RS59253B1 - Konjugati aktivnog agensa proteina i postupak za njihovo dobijanje - Google Patents

Konjugati aktivnog agensa proteina i postupak za njihovo dobijanje

Info

Publication number
RS59253B1
RS59253B1 RSP20191130A RS59253B1 RS 59253 B1 RS59253 B1 RS 59253B1 RS P20191130 A RSP20191130 A RS P20191130A RS 59253 B1 RS59253 B1 RS 59253B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
active agent
compound
amino acid
protein
Prior art date
Application number
Other languages
English (en)
Inventor
Yongzu Kim
Taekyo Park
Sungho Woo
Hyangsook Lee
Youngun Kim
Jongun Cho
Doohwan Jung
Sunyoung Kim
Hyunjin Kwon
Kyuman Oh
Yunseo Chung
Yun-Hee Park
Original Assignee
Legochem Biosciences Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Legochem Biosciences Inc filed Critical Legochem Biosciences Inc
Publication of RS59253B1 publication Critical patent/RS59253B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6859—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from liver or pancreas cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Opis
STANJE
(a) Oblast tehnike
Pronalazak je definisan patentnim zahtevima i, svaki drugi aspekt ili ostvarenje koje je ovde izneto a ne pripada području patentnih zahteva, služi samo kao informacija. Ovo izlaganje se odnosi na konjugat aktivnog agensa proteina. Protein (npr., oligopeptid, polipeptid, antitelo, ili slično) ima supstratnu specifičnost za željenu ciljnu metu i, aktivni agens (npr., lek, toksin, ligand, detekciona proba, i slično) ima specifičnu funkciju ili aktivnost. Izlaganje se, takođe, odnosi na postupke za pripremu konjugata. Izlaganje se dalje odnosi na postupke primene konjugata za oslobađanje aktivnog agensa u ciljnu ćeliju subjekta, kao i na postupke za lečenje subjekta kome je neophodan aktivan agens (npr., subjekt koji boluje od kancera).
(b) Stanje tehnike
Predloženi su postupci za inhibiciju rasta ćelija kancera ciljanim oslobađanjem antikancerskog sredstva. Na primer, pokazalo se da se ciljanim oslobađanjem antitelo-lek konjugata može ubiti naročita kancerska ćelija. Kako antitelo (ili fragment antitela) specifično vezuje ćeliju kancera, lek se oslobađa u ciljnu kancersku ćeliju. Ciljano oslobađanje leka obezbeđuje da lek deluje na ciljanu ćeliju kancera umesto normalne ćelije domaćina, čime se minimizuju neželjena dejstva koja proizilaze iz oštećenja normalnih ćelija.
Konjugati antitela se mogu upotrebiti za oslobađanje hemijskih i/ili bioloških molekula. Primeri hemijskih i/ili bioloških molekula obuhvataju: lek koji se konvencionalno primenjuje u hemijskom tretmanu, protein bakterijskog toksina (npr., difterijski toksin), protein biljnog toksina (npr., ricin), male molekulske toksine (npr., auristatin, geldanamicin, maitansinoid, kalicheamicin, daunomicin, metotreksat, vindesin i tubulizin), afinitetne ligande, detekcione probe (npr., fluorescentnu probu, radioaktivnu probu) i slične (uključujući njihove kombinacije).
Antitelo-lek konjugati koji su predloženi, do sada se proizvode vezivanjem dela leka za brojne lizinske grupe na antitelu. Alternativno, antitelo-lek konjugati se proizvode redukcijom svih ili dela međulančanih disulfidnih grupa u antitelu ili redukcijom međulančanih disulfidnih grupa i zatim, delimičnom oksidacijom kojom se dobijaju slobodne cisteinske tiol grupe i onda, vezivanjem slobodnih cisteinskih tiol grupa sa delom leka.
Postojeći proizvodni postupci, međutim, ispoljavaju brojne probleme. Na primer, ukupan proizvodni proces je komplikovan zato što postojeći proizvodni postupci za antitelo-lek konjugate nisu jednoobrazni (homogeni). Kada se antitelo-lek konjugati proizvode vezivanjem dela leka sa lizinskim grupama, dobijaju se brojne vrste i oblici antitelo-lek konjugata zahvaljujući prisustvu brojnih lizinskih grupa u antitelu (npr., 100 lizinskih grupa po antitelu). Slično, kada se antitelo-lek konjugati proizvode vezivanjem tiol grupa sa delom leka, dobija se smeša dijastereomera kao posledica vezivanja tiol grupa i maleimid grupa. Na primer, ukoliko se n leka konjuguje, dobija se smeša od 2n stereoizomera. Tako, kada je distribucioni broj leka 0-8
(npr., kada se redukuju međulančane disulfidne grupe), dobija se smeša od stereoizomera.
Pored toga, kada se i leka konjuguje sa q položaja, dobija se smeša od različitih jedinjenja.
Sem toga, kada se proizvode konjugati antitelo-lek vezivanjem lizinskih grupa sa delom leka, može se izgubiti električno naelektrisanje lizinskih grupa, na koji način antitelo gubi svoju jedinstvenu antigenu specifičnost. Slično, tercijerna ili kvaternerna struktura antitela možda neće biti održana kada se proizvode konjugati antitelo-lek redukcijom disulfidnih grupa, čime će doći do inaktivacije antitela ili će ono postati nespecifično antitelo. Kada se proizvode konjugati antitelo-lek primenom tiol-maleimid vezivanja, lek može da se otcepi (nespecifično) iz konjugata preko, npr., reverzne reakcije.
Da bi se prevazišli problemi, koji su povezani sa proizvodnim postupcima prethodne tehnike, predložen je alternativni postupak u kom se aminokiselinske grupe na posebnim položajima u antitelu zamenjuju sa cisteinskim grupama. Iako ovaj postupak ispoljava bolje rezultate od proizvodnih postupaka prethodne tehnike u pogledu toksičnosti, aktivnosti i bezbednosti, ovaj postupak i dalje uključuje tiol-maleimid vezivanje i, na taj način pokazuje nedostatak diajstereomera i probleme nestabilnosti povezane sa tiol-maleimid vezivanjem. Predložen je drugi alternativni postupak, u kom su selenocisteinske grupe vezane za karboksi terminale antitela.
Osim primene cisteinskih supstitucija u kontroli položaja konjugacije, Ambrx Technology (http://www.ambrx.com) se usmerila na inkorporaciju ne-prirodnih amino kiselina u antitelo kako bi se obezbedile funkcionalne grupe, koje se mogu koristiti u linker hemiji. Sistemi ekspresije Ambrx sadrže tRNA sintetaze, koje vrše aminoacilaciju originalne tRNA sa neprirodnom amino kiselinom, na koji način insertuju ne-prirodnu amino kiselinu kad god se naiđe na zaustavljanje na smoli.
Redwood Bioscience’s (http://www.redwoodbioscience.com) technology koristi genetski kodirane tagove i cilj je da se iskoriste specifične sekvence, koje postranslaciono enzimi prepoznaju i modifikuju, tj., formil glicin-generišući enzim, da bi se proizveo takozvani aldehidni hemijski nastavak. Inkorporisanje CxPxR sekvence na specifičnim položajima u antitelu obezbeđuje mogućnosti za proizvodnju reaktivnog aldehida podložne konjugaciji sa lekom.
Međutim, sa aspekta prethodno pominjanih problema u tehnici, koji se tiču proizvodnje antitelo-lek konjugata, veoma su poželjni novi konjugati antitelo-lek i novi postupci za proizvodnju konjugata antitelo-lek.
Prethodna informacija, izložena u ovom delu Stanja tehnike, služi za bolje razumevanje osnove pronalaska i, zbog toga, može sadržavati informaciju koja nije sadržaj prethodne tehnike, koja je već poznata stručnom licu u ovoj oblasti.
SUŠTINA PRONALASKA
Pronalazak je definisan patentnim zahtevima i, svaki drugi aspekt ili ostvarenje koje je ovde izneto a ne pripada području patentnih zahteva, služi samo kao informacija. Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi na konjugat antitela i aktivnog agensa, pri čemu antitelo poseduje aminokiselinski motiv kog može prepoznati izoprenoid transferaza, a gde je aktivan agens kovalentno povezan sa antitelom na aminokiselinskom motivu, pri čemu aminokiselinski motiv je CAAX, XXCC, XCXC, ili CXX, gde C predstavlja cistein, A predstavlja alifatičnu amino kiselinu i, X predstavlja amino kiselinu koja determiniše supstratnu specifičnost izoprenoid transferaze; i, pri čemu je aminokiselinski motiv kovalentno povezan sa aktivnim agensom preko najmanje jednog linkera, a gde je najmanje jedan linker izoprenil derivat kog može prepoznati izoprenoid transferaza, pri čemu je linker predstavljen formulom (I):
u kojoj,
P1i Y su, nezavisno, grupa koja sadrži prvu funkcionalnu grupu (FG1), FG1 je odabrana iz grupe, koju čine: acetilen, azid, aldehid, hidroksilamin, hidrazin, keton, nitrobenzofurazan (NBD), danzil, fluorescein, biotin i rodamin,
L1je (CH2)rXq(CH2)p,
X je kiseonik, sumpor, -NR1-, -C(O)NR1-, -NR1C(O)-, -NR1SO2-, -SO2NR1-, - (CH=CH)-, ili acetilen,
R1je vodonik, C1-6alkil, C1-6alkilaril, ili C1-6alkilheteroaril,
r i p su, nezavisno, ceo broj od 0 do 6,
q je ceo broj od 0 do 1 i
n je ceo broj od 1 do 4.
gde je aktivan agens vezan za grupu koja sadrži drugu funkcionalnu grupu (FG2) koja može reagovati sa FG1, pri čemu je FG2 odabrana iz grupe, koju čine: acetilen, hidroksilamin, azid, aldehid, hidrazin, keton i
gde je aktivan agens vezan za grupu koja sadrži FG2 preko -(CH2)rXq(CH2)p- ili -[ZCH2CH2O(CH2CH2O)wCH2CH2Z]-, u kojima
X je kisonik, sumpor, -NR1-, -C(O)NR1-, -NR1C(O)-, -NR1SO2-, ili -SO2NR1-,
Z je kisonik, sumpor ili NR1,
R1je vodonik, C1-6alkil, C1-6alkilaril, ili C1-6alkilheteroaril,
r i p su, nezavisno, ceo broj od 0 do 6,
q je ceo broj od 0 do 1 i
w je ceo broj od 0 do 6,
pri čemu su -(CH2)rXq(CH2)p- ili -[ZCH2CH2O(CH2CH2O)wCH2CH2Z]- vezani za (i) peptid(e) kog(je) može otcepiti katepsin B ili za (ii) glukuronid kog može otcepiti βglukuronidaza,
pri čemu je peptid koji može biti otcepljen katepsinom B
i
glukuronid koji može biti otcepljen β-glukuronidazom je
i gde je antitelo monoklonsko antitelo, fragment antitela za ciljano vezivanje, jednolančani Fv (scFv) mutant, multispecifično antitelo, bispecifično antitelo generisano od najmanje dva intaktna antitela, himerno antitelo, humanizovano antitelo, ili humano antitelo, ili fuzioni protein koji sadrži fragment antitela za ciljano vezivanje. Ovaj pronalazak se, isto tako, odnosi na postupak za proizvodnju konjugata antitela i aktivnog agensa pronalaska, postupak obuhvata: (a) ekspresiju antitela vezanog za aminokiselinski motiv kog prepoznaje izoprenoid transferaza; (b) enzimsku reakciju, primenom izoprenoid transferaze, eksprimirano antitelo sa najmanje jednim izosupstratom koji ima prvu funkcionalnu grupu (FG1), na koji način se proizvodi funkcionalizovano antitelo; (c) vezivanje druge funkcionalne grupe (FG2) za aktivan agens, kako se proizvodi funkcionalizovani aktivan agens; i (d) reakciju funkcionalizovanog antitela sa funkcionalizovanim aktivnim agensom, na koji način se proizvodi konjugat antitela sa aktivnim agensom, ili (a) ekspresiju antitela vezanog za aminokiselinski motiv kog prepoznaje izoprenoid transferaza; (b) vezivanje izosupstrata izoprenoid transferaze za aktivan agens; i (c) enzimsku reakciju, primenom izoprenoid transferaze, eksprimirano antitelo sa aktivnim agensom vezanim za izosupstrat. Dalje, ovaj pronalazak se odnosi na kompoziciju koja sadrži farmaceutski prihvatljiv ekscipijens i konjugat antitela sa aktivnim agensom iz ovog pronalaska.
Kako je dalje, u nastavku ovde opisano, generalno su ovde opisani, isto tako, konjugati protein-aktivnog agensa i postupci za proizvodnju konjugata aktivnog agensa proteina. Takođe, ovde su opisani i postupci za oslobađanje konjugata protein-aktivnog agensa u ciljnu ćeliju subjekta, kao i postupci za lečenje subjekta kome je aktivan agens neophodan. Ovde opisani konjugati protein-aktivnog agensa mogu da se homogeno proizvedu i imaju prednost u primeni za targetirano lečenje bolesti.
U aspektu, ovde su opisani konjugati protein-aktivnog agensa. Protein može imati aminokiselinski motiv kog može prepoznati izoprenoid transferaza. Aktivan agens može biti kovalentno vezan za protein na aminokiselinskom motivu.
Protein može posedovati deleciju u karboksi terminusu proteina. Modifikacija može biti vezana za aminokiselinski motiv.
Protein može posedovati adiciju oligopeptida ili polipeptida u karboksi terminusu proteina. U srodnim aspektima, modifikacija može biti vezana za aminokiselinski motiv.
Protein može posedovati deleciju u karboksi terminusu proteina i adiciju oligopeptida ili polipeptida u karboksi terminusu proteina. U srodnim aspektima, modifikacija može biti vezana za aminokiselinski motiv.
Protein može biti antitelo ili fragment antigenog polipeptida. Isto tako, protein može biti monoklonsko antitelo. Najmanje jedan od lakih lanaca i/ili najmanje jedan od teških lanaca monoklonskog antitela mogu imati aminokiselinski region koji sadrži aminokiselinski motiv.
U svakom od prethodnih aspekata, izoprenoid transferaza je FTaza ili GGTaza.
U svakom od prethodnih aspekata, aktivan agens je lek, toksin, afinitetni ligand, detekciona proba, ili kombinacija ovih.
U svakom od prethodnih aspekata, aminokiselinski motiv je CAAX, XXCC, XCXC, ili CXX, pri čemu C predstavlja cistein, A predstavlja alifatičnu amino kiselinu i X predstavlja amino kiselinu koja određuje supstratnu specifičnost izoprenoid transferaze.
U svakom od prethodnih aspekata, aminokiselinski motiv je kovalentno povezan sa aktivnim agensom preko najmanje jednog linkera. Linker može biti izoprenilni derivat, koji može biti prepoznat izoprenoid transferazom.
Linker može biti predstavljen sledećom formulom (I):
u kojoj,
P1i Y su, nezavisno, grupa koja sadrži prvu funkcionalnu grupu (FG1), FG1 je odabrana iz grupe, koju čine: acetilen, azid, aldehid, hidroksilamin, hidrazin, keton, nitrobenzofurazan (NBD), danzil, fluorescein, biotin i rodamin,
L1je (CH2)rXq(CH2)p,
X je kiseonik, sumpor, -NR1-, -C(O)NR1-, -NR1C(O)-, -NR1SO2-, -SO2NR1-, - (CH=CH)-, ili acetilen,
R1je vodonik, C1-6alkil, C1-6alkilaril, ili C1-6alkilheteroaril,
r i p su, nezavisno, ceo broj od 0 do 6,
q je ceo broj od 0 do 1 i
n je ceo broj od 0 do 4.
Aktivan agens može biti vezan za grupu koja sadrži drugu funkcionalnu grupu (FG2) koja može reagovati sa FG1. FG2 može biti acetilen, hidroksilamin, azid, aldehid, hidrazin, keton, ili amin. Dalje, aktivan agens može biti vezan za grupu koja sadrži FG2 preko -(CH2)rXq(CH2)p- ili -[ZCH2CH2O(CH2CH2O)wCH2CH2Z]-,
u kojima
X je kisonik, sumpor, -NR1-, -C(O)NR1-, -NR1C(O)-, -NR1SO2-, ili -SO2NR1-,
Z je kisonik, sumpor ili NR1,
R1je vodonik, C1-6alkil, C1-6alkilaril, ili C1-6alkilheteroaril,
r i p su, nezavisno, ceo broj od 0 do 6,
q je ceo broj od 0 do 1 i
m je ceo broj od 0 do 6.
I dalje, -(CH2)rXq(CH2)p- ili -[ZCH2CH2O(CH2CH2O)wCH2CH2Z]- mogu biti vezani za (i) peptid(e) kog(je) može otcepiti katepsin B ili za (ii) glukuronid kog može otcepiti βglukuronidaza.
Peptid, kog može otcepiti katepsin B, može biti
Glukuronid, kog može otcepiti β-glukuronidaza, može biti
Takođe, ovde su opisani postupci za proizvodnju bilo kog konjugata protein-aktivnog agensa, koji je ovde opisan. Postupci mogu obuhvatiti ekspresiju proteina koji ima aminokiselinski motiv, kog izoprenoid transferaza može prepoznati. Postupci mogu obuhvatiti enzimsku reakciju sa izoprenoid transferazom, ekspresovanog proteina i najmanje jednog izosupstrata, koji ima prvu funkcionalnu grupu (FG1), na koji način se proizvodi funkcionalizovani protein. Postupci mogu obuhvatiti povezivanje druge funkcionalne grupe (FG2) sa aktivnim agensom, na koji način se proizvodi funkcionalizovani aktivni agens. Postupci mogu obuhvatiti reakciju funkcionalizovanog proteina sa funkcionalizovanim aktivnim agensom, na koji način se proizvodi konjugat protein-aktivnog agensa.
Aminokiselinski motiv može da se nalazi na karboksi terminusu proteina. Aminokiselinski motiv može biti CAAX, XXCC, XCXC, ili CXX, pri čemu C predstavlja cistein, A predstavlja alifatičnu aminokiselinu i, X predstavlja aminokiselinu koja određuje supstratnu specifičnost izoprenoid transferaze.
Aminokiselinski motiv može biti CAAX, pri čemu postupak može dalje obuhvatiti uklanjanje AAX iz aminokiselinskog motiva posle koraka (b).
FG2 može biti povezana sa aktivnim agensom pomoću najmanje jednog linkera. Reakcija između funkcionalizovanog proteina i funkcionalizovanog aktivnog agensa može biti reakcija klik hemije ili formiranje hidrazona i/ili oksima. FG1 može biti azidna grupa i FG2 može biti acetilenska grupa. FG1 može biti acetilenska grupa i FG2 može biti azidna grupa. FG1 može biti aldehidna ili ketonska grupa i FG2 može biti hidrazin ili hidroksilamin. FG1 je hidrazin ili hidroksilamin i FG2 može biti aldehid ili keton.
Ovde su, isto tako, opisani postupci za proizvodnju ma kog od konjugata proteinaktivnog agensa, koji su ovde opisani i, postupci obuhvataju ekspresiju proteina koji ima aminokiselinski motiv kog može prepoznati izoprenoid transferaza. Postupci mogu obuhvatiti vezivanje izosupstrata izoprenoid transferaze za aktivan agens. Postupci mogu obuhvatiti enzimsku reakciju sa izoprenoid transferazom, ekspresovanog proteina i aktivnog agensa vezanog za izosupstrat.
Aminokiselinski motiv može da se nalazi na karboksi terminusu proteina. Aminokiselinski motiv može biti CAAX, XXCC, XCXC, ili CXX, pri čemu C predstavlja cistein, A predstavlja alifatičnu aminokiselinu i, X predstavlja aminokiselinu koja određuje supstratnu specifičnost izoprenoid transferaze.
Izosupstrat može biti povezan sa aktivnim agensom pomoću najmanje jednog linkera.
Ovde su, isto tako, opisane kompozicije koje sadrže bilo koji od konjugata proteinaktivnog agensa, koji su ovde opisani. Kompozicije mogu biti homogene smeše konjugata protein-aktivnog agensa. Protein može biti antitelo ili fragment antigenog polipeptida.
Ovde su, isto tako, opisani postupci kojima se oslobađa aktivan agens u ciljnu ćeliju u subjektu. Postupci mogu uključiti primenjivanje najmanje jednog konjugata protein-aktivnog agensa ili ovde opisanih kompozicija. Ciljna ćelija može biti kancerska ćelija.
Ovde su, isto tako, opisani postupci za lečenje subjekta kome je to neophodno (tj., kome je neophodan aktivan agens). Postupci mogu obuhvatiti primenjivanje najmanje jednog od konjugata protein-aktivnog agensa ili ovde opisanih kompozicija. Subjekt može imati kancer. Subjekt može imati infekciju patogenim agensom. Patogeni agens može biti virus, bakterija, gljivice, ili parazit.
U gore-opisanim konjugatima protein-aktivnog agensa, kompozicijama i postupcima, aktivan agens može biti imunomodulatorno jedinjenje, anti-kancersko sredstvo, antivirusno sredstvo, antibakterijsko sredstvo, anti-gljivično sredstvo ili sredstvo protiv parazita.
KRATAK OPIS SLIKA
SLIKA 1 prikazuje aminokiselinsku sekvencu modifikovanog herceptinskog antitela (Herceptin-HC-GCVIM), proizvedenog insertovanjem GCVIM u C-terminus teškog lanca herceptina.
SLIKA 2 prikazuje aminokiselinsku sekvencu modifikovanog herceptinskog antitela (Herceptin-LC-GCVIM), proizvedenog insertovanjem GCVIM u C-terminus lakog lanca herceptina.
SLIKA 3 prikazuje aminokiselinsku sekvencu modifikovanog herceptinskog antitela (Herceptin-HC-G5CVIM), proizvedenog insertovanjem G5CVIM u C-terminus teškog lanca herceptina.
SLIKA 4 prikazuje aminokiselinsku sekvencu modifikovanog herceptinskog antitela (Herceptin-LC-G5CVIM), proizvedenog insertovanjem G5CVIM u C-terminus lakog lanca herceptina.
SLIKA 5 prikazuje aminokiselinsku sekvencu modifikovanog herceptinskog antitela (Herceptin-HC-G7CVIM), proizvedenog insertovanjem G7CVIM u C-terminus teškog lanca herceptina.
SLIKA 6 prikazuje aminokiselinsku sekvencu modifikovanog herceptinskog antitela (Herceptin-LC-G7CVIM), proizvedenog insertovanjem G7CVIM u C-terminus lakog lanca herceptina.
SLIKA 7 prikazuje aminokiselinsku sekvencu modifikovanog herceptinskog antitela (Herceptin-HC-G10CVIM), proizvedenog insertovanjem G10CVIM u C-terminus teškog lanca herceptina.
SLIKA 8 prikazuje aminokiselinsku sekvencu modifikovanog herceptinskog antitela (Herceptin-LC-G10CVIM), proizvedenog insertovanjem G10CVIM u C-terminus lakog lanca herceptina.
SLIKA 9 prikazuje aminokiselinsku sekvencu modifikovanog herceptinskog antitela (Herceptin-HC-G10CVLL), proizvedenog insertovanjem G10CVLL u C-terminus teškog lanca herceptina.
SLIKA 10 prikazuje aminokiselinsku sekvencu modifikovanog herceptinskog antitela (Herceptin-LC-G10CVLL), proizvedenog insertovanjem G10CVLL u C-terminus lakog lanca herceptina.
SLIKA 11 prikazuje SDS-PAGE gel analizu modifikovanog anti cMET antitela (anti cMET-HC-G7CVIM), proizvedenog insertovanjem G7CVIM u C-terminus teškog lanca anti cMET antitela, modifikovanog anti cMET antitela (anti cMET-LC-G7CVIM), proizvedenog insertovanjem G7CVIM u C-terminus lakog lanca anti cMET antitela, modifikovanog anti cMET antitela (anti cMET-HC-G10CVIM), proizvedenog insertovanjem G10CVIM u C-terminus teškog lanca anti cMET antitela, i modifikovanog anti cMET antitela (anti cMET-LC-G10CVIM), proizvedenog insertovanjem G10CVIM u C-terminus lakog lanca anti cMET antitela.
SLIKA 12 prikazuje SDS-PAGE gel analizu prenilacije Herceptin-HC-GnCVIM primenom FTaze i NBD-GPP.
SLIKA 13 prikazuje SDS-PAGE gel analizu prenilacije Herceptin-LC-GnCVIM primenom FTaze i NBD-GPP.
SLIKA 14 prikazuje SDS-PAGE gel analizu prenilacije cMET-HC-GnCVIM primenom FTaze i NBD-GPP.
SLIKA 15 prikazuje SDS-PAGE gel analizu prenilacije cMET-LC-GnCVIM primenom FTaze i NBD-GPP.
SLIKA 16 prikazuje SDS-PAGE gel analizu prenilacije Herceptin-HC-G10CVLL i Herceptin-LC-G10CVLL primenom FTaze/NBD-GPP ili GGTaze I/NBD-FPP.
SLIKA 17 prikazuje rezultate LC/MS analize prenilovanog Herceptin-LC-G7CVIM.
SLIKA 18 prikazuje rezultate LC/MS analize prenilovanog Herceptin-LC-G10CVIM.
SLIKA 19 prikazuje rezultate LC/MS i dekonvolucije masene spektralne analize LCB14-0104 (Herceptin-LCG7CVIM-NC-MMAF-Ome).
SLIKA 20 prikazuje HIC-HPLC hromatograme Herceptin-LC-G7CVIM, prenilovanog Herceptin-LC-G7CVIM i LCB 14-0101 (Herceptin-LC-G7CVIM-BG-MMAF).
SLIKA 21 prikazuje rezultate anti-proliferacionog testa za LCB14-0101 (Herceptin-LC-G7CVIM-BG-MMAF) na ćelijskim linijama kancera dojke MCF-7, MDA-MB-468 i SK-BR-3.
SLIKA 22 prikazuje rezultate anti-proliferacionog testa za LCB 14-0102 (Herceptin-LC-G7CVIM-VC-MMAF-OMe) na ćelijskim linijama kancera dojke MCF-7 i SK-BR-3.
SLIKA 23 prikazuje rezultate anti-proliferacionog testa za LCB14-0103 (Herceptin-LC-G7CVIM-BG-MMAE) na ćelijskim linijama kancera dojke MCF-7 i SK-BR-3.
SLIKA 24 prikazuje proces posttranslacione modifikacije proteina (C-terminal CVIM).
SLIKA 25 prikazuje mehanizam oslobađanja aktivnih lekova (osim ne-otcepljivog linkera).
SLIKA 26 prikazuje hemijske strukture antitelo-lek konjugata LCB 14-0101, LCB14-0102, LCB14-0103 i LCB14-0104.
SLIKA 27 je šematski dijagram koji pokazuje proces za proizvodnju kojugata proteinaktivnog agensa, korišćenjem izoprenoid transferaze i njenog izosupstrata u kome je cistein CAAX motiva alkilovan.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
Definicije
Pod "agensom" ili "aktivnim agensom" se podrazumeva svako hemijsko jedinjenje malog molekula, antitelo, molekul nukleinske kiseline, ili polipeptid, ili njegovi fragmenti. Primeri obuhvataju, ali nisu ovima ograničeni, lek, toksin, afinitetni ligand, detekcionu probu, ili njihovu kombinaciju.
Pod "analogom" se podrazumeva molekul koji nije identičan, ali poseduje analogne funkcionalne ili strukturne karakteristike. Na primer, polipeptidni analog zadržava biološku aktivnost odgovarajućeg polipeptida koji se javlja u prirodi, uz izvesne biohemijske modifikacije koje uvećavaju funkciju analoga u odnosu na polipeptid koji se javlja u prirodi. Ove biohemijske modifikacije mogu povećati rezistenciju analoga na proteazu, permeabilnost kroz membranu, ili polu-život, ali bez izmene, na primer, vezivanja liganda. Analog može uključiti ne-prirodnu amino kiselinu.
"Dolazi u kontakt sa ćelijom" ovde znači obezbeđivanje agensa ćeliji npr., ćelija koja će se tretirati u kulturi, ex vivo, ili u životinji, tako da agens može međusobno reagovati sa ćelijom (npr., ćelijom koju treba lečiti), potencijalno može biti preuzet u ćeliju i, imati efekat na ćeliju. Agens (npr., adjuvans) može biti oslobođen direktno u ćeliju (npr., dodavanjem agensa medijumu kulture ili injekciono u ćeliju ili tkivo od interesa), ili oslobađanjem u organizmu površinskim ili parenteralnim putem primene za oslobađanje u ćeliju vaskularnim, limfnim, ili drugim putem. Stručno lice u ovoj oblasti će lako shvatiti da primenjivanje konjugata proteinaktivnog agensa, koji je ovde opisan, subjektu, obuhvata dovođenje u kontakt protein-aktivni agens konjugata sa ćelijom subjekta.
Kao "bolest" podrazumeva se svako stanje ili poremećaj koji oštećuje ili ometa normalnu funkciju ćelije, tkiva ili organa.
Izraz "efektivna količina," "terapeutski delotvorna količina," "efektivna doza," ili "terapeutski delotvorna doza" odnosi se na količinu agensa koji je potreban za postizanje nameravanog, terapeutskog, ili preventivnog rezultata. Na primer, farmakološki efektivna količina dovodi do sprečavanja ili odlaganja otpočinjanja bolesti, bilo kod pojedinca, bilo u učestalosti bolesti u populaciji.Može biti neophodno više od jedne doze da bi se obezbedila efektivna doza. Razume se da efektivna doza u jednoj populaciji može ili ne mora biti dovoljna za sve populacije. Tako, u vezi sa primenjivanjem agensa ili imunogene kompozicije, agens ili imunogena kompozicija je "efektivna protiv" bolesti ili stanja kada primenjivanje na klinički odgovarajuć način dovodi do korisnih efekata kod najmanje statistički značajne frakcije subjekata, kao što je sprečavanje početka bolesti, poboljšanje simptoma, lečenje, smanjenje znakova ili simptoma bolesti, produžavanje preživljavanja, poboljšanje kvaliteta života, ili drugih efekata koje medicinski doktori, upoznati sa lečenjem naročite vrste bolesti ili stanja, uopšteno prepoznaju kao pozitivne.
Pod "uvećanje" se podrazumeva pozitivna promena od najmanje 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, ili ma koji broj između ovih.
Pod "fragmentom" se misli na deo polipeptida ili molekula nukleinske kiseline. Ovaj deo obuhvata, poželjno, najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ili 90% ukupne dužine referentnog molekula nukleinske kiseline ili polipeptida. Fragment može biti izgrađen od 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, or 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, ili 1000 nukleotida ili amino kiselina.
"Dobijanje" se ovde shvata kao proizvodnju, kupovinu, sintezu, izolovanje, prečišćavanje, ili dolazak u posed na bilo koji drugi način.
Izraz "farmaceutski prihvatljiv nosač, podloga, ili diluent" se prepoznaje u struci i uključuje farmaceutski prihvatljiv materijal, kompoziciju ili vehikulum, koji su pogodni za administraciju jedinjenja, kako su ovde opisana, sisarima. Kako je ovde korišćen, izraz "farmaceutski prihvatljiv" znači odobren od Federalnih ili Vladinih državnih regulatornih agencija ili naveden u: U.S. Pharmacopia, European Pharmacopia ili drugim opšte prepoznatljivim farmakopejama za primenu kod sisara, npr., ljudi.
Pod "smanjivanje" se podrazumeva negativna promena od najmanje 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, ili ma koji broj između ovih.
Pod "referentan" se podrazumeva standardno ili kontrolno stanje.
"Uzorak", kako je ovde korišćen, odnosi se na biološki materijal koji je izolovan iz svog okruženja (npr., krv ili tkivo životinje, ćelije, ili kondicionirani medijum od kulture tkiva). Za uzorak se može predpostaviti da sadrži, ili se zna da sadrži analit, kao što je protein od interesa (npr., antitelo, citokin, i slično). Uzorak, isto tako, može biti delimično prečišćena frakcija tkiva ili telesne tečnosti. Referentan uzorak može biti "normalan" uzorak, od donora koji ne boluje od bolesti ili stanja, ili iz normalnog tkiva subjekta koji jeste bolestan, ili od nelečenog subjekta (npr., subjekt koji nije primao vakcinu). Referentan uzorak, isto tako, može biti uzet u "nultoj vremenskoj tački" pre dovođenja u kontakt ćelije ili subjekta sa agensom ili pre terapeutske intervencije koja se testira.
Pod "specifičnim vezivanjem" se podrazumeva prepoznavanje i vezivanje za ciljnu metu (npr., polipeptid, ćeliju i slično), međutim ono suštinski ne prepoznaje niti vezuje druge molekule u uzorku, na primer, biološkom uzorku.
"Subjekt", kako je ovde korišćen, odnosi se na živi organizam. Živi organizam može biti životinja. Subjekt može biti sisar. Subjekt može biti domaća životinja sisar ili primat, uključiv ne-humane primate. Primeri subjekta obuhvataju, ali nisu ovima ograničeni, ljude, majmune, pse, mačke, miševe, pacove, krave, konje, svinje, koze, ovce i ptice. Subjekt, isto tako, može da se odnosi na pacijenta.
Subjekt "koji boluje od ili suspektan da boluje od" specifične bolesti, stanja, ili sindroma, ima dovoljan broj faktora rizika ili ispoljava dovoljan broj ili kombinaciju znakova ili simptoma bolesti, stanja, ili sindroma, tako da će kompetentan pojedinac dijagnostikovati ili posumnjati da je subjekt bolestan od bolesti, stanja, ili sindroma. Postupci kojima se identifikuju subjekti koji boluju od ili su suspektni da su pogođeni sa bolešću ili stanjem, određeni su sposobnostima stručnog lica. Subjekti koji boluju od i, koji su suspektni da boluju od, specifične bolesti, stanja, ili sindroma, nužno nisu dve različite grupe. Stručno lice će takođe brzo shvatiti da subjekt kome je neophodan aktivan agens može, isto tako, biti subjekt koji boluje od ili subjekt za koga se sumnja da boluje od specifične bolesti, stanja, ili sindroma.
Kako su ovde korišćeni, izrazi "lečiti," "lečenje," "tretman," kao i slično, odnose se na smanjivanje ili poboljšavanje poremećaja i/ili simptoma koji su sa njima povezani (npr., kancer ili simptomi povezani sa kancerom). Shvata se da nije strogo da se lečenjem poremećaja ili stanja poremećaj, stanje ili simptomi koji su sa njim povezani u potpunosti eliminišu, iako nije isključeno.
Opsezi, koji se ovde navode, treba shvatiti kao skraćenicu za sve vrednosti unutar opsega. Na primer, opseg od 1 do 50 podrazumeva se da uključuje svaki broj, kombinaciju brojeva, ili pod-opseg iz grupe koju čine: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ili 50.
Ukoliko nije posebno navedeno ili očigledno iz konteksta, kako je ovde korišćen, izraz "otprilike" podrazumeva obuhvatanje opsega normalne tolerancije u struci, na primer, unutar 2 standardne devijacije srednje vrednosti. Otprilike (oko) se može tumačiti kao sadržaj bez 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, ili 0.01% od navedene vrednosti.
1. Postupci za dobijanje konjugata aktivnog agensa proteina
U nastavku su prikazani primeri postupaka, koji su dati kao ilustracija, a nemaju karakter ograničavanja ovog pronalaska.
Primer postupka 1
Postupak za proizvodnju konjugata protein-aktivnog agensa, kako je ovde opisan, obuhvata: (a) ekspresiju proteina koji ima aminokiselinski motiv kog može prepoznati izoprenoid transferaza; (b) enzimsku reakciju, primenom izoprenoid transferaze, ekspresovani protein i najmanje jedan izosupstrat koji ima prvu funkcionalnu grupu (FG1), na koji način se proizvodi funkcionalizovani protein; (c) povezivanje druge funkcionalne grupe (FG2) sa aktivnim agensom, na koji način se proizvodi funkcionalizovani aktivni agens; i (d) reakciju funkcionalizovanog proteina sa funkcionalizovanim aktivnim agensom, na koji način se proizvodi konjugat protein-aktivnog agensa.
Izraz "protein", koji je ovde korišćen, podrazumeva dve ili više nezavisno odabrane prirodne ili ne-prirodne amino kiseline, spojene kovalentnom vezom (npr., peptidna veza). Peptid može imati 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ili više prirodnih ili ne-prirodnih amino kiselina, spojenih peptidnim vezama. Polipeptidi, kako su ovde opisani, obuhvataju proteine u punoj dužini (npr., potpuno izvedene proteine), kao i kraće aminokiselinske sekvence (npr., fragmente proteina koji se prirodno javljaju ili sintetski polipeptidni fragmenti).
Protein podrazumeva oligopeptid ili polipeptid, koji sadrži najmanje jedan C-terminus i najmanje jedan N-terminus. Izrazom se ovde obuhvata intaktni oligopeptid ili polipeptid, njihov modifikovani oblik, njihov fragment i njihovi analozi. Na primer, izraz može da se odnosi na oligopeptid ili polipeptid, ili na oligopeptid ili polipeptid, koji su modifikovani dodavanjem aminokiselinske sekvence koja može prepoznati izoprenoid transferazu. Izraz "fragment", koji je ovde korišćen, odnosi se na deo aminokiselinske sekvence koja čini oligopeptid ili polipeptid. Izrazom se ovde obuhvata deo aminokiselinske sekvence koja ima specifičnost za supstrat oligopeptida ili polipeptida. Izraz "analog" se odnosi na oligopeptid ili polipeptid, koji imaju identitet sekvence od najmanje 70% ili 75%, najmanje 80% ili 85%, najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ili 95%, ili najmanje 96, 97%, 98%, ili 99% sa referentnim oligopeptidom ili polipeptidom.
Izraz "protein", koji je ovde korišćen, isto tako obuhvata antitelo fragment antigenog polipeptida, ili njegov analog ili derivat. Izraz "antitelo" označava imunoglobulinski molekul koji prepoznaje i specifično se vezuje za ciljnu metu, kao što bi bio protein, polipeptid, peptid, ugljeni hidrat, polinukleotid, lipid, ili kombinacije prethodno iznetog, preko najmanje jednog položaja koji prepoznaje antigen, unutar varijabilnog regiona molekula imunoglobulina. Kako je ovde korišćen, izraz "antitelo" obuhvata intaktna poliklonska antitela, intaktna monoklonska antitela, fragmente antitela (kao što su Fab, Fab’, F(ab’)2, Fd i Fv fragmenti), jednolančane Fv (scFv) mutante, multispecifična antitela, kao što su bispecifična antitela generisana iz najmanje dva intaktna antitela, himerna antitela, humanizovana antitela, humana antitela, fuzione proteine koji sadrže deo koji determiniše antigen u antitelu, kao i svaki drugi modifikovani molekul imunoglobulina koji sadrži položaj prepoznavanja antigena sve dotle dok antitela ispoljavaju željenu biološku aktivnost. Atitelo može biti iz bilo koje od pet glavnik klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, ili njihovih podklasa (izotipovi) (npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2), na osnovu identiteta njihovih konstantnih domena teškog lanca označenih kao alfa, delta, epsilon, gama, odnosno mu. Različite klase imunoglobulina imaju različite i dobro poznate strukture subjedinica i trodimenzionalne konfiguracije.
Izraz "fragment antitela" se odnosi na deo intaktnog antitela i, odnosi se navarijabilne regione koji su antigeno determinišući u intaktnom antitelu. Primeri fragmenata antitela obuhvataju, ali nisu ovima ograničeni Fab, Fab’, F(ab’)2, Fd i Fv fragmente, ravnolančana antitela, jednolančana antitela i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela.
"Monoklonsko antitelo" se odnosi na populaciju homogenog antitela, koja je uključena u visoko specifično prepoznavanje i vezivanje jedne antigene determinante, ili epitopa. Ovo je suprotno poliklonskim antitelima, koji obično obuhvataju različita antitela usmerena protiv različitih antigenih determinanti. Izraz "monoklonsko antitelo" obuhvata oba, intaktno i monoklonsko antitelo u punoj dužini, kao i fragmente antitela (kao što su Fab, Fab’, F(ab’)2, Fd, Fv), jednolančane (scFv) mutante, fuzione proteine koji sadrže deo antitela, kao i svaki drugi modifikovani imunoglobulinski molekul, koji sadrži položaj prepoznavanja antigena. Sem toga, "monoklonsko antitelo" se odnosi na takva antitela, napravljena ma kojim od brojnih načina, uključujući, ali bez ograničavanja na ove načine, hibridome, selekciju faga, rekombinantnu ekspresiju, kao i transgene životinje.
Izraz "humanizovano antitelo" se odnosi na forme ne-humanog (npr., mišijih) antitela koja su specifični imunoglobulinski lanci, himerni imunoglobulini, ili njihovi fragmenti koji sadrže minimalne ne-humane (npr., mišije) sekvence. Obično, humanizovana antitela su humani imunoglobulini u kojima su ostaci iz regiona koji određuje komplementarnost (CDR) zamenjeni ostacima iz CDR ne-humanih vrsta (npr., miš, pacov, zec, hamster) koji imaju željenu specifičnost, afinitet i moć (Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536). U nekim slučajevima, ostaci Fv okvirnog regiona (FR) humanog imunoglobulina su zamenjeni sa odgovarajućim ostacima u antitelu iz ne-humanih vrsta, koji imaju željenu specifičnost, afinitet i moć. Humanizovano antitelo može dalje biti modifikovano supstitucijom još ostataka, bilo u Fv okvirnom regionu i/ili u okviru ne-humanih ostataka, a da bi se preradila i optimizovala specifičnost, afinitet i/ili moć antitela. Generalno, humanizovano antitelo će suštinski sadržavati sve od najmanje jednog, a obično dva ili tri, varijabilna domena koja sadrže sve ili suštinski sve CDR regione, koji odgovaraju ne-humanom imunoglobulinu, dok su svi ili suštinski svi FR regioni oni, koji su humana imunoglobulinska konsenzus sekvenca. Humanizovano antitelo može, isto tako, sadržavati bar deo imunoglobulinskog konstantnog regiona ili domena (Fc), obično onog iz humanog imunoglobulina. Primeri postupaka, koji su korišćeni za stvaranje humanizovanih antitela, opisani su u: U.S. Pat.5,225,539.
Izraz "humano antitelo" označava antitelo, koje je proizveo čovečiji organizam ili antitelo koje ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara antitelu koje je proizveo čovečiji organizam, a proizvedeno je korišćenjem bilo koje poznate tehnike. Ova definicija humanog antitela obuhvata intaktna ili antitela u punoj dužini, njihove fragmente, i/ili antitela koja sadrže najmanje jedan polipeptid humanog teškog i/ili lakog lanca kao što je, na primer, antitelo koje sadrži polipeptide mišijeg lakog lanca i humanog teškog lanca.
Izraz "himerna antitela" odnose se na antitela u kojima je aminokiselinska sekvenca imunoglobulinskog molekula izvedena od dve ili više vrsta. Obično, varijabilni region oba, lakog i teškog lanca odgovara varijabilnom regionu antitela izvedenih od jedne vrste sisara (npr., miša, pacova, zeca, itd) sa željenom specifičnošću, afinitetom i moći dok su konstantni regioni homologni sa sekvencama antitela poreklom od druge vrste (obično čoveka) da bi se izbeglo izazivanje imunog odgovora u tim vrstama.
Izraz "epitop" ili "antigena determinanta" se ovde koriste ili jedan ili drugi i, odnose se na onaj deo antigena koji može biti prepoznat i specifično vezan naročitim antitelom. Kada je antigen polipeptid, epitopi se mogu formirati i od susednih amino kiselina i od ne-susednih amino kiselina, koje su postavljene jedna uz drugu tercijarnim sklapanjem proteina. Epitopi formirani od susednih amino kiselina se obično zadržavaju tokom proteinske denaturacije, dok se epitopi, formirani tercijarnim sklapanjem, obično gube tokom denaturacije proteina. Epitop obično uključuje najmanje 3, najmanje 5, ili najmanje 8-10 amino kiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji.
To da se antitelo "specifično vezuje" za epitop ili antigeni molekul znači da antitelo reaguje ili se vezuje daleko učestalije, brže, sa dužim trajanjem, sa većim afinitetom, ili sa nekom od kombinacija gore iznetog za epitop ili antigeni molekul u odnosu na alternativne supstance, uključujući nesrodne proteine. "Specifično vezivanje" može značiti, recimo, da se antitelo vezuje za protein sa KDod oko 0.1 mM ili manjom, ali češće sa manjom od otprilike 1 µM. Takođe, "specifično vezivanje" može značiti da se antitelo vezuje za protein povremeno sa KDod najmanje oko 0.1 µM ili manjom, a povremeno sa od najmanje oko 0.01 µM ili manjom. Zbog identiteta sekvence između homolognih proteina kod različitih vrsta, specifično vezivanje može obuhvatiti antitelo koje prepoznaje naročiti protein kod više od jedne vrste. Razume se da antitelo ili vezujući deo koji se specifično vezuje za prvu ciljnu metu može ali i ne mora specifično da se veže za drugu ciljnu metu. Kao takvo, "specifično vezivanje" ne zahteva nužno (mada može obuhvatiti) isključivo vezivanje, tj. vezivanje za samo jednu ciljnu metu. Generalno, ali ne i nužno, vezivanje se smatra specifičnim vezivanjem.
Antitela, uključujći njihove fragmente/derivate i monoklonska antitela, mogu se dobiti primenom poznatih postupaka. (Vidi McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Clackson et al., Nature 352:624-628; Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991); Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Waterhouse et al., Nucleic. Acids Res. 21:2265-2266 (1993); Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); Brennan et al., Science 229:81(1985); Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992); Kohler et al., Nature 256:495 (1975); U.S. Pat. No.4,816,567); Kilpatrick et al., Hybridoma 16(4):381-389 (1997); Wring et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 19(5):695-707 (1999); Bynum et al., Hybridoma 18(5):407-411 (1999), Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno.7:33 (1993); Barbas et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al., Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et. al., J. Immunol.
154(7):3310-9 (1995); Hawkins et al., J. Mol. Biol.226:889-896 (1992), U.S. Pat. Nos.5514548, 5545806, 5569825, 5591669, 5545807; WO 97/17852)
Primeri antitela, bez ograničenja, obuhvataju, ali bez ograničenja na ove, muromonab-CD3 abciksimab, rituksimab, daklizumab, palivizumab, infliksimab, trastuzumab, etanercept, baziliksimab, gemtuzumab ozogamicin, alemtuzumab, ibritumomab tiuksetan, adalimumab, alefacept, omalizumab, efalizumab, tositumomob-I131, cetuksimab, bevacizumab, natalizumab, ranibizumab, panitumumab, ekolizumab, rilonacept, certolizumab pegol, romiplostim, AMG-531, CNTO-148, CNTO-1275, ABT-874, LEA-29Y, belimumab, TACI-Ig, druga generacija. anti-CD20, ACZ-885, tocilizumab (atlizumab), mepolizumab, pertuzumab, humax CD20, CP-675, 206 (ticilimumab), MDX-010, IDEC-114, inotuzumab ozogamicin, HuMax EGFR, aflibercept, VEGF Trap-Eye, HuMax-CD4, Ala-Ala, ChAglyCD3;TRX4, katumaksomab, IGN101, MT-201, pregovomab, CH-14.18, WX-G250, AMG-162, AAB-001, motavizumab; MEDI-524, efumgumab, Aurograb®, raksibakumab, treća generacija. anti-CD20, LY2469298, veltuzumab.
Kada je protein monoklonsko antitelo, najmanje jedan laki lanac monoklonskog antitela, najmanje jedan teški lanac monoklonskog antitela, ili oba mogu da sadrže aminokiselinski region koji ima aminokiselinski motiv kog prepoznaje izoprenoid transferaza.
C-terminus lakog ili teškog lanca može biti modifikovan. Isto tako, CH2 regioni u Fc regionu mogu biti glikozilovani.
C-terminus proteina (njegovog fragmenta, analoga, ili derivata) može da se poveže sa aminokiselinskim motivom kog opet može prepoznati izoprenoid transferaza. C-terminus može biti modifikovan. Modifikacija može biti (i) delecija u karboksi kraju proteina, (ii)adicija oligopeptida ili polipeptida u karboksi kraju proteina, ili (iii) delecija u karboksi kraju proteina i adicija oligopeptida ili polipeptida u karboksi kraju proteina. Modifikacija može biti povezana sa aminokiselinskim motivom.
Izraz "izoprenoid transferaza", koji je ovde korišćen, odnosi se na enzim koji može prepoznati izvestan aminokiselinski motiv na ili u blizini C-terminusa proteina i izvesti selektivnu alkilaciju na položaju(ima) tiola cisteinskog(ih) ostatka(aka) izvesnog aminokiselinskog motiva dodavanjem izoprenoidne(ih) jedinice(a) na protein koji nosi izvestan aminokiselinski motiv.
Primeri izoprenoid transferaze uključuju farneziltransferazu (FTase) i geranilgeraniltransferazu (GGTase), koje obuhvataju prenos farnezila odnosno geranil-geranil dela na C-terminalni(e) cistein(e) ciljnog proteina. GGTaza može da se klasifikuje u GGTazu I i GGTazu II. FTaza i GGTaza I mogu prepoznati CAAX motiv i GGTaza II može prepoznati XXCC, XCXC, ili CXX motiv, u kom C predstavlja cistein, A predstavlja alifatičnu amino kiselinu, a X predstavlja amino kiselinu koja determiniše supstratnu specifičnost izoprenoid transferaza (Nature Rev. Cancer 2005, 5(5), pp.405-12; Nature Chemical Biology, 2010, 17, pp.
498-506; Lane KT, Bees LS, Structural Biology of Protein of Farnesyltransferase and Geranylgeranyltransferase Type I, Journal of Lipid Research, 47, pp. 681-699 (2006); Patrick J. Kasey, Miguel C. Seabra; Protein Prenyltransferases, The Journal of Biological Chemistry, Vol.
271, No.10, Issue of March 8, pp.5289-5292 (1996)).
Ovde, mogu se koristiti izoprenoid transferaze iz raznih izvora, npr., humane, životinjske, biljne, bakterijske, virusne i slične. Mogu se upotrebiti izoprenoid transferaze koje se prirodno javljaju. Mogu se koristiti prirodne ili veštački modifikovane izoprenoid transferaze. Na primer, izoprenoid transferaze koje imaju najmanje jednu prirodno izmenjenu aminokiselinsku sekvencu (uključujući post-translacionu modifikaciju), izoprenoid transferaze koje se prirodno javljaju ili su veštački skraćene od izoprenoid transferaza koje se javljaju u prirodi, izoprenoid transferaze koje su modifikovane najmanje sa jednim od (His)-tag, GST, GFP, MBP, CBP, iospep-tag, BCCP, Myc-tag, kalmodulin-tag, FLAG-tag, HA-tag, maltoza vezujući protein-tag, Nus-tag, glutation-S-transferaze-tag, zeleni fluorescentni protein-tag, tioredoksin-tag, S-tag, Softag 1, Softag 3, Strep-tag, SBP-tag, Ty tag, i slične.
Izoprenoid transferaze mogu prepoznati izosupstrat kao i supstrat. Izosupstrat se odnosi na supstratni analog, koji ima modifikaciju u supstratu. Izoprenoid transferaze alkiluju izvestan aminokiselinski motiv (npr., CAAX motiv) na C-terminusu proteina (Benjamin P. Duckworth et al, ChemBioChem 2007, 8, 98; Uyen T. T. Nguyen et al, ChemBioChem 2007, 8, 408; Guillermo R. Labadie et al, J. Org. Chem. 2007, 72(24), 9291; James W. Wollack et al, ChemBioChem 2009, 10, 2934). Funkcionalizovani protein može da se proizvede korišćenjem izoprenoid transferaze i izosupstrata putem alkilacije na C-terminalnom cisteinu(ima).
Na primer, cisteinski ostatak na CAAX motivu C-terminala može reagovati sa izosupstratom korišćenjem izoprenoid transferaze. U izvesnim slučajevima, AAX onda može da se ukloni proteazom. Nastali cistein zatim može da se metiluje na karboksi terminusu pomoću enzima (Iran M. Bell, J. Med. Chem.2004, 47(8), 1869).
U slučaju nekih proteina, može se javiti cisteinilacija i glutationilacija putem formiranja disulfidne veze zahvaljujući post-translacionoj modifikaciji. Takva disulfidna veza, međutim, može da se redukuje kada se javi ovakva alkilacija izoprenoid transferazama.
Proteini, koji su ovde opisani, mogu da se proizvedu primenom svakog postupka molekularne biologije ili ćelijske biologije, koji su dobro utvrđeni u ovoj stručnoj oblasti. Na primer, mogu se primeniti postupci prolazne transfekcije. Genetička sekvenca, koja kodira izvestan aminokiselinski motiv kog može prepoznati izoprenoid transferaza, može se umetnuti u poznati plazmidni vektor, primenom standardnih PCR tehnologija tako da bi se ekspresovao protein (njegov fragment ili analog) koji ima izvestan aminokiselinski motiv na svom C-terminusu. Kao takav, može se ekspresovati protein, koji ima najmanje jedan aminokiselinski motiv kojeg može prepoznati izoprenoid transferaza. Ekspresovani protein onda može enzimski reagovati sa izosupstratom izoprenoid transferaze korišćenjem izoprenoid transferaze, da bi se proizveo funkcionalizovani protein. Izosupstrat sadrži funkcionalnu grupu.
Jednom kada se ekspresuje protein, koji ima aminokiselinski motiv kog izoprenoid transferaza može prepoznati, on može enzimski reagovati, korišćenjem izoprenoid transferaze i najmanje jednog izosupstrata koji ima prvu funkcionalnu grupu (FG1), na koji način se proizvodi funkcionalizovan protein.
Izraz "funkcionalna grupa", koji je ovde korišćen se odnosi na grupu kojom se mogu postići, npr., 1,3-dipolarne cikloadicione reakcije, reakcije hetero-diela, reakcije nukleofilne supstitucije (npr., reakcija otvaranja prstena heterocikličnog elektrofila, kao što su epoksid, aziridin, ciklični sulfat i aziridijum), reakcije karbonila ne-aldol tipa (npr., formiranje oksima etara, urea, tiourea, aromatičnih heterocikla, hidrazona i amida), adicije na ugljenik-ugljenik višestruke veze, reakcije oksidacije (npr., epoksidacija, aziridinacija i sulfenil halid adicija) i, klik hemija. Funkcionalna grupa može obuhvatiti, ali nije ovime ograničena, fluorescentni tag, triazol, maleimid i radio izotop (Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 2004-2021; Drug Discovery Today, 2003, 8(24), 1128-1137; Chem. Rev. 2008, 108, 2952-3015). Funkcionalna grupa može biti acetilenska grupa i azid grupa.
Funkcionalna grupa može biti povezana za protein ili za aktivan agens preko najmanje jednog linkera. Linker može biti ravnolančani linker. Linker može biti razgranati linker. Kada je veza razgranati linker, aktivan agens može biti povezan sa svim granama. Svaka grana može imati isti ili različite aktivne agense. Linker može biti otcepljen. Može, takođe, biti neotcepljiv.
Funkcionalizovani aktivan agens može biti proizveden povezivanjem druge funkcionalne grupe (FG2) za aktivan agens. Primeri aktivnih agenasa obuhvataju, ali nisu ovima ograničeni, lek, toksin, afinitetni ligand, detekcionu probu, ili njihovu kombinaciju.
Primeri lekova uključuju, ali nisu ovima ograničeni, erlotinib (TARCEVA; Genentech/OSI Pharm.), bortezomib (VELCADE; MilleniumPharm.), fulvestrant (FASLODEX; AstraZeneca), sutent (SU11248; Pfizer), letrozol (FEMARA; Novartis), imatinib mezilat (GLEEVEC; Novartis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), oksaliplatin (Eloxatin; Sanofi), 5-fluorouracil (5-FU, leucovorin, rapamicin (Sirolimus, RAPAMUNE; Wyeth), lapatinib (TYKERB, GSK572016; GlaxoSmithKline), lonafarnib (SCH 66336), sorafenib (BAY43-9006; Bayer Labs.), gefitinib (IRESSA; Astrazeneca), AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), alkilirajuće agense, kao tiotepa i CYTOXAN® ciklofosfamid; alkil sulfonate, kao busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridine, kao benzodopa, karbohon, meturdopa i uredopa; etilenimin i metilamelamine uključujući altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trictiilentiofosforamid i trimetilolomelamin; acetogenine (posebno, bulatacin i bulatacinon); kamptotecin (uključiv sintetski analog topotekan); briostatin; kalistatin; CC-1065 (uključujući njegov adozelesin, karzelesin i bizelesin sintetske analoge); kriptoficine (naročito kriptoficin 1 i kriptoficin 8); dolastatin; duokarmicin (uključiv sintetske analoge, KW-2189 i CB1-TM1); eleuterobin; pankratistatin; sarkodiktin; spongistatin; azotne mustarde, kao hlorambucil, hlornafazin, holofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembihin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracil mustard; nitrozuree, kao karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin i ranimnustin; antibiotike, kao enedinske antibiotike (npr, kalihemicin, posebno kalihemicin gama1 I i kalihemicin omegaI1(vidi, npr., Agnew, Chem Intl ed Engl., 33: 183-186 (1994)) i dinemicin, uključujući dinemicin A; bisfosfonat, kao klodronat; esperamicin, neokarzinostatin hromofor i srodan hromoprotein enedin antibiotski hromofori, aklacinomisini, aktinomicin, antrmicin, azaserin, bleomicini, kaktinomicin, karabicin, karninomicin, karzinofilin, hromomicini, daktinomicin, daunorubicin, detorubucin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, ADRLIMYCIN® doksorubicin (uključujući morfolino-doksorubicin, cijanomorfolino-doksorubicin, 2-pirolinodoksorubucin, lipozomalni doksorubicin i deoksidoksorubicin), epirubicin, ezorubicin, marcelomicin, mitomicin, kao mitomicin C, mikofenolna kiselina, nogalamicin, olivomicine, peplomicin, potfiromicin, puromicin, kvelamicin, rodorubicin, streptomigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin i zorubicin; anti-metabolite, kao 5-fluorouracil(5-FU); analoge folne kiseline, kao što su denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; purinske analoge, kao fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin i tiguanin; pirimidinske analoge, kao što su ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin i floksuridin; androgene, kao kalusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostan i testolakton; anti-adrenalne agense, kao aminoglutetimid, mitotan i trilostan; nadopunjivače folne kiseline, kao što su folinska kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aminolevulinska kiselina; eniluracil; amsakrin; bestrabucil; bisantren; edatraksat; defofamin; demekolcin; diazihon; elfornitin; eliptinium acetat; epotilon; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiurea; lentinan; lonidainin; maitansinoidi, kao maitansin i ansamitocini; mitogvazon; mitoksantron; mopidanmol; nitraerin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; lozoksantron; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK® polisaharidni kompleks (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); razoksan; rizoksin; sizofiran; spirogermanium; tenuazonska kiselina; triazikion; 2,2’,2"-trihlorotrietilamin; trihotecene (posebno T-2 toksin, verakurin A, roridin A i anguidin); uretan; vindesin; dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid (’Ara-C’); ciklofosfamid; tiotepa; taksoide, npr., TAXOL® paklitaksel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N. J.) ABRAXANE™ bez kremofora, formulacija paklitaksela na albuminkonstruisanim nanočesticama (American Pharmaceutical Partners, Schaumber, I11.), i TAXOTERE® doksetaksel (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); hloranbucil; gemcitabin; 6-tioguanin; merkaptopurin; platinum analoge, kao cisplatin, karboplatin; vinblastin; platinum; etopozid, ifosfamid; mitoksantron; vinkristin; NAVELBINE® vinorelbin; novantron; tenipozid; edatreksat; daunomicin; aminopterin; kseloda; ibandronat; CPT-11; inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluorometilornitin (DFMO); retinoidi, kao retinska kiselina; kapecitabin; i njihove farmaceutski prihvatljive soli, solvate, kiseline, ili derivate.
Drugi lekovi obuhvataju, ali nisu ovima ograničeni, (i) anti-hormonska sredstva koja deluju tako da regulišu ili inhibiraju dejstvo hormona na tumore, kao što su anti-estrogeni i selektivni mofulatori estrogenog receptora (SERMs), uključujući, na primer, tamoksifen (uključiv NOLVADEX® tamoksifen), raloksifen, droloksifen, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston i FAREATON® toremifen; (ii) inhibitori aromataze koji inhibiraju enzim aromatazu, koji reguliše produkciju estrogena u adrenalnim žlezdama, kao, na primer, 4(5)-imidazoli, aminoglutetimid, MEGASE® megestrol acetat, AROMASIN® eksemestan, FEMARA® letrozol i ARIMIDEX® anastrozol; (iii) antiandrogene, kao što su flutamid, nilutamid, bikalutamid, leuprolid i goserelin; kao i troksacitabin (1,3-dioksolan nukleozid citozinski analog); (iv) inhibitori aromataze; (v) inhibitori protein kinaze; (vi) inhibitori lipidne kinaze; (vii) antisens oligonukleotide, posebno one koji inhibiraju ekspresiju gena u signalnim putevima uključenim u aberantnu ćelijsku proliferaciju, kao, na primer, PKC-alfa, Raf, H-Ras; (viii) ribozim, na primer, VEGF inhibitor kao što je ANGIOZYME ribozim i inhibitori HER2 ekspresije; (ix) vakcine, kao vakcine genske terapije; ALLOVECTIN® vakcina, LEUVECTIN vakcina i VAXID vakcina; PROLEUKIN®rlL-2; LURTOTECAN ® inhibitor topoizomeraze 1; ABARELIX® rmRH; (x) anti-angiogena sredstva, kao Bevacizumab (AVASTIN, Genentech); i (xi) njihove farmaceutski prihvatljive soli, solvate, kiseline, ili derivate.
Citokini se mogu upotrebiti kao lek. Citokini su mali molekuli proteina ćelijskog signaliziranja, koje izlučuju brojne ćelije i, grupa su signalnih molekula koja se intenzivno koristi za međućelijsku komunikaciju. Obuhvataju monokine, limfokine, tradicionalne polipeptidne hormone, i slično. Primeri citokina uključuju, ali nisu ovima ograničeni, hormon rasta, kao humani hormon rasta, N-metionil humani hormon rasta i goveđi hormon rasta; paratiroidni hormon; tiroksin; insulin; proinsulin; relaksin; prorelaksin; glikoproteinske hormone, kao folikulo stimulirajući hormon (FSH), tiroidno stimulirajući hormon (TSH) i luteinizirajući hormon (LH); jetreni faktor rasta fibroblastni faktor rasta; prolaktin; placentalni laktogen; tumor nekrozis faktor-α i -β; mullerian-inhibirajuća supstanca; mišiji gonadotropin-povezani peptid; inhibin; aktivin; vaskularni endotelialni faktor rasta; integrin; trombopoetin (TPO); nervni faktori rasta, kao NGF-β; trombocitni faktor rasta; transformišući faktori rasta (TGFs), kao TGF-α i TGF-β; insulinu-sličan faktor rasta-I i -II; eritropoetin (EPO); osteoinduktivni faktori; interferoni, kao interferon-α, -β, i -γ; faktori stimulisanja kolonija (CSFs), kao makrofagni-CSF (M-CSF); granulocitno-makrofagni-CSF (GM-CSF); i granulocitni-CSF (G-CSF); interleukini (ILs), kao IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; tumor nekrozis faktor, kao TNF-α i TNF-β; idrugi polipeptidni faktori, uključiv LIF i kit ligand (KL). Kako je ovde korišćen, izraz citokin, isto tako, obuhvata proteine iz prirodnih izvora ili iz rekombinantnih ćelijskih kultura i biološki aktivne ekvivalente nativnih sekvenci citokina.
Izraz "toksin" se odnosi na otrovne supstance koje se proizvode unutar živih ćelija ili organizama. Toksini mogu biti mali molekuli, peptidi ili proteini koji mogu dovesti do bolesti u kontaktu sa ili apsorpcijom u telesna tkiva, a interakcijom sa biološkim makromolekulama, kao što su enzimi ili ćelijski receptori. Toksini obuhvataju biljne toksine i životinjske toksine. Primeri životinjskih toksina obuhvataju, ali nisu ovima ograničeni, difterijski antitoksin, botulinski toksin, tetanusni antitoksin, toksin dizenterije, toksin kolere, tetrodotoksin, brevetoksin, ciguatoksin. Primeri biljnih toksina uključuju, ali nisu ovima ograničeni, ricin i AM-toksin.
Primeri toksina malih molekula uključuju, ali nisu ovima ograničeni, auristatin, geldanamicin (Kerr et al., 1997, Bioconjugate Chem. 8(6):781-784), maitansinoide (EP 1391213, ACR 2008, 41, 98-107), kalihemicin (US 2009105461, Cancer Res. 1993, 53, 3336-3342), daunomicin, doksorubicin, metotreksat, vindezin, SG2285 (Cancer Res. 2010, 70(17), 6849-6858), dolastatin, dolastatinski analog auristatin (US563548603), kriptoficin, kamptotecin, rizoksinske derivate, CC-1065 analoge ili derivate, duokarmicin, enedinske antibiotike, esperamicin, epotilon i toksoide. Toksini mogu ispoljiti citotoksičnost i aktivnost inhibicije ćelijskog rasta vezivanjem za tubulin, vezivanjem DNA, supresijom topoizomeraze i sličnim.
Izraz "ligand" se odnosi na molekul koji formira kompleks sa ciljnim biomolekulom. Primer liganda je molekul koji se vezuje za predeterminisani položaj ciljanog proteina i prenosi signal. Može biti supstrat, inhibitor, stimulišući agens, neurotransmiter, ili radioizotop.
"Detektabilan deo" ili "obeleživač" se odnosi na sastav koji se može detektovati spektroskopskim, fotohemijskim, biohemijskim, imunohemijskim, radioaktivnim, ili hemijskim načinom. Na primer, korisni obeleživači uključuju<32>P,<35>S, fluorescentne boje, reagense elektronske gustine, enzime (npr., kao što se uobičajene koriste za ELISA), biotin-streptavidin, dioksigenin, haptene i proteine za koje postoje antiserumi ili monoklonska antitela, ili molekule nukleinske kiseline sa sekvencom koja je komplementarna ciljnoj. Detektabilni deo često stvara signal koji je merljiv, kao radioaktivni, hromogeni, ili fluorescentni signal, koji se može koristiti za kvantitativno određivanje količine vezanog detektabilnog dela u uzorku. Kvantitativno određivanje signala se postiže, npr., scintilacionim brojanjem, denzitometrijom, protočnom citometrijom, ELISA, ili direktnom analizom masenom spektreometrijom intaktnih ili naknadno svarenih peptida (mogu se ispitati jedan ili više peptida). Stručne osobe poznaju tehnike kojima se jedinjenja od interesa obeležavaju, kao i načine detekcije. Ove tehnike i postupci su konvencionalni i dobro poznati u struci.
Izraz "proba", kako je ovde korišćen, odnosi se na materijal koji može (i) obezbediti detektabilan signal, (ii) međusobno reagovati sa prvom probom ili drugom probom radi modifikovanja detektabilnog signala obezbeđenog prvom ili drugom probom, kao što je transfer fluorescentne rezonantne energije (FRET), (iii) stabilisati interakciju sa antigenom ili ligandom ili povećati afinitet vezivanja; (iv) uticati na elektroforetsku pokretljivost ili aktivnost ćelijskog prodora pomoću fizičkih parametara kao što su naelektrisanje, hidrofobnost, itd., ili (v) kontrolisati afinitet liganda, antigen-antitelo vezivanje, ili formiranje jonskog kompleksa.
Jednom kada se proizvedu funkcionalizovani protein i funkcionalizovani aktivan agens, oni reaguju jedan sa drugim, na koji način proizvode konjugat aktivnog agensa proteina. Reakcija između funkcionalizovanog proteina i funkcionalizovanog aktivnog agensa može biti reakcija klik hemije preko formiranja hidrazona i/ili oksima. FG1 može biti azidna grupa i FG2 može biti acetilenska grupa, ili obrnuto. FG1 može biti aldehidna ili ketonska grupa i FG2 može biti hidrazin ili hidroksilamin, ili obrnuto.
Reakcije klik hemije se izvode u blagim uslovima, omogućavajući jednostavan rad sa proteinima. Reakcija klik hemije pokazuje veoma visoku specifičnost reakcije. Tako, čak i kada protein ima druge funkcionalne grupe (npr., ostatak na bočnom lancu ili na C-terminusu ili N-terminusu), ove funkcionalne grupe nisu pogođene reakcijom klik hemije. Na primer, reakcija klik hemije između acetilenske grupe i azidne grupe proteina može da se ostvari a da druge funkcionalne grupe proteina nisu pogođene reakcijom klik hemije. Sem toga, reakcija klik hemije može specifično da se javi a da na nju ne utiče vrsta uključenog liganda. U nekim slučajevima, ligand se može odabrati tako da poboljša ukupnu efikasnost reakcije. Na primer, azid-acetilen klik hemija može proizvesti triazol u visokom prinosu (Rhiannon K. Iha et al, Chem. Rev. 2009, 109, 5620; Morten Meldal and Christian Wenzel Tornoe, Chem Rev., 2008, 108, 2952; Hartmuth C. Kolb et al, Angew. Chemie Int. Ed. Engl., 2001, 40, 2004).
Azidna i acetilenska grupa su funkcionalne grupe koje ne postoje u aminokiselinskim sekvencama proteina koji se prirodno javljaju. Ukoliko se javi reakcija konjugacije korišćenjem ovih funkcionalnih grupa, ni jedan od ostataka bočnog lanca i nijedna N-terminalna ili C-terminalna funkcionalna grupa neće biti pogođena reakcijom klik hemije. Prema tome, može se proizvesti konjugat protein-aktivni agens u kome je aktivan agens konjugovan u ciljnom položaju(ima).
Kada je protein antitelo, celo ili deo antitela može biti smanjeno na jedan lanac u toku alkilacije izoprenoid transferazom. Jedan lanac može da se oksiduje kako formira H2L2-oblik antitela, zahvaljujući oksidacionom sredstvu korišćenom u reakciji klik hemije.
Kako antitelo ima 4 lanca (2H 2L), alkilacija se može izvesti na položajima 1-4 po antitelu. Broj aktivnih agenasa može biti veći od 4 s obzirom da mnoštvo aktivnih agenasa može da se veže za linker.
Kada je CAAX aminokiselinski motiv kog može prepoznati izoprenoid transferaza, postupak može dalje uključiti uklanjanje AAX. Postupak može dalje uključiti dodavanje metil grupe na C-terminusu po uklanjanju AAX (Journal of Lipid Research, 2006, 47, 681-699).
Primer postupka 2
Postupak za proizvodnju konjugata protein-aktivnog agensa, kako je ovde opisan, obuhvata: (a) ekspresiju proteina koji ima aminokiselinski motiv kog može prepoznati izoprenoid transferaza; (b) vezivanje izosupstrata izoprenoid transferaze za aktivan agens; i (c) enzimsku reakciju, primenom izoprenoid transferaze, ekspresovani protein sa aktivnim agensom vezanim za izosupstrat.
Ovde, jednom kada se protein koji ima aminokiselinski motiv kog može prepoznati izoprenoid transferaza ekspresuje, protein reaguje sa aktivnim agensom vezanim za izosupstrat izoprenoid transferaze. U ovom slučaju, može se javiti tiol-maleimid konjugacija. Ipak, čak i kada se javi tiol-maleimid konjugacija, aktivni agensi se konjuguju samo u ciljnim položajima prema ovom izlaganju. Prema tome, problem koji postoji kod prethodne tehnike da se proizvode ne-homogene smeše, na ovaj način je izbegnut.
2. Konjugati protein-aktivnog agensa
Ovde je takođe opisan konjugat protein-aktivnog agensa, koji sadrži protein koji ima aminokiselinski motiv kog može prepoznati izoprenoid transferaza, pri čemu je aktivan agens kovalentno povezan sa proteinom na aminokiselinskom motivu.
Prosečan stručnjak će lako odabrati protein, koji selektivno vezuje ciljanu metu (npr., ciljnu ćeliju u subjektu). Primeri proteina obuhvataju, ali nisu ovima limitirani, antitela ili fragmente koji su antigeni koji se specifično vezuju za ciljanu metu.
CAAX protein (CAAX antitelo)
Primer konjugata protein-aktivnog agensa, koji je proizveden postupkom kako je ovde opisan, predstavljen je sledećom formulom (I), u kojoj je protein antitelo (fragment ili njegov analog) (Ab), aktivan agens je lek (D) i aminokiselinski motiv, koji se može prepoznati izoprenoid transferazom je CAAX.
Ab(M) predstavlja antitelo ili njegov fragment, koji može sadržavati modifikaciju. Modifikacija može biti (i) delecija na karboksi kraju antitela ili njegovog fragmenta; (ii) adicija oligopeptida ili polipeptida na karboksi kraju antitela ili njegovog fragmenta; i (iii) delecija na karboksi kraju antitela ili njegovog fragmenta i adicija oligopeptida ili polipeptida na karboksi kraju antitela ili njegovog fragmenta. Q predstavlja linker. Linker može biti ravnolančani linker ili razgranati linker. Linker može obuhvatiti prvu funkcionalnu grupu (FG1). n1, n2i m mogu biti odgovarajuće determinisani, zavisno od antitela, aminokiselinskog motiva, linkera, aktivnog agensa, itd. Poželjno, n1i n2su, nezavisno, ceo broj od 1 do 4 i m je ceo broj od 1 do 16.
Linker može da se predstavi sledećom formulom (II):
P1i Y su, nezavisno, grupa koja sadrži prvu funkcionalnu grupu (FG1). FG 1 može biti odabrana iz grupe, koju čine: acetilen, azid, aldehid, hidroksilamin, hidrazin, keton, nitrobenzofurazan (NBD), dansil, fluorescein, biotin i Rhodamin. L1je (CH2)rXq(CH2)p, gde je X kiseonik, sumpor, -NR1-, -C(O)NR1-, -NR1C(O)-, -NR1SO2-, -SO2NR1-, -(CH=CH)-, ili acetilen; R1je vodonik, C1-6alkil, C1-6alkilaril, ili C1-6alkilheteroaril; r i p su, nezavisno, ceo broj od 0 do 6; q je ceo broj od 0 do 1; i n je ceo broj od 1 do 4.
Lek (D) može biti vezan za linker preko grupe, koja sadrži drugu funkcionalnu grupu (FG2), koja može reagovati sa FG1. FG2 može biti odabrana iz grupe, koju čine: acetilen, hidroksilamin, azid, aldehid, hidrazin, keton i amin.
Lek (D) može biti vezan za grupu, koja sadrži FG2 preko -(CH2)rXq(CH2)p- ili -[ZCH2CH2O(CH2CH2O)wCH2CH2Z]-, gde je X kiseonik, sumpor, -NR1-, -C(O)NR1-, -NR1C(O)-, -NR1SO2-, ili -SO2NR1-; Z je kiseonik, sumpor ili NR1; R1je vodonik, C1-6alkil, C1-6alkilaril, ili C1-6alkilheteroaril; r i p su, nezavisno, ceo broj od 0 do 6; q je ceo broj od 0 do 1; i w je ceo broj od 0 do 6.
(i) Peptid(i), koji mogu biti otcepljeni katepsinom B ili (ii) glukuronid, koji može biti otcepljen β-glukuronidazom, mogu biti vezani za -(CH2)rXq(CH2)p- ili za - [ZCH2CH2O(CH2CH2O)wCH2CH2Z]-.
Ne-samo-žrtvujuća grupa ili samo-žrtvujuća grupa može biti vezana za (i) peptid(e) koji mogu biti otcepljeni katepsinom B ili (ii) glukuronid koji može biti otcepljen βglukuronidazom. Primeri samo-žrtvujuće grupe, koji nisu ograničavajućeg karaktera, su aminofenilmetiloksikarbonil i hidroksifenilmetiloksikarbonil.
Peptid, kog katepsin B može otcepiti, može se predstaviti sledećom formulom (III):
Glukuronid, kog β-glukuronidaza može otcepiti, može se predstaviti sledećom formulom (IV):
3. Kompozicije
Poželjne su ovde, takođe, kompozicije koje sadrže konjugat protein-aktivnog agensa, koji je ovde opisan. Kompozicije se mogu primenjivati za dopremanje aktivnog agensa do ciljne ćelije kod subjekta. Kompozicije se takođe mogu primenjivati za lečenje subjekta kome je to neophodno (tj., kome je neophodan aktivan agens).
Izrada ovakvih kompozicija je poznata stručnom licu i, ovakve kompozicije se mogu in vivo oslobađati u subjektu.
U aspektima, kompozicije se pripremaju u vidu injektabilne forme, bilo kao tečan rastvor bilo kao suspenzija. Čvrsti oblici, pogodni za injekciju, mogu se takođe proizvesti u vidu emulzija, ili sa polipeptidima inkapsuliranim u lipozomima. Konjugati protein-aktivnog agensa mogu se kombinovati sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, koji obuhvata svaki nosač koji ne dovodi do produkcije antitela pogubnih za subjekta koji prima nosač. Pogodni nosači uobičajeno sadrže velike makromolekule koje se sporo metabolišu, kao što su proteini, polisaharidi, polilaktati, poliglikolne kiseline, polimerne amino kiseline, aminokiselinski kopolimeri, lipidni agregati, i slični. Ovakvi nosači su dobro poznati stručnim licima.
Kompozicije, kako su ovde opisane, mogu isto tako sadržavati diluente, kao što su voda, slani rastvor, glicerol, etanol. Pomoćne supstance takođe mogu biti prisutne, kao što su vlažeća ili emulgujuća sredstva, puferišuće pH supstance i slične. Proteini se mogu u vakcinama formulisati kao neutralni ili u vidu soli. Kompozicije se mogu primeniti parenteralno, injekcijom; ta injekcija može biti ili subkutana ili intramuskularna. Druge formulacije su pogodne za druge oblike primenjivanja, kao što su supozitorije ili oralno primenjivanje. Oralne kompozicije se mogu primenjivati u vidu rastvora, suspenzije, tablete, pilula, kapsula, ili formulacija sa produženim oslobađanjem.
Kompozicije se primenjuju na način koji je kompatibilan sa formulacijom doze. Kompozicija sadrži terapeutski efektivnu količinu konjugata protein-aktivnog agensa. Pod terapeutski efektivnom količinom se podrazumeva pojedinačna doza, ili kompozicija koja se primenjuje po šemi višestrukih doza, koja je efikasna u lečenju ili prevenciji bolesti ili poremećaja. Doza koja se primenjuje će varirati, u zavisnosti od subjekta koji se leči, zdravlja subjekta i fizičkog stanja, stepena željene zaštite, kao i drugih relevantnih faktora. Precizne količine aktivnog sastojka koje su neophodne, zavisiće od procene lekara.
4. Postupci korišćenja konjugata aktivnog agensa proteina i kompozicija
Ovde je takođe opisan postupak za oslobađanje aktivnog agensa u ciljnu ćeliju u subjektu, postupak obuhvata primenjivanje konjugata protein-aktivnog agensa ili kompozicije. U još jednom aspektu, ovde je, isto tako, opisan postupak lečenja subjekta kome je to neophodno (tj., subjekta kome je aktivan agens neophodan), postupak obuhvata primenjivanje subjektu efektivne količine konjugata protein-aktivnog agensa ili kompozicije koja sadrži konjugat.
Konjugat protein-aktivnog agensa (npr., antitelo-lek konjugat) ili kompozicija koja sadrži konjugat u terapeutski efektivnoj količini mogu da se primenjuju pacijentu koji boluje od kancera ili tumora, radi lečenja kancera ili tumora.
Konjugat protein-aktivnog agensa (npr., antitelo-lek konjugat) ili kompozicija koja sadrži konjugat u terapeutski efektivnoj količini mogu da se primenjuju pacijentu radi lečenja ili prevencije infekcije patogenim agensom (npr., virus, bakterija, gljive i paraziti, i slični). Ovakvi postupci obuhvataju korak primenjivanja sisaru terapeutske ili profilaktičke količine konjugata, koja je dovoljna za lečenje bolesti ili poremećaja ili simptoma, u uslovima takvim da se bolest ili poremećaj sprečava ili leči.
Konjugat protein-aktivnog agensa ili kompozicija, može se primeniti u vidu njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvata. Može se primeniti sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, farmaceutski prihvatljivom podlogom i/ili farmaceutski prihvatljivim aditivom. Farmaceutski prihvatljiva količina i vrsta farmaceutski prihvatljive soli ili solvata, podloge i aditiva, može se odrediti korišćenjem standardnih postupaka (Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 18th edition, 1990).
Izraz "terapeutski efektivna količina", u odnosu na kancer ili tumor, označava količinu koja može smanjiti broj kancerskih ćelija; smanjiti veličinu kancerskih ćelija; sprečiti da kancerske ćelije upadaju u periferne sisteme ili smanjiti invaziju; sprečiti da se kancerske ćelije šire u druge sisteme ili smanjiti širenje; sprečiti rast ćelija kancera; i/ili poboljšati najmanje jedan od simptoma koji su povezani sa kancerom. U tretmanu kancera, efektivnost leka se može proceniti vremenom u kome tumor progresira (TTP) i/ili brzinom odgovora (RR).
Izraz "terapeutski efektivna količina", u odnosu na infekciju patogenim agensom, označava količinu koja može sprečiti, lečiti ili smanjiti simptome koji su povezani sa infekcijom.
Izraz "farmaceutski prihvatljive soli", koji je ovde upotrebljen, uključuje organske soli i neorganske soli. Primeri ovih obuhvataju, ali nisu ograničeni na: hidrohlorid, hidrobromid, hidrojodid, sulfat, citrat, acetat, oksalat, hlorid, bromid, jodid, nitrat, bisulfat, fosfat, kiseli fosfat, izonikotinat, laktat, salicilat, kiseli citrat, tartrat, oleat, taninat, pantonat, bitartrat, askorbat, sukcinat, maleat, gentisinat, fumarat, glukonat, glukuronat, saharat, formijat, benzoat, glutamat, metansulfonat, etansulfonat, benzen sulfonat, p-toluen sulfonat i pamoat (tj., 1,1’-metilenbis-(2-hidroksi-3-naftoat)). Farmaceutski prihvatljive soli mogu uključiti drugi molekul (npr., acetatni joni, sukcinatni joni i drugi anjoni, itd.). Takođe, mogu uključivati najmanje jedan naelektrisani atom. Isto tako, mogu uklučivati najmanje jedan anjon.
Primeri solvata, koji se mogu upotrebiti kao farmaceutski prihvatljivi solvati za jedinjenja, kako su ovde opisana, obuhvataju ali bez ograničavanja na ove: vodu, izopropanol, etanol, metanol, DMSO, etilacetat, sirćetnu kiselinu i etanolamin.
PRIMERI
Sledeći primeri ilustruju pronalazak i nisu u funkciji ograničavanja istog.
PRIMER 1: IZRADA Ab(M)-CAAX
1-1. Konstruisanje, ekspresija i prečišćavanje Herceptin-CAAX
Modifikovana herceptinska antitela su generisana korišćenjem standardne rekombinantne DNA tehnologije i protokola PCR kloniranja sa pNATABH::Herceptin HC plazmidom ili pNATABL::Herceptin LC plazmidom. Rekombinantni plazmidi se ekspresuju u ćelijskoj liniji HEK293E prolaznom transfekcijom. Antitela se odvajaju i prečišćavaju hromatografijom na protein A koloni.
Konstruisanje Herceptin-HC-GCVIM i Herceptin-LC-GCVIM
Modifikovana herceptinska antitela su generisana korišćenjem standardnih protokola PCR kloniranja. Generalno, Herceptin-HC-GCVIM i Herceptin-LC-GCVIM plazmidi se konstruisšu umetanjem DNA sekvence koja kodira CAAX motiv (npr., GCVIM, G5CVIM, G7CVIM, G10CVIM, ili G10CVLL), u C-terminus teškog lanca ili lakog lanca koji je kodiran u pNATABH::Herceptin HC ili pNATABH::Herceptin LC plazmidu.
Na primer, sekvenca prepoznavanja SacII se nalazi na aminokiselini 172 na C-terminusu humanog IgG1-Fc regiona. Prema tome, napred prajmer je označen da vezuje SacII položaj u Fc regionu. DNA sekvenca koja će se umetnuti (npr., 15-mer koji kodira GCVIM 5-mer sekvencu) se dodaje nazad prajmeru specifičnom za kraj Fc-C-terminala. Za amplifikaciju PCR proizvoda su korišćeni napred i nazad prajmeri i, nastali proizvod je prečišćen korišćenjem PCR kit-a za prečišćavanje. Kako nazad prajmer sadrži XhoI položaj, PCR proizvod je svaren sa SacII i XhoI. Slično, pNATABH::Herceptin HC plazmid je svaren sa SacII i XhoI. Svarena kičma je prečišćena primenom kit-a za prečišćavanje na gelu i povezana sa svarenim PCR proizvodom. Ligacija se izvodi odgovarajućim podešavanjem odnosa vektora i inserta i, proizvod ligacije se transformiše u kompetentne bakterijske ćelije za skriniranje. Herceptin-HC-GCVIM i Herceptin-LC-GCVIM plazmidi su proizvedeni od sekvencioniranih klonova.
Aminokiselinske sekvence dobijenih plazmida su prikazane na Slikama 1-10. Delovi 1-4 i 1-7 u nastavku daju detaljan opis svake konstrukcije.
Ekspresija i prečišćavanje Herceptin-HC-GCVIM i Herceptin-LC-GCVIM
HEK293 E ćelije se uzgajaju u DMEM/10% FBS medijumu na 150 mm pločama (# 430599, Corning USA) do 70~80% konfluencije. Pomeša se 13 µg DNA i 26 µg PEI (#23966, Polysciences, USA) u odnosu od 1:2, inkubira na RT otprilike 20 minuta i zatim, doda HEK193E ćelijama. Nakon 16-20 sati, medijum se zameni sa medijumom bez seruma (No FBS DMEM (#SH30243.01, Hyclone Thermo.,USA)) i supernatant se sakuplja svaka dva do tri dana.
Supernatanti se filtriraju sa 0.22 um top-filterom (#PR02890, Millipore, USA) i zatim, vezuju za 500 µl zrnaca proteina A (#17-1279-03, GE healthcare Sweden) pakovanih u 5mL koloni. Pomoću peristaltičke pumpe, izvodi se vezivanje brzinom 0.9mL/min na 4°C, preko noći. Kolona se ispere sa 100mL ili više PBS (#70011, Gibco,USA). Vezani protein se onda eluira sa 0.1M glicin-HCl (#G7126, Sigma, USA) u 6 frakcija i neutrališe sa 1M Tris (#T-1503, Sigma, USA) (pH 9.0). Protein se kvantitativno odredi. 2 ili 3 frakcije, koje sadrže protein, sakupe se i ukoncentrišu na Amicon Ultra filter jedinicama (#UFC805024, Millipore, USA). Pufer se menja otprilike 10 puta sa 1x PBS (#70011, Gibco, USA). Potvrđeno je da je proteinski proizvod Herceptin-HC-GCVIM ili Herceptin-LC-GCVIM, putem Western blot-a. Za identifikaciju proteinske trake koja sadrži herceptin, primenjena je ImmunoPure peroksidaza konjugovana sa kozijim anti-humanim IgG Fc (#31413, Pierce, USA). U toku prečišćavanja, dobija se 1-2mg Herceptin-HC-CGVIM ili Herceptin-LC-GCVIM iz 1L medijuma ćelijske kulture.
Proizvodi Herceptin-HC-CGVIM i Herceptin-LC-GCVIM su isto tako analizirani pomoću Agilent bioanalizatora. Ukratko, 8µl prečišćenog proteinskog uzorka (approx. 1mg/ml) analizira se pomoću Agilent Protein 230 Kit-a (5067-1515 Agilent Technologies, USA). Uzorak proteina se razdvoji u 2 frakcije (4µl svaka). U svaki uzorak, doda se 2µl ne-redukujućeg pufera ili redukujućeg pufera. Uzorak se zagreva na 95-100°C u toku 5 minuta i ohladi na ledu do 4°C. Nakon obaranja, u uzorak se doda 84µl dejonizovane vode i “ladder” i promućka na vorteksu. Posle toga, uzorak se stavi na analizator zajedno sa kit-om prema uputstvima proizvođača.
1-2. Konstrukcija, ekspresija i prečišćavanje anti cMET-CAAX
Modifikovana anti cMET-CAAX antitela se isto tako proizvode prethodno opisanim postupcima. Na primer, modifikovana anti cMET-CAAX antitela su generisana primenom standardne tehnologije rekombinantne DNA i protokola PCR kloniranja sa pPMC-C1A5 plazmidom. Rekombinantni plazmidi se ekspresuju u HEK293T ćelijskoj liniji prolaznom transfekcijom. Antitela se izdvajaju i prečišćavaju hromatografijom na koloni protein A.
1-3. Herceptin-HC-GnCVIM
Proizvedena su Herceptin-HC-GCVIM, Herceptin-HC-G5CVIM, Herceptin-HC-G7CVIM i Herceptin-HC-G10CVIM antitela. Antitela imaju 5-mer(GCVIM), 9-mer(G5CVIM), 11-mer(G7CVIM), odnosno 14-mer(G10CVIM) sekvencu na C-terminusu teškog lanca (Slike 1, 3, 5 i 7).
1-4. Herceptin-LC-GnCVIM
Proizvedena su Herceptin-LC-GCVIM, Herceptin-LC-G5CVIM, Herceptin-LC-G7CVIM i Herceptin-LC-G10CVIM antitela. Antitela imaju 5-mer(GCVIM), 9-mer(G5CVIM), 11-mer(G7CVIM), odnosno 14-mer(G10CVIM) sekvencu na C-terminusu lakog lanca (Slike 2, 4, 6 i 8).
1-5. Herceptin-HC-G10CVLL
Proizvedeno je Herceptin-HC-G10CVLL antitelo. Antibody ima 14-mer(G10CVLL) sekvencu na C-terminusu teškog lanca (Slika 9).
1-6. Herceptin-LC-G10CVLL
Proizvedeno je Herceptin-LC-G10CVLL antitelo. Antitelo ima 14-mer(G10CVLL) sekvencu na C-terminusu lakog lanca (Slika 10).
1-7. Anti cMET-HC-GnCVIM
Proizvedena su anti cMET-HC-G7CVIM i anti cMET-HC-G10CVIM antitela. Antitela, imaju 11-mer(G7CVIM), odnosno 14-mer(G10CVIM) sekvencu na C-terminusu teškog lanca (nije prikazano). Slika 11 prikazuje SDS-PAGE gel analizu anti cMET-HC-G7CVIM i anti cMET-HC-G10CVIM antitela.
1-8. Anti cMET-LC-GnCVIM
Proizvedena su anti cMET-LC-G7CVIM i anti cMET-LC-G10CVIM antitela. Antitela, imaju 11-mer(G7CVIM), odnosno 14-mer(G10CVIM) sekvencu na C-terminusu lakog lanca (nije prikazano). Slika 11 prikazuje SDS-PAGE gel analizu anti cMET-LC-G7CVIM i anti cMET-LC-G10CVIM antitela.
PRIMER 2: FUNKCIONALIZACIJA AB(M)-CAAX
2-1. Geranil alkin difosfat (B, LCB14-0501)
(steps znači korak, dakle kroz 5 koraka, prim. prev.)
Gornje referentno jedinjenje je proizvedeno kroz 6 koraka sa geraniolom kao polaznim materijalom, postupkom koji je sličan postupku, koji je opisan u: ChembioChem 207, 8, 98-105.
(B)<1>H NMR (600MHz, D2O) δ 5.38 (t, J = 7.8Hz, 1H), 5.30 (t, J = 7.8Hz, 1H), 4.31 (brs, 2H), 3.96 (m, 2H), 3.84 (s, 2H), 2.70 (bs, 1H), 2.07 (m, 2H), 1.98 (m, 2H), 1.56 (s, 3H), 1.48 (s, 3H)
2-2. Dekadienil propargil etar difosfat (F, LCB14-0511) i dekadienil azid difosfat (G, LCB14-0512)
Acetoksidekadienil aldehid (C) je proizveden od farnezola kroz 5 koraka. Od jedinjenja (C), jedinjenja (D) i (E) se proizvode kroz 6 koraka, odnosno 5 koraka. Od jedinjenja (D) i (E), gornja referentna jedinjenja (F) i (G) se proizvode postupkom, koji je sličan postupku opisanom u prethodnom odeljku 2-1. Jedinjenja (C), (D) i (E) se proizvode postupkom, koji je sličan postupku opisanom u: JOC 2007, 72(24), 9291-9297.
(F):<1>H NMR (600MHz, D2O) δ 5.44 (t, J = 6Hz, 1H), 5.22 (t, J = 6Hz, 1H), 4.46 (t, J = 8.4Hz, 2H), 4.16 (t, J = 2.4Hz, 2H), 3.55 (m, 2H), 2.85 (m, 1H), 2.15 (m, 2H), 2.09 (t, J = 7.2Hz, 2H), 2.03 (t, J = 7.2Hz, 2H), 1.70-1.65 (m, 5H), 1.60 (s, 3H)
(G):<1>H NMR (600MHz, D2O) δ 5.43 (t, J = 6.6Hz, 1H), 5.23 (t, J = 6.6Hz, 1H), 4.40 (t, J = 6Hz, 2H), 3.26 (t, J = 6.0Hz, 2H), 2.15 (m, 2H), 2.10-2.04 (m, 4H), 1.70~1.65(m, 5H), 1.60 (s, 3H)
2-3. NBD-GPP
Tris-amonijum[3,7-dimetil-8-(7-nitro-benzo[1,2,5]oksadiazol-4-ilamino)-okta-2,6-dien-1]pirofosfat (NBD-GPP) se proizvodi postupkom, koji je sličan postupku opisanom u: JACS 2006, 128, 2822-2835.
<1>H NMR (600MHz, D2O) δ 8.51 (d, J = 9Hz, 1H), 6.37 (d, J = 9Hz, 1H), 5.50 (t, J = 6.6Hz, 1H), 5.42 (t, J = 6.6Hz, 1H), 4.43 (t, J = 6.6Hz, 2H), 4.08 (s, 2H), 2.22 (m, 2H), 2.10 (t, J = 7.2Hz, 2H), 1.69 (s, 6H)
2-4. Glukuronid linker-MMAF (LCB14-0592)
Jedinjenje 2
U rastvor D-glukurono-6,3-laktona (19g, 107.88mmol) u metanolu (250mL) u atmosferi azota, postepeno se doda rastvor NaOH (100mg) u metanolu (100mL). Dobijena smeša se meša 2 sata. Dodaje se rastvor NaOH (200 mg) u metanolu (15mL). Dobijena mešavina se meša 3 sata. Metanol se uklanja pod sniženim pritiskom. Na 10°C ili nižoj temperaturi, jedno za drugim se dodaju piridin (50mL) i sirćetni anhidrid (Ac2O, 54mL). Dobijena mešavina se meša na sobnoj temperaturi u toku 4 sata. Kada je reakcija završena, nastala smeša se ukoncentriše pod sniženim pritiskom i, podvrgava se hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje 2 (20g, 50%) u vidu čvrste materije.
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 5.77 (d, J= 7.8Hz, 1H), 5.31 (t, J= 9.6Hz, 1H), 5.24 (t, J= 9.6Hz, 1H), 5.14 (m, 1H), 4.17 (d, J= 9Hz, 1H), 3.74 (s, 3H), 2.12 (s, 3H), 2.04 (m, 9H)
Jedinjenje 3
Jedinjenje 2 (5g, 13.28mmol) je dodato rastvoru 33% HBr u AcOH (20mL) na 0°C. Dobijena mešavina se meša 2 sata na sobnoj temperaturi. Kada je reakcija završena, nastala smeša se razblaži sa toluenom (50mL). Dobijena mešavina se ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Dodaju se etil acetat (100mL) i zasićeni rastvor NaHCO3(100mL) radi ekstrakcije organskog sloja. Ovako nastali organski sloj se osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom kako se dobija jedinjenje 3 (5.27g, 100%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 6.64 (d, J= 3.6Hz, 1H), 5.61 (t, J= 3.6Hz, 1H), 5.24 (t, J= 3.6Hz, 1H), 4.85 (m, 1H), 4.58 (d, J= 10.2Hz, 1H), 3.76 (s, 3H), 2.10 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 2.05 (s, 3H)
Jedinjenje 4
Rastvor jedinjenja 3 (4g, 10.07mmol) i 2,4-dihidroksibenzaldehida (1.67g, 12.084mmol) u acetonitrilu (30mL) se tretira, jedno za drugim, sa molekularnim sitom (5g) i Ag2O (9.33g, 40.28mmol). Dobijena mešavina se meša 3 sata na sobnoj temperaturi. Kada je reakcija završena, čvrsta materija se odfiltrira i filtrat ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgava hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje 4 (2g, 43.5%).
<1>H NMR (400MHz, CDCl3) δ 11.38 (s, 1H), 9.77 (s, 1H), 7.48 (d, J= 8.4Hz, 1H), 6.61 (dd, J= 8.4, 2.0Hz, 1H), 6.53 (d, J= 2.0Hz, 1H), 5.36~5.25 (m, 4H), 4.23 (m, 1H), 3.73 (s, 1H), 2.06 (s, 9H)
Jedinjenje 5
Rastvor jedinjenja 4 (1g, 2.20mmol) u acetonu (10mL) se tretira sa kalijum karbonatom (760mg, 5.50mmol) i sa 80% propargil bromidom u toluenu (735µL, 6.60mmol). Dobijena mešavina se meša na 45°C tokom 12 sati. Kada je reakcija završena, dodaju se etil acetat (100mL) i destilovana voda (100mL). Ovako nastali organski sloj se osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgava hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje 5 (930mg, 87%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 10.33 (s, 1H), 7.83 (d, J= 9Hz, 1H), 6.75 (d, J= 1.8Hz, 1H), 6.67 (dd, J= 9, 1.8Hz, 1H), 5.39~5.34 (m, 2H), 5.31~5.26 (m, 2H), 4.79 (d, J= 2.4Hz, 2H), 4.23 (m, 2H), 3.72 (s, 3H), 2.59 (t, J= 2.4Hz, 1H), 2.07 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 2.05 (s, 3H)
Jedinjenje 6
Rastvor jedinjenja 5 (930mg, 1.88mmol) u izopropil alkoholu (2mL) i hloroformu (10mL) na 0°C, tretiran je uzastopno sa silika-gelom (5g) i NaBH4(178mg, 4.79mmol). Dobijena mešavina se meša 3 sata. Kada je reakcija završena, silika gel se odfiltrira. Reakciona smeša se ekstrahuje sa dihlorometanom (100mL) i destilovanom vodom (100mL), osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentriše in vacuo. Ostatak se podvrgava hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje 6 (610mg, 65%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 7.23 (d, J= 8.4Hz, 1H), 6.72 (d, J= 2.4Hz, 1H), 6.61 (dd, 8.4, 2.4Hz, 1H), 5.35~5.32 (m, 2H), 5.27 (m, 1H), 5.13 (d, J= 7.8Hz, 1H), 4.72 (d, J= 2.4Hz, 2H), 4.63 (d, J= 5.4Hz, 2H), 4.17 (m, 1H), 3.73 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.04 (s, 3H)
Jedinjenje 7
Rastvor jedinjenja 6 (250mg, 0.50mmol) u dimetilformamidu (0.5mL) se obradi sa bis(4-nitrofenil)karbonatom (308mg, 100mmol) i diizopropiletilaminom (DIPEA, 132µL, 0.75mmol). Dobijena mešavina se meša 3 sata na sobnoj temperaturi. Kada je reakcija završena, reakciona smeša se ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgava hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje 7 (310mg, 94%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 8.26 (d, J= 9Hz, 2H), 7.37 (d, J= 9Hz, 2H), 7.34 (d, J= 8.4Hz, 1H), 6.77 (d, J= 1.8Hz, 1H), 6.64 (dd, 7.8, 2.4Hz, 1H), 5.37~5.33 (m, 2H), 5.30~5.27 (m, 3H), 5.17 (d, J= 7.2Hz, 1H), 4.74 (d, J= 2.4Hz, 2H), 4.18 (m, 1H), 3.74 (s, 3H), 2.54 (t, J= 2.4Hz, 1H), 2.07 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.04 (s, 3H)
Jedinjenje 8
U rastvor jedinjenja 7 (150mg, 0.227mmol), MMAF-OMe (169.6mg, 0.227mmol) i anhidrovanog 1-hidroksibenzotriazola (HOBt, 6.2mg, 0.0454mmol) u dimetilformamidu (3mL) se doda piridin (0.8mL) i diizopropiletilamin (40µL, 0.227mmol). Dobijena mešavina se meša na sobnoj temperaturi u toku 12 sati. Kada je reakcija završena, dodaju se etil acetat (100mL) i destilovana voda (100mL). Ovako nastali organski sloj se osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgava hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje 8 (146mg, 50%).
EI-MS m/z: 1067(M<+>)
MMAF-OMe se proizvede prema postupcima, koji su opisani u: US61/483,698, ChemPharmBull, 1995, 43(10), 1706-1718, US7423116, US7498298 i WO2002/088172.
LCB14-0592
Rastvor jedinjenja 8 (85mg, 0.067mmol) u metanolu (2mL) se na 0°C obradi sa rastvorom LiBH4(28.2mg, 0.670mmol) u destilovanoj vodi (1mL). Dobijena mešavina se meša na sobnoj temperaturi u toku 3 sata. Kada je reakcija završena, metanol se uklanja pod sniženim pritiskom. Ostatak se rastvori u destilovanoj vodi (50mL) i zakiseli se sa sirćetnom kiselinom na pH=3. Reakciona smeša se ekstrahuje tri puta sa dihlorometanom (3 x 50mL). Spojeni organski sloj se ukoncentriše pod sniženim pritiskom kako se dobija čvrsta materija, koja se ispira sa dietiletrom (50mL), na koji način dobijamo jedinjenje LCB14-0592 (62mg, 83%).
EI-MS m/z: 1112(M<+>)
2-5. Glukuronid linker-MMAE (LCB14-0598)
Jedinjenje 3
Rastvor jedinjenja 7 iz Primera 2-4 (150mg, 0.227mmol), MMAE (163mg, 0.227mmol; ChemPharm-Bull, 1995, 43(10), 1706-1718, US7423116, WO2002/088172) i anhidrovanog 1-hidroksibenzotriazola (HOBt, 6.2mg, 0.0454mmol) u dimetilformamidu (3mL) je obrađen sa piridinom (0.8mL) i diizopropiletilaminom (40µL, 0.227mmol). Dobijena mešavina je mešana na sobnoj temperaturi u toku 24 sata. Kada je reakcija završena, nastala mešavina je razblažena sa etil acetatom (100mL), 0.5N HCl (10mL) i destilovanom vodom (100mL). Ovako nastali organski sloj se osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgava hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje 3 (30mg, 10%).
EI-MS m/z: 1238(M<+>)
LCB 14-0598
Rastvor jedinjenja 3 (30mg, 0.024mmol) u metanolu (3mL) je obrađen na 0°C sa LiOH (10mg, 0.24mmol) u destilovanoj vodi (0.5mL). Dobijena mešavina je mešana 3 sata na sobnoj temperaturi. Kada je reakcija završena, organski rastvarač se uklanja pod sniženim pritiskom. Dobijeni proizvod se razblaži sa destilovanom vodom (50mL) i zakiseli sa 0.5N HCl do pH = 3. Ekstrakcijom sa dihlorometanom (50mL] posle koje sledi koncentrisanje pod sniženim pritiskom, proizvodi se jedinjenje LCB14-0598 (21mg, 79%).
EI-MS m/z: 1098(M<+>)
2-6. Glukuronid linker-MMAF-metil amid (LCB14-0600)
Jedinjenje 2
Rastvor jedinjenja 1 (Z-MMAF, 558mg, 0.644mmol, ChemPharmBull, 1995, 43(10), 1706-1718) u dimetilformamidu (5mL) je obrađen sa metilamin hidrohloridom (130mg, 1.932mmol), dietilcijanofosfonatom (DEPC, 144mg, 0.966mmol) i trietilaminom (270µL, 1.932mmol). Dobijena mešavina je mešana na sobnoj temperaturi u toku 12 sati. Kada je reakcija završena, dodaju se etil acetat (100mL) i destilovana voda (100mL). Ovako nastali organski sloj se osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgava hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje 2 (490mg, 86%).
EI-MS m/z: 879(M<+>)
LCB14-0601 (MMAF-metil amid)
Jedinjenje 2 (470mg, 0.53mM) je rastvoreno u terc-butanolu (<t>BuOH, 8mL) i destilovanoj vodi (0.8mL). Na 0°C, doda se 10% Pd/C (50mg). Dobijena mešavina je mešana u gasu H2tokom 2 sata. Kada je reakcija završena, odfiltrira se Pd/C korišćenjem celita. Dobijeni filtrirani rastvor je ukoncentrisan pod sniženim pritiskom kako se dobija jedinjenje LCB14-0601 (340mg, 85%).
EI-MS m/z: 745(M<+>)
Jedinjenje 3
Rastvor jedinjenja 7 iz Primera 2-4 (133mg, 0.20mmol), LCB14-601 (150mg, 0.20mmol) i anhidrovanog 1-hidroksibenzotriazola (HOBt, 5.44mg, 0.04mmol) u dimetilamidu (3mL) je tretiran sa piridinom (0.8mL) i diizopropiletilaminom (DIPEA, 35µL, 0.20mmol). Dobijena mešavina je mešana na sobnoj temperaturi u toku 12 sati. Kada je reakcija završena, dodaju se etil acetat (100mL) i 0.5N rastvor HCl (50mL). Ovako nastali organski sloj se osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgava hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje 3 (123mg, 48%).
EI-MS m/z: 1265(M<+>)
LCB 14-0600 (Glukuronid linker-MMAF-metil amid)
Rastvor jedinjenja 3 (60mg, 0.047mmol) u metanolu (3mL) se na 0°C tretira sa LiOH (20mg, 0.47mmol) u destilovanoj vodi (0.5mL). Dobijena mešavina je mešana na sobnoj temperaturi u toku 2 sata. Kada je reakcija završena, organski rastvarač se uklanja pod sniženim pritiskom. Ostatak se razblaži sa destilovanom vodom (50mL) i zakiseli sa 0.5N HCl do pH = 3. Ekstrakcijom sa dihlorometanom (50mL) posle koje sledi koncentrisanje, proizvodi se jedinjenje LCB 14-0600 (25mg, 47%).
EI-MS m/z: 1125(M<+>)
2-7. Azid-linker-NBD: LCB14-0529
Jedinjenje 2
Rastvor jedinjenja 1 (4g, 12.67mmol) i N-metilmorfolina (1.6mL, 14.57mmol) u tetrahidrofuranu (30mL) se postepeno tretira sa izobutilhlroroformijatom (1.8mL, 13.94mmol) na -15°C i u atmosferi azota. Nastala smeša se meša na istoj temperaturi u toku 30 minuta. Dobijena smeša se uz pomoć filtera polako doda u rastvor natrijum borohidrida (959mg, 25.34mmol) u tetrahidrofuran/metanolu (36mL/12mL), na -78°C i uz efikasno mešanje. Reaktant se postepeno zagreje na sobnu temperaturu uz mešanje od 2 sata. Kada je reakcija završena, doda se sirćetna kiselina (4mL) i meša se 15 minuta. Dodaju se etil acetat (100mL) i destilovana voda (100mL). Ovako nastali organski sloj se osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgava hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje 2 (3.69g, 96.5%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 4.50 (s,1H), 3.64 (q, J= 6.6Hz, 2H), 3.11 (m, 2H), 1.56 (m, 2H), 1.44 (m, 11H), 1.29 (m, 10H)
Jedinjenje 3
Rastvor jedinjenja 2 (450mg, 1.73mmol) i N-metilmorfolina (381µL, 3.46mmol) u tetrahidrofuranu (5mL) se postepeno obradi sa metansulfonskim anhidridom (363mg, 2.07mmol) na 0°C i u atmosferi azota. Dobijena smeša se postepeno zagreje do sobne temperature uz mešanje od 1 sata. Kada je reakcija završena, dodaju se etil acetat (50mL) i destilovana voda (50mL). Ovako nastali organski sloj se osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgava hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje 3 u vidu čvrste materije bele boje (520mg, 89%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 4.50 (s, 1H), 4.22 (t, J= 6.6Hz, 2H), 3.11 (m, 2H), 3.01 (s, 3H), 1.74 (m, 2H), 1.44-1.36 (m, 13H), 1.29 (m, 8H)
Jedinjenje 4
Rastvor jedinjenja 3 (520mg, 1.54mmol) u dimetilformamidu (5mL) se obradi sa natrijum azidom (120mg, 1.85mmol) u atmosferi azota i, dobijena smeša se meša na 70°C tokom 3 sata. Kada je reakcija završena, dodaju se etil acetat (50mL) i destilovana voda (50mL). Ovako nastali organski sloj se osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentriše pod sniženim pritiskom kako se dobija jedinjenje 4 u tečnoj formi (430mg, 98%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 4.49 (s, 1H), 3.26 (t, J= 6.9Hz, 2H), 3.09-3.12 (m, 2H), 1.59 (m,2H), 1.44 (m, 11H), 1.33 (m, 10H)
Jedinjenje 5
Rastvor jedinjenja 4 (430mg, 1.51mmol) u dihlorometanu (6mL) se obradi sa 4M-HCl u 1,4-dioksanu (4mL) na 0°C, u atmosferi azota. Dobijena mešavina se meša u toku 3 sata i ukoncentriše pod sniženim pritiskom, kako se dobija jedinjenje 5 (330mg, 99%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 8.29 (s, 2H), 3.26 (t, J= 6.9Hz, 2H), 2.98 (m, 2H), 1.46 (m, 2H), 1.59 (m, 2H), 1.31-1.39 (m, 10H)
LCB 14-0529
Rastvor jedinjenja 5 (326mg, 1.47mmol) u smešanom rastvaraču (10mL) od acetonitrila i 25mmol natrijum bikarbonata je tretiran sa 4-hloro-7-nitrobenzofurazanom (442mg, 2.20mmol). Dobijena mešavina se meša u toku 3 sata na sobnoj temperaturi. Dodaju se etil acetat (50mL) i destilovana voda (50mL). Ovako nastali organski sloj se osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgava hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje LCB 14-0529 (250mg, 49%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 8.48 (d, J= 8.4Hz, 1H), 6.16 (d, 8.4Hz, 1H), 3.47 (q, 6.6Hz, 2H), 3.24 (t, 6.9Hz, 2H), 1.79 (m, 2H), 1.59 (m, 2H), 1.42-1.48 (m, 2H), 1.20-1.37 (m, 8H)
2-8. Azid-linker-NBD: LCB14-0530
Jedinjenje 2
Rastvor tri(etilen)glikola (5g, 33.29mmol) u dihlorometanu (30mL) je obrađen sa ptoluensulfonil hloridom (13.96g, 73.24mmol) i kalijum hidroksidom (8.96g, 159.79mmol) na 0°C i u atmosferi azota. Dobijena mešavina je mešana na 0°C tokom 3 sata. Dodaju se etil acetat (100mL) i destilovana voda (100mL). Ovako nastali organski sloj se osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgava hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje 2 (13.2g, 86.5%) u vidu čvrste materije bele boje.
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 7.79 (m, 4H), 7.35 (m, 4H), 4.14 (m, 4H), 3.65 (m, 4H), 3.53 (s, 4H), 2.44 (s, 6H)
Jedinjenje 3
Rastvor jedinjenja 2 (4.5g, 9.81mmol) u dimetilformamidu (20mL) je obrađen sa natrijum azidom (1.6g, 24.52mmol) u atmosferi azota. Dobijena mešavina je mešana na 65°C tokom 10 sati. Dodaju se etil acetat (100mL) i destilovana voda (100mL). Ovako nastali organski sloj se osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgava hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje 3 (1.96g, 99%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 3.68-3.66 (m, 8H), 3.37 (t, J=4.8Hz, 4H)
Jedinjenje 4
Rastvor jedinjenja 3 (500mg, 2.49mmol) u 6.6mL smešanog rastvarača od dietiletra, tetrahidrofurana i 1N HCl (V:V:V=3:0.6:3). Rastvor trifenilfosfina (655mg, 2.49mmol) u dietiletru (3.5mL) se polako dodaje tokom 5 minuta. Dobijena mešavina je mešana na sobnoj temperaturi u toku 5 sati. Dobijena mešavina se razblaži sa etil acetatom (50mL) i destilovanom vodom (50mL) i, neutrališe se sa 1N rastvorom NaOH. Ovako nastali organski sloj se osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgava hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje 4 (370mg, 85%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 3.69-3.63 (m, 6H), 3.52 (t, J=5.1Hz, 2H), 3.40 (t, J=4.8Hz, 2H), 2.87 (t, J=5.1 Hz, 2H)
LCB14-0530
Rastvor jedinjenja 4 (200mg, 1.14mmol) u tetrahidrofuranu (4mL) je obrađen sa trietilaminom (320µL, 2.28mmol) i zatim sa rastvorom 4-hloro-7-nitrobenzofurazana (442mg, 2.20mmol) u tetrahidrofuranu (1mL). Dobijena mešavina je mešana na sobnoj temperaturi u toku 1 sata. Dodaju se etil acetat (50mL) i destilovana voda (50mL). Ovako nastali organski sloj se osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgava hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje LCB14-0530 (305mg, 78.8%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 8.47 (d, J=8.4Hz, 1H), 6.75 (s, 1H), 6.17 (d, J=8.4Hz, 1H), 3.86 (t, J=4.8Hz, 2H), 3.66-3.73 (m, 8H), 3.41 (t, J=4.8Hz, 2H)
2-9. Azid-linker-lek: LCB14-0505, -0531 i -0510
Jedinjenje 2
Jedinjenje 1 je proizvedeno prema postupku opisanom u: ChemPharmBull, 1995, 43(10), 1706-1718. Rastvor jedinjenja 1 (0.50g, 0.57mmol) u terc-butanolu (6mL) i vodi (0.6mL) se meša 4 sata u atmosferi vodonika sa Pd/C (6mg, 0.06mmol). Reakcioni rastvor se filtrira kroz celitni sloj i filtrat se ukoncentriše pod sniženim pritiskom kako se dobija jedinjenje 2 (0.42g) u vidu čvrste materije bele boje.
EI-MS m/z: 747(M<+>)
Jedinjenje 9
Hromijum(VI) trioksid (CrO3, 7g, 0.07 mol) se rastvori u destilovanoj vodi (10mL) na 0°C. U rastvor se, jedno po jedno, doda 18M-H2SO4(6.1mL, 0.11mol) i destilovana voda (20mL). Dobijena mešavina se meša 5 minuta (=Jones reagens). Rastvor 9-bromo-1-nonanola (5g, 22.4mmol) u acetonu (250mL) se postepeno tretira sa Jones reagensom (18mL) na -5°C. Posle mešanja dobijene smeše od 3 sata na sobnoj temperaturi, odfiltrira se zelenkasta čvrsta materija i filtrat se ukoncentriše. Ostatak se ekstrahuje sa dietil etrom (100mL) i vodom (50mL). Organski ekstrakt se osuši sa anhidrovanim Na2SO4, filtrira se i ukoncentriše in vacuo. Ostatak se podvrgne flash hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje 9 (4.95g, 93%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 3.40 (t, J= 6.6Hz, 2H), 2.35 (t, J= 7.2Hz, 2H), 1.85 (m, 2H), 1.62 (m, 2H), 1.41 (m, 2H), 1.32 (m, 6H)
Jedinjenje 10
Rastvor jedinjenja 9 (4g, 16.86mmol) u N,N-dimetilformamidu (15mL) je obrađen sa natrijum azidom (1.64g, 25.29mmol). Dobijena mešavina je grejana na 80°C 6 sati uz mešanje. Kada je reakcija završena, dodaju se etil acetat (100mL) i destilovana voda (100mL). Ovako dobijeni organski sloj se odvoji, osuši sa anhidrovanim Na2SO4, filtrira i ukoncentriše in vacuo. Ostatak se podvrgne flash hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje 10 (3.3g, 98%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 3.26 (t, J=7.2Hz, 2H), 2.35 (t, J=7.2Hz, 2H), 1.64-1.57 (m, 4H), 1.35~1.32 (m, 8H)
LCB14-0505
Rastvor jedinjenja 2 (0.16g, 0.21mmol) i 9-azido-nonanske kiseline (10) (47mg, 0.24mmol) u metilenhloridu (3mL) se obradi sa DIPEA (0.06mL, 0.32mmol) i PyBOP (0.15g, 0.28mmol) na 0°C. Dobijena smeša se meša u toku 3 sata. Dobijena smeša se ekstrahuje sa metilenhloridom (100mL) i vodom (20mL). Ovako dobijeni organski sloj se ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni sa etil acetatom i heksanom kako se dobija jedinjenje LCB14-0505 (0.12g, 59%) u vidu čvrste materije bele boje.
EI-MS m/z: 928(M<+>)
LCB14-0531
Jedinjenje LCB 14-0531 (65%) se proizvede postupkom koji je sličan gore opisanom postupku.
EI-MS m/z: 917(M<+>)
LCB14-0510
Jedinjenje 6 je proizvedeno primenom postupaka opisanih u: BioconjugateChem.
2002, 13, 855-869 i US2005238649. Rastvor jedinjenja 6 (69mg, 0.15mmol) i jedinjenja 2 (100mg, 0.13mmol) u DMF-u (2mL) obradi se sa DIPEA (0.04mL, 0.2mmol) i PyBOP (0.09g, 0.17mmol) na 0°C. Dobijena mešavina se meša 3 sata. Za ekstrakciju organskog sloja se koriste etil acetat (100mL) i voda (30mL), koji se ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni sa metilenhloridom i metanolom kako se dobija jedinjenje LCB14-0510 (94mg, 64%) u vidu čvrste materije smeđe boje.
EI-MS m/z: 1199(M<+>)
2-10. Acetilen-linker-NBD: LCB14-0532
Jedinjenje 2
Rastvor jedinjenja 1 (1g, 5.93mmol) u 10mL dimetilformamidu je obrađen sa natrijum azidom (578mg, 8.89mmol) u atmosferi azota. Dobijena mešavina se meša na 80°C tokom 3 sata. Kada je reakcija završena, dodaju se etil acetat (50mL) i destilovana voda (50mL). Ovako dobijeni organski sloj se osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentriše pod sniženim pritiskom kako se dobija jedinjenje 2 (1.03g, 99%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 3.75 (m, 2H), 3.69 (m, 6H), 3.62 (m, 2H), 3.41 (t, J=3.5Hz, 2H), 2.30 (m, 1H)
Jedinjenje 3
U suspenziju natrijum hidrida (55% u mineralnom ulju, 250mg, 5.7mmol) u tetrahidrofuranu (10mL) na 0°C se doda rastvor jedinjenja 2 (500mg, 2.85mmol) u tetrahidrofuranu (5mL). Dobijena mešavina se meša 1 sat. Dobijena mešavina se zatim zagreje do sobne temperature i meša se 2 sata. Doda se propargil bromid (80% u toluenu, 800µl, 7.12mmol) i, dobijena mešavina se meša na sobnoj temperaturi u toku 12 sati. Dodaju se rastvor amonijum hlorida (20mL) i dietiletar (30mL). Ovako dobijeni organski sloj se osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentriše pod sniženim pritiskom kako se dobija jedinjenje 3 (530mg, 86.6%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 4.21 (d, J=2.4Hz, 2H), 3.66-3.72 (m, 10H), 3.39 (t, J=5.1Hz, 2H), 2.43 (t, J=2.4Hz, 1H)
Jedinjenje 4
Rastvor jedinjenja 3 (250mg, 1.17mmol) u 3mL smešanog rastvora od tetrahidrofurana i destilovane vode (V:V=2:1) se polako obradi sa trifenil fosfinom (461mg, 1.75mmol) u tetrahidrofuranu (1mL) tokom 5 minuta. Dobijena mešavina se meša na sobnoj temperaturi. Kada je reakcija završena, dodaju se dietiletar (30mL) i destilovana voda (30mL). Dobijena smeša se zakiseli sa 1N HCl i, organski sloj odvoji. Vodeni sloj se razblaži sa dihlorometanom (50mL) i neutrališe sa 1N rastvorom NaOH. Ovako dobijeni organski sloj se odvoji, osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentriše pod sniženim pritiskom kako se dobija jedinjenje 4 (200mg, 91.3%) u svetlo žutoj boji.
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 4.18 (d, J= 2.4Hz, 2H), 3.59-3.69 (m, 8H), 3.48 (t, J=5.4Hz, 2H), 2.84 (s, 2H), 2.40 (m, 1H)
LCB14-0532
Rastvor jedinjenja 4 (195mg, 1.04mmol) u tetrahidrofuranu (4mL) se obradi sa trietilaminom (290µL, 2.08mmol). Doda se rastvor 4-hloro-7-nitrobenzofurazana (270mg, 1.35mmol) u tetrahidrofuranu (1mL). Dobijena mešavina se meša na sobnoj temperaturi 1 sat. Dodaju se etil acetat (50mL) i destilovana voda (50mL). Ovako dobijeni organski sloj se osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentriše pod sniženim pritiskom kako se dobija jedinjenje LCB 14-0532 (280mg, 77%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 8.50 (d, J= 8.4Hz, 1H), 6.99 (s, 1H), 6.19 (d, J=8.4Hz, 1H), 4.19 (d, J=2.4Hz, 2H), 3.89 (t, J=5.1Hz, 2H), 3.68-3.75 (m, 10H), 2.41 (t, J=2.4Hz, 1H)
2-11. Acetilen-linker-MMAF-OMe (LCB14-0536)
Jedinjenje A
U suspenziju NaH (55% u mineralnom ulju, 390mg, 16.25mmol) u tetrahidrofuranu (10mL) na 0°C i u atmosferi azota se postepeno doda rastvor trietilen glikola (4g, 26.63mmol) u tetrahidrofuranu (20mL). Postepeno se doda 80% propargil bromid u toluenu (1.97g, 13.31mmol). Dobijena mešavina se meša na istoj temperaturi u toku 2 sata. Kada je reakcija završena, dodaju se dihlorometan (100mL) i voda (100mL). Ovako dobijeni organski sloj se ukoncentriše i ostatak podvrgne hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje (A) (1g, 43%) u vodenoj formi.
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 4.21-4.20 (m, 2H), 3.74-3.66 (m, 10H), 3.62-3.61 (m, 2H), 2.43 (t, J=2.4Hz, 1H)
Jedinjenje B
U rastvor jedinjenja A (1g, 5.31mmol) u acetonu, u atmosferi azota i na -5°C, polako se doda 5.3mL Jones reagensa. Dobijena smeša, dok se postepeno zagreva do sobne temperature, meša se u toku 3 sata. Kada je reakcija završena, dodaju se etil acetat (100mL) i voda (100mL). Ovako dobijeni organski sloj se ukoncentriše kako se dobija jedinjenje (B) (886mg, 82%) u vidu žute tečnosti.
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 4.21 (d, J=2.4,2H), 4.18-4.17 (m, 2H), 3.78-3.77 (m, 2H), 3.74-3.70 (m, 6H), 2.44(t, J=2.4Hz, 1H)
LCB14-0536
U rastvor jedinjenja (A) (MMAF-OMe, 100mg, 0.13mmol) u acetonitrilu (2mL) na sobnoj temperaturi se doda jedinjenje (B) (27mg, 0.13mmol), PyBOP (104mg, 0.19mmol) i DIPEA (0.03mL, 0.19mmol). Dobijena mešavina se meša 12 sati. Kada je reakcija završena, dodaju se etil acetat (50mL) i voda (20mL). Ovako dobijeni organski sloj se ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni sa dihlorometanom i metanolom kako se dobija jedinjenje LCB14-0536 (82mg, 68%) u vidu čvrste materije žute boje.
EI-MS m/z: 930(M<+>)
2-12. Acetilen-linker(peptidna sekvenca)-MMAF-OMe (LCB14-0589)
Jedinjenje 1 (Fmoc-Val-Cit-PAB)
Fmoc-Val-Cit-OH je proizveden prema postupku opisanom u WO2007/008603. U rastvor Fmoc-Val-Cit-OH (4.89g, 9.85mmol) u dihlorometanu (50mL) i metanolu (20mL) u atmosferi azota se doda para-aminobenzilalkohol (2.43g,19.70mmol) i 1-etoksikarbonil-2-etoksi-1,2-dihidrohinolin (1.98g, 19.7mmol). Dobijena smeša je mešana u toku 12 sati na sobnoj temperaturi. Kada je reakcija završena, rastvarač se ukoncentriše. Dobijena čvrsta materija se više puta ispere sa dietiletrom kako se dobija jedinjenje 1 (4.12g, 70%) u vidu čvrste materije žute boje.
<1>H NMR (600MHz, DMSO-d6) δ 10.00 (s, 1H), 8.12 (d, J=7.8Hz, 1H), 7.89 (d, J=7.8Hz, 2H), 7.75-7.72 (m, 2H), 7.55(d, J=7.8Hz, 2H), 7.44-7.41(m, 2H), 7.33-7.31(m, 2H), 7.23(d, J=8.4Hz, 2H), 6.02(bs,1H), 5.41-5.38(m,2H), 5.09(bs, 1H), 4.42(bs,2H), 4.30-4.28(m, 1H), 4.24-4.23(m, 2H), 3.94-3.91(m, 1H), 3.02-2.99(m, 1H), 2.94-2.93(m, 1H), 2.00-1.99(m, 1H), 1.7(bs, 1H), 1.60(bs, 1H), 1.43(bs, 1H), 1.36(bs, 1H), 0.88-0.84(m, 6H)
Jedinjenje 2 (Fmoc-Val-Cit-PABC-PNA)
Rastvor jedinjenja 1 (2g, 3.32mmol) u DMF-u (8mL) je obrađen sa bis(4-nitrofenil) karbonatom (2.02g, 6.64mmol) zatim, diizopropiletilaminom (0.647mL, 4.98mmol) u atmosferi azota. Dobijena smeša je mešana u toku 12 sati na sobnoj temperaturi. Kada je reakcija završena, doda se dietil etar radi očvršćavanja. Nastala čvrsta materija se više puta ispere sa dietiletrom i vodom kako se dobija jedinjenje 2 (1.52g, 60%) u vidu čvrste materije žute boje.
<1>H NMR (600MHz, DMSO-d6) δ 10.19 (s, 1H), 8.31 (d, J=9.6Hz, 2H), 8.15 (d, J=7.8Hz, 1H), 7.89 (d, J=7.2Hz, 2H), 7.75-7.72(m, 2H), 7.66(d, J=8.4Hz, 2H), 7.57(d, J=9.0Hz, 2H), 7.43-7.39(m, 4H), 7.32(t, J=7.2Hz, 2H), 6.05-6.04(m,1H), 5.42(m, 2H), 5.24(s,2H), 4.42(m, 1H), 4.30-4.28(m, 1H), 425-4.23(m, 2H), 3.94-3.91(m, 1H), 3.01-3.00(m, 1H), 2.96-2.94(m, 1H), 2.00-1.99(m, 1H), 1.70(m, 1H), 1.59(m, 1H), 1.45(m, 1H), 1.37(m, 1H), 0.89-0.83(m, 6H).
EI-MS m/z: 767(M<+>)
Jedinjenje 3 (Fmoc-Val-Cit-PABC-MMAF-OMe)
Rastvor jedinjenja 2 (200mg, 0.261mmol) i MMAF-OMe (194mg, 0.261mmol) u DMF-u (2mL) se obradi sa HOBt (7.1mg, 0.052mmol), piridinom (1mL) i DIPEA (0.045mL, 0.261mmol). Dobijena smeša se meša na sobnoj temperaturi u toku 12 sati. Kada je reakcija završena, za ekstrakciju organskog sloja se upotrebe etil acetat (30mL), voda (30mL) i slani rastvor (30mL). Ovako dobijeni organski sloj se ukoncentriše i i podvrgne hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje 3 (153mg, 42%) u vidu čvrste materije žute boje.
EI-MS m/z: 1375(M<+>)
Jedinjenje 4 (Val-Cit-PABC-MMAF-OMe)
U rastvor jedinjenja 3 (153mg, 0.112mmol) u tetrahidrofuranu (5mL) na sobnoj temperaturi se doda piperidin (0.2mL). Dobijena smeša se meša na istoj temperaturi tokom 2 sata. Kada je reakcija završena, izvede se rekristalizacija sa etrom i heksanom kako se dobija jedinjenje 4 (85mg, 66%) u vidu čvrste materije svetlo žute boje.
EI-MS m/z: 1152(M<+>)
LCB14-0589 (acetilen linker-Val-Cit-PABC-MMAF-OMe)
U rastvor jedinjenja 4 (85mg, 0.074mmol) i jedinjenjaB iz Primera 2-11 (18mg, 0.088mmol) u DMF-u (2mL) se dodaju DIPEA (0.03mL, 0.148mmol) i PyBOP (58mg, 0.111mmol). Dobijena smeša se meša na sobnoj temperaturi u toku 5 sati. Kada je reakcija završena, izvede se ekstrakcija sa etil acetatom (20mL) i vodom (20mL). Dobijeni sirovi proizvod se podvrgne hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje LCB14-0589 (35.4mg, 36%) u vidu čvrste materije bele boje.
EI-MS m/z: 1336(M<+>)
2-13. Acetilen-linker -Val-Cit-PABC- MMAE (LCB14-0602)
Jedinjenje 2 (Fmoc-Val-Cit-PABC-MMAE)
U rastvor Fmoc-Val-Cit-PABC-PNP (200mg, 0.261mmol) i MMAE (187mg, 0.261mmol) u DMF-u (2mL) se doda HOBt (7.1mg, 0.052mmol), piridin (1mL) i DIPEA (0.045mL, 0.261mmol). Dobijena smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom 12 sati. Kada je reakcija završena, za ekstrakciju organskog sloja se upotrebe etil acetat (30mL), voda (30mL) i slani rastvor (30mL). Ovako dobijeni organski sloj se ukoncentriše i podvrgne hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje 2 (50mg, 14.3%) u vidu čvrste materije žute boje.
EI-MS m/z: 1346(M<+>)
Jedinjenje 3 (Val-Cit-PABC-MMAE)
U rastvor jedinjenja 2 (50mg, 0.037mmol) u tetrahidrofuranu (5mL) na sobnoj temperaturi se doda piperidin (0.1mL). Dobijena smeša se meša na istoj temperaturi tokom 2 sata. Kada je reakcija završena, izvede se rekristalizacija sa etrom i heksanom kako se dobija jedinjenje 3 (37mg, 89%) u vidu čvrste materije svetlo žute boje.
EI-MS m/z: 1124(M<+>)
LCB14-0602 (Acetylene linker-Val-Cit-PABC-MMAE)
U rastvor jedinjenja 3 (35mg, 0.031mmol) i jedinjenja B iz Primera 2-11 (7.6mg, 0.037mmol) u DMF-u (2mL), na sobnoj temperaturi, doda se DIPEA (0.011mL, 0.062mmol) i PyBOP (24mg, 0.47mmol). Dobijena smeša se meša u toku 5 sati. Kada je reakcija završena, izvede se ekstrakcija sa etil acetatom (20mL) i vodom (20mL). Dobijeni sirovi proizvod se podvrgne hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje LCB14-0602 (28.5mg, 70%) u vidu čvrste materije bele boje.
EI-MS m/z: 1308(M<+>)
2-14. Azid linker-PBD(pirolobenzodiazepin) dimer (LCB14-0577)
Jedinjenje 2
U rastvor jedinjenja 1 (1.22g, 7.08mmol), trifenilfosfina (TPP, 2.23g, 8.50mmol) i heksaetilen glikola (2g, 7.08mmol) u tetrahidrofuranu (10mL) na 0°C u atmosferi azota se doda diizopropilazodikarbonat (DIAD, 1.67mL, 8.50mmol). Dobijena smeša se meša u toku 1 sata. Kada je reakcija završena, dodaju se etil acetat (50mL) i destilovana voda (50mL). Ovako dobijeni organski sloj se osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje 2 (1.4g, 45%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 7.35 (d, J= 8.4Hz, 2H), 6.80 (d, J= 8.4Hz, 2H), 4.09 (t, J= 4.8Hz, 2H), 3.84 (t, J= 4.8Hz, 2H), 3.72(t, J= 4.8Hz, 4H), 3.68~3.65 (m, 14H), 3.60 (t, J= 4.8Hz, 2H), 2.85 (bs, 1H)
Jedinjenje 3
U rastvor jedinjenja 2 (300mg, 0.68mmol) u 1,4-dioksanu (5mL) se, jedno za drugim, dodaju kalijum acetat (200mg, 2.04mmol), PdCl2(dppf) (28mg, 0.034mmol) i bis(pinakolato) diboron (174mg, 0.68mmol). Dobijena smeša se meša na 70°C tokom 12 sati. Kada je reakcija završena, dodaju se etil acetat (50mL) i destilovana voda (50mL). Ovako dobijeni organski sloj se osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje 3 (300mg, 90%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 7.73 (d, J= 8.4Hz, 2H), 6.90 (d, J= 8.4Hz, 2H), 4.15 (t, J= 4.8Hz, 2H), 3.86 (t, J= 4.8Hz, 2H), 3.73~3.72 (m, 4H), 3.68~3.64 (m, 14H), 3.60 (t, J= 4.8Hz, 2H), 1.33 (s, 12H)
Jedinjenje 4
Jedinjenje 4 je proizvedeno prema postupcima, koji su opisani u WO2006/111759 A1, WO2010/043880 A1 i WO2010/010347 A1.
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 7.35 (s, 1H), 7.29 (d, J= 9Hz, 2H), 7.27 (s, 1H), 7.23 (s, 1H), 7.17 (s, 1H), 6.89 (d, J= 9Hz, 2H), 6.77 (s, 1H), 6.75 (s, 1H), 5.91 (m, 2H), 5.23 (d, J= 9Hz, 2H), 5.21 (d, J= 9Hz, 2H), 4.29 (m, 2H), 4.17~4.13 (m, 4H), 3.96~3.91 (m, 8H), 3.82 (s, 3H), 3.33 (m, 2H), 2.82 (m, 2H), 2.44 (m, 2H), 0.90(2s, 18H), 0.27 (2s, 12H)
Jedinjenje 5
Jedinjenje 4 (83mg, 0.059mmol), natrijum karbonat (10mg, 0.089mmol) i Pd(TPP)4(3.4mg, 0.003mmol) se, jedno po jedno, rastvore u smešanom rastvaraču etanol/toluen/destilovana voda (0.3mL/0.3mL/0.3mL). Doda se rastvor jedinjenja 3 (31.6mg, 0.065mmol) u toluenu (3mL). Dobijena mešavina se meša na sobnoj temperaturi u toku 1 sata. Kada je reakcija završena, dodaju se etil acetat (50mL) i destilovana voda (50mL). Ovako dobijeni organski sloj se osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje 5 (79mg, 74%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 7.35 (m 2H), 7.31~7.27 (m, 6H), 6.92~6.89 (m, 4H), 6.78 (s, 2H), 5.90 (d, J= 9Hz, 2H), 5.23 (d, J= 12.6Hz, 2H), 4.30 (m, 2H), 4.16~4.13 (m, 6H), 3.97~3.94 (m, 8H), 3.87 (t, J= 4.8Hz, 2H), 3.83 (s, 3H), 3.74~3.64 (m, 18H), 3.61 (m, 2H), 3.34 (m 2H), 2.82 (m, 2H), 2.45 (m, 2H), 0.90 (s, 18H), 0.25 (2s, 12H)
Jedinjenje 6
U rastvor jedinjenja 5 (250mg, 0.155mmol) u tetrahidrofuranu (3mL) na 0°C se dodaju 4-metilmorfolin (34.2µL, 0.310mmol) i metan sulfonski anhidrid (Ms2O, 32.5mg, 0.186mmol). Dobijena mešavina se meša na sobnoj temperaturi u toku 3 sata. Kada je reakcija završena, dodaju se etil acetat (50mL) i destilovana voda (50mL). Ovako dobijeni organski sloj se osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje 6 (220mg, 84%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 7.33 (m, 2H), 7.28~7.23 (m, 6H), 6.89~6.86 (m, 4H), 6.76 (s, 2H), 5.88 (d, J= 9Hz, 2H), 5.21 (d, J= 12.6Hz, 2H), 4.35 (m , 2H), 4.26 (m, 2H), 4.13~4.11 (m 6H), 3.92 (s, 6H), 3.84 (t, J= 4.8Hz, 2H), 3.80 (s, 3H), 3.74~3.60 (m, 20H), 3,31 (m, 2H), 3.06 (s, 3H), 2.80 (m, 2H), 2.43 (m, 2H), 0.88 (s, 18H), 0.23(2s, 12H)
Jedinjenje 7
U rastvor jedinjenja 6 (100mg, 0.059mmol) u dimetilformamidu (2mL) se doda natrijum azid (NaN3, 4.6mg, 0.071mmol). Dobijena mešavina se meša na 55°C u toku 4 sata. Kada je reakcija završena, dodaju se etil acetat (50mL) i destilovana voda (50mL). Ovako dobijeni organski sloj se osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje 7 (85mg, 88%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 7.33 (bs, 2H), 7.28~7.24 (m, 6H), 6.89~6.87 (m, 4H), 6.76 (s, 2H), 5.88 (d, J= 9Hz, 2H), 5.21 (d, J= 12.6Hz, 2H), 4.26 (m, 2H), 4.13~4.11 (m, 6H), 3.92 (m, 8H), 3.84 (t, J= 4.8Hz, 2H), 3.80 (s, 3H), 3.71 (m, 2H), 3.67~3.64 (m, 16H), 3.36 (t, J= 4.8Hz, 2H), 3.31 (m, 2H), 2.80 (m, 2H), 2.43 (m, 2H), 0.88 (s, 18H), 0.23 (2s, 12H)
LCB14-0577
U rastvor jedinjenja 7 (80mg, 0.049mmol) u tetrahidrofuranu (1.5mL) dodaju se 1N-amonijum acetat (1mL) i 10% par kadmijum/olovo (120mg). Dobijena mešavina se meša na sobnoj temperaturi u toku 4 sata. Kada je reakcija završena, dodaju se dihlorometan (50mL) i destilovana voda (50mL). Ovako dobijeni organski sloj se osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje LCB 14-0577 (9mg, 18%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 7.86 (d, J= 4.2Hz, 2H), 7.36 (m, 2H), 7.31~7.23 (m, 6H), 6.89~6.80 (m, 6H), 4.34~4.22 (m, 6H), 4.11(m, 2H), 3.92 (m, 6H), 3.84~3.77(m, 5H), 3.71 (m, 2H), 3.67~3.63 (, 18H), 3.36 (m, 2H), 3.03 (m, 2H), 2.44~2.40 (m, 2H)
EI-MS m/z: 1017(M<+>)
2-15. Acetilen-linker-PBD dimer (LCB14-0578)
Jedinjenje 2
U rastvor jedinjenja 6 iz Primera 2-14 (95mg, 0.056mmol) u acetonitrilu (1mL) se doda rastvor natrijum karbonata (18mg, 0.168mmol) u propargil aminu (18µL, 0.28mmol) i destilovana voda (500µL). Dobijena smeša se meša na 40°C u toku 12 sati. Kada je reakcija završena, dodaju se etil acetat (50mL) i destilovana voda (50mL). Ovako dobijeni organski sloj se osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje 2 (45mg, 48%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 7.35 (m, 2H), 7.30~7.27 (m, 6H), 6.91~6.89 (m, 4H), 6.78 (s, 2H), 5.91 (d, J= 9Hz, 2H), 5.23 (d, J= 11.4Hz, 2H), 4.30 (m, 2H), 4.16~4.11 (m, 6H), 3.94 (s, 6H), 3.87 (t, J= 4.8Hz, 2H), 3.83 (s, 3H), 3.73 (m, 2H), 3.69~3.60 (m 18H), 3.45 (d, J= 2.4Hz, 2H), 3.33 (m, 2H), 2.87 (t, J= 4.8Hz, 2H), 2.82 (m, 2H), 2.45 (m, 2H), 2.22 (t, J= 4.4Hz, 1H), 0.90 (s, 18H), 0.24 (2s, 12H)
LCB14-0578
U rastvor jedinjenja 2 (40mg, 0.024mmol) u tetrahidrofuranu (750µL) se dodaju 1N-amonijum acetat (0.5mL) i 10% para kadmijum/olovo (70mg). Dobijena mešavina se meša na sobnoj temperaturi 4 sata. Kada je reakcija završena, dodaju se dihlorometan (50mL) i destilovana voda (50mL). Ovako dobijeni organski sloj se osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje LCB14-0578 (13mg, 52%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 7.88 (d, J= 4.2Hz, 2H), 7.38 (m, 2H), 7.33-7.28 (m, 6H), 6.91-6.86 (m, 6H), 4.38-4.20 (m, 6H), 4.13 (m 2H), 3.94 (s, 6H), 3.88-3.80 (m, 5H), 3.73 (m, 2H), 3.69-3.61 (m, 16H), 3.46 (d, J= 2.4Hz, 2H), 3.39(m, 2H), 3.30 (m, 2H), 2.88 (t, J= 4.8Hz, 2H), 2.43 (m, 2H), 2.23 (t, J= 4.4Hz, 1H))
EI-MS m/z: 1028(M<+>)
2-16. Acetilen-linker-PBD dimer(piridinska verzija) (LCB14-0582)
Jedinjenje 2
U suspenziju NaH (55% u mineralnom ulju, 184mg, 4.22mmol) u tetrahidrofuranu (5mL) na 0°C i u atmosferi azota se doda heksaetilenglikol (2.4g, 8.44mmol) u tetrahidrofuranu (3mL). Dobijena smeša se meša 10 minuta na 0°C. Postepeno se doda smešani rastvor, proizveden rastvaranjem jedinjenja 1 (1g, 4.22mmol) u dimetilformamidu (0.5mL) i tetrahidrofuranu (0.5mL). Dobijena mešavina se meša na sobnoj temperaturi 1 sat i zatim, meša se na 70°C u toku 12 sati. Nakon hlađenja dobijene mešavine na 0°C, doda se destilovana voda (2mL). Kada je reakcija završena, dodaju se etil acetat (100mL) i destilovana voda (100mL). Ovako dobijeni organski sloj se osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni kako bi se dobilo jedinjenje 2 (1.5g, 81%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 8.13(d, J= 2.4Hz, 1H), 7.61 (dd, J= 8.4, 2.4Hz, 1H), 6.67 (d, J= 9Hz, 1H), 4.41 (m, 2H), 3.81 (m, 2H), 3.70~3.61 (m, 18H), 3.58 (m, 2H), 2.71 (bs, 1H)
Jedinjenje 3
Rastvor jedinjenja 2 (500mg, 1.14mmol) u dimetilformamidu (5mL) se tretira, sa jednim po jednim, kalijum acetatom (336mg, 3.42mmol), PdCl2(dppf) (46.5mg, 0.057mmol) i bis(pinakolato)diboronom (318mg, 1.25mmol). Dobijena mešavina se meša na 70°C tokom 12 sati. Kada je reakcija završena, dodaju se etil acetat (100mL) i destilovana voda (50mL). Ovako dobijeni organski sloj se osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni kako bi se dobilo jedinjenje 3 (250mg, 45%).
<1>H NMR (400MHz, CDCl3) δ 8.50 (s, 1H), 7.90 (d, J= 8.4Hz, 1H), 6.74 (d, J= 8.4Hz, 1H), 4.50 (t, J= 4.8Hz, 2H), 3.84 (m, 2H), 3.74-3.70 (m, 20H), 1.33 (s, 12H)
Jedinjenje 5
Jedinjenje 4 (245mg, 0.175mmol), natrijum karbonat (28mg, 0.262mmol) i Pd(TPP)4(10mg, 0.009mmol) se, jedno po jedno, rastvore u smešanom rastvoru etanol/toluen/destilovana voda (1.5mL/1.5mL/1.5mL). Doda se rastvor jedinjenja 3 (94mg, 0.192mmol) u toluenu (1.5mL). Dobijena mešavina se meša na sobnoj temperaturi tokom 12 sati. Kada je reakcija završena, dodaju se etil acetat (100mL) i destilovana voda (100mL). Ovako dobijeni organski sloj se osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentriše se pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni kako bi se dobilo jedinjenje 5 (100mg, 35.5%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 8.02 (d, J= 2.4Hz, 1H), 7.66 (m, 1H), 7.38(s, 1H), 7.35 (s, 1H), 7.29 (d, J= 9Hz, 2H), 7.27 (m, 2H), 6.89 (d, J= 9Hz, 2H), 6.80 (d, J= 8.4Hz, 1H), 6.78 (s, 2H), 5.90 (d, J= 9Hz, 2H), 5.23 (dd, J= 11.4, 4.2Hz, 2H), 4.47 (m, 2H), 4.29 (m, 2H), 4.17~4.12(m, 2H), 3.4 (m, 8H), 3.86 (t, J= 4.8Hz, 2H), 3.82 (m, 4H), 3.74~3.65 (m, 18H), 3.61(m, 2H), 3.33(m, 2H), 2.83 (m, 2H), 2.45 (m, 2H), 0.90 (s, 18H), 0.25 (2s, 12H)
Jedinjenje 6
U rastvor jedinjenja 5 (180mg, 0.11mM) u tetrahidrofuranu (3ml) na 0°C se doda 4-metilmorfolin (NMM, 61.5µL, 0.55mM) i metan sulfonski anhidrid (Ms2O, 22mg, 0.121mM). Dobijena mešavina se meša na sobnoj temperaturi tokom 3 sata. Kada je reakcija završena, dodaju se etil acetat (50ml) i destilovana voda (50ml) da bi se organski sloj ekstrahovao. Organski sloj se osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentriše se pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni kako bi se pripremilo jedinjenje 6 (80mg, 43%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 8.03 (d, J= 2.4Hz, 1H), 7.66 (dd, J= 7.8, 2.4Hz, 1H), 7.38 (s, 1H), 7.35 (s, 1H), 7.30 (d, J= 9Hz, 2H), 7.27 (m, 2H), 6.89 (d, J= 9Hz, 2H), 6.80 (d, , J= 9Hz, 1H), 6.78 (s, 2H), 5.90 (d, J= 9Hz, 2H), 5.22 (dd, J= 12, 4.2Hz, 2H), 4.47 (m, 2H), 4.38 (m, 2H), 4.30 (m, 2H), 4.15 (m, 3H), 3.99~3.93 (m, 7H), 3.86 (m, 2H), 3.83 (s, 3H), 3.76 (m, 2H), 3.71 (m, 2H), 3.69~3.63 (m, 16H), 3.34 (m, 2H), 3.08 (s, 3H), 2.83 (m, 2H), 2.45 (m, 2H), 0.90 (2s, 18H), 0.25 (2s, 12H)
Jedinjenje 7
U rastvor jedinjenja 6 (80mg, 0.047mmol) u acetonitrilu (4mL) se doda rastvor natrijum karbonata (20mg, 0.141mmol) u propargilaminu (30µL, 0.47mmol) i destilovana voda (500µL). Dobijena mešavina se meša na 50°C u toku 12 sati. Kada je reakcija završena, dodaju se etil acetat (50mL) i destilovana voda (50mL). Ovako dobijeni organski sloj se osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentriše se pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni kako bi se dobilo jedinjenje 7 (25mg, 32%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 8.03 (d, J= 1.8Hz, 1H), 7.66 (dd, J= 8.4, 2.4Hz, 1H), 7.38 (s, 1H), 7.35 (s, 1H), 7.30 (d, J= 8.4Hz, 2H), 7.28 (m, 2H), 6.89 (d, J= 9Hz, 2H), 6.79 (d, J= 9Hz, 1H), 6.78 (s, 2H), ), 5.90 (d, J= 9Hz, 2H), 5.22 (dd, J= 12, 4.2Hz, 2H), 4.47 (m, 2H), 4.30 (m, 2H), 4.17~4.14 (m, 3H), 3.98~3.93 (m, 7H), 3.86 (m, 2H), 3.82 (s, 3H), 3.72 (m, 2H), 3.69~3.60 (m, 18H), 3.45 (d, J= 2.4Hz, 2H), 3.34 (m, 2H), 2.87 (t, J= 4.8Hz, 2H), 2.83 (m, 2H), 2.45 (m, 2H), 2.22 (m, 1H), 0.90 (2s, 18H), 0.25 (2s, 12H)
LCB14-0582
U rastvor jedinjenja 7 (25mg, 0.015mmol) u tetrahidrofuranu (750µL) se doda 1N-amonijum acetat (0.5mL) i 10% para kadmijum/olovo (50mg). Dobijena smeša se meša na sobnoj temperaturi u toku 3 sata. Kada je reakcija završena, dodaju se dimetilhlorometan (50mL) i destilovana voda (50mL). Ovako dobijeni organski sloj se osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentriše se pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni kako bi se dobilo jedinjenje LCB14-0582 (6mg, 38.4%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 8.00 (m, 1H), 7.88 (m, 2H), 7.60 (m, 1H), 7.41~7.28 (m, 6H), 6.90~6.71 (m, 5H), 4.46 (m, 2H), 4.35~4.24 (m, 4H), 3.95~3.79 (m, 11H), 3.70 (m, 2H), 3.68~3.61 (m, 18H), 3.47 (m, 2H), 3.38 (m, 2H), 3.04 (m, 2H), 2.89 (t, J= 5.4Hz, 2H), 2.40 (m, 2H), 2.23 (bs, 1H)
EI-MS m/z: 1029(M<+>)
2-17. Amino-Peg5-PBD dimer (LCB14-0594)
Jedinjenje 1
U rastvor jedinjenja 5 iz Primera 2-14 (456mg, 0.284mmol) u tetrahidrofuranu se dodaju trifenilfosfin (108mg, 0.411mmol) i ftalimid (50mg, 0.341mmol). DIAD (0.058mL, 0.340mmol) se polako doda na 0°C. Dobijena smeša se meša na sobnoj temperaturi u toku 2 sata. Kada je reakcija završena, izvede se ekstrakcija sa dihlorometanom (40mL) i vodom (40mL). Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje 1 (492mg, kvantitativno) u vidu čvrste materije žute boje.
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 7.84-7.82 (m, 2H), 7.70-7.69 (m, 2H), 7.34 (m, 2H), 7.29-7.25 (m, 6H), 6.90(d, J=7.2, 4H), 6.78(s, 2H), 5.92(d, J=9.0, 2H), 5.21(d, J=12.6, 2H), 4.28(m, 2H),4.19-4.10(m, 4H), 3.93(m, 6H), 3.89-3.87(m, 2H), 3.86-3.84(m, 2H), 3.82(s, 3H), 3.74-3.71 (m, 4H), 3.67-3.66(m, 2H), 3.63-3.62(m, 6H), 3.59-3.58(m, 6H), 3.33(m, 2H), 2.85-2.82(m, 2H), 2.42(m, 2H), 0.91(s, 18H), 0.27(2s, 12H)
Jedinjenje 2
U rastvor jedinjenja 1 (492mg, 0.283mmol) u etil alkoholu (2mL) i tetrahidrofuranu (2mL) se doda hidrazin monohidrat (0.07mL, 1.417mmol). Dobijena smeša se meša na 60°C tokom 5 sati. Kada je reakcija završena, 2mL etil acetata se doda. Čvrsta materija se odfiltrira. Filtrat se ukoncentriše i podvrgne hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje 2 (380mg, 83%) u vidu čvrste materije žute boje.
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 7.35 (bs, 2H), 7.29-7.26 (m, 6H), 6.92-6.88 (m, 4H), 6.79 (bs, 2H), 5.92 (d, J=8.4, 2H), 5.21 (d, J=12, 2H), 4.29-4.28 (m, 2H), 4.19-4.17 (m, 6H), 3.93-3.90(m, 6H), 3.89-3.87 (m, 2H), 3.82(s, 3H), 3.75-3.73 (m, 2H), 3.69-3.63 (m, 12H), 3.35-3.31 (m, 2H), 2.96 (bs, 2H), 2.85 (d, J=16.8, 2H), 2.43 (m, 2H), 0.91 (s, 18H), 0.27 (2s, 12H).
EI-MS m/z: 1606(M<+>)
LCB 14-0594
Rastvor jedinjenja 2 (25mg, 0.015mmol) u tetrahidrofuranu (1mL) na sobnoj temperaturi se doda u amonijum acetat (0.4mL) i 10% para kadmijum/olovo (40mg). Dobijena mešavina se meša na istoj temperaturi u toku 12 sati. Kada je reakcija završena, dobijena smeša se filtrira sa dihlorometanom. Filtrirani rastvor se ukoncentriše i podvrgne hromatografiji na koloni kako se dobija LCB 14-0594 (4mg, 26%) u vidu čvrste materije žute boje.
EI-MS m/z: 990(M<+>)
2-18. Glcukuronid-linker-PBD monomer (LCB14-0596)
Jedinjenje (B)
U rastvor jedinjenja (A) (300mg, 0.57mmol) u tetrahidrofuranu (5mL) na sobnoj temperaturi se doda N-metilmorfolin (0.16mL, 1.43mmol) i metansulfonski anhidrid (120mg, 0.69mmol). Dobijena mešavina se meša 4 sata. Dodaju se etil acetat (100mL) i voda (50mL). Ovako dobijeni organski sloj se ukoncentriše se pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni uz etil acetat i heksan kako se dobija jedinjenje (B) (330mg, 96%).<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ: 7.53(s, 1H), 7.40(s, 1H), 7.39-7.37(m, 2H), 7.33(t, J = 1.8Hz, 1H), 6.90-6.89(m, 2H), 5.47(d, J = 10.2Hz, 1H), 4.81(d, J = 10.2Hz, 1H), 4.62(dd, J = 7.2, 3.0Hz, 1H), 4.49-4.41(m, 2H), 3.97-3.93(m, 1H), 3.92(s, 3H), 3.83(s, 3H), 3.76-3.72(m, 1H), 3.68-3.64(m, 1H), 3.17-3.10(m, 3H), 2.96(s, 3H), 0.98(t, J = 8.4Hz, 2H), 0.02(s, 9H).
EI-MS m/z: 603(M<+>)
Jedinjenje (C)
U rastvor jedinjenja (B) (330mg, 0.55mmol) u DMF-u (3mL) na sobnoj temperaturi se doda natrijum azid (43mg, 0.66mmol). Dobijena mešavina se meša na 60°C u toku 3 sata. Dodaju se etil acetat (100mL) i voda (50mL). Ovako dobijeni organski sloj se ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni uz etil acetat i heksan kako se dobija jedinjenje (C) (307mg, 99%) u vidu čvrste materije žute boje.
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ: 7.54(s, 1H), 7.38-7.37(m, 3H), 7.34(t, J = 1.8Hz, 1H), 6.90-6.88(m, 2H), 5.49(d, J = 10.2Hz, 1H), 4.76(d, J = 10.2Hz, 1H), 4.63(dd, J = 7.2, 3.0Hz, 1H), 3.96-3.93(m, 1H), 3.92(s, 3H), 3.83(s, 3H), 3.79-3.75(m, 1H), 3.69-3.65(m, 1H), 3.52-3.50(m, 2H), 3.16-3.12(m, 1H), 3.03-2.99(m, 1H), 2.96-2.91(m, 1H), 0.99(t, J = 8.4Hz, 2H), 0.02(s, 9H). EI-MS m/z: 550(M<+>)
Jedinjenje (1-1)
U rastvor jedinjenja (C) (500mg, 0.91mmol) u tetrahidrofuranu (2mL) i destilovanoj vodi (0.5mL) na sobnoj temperaturi se doda trifenilfosfin (285mg, 1.09mmol). Dobijena smeša se meša na 40°C u toku 13 sati. Dodaju se etil acetat (200mL) i voda (100mL). Ovako dobijeni organski sloj se ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni uz etil acetat i heksan kako se dobija jedinjenje (1-1) (435mg, 93%) u vidu čvrste materije žute boje.
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ: 7.50(s, 1H), 7.38-7.36(m, 3H), 7.33(t, J = 1.8Hz, 1H), 6.90-6.88(m, 2H), 5.47(d, J = 9.6Hz, 1H), 4.81(d, J = 9.6Hz, 1H), 4.67(dd, J = 7.2, 3.0Hz, 1H), 3.95-3.92(m, 1H), 3.91(s, 3H), 3.83(s, 3H), 3.76-3.72(m, 1H), 3.68-3.64(m, 1H), 3.15-3.10(m, 2H), 3.06-2.96(m, 2H), 2.94-2.88(m, 1H), 2.86-2.80(m, 1H), 0.98(t, J = 8.4Hz, 2H), 0.02(s, 9H).
EI-MS m/z: 524(M<+>)
Jedinjenje 3
U rastvor jedinjenja 7 iz Primera 2-4 (126mg, 0.190mmol) i jedinjenja (1-1) (100mg, 0.190mmol) u dimetilformamidu (3mL) se doda trietilamin (TEA, 80µL, 0.57mmol). Dobijena mešavina se meša na sobnoj temperaturi tokom 3 hours. Kada je reakcija završena, dodaju se etil acetat (100mL) i destilovana voda (100mL). Ovako dobijeni organski sloj se osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentriše se pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje 3 (178mg, 89%).
<1>H NMR (400MHz, CDCl3) δ 7.46 (s, 1H), 7.37 (d, J= 8.8Hz, 2H), 7.34 (m, 2H), 7.22 (m, 1H), 6.87 (d, J= 8.8Hz, 2H), 6.71(d, J= 2.0Hz, 1H), 6.60 (m, 1H), 5.44 (d, J= 10.4Hz, 1H), 5.34 (m, 2H), 5.27 (m, 1H), 5.16 (d, J= 7.6Hz, 1H), 5.07 (s, 2H), 4.82~4.77 (m, 2H), 4.68 (d, J= 2.0Hz, 2H), 4.60 (m, 1H), 4.19 (d, J= 9.2Hz, 1H), 3.93 (m, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.82 (s, 3H), 3.72~3.61 (m, 5H), 3.45 (m, 2H), 3.11 (m, 1H), 2.93~2.84 (m, 2H), 2.51 (bs, 1H), 2.05 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 0.97 (t, J= 7.2Hz, 2H), 0.01 (s, 9H)
Jedinjenje 4
U rastvor jedinjenja 3 (100mg, 0.094mmol) u metanolu (5mL) na 0°C se doda litijum hidroksid (40mg, 1.880mmol) u destilovanoj vodi (2mL). Dobijena smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom 3 sata. Pošto je reakcija završena, metanol se uklanja pod sniženim pritiskom. Ostatak se razblaži sa destilovanom vodom (50mL) i postepeno zakiseli sa sirćetnom kiselinom do pH = 3. Ekstrakcija se izvodi tri puta sa dihlorometanom (3 x 50mL). Dobijeni proizvod se ukoncentriše pod sniženim pritiskom kako bi se dobilo jedinjenje u čvrstom stanju. Jedinjenje u čvrstom stanju se ispere sa dietiletrom (50mL) kako se dobija jedinjenje 4 (86.5mg, 100%).<1>H NMR (600MHz, CD3OD) δ 7.43 (s, 1H), 7.41 (d, J= 9Hz, 2H), 7.30 (d, J= 10.2Hz, 2H), 7.14 (d, J= 7.8Hz, 1H), 6.90 (d, J= 9Hz, 2H), 6.86 (m, 1H), 6.66 (m, 1H), 5.22 (m, 2H), 4.98~4.94 (m, 3H), 4.71~4.67 (m, 3H), 3.96 (m, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.78 (s, 3H), 3.75 (m, 1H), 3.59~3.47 (m, 5H), 3.36 (m, 2H), 3.25 (m, 1H), 3.13 (m, 1H), 2.90 (bs, 1H), 2.85 (m, 2H), 0.83 (m, 2H), 0.01 (s, 9H)
EI-MS m/z: 904(M<+>)
LCB14-0596
U rastvor jedinjenja 4 (86.5mg, 0.094mmol) u tetrahidrofuranu (1mL) i etanolu (1mL) na 0°C se doda litijum borohidrid 2M-tetrahidrofuranski rastvor (940µL, 1.88mmol). Dobijena mešavina se meša na sobnoj temperaturi u toku 12 sati. Doda se još litijum borohidrida 2M-tetrahidrofuranskog rastvora (1.41mL, 2.82mmol). Dobijena smeša se meša tokom 5 sati i ohladi se na 0°C. Reakciona smeša se ugasi dodatkom 1% rastvorom mravlje kiseline (33mL).
Dobijena mešavina se meša 3 sata. Kada je reakcija završena, izvede se ekstrakcija sa destilovanom vodom (50mL) i rastvorom mešavine etil acetata (20mL) i metanola (10mL). Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni uz primenu hloroform/metanol/mravlje kiseline V:V:V=9:1:0.05) kako se dobija jedinjenje LCB14-0596 (50mg, 69%).
EI-MS m/z: 756(M<+>)
2-19. Glukuronidni linker-PBD dimer (LCB14-0597)
Jedinjenje 3
U rastvor jedinjenja 7 iz Primera 2-4 (150mg, 0.220mmol) i jedinjenja 2 iz Primera 2-17 (365mg, 0.220mmol) u dimetilformamidu (3mL) se doda trietilamin (95µL, 0.66mmol). Dobijena smeša se meša na sobnoj temperaturi u toku 2 sata. Kada se reakcija završi, dodaju se etil acetat (100mL) i destilovana voda (100mL). Ovako dobijen organski sloj se osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje 3 (310mg, 64%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 7.35 (m, 2H), 7.30~7.25 (m, 7H), 6.90 (m, 4H), 6.78 (s, 2H), 6.73 (d, J= 2.4Hz, 1H), 6.60 (dd, 8.4, 1.8Hz, 1H), 5.90 (d, J= 2.4Hz, 2H), 5.36~5.32 (m, 2H), 5.27 (m, 2H), 5.22 (m, 2H), 5.13 (d, J= 7.2Hz, 1H), 5.09 (s, 2H), 4.69 (d, J= 2.4Hz, 2H), 4.29 (m 2H), 4.17~4.13 (m, 6H), 3.94 (m, 8H), 3.85 (t, J= 4.8Hz, 2H), 3.82 (s, 3H), 3.73 (s, 3H), 3.71 (m, 2H), 3.67~3.59 (m, 14H), 3.54 (t, J= 4.8Hz, 2H), 3.39~3.31 (m, 4H), 2.82 (m, 2H), 2.52 (t, J= 2.4Hz, 1H), 2.44 (m, 2H), 2.06 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 0.91 (s, 18H), 0.26 (2s , 12H)
Jedinjenje 4
U rastvor jedinjenja 3 (100mg, 0.047mmol) u metanolu (3mL) i tetrahidrofuranu (1.5mL) na 0°C doda se litijum hidroksid (20mg, 0.47mmol) u destilovanoj vodi (1.5mL). Dobijena smeša se meša na sobnoj temperaturi u toku 3 sata. Kada se reakcija završi, organski rastvarač se ukloni pod sniženim pritiskom. Ostatak se razblaži sa destilovanom vodom (50mL) i postepeno zakiseli sa 0.5N rastvorom HCl do pH = 3. Ekstrahovanje se izvodi tri puta sa dihlorometanom (3 x 50mL). Ekstrakt se ukoncentriše pod sniženim pritiskom kako se dobija jedinjenje 4 (93.4mg, 100%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 7.35 (m, 2H), 7.30~7.24 (m, 7H), 4.89 (m, 4H), 6.78 (m, 3H), 6.64 (m, 1H), 5.91 (m, 2H), 5.65 (m, 1H), 5.21 (m, 2H), 5.07 (m, 2H), 4.89 (m, 1H), 4.67 (m, 2H), 4.28 (m, 2H), 4.18~4.12 (m, 6H), 3.93 (m, 8H), 3.85~3.82 (m, 5H), 3.72 (m, 2H), 3.65~3.54 (m, 20H), 3.34~3.32 (m, 4H), 2.82 (m, 2H), 2.56 (m, 1H), 2.44 (m, 2H), 0.90 (2s, 18H), 0.25 (2s, 12H)
LCB 14-0597
U rastvor jedinjenja 4 (90mg, 0.045mmol) u tetrahidrofuranu (1.5mL) se dodaju 1N-amonijum acetat (1.2mL) i 10% para kadmijum/olovo (120mg). Dobijena smeša se meša na sobnoj temperaturi u toku 3 sata. Kada se reakcija završi, dodaju se etil acetat (50mL) i destilovana voda (50mL). Ovako dobijen organski sloj se osuši sa anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje LCB14-0597 (16.4mg, 26%).
EI-MS m/z: 1371(M<+>)
2-20. Amino-Pegl-PBD dimer (LCB14-0599)
Jedinjenje 1
U rastvor 4-bromofenola (4.0g, 23.1mmol) u etanolu (18mL) na sobnoj temperaturi se dodaju natrijum hidroksid (1.0g, 25.40mmol) i 2-bromoetanol (1.7mL, 23.10mmol). Dodaju se etil acetat (500mL) i voda (200mL). Ovako dobijeni organski sloj se ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni uz etil acetat i heksan kako se dobija jedinjenje 1 (4.3g, 86%) u tečnoj formi.
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ: 7.39-7.36(m, 2H), 6.81-6.78(m, 2H), 4.05-4.03(m, 2H), 3.95(t, J = 4.2Hz, 2H), 2.18(bs, 1H).
Jedinjenje 2
U rastvor jedinjenja 1 (0.3g, 1.38mmol) u 1,4-dioksanu (10mL) na sobnoj temperaturi se dodaju bis(pinakolato)diboron (0.35g, 1.38mmol), kalijum acetat (0.41g, 4.14mmol) i PdCl2(dppf) (56mg, 0.07mmol). Dobijena mešavina se meša na 70C°C u toku 12 sati i zatim, ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Filtracija se izvede sa etil acetatom. Filtrirani rastvor se ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni uz etil acetat i heksan kako se dobija jedinjenje 2 (0.36g, 97%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ: 7.76-7.75(m, 2H), 6.92-6.91(m, 2H), 4.11(t, J = 4.2Hz, 2H), 3.97-3.96(m, 2H), 1.99(bs, 1H), 1.33(s, 12H).
Jedinjenje 3
U rastvor jedinjenja (A) (85mg, 0.11mmol), koje je proizvedeno prema postupcima opisanim u WO2006/111759, WO2010/043880 i WO2010/010347 i jedinjenja 2 (35mg, 0.13mmol) u toluenu (2mL), dodaju se natrijum karbonat (17mg, 0.16mmol), destilovana voda (1mL) i etanol (1mL). Posle mešanja dobijene smeše tokom 5 minuta, doda se Pd(TPP3)4(22mg, 0.02mmol). Dobijena smeša se meša 2 sata. Dodaju se etil acetat (10mL) i voda (10mL). Ovako dobijeni organski sloj se ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni uz etil acetat i heksan kako se dobija jedinjenje 3 (79mg, 53%) u vidu čvrste materije žute boje.
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ: 7.36-7.35(m, 2H), 7.32-7.25(m, 6H), 6.92-6.89(m, 4H), 6.78(s, 2H), 5.92(d, J = 9.0Hz, 2H), 5.22(d, J = 12.0Hz, 2H), 4.30-4.28(m, 2H), 4.17-4.10(m, 6H), 3.98-3.94(m, 4H), 3.94(s, 6H), 3.83(s, 3H), 3.37-3.32(m, 2H), 2.85-2.82(m, 2H), 2.46-2.44(m, 2H), 1.98(bs, 1H), 0.91(s, 18H), 0.26(2s, 12H).
EI-MS m/z: 1387(M<+>)
Jedinjenje 4
U rastvor jedinjenja 3 (77mg, 0.06mmol) u tetrahidrofuranu (2mL) na sobnoj temperaturi se jedan po jedan dodaju trifenilfosphin (18mg, 0.07mmol), ftalimid (10mg, 0.07mmol) i DIAD (13ul, 0.07mmol). Dobijena smeša se meša 12 sati. Dodaju se etil acetat (10mL) i voda (10mL). Ovako dobijeni organski sloj se ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni uz etil acetat i heksan kako se dobija jedinjenje 4 (72mg, 87%) u vidu čvrste materije žute boje.
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ: 7.88-7.86(m, 2H), 7.77-7.75(m, 2H), 7.39-7.36(m, 2H), 7.30-7.24(m, 6H), 6.90-6.86(m, 4H), 6.78(d, J = 1.8Hz, 2H), 5.92- 5.88(m, 2H), 5.24-5.22(m, 2H), 4.28-4.24(m, 4H), 4.17-4.11(m, 6H), 3.98-3.90(m, 8H), 3.83(s, 3H), 3.36-3.29(m, 2H), 2.85-2.78(m, 2H), 2.47-2.43(m, 2H), 0.91(d, J = 1.8Hz, 18H), 0.27-0.24(m, 12H).
EI-MS m/z: 1516(M<+>)
Jedinjenje 5
Rastvor jedinjenja 4 (70mg, 0.05mmol) u etanolu (2mL) na sobnoj temperaturi je tretiran sa hidrazin monohidratom (12ul, 0.23mmol). Dobijena mešavina je mešana na 60°C u toku 5 sati. Čvrsta materija je odfiltrirana korišćenjem etil acetata (10mL). Filtrat je ukoncentrisan pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni uz dihlorometan i metanol kako se dobija jedinjenje 5 (64mg, 63%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ: 7.36-7.35(m, 2H), 7.32-7.25(m, 6H), 6.92-6.89(m, 4H), 6.78(s, 2H), 5.92(d, J = 9.0Hz, 2H), 5.22(d, J = 12.0Hz, 2H), 4.30-4.28(m, 2H), 4.17-4.10(m, 6H), 3.98-3.94(m, 4H), 3.94(s, 6H), 3.83(s, 3H), 3.37-3.32(m, 2H), 2.85-2.82(m, 2H), 2.46-2.44(m, 2H), 1.98(bs, 1H), 0.91(s, 18H), 0.26(2s, 12H).
EI-MS m/z: 1386(M<+>)
LCB14-0599
U rastvor jedinjenja 5 (30mg, 0.02mmol) u tetrahidrofuranu (2mL) na sobnoj temperaturi se doda 1N rastvor amonijum acetata (0.6mL) i par kadmijum/olovo (60mg). Dobijena mešavina se meša 4 sata. Čvrsta materija se odfiltrira korišćenjem etil acetata (10mL). Filtrat je ukoncentrisan pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni uz dihlorometan i metanol kako se dobija jedinjenje LCB14-0599 (9.0mg, 60%) u vidu čvrste materije žute boje.
<1>H NMR (600MHz, CDCl3, CD3OD_1drop) δ: 7.54-7.49(m, 3H), 7.35-7.30(m, 5H), 7.26(s, 1H), 6.93-6.86(m, 5H), 6.51(s, 1H), 6.29(s, 1H), 4.67-4.59(m, 2H), 4.28-4.09(m, 6H), 3.85(s, 9H), 3.31-3.27(m, 1H), 3.07-3.03(m, 2H), 2.92-2.89(m, 1H), 2.39-2.30(m, 2H), 2.05-2.03(m, 2H). EI-MS m/z: 770(M<+>)
2-21. Modifikovani GPP derivat koji obuhvata karbonilnu grupu (LCB14-0606)
Jedinjenje 2
U rastvor jedinjenja 1 (3g, 19.45mmol) u piridinu na sobnoj temperaturi doda se sirćetni anhidrid (7.9mL, 77.8mmol). Nastala mešavina se meša 2 sata. Doda se petrol etar (100mL) i 0.1N HCl (100mL). Ovako dobijeni organski sloj se ukoncentriše pod sniženim pritiskom kako se dobija jedinjenje 2 (3.81g, 100%) u vodenoj formi.
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 5.35-5.33 (m, 1H), 5.08-4.58 (m, 1H), 4.59 (d, J=6.6Hz, 2H), 2.11-2.03(m, 4H), 2.05(s, 3H), 1.70(s, 3H), 1.68(s, 3H), 1.60(s, 3H)
Jedinjenje 3
U rastvor jedinjenja 2 (3.81g, 19.41mml) u dihlorometanu (30mL) na sobnoj temperaturi jedan za drugim se dodaju selenijum dioksid (65mg, 0.58mml) i 70% tercbutilhidroperoksid (6.72mL, 48.52mmol). Dobijena smeša se meša 20 sati. Kada je reakcija završena, dodaju se dihlorometan (100mL) i voda (100mL). Ovako dobijeni organski sloj se ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni uz etil acetat i heksan kako se dobija jedinjenje 3 (1.8g, 43%) u vidu tečnosti.
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 5.38-5.30(m, 2H), 4.59 (d, J=7.2Hz, 2H), 4.00-3.99 (d, J=6Hz, 2H), 2.18-2.15(m, 2H), 2.10-2.06(m, 2H), 2.05(s, 3H), 1.70(s, 3H), 1.66(s, 3H)
Jedinjenje 4
U rastvor jedinjenja 3 (1.8g, 8.48 mmol) u dihlorometanu (18mL) na 0°C se dodaju trifenilfosfin (3.33g, 12.72mmol) i ugljen tetrabromid (3.37g, 10.18mmol). Dobijena mešavina se meša na 0°C u toku 4 sata. Dodaju se dihlorometan (100mL) i voda (100mL). Ovako dobijeni organski sloj se ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni uz etil acetat i heksan kako se dobija jedinjenje 4 (2.33g, 100%) u tečnoj formi.
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 5.57-5.55(m, 1H), 5.35-5.32 (m, 2H), 4.59 (d, J=7.2Hz, 2H), 3.96(s, 2H), 2.18-2.15(m, 2H), 2.10-2.07(m, 2H), 2.05(s, 3H), 1.75(s, 3H), 1.70(s, 3H)
Jedinjenje 5
U rastvor natrijum hidrida (348mg, 8.71mmol) u tetrahidrofuranu (35mL) na 0°C se, kap po kap, doda rastvor etilacetoacetata (1.85mL, 14.52mmol) u tetrahidrofuranu (5mL). Nakon što je dobijena smeša mešana na 0°C 30 minuta, polako se na 0°C dodaje jedinjenje 4 (2g, 7.26mmol), koje je rastvoreno u tetrahidrofuranu (5mL). Dobijena smeša je mešana na 80°C u toku 4 sata. Dodaju se etil acetat (80mL) i voda (80mL). Ovako dobijeni organski sloj se ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni uz etil acetat i heksan kako se dobija jedinjenje 5 (1.56g, 66%) u vidu tečnosti.
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 5.34-5.31(m, 1H), 5.17-5.14 (m, 1H), 4.60-4.58 (m, 2H), 4.20-4.16 (m, 2H), 3.61 (t, J=7.2Hz, 2H), 2.55-2.51 (m, 2H), 2.22 (s, 3H), 2.12-2.02 (m, 4H), 2.06 (s, 3H), 1.27(t, J=7.2Hz, 3H)
Jedinjenje 6
U rastvor jedinjenja 5(1.56g, 4.81mmol) u etanolu (20mL) doda se kalijum hidroksid (2.16g, 38.47mmol) sa etanolom (20mL). Dobijena mešavina se meša na 100°C tokom 4 sata, razblaži sa etil etrom (100mL) i 0.1N rastvorom HCl (50mL) zatim, neutrališe sa rastvorom Na2CO3. Ovako dobijeni organski sloj se ukoncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni kako se dobija jedinjenje 6 (819mg, 81%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 5.39-5.37(m, 1H), 5.09-5.07 (m, 1H), 4.15 (d, J=6.6Hz, 2H),2.53-2.51 (m, 2H), 2.27-2.24(m, 2H),2.13 (s, 3H), 2.12-2.09 (m, 2H), 2.04-2.01 (m, 2H),1.66 (s, 3H), 1.60(s, 3H)
Jedinjenje 7
U rastvor N-hlorosukcinimida (210mg, 1.57mmol) u dihlorometanu (10mL) u atmosferi azota se polako dodaje dimetilsulfid (126µL, 1.71mmol). Dobijena smeša se meša na 0°C u toku 5 minuta. Rastvor jedinjenja 6 (300mg, 1.43mmol) rastvoren u dihlorometanu (5mL) se doda na 30°C. Dobijena smeša se meša na 0°C u toku 2 sata. Kada je reakcija završena, dodaju se n-pentan (100mL) i voda (100mL). Ovako dobijeni organski sloj se ukoncentriše pod sniženim pritiskom kako se dobija jedinjenje 7 (325mg, 99%).
<1>H NMR (600MHz, CDCl3) δ 5.42 (m, 2H), 5.09 (m, 2H), 4.11 (d, J= 8.4Hz, 2H), 2.52 (m, 2H), 2.24 (m, 2H), 2.14 (s, 3H), 2.11 (m, 2H), 2.05 (m, 2H), 1.71 (s, 3H), 1.60 (s, 3H).
LCB 14-0606
Jedinjenje LCB 14-0606 se proizvodi prema sličnom postupku, opisanom u JACS, 2010, 132(12), 4281. U rastvor jedinjenja 7 (320mg, 1.40mmol) u 7mL acetonitrila na sobnoj temperaturi se polako doda rastvor tris(tetrabutilamonijum) hidrogen pirofosfat (2.25g, 2.80mmol) u acetonitrilu (7ml). Dobijena mešavina se meša 1 sat. Kada je reakcija završena, dobijena smeša se ukoncentriše pod sniženim pritiskom, na temperaturi ispod 25°C. Ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni (packed BioRad AG 50W-X8 smola, vodonični oblik, 15g) uz amonijačna voda:razblažena voda (V:V=3:1) i 25mM amonijum bikarbonat:izopropil alkohol (V:V=50:1), kako se dobija jedinjenje LCB 14-0606 (585mg, 99%).
<1>H NMR (600MHz, D2O) δ 5.42 (m, 1H), 5.16 (m, 1H), 4.46 (t, J= 6.6Hz, 2H), 2.66 (t, J= 7.2Hz, 2H), 2.25 (t, J= 7.2Hz, 2H), 2.19 (s, 3H), 2.14 (m,2H), 2.06 (m, 2H), 1.69 (s, 3H), 1.60 (s, 3H)
PRIMER 3 : PRENILACIJA Ab(M)-CAAX
3-1. Postupci prenilacije
Prenilacija Ab(M)-CAAX je izvedena primenom NBD-GPP (Tris-amonijum[3,7-dimetil-8-(7-nitro-benzo[1,2,5]oksadiazol-4-ilamino)-okta-2,6-dien-1]pirofosfata) i FTaze (#344146, Calbiochem, USA) ili NBD-FPP (#LI-013, Jena Bioscience, Germany) i GGTaze I (#345852, Calbiochem, USA).
Reakcija prenilacije je izvedena na 30°C tokom 3 sata, korišćenjem 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) pufer rastvora, koji sadrži 5 mM MgCl2, 10 µM ZnCl2i 5 mM DTT. Kada je reakcija završena, izvedeno je analiziranje pomoću SDS-PAGE. Korišćen je image-analizator (ChemiDoc XRS<+>, BioRad, USA) za identifikaciju fluorescentne(ih) proteinske(ih) trake(a) za potvrdu da je došlo do reakcije prenilacije.
3-2. Prenilacija Herceptin-HC-CAAX korišćenjem FTaze i NBD-GPP
Izvršena je prenilacija Herceptin-HC-GCVIM, Herceptin-HC-G5CVIM (nije prikazano), Herceptin-HC-G7CVIM i Herceptin-HCG10CVIM antitela primenom NBD-GPP i FTaze u prethodno opisanom postupku. Fluorescencija je detektovana na traci(kama) proteina, koja(e) odgovara(ju) lakom(im) lancu(ima) (otprilike 50K daltona) za svako antitelo. Ovaj rezultat je potvrdio da bi Herceptin-HC-CAAX antitela, od kojih svaki ima spejser različite dužine, mogla biti prenilovana (Slika 12).
3-3. Prenilacija Herceptin-LC-CAAX korišćenjem FTaze i NBD-GPP
Izvršena je prenilacija Herceptin-LC-GCVIM, Herceptin-LC-G5CVIM, Herceptin-LC-G7CVIM i Herceptin-LC-G10CVIM antitela primenom NBD-GPP i FTaze u prethodno opisanom postupku. Fluorescencija je detektovana na traci(kama) proteina, koja(e) odgovara(ju) lakom(im) lancu(ima) (otprilike 25K daltona) za svako antitelo. Ovaj rezultat je potvrdio da bi Herceptin-LC-CAAX antitela, od kojih svaki ima spejser različite dužine, mogla biti prenilovana (Slika 13).
3-4. Prenilacija anti cMET-HC-CAAX korišćenjem FTaze i NBD-GPP
Izvršena je prenilacija anti cMET-HC-G7CVIM i anti cMET-HC-G10CVIM antitela primenom NBD-GPP i FTaze u prethodno opisanom postupku. Fluorescencija je detektovana na traci(kama) proteina, koja(e) odgovara(ju) teškom(im) lancu(ima) (otprilike 50K daltona) za svako antitelo. Ovaj rezultat je potvrdio da bi anti cMET-HC-CAAX antitela, od kojih svaki ima spejser različite dužine, mogla biti prenilovana (Slika 14).
3-5. Prenilacija anti cMET-LC-CAAX korišćenjem FTaze i NBD-GPP
Izvršena je prenilacija anti cMET-LC-G7CVIM i anti cMET-LC-G10CVIM antitela primenom NBD-GPP i FTaze u prethodno opisanom postupku. Fluorescencija je detektovana na traci(kama) proteina, koja(e) odgovara(ju) lakom(im) lancu(ima) (otprilike 25K dalton) daltona) za svako antitelo. Ovaj rezultat je potvrdio da bi anti cMET-LC-CAAX antitela, od kojih svaki ima spejser različite dužine, mogla biti prenilovana (Slika 15).
3-6. Prenilacija Herceptin-HC-CAAX korišćenjem GGTaze I i NBD-FPP
Izvršena je prenilacija Herceptin-HC-G10CVLL antitela primenom NBD-FPP i GGTaze I u prethodno opisanom postupku. Fluorescencija je detektovana na traci proteina, koja odgovara teškom lancu(ima) (otprilike 50K daltona) antitela koje je povezano sa CAAX-motivom na C-terminusu preko G10spejsera. Ovaj rezultat je potvrdio da bi Herceptin-HC-CAAX antitela mogla biti prenilovana pomoću GGTaze I (Slika 16).
3-7. Prenilacija Herceptin-LC-CAAX korišćenjem GGTaze I i NBD-FPP
Izvršena je prenilacija Herceptin-LC-G10CVLL antitela primenom NBD-FPP i GGTaze I u prethodno opisanom postupku. Fluorescencija je detektovana na traci proteina, koja odgovara lakom lancu(ima) (otprilike 25K daltona) antitela koje je povezano sa CAAX-motivom na C-terminusu preko G10spejsera. Ovaj rezultat je potvrdio da bi Herceptin-LC-CAAX antitela mogla biti prenilovana pomoću GGTaze I (Slika 16).
3-8. Prenilacija Herceptin-LC-CAAX korišćenjem FTaze i izosupstrata
Herceptin-LC-G7CVIM
Izvršena je prenilacija Herceptin-LC-G7CVIM antitela primenom LCB14-0512 i FTaze u prethodno opisanom postupku. U slučaju gde je prenilovano Herceptin-LC-G7CVIM antitelo podvrgnuto analizi pomoću LC/MS u redukcionim uslovima bez obrade PNGaze F, predvidelo se da bi teoretske molekulske težine teškog lanca i lakog lanca bile 50,597 daltona, odnosno 24,480 daltona. Kako je prikazano na Slici 17, eksperimentalno izmerene molekulske težine teškog lanca i lakog lanca su bile 50,600 daltona, odnosno 24,479 daltona. Razlika između teorijskih vrednosti molekulske težine i eksperimentalnih vrednosti molekulske težine su bile unutar standardnog opsega greške. Ovaj rezultat je potvrdio da je Herceptin-LC-G7CVIM antitelo bilo prenilovano sa FTazom i izosupstratom (LCB14-0512).
Herceptin-LC-G10CVIM
Izvršena je prenilacija Herceptin-LC-G10CVIM antitela primenom LCB14-0512 i FTaze u prethodno opisanom postupku. U slučaju gde je prenilovano Herceptin-LC-G10CVIM antitelo podvrgnuto analizi pomoću LC/MS u redukcionim uslovima bez obrade PNGaze F, predvidelo se da bi teoretske molekulske težine teškog lanca i lakog lanca bile 50,596 daltona, odnosno 24,651 daltona. Kako je prikazano na Slici 18, eksperimentalno izmerene molekulske težine teškog lanca i lakog lanca su bile 50,601 daltona, odnosno 24,651 daltona. Razlika između teorijskih vrednosti molekulske težine i eksperimentalnih vrednosti molekulske težine su bile unutar standardnog opsega greške. Ovaj rezultat je potvrdio da je Herceptin-LC-G10CVIM antitelo bilo prenilovano sa FTazom i izosupstratom (LCB 14-0512).
PRIMER 4 : KONJUGACIJA LEKA POMOĆU KLIK HEMIJE
4-1. Reoksidacija prenilovanog Ab(M)-CAAX
Diafiltracija se izvodi radi uklanjanja viška reagenasa u prenilovanom Herceptin-LC-G7CVIM, pripremljenom prema prethodno opisanom postupku. Antitelo se reoksiduje pomoću CuSO4. Diafiltracija se izvede da bi se uklonio CuSO4.
4-2. Konjugovanje leka Ab(M)-CAAX pomoću klik hemije i leka-linkera
Reakcija klik hemije između reoksidovanog, prenilovanog Herceptin-LC-G7CVIM i jedinjenja LCB14-0536 se izvodi za 10 minuta. Nastali konjugat (LCB14-0104) (SLIKA 26) se podvrgne analizi pomoću LC/MS. U slučaju kada se antitelo podvrgne LC/MS analizi u redukovanom stanju, bez tretmana PNGazom F, predviđeno je da teoretske molekulske težine teškog lanca i lakog lanca treba da budu 49,153 daltona, odnosno 25,410 daltona. Kako je prikazano na SLICI 19, izmerene su eksperimentalne molekulske težine teškog lanca i lakog lanca i bile su 49,154 daltona, odnosno 25,408 daltona. Razlika između teorijskih vrednosti molekulskih težina i eksperimentalnih vrednosti molekulskih težina je bila unutar standardnog opsega greške. Ovaj rezultat potvrđuje da prenilovano Herceptin-LC-G7CVIM antitelo formira konjugat sa lekom putem reakcije klik hemije.
4-3. Analiza Herceptin-LC-CAAX-lek konjugata
Konjugat LCB 14-0101 je podvrgnut hromatografiji hidrofobne interakcije-tečnoj hromatografiji visokih performansi sa Ether-5PW kolonom (7.5 x 75 mm, 10 µm, Tosoh Bioscience, USA). Kao pufer A je korišćen 50 mM kalijum fosfatni pufer (pH 7.0) koji sadrži 1.5M amonijum sulfat i, kao pufer B je korišćen 50 mM kalijum fosfatni pufer (pH 7.0) koji sadrži 20% izopropil alkohol. 90% A/10% B se drži 5 minuta. Eluacija se izvodi primenom linearnog gradijenta od 90% A/10% B do 10%A/90%B sledećih 30 minuta. Brzina protoka i temperatura bile su podešene na 0.8mL/min, odnosno 25°C. Detekcija je praćena i na 254 i na 280 nm. Kako kontrole su upotrebljeni nemodifikovani Herceptin-LC-G7CVIM i prenilovani Herceptin-LC-G7CVIM. Retenciona vremena nemodifikovanog Herceptin-LC-G7CVIM, prenilovanog Herceptin-LC-G7CVIM i konjugata LCB14-0101 su bila 9.6, 11.7, odnosno 12.4 minuta (Slika 20).
PRIMER 5 : ANTIPROLIFERACIJA ADC
5-1. Ćelijske linije
Korišćene su komercijalno nabavljene ćelijske linije humanog karcinoma dojke MCF-7 (HER2 negativna do normalna), MDA-MB-468 (HER2 negativna) i SK-BR-3 (HER2 pozitivna). Ćelijske linije su uzgajane prema preporučenim specifikacijama, dobijenim uz komercijalno nabavljene ćelijske linije.
5-2. Uzorci za ispitivanje
Kao antitelo, korišćena su komercijalno dostupna Herceptin antitelo i Herceptin-LC-G7CVIM. Kao lek, korišćeni su LCB14-0537 (MMAF), LCB14-0508 (MMAF-OMe) i LCB14-0562 (MMAE). Kao konjugat protein-aktivnog agensa, korišćeni su LCB14-0101, LCB14-0102 i LCB14-0103 (Slika 26). Herceptin-LC-G7CVIM je prenilovan primenom LCB14-0512. Prenilovani Herceptin-LC-G7CVIM se podvrgne klik reakciji primenom LCB14-0592 za konjugovanje β-glukuronid linker(BG)-MMAF, na koji način se proizvodi LCB14-0101. sem toga, prenilovani Herceptin-LC-G7CVIM se podvrgne klik reakciji primenom LCB14-0589 za konjugovanje Val-Cit linker(VC)-MMAF-OMe, na koji način se proizvodi LCB14-0102. Dalje, prenilovani Herceptin-LC-G7CVIM se podvrgne klik reakciji primenom LCB14-0598 za konjugovanje β-glukuronid linker(BG)-MMAE, na koji način se proizvodi LCB 14-0103.
5-3. Postupci ispitivanja
Merene su anti-proliferativne aktivnosti antitela, lekova i konjugata prema kancerskim ćelijskim linijama. Ćelije su postavljene u ploče za kulturu tkiva sa 96 pozicija, u količini od 1 x 10<4>ćelija po poziciji. Posle 24 časa inkubacije, antitela, lekovi i konjugati se dodaju u različitim koncentracijama. Izbroji se broj vijabilnih ćelija nakon 72 sata primenom SRB boje. Apsorbanca se meri na 540nm na SpectraMax 190 (Molecular Devices, USA).
5-4. Rezultati ispitivanja
LCB 14-0101 (Herceptin-LC-G7CVIM-BG-MMAF)
Herceptin-LC-G7CVIM je imao IC50od 10 µg/mL ili viši sa MCF-7, MDA-MB-468 i SK-BR-3. LCB14-0101 (MMAF konjugat) je imao IC50od 8.09 µg/mL i 4.18 µg/mL sa MCF-7, odnosno sa MDA-MB-468, koja ne ekspresuje ili ekspresuje nizak nivo HER2, dok je imao IC50od 0.11 µg/mL sa SK-BR-3, koja prekomerno ekspresuje HER2. Pored toga što ima odličnu inhibitornu aktivnost, LCB14-0101 je oko 40-80 puta više selektivan u odnosu na Herceptin-LC-G7CVIM. Prema tome, potvrđeno je da LCB14-0101 ima i potencijal citotksičnog leka i anti HER2 selektivnost (Slika 21).
LCB 14-0102 (Herceptin-LC-G7CVIM-VC-MMAF-OM)
Herceptin-LC-G7CVIM ima IC50od 10 µg/mL sa MCF-7 i SK-BR-3. LCB14-0102 (MMAF-OMe konjugat) ima IC50od 4.38 µg/mL sa MCF-7, dok ima IC50od 0.15 µg/mL sa SK-BR-3. Pored toga što ima odličnu inhibitornu aktivnost, LCB14-0102 je oko 30 puta više selektivan u odnosu na Herceptin-LC-G7CVIM. Prema tome, potvrđeno je da LCB14-0102 ima i potencijal citotksičnog leka i anti HER2 selektivnost (Slika 22).
LCB 14-0103 (Herceptin-LC-G7CVIM-BG-MMAE)
LCB 14-0103 (MMAE konjugat) ima IC50od 7.25 µg/mL sa MCF-7, dok ima IC50od 0.072 µg/mL sa SK-BR-3. Pored toga što ima odličnu inhibitornu aktivnost, LCB 14-0103 je oko 100 puta više selektivan u odnosu na Herceptin-LC-G7CVIM. Prema tome, potvrđeno je da LCB14-0103 ima i potencijal citotksičnog leka i anti HER2 selektivnost (Slika 23).

Claims (13)

  1. Patentni zahtevi 1. Konjugat antitela sa aktivnim agensom, pri čemu antitelo ima aminokiselinski motiv kog može prepoznati izoprenoid transferaza, u kom je aktivni agens kovalentno vezan za antitelo na aminokiselinskom motivu, a pri čemu je aminokiselinski motiv CAAX, XXCC, XCXC, ili CXX, u kom C predstavlja cistein, A predstavlja alifatičnu amino kiselinu i, X predstavlja amino kiselinu koja određuje supstratnu specifičnost izoprenoid transferaze; i u kom je aminokiselinski motiv kovalentno vezan sa aktivnim agensom preko najmanje jednog linkera, pri čemu je najmanje jedan linker izoprenil derivat, kog može prepoznati izoprenoid transferaza, pri čemu je linker predstavljen formulom (I):
    u kojoj, P1i Y su, svaki nezavisno, grupa koja sadrži prvu funkcionalnu grupu (FG1), FG1 je odabrana iz grupe koju čine: acetilen, azid, aldehid, hidroksilamin, hidrazin, keton, nitrobenzofurazan (NBD), danzil, fluorescein, biotin i rodamin, L1je (CH2)rXq(CH2)p, X je kiseonik, sumpor, -NR1-, -C(O)NR1-, -NR1C(O)-, -NR1SO2-, -SO2NR1-, - (CH=CH)- ili acetilen, R1je vodonik, C1-6alkil, C1-6alkilaril ili C1-6alkilheteroaril, r i p su, svaki nezavisno, celi brojevi od 0 do 6, q je ceo broj od 0 do 1 i n je ceo broj od 1 do 4. gde je aktivni agens vezan za grupu koja sadrži drugu funkcionalnu grupu (FG2) koja može reagovati sa FG1, pri čemu je FG2 odabrana iz grupe koju čine: acetilen, hidroksilamin, azid, aldehid, hidrazin, keton i gde je aktivni agens vezan za grupu koja sadrži FG2 preko -(CH2)rXq(CH2)p- ili -[ZCH2CH2O(CH2CH2O)wCH2CH2Z]-, u kojima X je kisonik, sumpor, -NR1-, -C(O)NR1-, -NR1C(O)-, -NR1SO2-, ili -SO2NR1-, Z je kisonik, sumpor ili NR1, R1je vodonik, C1-6alkil, C1-6alkilaril ili C1-6alkilheteroaril, r i p su, svaki nezavisno, celi brojevi od 0 do 6, q je ceo broj od 0 do 1 i w je ceo broj od 0 do 6, pri čemu su -(CH2)rXq(CH2)p- ili -[ZCH2CH2O(CH2CH2O)wCH2CH2Z]- vezani za (i) peptid(e) koji se može otcepiti katepsinom B ili (ii) glukuronid koji se može otcepiti sa βglukuronidazom, pri čemu peptid koji može biti otcepljen katepsinom B je
    i glukuronid koji može biti otcepljen β-glukuronidazom je
    i gde je antitelo monoklonsko antitelo, fragment antitela za ciljano vezivanje, jednolančani Fv (scFv) mutant, multispecifično antitelo, bispecifično antitelo generisano od najmanje dva intaktna antitela, himerno antitelo, humanizovano antitelo ili humano antitelo ili fuzioni protein koji sadrži fragment antitela za ciljano vezivanje.
  2. 2. Konjugat antitela sa aktivnim agensom prema zahtevu 1, naznačen time što je aktivni agens lek, toksin, afinitetni ligand, detekciona proba, imunomodulatorno jedinjenje, anti-kancersko sredstvo, antivirusno sredstvo, antibakterijsko sredstvo, anti-gljivično sredstvo ili sredstvo protiv parazita.
  3. 3. Konjugat antitela sa aktivnim agensom prema zahtevu 1 ili 2, za upotrebu u terpiji kod subjekta.
  4. 4. Konjugat antitela sa aktivnim agensom prema zahtevu 3, naznačen time što subjekt ima kancer.
  5. 5. Konjugat antitela sa aktivnim agensom prema zahtevu 3, naznačen time što subjekt ima infekciju patogenim agensom.
  6. 6. Konjugat antitela sa aktivnim agensom prema zahtevu 5, naznačen time što je patogeni agens virus, bakterija, gljivica ili parazit.
  7. 7. Postupak za dobijanje konjugata antitela i aktivnog agensa prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu postupak sadrži: (a) ekspresiju antitela vezanog za aminokiselinski motiv koji se može prepoznati izoprenoid transferazom; (b) enzimsku reakciju, koristeći izoprenoid transferazu, eksprimirano antitelo sa najmanje jednim izosupstratom koji ima prvu funkcionalnu grupu (FG1), proizvodeći na taj način funkcionalizovano antitelo; (c) vezivanje druge funkcionalne grupe (FG2) za aktivni agens, proizvodeći na taj način funkcionalizovani aktivni agens; i (d) reakciju funkcionalizovanog antitela sa funkcionalizovanim aktivnim agensom, proizvodeći na taj način konjugat antitela sa aktivnim agensom, ili (a) ekspresiju antitela vezanog za aminokiselinski motiv koji se može prepoznati izoprenoid transferazom; (b) vezivanje izosupstrata izoprenoid transferaze za aktivni agens; i (c) enzimsku reakciju, koristeći izoprenoid transferazu, eksprimirano antitelo sa aktivnim agensom vezanim za izosupstrat.
  8. 8. Postupak prema zahtevu 7, naznačen time što postupak sadrži: (a) ekspresiju antitela vezanog za aminokiselinski motiv koji se može prepoznati izoprenoid transferazom; (b) enzimsku reakciju, koristeći izoprenoid transferazu, eksprimirano antitelo sa najmanje jednim izosupstratom koji ima prvu funkcionalnu grupu (FG1), proizvodeći na taj način funkcionalizovano antitelo; (c) vezivanje druge funkcionalne grupe (FG2) za aktivni agens, proizvodeći na taj način funkcionalizovani aktivni agens; i (d) reakciju funkcionalizovanog antitela sa funkcionalizovanim aktivnim agensom, proizvodeći na taj način konjugat antitela sa aktivnim agensom.
  9. 9. Postupak prema zahtevu 7, naznačen time što postupak sadrži: (a) ekspresiju antitela vezanog za aminokiselinski motiv koji se može prepoznati izoprenoid transferazom; (b) vezivanje izosupstrata izoprenoid transferaze za aktivni agens; i (c) enzimsku reakciju, koristeći izoprenoid transferazu, eksprimirano antitelo sa aktivnim agensom vezanim za izosupstrat.
  10. 10. Postupak prema zahtevu 7 ili 8, naznačen time što je FG2: (a) vezan za aktivni agens najmanje jednim linkerom, i (b) FG2 je izabaran od: acetilena, hidroksilamina, azida, aldehida, hidrazina, ketona i amina.
  11. 11. Postupak prema bilo kom od zahteva 7-10, naznačen time što je reakcija između funkcionalizovanog antitela i funkcionalizovanog aktivnog agensa reakcija klik hemije ili formiranja hidrazona i/ili oksima.
  12. 12. Postupak prema zahtevu 11, naznačen time što (i) FG1 je azidna grupa i FG2 je acetilenska grupa ili, gde je FG1 acetilenska grupa i FG2 je azidna grupa; ili (ii) FG1 je aldehidna ili ketonska goupa i FG2 je hidrazin ili hidroksilamin ili, gde je FG1 hidrazin ili hidroksilamin i FG2 je aldehid ili keton.
  13. 13. Kompozicija koja sadrži farmaceutski prihvatljiv ekscipijens i konjugat antitela sa aktivnim agensom prema zahtevu 1 ili 2.
RSP20191130 2011-05-08 2012-05-08 Konjugati aktivnog agensa proteina i postupak za njihovo dobijanje RS59253B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161483698P 2011-05-08 2011-05-08
PCT/IB2012/001065 WO2012153193A2 (en) 2011-05-08 2012-05-08 Protein-active agent conjugates and method for preparing the same
EP12782658.4A EP2707031B1 (en) 2011-05-08 2012-05-08 Protein-active agent conjugates and method for preparing the same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59253B1 true RS59253B1 (sr) 2019-10-31

Family

ID=47139740

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RSP20191130 RS59253B1 (sr) 2011-05-08 2012-05-08 Konjugati aktivnog agensa proteina i postupak za njihovo dobijanje

Country Status (24)

Country Link
US (7) US20120308584A1 (sr)
EP (2) EP2707031B1 (sr)
JP (2) JP6196613B2 (sr)
KR (1) KR101921068B1 (sr)
CN (1) CN103648530B (sr)
BR (2) BR112013028907A2 (sr)
CA (1) CA2835576C (sr)
CY (1) CY1122152T1 (sr)
DK (1) DK2707031T3 (sr)
ES (1) ES2744226T3 (sr)
HR (1) HRP20191586T1 (sr)
HU (1) HUE045348T2 (sr)
IL (2) IL229364B (sr)
LT (1) LT2707031T (sr)
MX (2) MX393973B (sr)
PH (1) PH12013502284A1 (sr)
PL (1) PL2707031T3 (sr)
PT (1) PT2707031T (sr)
RS (1) RS59253B1 (sr)
RU (1) RU2613906C2 (sr)
SG (1) SG194875A1 (sr)
SI (1) SI2707031T1 (sr)
SM (1) SMT201900500T1 (sr)
WO (1) WO2012153193A2 (sr)

Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX393973B (es) 2011-05-08 2025-03-24 Legochem Biosciences Inc Conjugados de proteína-agente activo y método para su preparación.
KR102356286B1 (ko) 2011-05-27 2022-02-08 암브룩스, 인코포레이티드 비-천연 아미노산 연결된 돌라스타틴 유도체를 함유하는 조성물, 이를 수반하는 방법, 및 용도
SG11201400770SA (en) * 2011-09-20 2014-04-28 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines as unsymmetrical dimeric pbd compounds for inclusion in targeted conjugates
SI2906252T1 (sl) * 2012-10-12 2017-10-30 Adc Therapeutics Sa Pirolobenzodiazepin-anti-HER2 protitelesni konjugati
EP2934596A1 (en) * 2012-12-21 2015-10-28 Glykos Finland Oy Linker-payload molecule conjugates
PT3611180T (pt) * 2013-03-15 2022-03-15 Biomolecular Holdings Llc Imunoglobulina híbrida que contém uma ligação não peptídica
PL2991683T3 (pl) 2013-05-02 2020-03-31 Glykos Finland Oy Koniugaty glikoproteiny lub glikanu z toksycznym ładunkiem
FR3008408B1 (fr) 2013-07-11 2018-03-09 Mc Saf Nouveaux conjugues anticorps-medicament et leur utilisation en therapie
EP3054983B1 (en) 2013-10-11 2019-03-20 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
KR20160122127A (ko) * 2013-12-23 2016-10-21 자임워크스 인코포레이티드 C-말단의 경쇄 폴리펩타이드 연장부를 포함하는 항체 및 이의 컨쥬게이트 및 이들의 사용방법
KR102587838B1 (ko) 2014-03-14 2023-10-12 바이오몰레큘러 홀딩스 엘엘씨 비-펩티드 결합을 함유하는 하이브리드 면역글로불린
KR101628872B1 (ko) 2014-05-28 2016-06-09 주식회사 레고켐 바이오사이언스 자가-희생 기를 포함하는 화합물
EP3154587B1 (en) 2014-06-13 2020-01-15 Tenboron OY Conjugates comprising an anti-egfr1 antibody
EP3160513B1 (en) 2014-06-30 2020-02-12 Glykos Finland Oy Saccharide derivative of a toxic payload and antibody conjugates thereof
US11820832B2 (en) 2014-07-25 2023-11-21 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Bispecific HER2 and CD3 binding molecules
JP6871155B2 (ja) * 2014-07-25 2021-05-12 メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター 二重特異性ｈｅｒ２及びｃｄ３結合分子
KR20160080832A (ko) 2014-12-29 2016-07-08 주식회사 레고켐 바이오사이언스 리피바디 유도체-약물 복합체, 그 제조방법 및 용도
CN104587487B (zh) * 2015-01-06 2018-01-16 华东师范大学 一种应用于靶向给药系统的新的支链连接体
CN104650179A (zh) * 2015-02-06 2015-05-27 东南大学 一种新型的可被溶酶体酶裂解的铂类前药
WO2017051249A1 (en) 2015-09-25 2017-03-30 Legochem Biosciences, Inc. Compositions and methods related to anti-cd19 antibody drug conjugates
WO2017051254A1 (en) 2015-09-25 2017-03-30 Legochem Biosciences, Inc. Compositions and methods related to anti-egfr antibody drug conjugates
AU2016359230B2 (en) 2015-11-25 2020-04-23 Ligachem Biosciences Inc. Conjugates comprising self-immolative groups and methods related thereto
KR102847348B1 (ko) * 2015-11-25 2025-08-19 주식회사 리가켐바이오사이언스 펩타이드 그룹을 포함하는 접합체 및 이와 관련된 제조방법
AU2016359235B2 (en) 2015-11-25 2022-09-15 Ligachem Biosciences Inc. Antibody-drug conjugates comprising branched linkers and methods related thereto
GB201521709D0 (en) * 2015-12-09 2016-01-20 Kings College London And Sec Dep For Health The PBD Antibacterial agents
SI3626273T1 (sl) * 2016-05-17 2021-04-30 Abbvie Biotherapeutics Inc. Konjugati protitelesa proti CMET in zdravila ter postopki za njihovo uporabo
CN109641051A (zh) 2016-06-17 2019-04-16 美真达治疗公司 用于耗尽细胞的组合物和方法
KR102480965B1 (ko) 2016-09-13 2022-12-26 알레간 인코포레이티드 안정화된 비단백질 클로스트리듐 독소 조성물
HRP20210922T1 (hr) * 2016-11-23 2021-09-03 Eli Lilly And Company Konjugati protutijela protiv met s lijekom
KR102085798B1 (ko) 2016-12-28 2020-03-06 주식회사 인투셀 베타-갈락토사이드가 도입된 자가-희생 기를 포함하는 화합물
CN108250055B (zh) * 2016-12-28 2022-08-05 重庆医药工业研究院有限责任公司 一种焦磷酸丙酮基香叶酯中间体的制备方法
EP3571230A4 (en) 2017-01-20 2020-12-16 Magenta Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR DELETION OF CD137 + CELLS
CA3058360A1 (en) 2017-03-29 2018-10-04 Legochem Biosciences, Inc. Pyrrolobenzodiazepine dimer prodrug and ligand-linker conjugate compound of the same
AU2018288030B2 (en) * 2017-06-20 2022-02-03 Systimmune, Inc. Screening of fixed-point coupling sites of cysteine-modified antibody-toxin conjugate (TDC)
WO2019035649A1 (ko) * 2017-08-14 2019-02-21 주식회사 레고켐 바이오사이언스 EGFRvIII에 대한 항체를 포함하는 항체 약물 접합체
EP3774923A4 (en) 2018-03-28 2021-12-29 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Drug conjugates of cmet monoclonal binding agents, and uses thereof
CN112601555A (zh) 2018-05-09 2021-04-02 乐高化学生物科学股份有限公司 与抗cd19抗体药物结合物相关的组合物和方法
KR20200084802A (ko) 2019-01-03 2020-07-13 주식회사 레고켐 바이오사이언스 안전성이 향상된 피롤로벤조디아제핀 이량체 화합물 및 이의 용도
WO2020141923A2 (ko) 2019-01-03 2020-07-09 주식회사 레고켐 바이오사이언스 안전성이 향상된 피롤로벤조디아제핀 이량체 화합물 및 이의 용도
EP3936150A4 (en) 2019-03-06 2023-03-29 LegoChem Biosciences, Inc. ANTIBODY-DRUG CONJUGATES COMPRISING ANTIBODY AGAINST HUMAN DLK1 AND USE THEREOF
JP2022530482A (ja) 2019-05-02 2022-06-29 レゴケム バイオサイエンシズ， インク． トリス構造を有するリンカーを含むリガンド―薬物複合体
KR102501394B1 (ko) * 2019-05-02 2023-02-21 주식회사 레고켐 바이오사이언스 트리스 구조를 가지는 링커를 포함하는 리간드-약물 접합체
JP7706210B2 (ja) 2019-06-10 2025-07-11 ストロ バイオファーマ インコーポレーテッド ５Ｈ－ピロロ［３，２－ｄ］ピリミジン－２，４－ジアミノ化合物およびその抗体コンジュゲート
KR20210028544A (ko) 2019-09-04 2021-03-12 주식회사 레고켐 바이오사이언스 인간 ror1에 대한 항체를 포함하는 항체 약물 접합체 및 이의 용도
KR20210086557A (ko) 2019-12-31 2021-07-08 주식회사 레고켐 바이오사이언스 피롤로벤조디아제핀 유도체 및 이의 리간드-링커 접합체
EP4301782A1 (en) 2021-03-05 2024-01-10 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-cd44 antibodies and their uses
WO2022211508A1 (ko) 2021-03-30 2022-10-06 주식회사 레고켐바이오사이언스 인간 cldn18.2에 대한 항체를 포함하는 항체 약물 접합체 및 이의 용도
US20250101126A1 (en) 2021-08-05 2025-03-27 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-muc4 antibodies and their uses
KR20230024845A (ko) * 2021-08-09 2023-02-21 주식회사 레고켐 바이오사이언스 신규 항생제 및 이의 용도
GB202203070D0 (en) 2022-03-04 2022-04-20 Iksuda Therapeutics Ltd Anti-canag antibody conjugate
EP4389152A1 (en) 2022-12-23 2024-06-26 Synaffix B.V. Conjugates of pbd prodrugs
EP4410313A1 (en) 2023-01-31 2024-08-07 Synaffix B.V. Homogeneous antibody-conjugates with high payload loading
EP4450489A1 (en) 2023-04-18 2024-10-23 Synaffix B.V. Stable 4-isoxazoline conjugates
WO2024218164A1 (en) 2023-04-17 2024-10-24 Synaffix B.V. Stable 4-isoxazoline conjugates
GB202313214D0 (en) 2023-08-30 2023-10-11 Iksuda Therapeutics Ltd Co-administration of antibody-drug conjugate
WO2025238253A1 (en) 2024-05-16 2025-11-20 Synaffix B.V. Antibody-oligonucleotide conjugates
WO2026008881A1 (en) 2024-07-05 2026-01-08 Synaffix B.V. Extracellular vesicles comprising biomolecule-conjugates
US20260078179A1 (en) 2024-07-18 2026-03-19 Novarock Biotherapeutics, Ltd. Cdh17 antibodies and uses thereof

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US20030129191A1 (en) * 1992-12-23 2003-07-10 Neorx Corporation Pretargeting methods and compounds
CA2115811A1 (en) 1993-02-17 1994-08-18 Claus Krebber A method for in vivo selection of ligand-binding proteins
US6011175A (en) * 1993-05-18 2000-01-04 University Of Pittsburgh Inhibition of farnesyltransferase
DE19544393A1 (de) 1995-11-15 1997-05-22 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Synergistische herbizide Mischungen
US20030017149A1 (en) * 1996-10-10 2003-01-23 Hoeffler James P. Single chain monoclonal antibody fusion reagents that regulate transcription in vivo
US7605238B2 (en) 1999-08-24 2009-10-20 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
CA2408818A1 (en) * 2000-05-11 2001-11-15 Oklahoma Medical Research Foundation Prevention of insulin-dependent diabetes, complications thereof, or allograft rejection by inhibition of cyclooxygenase-2 activity with ns398 or pdtc
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US7256257B2 (en) 2001-04-30 2007-08-14 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
IL162835A0 (en) 2002-01-09 2005-11-20 Medarex Inc Human monoclonal antibodies against cd30
EP1391213A1 (en) 2002-08-21 2004-02-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
US8048432B2 (en) * 2003-08-06 2011-11-01 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Polysaccharide-protein conjugate vaccines
EP2478912B1 (en) 2003-11-06 2016-08-31 Seattle Genetics, Inc. Auristatin conjugates with anti-HER2 or anti-CD22 antibodies and their use in therapy
AU2004296184B2 (en) * 2003-12-04 2010-12-16 Vaccinex, Inc. Methods of killing tumor cells by targeting internal antigens exposed on apoptotic tumor cells
ES2642214T3 (es) 2004-01-21 2017-11-15 Novo Nordisk Health Care Ag Conjugación de péptidos mediante transglutaminasa
AR048098A1 (es) 2004-03-15 2006-03-29 Wyeth Corp Conjugados de caliqueamicina
US20050266008A1 (en) 2004-03-29 2005-12-01 Medarex, Inc. Human anti-IRTA-5 antibodies
SV2007002227A (es) 2004-09-10 2007-03-20 Wyeth Corp Anticuerpos anti-5t4 humanizados y conjugados anticuerpo anti-5t4/calicheamicina ref. 040000-0317637
US7612062B2 (en) 2005-04-21 2009-11-03 Spirogen Limited Pyrrolobenzodiazepines
ES2708763T3 (es) 2005-07-07 2019-04-11 Seattle Genetics Inc Compuestos de monometilvalina que tienen modificaciones de la cadena lateral de fenilalanina en el extremo C
DK3248613T3 (da) * 2005-07-18 2022-03-14 Seagen Inc Beta-glucuronid-lægemiddel-linkerkonjugater
EP1928912A4 (en) * 2005-09-07 2010-02-24 Medimmune Inc EPH ANTI-RECEPTOR ANTIBODIES CONJUGATED TO TOXINS
NZ566395A (en) 2005-09-26 2012-03-30 Medarex Inc Human monoclonal antibodies to CD70
US20070122408A1 (en) * 2005-10-20 2007-05-31 The Scripps Research Institute Fc Labeling for Immunostaining and Immunotargeting
EP2007383A4 (en) * 2006-03-22 2010-09-15 Univ California HEMMER OF PROTEIN PRENYL TRANSFERASES
WO2007112007A2 (en) * 2006-03-22 2007-10-04 University Of Utah Research Foundation Immobilized proteins and methods and uses thereof
MX2009006277A (es) 2006-12-14 2009-07-24 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se enlazan a cd70 y usos de los mismos.
EP2176295B1 (en) * 2007-07-16 2014-11-19 Genentech, Inc. Humanized anti-cd79b antibodies and immunoconjugates and methods of use
US8865875B2 (en) * 2007-08-22 2014-10-21 Medarex, L.L.C. Site-specific attachment of drugs or other agents to engineered antibodies with C-terminal extensions
WO2009038685A1 (en) 2007-09-18 2009-03-26 The Scripps Research Institute Ligands for copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition reactions
EP2881736B1 (en) * 2008-03-31 2017-06-07 Pacific Biosciences of California, Inc. Single polymerase molecule loading methods and compositions
GB0813432D0 (en) 2008-07-22 2008-08-27 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB0819095D0 (en) 2008-10-17 2008-11-26 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepines
CN102012425A (zh) * 2010-12-29 2011-04-13 南开大学 一种新的免疫荧光标记方法
MX393973B (es) 2011-05-08 2025-03-24 Legochem Biosciences Inc Conjugados de proteína-agente activo y método para su preparación.
KR101628872B1 (ko) * 2014-05-28 2016-06-09 주식회사 레고켐 바이오사이언스 자가-희생 기를 포함하는 화합물

Also Published As

Publication number Publication date
US20140187756A1 (en) 2014-07-03
EP2707031A4 (en) 2015-03-25
BR122020001787A8 (pt) 2023-04-25
US9669107B2 (en) 2017-06-06
JP6196613B2 (ja) 2017-09-13
JP2014519492A (ja) 2014-08-14
CA2835576A1 (en) 2012-11-15
CA2835576C (en) 2021-01-05
CN103648530B (zh) 2017-02-08
EP2707031A2 (en) 2014-03-19
DK2707031T3 (da) 2019-10-07
ES2744226T3 (es) 2020-02-24
IL229364A0 (en) 2014-01-30
HUE045348T2 (hu) 2019-12-30
US20180021451A1 (en) 2018-01-25
US20120308584A1 (en) 2012-12-06
MX364707B (es) 2019-05-06
HRP20191586T1 (hr) 2019-12-13
EP2707031B1 (en) 2019-06-26
CY1122152T1 (el) 2020-11-25
KR20140035393A (ko) 2014-03-21
SI2707031T1 (sl) 2019-10-30
US20150105541A1 (en) 2015-04-16
LT2707031T (lt) 2019-10-10
WO2012153193A2 (en) 2012-11-15
US20140161829A1 (en) 2014-06-12
JP2017206515A (ja) 2017-11-24
MX393973B (es) 2025-03-24
PT2707031T (pt) 2019-09-05
EP3610889A1 (en) 2020-02-19
RU2613906C2 (ru) 2017-03-21
US20160213786A1 (en) 2016-07-28
SG194875A1 (en) 2013-12-30
IL229364B (en) 2021-08-31
SMT201900500T1 (it) 2019-11-13
WO2012153193A3 (en) 2013-04-11
RU2013154264A (ru) 2015-06-20
MX2019001253A (es) 2019-07-04
CN103648530A (zh) 2014-03-19
IL269804A (en) 2019-11-28
US20200289662A1 (en) 2020-09-17
JP6385525B2 (ja) 2018-09-05
KR101921068B1 (ko) 2018-11-22
PL2707031T3 (pl) 2020-01-31
BR112013028907A2 (pt) 2017-01-31
US10583197B2 (en) 2020-03-10
BR122020001787A2 (sr) 2017-01-31
MX2013013069A (es) 2014-01-31
PH12013502284A1 (en) 2014-02-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2707031B1 (en) Protein-active agent conjugates and method for preparing the same
US12144869B2 (en) Anti-ROR1 antibody conjugates, compositions comprising anti ROR1 antibody conjugates, and methods of making and using anti-ROR1 antibody conjugates
KR20160080832A (ko) 리피바디 유도체-약물 복합체, 그 제조방법 및 용도
EP4257606A1 (en) Preparation and use of anti-fshr antibody and antibody-drug conjugate thereof
US12540197B2 (en) Anti-tissue factor antibodies and antibody conjugates, compositions comprising anti-tissue factor antibodies or antibody conjugates, and methods of making and using anti-tissue factor antibodies and antibody conjugates
HK40017656A (en) Protein-active agent conjugates and method for preparing the same
HK1190330A (en) Protein-active agent conjugates and method for preparing the same