RS59276B1 - Metode i kompozicije za lečenje karcinoma - Google Patents

Metode i kompozicije za lečenje karcinoma

Info

Publication number
RS59276B1
RS59276B1 RSP20190840A RS59276B1 RS 59276 B1 RS59276 B1 RS 59276B1 RS P20190840 A RSP20190840 A RS P20190840A RS 59276 B1 RS59276 B1 RS 59276B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
omomic
polypeptide
seq
functionally equivalent
cell
Prior art date
Application number
Other languages
English (en)
Inventor
Laura Soucek
Marie-Eve Beaulieu
Original Assignee
Fundacio Privada Inst Dinvestigacio Oncològica De Vall Hebron
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fundacio Privada Inst Dinvestigacio Oncològica De Vall Hebron filed Critical Fundacio Privada Inst Dinvestigacio Oncològica De Vall Hebron
Publication of RS59276B1 publication Critical patent/RS59276B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001152—Transcription factors, e.g. SOX or c-MYC
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/09—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear localisation signal
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

Opis
Polje pronalaska
[0001] Pronalazak se odnosi na medicinsku upotrebu Omomic polipeptida za lečenje karcinoma.
STANJE TEHNIKE
[0002] Idealno, lek za karcinom treba da ima za cilj neredundantnu funkciju koja je neophodna za održavanje tumora, ali nije neophodna za održavanje i funkcionisanje bilo kog normalnog tkiva. Dakle, najčešć a logika je da se stvore genetski proizvodi koji su specifično mutirani u karcinomu, na osnovu toga što bi ovi mutantni molekuli bili verovatno „pokretači“ karcinoma i, možda, manje kritični za normalna tkiva. Iz ovih razloga, velika pažnja je usmerena na katalogizaciju ponavljajuć ih lezija kod specifičnih tipova karcinoma. Nažalost, postoji nekoliko problema u vezi sa ovim pristupom. Prvo, već ina čvrstih humanih karcinoma prolazi kroz epizode genomske nestabilnosti i ispoljava mutacijsku reakciju koja može zamagliti mutacije "vozača" i njihovih prateć ih efektorskih puteva. Drugo, karcinomi su krajnji rezultat procesa koji uključuje tranzicije kroz višestruka razvojna uska grla. Svako usko grlo može zahtevati specifičan tip mutacije čija je funkcija nakon toga nepotrebna za održavanje tumora i, shodno tome, nije dobar terapeutski cilj nakon tog trenutka u evoluciji tumora.
[0003] Mic je osnovni protein helik-loop-helik leucin zipper (b-HLH-LZ) koji je uključen u kontrolu rasta i karcinom, koji funkcioniše u mreži sa strukturno srodnim proteinima Mak, Mad i Mnt. Mic / Mak dimeri aktivira transkripciju gena i indukuje proliferaciju ć elija ili apoptozu. Kompleksi Mad / Mak i Mnt / Mak deluju kao represori i uzrokuju zaustavljanje rasta ćelija i diferencijaciju. Svi dimeri prepoznaju istu DNK konsenzus lokaciju, CACGTG E-kutiju.
[0004] Mic je strogo regulisan u normalnim ć elijama, gde su njegovi nivoi ve ć i u proliferaciji i ni ži u neproliferaciji. Aberantno visoka i/ili deregulisana aktivnost Mic je uzročno povezana sa već inom karcinoma i često povezana sa agresivnim, slabo diferenciranim i angiogenim karcinomima. Deregulacija ekspresije Mic je posledica prekomerne ekspresije putem amplifikacije gena, gubitka kontrole transkripcije, naru šene degradacije ili poveć ane stabilizacije. Ovo dovodi do aberantne proliferacije, pove ć anog pre življavanja, promena u metabolizmu, angiogenezi i inflamaciji, koje sve predstavljaju glavne karakteristike karcinoma. Višestruke studije su potvrdile ključnu ulogu Mic-a u regulaciji intracelularnih i ekstracelularnih aspekata tumorogeneze, sugerirajuć i da bi ciljanje njegove funkcije bilo terapeutski korisno.
[0005] Poznato je da dovn-regulacija Mic-a pomoć u BET inhibitora bromodomena dovodi do regresije vi še tipova tumora (Delmore, J.E., et a., 2011, Cell, 146: 904-917). Iako ovaj pristup pokazuje dobar potencijal, on sadrži neka ograničenja kao što su toksičnost i brojni efekti izvan ciljne grupe.
[0006] Mnogi mali molekuli koji narušavaju Mic/Mak interakciju pokazuju nisku specifičnost u celulu (Prochovnik, E.V. i Vogt, P.K., 2010, Genes Cancer 1, 650-659).
[0007] Inhibitor Mic, međutim, još nije postao klinički dostupan, a njegov dizajn sadrži različite prepreke: prvo, Mic je nuklearni transkripcijski faktor, pa je stoga teže doć i do membranskih ili citoplazmatskih molekula; drugo, Mic nema enzimsku "aktivnu lokaciju" koja bi mogla biti ciljana; treć e, porodica Mic sadrži 3 različita proteina, c-, N i L-Mic, koji su u određenim uslovima funkcionalno redundantni, tako da svi oni zahtevaju istovremenu inhibiciju. Štaviše, sumnjalo se da bi inhibicija Mic izazvala ozbiljne sporedne efekte inhibicijom proliferacije normalnih tkiva. Iz svih ovih razloga, davanje Mic inhibitora je rizično.
[0008] Omomic je dominantno negativan MIC mutant koji sadrži b-HLH-LZ domen Mic i sadrži četiri supstitucije aminokiselina u leucinskom zatvaraču Mic (Soucek, L. i sar., 1998, Oncogene 17, 2463-2472 Soucek, L. i saradnici (2002), Cancer Res 62: 3507-3510). Amino kiselinske supstitucije E61T, E68I, R74K i R75N daju promenjenu specifičnost dimerizacije proteinu, koji zadržava sposobnost vezivanja svog prirodnog partnera Mak i formiranja homodimera i heterodimera sa divljim tipom c-, N- i L-Mic.
[0009] Zbog ovih svojstava, Omomic je u stanju da spreči Mic-zavisne funkcije transaktivacije gena, kako in vitro, tako i in vivo, negiraju ć i sposobnost Mic da stvori svoje mesto vezivanja za DNK, kutiju E (Savino, M. et al. , 2011, PLoS One 6, e22284, Soucek, L. i sar (2004), Cell Death Differ 11, 1038 1045). Istovremeno, Omomic snažno potencira Mic-indukovanu apoptozu na način koji zavisi od Mic nivoa ekspresije i time jača Mic transrepresionu aktivnost. Omomic tako sprečava vezivanje Mic za E-kutije promotora i transaktivaciju ciljnih gena, dok zadržava vezivanje za promotore i transrepresiju o zavisnosti od Miz-1. U prisustvu Omomic-a, Mic se interaktom kanališe u represiju, a njegova aktivnost se prebacuje iz proonkogenog u tumor supresivni.
[0010] TRE-Omomic, CMVrtTA miševi, u kojima je Omomic ekspresija kontrolisana od strane promotora tetraciklin-reagensa i široko eksprimirani rtTA transaktivator je vođen CMV promotorom, pokazuju visoku Omomic ekspresiju u ve ć ini tkiva nakon davanja doksiciklina (Soucek et al., 2008, Nature, 455: 679-683). Ovi miševi su ukršteni sa dobro uspostavljenim LSL-KrasG12D mišjim modelom tumorogeneze pluć a. Samo 3 dana Omomic ekspresije je bilo dovoljno da izazove dramatično skupljanje tumora i jedne nedelje čini životinje suštinski slobodnim od tumora. Važno je da, iako su druga deljena tkiva, kao što su koža, testisi i creva, pokazala značajno smanjene stope proliferacije tokom tretmana, i pokazala određeni stepen atrofije, miševi nisu pokazivali očite znakove distresa ili bolesti. Štaviše, neželjeni efekti Mic inhibicije koji su rezultat ekspresije Omomic-a su potpuno reverzibilni i nestaju nakon prekida terapije.
[0011] Do danas, uprkos činjenici da se pokazalo da je ekspresija Omomic-a efikasna strategija inhibiranja Mic in vivo, ona je primenjena isključivo putem pristupa genske terapije. Zaista, Omomic je peptid koji se smatra preglomaznim i neprikladnim za isporuku u željeni ć elijski deo (Montagne M. et al., PLoS One.
2012; 7: e32172. Doi: 10.1371 / journal.pone.0032172), Savino M. et al. al., PLoS One. 2011; 6: e22284. doi: 10.1371 / journal.pone.0022284) i Genes Dev., 2011, 25: 895-7. doi: 10.1101 / gad.2053311.)
[0012] Štaviše, predviđa se da Omomic pokazuje slabu sposobnost prevazilaženja fizioloških barijera zbog svojih unutrašnjih fizičko-hemijskih svojstava (npr. Hidrofobnost, kao što je predviđeno upotrebom Kite & Doolittle hidropatije, Kite J., Doolittle RF (1982) J. Mol. Biol., 157: 105-132). Pored toga, uprkos prisustvu nekoliko ostataka arginina unutar osnovnog regiona Omomic-a, najnoviji algoritmi koji predviđaju sposobnost spontane penetracije ć elija u peptide ne predvi đaju da Omomic poseduje takvu osobinu (Gautam et al. Journal of Translational Medicine 2013, 11: 74).
[0013] Stoga bi bilo korisno da se obezbede terapeutski pristupi za lečenje karcinoma zasnovanog na b-HLH-LZ domenama sposobnim za transdukciju preko celularne membrane eukariotskih ć elija i inhibiranje Mic-zavisne transaktivacije gena.
KRATAK PREGLED PRONALASKA
[0014] U prvom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid koji se sastoji od SEK ID BR: 1 ili njegove funkcionalno ekvivalentne varijante sa stepenom identiteta u odnosu na SEK ID BR: 1 već im od 70 %, pri čemu funkcionalno ekvivalentna varijanta "Polipeptid" je polipeptid koji je rezultat umetanja ili dodavanja jedne aminokiseline i/ili delecije iz jedne ili više aminokiselina i/ili konzervativne supstitucije iz jedne ili više amino kiselina u odnosu na polipeptid sa SEK ID BR: 1 i gde se njegova funkcionalno ekvivalentna varijanta može dimerizovati sa Mic i inhibirati njegovu aktivnost jednom pronađenu u nukleusu, kako bi bila sposobna da se translocira preko ć elijske membrane i preko nuklearne ovojnice za upotrebu u medicini, gde je administriran polipeptid ili njegova funkcionalno ekvivalentna varijanta.
[0015] U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid koji se sastoji od SEK ID BR: 1 ili njegove funkcionalno ekvivalentne varijante sa stepenom identiteta u odnosu na SEK ID BR: 1 već im od 70 %, pri čemu funkcionalno ekvivalentna varijanta "Polipeptid" je polipeptid koji je rezultat umetanja ili dodavanja jedne aminokiseline i/ili delecije iz jedne ili više aminokiselina i/ili konzervativne supstitucije iz jedne ili više aminokiselina u odnosu na polipeptid iz SEK ID BR: 1 i gde se njegova funkcionalno ekvivalentna varijanta može dimerizovati sa Mic i inhibirati njegovu aktivnost jednom pronađenu u nukleusu, kako bi bila sposobna da se translocira preko ć elijske membrane i preko nuklearne ovojnice za upotrebu u prevenciji i/ili tretmanu karcinoma, pri čemu se daje polipeptid ili funkcionalno ekvivalentna varijanta.
KRATAK OPIS SLIKA
[0016]
Slika 1. (A) Fluorescentno snimanje A549 ć elija inkubiranih 2h sa Omomic-FITC na 37 ° C pokazuje da je Omomic-FITC lokalizovan u jezgru i citoplazmi (B) Hoescht za bojenje jezgara. (C) Fazni kontrast.
Slika 2.Ć elije inkubirane sa 10 uM bilo Omomic ili Mak * prebrojane su i obojene sa AnnekinV i PI. (A) Ukupni broj ć elija PBS, Omomic- ili Mak-tretirani sa A549. (B) Procenat mrtvih ć elija obojenih sa PI. (C) Procenat živih (neobojenih) ć elija. (D) Procenat pozitivnih ć elija AnnekinV.
Slika 3. (A) Spektri cirkularnog dikroizma (CD) zabeleženi na 20 ° C za c-Mic *, Mak * i Omomic prečišć ene proteine (32 mM) pokazuju da Omomic ima presavijenu strukturu sličniju Mak * nego Mic * . (mdeg, millidegrees) (B) Termička denaturacija je proučavana kružnim dikroizmom na 1 ° C / min za c-Mic *, Mak * i Omomic prečišć ene proteine pokazuje da Omomic ima sklopljenu strukturu više termički stabilnu od Mak *. (° m, milidegre na specificiranoj talasnoj dužini od 222 nm).
Slika 4. Kvantifikacija fluorescencije iz konfokalne mikroskopske slike A549 ć elija fiksiranih sa 4 % PFA posle 2 sata inkubacije na 37 ° C sa Omomic ili Mak * pri različitim koncentracijama peptida (5, 10 i 25 mM) po slici). AU, proizvoljne jedinice.
Slika 5. Kvantifikacija fluorescencije iz konfokalne mikroskopske slike A549 živihć elija posle 20 minuta inkubacije na 37 ° C sa Omomic ili Mak * (20 mM). AU, proizvoljne jedinice.
Slika 6. Kristalno ljubičasto bojenjeć elija A549 i H1650 adenokarcinoma plu ć a tretiranih sa 25 mM Omomic ili Mak * peptidom za naznačena vremena.
Slika 7. Kvantifikacija inhibicije proliferacije kristal violet bojama A549 i H1650 ć elija plu ć ne adenokarcinoma tretiranih sa 25 mM Omomic ili Mak * peptidima za naznačena vremena.
Slika 8. Reakcija doze A549 ć elija na Omomic i Mak * pomo ć u kvantifikacije kristal violeta.
Slika 9. Kvantifikacija proliferacije U87 glioma ć elija tretiranih sa Omomic ili Mak * peptidima na 25 mM.
Slika 10. (A) Pluć a netretiranih (levo) i tretiranih (desnih) životinja 10 minuta nakon intranazalnog davanja fluorescentnog peptida Omomic (pojedinačna doza od 37,5 mg / kg). (B) Mozak netretiranih (levo) i tretiranih (desnih) životinja 10 minuta nakon intranazalnog davanja fluorescentnog peptida Omomic (pojedinačna doza od 37,5 mg / kg).
Slika 11. Tretiranje adenokarcinoma pluć a sa PBS ili sa Omomic intranazalnom administracijom. (A) Proliferativna stopa tumora. (B) Gustina ć elija.
Slika 12. Merenje površine tumora nakon tretmana adenokarcinoma pluć a sa PBS ili sa Omomic intranazalnom administracijom.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0017] Autori ovog pronalaska su otkrili da je, iznenađujuć e, Omomic sposoban da se efikasno transdukuje preko ć elijske membrane i da se translocira u nukleus, pri čemu vrši suzbijanje karcinoma. Prema tome, Omomic je bona fide domena proteinske transdukcije (PTD). Prema tome, po prvi put Omomic se mo že sam koristiti kao anti-Mic lek bez potrebe za korišć enjem sredstava za isporuku polipeptida u citoplazmu ć elije ili koriš ć enjem pristupa genske terapije za isporuku nukleinske kiseline koja kodira Omomic u ć eliju. Ovo omoguć ava upotrebu Omomic polipeptida za lečenje bolesti povezanih sa deregulisanom proliferacijom ć elija kao što je karcinom. Autori ovog pronalaska su otkrili da Omomic ima nekoliko prednosti u poređenju sa bHLHZ domenom od Mak (Mak *):
• Omomic pokazuje ve ć u sposobnost prodiranja u ć elije u odnosu na Mak * u različitim tipovima ć elija i na različitim koncentracijama (Primer 6)
• Omomic je termički stabilniji od Mak * i to je jasna prednost za dizajn leka (Primer 5)
• Omomic je efikasniji od Mak * u sprečavanju rasta ć elija (Primer 8) i pove ć anju smrtnosti ć elije karcinoma (Primer 4).
[0018] Pored toga, Omomic je sposoban da savlada krvno-moždanu barijeru (Primer 9 i Slika 10B) i ima terapeutski efekat in vivo (Primer 10).
Terapijske upotrebe Omomic-a
[0019] Predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid koji ima sekvencu SEK ID BR: 1, koja odgovara Omomic-u, ili njegovu funkcionalno ekvivalentnu varijantu za upotrebu u le čenju karcinoma.
[0020] U prvom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid koji se sastoji od SEK ID BR: 1 ili njegove funkcionalno ekvivalentne varijante sa stepenom identiteta u odnosu na SEK ID BR: 1 već im od 70 %, pri čemu funkcionalno ekvivalentna varijanta "Polipeptid" je polipeptid koji je rezultat umetanja ili dodavanja jedne aminokiseline i/ili delecije iz jedne ili više aminokiselina i/ili konzervativne supstitucije iz jedne ili više aminokiselina u odnosu na polipeptid od SEK ID BR: 1 i gde se njegova funkcionalno ekvivalentna varijanta može dimerizovati sa Mic i inhibirati njegovu aktivnost jednom pronađenu u nukleusu, da bi bila sposobna da se translocira preko ć elijske membrane i preko nuklearne ovojnice za upotrebu u medicini, gde su administrirani polipeptid ili njegova funkcionalno ekvivalentna varijanta. U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid koji se sastoji od SEK ID BR: 1 ili njegove funkcionalno ekvivalentne varijante sa stepenom identiteta u odnosu na SEK ID BR: 1 već im od 70 %, pri čemu je funkcionalno ekvivalentna varijanta polipeptid koji je rezultat umetanja ili dodavanja jedne aminokiseline i/ili delecije iz jedne ili više aminokiselina i/ili konzervativne supstitucije iz jedne ili vi še aminokiselina u odnosu na polipeptid sa SEK ID BR: 1 i pri čemu se njegova funkcionalno ekvivalentna varijanta može dimerizovati sa Mic i inhibirati njegovu aktivnost jednom pronađenu u nukleusu, kako bi bila sposobna da se translocira preko ć elijske membrane i preko nuklearne ovojnice za upotrebu u prevenciji i/ili le čenju karcinoma, pri čemu treba da se administrira polipeptid ili funkcionalno ekvivalentna varijanta .
[0021] Polipeptid sekvence SEK ID BR: 1 odgovara Omomic proteinskoj sekvenci. Termin "Omomic", kako je ovde korišć en, odnosi se na polipeptid koji se sastoji od mutirane verzije bHLHZip domena Mic koji nosi E61T, E68I, R74K i R75N mutacije (gde je numeracija mutiranih pozicija data u odnosu na sekvencu Mic regiona koja odgovara aminokiselinama 365-454 polipeptida kako je definisano pod pristupnim brojem NP_002458 u NCBI bazi podataka, izdanje od 27. juna 2012). Sekvenca c-Mic data u NCBI bazi podataka pod pristupnim brojem NP_002458 je prikazana ispod, pri čemu je regija iz koje Omomic potiče prikazana kao podvučena:
[0022] Polinukleotid koji kodira Omomic (SEK ID BR: 3) i odgovarajuć a polipeptidna sekvenca (SEK ID BR: 1) su prikazani ispod, gde podvučeni i podebljani tripleti odgovaraju onim pozicijama koje su mutirane u odnosu na Mic:
[0023] Omomic takođe sadrži M2 domen c-Mic, koji ima sekvencu RKRRNELKRSF (SEK ID BR: 49) (videti Dang i Lee, Mol.Cell. Biol., 1988, 8: 4048-4054) (dvostruko podvučeno gore), i koji odgovara signalu nuklearne lokalizacije.
[0024] Omomic je karakteriziran time što pokazuje poveć ani kapacitet dimerizacije sa sva tri onkogena Mic proteina (c-Mic, N-Mic i L-Mic). Omomic može poticati iz bHLHZip domena bilo kojeg Mic proteina poznatog u struci, pod uslovom da su očuvane mutacije koje dovode do efekta supresivnog tumora. Prema tome, Omomic koji se može koristiti u ovom pronalasku može poticati od bilo koje vrste sisara, uključujuć i, ali ne ograničavaju ć i se na, doma ć e životinje (krave, konje, svinje, ovce, koze, pse, mačke ili glodare), primate i ljude. Poželjno, Omomic protein je izveden iz humanog Mic proteina (pristupni broj NP_002458, oslobađanje od 27. juna 2012).
[0025] Termin "Mic", kako se ovde koristi, odnosi se na familiju transkripcionih faktora koja uklju čuje c-Mic, N-Mic i L-Mic. Mic protein aktivira ekspresiju mnogih gena putem vezivanja na konsenzus sekvencu CACGTG (sekvence Enhancer Bok ili E-kutije i regrutovanje histon acetil-transferaza ili HAT). Međutim, Mic može da deluje i kao transkripcijski represor. Povezivanjem Miz-1 transkripcionog faktora i potiskivanjem p300 koaktivatora, on inhibira ekspresiju Miz-1 ciljnih gena. Mic tako đe ima direktnu ulogu u kontroli replikacije DNK.
[0026] Domen Mic b-HLH-LZ ili Mic osnovnog regiona helik-loop-helik leucin zipper se odnosi na region koji određuje dimerizaciju Mic sa Mak proteinom i vezivanje za Mic-ciljne gene. Ovaj region odgovara aminokiselinama 365-454 humanog Mic i karakterišu ga dva alfa heliksa povezana petljom (Nair, S.K., & Burlei, S.K., 2003, Cell, 112: 193-205).
[0027] Termin "funkcionalno ekvivalentna varijanta", kada se odnosi na Omomic, odnosi se na bilo koji polipeptid koji je rezultat delecije, insercije ili dodavanja jedne ili vi še aminokiselina u odnosu na polipeptid SEK ID BR: 1 ili koji je rezultat hemijske modifikacije polipeptida SEK ID BR: 1 i koji su štinski čuva tumorsku supresorsku aktivnost Omomic polipeptida. Stručnjak iz ove oblasti ć e razumeti da očuvanje tumorske supresorske aktivnosti Omomic-a zahteva da se varijanta mo že dimerizovati sa Mic i inhibirati njegovu aktivnost jednom pronađenu u jezgru, kako bi bila sposobna da se translocira preko ć elijske membrane i da se translocira preko nuklearnog omotača.
[0028] Pogodne funkcionalno ekvivalentne varijante Omomic-a obuhvataju polipeptide koji se u su štini sastoje od polipeptida SEK ID BR: 1. U ovom kontekstu, "sastavljen u suštini od" znači da specificirani molekul ne sadrži nikakve dodatne sekvence koje bi promenile aktivnost Omomic-a.
[0029] Pogodne funkcionalne varijante ciljnog peptida su one koje pokazuju stepen identiteta u odnosu na peptid od SEK ID BR: 1 od oko 70 % identičnosti aminokiselinske sekvence, kao što je 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ili 99 %. Stepen identiteta između dva polipeptida je određen korišć enjem kompjuterskih algoritama i postupaka koji su široko poznati stručnjacima. Identitet između dve aminokiselinske sekvence je poželjno određen korišć enjem BLASTP algoritma kao što je prethodno opisano [BLAST priručnik, Altschul, S., i sar., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S., et al., J Mol. Biol. 1990; 215: 403-410]. U poželjnoj realizaciji, identitet sekvence je određen u celoj dužini polipeptida sa SEK ID BR: 1 ili kroz celu dužinu varijante ili obe.
[0030] Funkcionalno ekvivalentne varijante Omomic polipeptida mogu takođe uključivati posttranslacione modifikacije, kao što su glikozilacija, acetilacija, izoprenilacija, miristilacija, proteoliti čka obrada, itd.
[0031] Alternativno, pogodne funkcionalne varijante ciljnog peptida su one u kojima jedna ili vi še pozicija unutar Omomic polipeptida sadrži aminokiselinu koja je konzervativna supstitucija aminokiseline prisutne u Omomic proteinu kako je naveden napred. "Konzervativne aminokiselinske supstitucije" su rezultat zamene jedne aminokiseline sa drugom koja ima slična strukturna i/ili hemijska svojstva. Na primer, sledeć ih šest grupa sadrže aminokiseline koje su konzervativne supstitucije jedna za drugu: 1) Alanin (A), Serin (S), Treonin (T); 2) asparaginska kiselina (D), glutaminska kiselina (E); 3) asparagin (N), glutamin (K); 4) arginin (R), lizin (K); 5) izoleucin (I), leucin (L), metionin (M), valin (V); i 6) fenilalanin (F), tirozin (I), triptofan (V). Izbor takvih konzervativnih aminokiselinskih supstitucija je u okviru stru čnosti prosečnog stručnjaka i opisan je, na primer, od strane Dordo et al. et al., (J. Mol. Biol, 1999, 217; 721-739) i Tailor et al., (J. Theor. Biol., 1986, 119: 205-218).
[0032] Podrazumeva se da funkcionalno ekvivalentne varijante Omomic-a sadr že mutacije na pozicijama koje odgovaraju mutacijama E61T, E68I, R74K i R75N koje su pronađene u Omomic-u izvedene iz humanog c-Mic. Položaj u kome se navedene mutacije moraju pojaviti u funkcionalno ekvivalentnoj varijanti mo že se odrediti višestrukim poravnanjem sekvenci različitih Mic sekvenci i identifikuje se poravnanjem onih pozicija koje odgovaraju pozicijama 61, 68, 74 i 75 unutar sekvence Omomic izvedene iz humani c-Mic.
[0033] Poravnavanje višestruke sekvence je produžetak poravnanja u parovima da bi se ugradilo više od dve sekvence u isto vreme. Metode višestrukog poravnanja usklađuju sve sekvence u datom skupu parametara. Poželjan program za višestruko poravnavanje sekvenci (i njegov algoritam) je ClustalV, Clusal2V ili ClustalV KSKSL (videti Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res 22: 4673-4680). Kada se sekvence c-Mic iz različitih organizama i varijante uporede (poravnaju) kao što je ovde opisano, stručnjak može lako da identifikuje pozicije unutar svake sekvence koja odgovara pozicijama i da unese u Omomic varijantne mutacije koje odgovaraju E61T, E68I, R74K i R75N mutacije pronađene u Omomic i izvedene iz humanog c-Mic.
[0034] Pogodni testovi za određivanje da li se polipeptid može smatrati funkcionalno ekvivalentnom varijantom Omomic-a uključuju, bez ograničenja:
- Analize koje mere kapacitet polipeptida da formira dimerne komplekse sa Mak i Mic, kao što su testovi zasnovani na ekspresiji reporter gena kao što je opisano u Soucek et al. (Oncogene, 1998, 17: 2463 - 2472) kao i PLA (test ligacije proteina) ili ko-imunoprecipitacija.
- Analize koje mere kapacitet polipeptida da se veže na Mic/Mak mesto prepoznavanja unutar DNK (CACGTG mesto), kao što je test elektroforske mobilnosti (EMSA) opisan u Soucek et al. (supra.)
- Analize koje mere sposobnost da se potisne transaktivacija indukovana sa Mic, kao što je test zasnovan na ekspresiji reporter gena pod kontrolom DNK vezujuć ih mesta specifi čnih za Mic/Mak kao što su opisali Soucek et al. (supra.).
- Testovi zasnovani na kapacitetu polipeptida da inhibiraju rast ć elija koje eksprimiraju mic onkogen, kao što su opisali Soucek et al. (supra.).
- Analize koje mere sposobnost polipeptida da poboljša mio-indukovanu apoptozu, kao što su testovi koje su opisali Soucek et al. (Oncogene, 1998: 17, 2463 - 2472). Štaviše, može se koristiti bilo koji test koji je uobičajen u struci za procenu apoptoze u ć eliji, kao što je Hoechst bojenje, propidijum jodid (PI) ili obojenje aneksinom V), tripan plavo, DNK lestvica/fragmentacija i TUNEL.
[0035] U poželjnoj realizaciji, polipeptid se smatra funkcionalno ekvivalentnom varijantom Omomic-a ako pokazuje aktivnost u jednom ili više gornjih testova koji sadrži najmanje 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ili 100 % rodnog Omomic-a.
[0036] Pored toga, funkcionalno ekvivalentne varijante Omomic-a su takođe sposobne da transdukuju ć elije nakon što se varijanta dovede u kontakt sa navedenom ć elijom. Podrazumeva se da funkcionalno ekvivalentne varijante Omomic-a sadrže domen transdukcije proteina koji se nalazi u prirodnom Omomic ili drugom funkcionalnom domenu transdukcije proteina.
[0037] Termin "peptidna sekvenca koja prodire u ć elije" se koristi u ovoj specifikaciji naizmeni čno sa "CPP", "domenom za transdukciju proteina" ili "PTD". Odnosi se na peptidni lanac promenljive du žine koji usmerava transport proteina unutar ć elije. Proces isporuke u ć eliju se obi čno dešava putem endocitoze, ali se peptid, takođe, može internalizovati u ć eliju pomo ć u direktne translokacije membrane. CPP tipi čno imaju aminokiselinski sastav koji ili sadrži visoku relativnu zastupljenost pozitivno naelektrisanih aminokiselina kao što je lizin ili arginin ili ima sekvence koje sadrže naizmenični obrazac polarne/ nabijene aminokiseline i nepolarne, hidrofobne amino kiseline. Primeri CPP-a koji se mogu koristiti u ovom pronalasku uključuju, bez ograničenja, CPP koji je pronađen u Drosophila antennapedia proteinu (RKIKIVFKNRRMKVKK. SEK ID BR: 4), CPP pronađen u herpesvirusu simplek 1 (HSV-1) VP22 DNK-vezujuć em proteinu (DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE, SEK ID BR: 5), CPP Bac-7 (RRIRPRPPRL-PRPRPRPLPFPRPG; SEK ID BR: 6), CPPs HIV-1 TAT proteina koji se sastoji od aminokiselina 49-57 (RKKRRKRRR, SEK ID BR: 7), aminokiseline 48-60 (GRKKRRKRRRTPK, SEK ID BR: 8), aminokiseline 47-57 (IGRKKRRKRRR; SEK ID BR: 9); CPP S413-PV peptida (ALVKTLLKKVLKAPKKKRKV; SEK ID BR: 10), CPP penetratina (RKIK-VFKNRRMKVKK; SEK ID BR: 11), CPP SinB1 (RGGRLSISRRRFSTSTGR; SEK ID BR: 12), CPP od SinB3 (RRLSISRRRF; SEK ID BR: 13), CPP PTD-4 (PIRRRKKLRRLK; SEK ID BR: 14), CPP PTD-5 (RRKRRTSKLMKR; SEK ID BR: 15), CPP FHV Coat- (35-49) (RRRRNRTRRNRRRVR; SEK ID BR: 16), CPP BMV Gag- (7-25) (KMTRAKRRAAARRNRVTAR; SEK ID BR: 17), CPP HTLV-II Rek- (4-16) (TRRKR-TRRARRNR; SEK ID BR: 18), CPP D- Tat (GRKKRRKRRRPPK; SEK ID BR: 19), CPP R9-Tat (GRRRRRRRRRPPK; SEK ID BR: 20), CPP MAP (KLALKLALKLALALKLA; SEK ID BR: 21), CPP SBP (MGLGLHLLVLAAALKGAVSKPKKKRKV; SEK ID BR : 22), CPP FBP (GALFLGVLGAAGSTMGAVSKP-KKKRKV; SEK ID BR: 23), CPP MPG (ac-GALFLGFLGAAGSTMGAVSKPKKKRKV-cia; SEK ID BR: 24), CPP MPG (ENLS) (ac-GALFLGFLGAAGSTMGAVSKPKSKRKV- cia; SEK ID BR: 25), CPP Pep-1 (ac-KET-VVETVVTEVSKPKKKRKV-cia; SEK ID BR: 26), CPP Pep-2 (ac-KETVFETVFTEVSKPKKKRKV-cia; SEK ID BR: 27) , polargininska sekvenca koja ima strukturu RN (gde je N između 4 i 17), sekvenca GRKKRRKRRR (SEK ID BR: 28), RRRRRRLR sekvenca (SEK ID BR: 29), RRKRRTS KLMKR sekvenca (SEK ID BR: 30) ); Transportan GVTLNSAGILLGKINLKALAALAKKIL (SEK ID BR: 31); KALAVEAKLAKALAKALAKHLAKA- LAKALKCEA (SEK ID BR: 32); RKIKIVFKNRRMKVKK (SEK ID BR: 33), sekvenca IGRKKRRKRRR (SEK ID BR: 34); sekvenca RKKRRKRR (SEK ID BR: 35); sekvenca IARAAARKARA (SEK ID BR: 36); sekvenca THRL-PRRRRRR (SEK ID BR: 37); sekvenca GGRRARRRRRR (SEK ID BR: 38).
[0038] Odgovarajuć i testovi za određivanje da li polipeptid čuva kapacitet Omomic-a za translokaciju ć elijske membrane, obuhvataju, bez ograničenja, testove koji mere kapacitet polipeptida da transdukuje ć elije u kulturi, kao što je test prikazan u primeru 3 ovog pronalaska. Ovaj test se zasniva na kontaktiranju polipeptida sa ć elijama kulture i detektovanjem prisustva polipeptida u intracelularnoj lokaciji. U poželjnoj realizaciji, detekcija polipeptida iz ovog pronalaska se izvodi pomoć u fluorescentne mikroskopije.
[0039] U poželjnoj realizaciji, polipeptid se smatra funkcionalno ekvivalentnom varijantom Omomic-a ako je sposoban da transdicira ciljnu ć eliju najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% , 80%, 90% ili 100% jednako efikasno kao i prirodni Omomic.
[0040] Pored toga, funkcionalno ekvivalentne varijante Omomic-a su takođe sposobne da dostignu jezgra transdukovanih ć elija nakon što se varijanta dovede u kontakt sa navedenom ć elijom. Podrazumeva se da funkcionalno ekvivalentne varijante Omomic-a sadrže NLS koji se nalazi u prirodnom Omomic-u ili drugom funkcionalnom NLS-u.
[0041] Termin "signal nuklearne lokalizacije", kako je ovde korišć en, odnosi se na aminokiselinsku sekvencu od oko 4-20 aminokiselinskih ostataka u dužini, koja služi za usmeravanje proteina u nukleus. Tipično, nuklearna lokalizaciona sekvenca je bogata baznim aminokiselinama i primerne sekvence su dobro poznate u tehnici (Gorlich D. (1998) EMBO 5.17: 2721-7). U nekim realizacijama, NLS je izabran iz grupe koja se sastoji od SV40 velikog T antigena NLS (PKKKRKV, SEK ID BR: 39); Nucleoplasmin NLS (KRPAATKKAGK AKKKK, SEK ID BR: 40); CBP80 NLS (RRRHSDEND-GGKPHKRRK, SEK ID BR: 41); HIV-I Rev protein NLS (RKARRNRRRVE, SEK ID BR: 42); HTLV-I Rek (MPKTRRRPRRSKRKRPPT, SEK ID BR: 43); hnRNP A NLS (NKSSNFGPMKGGNFGGRSSGPIGGGGKIFK-PRNKGGI, SEK ID BR: 44); rpL23a NLS (VHSHKKKKIRTSPTFTTPKTLRLRRKPKIPRKSAPRRNKLDHI, SEK ID BR: 45). U jednoj realizaciji pronalaska, signal nuklearne lokalizacije sadrži motiv K (K/R) Ks (K/R) (SEK ID BR: 46).
[0042] Pogodni testovi za određivanje da li je polipeptid funkcionalno ekvivalentna varijanta Omomic-a u smislu njegove sposobnosti da se translocira preko ć elijske membrane uključuje dvostruko obeležavanje ć elije sa reagensom specifičnim za polipeptid i sa bojom koja specifično označava nukleus ć elije (kao što je DAPI ili Hoechst boja). Takvi testovi su prikazani u Primeru 6 predmetnog pronalaska. U po željnoj realizaciji, detekcija polipeptida iz ovog pronalaska se izvodi konfokalnom mikroskopijom ili fluorescentnom mikroskopijom.
[0043] U poželjnom izvođenju, polipeptid se smatra funkcionalno ekvivalentnom varijantom Omomic-a ako je sposoban da se translocira u nukleus ciljnih tumorskih ć elija najmanje 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ili 100 % jednako efikasno kao i prirodni Omomic.
[0044] Pogodne funkcionalno ekvivalentne varijante koje ne čine deo pronalaska uključuju polipeptide Omomic * TAT i Omomic * LZArg kao što je definisano u daljem tekstu:
[0045] Prema pronalasku, Omomic polipeptid ili njegova funkcionalno ekvivalentna varijanta se koriste za prevenciju ili lečenje karcinoma kod subjekta. Podrazumeva se da preventivna ili terapeutska upotreba prema pronalasku uključuje direktnu upotrebu Omomic polipeptida ili njegove funkcionalno ekvivalentne varijante. Tako, preventivna ili terapeutska upotreba prema pronalasku ne uklju čuje davanje nukleinske kiseline koja kodira Omomic ili njenu funkcionalno ekvivalentnu varijantu.
[0046] Pod "prevencijom" podrazumeva se davanje polipeptida koji se sastoji iz SEK ID BR: 1 ili njegove funkcionalno ekvivalentne varijante u skladu sa prvim aspektom pronalaska, ili leka koji ga sadr ži u početnoj ili ranoj fazi bolesti, ili da spreči njeno nastajanje.
[0047] Termin "tretman" se koristi za označavanje primene polipeptida koji se sastoji od SEK ID BR: 1 ili njegove funkcionalno ekvivalentne varijante prema prvom aspektu pronalaska, ili leka koji ga sadr ži da bi kontrolisao napredovanje bolesti pre ili nakon pojave kliničkih simptoma. Kontrola progresije bolesti podrazumeva korisne ili željene kliničke rezultate koji uključuju, ali nisu ograničeni na, smanjenje simptoma, smanjenje vremena trajanja bolesti, stabilizaciju patolo ških stanja (posebno izbegavanje dodatnog ošteć enja), odlaganje progresije bolesti, poboljšanje patološkog stanja i remisije (i parcijalne i kompletne). Kontrola progresije bolesti takođe uključuje povećanje preživljavanja u odnosu na očekivano preživljavanje ukoliko se tretman nije primenio.
[0048] Termin "karcinom" odnosi se na bolest koju karakterišu nekontrolisana deljenja ć elija (ili poveć anjem otpornosti na preživljavanje ili apoptozu), sposobnoš ć u navedenih ć elija da napadnu druga susedna tkiva (invazija) ili širenjem na druge oblasti tela gde ć elije nisu normalno locirane (metastaze) kroz limfne i krvne sudove. U zavisnosti od toga da li se tumori mogu širiti invazijom ili metastazama, klasifikuju se kao benigni ili maligni: benigni tumori su tumori koji se ne mogu širiti invazijom ili metastazama, tj. dok su maligni tumori tumori koji se mogu širiti invazijom i metastazama. Medicinska upotreba u skladu sa ovim pronalaskom je korisna za lečenje lokalnih i malignih tumora. Kako se ovde koristi, termin karcinom obuhvata, ali nije ograničen na, sledeć e tipove karcinoma: karcinom dojke; karcinom žučnih puteva; karcinom bešike; karcinom mozga uključujuć i glioblastome i meduloblastome; karcinom grlić a materice; horiokarcinom; karcinom debelog creva; karcinom endometrijuma; karcinom jednjaka; karcinom želuca; hematološke neoplazme uključujuć i akutnu limfocitnu i mijelogenu leukemiju; T-ć elijska akutnu limfoblastičnu leukemiju/limfom; leukemiju dlakavih ć elija; hroničnu mijelogenu leukemiju, multipla mijelom; leukemije povezane sa AIDS-om i leukemiju/limfom odraslih T-ć elija; intraepitelne neoplazme uključujuć i Bovenovu bolest i Pagetovu bolest; karcinom jetre; karcinom plu ć a; limfome uključujuć i Hodglun-ovu bolest i limfocitne limfome; neuroblastome; karcinom usne šupljine uključujuć i karcinom skvamoznih ć elija; karcinom jajnika, uključuju ć i one koji potiču od epitelnih ć elija, stromalnih ć elija, ć elija zametaka i mezenhimalnih ć elija; karcinom pankreasa; karcinom prostate; karcinom rektuma; sarkome uključujuć i leiomiosarkom, rabdomiosarkom, liposarkom, fibrosarkom i osteosarkom; karcinom slezine, uključujuć i melanom, karcinom Merkelovih ć elija, Kaposijev sarkom, karcinom bazalnih ć elija i karcinom skvamoznih ć elija; karcinom testisa uključuju ć i germinalne karcinome kao što su seminom, ne-seminom (teratomi, horiokarcinomi), stromalni tumore i tumore zametnih ć elija; karcinom štitne žlezde uključujuć i adenokarcinom štitne žlezde i medularni karcinom; i karcinom bubrega, uključujuć i adenokarcinom i Vilmsov tumor. Drugi oblici karcinoma ć e biti poznati stru čnjaku u ovoj oblasti. U poželjnoj realizaciji, lečeni karcinom je karcinom pluć a, poželjno adenokarcinom plu ć a, poželjnije KRas-vođen adenokarcinom pluć a.
[0049] Autori ovog pronalaska su takođe primetili da Omomic ili njegova funkcionalno ekvivalentna varijanta mogu smanjiti proliferaciju ć elija bez obzira da li karcinom pokazuje pove ć anu ekspresiju ili aktivnost Mic proteina.
[0050] "Predmet", kako se ovde koristi, uključuje bilo koju životinju koja ima karcinom ili pokazuje simptome karcinoma, ili je pod rizikom od karcinoma ili ima simptom karcinoma. Pogodni subjekti (pacijenti) uključuju laboratorijske životinje (kao što su miš, pacov, zec ili zamorac), domać e životinje ili kuć ne ljubimce (kao što su mačka ili pas). Ne-humani primati i, poželjno, humani pacijenti su uključeni.
[0051] Odgovarajuć a doza Omomic-a ili njegove funkcionalno ekvivalentne varijante koja ć e se koristiti u skladu sa ovim pronalaskom zavisić e od različitih faktora kao što su tip karcinoma koji se leči, težina i tok bolesti, da li se kompozicija primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, prethodnu terapiju, klini čku istoriju pacijenta i reakciju na peptid ili polipeptid, i procenu lekara.
[0052] Količina polipeptida SEK ID BR: 1, ili njena funkcionalno ekvivalentna varijanta, pogodno se daje pacijentu u jednom trenutku ili putem serije tretmana. U zavisnosti od tipa i ozbiljnosti bolesti, odgovarajuć i nivo doze ć e generalno biti oko 0,01 do 500 mg po kg telesne težine pacijenta na dan u koji se može primeniti u pojedinačnim ili višestrukim dozama. Poželjno, nivo doze ć e biti oko 0.1 do oko 250 mg/kg dnevno; poželjnije oko 0.5 do oko 100 mg/kg dnevno. Odgovarajuć i nivo doze može biti oko 0.01 do 250 mg/kg dnevno, oko 0.05 do 100 mg/kg dnevno, ili oko 0.1 do 50 mg/kg dnevno. Unutar ovog opsega doza može biti 0,05 do 0,5, 0,5 do 5 ili 5 do 50 mg/kg dnevno. Za oralno davanje, kompozicije su poželjno obezbeđene u obliku tableta koje sadrže 1.0 do 1000 miligrama aktivnog sastojka, naročito 1.0, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0, 50.0, 75.0, 100.0, 150.0, 200.0, 250.0, 300.0400.0, 500.0, 600.0, 750.0, 800.0, 900.0 i 1000.0 miligrama aktivnog sastojka za simptomatsko prilagođavanje doze pacijentu koji se treba lečiti. Jedinjenja se mogu primenjivati u režimu od 1 do 4 puta dnevno, poželjno jednom ili dva puta dnevno.
[0053] Polipeptid sa SEK ID BR: 1, ili njegova funkcionalno ekvivalentna varijanta, treba primeniti na bilo koji pogodan način, kao što je oralnim putem, topikalnim putem, inhalacijom ili parenteralnim putem, tako da ć e biti uključeni farmaceutski prihvatljivi ekscipijenti neophodni za formulaciju željenog doznog oblika. Poželjan način davanja navedenih farmaceutskih kompozicija je endovenski put. U jo š jednom izvođenju, način davanja je intranazalni put.
[0054] U jednom izvođenju, Omomic ili njegova funkcionalno ekvivalentna varijanta je pripremljena sa nosačima koji ć e sprečiti eliminaciju navedenog polipeptida iz tela, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujuć i implantate i mikroinkapsulirane sisteme administracije. Mogu se koristiti biološki razgradivi biokompatibilni polimeri, kao što su etilen-vinilacetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polimlečna kiselina. Postupci za pripremu navedenih formulacija bi ć e jasni stručnjacima u ovoj oblasti. Materijali se takođe komercijalno mogu dobiti u Alza Corporation i Nova Pharmaceuticals, Inc.
1
[0055] Uprkos činjenici da Omomic i njegove funkcionalno ekvivalentne varijante mogu da se prenose preko bioloških membrana, moguć e je formulisati Omomic ili bilo koju od njegovih funkcionalno ekvivalentnih varijanti u nanočesticama. Nanočestice mogu doprineti očuvanju integriteta polipeptida u biološkim tečnostima sve dok ne dospeju u željeni organ. Pored toga, nanočestice se takođe mogu modifikovati tako da uključuju delove koji omoguć avaju ciljanje nanočestice na organ. Na ovaj način, Omomic ili njegova funkcionalno ekvivalentna varijanta ć e biti isporu čeni u blizini željenog organa, olakšavajuć i pristup Omomic-a unutrašnjosti ć elija gde je potrebna njegova biološka aktivnost.
[0056] Prema tome, u još jednom izvođenju, Omomic ili bilo koja njegova funkcionalno ekvivalentna varijanta su obezbeđeni kao deo nanočestice.
[0057] Kao što se ovde koristi, termin "nanočestica" se odnosi na bilo koji materijal koji ima dimenzije u opsegu od 1 do 1000 nm. U nekim realizacijama, nanočestice imaju dimenzije u opsegu 2-200 nm, poželjno u opsegu 2-150 nm, a još poželjnije u opsegu 2-100 nm. Nanočestice koje se mogu koristiti u ovom pronalasku uključuju takve materijale kao što su nanočestice na bazi lipida, superparamagnetnu nanočesticu, nanošel, nanokristal poluvodiča, kvantnu tačku, nanočestice na bazi polimera, nanočestice na bazi silicijuma, bazirane nanočestice, nanočestice na bazi metala, fuleren i nanocevi.
[0058] Željena isporuka se može postić i dodavanjem liganda bez ugrožavanja sposobnosti nanočestica da isporuče svoje polipeptidne korisne sadržaje. Smatra se da ć e to omogu ć iti isporuku specifičnim ć elijama, tkivima i organima. Ciljna specifičnost ligand-baziranih sistema za isporuku zasniva se na raspodeli receptora liganda na različitim tipovima ć elija. Ligand za ciljanje može biti ili ne-kovalentno ili kovalentno povezan sa nanočesticama, i može biti konjugovan sa nanočesticama različitim metodama kako je ovde opisano.
[0059] Primeri proteina ili peptida koji se mogu koristiti za ciljanje nano čestica uključuju transferin, laktoferin, TGF-p, nervni faktor rasta, albumin, HIV Tat peptid, RGD peptid i insulin, kao i druge.
[0060] Podrazumeva se da formulacija Omomic-a ili njegove funkcionalno ekvivalentne varijante u nanočesticama nije namenjena ili nije isključivo namenjena za olakšavanje pristupa Omomic-a unutrašnjosti ć elije, ve ć da zaštiti Omomic-a od degradacije i/ili za olakšavanje usmeravanja nanočestica na organ od značaja.
Omomic konjugati i fuzioni proteini koji sadrže Omomic
[0061] Pronalazak takođe opisuje konjugate koji uključuju prvu oblast koja sadrži polipeptid sa SEK ID BR: 1 ili njegovu funkcionalno ekvivalentnu varijantu i drugu oblast koja sadr ži hemijski deo koji olakšava prijem ć elija u polipeptid. Primeri delova za pove ć anje ćelijskog unosa uključuju, ali nisu ograničeni na: hidrofobnu grupu (npr. lipid ili masnu kiselinu), domen za transdukciju proteina i odre đene metalne helate.
[0062] Prisustvo dodatnih hemijskih delova u molekulu Omomic-a dovodi do konjugata koji pokazuju poveć anu sposobnost da se translociraju preko bioloških membrana u odnosu na nemodifikovani Omomic, što dovodi do poveć ane aktivnosti supresorskog tumora.
[0063] Prema tome, takođe je opisan konjugat koji sadrži:
(i) polipeptid SEK ID BR: 1 ili njegovu funkcionalno ekvivalentnu varijanta, i
(ii) hemijski deo koji olakšava prijem ć elija u polipeptid.
[0064] Termin "konjugat", kako je ovde korišć en, odnosi se na dva ili više jedinjenja koja su kovalentno vezana zajedno tako da je funkcija svakog jedinjenja zadržana u konjugatu.
[0065] U poželjnoj primeni, konjugati, kao što je opisano, obuhvataju najmanje 1, najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9, na najmanje 10 ili vi še hemijskih grupa koje olakšavaju prijem ć elija polipeptida ili njegove funkcionalno ekvivalentne varijante.
[0066] U drugoj primeni, hemijska grupa koja olakšava prijem ć elija polipeptida je lipid ili masna kiselina.
[0067] Masna kiselina je uopšteno govoreći molekul koji sadrži ugljenični lanac sa kiselim ostatkom (npr. karboksilna kiselina) na kraju lanca. Ugljenični lanac masne kiseline može biti bilo koje dužine, međutim, poželjno je da je dužina ugljeničnog lanca bude najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više atoma ugljenika, i bilo koji raspon izveden u njemu. U određenim opisima, dužina ugljeničnog lanca je od 4 do 18 atoma ugljenika u lančanom delu masne kiseline. U određenim izvođenjima, ugljenični lanac masne kiseline može da sadrži neparan broj atoma ugljenika, međutim, u određenim izvođenjima može biti poželjan paran broj atoma ugljenika u lancu. Masna kiselina koja sadrži samo jednostruke veze u svom ugljeničnom lancu naziva se zasić ena, dok se masna kiselina koja sadrži najmanje jednu dvostruku vezu u svom lancu naziva nezasić ena. Masna kiselina mo že biti razgranata, mada u poželjnom izvođenju, ona je nerazgranata. Specifične masne kiseline uključuju, ali nisu ograničene na, linoleinsku kiselinu, oleinsku kiselinu, palmitinsku kiselinu, linolensku kiselinu, stearinsku kiselinu, laurinsku kiselinu, miristinsku kiselinu, arahidinsku kiselinu, palmitoleinsku kiselinu, arahidonsku kiselinu.
[0068] U poželjnom izvođenju, hemijska grupa koja olakšava prijem ć elija u polipeptid je peptidna sekvenca koja prodire u ć elije, u kom slučaju je konjugat fuzioni protein koji sadrži Omomic ili njegovu funkcionalno ekvivalentnu varijantu i peptidnu sekvencu koja prodire u ć elije.
[0069] Termin "fuzioni protein" odnosi se na proteine generisane genskom tehnologijom koja se sastoji od dva ili više funkcionalnih domena izvedenih iz različitih proteina. Fuzioni protein može se dobiti konvencionalnim sredstvima, npr. pomoć u ekspresije gena nukleotidne sekvence koja kodira navedeni fuzioni protein u odgovarajućoj ć eliji. Podrazumeva se da se peptid koji prodire u ć elije odnosi na peptid koji prodire uć elije i koji se razlikuje od peptida koji prodire u ć elije i koji čini deo polipeptida SEK ID BR: 1 ili njegove funkcionalno ekvivalentne varijante.
[0070] Termini "polipeptid SEK ID BR: 1", "funkcionalno ekvivalentna varijanta polipeptida SEK ID BR: 1" i "peptid koji prodire u ć elije" su detaljno opisani u kontekstu medicinske upotrebe pronalaska i jednako su primenljivi u kontekstu fuzionog proteina.
[0071] U poželjnom izvođenju, navedeni peptid koji prodire kroz ć elije nije endogeni peptid koji prodire uć elije Omomic.
[0072] U jednom izvođenju, peptidna sekvenca koja prodire kroz ć elije je fuzionisana na N-kraju polipeptida SEK ID BR: 1 ili njegove funkcionalno ekvivalentne varijante. U drugom izvo đenju, peptid koji prodire kroz ć elije je fuzionisan na C-kraju polipeptida SEK ID BR: 1 ili njegove funkcionalno ekvivalentne varijante.
[0073] U poželjnim izvođenjima, fuzioni proteini, kao što je opisano, obuhvataju, pored sopstvenog peptida koji prodire u ć elije i koji se nalazi u polipeptidu SEK ID BR: 1 ili njegove funkcionalno ekvivalentne varijante, najmanje 1, najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9, najmanje 10 ili više dodatnih peptida koji prodiru u ć elije.
[0074] U drugom poželjnom izvođenju, konjugati ili fuzioni proteini, kao što je ovde opisano, sadrže polipeptid SEK ID BR: 1 ili njegovu funkcionalno ekvivalentnu varijantu i dalje sadr že N-terminalni ili C-terminalni signal nuklearne lokalizacije. Termin "signal nuklearne lokalizacije (NLS)" je opisan u kontekstu terapeutske upotrebe pronalaska i jednako je primenljiv na ovde opisane fuzione proteine. Treba imati na umu da se dodatni NLS odnosi na NLS koji je različit od endogenog NLS-a koji se nalazi u Omomic-u ili u njegovoj funkcionalno ekvivalentnoj varijanti. Dodatni NLS mogu biti isti ili razli čiti od endogenog NLS-a koji se nalazi u Omomic-u ili u njegovoj funkcionalno ekvivalentnoj varijanti.
[0075] U jednom izvođenju, NLS je jedan od NLS koji se pojavljuje endogeno u Mic sekvenci, kao što je M1 peptid (PAAKRVKLD, SEK ID BR: 50) ili M2 peptid (RKRRNELKRSF, SEK ID BR: 49) (vidi Dang i Lee, supra.)
[0076] U poželjnim izvođenjima, konjugati ili fuzioni proteini, kao što je ovde opisano, sadrže, pored endogenog NLS-a koji se nalazi u polipeptidu SEK ID BR: 1 ili u njegovoj funkcionalno ekvivalentnoj varijanti, najmanje 1, najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9, najmanje 10 NLS.
[0077] Stručnjak iz ove oblasti ć e razumeti da može biti poželjno da fuzioni protein dalje sadrži jedan ili više fleksibilnih peptida koji povezuju polipeptid SEK ID BR: 1 ili njegovu funkcionalno ekvivalentnu varijantu, peptidnu sekvencu koja prodire u ć elije i/ili NLS. Prema tome, u posebnom izvo đenju, opisani polipeptid je direktno povezan sa peptidnom sekvencom koja prodire u ć elije. U drugom posebnom izvođenju, opisani polipeptid je povezan sa peptidnom sekvencom koja prodire kroz ć elije preko fleksibilnog peptida. U posebnom izvođenju otkriveni polipeptid je direktno povezan sa peptidnom sekvencom koja prodire u ć elije i sa NLS. U drugom posebnom izvođenju, opisani polipeptid je povezan sa peptidnom sekvencom koja prodire kroz ć elije kroz prvi fleksibilni peptidni linker i na NLS kroz drugi fleksibilni peptidni linker.
[0078] Kako se ovde koristi, termin "fleksibilni peptid", "spacer peptid" ili "linker peptid" se odnosi na peptid koji kovalentno vezuje dva proteina ili ostatke, ali koji nije deo ni jednog polipeptida, dozvoljavajuć i kretanje jednog u odnosu na drugi, bez izazivanja značajnog štetnog uticaja na funkciju proteina ili ostatka. Prema tome, fleksibilni linker ne utiče na aktivnost supresorskog tumora Omomic sekvence, aktivnost ć elije koja prodire u peptid koji prodire kroz ć elije ili kapacitet nuklearne lokalizacije NLS.
[0079] Fleksibilni peptid sadrži najmanje jednu aminokiselinu, najmanje dve aminokiseline, najmanje tri aminokiseline, najmanje četiri aminokiseline, najmanje pet aminokiselina, najmanje šest aminokiselina, najmanje sedam aminokiselina, najmanje osam aminokiselina, najmanje devet aminokiselina, najmanje 10 aminokiselina, najmanje 12 aminokiselina, najmanje 14 aminokiselina, najmanje 16 aminokiselina, najmanje 18 aminokiselina, najmanje 20 aminokiselina, najmanje 25 aminokiseline, najmanje 30 aminokiselina, najmanje 35 aminokiselina, najmanje 40 aminokiselina, najmanje 45 aminokiselina, najmanje 50 aminokiselina, najmanje 60 aminokiselina, najmanje 70 aminokiselina, najmanje 80 aminokiselina, najmanje 90 aminokiselina, ili oko 100 aminokiselina. U nekim otkrić ima fleksibilni peptid ć e omogu ć iti kretanje jednog proteina u odnosu na drugi da bi se pove ć ala rastvorljivost proteina i/ili poboljšala njegova aktivnost. Pogodni linker regioni uključuju poli-glicinski region, GPRRRR sekvencu (SEK ID BR: 51) kombinacija glicinskih, prolinskih i alaninskih ostataka.
[0080] U nekim izvođenjima, fuzioni protein, kao što je opisano, može da sadrži dodatnu hemijsku grupu koja uključuje, između ostalog, fluorescentne grupe, biotin, polietilen glikol (PEG), analoge amino kiselina, neprirodne aminokiseline, fosfatne grupe, glikozil grupe, radioizotopne oznake, i farmaceutske molekule. U drugim izvođenjima, heterolozni polipeptid može da sadrži jednu ili više hemijski reaktivnih grupa uključujuć i, između ostalog, keton, aldehid, Cis ostatke i Lis ostatke.
[0081] U posebnom izvođenju, konjugati ili fuzioni proteini, kao što je opisano, sadrže oznaku vezanu za konjugat ili za C-terminalni ili N-terminalni domen navedenog fuzionog proteina ili njegove varijante. Navedena oznaka je uglavnom peptidna ili aminokiselinska sekvenca koja se mo že koristiti u izolaciji ili prečišć avanju navedenog fuzionog proteina. Prema tome, navedena oznaka je sposobna da se ve že za jedan ili više liganada, na primer, jedan ili više liganada matrice afiniteta kao što je hromatografski nosač ili kuglica sa visokim afinitetom. Primer navedene oznake je histidinska oznaka (His-tag ili HT), kao što je etiketa koja sadrži 6 ostataka histidina (His6 ili H6), koji se može vezati za kolonu nikla (Ni2 ) ili kobalta (Co2 ) sa visokim sadržajem. afinitet. Njegova oznaka ima poželjnu osobinu da može vezati svoje ligande pod uslovima koji se denaturiraju za već inu proteina i remete ve ć inu interakcija proteina i proteina. Prema tome, može se koristiti za uklanjanje proteina mamaca označenog sa H6 nakon prekida interakcija proteina i proteina sa kojima je mamac učestvovao.
[0082] Dodatni ilustrativni, neograničavajuć i primeri oznaka korisnih za izolovanje ili prečiš ć avanje fuzionog proteina uključuju Arg-tag, FLAG-tag (DIKDDDDK; SEK ID BR: 52), Strep-tag (VSHPKFEK, SEK ID BR: 53) ), epitop koji se može prepoznati od strane antitela, kao što je c-mic-tag (prepoznat od anti-c-mic antitela), HA oznaka (IPIDVPDIA, SEK ID BR: 54), V5 tag (GKPIPNPLLGLDST, SEK ID BR: 55), SBP-tag, S-tag, vezujuć i peptid kalmodulina, domen za vezivanje celuloze, domen za vezivanje hitina, glutation S-transferaza-tag, protein za vezivanje maltoze, NusA, TrkA, DsbA, Avi-tag, itd. K., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003, 60: 523-525), aminokiselinska sekvenca kao što je AHGHRP (SEK ID BR: 56) ili PIHDHDHPHLVIHSGMTCKSKSC (SEK ID BR: 57), P-galaktozidaza i slično.
[0083] Oznaka se može koristiti, ako je poželjno, za izolaciju ili prečišć avanje navedenog fuzionog proteina.
[0084] U drugom aspektu, opis se odnosi na konjugat ili fuzioni protein u skladu sa otkrić em za upotrebu u medicini.
[0085] U drugom aspektu, opis se odnosi na konjugat ili fuzioni protein prema pronalasku za upotrebu u prevenciji i/ili tretmanu karcinoma.
[0086] U drugom aspektu, opis se odnosi na upotrebu konjugata ili fuzionog proteina prema pronalasku za dobijanje leka za prevenciju i/ili lečenje karcinoma.
[0087] U drugom aspektu, opis se odnosi na ordiniranje konjugata ili fuzionog proteina prema pronalasku za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji karcinoma kod subjekta.
[0088] U poželjnom izvođenju, karcinom koji treba da se spreči ili leči je Mic-indukovani karcinom. U drugom poželjnom opisu, karcinom koji treba da se spreči ili leči je karcinom povezan sa mutacijom u
1
KRAS genu. U jednom opisu, mutacija u KRAS genu je mutacija na glicinu na poziciji 12, na glicinu na položaju 13 ili na glutaminu na poziciji 61. U poželjnijem izvođenj́ u, mutacija je izabrana iz grupe koja se sastoji od G12S mutacija, G12V mutacija, G13D mutacija, G12C mutacija, G12R mutacija, G12F mutacija, G12I mutacija, G13C mutacija, G13R mutacija, ili K61L mutacija.
[0089] Izrazi "lek", "prevencija", "tretman", "karcinom" i "karcinom koji je indukovan Mic" su prethodno definisani i jednako se primenjuju na u ovom pronalasku.
Antitumorske kompozicije
[0090] Neočekivani nalaz da je Omomic polipeptid sposoban da se translocira preko biolo ških membrana i vrši svoju tumor supresorsku aktivnost kada je obezbeđen kao polipeptid otvara moguć nost formulisanja Omomic-a sa drugim antitumorskim lekovima. Prema tome, u drugom aspektu, ovaj pronalazak tako đe obezbeđuje kompozicije koje sadrže, zajedno ili odvojeno, prvu komponentu izabranu iz grupe koja se sastoji od:
(i) Omomic-a,
(ii) funkcionalno ekvivalentnu njegovu varijantu, (iii) konjugat ili fuzioni protein kao što je opisano
(iii) kao druge komponente, antitumorska jedinjenja.
[0091] Prva komponenta je kompozicija prema pronalasku koja uključuje polipeptid SEK ID BR: 1, njegovu funkcionalno ekvivalentnu varijantu ili fuzioni protein u skladu sa opisom. Pogodni polipeptidi, funkcionalno ekvivalentne varijante polipeptida SEK ID BR: 1 i fuzioni proteini opisani su napred u kontekstu terapeutskih postupaka prema opisu i jednako su primenljivi na kompozicije u skladu sa otkrić em.
[0092] Kako se ovde koristi, "antitumorsko sredstvo" podrazumeva navedeno biolo ško ili hemijsko jedinjenje koje tretira tumore ili sprečava njegovo formiranje. U poželjnom izvođenju, navedeno antitumorsko sredstvo je izabrano iz grupe koja se sastoji od citotoksičnog sredstva, antiangiogenog sredstva, antimetastatskog sredstva i antiproliferativnog sredstva.
[0093] Kao što je upotrebljen u ovom pronalasku, termin "citotoksični agens" se odnosi na agens koji je sposoban da promovišeć elijsku smrt i koji ima sposobnost da smanji rast, zaustavlja rast ili uništava ć elije i, posebno, brzo proliferišuć e ć elije i još preciznije, tumorske ć elije. Ć elijska smrt može biti uzrokovana bilo kojim mehanizmom, kao što je na primer apoptoza, iako nije ograničena na ovaj proces, inhibicijom metabolizma, interferencijom sa organizacijom citoskeleta ili hemijskom modifikacijom DNK. Termin citotoksični agens obuhvata bilo koje hemoterapijsko sredstvo uključujuć i male organske molekule, peptide, oligonukleotide i slično; toksini; enzimi; ci-tokines; radioizotopima ili sredstvima za radioterapiju.
[0094] Pod pojmom "hemoterapijski agensi" podrazumevaju se hemijska jedinjenja kao što su, bez ograničenja, antraciklinski antibiotici kao što su doksorubicin i daunorubicin, taksani kao što su Takol ™ i docetaksel, vinka alkaloidi kao vinkristin i vinblastin, 5-fluorouracil (5-FU), leucovorin, irinotekan, idarubicin, mitomicin C, oksaliplatin, raltitreksed, tamoksifen, cisplatin, karboplatin, metotreksat, aktinomicin D, mitoksantron, blenoksan ili mitramicin.
[0095] Pod pojmom "toksin" podrazumeva se toksični agens koji se konjugira sa polipeptidom ili fuzionim proteinom prema opisu koji formira imunotoksin. Konjugacija određenih toksina sa navedenim polipeptidom ili sa navedenim fuzionim proteinom smanjuje toksičnost prvog, omoguć avaju ć i njihovu upotrebu kao terapeutskih agenasa, jer bi inače bili previše toksični. Vezivanje između toksina i polipeptida kako je opisano ili fuzionog proteina kako je otkriveno se izvodi hemijski, čuvajuć i njegovu biološku aktivnost. Njihovo razdvajanje se uglavnom dešava u lizosomima određenih ć elija, tako da se navedeno hemijsko vezivanje prekida samo u zatvorenoj kiseloj ć elijskoj sredini koju obezbeđuju lizosomi. Toksini korišćeni u kontekstu ovog pronalaska su biljni toksini, bakterijski toksini, toksini gljivičnog ili životinjskog porekla i njihovi fragmenti, kao što su, bez ograničenja, ricin A-lanac, saponin, difterijski A-lanac, aktivno nevezujuć i fragmenti toksina difterije, eksotoksin A-lanac Pseudomonas aeruginosa, Abrin A-lanac, modni A-lanac, a-sarcin, Leurites fordii A-proteini, diantinski proteini, Phitolaca americana (PAPI, PAPII i PAP-S) proteini, Momordica inhibitor haratinije, kurkin, krotin, inhibitor Saponaria officinalis, gelonin, mitogelin, restrikocin, fenomenicin, enomicin i trihotecen.
[0096] "Enzimi" u kontekstu ovog pronalaska se posmatraju kao enzimi koji aktiviraju lekove, kao što su, bez ograničenja, alkalna fosfataza koja aktivira etopozid i doksorubicin; karboksipeptidaza G2 koja aktivira azotne slačice; beta-laktamaza koja aktivira doksorubicin, paklitaksel i mitomicin.
[0097] Pod pojmom "citokini" podrazumevaju se peptidi različitih veličina i molekulskih težina koji sintetišu ć elije imunog sistema u cilju regulisanja imunološke reakcije, a mogu biti hormoni, faktori rasta, faktori nekroze, itd, prirodnog porekla ili iz rekombinantnih ć elijskih kultura i biolo ški aktivnih ekvivalenata citokina prirodne sekvence. Njihova konjugacija sa antitelima dovodi do imunocitokina. Citokini korisni u ovom opisu su, bez ograničenja, TNF faktor alfa, INF-gama, GM-GSF faktor ili IL-2.
[0098] Pod pojmom "radioizotopi" podrazumevaju se radioaktivni izotopi kao što su, bez ograničenja, 131I, 90I, 177Lu, 188Re, 67Cu, 211At, 213Bi, 125I, 111In.
[0099] Antiangiogeno sredstvo "podrazumeva se kao hemijska ili biološka supstanca koja inhibira ili smanjuje formiranje novih krvnih sudova, tj, angiogenezu.
[0100] Antiangiogeni agensi koji se mogu konjugovati sa polipeptidom prema opisu ili sa fuzionim proteinom prema opisu, uključuju, bez ograničenja, antiangiogeno sredstvo izabrano iz grupe pakltoksela, 2-metoksiestradiola, prinomastata, batimastata, BAI 12-9566, karboksiamidotriazol, CC-1088, dekstrometorfan sirć etne kiseline, dimetilksantenon sir ć etne kiseline, endostatina, IM-862, marimastata, penicilamin, PTK787/ZK 222584, RPI.4610, skvalamin laktat, SU5416, talidomid, kombinatastatin, tamoksifen -3, neovastat, BMS-275291, SU6668, anti-VEGF antitela, Medi-522 (Vitakin II), CAI, interleukin 12, IM862, amilorid, angiostatin, Kl-3 angiostatin, Kl-5 angiostatin, Kaptopril, DL-alfa -difluorometilornitin, DL-alfa-difluorometilornitin HCl, endostatin, fumagilin, herbimicin A, 4-hidroksifenilretinamid, juglon, laminin, laminin heksapeptid, laminin pentapeptid, lavndustin A, medroksiprogesteron, minociklin, ribonukleaza placenta ibitor, suramin, trombospondin, antitela usmerena protiv proangiogenih faktora (na primer, Avastin, Erbituk, Vectibik, Herceptin); inhibitori tirozin kinaze niske molekulske mase proangiogenih faktora rasta (na primer Tarceva, Nekavar, Sutent, Iressa); inhibitori mTOR (na primer Torisel); inhibitore interferona alfa, beta i gama, IL-12, matrične metaloproteinaze (na primer, COL3, marimastat, batimastat); ZD6474, SU11248, vitakin; Inhibitori PDGFR (na primer Gleevec); NM3 i 2- ME2; ciklopeptidi kao što je cilengitid.
[0101] Pod "antimetastatskim agensom" podrazumeva se hemijska ili biološka supstanca koja inhibira ili smanjuje metastaziranje, tj. razmnožavanje, u osnovi od limfnog ili krvnog toka, ć elija koje izazivaju karcinom, i rast novih tumora u telu.
[0102] "Antiproliferativni agens" se tretira kao hemijska ili biološka supstanca koja je sposobna da spreči ili inhibiranje formiranja ili rasta karcinoma. Antiproliferativni agensi uklju čuju, ali nisu ograničeni na (i) antimetabolite kao što su antimetaboliti folne kiseline (aminopterin, denopterin, metotreksat, edatreksat, trimetreksat, nolatreksed, lometreksol, pemetreksed, raltitreksed, piritreksim, pteropterin, leucovorin, 10-propargil-5,8- dideazafolat (PDDF, CB3717)), purinski analozi (kladribin, klofarabin, fludarabin, merkaptopurin, pentostatin, tioguanin) i analozi pirimidina (kapecitin, citarabin ili ara-C, decitabin, fluorouracil, 5-fluorouracil, doksifluridin, floksuridin i gemcitabin (ii) prirodni proizvodi, kao što su antitumorni antibiotici i mitotički inhibitori, kao što su vinka alkaloidi kao što su vindesin, vinkristin, vinblasin, vinorelbin; taksani kao što je paklitaksel (Takol ™), docetaksel (Takotere ™); kolhicin (NSC 757), tiokolhicin (NSC 361792), derivati kolhicina (npr., NSC 33410) i alekolhicin (NSC 406042); halihondrin B (NSC 609395); dolastatin 10 (NSC 376128); majtanzin (NSC 153858); rizoksin (NSC 332598); epotilon A, epotilon B; discoder-molide; estramustin; nocodazol; (iii) hormoni i njihovi antagonisti, kao što su tamoksifen, toremifen, anastrozol, arzoksifen, lasofoksifen, raloksifen, nafoksidin, fulvestrant, aminoglutetimid, testolakton, atamestan, eksemestan, fadrozol, formestan, letrozol, goserelin, leuprorelin ili leuprolid megestrol i fluoksimesteron; (iv) biološke agense, kao što su virusni vektori, interferon alfa i interleukini; (v) jedinjenja na bazi platine kao što su karboplatin, cisplatin [cisdiammendihloroplatin, (CDDP)], oksaliplatin, iproplatin, nedaplatin, triplatin tetranitrat, tetraplatin, satraplatin (JM216), JM118 [cis amin dichloro (II)], JM149 [cis amin dihloro (cikloheksilamin) trans dihidrokso platina (IV)], JM335 [trans amin dihloro dihidrokso platina (IV)], transplatin, ZD0473, cis, trans, cis-Pt (NH3) (C6H11NH2) (OOCC3H7) 2Cl, malanat-12-diaminocikloheksanoplatin (II), 5-sulfosalicilat-trans-(1,2-diammo-cikloheksan) platin (II) (SSP), poli - [(trans-1,2-diaminocikloheksan) platin] - karboksiamiloza (POLI- PLAT) i 4-hidroksi-sulfonilfenilacetat (trans-l, 2-diaminocikloheksan) platina (II) (SAP) i sli čno i (vi) lekovi za alkiliranje DNK kao što su azotni senfovi, nitrozoure, etileniminski derivati, alkil sulfonati i triazeni, uključujuć i, ali bez ograničenja na, ciklofosfamid (Citokan ™), busulfan, improsulfan, piposulfan, pipobroman, melfalan (L-sarkolizin), hlorambucil, hloretamin ili mustin, uramustin ili uracil senf, novembichin, fenesterin, trofosfamid, ifosfamid, karmustin (BCNU), lomustin (CCNU), hlorozotocin, fotemustin, nimustin, ranimnustin, semustin (metil-CCNU), streptozocin, tiotepa, trietilenmelamin,
1
trietilentiofosforamin, prokarbazin, altretamin, dakarbazin, mitozolomid i temozolomid.
Farmaceutske kompozicije
[0103] Pronalazak takođe opisuje farmaceutske kompozicije koje sadrže konjugate i fuzione proteine iz opisa ili kompozicije u skladu sa pronalaskom. Prema tome, u drugom aspektu, dokument opisuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži farmaceutski aktivnu količinu konjugata ili fuzionog proteina prema pronalasku i farmaceutski aktivni nosač (prvi farmaceutski sastav prema pronalasku). U drugom aspektu, dokument opisuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži farmaceutski aktivnu količinu kompozicije prema pronalasku i farmaceutski aktivni nosač (druga farmaceutska kompozicija prema pronalasku).
[0104] Kao što je korišćen u ovom pronalasku, izraz "farmaceutska kompozicija" se odnosi na formulaciju koja je prilagođena za davanje unapred određene doze jednog ili više terapeutski korisnih agenasa ć eliji, grupić elija, organu, tkivu ili životinji u kojoj je ć elijska deoba nekontrolisana, kao što je karcinom.
[0105] Prva farmaceutska kompozicija opisanog pronalaska sadrži farmaceutski efikasnu količinu konjugata ili fuzionog proteina, kao što je ovde opisano. Pogodni konjugati i fuzioni proteini za upotrebu u farmaceutskim kompozicijama u skladu sa ovim pronalaskom uključuju bilo koji od fuzionih proteina navedenih gore u paragrafu Omomic konjugata i fuzionih proteina iz opisa.
[0106] Druga farmaceutska kompozicija opisanog pronalaska sadrži farmaceutski efikasnu količinu kompozicije prema pronalasku i farmaceutski aktivni nosač. Druga farmaceutska kompozicija iz opisa sadrži polipeptid sa SEK ID BR: 1, njegovu funkcionalno ekvivalentnu varijantu ili fuzioni protein kao što je opisano. Pogodne funkcionalno ekvivalentne varijante polipeptida SEK ID BR: 1 ili pogodni fuzioni proteini za upotrebu u drugim farmaceutskim kompozicijama u skladu sa pronalaskom su kao što je napred definisano za terapeutsku upotrebu prema opisu ili pod fuzionim proteinima, kako je opisano.
[0107] Termin "garmaceutski efektivna količina", kako je ovde korišć en, označava količinu koja može da obezbedi terapeutski efekat, i koju stručnjak može da odredi pomoć u uobičajenih sredstava. Količina Omomic polipeptida, njene funkcionalno ekvivalentne varijante ili fuzionog proteina ili antitumorskog jedinjenja koji se mogu kombinovati u farmaceutskim kompozicijama prema pronalasku, varirać e u zavisnosti od subjekta i određenog načina primene. Stručnjaci u ovoj oblasti ć e uvideti da se doze mogu takođe odrediti prema uputstvima iz Goodman i Goldman-ove "Farmakološke osnove terapeutika", Deveto izdanje (1996), Dodatak II, str. Deseto izdanje (2001), Dodatak II, str.475-493.
[0108] Odgovarajuć a doza aktivnog principa ili principa unutar farmaceutske kompozicije ć e zavisiti od tipa karcinoma koji ć e se lečiti, težine i toka bolesti, da li se preparat primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, prethodne terapije, kliničku istoriju pacijenta i reakciju na peptid ili polipeptid i procenu lekara. Količina polipeptida SEK ID BR: 1, njegove funkcionalno ekvivalentne varijante, fuzionog proteina je pogodna da se primeni kod pacijenta u jednom trenutku ili preko serije tretmana. U zavisnosti od tipa i ozbiljnosti bolesti, odgovarajuć i nivo doze ć e uobičajno biti oko 0,01 do 500 mg po kg telesne težine pacijenta kada se može primeniti u pojedinačnim ili višestrukim dozama. Poželjno, nivo doze ć e biti oko 0.1 do oko 250 mg/kg dnevno; poželjnije oko 0.5 do oko 100 mg/kg dnevno. Odgovarajuć i nivo doze može biti oko 0.01 do 250 mg/kg dnevno, oko 0.05 do 100 mg/kg dnevno, ili oko 0.1 do 50 mg/kg dnevno. Unutar ovog opsega doza može biti 0,05 do 0,5, 0,5 do 5 ili 5 do 50 mg/kg dnevno. Za oralno davanje, kompozicije su poželjno obezbeđene u obliku tableta koje sadrže 1.0 do 1000 miligrama aktivnog sastojka, naročito 1.0, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0, 50.0, 75.0, 100.0, 150.0, 200.0, 250.0, 300.0 400.0, 500.0, 600.0, 750.0, 800.0, 900.0 i 1000.0 miligrama aktivnog sastojka za simptomatsko prilagođavanje doze pacijentu koji se treba lečiti. Jedinjenja se mogu primenjivati u režimu od 1 do 4 puta dnevno, poželjno jednom ili dva puta dnevno.
[0109] U slučaju drugih farmaceutskih kompozicija prema pronalasku, koje sadrže prvu komponentu izabranu od polipeptida SEK ID BR: 1, njegovu funkcionalno ekvivalentnu varijantu i fuzioni protein kao što je navedeno i drugu komponentu koja je antitumorsko sredstvo, kompozicija mo že biti predstavljena kao jedna formulacija (na primer, kao tableta ili kapsula koja sadrži fiksnu količinu svake od komponenti) ili može, s druge strane, biti predstavljena kao odvojene formulacije da bi se kasnije kombinovana za zajedničku, sekvencijalnu ili odvojenu administraciju. Kompozicije iz opisa tako đe uključuju formulaciju kao komplet delova gde su komponente formulisane odvojeno, ali su pakovane u istoj ambala ži. Oni koji su verzirani u stanje tehnike ć e razumeti da formulacija različitih komponenti u slučaju druge farmaceutske kompozicije, kao što je otkriveno, može biti slična, drugim rečima, formulisana na sličan način (u tabletama ili pilulama), što omoguć ava njihovo davanje istim putem. U slučaju kada su različite komponente, kao što je navedeno, formulisane odvojeno, ove dve komponente mogu biti predstavljene u
1
blisteru. Svaki blister sadrži lekove koji se moraju konzumirati tokom dana. Ako se lekovi moraju primenjivati nekoliko puta dnevno, lekovi koji odgovaraju svakoj primeni mogu biti postavljeni u razli čite delove blistera, poželjno je da se u svakom delu blistera zabeleži vreme dana kada treba da se daju. Alternativno, komponente opisane kompozicije mogu se formulisati drugačije tako da se različite komponente daju različito. Prema tome, moguć e je da je prva komponenta formulisana kao tableta ili kapsula za oralno ordiniranje i druga komponenta je formulisana za intravenozno davanje ili obrnuto. Odnos između komponenti koje su deo kompozicija koje se koriste u drugoj farmaceutskoj kompoziciji, kao što je otkriveno, može se podesiti od strane stručnjaka u zavisnosti od antitumorskog sredstva koje se koristi u svakom pojedinačnom slučaju, kao i od željene indikacije. Prema tome, opis otkriva kompozicije u kojima odnos između količina dve komponente može biti u opsegu od 50: 1 do 1:50, naročito od 20: 1 do 1:20, od 1:10 do 10: 1, ili od 5: 1. : 1 do 1: 5.
[0110] Prva i druga farmaceutska kompozicija iz ovog pronalaska mogu takođe da sadrže jedno ili više dodatnih jedinjenja za prevenciju i/ili lečenje patoloških stanja u kojima postoji nekontrolisana ć elijska deoba, kao što je karcinom. Navedena dodatna jedinjenja, kao što su antitumorska sredstva, mogu biti deo farmaceutske kompozicije kao nezavisni entiteti.
[0111] Prva i druga farmaceutska kompozicija, kao što je otkriveno, takođe sadrže jedan ili nekoliko dodatnih farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata. Pod pojmom "farmaceutski prihvatljiv ekscipijent" podrazumeva se terapeutski neaktivna supstanca za koju se kaže da se koristi za inkorporisanje aktivnog sastojka i koja je prihvatljiva za pacijenta sa farmaceutske/toksikolo ške tačke gledišta i za farmaceutskog hemičara koji ga proizvodi i koji zavisi od fizičkog/hemijskog gledišta u pogledu sastava, formulacije, stabilnosti, prihvatanja pacijenta i biodostupnosti.
[0112] Broj i priroda farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata zavise od željenog oblika doziranja. Farmaceutski prihvatljivi ekscipijenti su poznati prosečnom stručnjaku (Fauli i Trillo C. (1993) "Tratado de Farmacia Galenica", Luzan 5, S.A. Ediciones, Madrid) . Navedene kompozicije mogu biti pripremljene pomo ć u konvencionalnih metoda poznatih u stanju tehnike ("Remington: Nauka i praksa farmacije", 20. izdanje (2003) Genaro AR, izd., Lippincott Villiams & Vilkins, Philadelphia, SAD).
[0113] Prva i druga farmaceutska kompozicija, kao što je navedeno, mogu se primenjivati na bilo koji pogodan način, kao što je oralni put, topikalnim put, inhalacija ili parenteralni put, tako da farmaceutski prihvatljivi ekscipijenti neophodni za formulaciju željene doze imaju obrazac. Poželjan način davanja navedenih farmaceutskih kompozicija je endovenski put.
[0114] Pod pojmom "oralni put" podrazumeva se farmaceutska kompozicija ugrađena u organizam nakon deglutacije. U posebnom obliku, farmaceutska kompozicija iz pronalaska može biti u obliku doziranja pogodnom za njegovo davanje oralnim putem, bilo da je čvrsta ili tečna. Dozni oblici pogodni za njihovo davanje oralnim putem mogu biti tablete, kapsule, sirupi ili rastvori, i mogu sadr žati bilo koji uobičajeni ekscipijent poznat u struci, kao što su veziva, na primer sirup, akacija, želatin, sorbitol ili polivinilpirolidon; sredstva za punjenje, na primer laktoza, šeć er, kukuruzni skrob, kalcijum fosfat, sorbitol ili glicin; maziva za kompresiju, na primer, magnezijum stearat; sredstva za disintegraciju, na primer skrob, polivinilpirolidon, natrijum glikolat skroba ili mikrokristalna celuloza; ili farmaceutski prihvatljiva sredstva za kvašenje kao što je natrijum lauril sulfat. Mogu se pripremiti čvrste oralne kompozicije pomoć u konvencionalnih postupaka mešanja, punjenja ili komprimovanja. Ponavljaju ć e operacije mešanja se mogu koristiti za potpuno distribuiranje aktivnog sredstva u onim kompozicijama koje koriste velike količine sredstava za punjenje. Navedeni postupci su uobičajni u struci. Tablete se mogu pripremiti, na primer, pomoć u vlažne ili suve granulacije, i opciono se oblagati u skladu sa postupcima poznatim u zajedničkoj farmaceutskoj praksi, naročito sa enteričkom oblogom.
[0115] S druge strane, termin "topikalni put" označava primenu nesistemskim putem, i uključuje primenu farmaceutske kompozicije koja je otkrivena spolja na epidermu, u usnoj šupljini i ubacivanje navedene kompozicije u uši, oči i nos, čime se ne ulazi značajno u krvotok. Pod "sistemskim putem" podrazumeva se davanje oralnim putem, intravenskim putem, intraperitonealnim putem i intramuskularnim putem. Količina antitela koja je potrebna za terapeutski ili profilaktički efekat ć e prirodno varirati u zavisnosti od izabranog antitela, prirode i ozbiljnosti bolesti koja ć e biti lečena, i pacijenta.
[0116] "Inhalacija" podrazumeva davanje intranazalnim putem i oralnim inhaliranjem. Oblici za doziranje pogodni za navedenu administraciju, kao što su formulacija u aerosolu ili inhalator sa doziranim metrom mogu biti pripremljeni pomoć u konvencionalnih tehnika. U jednom izvođenju, put primene je intranazalni put.
1
[0117] Kako se ovde koristi, termin "parenteralno", obuhvata davanje intravenoznim putem, intraperitonealnim putem, intramuskularnim putem ili potko žnim putem. Subkutani, intramuskularni i intravenski dozni oblici parenteralne primene su uobičajno poželjni.
[0118] U jednom aspektu, prva i druga farmaceutska kompozicija, kao što je navedeno, mogu se prilagoditi za njihovu parenteralnu primenu, kao što su sterilni rastvori, suspenzije ili liofilizovani proizvodi u odgovarajuć em jediničnom doznom obliku. Farmaceutske kompozicije pogodne za njegovu injektabilnu upotrebu uključuju sterilne vodene rastvore (kada su rastvorljive u vodi), ili disperzije i sterilne praške za improvizovanu pripremu sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija. Za njegovu primenu intravenskim putem, neki pogodni nosači uključuju slani rastvor puferisan sa fosfatom (PBS). U svim slučajevima, kompozicija mora biti sterilna i mora biti fluidna do ta čke u kojoj postoji lakoć a ubrizgavanja. Mora biti stabilana u uslovima pripreme i čuvanja, i mora biti zaštić ena od kontaminacije mikroorganizmima kao što su bakterije i gljivice. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, farmaceutski prihvatljiv poliol kao što je glicerol, propilen glikol, tečni polietilen glikol i njihove odgovarajuće smeše. Odgovarajuća fluidnost se može održavati, na primer, korišć enjem prevlake kao što je lecitin, održavanjem veličine čestica koja je potrebna u slučaju disperzije i korišć enjem površinski aktivnih sredstava. Sprečavanje dejstva mikroorganizama može se posti ć i pomo ć u različitih antibakterijskih i antifungalnih sredstava, na primer, parabena, hlorobutanola, fenola, askorbinske kiseline, tiomersala i slično. U već ini slučajeva, poželjno je da se uključe izotonični agensi, na primer, šeć eri; polialkohole kao što je manitol, sorbitol; ili natrijum hlorid u kompoziciji. Produžena apsorpcija injekcionih kompozicija može biti uzrokovana uključivanjem sredstva koje odlaže apsorpciju, na primer, aluminijuma i želatin monostearata.
[0119] Sterilni rastvori za injektiranje mogu biti pripremljeni inkorporisanjem aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajućem rastvaraču sa jednom ili kombinacijom napred navedenih sastojaka, prema potrebi, nakon čega sledi sterilizacija filtracijom kroz sterilne membrane. Generalno, disperzije se pripremaju inkorporisanjem aktivnog jedinjenja u sterilni nosač koji sadrži osnovni medijum za disperziju i ostatak sastojaka koji se zahteva od prethodno navedenih. U slučaju sterilnih praškova za pripremu injektabilnih sterilnih rastvora, poželjni postupci pripreme su vakuumsko sušenje i liofilizacija koji daju prah sa aktivnim sastojkom plus bilo koji željeni dodatni sastojak iz prethodno filtriranog sterilnog rastvora.
[0120] Farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska mogu biti odgovarajući primenjene pomoć u pulsne infuzije, na primer, sa smanjenim dozama kompozicije. Poželjno, doza se primenjuje pomoć u injekcija, poželjnije intravenske ili subkutane injekcije, delom zavisno i od toga da li je primena akutna ili hroni čna.
[0121] U jednom izvođenju, prva ili druga farmaceutska kompozicija, kao što je navedeno, pripremaju se sa nosačima koji ć e zaštititi navedeni polipeptid od brze eliminacije iz tela, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujuć i implantate i sisteme mikroinkapsulirane administracije. Mogu se koristiti biološki razgradljivi biokompatibilni polimeri kao što su etilen vinilacetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polimlečna kiselina. Postupci za pripremu navedenih formulacija bi ć e jasni za stručnjake u ovoj oblasti. Materijali se takođe mogu komercijalno dobiti u Alza Corporation i Nova Pharmaceuticals, Inc.
[0122] Kompozicije sa neprekidnim oslobađanjem takođe uključuju preparate kristala antitela suspendovanih u odgovarajućim formulacijama koje mogu održavati kristale u suspenziji. Ovi preparati, kada se ubrizgavaju subkutanim ili intraperitonealnim putem, mogu proizvesti efekat neprekidnog oslobađanja. Druge kompozicije takođe uključuju antitela uhvać ena u liposomima. Liposomi koji sadrže takva antitela su pripremljeni pomoć u poznatih metoda kao što su Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1985) 82: 3688-3692; Hvang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1980) 77: 4030-4034; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949.
[0123] Uprkos činjenici da Omomic i konjugati i fuzioni proteini koji sadr že Omomic su sposobni da se translociraju preko bioloških membrana, stručnjak ć e razumeti da takođe može biti odgovarajuće da se formulišu konjugati ili fuzioni proteini koji sadrže Omomic u nanočesticama. Nanočestice mogu doprineti očuvanju integriteta polipeptida u biološkim fluidima dok ne dostigne u željeni organ. Štaviše, u slučaju kompozicija koje sadrže antitumorski agens, kapsuliranje kompozicije može smanjiti sekundarne efekte izazvane antitumorskim sredstvom. Na kraju, nanočestice se takođe mogu modifikovati tako da uključuju delove koji dozvoljavaju uticaj nanočestice na organ od značaja.
[0124] Prema tome, u drugom izvođenju, farmaceutske kompozicije koje su ovde opisane obuhvataju
1
konjugate, fuzione proteine i kompozicije prema opisu koji čine deo nanočestice.
[0125] Odgovarajuće nanočestice koje se mogu koristiti u kontekstu ovog pronalaska uključuju takve nanoskupne materijale kao što su nanočestice na bazi lipida, superparamagnetna nanočestica, nanošelica, poluvodički nanokristal, kvantna tačka, nanočestica na bazi polimera, silicijum nanočestice na bazi silike, nanočestice na bazi silike, nanočestice na bazi metala, fuleren i nanocevi.
[0126] Željeno oslobađanje se može postić i dodavanjem liganda bez ugrožavanja sposobnosti nanočestica da isporuče svoje polipeptidne korisne količine. Smatra se da ć e to omogu ć iti isporuku specifičnim ć elijama, tkivima i organima. Ciljna specifičnost ligand-baziranih sistema za isporuku zasniva se na raspodeli receptora liganda na različitim tipovima ć elija. Ligand za ciljanje može biti ili ne-kovalentno ili kovalentno povezan sa nanočesticama, i može biti konjugovan sa nanočesticama različitim metodama kako je ovde opisano.
[0127] Primeri proteina ili peptida koji se mogu koristiti za uticaj nano čestica obuhvataju transferin, laktoferin, TGF-p, nervni faktor rasta, albumin, HIV Tat peptid, RGD peptid i insulin, kao i druge.
[0128] Prva i druga farmaceutska kompozicija, kao što je ovde navedeno, mogu se formulisati sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. U poželjnom izvođenju, nosač ne dozvoljava direktnu isporuku fuzionog proteina ili kompozicije u citoplazmu ć elija, tj. nosač nije u stanju da se spoji sa plazmatskom membranom ciljnih ć elija. Kako se ovde koristi, termin "nosač" označava bilo koju supstancu koja može da poboljša isporuku i efikasnost aktivnog sastojka u farmaceutskoj kompoziciji. Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača uključuju jednu ili više voda, fiziološkog rastvora, fosfatno puferisanog rastvora soli, dekstroze, glicerola, etanola i slično, kao i njihove kombinacije. U mnogim slučajevima, poželjno je uključiti izotonične agense, na primer, šeć ere, polialkohole kao što su manitol, sorbitol ili natrijum hlorid u kompoziciji. Farmaceutski prihvatljivi nosači mogu dalje da sadrže manje količine pomoć nih supstanci kao što su sredstva za vlaženje ili emulgiranje, konzervanse ili pufere, koji poveć avaju rok trajanja ili efikasnost fuzionog proteina ili kompozicija koje čine deo farmaceutskih kompozicija. Primeri odgovarajuć ih nosača su dobro poznati u literaturi ( videti na primer Remington's Pharmaceutical Sciences, 19. izd., Mack Publishing Compani, Easton, PA, 1995). Primeri nosača bez ograničenja su serije saharida kao što su laktoza, dekstroza, saharoza, sorbitol, manitol, ksilitol, eritritol i maltitol; serija skroba kao što je kukuruzni skrob, pšenični skrob, rižin skrob i krompirov skrob; niz celuloze kao što je celuloza, metil celuloza, natrijum karboksi metil celuloza i hidroksil propilmetil celuloza; i niz punila kao što su želatin i polivinil pirolidon. U nekim slučajevima, mogu se dodati dezintegranti kao što su umreženi polivinil pirolidon, agar, alginska kiselina ili natrijum alginat.
[0129] Prva i druga farmaceutska kompozicija, kao što je navedeno, su pogodne za primenu na bilo kom tipu sisara, poželjno ljudskom biću.
[0130] Pronalazak je detaljno opisan u nastavku pomoć u slede ć ih primera koji su samo ilustrativni i ni na koji način ne ograničavaju obim pronalaska.
PRIMERI
Materijali i metode
Primer 1
Ekspresija Omomic konstrukta u bogatoj sredini ili u minimalnoj M9 sredini
[0131] Za proizvodnju Omomic NA bogatoj podlozi, 1L 2IT medija koji sadrži ampicilin sa BL21-AITM One Shot® hemijski kompetentne Escherichia coli (Life TECHNOLOGY) transformisane sa Omomic-pET-3a konstruktom je inokulisan, uzgajan na 37° C uz mešanje na 250 rpm dok OD600 ne dostigne 0,8. Ekspresija proteina je indukovana sa 10 mL rastvora Arabinose, inkubirajuć i na 37°C tokom 12 h. Alternativno, za proizvodnju Omomic u minimalnoj sredini M9, E. coli je transformisana sa Omomic-pET3a konstruktom i inokulirana u 1L minimalne sredine M9 koja sadrži hloramfenikol i ampicilin sa BL21-CodonPlus (Strategene) te uzgajana na 37°C uz mešanje na 250 rpm dok OD600 ne dostigne 0,8. Ekspresija proteina je indukovana sa 1 mL rastvora IPTG 1000Ks. Kultura ć elija je inkubirana uz me šanje na 250 rpm na 37°C tokom 12 h.
[0132] Bakterijska kultura je centrifugirana na 10,000 rpm, 4°C, 5 minuta u SLA-1500 rotoru upotrebom boca od 250 mL. Kultura je sekvencijalno centrifugisana da bi se dobio ekvivalent od 1L kulture po boci.
[0133] Da bi se verifikovala uspešna ekspresija proteina, sakupljen je 1 ml alikvota iz kultura i izmeren je
1
njegov OD600. 800 mL navedenog alikvota je rasut na 16,060 kg tokom 1 minuta i supernatant je odbačen. Pelet je suspendovan u zapremini IB Laemmli pufera ekvivalentnog (0.1 k OD600 vrednost) mL da bi se obezbedile jednake količine liziranog ć elijskog ekstrakta u svakom uzorku i olakšalo poređenje između ć elija pre i posle ekspresije proteina. Zatim su uzorci pome šani vorteksom, ultrazvukom 5 sekundi na maksimalnoj snazi, zamrznuti u tečnom azotu i konačno, kuvani 2 minuta (ponovljeno 3 puta) pre punjenja i denaturisani sa 16.5 % akrilamid SDS-PAGE gela. Elektroforeza je pra ć ena Coomassie plavom bojom ili bojom Vestern blot. IB Laemmli pufer je optimizovan da bi se omoguć ila solubilizacija inkluzionih tela i da bi se obezbedila adekvatna migracija i razdvajanje proteina da bi vizualizovala ekspresiju Omomic-a.
Primer 2
Prečišć avanje Omomic b-HLH-LZ
[0134] Ć elijski peleti su suspendovani u 3 mL pufera po gramu peleta vorteksovanjem. Dodato je 150 mL Triton rastvora po gramu pelet kulture. Viskoznost suspenzije je redukovana soniciranjem na ledu, na snazi 15 za 6 x 15 sekundi upotrebom ultrazvučnog homogenizatora.
[0135] Zatim je dodat ekvivalent od 100 mL/g pelet kulture goveđe DNaze I pankreasa, nakon čega je usledila inkubacija od 60 minuta na 37°C uz mešanje na 50 o/min. Uzorci su centrifugisani 20 min na 12,0003 g (13,000 rpm u SS34 rotoru u Sorvall RC 5B Plus, upotrebom boce za centrifugisanje od 35 mL), 4 °C za peletiranje inkluzionih tela kao i kompleksi visoke molekulske mase kao što su ć elijski zidovi, ribozomi i nedegradirani genomski DNK. Lipidi, rastvorljivi proteini, amino kiseline, šeć eri i nukleinske kiseline čine supernatant koji je odbačen nakon centrifugisanja.
[0136] Peletirana inkluziona tela su rastvorena sa 15 mL pufera Bull delom pufera A vorteksovanjem. Ova kisela, visoka jonska jačina i denaturantni pufer omoguć avaju potpunu solubilizaciju Omomic konstrukta iz inkluzionih tela i omoguć ava eliminaciju kompleksa visoke molekulske mase i rezidualne DNK centrifugisanjem.
[0137] Rastvor tela inkluzije 1:1 je razblažen sa Bull kreker delom B. Posle toga, uzorci su centrifugisani 30 min na 30,0003g (19,000 rpm u SS34 rotoru u Sorvall RC 5B Plus) na 4°C.
[0138] Supernatant je prečišć en hromatografijom na kationskoj izmeni na 5, kolone za kationske izmene od 5 mL (HiTrapTM SP Sepharose HP kolone od GE Healthcare ili ekvivalentne) montirane u seriji na FPLC sistemu. Prvo, kolona je isprana sa 2 zapremine kolone (CV) FPLC pufera B pri brzini protoka od 5 mL/ min. Zatim, kolona je ekvilibrirana sa 5 CV (125 mL) FPLC pufera A pri brzini protoka od 2.5 mL/min. Supernatant (ekvivalentan maksimumu od 9 g pelet kulture po punjenju) je napunjen sa 2,5 mL/min. Odmah nakon punjenja supernatanta, kolona je isprana sa 75 mL (3 CV) U8 pufera, pri brzini protoka od 2.5 mL/min. Isprano sa 1 CV pufera A. Zatim, 3 CV 10% pufera B je dodato u kolonu. Eluacija omomic je izvedena sa gradijentom Buffer B od 10-35% u 50 mL (0.5% / mL) na 2.5 mL/min u frakcijama od 2.5 mL. U ovim uslovima, Omomic eluira na ~ 1.5 M NaCl (tj. ~ 30% v/v gradijenta) sa čistoć om od 90%.
[0139] Frakcije koje sadrže čistu konstrukciju su sakupljene i desalinizovane na 5 uzastopnih kolona HiTrapTM Desalting od GE Healthcare (ili ekvivalenta) ekvilibrirane sa TFA puferom za desalinizaciju, pri brzini protoka od 3.0 mL/min. Sakupljene frakcije su ubrizgane (maksimalna zapremina od 7,5 mL po injekciji) i eluacija je prać ena sa OD280 detektorom. Protein se eluira unutar prvih 15 mL nakon injekcije. Sledeć e frakcije koje pokazuju niske vrednosti OD280 i visoku provodljivost su odbačene. Ovom metodom je omoguć en povra ć aj od 95% 98-99% slanog proteina.
[0140] Prečiš ć eni protein može da se koncentriše bilo centrifugisanjem u Amicon® Ultra centrifugalnim filterima Ultracel®-3K (Millipore ™) ili ekvivalentu, ili liofilizacijom. Za koncentraciju pomo ć u Amicon® Ultra, pratite indikaciju proizvođača. Alternativno, za liofilizaciju, dodajte 50% v/v acetonitrila u desalovane frakcije, zamrznite u tečnom azotu i liofilizujte. Dobijeni penasti liofilizirani protein mo že biti ponderisan i rastvoren do 100 ml mg u 50% v/v acetonitrila koji sadrži 0,05% v/v TFA, alikvotno od 1 do 10 mg po ependorfu i ponovo liofiliziran.
[0141] Dobije se oko 25 mg/L kulture u bogatoj podlozi i 15 mg/L kulture u minimalnom M9 medijumu.
Primer 3
Pretvaranje Omomica u A549 ć elije
[0142] Autori pronalaska pokušali su da dokažu da u ć elijama koje su tretirane Omomic-om, da čak i
2
nakon tako kratkog vremena, Omomic već prodire u jezgro ćelije.
[0143] Ekspresija i prečišć avanje Omomic-a je obavljeno kako je prikazano u Primerima 1 i 2.
[0144] A549 ć elije (ATCC) su održavane u Dulbecco modifikovanom Eagle-ovom mediju (DMEM) dopunjenom sa 10% fetalnog goveđeg seruma na 37°C u vlažnoj atmosferi koja sadrži 5% CO<2>. Za fluorescentnu mikroskopiju, 20,000 A549 ć elija je zasijano na poklopcima od 0,5 inča i ostavljeno je pokriveno 16 sati. Dodat je svež medij dopunjen sa Omomic peptidom (35 mM) i inkubiran 2 sata na 37°C. Ć elije su isprane 3 puta sa PBS i fiksirane u 3% paraformaldehidu, i posmatrane pod mikroskopom.
[0145] Slika 1 pokazuje da Omomic može da funkcioniše kao domen transdukcije proteina preko ć elijske membrane i da se translocira u nukleus.
Primer 4
Omomic smanjuje broj vitalnih A549 ć elija i indukuje apoptozu
[0146] A549 ć elije su inkubirane u pločama sa 24 bunari ć a tokom perioda od 72 sata sa 10 mM Mak * ili Omomic. Mak * je dobijen kao što je opisano u Montagne M. et al. (Montagne M. et al. 2012. PLoS One, 7 (2): e32172). Ć elije su sakupljene i obojene aneksinom V i PI prema protokolu proizvođača (Tali® Apoptosis Kit A10788, Life tehnologije) i fluorescencija kvantifikovana upotrebom citometra na bazi Tali® slike.
[0147] U ovom pronalasku autori pokazuju da je Omomic efikasniji u redukciji broja vitalnih A549 ć elija nego bHLHZ domena Mak-a (Slika 2 A i C). Dosledno, procenat mrtvih/apoptotskih ć elija je ve ć i nakon tretmana sa Omomic peptidom nego sa Mak * peptidom (Slika 2B i D).
Primer 5
Omomic je više savijen nego c-Mic * i termički je stabilniji od Mak i C-Mic * u rastvoru
[0148] Termički stabilni polipeptidi imaju prednost u onim okolnostima kada se polipeptid mora formulisati kao farmaceutska kompozicija. Dakle, utvrđena je komparativna termička stabilnost Omomic i Mak *.
[0149] Omomic gen je eksprimiran kao što je opisano u Primeru 1 i prečišć en kao u napred navedenom Primeru 2. Prečiš ć avanje Mak * je izvedeno kao što je detaljno opisano u Beaulieu M.E. et al., 2013 (Methods Mol Biol, 1012: 7-20). Ukratko, BL21-DE3-pLis bakterije su transformisane sa pET-3a ekspresionim vektorom koji sadrži Mak * insert, i kultivisane kao što je napred opisano. Indukcija je izvedena sa IPTG (0.6 mM) tokom 4 sata, nakon čega su ć elije sakupljene. Nakon liziranja sa puferom za lizu i centrifugisanjem na 30000 x g, solubilizovani proteinski ekstrakt je prečišć en koriš ć enjem kationskoizmenjivačke hromatografije i desalinizovan kao što je napred opisano. Prečišć eni i liofilizovani proteini su resuspendovani u 50 mM KH2P04, 50 mM KCl, 5 mM DTT (pH je podešen upotrebom 1N KOH ili 1N Hcl).
[0150] Merenja cirkularnog dihroizma su izvršena kao što je opisano u Beaulieu M.E. i sar., 2012 (J Mol Recognit, 25 (7): 414-26), koristeć i koncentraciju proteina od 32 mM. CD spektri su zabeleženi na 20°C, a termalna degeneracija je izvedena na 1°C/min (Slika 3A i 3B), prać enje je izvr šeno na talasnoj dužini od 222 nm da bi se izmerio helikoidni sadržaj (koji odražava presavijeni, strukturirani status) proteina.
Primer 6
Omomic efikasnije prodire u jezgre ć elija nego Mak *
[0151] Ukratko, prečišć eni Omomic i Mak * peptidi su obeleženi sa fluorescein-maleimidom (FITC) preko projektovanog C-terminalnog cisteinskog ostatka. Posle prečišć avanja i procene prisustva jedne fluorescentne etikete po molekulu proteina masenom spektrometrijom, različite koncentracije proteina (5 mM, 10 mM ili 25 mM) su dodate u A549 ć elije (K-Ras mutantni adenokarcinom plu ć a) kultivisane u RPMI koje sadrže 0,5% seruma i inkubirane 2h na 37°C pre nego što su isprane tri puta sa PBS-om i fiksirane u 4% PFA 10 minuta, bojene sa 1,5 mg/ml Hoechst-a 10 minuta i montirane na mikroskopske preparate. Slike konfokalne mikroskopije pokazale su da Omomic efikasnije prodire u jezgra ć elija A549 od Mak * u koncentracijama od 5, 10 i 25mM (podaci nisu prikazani). Intenzitet nuklearne fluorescencije je kvantifikovan pomoć u ImageJ, sa brojem ćelija 30 do 80 po slici. Kvantifikacija penetracije ć elija posmatrana za Omomic i Mak * u A549 fiksnim ć elijama prikazana je na slici 4.
[0152] Superiorna sposobnost prodiranja ć elija Omomic preko Mak * je potvrđena u koncentraciji od 20 mM u živim ć elijama (da bi se izbegli potencijalni artefakti fiksacije) nakon 20 minuta inkubacije.
Ukratko, FOMT-označeni Omomic i Mak * dodaju se u A549 kulture ć elije u RPMI koji sadrže 0.5% seruma i inkubiraju 20 minuta na 37°C pre nego što se tri puta isperu u PBS i montiraju u medijumu koji sadr ži Hoechst. Konfokalne mikroskopske slike su pokazale da Omomic efikasnije prodire u jezgre živih ć elija A549 od Mak * na 20 mM (podaci nisu prikazani). Intenzitet nuklearne fluorescencije je kvantifikovan pomoć u ImageJ, sa brojem ćelija 30 do 80 po slici. Kvantifikacija penetracije ć elija posmatrana za Omomic i Mak * u živimć elijama A549 prikazana je na slici 5.
Primer 7
Omomic unos se odvija kroz proces koji zavisi od ATP
[0153] Pokazano je da Mak * prodire kroz ć elije preko ATP-zavisnog procesa, koji se može blokirati snižavanjem temperature na 4°C. Sličan mehanizam je uključen u Omomic-ovu sposobnost prodiranja u ć elije. A549 ć elije su inkubirane tokom 2 sata sa 20 mM FITC-obeleženim peptidom na 4°C i fiksirane sa 4% PFA, pre nego što su tri puta oprane sa PBS-om i postavljene na mikroskopskim slajdovima koristeć i montažni medijum koji sadrži Hoechst. Konfokalne mikroskopske slike su pokazale da se ulaz Omomic-a može blokirati smanjenjem temperature na 4°C.
Primer 8
Omomic smanjuje ukupan broj ć elija efikasnije od Mak *
[0154] Ukratko, A549 i H1650 ć elije adenokarcinoma plu ć a su inkubirane sa 25 mM Omomic ili Mak * peptidima u RPMI koji sadrže 5 % seruma i fiksirani u naznačenom vremenu (2 dana ili 4 dana) sa 4% PFA prać eno kristalno ljubičastom bojom ( 0.5% kristal violeta u 25% metanola 10 minuta) i pranjem najmanje tri puta vodom. I Omomic i Mak * sprečavaju rast ć elija, ali Omomic je efikasniji u tome (Slika 6). Ć elije sa kristalno ljubičastom bojom su rastvorene u 10 % sirć etnoj kiselini i dobijeni rastvor je razblažen 1:4 u H2Odd i kvantifikovan merenjem apsorbancije na OD595. Kvantifikacija inhibicije proliferacije kristalnom ljubičastom pokazala je da je Omomic očigledno efikasniji od Mak * da smanji proliferaciju H1650 ć elija (EGFR-mutirane ć elije adenokarcinoma plu ć a) kada se koristi u koncentraciji od 25 mM tokom 6 dana (Slika 7).
[0155] Da bi se izračunao IC<50>od Omomic-a i Mak-a, A549 ć elije su tretirane sa naznačenom koncentracijom peptida u medijumu za kulturu koji sadrži 5 % seruma i obojene kristalno ljubičastom bojom kao što je napred opisano. Kvantifikacija je izvedena kao što je napred opisano. Slika 8 prikazuje doznu reakciju A549 ć elija na Omomic u odnosu na Mak * koji pokazuje da Omomic ima ni ži IC<50>nego Mak * (tj. Omomic treba manju dozu u poređenju sa Mak * da bi se smanjio broj ć elija na pola). Specifično, IC<50>za Omomic je 1.2 mM i IC50 za Mak * je 2.6 mM.
[0156] Efekat Omomic-a na proliferaciju ć elija analiziran je u U87 ćelijama glioma. U87 ćelije glioma su inkubirane sa Omomic ili Mak * peptidima (25 mM konačna koncentracija) u DMEM koji sadrži 5 % seruma tokom 48 h. Ć elije su tripsinizovane i izbrojane koriš ć enjem brojača Tali ć elija (Life technologies Inc.). Slika 9 pokazuje da Omomic smanjuje proliferaciju U87 ć elija glioma efikasnije nego Mak *.
Primer 9
Omomic efikasno prodire u pluć no i moždano tkivo nakon intranazalne primene
[0157] Životinje su tretirane sa jednom dozom od 37.5 mg/kg Omomic ili ostavljene neobrađene (tretirane sa PBS) intranazalnom administracijom. 10 minuta nakon intranazalne primene detektovan je fluorescentni peptid. Pluć a tretiranih životinja su postala fluorescentna kao posledica Omomic lokalizacije (Slika 10A). Ovo pokazuje da Omomic peptid može biti administriran životinjama intranazalnom instilacijom i efikasno prodreti u njihova pluć a. Mozak istih životinja opisan u prethodnoj slici takođe izgleda fluorescentno (Slika 10B). Očigledno je da fluorescentni Omomic peptid može proć i krvno-moždanu barijeru (BBB) i prodreti do mozga.
Primer 10
Omomic peptid ima terapeutski efekat in vivo
[0158] Primenjen kao peptid intranazalno, Omomic smanjuje proliferaciju u modelu mi ša koji je vođen KRas-om upravljanog adenokarcinoma pluć a. Pronalazači su koristili mišji model karcinoma koji je upravljan KRas (model LSLKRasG12D). Ukratko, u miševe stare 8 nedelja su ubrizgani AdenoCre virusi da da u plućima indukuju ekspresiju KRas-G12D mutantnog proteina. Kada su mi ševi razvili adenokarcinom pluć a (18 nedelja nakon infekcije), životinje su tretirane intranazalno sa Omomic peptidom (15 mg/kg u 35 mL zapremine) dnevno tokom 3 dana. Omomic je smanjio proliferativnu stopu tumora (Ki67 bojenje; Slika 11A) i smanjenuć elijsku gustinu (Slika 11B).
[0159] Omomic peptid takođe smanjuje optere ć enje tumora in vivo nakon tretmana od 1 nedelje. Koristeć i isti model miša i eksperimentalne uslove kao što je prethodno opisano, životinje su tretirane svakodnevno tokom 1 nedelje sa 15 mg/kg peptida. % tumorske površine je meren koriš ć enjem ImageJ. Slika 12 pokazuje da Omomic smanjuje optereć enje karcinoma u modelu mi ša sa adenokarcinomom plu ć a koje pokreć e Kras.
2
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�

Claims (4)

Patentni zahtevi
1. Polipeptid koji se sastoji od SEK ID BR: 1 ili njegove funkcionalno ekvivalentne varijante koje imaju stepen identičnosti u odnosu na SEK ID BR: 1 već i od 70%, pri čemu je funkcionalno ekvivalentna varijanta polipeptid koji je rezultat umetanja ili dodavanja jedne aminokiseline i/ili delecije iz jedne ili vi še aminokiselina i/ili konzervativne supstitucije iz jedne ili vi še aminokiselina u odnosu na polipeptid od SEK ID BR: 1 i gde se njegova funkcionalno ekvivalentna varijanta može dimerizovati sa MIC i inhibirati njegovu aktivnost jednom pronađenu u nukleusu, sposobnu da se translocira preko ć elijske membrane i preko nuklearne ovojnice za upotrebu u medicini, pri čemu treba primeniti polipeptid ili njegovu funkcionalno ekvivalentnu varijantu.
2. Polipeptid koji se sastoji od SEK ID BR: 1 ili njegove funkcionalno ekvivalentne varijante koje imaju stepen identičnosti u odnosu na SEK ID BR: 1 već i od 70%, pri čemu je funkcionalno ekvivalentna varijanta polipeptid koji je rezultat umetanja ili dodavanja jedne aminokiseline i/ili delecije iz jedne ili vi še aminokiselina i/ili konzervativne supstitucije iz jedne ili vi še aminokiselina u odnosu na polipeptid od SEK ID BR: 1 i gde se njegova funkcionalno ekvivalentna varijanta može dimerizovati sa MIC i inhibirati njegovu aktivnost jednom pronađenu u nukleusu, sposobnu da se translocira preko ć elijske membrane i preko nuklearne ovojnice za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju karcinoma, pri čemu treba primeniti polipeptid ili njegovu funkcionalno ekvivalentnu varijantu.
3. Polipeptid ili njegova funkcionalno ekvivalentna varijanta za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 ili 2, pri čemu se polipeptid ili njegova funkcionalno ekvivalentna varijanta daje bez upotrebe sredstava za isporuku polipeptida u citoplazmu ć elije.
4. Polipeptid ili njegova funkcionalno ekvivalentna varijanta za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 3, pri čemu je funkcionalno ekvivalentna varijanta polipeptid koji je rezultat umetanja ili dodavanja jedne aminokiseline u odnosu na polipeptid SEK ID BR: 1.
RSP20190840 2013-05-07 2014-05-07 Metode i kompozicije za lečenje karcinoma RS59276B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20130382167 EP2801370A1 (en) 2013-05-07 2013-05-07 Methods and compositions for the treatment of cancer
PCT/EP2014/059315 WO2014180889A1 (en) 2013-05-07 2014-05-07 Methods and compositions for the treatment of cancer
EP14722204.6A EP2994533B1 (en) 2013-05-07 2014-05-07 Methods and compositions for the treatment of cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59276B1 true RS59276B1 (sr) 2019-10-31

Family

ID=48366303

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RSP20190840 RS59276B1 (sr) 2013-05-07 2014-05-07 Metode i kompozicije za lečenje karcinoma

Country Status (26)

Country Link
US (2) US10370434B2 (sr)
EP (4) EP2801370A1 (sr)
JP (2) JP6722103B2 (sr)
KR (1) KR102324116B1 (sr)
CN (1) CN105378084B (sr)
AU (1) AU2014264642B2 (sr)
BR (2) BR112015028115B1 (sr)
CA (1) CA2911863A1 (sr)
CY (1) CY1121849T1 (sr)
DK (1) DK2994533T3 (sr)
EA (2) EA202090683A3 (sr)
ES (1) ES2733515T3 (sr)
HK (1) HK1251494A1 (sr)
HR (1) HRP20191330T1 (sr)
HU (1) HUE045615T2 (sr)
IL (2) IL242483B (sr)
LT (1) LT2994533T (sr)
ME (1) ME03509B (sr)
MX (1) MX370792B (sr)
PL (1) PL2994533T3 (sr)
PT (1) PT2994533T (sr)
RS (1) RS59276B1 (sr)
SG (2) SG11201509131VA (sr)
SI (1) SI2994533T1 (sr)
SM (1) SMT201900423T1 (sr)
WO (1) WO2014180889A1 (sr)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2801370A1 (en) 2013-05-07 2014-11-12 Fundació Privada Institut d'Investigació Oncològica de Vall Hebron Methods and compositions for the treatment of cancer
US10654894B2 (en) * 2016-02-03 2020-05-19 Keenesaw State University Research And Service Foundation, Inc. Methods for delivering cargo into a cell by using signal molecules as cell penetration agents
US20190135868A1 (en) * 2016-04-29 2019-05-09 The University Of Chicago Synthetic dna binding domain peptides and uses thereof
EP3269734A1 (en) * 2016-07-15 2018-01-17 Fundació Privada Institut d'Investigació Oncològica de Vall-Hebron Methods and compositions for the treatment of cancer
CN106591335A (zh) * 2016-11-08 2017-04-26 安徽省农业科学院水稻研究所 一种密码子植物化改造的LbCpf1基因及其应用
WO2019048679A1 (en) * 2017-09-08 2019-03-14 Idp Discovery Pharma, S.L. NEW TREATMENTS OF MULTIPLE MYELOMA
WO2019108134A1 (en) * 2017-11-29 2019-06-06 Agency For Science, Technology And Research Chimeric molecule for targeting c-myc in cells
EP3775258A4 (en) 2018-03-28 2022-01-26 Board of Regents, The University of Texas System IDENTIFICATION OF EPIGENETIC ALTERATIONS IN DNA ISOLATED FROM EXOSOMES
WO2019199803A1 (en) * 2018-04-09 2019-10-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Therapeutic targeting of oncogenes using exosomes
CA3126544A1 (en) * 2019-01-12 2020-07-16 The Methodist Hospital Self-assembled peptide nanoparticle and use thereof
TWI829893B (zh) * 2019-03-19 2024-01-21 瓦爾希伯倫私人腫瘤研究基金會 診斷肺癌的方法
CN113795264A (zh) 2019-03-19 2021-12-14 瓦尔希伯伦私人肿瘤研究基金会 采用Omomyc和结合PD-1或CTLA-4的抗体治疗癌症的联合疗法
CN114174313A (zh) 2019-04-09 2022-03-11 芝加哥大学 采用狄尔斯-阿尔德环加成反应的通用型肽和蛋白质的大环化和多聚化
KR102221227B1 (ko) 2019-05-07 2021-03-03 김영화 공급자 연동과 다국어 지원 기능을 구비한 쇼핑몰 플랫폼 제공 장치 및 그 방법
US20220307013A1 (en) * 2019-08-30 2022-09-29 The Regents Of The University Of California Gene fragment overexpression screening methodologies, and uses thereof
CN115925975B (zh) * 2022-08-03 2024-09-17 山东大学 一种靶向肿瘤干细胞的car-mφ体内外编辑制备方法以及其应用
EP4361633A1 (en) 2022-10-25 2024-05-01 Peptomyc, S.L. Method for predicting response to a cancer treatment
EP4446742A1 (en) 2023-04-14 2024-10-16 Peptomyc, S.L. Method for assessing or monitoring the response to a cancer treatment
EP4473974A1 (en) * 2023-06-07 2024-12-11 Peptomyc, S.L. Omomyc and kras inhibitors combination therapy for the treatment of cancer
WO2025064985A1 (en) * 2023-09-22 2025-03-27 Ohio State Innovation Foundation Myc INHIBITOR PROTEINS AND USES THEREOF
CN118324872A (zh) * 2024-04-19 2024-07-12 国家纳米科学中心 靶向kras突变蛋白的多肽及其应用
CN118557561A (zh) * 2024-05-16 2024-08-30 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） 9-十六烯酸在制备防治结直肠肿瘤的产品及其作为化疗药物的增效剂中的应用

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
DE3169595D1 (en) 1980-11-10 1985-05-02 Gersonde Klaus Method of preparing lipid vesicles by ultrasonic treatment, the use of this method and apparatus for its application
DE3374837D1 (en) 1982-02-17 1988-01-21 Ciba Geigy Ag Lipids in the aqueous phase
DE3474511D1 (en) 1983-11-01 1988-11-17 Terumo Corp Pharmaceutical composition containing urokinase
US5322801A (en) 1990-04-19 1994-06-21 The General Hospital Corporation Protein partner screening assays and uses thereof
EP0633933A1 (en) * 1992-03-23 1995-01-18 Imperial Cancer Research Technology Limited Leucine zippers
EP1342781A1 (en) * 2002-03-09 2003-09-10 ARTEMIS Pharmaceuticals GmbH Recombinase fusion protein with enhanced cellular uptake
GB0413730D0 (en) 2004-06-18 2004-07-21 Tillotts Pharma Ag A pharmaceutical composition and its use
US8735394B2 (en) * 2005-02-18 2014-05-27 Abraxis Bioscience, Llc Combinations and modes of administration of therapeutic agents and combination therapy
AU2010295646B2 (en) * 2009-09-15 2016-02-11 Ellipses Pharma Limited Treatment of cancer
DE102009052866A1 (de) * 2009-11-13 2011-05-19 Bizerba Gmbh & Co. Kg Schneidemaschine
EP2544686A4 (en) 2010-02-05 2013-06-26 Whitehead Biomedical Inst COMBINATION PROCEDURE FOR THE TREATMENT OF A DISEASE
RU2556800C2 (ru) 2010-06-14 2015-07-20 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Пептиды, проникающие в клетки, и их применения
WO2013063560A2 (en) * 2011-10-27 2013-05-02 New York University INHIBITION OF c-MYC UBIQUITINATION TO PREVENT CANCER INITIATION AND PROGRESSION
EP2801370A1 (en) 2013-05-07 2014-11-12 Fundació Privada Institut d'Investigació Oncològica de Vall Hebron Methods and compositions for the treatment of cancer

Also Published As

Publication number Publication date
EP2994533B1 (en) 2019-05-01
HUE045615T2 (hu) 2020-01-28
WO2014180889A1 (en) 2014-11-13
ME03509B (me) 2020-04-20
SMT201900423T1 (it) 2019-09-09
KR102324116B1 (ko) 2021-11-11
SI2994533T1 (sl) 2019-09-30
BR112015028115A2 (pt) 2017-10-17
EA035463B1 (ru) 2020-06-19
MX2015015518A (es) 2016-07-21
WO2014180889A8 (en) 2015-06-18
US11339205B2 (en) 2022-05-24
BR112015028115B1 (pt) 2023-11-21
HK1219756A1 (en) 2017-04-13
EA201690159A1 (ru) 2016-05-31
EP3338789A1 (en) 2018-06-27
ES2733515T3 (es) 2019-11-29
CA2911863A1 (en) 2014-11-13
JP2016520056A (ja) 2016-07-11
PT2994533T (pt) 2019-08-05
CN105378084A (zh) 2016-03-02
DK2994533T3 (da) 2019-07-01
IL273090A (en) 2020-04-30
LT2994533T (lt) 2019-08-12
US10370434B2 (en) 2019-08-06
PL2994533T3 (pl) 2020-03-31
EA202090683A2 (ru) 2020-06-30
US20190382468A1 (en) 2019-12-19
JP6790148B2 (ja) 2020-11-25
EA202090683A3 (ru) 2020-09-30
IL273090B (en) 2022-06-01
CY1121849T1 (el) 2020-07-31
IL242483B (en) 2020-03-31
EP2801370A1 (en) 2014-11-12
HK1251494A1 (en) 2019-02-01
AU2014264642A1 (en) 2015-11-19
HRP20191330T1 (hr) 2019-10-18
AU2014264642B2 (en) 2020-09-17
MX370792B (es) 2020-01-08
SG10201709101VA (en) 2017-12-28
BR122020017819B1 (pt) 2023-11-21
KR20160013058A (ko) 2016-02-03
EP3545966A1 (en) 2019-10-02
JP6722103B2 (ja) 2020-07-15
EP2994533A1 (en) 2016-03-16
US20160122415A1 (en) 2016-05-05
SG11201509131VA (en) 2015-12-30
CN105378084B (zh) 2019-07-05
JP2019147792A (ja) 2019-09-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11339205B2 (en) Methods and compositions for the treatment of cancer
AU2017295071B2 (en) Methods and compositions for the treatment of cancer
HK40014958A (en) Methods and compositions for the treatment of cancer
CA3029781C (en) Methods and compositions for the treatment of cancer
HK1219756B (en) Methods and compositions for the treatment of cancer
EA047076B1 (ru) Способы и композиции для лечения рака
HK40007694B (en) Methods and compositions for the treatment of cancer
HK40007694A (en) Methods and compositions for the treatment of cancer
EA042570B1 (ru) Способы и композиции для лечения рака