RS59204B1

RS59204B1 - Kombinovana terapija anti-cd20 antitelom sa inhibitorom bcl-2 i inhibitorom mdm2

Info

Publication number: RS59204B1
Authority: RS
Inventors: Christian Klein; Frank Herting; Markus Dangl
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2015-05-26
Filing date: 2016-05-23
Publication date: 2019-10-31
Also published as: KR102043803B1; MY188849A; LT3302549T; IL255353B; HK1252855A1; RU2017145649A3; CN107847600A; US20160347852A1; AR104735A1; SI3302549T1; UA124617C2; PL3302549T3; AU2016267564B2; EP3302549A1; HRP20191585T1; MX2017014977A; ES2744624T3; RU2017145649A; DK3302549T3; AU2016267564A1

Description

OPIS

Predmetni pronalazak se odnosi na kombinovanu terapiju anti-CD20 antitelom sa inhibitorom Bcl-2 i inhibitorom MDM2 za lečenje kancera.

Oblast pronalaska

Afukozilovana antitela

Ćelijski posredovane efektorske funkcije monoklonskih antitela mogu se povećati dizajniranjem njihove oligosaharidne komponente, kao što opisuju Umaña, P. i sar. Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180; i US 6,602,684. Antitela IgG1 tipa, najčešće korišćena antitela u imunoterapiji kancera, su glikoproteini koji imaju očuvano N-vezano mesto glikozilacije na Asn297 u svakom CH2 domenu. Dva kompleksa biantenarnih oligosaharida vezanih za Asn297 su ubačena između CH2 domena, formirajući obimne kontakte sa polipeptidnim skeletom, i njihovo prisustvo je od suštinskog značaja za antitelo radi posredovanja efektorskih funkcija, kao što je ćelijska citotoksičnost koja zavisi od antitela (ADCC) (Lifely, M.R. i sar. Glycobiology 5 (1995) 813-822; Jefferis, R. i sar. Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76; Wright, A. i Morrison, S.L. Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32). Umaña, P. i sar. Nature Biotechnol.

17 (1999) 176-180 i WO 99/154342 su pokazali da prekomerna ekspresija β(1,4)-N-acetilglukozaminiltransferaze III („GnTIII“), glikoziltransferaze koja katalizuje formiranje bisekciranih oligosaharida, u ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO) značajno povećava in vitro ADCC aktivnost antitela. Promene u sastavu N297 ugljenih hidrata ili njihova eliminacija utiču i na vezivanje za Fc vezivanje za FcγR i C1q (Umaña, P. i sar. Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180; Davies, J. i sar. Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294; Mimura, Y. i sar. J. Biol. Chem. 276 (2001) 45539-45547; Radaev, S. i sar. J. Biol. Chem. 276 (2001) 16478-16483; Shields, R.L. i sar. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Shields, R.L. i sar. J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740; Simmons, L.C. i sar. J. Immunol. Methods 263 (2002) 133-147). Prijavljene su studije koje razmatraju aktivnosti afukozilovanih i fukozilovanih antitela, uključujući anti-CD20 antitela (npr. Iida, S. i sar. Clin. Cancer Res. 12 (2006) 2879-2887; Natsume, A. i sar. J. Immunol. Methods 306 (2005) 93-103; Satoh, M. i sar. Expert Opin. Biol. Ther. 6 (2006) 1161-1173; Kanda, Y. i sar. Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688; Davies, J. i sar. Biotechnol. Bioeng.74 (2001) 288-294.

CD20 i anti-CD20 antitela

Molekul CD20 (koji se još naziva humani B-limfocitima ograničeni antigen za diferencijaciju ili Bp35) je hidrofobni transmembranski protein koji se nalazi na pre-B i zrelim B limfocitima koji su detaljno opisani (Valentine, M.A. i sar. J. Biol. Chem.264 (1989) 11282-11287; i Einfeld, D.A. i sar. EMBO J.7 (1988) 711-717; Tedder, T.F. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (1988) 208-212; Stamenkovic, I. i sar. J. Exp. Med. 167 (1988) 1975-1980; Tedder, T.F. i sar. J. Immunol. 142 (1989) 2560-2568). CD20 je eksprimiran na više od 90% B ćelija ne-Hodžkinovog limfoma (NHL) (Anderson, K.C. i sar. Blood 63 (1984) 1424-1433), ali nije nađen na matičnim ćelijama hematopoeze, pro-B ćelijama, normalnim ćelijama plazme, ili u drugim normalnim tkivima (Tedder, T.F. i sar. J. Immunol.135 (1985) 973-979).

Postoje dva različita tipa anti-CD20 antitela, koji se značajno razlikuju prema načinu vezivanja CD20 i biološkoj aktivnosti (Cragg, M.S., i sar., Blood 103 (2004) 2738-2743; i Cragg, M.S., i sar., Blood 101 (2003) 1045-1052). Antitela tipa I, kao što su, na primer, rituksimab (neafukozilovano antitelo sa količinom fukoze od 85% ili više), ofatumumab, veltuzumab, okrelizumab, su snažni u citoksičnosti posredovanoj komplementom.

Antitela tipa II, kao npr. tositumomab (B1), 11B8, AT80 ili humanizovana B-Ly1 antitela, efikasno iniciraju smrt ciljnih ćelija putem ćelijske smrti nezavisne od kaspaze, sa istovremenim izlaganjem fosfatidilserinu.

Anti-CD20 antitela su korišćena u kombinaciji sa Bcl-2 inhibitorima (Roberts i sar. BLOOD, 124(21), Abstract 325, 2014; Ma i sar. J. Clin.Onc., 32(15, Suppl.), Abstract 7013, 2014; Flinn i sar. BLOOD, 124(21), Abstract 4687, 2014, Herting i sar. BLOOD, 116(21), Abstract 3915, 2010).

Anti-CD20 antitela su korišćena u kombinaciji sa inhibitorima MDM2 (Herting i sar. BLOOD, 124(21), Abstract 1780; WO2012080389).

MDM2

p53 je tumor supresorski protein koji igra glavnu ulogu u zaštiti od razvoja kancera. On čuva integritet ćelije i sprečava propagaciju trajno oštećenih ćelijskih klonova putem indukcije zastoja rasta ćelija ili apoptoze. Na molekulskom nivou, p53 je faktor transkripcije koji može da aktivira skup gena uključen u regulaciju ćelijskog ciklusa i apoptozu. p53 je moćan inhibitor ćelijskog ciklusa, koga na ćelijskom nivou strogo reguliše MDM2. MDM2 i p53 čine povratnu kontrolnu spregu. MDM2 može da veže p53 i da inhibira njegovu sposobnost da transaktivira gene koje reguliše p53. Pored toga, MDM2 posreduje u degradaciji p53 zavisnoj od ubikvitina. p53 može da aktivira ekspresiju MDM2 gena, i tako podigne nivo MDM2 proteina u ćeliji. Povratna kontrolna sprega obezbeđuje da se sadržaj MDM2 i p53 održava na niskom nivou u normalnim proliferativnim ćelijama. MDM2 je takođe kofaktor E2F, koji ima glavnu ulogu u regulisanju ćelijskog ciklusa.

Odnos MDM2 prema p53 (E2F) je poremećen kod mnogih kancera. Na primer, pokazalo se da molekularni defekti koji često nastaju u p16INK4/p19ARF lokusu utiču na degradaciju MDM2 proteina. Inhibicija interakcije MDM2-p53 u tumorskim ćelijama sa divljim tipom p53 bi dovela do nakupljanja p53, prekidanja ćelijskog ciklusa i/ili apoptoze. Stoga MDM2 antagonisti mogu da ponude novi pristup terapiji kancera, kao samostalni agensi ili u kombinaciji sa širokim spektrom drugih antitumorskih terapija. Izvodljivost ove strategije dokazana je primenom različitih makromolekulskih alata za inhibiciju interakcije MDM2-p53 (npr. antitela, antisens oligonukleotidi, peptidi). MDM2 takođe vezuje E2F putem očuvanog vezujućeg regiona kao p53, i aktivira transkripciju ciklina A zavisnu od E2F, nagoveštavajući da MDM2 antagonisti mogu da imaju efekta na p53 mutantnih ćelija.

Bcl-2 i Bcl-2 inhibitori

Bcl-2 proteini imaju ulogu u mnogim bolestima, posebno kod kancera, leukemije, imunih i autoimunih bolesti. Smatra se da su Bcl-2 proteini uključeni u kancer mokraćne bešike, kancer mozga, rak dojke, rak koštane srži, rak grlića materice, hroničnu limfocitnu leukemiju, kolorektalni kancer, rak jednjaka, hepatocelularni kancer, limfoblastnu leukemiju, folikularni limfom, limfoidne malignitete T-ćelijskog ili B-ćelijskog porekla, melanom, mijelogenu leukemiju, mijelom, oralni kancer, rak jajnika, nemikrocelularni karcinom pluća, rak prostate, mikrocelularni karcinom pluća, rak slezine. Prekomerna ekspresija Bcl-2 proteina je u vezi sa rezistencijom na hemoterapiju, kliničkim ishodom, progresijom bolesti, ukupnom prognozom ili njihovom kombinacijom kod različitih vrsta kancera i poremećaja imunog sistema.

Inhibitori Bcl-2 i inhibitori MDM-2 su korišćeni u kombinaciji (Dangl i sar. CANC.RES., 74(19), Abstract 5505, 2014; Rongqing i sar. BLOOD, 124(21), Abstract 2162, 2014).

Sažetak pronalaska

Sada smo otkrili da kombinacija anti-CD20 antitela tipa I ili afukozilovanog, anti-CD20 antitela tipa II sa inhibitorom Bcl-2 i inhibitorom MDM2 pokazuje značajno poboljšano antiproliferativno dejstvo. Iznenađujuće, ova kombinacija je više nego aditivna, tj. visoko sinergijska.

Otelotvorenja pronalaska su definisana u priloženim patentnim zahtevima.

Jedan aspekt otkrića je afukozilovano anti-CD20 antitelo sa količinom fukoze od 60% ili manje u odnosu na ukupnu količinu oligosaharida (šećera) na Asn297, za lečenje kancera u kombinaciji sa inhibitorom Bcl-2 i inhibitorom MDM2.

Još jedan aspekt otkrića je upotreba afukozilovanog anti-CD20 antitela sa količinom fukoze od 60% ili manje u odnosu na ukupnu količinu oligosaharida (šećera) na Asn297, za proizvodnju leka za lečenje kancera u kombinaciji sa inhibitorom Bcl-2 i inhibitorom MDM2.

Drugi aspekt otkrića je postupak lečenja pacijenta obolelog od kancera davanjem afukozilovanog anti-CD20 antitela sa količinom fukoze od 60% ili manje u odnosu na ukupnu količinu oligosaharida (šećera) na Asn297 u kombinaciji sa inhibitorom Bcl-2 i inhibitorom MDM2, pacijentu kome je takvo lečenje potrebno.

U jednoj realizaciji, količina fukoze je između 40% i 60% od ukupne količine oligosaharida (šećera) na Asn297. U drugom otelotvorenju , količina fukoze je 0% od ukupne količine oligosaharida (šećera) na Asn297.

U jednom aspektu, anti-CD20 antitelo tipa I je rituksimab. U jednoj realizaciji, afukozilovano anti-CD20 antitelo je IgG1 antitelo. U drugoj realizaciji, navedeni karcinom je CD20 koji eksprimira, poželjno limfom ili limfocitna leukemija. U jednom otelotvorenju, pomenuto afukozilovano anti-CD20 antitelo je humanizovano B-Ly1 antitelo. U još jednom otelotvorenju, pomenuto afukozilovano antitelo je anti-CD20 antitelo tipa II. U poželjnom otelotvorenju, pomenuto afukozilovano antitelo je obinutuzumab.

U jednom aspektu, pomenuti Bcl-2 inhibitor je jedinjenje izabrano od jedinjenja opisanih u WO2010/138588. Postupci proizvodnje pomenutih Bcl-2 inhibitora su takođe otkrivene u WO2010/138588.

Prema pronalasku, Bcl-2 inhibitor je 4-(4-{[2-(4-hlorofenil)-4,4-dimetilcikloheks-1-en-1-il] metil}piperazin-1-il)-N-({3-nitro-4-[(tetrahidro-2H-piran-4-ilmetil)amino]fenil}sulfonil)-2-(1H-pirolo[2,3-b]piridin-5-iloksi)benzamid kao u formuli u nastavku ili njena so, estar ili polimorf. Primer 5 iz WO2010/138588 opisuje postupke za pripremu navedenog jedinjenja.

Pomenuti inhibitor Bcl-2 je takođe prikazan u sledećoj formuli:

Pomenuto jedinjenje se naziva i ABT-199 (GDC-0199 ili Venetoclax).

U jednom aspektu otkrića, pomenuti inhibitor MDM2 je jedinjenje izabrano od jedinjenja opisanih u WO2011/098398. Postupci proizvodnje pomenutih inhibitora MDM2 su takođe otkrivene u WO2011/098398.

Prema pronalasku, inhibitor MDM2 je 4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-3-metoksibenzojeva kiselina kao u formuli u nastavku ili njegova so, ester ili polimorf. Primer 448 iz WO2011/098398 opisuje postupak za pripremu navedenog jedinjenja.

Molekulska masa =616,4973

Molekulska formula =C31H29Cl2F2N3O4

U jednom aspektu otkrića, pomenuto anti-CD20 antitelo tipa I je rituksimab, pomenuto afukozilovano anti-CD20 antitelo je humanizovano B-Ly1 antitelo, poželjno obinutuzumab, i Bcl-2 inhibitor, pri čemu je Bcl-2 inhibitor izabran od jedinjenja opisanih u WO 2010/138588 i MDM2 inhibitor odabran od jedinjenja opisanih u WO2011/098398. Pomenuti inhibitor MDM2 poželjno je jedinjenje prema formuli I ili prema formuli 1-1 kao što je prethodno opisano u predmetnoj specifikaciji. Poželjno, inhibitor MDM2 je 4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]amino}-3-metoksi-benzojeva kiselina ili njena so, a pomenuti kancer je kancer koji eksprimira CD20, u jednom aspektu limfom ili limfocitna leukemija.

U jednom otelotvorenju, afukozilovano anti-CD20 antitelo vezuje CD20 sa KD od 10<-8>M do 10<-13>M.

Jedan aspekt otkrića je farmaceutska kompozicija koja sadrži kombinaciju anti-CD20 antitela tipa I (u jednom otelotvorenju rituksimab) ili afukozilovanog anti-CD20 antitela sa količinom fukoze od 60% ili manje od ukupne količine oligosaharida (šećera) na Asn297, (u jednom aspektu afukozilovano humanizovano B-Ly1 antitelo ili poželjno obinutuzumab), i Bcl-2 inhibitor, pri čemu je Bcl-2 inhibitor izabran od jedinjenja opisanih u WO 2010/138588 i inhibitor MDM2, pri čemu je inhibitor MDM2 izabran od jedinjenja opisanih u WO2011/098398. Pomenuti inhibitor MDM2 poželjno je jedinjenje prema formuli I ili prema formuli 1-1 kao što je prethodno opisano u predmetnoj specifikaciji. Poželjno, inhibitor MDM2 je 4- {[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetilpropil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-3-metoksi-benzojeva kiselina ili njena so je 4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetilpropil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-3-metoksi-benzojeva kiselina ili njena so za lečenje raka.

Opis slika

Slika 1: Razvoj volumena tumora do 29. dana i IQR vrednosti (primer 1)

Slika 2: Razvoj volumena tumora do 32. dana i TGI vrednosti (primer 2)

Slika 3: Analiza vremena do događaja do dana 125 (primer 2)

Detaljan opis predmetnog pronalaska

Pronalazak obuhvata afukozilovano anti-CD20 antitelo sa izotipom IgG1 ili IgG3 sa količinom fukoze od 60% ili manje od ukupne količine oligosaharida (šećera) na Asn297, za lečenje kancera u kombinaciji sa inhibitorom Bcl-2 i inhibitorom MDM2, kako je definisano patentnim zahtevima.

Pronalazak obuhvata upotrebu afukozilovanog anti-CD20 antitela izotipa IgG1 ili IgG3 sa količinom fukoze od 60% ili manje od ukupne količine oligosaharida (šećera) u Asn297, za proizvodnju leka za lečenje kancera u kombinaciji sa inhibitorom Bcl-2 i inhibitorom MDM2, kako je definisano patentnim zahtevima.

U jednoj realizaciji, količina fukoze je između 40% i 60% od ukupne količine oligosaharida (šećera) na Asn297.

Termin „antitelo“ obuhvata različite oblike antitela, uključujući, ali se ne ograničavajući na cela antitela, humana antitela, humanizovana antitela i antitela dobijena genetskim inženjerstvom, kao monoklonska antitela, himerna antitela ili rekombinantna antitela, kao i fragmente takvih antitela, sve dok su zadržane karakteristične osobine prema pronalasku. Termini „monoklonsko antitelo“ ili „kompozicija monoklonskih antitela“, kako je ovde korišćeno, odnose se na pripremu molekula antitela sa jednim aminokiselinskim sastavom. Prema tome, termin „humano monoklonsko antitelo“ odnosi se na antitela koja pokazuju jedinstvenu specifičnost vezivanja, i koja poseduju varijabilne i konstantne regione, dobijene iz imunoglobulinskih sekvenci humane germinativne linije. Humana monoklonska antitela proizvode se posredstvom hibridoma, koji uključuju B ćelije dobijene od transgene životinje, a ne od čoveka, npr., od transgenog miša, koji poseduje genom koji sadrži transgen humanog teškog lanca i transgen humanog lakog lanca, spojen sa besmrtnom ćelijom.

Termin „himerno antitelo“ odnosi se na monoklonsko antitelo koje sadrži varijabilni region, tj. vezujući region, iz jednog izvora ili vrste, i najmanje deo konstantnog regiona koji je dobijen iz različitog izvora ili vrste, a koje se uglavnom priprema rekombinantnim DNK tehnikama. Himerna antitela koja sadrže mišji varijabilni region i humani konstantni region posebno su poželjna. Takva mišja/ljudska himerna antitela su proizvod ekspresovanih imunoglobulinskih gena, koji sadrže segmente DNK koji kodiraju varijabilne regione mišjeg imunoglobulina i segmente DNK koji kodiraju konstantne regione humanog imunoglobulina. Drugi oblici „himernih antitela“ jesu oni u kojima je klasa ili potklasa modifikovana ili izmenjena u odnosu na onu originalnog antitela. Takva „himerna“ antitela se, takođe, označavaju kao „antitela sa promenjenom klasom“. Postupci za proizvodnju himernih antitela obuhvataju klasične tehnike rekombinacije DNK i genske transfekcije, koje su danas dobro poznate u praksi. Videti, npr., Morrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US 5,202,238 i US 5,204,244.

Termin „humanizovano antitelo“ se odnosi na antitela u kojima su okvir ili „regioni koji određuju komplementarnost“ (CDR) modifikovani tako da sadrže CDR imunoglobulina različite specifičnosti u poređenju sa onim kod matičnog imunoglobulina. U poželjnom otelotvorenju, mišji CDR se kalemi u region okvira humanog antitela kako bi se proizvelo „humanizovano antitelo“. Vidi npr. Riechmann, L. i sar. Priroda 332 (1988) 323-327; i Neuberger, M.S. i sar. Priroda 314 (1985) 268-270. Posebno poželjni CDR-i odgovaraju onima koji predstavljaju sekvence koje prepoznaju antigene, koji su iznad naznačeni za himerna i biili multispecifična antitela.

Termin „humano antitelo“, kao što je ovde korišćen, utvrđen je kako bi uključio antitela koja poseduju varijabilne i konstantne regione dobijene iz imunoglobulinskih sekvenci humane germinativne linije. Humana antitela su dobro poznata u struci (van Dijk, M.A., i van de Winkel, J.G., Curr. Opin. in Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). Na osnovu takve tehnologije, mogu biti proizvedena humana antitela protiv velikog broja ciljeva. Primeri humanih antitela su, na primer, opisani u Kellermann, S.A. i sar. Curr Opin Biotechnol. 13 (2002) 593-597.

Termin „rekombinantno humano antitelo“, koji se ovde koristi, utvrđen je kako bi obuhvatio sva humana antitela, koja se pripremaju, eksprimiraju, kreiraju ili izoluju na rekombinantne načine, kao što su antitela izolovana iz ćelije domaćina, kao što je NS0 ili CHO ćelija, ili iz životinje (npr. miš), koja je transgena za humane imunoglobulinske gene, ili antitela, koja se eksprimiraju korišćenjem rekombinantnog ekspresionog vektora, transficiranog u ćeliju domaćina. Takva rekombinantna humana antitela imaju varijabilne i konstantne regione dobijene iz imunoglobulinskih sekvenci humane germinativne linije u preuređenom obliku. Rekombinantna humana antitela prema pronalasku bila su podvrgnuta in vivo somatskoj hipermutaciji. Prema tome, aminokiselinske sekvence VH i VL regiona rekombinantnih antitela su sekvence koje, budući da su dobijene iz VH i VL sekvenci humane germinativne linije i srodne su sa njima, ne mogu prirodno postojati in vivo u okviru repertoara humanih antitela germinativne linije.

Termin "bi- ili multispecifično antitelo", kako se ovde koristi, odnosi se na monoklonska antitela koja imaju specifičnosti vezivanja za najmanje dva različita mesta. U pojedinim otelotvorenjima, jedna od specifičnosti vezivanja je za CD20, a druga je za bilo koji drugi antigen. U pojedinim otelotvorenjima, bispecifična antitela mogu da se vežu za dva različita epitopa CD20. Bispecifična antitela mogu takođe da se upotrebe za lokalizaciju citotoksičnih agenasa na ćelije koje eksprimiraju CD20. Bispecifična antitela mogu da se dobiju kao antitela kompletne dužine ili kao fragmenti antitela.

Kao što je ovde upotrebljen, termin „vezujući“ ili „specifično vezujući“ odnosi se na vezivanje antitela za epitop antigena tumora u in vitro testu, poželjno u testu plazmonske rezonance (BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Sweden) sa prečišćenim antigenom divljeg tipa. Afinitet vezivanja je definisan pojmovima ka (konstanta brzine za asocijaciju antitela iz kompleksa antitelo/antigen), kD(konstanta disocijacije) i KD(kD/ka). Vezivanje ili specifično vezivanje znači afinitet vezivanja (KD) koji iznosi 10<-8>M ili manje, a poželjno 10<-8>M do 10<-13>M (u jednom otelotvorenju 10<-9>M do 10<-13>M). Tako, afukozilovano antitelo prema pronalasku se specifično vezuje za antigen tumora sa afinitetom vezivanja (KD) koji iznosi 10<-8>mol/l ili manje, poželjno je 10<-8>M do 10<-13>mol/l. (u jednoj realizaciji 10<-9>M do 10<-13>M).

Termin „molekul nukleinske kiseline“, kao što je ovde korišćen, utvrđen je kako bi uključio molekule DNK i molekule RNK. Molekul nukleinske kiseline može biti jednolančani ili dvolančani, ali je poželjna dvolančana DNK.

„Konstantni domeni“ nisu direktno uključeni u vezivanje antitela za antigen, ali su uključeni u efektorske funkcije (ADCC, vezivanje komplementa i CDC).

„Varijabilni region“ (varijabilni region lakog lanca (VL), varijabilni region teškog lanca (VH)), kako je ovde korišćen, označava svaki par lakih i teških lanaca koji je direktno uključen u vezivanje antitela za antigen. Domeni varijabilnih humanih lakih i teških lanaca imaju istu opštu strukturu, a svaki domen sadrži četiri okvirna (FR) regiona, čije su sekvence u velikoj meri konzervirane, a povezane su pomoću tri „hipervarijabilna regiona“ (ili regiona koji određuju komplementarnost, CDR). Regioni okvira poprimaju tzv. “β-presavijenu“ konformaciju, a CDR mogu da formiraju petlje koje povezuju “β-presavijenu“ strukturu. CDR u svakom lancu se održavaju u svojoj trodimenzionalnoj strukturi pomoću regiona okvira i formiraju, zajedno sa CDR-ima iz drugog lanca, antigen vezujuće mesto.

Termin „hipervarijabilni region" kada se ovde koristi odnosi se na aminokiselinske ostatke antitela koji su odgovorni za vezivanje antigena. Hipervarijabilni region sadrži aminokiselinske ostatke iz „regiona koji određuju komplementarnost“ ili „CDR-e“. Regioni „okvira“ ili „FR“ regioni su oni regioni varijabilnog domena, koji se razlikuju od ostataka hipervarijabilnog regiona kako je ovde definisano. Prema tome, laki i teški lanci antitela od N-do C-kraja sadrže domene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Posebno, CDR3 teškog lanca je region koji najviše doprinosi vezivanju antigena. CDR i FR regioni su određeni prema standardnoj definiciji u: Kabat i sar., Sekvence proteina sa imunološkim interesom, 5. izd., služba za javno zdravlje, nacionalni instituti za zdravlje, Bethesda, dr. (1991) i/ili onim ostacima iz „hipervarijabilne petlje“.

Termin „afukozilovano antitelo“ odnosi se na antitelo izotipa IgG1 ili IgG3 (poželjno IgG1 izotipa) sa izmenjenim profilom glikozilacije u Fc regionu Asn297 sa smanjenim sadržajem fukoznih ostataka. Glikozilacija humanog IgG1 ili IgG3 se javlja kod Asn297 kao fukozilovanog bianetenarnog kompleksnog oligosaharidnog glikozilovanja, završenog sa do 2 Gal ostatka. Ove strukture su označene kao ostaci G0, G1 (α1,6 ili α1,3) ili G2 glikana, zavisno od količine terminalnih Galovih ostataka (Raju, T.S., BioProcess Int. 1 (2003) 44-53). Glikozilaciju CHO tipa Fc delova antitela opisao je, npr. Routier F.H. Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207. Antitela koja su rekombinantno eksprimirana u CHO ćelijama domaćina bez glikomodifikacija obično su fukozilovana na Asn 297, u količini koja je najmanje 85%. Treba razumeti da termin afukozilovano antitelo kao što se ovde koristi uključuje antitelo koje nema fukozu u svom profilu glikozilacije. Opšte je poznato da je položaj tipičnog glikozilovanog ostatka u antitelu je asparagin u položaju 297, prema EU sistemu numerisanja („Asn297“).

1

„EU sistem numerisanja“ ili „EU indeks“ generalno se koristi kada se ukazuje na ostatak u konstantnom regionu teškog lanca imunoglobulina (npr. EU indeks koji su objavili Kabat i sar., Sekvence proteina sa imunološkim interesom, 5. izd., služba za javno zdravlje, nacionalni instituti za zdravlje, Bethesda, dr. (1991)).

Tako afukozilovano antitelo prema pronalasku označava antitelo izotipa IgG1 ili IgG3 (poželjno IgG1 izotipa), naznačeno time što je količina fukoze 60% ili manje od ukupne količine oligosaharida (šećera) na Asn297 (što znači da je najmanje 40% ili više oligosaharida Fc regiona Asn297 afukozilovano). U jednom otelotvorenju, količina fukoze je između 40% i 60% od oligosaharida Fc regiona na Asn297. U drugom otelotvorenju, količina fukoze je 50% ili manje, a u još jednom otelotvorenju, količina fukoze je 30% ili manje od oligosaharida Fc regiona na ASn297. Prema pronalasku, „količina fukoze“ označava količinu pomenutog oligosaharida (fukoze) u lancu oligosaharida (šećera) na Asn297, u odnosu na zbir svih oligosaharida (šećera) vezanih za Asn 297 (npr. kompleksne, hibridne ili strukture sa visokim sadržajem manoze) izmerenu MALDI-TOF masenom spektrometrijom i izračunatu kao prosečna vrednost (za detaljni postupak za određivanje količine fukoze, pogledajte npr. u WO 2008/077546). Nadalje, u jednoj realizaciji, oligosaharidi Fc regiona su se prepolovili. Afukozilovano antitelo prema pronalasku može se izraziti u glikomodifikovanoj ćeliji domaćina koja je projektovana da eksprimira najmanje jednu nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid koji ima GnTIII aktivnost u količini koja je dovoljna za delimično fukozilovanje oligosaharida u regionu Fc. U jednoj realizaciji, polipeptid koji ima GnTIII aktivnost je fuzioni polipeptid. Alternativno, α1,6-fukoziltransferazna aktivnost ćelije domaćina može biti smanjena ili eliminisana prema US 6.946.292 dajući glikomodifikovane ćelije domaćina. Količina fukozilacije antitela može biti unapred određena, npr. uslovima fermentacije (npr. vremenom trajanja fermentacije) ili kombinacijom najmanje dva antitela sa različitom količinom fukozilacije. Takva afukozilovana antitela i odgovarajući postupci glikokonstruisanja opisani su u WO 2005/044859, WO 2004/065540, WO 2007/031875, Umana, P. i sar. Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180, WO 99/154342, WO 2005/018572, WO 2006/116260, WO 2006/114700, WO 2005/011735, WO 2005/027966, WO 97/028267, US 2006/0134709, US 2005/0054048, US 2005/0152894, WO 2003/035835, WO 2000/061739. Ova glikokonstruisana antitela imaju povećan ADCC. Drugi postupci glikokonstruisanja koji daju afukozilovana antitela prema pronalasku opisani su npr. u Niwa, R. i sar. J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160; Shinkawa, T. i sar. J. Biol. Chem, 278 (2003) 3466-3473; WO 03/055993 ili US 2005/0249722.

Tako, jedan aspekt pronalaska se odnosi na afukozilovano anti-CD20 antitelo izotipa IgG1 ili IgG3 (poželjno izotipa IgG1) koje se specifično vezuje za CD20 sa količinom fukoze od 60% ili manje od ukupne količine oligosaharida (šećera) na Asn297, za lečenje kancera u kombinaciji sa inhibitorom Bcl-2 i inhibitorom MDM2, kako je definisano u patentnim zahtevima. U drugom aspektu pronalaska je upotreba afukozilovanog anti-CD20 antitela izotipa IgG1 ili IgG3 (poželjno izotipa IgG1) koje se specifično vezuje za CD20 sa količinom fukoze od 60% ili manje od ukupne količine oligosaharida (šećera) na Asn297, za proizvodnju leka za lečenje kancera u kombinaciji sa inhibitorom Bcl-2 i inhibitorom MDM2, kako je definisano u patentnim zahtevima. U jednoj realizaciji, količina fukoze je između 60% i 20% od ukupne količine oligosaharida (šećera) na Asn297. U jednoj realizaciji količina fukoze je između 60% i 40% od ukupne količine oligosaharida (šećera) na Asn297. U jednoj realizaciji, količina fukoze je između 0% od ukupne količine oligosaharida (šećera) na Asn297.

CD20 (takođe poznat kao antigen B-limfocita CD20, površinski antigen B-limfocita B1, Leu-16, Bp35, BM5 i LF5; sekvenca je okarakterisana u SwissProt bazi podataka, unos P11836) je hidrofobni transmembranski protein sa molekulskom masom od oko 35 kD, koji se nalazi na pre-B i zrelim B limfocitima (Valentine, M.A. i sar. J. Biol. Chem.264 (1989) 11282-11287; Tedder, T.F. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (1988) 208-212; Stamenkovic, I. i sar., J. Exp. Med. 167 (1988) 1975-1980; Einfeld, D.A. i sar. EMBO J. 7 (1988) 711-717; Tedder, T.F. i sar. J. Immunol. 142 (1989) 2560-2568). Odgovarajući humani gen je membranski premošćujući sa 4 domena, potporodica A, član 1, takođe poznat kao MS4A1. Ovaj gen kodira članove membranski premošćujuće 4A porodice gena. Članovi ove nastajuće porodice proteina karakterišu se opštim strukturnim osobinama i sličnim splajs granicama intron/ekson, i ispoljavaju jedinstvene obrasce ekspresije kod hematopoetskih ćelija i nelimfoidnih tkiva. Ovaj gen kodira površinski molekul B-limfocita, koji ima ulogu u razvoju i diferencijaciji B-ćelija u ćelije plazme. Ovaj član porodice je lokalizovan na 11q12 u grupi članova porodice. Alternativno splajsovanje ovog gena daje dve varijante transkripta koje kodiraju isti protein.

Termini „CD20“ i „CD20 antigen“ ovde su korišćeni kao zamena jedan drugom, a uključuju bilo koje varijante, izooblike i homologe, u odnosu na vrstu, humanog CD20, koji se prirodno eksprimiraju od strane ćelija transficiranih CD20 genom, ili se eksprimiraju na njima. Vezivanje antitela iz pronalaska za CD20 antigen ima posredničku ulogu u uništavanju ćelija koje eksprimiraju CD20 (npr., tumorska ćelija), putem inaktivacije CD20. Uništavanje ćelija koje eksprimiraju CD20 može se odigrati prema jednom od sledećih mehanizama: Indukcija ćelijske smrti/apoptoze, ADCC i CDC.

Sinonimi za CD20, kako je u struci utvrđeno, uključuju B-limfocitni antigen CD20, B-limfocitni površinski antigen B1, Leu-16, Bp35, BM5 i LF5.

Termin „anti-CD20 antitelo“ prema pronalasku je antitelo koje se specifično vezuje za CD20 antigen. U zavisnosti od karakteristika vezivanja i biološke aktivnosti anti-CD20 antitela u odnosu na CD20 antigen, mogu se razlikovati dva tipa anti-CD20 antitela (tip I i tip II anti-CD20 antitela), prema članku Cragg, M.S., i sar., Blood 103 (2004) 2738-2743; i Cragg, M.S., i sar, Blood 101 (2003) 1045-1052 pogledajte Tabelu br.1.

Tabela 1: Osobine anti-CD20 antitela tip I i tip II

Primeri ovakvih anti-CD20 antitela tip II uključuju, npr. humanizovano B-Ly1 antitelo IgG1 (himerno humanizovano IgG1 antitelo, kako je izloženo u WO2005/044859), 11B8 IgG1 (kako je izloženo u WO 2004/035607), kao i AT80 IgG1. Uobičajeno anti-CD20 antitela tip II IgG1 izotipa imaju karakteristična CDC svojstva. Anti-CD20 antitela tip II imaju umanjen CDC (ako su IgG1 izotipa) u poređenju sa antitelima tip I IgG1 izotipa.

Primeri za anti-CD20 antitela tip I uključuju npr. rituksimab, HI47 IgG3 (ECACC, hibridom), 2C6 IgG1 (kao što je objavljeno u WO 2005/103081), 2F2 IgG1 (kao što je objavljeno u WO 2004/035607 i WO 2005/103081) i 2H7 IgG1 (kao što je objavljeno u WO 2004/056312).

Afukozilovano anti-CD20 antitelo za upotrebu prema pronalasku je afukozilovano humanizovano B-Ly1 antitelo.

Afukozilovana anti-CD20 antitela za upotrebu prema pronalasku imaju povećanu ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), za razliku od anti-CD20 antitela koja nemaju smanjenu količinu fukoze.

1

Pod „afukozilovanim anti-CD20 antitelom koje ima povećanu ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC)“ podrazumeva se afukozilovano anti-CD20 antitelo, na način kako je taj izraz ovde definisan, koje ima povećanu ADCC, određenu ma kojim pogodnim postupkom poznatim stručnjacima u ovoj oblasti. Jedan prihvaćeni in vitro ADCC test je sledeći:

1) test koristi ciljne ćelije za koje se zna da eksprimiraju ciljni antigen koga prepoznaje antigen-vezujući region antitela;

2) test koristi humane mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), izolovane iz krvi nasumično odabranih zdravih donora, kao efektorske ćelije;

3) test se izvodi prema sledećem protokolu:

i) PBMC se izoluju korišćenjem standardnih procedura centrifugiranja prema gustini, i suspenduju se na 5 x 10<6>ćelija/ml u RPMI hranljive podloge za ćelije;

ii) ciljne ćelije se uzgajaju standardnim postupcima za kulture tkiva, sakupljaju u eksponencijalnoj fazi rasta sa vijabilnošću većom od 90%, ispiraju u RPMI hranjivoj podlozi za ćelije, obeležavaju sa 100 mikro-Kirija<51>Cr, ispiraju dva puta hranljivom podlogom za ćelije, i ponovo suspenduju u hranljivoj podlozi za ćelije pri gustini od 10<5>ćelija/ml;

iii) 100 mikrolitara finalne gornje suspenzije ciljnih ćelija se prenosi u svaki bunarčić mikrotitarske ploče sa 96 bunarčića;

iv) antitelo se serijski razblažuje od 4000 ng/ml do 0,04 ng/ml u hranljivoj podlozi za ćelije, i 50 mikrolitara dobijenih rastvora antitela se dodaje u ciljne ćelije na mikrotitarskoj ploči sa 96 bunarčića, testirajući u triplikatu različite koncentracije antitela koje pokrivaju celokupni gorenavedeni koncentracioni opseg;

v) za kontrole maksimalnog oslobađanja (MR), u 3 dodatna bunarčića na ploči koji sadrže obeležene ciljne ćelije, dodato je 50 mikrolitara 2% (VN) vodenog rastvora nejonskog deterdženta (Nonidet, Sigma, St. Louis), umesto rastvora antitela (vidi tačku iv iznad);

vi) za kontrole spontanog oslobađanja (SR), u 3 dodatna bunarčića na ploči koji sadrže obeležene ciljne ćelije, dodato je 50 mikrolitara RPMI hranljive podloge za ćelije umesto rastvora antitela (tačka iv iznad);

vii) 96-poziciona mikrotitarska ploča se onda centrifugira na 50 x g u toku 1 minuta, i inkubira 1 sat na 4°C;

viii) 50 mikrolitara suspenzije PBMC (tačka i iznad) je dodato u svaki bunarčić da bi se dobio odnos efektor:ciljna ćelija 25:1, i ploče su smeštene u inkubator, u atmosferu sa 5% CO2, na 37°C tokom 4 sata;

ix) supernatant bez ćelija iz svakog bunarčića se sakupi, i eksperimentalno oslobođena radioaktivnost (ER) se izmeri korišćenjem gama brojača;

x) procenat specifične lize se računa za svaku koncentraciju antitela prema formuli (ER-MR)/(MR-SR) x 100, gde je ER prosečna vrednost kvantifikovane radioaktivnosti (vidi tačku ix iznad) za tu koncentraciju antitela, MR je prosečna kvantifikovana radioaktivnost (vidi tačku ix iznad) za MR kontrole (vidi tačku v iznad), a SR je prosečna kvantifikovana radioaktivnost (vidi tačku ix iznad) za SR kontrole (vidi tačku vi iznad);

4) "povećanje ADCC" je definisano ili kao povećanje maksimalnog procenta specifične lize koje se zapaža unutar koncentracionog opsega antitela testiranog gore i/ili smanjenje koncentracije antitela neophodno da se postigne polovina maksimalnog procenta specifične lize koja se zapaža unutar koncentracionog opsega antitela testiranog gore. Povećanje ADCC je u odnosu na ADCC, mereno gornjim testom, posredovano istim antitelom, koje je proizvedeno istim tipom ćelija domaćina, korišćenjem istih standardnih postupaka proizvodnje, prečišćavanja, formulisanja i čuvanja, koji su poznati stručnjacima u ovoj oblasti, ali koje nije proizvedeno u ćelijama domaćina konstruisanim da prekomerno eksprimiraju GnTIII.

Pomenuta „povećana ADCC“ može se dobiti glikokonstrukcijom pomenutih antitela, što znači pojačanje pomenutih prirodnih, ćelijski posredovanih efektorskih funkcija monoklonskih antitela konstruisanjem njihove oligosaharidne komponente, kako su opisali Umana, P. i sar. Nature Biotechnol.17 (1999) 176-180 i US 6.602.684.

Izraz „citotoksičnost koja zavisi od komplementa (CDC)“ odnosi se na lizu humanih tumorskih ciljnih ćelija antitelom u prisustvu komplementa. CDC se poželjno meri tretiranjem preparata ćelija koje eksprimiraju CD20 anti-CD20 antitelom u prisustvu komplementa. CDC se nalazi ukoliko antitelo u koncentraciji od 100 nM indukuje lizu (ćelijsku smrt) 20% ili više tumorskih ćelija nakon 4 sata. Test se poželjno izvodi sa tumorskim ćelijama obeleženim sa

<51>Cr ili Eu, i merenjem oslobođenog<51>Cr ili Eu. Kontrole obuhvataju inkubaciju tumorskih ciljnih ćelija sa komplementom, ali bez antitela.

Antitelo „rituksimab“ (primer za anti-CD20 antitelo tipa I) je genetski konstruisano himerno humano monoklonsko antitelo koje sadrži gama 1 mišji konstantni domen, usmereno protiv humanog CD20 antigena.

Antitelo „rituksimab“ (primer za anti-CD20 antitelo tipa I) je genetski konstruisano himerno humano monoklonsko antitelo koje sadrži gama 1 mišji konstantni domen, usmereno protiv humanog CD20 antigena. Ovo himerno antitelo sadrži humane gama 1 konstantne domene i identifikuje se nazivom „C2B8“ u US 5.736.137 (Anderson i sar.) od 17. aprila 1998.

1

godine, koji je dobila kompanija „IDEC Pharmaceuticals Corporation“. Rituksimab je odobren za lečenje pacijenata sa relapsnim ili refraktornim CD20 pozitivnim B-ćelijskim ne-Hodžkinovim limfomom, niskog gradusa ili folikularnim. Ispitivanja mehanizma dejstva in vitro su pokazala da rituksimab ispoljava humanu citotoksičnost koja zavisi od komplementa (CDC) (Reff, M.E. i sar. Blood 83 (1994) 435-445). Sem toga, ispoljava značajnu aktivnost u testovima koji mere ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC). Rituksimab nije afukozilovan.

Tabela 2

Termin „humanizovano B-Ly1 antitelo“ se odnosi na humanizovano B-Ly1 antitelo, kako je izloženo u WO 2005/044859 i WO 2007/031875, koje je dobijeno od mišjeg monoklonskog anti-CD20 antitela B-Ly1 (varijabilni region mišjeg teškog lanca (VH): SEQ ID NO: 1; varijabilni region mišjeg lakog lanca (VL): SEQ ID NO: 2 (vidi Poppema, S. i Visser, L., Biotest Bulletin 3 (1987) 131-139) himerizacijom sa humanim konstantnim domenom iz IgG1 i zatim humanizacijom (vidi WO 2005/044859 i WO 2007/031875). Ova „humanizovana B-Ly1 antitela“ su detaljno izložena u WO 2005/044859 i WO 2007/031875.

U jednom otelotvorenju, „humanizovano B-Ly1 antitelo“ ima varijabilni region teškog lanca (VH) izabran iz grupe od SEQ ID NO: 3 do SEQ ID NO: 19 (B-HH2 do B-HH9 i B-HL8 do B-HL17 iz WO 2005/044859 i WO 2007/031875). U jednom specifičnom otelotvorenju, takav varijabilni domen je izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 i SEQ ID NO: 15 (B-HH2, BHH-3, B-HH6, B-HH8, B-HL8, B-HL11 i B-HL13 iz WO 2005/044859 i WO 2007/031875). U jednom specifičnom otelotvorenju, „humanizovano B-Ly1 antitelo“ ima varijabilni region lakog lanca (VL) iz SEQ ID NO: 20 (B-KV1 iz WO 2005/044859 i WO 2007/031875). U jednom specifičnom otelotvorenju, „humanizovano B-Ly1 antitelo“ ima varijabilni region

1

teškog lanca (VH) iz SEQ ID NO: 7 (B-HH6 iz WO 2005/044859 i WO 2007/031875) i varijabilni region lakog lanca (VL) iz SEQ ID NO: 20 (B-KV1 iz WO 2005/044859 i WO 2007/031875). Nadalje, u jednom otelotvorenju, humanizovano B-Ly1 antitelo je IgG1 antitelo. Prema pronalasku, takva afukozilovana humanizovana B-Ly1 antitela su glikokonstruisana (GE) u Fc regionu prema postupcima opisanim u WO 2005/044859, WO 2004/065540, WO 2007/031875, Umana, P. i sar. Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 i WO 99/154342. U jednom otelotvorenju, afukozilovani glikokonstruisani humanizovani B-Ly1 je B-HH6-B-KV1 GE. U jednom otelotvorenju, anti-CD20 antitelo je obinutuzumab (preporučeni INN, WHO informacije o lekovima, tom 26, br. 4, 2012, str. 453). Kao što se ovde koristi, obinutuzumab je sinonim za GA101. Trgovačko ime je GAZYVA ili GAZYVARO. Dokument SZO sa informacijama o leku zamenjuje sve prethodne verzije (npr. tom 25, br.1, 2011, str.75-76), a ranije je bio poznat kao afutuzumab (preporučeni INN, SZO informacije o lekovima, tom 23, br. 2, 2009, str.176; tom 22, br.2, 2008, str.124).

Termin "inhibitor MDM2" prema pronalasku odnosi se na agense koji sprečavaju aktivnost MDM2 sa IC50 od 0,001 µM do oko 2 µM, u jednom otelotvorenju od 0,002 µM do oko 2 µM.

U drugom otelotvorenju, inhibitori MDM2 su jedinjenja male molekulske mase sa molekulskom masom (Mm) manjom od 1500 daltona (Da).

Prema nekim aspektima otkrića, inhibitor MDM2 je jedinjenje izabrano od jedinjenja opisanih u WO2011/098398. Postupci proizvodnje pomenutih inhibitora MDM2 su takođe otkrivene u WO2011/098398. Pomenuti inhibitor MDM2 poželjno je jedinjenje prema formuli I ili prema formuli Ia kako je ovde opisano (formula II ili formula IIa iz WO2011/098398).

pri čemu

X je izabrano iz grupe koja se sastoji od H, F, CI, Br, I, cijano, nitro, etinil, ciklopropil, metil, etil, izopropil, vinil i metoksi,

1

Y je jedna do četiri grupe nezavisno izabrane iz grupe koja se sastoji od H, F, CI, Br, I, CN, OH, nitro, niži alkil, cikloalkil, niži alkoksi, niži alkenil, cikloalkenil, niži alkinil, aril, heteroaril, heterocikl, COOR’, OCOR’, CONR’R”, NR’COR”, NR”SO2R’, SO2NR’R”, i NR’R”, pri čemu

R’ i R” su nezavisno izabrani od H, niži alkil, supstituisani niži alkil, niži cikloalkil, supstituisani niži cikloalkil, niži alkenil, supstituisani niži alkenil, niži cikloalkenil, supstituisani niži cikloalkenil, aril, supstituisani aril, heteroaril, supstituisani heteroaril, heterocikl, ili supstituisani heterocikl,

i pri čemu R’ i R” mogu nezavisno da se povežu i da stvore cikličnu strukturu izabranu između supstituisanog ili nesupstituisanog cikloalkila, supstituisanog ili nesupstituisanog cikloalkenila, supstituisanog ili nesupstituisanog heteroarila, ili supstituisanog ili nesupstituisanog heterocikla,

R1je izabran iz grupe koju čine niži alkil, supstituisani niži alkil, niži alkenil, supstituisani niži alkenil, aril, supstituisani aril, heteroaril, supstituisani heteroaril, heterocikl, supstituisani heterocikl, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, cikloalkenil, i supstituisani cikloalkenil,

R2je vodonik ili niži alkil,

R3je H ili niži alkil,

R5je izabran iz grupe koja se sastoji od: niži alkil, supstituisani niži alkil, niži alkenil, supstituisani niži alkenil, aril, supstituisani aril, heteroaril, supstituisani heteroaril, heterocikl, supstituisani heterocikl, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, cikloalkenil, i supstituisani cikloalkenil,

R4je vodonik,

R6i R7su izabrani iz grupe koja se sastoji od (CH2)n-R’, (CH2)n-NR’R’’, (CH2)n-NR’COR’’, (CH2)n-NR’SO2R’’, (CH2)n-COOH, (CH2)n-COOR’, (CH2)n-CONR’R’’, (CH2)n-OR’, (CH2)n-SR’, (CH2)n-SOR’, (CH2)n-SO2R’, (CH2)n-COR’, (CH2)n-SO3H, (CH2)n-SONR’R’’, (CH2)n-SO2NR’R’’, (CH2CH2O)m-(CH2)n-R’, (CH2CH2O)m-(CH2)n-OH, (CH2CH2O)m-(CH2)n-OR’, (CH2CH2O)m-(CH2)n-NR’R’’, (CH2CH2O)m-(CH2)n-NR’COR’’, (CH2CH2O)m-(CH2)n-NR’SO2R’’, (CH2CH2O)m-(CH2)n-COOH, (CH2CH2O)m-(CH2)n-COOR’, (CH2CH2O)m-(CH2)n-CONR’R’’, (CH2CH2O)m-(CH2)n-SO2R’, (CH2CH2O)m-(CH2)n-COR’, (CH2CH2O)m-(CH2)n-SONR’R’’, (CH2CH2O)m-(CH2)n-SO2NR’R’’, (CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-R’, (CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-OH, (CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-OR’, (CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-NR’R’’, (CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-NR’COR’’, (CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-NR’SO2R’’, (CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-COOH, (CH2)p-(CH2CH2O)m-

1

(CH2)n-COOR’, (CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-CONR’R’’, (CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-SO2R’, (CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-COR’, (CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-SONR’R’’, (CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-SO2NR’R’’, −COR’, −SOR’ i SO2R’

pri čemu su R’ i R” kao iznad,

m, n i p su nezavisno od 0 do 6

i njihove farmaceutski prihvatljive soli i estri.

Posebno su poželjna jedinjenja formule I, pri čemu

X je F, Cl ili Br,

Y je jedna do dve grupe nezavisno izabrane iz grupe koja se sastoji od H, F, CI, Br, I, CN, OH, nitro, niži alkil, cikloalkil, niži alkoksi, niži alkenil, niži cikloalkenil i niži alkinil, R1je izabran iz grupe koja se sastoji od: niži alkil, supstituisani niži alkil, niži alkenil, supstituisani niži alkenil, aril, supstituisani aril, heteroaril, supstituisani heteroaril, heterocikl, supstituisani heterocikl, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, cikloalkenil, i supstituisani cikloalkenil,

R2je vodonik,

R3je H,

R5je izabran iz grupe koja se sastoji od: aril, supstituisani aril, heteroaril i supstituisani heteroaril,

R4je vodonik,

R6i R7su izabrani iz grupe koja se sastoji od (CH2)n-R’, (CH2)n-NR’R’’, (CH2)n-NR’COR’’, (CH2)n-NR’SO2R’’, (CH2)n-COOH, (CH2)n-COOR’, (CH2)n-CONR’R’’, (CH2)n-OR’, (CH2)n-SR’, (CH2)n-SOR’, (CH2)n-SO2R’, (CH2)n-COR’, (CH2)n-SO3H, (CH2)n-SONR’R’’, (CH2)n-SO2NR’R’’, (CH2CH2O)m-(CH2)n-R’, (CH2CH2O)m-(CH2)n-OH, (CH2CH2O)m-(CH2)n-OR’, (CH2CH2O)m-(CH2)n-NR’R’’, (CH2CH2O)m-(CH2)n-NR’COR’’, (CH2CH2O)m-(CH2)n-NR’SO2R’’, (CH2CH2O)m-(CH2)n-COOH, (CH2CH2O)m-(CH2)n-COOR’, (CH2CH2O)m-(CH2)n-CONR’R’’, (CH2CH2O)m-(CH2)n-SO2R’, (CH2CH2O)m-(CH2)n-COR’, (CH2CH2O)m-(CH2)n-SONR’R’’, (CH2CH2O)m-(CH2)n-SO2NR’R’’, (CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-R’, (CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-OH, (CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-OR’, (CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-NR’R’’, (CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-NR’COR’’, (CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-NR’SO2R’’, (CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-COOH, (CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-COOR’, (CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-CONR’R’’, (CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-SO2R’, (CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-COR’, (CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-SONR’R’’, (CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-SO2NR’R’’, −COR’, −SOR’ i SO2R’, pri čemu

1

R’ i R" su nezavisno izabrani od: H, niži alkil, supstituisani niži alkil, niži cikloalkil, supstituisani niži cikloalkil, niži alkenil, supstituisani niži alkenil, niži cikloalkenil, supstituisani niži cikloalkenil, aril, supstituisani aril, heteroaril, supstituisani heteroaril, heterocikl, ili supstituisani heterocikl, i naznačeno time što R’ i R” mogu takođe nezavisno da se vežu i da stvore cikličnu strukturu izabranu od supstituisanog ili nesupstituisanog cikloalkila, supstituisanog ili nesupstituisanog cikloalkenila, supstituisanog ili nesupstituisanog heteroarila ili supstituisanog ili nesupstituisanog heterocikla,

m, n i p su nezavisno od 0 do 6

i njihove farmaceutski prihvatljive soli i estri.

Dalje su poželjna jedinjenja formule I, naznačena time što:

X je F, Cl ili Br,

Y je monosupstituišuća grupa izabrana između H ili F, a

R1je izabran iz grupe koja se sastoji od: niži alkil, supstituisani niži alkil, niži alkenil, supstituisani niži alkenil, heterocikl, supstituisani heterocikl, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, cikloalkenil i supstituisani cikloalkenil.

Dalje poželjan R1je supstituisani niži alkil odabran od:

gde su i R8i R9metil, ili su vezani formirajući ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil ili acikloheksil grupu,

R10je (CH2)m-R11,

m je 0, 1 ili 2,

R11je odabran od sledećeg: vodonik, hidroksil, niži alkil, niži alkoksi, aril, supstituisani aril, heteroaril, supstituisani heteroaril, heterocikl ili supstituisani heterocikl,

R2je H,

R3je H,

R5je supstituisani fenil izabran od:

W je F, Cl ili Br,

V je H ili F,

2

R4je vodonik,

jedan od R6i R7je vodonik a drugi je (CH2)n-R’,

n je 0 ili 1 i

R’ je izabran od: aril, supstituisani aril, heteroaril, supstituisani heteroaril, heterocikl ili supstituisani heterocikl.

U drugim aspektima otkrića, predmetni pronalazak je usmeren na jedinjenja formule Ia

pri čemu R6i sve promenljive i supstituenti koji su pomenuti u definicijama za R6imaju značenja data za formulu I iznad.

U drugim aspektima, obezbeđena su jedinjenja formule Ia, pri čemu R6je -(CH2)n-R', i R’ je cikloheksil, ili 5- do 10-člani, mono- ili biciklični aromatični ugljovodonik, pri čemu 1 ili 2 ugljenikova atoma mogu da budu zamenjena sa N, S ili O, i pri čemu bilo koji od gorepomenutih cikloheksil ili aromatičnih ugljovodonika može biti supstituisan jednom ili dva puta grupom nezavisno izabranom od niže alkil, niže alkenil, niže alkinil, diokso-niža alkilen (formirajući, npr. benzodioksil grupu), halogen, hidroksi, CN, CF3, NH2, N(H, niža alkil), N(niža alkil)2, aminokarbonil, karboksi, NO2, niža alkoksi, tio-niža alkoksi, niža alkilsufonil, aminosulfonil, niža alkilkarbonil, niža alkilkarboniloksi, niža alkoksikarbonil, niža alkilkarbonil-NH, fluor-niža alkil, fluor-niža alkoksi, niža alkoksikarbonil-niža alkoksi, karboksi-niža alkoksi, karbamoil-niža alkoksi, hidroksi-niža alkoksi, NH2-niža alkoksi, N(H, niža alkil)-niža alkoksi, N(niža alkil)2-niža alkoksi, niža alkil-1-oksiranil-niža alkoksi-niža alkil, 2-okso-pirolidin-1-il, (1,1-diokso)-2-izotiazolidin, 3-niža alkil sulfinil, supstituisani ili nesupstituisani heterociklični prsten, supstituisani ili nesupstituisani aril prsten, supstituisani ili nesupstituisani heteroaril prsten, trifluor-niži alkilsulfonilamino-aril, niži alkil sulfonilaminokarbonil, niži alkil sulfonilaminokarbonil-aril, hidroksikarbamoil-fenil, benziloksi-niža alkoksi, mono- ili di-niža alkil supstituisana amino-sulfonil i niža alkil koja opciono može biti supstituisana halogenom, hidroksi grupom, NH2, N(H, niža alkil) ili N(niža alkil)2; i

n predstavlja 0 ili 1.

U drugim aspektima, obezbeđena su jedinjenja formule la, pri čemu

R6 je -(CH2)n-R’, i

R’ je fenil, piridinil, pirazinil ili pirimidinil, gde svaki može biti nesupstituisan ili jednom ili dvaput supstituisan supstituentom nezavisno izabranim od halogena, C1-6 alkoksi, C1-6 alkil, hidroksikarbonil, karboksi, karboksi C1-6 alkoksi, okso i CN; i

n je 0.

Posebno su poželjna jedinjenja formule Ia, koja su izabrana od

rac-4-({[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-metil)-cikloheksankarboksilna kiselina metil estar,

rac-4-({[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-metil)-cikloheksankarboksilna kiselina, rac-4-({[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-metil)-2-metoksi-benzojeva kiselina metil estar,

rac-4-({[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-metil)-2-metoksi-benzojeva kiselina, rac-4-({[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-metil)-2-fluor-benzojeva kiselina metil estar,

rac-4-({[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-metil)-2-fluor-benzojeva kiselina, hiralni 5-({[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-metil)-piridin-2-karboksilna kiselina metil estar,

hiralna 5-({[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-metil)-piridin-2-karboksilna kiselina, hiralni 6-({[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-metil)-nikotinska kiselina etil estar, hiralna 6-({[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-metil)-nikotinska kiselina,

rac 4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-2-etoksi-benzojeva kiselina,

hiralni (2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karboksilna kiselina (4-hidrazinokarbonil-fenil)-amid, hiralni [2-(4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-fenil)-etil]-karbaminska kiselina terc-butil estar,

hiralni (2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karboksilna kiselina [4-(2-amino-etil)-fenil]-amid,

hiralna 5-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-pirazin-2-karboksilna kiselina,

hiralna 4-(((2R,3S,4R,5S)-3-(3-hlor-2-fluorfenil)-4-(4-hlor-2-fluorfenil)-4-cijano-5-neopentilpirolidin-2-karboksamido)metil)-2-metoksibenzojeva kiselina,

hiralna 4-({[(2S,3R,4S,5R)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-metil)-2-metoksi-benzojeva kiselina, hiralni metil 3-(4-((2R,3S,4R,5S)-3-(3-hlor-2-fluorfenil)-4-(4-hlor-2-fluorfenil)-4-cijano-5-neopentilpirolidin-2-karboksamido)fenil)propanoat,

hiralna 3-(4-((2R,3S,4R,5S)-3-(3-hlor-2-fluorfenil)-4-(4-hlor-2-fluorfenil)-4-cijano-5-neopentilpirolidin-2-karboksamido)fenil)propanska kiselina,

hiralna-4-(((2S,3R,4S,5R)-3-(3-hlor-2-fluorfenil)-4-(4-hlor-2-fluorfenil)-4-cijano-5-neopentilpirolidin-2-karboksamido)metil)-2-fluorbenzojeva kiselina,

hiralna 4-(((2R,3S,4R,5S)-3-(3-hlor-2-fluorfenil)-4-(4-hlor-2-fluorfenil)-4-cijano-5-neopentilpirolidin-2-karboksamido)metil)-2-fluorbenzojeva kiselina,

hiralni (2R,3S,4R,5S)-3-(3-hlor-2-fluorfenil)-4-(4-hlor-2-fluorfenil)-4-cijano-N-(2-morfolinopirimidin-5-il)-5-neopentilpirolidin-2-karboksamid,

hiralni (2R,3S,4R,5S)-3-(3-hlor-2-fluorfenil)-4-(4-hlor-2-fluorfenil)-4-cijano-5-neopentil-N-(pirimidin-5-il)pirolidin-2-karboksamid,

hiralni (2S,3R,4S,5R)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karboksilna kiselina (4-dimetilaminometil-fenil)-amid, (2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karboksilna kiselina (4-dimetilaminometil-fenil)-amid, hiralni metil 5-((2R,3S,4R,5S)-3-(3-hlor-2-fluorfenil)-4-(4-hlor-2-fluorfenil)-4-cijano-5-neopentilpirolidin-2-karboksamido)-1H-benzo[d]imidazol-2-karboksilat,

hiralna-5-((2R,3S,4R,5S)-3-(3-hlor-2-fluorfenil)-4-(4-hlor-2-fluorfenil)-4-cijano-5-neopentilpirolidin-2-karboksamido)-1H-benzo[d]imidazol-2-karboksilna kiselina,

2

hiralni metil 5-((2R,3S,4R,5S)-3-(3-hlor-2-fluorfenil)-4-(4-hlor-2-fluorfenil)-4-cijano-5-neopentilpirolidin-2-karboksamido)benzofuran-2-karboksilat,

hiralna 5-((2R,3S,4R,5S)-3-(3-hlor-2-fluorfenil)-4-(4-hlor-2-fluorfenil)-4-cijano-5-neopentilpirolidin-2-karboksamido)benzofuran-2-karboksilna kiselina,

hiralni metil 4-(4-((2R,3S,4R,5S)-3-(3-hlor-2-fluorfenil)-4-(4-hlor-2-fluorfenil)-4-cijano-5-neopentilpirolidin-2-karboksamido)fenil)butanoat,

hiralna 4-(4-((2R,3S,4R,5S)-3-(3-hlor-2-fluorfenil)-4-(4-hlor-2-fluorfenil)-4-cijano-5-neopentilpirolidin-2-karboksamido)fenil)butanska kiselina,

hiralni metil 5-((2R,3S,4R,5S)-3-(3-hlor-2-fluorfenil)-4-(4-hlor-2-fluorfenil)-4-cijano-5-neopentilpirolidin-2-karboksamido)benzo[d]oksazol-2-karboksilat,

hiralna 5-((2R,3S,4R,5S)-3-(3-hlor-2-fluorfenil)-4-(4-hlor-2-fluorfenil)-4-cijano-5-neopentilpirolidin-2-karboksamido)benzo[d]oksazol-2-karboksilna kiselina,

hiralni (2R,3S,4R,5S)-N-(benzo[d]oksazol-5-il)-3-(3-hlor-2-fluorfenil)-4-(4-hlor-2-fluorfenil)-4-cijano-5-neopentilpirolidin-2-karboksamid,

rac-(4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-benzil)-karbaminska kiselina tert-butil estar, rac-(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karboksilna kiselina (4-aminometil-fenil)-amid, (2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karboksilna kiselina [4-(metansulfonilamino-metil)-fenil]-amid, 1-(4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-fenil)-piperidin-4-karboksilna kiselina etil estar, 1-(4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-fenil)-piperidin-4-karboksilna kiselina,

rac-(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karboksilna kiselina (4-dimetilaminometil-fenil)-amid,

rac-5-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-2-pirolidin-1-il-benzojeva kiselina,

rac-4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-4-metil-piperidin-1-karboksilna kiselina terc-butil estar,

rac-(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karboksilna kiselina (4-metil-piperidin-4-il)-amid,

rac-(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karboksilna kiselina (1-metansulfonil-4-metil-piperidin-4-il)-amid, metil 1-(4-((2R,3S,4R,5S)-3-(3-hlor-2-fluorfenil)-4-(4-hlor-2-fluorfenil)-4-cijano-5-neopentilpirolidin-2-karboksamido)fenil)pirolidin-2-karboksilat,

1-(4-((2R,3S,4R,5S)-3-(3-hlor-2-fluorfenil)-4-(4-hlor-2-fluorfenil)-4-cijano-5-neopentilpirolidin-2-karboksamido)fenil)pirolidin-2-karboksilna kiselina,

hiralna 5-{[(2R,3S,4R,5S)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-1H-pirol-2-karboksilna kiselina, hiralni 5-{[(2R,3S,4R,5S)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-1H-pirol-2-karboksilna kiselina etil estar, hiralna (R)-2-(4-{[(2R,3S,4R,5S)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-fenil)-buterna kiselina, hiralna (S)-2-(4-{[(2R,3S,4R,5S)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-fenil)-buterna kiselina, hiralni (S)-2-{[(2R,3S,4R,5S)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-3-tiazol-4-il-propanska kiselina metil estar,

hiralni (S)-2-{[(2S,3R,4S,5R)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-3-tiazol-4-il-propanska kiselina metil estar,

hiralna (S)-2-{[(2R,3S,4R,5S)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-3-tiazol-4-il-propanska kiselina, hiralna (S)-2-{[(2S,3R,4S,5R)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-3-tiazol-4-il-propanska kiselina, hiralna 4-{[(2R,3S,4R,5S)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-1H-indol-2-karboksilna kiselina,

rac (2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karboksilna kiselina (5-jod-piridin-2-il)-amid,

2-hlor-4-{[(2R,3S,4R,5S)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-benzojeva kiselina,

6-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-nikotinska kiselina,

(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karboksilna kiselina piridin-2-ilamid,

2

(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karboksilna kiselina piridin-4-ilamid,

5-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-piridin-2-karboksilna kiselina, (2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karboksilna kiselina piridin-3-ilamid,

(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karboksilna kiselina (4-jod-3,5dimetil-fenil)-amid,

4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-2-fluor-benzojeva kiselina terc-butil estar,

4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-2-fluor-benzojeva kiselina,

4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-3-fluor-benzojeva kiselina,

4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-2-trifluormetil-benzojeva kiselina, (2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karboksilna kiselina (4-jod-2-trifluormetoksi-fenil)-amid,

4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-3-trifluormetoksi-benzojeva kiselina metil estar, 4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-3-trifluormetoksi-benzojeva kiselina,

6-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-nikotinska kiselina metil estar, (2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karboksilna kiselina (6-jod-piridin-3-il)-amid,

5-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-piridin-2-karboksilna kiselina metil estar,

4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-3-metoksi-benzojeva kiselina metil estar,

4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-3-metoksi-benzojeva kiselina,

2

(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karboksilna kiselina (6-karbamoil-naftalen-2-il)-amid, (2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karboksilna kiselina (4-karbamoil-3-hlor-fenil)-amid, (2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karboksilna kiselina (4-karbamoil-3-trifluormetil-fenil)-amid, 5-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-piridin-2-karboksilna kiselina,

4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-3-fluor-benzojeva kiselina metil estar,

4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-3-hlor-benzojeva kiselina metil estar,

4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-3-hlor-benzojeva kiselina, (2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karboksilna kiselina (4-karbamoil-2-fluor-fenil)-amid, (2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karboksilna kiselina (4-karbamoil-2-metoksi-fenil)-amid,

4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-2,5-difluor-benzojeva kiselina metil estar, 4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-2,5-difluor-benzojeva kiselina, (2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karboksilna kiselina (3,5-difluor-4-jod-fenil)-amid,

4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-2,6-difluor-benzojeva kiselina,

4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-3-hidroksi-benzojeva kiselina, (2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karboksilna kiselina (4-karbamoil-3-metoksi-fenil)-amid, (2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karboksilna kiselina (4-karbamoil-3-trifluormetoksi-fenil)-amid, (2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karboksilna kiselina (4-karbamoil-3-fluor-fenil)-amid,

2

(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karboksilna kiselina (4-karbamoil-2-hlor-fenil)-amid,

4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-2-fluor-5-metoksi-benzojeva kiselina metil estar, 4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-2-fluor-5-metoksi-benzojeva kiselina,

2-(4-{[(2R,3S,4R,5S)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-fenil)-4-metil-pentanska kiselina,

hiralni 2-(4-{[(2S,3R,4S,5R)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-fenil)-2-metil-propanska kiselina metil estar,

hiralna 2-(4-{[(2R,3S,4R,5S)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-fenil)-2-metil-propanska kiselina, hiralni (2S,3R,4S,5R)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karboksilna kiselina [4-(1-metil-1-metilkarbamoil-etil)-fenil]-amid, hiralni (2S,3R,4S,5R)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karboksilna kiselina {4-[1-(3-hidroksi-propilkarbamoil)-1-metiletil]-fenil}amid, i

hiralni (2S,3R,4S,5R)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karboksilna kiselina [4-(1-karbamoil-1-metil-etil)-fenil]-amid.

U specifikaciji gde je naznačeno, različite grupe mogu biti supstituisane sa 1 do 5, ili poželjno 1-3 supstituenta nezavisno izabrana iz grupe koja se sastoji od niže alkil, niže alkenil, niže alkinil, diokso-niže alkilen (formirajući, npr. benzodioksil grupu), halogena, hidroksi grupe, CN, CF3, NH2, N(H, niža alkil), N(niža alkil)2, aminokarbonil, karboksi, NO2, niže alkoksi, tio-niža alkoksi, niže alkilsufonil, aminosulfonil, niže alkilkarbonil, niže alkilkarboniloksi, niže alkoksikarbonil, niže alkilkarbonil-NH, fluor-niža alkil, fluor-niža alkoksi, niža alkoksikarbonil-niža alkoksi, karboksi-niža alkoksi, karbamoil-niža alkoksi, hidroksi-niža alkoksi, NH2-niža alkoksi, N(H, niža alkil)-niže alkoksi, N(niža alkil)2-niža alkoksi, niža alkil-1-oksiranil-niža alkoksi-niža alkil, 2-okso-pirolidin-1-il, (1,1-diokso)-2-izotiazolidin, 3-niža alkil sulfinil, supstituisani ili nesupstituisani heterociklični prsten, supstituisani ili nesupstituisani aril prsten, supstituisani ili nesupstituisani heteroaril prsten, trifluor-niža alkilsulfonilamino-aril, niža alkil sulfonilaminokarbonil, niža alkil sulfonilaminokarbonil-aril, hidroksikarbamoil-fenil, benziloksi-niža alkoksi, mono- ili di-niža alkil supstituisana amino-sulfonil i niža alkil koja opciono može biti supstituisana halogenom,

2

hidroksi grupom, NH2, N(H, niža alkil) ili N(niža alkil)2grupom. Poželjni supstituenti za cikloalkil, cikloalkenil, aril, heteroaril i heterociklične prstenove su halogen, niži alkoksi, niži alkil, hidroksikarbonil, karboksi, karboksi niži alkoksi, okso i CN. Poželjni supstituenti za alkil su alkoksi i N(niži alkil)2.

Termin "alkil" ukazuje na zasićene ugljovodonične grupe ravnog ili razgranatog niza koje imaju od 1 do oko 20 atoma ugljenika, uključujući grupe koje imaju od 1 do oko 7 atoma ugljenika. U pojedinim aspektima, alkil supstituenti mogu biti niži alkil supstituenti. Termin "niži alkil" se odnosi na alkil grupe koje imaju od 1 do 6 atoma ugljenika, a u pojedinim aspektima od 1 do 4 atoma ugljenika. Primeri za alkil grupe uključuju, ali se ne ograničavaju na metil, etil, n-propil, i-propil, n-butil, s-butil, t-butil, n-pentil i s-pentil.

Kao što je ovde upotrebljen, "cikloalkil" treba da se odnosi na svaki stabilan monociklični ili policiklični sistem, koji se sastoji samo od atoma ugljenika, a svaki od prstenova je zasićen, a termin "cikloalkenil" treba da se odnosi na svaki stabilan monociklični i policiklični sistem, koji se sastoji samo od atoma ugljenika, sa bar jednim od prstenova koji je delimično nezasićen. Primeri za cikloalkil grupe uključuju, ali se ne ograničavaju na ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, cikloheksil, cikloheptil, adamantil, ciklooktil, bicikloalkile, uključujući biciklooktane, kao [2.2.2]biciklooktan ili [3.3.0]biciklooktan, biciklononane, kao [4.3.0]biciklononan, i biciklodekane, kao [4.4.0]biciklodekan (dekalin), ili spiro jedinjenja. Primeri za cikloalkenil grupe uključuju, ali se ne ograničavaju na ciklopentenil ili cikloheksenil.

Termin "alkenil", kao što je ovde upotrebljen, označava nezasićenu alifatičnu ugljovodoničnu grupu ravnog ili razgranatog niza koja sadrži jednu dvostruku vezu i ima 2 do 6, poželjno 2 do 4 atoma ugljenika. Primeri za takvu "alkenil grupu" su vinil etenil, alil, izopropenil, 1-propenil, 2-metil-1-propenil, 1-butenil, 2-butenil, 3-butenil, 2-etil-1-butenil, 3-metil-2-butenil, 1-pentenil, 2-pentenil, 3-pentenil, 4-pentenil, 4-metil-3-pentenil, 1-heksenil, 2-heksenil, 3-heksenil, 4-heksenil i 5-heksenil.

Termin "alkinil", kao š to je ovde upotrebljen, označava nezasićenu alifatičnu ugljovodoničnu grupu ravnog ili razgranatog niza koja sadrži jednu trostruku vezu i ima 2 do 6, poželjno 2 do 4 atoma ugljenika. Primeri za takvu "alkinil grupu" su etinil, 1-propinil, 2-propinil, 1-butinil, 2-butinil, 3-butinil, 1-pentinil, 2-pentinil, 3-pentinil, 4-pentinil, 1-heksinil, 2-heksinil, 3-heksinil, 4-heksinil i 5-heksinil.

Termin "halogen" kao što je upotrebljen u definicijama znači fluor, hlor, brom ili jod, poželjno je fluor i hlor.

"Aril" znači jednovalentni, monociklični ili biciklični, aromatični karbociklični ugljovodonični radikal, poželjno 6- do 10-člani aromatični prstenasti sistem. Poželjne aril grupe

2

uključuju, ali se ne ograničavaju na fenil, naftil, tolil i ksilil. Tamo gde je aril grupa biciklična, poželjna grupa je 1,3-diokso-2,3-dihidro-1H-izoindol-5-il grupa.

"Heteroaril" označava aromatični heterociklični prstenasti sistem koji sadrži do dva prstena. Poželjne heteroaril grupe uključuju, ali se ne ograničavaju na tienil, furil, indolil, pirolil, piridinil, pirazinil, oksazolil, tiaksolil, hinolinil, pirimidinil, imidazol supstituisanu ili nesupstituisanu triazolil i supstituisanu ili nesupstituisanu tetrazolil.

U slučaju aril ili heteroaril koji su biciklični, podrazumeva se da jedan prsten može biti aril, dok je drugi heteroaril, i oba su supstituisana ili nesupstituisana.

"Heterocikl" ili "heterociklični prsten" označava supstituisani ili nesupstituisani, 5- do 8-člani mono- ili biciklični nearomatični ugljovodonik, naznačen time što je 1 do 3 atoma ugljenika zamenjeno heteroatomom izabranim od atoma azota, kiseonika ili sumpora. Primeri uključuju pirolidin-2-il; pirolidin-3-il; piperidinil; morfolin-4-il i slične, koji redom mogu biti supstituisani. "Heteroatom" označava atom izabran između N, O i S.

"Alkoksi, alkoksil ili niža alkoksi" odnosi se na svaku od gorepomenutih nižih alkil grupa vezanu za atom kiseonika. Tipične niže alkoksi grupe uključuju metoksi, etoksi, izopropoksi ili propoksi, butiloksi i slično. Nadalje, uključeni u značenje alkoksi su višestruki alkoksi bočni nizovi, npr. etoksi etoksi, metoksi etoksi, metoksi etoksi etoksi i slično, i supstituisani alkoksi bočni nizovi, npr. dimetilamino etoksi, dietilamino etoksi, dimetoksifosforil metoksi i slično.

"Farmaceutski prihvatljiv", kao što je farmaceutski prihvatljiv nosač, ekscipijens, itd, znači farmakološki prihvatljiv i suštinski netoksičan za ispitanika kome je dato konkretno jedinjenje.

"Farmaceutski prihvatljiva so" ukazuje na klasične kisele adicione soli ili bazne adicione soli koje zadržavaju biološku efikasnost i osobine jedinjenja iz predmetnog pronalaska, i nastaju iz pogodnih netoksičnih organskih ili neorganskih kiselina, ili organskih ili neorganskih baza. Uzorci kiselih adicionih soli uključuju one dobijene od neorganskih kiselina kao što su hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, jodovodonična kiselina, sumporna kiselina, sulfaminska kiselina, fosforna kiselina i azotna kiselina, kao i one koje se dobijaju iz organskih kiselina, kao što su p-toluensulfonska kiselina, salicilna kiselina, metansulfonska kiselina, oksalna kiselina, sukcinska kiselina, limunska kiselina, jabučna kiselina, mlečna kiselina, fumarna kiselina, trifluorsirćetna kiselina, i slično. Primeri za bazne adicione soli uključuju one dobijene od amonijaka, kalijuma, natrijuma i kvaternernih amonijum hidroksida, kao što je, na primer, tetrametilamonijum hidroksid. Hemijska modifikacija farmaceutskog jedinjenja (tj. leka) u so predstavlja tehniku za postizanje poboljšane fizičke i hemijske stabilnosti, higroskopnosti, tečljivosti i rastvorljivosti jedinjenja koja je dobro poznata farmaceutskim hemičarima. Vidi npr., Ansel i sar. Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (6. izd.1995) str.196 i 1456-1457.

Jedinjenja formule I i Ia, kao i njihove soli koje imaju najmanje jedan asimetričan atom ugljenika, mogu biti prisutni kao racemske smeše ili različiti stereoizomeri. Različiti izomeri mogu se izolovati poznatim separacionim metodama, npr. hromatografijom.

Ovde objavljena jedinjenja koja su pokrivena formulom I ili Ia mogu da ispolje tautomeriju ili strukturnu izomeriju. Namera je da te formule obuhvate svaki tautomerni ili strukturni izomerni oblik tih jedinjenja, ili smešu takvih oblika, i nisu ograničene ni na jedan tautomerni ili strukturni izomerni oblik predstavljen gornjim formulama.

Najpoželjnije, inhibitor MDM2 je 4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-3-metoksibenzojeva kiselina kao u donjoj formuli, ili njena so, estar ili polimorf. Primer 448 iz WO2011/098398 opisuje postupak za pripremu navedenog jedinjenja. Pomenuto jedinjenje se takođe naziva MDM2(4) ili RG7388 ili RO5503781, koji se ovde koriste kao sinonimi.

Molekulska masa =616,4973

Molekulska formula =C31H29Cl2F2N3O4

Priprema inhibitora MDM2 se vrši kao što je opisano u WO2011/098398.

"So" se odnosi na soli jedinjenja, kao farmaceutski prihvatljiva so. Takve soli se mogu navesti kao soli sa alkalnim metalima (kalijum, natrijum i slično), soli sa zemnoalkalnim metalima (kalcijum, magnezijum i slično), amonijumove soli, soli sa farmaceutski prihvatljivim organskim aminima (tetrametilamonijum, trietilamin, metilamin, dimetilamin, ciklopentilamin, benzilamin, fenetilamin, piperidin, monoetanolamin, dietanolamin, tris(hidroksimetil)aminometan, lizin, arginin, N-metil-D-glukamin i slično), i kisele adicione soli (soli neorganskih kiselina (hidrohlorid, hidrobromid, hidrojodid, sulfat, fosfat, nitrat i slično) i soli organskih kiselina (acetat, trifluoracetat, laktat, tartarat, oksalat, fumarat, maleat,

1

benzoat, citrat, metansulfonat, etansulfonat, benzensulfonat, toluensulfonat, izetionat, glukuronat, glukonat i slično)).

„IC50“ ukazuje na koncentraciju konkretnog jedinjenja potrebnog da inhibira 50% specifične izmerene aktivnosti.

Oligosaharidna komponenta može značajno uticati na svojstva relevantna za efikasnost terapeutskog glikoproteina, uključujući fizičku stabilnost, otpornost na napad proteaze, interakcije sa imunim sistemom, farmakokinetiku, kao i specifičnu biološku aktivnost. Ova svojstva mogu zavisiti ne samo od prisustva ili odsustva oligosaharida, već isto tako i od njihovih specifičnih struktura. Mogu se postaviti izvesne generalizacije između strukture oligosaharida i funkcije glikoproteina. Na primer, određene oligosaharidne strukture posreduju brzi klirens glikoproteina iz krvotoka kroz interakcije sa specifičnim proteinima vezanim za ugljene hidrate, dok druge mogu biti vezane antitelima i aktivirati neželjene imune reakcije (Jenkins, N. i sar. Nature Biotechnol.14 (1996) 975-981).

Ćelije sisara su odlični domaćini za proizvodnju terapeutskih glikoproteina, zbog svoje sposobnosti da glikoziluju proteine u najkompatibilnijem obliku za ljudsku primenu (Cumming, D.A. i sar. Glycobiology 1 (1991) 115-130; Jenkins, N. i sar. Nature Biotechnol.

14 (1996) 975-981). Bakterije veoma retko glikoziluju proteine i, kao i druge vrste uobičajenih domaćina, kao što su kvasci, filamentozne gljive, insekti i ćelije biljaka, daju glikozilacione profile koji se povezuju sa brzim klirensom iz krvotoka, nepoželjnim imunolološkim interakcijama i, u nekim specifičnim slučajevima, smanjenom biološkom aktivnošću. Od ćelija sisara, jajne ćelije kineskog hrčka (CHO) se najčešće koriste tokom poslednje dve decenije. Osim što proizvode pogodne profile glikozilacije, ove ćelije omogućavaju konzistentno stvaranje genetički stabilnih, visoko produktivnih klonskih ćelijskih linija. Mogu se uzgajati do velikih gustina u jednostavnim bioreaktorima korišćenjem hranjive podloge bez seruma, i omogućiti razvoj bezbednih i reproduktivnih bioprocesa. Druge ćelije životinja koje se obično koriste uključuju bubrežne ćelije bebe hrčka (BHK), ćelije mijeloma NSO- i SP2/0-miša. Skorije je testirana i proizvodnja kod transgenih životinja (Jenkins, N. i sar. Nature Biotechnol.

14 (1996) 975-981).

Sva antitela sadrže ugljenohidratne strukture na konzervisanim položajima u konstantnim regionima teškog lanca, i svaki izotip ima različitu paletu N-vezanih ugljenohidratnih struktura, koje promenljivo utiču na sastav proteina, sekreciju ili funkcionalnu aktivnost (Wright, A. i Morrison, S.L. Trends Biotech.15 (1997) 26-32). Struktura povezanih N-vezanih ugljenih hidrata varira značajno, što zavisi od stepena obrade, i može obuhvatiti oligosaharide sa velikim sadržajem manoze, višestruko razgranate kao i biantenarne

2

kompleksne oligosaharide (Wright, A. i Morrison, S.L. Trends Biotech. 15 (1997) 26-32). Uobičajeno, postoji heterogena obrada jezgrenih oligosaharidnih struktura koje su vezane za naročito mesto glikozilacije, tako da čak i monoklonska antitela postoje kao višestruki glikooblici. Na sličan način, pokazalo se da se glavne razlike u glikozilaciji antitela javljaju među ćelijskim nizovima, a nešto manje razlike viđaju se za dati ćelijski niz koji je uzgajan pod različitim uslovima kultivacije (Lifely M. R. i sar. Glycobiology 5 (1995) 813-822).

Jedan od načina da se dobije veliki rast potencije, a da se održi jednostavan proizvodni proces i potencijalno izbegnu značajni, neželjeni sporedni efekti, jeste da se uvećaju prirodne, ćelijski posredovane efektorske funkcije monoklonskih antitela konstruisanjem njihove oligosaharidne komponente, kako su opisali Umana, P. i sar. Nature Biotechnol.17 (1999) 176-180 i US 6,602,684. Antitela IgG1 tipa, najčešće korišćena antitela u imunoterapiji kancera, su glikoproteini koji imaju očuvano N-vezano mesto glikozilacije na Asn297 u svakom CH2 domenu. Dva kompleksna biantenarna oligosaharida vezana za Asn297 su ubačena između CH2 domena, formirajući obimne kontakte sa skeletom polipeptida, i njihovo prisustvo je od suštinskog značaja za antitelo radi posredovanja efektorskih funkcija, kao što je ćelijska citotoksičnost koja zavisi od antitela (ADCC) (Lifely, M.R. i sar. Glycobiology 5 (1995) 813-822; Jefferis, R. i sar. Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76; Wright, A. i Morrison, S.L. Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32).

Prethodno je pokazano da prekomerna ekspresija u jajnim ćelijama kineskog hrčka (CHO) β(1,4)-N-acetil-glukozaminiltransferaze III („GnTIII7y“), glikoziltransferaze koja katalizuje formiranje bisektovanih oligosaharida, značajno povećava in vitro ADCC aktivnost himernog monoklonskog antineuroblastom antitela (chCE7) proizvedenog u konstruisanim CHO ć elijama (vidite Umana, P. i sar. Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180; i WO 99/154342).

Antitelo chCE7 pripada velikoj klasi nekonjugovanih monoklonskih antitela koja imaju veliki afinitet i specifičnost prema tumoru, ali su isuviše slaba da bi bila klinički korisna kada se proizvode u standardnim industrijskim ćelijskim linijama kojima nedostaje GnTIII enzim (Umana, P. i sar. Nature Biotechnol.17 (1999) 176-180). Ova studija je prva pokazala da veliko povećanje ADCC aktivnosti može da se dobije dizajniranjem ćelija koje proizvode antitela tako da eksprimiraju Gn TIII, što je takođe dovelo do povećanja udela bisektovanih oligosaharida vezanih za konstantne (Fc) regione, uključujući bisektovane, nefukozilovane oligosaharide, iznad nivoa nađenih u antitelima koja postoje u prirodi.

Termin „kancer“, kao što se ovde koristi, uključuje limfome, limfocitne leukemije, kancer pluća, nemikrocelularni karcinom pluća (NSCL), bronhioalveolarni ćelijski kancer pluća, kancer kostiju, kancer pankreasa, kancer kože, kancer glave ili vrata, kutani ili intraokularni melanom, kancer uterusa, kancer ovarijuma, rektalni kancer, kancer analnog regiona, kancer želuca, gastrični kancer, kancer kolona, kancer dojke, kancer uterusa, karcinom jajovoda, karcinom endometrijuma, karcinom cerviksa, karcinom vagine, karcinom vulve, Hodžkinovu bolest, kancer jednjaka, kancer tankog creva, kancer endokrinog sistema, kancer tiroidne žlezde, kancer paratiroidne žlezde, kancer nadbubrežne žlezde, sarkom mekog tkiva, kancer uretre, kancer penisa, kancer prostate, kancer bešike, kancer bubrega ili uretera, karcinom bubrežnih ćelija, karcinom bubrežne karlice, mezoteliom, hepatocelularni kancer, kancer žučnih puteva, neoplazme centralnog nervnog sistema (CNS), tumore kičmenog stuba, gliom moždanog stabla, glioblastom multiforme, astrocitome, švanome, ependimome, meduloblastome, meningiome, karcinome skvamoznih ćelija, adenom hipofize, uključujući refraktorne verzije svih gorenavedenih kancera, ili kombinaciju jednog ili više gorenavedenih kancera. U jednom otelotvorenju, termin kancer se odnosi na kancer koji eksprimira CD20.

Termin „ekspresija CD20“ antigena treba da naznači značajan nivo ekspresije CD20 antigena u ćeliji, poželjno na površini T ili B ćelije, još poželjnije B ćelije, tumora odnosno kancera, poželjno tumora koji nije čvrst. Pacijenti koji imaju „kancer koji eksprimira CD20“ mogu biti otkriveni standardnim testovima poznatim u struci. Na primer, ekspresija CD20 antigena može da se odredi pomoću imunohistohemijske (IHC) detekcije, FACS-a ili detekcije na osnovu PCR odgovarajuće mRNK.

Termin „kancer koji eksprimira CD20“ kao što se ovde koristi, odnosi se na sve kancere kod kojih ćelije kancera pokazuju ekspresiju CD20 antigena. Poželjno, kancer koji eksprimira CD20, kako je ovde korišćeno, odnosi se pre svega na limfome (poželjno B-ćelijske ne-Hodžkinove limfome (NHL)) i limfocitne leukemije. Takvi limfomi i limfocitne leukemije uključuju npr: a) folikularne limfome, b) limfome malih neotcepljenih ćelija/Burkitov limfom (uključujući endemski Burkitov limfom, sporadični Burkitov limfom i ne-Burkitov limfom), c) limfome marginalne zone (uključujući B-ćelijski limfom ekstranodalne marginalne zone (limfomi limfatičnog tkiva povezanog sa mukozom, MALT), B-ćelijski limfom nodalne marginalne zone i limfom slezinske marginalne zone), d) limfom ćelija omotača (MCL), e) limfom džinovskih ćelija (uključujući B-ćelijski difuzni limfom džinovskih ćelija (DLCL), difuzni limfom mešanih ćelija, imunoblastni limfom, primarni medijastinalni limfom B-ćelija, angiocentrični limfom-plućni limfom B-ćelija), f) leukemiju vlasastih ćelija, g) limfocitni limfom, Valdenstromovu makroglobulinemiju, h) akutnu limfocitnu leukemiju (ALL), hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL)/limfom malih limfocita (SLL), B-ćelijsku prolimfocitnu

4

leukemiju, i) neoplazme plazmatskih ćelija, mijelom plazma ćelija, multipli mijelom, plazmacitom, j) Hodžkinovu bolest.

U drugom otelotvorenju, pomenuti kancer koji eksprimira CD20 je B-ćelijski ne-Hodžkinov limfom (NHL). U drugom otelotvorenju, kancer koji eksprimira CD20 je limfom ćelija omotača (MCL), akutna limfocitna leukemija (ALL), hronična limfocitna leukemija (CLL), B-ćelijski limfom difuznih velikih ćelija (DLCL), Burkitov limfom, leukemija vlasastih ćelija, folikularni limfom, multipli mijelom, limfom marginalne zone, post-transplantacioni limfoproliferativni poremećaj (PTLD), limfom povezan sa HIV-om, Valdenstromova makroglobulinemija, ili primarni limfom CNS-a.

Termin „postupak lečenja“, „metoda terapije“, ili njemu ekvivalentni izrazi, kada se primenjuje, na primer, na kancer, odnosi se na postupak ili pravac delovanja koji je utvrđen da bi se smanjio ili eliminisao broj ćelija kancera kod pacijenta, ili da bi se ublažili simptomi kancera. „Postupak lečenja“ kancera ili drugog proliferativnog poremećaja ne znači obavezno da će ćelije kancera ili drugog poremećaja biti stvarno eliminisane, da će broj ćelija kancera ili poremećaja biti stvarno redukovan, ili da će simptomi kancera ili drugog poremećaja biti stvarno ublaženi. Često će postupak lečenja kancera biti obavljan čak i kada postoji mala verovatnoća uspeha, ali za koji se ipak smatra da, imajući u vidu datu istoriju bolesti i procenjeno očekivano preživljavanje pacijenta, podstiče sveukupni povoljni pravac delovanja.

Termini "kombinacija", "zajedničko davanje" ili "zajednička primena" odnose se na davanje pomenutog anti-CD20 antitela tipa I ili pomenutog afukozilovanog anti-CD20, te pomenutog inhibitora Bcl-2 i pomenutog inhibitora MDM2 kao dve odvojene formulacije (ili kao jedne formulacije). Zajednička primena može biti istovremena ili redom po bilo kom redosledu, naznačena time što je poželjno da postoji vremenski period kada oba (ili svi) aktivni agensi simultano vrše svoju biološku aktivnost. Pomenuto anti-CD20 antitelo tipa I ili pomenuto anti-CD20 afukozilovano antitelo i pomenuti inhibitor Bcl-2 i pomenuti inhibitor MDM2 se zajedno daju istovremeno ili sekvencijalno (npr. intravenski (i.v.) kroz kontinualnu infuziju (jedna za anti-CD20 antitelo i eventualno jedna za pomenuti inhibitor Bcl-2 i pomenuti inhibitor MDM2, ili npr. anti-CD20 antitelo se daje intravenski (i.v.) kroz kontinualnu infuziju i pomenuti inhibitor Bcl-2 i pomenuti inhibitor MDM2 se daju oralno). Kada se oba terapeutska agensa zajednički primenjuju sekvencijalno, doza se daje ili istog dana u dve odvojene primene, ili se jedan agens daje 1. dana, a drugi se zajedno daje od 2. do 7. dana, poželjno od 2. do 4. dana. Stoga, izraz „sekvencijalno“ znači u roku od 7 dana nakon doze prve komponente (anti-CD20 antitela ili pomenutog inhibitora Bcl-2 i pomenutog inhibitora MDM2), poželjno u roku od 4 dana nakon doze prve komponente, a termin „istovremeno“ znači u isto vreme. Termin „zajednička primena“ u odnosu na doze održavanja pomenutog anti-CD20 antitela tipa I ili pomenutog afukozilovanog anti-CD20 antitela i pomenutog inhibitora Bcl-2 i pomenutog inhibitora MDM2 znači da doze održavanja mogu biti ili istovremeno zajednički primenjene, ako je ciklus lečenja odgovarajući za oba leka, npr. svake nedelje. Ili se pomenuti inhibitor Bcl-2 i pomenuti inhibitor MDM2 daju npr. svakog prvog do trećeg dana, a pomenuto afukozilovano antitelo se daje svake nedelje. Ili se doze održavanja zajednički primenjuju redom, bilo tokom jednog dana ili u roku od više dana.

Očigledno je da se antitela daju pacijentu u „terapeutski efikasnoj količini“ (ili samo „efikasnoj količini“), što je količina odgovarajućeg jedinjenja ili kombinacije koja će izazvati biološki ili medicinski odgovor tkiva, sistema, životinje ili čoveka kakav traže istraživač, veterinar, lekar ili učesnik u kliničkom ispitivanju.

Količina zajedničkog davanja pomenutog anti-CD20 antitela tipa I ili pomenutog anti-CD20 afukozilizovanog antitela i pomenutog inhibitora Bcl-2 i pomenutog inhibitora MDM2 i vreme zajedničkog davanja zavisiće od tipa (vrsta, pol, starost, težina, itd.) i stanja pacijenta koji se leči i ozbiljnosti bolesti ili stanja koji se leče. Pomenuto anti-CD20 antitelo tipa I ili pomenuto afukozilovano anti-CD20 antitelo i pomenuti inhibitor Bcl-2 i pomenuti inhibitor MDM2 su pogodno zajedno davani pacijentu u jednom trenutku ili tokom serije tretmana, npr. istog dana ili sutradan.

Ako je primena intravenska, inicijalno vreme infuzije za pomenuto anti-CD20 antitelo tipa I, pomenuto afukozilovano anti-CD20 antitelo ili pomenuti inhibitor Bcl-2 i pomenuti inhibitor MDM2 može biti duže nego kasnije trajanje infuzije, na primer oko 90 minuta za inicijalnu infuziju, a oko 30 minuta za sledeće infuzije (ako se inicijalna infuzija dobro podnosi).

U zavisnosti od vrste i težine bolesti, oko 0,1 mg/kg do 50 mg/kg (npr.0,1-20 mg/kg) pomenutog anti-CD20 antitela tipa I ili afukozilovanog anti-CD20 antitela; i 1 µg/kg do 50 mg/kg (npr. 0,1-20 mg/kg) pomenutog inhibitora Bcl-2 i pomenutog inhibitora MDM2 je eventualna početna doza za zajedničku primenu oba leka na pacijentu. U jednom otelotvorenju, poželjna doza pomenutog afukozilovanog anti-CD20 antitela (poželjno afukozilovanog humanizovanog B-Ly1 antitela, poželjnije obinutuzumaba) biće u opsegu od oko 0,05 mg/kg do oko 30 mg/kg. Tako, jedna ili više doza od oko 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 10 mg/kg ili 30 mg/kg (ili ma koje kombinacije ovih) može da se zajednički primeni na pacijentu.

U jednom aspektu, poželjna doza pomenutog Bcl-2 inhibitora (poželjno 4-(4-{[2-(4-hlorfenil)-4,4-dimetilcikloheks-1-en-1-il]metil}piperazin-1-il)-2-(1H-pirolo[2,3-b]piridin-5-iloksi)-N-({4-[(tetrahidro-2H-piran-4-ilmetil)amino]-3

[(trifluormetil)sulfonil]fenil}sulfonil)benzamida ili njegove soli ili polimorfa) biće u rasponu od oko 0,05 mg/kg do oko 30 mg/kg. Tako, jedna ili više doza od oko 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 10 mg/kg ili 30 mg/kg (ili ma koje kombinacije ovih) može da se zajednički primeni na pacijentu.

U jednom aspektu, poželjna doza pomenutog inhibitora MDM2 (poželjno 4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor)-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetilpropil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-3-metoksi-benzojeva kiselina ili njena so ili polimorf) biće u rasponu od 0,05 mg/kg do oko 30 mg/kg. Tako, jedna ili više doza od oko 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 10 mg/kg ili 30 mg/kg (ili ma koje kombinacije ovih) može da se zajednički primeni na pacijentu.

Npr. anti-CD20 antitelo tipa I ili pomenuto afukozilovano anti-CD20 antitelo može se davati npr. svake nedelje do svake tri nedelje, a pomenuti inhibitor Bcl-2 i pomenuti inhibitor MDM2 mogu se davati svakodnevno ili svakih 2 do 10 dana. Može se primeniti početna veća doza, za kojom sledi jedna ili više manjih doza.

Doza anti-CD20 antitela tipa I (poželjno rituksimaba) može biti u rasponu od oko 100 mg/m<2>do oko 1000 mg/m<2>1, 8, 15, 22, 29, 36, 43, 50, 57. dana 8-nedeljnog ciklusa doziranja.

U jednom otelotvorenju, poželjna doza pomenutog afukozilovanog anti-CD20 antitela (poželjno afokuzilovano humanizovano B-Ly1 antitelo, poželjnije obinutuzumab) biće 800 do 1600 mg (u jednom otelotvorenju 800 do 1200 mg) 1, 8, 15. dana u ciklusu doziranja od 3 do 6 nedelja, a zatim u dozama od 400 do 1200 (u jednom otelotvorenju od 800 do 1200 mg) 1. dana u najviše devet ciklusa doziranja od 3 do 4 nedelje.

U jednom aspektu, doza za pomenuti inhibitor Bcl-2, pri čemu je inhibitor Bcl-2 izabran iz grupe koja se sastoji od inhibitora Bcl-2 kao što je gore opisan, i poželjno je 4-(4-{[2-(4-hlorfenil)-4,4-dimetilcikloheks-1-en-1-il]metil}piperazin-1-il)-2-(1H-pirolo[2,3-b]piridin-5-iloksi)-N-(4-[(tetrahidro-2H-piran-4-ilmetil)amino]-3-[(trifluormetil)sulfonil]fenil}sulfonil)benzamid, je kako sledi. Navedena doza prema pronalasku je 10 mg/kg do 70 mg/kg, poželjno 20 mg/kg do 55 mg/kg, jednom dnevno ili svaki drugi dan kao oralna primena.

U jednom aspektu, doza za pomenuti inhibitor MDM2, pri čemu je inhibitor MDM2 izabran iz grupe koja se sastoji od inhibitora MDM2 kao što je gore opisan i poželjno je 4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor)-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetilpropil)-pirolidin-2-karbonil]amino}-3-metoksi-benzojeva kiselina, je kako sledi. Navedena doza prema pronalasku je 10 mg/kg do 70 mg/kg, poželjno 20 mg/kg do 55 mg/kg, jednom dnevno ili svaki drugi dan kao oralna primena.

Preporučena doza može da se razlikuje u zavisnosti od toga da li postoji dalja zajednička primena hemoterapeutskog sredstva, i na osnovu tipa hemoterapeutskog sredstva.

U jednom otelotvorenju, ovaj pronalazak je koristan za sprečavanje ili smanjivanje metastaza ili daljeg širenja kod pacijenata koji su oboleli od kancera, poželjno kancera koji ekspimira CD20. Ovaj pronalazak je koristan za produženje trajanja preživljavanja takvog pacijenta, produženje preživljavanja bez progresije kod takvog pacijenta, produženje trajanja odgovora, što dovodi do statistički značajnog i klinički značajnog poboljšanja lečenog pacijenta, mereno trajanjem preživljavanja, preživljavanja bez progresije, stopom odgovora ili trajanjem odgovora. U poželjnom otelotvorenju, ovaj pronalazak je koristan za povećanje stope odgovora u grupi pacijenata.

U kontekstu ovog otkrića, dodatni drugi citotoksični, hemoterapeutski ili antikancerogeni agensi, ili jedinjenja ili jonizujuće zračenje koje pojačava dejstvo takvih agenasa (npr. citokina) mogu se koristiti u kombinovanom lečenju kancera pomoću anti-CD20 antitela tipa I ili afukozilovanog anti-CD20 antitela i pomenutog inhibitora Bcl-2 i pomenutog inhibitora MDM2. Takvi molekuli su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za nameravane svrhe. U jednom otelotvorenju, kombinovano lečenje pomenutim anti-CD20 antitelom tipa I, poželjno rituksimabom ili pomenutim afukozilovanim anti-CD20 antitelom, poželjno afukozilovanim humanizovanim B-Ly1 antitelom, poželjnije obinutuzumabom, i pomenutim Bcl-2 inhibitorom i pomenutim inhibitorom MDM2 se koristi bez takvih dodatnih citotoksičnih, hemoterapeutskih ili antikancerogenih agenasa ili jedinjenja koja pojačavaju efekte takvih dodatnih agenasa.

Takvi dodatni agensi obuhvataju, na primer: alkilujuće agense ili agense sa alkilujućim dejstvom, kao što je ciklofosfamid (CTX; npr. cytoxan®), hlorambucil (CHL; npr. leukeran®), cisplatin (CisP; npr. platinol®) busulfan (npr. myleran®), melfalan, karmustin (BCNU), streptozotocin, trietilenmelamin (TEM), mitomicin C, i slične; anti-metabolite, kao što je metotreksat (MTX), etopozid (VP16; npr. vepesid®), 6-merkaptopurin (6MP), 6-tioguanin (6TG), citarabin (Ara-C), 5-fluorouracil (5-FU), kapecitabin (npr. Xeloda®), dakarbazin (DTIC), i slične; antibiotike, kao što je aktinomicin D, doksorubicin (DXR; npr. adriamycin®), daunorubicin (daunomicin), bleomicin, mitramicin i slične; alkaloide, kao što su vinka alkaloidi, kao vinkristin (VCR), vinblastin, i slični; i druge antitumorske agense, kao paklitaksel (npr. taxol®) i derivate paklitaksela, citostatske agense, glukokortikoide, kao što je deksametazon (DEX; npr. decadron®) i kortikosteroide, kao što je prednizon, inhibitore nukleozidnog enzima, kao što je hidroksiurea, enzime za iscrpljivanje aminokiselina, kao što je asparaginaza, leukovorin i drugi derivati folne kiseline, kao i slične, raznovrsne antitumorske agense. Sledeća sredstva mogu, isto tako, da se koriste kao dodatna sredstva: arnifostin (npr. etiol®), daktinomicin, mehloretamin (azotni iperit), streptozocin, ciklofosfamid, lomustin (CCNU), doksorubicin lipo (npr. doxil®), gemcitabin (npr. gemzar®), daunorubicin lipo (npr. daunoksom®), prokarbazin, mitomicin, docetaksel (npr. taksoter®), aldesleukin, karboplatin, oksaliplatin, kladribin, kamptotecin, CPT 11 (irinotekan), 10-hidroksi 7-etil-kamptotecin (SN38), floksuridin, fludarabin, ifosfamid, idarubicin, mesna, interferon beta, interferon alfa, mitoksantron, topotekan, leuprolid, megestrol, melfalan, merkaptopurin, plikamicin, mitotan, pegaspargaza, pentostatin, pipobroman, plikamicin, tamoksifen, tenipozid, testolakton, tiogvanin, tiotepa, uracil mustard, vinorelbin, hlorambucil. U jednom otelotvorenju, kombinovani tretman afukozilovanim anti-CD20 antitelom i pomenutim inhibitorom Bcl-2 i pomenutim inhibitorom MDM2 upotrebljavaju se bez takvih dopunskih agenasa.

Upotreba gore opisanih citotoksičnih i antikancerogenih agenasa, kao i antiproliferativnih ciljno-specifičnih antikancerogenih lekova, kao što su inhibitori protein kinaze, u hemioterapeutskim režimima je generalno dobro opisana u tehnikama terapije kancera, a njihova upotreba ovde potpada pod ista shvatanja praćenja tolerancije i efikasnosti, i kontrolisanja puteva primene i doziranja, uz izvesna podešavanja. Na primer, stvarne doze citotoksičnih agenasa mogu varirati u zavisnosti od odgovora uzgajenih ćelija pacijenta, koji se određuje upotrebom postupaka histokulture. Generalno, doza će biti smanjena u poređenju sa količinom upotrebljenom u odsustvu dodatnih drugih agenasa.

Uobičajene doze delotvornog citotoksičnog agensa mogu biti u opsezima koje preporučuje proizvođač, a gde je indikovano in vitro odgovorima ili odgovorima na životinjskim modelima, mogu biti smanjene za do oko jedan red veličine koncentracije ili količine. Tako, stvarna doza će zavisiti od procene lekara, stanja pacijenta, kao i delotvornosti terapijskog postupka na osnovu in vitro odgovora primarno uzgajanih malignih ćelija ili histouzgajanih uzoraka tkiva, ili odgovora zapaženih na odgovarajućim životinjskim modelima.

U kontekstu ovog otkrića, može se upotrebiti efikasna količina jonizujućeg zračenja i/ili se može koristiti radiofarmaceutika pored kombinovanog tretmana anti-CD20 antitelom tipa I ili afukozilovanim anti-CD20 antitelom i pomenutim inhibitorom Bcl-2 i pomenutim inhibitorom MDM2 za lečenje kancera koji eksprimira CD20. Izvor zračenja za pacijenta koji se leči može biti ili spoljašnji ili unutrašnji. Kada je izvor za pacijenta spoljašnji, terapija je poznata kao terapija eksternim zračenjem (EBRT). Kada je izvor zračenja za pacijenta unutrašnji, tretman se naziva brahiterapija (BT). Radioaktivni atomi za upotrebu u kontekstu ovog pronalaska mogu da se odaberu iz grupe koju čine, bez ograničenja, radijum, itrijum-90, cezijum-137, iridijum-192, americijum-241, zlato-198, kobalt-57, bakar-67, tehnecijum-99, jod-123, jod-131 i indijum-111. Takođe je moguće da se antitelo obeleži takvim radioaktivnim izotopima. U jednom otelotvorenju, kombinovano lečenje anti-CD20 antitelom tipa I ili afukozilovanim anti-CD20 antitelom i pomenutim inhibitorom Bcl-2 i pomenutim inhibitorom MDM2 koristi se bez takvog jonizujućeg zračenja.

Radijaciona terapija je standardni tretman obuzdavanja neuklonjivih ili neoperabilnih tumora i/ili tumorskih metastaza. Poboljšani rezultati su zapaženi kada je radijaciona terapija kombinovana sa hemioterapijom. Radijaciona terapija se zasniva na principu da visoko-dozno zračenje oslobođeno na ciljnu površinu dovodi do smrti reproduktivnih ćelija i u tumoru i u normalnim tkivima. Režim doziranja radijacije je generalno definisan u smislu apsorbovane doze radijacije (Gy), vremena i frakcionisanja, i onkolog ga mora pažljivo definisati. Količina zračenja koju pacijent prima zavisiće od različitih uslova, ali dva najvažnija su lokacija tumora u odnosu na druge kritične strukture ili organe u telu, i stepen do kog se tumor raširio. Uobičajeni profil tretmana za pacijenta koji se podvrgava radijacionoj terapiji biće plan lečenja tokom perioda od 1 do 6 nedelja, sa ukupnom dozom između 10 i 80 Gy primenjenoj na pacijentu u pojedinačnoj dnevnoj frakciji od otprilike 1,8 do 2,0 Gy, 5 dana nedeljno. U poželjnom otelotvorenju ovog pronalaska postoji sinergija kada se tumori kod humanih pacijenata tretiraju kombinacijom tretmana iz pronalaska i radijacije. Drugim rečima, inhibicija rasta tumora putem agenasa koji sadrže kombinaciju iz pronalaska se uvećava kada se kombinuju sa zračenjem, eventualno sa dodatnim hemioterapeutikom ili antikancerogenim agensom. Parametri adjuvantnih radijacionih terapija su, na primer, sadržani u WO 99/60023.

Anti-CD20 antitelo tipa I ili afukozilovano anti-CD20 antitelo se daju pacijentu prema poznatim postupcima, kao što je intravenska primena kao bolus, ili kontinualnom infuzijom tokom vremenskog perioda, intramuskularno, intraperitonealno, intracerebrospinalno, subkutano, intraartikularno, intrasinovijalno ili intratekalno. U jednoj realizaciji, primena antitela je intravenozna ili subkutana.

Inhibitor Bcl-2 i inhibitor MDM2 se daju pacijentu prema poznatim postupcima, kao što je intravenska primena kao bolus, ili kontinualnom infuzijom tokom vremenskog perioda, oralno, intramuskularno, intraperitonealno, intracerebrospinalno, subkutano, intraartikularno, intrasinovijalno ili intratekalno. U jednom otelotvorenju, davanje pomenutog inhibitora Bcl-2 i pomenutog inhibitora MDM2 je intravensko ili oralno.

Kako se ovde koristi, „farmaceutski prihvatljiv nosač“ je namenjen da uključi bilo koji, i sve materijale kompatibilne sa farmaceutskom primenom, uključujući rastvarače, disperzione medije, obloge, antibakterijske i antifungalne agense, izotonična i apsorpciona sredstva za

4

odlaganje i druge materijale i jedinjenja kompatibilna sa farmaceutskom primenom. Osim ako se ne ukaže da je neki od konvencionalnih medija ili agenasa nekompatibilan sa aktivnim sastojkom, njegova je upotreba u kompozicijama predmetnog pronalaska razmotrena. Dodatna aktivna jedinjenja se takođe mogu ugraditi u kompozicije.

Farmaceutske kompozicije:

Farmaceutske kompozicije se mogu dobiti obradom anti-CD20 antitela i/ili inhibitora Bcl-2 i inhibitora MDM2 prema ovom pronalasku, sa farmaceutski prihvatljivim, neorganskim ili organskim nosačima. Laktoza, kukuruzni skrob ili njihovi derivati, talk, stearinske kiseline ili njihovi soli i slično mogu se koristiti, na primer, kao takvi nosači za tablete, obložene tablete, dražeje i tvrde želatinske kapsule. Odgovarajući nosači lekovitih supstanci za meke želatinske kapsule su, na primer, biljna ulja, voskovi, masti, polučvrsti i tečni polioli, i slično. Međutim, u zavisnosti od prirode aktivnih supstanci, u slučaju mekih želatinskih kapsula obično nisu potrebni nosači. Pogodni nosači za proizvodnju rastvora i sirupa su, na primer, voda, polioli, glicerol, biljna ulja i slično. Odgovarajući nosači supozitorija su, na primer, prirodna ili čvrsta ulja, voskovi, masti, polutvrdi ili tečni polioli i slično.

Pored toga, farmaceutske kompozicije mogu da sadrže konzervanse, solubilizatore, stabilizatore, sredstva za kvašenje, emulgatore, zaslađivače, boje, arome, soli za izmenu osmotskog pritiska, pufere, agense za maskiranje ili antioksidanse. Mogu da sadrže i druge terapeutski korisne supstance.

U jednom aspektu otkrića, kompozicija sadrži i pomenuto anti-CD20 antitelo tipa I (poželjno rituksimab) ili pomenuto afukozilovano anti-CD20 antitelo sa količinom fukoze od 60% ili manje (poželjno afukozilovano humanizovano B-Ly1 antitelo, poželjnije obinutuzumab) i pomenuti inhibitor Bcl-2 i pomenuti inhibitor MDM2 za upotrebu u lečenju kancera, posebno kancera koji eksprimira CD20 (poželjno limfom ili limfocitna leukemija, poželjnije B-ćelijski ne-Hodžkinov limfom (NHL), limfom ćelija omotača (MCL), akutna limfocitna leukemija (ALL), hronična limfocitna leukemija (CLL), difuzni B-ćelijski limfom velikih ćelija (DLCL), Burkitov limfom, leukemija vlasastih ćelija, folikularni limfom, multipli mijelom, limfom marginalne zone, limfoproliferativni poremećaj nakon transplantacije (PTLD), limfom povezan sa HIV-om, Valdenstromova makroglobulinemija ili primarni limfom CNS-a).

Pomenuta farmaceutska kompozicija može dalje da sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača.

U jednom aspektu pronalaska obezbeđena je farmaceutska kompozicija, npr. za upotrebu kod kancera, koja sadrži (i) efektivnu prvu količinu anti-CD20 antitela tipa I (poželjno rituksimaba) ili afukozilovanog anti-CD20 antitela sa količinom fukoze od 60% ili manje (poželjno afukozilovano humanizovano B-Ly1 antitelo), i (ii) efektivnu drugu količinu inhibitora Bcl-2 i inhibitora MDM2. Takva kompozicija opciono sadrži farmaceutski prihvatljive nosače i/ili ekscipijense.

Farmaceutske kompozicije samo anti-CD20 antitela tipa I ili afukozilovanog anti-CD20 antitela pripremljene su za čuvanje mešanjem antitela željenog stepena čistoće sa opcionim farmaceutski prihvatljivim nosačima, ekscipijensima ili stabilizatorima (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16. izdanje, Osol, A. (izd.) (1980)), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Prihvatljivi nosači, ekscipijensi ili stabilizatori su netoksični za primaoca u primenjenim dozama i koncentracijama, i uključuju pufere, kao što je fosfatni, citratni i puferi drugih organskih kiselina; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum-hlorid; heksametonijum-hlorid; benzalkonijum-hlorid, benzetonijum-hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene, kao što je metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske mase (manje od 10 ostataka); proteine, kao što je serum albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline, kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense, kao što je EDTA; šećere, kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontra-jone koji grade soli, kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. kompleksi Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante, kao što je TWEEN™, PLURONICS™ ili polietilen glikol (PEG).

Farmaceutske kompozicije inhibitora Bcl-2 i inhibitora MDM2 mogu biti slične onima koje su gore opisane za anti-CD20 antitelo tipa I ili afukozilovano anti-CD20 antitelo.

Farmaceutske kompozicije inhibitora Bcl-2 i inhibitora MDM2 sa malim molekulima uključuju one pogodne za oralnu, nazalnu, topikalnu (uključujući bukalnu i sublingvalnu), rektalnu, vaginalnu i/ili parenteralnu primenu. Kompozicije mogu pogodno biti predstavljene u jediničnom doznom obliku, i mogu se dobiti bilo kojom metodom poznatom u farmaciji. Količina aktivnog sastojka koji se može kombinovati sa nosećom supstancom radi proizvodnje pojedinačnog doznog oblika variraće u zavisnosti od domaćina koji se leči, kao i konkretnog načina primene. Količina aktivnog sastojka koji se može kombinovati sa nosećom supstancom radi proizvodnje pojedinačnog doznog oblika generalno će biti ona količina inhibitora Bcl-2 i inhibitora MDM2 koja daje terapeutski efekat. Generalno, u opsegu od sto procenata, ta količina će varirati od oko 1 procenta do oko devedeset devet procenata aktivnog sastojka, poželjno od oko 5 procenata do oko 70 procenata, najpoželjnije od oko 10 procenata do oko 30 procenata. Postupci za pripremu ovih kompozicija uključuju korak dovođenja inhibitora Bcl-2 i inhibitora MDM2 u vezu sa nosačem i, opciono, jednim ili više pomoćnih sastojaka. Generalno, farmaceutske kompozicije BTK inhibitora se pripremaju jednoličnim i bliskim dovođenjem u vezu jedinjenja inhibitora Bcl-2 i inhibitora MDM2 sa tečnim nosačima, ili fino raspoređenim čvrstim nosačima, ili oba, a zatim, po potrebi, oblikovanjem proizvoda. Farmaceutske kompozicije pogodne za oralnu primenu mogu biti u obliku kapsula, kesica, skrobnih kapsula, pilula, tableta, lozengi (koristi se aromatizovana osnova, obično saharoza i akacija ili tragakant), praškova, granula, ili kao rastvor ili suspenzija u vodenoj ili nevodenoj tečnosti, ili kao tečna emulzija ulja u vodi ili vode u ulju, ili kao eliksir ili sirup, ili kao pastile (korišćenjem inertne baze, kao što je želatin i glicerin, ili saharoza i akacija) i/ili kao voda za ispiranje usta i slično, pri čemu svaki sadrži prethodno određenu količinu inhibitora Bcl-2 i inhibitora MDM2 kao aktivnog sastojka. Inhibitor Bcl-2 i inhibitor MDM2 mogu se davati i kao bolus, elektuarijum ili pasta.

U jednom aspektu otkrića, anti-CD20 antitelo tipa I ili afukozilovano anti-CD20 antitelo i inhibitor Bcl-2 i inhibitor MDM2 formulisani su u dve odvojene farmaceutske kompozicije.

Aktivni sastojci mogu takođe biti zarobljeni u mikrokapsulama, pripremljenim, na primer, tehnikama koacervacije ili interfacijalne polimerizacije, na primer, mikrokapsule od hidroksimetilceluloze, odnosno želatinske mikrokapsule, i mikrokapsule od poli-(metilmetakrilata), u koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su objavljene u Remington's Pharmaceutical Sciences 16. izdanje, Osol, A. (izd.) (1980).

Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju semipermeabilne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže antitelo, pri čemu su matrice uobličeni proizvodi, npr. film ili mikrokapsule. Primeri matrica sa produženim oslobađanjem uključuju poliestre, hidrogele (na primer, poli(2-hidroksietil-metakrilat) ili poli(vinilalkohol)), polilaktide (US 3,773,919), kopolimere L-glutaminske kiseline i gama-etil-L-glutamata, nerazgradivi etilen-vinil acetat, razgradive kopolimere mlečne kiseline i glikolne kiseline, kao što su LUPRON DEPOT™ (injektirajuće mikrosfere sastavljene od kopolimera mlečne kiseline, glikolne kiseline i leuprolid acetata) i poli-D-(-)-3-hidroksibutirnu kiselinu.

Formulacije za primenu in vivo moraju biti sterilne. To se lako postiže filtracijom kroz sterilne filtracione membrane.

Poželjno, pomenuto anti-CD20 antitelo tipa I je rituksimab ili je pomenuto afukozilovano anti-CD20 antitelo humanizovano B-Ly1 antitelo i pomenuti inhibitor Bcl-2 je

4

4-(4-{[2-(4-hlorfenil)-4,4-dimetilcikloheks-1-en-1-il]metil}piperazin-1-il)-2-(1H-pirolo[2,3-b]piridin-5-iloksi)-N-({4-[(tetrahidro-2H-piran-4-ilmetil)amino]-3-[(trifluormetil)sulfonil]fenil}sulfonil)benzamid ili njegova so ili polimorf i pomenuti inhibitor MDM2 je 4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-3-metoksi-benzojeva kiselina ili njena so ili polimorf, a pomenuti kancer je kancer koji eksprimira CD20, poželjno limfom ili limfocitna leukemija.

Jedan aspekt otkrića je farmaceutska kompozicija koja sadrži kombinaciju anti-CD20 antitela tipa I ili humanizovanog B-Ly1 antitela koje je afukozilovano sa količinom fukoze od 60% ili manje u odnosu na ukupnu količinu oligosaharida (šećera) na Asn297, i 4-(4-{[2-(4-hlorfenil)-4,4-dimetilcikloheks-1-en-1-il]metil}piperazin-1-il)-2-(1H-pirolo[2,3-b]piridin-5-iloksi)-N-({4-[(tetrahidro-2H-piran-4-ilmetil)amino]-3-[(trifluormetil)sulfonil]fenil}sulfonil)benzamid ili njegovu so ili polimorf i 4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-3-metoksi-benzojevu kiselinu ili njenu so ili polimorf, za lečenje kancera, pri čemu je pomenuti kancer, kancer koji eksprimira CD20, poželjno limfom ili limfocitna leukemija.

Predmetno otkriće dalje obezbeđuje postupak za lečenje kancera, koji obuhvata davanje pacijentu kojem je potreban takav tretman (i) efektivne prve količine anti-CD20 antitela tipa I ili afukozilovanog anti-CD20 antitela sa količinom fukoze od 60% ili manje, (poželjno afukozilovano humanizovano B-Ly1 antitelo); i (ii) efektivne druge količine inhibitora Bcl-2 i inhibitora MDM2.

U jednom aspektu, količina fukoze je između 40% i 60%.

Poželjno, pomenuti kancer je kancer koji eksprimira CD20.

Ranije pomenuti kancer koji eksprimira CD20 je limfom ili limfocitna leukemija. Poželjno, anti-CD20 antitelo tipa I je rituksimab.

Poželjno, pomenuto afukozilovano anti-CD20 antitelo je anti-CD20 antitelo tip II. Poželjno, pomenuto antitelo je humanizovano B-Ly1 antitelo, kako je ovde objavljeno. Poželjno, pomenuto antitelo je obinutuzumab.

Poželjno, pomenuti inhibitor Bcl-2 je 4-(4-{[2-(4-hlorfenil)-4,4-dimetilcikloheks-1-en-1-il]metil}piperazin-1-il)-2-(1H-pirolo[2,3-b]piridin-5-iloksi)-N-({4-[(tetrahidro-2H-piran-4-ilmetil)amino]-3-[(trifluormetil)sulfonil]fenil}sulfonil)benzamid ili njegova so ili polimorf.

Poželjno, pomenuti inhibitor MDM2 je 4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-3-metoksibenzojeva kiselina ili njena so ili polimorf.

Poželjno, pomenuto anti-CD20 antitelo tipa I je rituksimab ili je pomenuto afukozilovano anti-CD20 antitelo humanizovano B-Ly1 antitelo i pomenuti inhibitor Bcl-2 je 4-(4-{[2-(4-hlorofenil)-4,4-dimetilcikloheks-1-en-1-il]metil}piperazin-1-il)-2-(1H-pirolo[2,3-b]piridin-5-iloksi)-N-({4-[(tetrahidro-2H-piran-4-ilmetil)amino]-3-[(trifluormetil)sulfonil]fenil}sulfonil)benzamid ili njegova so ili polimorf i pomenuti inhibitor MDM2 je 4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-3-metoksi-benzojeva kiselina ili njena so ili polimorf, a pomenuti kancer je kancer koji eksprimira CD20, poželjno limfom ili limfocitna leukemija.

Kao što je ovde korišćen, termin "pacijent" se poželjno odnosi na čoveka kome je potrebno lečenje anti-CD20 antitelom tipa I ili afukozilovanim anti-CD20 antitelom (npr. pacijent koji boluje od kancera koji eksprimira CD20) u bilo koju svrhu, a poželjnije čoveka kome je takva terapija potrebna za lečenje kancera, ili prekanceroznog stanja ili lezije. Međutim, termin „pacijent“ može se takođe odnositi i na nehumane životinje, poželjno sisare kao što su psi, mačke, konji, krave, svinje, ovce i nehumani primati, između ostalog.

Predmetno otkriće dalje obezbeđuje anti-CD20 antitelo tip I ili afukozilovano anti-CD20 antitelo sa količinom fukoze od 60% ili manje, i inhibitor Bcl-2 i inhibitor MDM2 za upotrebu u lečenju kancera.

Poželjno, pomenuto anti-CD20 antitelo tipa I je rituksimab.

Poželjno, pomenuto afukozilovano anti-CD20 antitelo je humanizovano B-Ly1 antitelo. Poželjno, pomenuto afukozilovano humanizovano B-Ly1 antitelo je obinutuzumab. Poželjno, pomenuti inhibitor Bcl-2 je 4-(4-{[2-(4-hlorfenil)-4,4-dimetilcikloheks-1-en-1-il]metil}piperazin-1-il)-2-(1H-pirolo[2,3-b]piridin-5-iloksi)-N-({4-[(tetrahidro-2H-piran-4-ilmetil)amino]-3-[(trifluormetil)sulfonil]fenil}sulfonil)benzamid ili njegova so ili polimorf i pomenuti inhibitor MDM2 je 4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluorfenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-3-metoksi-benzojeva kiselina ili njena so ili polimorf.

Poželjno, pomenuto anti-CD20 antitelo tipa I je rituksimab ili je pomenuto afukozilovano anti-CD20 antitelo humanizovano B-Ly1 antitelo, poželjnije obinutuzumab, i pomenuti inhibitor Bcl-2 je 4-(4-{[2-(4-hlorofenil)-4,4-dimetilcikloheks-1-en-1-il]metil}piperazin-1-il)-2-(1H-pirolo[2,3-b]piridin-5-iloksi)-N-({4)-[(tetrahidro-2H-piran-4-

4

ilmetil)amino]-3-[(trifluormetil)sulfonil]fenil}sulfonil)benzamid ili njegova so ili polimorf i pomenuti inhibitor MDM2 je 4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluorfenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-3-metoksi-benzojeva kiselina ili njena so ili polimorf, a pomenuti kancer je kancer koji eksprimira CD20, poželjno limfom ili limfocitna leukemija.

Sledeći primeri i slike su dati da olakšaju razumevanje predmetnog pronalaska, čiji pravi obim je naveden u priloženim patentnim zahtevima.

Listing sekvenci

SEQ ID NO: 1 aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca (VH) mišjeg monoklonskog anti-CD20 antitela B-Ly1.

SEQ ID NO: 2 aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca (VL) mišjeg monoklonskog anti-CD20 antitela B-Ly1.

SEQ ID NO: 3-19 aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH) humanizovanih B-Ly1 antitela (B-HH2 do B-HH9, B-HL8, i B-HL10 do B-HL17) SEQ ID NO: 20 aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca (VL) humanizovanog B-Ly1 antitela B-KV1

Eksperimentalni postupci

Primer 1:

Primer

In vivo antitumorska efikasnost

In vivo antitumorska efikasnost CD20 specifičnog antitela obinutuzumaba u kombinaciji sa inhibitorom bcl-2, GDC-0199, i inhibitorom MDM2, RG7388, je procenjena prema DOHH2 DLBCL ksenograftima (CD20+, p53wt). Kako se ovde koristi, obinutuzumab se koristi kao sinonim za RO5072759 i B-HH6-B-KV1 GE. Kako se ovde koristi, pomenuti inhibitor bcl-2, GDC-0199, je sledeće hemijsko jedinjenje: 4-(4-{[2-(4-hlorfenil)-4,4-dimetilcikloheks-1-en-1-il]metil}piperazin-1-il)-2-(1H-pirolo[2,3-b]piridin-5-iloksi)-N-({4-[(tetrahidro-2H-piran-4-ilmetil)amino]-3-[(trifluormetil)sulfonil]fenil}sulfonil)benzamid ili njegova so ili polimorfni oblik. Kako se ovde koristi, pomenuti inhibitor MDM2, RG7388, je sledeće hemijsko jedinjenje: 4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluorfenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-3-metoksi-benzojeva kiselina ili njena so ili polimorfni oblik.

Agensi za ispitivanje

CD20 antitelo obinutuzumab je obezbeđeno kao osnovni rastvor iz kompanije Roche, Bazel, Švajcarska. Pufer za antitelo je uključivao histidin. Rastvor antitela je prikladno

4

razblažen u puferu iz osnovnog rastvora za prethodne injekcije. Inhibitor MDM2(4) je obezbeđen kao formulacija SDP iz kompanije Roche, Bazel, Švajcarska, i ponovo je suspendovan pre upotrebe. Inhibitor Bcl-2, GDC-0199, je nabavljen od GNE, SSF, SAD, i formulisan je pre upotrebe.

Ćelijske linije i uslovi uzgajanja

Izvorna DOHH-2 ljudska B ćelijska linija NHL ćelija (DLBCL) je uspostavljena u NCI i kupljena od ATCC (Manassas, VA, SAD). Ekspanzija tumorskih ćelija za transplantaciju izvršena je pomoću sistema TAP CompacT CellBase Cell Culture Roboter prema protokolu. Linija ćelija tumora je rutinski kultivisana u RPMI 1640 medijumu sa 10% FCS i 2 mM L-glutamina na 37°C u atmosferi zasićenoj vodom sa 5% CO2. Pasažiranje kultura je izvedeno sa tripsinom/EDTA 1x razdvajanjem dva puta nedeljno i 2. pasažiranje je korišćeno za transplantaciju.

Životinje

Ženke SCID bež miševa, starosti 6-7 nedelja po dolasku, održavane su u stanju bez specifičnih patogena uz dnevne cikluse od 12 h svetla/12 h tame u skladu sa predatim smernicama. Protokol eksperimentalne studije pregledala je i odobrila lokalna vlast. Po dolasku, životinje su držane u objektu za životinje nedelju dana kako bi se privikle na novu okolinu, i radi posmatranja. Redovno je praćeno njihovo zdravstveno stanje. Dijetalna hrana i autoklavirana voda su obezbeđeni ad libitum.

Praćenje

Životinje su svakodnevno kontrolisane zbog kliničkih simptoma i uočavanja neželjenih efekata. Za praćenje tokom eksperimenta dokumentovana je telesna težina životinja.

Lečenje životinja

Lečenje životinja je počelo nakon randomizacije, kada je medijana veličine tumora bila oko 200 mm<3>. CD20 antitelo obinutuzumab je davano kao pojedinačni agens i u kombinaciji pri 10 mg/kg ip jednom nedeljno, 13, 21. i 27. dana. Odgovarajući vehikulum primenjivan je istim danima. Oralno lečenje MDM2(4) inhibitorom, RG7388, pri 30 mg/kg je sprovedeno kao sa pojedinačnim agensom i u kombinaciji, od 13-17, 20-24. i 27-29. dana. Konačno, inhibitor bcl-2, GDC-0199, je davan oralno u količini od 100 mg/kg od 13. do 29. dana kao pojedinačni agens i u kombinaciji.

Antitumorska efikasnost

DOHH-2 ćelije B-ćelijskog limfoma humanih difuznih velikih ćelija (DLBCL) (CD20+, p53wt) su inokulirane sa Matrigelom na ženke SCID bež miševa. Miševi koji su imali tumore su randomizovani 13 dana kasnije u naznačene studijske grupe, i započeto je lečenje

4

jedinjenjem. Životinje koje su imale tumore lečene su kontrolom sa vehikulumom, inhibitorom MDM2(4), RO5503781 (RG7388) sa 30 mg/kg, anti-CD20 antitelom obinutuzumabom sa 10 mg/kg ili inhibitorom bcl-2, GDC-0199, (100 mg/kg) kao pojedinačnim agensom. Nadalje, jedna studijska grupa je primila trostruku kombinaciju inhibitora MDM2 RG7388, CD20 antitela obinutuzumaba i inhibitora bcl-2 GDC-0199. Kao rezultat, sva jedinjenja koja su data kao pojedinačni agens pokazala su značajnu anti-tumorsku efikasnost protiv DOHH-2 ksenografta. Detaljnije, lečenje inhibitorom MDM2(4), RO5503781 (RG7388), dovelo je do inhibicije rasta tumora protiv p53wt DOHH2 ksenografta od 56% u poređenju sa kontrolom. Slična efikasnost je primećena nakon lečenja inhibitorom bcl-2, GDC-0199 (60% inhibicije rasta tumora, TGI), dok je najbolja efikasnost kod pojedinačnog agensa postignuta nakon lečenja sa anti-CD20 antitelom obinutuzumabom, i gotovo je dosegnuta staza tumora (TGI 90%). Međutim, poboljšana efikasnost je primećena za grupu trostruke kombinacije, uključujući inhibitor MDM2 RG7388 plus CD20 antitelo obinutuzumab plus inhibitor bcl-2 GDC-0199. Detaljnije, pristup sa trostrukom kombinacijom je značajno indukovao ranu regresiju tumora, koja je konačno dostigla 90% uz 30% kompletnih tumorskih remisija. Snažna efikasnost grane sa trostrukom kombinacijom bila je sinergetski bolja u odnosu na odgovarajuću granu sa pojedinačnim agensom.

4

Tabela 2

Primer 2

CD20 specifično antitelo obinuzumab u kombinaciji sa inhibitorom bcl-2 GDC-0199 i inhibitorom MDM2 RG7388.

Takođe u ovom primeru, CD20-specifično antitelo obinutuzumab se koristi u kombinaciji sa inhibitorom bcl-2 GDC-0199 i inhibitorom MDM2 RG7388. Kako se ovde koristi, obinutuzumab se koristi kao sinonim za RO5072759 i B-HH6-B-KV1 GE. Kako se ovde koristi, pomenuti inhibitor bcl-2 GDC-0199 je sledeće hemijsko jedinjenje: 4-(4-{[2-(4-hlorfenil)-4,4-dimetilcikloheks-1-en-1-il]metil}piperazin-1-il)-2-(1H-pirolo[2,3-b]piridin-5-iloksi)-N-({4-[(tetrahidro-2H-piran-4-ilmetil)amino]-3-[(trifluormetil)sulfonil]fenil}sulfonil)benzamid ili njegova so ili polimorfni oblik. Kako se ovde koristi, pomenuti inhibitor MDM2, RG7388, je sledeće hemijsko jedinjenje: 4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetilpropil)-pirolidin-2-karbonil]-amino}-3-metoksi-benzojeva kiselina ili njena so ili polimorfni oblik.

Antitumorska aktivnost kombinovanog lečenja anti-CD20 antitelom tipa II RO5072759 (B-HH6-B-KV1 GE), inhibitorom specifičnim za Bcl-2, GDC-0199 (Abt-199, RG7601), i antagonistom MDM2, RG7388 (RO5503781).

Agensi za ispitivanje

B-HH6-B-KV1 GE anti-CD20 antitelo tipa II (= humanizovano B-Ly1, glikokonstruisano B-HH6-B-KV1, vidi WO 2005/044859 i WO 2007/031875) nabavljeno je kao osnovni rastvor (c=9,4 mg/ml) od kompanije GlycArt, Schlieren, Švajcarska, u histidinu, trehalozi i puferu polisorbat 20. Antitelo je razblaženo PBS-om pre primene in vivo.

Inhibitor Bcl-2 GDC-0199 je dobijen od kompanije Genentech Inc., CA, SAD. Antagonist MDM2(4) RG7388 (RO5503781) obezbeđen je od strane Small Molecule Process Research and Development unit, Hoffmann-La Roche, Bazel, Švajcarska.

Ćelijske linije i uslovi uzgajanja

Humana Z138 ćelijska linija limfoma ćelija omotača je uzgajana u DMEM-u uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma (PAA Laboratories, Austrija) i 2 mM L-glutamina na 37°C u atmosferi zasićenoj vodom, uz 5% CO2. Za in vivo eksperimente sa ksenograftom, ćelije su koinjektovane sa Matrigelom.

4

Životinje

Ženke SCID bež miševa, starosti 4-5 nedelja na dolasku (nabavljene od Charles River, Sulzfeld, Nemačka) držane su u karantinskom delu objekta za životinje tokom jedne nedelje, i nakon toga pod specifičnim uslovima bez patogena, sa dnevnim ciklusima od 12 h svetla/12 h tame prema smernicama (GV-Solas; Felasa; TierschG). Protokol eksperimentalne studije pregledali su i odobrili Roche i lokalna uprava (Regierung von Oberbayern; registracioni broj 55.2-1-54-2531.2-26-09). Dijetalna hrana (KLIBA NAFAG 3807) i voda (filtrirana) su obezbeđeni ad libitum.

Praćenje

Životinje su svakodnevno praćene zbog kliničkih simptoma i uočavanja neželjenih efekata. Tokom trajanja eksperimenta, telesna težina životinja je proveravana dva puta nedeljno, a zapremina tumora je merena pomičnim merilom.

Lečenje životinja

Lečenje životinja je počelo na dan randomizacije, 18 dana nakon inokulacije ćelija tumora. Humanizovano anti-CD20 antitelo tipa II RO5072759 B-HH6-B-KV1 GE (obinutuzumab) je davano kao pojedinačno sredstvo ip q7d jednom nedeljno (18, 25, 32. dana) tokom 3 nedelje u dozi od 0,5 mg/kg. Inhibitor Bcl-2 GDC-0199 davan je oralno jednom dnevno (od 18. do 36. dana) tokom 19 dana u dozi od 100 mg/kg. Antagonist MDM2 RG7388 (RO5503781) davan je oralno jednom dnevno tokom 5 dana u dozi od 100 mg/kg (aktivno jedinjenje) od 18. do 22. dana, i davan je tokom 12 dana u dozi od 80 mg/kg (aktivno jedinjenje) od 25. do 36. dana. Nije bilo lečenja 23. i 24. dana. U kombinovanim grupama, RO5072759 B-HH6-B-KV1 GE, MDM2(4) i GDC-0199 su davani u istim dozama i istim danima. Odgovarajući vehikulum primenjivan je istim danima.

Inhibicija rasta tumora (TGI) 32. dana

Lečenje monoterapijom pomoću RO5072759, GDC-0199 ili RG7388 (RO5503781) rezultovalo je inhibicijom rasta tumora od 47%, 53%, odnosno 67%. Kombinacija RO5072759 sa GDC-0199 ili RG7388 (RO5503781) dovela je do inhibicije rasta tumora od 85%, odnosno 86%. Kombinacija RG7388 (RO5503781) sa GDC-0199 i trostruka kombinacija pokazala je regresiju tumora (TGI>100%) 32. dana nakon inokulacije tumorskih ćelija.

Da bi se razjasnili dugoročni efekti različitih lečenja, izvršena je analiza vremena do događaja do 125. dana nakon inokulacije tumorskih ćelija. Trostruka kombinacija dovela je do potpune remisije tumora kod svih životinja do 125. dana (završetak studije). Kombinacija RG7388 (RO5503781) i RO5072759 dovela je do 5 životinja bez tumora (5 od 10).

Monoterapija sa RO5072759 u suboptimalnoj dozi od 0,5 mg/kg dovela je do 2 životinje bez tumora na kraju ispitivanja.

Parametar "medijana vremena do događaja" za svaku grupu je naveden u Tabeli 3. Tabela 3: Sažetak rezultata analize vremena do događaja

* Medijana vremena do događaja je vreme (broj dana) u kojem polovina životinja ima događaj

Kao što je ovde opisano i takođe priloženo u listi sekvenci, sledeće sekvence su deo predmetnog otkrića:

1

SEKVENCE

SEQ ID NO: 1

aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca (VH) mišjeg monoklonskog anti-CD20 antitela B-Ly1

SEQ ID NO:2

aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca (VL) mišjeg monoklonskog anti-CD20 antitela B-Ly1

SEQ ID NO:3

aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH) humanizovanog B-Ly1 antitela (B-HH2)

2

SEQ ID NO:4

aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH) humanizovanog B-Ly1 antitela (B-HH3)

SEQ ID NO:5

aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH) humanizovanog B-Ly1 antitela (B-HH4)

SEQ ID NO:6

aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH) humanizovanog B-Ly1 antitela (B-HH5)

SEQ ID NO:7

aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH) humanizovanog B-Ly1 antitela (B-HH6)

4

SEQ ID NO:8

aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH) humanizovanog B-Ly1 antitela (B-HH7)

SEQ ID NO:9

aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH) humanizovanog B-Ly1 antitela (B-HH8)

SEQ ID NO:10

aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH) humanizovanog B-Ly1 antitela (B-HH9)

SEQ ID NO:11

aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH) humanizovanog B-Ly1 antitela (B-HL8)

SEQ ID NO:12

aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH) humanizovanog B-Ly1 antitela (B-HL10)

SEQ ID NO:13

aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH) humanizovanog B-Ly1 antitela (B-HL11)

SEQ ID NO:14

aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH) humanizovanog B-Ly1 antitela (B-HL12)

SEQ ID NO:15

aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH) humanizovanog B-Ly1 antitela (B-HL13)

SEQ ID NO:16

aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH) humanizovanog B-Ly1 antitela (B-HL14)

SEQ ID NO:17

aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH) humanizovanog B-Ly1 antitela (B-HL15)

SEQ ID NO:18

aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH) humanizovanog B-Ly1 antitela (B-HL16)

SEQ ID NO:19

aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH) humanizovanog B-Ly1 antitela (B-HL17)

SEQ ID NO:20

aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca (VL) humanizovanog B-Ly1 antitela B-KV1

1

2

4

1

2

4

Claims

PATENTNI ZAHTEVI

1. Farmaceutska kompozicija koja sadrži kombinaciju humanizovanog B-Ly1 antitela, koje je afukozilovano sa količinom fukoze od 60% ili manje u odnosu na ukupnu količinu oligosaharida na Asn297, i 4-(4-{[2-(4-hlorfenil)-4,4-dimetilcikloheks-1-en-1-il]metil}piperazin-1-il)-N-({3-nitro-4-[(tetrahidro-2H-piran-4-ilmetil)amino]fenil}sulfonil)-2-(1H-pirolo[2,3-b]piridin-5-iloksi)benzamida (GDC-0199, ABT199) i 4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-hlor-2-fluor-fenil)-3-(3-hlor-2-fluor-fenil)-4-cijano-5-(2,2-dimetil-propil)-pirolidin-2-karbonil]amino}-3-metoksi-benzojeve kiseline (RG7388) ili njene soli za upotrebu u lečenju kancera.

2. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1, pri čemu pomenuti kancer je kancer koji eksprimira CD20.

3. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 2, pri čemu pomenuti kancer koji eksprimira CD20 je limfom ili limfocitna leukemija.

4. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-3, pri čemu afukozilovano anti-CD20 antitelo je obinutuzumab.

5. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-4, pri čemu se primenjuje jedan ili više drugih, dodatnih citotoksičnih, hemoterapeutskih ili antikancerogenih agenasa ili jedinjenja ili jonizujuće zračenje, koji povećavaju efekte takvih agenasa.