal and polyclonal CD4 and CD8 lymphocytes in aplastic anemia and paroxysmal nocturnal hemoglobinuria measured by V beta CDR3 spectratyping and flow cytometry. Blood 2002, 100(1):178-183.

Roig MG (1986) Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press.

Sambrook et al., urednici (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2. izdanje. Sandhu, 1992, Crit. Rev. Biotech.12: 437.

Shier, R. et al., 1996, Gene 169: 147

Singer et al., 1993, J. Immun. 150: 2844.

Songsivilai et al., 1990, Clin. Exp. Immunol.79: 315-321.

Sun Y, Tawara I, Tubai T, i Reddy P. Pathophysiology of Acute Graft-vs-Host Disease: Recent Advances. Transl Res.2007; 150: 197-214.

Taylor et al., Int. Immun. 1994 6:579.

Tempest et al., 1991, Biotechnology 9:266.

Tian, C., J. Bagley, D. Forman i J. lacomini (2006). "Inhibition of CD26 peptidase activity significantly improves engraftment of retrovirally transduced hematopoietic progenitors." Gene Ther 13(7): 652-8.

Timmerman et al., 2007, J. Mol. Recognit.20: 283-290

Ulmer et al. (1990) J. Immunol. 31, 429-435.

US 2010/0196266 A1, EP 404 097, WO 93/11161, Goldenberg, U.S. Pat. brojevi 4,036,945 i 4,331,647, US 4,704,692, US 4,946,778, US 5,545,807, US 5,545,806, US 5,633,425, US 5,661,016, US 5,567,610, US 5,229,275, EP 1 241 179 B1, US 4,683,195 (Mullis et al.), US 7,863,239, US 7,972,993, US 7,982,013 B2.

Vanham G, Kestens L, Demeester I et al. Decreased expression of the memory marker CD26 on both CD4+ and CD8+ T lymphocytes of HIV infected subjects. J Acquir Immune Defic Syndr 1993; 6: 749-757.

Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534.

Weir DM i Blackwell CC, urednici (1986) Handbook of Experiment Immunology, odlomak I-IV

Willheim M, Ebner C, Baier K, Kern W, Schrattbauer K, Thien R, Kraft D, Breiteneder H, Reinisch W, Scheiner O. Cell surface characterization of T lymphocytes and allergenspecific T cell clones - correlation of CD26 expression with Th1 subsets. J Allergy Clin Immunol 1997, 100:348-255.

Wu (1986) in Methods in enzymology, tom 154, predgovor.

Wu (1987) in Methods in enzymology, tom 155, predgovor.

Young NS, Maciejewski JP. The pathophysiology of acquired aplastic anemia. N Eng J Med 1997, 336:1365-1372.

Zeng W, Nakao S, Takamatsu H, Yachie A, Takami A, Kondo Y, Sugimori N, Yamazaki H, Miura Y, Shiobara S, Matsuda T. Characterization of T-cell repertoire of the bone marrow in immunemediated aplastic anemia: Evidence for the involvement of antigendriven T-cell response in cyclosporine-dependent aplastic anemia. Blood 1999, 93(9):3008-3016.

Zeng W, Maciejewski JP, Chen G, Young NS. Limited heterogeneity of T cell receptor BV usage in aplastic anemia. J Clin Invest 2001, 108(5):765-773.

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Izolovano monoklonsko antitelo koje specifično vezuje humani CD26, navedeno antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca, gde navedeni varijabilni region teškog lanca sadrži VH CDR1 koji sadrži sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 133, VH CDR2 koji sadrži sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 134, i VH CDR3 koji sadrži sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 1, i gde navedeni varijabilni region lakog lanca sadrži VL CDR1 koji sadrži sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 129, VL CDR2 koji sadrži sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 130, i VL CDR3 koji sadrži sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 2, gde navedeni varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 4, i 6 do 21, i gde navedeni varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 22 do 47.

2. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, gde navedeni varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 4.

3. Antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde navedeni varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO: 26.

4. Antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde navedeno antitelo sadrži iste sekvence teškog lanca i iste sekvence lakog lanca kao antitelo proizvedeno pomoću hibridomske ćelijske linije deponovane u CBA-ICLC u Đenovi (Italija) kao PD 12002.

5. Antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde navedeno antitelo sadrži konstantni region lakog lanca, pri čemu navedeni konstantni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 48.

6. Antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je navedeno antitelo IgG 2B klase, i/ili gde navedeno antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 49.

7. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, gde antitelo je rekombinantno antitelo, himerno antitelo, fragment antitela, bispecifično antitelo, monospecifično antitelo, ili monovalentno antitelo.

8. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, gde antitelo je proizvedeno iz hibridomske ćelijske linije deponovane u CBA-ICLC u Đenovi (Italija) kao PD 12002.

9. Proces proizvodnje antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, koji obuhvata korake:

i. obezbeđivanje hibridomske ćelijske linije deponovane u CBA-ICLC u Đenovi (Italija) kao PD 12002;

ii. kultivisanje navedene ćelije domaćina u medijumu za kultivaciju; i

iii. dobijanje antitela iz medijuma;

iv. po izboru prečišćavanje antitela, na primer ekskluzionom hromatografijom, afinitetnom hromatografijom, jon-izmenjivačkom hromatografijom, filtracijom i/ili nanofiltracijom.

10. Farmaceutska kompozicija koja sadrži najmanje jedno antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, i po izboru najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

11. Farmaceutska kompozicija iz patentnog zahteva 10 za primenu kao lek.

12. Farmaceutska kompozicija iz patentnog zahteva 11

(a) za primenu u sprečavanju i/ili lečenju bolesti kalem protiv domaćina (Graft-versus-Host disease - GvHD), poželjno nakon transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija, i/ili (b) za primenu u sprečavanju i/ili lečenju aplastične anemije, poželjno teške aplastične anemije.

13. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8 za primenu kao lek.

14. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8 za primenu u sprečavanju i/ili lečenju bolesti kalem protiv domaćina (Graft-versus-Host disease - GvHD), poželjno nakon transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija, i/ili za primenu u sprečavanju i/ili lečenju aplastične anemije, poželjno teške aplastične anemije.

15. Kit koji sadrži:

i. najmanje jedno antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, i dodatno ii.

a) najmanje jedan imunosupresivni lek, ili

b) najmanje jedan kortikosteroid i najmanje jedan antihistamin.