RS59211B2 - Antifungalni topikalni sastav i postupci tretmana - Google Patents

Description

Opis

Tehničko polje pronalaska

[0001] Pronalazak se odnosi na topikalni sastav (i postupke za proizvodnju takvih sastava) za tretman gljivičnih infekcija kože ili noktiju, koji sadrži polimer sposoban da formira nanočestice i antifungalni agens, koji je Terbinafin.

Pozadina pronalaska

[0002] Gljivične infekcije su sve češće kod ljudi i kod životinja, ali tretman takvih infekcija ostaje problematičan zbog toksičnosti antifungalnih sastava, slabe rastvorljivosti takvih sastava i nezgodnih lokacija nekih infekcija koje se mogu pokazati teško dostupnim korišćenjem tradicionalnih medicinskih formulacija.

[0003] Stoga, na primer, dokument kao što je US 2010/021530 opisuje postupak za isporuku antiinfektivnog agensa kroz nokat pacijenta koji ima infekciju nokta sistemom za zagrevanje koji održava strukturu nokta na temperaturi od 37-45°C.

[0004] Širok spektar antifungalnih sredstava kao što su amfotericin B, hamicin, filipin i nistatin otkriven je 1960-ih. Međutim, zbog toksičnosti, samo se hamicin i nistatin koriste topikalno, i amfotericin B se koristi sistemski. Napredak u antifungalnoj terapiji bio je uvođenje azola, naročito ketokonazola. Glavne klase antifungalnih sredstava koje se trenutno koriste su polieni, azoli alil amini, lipopeptidi i pirimidini. Međutim, polieni su toksični za ćelije sisara. Azoli se dobro tolerišu lokalno, ali imaju sporedne efekte kada se daju sistemski i bilo je više izveštaja o rezistenciji na azole. Flucitosin je najčešće korišćeni pirimidin. Iako ima odličnu penetraciju u tkivima, otpornost na flucitozin se može brzo razviti i proizvesti gastro-intestinalne sporedne efekte. Lipopetidi pokazuju nisku toksičnost i nekoliko ispitivanja je još uvek u toku testiranja efikasnosti.

[0005] Razvoj novih antifungalnih sredstava je ograničen zato što su gljive eukariote, i ćelijski ciljevi, ako se poremete, takođe mogu da oštete ćelije domaćina. Povećanje gljivičnih infekcija i povećanje upotrebe antifungalnih sredstava rezultovalo je pojavom rezistencije među gljivama. Rezistencija na antifungalna sredstva ima visok klinički uticaj jer gljivične bolesti uzrokuju povećanje morbiditeta i mortaliteta kod pacijenata sa oslabljenim imunitetom.

[0006] Procenjuje se da oko 40% novootkrivenih lekova ima neuspehe zbog nedostatka pravilne isporuke usled problema rastvorljivosti u vodi. U slučaju topikalne primene lekova, barijerna svojstva kože često zahtevaju pojačivače permeacije kako bi se postigla potrebna doza lekova.

[0007] Onihomikoza (češće poznata kao gljivična infekcija noktiju) uzrokuje da se nokti zgusnu, promene boju, izobliče i razdvoje. Bez tretmana, nokti mogu postati toliko gusti da pritisnu unutrašnjost cipela, izazivajući pritisak, iritaciju i bol. Postoje rizici za dalje komplikacije, posebno kod pacijenata sa dijabetesom, onih sa perifernom vaskularnom bolesti i imunokompromitovanih pacijenata. Gljivična infekcija noktiju može izazvati psihološke i socijalne probleme. Učestalost gljivične infekcije noktiju se povećava sa starošću i ima prevalenciju od -30% kod osoba sa preko 60 godina, sa značajnom učestalošću u Evropi sa još višim nivoima u Aziji. Gljivična infekcija noktiju može da utiče na jedan ili više noktiju na nogama i/ili prstima i može potpuno uništiti nokat ako se ne tretira.

[0008] Trenutni tretman gljivične infekcije noktiju je topikalni lak/boja za nokte (kao što je amorolfin) 1-2 puta nedeljno tokom 6-12 meseci i/ili oralna antifungalna sredstva (kao što su terbinafin ili itrakonazol). Oralna antifungalna sredstva mogu imati ozbiljne neželjene efekte kao što su gastro-intestinalni poremećaji i mogu čak dovesti do otkazivanja jetre. Relaps se najčešće javlja u 25-50% slučajeva i mnogi pacijenti neće se obavezati na terapiju zbog predviđenih sporednih efekata i dužine trajanja tretmana, i često će tretman početi tek kada bolest postane agresivnija. Trenutni oralni ili topikalni tretmani mogu da traju 6-12 meseci. Oralni tretmani moraju zasititi sistemsku cirkulaciju kako bi došli do prstiju, i povećane doze povećavaju rizik za gastro-intestinalne i jetrene komplikacije. Topikalni tretmani su neefikasni u prodiranju u zadebljale nokte i ponovo zahtevaju visoko doziranje.

[0009] Atletsko stopalo (inače poznato kao dermatofitoza u stopalu, Tinea pedis ili mokasinsko stopalo) je gljivična infekcija kože koja je generalno uzrokovana gljivama iz roda Trichophyton (najčešće T rubrum ili T mentagrophytes). Različite parazitske gljive koje uzrokuju atletsko stopalo takođe mogu uzrokovati druge infekcije kože kao što su onihomikoza i Tinea cruris. Iako se razlikuje od gljivične infekcije noktiju, atletsko stopalo takođe ima problema sa usklađenošću i trajanjem tretmana.

[0010] Aspergiloza je uzrokovana infekcijom pluća izazvanom Aspergilus gljivom. Infekcija je povezana sa brojnim stanjima kao što su tuberkuloza i hronična opstruktivna plućna bolest. Infekciju često može biti teško tretirati čak i kada se koristi kombinovani terapijski pristup. Sve češće, Aspergilus infekcije su otporne na triazole.

[0011] Gljivični keratitis je upala rožnjače uzrokovana gljivičnom infekcijom. Natamicinska oftalmička suspenzija se često koristi za filamentozne gljivične infekcije, dok se flukonazolni oftalmički rastvor preporučuje za infekcije kandide. Amfotericin B kapi za oči se koriste za slučajeve teške za tretman, međutim, ove kapi za oči mogu biti toksične za pojedinca.

[0012] Oralna kandidijaza je gljivična infekcija sluzokože usne vrste Candida. To može biti posebno problematično kod pacijenata sa nedostatkom imuniteta, gde je često teško uspešno tretirati.

[0013] Predmet predmetnog pronalaska je da se odgovori na jedan ili više gore navedenih problema povezanih sa trenutnim antifungalnim tretmanima. Takođe je cilj predmetnog pronalaska da obezbedi topikalni antifungalni tretman. Dodatno je cilj predmetnog pronalaska da obezbedi tretman koji omogućava bolju penetraciju antifungalnog agensa kroz brojna tkiva tela, kao što su nokti i/ili dermis, mukozne membrane, i rožnjača i/ili beonjača.

[0014] Pronalazak je definisan patentnim zahtevima. Bilo koji predmet koji se nalazi izvan opsega patentnih zahteva daje se samo u informativne svrhe.

[0015] Bilo koje reference u opisu postupaka tretmana odnose se na jedinjenja, farmaceutske sastave i lekove predmetnog pronalaska za upotrebu u tretmanu ljudskog (ili životinjskog) tela terapijom (ili dijagnostikom).

Rezime pronalaska

[0016] U skladu sa prvim aspektom predmetnog pronalaska, pružen je topikalni sastav za tretman gljivične infekcije koja sadrži polimer sposoban da formira nanočestice i antifungalni agens, gde polimer sadrži linearni i/ili razgranati ili ciklični polimonogvanid/poligvanidin, polibigvanid, njegov analog ili derivat i antifungalni agens sadrži Terbinafin. Sastav je u obliku nanočestica.

[0017] Formiranjem nanočestica od polimonogvanid/poligvanidina, polibigvanida i terbinafina, pronalazači su pogodno pronašli da se antifungalni agensi unose u ćelije mnogo efikasnije i na taj način mogu biti formulisani u lokalni preparat koji ima ne samo sporiji profil oslobađanja, već i smanjenu terapijsku doza koja se može davati lokalno, a ne sistemski, čime se uklanja opasnost od nekih oralno primenjenih antifungalnih agenasa. Kombinovanjem nanopolimernog sistema za nanošenje sa moćnim antifungalnim agensom, može se pružiti topikalni tretman koji može poboljšati efikasnost i potencijalno smanjiti trenutne rokove tretmana za infekcije sa 6 meseci na 6 nedelja.

[0018] Izraz „topikalni sastav“ označava sastav koji je (ili može biti) primenjen na spoljašnju površinu površine tela, kao što su koža i nokti.

[0019] Izraz „nanočestica“ označava strukturu koja ima prosečni prečnik u približnom opsegu od 0,5 - 200 nm. Poželjno, nanočestice će biti u opsegu od 1 do 150 nm, poželjnije u opsegu od 2 do 120 nm i najpoželjnije 5 do 120 nm. U nekim slučajevima, poželjno je da su nanočestice u gornjem opsegu od oko 100 do 120 nm, poželjnije u opsegu od 50 do 175 nm, čak još poželjnije u opsegu od 75 do 150 nm i najpoželjnije u opsegu od 110 do 140 nm. U drugim slučajevima, poželjno je da su nanočestice u nižem opsegu od 0,5 do 10 nm, poželjnije u opsegu od 0,5 do 8 nm, čak još poželjnije 1 do 7 nm i najpoželjnije oko 7 nm ili niže. Izraz „antifungalni agens“ treba da pokriva niz jedinjenja i molekula koji su sposobni da inhibiraju rast i/ili preživljavanje gljiva koje izazivaju gljivičnu infekciju.

[0020] Poželjno je da polimer sadrži linearni i/ili razgranati ili ciklični polimonogvanid/poliuganidin, njegov polibigvanid, analog ili derivat. Linearni i/ili razgranati ili ciklični polimonogvanid/poligvanidin, polibigvanid, njegov analog ili derivat mogu biti prema sledećoj formuli la ili formuli lb, sa primerima datim u tabelama A i B u nastavku:

gde:

„n“, odnosi se na broj ponavljajućih jedinica u polimeru, i n može da varira od 2 do 1000, na primer od 2 ili 5 do 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800 ili 900;

G1i G2nezavisno predstavljaju katjonsku grupu koja sadrži bigvanid ili gvanidin, gde su L1i L2su direktno spojeni na atom azota gvanida. Prema tome, bigvanid ili gvanidin grupe su integralne u polimernoj kičmi. Bigvanidin ili gvanidin grupe nisu delovi bočnog lanca u formuli 1a.

Primer katjonskih grupa:

[0021]

ili

[0022] U predmetnom pronalasku, L1i L2su grupe koje povezuju G1i G2katjonske grupe u polimeru. L1i L2mogu nezavisno da predstavljaju alifatičnu grupu koja sadrži C1-C140atoma ugljenika, na primer alkil grupu kao što su metilen, etilen, propilen, C4C5, C6, C7, C8, C9ili C10; C1-C10, -C20, -C30, -C40, -C50-C60, -C70, -C80, -C90,-C100, -C110, -C120, -C130ili -C140, alkil; ili L1i L2mogu (nezavisno) biti C1-C140(na primer C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9ili C10; C1-C10, -C20, -C30, -C40, -C50-C60, -C70,-C80, -C90, -C100, -C110, -C120, -C130ili -C140), cikloalifatski, heterociklični, aromatski, aril, alkilaril, arilalkil, oksialkilenski radikali, ili L1i L2mogu (nezavisno) da budu polialkilenski radikal, opciono prekinut sa jednim ili više atoma, poželjno jednim, kiseonikom, azotom ili sumporom, funkcionalnim grupama kao i zasićenim ili nezasićenim cikličnim delom. Primeri pogodnih L1i L2su grupe navedene u tabeli A.

[0023] L1, L2, G1i G2mogu biti modifikovani korišćenjem alifatskih, cikloalifatskih, heterocikličnih, arilnih, alkarilnih i oksialkilenskih radikala.

[0024] N i G3poželjno su krajnje grupe. Tipično polimeri koji se koriste u pronalasku imaju terminalne amino (N) i cijanogvanidin (G3) ili gvanidin (G3) krajnje grupe. Takve krajnje grupe mogu biti modifikovane (na primer sa 1,6-diaminoheksanom, 1,6-di (cijanogvanidino) heksanom, 1,6-digvanidinoheksanom, 4-gvanidin-maslačnom kiselinom) vezivanjem za alifatične, cikloalifatske heterociklične, heterociklične, aril, alkilaril, arilalkil, oksialkilen radikale. Pored toga, krajnje grupe mogu biti modifikovane vezivanjem za ligande receptora, dekstrane, ciklodekstrine, masne kiseline ili derivate masnih kiselina, holesterol ili derivate holesterola ili polietilen glikol (PEG). Opciono, polimer može da se završi sa gvanidinom ili bigvanidom ili cijanoaminom ili aminom ili cijanogvanidinom na N i G3položajima ili cijanoaminom na N i cijanogvanidinom na G3položaju ili gvanidinom na N i Cijanogvanidinom G3G3 položaju ili L1aminom na G3i cijanogvanidinom na N. G3može biti L1-amin, L2-cianogvanidin ili L2-gvanidin. U zavisnosti od broja polimerizacije (n) ili prekida polimernog lanca i sporednih reakcija tokom sinteze, heterogena mešavina krajnjih grupa može nastati kao što je opisano iznad kao primer. Prema tome, N i G3 grupe mogu biti zamenjene/prisutne kao heterogena smeša, kao što je gore navedeno. Alternativno, N i G3mogu biti odsutni i polimer može biti cikličan, u kom slučaju su odgovarajuće terminalne L1i G2grupe direktno povezane jedna sa drugom.

[0025] U formuli lb, X može biti prisutan ili odsutan. L3, L4i X su kao što je gore navedeno za „L1or L2“. Stoga, L3i L4i X su grupe koje povezuju G4i G5katjonske grupe u polimeru. L3i L4i X mogu nezavisno da predstavljaju alifatičnu grupu koja sadrži C1-C140atoma ugljenika, na primer alkil grupu kao što su metilen, etilen, propilen, C4, C5, C6, C7, C8, C9ili C10; C1-C10, -C20, -C30, -C40, -C50-C60, -C70, -C80, -C90, - C100, -C110, -C120, -C130ili -C140alkil; ili L3i L4i X mogu nezavisno biti C1-C140(na primer C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9ili C10; C1-C10, -C20, -C30, -C40, -C50-C60, -C70, - C80, -C90, -C100, -C110, -C120, -C130ili -C140), cikloalifatski, heterociklični, aromatski, aril, alkilaril, arilalkil, oksialkilen radikali, ili L3i L4i X mogu nezavisno da budu polialkilen radikal, opciono prekinut sa jednim ili više, poželjno jednim, atomom kiseonika, azota ili sumpora, funkcionalnom grupom kao i zasićenim ili nezasićenim cikličnim delom. Primeri pogodnih L3i L4i X u grupe navedene u tabeli B.

[0026] „G4“ i „G5“ su katjonski ostaci i mogu biti isti ili različiti. Najmanje jedan od njih je bigvanidin grupa ili karbamoilgvanidin, i druga grupa može biti kao iznad (bigvanidin ili karbamoilgvanidin) ili amin. Kako bi se izbegla sumnja, u formuli lb, katjonski ostatak G4i G5ne sadrže samo pojedinačnu gvanidin grupu. Na primer, G4i G5obično ne sadrže pojedinačne grupe gvanidina. Primeri takvih jedinjenja su polialilbigvanid, poli (alilbigvanidio-ko-alilamin), poli (alilkarbamoilgvanidino-ko-alilamin), polivinilbigvanid, kako je navedeno u tabeli B. Primer polialilbigvanida je kao što je prikazano ispod:

[0027] U slučaju polialilbigunidina L3i L4su identični, G4i G5su slični, tako da se polialilbigvanid može pojednostaviti kao u nastavku.

[0028] Primer poli (alilkarbamoilgvanidio-ko-alilamina) je kao što je prikazano u nastavku

[0029] Polimeri za upotrebu u pronalasku će generalno imati kontra jone povezane sa njima. Pogodni kontra joni uključuju, ali nisu ograničeni na sledeće: halid (na primer hlorid), fosfat, laktat, fosfonat, sulfonat, amino karboksilat, karboksilat, hidroksi karboksilat, organofosfat, organofosfonat, organosulfonat i organosulfat.

[0030] Polimeri za upotrebu u pronalasku mogu biti ili heterogene smeše polimera različitih „n“ brojeva ili homogenih fragmenata koji sadrže specifične „n“ brojeve prečišćene standardnim postupcima prečišćavanja. Kao što je naznačeno iznad, polimeri mogu takođe biti ciklični i dodatno mogu biti razgranati.

[0031] Poželjni brojevi za „n“ uključuju 2-250, 2-100, 2-80 i 2-50.

Tabela A. Primeri polimernih analoga koji potiču od formule la.

CAS brojevi, na primer jedinjenja koja potiču od formule 1a

Tabela B. Primeri polimernih analoga koji potiču od formule 1b.

1

[0032] Polimer koji se koristi u postupku prema pronalasku može da sadrži linearne, razgranate ili dendrimerne molekule. Polimer može sadržati kombinaciju linearnih, razgranatih ili dendrimernih molekula. Polimer može sadržati jednu ili bilo koju kombinaciju molekula Formule la ili Formule lb, na primer kao što je opisano iznad.

[0033] Na primer, polimer može da sadrži jedan ili više poliheksametilen bigvanida (PHMB), poliheksametilen monogvanid (PHMG), polietilen bigvanid (PEB), politetrametilen bigvanid (PTMB) ili polietilen heksametilen bigvanid (PEHMB). Neki primeri su navedeni u tabeli A i B.

[0034] Prema tome, polimer može da sadrži homogene ili heterogene smeše jednog ili više iz grupe koju čine poliheksametilen bigvanid (PHMB), poliheksametilen monogvanid (PHMG), polietilen bigvanid (PEB), politetrametilen bigvanid (PTMB), polietilen heksametilen bigvanid (PEHMB), polimetilen bigvanidi (PMB), poli(alilbigvanidio-ko-alilamin), poli(N-vinilbigvanid), polialbigvanid.

[0035] Najpoželjniji polimer obuhvata poliheksametilen bigvanid (PHMB).

[0036] Nanočestice se mogu formirati sa i/ili u prisustvu Terbinafina. Različiti postupci se mogu koristiti za formiranje nanočestica i predviđeno je da će se nanočestice formirati kao kompleks polimera i antifungalnog agensa, gde polimer sadrži linearni i/ili razgranati ili ciklični polimonogvanid/poligvanidin, polibigvanid, njegov analog ili derivat i antifungalni agens sadrži Terbinafin. Međutim, polimerne nanočestice mogu biti nezavisno formirane i zatim inkubirane sa Terbinafinom tako da se apsorbuju ili vezuju za nanočestice na takav način da zadrže svoju efikasnost protiv gljiva.

[0037] U jednom otelotvorenju predmetnog pronalaska, obično sistemski primenjeni antifungalni agens je prisutan u količini doze unutar sastava koja je manja od terapeutski efikasne sistemske doze Terbinafina. Kako topikalni sastav može efikasnije da primenjuje antifungalni agens na mesto infekcije, doza se može smanjiti i to može smanjiti potencijalne toksikološke probleme kod nekih agenasa.

[0038] Stručnjaku će biti jasno da sastav može dalje da sadrži jednu ili više sledećih komponenti: pufere, ekscipijente, vezivna sredstva, ulja, vodu, emulgatore, glicerin, antioksidanse, konzervanse i mirise ili bilo koje dodatne komponente koje se obično nalaze u topikalnim kremama i mastima. Pored toga, sastav može biti u brojnim oblicima, kao što je pasta ili suspenzija za upotrebu sa uređajem za raspršivanje ili formulisana za upotrebu zajedno sa sistemom za isporuku mikro-igličnog niza. Ako se koristi niz mikro-iglica, on se može ugraditi u adhezivni flaster.

[0039] Za određene primene, sastav može dodatno da sadrži agens koji prodire tako da dozvoljava isporuku antifungalnog agensa na inficiranu oblast. Na primer, urea se može koristiti da se nanočesticama omogući probijanje nokta kod pojedinca koji pati od gljivične infekcije noktiju gde je infekcija ispod ili u samom noktu.

[0040] Sastav pronalaska se takođe može primenjivati intranazalno ili inhalacijom i može se pogodno isporučiti u obliku inhalatora za suvi prašak ili prezentacije aerosolnog spreja iz posude pod pritiskom, pumpe, raspršivača ili nebulizatora uz upotrebu pogodnog propelanta, npr. dihlorodifluorometan, trihlorofluorometan, dihlorotetrafluoro-etan, hidrofluoroalkan kao što je 1,1,1,2-tetrafluoroetan (HFA 134A ili 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropan (HFA 227EA3), ugljen dioksid ili drugi pogodni gas. U slučaju aerosola pod pritiskom, jedinična doza se može odrediti pružanjem ventila za isporuku merene količine. Kontejner pod pritiskom, pumpa, sprej ili nebulizator mogu da sadrže rastvor ili suspenziju sastava, npr. etanol i propelant kao rastvarač, koji mogu dodatno da sadrže lubrikant, npr. sorbitan trioleat.

Kapsule i patrone (napravljene, na primer, od želatina) za upotrebu u inhalatoru ili insuflatoru mogu biti formulisane tako da sadrže smešu praha sastave pronalaska i pogodne praškaste baze kao što su laktoza ili skrob.

[0041] Formulacije aerosola ili suvog praha su poželjno postavljene tako da svaka odmerena doza ili „ispust“ sadrži najmanje 1 µg sastava za isporuku pacijentu. Treba imati na umu da će ukupna dnevna doza sa aerosolom varirati od pacijenta do pacijenta i može se primenjivati u jednoj dozi ili, obično, u podeljenim dozama tokom dana.

[0042] Alternativno, sastav pronalaska se primenjuje topikalno u obliku losiona, rastvora, kreme, masti ili praha za zaprašivanje. Sastav pronalaska može takođe biti transdermalno primenjen, na primer, korišćenjem flastera za kožu.

[0043] Za oftalmološku upotrebu, sastav pronalaska može biti formulisana korišćenjem sistema sa nanočesticama ili kao mikronizovane suspenzije u izotoničnom, pH podešenom, sterilnom fiziološkom rastvoru, ili, poželjno, kao rastvori u izotoničnom, pH podešenom, sterilnom slanom rastvoru, opciono u kombinaciji sa konzervansom kao što je kao benzilalkonijum hlorid. Alternativno, oni mogu biti formulisani u masti kao što je vazelin.

[0044] Za površinsku primenu na kožu, sastav pronalaska može biti formulisana kao pogodna mast koja sadrži aktivno jedinjenje suspendovano ili rastvoreno u, na primer, smeši sa jednim ili više od sledećeg: mineralno ulje, tečni petrolatum, beli vazelin, propilen glikol, polioksietilen polioksipropilen, emulgirajući vosak i voda. Alternativno, mogu biti formulisani kao pogodni losion ili krema, suspendovani ili rastvoreni u, na primer, smeši jednog ili više od sledećeg: mineralno ulje, sorbitan monostearat, polietilen glikol, tečni parafin, polisorbat 60, vosak cetil estera, cetearil alkohol, 2-oktildodekanol, benzil alkohol i voda.

[0045] Sastav za topikalnu primenu, kako je ovde opisan, može se koristiti za tretman brojnih gljivičnih infekcija. Međutim, on je posebno pogodan za tretman gljivične infekcije noktiju, atletskog stopala ili drugih vrsta gljivične infekcije kože/dermatofitnih infekcija (kao što su dermatofitoza prepona (Tinea cruris), dermatofitoza tela (Tinea corporis), dermatofitoza skalpa (Tinea capitis), druge infekcije tipa „dermatofitoze“). Pronalazak će takođe biti pogodan za tretman infekcija kvascima kao što su, ali ne ograničavajući se na, intertrigo, pitiriasis versicolor, i drozd (Candida albicans).

[0046] Upotrebljeni antifungalni agens će, naravno, u velikoj meri biti upravljan svojom efikasnošću protiv gljiva koje uzrokuju infekciju. Antifungalni agens može sadržati jedan ili više drugih agenasa izabranih iz sledeće grupe: Nistatin, Ketokonazol, Amfotericin B, Itrakonazol ili Berberin.

1

[0047] Gljivična infekcija može da sadrži dermatofitnu infekciju. Međutim, ovaj pronalazak se takođe može koristiti za tretman infekcija i/ili kolonizacije kvascima.

[0048] U predmetnom pronalasku, pružen je lokalni lek koji sadrži nanopartikulatnu kombinaciju poliheksametilen bigvanida i antifungalnog agensa, terbinafina, za tretman gljivične infekcije.

[0049] U skladu sa daljim aspektom predmetnog pronalaska, pružena je upotreba poliheksametilen bigvanida (PHMB) kako bi se formirala jedna ili više nanočestica sa, ili povezana sa, Terbinafinom, u pripremi topikalnog medikamenta. Nanočestice će biti korišćene kao nosač za oslobađanje antifungalnog agensa u zaraženom području i takođe stvaraju sinergetski efekat kada se tretiraju gljivične infekcije. Stručnjaku će biti jasno da će upotreba PHMB biti da se formira sastav koji je ovde opisan u vezi sa prvim aspektom pronalaska.

[0050] U skladu sa još jednim aspektom predmetnog pronalaska, pružen je postupak za proizvodnju topikalnog sastava za tretman gljivične infekcije, koji obuhvata mešanje polimera, gde polimer sadrži linearni i/ili razgranati ili ciklični polimonogvanid/poligvanidin, polibigvanid, njegov analog ili derivat, sposoban da formira nanočestice sa terbinafinom pod uslovima koji su pogodni da omoguće formiranje nanočestica. Ponovo, očigledno je da će se postupak koristiti da se dobije sastav koji je ovde opisan.

[0051] U još jednom dodatnom aspektu predmetnog pronalaska, pružena je kombinacija sastava koja sadrži polimer sposoban da formira nanočestice i antifungalni agens, gde polimer sadrži linearni i/ili razgranati ili ciklični polimonogvanid/poligvanidin, polibigvanid i antifungalni agens sadrži Terbinafin. i niz mikro-iglica za upotrebu u tretmanu gljivične infekcije noktiju. Niz mikro-iglica može biti inkorporiran u adhezivni flaster. Mikro-iglice mogu biti manje od 2 mm dužine. Još poželjnije, mikroiglice su manje od 1,5 mm dužine. Najpoželjnije, mikroiglice su manje od 1 mm dužine. Poželjno je da se u kožu umetne manje od 500 µm mikro-iglica. Poželjnije je da se u kožu umetne manje od 400 µm mikroiglica. Najpoželjnije je da se u kožu umetne oko 300 - 200 µm mikro-iglica. Poželjno, mikro-iglice isporučuju sastav dermisu i/ili epidermisu.

Detaljan opis pronalaska

[0052] Otelotvorenja predmetnog pronalaska će sada biti opisana, samo kao primer, u vezi sa sledećim eksperimentima i pratećim slikama, u kojima:

Slika 1 je grafik koji prikazuje smanjenje Minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) antifungalnih sredstava protiv Saccharomyces cerevisiae EBI100, u kombinaciji sa PHMB. Ispunjeni kvadrati predstavljaju MIC samog leka i ispunjeni krugovi predstavljaju MIC leka kada se kombinuje sa PHMB. Smanjenje MIC svakog leka je: nistatin-2 puta, amfotericin B-4 puta, berberin-2 puta, ketokonazol-4 puta i terbinafin-8 puta;

Slika 2 je grafik koji prikazuje MIC antifungalnih sredstava protiv Saccharomyces cerevisiae NOD 24, u kombinaciji sa PHMB. Ispunjeni kvadrati predstavljaju MIC samog leka i ispunjeni krugovi predstavljaju MIC leka kada se kombinuje sa PHMB. Smanjenje MIC svakog leka je: nistatin-4 puta, amfotericin B-16 fold, berberin-16 puta, ketokonazol-4 puta i terbinafin-16 puta;

Slika 3 je grafik koji pokazuje smanjenje MIC antifungalnih sredstava protiv Candida albicans, u kombinaciji sa PHMB. Ispunjeni kvadrati predstavljaju MIC samog leka i ispunjeni krugovi predstavljaju MIC leka kada se kombinuje sa PHMB. Smanjenje MIC svakog leka je: nistatin-2 puta, amfotericin B-2 puta, berberin-2 puta, ketokonazol-4 puta i terbinafin-4 puta;

Slike 4A - 4E su grafici koji prikazuju promene u fluorescenciji/apsorbanciji antifungalnih agenasa u kombinaciji sa PHMB. Ispitana je promena intenziteta fluorescentne emisije fluorescentnih jedinjenja u prisustvu i odsustvu PHMB. Smanjena je fluorescencija ketokonazola (Slika 4A), amfotericina B ( Slika 4B), berberina (Slika 4C) i nistatina (Slika 4D) (gašenje fluorescencije). Promene u apsorpciji terbinafina u prisustvu i odsustvu PHMB su testirane i utvrđeno je da su povećane (hiperhromni efekat) (Slika 4E);

Slika 5 (a) i (b) su grafici koji pokazuju raspodelu veličine formiranih čestica testiranih korišćenjem dinamičkog raspršenja svetlosti. Slika 5 (a) pokazuje distribuciju veličine čestica (Prosečna veličina = 22,22 ± 1,591 nm) nastalu kada je Berberin kombinovan sa PHMB u odnosu 1:3, dok Slika 5 (b) pokazuje raspodelu veličine čestica nastalu kada je Ketokonazol bio u kombinaciji sa PHMB u odnosu 1:3. Vrh 1 Prosečna veličina = 1,15 0,017, Vrh 2 Prosečna veličina = 5,88 ± 0,71 i Vrh 3 Prosečna veličina = 498,9 65,2;

Slika 6 prikazuje fluorescentne mikroskopske slike od C albicans pokazujući poboljšanu isporuku Berberina u kombinaciji sa PHMB. A = Neobrađeno C albicans obojen sa DAPI, stoga je jezgro plavo. B = C albicans tretiran sa 1 µg/ml samog berberina pokazujući zelenu fluorescenciju unutar citoplazme usled isporuke male količine berberina. C = C albicans

1

tretiran sa 1 µg/ml berberina i 1,25 µg/ml PHMB pokazujući povećanu zelenu fluorescenciju citoplazme koja ukazuje na povećanu isporuku berberina. Lestvica = 5µm;

Slika 7 je grafik koji prikazuje analizu protočne citometrije C albicans ćelija pozitivnih na Berberin kada su tretirane samim Berberinom i kombinacijom Berberina i PHMB. % ćelija je predstavljen kao srednja vrednost triplikata ± SD. Ova brojka pokazuje kako se koncentracija PHMB povećava sa 1,25 na 5 µg/ml, i povećava se isporuka u ćelije. Za svaku koncentraciju Berberina, kolone su sledeće: Sam Berberin, 1,25 µg/ml PHMB; 2,5 µg/ml PHMB; i 5 µg/ml PHMB;

Slika 8 je grafik koji prikazuje veličinu/koncentraciju nanočestica proizvedenih proizvedenih nanočestica koje sadrže Terbinafin i PHMB;

Slika 9 je grafik koji prikazuje veličinu nanočestica/relativni intenzitet proizvedenih nanočestica koje sadrže Terbinafin i PHMB;

Slika 10 je grafik koji prikazuje 3D grafički prikaz veličine/relativnog intenziteta proizvedenih nanočestica koje sadrže Terbinafin i PHMB;

Slika 11 je prikaz dijagrama prsta sa noktom koji se tretira sa mikro-igličnog flasterom za isporuku sastava prema predmetnom pronalasku;

Slika 12 je dijagram poprečnog preseka prsta kao što je prikazano na Slici 11; i

Slika 13 je dijagram poprečnog preseka mikro-igličnog flastera.

[0053] Cilj sledećih eksperimenata je bio da se ispita da li bi se ćelijska isporuka antifungalnih sredstava mogla poboljšati korišćenjem sistema za isporuku na bazi nanotehnologije sa katjonskim polimerom poliheksametilen bigvanidom (PHMB).

Eksperimenti su takođe istražili novu strategiju kombinovanja antifungalnih sredstava sa PHMB koji mogu da formiraju nanočestice sa malim molekulima. PHMB je jeftin, lako dostupno dezinfekciono sredstvo i antiseptik koji se obično koristi u zavojima, bazenima i rastvorima za kontaktna sočiva. Smatra se da njegovo antiseptičko dejstvo funkcioniše tako što razbija ćelijske membrane organizama i time izaziva curenje sadržaja ćelija. Eksperimenti su takođe procenili da li bi kombinacija antifungalnog agensa i PHMB omogućila smanjenje doze leka i na taj način smanjila toksičnost i/ili povećala internalizaciju leka agensa i da li bi postojao neki sinergetski efekat.

[0054] Eksperimenti su bili fokusirani na antifungalna sredstva koja imaju intracelularne ciljeve za antifungalno dejstvo i trenutno se klinički koriste, ali su manje preferirani zbog problema rastvorljivosti, toksičnosti i rezistentnosti. Zajedno sa klinički upotrebljenim antifungalnim sredstvima, takođe je proučavan i novi kandidat, Berberine, sa dokazanim

1

antifungalnim dejstvom(Zhao i dr., (2010) J. Therm. Analysis and Calorimetry, 102, 49-55). Izabrani kandidati su ilustrovani u Tabeli 1 u nastavku. Samo je terbinafin u opsegu patentnih zahteva.

Tabela 1

1

[0055] In vitro osetljivost kliničkog izolata Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae NOD 24 i S cerevisiae EBI 100 na kombinaciju antifungalnog agensa i PHMB je procenjena korišćenjem chequerboard testa. Takođe je procenjena interakcija između lekova i PHMB, formiranje nanočestica i unos u ćelije.

Antifungalna sredstva

[0056] Nistatin, terbinafin, ketokonazol i berberin su dobijeni kao prašak od Sigma-Aldrich, UK. Amfotericin B je dobijen od Sigma kao rastvor u deionizovanoj vodi. Dimetil sulfoksid (DMSO) je takođe od Sigma. Osnovni rastvori nistatina (5 mg/ml), terbinafina (15 mg/ml), ketokonazola (5 mg/ml) i amfotericina B (0,2 mg/ml) su pripremljeni u DMSO. Berberin je rastvoren u vodi kako bi se dobio rastvor od 10 mg/ml. PHMB osnovni rastvor (5 mg/ml) je takođe napravljen u vodi. Svi osnovni rastvori su napravljene u različitim alikvotima od 500 µl, čuvani na -20°C i zaštićeni od svetlosti.

Sojevi

[0057] Dva soja Saccharomyces cerevisiae i jedan klinički izolat Candida albicans su proučavani. S cerevisiae NOD 24 je nabavljen od Royal Veterinary College i S cerevisiae EBI 100 od Allinson Bread®, UK. Klinički izolat C albicans takođe je dobijen od Royal Veterinary College.

Medijumi

[0058] RPMI 1640 medijum je dobijen kao prašak i rastvoren u destilovanoj vodi i puferisan sa 0,165M morfolino propanesulfonske kiseline (MOPS) prema standardnoj proceduri. pH je podešen na 7 koristeći 1M rastvor natrijum hidroksida. Sabouraud-ov glukozni agar (SGA) je

1

dobijen kao prašak. Svi mediji i hemikalije su od Sigma-Aldrich, UK.

Priprema inokuluma

[0059] Inokulum kvasca je pripremljen sakupljanjem pet kolonija od 24 sata uzgajane kulture u SGA i mešanjem u RPMI 1640 sa MOPS. Optička gustina smeše je podešena spektrofotometrijski na 1, što je ekvivalentno 3 X 10<7>jedinice za formiranje kolonija kvasca/ml. Ova suspenzija je dalje razblažena u RPMI 1640 sa MOPS kako bi se dobila konačna veličina inokuluma od 0,5 X 10<4>CFU/ml.

Chequerboard titration test

[0060] Testiranje titracije na kontrolnoj tabli je sprovedeno u sterilnim pločama sa 96 komorica prema CLSI preporučenoj standardnoj proceduri za testiranje antifungalnog efekta lekova samih i u kombinaciji sa PHMB. Kao test medijum je korišćen RPMI 1640 medijum puferisan sa MOPS. Razređivanjem leka pripremljen je medijum za testiranje ako je osnovni rastvor napravljen u DMSO i u slučaju osnovnih rastvora koji su napravljeni u vodi, dalje razblaživanje leka bilo je u samoj vodi. Ispitivane koncentracije su: nistatin 0,000039 mg/ml do 0,02 mg/ml, amfotericin B 0,032 mg/ml do 0,0000625 mg/ml, berberin 0,01 mg/ml do 0,00002 mg/ml, ketokonazol 0,032 mg/ml do 0,0000625 mg/ml i terbinafin 0,16 mg/ml do 0,00031 mg/ml. Kontrola rasta i kontrola sterilnosti bili su prisutni u svim pločama. Sve ploče su pripremljene u triplikatu.

Inkubacija i izračunavanje minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) i frakcionalnog indeksa inhibitorne koncentracije (FICI)

[0061] Ploče su zapečaćene parafinskom folijom kako bi se sprečilo isparavanje i držane su na 37°C za C albicans i 30°C za S cererevisiae. MIC je snimljen vizuelno, uz pomoć Powerwave 340 univerzalnog spektrofotometra za mikroploče (Biotek) nakon 24 sata za C albicans i S cerevisiae NOD 24. Međutim to je zabeleženo posle 48 sati za S cerevisiae EBI 100 pošto nije bilo rasta ni u kontrolnim komoricama nakon 24 sata. MIC je definisan kao najniža koncentracija kod koje nema vidljivog rasta. FICI je korišten za analizu interakcija lekova in vitro i izračunat je pomoću sledeće jednačine:

[0062] Vrednosti FICI su interpretirane prema preporučenim standardima (FICI ≤ 0,5 je

1

'sinergetski efekat',> 0,5, ali ≤ 4 je 'bez interakcije' i> 4 je 'antagonistički efekat').

Studije fluorescencije i apsorpcije

[0063] Interakcija fluorescentnih antifungalnih sredstava sa PHMB je testirana flourometrijski. Dozvoljena je specifična koncentracija svakog leka u interakciji sa različitim koncentracijama PHMB i proučavane su promene intenziteta fluorescencije. Eksperiment je sproveden u kvantnim pločama ravnog dna sa 96 komorica.150 µg/ml berberina, 5 µg/ml ketokonazola i 5 µg/ml amfotericina B je pomešano sa PHMB u w/w odnosima v 1:0 do 1:10.

50 µg/ml nistatina je pomešano sa PHMB u w/w odnosima 1:0 do 1: 4. U slučaju terbinafina koji nije fluorescentan, proučavane su promene u apsorbanciji.10 µg/ml Terbinafina je pomešano sa PHMB u w/w odnosima 1:0 do 1: 5. Rastvori su pripremljeni od osnovnih rastvora u fosfatnom puferu (PBS) za sve lekove osim za Berberin za koji je korišćena voda dok se taložio u PBS u koncentraciji. Smeša je temeljno pomešana pipetiranjem i držana je na sobnoj temperaturi tokom 20 minuta, i zatim je testirana na promenu fluorescencije/apsorbancije. Fluorescencija je testirana u Infinite M200 Pro Fluorometer-u (Tecan). Kako bi se testirala fluorescencija, ekscitacija intenziteta i talasna dužina emisije bili su 320nm i 410nm za nistatin, 340nm i 480nm za amfotericin B, 350nm i 550nm za berberin, 260nm i 375nm za ketokonazol. U slučaju Terbinafina, proučavane su promene apsorbancije pomoću ND1000 spektrofotometra (Nanodrop). Maksimum apsorpcije za terbinafin je bio 272 nm. Promene maksimalne apsorpcije na 272 nm su ucrtane u odnosu na koncentraciju PHMB.

Formiranje čestica i određivanje veličine čestica

[0064] Za procenu formiranih kompleksa korišćeno je dinamičko raspršivanje svetlosti (DLS). Zasniva se na principu da se merenjem raspršene svetlosti od čestica u pokretu može odrediti njihova veličina. Antifungalna sredstva (100 µg/ml) i PHMB su temeljno pomešani pri w/w odnosu 1:3 u PBS i držani 20 minuta na sobnoj temperaturi. Veličina čestica je određena korišćenjem Zetasizer S (Malvern instruments, UK).

Mikroskopija

[0065] Ćelijska isporuka berberina je vizuelno detektovana pošto je jedinjenje fluorescentno dovoljno da se detektuje mikroskopijom. C albicans ćelije su tretirane samo berberinom i kombinacijom berberina i PHMB.50 µl od 1 µg/ml, 2 µg/ml i 3 µg/ml rastvora Berberina je pravilno pomešano sa 50 µl od 1 µg/ml i 2,5 µg/ml PHMB u sterilnim pločama sa 96

2

komorica pipetiranjem 3-4 puta, i držano je na sobnoj temperaturi tokom 20 minuta.100µl C albicans ćelija u RPMI 1640 se dodaje u te komorice, do 100 µl rastvora samog Berberina i do 100 µl PBS i drži se na 37°C tokom 1 sata. Sadržaj svake komorice je prebačen u ependorf epruvete i centrifugiran na 5000 rpm tokom 10 minuta. Posle uklanjanja supernatanta, 100 µl 2,5 µg/ml 4', 6' diamino-2-fenilindola (DAPI) je dodato u svaku epruvetu kako bi se obojili nukleusi gljiva. Slajdovi su pripremljeni u agaroznom sloju i posmatrani pod DM4000 uspravnim fluorescentnim mikroskopom (Leica microsystems) koristeći uljano imerziono sočivo.

Protočna citometrija

[0066] Ćelijska isporuka berberina u C albicans kada je kombinovan sa PHMB testirana je kvantitativno korišćenjem protočne citometrije. U 9-komoričnoj ploči ćelije kvasca su tretirane sa 1 µg/ml-5 µg/ml samog berberina i kombinacije ovih koncentracija sa 1,25, 2,5, 5 µg/ml PHMB. Postupak je bio potpuno isti kao i postupak za mikroskopiju. Posle centrifugiranja, uklonjeno je 100 µl supernatanta, dodato je 400 µl PBS i testirano je za isporuku berberina koristeći FITC (fluorescein izotiocijanat) filter u FACS Canto™ II protočnom citometru (BD Biosciences). Podaci su dobijeni korišćenjem FACS Diva softvera i analizirani korišćenjem Flowjo 5.6.5 softvera.

Statistička analiza

[0067] Wilcoxon potpisan test ranga je korišćen za statističku analizu promena u MIC od antifungalnih sredstava u kombinaciji sa PHMB. P vrednost manja od 0,05 smatrana je značajnom. Statistička analiza izvršena je korišćenjem SPPSS softvera verzija 2.0.

Analiza kontrolne ploče

[0068] Osetljivost gljiva na odabrana antifungalna sredstva i njihova kombinacija sa PHMB chequerboard testom je merena procenom promena u MIC od antifungalnih sredstava kako bi se utvrdilo da li postoji bilo kakva redukcija kada PHMB i lekovi deluju zajedno. Svi lekovi su pokazali značajno smanjenje MIC u kombinaciji sa PHMB (p vrednost = 0,043). MIC antifungalnih sredstava i FICI vrednosti su sumirane u Tabeli 2 u nastavku. Samo je Terbinafin u opsegu patentnih zahteva.

Tabela 2

Pad MIC-a je prikazan na Slikama 1 do 3. Svi lekovi su pokazali pad MIC protiv svih organizama u kombinaciji sa manje od 0,00005 mg/ml PHMB. Takođe je bilo značajno (p vrednost = 0,045) smanjenje MIC od PHMB kada se kombinuje sa antifungalnim sredstvima, što je ilustrovano u Tabeli 3 u nastavku.

Tabela 3

2

[0069] Tokom chequerboard testiranja naišli smo na probleme rastvorljivosti sa terbinafinom u medijumu. Ali ovo je rešeno držanjem na 37°C tokom 10 minuta. Neka antifungalna sredstva su pokazali sinergiju. Postojala je razlika u MIC od različitih lekova protiv različitih organizama, kako se i očekivalo. Ogromni pad MIC antifungalnih sredstava protiv S cerevisiae NOD 24 je primećeno. U slučaju terbinafina i ketokonazola otkrivena je jaka sinergija sa PHMB. U slučaju amfotericina B, sinergija je primećeno kada se testira protiv S cerevisiae EBI 100. Rezultati chequerboard testa ukazuju da PHMB može pojačati dejstvo ovih antifungalnih sredstava

Studije fluorescencije i apsorpcije

[0070] Interakcija između PHMB i antifungalnih sredstava je testirana proučavanjem promena u intenzitetu fluorescencije. Rezultati su prikazani na Slici 4. Smanjenje fluorescencije svih jedinjenja. U odnosu 1:6 između ketokonazola i PHMB njegova fluorescencija je pala na skoro 50%. Fluorescencija nistatina pokazuje samo malo smanjenje. Za vreme studije je otkriveno da se berberin taloži u PBS, pa je voda korišćena kao rastvarač. Bilo je pada fluorescencije berberina, ali je onda počela da se blago povećava, ali nikada nije bila veća od uzorka samo sa berberinom. Slično je i sa amfotericinom B. Ovaj pad fluorescencije uzorka naziva se gašenje fluorescencije. U slučaju terbinafina, apsorbancija je blago povećana. To se naziva hiperhromni efekat. Fluorescentno gašenje i hiperhromni efekti pokazuju da PHMB interaguje sa antifungalnim sredstvima.

Veličina formiranih čestica

[0071] Veličina kompleksa formiranih između PHMB i antifungalnih sredstava određena je pomoću DLS. Nanočestice su primećene u slučaju ketokonazola i berberina (Slika 5). Ali u slučaju ketokonazola, bilo je i nekoliko čestica većih dimenzija. U slučaju berberina (Slika 5 (a)) 64,5% čestica je bilo oko 22,2 ± 1,5 nm. Ali za ketokonazol (Slika 5 (b)) svega manje od 10% čestica bilo je veličine manje od 10 nm. Indeks polidisperznosti bio je veći od 1, što znači širu distribuciju veličine čestica. U slučaju drugih lekova, uočene su čestice od 50 do ≤ 1000 nm. Rezultati pokazuju da PHMB formira čestice sa svim antifungalnim sredstvima i nanočesticama sa terbinafinom, ketokonazolom i berberinom.

Mikroskopija

[0072] Ćelijska isporuka berberina u C albicans je testirana korišćenjem fluorescentne mikroskopije. Došlo je do značajnog povećanja fluorescencije ćelija kada je berberin kombinovan sa PHMB, u poređenju sa samim berberinom kao što je prikazano na Slici 6. Takođe je primećeno povećanje fluorescencije kada je koncentracija PHMB povećana za istu koncentraciju berberina. Slika 6 predstavlja samo jednu koncentraciju berberina, ali su slični rezultati uočeni za sve ispitivane koncentracije. Rezultati ukazuju da se doprimenom PHMB povećava ulazak berberina u ćelije u odnosu na sam berberin. Ovo kvalitativno dokazuje da PHMB može poboljšati isporuku berberina u gljive.

Protočna citometrija

[0073] Poboljšana isporuka berberina u C albicans je kvantifikovana pomoću protočne citometrije. FITC filter je korišćen kao vrh emisije berberina koji ulazi u FITC spektar apsorpcije. Postoji jasan porast broja pozitivnih ćelija za berberin kada je kombinovan sa PHMB, kao što je prikazano na Slici 7. Posmatranje je bilo slično mikroskopiji, tj., povećanje ćelija pozitivnih na berberin sa povećanjem koncentracije PHMB. Uočen je i blagi porast kod viših koncentracija samog berberina. Ovi rezultati ukazuju da PHMB povećava ćelijsku isporuku berberina u C albicans.

Rezultati

[0074] PHMB je nisko toksični, klinički siguran antiseptik i eksperimenti pokazuju pojačanu isporuku antifungalnih sredstava kombinovanjem sa ovim katjonskim polimerom. Lekovi su testirani na promene u svojom antifungalnom delovanju protiv C albicans i S cerevisiae u kombinaciji sa PHMB. Interakcija između polimera i lekova je testirana korišćenjem studija fluorescencije/apsorpcije i dinamičkog raspršenja svetlosti. Isporuka berberina u ćelije proučavana je pomoću protočne citometrije i fluorescentne mikroskopije.

[0075] Eksperimenti pokazuju da postoji značajna redukcija (p vrednost = 0,043) u MIC od svih lekova u kombinaciji sa PHMB. Takođe, intenzitet fluorescencije i apsorbancija svih ispitivanih lekova su promenjeni u prisustvu PHMB ukazujuće interakcije. Interakcije leka -PHMB potvrđene su dinamičkim rasipanjem svetlosti. Nanočestice su primećene u slučaju berberina, terbinafina i ketokonazola. Povećana ćelijska isporuka berberina u C albicans je vizualizovana pomoću mikroskopije i kvantifikovana pomoću protočne citometrije.

[0076] PHMB potencira dejstvo antifungalnih sredstava, formira nanočestice i poboljšava ćelijsku isporuku berberina i predviđa se da će upotreba nanočestica u kombinaciji sa antifungalnim agensima poboljšati antifungalno dejstvo in vivo.

2

[0077] PHMB je pojačao antifungalno dejstvo svih ispitivanih lekova, kao što je smanjenje MIC svih lekova koje je ilustrovano u Tabeli 2. Sinergetski efekat je primećen kod ketokonazola, terbinafina i amfotericina B.

[0078] Pretpostavljeno je da PHMB formira nanočestice sa odabranim antifungalnim sredstvima. Nanočestice nisu detektovane kada su nistatin, terbinafin i amfotericin B kombinovani sa PHMB u odnosu 1:3. Otkrivene su čestice većih dimenzija u rasponu veličina od 500 do 1000 nm. To može biti zbog agregacije ili taloženja. Međutim, veruje se da bi kombinovanje lekova i PHMB u različitim odnosima dovelo do formiranja nanočestica pored promene temperature pri kojoj se formiraju čestice, promene medijuma/rastvarača reakcije i prilagođavanja pH.

[0079] Alternativna tehnika isporuke leka koja je istražena u ovoj studiji ima svoje potencijalne primene u intracelularnim i topikalnim gljivičnim infekcijama, kao i infekcijama sa visoko otpornim gljivama. Infekcije sa intracelularnim gljivama Histoplasma capsulatum i Cryptococcus neoformans teško se tretiraju zbog teškoća u transportu kroz ćelijske membrane i smanjeno dejstvo unutar ćelija. Sistem za isporuku lekova zasnovan na PHMB nudi jeftinije rešenje u poređenju sa postojećim i omogućava upotrebu nižih doza antifungalnih agenasa.

[0080] Predviđeno je da se PHMB (ili odista i slični polimeri sposobni za formiranje nanočestica mogu kombinovati sa antifungalnim agensima kako bi se ciljale gljive navedene u Tabeli 4 u nastavku.

Tabela 4

Formiranje nanočestica sa Terbinafinom i PHMB

[0081] Eksperimenti su izvedeni kako bi se formirale nanočestice formirane sa Terbinafinom

2

i PHMB.

[0082] Terbinafin je rastvoren u DMSO do koncentracije od 10 mg/ml. Zatim je dalje razblažen do koncentracije od 1 mg/ml u ultra čistoj vodi (20 µl 10 mg/ml Terbinafina je dodato u 180ul H2O) i dobro pomešano vrtloženjem).

[0083] PHMB (1 mg/ml u vodi) je zagrejano tokom 20 minuta na 60°C i zatim ostavljeno da se ohladi do sobne temperature pre upotrebe.

[0084] Odnos PHMB: Terbinafin je održavan konstantnim pri 3:1, jer je to omogućilo optimalnu veličinu i brojeve nanočestica u do sada testiranim uslovima.

PHMB/Terbinafin formulacija nanočestica:

[0085] Deset puta nanočestična formulacija 30:10 (µg/ml PHMB:Terbinafin) je napravljena u 300ul. 288 µl PBS je dodato u 1,5 ml sterilnu epruvetu. Dodato je 9 µl 1 mg/ml PHMB i pomešano pipetiranjem 5 puta. Zatim se polako dodaje 3 mg 1 mg/ml Terbinafina i pomeša se pipetiranjem 5 puta. Inkubacija je zatim ostavljena 1 sat na sobnoj temperaturi u prisustvu PHMB kako bi se formirale nanočestice.

[0086] Rastvor je zatim dalje razređen deset puta sa PBS za merenje na Nanosight LM10 nano-čestičnoj mašini (kako bi se dobila konačna koncentracija 3ug/ml PHMB i 1ug/ml Terbinafina).

[0087] Merenja su očitana na Nanosight LM10 mašini (dobijena od Nanosight Limited, Wiltshire, UK) tokom 1 minuta na 20°C, nivo kamere 9, pojačanje ekrana 10 i prag detekcije 6.

[0088] Nanosight rezultati su prikazani na Slikama 8 do 10 i sumirani su u Tabeli 5 u nastavku:

Tabela 5

2

[0089] Kao što je prikazano na Slikama 8-10, proizvedene su nanočestice koje sadrže PHMB i Terbinafin i PHMB koje se zatim mogu koristiti u pripremi topikalnog medikamenta za naknadni tretman niza potencijalnih gljivičnih infekcija.

Mikro-iglični flaster

[0090] Transdermalni flasteri se dugo koriste za isporuku malih molekula lipofilnih lekova koji se lako apsorbuju kroz kožu. Ovaj neinvazivni način primene je pogodan za primenu mnogih lekova koji nisu kompatibilni sa oralnom primenom, jer dozvoljava direktnu apsorpciju leka u sistemsku cirkulaciju, zaobilaženje i digestivnog i hepatičnog portalnog sistema koji takođe može dramatično da smanji bioraspoloživost mnogih lekova.

Transdermalni unos takođe prevazilazi mnoge od izazova povezanih sa potkožnom injekcijom tako što značajno smanjuje nelagodnost pacijenta, anksioznost od igle, rizik od slučajne povrede iglom od astrane lekara i probleme oko odlaganja oštrih predmeta.

[0091] Uprkos ovim mnogim prednostima, transdermalna primena lekova je ograničena na klase molekula kompatibilne sa apsorpcijom kroz kožu. Isporuka malih molekulskih soli i terapeutskih proteina nije tipično moguća sa tradicionalnom transdermalnom isporukom, jer koža pruža efikasnu zaštitnu barijeru za ove molekule čak i u prisustvu ekscipijenata za povećanje apsorpcije. Međutim, tehnologija mikro-iglica se može koristiti za isporuku nanočestica koje sadrže antifungalne agense direktno u epidermis, dermis i matricu nokta (gde se nokti i koža sastaju na eponichium-u). Isporukom sastava pronalaska na ovaj način, nanočestice će ući u matricu nokta i kapilarni sistem i isporučiti antifungalni sastav nanočestica u ležište nokta, ispod tvrde ploče nokta, i u gljive. Na taj način potentni antifungalni agensi mogu biti direktno isporučeni na mesto dejstva, čime se smanjuje vreme tretmana i povećava potentnost.

[0092] Slike 11 i 12 prikazuju dijagrame prsta 10 na koji se mikro-iglični flaster (ilustrovan na slici 13) može primeniti na prst unutar područja za tretman 12 prikazano isprekidanom

2

linijom. Područje za tretman 12 se formira od dermisa iza nokta 14 i takođe u matrici nokta (eponichium) 16, gde se nokat i koža sastaju. Koren nokta 18 se nalazi u području ispod dermisa iza nokta i stoga se može efikasno tretirati nanošenjem mikro-igličnog flastera za isporuku sastava predmetnog pronalaska. Naravno, mikro-iglični flaster se može koristiti za nokte na prstima ili nožnim prstima.

[0093] Slika 13 prikazuje dijagram mikro-igličnog flastera koji se može koristiti za nanošenje sastava predmetnog pronalaska pojedincu koji pati od gljivične infekcije noktiju. Mikroiglični flaster 20 je napravljen od fleksibilne mreže materijala 22 koja ima lepak 24 koji je nanesen na njegovu donju stranu. Centralno lociran na donjoj strani fleksibilne mreže je niz mikro-iglica 26 koje se protežu nadole i koje imaju veći broj tačaka 30. Tačke se mogu formirati kao igle koje imaju provodnike koji su povezani sa rezervoarom 28 koji sadrži sastav ili jednostavno imaju svoje tačke u sastavu. U alternativnoj konfiguraciji, rezervoar 28 može izbaciti sastav kroz rupe raspoređene oko niza mikro-iglica, tako da sastav može kontinualno prekriti tačke niza tokom unapred određenog vremenskog okvira. Očigledno je da je stručnjaku dostupno više različitih mikro-igličnih flastera i da se sastav predmetnog pronalaska može prilagoditi za upotrebu sa njihovim opsegom.

[0094] Mikro-iglice mogu biti manje od 2 mm dužine, i poželjno je oko 250µm biti umetnute u kožu sa minimalnom neudobnosti za pacijenta i, s obzirom na malu rupu, sa minimalnim rizikom od infekcije, krvarenja ili rizika od nesmotrene IV injekcije za intradermalnu administraciju. Pored toga, mikro-iglice smanjuju rizik za onoga ko primenjuje injekciju, jer je slučajno bušenje kože gotovo nemoguće sa ovim malim iglama.

[0095] Predviđeno je da flaster sa mikro iglom može da se koristi za pojedinačan tretman u kom pacijent mora samo da ukloni flaster sa omotača i nanese ga na odgovarajući deo prsta ili nožnog prsta u određenom vremenskom periodu. Alternativno, mikro-iglični flaster se može prodati u kombinaciji sa sastavom, i pacijent će premazati količinu sastava na površinu mikro-iglica i naneti flaster na telo na propisani način. Flaster može doći sa oznakama na spoljnoj strani kako bi se pomoglo pacijentu ili lekaru da ispravno poravnaju mikroiglice sa ispravnim položajem na prstu ili nožnom prstu koji se tretiraju.

Aerosol

[0096] Sastav pronalaska se takođe može formulisati u formulaciju aerosola. U ovom

2

izrađenom primeru, nanočestice PHMB se formiraju sa kaspofunginom (antifungalni lipopeptid) i suše. Osušene nanočestice se zatim dodaju propelantu. Propelant pruža silu za generisanje aerosolnog oblaka i takođe je medijum u kome se aktivna komponenta nanočestica kaspofungina suspenduje ili rastvara.

[0097] Može se koristiti čitav niz propelanata, ali uopšteno govoreći propelant mora da ima:

• tačku ključanja u opsegu -100 do 30°C

• gustinu od približno 1,2 do 1,5 g cm<-3>(približno leku koji je suspendovan ili rastvoren)

• pritisak pare od 40 do 80 psig

• nema toksičnosti za pacijenta

• nije zapaljiv

• u stanju je da rastvori uobičajene aditive. Aktivni sastojci moraju biti potpuno rastvorljivi ili potpuno nerastvorljivi.

[0098] Propelanti koji se koriste u inhalatorima za astmu biće naročito pogodni, kao što su hidrofluoroalkani (HFA): bilo HFA 134a (1,1,1,2,-tetrafluoroetan) ili HFA 227 (1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropan) ili njihove kombinacije. Dodatno, ili alternativno, mogu se koristiti fosfolipidi koji povećavaju penetraciju i bioraspoloživost.

[0099] Nanočestice će se rekonstituisati kada se doda vlaga, na primer kada se preparat poprska u vlažnu sredinu pluća. Poželjno je da se preparat nalazi u posudi od aluminijumske legure koja je unutrašnje obložena sa fluoropolimerima i zapečaćena sa dozirajućim ventilom tako da se može dozirati izmerena doza. Po potrebi se mogu postaviti i mlaznice za raspršivanje i poklopac za prašinu.

Claims (11)

Patentni zahtevi

1. Sastav za topikalnu primenu za tretman gljivične infekcije noktiju ili kože, koji sadrži polimer i antifungalni agens, gde polimer sadrži linearni i/ili razgranati ili ciklični polimonogvanid/poligvanidin, polibigvanid, i antifungalni agens sadrži Terbinafin, te pri čemu je sastav u obliku nanočestica.

2. Sastav za topikalnu primenu prema zahtevu 1, gde polimer sadrži poliheksametilen bigvanid (PHMB).

3. Sastav za topikalnu primenu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je antifungalni agens prisutan u količini doze unutar sastava, koja je manja od terapeutski efikasne sistemske doze antifungalnog agensa.

4. Sastav za topikalnu primenu u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva, gde sastav dalje sadrži jednu ili više sledećih komponenti: puferi, ekscipijenti, vezivna sredstva, ulja, voda, emulgatori, glicerin, antioksidanti, konzervansi i mirisi, i opciono, dalje sadrži ureu.

5. Sastav za topikalnu primenu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde gljivična infekcija kože obuhvata atletsko stopalo ili dermatofitnu infekciju i/ili infekciju kvascima.

6. Sastav za topikalnu primenu u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva, gde antifungalni agens sadrži jedan ili više dodatnih agenasa izabranih iz sledeće grupe: nistatin, ketokonazol, amfotericin B, itrakonazol ili berberin.

7. Sastav za topikalnu primenu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je sastav u obliku kreme, masti, spreja ili praha.

8. Sastav za topikalnu primenu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde se sastav primenjuje pomoću niza mikro-iglica, koji je opciono ugrađen u adhezivni flaster.

9. Postupak za proizvodnju sastava za topikalnu primenu za tretman gljivične infekcije noktiju ili kože, koji obuhvata mešanje polimera, obuhvata linearni i/ili razgranati ili ciklični polimonogvanid/poligvanidin, polibigvanid i antifungalni agens koji sadrži Terbinafin, pod uslovima koji omogućavaju formiranje nanočestica.

10. Postupak prema patentnom zahtevu 9, gde se postupak koristi za dobijanje sastava prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8.

11. Sastav za topikalnu primenu prema patentnim zahtevima 1 do 8, gde se sastav koristi u kombinaciji sa nizom mikro-iglica, gde je po izboru, niz mikro-iglica ugrađen u adhezivni flaster.