RS59285B1 - Kompozicija za upotrebu u lečenju bola povezanog sa intervertebralnim diskom - Google Patents

Description

Opis

OBLAST TEHNIKE PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na bol povezan sa intervertebralnim diskom, kao što je bol u donjem delu leđa, hronični bol u donjem delu leđa, bol u vratu, hronični bol u vratu i kokcigodinija, i kompoziciju za upotrebu u lečenju bola povezanog sa intervertebralnim diskom.

OSNOVA PRONALASKA

[0002] Bol u donjem delu leđa, npr. hronični bol u donjem delu leđa, je često stanje koje pogađa oko 80 % adultne populacije u toku njihovog životnog veka. Bol u donjem delu leđa nije specifična bolest sa poznatom patofiziologijom, već je pre simptom sa mnogim uzrocima. Procenjeno je da je direktan uzrok, kao što je tumor, fraktura ili infekcija, poznat samo kod približno 5-10 % pacijenata. Kod preostalih 90-95 % slučajeva, bol u donjem delu leđa je idiopatski, tj. bez poznatog porekla.

[0003] Struktura u leđima koja izgleda da je većinom odgovorna za proizvodnju bola u donjem delu leđa je intervertebralni disk. Intervertebralni disk se nalazi između dva susedna pršljena. Intervertebralni disk je tipično fleksibilan i omogućava kretanje između susednih pršljenova. On je formiran od prstena vezivnog tkiva koji uglavnom sadrži kolagen i polu-tečan centar koji sadrži npr. kolagen i proteoglikane. Prsten je označen kao annulus fibrosus i centar je označen kao nucleus pulposus.

[0004] Već u starosti od 20-30 godina, intervertebralni disk čoveka počinje da prolazi kroz starenje, proces koji je često označen kao degeneracija diska. U toku procesa starenja intervertebralni disk može da curi ili da formira herniju i proizvede simptome kao što je bol u donjem delu leđa i išijas. Starenje intervertebralnog diska se obično završava pri starosti od 60-80 godina. U ovom stadijumu, intervertebralni disk je transformisan u čvrsto i gusto vezivno tkivo. Kada se ovo javi, intervertebralni disk tipično više neće proizvoditi simptome s obzirom da je manje verovatno da curi ili da formira herniju. Starenje intervertebralnog diska dalje ukazuje na redukciju u visini diska i redukciju pokretljivosti kičme.

[0005] Poznato je da će degeneracija diska indukovati prstenaste fisure koje mogu da omoguće komunikaciju između centra intervertebralnog diska i spoljašnje površine annulus fibrosus. Na taj način, supstance, kao što su inflamatorni agensi, iz centra intervertebralnog diska mogu da cure na spoljašnju površinu annulus fibrosus. Receptori, koji obično tihi i nalaze se na spoljašnjoj površini annulus fibrosus, mogu zatim biti aktivirani inflamatornim agensima tipično prisutnim u centru intervertebralnog diska u toku degeneracije diska. Ovaj mehanizam je sugerisan kao jedan mehanizam odgovoran za bol u donjem delu leđa.

[0006] Sledeći mehanizam koji je sugerisan kao odgovoran za bol u donjem delu leđa je taj da tu može biti novo-formiranih krvnih sudova i nerava koji rastu sa spoljašnje površine annulus fibrosus u centar intervertebralnog diska kroz prstenaste fisure. Pretpostavljeno je da ovi nervi mogu da proizvode bol kada se intervertebralni disk kreće i vrši pritisak na nerve.

[0007] Jedan uobičajeni postupak za lečenje bola u donjem delu leđa je hirurškom stabilizacijom vertebralnog segmenta koji sadrži intervertebralni disk, pri čemu intervertebralni disk verovatno proizvodi bol. Obrazloženje je da je potrebno smanjiti pokrete intervertebralnog diska koji proizvodi bol u cilju izbegavanja da urastajući nervi budu pritisnuti i da proizvode bol. Ovaj hirurški tretman je, međutim, invazivan, i nije potpuno zadovoljavajući.

[0008] Sledeći predloženi postupak za lečenje bola u donjem delu leđa ili pre išijasa, je pomoću takozvane hemonukleolize, pri čemu je enzim injektiran u intervertebralni disk u cilju rastvaranja nucleus pulposus na taj način smanjujući pritisak koji vrši nucleus pulposus intervertebralnog diska na npr. nerv.

[0009] Pored toga, sledeći predloženi postupak za lečenje bola u donjem delu leđa je podmlađivanjem ili regeneracijom, intervertebralnog diska uvođenjem npr. kultivisanih ćelija diska i matičnih ćelija. Međutim, izgleda malo verovatno da bi sredina lišena nutritijenata u centru intervertebralnog diska uspešno osigurala preživljavanje novo-uvedenih ćelija.

[0010] Na primer, regeneracija stimulisana fibroznim sredstvom je otkrivena u WO 2005/046746. WO 2005/046746 se odnosi na npr. postupak koji sadrži uvođenje u prostor intervertebrallnog diska pacijenta kod koga postoji potreba za tim, terapeutski efikasne količine fibrozog agensa ili kompozicije koja sadrži fibrozni agens. Fibrozni agens indukuje fibrotički odgovor u prostoru intervertebralnog diska pacijenta, na taj način obezbeđujući pacijentu korisan rezultat. WO 2005/046746 se takođe odnosi na injektabilnu kompoziciju koja sadrži fibrozni agens i agens za punjenje.

[0011] Međutim, u stanju tehnike još uvek postoji potreba za obezbeđivanjem bezbednog i zadovoljavajućeg postupka za uspešnije lečenje bola u donjem delu leđa.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0012] Cilj predmetnog pronalaska je obezbediti kompoziciju za upotrebu u lečenju bola povezanog sa intervertebralnim diskom, kao što je bol u donjem delu leđa, hronični bol u donjem delu leđa, bol u vratu, hronični bol u vratu i kokcigodinija.

[0013] Kompozicija za upotrebu u lečenju bola povezanog sa intervertebralnim diskom može biti formulisana tako da se može primenjivati u terapeutski efikasnoj količini lokalnom injekcijom u intervertebralni disk.

[0014] Koncept predmetnog pronalaska je smanjenje bola povezanog sa intervertebralnim diskom ubrzavanjem starenja intervertebralnog diska na taj način čineći intervertebral disk čvršćim, npr. transformacijom intervertebralnog diska u čvrsto ili gusto vezivno tkivo. Transformacija intervertebralnog diska u čvrsto i gusto vezivno tkivo čini ga stabilnijim i posledično, intervertebralni disk dobija smanjeni opseg pokreta. Intervertebralni disk transformisan u čvrsto i gusto vezivno tkivo neće omogućiti nijednoj tečnoj komponenti da iscuri iz prostora diska, npr. na spoljašnju površinu annulus fibrosus, niti omogućava nervima da rastu u intervertebralni disk.

[0015] Već 1959., Carl Hirsch je tvrdio da: "Pre ili kasnije moguće je da će se pronaći supstanca pomoću koje bi degenerisani disk mogao biti transformisan u gusto vezivno tkivo." U radu "Studies on the Pathology of Low Back Pain" objavljenom u The Journal of Bone and Joint Surgery, Vol. 41B, No. 2, p. 237-243, May 1959. Ipak, izgleda da niko do sada nije predstavio bilo koju takvu supstancu.

[0016] Pronalazač predmetnog pronalaska je iznenađujuće našao da bi ta supstanca uspešno mogla biti mlečna kiselina, ili njena farmaceutski prihvatljiva so. Ovaj nalaz je naročito iznenađujuć u pogledu stanja tehnike pre nego fokusiranje na smanjenje količine mlečne kiseline, ili njene farmaceutski prihvatljive soli, unutar intervertebralnog diska koji izaziva bol. Na primer, US 2012/0022425 A1 otkriva postupak za smanjenje mlečne kiseline unutar intervertebralnog diska injektiranjem inhibitora mlečne kiseline u vertebralni disk da bi se inhibirala proizvodnja mlečne kiseline i na taj način ublažavanje bola u leđima od pečenja od mlečne kiseline. Pored toga, WO 2013/092753 A1 otkriva jedinjenje derivata indola za inhibiciju proizvodnje laktata u lečenju na primer hroničnog bola u leđima.

[0017] Mlečna kiselina je karboksilna kiselina sa hemijskom formulom CH3CH(OH)COOH. Kao što je prikazano u formuli (I) u daljem tekstu, mlečna kiselina može u vodenom rastvoru da izgubi proton iz svoje karboksilne grupe, proizvodeći jon laktata CH3CH(OH)COO- . Molarna frakcija mlečne kiseline prema jonu laktata je 1:1.

CH3CH(OH)COOH (aq) ↔ CH3CH(OH)COO- H+ (I)

[0018] Laktatni jon može zajedno sa protiv-jonom da formira farmaceutski prihvatljivu so. Protiv-jon može biti jon metala izabran iz grupe koja se sastoji od jona od sledećih elemenata: Li, Be, Na, Mg, K i Ca. Alternativno, protiv-jon može biti organski jon, kao što je amonijum amonijum ili holin. Mlečna kiselina ili njene farmaceutski prihvatljive soli, su prirodno prisutne u ljudskom telu.

[0019] Koncentracija jona laktata u tkivnoj vodi lumbalnog intervertebralnog diska pacijenta sa bolom u leđima je izmerena tako da je unutar opsega od 1 mmol/L do skoro 12 mmol/L, tipično u opsegu od 2 mmol/L do 6 mmol/L. Ove izmerene vrednosti su predstavljene na stranici 5 i na slici 6 naučnog rada "Oxygen and lactate concentrations measured in vivo in the intervertebral discs of patients with scoliosis and back pain" od Bartels et al., objavljenog u Spine 23(1): pp.1-8, 1998.

[0020] Kao što se vidi u Tabeli 1, molekulska masa jona laktata je 89.07 g/mol. Molarna koncentracija od 1 mmol jona laktata po litri tkivne vode u lumbalnom intervertebralnom disku na taj način odgovara masenoj koncentraciji od 89.07 mg/L. Slično, molarna koncentracija od 12 mmol jona laktata po litri tkivne vode u disku odgovara masenoj koncentraciji od 1067 mg/L.

[0021] Kod čoveka, prostor diska lumbalnog intervertebralnog diska ima zapreminu koja je procenjena da je približno od 1.5 mL do 3.0 mL.

[0022] U pogledu gore navedenog, stručnjak iz date oblasti tehnike bi lako mogao da izračuna količinu laktata, izraženu u molima ili gramima, u disku. Primer je dat u Tabeli 1.

Tabela 1. Približne količine jona laktata u lumbalnom intervertebralnom disku pacijenta sa bolom u leđima.

[0023] Mlečna kiselina, jon laktata ili njegova farmaceutski prihvatljiva so mogu negativno da utiču na funkciju ćelija intervertebralnog diska, naročito ćelija koje proizvode proteoglikane neophodne za prevenciju starenja diska.

[0024] Starenje intervertebralnog diska je započeto smanjenim snabdevanjem hranljivih sastojaka i kiseonika preko difuzije iz krvnih sudova u susednim pršljenovima i iz okolnih struktura. Ovo će postepeno indukovati akumulaciju metaboličkih otpadnih proizvoda u intervertebralnom disku, kao što je u nucleus pulposus. Jedna vrsta metaboličkog otpadnog proizvoda koja može biti prisutna je mlečna kiselina i njene farmaceutski prihvatljive soli.

[0025] Mlečna kiselina i njene farmaceutski prihvatljive soli, mogu da doprinesu nekoliko mehanizama koji će dati ćelijsku smrt u intervertebralnim diskovima, kao što je intracelularna akumulacija masti, mitohondrijalno bubrenje, grudvanje hromatina i oslobađanje ekscitotoksičnog glutamata.

[0026] Mlečna kiselina i njene farmaceutski prihvatljive soli, mogu da oslobode PGE2 izazivajući inflamaciju i proizvodnju vezivnog tkiva. Pored toga, mlečna kiselina i njene farmaceutski prihvatljive soli, mogu da stimulišu oslobađanje TGF-beta, koji zatim stimuliše fibroblaste da proizvode kolagen.

[0027] Mlečna kiselina i njene farmaceutski prihvatljive soli, takođe mogu da doprinesu rasprostranjenoj intravaskularnoj koagulaciji i koagulopatiji, koja povećava tendenciju agregacije crvenih krvnih zrnaca, formirajući "krvni talog" i čini crvena krvna zrnca rigidnijim, zauzvrat, povećavajući viskozitet krvi i smanjujući cirkulaciju u malim krvnim sudovima.

[0028] Na taj način, povećanje u koncentraciji mlečne kiseline ili njene farmaceutski prihvatljive soli, u intervertebralnom disku primenom kompozicije koja koja sadrži mlečnu kiselinu, ili njenu farmaceutski prihvatljivu so, u prostor diska intervertebralnog diska bi prema tome ubrzalo starenje diska i indukovalo transformaciju nucleus pulposus u vezivno tkivo.

[0029] Starenje intervertebralnog diska, uključujući transformaciju nucleus pulposus u vezivno tkivo, čini intervertebralni disk čvršćim i primenom kompozicije koja sadrži mlečnu kiselinu ili njenu farmaceutski prihvatljivu so, starenje može biti ubrzano na način koji se može kontrolisati. Tipično, koncentracija mlečne kiseline ili njenih farmaceutski prihvatljivih soli, može biti povećana u intervertebralnom disku, specifičnije u prostoru diska, u cilju ubrzanja starenja.

[0030] Pronalazač je našao da kompozicija koja sadrži mlečnu kiselinu ili njenu farmaceutski prihvatljivu so, indukuje izrazitu transformaciju intervertebralnog diska, na taj način čineći ga čvršćim. Izrazita transformacija je tumačena kao ubrzano starenje intervertebralnog diska transformacijom nucleus pulposus u vezivno tkivo. Posledično, pronalazač očekuje poboljšanja za pacijenta u vezi sa bolom povezanim sa intervertebralnim diskom ako se kompozicija koja sadrži mlečnu kiselinu ili njenu farmaceutski prihvatljivu so primenjuje u nucleus pulposus intervertebralnog diska rezultujući u povećanoj koncentraciji mlečne kiseline ili njene farmaceutski prihvatljive soli, unutar prostora diska.

[0031] Pronalazač očekuje poboljšanja za pacijenta u vezi sa bolom povezanim sa intervertebralnim diskom, kao što je bol u vratu, bol u donjem delu leđa ili kokcigodinija, posle primene mlečne kiseline ili njene farmaceutski prihvatljive soli, ili kompozicije koja sadrži mlečnu kiselinu ili njenu farmaceutski prihvatljivu so, u prostor diska intervertebralnog diska koji je najmanje delimično, odgovoran za bol povezan sa intervertebralnim diskom.

[0032] Prema prvom aspektu pronalaska, obezbeđena je kompozicija za upotrebu u lečenju bola povezanog sa intervertebralnim diskom. Kompozicija sadrži mlečnu kiselinu ili njenu farmaceutski prihvatljivu so. Kompozicija je primenjena u prostor diska koji sadrži nucleus pulposus intervertebralnog diska.

[0033] Kompozicija za upotrebu u lečenju bola povezanog sa intervertebralnim diskom može da sadrži najmanje jedan od mlečne kiseline i njene farmaceutski prihvatljive soli. Farmaceutski prihvatljiva so je farmaceutski prihvatljiva so koja sadrži jon laktata i protiv-jon.

[0034] Prednosti kompozicije za upotrebu u lečenju bola povezanog sa intervertebralnim diskom prema predmetnom pronalasku je bezbednije i efikasnije lečenje bola povezanog sa intervertebralnim diskom, pored toga je takođe jeftinije i manje invazivno od tretmana, npr. hirurškog tretmana, poznatih u stanju tehnike. Pored toga, mlečna kiselina ili njena farmaceutski prihvatljiva so, su biokompatibilni. Telo kičmenjaka, kao što je čovek, je sposobno da obrađuje, kao što je razlaže, mlečnu kiselinu ili njene farmaceutski prihvatljive soli, jer su ova jedinjenja prirodna jedinjenja, kao što su otpadni proizvodi, prisutni u telu kičmenjaka.

[0035] Pronalazač sugeriše da nucleus pulposus u prostoru diska intervertebralnog diska može da se transformiše u čvrsto i gusto vezivno tkivo, slično vezivnom tkivu annulus fibrosus, kada se kompozicija za upotrebu u lečenju bola povezanog sa intervertebralnim diskom prema pronalasku primenjuje u nucleus pulposus. Na primer, takođe, zgrušavanje krvi može da se odigrava u toku transformacije nucleus pulposus u vezivno tkivo, čineći intervertebralni disk čak čvršćim i gušćim. Povećana čvrstina očekuje se da rezultuje u smanjenom bolu.

[0036] Prema primeru izvođenja, kompozicija za upotrebu se primenjuje u količini efikasnoj u povećanju koncentracije mlečne kiseline ili koncentracije jona laktata iz farmaceutski prihvatljive soli, u prostoru diska do iznad 12 mmol/L.

[0037] Kompozicija za upotrebu može biti primenjivana u količini efikasnoj za povećanje koncentracije mlečne kiseline ili jona laktata u prostoru diska do koncentracije više od koncentracije koja se javlja u toku prirodnog starenja.

[0038] Prema primeru izvođenja, kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 2, pri čemu je koncentracija mlečne kiseline ili koncentracija jona laktata farmaceutski prihvatljive soli, u kompoziciji najmanje 12 mmol/L, na primer unutar opsega od 12 do 12000 mmol/L, kao što je od 100 do 10000 mmol/L, kao što je od 500 do 5000 mmol/L, kao što je od 800 do 2000 mmol/L.

[0039] Prema primeru izvođenja, farmaceutski prihvatljiva so je laktat bilo kog od elemenata izabranih iz grupe koja se sastoji od: alkalnih metala i zemnoalkalnih metala. Na primer, farmaceutski prihvatljiva so je najmanje jedna od litijum laktata, natrijum laktata, kalijum laktata, berilijum laktata, magnezijum laktata i kalcijum laktata.

[0040] Prema primeru izvođenja, farmaceutski prihvatljiva so je izabrana iz grupe koja se sastoji od: amonijum laktata, holin laktata, litijum laktata, natrijum laktata, kalijum laktata, berilijum laktata, magnezijum laktata i kalcijum laktata.

[0041] Prema primeru izvođenja, kompozicija za upotrebu je primenjena na prostor diska intervertebralnog diska koji doprinosi bolu povezanom sa intervertebralnim diskom.

[0042] U primeru, kompozicija za upotrebu može biti primenjena na bilo koji ili sve intervertebralne diskove za koje se sumnja da doprinose bolu povezanom sa intervertebralnim diskom.

[0043] Prema primeru izvođenja, mlečna kiselina ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, je primenjena lokalnom injekcijom u prostor diska koji sadrži nucleus pulposus.

[0044] Lokalna injekcija može tipično biti izvedena pomoću šprica.

[0045] Prema primeru izvođenja, mlečna kiselina je primenjena u jednoj dozi unutar opsega od 2 mg do 200 mg, kao što je od 5 mg do 200 mg, kao što je od 10 do 100 mg, kao što je od 10 do 50 mg, kao što je od 15 do 30 mg. Jedna doza odgovara količini mlečne kiseline koja se primenjuje na prostor diska.

[0046] Ako je farmaceutski prihvatljiva so primenjena, jon laktata farmaceutske soli je primenjen u količini koja odgovara jednoj dozi mlečne kiseline iz prethodnog teksta, uzimaju u obzir molarnu frakciju mlečne kiseline prema jonu laktata.

[0047] Prema primeru izvođenja, kompozicija za upotrebu koja sadrži mlečnu kiselinu ili njenu farmaceutsku so, je primenjena u jednoj prilici u jednoj dozi.

[0048] Prema primeru izvođenja, kompozicija je u obliku vodenog rastvora koji sadrži navedenu mlečnu kiselinu li njenu farmaceutski prihvatljivu so.

[0049] Tipično, kompozicija za upotrebu u lečenju bola povezanog sa intervertebralnim diskom je obezbeđena u tečnom stanju pogodnom za lokalnu injekciju.

[0050] Prema primeru izvođenja, bol povezan sa intervertebralnim diskom je izabran od bola u vratu, hroničnog bola u vratu, bola u donjem delu leđa, hroničnog bola u donjem delu leđa i kokcigodinije.

[0051] U nekim primerima, kompozicija može dalje da sadrži najmanje jedno sredstvo izabrano od solubilizatora, stabilizatora, pufera, modifikatora toničnosti, sredstava za punjenje, pojačivača viskoznosti, sredstava za smanjenje viskoznosti, surfaktanata, helirajućih sredstava, konzervanasa i ađuvanasa.

[0052] U alternativnom primeru, derivat mlečne kiseline može dodatno ili alternativno biti primenjivan kao prolek, kao što je etil laktat.

[0053] Kod čoveka, količina kompozicije za primenu može biti unutar opsega od 0.05 mL do 5 mL, kao što je od 0.1 do 3 mL, npr. od 0.2 mL do 2 mL. Ove količine odgovaraju više ili manje zapremini nucleus pulposus kod čoveka. Za lumbačni intervertebralni disk, količina kompozicije koja se primenjuje može biti približno od 1.5 mL do 3.0 mL. Za cervikalni intervertebralni disk, količina kompozicije koja se primenjuje može biti približno 0.5 mL. Za kokcigealni intervertebralni disk, količina kompozicje koja se primenjuje može biti približno 0.2 mL.

[0054] Termin "jedna prilika" ovde označava prilikom jedne posete medicinskoj ordinaciji, kao što je u toku posete lekaru npr. u bolnici. Poseta može biti ne duža od 24 časa, kao što je od 0.5 do 5 časova. Termin tipično, ali ne neophodno, ukazuje na to da se jedna doza primenjuje samo pomoću jedne injekcije pri jednoj prilici. Međutim, termin takođe pokriva slučajeve gde se jedna doza primenjuje prilikom jedne prilike, ali pomoću nekoliko injekcija, kao što je od 2 do 10 injekcija po jedinoj prilici, npr. od 2 do 5 injekcija po jednoj prilici.

[0055] Termin "ponovljene prilike" ovde označava više od jedne posete, tj. množinu poseta, medicinskoj ordinaciji, kao što je u toku više od jedne posete lekaru npr. u bolnici. Svaka poseta može biti ne duža od 24 časa, kao što je od 0.5 do 5 časova. Termin tipično, ali ne neophodno, ukazuje na to da je jedna doza primenjena pomoću samo jedne injekcije, ali prilikom ponovljenih prilika. Međutim, termin takođe pokriva slučajeve gde se jedna doza primenjuje prilikom ponovljenih prilika, ali pomoću nekoliko injekcija, kao što su od 2 do 10 injekcija po svakoj od navedenih ponovljenih prilika, npr. od 2 do 5 injekcija po svakoj od navedenih ponovljenih prilika.

[0056] Termin "intervertebralni disk" označava element koji je između dva susedna pršljena u kičmi. Svaki intervertebralni disk formira hrskavičavi zglob da bi se omogućilo neznatno kretanje pršljenova, i deluje kao ligament za držanje pršljenova zajedno. Intervertebralni disk se sastoji od spoljašnjeg annulus fibrosus, koji okružuje unutrašnji nucleus pulposus. Humani kičmeni stub sadrži 23 intervertebralna diska: 6 u vratu (cervikalni region), 12 u sredini leđa (torakalni region), i 5 u donjem delu leđa (lumbalni region). Pored toga, intervertebralni diskovi su takođe raspoređeni između kokcigealnih kostiju. Intervertebralni disk takođe može biti označen kao disk.

[0057] Termin "nucleus pulposus" označava supstancu sličnu želatinu u sredini intervertebralnog diska. Nucleus pulposus sadrži ćelije slične hondrocitama, fibrile kolagena i agrekane proteoglikana koji se nagomilavaju preko hijaluronskih lanaca. Vezani za svaki molekul agrekana su lanci glikozaminoglikana (GAG) hondroitin sulfata i keratan sulfata. Nucleus pulposus deluje kao apsorber udaraca, i održava dva susedna pršljena odvojenim.

[0058] Termin "annulus fibrosus" označava, pločicu fibroznog tkiva i fibro-hrskavice formiranu kao na obodu nucleus pulposus. Annular fibrosus služi za raspodelu pritiska podjednako duž intervertebralnog diska.

[0059] Termin "prostor diska" označava prostor intervertebralnog diska koji je napunjen sa nucleus pulposus i koji ima obim definisan sa annular fibrosus.

[0060] Termin "kranijalna ploča" označava površinu intervertebralnog diska koja je okrenuta prema kranijumu. Kranijalna ploča je raspoređena na suprotnoj strani intervertebralnog diska u poređenju sa kaudalnom pločom.

[0061] Termin "kaudalna ploča" označava površinu intervertebralnog diska koja je okrenuta od kranijuma. Kaudalna ploča je raspoređena na suprotnoj strani intervertebralnog diska u poređenju sa kranijalnom pločom.

[0062] Termin "fasetni zglob" označava parnu zglobnu strukturu koja tipično ima povrpinu zgloba koja je pokrivena zglobnom hrskavicom. Fasetni zglob je tipično zatvoren kapsulom. Fasetni zglob formira artikulaciju između donjeg zglobnog nastavka pršljena i gornjeg zglobnog nastavka pršljena. Fasetni zglob je tipično konstruisan tako da omogući pokrete i da obezbedi mehaničku potporu kičmenom stubu.

[0063] Termin "poprečni nastavak" označava koštanu formaciju koja se pruža lateralno od kičmenog luka na obe strane. On je takođe označen terminom processus costarius.

[0064] Termin "bol povezan sa intervertebralnim diskom" ovde označava bol povezan sa intervertebralnim diskom koji proizvodi bol. Bol povezan sa intervertebralnim diskom može biti bol povezan sa najmanje jednim od cervikalnog pršljena (C), lumbalnog pršljena (L), sakralnog pršljena (S) i kokcigealnog pršljena (Co). Primeri bola povezanog sa intervertebralnim diskom može biti bol u donjem delu leđa, hronični bol u donjem delu leđa, bol u vratu, hronični bol u vratu i kokcigodinija.

[0065] Termin "hronični bol u donjem delu leđa" je označen kao bol u donjem delu leđa gde su se simptomi javili više od 12 nedelja.

[0066] Termin "hronični bol u vratu" označava bol u vratu gde su se simptomi javili više od 12 nedelja.

[0067] Termin "kokcigodinija" označava bol u oblasti trtične ili repne kosti.

[0068] Termin "fleksiona ukočenost" ovde označava karakteristiku koja opisuje ukočenost intervertebralnog diska raspoređenog u segmentu kičmenog stuba. Fleksiona ukočenost može biti određena primenom sile na segment kičmenog stuba sve dok ne dostigne puni lateralni fleksioni mod, i zatim merenjem udaljenosti između poprečnih nastavaka pršljenova koji su raspoređeni na dve suprotne strane intervertebralnog diska, respektivno. Puni lateralni fleksioni mod je definisan kao stanje gde intervertebralni disk segmenta kičmenog stuba ne može biti dodatno opterećen bez lomljenja segmenta kičmenog stuba. Ova karakteristika je izmerena u milimetrima. Fleksiona ukočenost je način karakterizacije fleksuralne krutosti segmenta kičmenog stuba, i specifičnije, fleksuralne krutosti intervertebralnog diska.

[0069] Fleksuralna rigidnost je generalno definisana kao sila potrebna da savije strukturu koja nije kruta do jedinične zakrivljenosti. To je mera ukočenosti strukturnog člana; proizvod modulusa elastičnosti i momenta inercije podeljen sa dužinom člana. Drugim rečima, to je odnos stresa prema istegnuću u elastičnom materijalu kada je taj materijal savijen.

[0070] Prema drugom aspektu, obezbeđen je postupak za lečenje bola povezanog sa intervertebralnim diskom primenom terapeutski efikasne količine mlečne kiseline ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, u nucleus pulposus intervertebralnog diska pacijenta kod koga postoji potreba za tim. Efekti i karakteristike ovog drugog aspekta predmetnog pronalaska su analogni onima opisanim u prethodnom tekstu u vezi sa prvim aspektom predmetnog pronalaska.

[0071] Prema trećem aspektu, obezbeđena je upotreba mlečne kiseline, ili njene farmaceutski prihvatljive soli u proizvodnji leka za lečenje bola povezanog sa intervertebralnim diskom. Efekti i karakteristike ovog trećeg aspekta predmetnog pronalaska su analogni onima opisanim u prethodnom tekstu u vezi sa prethodnim aspektima predmetnog pronalaska.

[0072] Prema četvrtom aspektu, obezbeđena je mlečna kiselina ili njena farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu u lečenju bola povezanog sa intervertebralnim diskom. Efekti i karakteristike ovog četvrtog aspekta predmetnog pronalaska su analogni onima opisanim u prethodnom tekstu u vezi sa prethodnim aspektima predmetnog pronalaska.

[0073] Dodatne karakteristike i prednosti predmetnog pronalaska će postati očigledne prilikom studiranja priloženih patentnih zahteva i sledećeg opisa. Stručnjak iz date oblasti tehnike shvata da različite karakteristike predmetnog pronalaska mogu biti kombinovane tako da se stvore primeri izvođenja osim onih opisanih u sledećem tekstu, bez udaljavanja od obima predmetnog pronalaska.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0074] Ovi i drugi aspekti predmetnog pronalaska će sada biti opisani detaljnije, u vezi sa priloženim crtežima koji prikazuju primere izvođenja prema pronalasku.

Na sl.1, poprečni presek kičmenog stuba čoveka je šematski prikazan.

Na sl.2, dva susedna pršljena ljudskog kičmenog stuba su šematski prikazana u bočnom prikazu. Na sl.3, donji deo kičmenog stuba čoveka je šematski prikazan u bočnom prikazu.

Na sl.4, kičmeni segment je šaematski prikazan u posteriornom prikazu.

Na sl. 5, šematski je prikazano kako je merena anterio-posteriorna dužina poprečnog preseka intervertebralnog diska.

Na sl. 6, šematski je prikazano kako je izmerena bilateralna širina poprečnog preseka intervertebralnog diska.

Sl. 7 prikazuje tri intervertebralna diska u poprečnom preseku, i transformaciju nucleus pulposus u vezivno tkivo u disku na koja je primenjena kompozicija prema primeru izvođenja predmetnog pronalaska.

Sl. 8 prikazuje eksperimentalne rezultate iz studije proizvodnje kolagena u fibroblastima posle tretmana mlečnom kiselinom.

Sl. 9 prikazuje eksperimentalne rezultate iz studije proizvodnje kolagena u ćelijama nucleus pulposus posle tretmana mlečnom kiselinom.

[0075] Kao što je ilustrovano na slikama, veličine slojeva i regiona su preuveličane za ilustrativne svrhe i, na taj način, date su za ilustraciju opštih struktura primera izvođenja prema predmetnom pronalasku. Slični referentni brojevi označavaju slične elemente.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0076] Kako pršljen stari, njegovi intervertebralni diskovi se podvrgavaju transformaciji. Efekat transformacije je taj da nucleus pulposus počinje da dehidrira i koncentracija proteoglikana u matriksu se smanjuje, rezultujući u smanjenoj veličini intervertebralnog diska. Sledeći efekat je taj da annulus fibrosus postaje slabiji i ima povećani rizik od fisura. Efekti transformacije intervertebralnog diska mogu da izazovu bol povezan sa intervertebralnim diskom, npr. bol u vratu, bol u donjem delu leđa ili kokcigodiniju, u stanju pre nego što intervertebralni disk postane dovoljno čvrst i gust.

[0077] Kičmeni stub kičmenjaka sadrži pršljenove, koji okružuju i štite kičmenu moždinu. Kod ljudi, kičmeni stub je postavljen u dorzalnom aspektu trupa. Između dva susedna pršljena, nalazi se intermedijerni intervertebralni disk, tj. pršljenovi se smenjuju sa intervertebralnim diskovima formirajući kičmeni stub. Specifična struktura i dodatni delovi kičmenog stuba su poznati stručnjaku iz date oblasti tehnike.

[0078] Sl. 1 šematski prikazuje poprečni presek kičmenog stuba 100 čoveka. Pored tela 15 pršljena, nalazi se intervertebralni disk koji sadrži annulus fibrosus 10 i nucleus pulposus 11. Nucleus pulposus 11 ispunjava takozvani prostor diska intervertebralnog diska. Annulus fibrosus 10 okružuje nucleus pulposus 11 i definiše granicu nucleus pulposus kao i prostora diska.

[0079] Kičmena moždina 17 se nalazi u centru kičmenog stuba i pored intervertebralnog diska. Spinalni nervi 16, 16’, se pružaju od kičmene moždine 17 do suprotnih strana i blizu intervertebralnog diska.

[0080] Fasetni zglob 14, 14’, se nalazi između donjeg zglobnog nastavka 13, 13’ i gornjeg zglobnog nastavka 12, 12’. Na suprotnim stranama kičmene moždine 17, nalaze se dva fasetna zgloba 14, 14’, respektivno. Fasetni zglobovi 14, 14’, se nalaze približno u istom poprečnom preseku i ravni.

[0081] Sl.2 šematski prikazuje segment kičmenog stuba 200 koji sadrži dva susedna pršljena 20, 22. Prvi pršljen 22 i drugi pršljen 20 se nalaze na suprotnim stranama intervertebralnog diska 21. Prvi pršljen 22 se nalazi relativno bliže toraksa, i drugi pršljen 20 se nalazi relativno bliže sakruma. Kaudalna ploča 23 prvog pršljena 22 i kranijalna ploča 25 drugog pršljena 20 su prikazane na Sl. 2. Kranijalna ploča 25 i kaudalna ploča 23 su okrenute ka suprotnim stranama intervertebralnog diska 21.

[0082] Sl. 2 takođe šematski prikazuje kako se fasetni zglob 24 nalazi između donjeg zglobnog nastavka prvog pršljena 22 i gornjeg zglobnog nastavka drugog pršljena 20. Poprečni nastavak 26 se proteže lateralno iz kičmenog luka.

[0083] Sl. 3 šematski prikazuje donji deo kičmenog stuba 300. Kokcigealni pršljenovi 36 kičmenog stuba se nalaze na krajnjem delu donjeg dela kičmenog stuba 300. Sakrum 39 kičmenog stuba se nalazi pored kokcigealnog pršljena 36, bliže toraksu od kokcigealnog pršljena 36. Peti lumbalni pršljen, ovde označen kao L5, 30 nalazi se pored sakruma 39, bliže toraksu od sakruma 39. U smeru od sakruma 39 prema toraksu, nekoliko pršljenova su raspoređeni u redu počevši od L5, 30. Pored petog lumbalnog pršljena 30, tj. L5, sledeći pršljenovi se nalaze u sledećem redosledu: četvrti lumbalni pršljen 32, tj. L4, treći lumbalni pršljen, tj. L3, drugi lumbalni pršljen, tj. L2, i prvi lumbalni pršljen 38, tj. L1; prvi lumbalni pršljen se nalazi relativno najbliže toraksu. Između dva susedna pršljena, nalazi se intermedijerni disk 31. Intervertebralni diskovi (nisu prikazani) su takođe prisutni kod kokcigealnih pršljenova 36.

PRIMERI

[0084] Postupak za indukciju i procenu ubrzane transformacije nucleus pulposus u vezivno tkivo u intervertebralnom disku kod svinje primenom kompozicije za upotrebu u lečenju bola povezanog sa intervertebralnim diskom koja sadrži mlečnu kiselinu ili njenu farmaceutski prihvatljivu so, ovde u daljem tekstu će biti potpunije opisan.

[0085] U predstavljenom primeru, kompozicija za upotrebu u lečenju bola povezanog sa intervertebralnim diskom koja sadrži mlečnu kiselinu ili njenu farmaceutski prihvatljivu so, je primenjena u nucleus pulposus intervertebralnog diska koji se nalazi između trećeg lumbalnog pršljena L3 i četvrtog lumbalnog pršljena L4. Stručnjak iz date oblasti tehnike bi lako mogao da razume da se isti postupak može primeniti na bilo koji intervertebralni disk u kičmenom stubu.

[0086] Na taj način, koraci postupka su sledeći:

100. priprema kompozicije koja sadrži mlečnu kiselinu ili njenu farmaceutski prihvatljivu so; 101. anesteziranje svinje koja ima kičmeni stub koji sadrži intervertebralni disk koji sadrži nucleus pulposus u koji će se kompozicija primenjivati;

102. omogućavanje pristupa intervertebralnom disku preko lateralnog reza između najnižeg rebra i ilijačne kreste svinje;

103. sečenje intervertebralnog diska;

104. primenjivanje, ovde lokalnim injektiranjem, kompozicije u nucleus pulposus iglom za injekciju;

105. omogućavanje da se svinja slobodno kreće sedam dana posle oporavka od anestezije;

106. sakupljanje lumbalne kičme en bloc, pri čemu sakupljeni segment sadrži tela pršljenova i intervertebralni disk koji sadrži nucleus pulposus podvrgnut injekciji, ali bez posteriornih elemenata (kičmeni luk i fasetni zglobovi);

107. merenje udaljenosti između poprečnih nastavaka na nivoima diskova L 2-3, L 3-4, L4-5 bez primene bilo kakve spoljašnje sile;

108. primena spoljašnje sile na segment kičmenog stuba sve dok se ne postigne puni lateralni fleksioni mod za uzorak lumbalne kičme;

109. merenje udaljenosti između poprečnih nastavaka na nivoima diskova L 2-3, L 3-4, L4-5 pod punom lateralnom fleksijom;

110. izvođenje inakrsnog preseka diskova i merenje dužine (anterio-posteriorni smer) i širine (bilateralni smer) prostora diska.

Primer 1: Priprema kompozicije koja sadrži mlečnu kiselinu

[0087] Čist rastvor mlečne kiseline je kupljen iz Sigma Aldrich (broj proizvoda: 69775 Fluka; CAS broj: 50-21-5, Stockholm, Sweden). Kao što je prikazano u Tabeli 2, molekulska masa mlečne kiselineje 90.08 g/mol i gustina čistog rastvora iz Sigma Aldrich je bila 1.209 g/mL, respektivno.

[0088] Koncentracija mlečne kiseline u čistom rastvoru iz Sigma Aldrich je posledično izračunata da je 0.0134 mol/mL, što je jednako 13.4 mol/L.

[0089] Čisti rastvor mlečne kiseline je zatim razblažen 10 puta upotrebom destilovane vode na sobnoj temperaturi. Eksplicitnije, 1 mL čistog rastvora mlečne kiseline iz Sigma Aldrich je razblažen sa 9 mL destilovane vode. Rezultujuća koncentracija mlečne kiseline u pripremljenoj kompoziciji je posledično bila 1.34 mol/L.

Tabela 2. Količine mlečne kiseline u pripremljenoj kompoziciji.

Primer 2: Primena kompozicije koja sadrži mlečnu kiselinu na nucleus pulposus intervertebralnog diska u svinji pomoću lokalne injekcije

[0090] Dve svinje su anestezirane i postavljene na njihovu desnu stranu. Pristup L4-5 intervertebralnom disku je dobijen preko lateralnog reza između najnižeg rebra i ilijačne kreste na levoj strani svake svinje. Zatim, L3-4 intervertebralni disk je isečen skalpelom.

[0091] Kompozicija koja sadrži mlečnu kiselinu je injektirana pomoću šprica u nucleus pulposus L3-4 intervertebralnog diska. Kompozicija koja sadrži mlečnu kiselinu u ukupnoj koncentraciji od 1.34 mol/L je injektirana u količini od približno 0.2 mL u nucleus pulposus, kao što je prikazano u Tabeli 3. Kompozicija je injektirana u jednom koraku u jednoj prilici.

[0092] Izgleda da su obe svinje dobro tolerisale postupak i nije zabeležena štetna reakcija kao što je smanjena pokretljivost ili vokalizacija u toku perioda od sedam dana do sakupljanja. Prilikom sakupljanja, svinje su ubijene.

Tabela 3. Količina mlečne kiseline u kompoziciji primenjenoj na L3-4 interverebralni disk svinje.

Primer 3: Procena transformacije nucleus pulposus u vezivno tkivo u intervertebralnom disku na koji je primenjena kompozicija koja sadrži mlečnu kiselinu

[0093] Mesto injekcije je zabeleženo golim okom. Nije zabeležena štetna reakcija na mestu injekcije, kao što su krvarenja, inflamacija ili nekroza, ni kod jedne od svinja. Segment kičmenog stuba koji se pruža od lumbalnog pršljena L2 do sakralnog pršljena S1 je uklonjen. Fasetni zglobovi su uklonjeni, na taj način omogućavajući potpunu fleksibilnost diskova bez ograničenja od drugih struktura.

3a – Fleksiona ukočenost intervertebralnog diska pre i posle primene kompozicije, respektivno [0094] Na sl. 4 prikazan je segment kičmenog stuba koji sadrži intervertebralne diskove 21, naime intervertebralne diskove L2-3, L3-4 i L4-5.

[0095] U toku procene fleksione ukočenosti, udaljenost između svakog od odgovarajućih susednih poprečnih nastavaka 26 kičmenog stuba, na taj način, segment kičmenog stuba koji se pruža od lumbalnog pršljena L2 do sakralnog pršljena S1, je meren pomoću nonijusa kada se segment kičmenog stuba nalazi u modu bez bilo kakvog primenjenog spoljašnjeg tereta.

[0096] Zatim, kičmeni stub, na taj način, segment kičmenog stuba koji se pruža od lumbalnog pršljena L2 do sakralnog pršljena S1, ručno je pritisnut u puni lateralni fleksioni mod primenom spoljašnje sile na svaki od dva krajnja dela kičmenog stuba sve dok se ne dostigne kritična granica, tj. sve dok se ne dostigne puni fleksioni mod. Kretanje poprečnih nastavaka usled primenjene sile je šematski prikazano na sl.4 strelicama sa tačkastim linijama.

[0097] Kritična granica je definisana kao tačka neposredno pre tačke lomljenja segmenta kičmenog stuba. Na taj način, spoljašnja sila je primenjena tako da je dobijena maksimalna lateralna fleksija bez lomljenja bilo kog dela kičmenog segmenta.

[0098] Pretpostavlja se da je sila bila slična za segment kičmenog stuba u svakoj od obe svinje. U položaju pune lateralne fleksije, udaljenost između susednih poprečnih nastavaka za diskove L 2-3, L 3-4, L4-5 je merena pomoću nonijusa.

[0099] Udaljenost između susednih poprečnih nastavaka za određeni disk u modu bez spoljašnjeg tereta je oduzeta od udaljenosti između istih poprečnih nastavaka u modu sa spoljašnjim teretom primenjenim da bi se postigao potpuni lateralni fleksioni mod, na taj način obezbeđujući vrednost ravnotežne udaljenosti dobijene pomoću pune lateralne fleksije. Ravnotežna vrednost za injektirane intervertebralne diskove reflektuje fleksionu ukočenost intervertebralnog diska koji se leči kompozicijom za upotrebu u lečenju bola povezanog sa intervertebralnim diskom u poređenju sa ne-injektiranim intervertebralnim diskom.

[0100] Fleksiona ukočenost je indirektna mera transformacije nucleus pulposus u vezivno tkivo, jer što je manja ravnotežna vrednost, to je ukočeniji intervertebralni disk. Što je ukočeniji intervertebralni disk, to je veći sadržaj čvrstog i gustog vezivnog tkiva. Stoga, fleksiona ukočenost ukazuje na to da li je nucleus pulposus prošao kroz transformaciju u vezivno tkivo, tj. ubrzano starenje, ili ne.

[0101] Merenja pokazuju da su injektirani diskovi (L 3-4) imali mnogo manju ravnotežnu vrednost od neinjektiranih susednih diskova (L 2-3; L 4-5), što ukazuje na veću fleksionu ukočenost injektiranog diska. Na taj način, ubrzana transformacija nucleus pulposus u vezivno tkivo se odigrala unutar prostora diska injektiranog diska u poređenju sa unutrašnjošću prostora diska neinjektiranih diskova (videti Tabelu 4).

Tabela 4. Razlika u udaljenosti između poprečnih nastavaka pre i posle pune lateralne fleksije (mm±SD).

3b – Dimenzija prostora diska pre i posle primene kompozicije, respektivno

[0102] Intervertebralni diskovi (L2-3, L3-4, L4-5) su presečeni po poprečnom preseku i dužina prostora diska (anterioposteriorni smer) i širina (bilateralni smer) prostora diska su mereni pomoću nonijusa.

[0103] Na sl. 5 i 6, intervertebralni disk je šematski prikazan u poprečnom preseku. Intervertebralni disk sadrži annulus fibrosus 10, i prostor diska definisan sa annulus fibrosus i koji sadrži nucleus pulposus 11.

[0104] Na sl. 5, strelica šematski prikazuje kako je merena anterio-posteriorna dužina prostora diska intervertebralnog diska. Na sl. 6, strelica šematski prikazuje kako je merena bilateralna širina prostora diska intervertebralnog diska.

[0105] Kao što se vidi iz merenja, prosečna anterio-posteriorna dužina prostora diska je bila značajno manja kod injektiranih diskova (L 3-4) nego u susednim neinjektiranim diskovima (L2-3, L4-5) (videti Tabelu 5).

Tabela 5. Prosečna antero-posteriorna dužina prostora diska (mm±SD).

[0106] Kao što se vidi iz merenja, prosečna bilateralna širina prostora diska je bila značajno niža u injektiranim diskovima (L 3-4) nego u susednim neinjektiranim diskovima (L2-3, L4-5) (videti Tabelu 6).

Tabela 6. Prosečna bilateralna širina prostora diska (mm±SD).

[0107] Sl. 7 prikazuje intervertebralne diskove L2-3, L-3-4 i L4-5, respektivno, iz jedne od svinja u eksperimentima iz prethodnog teksta. Širina i dubina prostora diska su označene boldiranim pravim linijama koje odgovaraju šematskim crtežima na sl.5-6.

[0108] Na sl. 7, dalje je prikazano kako je prostor diska injektiranog L3-4 diska imao mnogo manju površinu poprečnog preseka od neinjektiranih L2-3 i L4-5 diskova, respektivno. Na taj način, može biti potvrđeno golim okom da je tu postojalo novo-formirano vezivno tkivo u prethodom prostoru diska koji sadrži nucleus pulposus u injektiranim intervertebralnim diskovima.

Zaključak eksperimenata

[0109] Očigledno je da je prostor diska u dva neinjektirana diska (L2-3) i (L4-5) mnogo dublji i širi od diska (L3-4) na koji je primenjivana kompozicija koja sadrži mlečnu kiselinu. Izgleda da je prethodni prostor diska zamenjen novo-formiranim vezivnim tkivom (naglašen bledim, dodatnim linijama u uređenju sličnom luku, na slici 7), tako da je annular fibrosus (formiran pomoću prstena vezivnog tkiva koji uglavnom sadrži kolagen) proširen na račun nucleus pulposus čija veličina se smanjila.

[0110] Na taj način, postiguta je fleksiona ukočenost injektiranih intervertebralnih diskova, i ukočenost može da suprimira bol koji oseća pacijent koji ima bol povezan sa intervertebralnim diskom. Prednost ovog načina lečenja bola povezanog sa intervertebralnim diskom, je ta da je lečenje manje invazivno od trenutnih metoda lečenja, kao što je u poređenju sa trenutnim metodom lečenja artrodeze.

[0111] U primerima opisanim u prethodnom tekstu, intervertebralni disk se nalazi u lumbalnoj kičmi. Međutim, očekuje se da se sličan proces zabeleži u intervertebralnom disku raspoređenom u cervikalnom delu kičme ili u kokcigealnom delu kićme.

[0112] Da bi se zapazili efekti mlečne kiseline na ćelijskom nivou, izvršene su studije na fibroblastima, uobičajeno prisutne u vezivnom tkivu kao što su ćelije annulus fibrosus i nucleus pulposus, uobičajeno prisutne u nucleus pulposus, respektivno. Kao mera toga kako su se ćelije transformisale kao odgovor na tretman mlečnom kiselinom, ispitivana je proizvodnja kolagena u ćelijama.

Ispitivanje proizvodnje kolagena u fibroblastima posle tretmana mlečnom kiselinom

Kultura dermalnih fibroblasta odraslog čoveka (HDFa)

[0113] Humani dermalni fibroblasti izolovani iz kože odraslog čoveka, takozvani HDFa, (Life Technologies Frederick, USA) su kultivisani i ispitivani. Zrele humane ćelije intervertebralnog diska su opisane kao fibrocitne (ili slične fibroblastima) u spoljašnjem annulus fibrosus. Fibroblasti su najčešći tip ćelija koje se nalaze u vezivnom tkivu. Fibroblasti mogu prirodno da izlučuju proteine kolagena koji se koriste za održavanje strukturnog okvira za mnoga tkiva i takođe imaju važnu ulogu u zarastanju rana.

[0114] Prvo, kriprezervirani fibroblasti su odmrznuti u 37°C vodenom kupatilu. Odmrznuti fibroblasti su zatim dispergovani upotrebom pipete od 1 mililitra da bi se suspenzija odmrznutih fibroblasta pomerila na gore i na dole u bočicu. Dispergovani fibroblasti su zatim razblaženi u rastvoru tripan plave (kat. br. 15250-061, serija br. 1311086, Gibco Life Technologies), i koncentracija vijabilnih fibroblasta je određena pomoću hemacitometra.

[0115] Dispergovani fibroblasti su zatim ponovo razblaženi, ovaj put u dopunjenom medijumu 106 do koncentracije od 2.5 x 104 vijabilnih fibroblasta po mililitru. 5 ml suspenzije fibroblasta je zatim dodato u T25 posudu ćeljske kulture koja ima zapreminu od 25 cm<3>da bi se postigla početna gustina od 5.0 x 10<3>vijabilnih fibroblasta po mililitru u T25 posudi dodatnim razblaživanjem sa dopunjenim medijumom 106.

[0116] Dopunjeni medijum 106 se sastojao od medijuma 106 (kat. Br. M-106-500, Life Technologies, Paisley, Great Britain) dopunjenog sa Low Serum Growth Supplement, LSGS, (Life Technologies, Paisley, Great Britain) u koncentraciji fetusnog telećeg seruma od 2 % po zapremini.

[0117] T25 posuda koja sadrži pripremljene fibroblaste je uskovitlana kako bi se fibroblasti raspodelili u medijumu. Ćelijska kultura je zatim inkubirana u 37°C, 5 % CO2/95 % vazduhu u humidifikovanom inkubatoru za ćelijsku kulturu u trajanju od 72 časa.

[0118] Na konfluensi, fibroblasti su razblaženi u dopunjenom medijumu da bi se izbegle promene u ćelijskom fenotipu.

Priprema mlečne kiseline

[0119] Mlečna kiselina (Fluka 69775, Sigma-Aldrich, Stockholm, Sweden) je izmerena u sterilnu 10 mL epruvetu ili 50 mL epruvetu. Milli-Q voda (> 18.2 Ω) je dodata da bi se pripremio osnovni rastvor mlečne kiseline. Osnovni rastvor je mešan i čuvan pre pripreme finalnih rastvora mlečne kiseline sa različitim koncentracijama. Period čuvanja je bio manji od 1 časa na temperaturi sredine, ili, alternativno, manji od 24 časa na temperaturi od 4°C.

Efekat mlečne kiseline na proizvodnju kolagena u dermalnim fibroblastima odraslog čoveka (HDFa)

[0120] Fibroblasti kultivisani kao što je opisano u prethodnom tekstu su odvojeni od posude ćelisjke kulture i postavljeni na 6-komorne ploče na početnoj gustini od 6.0 x 10<4>vijabilnih ćelija po komorici. Fibroblasti su gajeni u dopunjenom medijumu 106. Fibroblasti u nekim od komora su takođe tretirani mlečnom kiselinom (Fluka 69775, Sigma-Aldrich, Stockholm, Sweden) u različitim koncentracijama: 0, 0.5, 2, 5, 10, 20 i 50 mg/mL, respektivno. Fibroblasti su inkubirani u 37°C, 5 % CO2/95 % vazduhu humidifikovanog inkubatora za ćelijsku kulturu u trajanju od 48 časova.

[0121] Da bi se ispitao efekat mlečne kiseline na proizvodnju kolagena u fibroblastima, primenjen je spektrofotometrijski postupak označen kao Soluble Collagen Assay (QuickZyme Biiosciences, Leiden, Netherlands) na bazi vezivanja Sirius Red boje za kolagen. Ispitivanje je izvršeno dva puta.

[0122] Ćelijski medijum je sakupljen iz svake komorice i 140 µL je pipetirano u 96-komornu ploču. Uzorci su uzimani u duplikatima. Uzorci medijuma su mešani temeljno sa 60 µL rastvora Sirius Red boje pipetiranjem na gore i na dole najmanje pet puta. 96-komorna ploča je centrifugirana na 3000 x g u trajanju od 1 časa. Svi ovi koraci su izvedeni na temperaturi ispod 25°C, na primer centrifugiranje je izvedeno na 4°C.

[0123] Centrifugirani uzorak je ispran i supernatant je uklonjen. Ćelijski talog je resuspendovan u 150 µL detekcionog rastvora temeljnim mešanjem pipetiranjem na gore i na dole najmanje deset puta. Zatim, 100 µL svakog uzorka je prebačeno u novu 96-komornu ploču i sadržaj kolagena je meren spektrofotometrijski na optičkoj gustini od 540 nm.

[0124] Iz dve studije od kojih je svaka izvedena u duplikatima, jasno je pokazano da dodavanje mlečne kiseline u fibroblaste povećava prosečnu proizvodnju kolagena u fibroblastima, kao što je pokazano u Tabeli 7 i na slici 8. Prosečna proizvodnja je merena posle 2 dana tretmana mlečnom kiselinom.

[0125] Na slici 8, rezultati iz prve grupe ispitivanja su predstavljeni rombovima, dok su rezultati iz druge grupe ispitivanja predstavljeni kvadratima. Prosečna linija trenda kretanja dva perioda je uključena radi šematskog prikaza trenda u proizvodnji kolagena za svaku grupu. Linija trenda za prvu grupu je predstavljena tačkastom linijom, i linija trenda za drugu grupu je predstavljena isprekidanom linijom, respektivno. X-osa prikazuje koncentraciju mlečne kiseline dodatu u komorice koja sadrži fibroblaste, i y-osa prikazuje prosečnu količinu proizvedenog kolagena u ovim komoricama posle merenja posle dva dana od dodavanja mlečne kiseline u komorice.

[0126] Naročito, povećanje u proizvodnji kolagena je bilo značajno kada je mlečna kiselina dodata u koncentraciju od najmanje 2 mg/mL, kao što je najmanje 5 mg/mL, u komorici. Pored toga, pokazano je da se proizvodnja kolagena povećala sa rastućom koncentracijom mlečne kiseline do najmanje 20 mg/mL ili najmanje 50 mg/mL kao što je takođe naznačeno na slici 8.

Tabela 7. Efekat mlečne kiseline na proizvodnju kolagena u fibroblastima.

[0127] Kako je prosečna proizvodnja kolagena u korelaciji sa brojem ćelija koje su sposobne da proizvode kolagen, neznatna razlika u prosečnoj proizvodnji kolagena između prve grupe i druge grupe ispitivanja može biti posledica prirodne varijanse u broju ćelija u ispitivanim komoricama.

Ispitivanje proizvodnje kolagena u ćelijama nucleus pulposus posle tretmana mlečnom kiselinom Kultura humanih ćelija nucleus pulposus

[0128] Ćelije nucleus pulposus (NP) izolovane iz ljudi (4800, ScienCell, USA) su kultivisane i ispitivane. NP ćelije su ćelije intervertebralnog diska u nucleus pulposus.

[0129] Prvo, krioprezervirane NP ćelije su odmrznute u 37°C vodenom kupatilu. Odmrznute NP ćelije su zatim suspendovane u dopunjenom medijumu ćelija nucleus pulposus i zatim zasejane u T75 posudi ćelijske kulture koja ima zapreminu od 75 cm<3>i obložena na njenoj unutrašnjosti sa poli-L-lizinom (0413, ScienCell, USA). Početna gustina zasejavanja bila je 5.0 x 10<3>vijabilnih NP ćelija po mililitru.

[0130] Dopunjeni medijum ćelija nucleus pulposus se sastojao od medijuma ćelija nucleus pulposus (4801, Scien-Cell, USA) dopunjenog sa 2 % po zapremini fetusnog telećeg seruma (0010, ScienCell, USA), 1X suplementom za rast ćelija nucleus pulposus (4852, ScienCell, USA) i 1X rastvorom penicilina/streptomicina (0503, ScienCell, USA).

[0131] T75 posuda koja sadrži pripremljene NP ćelije je uskovitlana tako da se raspodele NP ćelije u medijum. Ćelijska kultura je zatim inkubirana u 37°C, 5 % CO2/95 % vazduhu humidifikovananog inkubatora ćelijske kulture preko noći.

[0132] Na konfluenci, fibroblasti su razblaženi u dopunjenom medijumu da bi se izbegle promene u ćelijskom fenotipu, ćelijskoj proliferaciji i/ili ćelijskoj diferencijaciji.

Priprema mlečne kiseline

[0133] Mlečna kiselina (PURAC PF 90, serija br. 1406001940, Corbion Purac, the Netherlands) je izmerena u sterilnu 10 mL epruvetu ili 50 mL epruvetu. Milli-Q voda (> 18.2 Ω) je dodata za pripremu osnovnog rastvora mlečne kiseline. Osnovni rastvor je mešan i čuvan pre pripreme finalnih rastvora mlečne kiseline sa različitim koncentracijama. Period čuvanja je bio manji od 1 časa na temperaturi sredine, ili, alternativno, manji od 24 časa na temperaturi od 4°C.

Efekat mlečne kiseline na proizvodnju kolagena u humanim ćelijama nucleus pulposus [0134] NP ćelije kultivisane kao što je opisano u prethodnom tekstu su odvojene od posude za ćelijske kulture i postavljene na 6-komorne ploče na početnoj gustini od 4.5 x 10<4>vijabilnih ćelija po komorici. NP ćelije su gajene u dopunjenom medijumu ćelija nucleus pulposus. NP ćelije u nekim komoricama su takođe tretirane mlečnom kiselinom (PURAC PF 90, serija br.

1406001940, Corbion Purac, the Netherlands) u različitim koncentracijama: 0, 0.5, 5, 10, 20 i 50 mg/mL, respektivno. NP ćelije su inkubirane u 37°C, 5 % CO2/95 % vazduhu humidifikovanog inkubatora ćelijske kulture u trajanju od 48 časova.

[0135] Da bi se ispitao efekat mlečne kiseline na proizvodnju kolagena u NP ćelijama, primenjen je spektrofotometrijski postupak označen kao Soluble Collagen Assay (QuickZyme Biiosciences, Leiden, the Netherlands) na bazi vezivanja Sirius Red boje za kolagen.

[0136] Ćelijski medijum je sakupljen iz svake komorice i 140 mL je pipetirano u 96-komornu ploču. Uzorci su uzeti i tri kopije. Uzorci medijuma su temeljno mešani sa 60 mL rastvora Sirius Red boje pipetiranjem na gore i na dole najmanje pet puta. 96-komorna ploča je centrifugirana na 1500 x g u trajanju od 2 časa. Svi ovi koraci su izvedeni na temperaturi ispod 25°C, na primer centrifugiranje je izvedeno na 4°C.

[0137] Centrifugirani uzorak je ispran i supernatant je uklonjen. Ćelijski talog je resuspendovan u 150 mL detekcionog rastvora temeljnim mešanjem pipetiranjem na gore i na dole najmanje deset puta. Zatim, 100 mL svakog uzorka je prebačeno u novu 96-komornu ploču i sadržaj kolagena je meren spektrofotometrijski na optičkoj gustini od 540 nm.

[0138] Da bi odgovarale aparatu kojim se vrši merenje, ćelije su razblažene u rastvoru fosfatnog pufera (PBS) u odnosu od 1:1.

[0139] Iz studije izvršenoj u tri kopije, jasno je pokazano da dodavanje mlečne kiseline u NP ćelije povećava prosečnu proizvodnju kolagena u NP ćelijama, kao što je nazančeno u Tabeli 8 i na slici 9. Prosečna proizvodnja je merena posle 2 dana tretmana mlečnom kiselinom.

[0140] Na slici 9, rezultati iz studije su predstavljeni kao rombovi. Prosečna linija trenda kreanja od dva perioda uključena da bi se šematski prikazao trend u proizvodnji kolagena. X-osa pokazuje koncentraciju mlečne kiseline koja je dodata u komorice koje sadrže NP ćelije, i y-osa prikazuje prosečnu količinu proizvedenog kolagena u ovim komoricama posle merenja posle dva dana od dodavanja mlečne kiseline u komorice.

[0141] Naročito, povećanje u proizvodnji kolagena je bilo značajno kada je mlečna kiselina dodata u koncentraciji od najmanje 5 mg/mL u komoricu. Pored toga, pokazano je da se proizvodnja kolagena povećava sa povećanjem koncentracije mlečne kiseline do oko 10-20 mg/mL, gde je plato dostignut kao što je takođe naznačeno na slici 9. Smanjenje u proizvodnji kolagena na 50 mg/mL tumači se tako da tretman mlečnom kiselinom u takvoj visokoj koncentraciji može imati citotoksične efekte koji izazivaju ćelijsku smrt.

Tabela 8. Efekat na proizvodnju kolagena u NP ćelijama mlečne kiseline.

Zaključak

[0142] Pronalazači veruju da će upotreba prema primerima izvođenja prema predmetnom pronalasku lečiti bol povezan sa intervertebralnim diskom takođe kod ljudi.

[0143] Očekivana transformacija u vezivno tkivo intervertebralnog diska podvrgnutog injekciji supstance, kao što je mlečna kiselina ili njena farmaceutski prihvatljiva so, može biti zabeležena in vivo. Tipično, postupak će biti izveden pod anestezijom ili lakom sedacijom i upotrebom radiološkog vođenja. Na taj način, postupak lečenja će biti sličan radiološkoj proceni intervertebralnog diska, takozvanoj diskografiji, kada je kontrastni medijum injektiran u intervertebralni disk pod radiološkim vođenjem.

[0144] Ostale supstance sposobne da indukuju ubrzanu degeneraciju intervertebralnog diska takođe se mogu smatrati zamenama i/ili alternativama mlečnoj kiselini ili njenoj farmaceutski prihvatljivoj soli.

Claims (13)

Patentni zahtevi

1. Kompozicija za upotrebu u lečnju bola povezanog sa intervertebralnim diskom, naznačena time što navedena kompozicija sadrži mlečnu kiselinu ili njenu farmaceutski prihvatljivu so, pri čemu se navedena kompozicija primenjuje u prostor diska koji sadrži nucleus pulposus intervertebralnog diska.

2. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što se kompozicija primenjuje u količini koja je efikasna za povećanje koncentracije mlečne kiseline ili koncentracije jona laktata iz farmaceutski prihvatljive soli, u navedenom prostoru diska do iznad 12 mmol/L.

3. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 2, naznačena time što je koncentracija mlečne kiseline ili koncentracija jona laktata farmaceutski prihvatljive soli, u kompoziciji najmanje 12 mmol/L, na primer unutar opsega od 12 do 12000 mmol/L, kao što je od 100 do 10000 mmol/L, kao što je od 500 do 5000 mmol/L, kao što je od 800 do 2000 mmol/L.

4. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, naznačena time što, farmaceutski prihvatljiva so je laktat bilo kog od elemenata izabranih iz grupe koja se sastoji od: alkalnih metala i zemnoalkalnih metala.

5. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačena time što je farmaceutski prihvatljiva so izabrana iz grupe koja se sastoji od: amonijum laktata, holin laktata, litijum laktata, natrijum laktata, kalijum laktata, berilijum laktata, magnezijum laktata i kalcijum laktata.

6. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, naznačena time što se navedena kompozicija primenjuje na prostor diska intervertebralnog diska koji doprinosi bolu povezanom sa intervertebralnim diskom.

7. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, naznačena time što se navedena mlečna kiselina ili njena farmaceutski prihvatljiva so primenjuje pomoću lokalne injekcije u prostor diska koji sadrži nucleus pulposus.

8. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, naznačena time što se mlečna kiselina primenjuje u jednoj dozi unutar opsega od 2 mg do 200 mg.

9. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, naznačena time što se mlečna kiselina primenjuje u jednoj dozi unutar opsega od 5 mg do 200 mg, kao što je od 10 do 100 mg, kao što je od 10 do 50 mg, kao što je od 15 do 30 mg.

10. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 8 ili 9, naznačena time što se navedena mlečna kiselina ili njena farmaceutski prihvatljiva so primenjuje u jednoj prilici u navedenoj jednoj dozi.

11. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10, naznačena time što je navedena kompozicija u obliku vodenog rastvora koji sadrži navedenu mlečnu kiselinu ili njenu farmaceutski prihvatljivu so.

12. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 11, naznačena time što je navedeni bol povezan sa intervertebralnim diskom izabran od bola u vratu, hroničnog bola u vratu, bola u donjem delu leđa i hroničnog bola u donjem delu leđa.

13. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 11, naznačena time što, navedeni bol povezan sa intervertebralnim diskom je kokcigodinija.