RS59287B1 - Postupci za otkrivanje bolesti bubrega - Google Patents

Postupci za otkrivanje bolesti bubrega

Info

Publication number
RS59287B1
RS59287B1 RSP20191171A RS59287B1 RS 59287 B1 RS59287 B1 RS 59287B1 RS P20191171 A RSP20191171 A RS P20191171A RS 59287 B1 RS59287 B1 RS 59287B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
sdma
creatinine
concentration
antibody
gfr
Prior art date
Application number
Other languages
English (en)
Inventor
Mahalakshmi Yerramilli
Murthy V S N Yerramilli
Original Assignee
Idexx Lab Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=52628954&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS59287(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Idexx Lab Inc filed Critical Idexx Lab Inc
Publication of RS59287B1 publication Critical patent/RS59287B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6806—Determination of free amino acids
    • G01N33/6812—Assays for specific amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/70—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving creatine or creatinine
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H10/00—ICT specially adapted for the handling or processing of patient-related medical or healthcare data
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H50/00—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics
    • G16H50/30—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics for calculating health indices; for individual health risk assessment
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/34—Genitourinary disorders
    • G01N2800/347—Renal failures; Glomerular diseases; Tubulointerstitial diseases, e.g. nephritic syndrome, glomerulonephritis; Renovascular diseases, e.g. renal artery occlusion, nephropathy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Primary Health Care (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Data Mining & Analysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

Opis
Oblast
[0001] Ovaj opis se generalno odnosi na određivanje bubrežne funkcije. Određenije, ovaj opis se odnosi na postupke za procenu brzine glomerularne filtracije i dijagnostikovanja, prognoziranja i određivanja progresije bolesti bubrega.
Opis stanja tehnike
[0002] Od velikog je značaja da postoji mogućnost brzog i preciznog merenja bubrežne funkcije. Na primer, doziranje lekova mora se prilagoditi pacijentu sa bubrežnom insuficijencijom. Na taj način, izvođenje preciznog određivanja bubrežne funkcije preduslov je u kliničkoj medicini. Međutim, dijagnostikovanje bubrežne insuficijencije otežano je zbog manje pouzdanih markera brzine glomerularne filtracije (GFR) i/ili dostupnih dijagnostičkih testova. Široko primenjivano merenje GFR predstavlja klirens inulina, ali ovaj test je robustan i skup, što suštinski smanjuje njegovu primenu u kliničkoj praksi. To se takođe odnosi i na test klirensa radioizotopa. Prema tome, u kliničkoj praksi, kreatinin u serumu obično se koristi za određivanje bubrežne funkcije. Međutim, upotrebe kreatinina u serumu mogu da budu neprecizne, budući da podaci mogu biti podvrgnuti promenljivošću relativno visokog stepena.
[0003] M.B. Nabity et al., 9 May 2013, XP055350785, opisuje korelaciju između SDMA i brzine glomerularne filtracije (GFR) kod pasa sa ili bez hronične progresivne bolesti bubrega.
[0004] Macallister et al., Nephrol Dial Transplant, 1 Jan 1996, 2449-2452, opisuje da je značajno povećanje odnosa SDMA/kreatinin bilo očigledno u uzorcima plazme pacijenata pre i nakon 4 sata haemodjalize. Nije bilo korelacije sa glomerularnom filtracijom. Takođe, nije bilo korelacije proizvoda nivoa SDMA i kreatinina.
[0005] Kielstein et al., Nephrology Dialyses Transplantation, vol.26, no.1, 9 July 2010, p.324-328, opisuje više ispitivanja koja uključuju korelaciju seruma SDMA i seruma kreatinin sa procenjenom brzinom glomerularne filtracije (GFR). Nivoi SDMA i kreatinina nisu bili u korelaciji.
[0006] M.B. Nabity et al., J Vet Intern Med, vol.29, no.4, 16 June 2015, opisuje da nivoi krvi SDMA predstavljaju rani marker za GFR promene nakon donacije bubrega povezanog sa spašavanjem života i na taj način omogućava otkrivanje akutne povrede bubrega. Takođe, mere se i nivoi kreatinina u serumu (FIG.3). Ne postoji korelacija proizvoda između nivoa SDMA i kreatinina.
[0007] Shodno tome, pronalazači su u ovoj oblasti identifikovali potrebu za postupcima za procenu bubrežne funkcije sa povećanom preciznošću.
KRATAK PREGLED
[0008] Ovaj pronalazak se odnosi na postupak za procenu brzine glomerularne filtracije (GFR) kod životinjskog subjekta, kako je definisano u priloženim patentnim zahtevima. Postupak uključuje merenje koncentracije slobodnog SDMA u uzorku krvi tog subjekta, merenje koncentracije kreatinina u uzorku krvi tog subjekta; i poređenje vrednosti dobijene iz jednačine koja obuhvata proizvod koncentracije kreatinina i koncentracije slobodnog SDMA sa jednom ili više standardnih vrednosti koje su u korelaciji sa brzinom glomerularne filtracije kod životinje.
[0009] U raznim primerima izvođenja ovde opisanog postupka, ta jednačina obuhvata inverznu vrednost proizvoda koncentracije kreatinina i koncentracije slobodnog SDMA. Takođe, koncentracija kreatinina i/ili koncentracija su slobodan SDMA može biti procenjena u izračunavanju. Faza poređenja može se izvesti upotrebom mikroprocesora. Postupak takođe uključuje određivanje bubrežne funkcije, bolesti bubrega ili disfunkcije bubrega poređenjem GFR kod subjekta sa GFR kod jednog ili više zdravih subjekata.
[0010] U još jednom referentnom aspektu, ovaj opis odnosi se na postupak za dijagnostikovanje bolesti bubrega ili disfunkcije bubrega kod životinjskog subjekta. Postupak uključuje merenje koncentracije slobodnog SDMA u serumu tog subjekta; merenje koncentracije kreatinina u serumu tog subjekta; i poređenje proizvoda prve procenjene vrednosti bazirane na koncentraciji kreatinina i druge procenjene vrednosti bazirane na koncentraciji slobodnog SDMA sa jednoj ili više standardnih vrednosti koje su u korelaciji sa bolešću bubrega ili disfunkcijom bubrega.
[0011] Kod određenih primera izvođenja, proizvod prve procenjene vrednosti bazirane na koncentraciji kreatinina i druge procenjene vrednost bazirane na koncentraciji slobodnog SDMA predstavljen je formulom PROD = (CRE)<P>×(SDMA)<Q>u kojoj PROD predstavlja proizvod, CRE predstavlja koncentraciju kreatinina, SDMA predstavlja koncentraciju SDMA, P obezbeđuje procenu koja se dodeljuje CRE u formuli, i Q obezbeđuje procenu koja se dodeljuje SDMA u formuli. Jedna ili više standardnih vrednosti mogu biti u korelaciji sa inverznom vrednošću proizvoda.
[0012] Dalji referentni aspekt ovog opisa odnosi se na postupak za izračunavanje vrednosti povezane sa dijagnozama bolesti bubrega ili disfunkcije bubrega kod životinjskog subjekta. Postupak uključuje izvršavanje instrukcija čitljivih od strane mašine za izračunavanje proizvoda prve procenjene vrednosti bazirane na koncentraciji kreatinina u uzorku krvi tog subjekta i druge procenjene vrednost bazirane na koncentraciji slobodnog SDMA u uzorku krvi tog subjekta.
[0013] U još jednom referentnom aspektu, ovaj opis odnosi se na postupak određivanja da li pojedinac ima bolesti bubrega. Postupak uključuje merenje koncentracija SDMA [SDMA] i kreatinina [CRE] u uzorku seruma tog pojedinca, izračunavanje odnosa [SDMA] / SDMACUT, izračunavanje odnosa [CRE] / CRECUT, izračunavanje vrednosti kombinacije: C = [SDMA] / SDMACUT+ [CRE] / CRECUT, i određivanja da taj pojedinac ima bolesti bubrega ako je C veće od CCUT, u kojem, SDMACUTpredstavlja isečak vrednosti za SDMA, CRECUTpredstavlja isečak vrednosti za kreatinin, i CCUTpredstavlja isečak vrednosti za vrednost kombinacije.
[0014] Jedan postupak u skladu sa ovim opisom, uključuje određivanje da li pojedinac ima bolest bubrega. Postupak uključuje merenje koncentracija SDMA [SDMA] i kreatinina [CRE] u uzorku seruma tog pojedinca, izračunavanje odnosa [SDMA] / SDMACUT, izračunavanje odnosa [CRE] / CRECUT, izračunavanje vrednosti kombinacije: C = [SDMA] / SDMACUT+ [CRE] / CRECUT, i određivanje da taj pojedinac ima bolest bubrega ako je C veće od CCUT, u kojem SDMACUTpredstavlja isečak vrednosti za SDMA, CRECUTpredstavlja isečak vrednosti za CRE i CCUTpredstavlja isečak vrednosti za vrednost kombinacije.
[0015] Dalje, ovaj opis u referentnom aspektu odnosi se na postupak za predviđanje rane smrti kod životinjskog subjekta, pri čemu taj postupak uključuje merenje koncentracije slobodnog SDMA u serumu tog subjekta, merenje koncentracije kreatinina u serumu tog subjekta, izračunavanje odnosa [SDMA]/[CRE], i određivanje da će kod tog pojedinca doći do rane smrti ako je odnos iznad vrednosti isečka.
[0016] U jednom primeru izvođenja, ovaj opis u referentnom aspektu odnosi se na postupak za određivanje smrtnosti povezane sa bolešću bubrega. Postupak uključuje merenje slobodnog SDMA u uzorku krvi pacijenta, na primer psa ili mačke, i određivanje da pacijent u povećanom riziku od smrti povezanom sa bolešću bubrega kada taj pacijent ima koncentraciju SDMA u krvi veću od graničnog nivoa. Postupak može dalje da obuhvata fazu merenja kreatinina u uzorku krvi, izračunavanje odnosa [SDMA]/[CRE], u kojem je pacijent u povećanom riziku od smrti povezanom sa bolešću bubrega kada taj pacijent ima odnos [SDMA]/[CRE] u krvi veći od graničnog odnosa.
[0017] U drugom aspektu, ovaj opis je u referentnom aspektu takođe usmeren na uređaj za određivanje bubrežne funkcije kod životinjskog subjekta. Taj uređaj uključuje prvu čvrstu fazu za koju je vezan SDMA analog, ili antitelo specifično za SDMA koje ne poseduje ili suštinski ne poseduje unakrsnu reaktivnost sa jednim ili više jedinjenja odabranih od asimetričnog dimetilarginina (ADMA), L-arginina, i N-metilarginina; i drugu čvrstu fazu za koju je vezan reagens za otkrivanje kreatinina ili antitelo specifično za kreatinin.
[0018] U daljem aspektu, ovaj opis u referentnom aspektu odnosi se na komplet za određivanje bubrežne funkcije kod životinjskog subjekta. Taj komplet uključuje jedan ili više reagenasa za otkrivanje kreatinina i jedan ili više reagenasa za otkrivanje SDMA, i opciono uključuje set jedne ili više standardnih vrednosti povezanih sa bubrežnim funkcijama na osnovu proizvoda koncentracije kreatinina i koncentracije SDMA u jednom ili više uzoraka krvi životinja.
[0019] Dalje, ovaj opis u referentnom aspektu se odnosi na računarski uređaj sa memorijom koja obuhvata softverske instrukcije, koji kada se izvede, izračunava inverznu vrednost proizvoda koncentracije kreatinina i koncentracije slobodnog SDMA. Memorija takođe može da uključi softverske instrukcije za poređenje rezultata izračunavanja sa jednom ili više standardnih vrednosti koje predstavljaju brzinu glomerularne filtracije kod životinjskog subjekta.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0020] Prateći crteži, koji su uključeni radi dodatnog razumevanja ovog opisa, uključeni su u i čine deo ove specifikacije, ilustruju primere izvođenja ovog opisa i zajedno sa detaljnim opisom služe da objasne principe ovog pronalaska. Nisu dati konstrukcioni detalji ovog pronalaska detaljnije nego što je potrebno za fundamentalno razumevanje ovog pronalaska i različiti načini na koje se može praktikovati.
FIG.1 predstavlja grafikon koji poredi rezultate ELISA postupka za otkrivanje SDMA sa masenom sprektroskopijom.
FIG.2 predstavlja grafičke podatke SDMA koncentracija kod zdravih pasa i pasa sa kancerom, kardiološkom bolešću, ili kardiološko-bubrežnom bolešću. Horizontalni stubić predstavlja vrednost isečka (određen kao srednja vrednost SDMA koncentracija plus 2 standardne devijacije iz populacije zdravih pasa).
FIG.3 predstavlja grafičke podatke SDMA koncentracija kod zdravih mačaka i mačaka sa bolešću bubrega ili kancerom. Horizontalni stubić predstavlja vrednost isečka (određen kao srednja vrednost SDMA koncentracija plus 2 standardne devijacije iz populacije zdravih mačaka).
FIG.4 predstavlja grafičke podatke absorbance na 280 nm nasuprot broja frakcija za eluiranje SDMA konjugat proteina cistamida, u kojem je protein KLH (◆) ili BSA (■), iz Sephadex G-25M gel-filtracione kolone kakva je ona opisana u primerima.
FIG.5 predstavlja grafičke podatke koncentracije kreatinina nasuprot GFR za skup uzoraka seruma pasa, kako je opisano u primeru 6.
FIG.6 predstavlja grafičke podatke SDMA koncentracije nasuprot GFR za skup uzoraka seruma pasa, kako je opisano u primeru 6.
FIG.7 predstavlja grafičke podatke [Kreatinin]<∗>[SDMA] nasuprot GFR za skup uzoraka seruma pasa, kako je opisano u primeru 6.
FIG.8 prikazuje grafičke podatke, primenom linearne aproksimacije, kreatinina nasuprot GFR, 1/SDMA nasuprot CGF i 1/[Kreatinin<0.37>]<∗>1/[SDMA<0.43>] nasuprot kreatinina za skup uzoraka seruma pasa, kako je opisano u primeru 6.
FIG.9 predstavlja grafičke podatke SDMA koncentracije nasuprot GFR za skup uzoraka seruma mačaka, kako je opisano u primeru 7.
FIG.10 predstavlja grafičke podatke koncentracije kreatinina nasuprot GFR za skup uzoraka seruma mačke, kako je opisano u primeru 7.
FIG.11 predstavlja grafičke podatke [Kreatinin]<∗>[SDMA] nasuprot GFR za skup uzoraka seruma mačaka, kako je opisano u primeru 7.
FIG.12 prikazuje grafičke podatke, primenom linearne aproksimacije, [Kreatinin] nasuprot GFR, 1/SDMA nasuprot CGF, i 1/[Kreatinin<1.2>]<∗>1/[SDMA<0 39>] nasuprot kreatinina za skup uzoraka seruma pasa, kako je opisano u Primeru 7.
FIG.13 grafikon koji prikazuje poboljšanu specifičnost i osetljivost u postupku za određivanje bolesti bubrega.
FIG.14 prikazuje korelaciju između SDMA (µg/dL) i kreatinina (mg/dL) kod pasa.
FIG.15 prikazuje koncentraciju kreatinina i SDMA u serumu u populaciji mačaka.
FIG.16 prikazuje koncentraciju kreatinina i SDMA u serumu kod mačke tokom perioda od nekoliko godina.
FIG.17 prikazuje koncentraciju kreatinina i SDMA u serumu kod mačke tokom perioda od nekoliko godina.
FIG.18 prikazuje koncentraciju kreatinina i SDMA u serumu kod mačke tokom perioda od nekoliko godina.
FIG.19 predstavlja Kaplan-Mcicr krivu preživljavanja koja prikazuje da mačke sa koncentracijom SDMA u serumu od manje od 14 µg/dL preživljavaju približno 1.6 puta duže od mačaka sa koncentracijama većim od 14 µg/dL.
FIG.20 predstavlja Kaplan-Mcicr krivu preživljavanja koja prikazuje da psi sa koncentracijom SDMA u serumu od manje od 14 µg/dL preživljavaju približno 2.6 puta duže od pasa sa koncentracijama većim od 14 µg/dL.
OPIS
[0021] U raznim aspektima, ovaj opis se odnosi na određivanje, dijagnozu, progresiju i prognozu bolesti bubrega i smrtnosti povezane sa bolešću bubrega. Ovaj opis uključuje postupak za određivanje bubrežne funkcije, kod određenih procena brzina glomerularne filtracije (GFR), kod životinje. GFR može biti korisna u dijagnozi i tretiranju bolesti bubrega ili disfunkcije. Ovaj pronalazak definisan je priloženim patentnim zahtevima.
[0022] U raznim aspektima, ovaj opis se odnosi na upotrebu slobodnog simetričnog dimetilarginina (SDMA) i kreatinina u uzorcima krvi kod životinja, kod određenih mačaka i pasa, da bi se odredila brzina glomerularne filtracije i bolesti bubrega. U jednom aspektu, proizvod koncentracije kreatinina i slobodnog SDMA u uzorcima krvi životinje može biti u korelaciji sa GFR i bolešću bubrega. Primera radi, inverzna vrednost proizvoda koncentracija kreatinina i slobodnog SDMA (npr., 1/[kreatinin][SDMA]) je upotrebljena i neočekivano obezbedilo znatno preciznije merenje brzine glomerularne filtracije od upotrebe bilo kog merenja pojedinačno. Prema tome, ovaj opis uključuje postupak za merenje koncentracije slobodnog SDMA u uzorku krvi životinjskog subjekta; merenje koncentracije kreatinina u uzorku krvi životinjskog subjekta; i određivanje brzine glomerularne filtracije životinjskog subjekta poređenjem inverzne vrednosti proizvoda koncentracije kreatinina i koncentracije slobodnog SDMA sa jednom ili više standardnih vrednosti za brzinu glomerularne filtracije kod životinje. Drugi aspekti ovog opisa uključuju upotrebu same SDMA koncentracije ili u odnosu koncentracije SDMA prema koncentraciji kreatinina za određivanje bolesti bubrega kako je ovde opisano.
[0023] SDMA je strukturalni izomer asimetričnog dimetilarginina (ADMA) inhibitora endogene azot oksid sintetaze (NOS). I ADMA i SDMA dobijaju se iz intranuklearne metilacije ostataka L-arginina i oslobađaju se u citoplazmu nakon proteolizije. SDMA se proizvodi protein-arginin metiltransferazom 5 (PRMT 5) i PRMT 7. Proteini koji nose metilarginine, kao što je SDMA, monometilarginin i ADMA, igraju ulogu u RNK procesuiranju, proteinskom prenosu i signalnoj transdukciji (Bedford and Richard, Mol. Cell, 2005, Apr 29, 18(3):263-72). Slobodan SDMA dobijen iz raspadanja takvih metilisanih proteina uglavnom se eliminiše izlučivanjem iz bubrega, dok se ADMA metaboliše u velikoj meri. ADMA je u jakoj korelaciji sa faktorima rizika prema koronarnoj arterijskoj bolesti (CAD) kao što je hipertenzija, hipercholesterolemija, hiperhomocisteinemija, insulinska rezistencija, starostni, i srednji arterijski pritisak. SDMA je u korelaciji sa parametrima bubrežne funkcije, kao što je brzina glomerularne filtracije (GFR), klirens inulina, i klirens kreatinina.
[0024] Shodno tome, jedan aspekt ovog opisa odnosi se na postupak za procenu brzine glomerularne filtracije životinjskog subjekta upotrebom vrednosti i za koncentraciju slobodnog SDMA i koncentraciju kreatinina u serumu. Inverzna vrednost proizvoda vrednosti (npr., 1/([kreatinin][SDMA]) u korelaciji je linearno sa GFR preciznije nego sama koncentracija kreatinina ili SDMA.
[0025] U nastavku je definisano više termina:
Ab je antitelo.
ADMA je asimetrični dimetilarginin. Struktura ADMA je:
BUN je azot uree u krvi.
BSA je goveđi serum albumin.
CMIA je hemiluminescentni magnetni imuno ogled.
DCM je dihlorometan.
DIPEA je N,N-diizopropiletilamin.
DMF je dimetil formamid.
EIA je enzimski imuno ogled.
ELISA je enzimski imunosorbentni ogled.
ESI-MS je masena sprektroskopija sa elektrosprej jonizacijom.
FPIA je fluorescentno polarizacioni imuno ogled.
GFR je brzina glomerularne filtracije.
HATU je (1H-7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil uranijum heksafluorofosfat metanaminijum.
KLH je hemocijanin iz prilepka.
MEIA je mikročestični enzimski imuno ogled.
NOS je azot oksid sintaza.
PBS je fosfatni puferovani slani rastvor.
RIA je radioinumološki ogled.
SDMA je simetrični dimetilarginin. Struktura SDMA je:
[0026] Slobodan SDMA odnosi se na SDMA koji nije deo polipeptidnog lanca. Jedan ili više aminokiselinskih ostataka SDMA može biti prisutno u polipeptidu.
[0027] SLE je sistemski lupus eritematozus.
[0028] TFA je trifluorosirćetna kiselina.
[0029] Struktura arginina je:
[0031] Pojam "analog," kako se ovde koristi, generalno se odnosi na jedinjenje u kojem su jedan ili više pojedinačnih atoma zamenjeni različitim atomom(ima) ili različitom funkcionalnom grupom(ama). Na primer, analog može biti modifikovan oblik analita koji može da uđe u kompeticiju sa analitom za receptor, pri čemu ta modifikacija obezbeđuje sredstvo za združivanje analita drugoj grupi, kao što je oznaka ili čvrsta podloga. Taj analog analita može se vezati za antitelo na način sličan analitu.
[0032] Pojam "antitelo," kako se ovde koristi, generalno se odnosi na glikoprotein proizveden pomoću B limfocitnih ćelija kao odgovor na izlaganje nekom antigenu i vezuju se specifično za taj antigen. Pojam "antitelo" je upotrebljen u svom najširem značenju, a naročito pokriva monoklonalna antitela (koja uključuju monoklonalna antitela pune dužine), poliklonalna antitela, multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela), i fragmente antitela dokle god ispoljavaju poželjnu biološku aktivnost.
[0033] Kako se ovde koristi, "anti-SDMA," "deo anti-SDMA antitela," ili " fragment anti-SDMA antitela " i/ili "varijanta anti-SDMA antitela" i slično uključuju bilo koje protein ili peptid koji sadrže molekul koji obuhvata najmanje deo imunoglobulinskog molekula, kao što je, ali nije ograničen na jedan region određivanja komplementarnosti (CDR) konstantnog regiona teškog lanca ili lakog lanca, region okvira, ili bilo koji njihov deo.
[0034] Pojam "fragment antitela," kako se ovde koristi, odnosi se na deo antitela pune dužine, generalno njegov antigen vezujući ili varijabilni domen. Specifično, na primer, fragmenti antitela mogu da uključuju Fab, Fab', F(ab')2, i Fv fragmente; dijatela; linearna antitela; moleklule jednolančanog antitela; i multispecifična antitela iz fragmenata antitela.
[0035] Pojam "antigen," kako se ovde koristi, generalno se odnosi na supstancu koja može, pod odgovarajućim uslovima, da reaguje sa antitelom specifičnim za antigen.
[0036] Pojam "analit," kako se ovde koristi, generalno se odnosi na supstancu, ili skup supstanci u uzorku koji se određuju i/ili mere.
[0037] Pojam "životinja," kako se ovde koristi, generalno se odnosi na bilo koju životinju, npr., čovek, ili ne-humanu životinju kao što je mačka, pas ili konj.
[0038] Pojam "uzorak krvi," kako se ovde koristi, generalno se odnosi na bilo koji iz krvi dobijen tečni uzorak, koji uključuje ali se ne ograničava na punu krv, plazmu, i serum. Da bi se obezbedio serum za upotrebu u postupcima ovog opisa, jedan ili više uzoraka seruma uzima se od životinjskog subjekta. Ti uzorci seruma mogu biti, na primer, dobijeni od životinjskog subjekta kao uzorci krvi, zatim podeljeni da bi se dobio serum. U određenim primerima izvođenja, serum se može izmeriti bez izdvajanja iz krvi. Kao što će stručnjak iz tehnike ceniti, jedan dobijeni uzorak može biti podeljen ili na drugim način upotrebljen za oba merenja koncentracije. Alternativno, veći broj uzoraka može se dobiti iz životinjskog subjekta, pri čemu se (najmanje) jedan uzorak meri za koncentraciju kreatinina, i (najmanje) jedan uzorak meri se za koncentraciju slobodnog SDMA. U određenim ovakvim slučajevima, uzorci se dobijaju od životinja u otprilike isto vreme (npr., u roku od 60 minuta, u roku od 30 minuta, ili čak u roku od 10 minuta jedan od drugog).
[0039] Pojam "unakrsna reaktivnost," kako se ovde koristi, generalno se odnosi na sposobnost pojedinačnog antigen vezujućeg mesta antitela da reaguje sa više od jedne antigenske determinante ili sposobnost populacije molekula antitela da reaguju sa više od jednog antigena. Generalno, do unakrsnih reakcija dolazi zbog (i) unakrsno reagujući antigen deli zajednički epitop sa imunizujućim antigenom ili (ii) ima epitop koji je strukturalno sličan jednom na imunizujućem antigenu (multispecifičnost).
[0040] Pojam "imunološki ogled," kako se ovde koristi, generalno se odnosi na test koji upošljava antitelo i antigen komplekse za generisanje merljivog odgovora. "Antitelo:antigen kompleks" može se naizmenično koristiti sa pojmom "imuno-kompleksom." Imunološki ogledi, generalno, uključuju nekompetitivne imunološke oglede, kompetitivne imunološke ogledi, homogene imunološke oglede, i heterogene imunološke oglede. Kod "kompetitivnih imunoloških ogleda," neobeleženi analit (ili antigen) u test uzorku meri se njegovom sposobnošću da uđe u kompeticiju sa obeleženim antigenom u imunološkom ogledu. Neobeleženi antigen blokira sposobnost označenog antigena da se veže jer je vezujuće mesto na antitelu već zaokupljeno. U "kompetitivnim imunološkim ogledima," količina antigena prisutna u test uzorku inverzno je povezana sa količinom signala generisanog iz oznake.
Suprotno tome, u "nekompetitivnim imunološkim ogledima," takođe poznatim i kao "sendvič" imunološki ogledi, analit se vezuje između dva visoko specifična reagensa antitela radi formiranja kompleksa, a količina antigena direktno je proporcionalna količini signala povezanog sa kompleksom. Imunološki ogledi koji zahtevaju razdvajanje vezanog antitela: antigen kompleksa, generalno se nazivaju "heterogeni imunološki ogledi," a imunološki ogledi koji ne zahtevaju razdvajanje antitelo:antigen kompleksa generalno se nazivaju "homogeni imunološki ogledi." Stručnjak iz tehnike lako će razumeti razne formate imunoloških ogleda.
[0041] Pojam "imunološki kompleksi," kako se ovde koristi, generalno se odnosi na komplekse formirane vezivanjem molekula antigena i antitela, sa ili bez fiksiranja komplementa. Kada je jedan od bilo koga, antitela ili antigena, obeležen, oznaka je povezana sa imunološkim kompleksom kao rezultat vezivanja između antigena i antitela. Prema tome, kada je antitelo obeleženo, oznaka postaje povezana sa antigenom kao rezultat vezivanja. Slično, kada je antigen obeležen (npr., analog analita sa oznakom), oznaka postaje povezana sa antitelom kao rezultat vezivanja između antigena i antitela.
[0042] Pojam "oznaka," kako se ovde koristi, odnosi se na detektabilno jedinjenje, kompoziciju, ili čvrstu podlogu, koja može biti konjugovana direktno ili indirektno (npr., na kovalentan ili ne-kovalentan način, sama ili enkapsulirana) za antitelo, SDMA analog, ili antigen prema ovom pronalasku. Oznaka može biti detektabilna sama po sebi (npr., radioizotpone oznake, hemiluminescentna boja, elektrohemijske oznake, helati metala, čestice lateksa, ili fluorescentne oznake) ili, u slučaju enzimatskih oznaka, može katalizovati hemijsku izmenu jedinjenja ili kompozicije supstrata koja je detektabilna (npr., enzimi kao što je peroksidaza rena, alkalinska fosfataza, i slično). Oznaka uposlena u ovom pronalasku mogla bi biti, ali se ne ograničava na: alkalinska fosfataza; glukoza-6-fosfat dehidrogenaza ("G6PDH"); peroksidaza rena (HRP); hemiluminescentna sredstva kao što je izoluminol, fluorescenciona sredstva kao što su fluorescein i rodamin jedinjenja; ribozimi; i boje. Oznaka takođe može biti specifično vezujući molekul koji sam po sebi može biti detektabilan (npr., biotin, avidin, streptavidin, digoksigenin, maltoza, oligohistidin, 2, 4-dinitrobenzen, fenilarsenat, ssDNK, dsDNK, i slično). Oznaka može biti vezana za drugi molekul ili čvrstu podlogu i odabranu zbog specifičnih karakteristika koje omogućavaju detekciju označenog molekula. Upotreba oznake proizvodi signal koji se može detektovati sredstvima kao što je detekcija elektromagnetne radijacije ili direktne vizualizacije, i koji se opciono može izmeriti.
[0043] Pojam "monoklonalno antitelo," kako se ovde koristi generalno se odnosi na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj., pojedinačna antitela koja obuhvataju populaciju su identična. Monoklonalna antitela su visoko specifična, pri čemu su direktno usmerena prema jednom antigenskom mestu. Nasuprot preparatima poliklonalnih antitela, koji tipično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih epitopa, svako monoklonalno antitelo usmereno je priotiv pojedinačnog epitopa na antigenu. Atribut "monoklonalno" odnosi se samo na karakter antitela i nije konstruisan kao zahtevana proizvodnja antitela bilo kojim određenim postupkom. Specifično, na primer, monoklonalna antitela mogu biti izrađena metodologijom hibridoma, ili može biti izrađena rekombinantnim DNK postupcima, ili mogu biti izolovana iz biblioteke faga antitela primenom poznatih tehnika.
[0044] Pojam "polipeptid," kako se ovde koristi, generalno se odnosi na molekul sa sekvencom aminokiselina povezanih peptidnim vezama. Ovaj pojam uključuje proteine, fuzione proteine, oligopeptide, ciklične peptide, i polipeptidne derivate. Antitela i derivati antitela prethodno su opisani u odvojenom delu, ali se antitela i derivati antitela, za svrhe ovog opisa, tretiraju kao podklasa polipeptida i derivata polipeptida.
[0045] Pojam "čvrsta podloga," kako se ovde koristi, odnosi se na ne-vodenu matricu na koju mogu da prijanjaju antitelo ili SDMA analog prema ovom pronalasku. Primeri čvrste podloge uključuje podloge formirane delimično ili u celosti od stakla (npr., staklo sa kontrolisanim otvorima), sintetičkih i prirodnih polimera, polisaharida (npr., agaroza), poliakrilamida, polistirena, polivinil alkohola i silikona, magnetnih čestica, čestica lateksa, hromatografskih traka, mikrotitarskih polistirenskih ploča, ili bilo koje druge supstance koja omogućava vezivanje antigena i/ili antitela koja se ispiraju ili odvajaju od nevezanih materijala. U određenim primerima izvođenja, zavisno od primene, čvrsta podloga može biti bazenčić ogledne ploče ili može biti kolona za prečišćavanje (npr., kolona afinitetne hromatografije).
[0046] "Receptor" se odnosi se na bilo koje jedinjenje ili kompoziciju koja može da prepozna određenu prostornu ili polarnu organizaciju molekula, npr., epitopno ili determinantno mesto. Ilustrativni receptori uključuju antitela, Fab fragmente, i slično.
[0047] "Vezujuća specifičnost" ili "specifično vezivanje" se odnosi na suštinsko prepoznavanje prvog molekula za drugi molekul, na primer polipeptid i poliklonalno ili monoklonalno antitelo, ili fragment antitela (npr. Fv, jednolančani Fv, Fab', ili F(ab')2 fragment) specifični za polipeptid. Na primer, "specifičnost," kako se ovde koristi, generalno se odnosi na sposobnost pojedinačnog antitelo kombinujućeg mesta da reaguje samo sa jednom antigenskom determinantom ili sposobnost populacije molekula antitela da reaguju samo sa jednim antigenom. Generalno, postoji visok stepen specifičnosti u reakcijama antigen-antitelo. Antitela mogu razlikovati razlike u (i) primarnoj strukturi antigena, (ii) izomernim oblicima antigena, i (iii) sekundarnoj i tercijernoj strukturi antigena. Antitelo-antigen reakcije koje ispoljavaju visoku specifičnost, ispoljavaju nisku unakrsnu reaktivnost.
[0048] "Suštinsko vezivanje" ili "suštinski vezati" se odnosi na količinu specifičnog vezivanje ili prepoznavanje između molekula u oglednoj mešavini pod određenim oglednim uslovima. U ovom najširem aspektu, suštinsko vezivanje se odnosi na razliku između nesposobnosti vezivanja prvog molekula ili prepoznavanja drugog molekula, i sposobnosti prvog molekula za vezivanje ili prepoznavanje trećeg molekula, tako da je razlika dovoljna da omogući značajan ogled za sprovođenje koji razlikuje specifično vezivanje pod određenim skupom oglednih uslova, koji uključuju relativne koncentracije molekula, i vreme i temperaturu inkubacije. U drugom aspektu, jedan molekul je suštinski nesposoban za vezivanje ili prepoznavanje drugog molekula u smislu unakrsne reaktivnosti gde prvi molekul ispoljava reaktivnost prema drugom molekulu koja je manja od 25%, manja od 10%, manja od 5% ili manja od 1% reaktivnosti ispoljene prema trećem molekulu pod određenim skupom oglednih uslova. Specifično vezivanje može se ispitati primenom više dobro poznatih postupaka, npr., imunohistohemijski ogled, enzimski imunosorbentni ogled (ELISA), radioinumološki ogled (RIA), ili western blot ogled.
[0049] Pojam "so," kako se ovde koristi, označava so formiranu između kisele i bazne funkcionalne grupe jedinjenja. Primerne soli uključuju, ali se ne ograničavaju na, sulfatne, citratne, acetatne, oksalatne, hloridne, bromidne, jodidne, nitratne, bisulfatne, fosfatne, kisele fosfatne, izonikotinatne, laktatne, salicilatne, kiselete citratne, tartaratne, oleatne, tanatne, pantotenatne, bitartratne, askorbatne, sukcinatne, maleatne, gentisinatne, fumaratne, glukonatne, glukaronatne, saharatne, formatne, benzoatne, glutamatne, metanesulfonatne, etansulfonatne, benzensulfonatne, ptoluenesulfonatne, i pamoatne (tj., 1,1'-metilen-bis-(2-hidroksi-3-nafthoatne)) soli. Pojam "so" takođe se odnosi na so formiranu između jedinjenja sa kiselom funkcionalnom grupom, kao što je funkcionalna grupa karboksilne kiseline, i neorganske ili organske baze. Pogodne baze uključuju, ali se ne ograničavaju na, hidrokside alkalnih metala kao što je natrijum, kalijum, i litijum; hidroksid zemno alkalnih metala kao što je kalcijum i magnezijum; hidrokside drugih metala, kao što je aluminijum i cink; amonijak, i organski amini, kao što je nesupstituisani ili hidroksi-supstituisani mono-, di-, ili trialkilamini; dicikloheksilamin; tributil amin; piridin; N-metil, N-etilamin; dietilamin; trietilamin; mono-, bis-, ili tris-(2-hidroksi-niži alkil amini), kao što je mono-, bis-, ili tris-(2-hidroksietil)amin, 2-hidroksi-tert-butilamin, ili tris-(hidroksimetil)metilamin, N, N,-di-niži alkil-N-(hidroksi niži alkil)-amini, kao što je N,N,-dimetil-N-(2-hidroksietil)amin, ili tri-(2-hidroksietil)amin; N-metil-D-glukamin; i amino-kiseline kao što je argininska, lizinska, i slično.
[0050] U određenim ovde opisanim postupcima, brzina glomerularne filtracije životinjskog subjekta je određena poređenjem rezultata jednačine koja podrazumeva proizvod koncentracije kreatinina i koncentracije slobodnog SDMA u uzorcima krvi životinjskog subjekta. Na primer, za određivanje GFR, inverzna vrednost proizvoda koncentracije kreatinina i koncentracije slobodnog SDMA može se porediti sa jednom ili više standardnih vrednosti koje su u korelaciji sa brzinom glomerularne filtracije kod životinje. Kako je opisano detaljnije u Primeru 6 koji sledi, postoji linearna veza između GFR i inverzne vrednosti proizvoda koncentracije kreatinina i koncentracije slobodnog SDMA. Shodno tome, stručnjak iz tehnike može da ustanovi linearnu jednačinu između GFR i 1/([kreatinin][SDMA]) za životinjski subjekt (npr., upotrebom drugih životinja iste vrste ili tipa), i da tu jednačinu koristi kako bi se obezbedile standardne vrednosti za poređenje sa inverznom vrednosti proizvoda izmerenih koncentracija. Kako to stručnjak iz tehnike shvata, poređenje sa standardnim vrednostima može da uključi korišćenje te jednačine samo da bi se izračunala GFR od vrednosti 1/([kreatinin][SDMA]). Alternativno, skup standardnih vrednosti inverzne vrednosti proizvoda koncentracija kreatinina i slobodnog SDMA za skup poznatih GFR vrednosti se može odrediti; i GFR životinjskog subjekta se može odrediti poređenjem inverzne vrednosti proizvoda njegovih izmerenih koncentracija kreatinina i slobodnog SDMA sa standardnim vrednostima. U određenim primerima izvođenja, faza određivanja se izvodi upotrebom mikroprocesora programiranog tako da uporedi inverznu vrednost proizvoda koncentracija kreatinina i slobodnog SDMA sa tom jednačinom ili sa tom jednom ili više standardnih vrednosti. Mikroprocesor je obično komponenta računarskog uređaja koja sadrži memoriju za čuvanje koja sadrži uputstva za softver, koji kada se izvede, sprovodi funkciju izračunavanja te jednačine i izvođenja poređenja na osnovu unosa operatera ili uređaja za detekciju.
[0051] Kako to stručnjak iz tehnike shvata, poređenje inverzne vrednosti proizvoda koncentracije kreatinina i koncentracije slobodnog SDMA sa jednom ili više standardnih vrednosti za inverznu vrednost proizvoda koje su u korelaciji sa brzinom glomerularne filtracije takođe uključuje numerička poređenja koja su matematički ekvivalentna takvom poređenju. Na primer, poređenja koja koriste reprezentativne vrednosti {konstanta × (1/([kreatinin][SDMA])} i/ili [konstanta × GFR] se takođe uzimaju u razmatranje. Na primer, takvo poređenje se može postići na osnovu samog proizvoda ([kreatinin] [SDMA]). Pored toga, stručnjak iz tehnike to shvata u smislu da umetanje faktora u delilac i/ili brojilac količnika (1/([kreatinin] [SDMA]) ne menja jačinu njegove veze sa GFR (npr., 2/([SDMA][kreatinin]), 1/(2[SDMA][kreatinin]) ili 5/(3[SDMA][kreatinin]). Slično, veza ([kreatinin] [SDMA]) sa 1/GFR se isto tako uzima u razmatranje.
[0052] U drugom aspektu, ovaj opis odnosi se na procenu GFR korišćenjem formule:
[0053] Na osnovu eksperimentalnih rezultata, ova formula ima koeficijent korelacije (R-kvadratni) od oko 0.8347. Kada se ta jednačina generalizuje kako sledi:
eksponenti (P i Q) koji dovode do maksimuma koeficijent korelacije su P ≅ -1.551102 i Q ≅ -0.2204409. R-kvadratni za ovaj skup eksponenti je 0.9116. Iz ugla jednog stručnjaka iz tehnike, P i Q predstavljaju faktore za procenu koji se mogu podesiti tako da koeficijent korelacije dovedu do maksimuma.
[0054] Izgleda da blaga promena eksponenti ne utiče značajno na R-kvadratni. Na primer, kada je za P = -1.5 i Q = -0.25, R-kvadratni je 0.9114. Radi pojednostavljivanja, idealna transformacija energije za kreatinin i SDMA nivoe u vezi sa GFR nivoom je u obliku:
[0055] U raznim primerima izvođenja, faktori procene P i Q se mogu dalje podešavati. Na primer, P može da varira od oko -5 do manje od gotovo 0 (npr., -0.01). Drugim rečima, P može da varira od oko -5 do bilo koje vrednosti između -5 i 0, ali ne uključujući nulu. U specifičnim ne-ograničavajućim primerima, P može da varira od oko -4.0 do -0.1, oko -3.0 do -0.5, oko -2.0 do -1.0., i oko - 1.0 do 0, ali ne uključujući 0). Nezavisno od toga, Q može da varira od -2.5 do gotovo 0 (npr., -0.01). Drugim rečima, Q može da varira od oko -2.5 do bilo koje vrednosti između -2.5 i 0, ali ne uključujući nulu. U specifičnim ne-ograničavajućim primerima, Q može da varira od oko -2.0 do 0.1, oko -1.5 do -0.15, oko - 1.0 do -0.2, oko -1.5 do -0.5, oko -1.2 do -0.8,i oko -1.0 do 0, ali ne uključujući 0.
[0056] U određenim primerima izvođenja, brzina glomerularne filtracije je upotrebljena za određivanje bubrežne funkcije životinjskog subjekta. Na primer, brzina glomerularne filtracije se može koristiti radi dijagnostikovanja bolesti bubrega ili disfunkcije kod životinje. Bolesti i poremećaji bubrega (npr., oštećenje bubrega, bubrežna insuficijencija, hronična bolest bubrega, glomerulonefritis, dijabetska nefropatija, intersticijalni nefritis, policistična bolest bubrega, i hipertenzivna bolest bubrega) imaju tendenciju da smanje celokupnu bubrežnu funkciju, koja uključuje GFR, i mogu se dijagnostikovati korišćenjem ovde opisanih postupaka. Na primer, brzina glomerularne filtracije kod neke životinje za koju se zna ili za koju se sumnja da ima bolest se može porediti sa brzinom glomerularne filtracije kod jedne ili više, npr., populacija zdravih subjekata. Bolesti i poremećaji bubrega se mogu predvideti kada je stopa subjekta manja od stope zdrav(ih)og subjek(a)ta. U određenim primerima izvođenja, ukoliko je brzina glomerularne filtracije statistički značajno manja od prosečne vrednosti za populaciju zdravih životinja iste vrste (tj., kako je procenjeno korišćenjem korelacije sa [kreatinin]<P>[SDMA]<Q>), mogu se dijagnostikovati bolesti bubrega ili disfunkcije. U ne-ograničavajućem primeru, GFR životinjskog subjekta je statistički značajno manja od prosečne zdrave populacije kada je razlika veća od dve standardne devijacije.
[0057] U jednom aspektu ovaj opis se odnosi na skup standardnih vrednosti za tu jednačinu koja je u korelaciji sa GFR ili bolešću ili disfunkcijom bubrega. Skup može biti povezan sa standardnom krivom koja je u korelaciji sa vrednošću te jednačine sa GFR kako je prikazano na FIG.7. U drugim primerima izvođenja, vrednosti ili standardna kriva su povezani sa bolešću ili disfunkcijom bubrega. Standardne vrednosti se mogu prikazati u formi tabele ili grafikona u kom se nalazi referenca koja upućuje na pružaoca zdravstvene usluge ili na uputstva koja mogu biti očitana mašinom povezanom sa računarskim uređajem kako je opisano u ovom tekstu.
[0058] U drugom aspektu, bolest ili poremećaj bubrega se mogu dijagnostikovati iz jednačine koja uključuje proizvod koncentracija kreatinina i SDMA kako je prethodno opisano bez intermedijarne faze određivanja GFR. Shodno tome, korišćenje te jednačine za generisanje vrednosti, pri čemu se ta vrednost može porediti sa standardnom vrednošću ili skupom standardnih vrednosti za koje se zna da su povezane sa bolešću ili disfunkcijom. U jednom aspektu, izračunavanje je sprovedeno u referentnoj laboratoriji a vrednost iz te jednačine se može prijaviti lekaru, veterinaru ili drugom pružaocu zdravstvenih usluga za životinje. Pružalac može da uporedi tu vrednost sa jednim ili više poznatih skupova vrednosti koji su u korelaciji sa bolešću ili disfunkcionm bubrega. Pružalac može da uporedi vrednost sa jednom ili više poznatih skupova vrednosti koje su u korelaciji sa bolešću ili disfunkcijom bubrega. U drugom aspektu, referentna laboratorija može da sprovede poređenje, na primer na računarskom uređaju, i da krajnji rezultat prijavi doktoru.
[0059] U drugom aspektu, ovaj opis se odnosi na dijagnozu bolesti ili poremećaj bubrega, kao što je hronična bolesti bubrega (CKD) kombinovanjem vrednosti povezanih sa SDMA i koncentracijom kreatinina u uzorcima uzetih od životinja, na primer u uzorcima seruma. Formula koristi vrednosti isečka za SDMA i kreatinin dobijen iz graničnih koncentracija uzorka koje ukazuju na bolest bubrega. Kritične ili granične koncentracije se mogu odrediti uzorkovanjem populacije životinja i povezivanjem sa koncentracijama SDMA i kreatinina u populacijama sa stanjem bolesti poznatim u tehnici. U raznim primerima izvođenja, granična vrednost SDMA (SDMACUT) može biti između oko 10 i oko 20 µg/dL, određenije oko 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 µg/dL, i još određenije, oko 14 µg/dL. Kritična vrednost kreatinina može biti između oko 1.3 i oko 2.5 ili između oko 1.7 i oko 2.8 mg/dL, određenije oko 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, i 2.8 mg/dL. Kada se kritične vrednost odrede, vrednost (C) koja predstavlja kombinaciju koncentracija SDMA i kreatinina u uzorku pacijenta u poređenju sa kritičnim vrednostima za SDMA i kreatinin se može dobiti iz sledeće formule: C = [SDMA] / SDMACUT+ [CRE] / CRECUT. Ako je C veće od CCUT, pacijentu je dijagnostikovana bolest bubrega.
[0060] CCUTse određuje biranjem vrednosti koje imaju optimalno kombinovanu osetljivost i specifičnost za ogled. FIG.13 prikazuje kako različite vrednosti CCUTutiču na specifičnost i/ili osetljivost. CCUTse može odabrati kako bi se prilagodio željeni nivo specifičnost i/ili osetljivosti za detekciju bolesti bubrega. Na primer, za podatke prikazane na FIG.13, i osetljivost i specifičnost detekcije prelaze 90% kada je CCUT= 1.6. Obično, više vrednosti CCUTdovode do više specifičnosti ali niže osetljivosti. Suprotno tome, niže vrednosti CCUTobično dovode do niže specifičnosti ali više osetljivosti.
[0061] Ovaj opis je takođe usmeren na računarski uređaj za sprovođenje gore opisanog računanja, za određivanje GFR, ili za dijagnostikovanje bolesti bubrega ili disfunkcije. Računarski uređaj uključuje memoriju za čuvanje softverskih uputstava, koji kada se izvede, računa vrednost iz jednačine koja uključuje proizvod koncentracije kreatinina i koncentraciju slobodnog SDMA.
[0062] U drugom primeru izvođenja, ovaj opis se odnosi na prognostički postupak za predviđanje prerane ili rane smrti kod pacijenta ili životinjskog subjekta. U skladu sa ovim postupkom, mačke imaju povećan rizik od rane smrti kada postoji neuobičajena neusaglašenost između [SDMA] i [CRE], tako da je SDMA vrednost podignuta na mnogo viši nivo od CRE vrednosti, u odnosu na njihovu normalnu vrednost isečka. U jednom primeru izvođenja, postupak obezbeđuje prognozu rane smrti kada je odnos [SDMA]/[CRE] u serumu veći od određenje granične vrednosti T.
[0063] Na primer, kada je [SDMA] izražen u µg/dL (mikrogrami/decilitar) i [CRE] je izražen u mg/dL (miligrami/decilitar), T može da podrazumeva vrednost od oko 4 do oko 10 (tj., oko 4 µg/dL SDMA:1 mg/dL kreatinin do oko 10 µg/dL SDMA:1 mg/dL kreatinina). U raznim primerima izvođenja, granična vrednost T može biti između oko 7 i 20, određenije oko 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20. Stručnjak iz tehnike zna da ukoliko je koncentracija CRE i/ili SDMA izražena različitim jedinicama merenja od onih prethodno datih, granična vrednost [SDMA]/[CRE] se shodno tome može menjati i proporcionalno, bez uticaja na smisao i prognostičku iskoristivost postupka.
[0064] Dalje, rizik od prerane smrti se može povećavati kako se povećava vrednost odnosa [SDMA]/[CRE]. Na primer, pojedinac koji ima [SDMA]/[CRE] = 40 može imati veći rizik od prerane smrti od pojedinca sa [SDMA]/[CRE] = 12.
[0065] Pored toga, neuobičajeno iznenadan porast [SDMA] je prognostički za povećan rizik od rane smrti. Slično, neuobičajeno visoke vrednosti [SDMA] su prognostičke za povećan rizik od rane smrti. Na primer, neuobičajeno visoke vrednosti [SDMA] kod mačaka mogu biti vrednosti iznad oko 25 µg/dL, iznad oko 30 µg/dL, ili iznad oko 30 µg/dL.
[0066] U jednom aspektu, ovaj opis odnosi se na koncentraciju SDMA u serumu koja ukazuje na smrtnost. Na primer, kako je prikazano na FIG.19 i 20, ustanovljeno je da je koncentracija SDMA u serumu veća od 14 µg/dL povezana sa smrtnošću kod mačaka i pasa. Shodno tome, ovaj opis odnosi se na identifikovanje odgovarajuće vrednosti isečka koncentracije SDMA koja najviše ukazuje na smrtnost. U jednom aspektu, isečak je u opsegu od oko 10-20 µg/dL, određenije oko 12-18 µg/dL, ili oko 14-16 µg/dL. Identifikacija odgovarajuće koncentracije isečka se može odrediti, na primer, merenjem koncentracije SDMA u serumu kod svakog člana grupe pasa ili mačaka, ponavljanje merenja tokom nekoliko meseci ili godina do smrti svakog člana grupe. Opciono, svim psima ili mačkama u grupi je dijagnostikovan CKD. Kod različitog kandidata vrednosti isečka koncentracije SDMA graničnih vrednosti je ispitivana mogućnost predviđanja smanjenog vremena preživljavanja. Takvo ispitivanje može da se sprovede. Na primer, upotrebom Kaplan-Meier-ove krive preživljavanja.
[0067] Kaplan-Meier-ove krive preživljavanja se mogu koristiti za prikazivanje predviđanja smrtnosti. Kaplan-Meier krive predstavljaju opšti način bavljenja odloženim vremenima preživljavanja (vreme-dodogađaja), naročito kada svi subjekti ne nastavljaju ispitivanje. Svaki subjekat karakterišu tri varijable: njihovo serijsko vreme, njihov status na kraju serijskog vremena (vreme događaja ili cenzurisanog); studijska grupa je (npr., SDMA < ili ≥ 14). Događaj obično predstavlja klinički ishod kao što je smrt, nestanak tumora itd. Vreme ispitivanja je vremenski period u kojem je verovatno da će se događaj od interesa javiti od početne tačke. Do kraja ovog ispitivanja se dolazi pre nego što se svi učesnici upoznaju sa ovim događajem, čak i ako je ishod preostalih učesnika nepoznat. FIG.19 i 20 predstavljaju Kaplan-Meier-ove krive preživljavanja koje prikazuju da mačke i psi koji imaju koncentracije SDMA u serumu od manje od 14 µg/dL preživljavaju približno 1.6 i 2.6 puta duže (tim redom) od mačaka i pasa sa koncentracijama većim od ili jednakim 14 µg/dL. U drugom aspektu, ovaj opis se odnosi na postupak određivanja odnosa kreatinina i SDMA kod zdravih i bolesnih životinja, i upotrebu tog odnosa za određivanje bolesti bubrega i smrtnosti povezane sa bolešću bubrega. Primera radi, kod zdravih životinja, koncentracija SDMA (µg/dL) i kreatinin (mg/dL) je generalno u odnosu koji je u opsegu od oko 4:1 do 10:1 (ug/dL:mg/dL). Međutim, kod nekih pacijenata koji imaju hroničnu bolest bubrega, SDMA vrednosti su značajno više od odgovarajućih vrednosti kreatinina, koje ukazuju na napredak bolesti. Shodno tome, neusaglašavanje kod SDMA:kreatinin odnosa može ukazivati na smrtnost kod životinja. Kako je prikazano na FIG.14, postoji jaka korelacija između SDMA i kreatinina, i normalni odnos je manji od 10 (µg/dL:mg/dL). Međutim, odnos SDMA koncentracije (µg/mL) i kreatinina (mg/dL) veći od 10 ukazuje na uznapredovalu bolest bubrega, koja često dovodi do smrti.
[0068] Shodno tome, korišćenje odnosa koncentracije SDMA i koncentracije kreatinina u serumu ukazuje na bolest i/ili smrtnost. Prema tome, ovaj opis uključuje određivanje ili prognoziranje bolesti bubrega ili smrti povezanu sa bolešću bubrega. Postupak uključuje određivanje koncentracija SDMA i kreatinina u krvi, npr., serumu, uzoraku od životinja, kod određenih mačaka i pasa. Onog trenutka kada su koncentracije određene, odnos SDMA i kreatinina se može porediti sa odnosom isečka kako bi se odredilo prisustvo, stepen napredovanja bolesti bubrega i verovatnoća smrti koja se javlja kao rezultat bolesti bubrega. Odnos isečka može biti oko 5-15 (µg/dL SDMA : mg/dL kreatinina), određenije oko 7-13 ili oko 9-11, i čak određenije oko 10. Životinje koje imaju odnos SDMA:kreatinin veći od 10 mogu biti okarakterisane kao da kod njih postoji povećana verovatnoća od prerane smrti. Generalno, što je veći odnos, veća je verovatnoća od neminovne smrti. Na primer, FIG.15 prikazuje odnos SMDA:kreatinin za populaciju mačaka. Kod dve mačke odnos je bio od oko 19 i 34, i svaka je uginula u toku trajanja ispitivanja. FIG.16, 17 i 18 prikazuju rezultat longitudinalnog ispitivanja tri mačke koje su uginule u roku od oko dve godine nakon što su im odnosi bili identifikovani da su veći od oko 10. Jedna od ovih mačaka je uginula u roku od oko jednog meseca nakon što je identifikovano da joj je odnos veći od 20 (Fig.18).
[0069] Jednom kada se bolest ili disfunkcija bubrega dijagnostikuje, postupak može da uključi lečenja životinjskog subjekta od bolesti bubrega ili disfunkcije. Lečenja mogu da uključe, na primer, djalizu, transplant bubrega, antibiotsku terapiju (npr., ukoliko se disfunkcija bubrega javlja usled infekcije ispod kože), prepisane dijete; lečenje potkožne sistemske zapaljenske, infektivne, ili neoplastične bolesti (npr., ukoliko disfunkcije bubrega nastaju usled nefropatije nastale usled gubitka proteina); primenu fomepazola ili etanola (npr., u slučajevima trovanja etilen-glikolom); primenu ACE inhibitora,dijete sa umerenim unosom proteina i/ili dodataka obogaćenih omega 3 masnim kiselinama (npr., u slučaju proteinurije); primenu sredstava za vezivanje fosfora i/ili dijete sa ograničenim unosom fosfora (npr., u slučaju hiperfosfatmije); lečenje sa IV tečnostima, terapiju supkutane primene tečnosti , dijetu sa niskim unosom proteina i/ili H2receptor antagonista (npr., u slučajevima azotemije); amlodipin, atenolol i/ili ACE inhibitore (npr., u slučajevima sistemske hipertenzije ); bikarbonat i/ili citrat (npr., za acidozu); primenu analoga vitamina D kao što je kalcitriol ili 1,25-dihidroksivitamin D), sredstava za vezivanje fosfata (poželjno onih koji nisu na bazi Ca) i/ili dijetu sa ograničenim unosom fosfora (npr., u slučajevima sekundarnog renalnog hiperparatiroidizma); i/ili primenu H2receptor antagonista i/ili humanog rekombinantnog eritropoietina (moguće sa dodatkom gvožđa) (npr., u slučajevima anemije).
[0070] U određenim primerima izvođenja, koncentracija slobodnog SDMA se određuje upotrebom imunoloških postupaka, uređaja i kompleta opisanih u U.S. Provisional Patent Application serial no. 61/086,870 koje je podnesena 07. avgusta 2008. godine, U.S. Patent Application serial no.12/512,479, koja je podnesena 30. jula 2009. godine, i U.S. Patent Application Publication no.2010/0035274, koja je objavljena 11. februara, 2010. godine. Postupak može da uključi kontrole, kalibratore ili standarde koji obuhvataju jedan ili više SDMA analoga. Određenije, postupak se može realizovati korišćenjem tehnika imunološkog ogleda koje su stručnjacima dobro poznate, i koje uključuju, ali bez ograničenja, upotrebu mikroploča i uređaja za lateralni protok. Životinjski subjekti od kojih se uzorci uzimaju za otkrivanje SDMA, uključuju humane subjekte i subjekte ne-humanih životinja (npr., kućne ljubimce, stoku, itd.). Određivanje stanja bolesti povezanih sa prisustvom ili količinom SDMA se može sprovesti i za humane i za nehumane subjekte.
[0071] Format ogleda sa čvrstom fazom je tehnika koja se uobičajeno koristi u ogledima vezivanja. Postoji neodređen broj uređaja za oglede i postupke u kojima je prisustvo analita naznačeno vezivanjem analita za konjugat i/ili imobilisani komplementarni član vezivanja. U jednom određenom aspektu, imobilisani član za vezivanje (npr., anti-SDMA antitelo) se vezuje, ili postaje vezan tokom ogleda, za čvrstu fazu kao što je reakcioni bazenčić, merač nivoa tečnosti, test traka, propusni uložak, papir, matrica vlakana ili druge prikladne materijale čvrste faze. Reakcija vezivanja između slobodnog SDMA u uzorku i imobilisanog antitela se određuje dodavanjem uzorku količine analognog SDMA, koja uključuje SDMA konjugovan sa oznakom. Nakon dovođenja u kontakt mešavine uzorka i analoga SDMA u čvrstoj fazi, mešavina i čvrsta faza se inkubiraju kako bi se omogućilo vezivanje između imobilisanog antitela, SDMA i SDMA analoga. Nakon inkubacije, nevezani reaktanti se uklanjaju iz čvrste faze. Izmeri se količina oznake koja postaje povezana sa antitelom putem vezivanja antitela za analoge. Količina oznake povezane sa antitelom je obrnuto proporcionalna količini slobodnog SDMA u uzorku.
[0072] Imobilizacija jednog ili više antitela za SDMA na uređaju ili čvrstoj podlozi se izvodi tako da se ta antitela ne isperu uzorkom, diluentom i/ili postupcima ispiranja. Jedno ili više antitela se može pričvrstiti na površini fizičkom apsorpcijom (tj., bez upotrebe hemijskih veznika) ili hemijskim vezivanjem (tj., sa korišćenjem hemijskih veznika). Hemijsko vezivanje može da generiše jače pričvršćivanje antitela na površinu i da obezbedi definisanu orijentaciju i konformaciju molekula vezanih za površinu.
[0073] U drugom primeru izvođenja, SDMA antitela uvedena kod određenih vrsta se vezuju za čvrstu podlogu interakcijom sa anti-vrstama antitela koje se vezuje za podlogu. U jednom određenom aspektu, anti-SDMA antitela se uvode kod zečeva, a podloga se shodno tome vezuje za antitelo anti-zeca koje prepoznaje anti-SDMA antitelo uvedeno kod zečeva. U ovom aspektu, antitelo može biti u obliku antiseruma dobijenog od tih vrsta. Anti-SDMA antitela se mogu primeniti ili na čvrstu fazu koja ima antitelo anti-vrsta pre dodavanja uzorka u čvrstu fazu, ili se anti-SDMA antitela mogu mešati sa uzorkom pre dodavanja uzorka čvrstoj fazi. U svakom slučaju, anti-SDMA antitela postaju vezana za čvrstu fazu putem vezivanja za antitelo anti-vrste na čvrstoj fazi.
[0074] U drugom primeru izvođenja, jedno ili više obeleženih antitela može da se meša kao ispitivani uzorak pre nanošenja mešavine na čvrstu podlogu. U ovom slučaju, SDMA analog se može pričvrstiti na čvrstu podlogu tako da se analog ne ispere uzorkom, diluentom i/ili postupcima pranja. Obeležena antitela u uzorku se vezuju za SDMA u uzorku i, prema tome, nisu dostupna za vezivanje sa SDMA analogom na čvrstoj podlozi. Nakon nanošenja mešavine na čvrstu podlogu, i odgovarajuće inkubacije, ta mešavina se ispere iz čvrste podloge. Antitela koja ne moraju da se vezuju za uzorak SDMA se vezuju za SDMA analog na čvrstoj podlozi. Prisustvo ili količina SDMA u uzorku je obrnuto proporcionalno količini antitela koje je postalo vezano za SDMA analog. Signal povezan sa oznakom na antitelu se može izmeriti odgovarajućim postupkom.
[0075] FIG.1 prikazuje poređenje ELISA postupka za otkrivanje SDMA u prikupljenim psećim serumima sa dodatkom SDMA i detekcije SDMA upotrebom masene spektroskopije. Kako je prikazano, vrednosti koncentracije SDMA dobijene korišćenjem ovde opisanog ELISA postupka su u jakoj korelaciji sa vrednostima dobijenim korišćenjem MS.
[0076] Detekcija antitela: antigen kompleksi se mogu ostvariti raznim tehnikama dobro poznatim u tehnici, kao što je, na primer, turbidimetrija, enzimatsko obeležavanje, radiološko obeležavanje, luminescencija, ili fluorescencija. Metodologije imunološkog ogleda su poznate i običnim stručnjacima iz tehnike i smatra se da uključuju, ali bez ograničenja, radioinumološki ogled (RIA), enzimske imuno oglede (EIA), fluorescentno polarizacione imuno oglede (FPIA), mikročestične enzimske imuno oglede (MEIA), oglede sa tehnologijama multipliciranih imunoenzimskih ogleda (EMIT), imunoturbidometrijske ogleda ili oglede aglutinacije, imunološke oglede zasnovane na koloidalnom zlatu uključujući uređaje za lateralni protok i hemijsko-iluminiscentnte magnetne imunološke oglede (CMIA). Kod RIA, antitelo ili antigen je obeležen radioaktivnošću i koristi se u kompetitivnom ili nekompetitivnom formatu. Kod EIA, antitelo ili antigen je obeležen sa enzimom koji pretvara supstrat u proizvod što za rezultat ima signal koji se meri, kao što je promena boje. Kod FPIA, antigen je obeležen sa fluorescentnom oznakom i takmiči se sa neobeleženim antigenom predstavnika vrste. Količina izmerenog analita je obrnuto proporcionalna količini izmerenog signala. Kod MEIA, čvrsta faza mikročestica je obložena sa antitelima nasuprot antigena interesa i upotrebljena je da uhvati analit. Antitelo za detekciju je obeleženo sa enzimom kao kod EPI postupka. Koncentracija izmerenog analita je proporcionalna količini izmerenog signala. Kod CMIA, hemijsko-iluminiscentna oznaka je konjugovana u antitelo ili antigen, i proizvodi svetlo kada se kombinuje sa svojim supstratom. CMIA se može konfigurisati u kompetitivni ili nekompetitivni format, i dati rezultate koji su obrnuto ili direktno proporcionalni količini prisutnog analita, tim redom.
[0077] Upotreba test traka impregniranih reagensom u ogledima specifičnog vezivanja je takođe dobro poznata. Kod takvih postupaka, ispitivani uzorak se nanosi na jedan deo test trake i onda se ostavi da migrira ili da se apsorbuje putem materijala trake. Na taj način, detektovan ili izmeren analit prolazi kroz ili duž materijala, moguće uz pomoć eluirajućeg rastvarača koji može biti i sam ispitivan uzorak ili odvojeno dodati rastvor. Analit migrira u zonu hvatanja ili detekcije na test traci, gde je komplementarni član vezivanja analita imobilisan. Nivo do kog analit postaje vezan u zoni detekcije se može odrediti uz pomoć konjugata koji se takođe može inkorporisati u test traku ili koji se može odvojeno naneti. U jednom primeru izvođenja, antitelo specifično za SDMA se imobiliše na čvrstoj podlozi na različitoj lokaciji. Nakon dodavanja uzorka, detekcija kompleksa SDMA-antitela na čvrstoj podlozi može na bilo koji način biti poznata u tehnici. Na primer, U.S. Patent No.5,726,010, primer uređaja za lateralni protok, SNAP® Uređaj za imunološki ogled (IDEXX Laboratories).
[0078] Ostale tehnologije za detekciju koriste magnetne čestice ili mikroperle, na primer, polimerne perle impregnirane superparamagnetnim gvožđe oksidom. Ove perle su povezane sa, na primer, specifičnim partnerom za vezivanje za analit. Perle se vezuju sa ciljnim analitima u uzorku koji se ispituje i zatim se obično magnetom izoluju ili izdvoje iz rastvora. Kada dođe do izolacije, mogu se sprovesti druga ispitivanja, koja uključuju posmatranje određenih slika ili obeležja, bilo da je direktno optički ili pomoću kamere.
[0079] U daljim primerima izvođenja, SDMA analozi, određenije oni koji sadrže -tiol, hidroksil-, amino-, --karboksilat, koji omogućuju da SDMA bude povezan sa drugim molekulom (konjugovanim ciljem), kao što je aktivirani protein, kako bi se formirao SDMA konjugat. SDMA analozi opisani ovde omogućavaju da SDMA bude povezan sa ciljem konjugacije kao što je protein, polipeptid, detektabilna oznaka, čvrsta podloga, i slično kako bi se obezbedio SDMA konjugat. SDMA konjugati opisani ovde se mogu koristiti kako bi se proizvela antitela za upotrebu u imunološkim ogledima specifičnim za SDMA. Antitela malo, ili uopšte ne reaguju sa argininom, ADMA, i/ili monometilargininom. SDMA analozi takođe mogu biti konjugovani sa oznakom za upotrebu u imunološkim ogledima specifičnim za SDMA.
[0080] SDMA analozi mogu da imaju, na primer, sledeće strukture:
u kojima x i y predstavljaju celine koje su u opsegu od 1 do 5.
[0081] U skladu sa jednim primerom izvođenja, SDMA analozi imaju sledeću opštu formulu:
u kojoj R1može biti tiol (ili zaštićeni tiol), hidroksil (ili zaštićeni hidroksil), amino (ili zaštićena amino) grupa, ili karboksilat (koji uključuje karboksilnu kiselinu) ili zaštićenu grupu karboksilata.
[0082] Prikladni tiol, hidroksil, amino, i karboksilat zaštitničke grupe su poznate stručnjacima kao što su one opisane, na primer, u T.W. Greene, et al. Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd ed. (1999).
[0083] U jednom određenom primeru izvođenja, SDMA analog predstavlja jedinjenje formule (3):
ili njegovu so. Jedinjenje formule (3) obezbeđuje dostupan tiol koji može da reaguje sa ciljem konjugacije koji uključuje odgovarajuće "tiol-reaktivno-mesto," tj., mesto koje reaguje sa grupom tiola. Na primer, maleimidi, alkil i aril halidi, i alfa-haloackili predstavljaju ilustrativna tiol-reaktivna mesta koja mogu da reaguju sa tiolima kako bi se formirali tio-etri. Slično, piridil disulfidi mogu da reaguju sa tiolima kako bi se formirali mešani disulfidi.
[0084] U drugom primeru izvođenja, R1je X-R2, u kojem X predstavlja -S-, -O-, -N-, ili, -COO- a R2je oznaka koja ima tiol, hidroksil, amino, ili karboksilat reaktivnu grupu.
[0085] U jednom primeru izvođenja, R1je X-R2, u kojem X predstavlja -S-, -O-, -N-, ili, -COO-a R2je protein koji je funkcionalizovan kako bi uključio tiol, hidroksil, amino, ili karboksilat reaktivnu grupu.
[0086] U jednom primeru izvođenja, SDMA je konjugovan u nosača proteina kako bi se formirao "nosač heptana" imunogen koji može da se koristi kako bi se stimulisao imunološki odgovor na epitop koji uključuje SDMA. Primeri imunogenskih proteina uključuju, ali se ne ograničavaju na, BSA, KLH, i ovalbumin. Protokoli za heptane koji se konjuguju u proteine su poznati u tehnici (videti, npr., Antibodies: A Laboratory Manual, E. Harlow and D. Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory (Cold Spring Harbor, NY, 1988) pp.78-87).
[0087] U jednom primeru izvođenja, SDMA analog je konjugovan u protein aktiviran od strane maleimida, kao što je, na primer, protein hemocijanina iz prilepka aktiviran od strane maleimida (KLH) ili goveđi serum albumina aktiviran od strane maleimida (BSA).
[0088] U jednom primeru izvođenja, jedinjenje formule (3) je konjugovano u protein aktiviran od strane maleimida, kao što je, na primer, protein hemocijanina iz prilepka aktiviran od strane maleimida (KLH) ili goveđi serum albumina aktiviran od strane maleimida (BSA).
[0089] Na taj način, u specifičnom primeru izvođenja, konjugat jedinjenja formule (3) i protein koji je aktiviran od strane maleimida imaju formulu:
u kojoj m predstavlja ceo broj.
[0090] Obično, m je veća od 5. Međutim, vrednost za m je varijabilna. Na primer, m je oko 15 grupa maleimida po proteinu u BSA aktiviranom od strane maleimida komercijalno dostupnog od Sigma-Aldrich of St. Louis, MO; m je oko 80 grupa maleimida po proteinu u KLH aktiviranom od strane melaimida komercijalno dostupnog od Sigma-Aldrich; m je u opsegu od oko 15 do oko 25 grupa maleimida po proteinu u BSA aktiviranom od strane maleimida komercijalno dostupnog od Thermo Scientific Pierce Protein Research Products of Rockford, IL; m je veća od oko 400 grupa maleimida po proteinu u KLH aktiviranom od strane proteina komercijalno dostupnog od Thermo Scientific Pierce Protein Research Products; i m je u opsegu od oko 150 do oko 300 grupa maleimida po proteinu u KLH aktiviranom od strane maleimida komercijalno dostupnog od A. G. Scientific of San Diego, CA.
Generalno, m je ograničen brojem dostupnih amino grupa prisutnih u imunogenskom proteinu. Broj dostupnih amina se može uvećati konjugovanjem imunogenskog proteina u poliamine.
[0091] U jednom primeru izvođenja, PROTEIN je BSA a m je veća od oko 5. U jednom primeru izvođenja, PROTEIN je BSA a m je veća od oko 10. U jednom primeru izvođenja, PROTEIN je BSA a m je veća od oko 25. U jednom primeru izvođenja, PROTEIN je BSA a m je veća od oko 50. U jednom primeru izvođenja, PROTEIN je BSA a m je veća od oko 75. U jednom primeru izvođenja, PROTEIN je BSA a m je u opsegu od od oko 5 do oko 80. U jednom primeru izvođenja, PROTEIN je BSA a m je veća od oko 75. U jednom primeru izvođenja, PROTEIN je BSA a m je u opsegu od oko 10 do oko 80. U jednom primeru izvođenja, PROTEIN je BSA a m je veća od oko 75. U jednom primeru izvođenja, PROTEIN je BSA a m je u opsegu od oko 20 do oko 80. U jednom primeru izvođenja, PROTEIN je BSA a m je veća od oko 75. U jednom primeru izvođenja, PROTEIN je BSA a m je u opsegu od oko 30 do oko 80.
[0092] U jednom primeru izvođenja, PROTEIN je KLH, a m je veća od oko 5. U jednom primeru izvođenja, PROTEIN je KLH, a m je veća od oko 50. U jednom primeru izvođenja, PROTEIN je KLH, a m je veća od oko 100. U jednom primeru izvođenja, PROTEIN je KLH, a m je veća od oko 200. U jednom primeru izvođenja, PROTEIN je KLH, a m je veća od oko 300. U jednom primeru izvođenja, PROTEIN je KLH, a m je veća od oko 400. U jednom primeru izvođenja, PROTEIN je KLH, a m je veća od oko 500. U jednom primeru izvođenja, PROTEIN je KLH, a m je veća od oko 600. U jednom primeru izvođenja, PROTEIN je KLH, a m je veća od oko 700. U jednom primeru izvođenja, PROTEIN je KLH, a m je veća od oko 800. U jednom primeru izvođenja, PROTEIN je KLH, a m je u opsegu od oko 5 do oko 800. U jednom primeru izvođenja, PROTEIN je KLH, a m je u opsegu od oko 5 do oko 600. U jednom primeru izvođenja, PROTEIN je KLH, a m je u opsegu od oko 5 do oko 400. U jednom primeru izvođenja, PROTEIN je KLH, a m je u opsegu od oko 5 do oko 200. U jednom primeru izvođenja, PROTEIN je KLH, a m je u opsegu od oko 5 do oko 100. U jednom primeru izvođenja, PROTEIN je KLH, a m je u opsegu od oko 100 do oko 200. U jednom primeru izvođenja, PROTEIN je KLH, a m je u opsegu od 100 do oko 300. U jednom primeru izvođenja, PROTEIN je KLH, a m je u opsegu od oko 100 do oko 400. U raznim aspektima, PROTEIN je KLH, a m je u opsegu od oko 100 do oko 500, oko 100 do oko 600, oko 100 do oko 700, oko 100 do oko 800, ili oko 100 do oko 1,000.
[0093] Konjugat jedinjenja formule (3) i protein aktiviran od strane maleimida mogu biti okarakterisani upotrebom postupaka dobro poznatih stručnjacima (videti, na primer, Sigma-Aldrich Technical Bulletin for Maleimide Activated BSA, KLH Conjugation Kit (kataloški br. MBK1)).
[0094] U alternativnom primeru izvođenja, SDMA analog je povezan sa detektabilnom oznakom putem tiola, hidroksila, amino, ili karboksilat grupe. Oznaka može biti detektabilna sama po sebi (npr., radioizotpone oznake, hemiluminescentna boja, elektrohemijske oznake, helati metala, čestice lateksa, ili fluorescentne oznake) ili, u slučaju enzimatskih oznaka, može katalizovati hemijsku izmenu jedinjenja ili kompozicije supstrata koja je detektabilna (npr., enzimi kao što je peroksidaza rena, alkalinska fosfataza, i slično). Oznaka može biti molekul specifičnog vezivanja koji sam po sebi može biti detektabilan (npr., biotin, avidin, streptavidin, digoksigenin, maltoza, oligohistidin, 2, 4-dinitrobenzen, fenilarsenat, ssDNA, dsDNA, itd.). SDMA može biti povezan sa detektabilnom oznakom upotrebom postupaka poznatih stručnjacima u tehnici. Kao ilustrativan primer, SDMA analog se može povezati sa peroksidazama aktiviranim od strane maleimida, od liofiziranog rena u prahu, veća od oko 200 jedinica/mg proteina (komercijalno dostupnih od Sigma-Aldrich St. Louis, MO (kataloški br. P1709) prema smernicama datim u uputstvu za korisnika).
[0095] Analog formule (3) može biti pripremljen od SDMA (komercijalno dostupnog od EMD Chemicals Inc. of Gibbstown, NJ) po sledećoj ilustrativnoj sintetičkoj šemi (1):
[0096] Primarne i sekundarne amino grupe SDMA su zaštićene reagovanjem SDMA sa di-tertbutlldikarbonatom (Boc2O). Dobijeni tert-butoksikarbonil (BOC) zaštićen SDMA ((Boc3)-SDMA, 1) se zatim povezuje sa smolom. Na primer, (Boc3)-SDMA (1) se može povezati sa cisteamin-4-metoksi tritil smolom (komercijalno dostupnom od EMD Chemicals, Inc. of Gibbstown, NJ) dovođenjem u kontakt (Boc3)-SDMA (1) sa smolom u prisustvu 2-(1H-7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil uranijum heksafluorofosfat metanaminijuma (HATU) i N,N-diizopropiletilamina (DIPEA) u dimetil formamidu (DMF) kako bi se obezbedila smola vezana za (Boc3)-SDMA cistamid (2). Grupe koje štite BOC na vezi smola (Boc3)-SDMA cistamid (2) se uklanjaju i dobijeni cistamid vezan sa SDMA se ocepi od smole, upotrebom, na primer, trifluoroacetične kiseline u dihlorometanu, kako bi se obezbedio SDMA cistamid (3), koji se pretvara u so hlorovodonika (4) reakcijom sa hlorovodoničnom kiselinom.
[0097] Analozi formule A-D, opisani gore iznad, se mogu napraviti korišćenjem sličnih metodologija kako je opisano u Šemi 1.
[0098] Protein aktiviran od strane maleimida zatim može da reaguje sa SDMA cistamidom (3) kako bi se dobio SDMA konjugat proteina cistamida kako je opisano u nastavku u Šemi II:
u kojem n predstavlja ceo broj koji je u opsegu od 1 do 3 a m predstavlja ceo broj kako je gore definisano.
[0099] Dobijeni konjugat može da se prečisti upotrebom postupaka poznatih stručnjacima u tehnici koji uključuju, ali bez ograničenja, hromatografiju sa kolonom, na primer, upotrebu hromatografije sa gelfiltracionom kolonom sa Sephadex (na primer, Sephadex G-25M) kao čvrstom podlogom (komercijalno dostupnom od Sigma-Aldrich).
[0100] Konjugati analoga A-D mogu da se naprave upotrebom sličnih metodologija kako je opisano u Šemi 2.
[0101] Konjugat analoga formule A-D i KLH aktiviranog od strane maleimida ili BSA aktiviranog od strane maleimida se može koristiti kao imunogen za generisanje antitela koji se suštinski vezuje za SDMA (tj., anti-SDMA antitela) i ne pokazuje ili suštinski ne pokazuje unakrsnu reaktivnost sa ADMA, L-argininom, i/ili N-metilargininom. Konjugat analoga formule (3) i KLH aktiviran od strane maleimida ili BSA aktiviran od strane maleimida se mogu koristiti kao imunogen za generisanje antitela koja se suštinski vezuju za SDMA (tj., anti-SDMA antitela). Takva antitela ne pokazuju ili suštinski ne pokazuju ukrštenu reaktivnost sa ADMA, L-argininom, i/ili N-metilargininom.
[0102] Anti-SDMA antitela korisna u postupcima, uređaje i komplete ovog opisa karakteriše visok afinitet vezivanja za SDMA sa malo ili bez unakrsne reaktivnosti sa ADMA, argininom, i/ili monometilargininom. Shodno tome, u ovom tekstu su opisana izolovana, rekombinantna, sintetička, i/ili in vivo-proizvedena anti-SDMA antitela, kao i postupci pravljenja i korišćenja takvih antitela, koji uključuju dijagnostičke i terapeutske kompozicije, postupke, i uređaje. Anti-SDMA antitela opisana ovde su korisna, na primer, kao dijagnostički marker za bubrežnu funkciju, kao što je oštećenje bubrega, bubrežna insuficijencija, brzina glomerularne filtracije (GFR), inulin klirens, i kreatinin klirens, i za poremećaje/bolesti bubrega, kao što je hronična bolest bubrega, glomerulonefritis, dijabetička nefropatija, intersticijalni nefritis, policistična bolest bubrega, i hipertenzivna bolest bubrega.
[0103] U jednom primeru izvođenja, generisana antitela mogu da detektuju slobodan SDMA (tj., SDMA koji ne čini deo polipeptidnog lanca) i da ne pokazuju ili suštinski da ne pokazuju reaktivnost sa ADMA, L-argininom, i/ili N-metilargininom. Kako je prikazano u primerima, antitela opisana ovde pokazuju manje od 1% ukrštene reaktivnosti sa ADMA, L-argininom i/ili N-metilargininom, na osnovu jednakih koncentracija antigena. Kako je generalno zastupljeno mišljenje u tehnici, uticaj unakrsne reaktivnosti zavisi od relativnog mnoštva antigena koji su sposobni za unakrsno reagovanje (npr., ADMA, L-arginin i/ili N-metilarginin) u poređenju sa imunizujućim antigenom (SDMA) u ispitivanom uzorku. Na primer, unakrsna reaktivnost visoka do 50% može biti prihvatljiva ukoliko je koncentracija imunizujućeg antigena 100 puta veća od koncentracije antigena koji je sposoban za unakrsno reagovanje. Shodno tome, uticaj unakrsne reaktivnosti se mora sagledavati u kontekstu relativnog mnoštva bilo kojih antigena sposobnih za unakrsno reagovanje i imunizirajućeg gena, u uzorku koji je potrebno analizirati. U različitim aspektima ovog opisa, ukrštena reaktivnost ne utiče na suštinsko vezivanje SDMA ili SDMA analoga za anti-SDMA antitelo.
[0104] Postupci za pravljenje antitela mogu da uključe jedan ili više SDMA konjugata kao što je imunogen kako bi se stimulisao imunološki odgovor. Postupci uključuju davanje jednog ili više SDMA konjugata životinjama upotrebom adekvatnog protokola imunizacije, i odvajanjem odgovarajućeg antitela od telesn(e)ih tečnosti životinja, kako je opisano, na primer, u primeru 3, infra. Alternativno, SDMA konjugati se mogu koristiti u postupcima prikazivanja faga kako bi se odabrao fag koji će na njihovim površinama prikazivati odgovarajuće antitelo, nakon čega će uslediti razdvajanje sekvenci nukleinske kiseline koja kodira najmanje varijabilni region domena odgovarajućeg antitela. Postupci za prikazivanje faga su dobro poznati stručnjacima u tehnici. (videti, na primer, Antibody Phage Display; Methods in Molecular Biology, Vol.178, O’Brien, Philippa M.; Aitken, Robert (Eds.) 2002). Monoklonalna antitela SDMA se mogu pripremiti primenom postupaka generalno poznatih u tehnici.
[0105] SDMA analozi opisani u ovom tekstu mogu biti povezani sa oznakom da bi se obezbedio detektabilni konjugat za upotrebu u ogledima vezivanje receptora, kao što su imunološki ogledi za SDMA. Slično, anti-SDMA antitela mogu biti povezana sa oznakom kako bi se obezbedila detektabilna anti-SDMA antitela za upotrebu u ogledima vezivanja receptora kao što su imunološki ogledi za SDMA. SDMA analozi i anti-SDMA-antitela mogu biti povezana sa oznakom upotrebom postupaka koji su dobro poznati stručnjacima. Npr., Immunochemical Protocols; Methods in Molecular Biology , Vol.295, edited by R. Burns (2005)). Detektabilan SDMA konjugat ili detektabilna anti-SDMA antitela se mogu koristiti u raznim homogenim, sendvič, kompetitivnim, ili ne-kompetitivnim formatima ogleda, za generisanje signala koji je povezan sa prisustvom ili količinom SDMA u ispitivanom uzorku.
[0106] U specifičnom primeru izvođenja, metodologije imunološkog ogleda predstavljaju kompetitivne imunološke oglede za detekciju anti-SDMA antitela. Kompetitivni imunološki ogled može da se sprovede na sledeći ilustrativni način. Uzorak, iz životinjske telesne tečnosti, koji potencijalno sadrži anti-SDMA antitela, kontaktira sa SDMA analogom konjugovanim u čvrstu podloga i sa anti-SDMA antitelom konjugovanim u detektibilnu oznaku. Anti-SDMA antitela interesa, prisutna u uzorku, ulaze u kompeticiju sa anti-SDMA antitelom konjugovanim u detektabilnu oznaku radi vezivanja sa SDMA analogom konjugovanim u čvrstu podlogu. Količina oznake povezane sa čvrstom podlogom se može odrediti nakon razdvajanja nevezanih antitela i čvrste podloge. U alternativnom primeru izvođenja, kompetitivni imunološki ogled se izvodi na sledeći ilustrativni način. Uzorak, iz životinjske telesne tečnosti, koji potencijalno sadrži anti-SDMA antitela, kontaktira sa SDMA analogom povezanim sa detektabilnom oznakom a zatim sa antitelom konjugovanim u čvrstu podlogu. Anti-SDMA antitela u uzorku ulaze u kompeticiju sa anti-SDMA antitelom na čvrstoj podlozi za vezivanje sa SDMA konjugatom povezanim sa detektabilnom oznakom. U svakom slučaju, dobijeni signal je obrnuto povezan sa količinom SDMA antitela interesa prisutnog u uzorku.
[0107] Naravno, drugi postupci merenja slobodnog SDMA se mogu koristiti u postupcima opisanim ovde. SDMA sam po sebi može da predvidi bolest (videti Figs.2 i 3).
[0108] Koncentracija kreatinina u serumu se može izmeriti na različite načine, kao što je poznato stručnjaku u tehnici. Na primer, Catalyst Dx™ Chemistry Analyzer ili a VetTest® Chemistry Analyzer se mogu koristiti kao suvi slajdovi prilagođeni testu za kreatinin, na primer, oni komercijalno dostupni od IDEXX Laboratories. Drugi analizatori i slajdovi, kao što su VITROS® 950 analizator i VITROS® CREA slajdovi dostupni od Ortho Clinical Diagnostics, se takođe mogu koristiti. Enzimatski vlažni ogledi se takođe mogu koristiti. Na primer, stručnjak može da koristi enzimatski vlažni hemijski postupak na Integra 800 analizatoru. Jedan određeni ogled se zasniva na sistemu kreatininaze/kreatinaze/sarkosinoksidaze sa detekcijom na 552 nm i absorbancom slepe probe na 659 nm. Stručnjak iz tehnike takođe može da koristi kolorimetrijske postupke, na primer, one zasnovane na pikratu kao što je Jaffe ogled. Drugi postupci poznati stručnjaku iz tehnike, kao što su oni opisani u U.S. Patent Publication no.2005/0266574 i U.S. Patent no.4,818,703, se takođe mogu koristiti za merenje koncentracije kreatinina. U određenim primerima izvođenja, merenje koncentracije kreatinina se izvodi korišćenjem masene spektrometrije sa razblaženjem izotopa.
[0109] Nekoliko postupaka određivanja GFR je poznato. Na primer, GFR se može odrediti kao klirens bubrega od<125>I-iotalamata, kako je opisano u Perrone et al., Am. J. Kidney Disease, vol.16, pp 224-35 (1990) and Levey et al., J. Am. Soc. Nephrol., vol.4, pp.1159-71 (1993). Drugi postupci koji se zasnivaju na sakupljanju urina se takođe mogu koristiti, uključujući merenje klirensa bubrega drugih egzogenih supstanci, npr.<51>Cr-EDTA,<99>Tc-DTPA, joheksol, ili inulin. GFR vrednosti dobijene bilo kojim od ovih postupaka mogu biti u korelaciji sa obrnutim proizvodom koncentracija kreatinina i slobodnog SDMA za uzorke sakupljene u otprilike isto vreme kako bi se obezbedila kalibraciona kriva i standardne vrednosti za upotrebu u postupcima opisanim u ovom tekstu.
[0110] Ono što sledi je dato samo kao primer.
PRIMERI
Primer 1: Sinteza SDMA cistamida (3) i SDMA cistamida hlorovodonične soli (4)
[0111] SDMA cistamid (3) se priprema u skladu sa putem sinteze opisanim u Šemi 1.
[0112] (BOC)3-SOMA (1): Rastvoru od 4.36 g (20 mmol) di-tert-butildikarbonata (Boc2O) u 20 mL dioksana se u kapima dodaje u 550 mg (2.0 mmol) N,N-dimetilarginina dihidrohlorida (SDMA) (komercijalno dostupnog od EMD Chemicals Inc. of Gibbstown, NJ) rastvorenog u 10 mL 5.0 N NaOH tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi uz mešanje. Dobijena reakciona mešavina se meša preko noći.
30 mL dihlorometana (DCM) i 30 mL vode se dodaje reakcionoj mešavini i pH se podesi na 6.5 sa sirćetnom kiselinom (AcOH). Sloj DCM se razdvoji, opere sa fiziološkim rastvorom, i osuši bezvodnim Na2SO4. DCM se zatim ukloni pod smanjenim pritiskom kako bi se dobila čvrsta materija. Dobijena čvrsta materija se opere 2 puta sa 10 mL heksana. Čvrsta materija se zatim osuši pod vakuumom kako bi se dobilo 800 mg svetlo žute čvrste materije. Naknadne reakcije nisu zahtevale dalje prečišćavanje. Ta čvrsta materija je okarakterisana masenom spektroskopijom. ESI-MS: 525.7 (M Na)<+>, 503.6 (M 1)-, 403.5 (M - Boc 1)-, 303.5 (M - 2Boc 1)-.
[0113] (Boc)3-SDMA-cistamin-smola (2): Mešavini od 600 mg (1.2 mmol) (Boc)3-SDMA (1) i 627 mg (1.6 mmol) 2-(1H-7-Azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil uronium heksafluorofosfat metanaminiuma (HATU) u 15 mL dimetilformamida (DMF) se dodaje 420 µL (2.4 mmol) N,N-diizopropiletilamina (DIPEA). Dobijena mešavina se zatim meša 20 minuta pod atmosferom suvog N2. Nezavisno od toga, cistamin 4-metoksi tritil smola (1.0 g) (komercijalno dostupna od EMD Chemicals, Inc. of Gibbstown, NJ) bubri i pere se koristeći DMF. Nabubrena smola se zatim dodaje reakcionoj mešavini i reakciona mešavina se nežno promućka pod atmosferom N2 tri sata. Smola se zatim sakupi filtracijom, opere prvo sa 5 mL DMF, zatim sa 5 mL metanola, i sa 5 mL DCM.
[0114] SDMA-cistamid (3): Modifikovanoj smoli se dodaje 15 mL 90% trifluorosirćetne kiseline (TFA), dobijena mešavina se nežno promućka dva sata, i filtrira se. Smola se dva puta ispere sa 3 mL TFA/DCM (1:1 (v/v)). Filtrat i isplake se kombinuju i dodaju u 200 mL hladnog etra kako bi se dobio talog. Dobijeni talog se sakupi centrifugom i osuši se pod smanjenim pritiskom da bi se dobilo 300 mg SDMA-cistamida (3). SDMA-cistamid (3) je okarakterisan masenom spektroskopijom. EIS-MS: 262.4 (M 1)+, 132.0 (M 2)+.
[0115] SDMA-cistamid hlorovodonična so (4): SDMA-cistamid 3 (300 mg) se rekonstituiše u 5 mL 1.0 N HCl i dobijena mešavina se liofizira kako bi se dobila svetlo žuta čvrsta materija u obliku pene.
[0116] Isti opšti postupak kao ovaj prethodno opisani se može koristiti za pripremu drugih SDMA analoga.
Primer 2: Konjugacija SDMA cistamida (3) sa proteinom aktiviranim od strane maleimida
[0117]
A. Opšti postupak za konjugovanje SDMA cistamida (3) sa KLH-om aktiviranim od strane maleimida:
1. Polako se otvori fiola KLH-a aktiviranog od strane maleimida (komercijalno dostupnog od Sigma-Aldrich St. Louis, MO (kataloški br. K0383)) kako bi se otpustio vakuum.
2. Rekonstituiše se sadržaj fiole sa 1 mL vode da bi se dobilo 5 mg/mL rastvora KHL-a aktiviranog od strane maleimida u 20 mM pufera natrijum fosfata sa 230 mM NaCl, 2 mM EDTA, i 80 mM saharoze, pH 6.6.
3. Pripremi se rastvor pufera za konjugaciju od 20 mM pufera natrijum fosfata sa 100 mM EDTA i 80 mM saharoze, pH 6.6 se podesi rekonstituisanjem pufera za konjugaciju (komercijalno dostupan od Sigma-Aldrich St. Louis, MO (kataloški br. C3957)) sa 10 mL vode.
4. Rastvori se približno 0.8 mg haptena (tj., SDMA cistamid (3)) u 0.5 mL pufera za konjugaciju. Zadrži se 50 µl dobijenog peptidnog rastvora radi određivanja efikasnosti kuplovanja (hapukupno). Zadržan rastvor haptena se čuva na 2-8 °C.
5. Rastvor haptena iz faze 4 se odmah meša sa rastvorom KLH-om aktiviranim od strane maleimida iz faze 2 u reakcionoj fioli opremljenoj sa štapićem za mešanje. Dobijena mešavina se degasira prilikom mešanja pod blagim mlazom azota oko 1-2 minuta.
6. Reakciona fiola se zatvori i mešanje se nastavi na sobnoj temperaturi 2 sata ili preko noći na 2-8 °C.
7. 100 µl konjugacione reakcije iz faze 6 (hap-slobodan) se zadržava za određivanje efikasnosti kuplovanja.
B: Opšti postupak za konjugovanje SDMA cistamida (3) sa BSA aktiviranim od strane maleimida:
1. Polako se otvori fiola BSA aktiviranog od strane maleimida (komercijalno dostupnog od Sigma-Aldrich St. Louis, MO (kataloški br. B7542)) kako bi se otpustio vakuum.
2. Rekonstituiše se sadržaj fiole sa 1 mL vode da bi se dobilo 5 mg/mL rastvora BSA aktiviranog od strane maleimida u 20 mM pufera natrijum fosfata sa 230 mM NaCl, 2 mM EDTA, i 80 mM saharoze, pH 6.6.
3. Rastvori se 5 mg haptena (tj., SDMA cistamida (3)) u 0.5 mL pufera za konjugaciju (pripremi se kako je prethodno opisano u fazi A3). Zadrži se 50 µl dobijenog peptidnog rastvora radi određivanja efikasnosti kuplovanja (hap-ukupno). Zadržan rastvor haptena se čuva na 2-8 °C.
4. Rastvor haptena iz faze 3 se odmah meša sa rastvorom BSA aktiviranim od strane maleimida iz faze 2 u reakcionoj fioli opremljenoj sa štapićem za mešanje. Dobijena mešavina se degasira prilikom mešanja pod blagim mlazom azota oko 1-2 minuta.
5. Reakciona fiola se zatvori i mešanje se nastavi na sobnoj temperaturi 2 sata ili preko noći na 2-8 °C.
6. 100 µl konjugacione reakcije iz faze 5 (hap-slobodan) se zadržava radi određivanja efikasnosti kuplovanja.
C: Izolovanje KLH ili BSA konjugata:
1. Rastvori se sadržaj pakovanja slanog rastvora puferovanog fosfatom (PBS) (komercijalno dostupnog od Sigma-Aldrich St. Louis, MO (kataloški br. P3813)) u 1 litru vode.
2. Sephadex G-25M gel filtraciona kolona (komercijalno dostupna od Sigma-Aldrich St. Louis, MO (kataloški br. B4783)) se nasloni preko čaše.
3. Ukloni se poklopac sa vrha kolone, preseče se niži vrh kolone, i pusti se da višak tečnosti prođe. Ne sme se dozvoliti da kolona u radu bude suva.
4. Kolona se ekvilibriše sa 30 mL PBS-a.
5. Reakciona mešavina iz primera 2A ili 2B se nanosi na kolonu.
6. Kolona se eluira sa PBS-om, upotrebom ukupne zapremine od oko 10 mL i sakupe se frakcije od oko 0.5-1.0 mL. Prisustvo proteina u frakcijama se prati merenjem abosrbance svake frakcije na 280 nm.
7. Kombinuju se frakcije koje sadrže protein. Na FIG.4 je dat grafički prikaz apsorpcije nasuprot broja frakcija ilustrativnog profila eluiranja za proteine KLH (◆) i BSA (■).
8. Frakcije koje sadrže protein se podele u male alikvore koji se čuvaju zamrznuti na -20°C. D. Ogled za određivanje efikasnosti kuplovanja:
1. Ispitivanje standarda cisteina – Kako bi se procenila efikasnost kuplovanja analoga peptida cisteina, priprema se standardna kriva korišćenjem poznatih koncentracija cisteina. Ogled se zasniva na reakciji 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoične kiseline) (DTNB ili Elmanov reagens) koja reaguje sa sulfhidril grupama na pH 8.0 kako bi se dobio hromofor sa maksimalnom apsorpcijom na 412 nm. Prati se sledeći postupak:
a. Pripremi se pufer A DTNB rastvaranjem sadržaja fiole pufera DTNB (komercijalno dostupnog od Sigma-Aldrich St. Louis, MO (kataloški br. D4179) u 10 mL vode.
b. DTNB reagens (komercijalno dostupan od Sigma-Aldrich St. Louis, MO (kataloški br. D8130)) se zatim rastvori u 5 mL DTNB pufera iz faze a.
c. Neposredno pre upotrebe, pripremi se rastvor cisteina rastvaranjem 32 mg L-cistein hidrohlorid monohidrata (komercijalno dostupnog od Sigma-Aldrich St. Louis, MO (kataloški br. C7880)) u 1 mL vode. Dobijeni rastvor L-cistein hidrohlorida se serijski razblaži sa vodom kako bi se dobili osnovni rastvori u opsegu od 0.4-0.04 mg/mL.
Razblaženi osnovni rastvori se odmah upotrebljavaju.
d. Obeleženim epruvetama se dodaje 50 µL razblaženih osnovnih rastvora. Epruveta koja sadrži 50 µL vode se koristi kao slepa proba.
e. Svakoj epruveti se zatim dodaje 0,1 ml vode, 0.75 mL DTNB pufera, pH 8.0, i, odmah zatim, 0.1 mL DTNB rastvora reagensa (1 mg/mL) kako bi se dobio konačan rastvor za ispitivanje standarda cisteina sa zapreminom od 1 mL.
f. Pomešaju se sadržaji svake epruvete.
g. Absorbanca svakog rastvora za ispitivanje standarda cisteina se određuje na 412 nm. Ukoliko je absorbanca iznad 1.4, uzorci se razblaže a ispitivanje se ponovi.
h. Absorbanca na 412 nm se grafički prikazuje u zavisnosti od koncentracije cisteina (mg/mL) da bi se dobila standardna kriva. Linearni deo standardne krive, sa koncentracijom cisteina u opsegu od 2-20 µg/ml, se koristi za određivanje hap-ukupnog i hap-slobodnog.
2. Ispitivanje haptena - Napomena: ukoliko uzorci generišu vrednosti veće od najvišeg standarda cisteina u ispitivanju standarda cisteina, uzorci se razblaže i ispitivanje se ponovi.
a. Adekvatno obeleženim epruvetama se dodaje 50 µl sledećih rastvora:
(i) DTNB pufer (slepa proba)
(ii) razblaženi uzorak peptida (hap-ukupno, od KLH konjugacije, od faze A4 iz primera 2) (iii) hapten-KLH (hap-slobodan, od faze KLH konjugacije A7 iz primera 2)
(iv) razblažen uzorak peptida (hap-ukupno, od faze BSA konjugacije B3 iz primera 2) (v) hap-BSA (hap-slobodan, od BSA konjugacije, faza B6 iz primera 2)
b. Svakoj obeleženoj epruveti iz faze (a) se dodaje 0.1 mL vode, 0.75 mL DTNB pufera, pH 8.0, i, odmah, 0.1 ml DTNB rastvora reagensa (1 mg/mL), kako bi se dobio konačan rastvor za ispitivanje haptena od 1 mL.
c. Pomeša se sadržaj svake epruvete.
d. Absorbanca rastvora u svakoj obeleženoj epruveti se određuje na 412 nm. Ukoliko je absorbanca iznad 1.4, uzorci se razblaže a ispitivanje se ponovi.
e. Koncentracija hap-ukupnog se zatim odredi iz izmerene absorbance korišćenjem standardne krive dobijene kako je opisano prethodno u odeljku 1h. Absorbanca izmerena za epruvetu (ii) i epruvetu (iv) se koristi za određivanje hap-ukupnog za KLH i BSA, tim redom. Absorbanca izmerena za epruvetu (iii) i epruvetu (v) se koristi za određivanje hap-slobodnog za KLH i BSA, tim redom. Koncentracija peptida u nerazblaženom rastvoru i efikasnost kuplovanja se zatim izračunaju kako je opisano u odeljku izračunavanja.
3. Izračunavanja
[0118] Kako bi se procenile koncentracije peptida i efikasnost kuplovanja, standardna kriva se priprema upotrebom poznatih koncentracija cisteina kako je gore opisano (ispitivanje standarda cisteina). U ovom računanju, jedan mol cisteina je ekvivalentan jednom molu sulfhidrila koji sadrži hapten.
[0119] Koriste se sledeće formule
Hap (ukupno) = Peptid (Ukupno) µmole/ml
Hap (slobodan) = Peptid (slobodan) µmole/ml
Hap (konjugovan) = Hap (ukupno) - Hap (slobodan)
(Videti, takođe, Sigma-Aldrich Technical Bulletin for Maleimide Activated BSA, KLH Conjugation Kit (kataloški br. MBK1)). Ovaj isti opšti postupak kako je opisano u primerima 2A-D se može koristiti za merenje efikasnosti konjugacije drugih SDMA analoga KLH-a i BSA-a.
Primer 3: Postupak za generisanje anti-SDMA antitela
[0120] Protokol imunizacije za generisanje anti-SDMA antitela se sprovodi u skladu sa sledećim protokolom. Šest zečeva kalifornijske vrste je imunizovano sa SDMA-konjugatom. Tri od šest zečeva su imunizovano sa SDMA konjugovanim sa BSA (zečevi # 155, 156 i 157) a druga tri zeca su imunizovana sa SDMA konjugovanim sa KLH (zečevi # 152, 153 i 154) (pripremljeni kako je opisano u primeru 2). Za primarne imunizacije, svakom zecu je ubrizgano 0.5 mg SDMA konjugata u 1 ml fosfatnog puferovanog slanog rastvora (PBS) pomešanog sa 1 ml Freundovog adjuvansa. Svakom zecu se daje 20-30 intradermalnih injekcija u njihova obrijana leđa. Svaki zec je dobio dopusnsku dozu od 0.25 mg imunogena u 1 ml PBS-a pomešanog sa jednakom zapreminom Freundovog adjuvansa u zadnje noge. Te dopunske injekcije se daju svakog meseca nakon primarne injekcije. Test krvni uzorci od 5 ml se uzimaju od svakog zeca 7-10 dana nakon svake dopunske doze. Proizvodni krvni uzorci od 40 ml se uzimaju od svakog zeca nakon treće dopunske injekcije, kada je titer antiseruma veći od oko 1:2000. Titer antiseruma predstavlja razblaženje antiseruma koji generiše najstrmiju kalibracionu krivu za ispitivanje.
Primer 4: Karakterizacija anti-SDMA antitela
[0121] Kako bi se odredila specifičnost antitela dobijena putem postupaka opisanih u prethodnom primeru 3, njihova reaktivnost sa SDMA, ADMA, L-argininom, i/ili N-metilargininom se meri u kompetitivnom ELISA ogledu (Tabela 1).
[0122] ADMA-2HCl, SDMA-2HCl, N-metilarginin acetat (Sigma, Cat. No. M7033) ili L-arginin (Sigma, Cat. No. A5006) se svaki pojedinačno rastvori u PBS-u kako bi se napravili osnovni rastvori na 1 mg/ml. Od ovih osnovnih rastvora, pripreme se radne koncentracije od 100 µg/ml, 10 µg/ml i 1 µg/ml u PBS-u.
[0123] 50 µl SDMA-HRP konjugata (kako je opisano u primeru 5 u nastavku), 50 µl ADMA, SDMA, N-metilarginina ili L-arginina (u koncentracijama od 1-100 µg/ml kako je prethodno opisano), i 50 µl anti-SDMA antitela zeca u serumu (1:3000 titer) se naknadno dodaju u bazenčić pojedinca u polisirinsku mikroploču sa 96 bazenčića, prethodno obloženu sa anti-zečijim IgG ovce (komercijalno dostupnim od Beacon Analytical Systems Inc. of Portland, ME). Nakon perioda inkubacije od 30 minuta na sobnoj temperaturi, bazenčići se isperu 4 puta sa PBST-om (fosfatni puferovani slani rastvor, 0.05% Tween).
[0124] 100 µl 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (komercijalno dostupnog od Promega Corporation of Madison, WI) se naknadno dodaje. Nakon perioda inkubacije od 30 minuta na sobnoj temperaturi, dodaje se 100 µl stop rastvora (1 N HCl) i izmeri se absorbanca na 450 nm koristećei BioTek ELX 808 (Winooski, VT) čitač ploče. Podaci prolaze kvantifikaciju koristeći Softmax software (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
[0125] Vrednosti absorbance dobijene sa 0 µg/mL, 1 µg/mL, 10 µg/mL, i 100 µg/mL ADMA, SDMA, N-metilarginina ili L-arginina, tim redom ,se odrede i grafički prikažu. Koncentracija SDMA pri kojoj je vrednost aborbance smanjena 50% (u odnosu na maksimum absorbance dobijen na 0 µg/mL SDMA; tj. IC50) se podeli svakom koncentracijom ADMA, N-metilarginina ili L-arginina, tim redom, pri kojoj se vrednost absorbance smanjuje 50% (IC50). Dobijena vrednost se množi sa 100 kako bi se dobila vrednost "% unakrsne reaktivnosti". Tamo gde se smanjenje absorbance < 50% posmatra pri koncentracijama do i uključujući 100 µg/mL, primećena je unakrsna reaktivnost od <1% (videti Tabelu 1).
[0126] Kako je prikazano u Tabeli 1, svih 6 zečjih anti-SDMA seruma ima unakrsnu reaktivnost od <1% sa ADMA-om, N-metilargininom ili L-argininom, tim redom.
Tabela 1
[0127] Sličan eksperiment kao onaj opisan u Primerima 1-4, ali u kom se ADMA koristi pre nego SDMA, takođe generiše antitela. Upotreba ADMA-protein konjugata za generisanje antitela, međutim, proizvodi antitela koja nisu specifična za ADMA i nisu korisna u ogledu za merenje ADMA.
[0128] U drugom eksperimentu, upotrebom samo poliklonalnog antitela iz Zeca br.154, specifičnost antitela se određuje strožije gore opisanim postupkom. Ovi podaci (videti Tabelu 2) prikazuju da specifičnost za antitelo iz Zeca br.154 je čak veća od prikazanih u Tabeli 1, gore iznad.
Tabela 2
Primer 5: Kompetitivni imunološki ogled za otkrivanje in vivo SDMA nivoa
[0129] Uzorke seruma obezbeđuju veterinarske klinike/laboratorije od životinja koje su bile podvrgnute rutinskom fizičkom ispitivanju i rutinskom hemijskom panelu.
[0130] A SDMA-HRP konjugat se priprema u skladu sa sledećim postupkom:
1. Liofizirani prašak peroksidaze rena aktivirane od strane maleimida, >200 jedinica/mg proteina (komercijalno dostupan od Sigma-Aldrich St. Louis, MO broj proizvoda P1709)) se rekonstituiše do 2-5 mg/mL u 0.15 M NaCl, 0.1 M natrijum fosfata, pH 7.0. Pufer se izvetri i prečisti sa azotom ili argonom pre upotrebe a voda koja se koristi za pripremu pufera ne sadrži tragove teških metala i drugih oksidirajućih agenasa. Kuplovanje se izvodi u braon fioli kako bi reakcija bila zaštićena od svetlosti.
2. SDMA analog (3) se rastvori u istom puferu koji se koristi i u fazi 1 da bi se dobio rastvor sa koncentracijom od 2-5 mg/mL. Generalno se koriste 1-2-mola peroksidaze po molu sulfhidril jedinjenja. Molekulska masa peroksidaze iznosi oko 40,000.
3. Rastvor iz faze 1 se kombinuje sa rastvorom iz faze 2 i dobijeni rastvor se nežno meša 3 sata na sobnoj temperaturi. Neizreagovane grupe maleimida su zatim blokirane dodavanjem 1M 2-merkaptoetanola (komercijalno dostupan od Sigma-Aldrich St. Louis, MO.(kataloški br. M 6250)) kako bi se dobile konačne koncentracije od 0.0015 M 2-merkaptoetanola i dobijeni rastvor se meša oko 15 minuta.
4. Neizreagovane grupe sulfhidrila su zatim blokirane dodavanjem 0.3 M N-etilmaleimida (komercijalno dostupnog od Sigma-Aldrich St. Louis, MO (kataloški br. D 8654)) rastvoru iz faze 3 kako bi se dobile konačna koncentracija od 0.003 M N-etilmaleimida.
5. Dobijeni rastvor SDMA-HRP konjugata se zatim razmeni u PBS-u hromatografijom (upotrebom istog postupka prethodno opisanog u primeru za konjugovanje SDMA analoga (3) u KLH-u aktiviranom od strane maleimida i BSA) ili dijalizom u PBS-u (Spectra/Por3, MWCO 3500 Spectrum Labs, Rancho Dominguez, CA) u skladu sa uputstvima proizvođača. Dobijeni rastvor se zatim liofizira.
[0131] Videti, takođe, Lin, F. T., et al., Biochemistry, 18(4), 690 (1979); Kitagawa, T., et al., Chem. Pharm. Bull., 29(4), 1131 (1981); Duncan, R. J. S., et al., Anal. Biochem., 132, 68 (1983); i Palmer, J. L., et al., J. Biol. Chem., 238(7), 2393 (1963).
[0132] 50 µl SDMA-HRP konjugata, 50 µl uzorka seruma (ili kalibratora, SDMA 2 HCl, komercijalno dostupnog od Calbiochem of San Diego, CA), i 50 µl zečijeg anti-SDMA antitela u serumu (1:3000 titer) se naknadno dodaju bazenčiću pojedinca u polistirenskoj mikrobazenskoj ploči sa 96 bazenčića, prethodno obloženoj sa anti-zečijim IgG ovce (komercijalno dostupnim od Beacon Analytical Systems Inc. of Portland, ME). Nakon perioda inkubacije od 30 minuta na sobnoj temperaturi, bazenčići se 4 puta isperu sa PBST-om (fosfatni puferovani slani rastvor, 0.05% Tween).
[0133] 100 µl 3,3',5,5'-etrametilbenzidina (komercijalno dostupan od Promega Corporation of Madison, WI) se dodaje naknadno. Nakon perioda inkubacije od 30 minuta na sobnoj temperaturi, dodaje se 100 µl stop rastvora (1 N HCl) i absorbanca se izmeri na 450 nm koristeći BioTek ELX 808 (Winooski, VT) čitač ploča. Podaci su prošli kavantifikaciju koristeći Softmax software (Molecular Uređajs, Sunnyvale, CA). Kalibraciona kriva se generiše pokretanjem serije SDMA standarda (npr., 0, 0.05 µg/mL, 0.15 µg/mL, 0.45 µg/mL, i 1.35 µg/mL). Nepoznati uzorci se kvantifikuju pomoću kalibracione krive. Sažetak rezultata je prikazan u Tabeli 3.
Tabela 3
[0134] U Tabeli 3, status "bolest bubrega" ukazuje na to da uzorak uzet od životinja pokazuje da su vrednosti kreatinina i azota uree u krvi (BUN) iznad normalnog referentnog opsega a status "zdravi" ukazuje da je uzorak uzet od životinje pokazao normalne vrednosti (referentni opseg) kreatinina i azota uree u krvi (BUN). Kod pasa, gornja granica normalnog referentnog opsega iznosi 27 mg/dL za BUN i 1.8 mg/dL za kreatinin. Za mačke, gornja granica normalnog referentnog opsega iznosi 34 mg/dL za BUN, i 2.3 mg/dL za kreatinin.
[0135] Rezultati u Tabeli 3 pokazuju da se nivoi SDMA procenjuju kod pasa i mačaka sa kompromitovanom funkcijom bubrega. Na taj način, SDMA se može koristiti kao marker da se dijagnostikuje bolest bubrega kod životinja.
Primer 6: Analiza brzina glomerularne filtracije sa koncentracijom kreatinina i koncentracijom slobodnog SDMA kod pasa.
[0136] Uzorci seruma se uzimaju od heterozignih (nosač) ženki pasa (n=20) sa naslednom neuropatijom povezanom sa X hromozomom (XLHN). XLHN je uzrokovana mutacijom gena COL4A5, koji kod ženki pasa izaziva mozaičnu ekspresiju tipa IV kolagenskih peptida i početak glomerularne proteinurije između 3. i 6. meseca života. (Nabity et al., J Vet Intern Med 2007; 21:425-430) Koncentracije kreatinina i SDMA se mere u svakom uzorku.
[0137] Koncentracija kreatinina u uzorcima se meri pomoću IDEXX tehnologije suvih slajdova kako je prethodno opisano.
[0138] Koncentracije slobodnog SDMA u uzorcima su određene kako sledi: mobilne faze LCMS su (A) 10 mL propionske kiseline i 250 µL trifluorosirćetne kiseline u 1 L vode; i (B) 10 mL propionske kiseline i 250 µL trifluorosirćetne kiseline u 1 L acetonitrila. Pripremi se interni standard od 2.5 ng/mL izvetrenog asimetričnog dimetil arginina (d-ADMA) u vodi. STD (standard) kriva se napravi u ogoljenom serumu pasa dodavanjem 20 µg/mL SDMA rastvora, nakon čega se dodaju razblaženja kako bi se dobila STD kriva sa devet tačaka sa koncentracijama koje variraju od 1.56 µg/dL do 100 µg/dL. Da bi se sprovela merenja, 100 µL uzorka koji bi trebalo da se izmeri (tj., uzorka iz seruma ili standardnog rastvora) se prebaci u epruvete za mikrocentrifugu.10 µL internog standardnog rastvora i 200 µL mobilne faze B se dodaje u svaku epruvetu. Epruvete se stavljaju u vorteks mešalicu kako bi se izmešale i ostave se da odstoje 30 minuta, a zatim se centrifugiraju na 13000g 20 minuta na 25 °C. Supernatanti se prebace u braon HPLC fiole od 2 mL, i uzorci se analiziraju LCMS-om. LCMS se izvodi na HPLC i API-4000 od ABSciex, skenira se tipa MRM-om, pozitivan polaritet, turbo sprej režim skeniranja, Q1 rezolucija = jedinica i Q3 rezolucija = jedinica. Kolona je 150x4.6 PVA SIL, protok iznosi 1 mL/min a gradijent je izokratski 90:10 B:A. Hromatogrami se puste u rad na 9 minuta na sobnoj temperaturi.
[0139] Stvarna GFR životinja se meri joheksol klirens postupkom. Subjektima se ubrizgava joheksol.
[0140] Uzorci krvi se uzimaju u različitim vremenskim intervalima, a joheksol u serumu se meri HPLC-om.
[0141] Sakupljeni su podaci sa tri tačke za svakog psa. Logistički grafikon sa 4 parametra (4PL) koncentracije kreatinina (mg/dL) nasuprot GFR (ml/min/kg) je obezbeđena na FIG.5. Vrednost R<2>za ove podatke iznosi 0.94 sa standardnom greškom od 0.12 tokom 0.5-3.0 mg/dl opsega koncentracije, koji grubo predstavlja 5% ukupnog opsega.
[0142] Na FIG.6 su prikazani rezultati SDMA koncentracije (µg/dl) nasuprot GFR (ml/min/kg).4A PL aproksimacija SDMA-GFR odnosa obezbeđuje R2vrednost od 0.95, sa standardnom greškom od 1.7 tokom 5-40 µg/dL opsega za SDMA. Ova greška predstavlja grubo 5% ukupnog opsega.
[0143] Na FIG.7 su prikazani rezultati kombinovanja vrednosti kreatinina i SDMA vrednosti upotrebom jednostavnog množenja vrednosti, koje pokazuje napredak veze GFR tokom samog kreatinina ili samog SDMA.4PL aproksimacija [Kreatinin]∗[SDMA]--GFR veze obezbeđuje R<2>vrednost od 0.98, sa standardnom greškom od 2.8 tokom 0-90 µg/dL opsega za [Kreatinin]∗[SDMA]. Ova greška grubo predstavlja 3% ukupnog opsega u odnosu na GFR kod ovih pasa.
[0144] Na FIG.8 je prikazana analiza 1/[Kreatinin]<P>∗1/[SDMA]<Q>, upotrebom linearne aproksimacije. Upotrebom linearne regresije, P je 0.37 a Q je 0.43. R<2>za kombinaciju dobijene vrednosti od 0.87, u poređenju sa 0.83 za sam 1/[Kreatinin] i 0.85 za sam 1/[SDMA].
Primer 7: Analiza brzine glomerularne filtracije sa koncentracijom kreatinina i koncentracijom slobodnog SDMA kod mačaka.
[0145] Deset ženki mačaka sa tačkama podataka 1 do 4, od kojih je svaka bila korišćena za procenu da li su rezultati višestruke kombinacija SDMA i vrednosti kreatinina u boljoj korelaciji sa GFR od samih vrednosti individualnih markera. SDMA, kreatinin i GFR su izmereni kako je gore opisano.
[0146] Na FIG.9 su prikazani rezultati SDMA koncentracije (µg/dl) nasuprot GFR (ml/min/kg).4 PL aproksimacija SDMA-GFR odnosa obezbeđuje R<2>vrednost od 0.73, sa standardnom greškom od 2.3 tokom 15 µg/dL opsega za SDMA. Ova greška predstavlja grubo 15% ukupnog opsega.
[0147] Na FIG.10 su prikazani rezultati koncentracije kreatinina (mg/dl) nasuprot GFR (ml/min/kg).4 PL aproksimacija kreatinin-GFR odnosa obezbeđuje R<2>vrednost od 0.82, sa standardnom greškom od preko 1.5 mg/dL opsega. Ova greška predstavlja grubo 10% ukupnog opsega.
[0148] Na FIG.11 su prikazani rezultati kombinovanih vrednosti kreatinina i SDMA vrednosti upotrebom jednostavnog množenja vrednosti, što pokazuje napredak u odnosu na GFR preko samog kreatinina ili samog SDMA.4PL aproksimacija [Kreatinin]*[SDMA]-GFR odnosa obezbeđuje R<2>vrednost od 0.89, sa standardnom greškom od 3.9 preko 40 µg/dL opsega za [Kreatinin]∗[SDMA]. Ova greška predstavlja grubo 10% ukupnog opsega.
[0149] Na FIG.12 je prikazana analiza 1/[Kreatinin]<P>∗1/[SDMA]<Q>, upotrebom linearne aproksimacije. Upotrebom linearne regresije, P je 1.2 a Q je 0.95. R<2>za kombinaciju dobijene vrednosti od 0.95, u poređenju sa 0.44 za 1/[Kreatinin] sam i 0.65 za 1/[SDMA] sam.
Primer 8: Poboljšanje osetljivosti i/ili specifičnosti u dijagnozi bolesti bubrega putem kombinacije CRE i SDMA vrednosti isečka (referentni primer nije deo ovog pronalaska).
[0150] Status bolesti bubrega 113 mačaka se određuje i određuje im se faza u skladu sa Algoritmom za određivanje faze hronične bolesti bubrega (CKD) kod pasa i mačaka na način kako to predviđa Internacionalno renalno udruženje (IRIS). Za svaku mačku, 1 do 6 uzorci seruma uzeti u različitim vremenskim periodima se analiziraju radi kreatinina [CRE] i/ili SDMA.194 uzorka su uzeta od normalnih mačaka (tj., onih koje nemaju CKD).182 uzorka su uzeta od 55 mačaka koje imaju CKD.
[0151] U ovom primeru, vrednosti isečka za SDMA i CRE se određuju i koriste se za određivanje CKD. Vrednost isečka predstavlja graničnu vrednost koncentracije seruma iznad koje se smatra da je pojedincu dijagnostikovana bolest bubrega prema ovom određenom testu. SDMACUTpredstavlja isečak vrednosti za SDMA. [SDMA] i SDMACUTse izmere u µg/dL (mikrogrami/decilitar). Na primer, SDMACUTmože biti oko 14 µg/dL, ili između oko 10 i 20 µg/dL.
[0152] CRECUTpredstavlja isečak vrednosti za CRE. CRE i CRECUTse izmere u mg/dL. Na primer, CRECUTmože biti od oko 2.0 mg/dL do 2.4 mg/dL, ili između oko 1.7 i 2.8 mg/dL.
[0153] Za sam SDMA , vrednost isečka (SDMACUT) se podesi na 14 µg/dL. Upotrebom ove vrednosti, bilo je 10.3% lažne pozitivne stope za normalne mačke, i 26.9% lažne pozitivne stope za mačke sa CKD-om (videti Tabelu 4).
Tabela 4
[0154] Za sam kreatinin, vrednost isečka (CRECUT) se podesi na 2.4 mg/dL. Upotrebom ove vrednosti, bilo je 0.0% lažne pozitivne stope za normalne mačke, i 43.4% lažne negativne stope za mačke sa CKD-om (videti Tabelu 5).
Tabela 5
CCUTpredstavlja isečak vrednosti za vrednost kombinacije C. Kreatinin i SDMA vrednosti se kombinuju prema formuli:
[0155] CCUTnema jedinicu merenja. Na primer, CCUTmože biti 1.5, 1.7 ili 2.0, ili između 1.3 i 2.5.
[0156] Kada se CCUTpodesi na 1.5, postoji 12.4% lažne pozitivne stope za normalne mačke, i 1.6% lažne negativne stope za mačke sa CKD-om (videti Tabelu 6). Kada se CCUTpodesi na 1.7, postoji 3.5% lažna pozitivna stopa za normalne mačke, i 14.3% lažne negativne stope za mačke sa CKD-om (videti Tabelu 7). Kada se CCUTpodesi na 2.0, postoji 3.5% lažne pozitivne stope za normalne mačke, i 33.5% lažne negativne stope za mačke sa CKD-om (videti Tabelu 8).
Tabela 6
Tabela 7
Tabela 8
[0157] Procenjena osetljivost i specifičnost vrednosti kombinacije se grafički prikazuje u odnos u na CCUTza određivanje prikladnih vrednosti za CCUT(videti FIG.13). Ako je C veće od (>) CCUT, pojedincu se dijagnostikuje bolest bubrega. Shodno tome, kombinovanje SDMA i CRE vrednosti na osnovu njihovih dijagnostičkih vrednosti isečaka dovodi do poboljšane osetljivosti i/ili specifičnosti detekcije bolesti bubrega kod životinja.
Primer 9: Određivanje odnosa kreatinina i SDMA kod zdravih i bolesnih životinja.
[0158] Kod zdravih životinja, odnos koncentracije SDMA (µg/dL) i kreatinina (mg/dL) je generalno u opsegu od oko 4:1 do 10:1 (µg/dL:mg/dL). Kod nekih pacijenata koji imaju hroničnu bolest bubrega, ovaj odnos prelazi 10:1, što može da ukaže na napredak bolesti.
[0159] U ovom ispitivanju, primećeno je longitudinalno kretanje SDMA i kreatinina kod CKD pasa.
Dvadeset četiri psa sa CKD-om su uključena u ispitivanje zasnovano na sledećim kriterijumima: starosni uzrast (9.4-18.3 y); konstantna azotemija (> 3meseca); GFR; fizičko ispitivanje; kreatinin u serumu, i analiza urina.
[0160] Svim psima je pružena kvalitetna nega uključujući optimalnu ishranu, veterinarsku brigu, i dnevne fizičke vežbe. Nakon dijagnoze CKD-a, psi se hrane sa PRESCRIPTION DIET® k/d® Hranom za pse (Hill's Pet Nutrition, Inc., Topeka, Kansas).
[0161] Uzorci se od ovih pasa uzimaju redovno (2-3 puta godišnje). Uzorci se zamrznu i stave u banku, kreatinin se izmeri enzimatskom kolorimetrijom upotrebom COBAS® analizatora. SDMA se izmeri LCMS-om kako je gore opisano sa izuzetkom da se uzorci seruma talože sa acetonitrilom, i da se koristi Waters XBridge C185µm 4.6<∗>30 kolona. Mobilna faza A se sastoji od 0.5mM perfloroheptanoične kiseline u 0.1% mravlje kiseline u vodi a mobilna faza B je 0.1% mravlja kiselina u acetonitrilu sa gradijentom od 100% B do 100%A sa vremenom rada od 4 minuta. Korelacija između SDMA (µg/dL) i kreatinina (mg/dL) je prikazana na Fig.14.
Primer 10: Neusaglašenost između vrednosti SDMA i kreatinina kod nekih mačaka sa CKD-om (Referentni primer)
[0162] Neusaglašenost u odnosu SMDA:kreatinin može da predvidi smrtnost kod životinja. Primera radi, kod CKD mačaka, primećene SDMA vrednosti su bile visoke u poređenju sa očekivanim koncentracijama na osnovu odgovarajućih vrednosti kreatinina. Kako je prikazano na FIG.14, postoji jaka korelacija između SDMA i kreatinina, i normalni odnos je manji od 10 (µg/dL:mg/dL). U ovom ispitivanju, odnos se određuje kod 26 mačaka sa CKD-om. Kod ovih 26 mačaka dijagnostikovan je CKD na osnovu fizičkog pregleda, kreatinina u serumu i analize urina. Kako je prikazano na FIG.15, dve od 26 mačaka su imale odnos SMDA:kreatinin veći od 10 i uginule su u toku daljeg praćenja, iako nije dokumentovano da li su te mačke eutanazirane ili su uginule od bolesti.
Primer 11: SDMA:kreatinin odnos kod predviđanja smrtnosti kod mačaka sa CKD-om
(Referentni primer)
[0163] U ovom ispitivanju, praćeno je longitudinalno kretanje SDMA i kreatinina kod mačaka sa CKD-om. Osamnaest mačaka sa CKD-om je uključeno u ispitivanje koje se zasniva na sledećim kriterijumima: neprestana azotemija najmanje 3 meseca; ili ne-azotemija sa >30% smanjenjem kod GFR od medijana GFR-a normalnih mačaka; ili kamenje kalcijum oksilata u bubregu.
[0164] Svim mačkama je pružena kvalitetna nega uključujući optimalnu ishranu, veterinarsku brigu, i dnevnu fizičku aktivnost, redovne prilike za obogaćivanje u smislu životne sredine i ponašanja. Nakon dijagnoze sa CKD-om, mačke se hrane PRESCRIPTION DIET® c/d® Hranom (Hill's Pet Nutrition, Inc., Topeka, Kansas).
[0165] Uzorci krvi i urina od ovih mačaka se sakupljaju u različitim vremenskim periodima, zamrznu se i čuvaju u banci. Kreatinin se izmeri enzimatskom kolorimetrijom upotrebom COBAS® Analizatora. SDMA se izmeri LCMS-om kako je gore iznad opisano.
[0166] U vreme kada je koncentracija SDMA prvo dostigla ili prešla vrednost od 14 µg/dL kod svake od 18 mačaka, 12 mačaka je imalo odnos SMDA:kreatinin veći od 10:1, i 6 mačaka je imalo odnos SMDA:kreatinin koji je iznosio 10:1 ili manje. Za svaku mačku, praćeno je vreme od datuma kada je koncentracija SDMA prvo dostigla ili prešla vrednost od 14 µg/dL do datuma uginuća, sa izuzetkom dve mačke. Ove dve mačke su bile i dalje žive nakon završetka ispitivanja; na taj način, krajnji datum ispitivanja je supstituisan datumom uginuća ove dve mačke.
[0167] Tih 12 mačaka koje su imale odnos SMDA:kreatinin veći od 10:1, njihov medijan preživljavanja je iznosio 13.9 meseci (srednja vrednost = 18.7; opseg = 1.8-47.4).6 mačaka koje su imale odnos SMDA:kreatinin od 10:1 ili manje su imale medijan preživljavanja od 18.7 meseci (srednja vrednost = 18.9; opseg = 8.7-28.7). Na taj način, mačke koje imaju SDMA:kreatinin odnose veće od 10:1, imale su veću smrtnost nego mačke koje su imale SDMA:kreatinin odnose od 10:1. Na FIG.16, 17 i 18 je dat prikaz toka SDMA:kreatinin odnosa za tri mačke iz ispitivanja, sa SDMA:kreatinin odnosima većim od 10 (mačka #13, mačka #8 i mačka #14), tokom trajanja od nekoliko godina. Mačka #13 je uginula sa 27.2 meseca, mačka # 8 je uginula sa 29.4 meseca, a mačka #14 je uginula sa 12.3 meseci, nakon datuma kada je koncentracija SDMA u serumu prvi put dostigla vrednost od najmanje 14 µg/dL. Kod poslednjeg merenja prilikom autopsije, odnosi za tri mačke su bili u opsegu približno 17 do 34.
Primer 12: Predviđanje smrtnosti upotrebom SDMA i kreatinina
(referentni primer koji nije deo ovog pronalaska).
[0168] Na FIG.19 i 20 je prikazana Kaplan-Meier-ova kriva preživljavanja za mačke (iz ispitivanja opisanog u primeru 11) i pse (iz ispitivanja opisanih u primeru 9) upotrebom SDMA vrednosti isečka od 14 µg/dL. Na FIG.19 su prikazane mačke koje su sa koncentracijom SDMA u serumu od najmanje 14 µg/dL imale smanjeno vreme preživljavanja i povećanu šansu smrtnosti. Mačke sa koncentracijom SDMA u serumu manjom od 14 µg/dL preživele su približno 1.6 puta duže od mačaka čija je koncentracija SDMA u serumu bila jednaka ili veća od 14 µg/dL. U ovom ispitivanju, kreatinin nije uspeo da predvidi smrtnost kod mačaka (2.1 mg/dL referentni isečak).
[0169] Na FIG.20 je prikazano da Kaplan-Meier-ova kriva preživljavanja za pse koji imaju koncentraciju SDMA u serumu veću ili manju od 14 µg/dL. U ovom ispitivanju, psi sa SDMA <14 µg/dL preživeli su 2.6 puta duže u poređenju sa psima sa SDMA ≥14 µg/dL. Kreatinin nije uspeo da predvidi smrtnost (1.5 mg/dL referentni isečak).
[0170] Primeri dati iznad predstavljaju samo ilustracije i ne predstavljaju iscrpnu listu svih mogućih primena ili modifikacija ovog pronalaska. Samim tim, razne modifikacije i varijacije opisanih sistema postupaka koji se upotrebljavaju u ovom pronalasku su jasni stručnjacima pri čemu se ne odstupa od područja primene ovog pronalaska.
[0171] Takođe bi trebalo imati u vidu da, kako su upotrebljeni u ovom tekstu i priloženim patentnim zahtevima, oblici jednine označeni sa "jedan," neki"," i "ovaj" uključuju i reference u množini osim ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije. To znači da, na primer, referenca ka "jednom vezniku" predstavlja referencu ka jednom ili više veznika i njegovih ekvivalenata poznatih stručnjacima.
[0172] Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi upotrebljeni u ovom tekstu imaju ista značenja koje stručnjaci iz tehnike, na koje se ovaj pronalazak odnosi, shvataju. Primeri izvođenja ovog pronalaska i razne odlike i njegovi detalji koji predstavljaju prednost su potpunije objašnjeni sa pozivanjem na primere izvođenja i/ili su ilustrovani u pratećim crtežima i detaljnije predstavljeni u opisu. Trebalo bi imati u vidu da karakteristike ilustrovane u primerima nisu prikazane kako treba, i da se karakteristike jednog primera izvođenja mogu upotrebljavati i kod drugih primera izvođenja što jedan stručnjak iz tehnike prepoznaje, čak i ako to nije izričito navedeno u ovom tekstu.
[0173] Bilo koje numeričke vrednosti navedene u ovom tekstu uključuju sve vrednosti od niže vrednosti do više vrednosti u povećanjima od jedne jedinice pod uslovom da postoji razdvajanje najmanje dve jedinice između bilo koje niže ili više vrednosti. Kao primer, ukoliko se navodi da je koncentracija komponente ili vrednosti varijabli procesa kao što su, na primer, veličina, veličina ugla, pritisak, vreme i slično, iznosi, na primer, od 1 do 90, specifično od 20 do 80, specifičnije od 30 do 70, namera je da vrednosti kao što su 15 do 85, 22 do 68, 43 do 51, 30 do 32, itd. budu izričito numerisane u ovoj specifikaciji. Za vrednosti koje su manje od jedan, smatra se da je jedna jedinica 0.0001, 0.001, 0.01 ili 0.1 kako je prikladno. Ovo su samo primeri onoga što je specifično nameravano i sve moguće kombinacije numeričkih vrednosti između numerisane najmanje vrednost i najviše vrednosti ni trebalo uzimati u obzir radi izričitog navođenja u ovoj prijavi na sličan način.
[0174] Određeni postupci, uređaji, i materijali su opisani, iako se bilo koji postupci ili materijali slični ili jednaki onima opisanim u ovom tekstu mogu koristiti u praksi ili ispitivanju ovog pronalaska.

Claims (10)

Patentni zahtevi
1. Postupak za procenu brzine glomerularne filtracije (GFR) kod životinjskog subjekta, koji postupak obuhvata:
merenje koncentracije slobodnog simetričnog dimetilarginina (SDMA) u uzorku krvi tog subjekta; merenje koncentracije kreatinina u uzorku krvi tog subjekta; i
poređenje vrednosti dobijene iz jednačine koja obuhvata proizvod koncentracije kreatinina i koncentracije slobodnog SDMA sa jednom ili više standardnih vrednosti koje su u korelaciji sa brzinom glomerularne filtracije kod tog životinjskog subjekta.
2. Postupak prema zahtevu 1, u kojem ta jednačina obuhvata inverznu vrednost proizvoda koncentracije kreatinina i koncentracije slobodnog SDMA.
3. Postupak prema zahtevu 1 u kojem se najmanje jedna od koncentracije kreatinina i koncentracije slobodnog SDMA procenjuje u izračunavanju.
4. Postupak prema zahtevu 3, u kojem je proizvod prve procenjene vrednosti bazirane na koncentraciji kreatinina i druge procenjene vrednosti bazirane na koncentraciji slobodnog SDMA, predstavljen formulom PROD = [CRE]<P>× [SDMA]<Q>u kojoj PROD predstavlja proizvod, [CRE] predstavlja koncentraciju kreatinina, [SDMA] predstavlja koncentraciju SDMA, P obezbeđuje procenu koja se dodeljuje [CRE] u formuli, a Q obezbeđuje procenu koja se dodeljuje [SDMA] u formuli.
5. Postupak prema zahtevu 4, u kojem su jedna ili više standardnih vrednosti u korelaciji sa inverznom vrednošću proizvoda.
6. Postupak prema zahtevu 4, u kojem je P između oko -5 i 0, ali ne uključujući 0.
7. Postupak prema zahtevu 4, u kojem je Q između oko -2.5 i 0, ali ne uključujući 0.
8. Postupak prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, koji dalje obuhvata određivanje bubrežne funkcije, bolesti bubrega ili disfunkcije bubrega, poređenjem GFR kod subjekta sa GFR kod jednog ili više zdravih subjekata.
9. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, u kojem merenje koncentracije slobodnog SDMA obuhvata:
dovođenje u kontakt uzorka sa anti-SDMA antitelom konjugovanim sa oznakom i sa SDMA analogom; pri čemu je anti-SDMA antitelo specifično za slobodan SDMA i ne poseduje ili suštinski ne poseduje unakrsnu reaktivnost sa jednim ili više jedinjenja odabranih iz grupe koju čine asimetrični dimetilarginin (ADMA), L- arginin, i N-metilarginin, i
otkrivanje prisustva ili količine oznake povezane sa SDMA analogom, čime se određuje prisustvo ili količina SDMA u uzorku.
10. Postupak prema zahtevu 9, u kojem anti-SDMA antitelo poseduje reaktivnost prema ADMA od - manje od 25 % svoje reaktivnosti prema SDMA,
- manje od 10 % svoje reaktivnosti prema SDMA,
- manje od 5 % svoje reaktivnosti prema SDMA, ili
- manje od 1 % svoje reaktivnosti prema SDMA.
RSP20191171 2013-09-05 2014-09-05 Postupci za otkrivanje bolesti bubrega RS59287B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361874011P 2013-09-05 2013-09-05
PCT/US2014/054278 WO2015035155A1 (en) 2013-09-05 2014-09-05 Methods for detecting renal disease
EP14842603.4A EP3041576B1 (en) 2013-09-05 2014-09-05 Methods for detecting renal disease

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59287B1 true RS59287B1 (sr) 2019-10-31

Family

ID=52628954

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RSP20191171 RS59287B1 (sr) 2013-09-05 2014-09-05 Postupci za otkrivanje bolesti bubrega

Country Status (21)

Country Link
US (3) US11035861B2 (sr)
EP (3) EP3480600B1 (sr)
JP (4) JP6657096B2 (sr)
KR (2) KR102273028B1 (sr)
CN (1) CN105705202B (sr)
AU (2) AU2014315063B2 (sr)
CA (2) CA2923140C (sr)
CY (1) CY1123179T1 (sr)
DK (1) DK3041576T3 (sr)
ES (2) ES2746008T3 (sr)
HR (1) HRP20191569T1 (sr)
HU (1) HUE045723T2 (sr)
LT (1) LT3041576T (sr)
MX (2) MX383274B (sr)
NZ (1) NZ717554A (sr)
PL (1) PL3041576T3 (sr)
PT (1) PT3041576T (sr)
RS (1) RS59287B1 (sr)
SI (1) SI3041576T1 (sr)
SM (1) SMT201900526T1 (sr)
WO (1) WO2015035155A1 (sr)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL3041576T3 (pl) 2013-09-05 2019-12-31 Idexx Laboratories, Inc. Sposoby wykrywania choroby nerek
FI3259593T3 (fi) 2015-02-20 2023-01-13 Homogeeninen immunomääritys, jossa on taustasignaalikompensointi
PL3289355T3 (pl) * 2015-04-30 2025-11-24 Idexx Laboratories, Inc. Sposoby wykrywania chorób nerek
JP7344127B2 (ja) 2017-05-31 2023-09-13 マース インコーポレーテッド 慢性腎臓病の診断及び治療方法
AU2018313853A1 (en) 2017-08-08 2020-01-02 Fresenius Medical Care Holdings, Inc. Systems and methods for treating and estimating progression of chronic kidney disease
CN111246918B (zh) * 2017-10-19 2024-06-14 艾德克斯实验室公司 对称二甲基精氨酸的检测
JP6868878B2 (ja) * 2018-10-17 2021-05-12 Kagami株式会社 糸球体濾過能力の決定方法
CN109545377B (zh) * 2018-10-22 2021-11-23 中南大学湘雅三医院 获取肾小球滤过率的模型的建立方法
US10745492B1 (en) 2019-04-03 2020-08-18 Ark Diagnostics, Inc. Antibodies to symmetrically dimethylated arginine analytes and use thereof
CA3152793A1 (en) 2019-09-05 2021-03-11 The Regents Of The University Of California Noninvasive method to quantify kidney function and functional decline
EP4083628B1 (en) * 2019-12-27 2026-03-11 Kagami Inc. Method and system for estimating renal function
GB202005110D0 (en) * 2020-04-07 2020-05-20 Royal Veterinary College Diagnosis of stage b2 dmvd
JP7784798B2 (ja) * 2020-04-17 2025-12-12 株式会社藤商事 遊技機
WO2022133159A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 Nephrosant, Inc. Kits for stabilization of urine samples
CN112768073B (zh) * 2021-01-15 2023-04-18 中山大学附属第三医院 一种肾小球滤过率估计模型的构建方法
AU2022426744A1 (en) * 2021-12-27 2024-05-23 Société des Produits Nestlé S.A. Compositions and methods for diagnosing and treating chronic kidney disease
AU2023213987A1 (en) 2022-01-26 2024-09-05 Idexx Laboratories, Inc. Methods and compositions for differentiating progressive chronic kidney disease from stable chronic kidney disease
JP2023160475A (ja) * 2022-04-22 2023-11-02 株式会社三共 遊技機
WO2024015991A2 (en) * 2022-07-15 2024-01-18 Idexx Laboratories, Inc. Systems and methods for at-home diagnostics utilizing microneedles
KR102880012B1 (ko) * 2023-12-22 2025-11-10 주식회사 페토바이오 반려동물의 신부전 치료를 위한 임상 의사결정 지원 시스템 및 임상 의사결정 지원 방법
CN119125582A (zh) * 2024-09-20 2024-12-13 武汉虹之彩包装印刷有限公司 一种用于肌酐检测的纸基传感器及其制备方法

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3134787A1 (de) * 1981-09-02 1983-03-10 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Creatinin-antikoerper
US4818703A (en) 1985-10-23 1989-04-04 Pizzolante John M Stabilized alkaline picrate reagent for jaffe creatinine determination
EP0356160A3 (en) 1988-08-24 1991-09-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Capillary device
US5726010A (en) 1991-07-31 1998-03-10 Idexx Laboratories, Inc. Reversible flow chromatographic binding assay
US6455288B1 (en) 1993-04-08 2002-09-24 Dade Behring Marburg Gmbh Homogeneous immunoassays using mutant glucose-6-phosphate dehydrogenases
US5804452A (en) * 1995-04-27 1998-09-08 Quidel Corporation One step urine creatinine assays
WO1998049199A1 (en) 1997-05-01 1998-11-05 Panorama Research, Inc. Cardiovascular disease risk assessment
US6736957B1 (en) 1997-10-16 2004-05-18 Abbott Laboratories Biosensor electrode mediators for regeneration of cofactors and process for using
US6358699B1 (en) 1999-02-05 2002-03-19 Cooke Pharma Assay for asymmetrical NG, NG dimethyl-l-arginine
US6699673B2 (en) 1999-12-22 2004-03-02 The Research Foundation Of State University Of New York Protein methylarginine-specific antibodies
WO2002004465A1 (en) 2000-07-06 2002-01-17 Fal Diagnostics Methods and kits for the detection of arginine compounds
AU2001293699A1 (en) * 2000-07-12 2002-01-21 Werner Naser Direct assessment of analyte to reference molecule ratios
DE10040904A1 (de) 2000-08-18 2002-02-28 Boeger Rainer H Verfahren und Mittel zum Nachweis einer Wahrscheinlichkeit zukünftigen Fortschreitens von Gefässerkrankungen
US7241856B2 (en) 2003-06-02 2007-07-10 Pentron Clinical Technologies Llc Dental resins, dental composite materials, and method of manufacture thereof
JP4214271B2 (ja) 2002-10-15 2009-01-28 アークレイ株式会社 クレアチニン測定用試験片
US7501053B2 (en) 2002-10-23 2009-03-10 Abbott Laboratories Biosensor having improved hematocrit and oxygen biases
WO2004046314A2 (en) 2002-11-15 2004-06-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for detecting asymmetric dimethylarginine in a biological sample
US20050148029A1 (en) * 2003-09-29 2005-07-07 Biosite, Inc. Methods and compositions for determining treatment regimens in systemic inflammatory response syndromes
DE602004020360D1 (de) 2004-11-04 2009-05-14 Germediq Forsch & Entw Ges Mbh Methode zur Bestimmung von Arginin, methylierten Argininen und deren Derivate
US8698817B2 (en) 2004-11-15 2014-04-15 Nvidia Corporation Video processor having scalar and vector components
WO2006078813A2 (en) 2005-01-21 2006-07-27 Biosite Incorporated Arginine analogs, and methods for their synthesis and use
JP2007176872A (ja) 2005-12-28 2007-07-12 Sentan Seimei Kagaku Kenkyusho:Kk アシンメトリックジメチルアルギニンを認識する抗体及びその製造方法並びに翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質の検出方法
FR2919063B1 (fr) * 2007-07-19 2009-10-02 Biomerieux Sa Procede de dosage du leucocyte elastase inhibitor pour le diagnostic in vitro du cancer colorectal.
WO2009071904A1 (en) 2007-12-05 2009-06-11 King's College London Methods and compositions
HUE051130T2 (hu) * 2008-08-07 2021-03-01 Idexx Lab Inc Eljárások szimmetrikus dimetilarginin kimutatására
BRPI0924639B1 (pt) 2009-06-02 2021-12-07 Biocrates Life Sciences Ag Novos biomarcadores para avaliação de doenças renais
CN101587118B (zh) * 2009-07-03 2012-09-12 长春迪瑞医疗科技股份有限公司 肌酐尿液分析试纸及制备方法
CN101598727B (zh) * 2009-07-09 2012-10-10 上海科华生物工程股份有限公司 定量测定人体血液尿素含量的干化学试纸
US9285246B2 (en) * 2010-02-12 2016-03-15 Intuitive Surgical Operations, Inc. Method and system for absolute three-dimensional measurements using a twist-insensitive shape sensor
CN101865911A (zh) * 2010-03-16 2010-10-20 苏州市玮琪生物科技有限公司 一种尿肌酐定量检测卡
DE102011055265A1 (de) 2010-11-17 2012-05-24 Karl-Heinz Kellner Automatenfähiger Immunoassay für biogene Amine
JP2012112785A (ja) 2010-11-24 2012-06-14 Tohoku Univ 透析膜の評価方法
JP5925026B2 (ja) * 2011-04-28 2016-05-25 アークレイ株式会社 クレアチニン測定用乾式試験片及びクレアチニン測定法
AU2012271718A1 (en) * 2011-06-16 2014-01-09 Baylor Research Institute Analysis of total homocysteine and methylmalonic acid in plasma by LC-MS/MS from a plasma separator device (PSD)
WO2013115283A1 (ja) * 2012-01-31 2013-08-08 味の素株式会社 早期腎症の評価方法、早期腎症評価装置、早期腎症評価方法、早期腎症評価プログラム、早期腎症評価システムおよび情報通信端末装置
US20140038203A1 (en) * 2012-07-09 2014-02-06 Musc Foundation For Research Development Methods for detecting or predicting kidney disease
PL3041576T3 (pl) 2013-09-05 2019-12-31 Idexx Laboratories, Inc. Sposoby wykrywania choroby nerek

Also Published As

Publication number Publication date
EP3041576A1 (en) 2016-07-13
KR102273028B1 (ko) 2021-07-02
EP3041576A4 (en) 2017-07-26
SMT201900526T1 (it) 2019-11-13
ES2746008T3 (es) 2020-03-04
EP3480600A1 (en) 2019-05-08
CA3213810A1 (en) 2015-03-12
JP6657096B2 (ja) 2020-03-04
US20220137059A1 (en) 2022-05-05
EP3480600B1 (en) 2023-11-08
EP3480600C0 (en) 2023-11-08
US11035861B2 (en) 2021-06-15
CA2923140C (en) 2023-09-26
ES2969979T3 (es) 2024-05-23
JP2020073927A (ja) 2020-05-14
LT3041576T (lt) 2019-10-25
CN105705202B (zh) 2019-02-26
HUE045723T2 (hu) 2020-01-28
CA2923140A1 (en) 2015-03-12
EP4295907A2 (en) 2023-12-27
KR102412431B1 (ko) 2022-06-22
JP2016530532A (ja) 2016-09-29
PT3041576T (pt) 2019-09-27
WO2015035155A1 (en) 2015-03-12
MX383274B (es) 2025-03-13
AU2014315063A1 (en) 2016-03-17
BR112016004839A8 (pt) 2020-02-11
KR20160051887A (ko) 2016-05-11
EP3041576B1 (en) 2019-06-19
MX2016002922A (es) 2016-11-07
AU2020256440B2 (en) 2023-03-02
MX2021006716A (es) 2021-07-15
AU2020256440A1 (en) 2020-11-12
SI3041576T1 (sl) 2019-11-29
KR20210082567A (ko) 2021-07-05
US20250271442A1 (en) 2025-08-28
JP2024020376A (ja) 2024-02-14
NZ717554A (en) 2022-04-29
JP7894843B2 (ja) 2026-07-24
EP4295907A3 (en) 2024-03-13
US20160187348A1 (en) 2016-06-30
PL3041576T3 (pl) 2019-12-31
CN105705202A (zh) 2016-06-22
JP2022070879A (ja) 2022-05-13
AU2014315063B2 (en) 2020-07-23
DK3041576T3 (da) 2019-09-09
CY1123179T1 (el) 2021-10-29
HRP20191569T1 (hr) 2019-11-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2020256440B2 (en) Methods for detecting renal disease
US20220221446A1 (en) Methods for Detecting Symmetrical Dimethylarginine
EP4640716A2 (en) Methods for detecting renal disease
HK40008342B (en) Methods for detecting renal disease
HK40008342A (en) Methods for detecting renal disease
HK1226979A1 (en) Methods for detecting renal disease
HK1226979B (en) Methods for detecting renal disease
BR112016004839B1 (pt) Método para estimar a taxa de filtração glomerular (gfr) em uma amostra de um indivíduo animal, para diagnosticar uma doença renal ou uma disfunção renal em uma amostra de um indivíduo animal, para predizer a morte prematura ou determinar a mortalidade associada a uma doença renal em um indivíduo animal a partir de uma amostra do mesmo, dispositivo e kit