RS59353B1 - Modulacija aktivnosti komplementa - Google Patents

Modulacija aktivnosti komplementa

Info

Publication number
RS59353B1
RS59353B1 RSP20191263A RS59353B1 RS 59353 B1 RS59353 B1 RS 59353B1 RS P20191263 A RSP20191263 A RS P20191263A RS 59353 B1 RS59353 B1 RS 59353B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
polypeptide
polypeptides
complement
acid
seq
Prior art date
Application number
Other languages
English (en)
Inventor
Michelle Denise Hoarty
Ketki Ashok Dhamnaskar
Daniel Elbaum
Kristopher Josephson
Kelley Cronin Larson
Zhong Ma
Nathan Ezekiel Nims
Alonso Ricardo
Kathleen Seyb
Guo-Qing Tang
Douglas A Treco
Zhaolin Wang
Ping Ye
Hong Zheng
Sarah Jacqueline Perlmutter
Robert Paul Hammer
Original Assignee
Ra Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=54834568&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS59353(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Ra Pharmaceuticals Inc filed Critical Ra Pharmaceuticals Inc
Publication of RS59353B1 publication Critical patent/RS59353B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/472—Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a, C5a
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis
UPUĆIVANJE NA POVEZANE PRIJAVE
[0001] Ova prijava zahteva prioritet od US privremene prijave patenta Br.62/011,368 podnete Juna 12, 2014, pod nazivom Modulacija aktivnosti komplementa, US privremene prijave patenta Br.62/077,460 podnete Novembra 10, 2014, pod nazivom Modulacija aktivnosti komplementa, i US privremene prijave patenta Br.62/108,772 podnete Januara 28, 2015, pod nazivom Modulacija aktivnosti komplementa.
LISTA SEKVENCI
[0002] Ova prijava sadrži Listu sekvenci koja je elektronski podneta u ASCII formati. Pomenuta ASCII copija, kreirana Juna 11, 2015, nosi naziv 20111005PCT_SL.txt i iznosi 130,110 bajtova.
OBLAST PRONALASKA
[0003] Ovaj pronalazak odnosi se na jedinjenja, uključujući polipeptide, koja su korisna kao inhibitori i/ili antagonisti aktivnosti komplementa. Ovde su takođe obezbeđeni postupci primene ovih inhibitora kao terapeutika.
POZADINA PRONALASKA
[0004] Imuni odgovor kičmenjaka sastoji se od adaptivnih i urođenih komponenti imuniteta. Dok je adaptivni imuni odgovor selektivan za određene patogene i sporog odgovora, komponente urođenog imunog odgovora prepoznaju širok spektar patogena i rapidno daju odgovor nakon infekcije. Jedna takva komponenta urođenog imunog odgovora je sistem komplementa.
[0005] Sistem komplementa uključuje oko 20 cirkulišućih proteina, sintetizovanih primarno od strane jetre. Komponente ovog određenog imunog odgovora prvo su nazvane "komplement" zbog zapažanja da dopunjuju odgovor antitela u uništavanju bakterija. Ovi proteini ostaju u neaktivnom obliku pre aktivacije kao odgovor na infekciju. Aktivacija se odvija putanjom proteolitičkog cepanja iniciranog prepoznavanjem patogena i dovođenjem do uništenja tog patogena. U sistemu komplementa, poznate su tri takve putanje, a one su klasična putanja, lektinska putanja i alternativna putanja. Klasična putanja aktivira se kada se IgG ili IgM molekul veže za površinu patogena. Lektinska putanja inicirana je the manan-vezujući lektinski protein koji prepoznaje ostatke šećera bakterijskog ćelijskog zida. Alternativna putanja ostaje aktivna na niskim nivoima u odsustvu bilo kog specifičnog stimulansa. Dok se sve tri putanje razlikuju u pogledu njihovog iniciranja, sve tri putanje teže cepanju komponenti C3 komplementa. C3 se cepa na dva proizvoda pod nazivom C3a i C3b. Od njih, C3b postaje kovalentno vezan za površinu patogena dok C3a dejstvuje kao difuzujući signal radi promovisanja zapaljenja i uposlio cirkulišuće imune ćelije. Površini-povezani C3b formira kompleks sa drugim komponentama radi započinjanja kaskade reakcija među tim komponentama sistema komplementa. Zbog potrebe za površinskim vezivanjem, aktivnost komplementa ostaje lokalizovana i minimizuje destrukciju na neciljanim ćelijama.
[0006] Sa patogenom povezana C3b omogućava uništavanje patogena na dva načina. U jednoj putanji, C3b se direktno prepoznaje od strane fagocitnih ćelija i to dovodi do zahvatanja tog patogena. U drugoj putanja, sa patogenom povezana C3b inicira formiranje membranskog napadnog kompleksa (MAC). U prvoj fazi, C3b ulazi u kompleksi sa drugim komponentama komplementa radi formiranja C5-konvertaza kompleks. Zavisno od inicijalne putanje aktivacije komplementa, komponente ovog kompleks se mogu razlikovati. C5-konvertaza formirana ko rezultat klasične putanje komplementa obuhvata C4b i C2a pored C3b. Kada se formira alternativnom putanjom, C5-konvertaza obuhvata dve podjedinice C3b kao i jednu Bb komponentu.
[0007] Komponenta C5 komplementa se cepa bilo kojim C5-konvertaza kompleksom na C5a i C5b. C5a, kao i C3a, širi se cirkulacijom i promoviše zapaljenje, delujući kao hemoatraktant za zapaljenske ćelije. C5b ostaje pričvršćen za ćelijsku površinu gde izaziva formiranje MAC-a kroz međusobne reakcije sa C6, C7, C8 i C9. MAC je hidrofilna pora koja se nalazi na membrani i promoviše slobodan protok fluida u i iz ćelije, čime je uništava.
[0008] Značajna komponenta sveukupne imunske aktivnosti je sposobnost imunog sistema da pravi razliku između sopstvenih i ne-sopstvenih ćelije. Patologija se javlja kada imuni sistem nije u stanju da napravi tu razliku. U slučaju sistema komplemnta, ćelije kičmenjaka eksprimiraju proteine koji ih štite od efekata komplement kaskade. To omogućava da su mete sistema komplemnta ograničene na patogene ćelije. Mnogi sa komplementom povezani poremećaji i bolesti povezani su sa abnormalnim uništavanjem sopstvenih ćelija od strane komplement kaskada. U jednom primeru, subjekti koji boluju od paroksizmalne noćne hemoglobinurije (PNH) ne mogu da sintetizuju funkcionalne verzije komplement regulatornih proteina CD55 i CD59 na hematopietičnim matičnim ćelijama. To rezultuje u komplementom-posredovanoj hemolizi i i raznim posledičnim komplikacijama. Drugi sa komplementom povezani poremećaji i bolesti čine, ali se ne ograničavaju na, autoimune bolesti i poremećaji, neurološke bolesti i poremećaji, bolesti i poremećaji krvi i infektivne bolesti i poremećaji. Eksperimentalni dokaz sugeriše da su mnogi sa komplementom povezani poremećaji zaobiđeni inhibicijom aktivnosti komplementa. Prema tome, postoji potreba da se razviju jedinjenja sposobna da selektivno blokiraju komplementom-posredovano uništavanje ćelija.
[0009] WO 98/32427 opisuje nepucajuće, sa produženim oslobađanjem biokompatibilne i biorazgradive mikrokapsule koje se sastoje od jezgra polipeptida.
[0010] WO 2013/126006 A1 opisuje C5 vezujuće polipeptide koji obuhvataju C5 vezujući motiv.
[0011] WO 2005/023866 A2 opisuje kompozicije koje inhibiraju aktivaciju komplementa.
SAŽETAK PRONALASKA
[0012] Ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid, pri čemu je taj polipeptid odabran od: SEQ ID NO: 177, 184, i 191-195. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju koja obuhvata polipeptid ovog pronalaska i prihvatljiv nosač ili ekscipijens. Dalje, ovaj pronalazak obezbeđuje kompoziciju ovog pronalaska za upotrebu u terapeutskom postupku za inhibiranje C5 cepanja u ćelijskom sistemu, pri čemu pomenuti postupak obuhvata dovođenje u kontakt pomenutog ćelijskog sistema sa kompozicijom.
[0013] Dalji aspekti ovog pronalaska definisani su u patentnim zahtevima. Ovaj pronalazak u opsiu koji sledi obezbeđuje informacije koje se odnose i na predmetnu stvar pokrivenu definicijom patentnih zahteva, kao i dodatne informacije koje se odnose na predmetnu stvar koje nisu pokrivene patentnim zahtevima. U opisu koji sledi, prilikom pozivanja na primere izvođenja ili aspekte, takve primere izvođenja ili aspekte treba shvatiti kao uopštene primere izvođenja ili aspekte ovog pronalaska, dok je obim ovog pronalaska definisan u patentnim zahtevima. Opis bilo koje predmetne stvari koja nije pokrivena patentnim zahtevima ovde je data samo kao informacija.
[0014] Ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenja, uključujući polipeptide (npr., peptidomimetici, ciklični polipeptidi i ciklični peptidomimetici,) male molekule, antitela, fragmente antitela, i aptamere, i postupke primene pomenutog jedinjenja za modulaciju komplementa. U skladu sa ovim pronalaskom, polipeptidi mogu da imaju sekvence navedene u SEQ ID NO 1-201 ili 211. One mogu biti ravne ili ciklične i mogu da obuhvataju cikličnu petlju formiranu premošćujućom grupom između dve aminokiseline. Premošćujuće grupe mogu da obuhvataju osobinu odabranu iz grupe koju čine disulfidna veza, amidna veza (laktam), tioetarska veza, aromatični prsten, nezasićeni alifatični ugljovodonični lanac, zasićeni alifatični ugljovodonični lanac, prsten triazola ili njihove kombinacije. Pored toga, ciklična petlja može da varira u dužini i može biti 1 aminokiselina, 2 aminokiseline, 3 aminokiseline, 4 aminokiseline, 5 aminokiselina, 6 aminokiselina, 7 aminokiselina, 8 aminokiselina, 9, aminokiselina, 10 aminokiselina, 11 aminokiselina, 12 aminokiselina, 13 aminokiselina, 14 aminokiselina, 15 aminokiselina, 16 aminokiselina, ili više.
[0015] Premošćujuća grupa može da obuhvata disulfid između dva cisteinska ostatka ili aromatični prsten proizveden reakcijom sa poli(bromometil)benzenom i takav poli(bromometil)benzen može biti odabran iz grupe koju čine 1,2- bis(biomometil)benzen, 1,3-bis(bromometil)benzen i 1,4-bis(biomometil)benzen.
[0016] Premošćujuća grupa takođe može da obuhvata aromatični prsten proizveden reakcijom sa jedinjenjem odabranim iz grupe koju čine 2,6-bis(bromometil)piridin, (E)-1,4-dibromobut-2-en i 1,2-bis(bromometil)-4-alkilbenzen.
[0017] Premošćujuća grupa takođe može da obuhvata amidnu vezu proizvedenu reakcijom bočnih lanaca sledećih parova aminokiselina: lizin i glutamat, lizin i aspartat, ornitin i glutamat, ornitin i aspartat, homolizin i glutaminska kiselina, homolizin i asparaginska kiselina, druge kombinacije aminokiselina, neprirodne aminokiseline ili ne-aminokiselinski ostaci koji obuhvataju primarni amin i karboksilna kiselina.
[0018] U skladu sa ovim pronalaskom, polipeptidi su korisni u tome što mogu da eksprimiraju komplement C5 inhibitorna aktivnost. U nekim slučajevima, takva aktivnost može da se kreće od polumaksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) manje od 50 nM.
[0019] Ovaj pronalazak opisuje polipeptide koji imaju triptofan ili jedan ili više analoga triptofana odabranih iz grupe koju čine 5-fluorotriptofan, 5-metil-O-triptofan, 1-metiltriptofan, D-triptofan i 7-azatriptofan prisutni unutar aminokiselinske sekvence. Takvo jedinjenja uključuje one iz SEQ ID NO: 3, 9, 11, 19, 45, 46, 50 i 59, između ostalog.
[0020] Polipeptidi opisan ovde mogu da se vežu za region na C5, pri čemu je pomenuti region udaljen od mesta cepanja C5a-C5b. U nekim slučajevima, polipeptidi opisan ovde mogu da inhibiraju cepanje C5 na C5a i C5b proizvode cepanja.
[0021] U nekim slučajevima, predmet ovog pronalaska može biti deo antitela.
[0022] Polipeptidi opisani ovde mogu biti obuhvaćeni u kompozicijama. Takve kompozicije mogu da obuhvataju jedan ili više prihvatljivih nosača ili ekscipijenasa. Takvi polipeptidi mogu dalje da budu konjugovan sa drugom ne-polipeptidnom grupom kao što je na primer u vodi rastvorljiv polimer. Ovi polimeri mogu biti hidrofilni ili hidrofobni. Hidrofilni polimer može biti odabran iz grupe koju čine polialkilen oksid homopolimeri, polipropilen glikoli, polioksietilenovani polioli i njihovi kopolimeri. On takođe može da obuhvata polietilen glikol (PEG). Kompozicije mogu dalje da obuhvataju polipeptide konjugovane sa albumin vezujućim polipeptidom odabranim iz grupe koju čine SEQ ID NO: 202-204. U nekim slučajevima kompozicije mogu da obuhvataju polipeptide konjugovane sa polipeptidom koji prodire u ćeliju odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 205-210. Kompozicije mogu dalje da obuhvataju polipeptide konjugovane sa lipidnom grupom. Lipidne grupe mogu da čine, ali se ne ograničavaju na, masne kiseline, fosfolipidi i steroli. U nekim slučajevima, lipidne grupe mogu biti direktno konjugovane sa ovde opisanim polipeptidima ili vezane za polipeptid-PEG konjugat. Neke kompozicije mogu da obuhvataju farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.
[0023] Ovde je opisan postupak za inhibiranje C5 cepanja u ćelijskom sistemu koji obuhvata upotrebu kompozicije, kao što su one prethodno opisane. Neki takvi postupci mogu da smanje C5a nivoe. Dalji postupci mogu da smanje formiranje membranskog napadnog kompleksa (MAC).
[0024] Neki postupci mogu da dovedu do inhibicije C5 cepanja sa IC50od oko 50 nM do oko 200 nM. U nekim slučajevima, postupci mogu da obuhvataju inhibiciju C5 cepanja sa IC50manjom od 50 nM.
[0025] Neki postupci mogu se primeniti na ćelijske sisteme koji su odabrani od in vitro sistema, in vivo sistema i ex vivo sistema. Neki in vivo sistemi mogu da uključuju subjekte, kao što su humani subjekti. U nekim slučajevima, polipeptidi i polipeptidne kompozicije mogu se primeniti u lečenju ili prevenciji bolesti, poremećaja i/ili stanja povezanog sa komplementom kod nekog subjekta. Davanje subjektu može biti odabrano iz grupe koju čine bukalno, intranealno, oralno, intravensko, intramuskularno, intraperitonelano, subkutano, transdermalno i intravitrealno. U nekim slučajevima, kompozicije se mogu primeniti za lečenje paroksizmalne noćne hemoglobinurije i/ili atipičnog hemolitičko uremičkog sindroma. U nekim slučajevima, kompozicije opisane ovde mogu se primeniti za lečenje jedne ili više od zapaljenska indikacija, rana, povreda, autoimuna bolest, vaskularna indikacija, neurološka indikacija, indikacija povezana sa bubrezima, i očna bolest.
[0026] Ovde su opisani postupci za inhibiranje trombinom-indukovane aktivacije komplementa u ćelijskim sistemima koji obuhvataju dovođenje u kontakt takvih sistema sa ovde opisanim polipeptidima. Dalje su opisani postupci lečenja hemolize kod subjekata, koji obuhvataju davanje ovde opisanih polipeptida. U skladu sa nekim takvim postupcima, hemoliza koja se leči izazvana je trombinom-indukovanom aktivacijom komplementa.
[0027] Ovde su opisani kompleti za dijagnozu, prognozu, profilaksu ili lečenje bolesti, poremećaja i/ili stanja kod nekog sisara, uključujući čoveka. Takvi kompleti bi sadržavali jedan ili više polipeptida ili polipeptidnih kompozicija opisanih ovde i opciono reagense i/ili uputstva za upotrebu. Kod takvih kompleta, polipeptidi mogu da obuhvataju detektabilno obeležje ili sposobnost da se vežu za detektabilno obeležje radi formiranja detektabilnog kompleksa. To obeležje može da obuhvata BODIPY-TMR obeležje.
OPIS CRTEŽA
[0028]
FIG.1 je grafikon koji pokazuje rezultate enzimskog imunoogleda (EIA) za detektovanje C5a u supernatantu iz ogleda hemolize humanih crvenih krvnih zrnaca (RBC) sa rastućim koncentracijama inhibitora R3002 (SEQ ID NO: 3) i R3008 (SEQ ID NO: 9). Nivoi C5a u korelaciji su sa aktivnošću komplementa i prema tome su pokazatelj sposobnosti ispitanog jedinjenja da inhibiraju aktivnost komplementa. Supernatant iz hemolitičkog ogleda razblažen je 1:50 i procenjen na C5a nivoi. C5a nivoi smanjeni su u humanom hemolitičkom ogledu na uzorcima supernatana sa rastućim nivoima bilo kog procenjenog inhibitora. R3002 (SEQ ID NO: 3) ima IC50od 5.4 nM dok R3008 (SEQ ID NO: 9) ima IC50od 54.5 nM. Kako se ovde koristi, pojam "IC50" odnosi se na polumaksimalnu inhibitornu koncentraciju, vrednost koja se koristi da ukaže na količinu inhibitora koja je potrebna da se smanji data reakcija ili postupak za pola.
FIG.2 je grafikon koji pokazuje rezultate EIA za detektovanje membranskog napadnog kompleksa (MAC) u supernatantu iz humanog RBC hemolitičkog ogleda sa rastućim koncentracijama R3008 (SEQ ID NO: 9). Nivoi MAC-a u korelaciji su sa aktivnošću komplementa i prema tome su pokazatelj sposobnosti R3008 (SEQ ID NO: 9) da inhibira aktivnost komplementa. Supernatant iz hemolitičkog ogleda razblažen je 1:5 i procenjen na MAC nivoe. MAC nivoi smanjeni su u hemolitičkom ogledu na uzorcima supernatana sa rastućim nivoima inhibitora procenjenog sa IC50od 33 nM.
FIG.3 je grafikon koji pokazuje podatke kompetetivne fluorescencione polarizacije (FP) za ispitane predmete R3003 (SEQ ID NO: 4), R3011 (SEQ ID NO: 31), R3014 (SEQ ID NO: 55), R3023 (SEQ ID NO: 104), R3043 (SEQ ID NO: 50) i R3050 (SEQ ID NO: 23). FP omogućava da se pojave vezivanja izmere u homogenom rastvoru. Sproveden je ogled kompetetivnog vezivanja u kome je 25 nM rastvor jedinjenja R3076 (SEQ ID NO: 40), koji ima fluorescentni tag, kombinovano sa rastućim količinama test predmeta i izmeren za promene u FP (u mili-polarizujućim jedinicama; mP). Snižavanje mP nivoa u korelaciji je sa uspešnim ulaženjem u kompeticiju test predmeta sa C5. Prikazani su proseci dva nezavisna eksperimenta sprovedena u triplikatu (+/standardna devijacija). Od svih ispitanih predmeta, R3003 (SEQ ID NO: 4) bio je najpotentniji dok R3023 (SEQ ID NO: 104), kontrolni polipeptid, nije pokazao nikakvu aktivnost pri najvišim testiranim koncentracijama.
FIG.4 prikazuje rezultate iz ispitivanja na makaki majmun. Prikazane su promene u R3152 (SEQ ID NO: 153) plazma koncentraciji (kružići) nakon pojedinačne 3 mg/kg IV doze na makaki majmunu. Takođe su pokazane promene u hemolitičkoj aktivnosti (kvadrati) u istim vremenskim tačkama.
FIG.5 prikazuje rezultate jedinjenja koja su praćena u plazmi sledeći intravensko (IV; kvadrati) ili subkutano (SC; kružići) davanje 2 mg/kg R3152 (SEQ ID NO: 153) mužjacima Sprague-Dawley pacova. Praćenje obuhvata određivanje kombinovanih plazma kombinacija za R3152 (SEQ ID NO: 153) kao i njegovog ekvipotentnog C-terminalnog deaminovanog metabolita, R3201 (SEQ ID NO: 211.)
FIG.6 prikazuje farmakokinetike ovde opisanih jedinjenja od pacova. Levo: Male Sprague-Dawley pacovima (n=3) ubrizgani su intravensko sa jednom 2 mg/kg doza. Uzorci krvi sakupljeni su u indikovanim vremenskim tačkama, obrađeni u plazmu, i analizirani za indikovano jedinjenje putem LC-MS. Crni kružići: R3176 (SEQ ID NO: 177) (ne-lipidovano jedinjenje); Otvoreni kružići: R3183 (SEQ ID NO: 184) (C16 lipidovano jedinjenje). Desno: Male Sprague-Dawley pacovi (n=3) ubrizgani su subkutano sa jednom 15 mg/kg dozom. Uzorci krvi sakupljeni su u indikovanim vremenskim tačkama, obrađeni u plazmu, i analizirani za indikovano jedinjenje putem LC-MS. Crni kružići: R3176 (SEQ ID NO: 177) (nelipidovano jedinjenje); Otvoreni kružići: R3183 (SEQ ID NO: 184) (C16 lipidovano jedinjenje).
FIG.7 je grafikon koji prikazuje efekte R3183 (SEQ ID NO: 184) (C16 lipidovano jedinjenje) ili anti-C5 monoklonalnog antitela slično ECULIZUMAB® na inhibiciju hemolize putem trombinom-indukovane putanje komplementa.
DETALJAN OPIS
[0029] Ovaj pronalazak odnosi se na otkriće novih C5 modulatornoih jedinjenja. Takva jedinjenja mogu da čine, ali se ne ograničavaju na, polipeptide (npr. ciklični polipeptidi, peptidomimetici i ciklični peptidomimetici, mali molekuli, antitela, fragmenti antitela, i aptameri. U nekim slučajevima, C5 modulatorna jedinjenja su polipeptidi, kao što su ciklični polipeptidi, peptidomimetici i ciklični peptidomimetici koji su korisni u dijagnozi i/ili lečenju bolesti ukojoj je poželjna inhibicija aktivacije komplementa. Polipeptidi opisani ovde mogu specifično da se vežu za komponentu C5 komplementa. U nekim slučajevima, polipeptidi mogu da smanje komplementom-posredovanu ćelijsku liziju sprečavanjem cepanja C5 na C5a i C5b fragmente.
[0030] Kako se ovde koristi, "mimetik" se odnosi na molekul koji eksprimira neke od osobina ili osobine drugog molekula. "Peptidomimetik" ili "polipeptidni mimetik" je mimetik u kojem molekul sadrži strukturne elemente koji se ne mogu naći kod prirodnih polipeptida (tj. polipeptidi sačinjeni od samo 20 proteinogenih aminokiselina). Peptidomimetici mogu biti sposobni da rekapituliraju ili imitiraju biološku aktivnost(i) prirodnih peptida. Peptidomimetik se može razlikovati na mnoge načine od prirodnih polipeptida, uključujući, ali ne ograničavajući se na promene u strukturi kičme i prisustvo aminokiselina koje se ne javljaju u prirodi. U nekim slučajevima, peptidomimetici mogu da uključuju aminokiseline sa bočnim lancima koji se ne javljaju među poznatih 20 proteinogenih aminokiselina, ne-polipeptidbazirane premošćujuće grupe koje se primenjuju da izvedu ciklizaciju između terminalnih krajeva ili internalnih delova molekula, supstitucije amidne veze vodonične grupe metil grupom (N-metilacija) ili drugim alkil grupama, zamena peptidne veze sa hemijskom grupom ili vezom koja je otporna na hemijske ili enzimatske tretmane, N- i C-terminalne modifikacije, i konjugacija sa ne-peptidnim nastavkom (kao što je polietilen glikol, lipidi, ugljeni hidrati, nukleozidi, nukleotidi, nukleozidne baze, razni mali molekuli, ili fosfatne ili sulfatne grupe).
[0031] Neki polipeptidi mogu biti ciklični. Ciklični polipeptidi uključuju bilo koje polipeptide koji kao deo svoje strukture imaju jednu ili više cikličnih osobina kao što je petlja, premošćujuća grupa, i/ili interna veza. Kako se ovde koristi, pojam "premošćujuća grupa" odnosi se na jednu ili više komponenti mosta formiranog između dve susedne ili ne-susedne aminokiseline, neprirodne aminokiseline ili neaminokiseline u polipeptidu. Premošćujuće grupe mogu biti bilo koje veličine ili kompozicije.
Premošćujuće grupe mogu da obuhvataju jednu ili više hemijskih veza između dve susedne ili nesusedne aminokiseline, neprirodne aminokiseline, ne-aminokiselinski ostaci ili njihove kombinacije. Takve hemijske veze mogu biti između jedne ili više funkcionalnih grupa na susednim ili ne-susednim aminokiselinama, neprirodnim aminokiselinama, ne-aminokiselinskim ostacima ili njihovim kombinacijama. Premošćujuće grupe mogu da obuhvataju jednu ili više osobina uključujući, ali ne ograničavajući se na amidnu vezu (laktam), disulfidnu vezu, tioetarsku vezu, aromatični prsten, prsten triazola, i ugljovodonični lanac. Premošćujuće grupe mogu da obuhvate amidnu veza između aminske funkcionalnosti i karboksilatne funkcionalnosti, od kojih je svaka prisutna u aminokiselini, neprirodnoj aminokiselini ili bočnom lancu ostatka ne-aminokiseline. U nekim slučajevima, aminske ili karboksilatne funkcionalnosti predstavljaju deo ne-aminokiselinog ostatka ili ostatka neprirodne aminokiseline. U nekim slučajevima, premošćujuće grupe mogu da obuhvate veze formirane između ostataka koji mogu da čine, ali se ne ograničavaju na, (S)-2-amino-5-azidopentanoičnu kiselinu (takođe u daljem tekstu označenu kao "X02"), (S)-2-aminohept-6-enoičnu kiselinu (takođe u daljem tekstu označenu kao "X30"), (S)-2-aminopent-4-inoičnu kiselinu (takođe u daljem tekstu označenu kao "X31") i (S)-2-aminopent-4-enoičnu kiselinu (takođe u daljem tekstu označenu kao "X12".) Premošćujuće grupe mogu biti formirane putem reakcija ciklizacije upotrebom metateze olefina. U nekim slučajevima, takve premošćujuće grupe mogu biti formirane između X12 i X30 ostataka. U nekim slučajevima, premošćujuća grupa obuhvata disulfidnu vezu formiranu između dva ostatka koja sadrže tiol. U nekim slučajevima, premošćujuća grupa obuhvata jedan ili više tioetar veza. Takve tioetar veze, mogu da uključe i jednu koja se nalazi u jedinjenjima ciklo-tioalkila. Ove veze su formirane tokom reakcije hemijske ciklizacije između N-terminalno modifikovanih grupa hloro sirćetne kiseline (takođe u daljem tekstu označene kao "X35") i ostataka cisteina. U nekim slučajevima, premošćujuće grupe obuhvataju jedan ili više prstenova triazola. Takvi prstenovi triazola mogu da čine, ali se ne ograničavaju na, one formirane reakcijom ciklizacije između X02 i X31. U nekim slučajevima, premošćujuće grupe obuhvataju ne-proteinske ili nepolipeptidne grupe, uključujući, ali ne ograničavajući se na ciklične prstenove (uključujući, ali ne ograničavajući se na strukture aromatičnih prstenova (npr. ksilils)). Takve premošćujuće grupe mogu biti uvedene reakcijom sa reagensima koja sadrži višestruke reaktivne halide, uključujući, ali ne ograničavajući se na poli(bromometil)e poli(bromometil)piridme, poli(bromometil)alkilbenzene i/ili (E)-1,4-dibromobut-2-en. Primeri premošćujućih grupa uključuju sledeće strukture:
pri čemu svako X nezavisno predstavlja N ili CH, tako da nijedan prsten ne sadrži više od 2 N; pri čemu je svako Z nezavisno odsutno ili odabrano iz veze, NR, O, S, CH2, C(O)NR, NRC(O), S(O)vNR i NRS(O)v; pri čemu je svako m nezavisno odabrano od 0, 1, 2, i 3; pri čemu je svako v nezavisno odabrano od 1 i 2; pri čemu je svako R nezavisno odabrano od H i C1-C6; i pri čemu je svaka premošćujuća grupa povezana sa polipeptidom putem nezavisno odabrane veze ili C1-C6spejsera.
[0032] Polipeptidi se mogu dobiti makrociklično formiranjem kovalentnih veza između atoma prisutnih unutar linearniog polipeptida i atoma premošćujuće grupe. Ova premošćujuća grupa služi svrsi hemijskog povezivanja lancem dva reaktivna mesta na linearnom polipeptidu kako bi se obezbedio ciklični polipeptidni proizvod. Primeri uključuju polipeptide ciklizovane na gore pomenuti način i koji obuhvataju premošćujuću grupu koja sadrži aromatični, 6-člani prsten. U ovim slučajevima, atomi ravnog polipeptida koji formiraju eksplicitne hemijske veze sa premošćujućom grupom mogu biti heteroatomi (uključujući, ali ne ograničavajući se na, azot, kiseonik i sumpor), ili zasićeni ili nezasićeni atomi ugljenika. U svakom od ovih slučajeva, atomi polipeptidnog bočnog lanca mogu biti vezani direktno sa atomom ugljenika unutar aromatičnog prstena premošćujuće grupe. Kod alternativnih oblika, atomi polipeptidnog bočnog lanca mogu biti vezani za zasićenu -CH2- grupu koja je za uzvrat direktno vezana sa atomom ugljenika unutar aromatičnog prstena premošćujuće grupe. U određenim slučajevima, aromatični, 6-člani prsten unutar premošćujuće grupe je benzen, kao kod struktura koje slede pri čemu Z može biti odabran od NH, S, O i (CH)2:
[0033] Kod alternativnih oblika, aromatični, 6-člani prsten koji obuhvata premošćujuću grupu je heterociklični i sadrži jedan ili više atoma azota. U ovim slučajevima, aromatični heterociklični oblik može biti piridin, koji sadrži jedan atom azota u aromatičnom prstenu [npr. bilo koja od dole prikazanih struktura pri čemu Z može biti odabran od NH, S, O i (CH)2]:
[0034] Aromatični heterociklični oblici mogu alternativno biti piridazini, koji sadrže dva susedna atoma azota u 1,2-orijentaciji unutar aromatičnog prstena [npr. bilo koja od dole prikazanih struktura pri čemu Z može biti odabran od NH, S, O i (CH)2]:
[0035] U drugim slučajevima, aromatični heterociklični oblik može biti pirimidin, koji sadrži dva atoma azota u 1,3-orijentaciji unutar aromatičnog prstena [npr. bilo koja od dole prikazanih struktura pri čemu Z može biti odabran od NH, S, O i (CH)2]:
[0036] Alternativno, aromatični heterociklični oblik može biti pirazin, koji sadrži dva atoma azota u 1,4-orijentaciji unutar aromatičnog prstena [npr. bilo koja od dole prikazanih struktura pri čemu Z može biti odabran od NH, S, O i (CH)2]:
[0037] Kod alternativnih oblika, polipeptidi se dobijaju makrociklično kao rezultat formiranja kovalentne veze između atoma ravni polipeptida i atoma slučajeva premošćujuće grupe koja se sastoji od heterocikličnog, aromatičnog, 5-članog prstena. U ovim slučajevima, atomi ravnog polipeptida koji formiraju eksplicitne hemijske veze sa premošćujućom grupom mogu biti heteroatomi (uključujući, ali ne ograničavajući se na, azot, kiseonik i sumpor), ili zasićeni ili nezasićeni atomi ugljenika. U svakom od ovih slučajeva, atomi polipeptidnog bočnog lanca mogu biti vezani direktno za atom ugljenika ili atom azota unutar aromatičnog prstena premošćujuće grupe. Kod alternativnih oblika, atomi polipeptidnog bočnog lanca mogu biti vezani za zasićenu -CH2- grupu koja je za uzvrat direktno vezana za atom ugljenika ili atom azota unutar aromatičnog prstena premošćujuće grupe. U određenim slučajevima, heterociklični, aromatični, 5-člani prsten unutar premošćujuće grupe je 1,2,3-triazol. U ovim slučajevima, aromatični prsten može biti supstituisan na pozicijama 1 i 4 sa hemijskom funkcionalnošću ravnog polipeptida koji se tretira. Alternativno, porozna struktura 1,2,3-triazola može biti supstituisana na pozicijama 1 i 4 sa -CH2- grupom koje su direktno vezane za atome ravnog polipeptida koji se tretira [npr. bilo koja od dole datih struktura pri čemu Z može biti odabranu od NH, S, O i (CH)2]:
[0038] U drugim slučajevima, heterociklični, aromatični, 5-člani prsten koji obuhvata premošćujuću grupu je pirazol. U ovim slučajevima, aromatični prsten može biti supstituisan ili na pozicijama 1 i 3 ili na pozicijama 1 i 4 sa hemijskom funkcionalnošću ravnog polipeptida koji se tretira. Alternativno, porozna struktura pirazola može biti supstituisana ili na pozicijama 1 i 3 ili na pozicijama 1 i 4 sa -CH2- grupom koji su direktno vezani za atome ravnog polipeptida koji se tretira [npr. bilo koji od dole prikazanih struktura pri čemu Z može biti odabran od NH, S, O i (CH)2]:
[0039] Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde upotrebljavaju imaju isto značenje koje je poznato stručnjaku iz tehnike kome ovaj pronalazak pripada. Iako se postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima opisanim ovde mogu koristiti u praksi ili ispitivanju cikličnih polipeptida i postupaka sadržanih u ovom opisu, u nastavku su opisani prikladni postupci i materijali
Polipeptidi kao lekovi
[0040] U skladu sa njihovom veličinom i kompleksnošću, polipeptidi mogu da formiraju brojne, visoko specifične kontakte sa biološkim ciljevima i mogu da pokažu visok nivo selektivnosti za ispravni ili željeni cilj u poređenju sa blisko povezanim ciljem unutar iste porodice. Ne-ciljni efekti (poznati kao neželjena dejstva) često dovode do toga da izuzetno delotvorni lekovi ne dobiju registraciono odobrenje usled bezbednosnih problema.
[0041] Brojni polipeptidi (uključujući, ali ne ograničavajući se na peptidomimetike, su razvijeni u delotvorne lekove. U njih se ubrajaju, ali bez ograničenja na,, insulin, peptid 1 (GLP-1) sličan glukagonu, somatostatin, vazopresin, ciklosporin A, i njima slični. Terapeutski polipeptid može biti identičan molekulu koji se prirodno javlja (tj. onaj koji cirkuliše u telu ljudskih bića i smatra se „divljim tipom“ kod ljudske populacije). U mnogim drugim slučajevima, polipeptid nije prikladan ili je pod-optimalan za terapeutsku upotrebu usled kratkog cirkulišućeg polu-života koji je često takav usled metaboličke nestabilnosti u organizmu. U ovim slučajevima koristi se modifikovan oblik ili varijanta polipeptida (peptidomimetik) koja za rezultat ima poboljšano farmakokinetičko ili farmakodinamičko ponašanje. U drugim slučajevima polipeptid dobijen iz prirodnog izvora ima ekvivalentan mehanizam delovanja i poželjan farmaceutski profil i može se koristiti kao terapija. Na primer, egzenatid, sintetička verzija egzedin-4, ima biološke osobine slične humanom peptidu 1 (GLP-1) koji je sličan glukagonu ali sa poboljšanom farmakokinetikom, i odobren je od Američke agencije za hranu i lekove (FDA) za lečenje dijabetesa melitusa tip 2. Kao drugi primer, kalcitonin lososa, kalcitonin ekstrahovan iz ultimobranhijalnih žlezda losos, liči na humani kalcitonin ali je aktivniji od humanog kalcitonina i može se primenjivati za lečenje postmenopauzalne osteoporoze, hiperkalcaemije, Pagetove bolesti, metastaza kostiju i bola fantomske noge.
[0042] Polipeptidi su obično ograničeni na ne-oralne puteve primene. U gotovo svim slučajevima, polipeptidi se moraju davati putem injekcije, jer čak i veoma mali polipeptidi (npr., polipeptidi sa 4-10 aminokiselinskih ostataka) ne mogu ili jedva mogu da prođu kroz ćelijske zidove koji oblažu intestinalni trakt. Radi efikasne oralne dostupnosti, lekovi obično moraju da prođu kroz luminalne i bazolateralne membrane epitelijalnih ćelija creva kako bi dospeli do sistemske cirkulacije. Slaba popustljivost membrane i nedostatak oralne bioraspoloživosti polipeptida značajno ograničavaju terapeutsku upotrebu.
[0043] Na efikasnost polipeptida kao leka može uticati proteolitička stabilnost. Unutar organizma, polipeptidi mogu biti modifikovani ili degradirani enzimima, koji mogu da ograniče njihovu efikasnost radi interakcije sa ciljem. Unutar organizma, polipeptidi mogu biti modifikovani ili degradirani enzimima, koji mogu da ograniče njihovu efektivnost radi stupanja u interakciju sa nameravanim ciljem.
[0044] Metabolička stabilnost polipeptida je važna budući da je povezana sa njihovom globalnom fleksibilnošću, intramolekularnim fluktuacijama, raznim internim dinamičkim procesima kao i mnogim biološkim funkcijama. Metabolička stabilnost polipeptida može biti kritična u razvoju farmaceutskih preparata, i može uticati na parametre kao što su, ali bez ograničenja na, bistrina, polu-život i bioraspoloživost lekova.
[0045] Održavanje zadatog nivoa terapeutskog polipeptida unutar organizma ili krvotoka može biti teško usled efluksa. Brzina efluksa polipeptida iz tela može da varira i trebalo bi je pratiti kada se uzme u obzir davanje terapeutskih polipeptida.
[0046] Ostaje značajna medicinska potreba za komplementnom aktivacijom inhibitora ili inhibitora komplementne aktivnosti i formulacija inhibitora koje su visoko potentne i visoko specifične.
Otkriće peptidomimetika
[0047] Peptidomimetici mogu biti identifikovani različitim sredstvima. U nekim slučajevima peptid koji se prirodno javlja ili sekvenca iz prirodnog proteina se koristi kao početna tačka. U ovim slučajevima, polazna sekvenca peptida je izabrana zato što je poznato da stupa u fizičku interakciju sa željenim ciljnim molekulom. Prirodni peptid može biti izabran jer predstavlja agonist ili antagonist za receptor, inhibira enzim, ili modulira kanal. Sekvenca kod prirodnog proteina može biti izabrana jer obuhvata domen koji učestvuje u interakciji sa drugim proteinom ili nekim drugim molekulom kod čoveka ili životinje. U mnogim slučajevima, strukturni podaci o interakciji proteina se mogu dobiti iz javno dostupnih baza podataka (npr. the RCSB Protein Data Bank; H.M. Berman, J. Westbrook, Z. Feng, G.
Gilliland, T.N. Bhat, H. Weissig, I.N. Shindyalov, P.E. Bourne (2000) The Protein Data Bank Nucleic Kiselinas Research, 28: 235-242) a specifičan region proteina koji stupa u interakciju sa željenim ciljem može biti identifikovan iz kristalografičkih podataka o kompleksu proteina. U drugim slučajevima, polipeptidi koji odgovaraju različitim delovima proteina se mogu pripremiti i ispitati radi vezivanja za cilj od interesa. Kada se identifikuju, hemijske modifikacije se uvode kako bi se poboljšala stabilnost i potentnost, pri čemu se dobija peptidomimetik koji ima poboljšane farmakokinetičke ili farmakodinamičke parametre.
[0048] U drugim slučajevima, polipeptid se izoluju jednim od nekoliko postupaka za izolovanje polipeptidnih sekvenci iz biblioteka polipeptida zasnovanih na njihovim afinitetima ka specifičnim ciljnim proteinima, nukleinskim kiselinama, ugljenim hidratima, lipidima, ili celim ćelijama. Takvi postupci uključuju prikaz faga, prikaz mRNK, prikaz ribozoma, prikaz DNK, skup koji kodira DNK, i dvohibridno skeniranje, kao i njihove modifikacije (See, e.g., Takashashi, T.T et al. (2003). Trends in Biochem.
Sci.28(3):159-165; Kay, B.K. et al. (2001). Methods.24:240-246; He, M and Taussig, M (2002). Briefs in Functional Genomics and Proteomics.1(2): 204-212; Rothe, A. et al. (2006). The FASEB Journal.
20(10):1599-1610.)
[0049] Polipeptidi mogu da usvoje trodimenzionalne strukture koje su sposobne da se vezuju za druge biološke molekule sa određenim stepenom afiniteta i specifičnosti. Neki se vezuju sa veoma visokim afinitetom i specifičnošću. Biblioteka nasumičnih polipeptidnih sekvenci se popunjava molekulima sa raznovrsnim trodimenzionalnim strukturama. Kako bi se izolovao peptid sa konformacijom koji stupa u interakciju sa specifičnim ciljnim proteinom, mogu se pripremiti pojedinačne sekvence iz biblioteke i ispitati ili skenirati zbog afiniteta ka cilju. Međutim, za veoma velike biblioteke (>10<6>članova), skeniranje individualne sekvence za vezujući afinitet nije izvodljivo. Kako bi se ovo ograničenje prevazišlo, razvijen je čitav niz tehnika za odabir novih polipeptida iz ekstremno velikih, mešavina kompleksa u skladu sa njihovim vezujućim afinitetom prema cilju. Budući da se za vezujuće polipeptide visokog afiniteta predviđa da su albo prisutni u populaciji, ovi postupci odabira se oslanjaju na održavanje fizičke veze između polipeptida i genetskog materijala (uopšteno nukleinske kisleine kao što je DNK ili RNK) koja kodira polipeptid tako da odabir polipeptida automatski uključuje odabir nukleinske kiseline koja ga kodira. Nukleinska kiseline koja kodira odabrani polipeptid može da bude amplifikovana i sekvencirana kako bi se otkrila sekvenca i nukleinske kiseline i polipeptida. U jednom pristupu, prikaza faga
(see Cwirla, S.E. et al. (1990). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.87:6378-6382; Dower, W.J. i Cwirla, S.E. U.S. Patent Nos.5,427,908 i 5,580,717), svaki nasumični član biblioteke polipeptida je prikazao na površini bakteriofaga česticu fuzionog proteina između polipeptida jednog od proteina omotača faga. Čestica faga obezbeđuje vezu između polipeptida i kodirajuće DNK tako što ih zajedno locira unutar istog fizičkog entiteta, i kodirajuća DNK može biti naknadno amplifikovana inficiranjem bakterija sa odabranim fagom. U drugom pristupu, prikaz ribozoma (videti Kawasaki, G.H. U.S. Patent Nos.
5,658,754 i 5,643,768), mešavina molekula nosioca poruke RNK (mRNK) se translatuje in vitro na način koji proizvodi, za svaku mRNK u mešavini, stabilizovani kompleks ribozoma, mrNK, i novo sintetizovani polipeptid koji proizilazi iz ribozoma. Stabilizovanje kompleksa dopušta da se održava zajedno dok se polipeptidi skeniraju radi vezivanja za cilj od interesa. mRNK koje kodiraju odabrane polipeptide mogu da budu amplifikovane upotrebom reakcijom lanca polimeraze (PCR), i da budu okarakterisane, npr., sekvenciranjem.
[0050] Opet u drugom pristupu, prikaz mRNK (sec Szostak, J.W. i Roberts, R.W., U.S. Patent No.
6,258,558), svaki mRNK molekul u biblioteci je modifikovan kovalentnim dodatkom grupe koja liči na puromicin na svom 3' terminalnom kraju. Grupa koja liči na piromicin predstavlja analog aminoacil-tRNK acceptor stem analog koji funkcioniše kao primalac peptidila, i može da se doda rastućem lancu polipeptida putem aktivnosti peptidil transferaze ribozoma koji translatuje mRNK. Tokom in
vitro translacije, mRNK i kodirani polipeptid postaju kovalentno povezani putem grupe koja liči na piromicin, stvarajući RNK-peptid fuziju. Nakon odabira fuzionog molekula vezivanjem njegovih polipeptidnih komponenti za cilj, RNK komponenta odabranog fuzionog molekula se može pojačati korišćenjem PCR-a, a zatim okarakterisana. Nekoliko drugih postupaka je razvijeno kako bi se proizvela fizička veza između polipeptida i njegove kodirajuće nukleinske kiseline kako bi se olakšao odabir i amplifikacija. Razvijeno je nekoliko drugih postupaka kako bi se proizvela fizička veza između polipeptida i njegove kodirajuće nukleinske kiseline radi olakšanja odabira i amplifikacije (videti Yanagawa, H., Nemoto, N., Miyamoto, E., and Husimi, Y., U.S. Patent No.6,361,943; Nemoto, H., Miyamoto-Sato, E., Husimi, H., and Yanagawa, H. (1997). FEBS Lett.414:405-408; Gold, L., Tuerk, C., Pribnow, D., and Smith, J.D., U.S. Patent Nos.5,843,701 and 6,194,550; Williams, R.B., U.S. Patent No.
6,962,781; Baskerville, S. and Bartel, D.P. (2002). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:9154-9159; Baskerville, D.S. and Bartel, D.P., U.S. Patent No.6,716,973; Sergeeva, A. ct al. (2006). Adv. Drug Deliv. Rev.58:1622-1654).
[0051] mRNK prikaz je naročito koristan postupak za stvaranja velikih biblioteka polipeptida. S tim u vezi, ovde su opisani postupci biranja polipeptida (ili mRNK koja kodira polipeptid) koji stupa u interakciju sa komplementnim proteinom C5. Biblioteka generalno sadrži najmanje 10<2>članova, poželjnije najmanje 10<6>članova, i najpoželjnije najmanje 10<9>članova (npr., bilo koji od mRNK-polipeptid kompleksa). U nekim slučajevima, biblioteka broji najmanje 10<12>članova ili najmanje 10<14>članova. Uopšteno, članovi se razlikuju jedan od drugog; međutim, očekuje se da postoji određeni stepen preopširnosti u bilo kojoj biblioteci. Biblioteka može da postoji kao jedinstvena mešavina svih članova, ili može da se podeli na nekoliko bazena koji se drže u odvojenim kontejnerima ili bunarčićima, od kojih svaki sadrži podskup biblioteke, ili biblioteka može predstavljati zbir kontejnera ili bunarčića na ploči, od kojih svaki kontejner ili bunarčić sadrži jedan ili nekoliko članova biblioteke.
[0052] Svaka mRNK u biblioteci može da obuhvati sekvencu inicijacije translacije, start kodon, i varijabilni polipeptid (npr., protein ili kratak peptid) koji kodira region koji je generisan, na primer, nasumičnim ili polu-nasumičnim sklopom nukleotida, i varira od mRNK do mRNK u biblioteci (iako postoji verovatnoća da se javi određeni stepen preopširnosti unutar biblioteke). Sekvenca inicijacije translacije, start kodon, i varijabilni polipeptid koji kodira region može biti sa obe strane poznatih, fiksrianih sekvenci koje se mogu koristiti za PCR amplifikaciju mRNK, npr., nakon odabira. Druge fiksirane sekvence koje mogu biti prisutne uključuju onu koja odgovara sekvencama koje kodiraju aminokiseline koje učestvuju u hemijskim ili enzimski ukrštenim reakcijama, tako da proizvedeni polipeptid može biti modifikovan ili derivatizovan nakon translacije, ili tako da kodira produžetak fiksnog C-terminalnog kraja kao što je tag polipeptida koji može da olakša prečišćavanje peptid-mRNK fuzija.
[0053] Kada se stvori biblioteka mRNK derivatizovane sa puromicinom, ista ta biblioteka se može translatovati. Dobijeni polipeptidi (npr., prikazani polipeptidi) su vezani za njihove odgovarajuće mRNK kako je ovde opisano (npr., kao mRNK-polipeptid kompleks).
[0054] U literaturi su opisani brojni in vitro sistemi translacije. Najčešći sistemi koriste lizate retikulocita zeca, ekstrakte pšenične klice, ili ekstrakte E. coli, koji su dostupni iz velikog proja komercijalnih izvora u obliku kompleta (npr., Ambion, Austin, TX; Promega, Madison, WI; Novagen/EMD Chemicals, Gibbstown, NJ; Qiagen, Valencia, CA).
[0055] Za razliku od prikaza faga ili drugih sistema koji se oslanjaju na translaciju unutar ćelije, prikaz mRNK može da se adaptira direktno kako bi se proizvele biblioteke peptidometika izvođenjem in vitro translacije sa neprirodnim ili ne-standardnim aminokiselinama.20 prirodnih proteinogenih aminokiselina su identifikovane i ovde označene ili sa jednoslovnim ili troslovnim oznakama kako sledi: asparaginska kiselina (Asp:D), izoleucin (Ile:I), treonin (Thr:T), leucin (Leu:L), serin (Ser:S), tirozin (Tyr:Y), glutaminska kiselina (Glu:E), fenilalanin (Phe:F), prolin (Pro:P), histidin (His:H), glicin (Gly:G), lizin (Lys:K), alanin (Ala:A), arginin (Arg:R), cistein (Cys:C), triptofan (Trp:W), valin (Val:V), glutamin (Gln:Q) metionin (Met:M), asparagin (Asn:N). Aminokiseline koje se prirodno javljaju postoje u svojim levorotirajućim (L) sterkoizomernim oblicima. Aminokiseline pomenute ovde su L-stereoizomeri izuzev tamo gde je to drugačije naznačeno.
[0056] Neprirodne aminokiseline imaju bočne lance ili druge osobine koje nisu prisutne kod 20 aminokiselina koje se prirodno javljaju navedenih gore i uključuju, ali nisu ograničene na: N-metil aminokiseline, N-alkil aminokiseline, alfa, alfa supstituisane aminokiseline, beta-aminokiseline, alfahidroksi aminokiseline, D-aminokiseline, i druge neprirodne aminokiseline poznate u tehnici (videti, npr., Josephson et al., (2005) J. Am. Chem. Soc.127: 11727-11735; Forster, A.C. et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 6353-6357; Subtelny et al., (2008) J. Am. Chem. Soc.130: 6131-6136; Hartman, M.C.T. et al. (2007) PLoS ONE 2:e972; and Hartman et al., (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4356-4361).
[0057] Suštinski bilo koja aminokiselina koja, kada je pričvršćena za odgovarajuću tRNK, može biti uklopljena u polimer upotrebom prirodnih ili mutantnih ribozoma (videti Sando, S. et al., (2007) J. Am. Chem. Soc.129:6180-6186; Dedkova, L. et al. (2003) J. Am. Chem. Soc.125: 6616-6617; Josephson, K., Hartman, M.C.T., i Szostak, J.W. (2005) J. Am. Chem. Soc.127:11727-11735; Forster, A.C. et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:6353-6357; Subtelny, A.O., Hartman, M.C.T., i Szostak, J.W. (2008) J. Am. Chem. Soc.130:6131-6136; i Hartman, M.C.T. et al. (2007) PLoS ONE 2:e972).
[0058] Kada su poželjne neprirodne aminokiseline, povoljno je koristiti prečišćen sistem translacije kome nedostaju enfogene aminoacilisane tRNK (Shimizu, Y. et al. (2001) Nat. Biotech.19:751-755; Josephson, K., Hartman, M.C.T., i Szostak, J.W. (2005) J. Am. Chem. Soc.127: 11727-11735; Forster, A.C. et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 6353-6357). Ukoliko se neprirodne aminokiseline koriste sa in vitro sistemom translacije baziranim na lizatu ili ekstraktu, može biti poželjno da se istroši ektrakt endogenih tRNK, kako je prethodno opisano (videti Jackson, R.J., Napthine, S., and Brierley, I. (2001) RNA 7:765-773). Sistem zasnovan na faktorima translacije prečišćene E. coli je komercijalno dostupan (PUREKSPRIMIRAJU™; New England Biolabs, Ipswich, MA). Ovi sistemi su naročito korisni za translaciju sa neprirodnim aminokiselinama radi proizvodnje peptidomimetika.
[0059] Kada se koriste prirodne aminokiseline sa in vitro sistemom za translaciju baziranim na lizatu ili ekstraktu, translacija zavisi od enzimatskog punjenja aminokiselina na tRNK putem tRNK sintetaza, od kojih su sve komponenete ekstrakti. Alternativno, in vitro sistemi translacije koji koriste prečišćene faktore translacije i ribozome, ili ekstrakte istrošene tRNK, zahtevaju da se obezbede aminoakilisane tRNK. U ovim slučajevima, prečišćene ili in vitro sintetizovane tRNK mogu da se pune aminokiselinama korišćenjem hemijskih (videti Frankel, A., Millward, S.W., and Roberts, R.W. (2003) Chem. Biol.10:1043-1050) ili enzimatskih postupaka (Josephson, K., Hartman, M.C.T., and Szostak, J.W. (2005) J. Am. Chem. Soc.127: 11727-11735; Murakami, H. et al. (2006) Nat. Postupci 3:357-359).
[0060] Brojne publikacije opisuju oporavak mRNK-prikazanih polipeptida od kompleksa za translaciju, i oni su pogodni za upotrebu sa ovde opisanim postupcima (Liu, R. et al. (2000). Methods Enzymol.
318:268-293; Baggio, R. et al. (2002). J. Mol. Recognit.15:126-134; U.S. Pat. No.6,261,804). Oporavak mRNK-prikazanih polipeptida može biti olakšan upotrebom različitih „tagova“ koji su uključeni u polipeptid translacijom fiksnih sekvenci polipeptida koji kodira sekvence i koji se vezuju za specifične supstrate ili molekule. Brojni reagensi za hvatanje takvih tagova se komercijalno dostupni, uključujući reagense za hvatanje His-tag, FLAG-tag, glutaciju-S-transferaze (GST) tag, strep-tag, HSV-tag, T7-tag, S-tag, DsbA-tag, DsbC-tag, Nus-tag, myc-tag, hemaglutinin (HA)-tag, ili Trx-tag (Novagen, Gibbstown, NJ; Pierce, Rockford, IL). mRNK-prikazani polipeptidi se takođe mogu izolovati vezivanjem poliA zadnjeg dela na mRNK do polidT smole, ili kombinacijom poliA zadnjeg dela i His-tag-a.
[0061] Nakon izvođenja in vitro rekacije translacije, a pre faze odabira, deo mRNK funkcionalne RNK je obično obrnuto-transkribovan kako bi se proizveo RNK-DNK hibridni molekul. Ovo služi da se RNK zaštiti od degradiranja, i takođe sprečava savijanje RNK u sekundarnu strukturu koja može da se veže za cilj odabira, što bi dovelo do odabira neprikladnih proizvoda (npr., odabira RNK aptamera pre nego aptamera polipeptida).
[0062] Nakon in vitro translacije i izolacije polipeptid-mRNK fuzija, polipeptid grupa može biti modifikovana intramolekularnom ili intermolekularnim ukrštanjem, hemijskom konjugacijom, enzimatskim cepanjem, skraćivanjem, ili produžetkom sa dodatnim monomerima aminokiselina. Jedan način da se to postigne je inkorporacijam neprirodnih aminokiselina sa reaktivnim bočnim lancima u polipeptide koji čine biblioteku. Nakon translacije, novo formirani polipeptidi mogu da reaguju sa molekulima koji reaguju specifično sa reaktivnim bočnim lancima inkorporisane aminokiseline. Na primer, aminokiselina sa bočnim lancem sa alkinom na kraju može da bude inkorporisana u polipetidnu biblioteku i naknadno može da reaguje sa azido šećerom, stvarajući biblioteku prikazanih polipeptida sa šećerima pričvršćenim na pozicijama alkinilskih bočnih lanaca (Josephson, K., Hartman, M.C.T., and Szostak, J.W. (2005) J. Am. Chem. Soc.127: 11727-11735). Različiti bočni lanci se mogu koristiti za takve konjugacije nakon translacije, uključujući amine, karboksilne grupe, azide, terminalne alkine, alkene i tiole.
[0063] Jedna naročito korisna modifikacija je zasnovana na ukrštanju aminokiselina radi proizvodnje cikličnih struktura. Ciklični regioni u polipeptidu sadrže tvrd domen, koji smanjuje konformacionu fleksibilnost i stepene rotacione slobode, što dovodi do vezivanja veoma visokog afiniteta za ciljne proteine. Neodređeni broj postupaka za ciklizaciju polipeptida je dostupan stručnjacima u tehnici. Obično, hemijska reaktivnost bočnih lanaca specifičnih aminokiselina i/ili karboksil ili amino terminalnih krajeva polipeptida se eksploatiše tako da ukrsti dva mesta polipeptida kako bi se proizveo ciklični molekul. U jednom postupku, tiol grupa cisteinskog ostatka je ukrštena sa drugim cisteinskim ostatkom kako bi se formirala disulfidna veza. U nekim slučajevima, tiol grupe ostataka cisteina reaguju sa bromometil grupom molekula poli(bromometil)benzena kako bi se formirala stabilna veza
(videti Timmerman, P. et al., (2005) ChemBioChem 6:821-824). Molekuli poli(bromometil)benzena mogu da čine, ali se ne ograničavaju na, 1,2-bis(bromometil)benzen, 1,3-bis(bromometil)benzen i 1,4-bis(bromometil)benzen. Bis-, tris- i tetrakis(bromometil)benzen molekuli, na primer, se mogu koristiti da generišu premošćujuće grupe radi proizvodnje polipeptida sa jednom, dve ili tri petlje. Bromometil grupe molekula poli(bromometil)benzena mogu biti raspoređeni na prstenu benzena na susednom prstenu ugljenika (orto- ili o-), sa prstenom ugljenika koji razdvaja dve grupe (meta- ili m-) ili na suprotnom prstenu ugljenika (para- ili p-). U nekim slučajevima, m-bis(bromometil)benzen (takođe u daljem tekstu označen kao m-dibromoksilen) se koristi kod formiranja cikličnih polipeptida. U nekim slučajevima, o-bis(bromometil)benzen (takođe u daljem tekstu označen kao o-dibromoksilen) ili pbis(bromometil)benzen (takođe u daljem tekstu označen kao p-dibromoksilen) se koriste kod formiranja cikličnih polipeptida. U nekim slučajevima, tiol grupe ostataka cisteina reaguju sa drugim reagensima koji obuhvataju jednu ili više bromo funkcionalnih grupa kako bi se formirale stabilne veze. Takvi reagensi mogu da čine, ali se ne ograničavaju na, poli(bromometil)piridins (uključujući, ali ne ograničavajući se na 2,6-bis(bromometil)piridin), poli(bromometil)alkilbenzens (uključujući, ali ne ograničavajući se na 1,2-bis(bromometil)-4-alkilbenzen) i/ili (E)-1,4-dibromobut-2-en.
[0064] U drugom primernom postupku, bočni lanac amino grupe i terminalna amino grupa se ukrštaju sa disukcinimidil glutaratom (videti Millward, S.W. et al., J. Am. Chem. Soc.127:14142-14143, 2005). U drugim pristupima, ciklizacija se postiže formiranjem tioetarske veze između dva mesta na polipeptidu (videti Timmerman, P. et al., (2005) ChemBioChem 6:821-824). Enzimatski postupak se oslanja na reakciju između (1) cisteina i (2) dehidroalanina ili dehidrobutirin grupe, pri čemu je katalizator lantibiotska sintetaza, kako bi se stvorila tioetarska veza (videti Levengood, M.R. and Van der Donk, W.A., Bioorg. and Med. Chem. Lett.18:3025-3028, 2008). Dehidro funkcionalna grupa takođe može biti hemijski generisana oksidacijom selenijuma koji sadrži bočne lance aminokiseline inkorporisane tokom translacije (videti Seebeck, F.P. and Szostak, J.W. J. Am. Chem. Soc.2006).
[0065] Biblioteka mRNK-polipeptid fuzija (takođe u daljem tekstu označena kao biblioteka mRNK prikaza) generisana gore opisanim postupcima, i koja može ili ne mora biti podvrgnuta posttranslacionoj modifikaciji (kao što je ciklizacija polipeptida, kako je gore opisano), može biti podvrgnuta fazi odabira šarže za izolovanje onih kompleksa koji pokazuju poželjne polipeptide.
[0066] Obično se, C5 konjuguje u čvrst supstrat, kao što je agaroza ili sintetička polimerna perla. Brojni postupci su dostupni za imobilisanje C5 u čvrstu potporu. Kod jednog naročito korisnog postupka, C5 se konjuguje sa biotinom a perle streptavidina se koriste da imobilišu protein. Perle koje obuhvataju imobilisani C5 se mešaju sa bibliotekom mRNK prikaza i inkubiraju se u uslovima (npr., temperature, jonske snage, dvovalentnih katjona, i kompetitivnih vezujućih molekula) koji dozvoljavaju specifičnim članovima biblioteke da se vežu za cilj. Alternativno, biotinilisan enzim može biti slobodan u rastvoru i, nakon vezivanja za odgovarajući polipeptid, fuzije mRNK-polipeptida vezane za C5 su uhvaćene od strane odgovarajuće modifikovanih perli.
[0067] Uslovi vezivanja mogu da variraju kako bi se izmeni strogoća odabira. Na primer, niska koncentracija kompetitivnog sredstva za vezivanje se može dodati kako bi se obezbedilo da odabrani polipeptidi imaju relativno visok afinitet. Alternativno, može se odabrati da period inkubacije bude veoma kratak, takav da se samo polipeptidi sa visokim stopama kon(stopa združavanja) mogu izolovati. Na ovaj način, uslovi inkubacije igraju važnu ulogu u određivanju osobina odabranih polipeptida.
Negativni odabir se takođe može koristiti. U ovom slučaju, odabir da se uklone polipeptidi sa afinitetom ka supstratu za koji je cilj vezan (npr., sefaroza) se vrši primenom prikazane biblioteke na perle supstrata kojima nedostaje ciljni protein. Ova faza može da ukloni mRNK i njihove kodirane polipeptide koji nisu specifični za ciljani protein. Dostupne su brojne reference koje opisuju kako se sprovodi eksperimenti vezano za odabir. (videti, npr., U.S. Patent No.6,258,558, Smith, G.P. and Petrenko, V.A., (1997) Chem.
Rev.97:391-410; Keefe, A.D. and Szostak, J.W. (2001) Nature 15:715-718; Baggio, R. et al. (2002) J. Mol. Recog.15:126-134 and Sergeeva, A. et al. (2006) Adv. Drug Deliv. Rev.58:1622-1654).
[0068] Očekuje se da je učestalost u kojoj su vezujući molekuli prisutni u biblioteci nasumičnih sekvenci veoma niska. Na taj način, kod početne faze odabira, tek nekoliko polipeptida koji ispunjavaju kriterijume odabira (i njihove mRNK) bi trebalo obnoviti. Uobičajeno, odabir se ponavlja sa mRNK odabranim tokom prvog kruga odabira. Ovo se postiže korišćenjem PCR-a da se amplifikuju mRNK ili odgovarajuće DNK odabrane u prvom krugu, praćene sa in vitro transkripcijom kako bi se proizvela nova biblioteka mRNK. Koriste se PCR prajmeri koji odgovaraju 5' i 3' terminalnim krajevima mRNK u biblioteci. Obično, se 5' prajmer produžava u smeru 5' izvan terminalnog kraja mRNK tako da se bakterijski promoter, kao što je T7 promoter, dodaje 5' terminalnom kraju svakog amplifikovanog molekula. Kada se amplifikuje, dvolančana DNK se može koristiti kod in vitro reakcije transkripcije kako bi se generisala mRNK za naredni krug odabira.
[0069] Postupak odabira obično uključuje neodređeni broj rundi ili krugova, u kojima se bazen odabranih molekula postepeno obogaćuje u specifičnom skupu sekvenci na kraju svake runde. Uslovi odabira mogu biti isti za svaku rundu, ili se uslovi mogu promeniti, na primer, kako bi se povećala strogoća odabira u kasnijim rundama. Napredak odabira se može pratiti upotrebom izotopičnoobeleženih aminokiselina, kao što je<35>S metionin. Količina radioobeleženih polipeptida vezanih za cilj u svakoj rundi se izmeri, a progresivni porast obnovljenog radioobeležja je pokazatelj progresivnog bogaćenja kod RNK molekula koji kodiraju polipeptide sa vezujućim afinitetetom prema cilju. Nakon bilo koje runde, PCR proizvodi mogu biti klonirani i sekvencirani. Generalno, kloniranje i sekvenciranje se izvode nakon runde u kojoj se prilične (npr. >2% preko pozadine u perle kojima nedostaje imobilisani C5) količine radioobeleženog polipeptida obnavljaju kod bazena vezanog za cilj. Sekvence pronađene u višestrukim izolovanim primerima predstavljaju kandidate za kodiranje polipeptida koji se specifično vezuju za cilj. Alternativno, veliki protok podataka o sekvenciranju hiljada klonova može da se izvede nakon prve ili narednih rundi. Sekvence koje povećavaju frekvenciju između, na primer, treće i četvrte runde predstavljaju kandidate za kodiranje polipeptida koji se specifično vezuju za cilj. Polipeptid kodiran bilo kojom sekvencom može biti preveden ili sintetizovan i ispitan radi vezujućeg afiniteta prema originalnom ciljanom proteinu koji se koristi u odabiru.
[0070] Biblioteke i postupci opisani ovde mogu se primeniti kako bi se optimizovala funkcija ili osobine polipeptida. Kod jednog pristupa, mutageni PCR (Keefe, A.D. and Szostak, J.W. (2001). Nature 15:715-718) se koristi da bi se uvela varijacija sekvence u biblioteku kada se populacija obogati polipeptidima sa odrešenim nivoom afiniteta ka vezivanju. Alternativno, jedna RNK sekvenca koja kodira polipeptid sa definisanim osobinama vezivanja može biti replicirana ali sa definisanim nivoom mutacija, ili mutageni PCR može biti izveden kako bi se proizveo bazen mutiranih molekula. Po in vitro translaciji dobijena mešavina od mRNK molekula proizvedena od takvog bazena se očekuje da kodira polipeptide sa opsegom poboljšanih, sličnih, ili smanjenih afiniteta u poređenju sa početnom sekvencom, a odabir koji je izveden na mRNK od takvog bazena se može očekivati da identifikuje polipeptide sa poboljšanim afinitetom ukoliko se prilikom odabir vrši uz određeni režim strogoće.
[0071] Kod drugog pristupa, optimizacija se izvodi direktno. Sekvenca koja kodira polipeptid sa ustanovljenim svojstvima vezivanja ili funkcionalnim svojstvima je podvrgnuta mutagenezi usmerenoj ka mestu, pri čemu je proizvedena serija sekvenci, pri čemu svaka sekvenca ima jedan kodon koji je zamenjen sa, na primer, kodonom alanina. Broj sekvenci u skupu je jednak broju ostataka aminokiselima koje bi trebalo mutirati. Nakon in vitro translacije, proizvod polipeptida svakog mutanta"skeniranog alaninom " se ispituje zbog vezujućih ili funkcionalnih osobina. Mesta na kojima supstitucija alanina utiče na vezivanje ili funkciju polipeptida se smatraju kritičnim ostacima. Slično tome, skeniranje N-metila se može sprovesti, tako da je svaki ostatak zamenjen sa derivatom N-metila, i mogu se identifikovati pozicije u kičmi polipeptida koje mogu da tolerišu supstitucije N-metila.
[0072] Alternativno, sekvence se mogu združiti, tako što se podvrgnu jednoj ili više rundi izuzetno strogog postupka odabira i izoluje se bazen sekvenci koje predstavljaju polipeptide visokog afiniteta vezivanja. Kritični ostaci se identifikuju nakon DNK sekvenciranja obnovljenog DNK kao oni koji ne mogu biti supstituisani ostatkom analina bez gubitka aktivnosti. Kada se kritični ostaci identifikuju, bazen mRNK molekula koji kodiraju široku paletu prirodnih (ili neprirodnih) aminokiselina je proizveden na svakoj kritičnoj poziciji. Dobijeni bazen prolazi kroz jednu ili više rundi izuzetno strogog odabira (sa odgovarajućom mešavinom tRNK napunjenih prirodnim ili neprirodnim aminokiselinama), i sekvence koje predstavljaju polipeptide visokog afiniteta vezivanja se izoluju nakon in vitro translacije. Na ovaj način, može da se identifikuje optimalni polipeptid. Obzirom da optimalna mešavina ne mora nužno da bude identifikovana kombinovanjem optimalnih ostataka na pojedinačnim mestima, korisno je da se ispitaju mutacije na višestrukim mestima u kombinaciji.
[0073] Skeniranje i alanina i N-metila se može takođe sprovesti pomoću pristupa hemijske sinteze, kao što je sinteza polipeptida čvrste faze (videti npr., Coin, I et al. (2007); Nature Protocols 2(12):3247-56).
[0074] Kada se bazen, populacija ili podskup polipeptida identifikuju, kod njih se mogu proceniti terapeutske ili dijagnostičke primene, uključujući poboljšane farmakokinetičke i/ili farmakodinamičke osobine.
[0075] U nekim slučajevima, kod polipeptida se procenjuje jedan ili više ciljanih afiniteta vezivanja, aktivnost u biohemijskim ogledima ili ogledima baziranim na ćelijama, rezistentnosti proteaze, in vitro ili in vivo propustljivost, osobine koje se odnose na pogodnost za upotrebu u obliku faramceutskog sredstva kao što je vezivanje proteina plazme, metabilizan (kod mikrozoma, hepatocita, ili plazme), P-glikoprotein (Pgp) inhibicija i inhibicija citohroma P450. Polipeptidi opisani ovde mogu takođe biti ispitani radi oralne bioraspoloživosti, toksičnosti, inhibicije proizvoda human ether-a-go-go related gene (hERG), cirkulišućeg polu-života, drugih farmakokinetičkih i farmakodinamičkih parametara, i efikasnosti kod bolesti modela životinja.
Polipeptidi
[0076] Kada se jedan polipeptid ili bazen molekula polipeptida kandidata identifikuje, oni takođe mogu da prođu jednu ili više rundi optimizacije odnosa struktura-aktivnost (SAR) pomoću standardnih tehnika za sintezu polipeptida. Takva optimizacija može da uključi razmatranja kao što je izbegavanje napunjenih polarnih bočnih lanaca (Asp, Glu, Arg, Lys) koji mogu da inhibiraju prodiranje ćelije, izbegavanje bočnih lanaca koji predstavljaju metaboličke odgovornosti (Tyr, Met, Trp, Cys), poboljšana rastvorljivost, izbegavanje nepotrebne molekulske mase, izbegavanje veza koje mogu da se rotiraju, i menjanje lipofilnosti.
[0077] Cilj ovog pronalaska je da obezbedi ciklične peptidomimetike dizajnirane da budu metabolički stabilni, ćelijski propusni, i/ili oralno dostupni.
Varijante aminokiseline
[0078] Kako se ovde koristi, pojam "aminokiselina" uključuje ostatke prirodne aminokiseline kao i neprirodne aminokiseline. Pojam takođe uključuje aminokiseline koje nose konvencionalnu zaštitnu grupu (npr. acetil ili benziloksikarbonil), kao i prirodni i neprirodne aminokiseline zaštićene na karboksi terminalnom kraju (npr., kao (C1-C6) alkil, fenil ili benzil ester ili amid; ili kao alfa-metilbenzil amid). Druge prigodne amino i karboksi zaštićene grupe su poznate stručnjacima iz tehnike (videti na primer, Greene, T. W.; Wutz, P. G. M., Protecting Grupe In Organic Synthesis; second edition, 1991, New York, John Wiley & sons, Inc., i dokumenta navedena u istim). Polipeptidi i/ili polipeptidne kompozicije opisane ovde mogu takođe da uključe modifikovane aminokiseline.
[0079] Neprirodne aminokiseline korisne za optimizaciju polipeptida i/ili polipeptidnih kompozicija čine, ali bez ograničenja na, 1,2,3,4-tetrahidroizokvinolin-1-karboksilna kiselina, 1-amino-2,3-hidro-1H-inden-1-karboksilna kiselina, homolizin, homoarginin, homoserin, 2-aminoapidinska kiselina, 3-aminoapidinska kiselina, beta-alanin, aminopropionska kiselina, 2-aminobutirinska kiselina, 4-aminobutirinska kiselina, 5-aminopentanoinska kiselina, 5-aminoheksanoična kiselina, 6-aminokaproinska kiselina, 2-aminoheptanoična kiselina, 2-aminoizobutirna kiselina, 3-aminoizobutirna kiselina, 2-aminopimelinska kiselina, dezmozin, 2,3-diaminopropionska kiselina, N-etilglicin, N-etilasparagin, homoprolin, hidroksilizin, alo-hidroksilizin, 3-hidroksiprolin, 4-hidroksiprolin, izodezmozin, alo-izoleucin, N-metilpentiglicin, naftilalanin, ornitin, pentiglicin, tioprolin, norvalin, tert-butilglicin, fenilglicin, azatriptofan, 5-azatriptofan, 7-azatriptofan, 4-fluorofcnilalanin, penicilamin, sarkozin, homocistein, 1-aminociklopropankarboksilna kiselina, 1-aminociklobutankarboksilna kiselina, 1-aminociklopentankarboksilna kiselina, 1-aminocikloheksankarboksilna kiselina, 4-aminotetrahidro-2Hpiran-4-karboksilna kiselina, (S)-2-amino-3-(1H-tetrazol-5-il)propionska kiselina, ciklopentiglicin, cikloheksilglicin, ciklopropilglicin, η-ω-metil-arginin, 4-hlorofenilalanin, 3-hlorotirozin, 3-fluorotirozin, 5-fluorotriptofan, 5-hlorotriptofan, citrulin, 4-hloro-homofenilalanin, homofenilalanin, 4-aminometilfenilalanin, 3-aminometil-fenilalanin, oktilglicin, norleucin, traneksamična kiselina, 2-amino pentanoinska kiselina, 2-amino heksanoična kiselina, 2-amino heptanoična kiselina, 2-amino oktanoična kiselina, 2-amino nonanoična kiselina, 2-amino dekanoična kiselina, 2-amino nedekanoična kiselina, 2-amino dodekanoinska kiselina, aminovalerinska kiselina, i 2-(2-aminoetoksi)sirćetna kiselina, pipekolinska kiselina, 2-karboksi azetidin, heksafluoroleucin, 3-Fluorovalin, 2-amino-4,4-difluoro-3-metilbutanoinska kiselina, 3-fluoro-izoleucin, 4-fluoroizoleucin, 5-fluoroizoleucin, 4-metil-fenilglicin, 4-etil-fenilglicin, 4-izopropil--fenilglicin, (S)-2-amino-5-azidopentanoinska kiselina (takođe u daljem tekstu označena kao "X02"), (S)-2-aminohept-6-enoična kiselina (takođe u daljem tekstu označena kao "X30"), (S)-2-aminopent-4-inoična kiselina (takođe u daljem tekstu označena kao "X31"), (S)-2-aminopent-4-enoična kiselina (takođe u daljem tekstu označena kao "X12"), (S)-2-amino-5-(3-metilgvanidino) pentanoinska kiselina, (S)-2-amino-3-(4-(aminometil)fenil)propionska kiselina, (S)-2-amino-3-(3-(aminometil)fenil)propionska kiselina, (S)-2-amino-4-(2-aminobenzo[d]oksazol-5-il)butanoinska kiselina, (S)-leucinol, (S)-valinol, (S)-tert-leucinol, (R)-3-metilbutan-2-amin, (S)-2-metil-1-fenilpropan-1-amin, i (S)-N,2-dimetil-1-(piridin-2-il)propan-1-amin, (S)-2-amino-3-(oksazol-2-il)propionska kiselina, (S)-2-amino-3-(oksazol-5-il)propionska kiselina, (S)-2-amino-3-(1,3,4-oksadiazol-2-il)propionska kiselina, (S)-2-amino-3-(1,2,4-oksadiazol-3-il)propionska kiselina, (S)-2-amino-3-(5-fluoro-1H-indazol-3-il)propionska kiselina, i (S)-2-amino-3-(1H-indazol-3-il)propionska kiselina, (S)-2-amino-3-(oksazol-2-il)butanoinska kiselina, (S)-2-amino-3-(oksazol-5-il) butanoinska kiselina, (S)-2-amino-3-(1,3,4-oksadiazol-2-il) butanoinska kiselina, (S)-2-amino-3-(1,2,4-oksadiazol-3-il) butanoinska kiselina, (S)-2-amino-3-(5-fluoro-1H-indazol-3-il) butanoinska kiselina, i (S)-2-amino-3-(1H-indazol-3-il) butanoinska kiselina, 2-(2'MeOfenil)-2-amino sirćetna kiselina, tetrahidro 3-izokvinolinkarboksilna kiselina i njihovi steroizomeri (uključujući, ali bez ograničenja na, do D i L izomera).
[0080] Dodatne neprirodne aminokiseline korisne u optimizaciji polipeptida ili polipeptidnih kompozicija uključuju ali bez ograničenja na fluorovane aminokiseline pri čemu jedan ili više atoma vodonika vezanih za ugljenik su zamenjeni fluorom. Broj uključenih atoma fluora je u opsegu od 1 do i uključujući sve atome vodonika. Primeri takvih aminokiselina uključuju ali bez ograničenja na 3-fluoroprolin, 3,3-difluoroprolin, 4-fluoroprolin, 4,4-difluoroprolin, 3,4-difluroprolin, 3,3,4,4-tetrafluoroprolin, 4-fluorotriptofan, 5-flurotriptofan, 6-fluorotriptofan, 7-fluorotriptofan, i njihove stereoizomere.
[0081] Dalje neprirodne aminokiseline koje su korisne u optimizaciji polipeptida ili polipeptidnih kompozicija ali bez ograničenja na one koje su disupstituisane na α-ugljeniku. One uključuju aminokiseline u kojima su dva supstituenta na α-ugljeniku ista, na primer α-amino izobutirna kiselina, i 2-amino-2-etil butanoinska kiselina, kao i one kod kojih su supstituenti različiti, na primer αmetilfenilglicin i α-metilprolin. Dalje supstituenti na α-ugljeniku mogu biti uzeti zajedno kako bi se formirao prsten, na primer 1-aminociklopentankarboksilna kiseline, 1-aminociklobutankarboksilne kiseline, 1-aminocikloheksankarboksilne kiseline, 3-aminotetrahidrofuran-3-karboksilne kiseline, 3-aminotetrahidropiran-3-karboksilne kiseline, 4-aminotetrahidropiran-4-karboksilne kiseline, 3-aminopiraildna-3-karboksilna kiselina, 3-aminopiperidin-3-karboksilna kiselina, 4-aminopiperidin-4-karboksiliksne kiseline, i njihovih izomera.
[0082] Dodatne neprirodne aminokiseline koje su korisne u optimizaciji polipeptida ili polipeptidnih kompozicija uključuju ali bez ograničenja na analoge triptofana u kojima je prstenasti sistem indola zamenjen drugim 9 ili 10-članim dvocikličnim prstenastim sistemom koji obuhvata 0,1,2,3 ili 4 heteroatoma nezavisno odabranih od N,O, ili S. Svaki prstenasti sistem može biti zasićen. Delimično nezasićen ili potpuno nezasićen. Taj prstenasti sistem može biti supstituisan 0,1,2,3, ili 4 supstituentima bilo kog atoma koji se može supstituisati. Svaki supsitutent je nezavisno odabran od H, F, Cl, Br, CN, COOR, CONRR', okso, OR, NRR'. Svaki R i R' je nezavisno odabran od H, C1-C20 alkil, C1-C20 alkil-O-C1-20 alkil.
[0083] U nekim slučajevima, analozi triptofana (takođe u daljem tekstu označeni kao "analozi triptofana") koji su korisni u optimizaciji polipeptida ili polipeptidne kompozicije čine, ali se ne ograničavaju na, 5-fluorotriptofan [(5-F)W], 5-metil-O-triptofan [(5-MeO)W], 1-metiltriptofan [(1-Me-W) ili (1-Me)W], D-triptofan (D-Trp), azatriptofan (uključujući, ali ne ograničavajući se na 4-azatriptofan, 7-azatriptofan i 5-azatriptofan,) 5-hlorotriptofan, 4-fluorotriptofan, 6-fluorotriptofan, 7-fluorotriptofan, i njihove stereoizomere. Osim u slučajevima gde je to suprotno naznačeno, pojam "azatriptofan" i njegova skraćenica, "azaTrp," kako se ovde koristi, se odnose na 7-azatriptofan.
[0084] Modifikovani aminokiselinski ostaci koji su korisni za optimizaciju polipeptida i/ili polipeptidne kompozicije čine, ali se ne ograničavaju na, one koji su hemijski blokirani, reverzibilno ili ireverzibilno, ili hemijski modifikovani na njihovim amino guprama sa N-terminalnim krajem ili njihovim bočnim lancima grupe, ili hemijski modifikovani u kičmi amida, kao na primer, N-metilisan, D (neprirodne aminokiseline) i L (prirodne aminokiseline) stereoizomeri ili ostaci pri čemu su bočni lanac funkcionalne grupe hemijski modifikovani drugim funkcionalnim grupama. Na primer, modifikovane aminokiseline uključuju bez ograničenja, metionin sulfoksid; metionin sulfon; asparaginsku kiselinu-(beta-metil ester), modifikovanu aminokiselinu asparaginske kiseline; N-etilglicin, modifikovanu aminokiselinu glicina; ili alanin karboksamid, i modifikovanu aminokiselinu alanina. Neprirodne aminokiseline se mogu nabavljati od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), Bachem (Torrance, CA) ili drugih dobavljača. Neprirodne aminokiseline mogu dalje da uključe bilo koje od onih navedenih u Tabeli 2 u US patent publication US 2011/0172126.
[0085] U nekim slučajevima, sekvence aminokiselina polipeptida i/ili polipeptidne kompozicije mogu da obuhvate samo aminokiseline koje se prirodno javljaju. Dok je u tehnici poznato da pojmovi peptidi, polipeptidi, i/ili njihovi fragmenti ukazuju na relativnu veličinu, ove pojmove kako se ovde upotrebljavaju, ne bi trebalo smatrati ograničavajućim u smislu veličine raznih molekula baziranih na polipeptidima pomenutim u ovom tekstu, ukoliko drugačije nije napomenuto. U nekim slučajevima, polipeptidi mogu da obuhvate i aminokiseline koje se prirodno i ne-prirodno javljaju i/ili modifikovane aminokiseline ili mogu da obuhvataju isključivo aminokiseline koje se prirodno javljaju.
Varijante polipeptida
[0086] Bilo koja aminokiselina bazirana na molekulu (prirodnom ili neprirodnom) može biti označena pojmom „polipeptid“ a ovaj pojam obuhvata „peptide“, „peptidomimetike“ i proteine. "Polipeptidi su takođe kategorija proteina i tradicionalno se smatraju da su u opsegu veličine od oko 4 do oko 50 aminokiselina. Dipeptidi, oni koji imaju dva ostataka aminokiselina, predstavljaju kategoriju polipeptida kao što su tripeptidi (polipeptidi koji obuhvataju tri aminokiseline). Polipeptidi veći od oko 50 aminokiselina su generalno označeni pojmom "proteini." Polipeptidne sekvence mogu biti ravne ili ciklične. Na primer, ciklični polipeptid se može pripremiti ili može nastati kao rezultat formiranja disulfidne veze između dva ostatka cisteina u sekvenci. Polipeptid može biti ciklizovan putem karboksi terminalnog kraja, amino terminalnog kraja ili putem druge pogodne tačke dodavanja, kao što je, na primer, putem sumpora cisteina bilo koje strane lanca ostatka aminokielsina ili druge veze uključujući, ali ne ograničavajući se na, vezu maleimida, amidnu vezu, estar vezu, etar vezu, tiol etar vezu, hidrazon vezu, ili acetamidnu vezu. U nekim slučajevima, ciklični polipeptidi se formiraju kada molekul ima ulogu premošćujuće grupe povezivanja dva ili više regiona polipeptida.
[0087] Pojam "varijanta sekvence aminokiseline" se odnosi na polipeptide sa nekim razlikama u njihovim sekvencama aminokiselina u poređenju sa polaznom, referentnom ili nativnom sekvencom. Varijante sekvence aminokiseline mogu da poseduju supstitucije, brisanja, i/ili umetanja na određenim pozicijama unutar sekvence aminokiseline. Uobičajeno, varijante poseduju najmanje oko 70% homologije u odnosu na nativnu ili polaznu sekvencu, i poželjno, oni su 80%, poželjnije 90% homologni u odnosu na nativnu ili polaznu sekvencu.
[0088] "Homologija" kako je primenjiv na sekvence aminokiselina je definisana kao procenat ostataka u kandidatu sekvence aminokiseline koji su identični ostacima u sekvenci aminokiseline druge sekvence nakon poravnanja sekvenci i uvođenja gapova, ukoliko je neophodno, kako bi se postigao maksimalni procenat homologije. Postupci i kompjuterski programi za poravnanje su dobro poznati u tehnici.
Smatra se da homologija zavisi od izračunavanja identiteta procena ali se može razlikovati u vrednosti usled gapova i penala uvedenih u izračunavanje.
[0089] "Homolozi" kako je primenjivo na sekvence aminokiseline, označavaju sekvencu drugih vrsta koji imaju suštinski identitet druge sekvence druge vrste.
[0090] "Analozi" bi trebalo da uključe varijante sekvence aminokiseline koje se razlikuju u jednoj ili više promena kod aminokiselina, npr. supstitucija, dodavanja, ili brisanja ostataka aminokiselina koje i dalje održavaju jednu ili više osobina polaznog polipeptida ili polipeptida roditelja.
[0091] Ovde je opisano nekoliko tipova kompozicija koji uključuju polipeptide uključujući varijante i derivate. One uključuju kovalentne varijante i derivate koji su supstitucioni, koji se mogu umetnuti i brisati. Pojam "derivat" se koristi kao sinonim sa pojmom "varijanta" i odnosi se na molekul koji je modifikovan ili promenjen na bilo koji način koji se odnosi na referentni ili polazni molekul.
[0092] Kao takvi, ovde su opisani polipeptidi koji sadrže supstitucije, umetanja i/ili dodavanja, brisanja i kovalentne modifikacije. Na primer, tagovi sekvence ili aminokiselina, kao što su jedna ili više lizina, se mogu dodati ovde opisanim sekvencama polipeptida (npr., na N-terminalni kraj ili C-terminalni kraj). Tagovi sekvence se mogu koristiti za prečišćavanja ili lokalizaciju polipeptida. Lizini se mogu koristiti kako bi se povećala rastvorljivost polipeptida ili kako bi se omogućile modifikacije specifične za mesto, kao što je, ali ne ograničavajući se na, biotinilacija ili PEGilacija. U nekim slučajevima, polipeptidi mogu biti destiobiotinilisani. Kako se ovde koristi, polipeptid koji je destiobiotinilisan može da obuhvati destiobiotin (Dtb) grupu konjugovanu sa epsilon-amino grupom ostatka lizina. Takvi ostaci lizina mogu biti ostaci C-terminalnog kraja u nekim slučajevima. Alternativno, aminokiselinski ostaci koji se nalaze na regionima karboksi i amino terminalnih krajeva sekvence aminokiseline polipeptida se mogu opciono obrisati, obezbeđujući skraćene sekvence. Određene aminokiseline (npr., ostaci C-terminalnog kraja ili N-terminalnog kraja) se mogu alternativno obrisati zavisno od upotrebe sekvence, kao što je na primer, eksprimiranje sekvence kao dela veće sekvence, koja je rastvorljiva, ili povezana sa čvrstom podrškom.
[0093] "Supstitucione varijante" kada se odnose na polipeptide su one kod kojih je najmanje jedan ostatak aminokiseline u nativnoj ili polaznoj sekvenci uklonjen i na čije je mesto na istoj poziciji umetnuta različita aminokiselina. Supstitucije mogu biti pojedinačne, pri čemu je samo jedna aminokiselina u molekulu supstituisana, ili mogu biti višestruke, pri čemu je dve ili više aminokiselina supstituisano u istom molekulu.
[0094] Kako se ovde koristi pojam "konzervativna supstitucija aminokiseline" odnosi se na supstituciju aminokiseline koja je inače prisutna u sekvenci različitom aminokiselinom slične veličine, naboja, ili polariteta. Primeri konzervativne supstitucije uključuju supstituciju ne-polarnog (hidrofobnog) ostatka kao što je izoleucin, valin i leucin sa drugim ne-polarnim ostatkom. Slično tome, primeri konzervativne supstitucije uključuju supstituciju jednog polarnog (hidrofilnog) ostatka sa drugim kao što je između arginina i lizina, između glutamina i asparagina, i između glicina i serina. Pored toga, supstitucija osnovnog ostatka kao što je lizin, arginin ili histidin drugim, supstitucija jednog ostatka kiseline kao što je asparaginska kiselina ili glutaminska kiselina drugim kiselim ostatkom predstavljaju dodatne primere konzervativne supstitucije. Primeri ne-konzervativne supstitucije uključuju supstituciju ne-polarnog (hidrofobnog) ostatka aminokiseline kao što je izoleucin, valin, leucin, alanin, metionin polarnim (hidrofilnim) ostatkom kao što je cistein, glutamin, glutaminska kiselina ili lizin i/ili polarnog ostatka nepolarnim ostatkom.
[0095] "Izosteri" predstavljaju dva ili više molekula koji ispoljavaju neke sličnosti bioloških osobina kao rezultat toga što imaju isti broj ukupnih ili valentnih elektrona u istom rasporedu i koji se sastoje od različitih atoma, ne nužno istog broja atoma. Postoje dve klase izostera, klasična i ne-klasična. Klasični izosterri imaju isti broj atoma i/ili isti broj valentnih elektorna dok ne-klasični izosteri predstavljaju molekule koji proizvode sličan biološki efekat in vivo ali nemaju isti broj atoma i/ili valentnih elektrona.
[0096] "Izosteri peptidnih veza " se definišu kao izosteri koji imaju osobine koje liče na peptidne veze. Peptidna veza izostera može biti ravnog tipa koja obuhvata najmanje jednu zamenu peptidne veze ili može biti ciklična i obuhvatati amin i funkciju karboksilne kiseline. Takva zamena može biti sa bilo kojom grupom koja poboljšava fizičko-hemijske ili funkcionalne osobine molekula. Zamena peptidne veze može da poveća metaboličku stabilnost polipeptida i da smanji ili poveća fleksibilnost . Izosteri sa peptidnom vezom opisani ovde mogu biti mono-, di-, tri-, tetra-, penta-, seksta-, septa-, okta-, nona-, ili dekaizosteri peptidne veze, što znači da najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 peptidnih veza može biti zamenjeno. Ne-ograničavajući primeri ravnih izostera dipeptidnih veza za amidne (peptidne) veze uključuju tioamid, sulfonamid, sulfonat, fosfonamid, fosfonat fosfotioat, fosfinat, alkan, 1 ili 2 hidroksietilen, dihidroksiletilen, C-C pojedinačnu vezu (alkan), C-C dvostruku vezu (alken), C-C trostruku vezu (alkin), C-O vezu (metilenoksi), O-N ili N-O vezu,(metilenmino), triazol, hidrazid, urea, keton, uretan vezu, (di)haloalken, metilenmerkapto, metilenamino, trifluoroetilamino, hidrazid, amidoksi, i druge primere poznate stručnjacima u tehnici.
[0097] Izosteri peptidnih veza mogu takođe biti ciklični molekuli koji su dekorisani aminom i funkcijom karboksilne kiseline. Ne-ograničavajući primeri cikličnih izostera peptidne veze sa raznolikim veličinama prstenova uključuju karbaciklične, azaciklićne i oksaciklične izostere. Azaciklični mogu biti bazirani na alkaloidnom jezgru koje formira izoster biciklične strukture. Azaciklici mogu biti bazirani na alkaloidnom jezgru koje formira dvocikličnu strukturu izostera. Primer azacikličnog izostera uključuje izoster baziran na prstenu tiazola formiranom cikloadicijom azid-alkina pri čemu je katalizator bakar. Ciklični izosteri peptidne veze opisani ovde mogu biti bi-, tri-, tetra-, penta-seksta-, septa-, okta- nona- deka-peptidni ciklični izosteri.
[0098] "Insercione varijante" kada se odnose na polipeptide su one sa jednom ili više aminokiselina umetnutih neposredno do aminokiseline na odrešenoj poziciji u nativnoj ili polaznoj sekvenci.
"Neposredno do" aminokiseline znači povezano ili sa alfa-karboksi ili alfa-amino funkcionalnom grupom aminokiseline.
[0099] "Delecione varijante" kada se odnose na polipeptide predstavljaju one kod kojih je jedna ili više aminokiselina u nativnoj ili polaznoj sekvenci aminokiselina uklonjena. Uobičajeno, kod delecionih varijanti jedna ili više aminokiselina je izbrisano u određenom regionu molekula.
[0100] "Skraćene varijante" kada se odnose na polipeptide predstavljaju one kod kojih je jedna ili više aminokiselina u nativnoj ili polaznoj sekvenci aminokiselina uklonjena iz nekog od terminalnih krajeva polipeptida. [0101] Polipeptidi mogu biti modifikovani dodavanjem jedne ili više grupa konjugata. U nekim slučajevima, polipeptidi se mogu davati u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih molekula.
[0102] Kako se ovde koristi, "konjugat" se odnosi na bilo koji molekul ili grupu izmenjenu drugim molekulom. Konjugati mogu ili ne moraju biti bazirani na polipeptidu (aminokiselini). Konjugati mogu da obuhvate lipidi, male molekule, RNK, DNK, polipeptide, polimere, ili njihove kombinacije. Funkcionalno, konjugati mogu da služe kao ciljani molekuli ili mogu da služe kao koristan teret koji bi trebalo isporučiti ćeliji, organu ili tkivu. Konjugati su obično kovalentne modifikacije koje uvode reakcioni ciljni aminokiselinski ostaci ili terminalni krajevi polipeptida sa organskim derivacionim sredstvom koji može da reaguje sa odabranim bočnim lancima ili ostacima terminalnih krajeva. Takve modifikacije su spadaju pod uobičajenu tehniku i izvode se bez nepravovremenog eksperimentisanja.
[0103] Postupak konjugacije može da uključi PEGilaciju, lipidaciju, albuminaciju, biotinilaciju, destiobiotinilaciju, dodavanje drugih zadnjih delova polipeptida ili kalemljenje na Fc domene antitela, CDR regione netaktnih antitela, ili domene antitela proizvedene bilo kojim brojem sredstava. Konjugat može da uključi ankere uključujući grupu holesterol oleata, grupu holesteril laurata, α-tokoferol grupa, fitol grupa, oleat grupa, ili nezasićena holesterol-estar grupa ili lipofilinsko jedinjenje odabrano od acetanilida, anilida, aminokvinolina, benzhdiril jedinjenja, benzodiazepina, benzofurana, kanabinoida, cikličnih polipeptida, dibenzazepina, digitalis glikozida, ergot alkaloida, flavonoida, imidazola, kvinolina, makrolida, naftalena, opiata (kao što su, ali ne ograničavajući se na, morfinani ili drugi psihoaktivni lekovi), oksazina, oksazola, fenilalkilamina, piperidina, policikličnih aromatičnih ugljovodonika, pirolidina, pirolidinona, stilbena, sulfonilureaa, sulfona, triazola, tropana, i vinca alkaloida.
[0104] Kako se ovde koristi, pojam "kovalentni derivat" kada se odnosi na polipeptid uključuje modifikaciju nativnog ili polaznog polipeptida sa organskim proteinskim ili ne-proteinskim derivatizujućim sredstvom, i/ili post-translacionu modifikaciju. Kovalentne modifikacije se tradicionalno uvode reagovanjem ciljnih aminokiselinskih ostataka polipeptida sa organskim derivatizujzćim sredstvom koji je sposoban da reaguje sa odabranim bočnim lancima ili terminalnim ostacima, ili upošljavanjem mehanizama post-translacionih modifikacija koji funkcionišu u rekombinantnim ćelijama domaćina. Dobijeni kovalentni derivati u programima usmerenim na identifikovanje ostataka važnih za biološku aktivnost, za imunološke probe, ili za pripremu anti-proteinskih antitela za prečišćavanje imunološkog afiniteta rekombinantnog proteina. Takve modifikacije su u okviru tehnike i izvode se bez nepravovremenskih eksperimentisanja.
[0105] Određene post-translacione modifikacije su rezultat delovanja rekombinantne ćelije domaćina na eksprimirani polipeptid. Ostaci glutaminila i asparaginila se često deadmidizuju nakon translacije u odgovarajuće ostatke glutamila i asparatila. Alternativno, ovi ostaci se deamidizuju u blago kiselim uslovima. Bilo koji oblik ovih ostataka može biti prisutan u polipeptidu proizvedenom u skladu sa ovim pronalaskom.
[0106] Druge post-translacione modifikacije uključuju hidroksilaciju prolina i lizina, fosforilaciju hidroksil grupe tirosinila, ostatka serila ili treonilai, metilaciju bočnih lanaca alfa-amino grupe lizina, arginina, i histidina (Creighton, T. E., Proteini: Structure i Molecular Osobine, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, pp.79-86).
[0107] Kovalentne modifikacije specifično uključuju vezivanje ne-proteinskih polimera za polipeptide. Ne-proteinski polimeri mogu da uključuju hidrofilni sintetički polimer tj., polimer koji se drugačije ne može pronaći u prirodi. Međutim, polimeri koji postoje u prirodi i koji su proizvedeni rekombinantnim ili in vitro postupcima su korisni, kao i polimeri koji su izolovani iz prirode. Hidrofilni polivinil polimeri su opisani ovde, npr. polivinilalkohol i polivinilpirolidon. Polipeptidi mogu biti vezani za razne ne-proteinske polimere, kao što je polietilen glikol, polipropilen glikol ili polioksialkileni, na način naveden u U.S. Pat. No.4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 ili 4,179,337.
[0108] "Osobine" kada se odnose na polipeptide su definisane kao distinktivne komponente bazirane na sekvenci molekula aminokiseline. Osobine polipeptida ovog pronalaska uključuju manifestacije na površini, lokalni konformacioni oblik, nabore, petlje, polu-petlje, domene, polu-domene, mesta, terminalne krajeve ili bilo koju njihovu kombinaciju.
[0109] Kako se ovde koristi kada se odnose na polipeptide, pojam "nabor" odnosi se na dobijenu konformaciju aminokiselinske sekvence nakon svođenja energije na minimum. Pregib može da se javi na sekundarnom ili tercijarnom nivou postupka savijanja. Primeri sekundarnog nivoa savijanja uključuju beta listove i alfa spirale. Primeri tercijarnih nabora uključuju domene i regione formirane usled agregacije ili separacije fizičko-hemijskih distinktivnih regiona. Regioni formirani na ovaj način uključuju hidrofbne i hidrofilne džepove, i njima slične.
[0110] Kako se ovde koristi pojam "obrnuti" kako se odnosi na konformaciju proteina označava savijanje koje menja smer kičme polipeptida i može da uključi jedan, dva ili tri aminokiselinska ostatka.
[0111] Kako se ovde koristi kada se odnosi na polipeptide, pojam "petlja" odnosi se na strukturnu osobinu polipeptida koja može da služi da obrne smer kičme polipeptida. Kada je petlja prisutna u polipeptidu isamo menja smer kičme, može da obuhvati četiri ili više aminokiselinskih ostataka. Oliva et al. identifikuju najmanje 5 klasa proteinske petlje (Oliva, B. et al., J Mol Biol.1997 Mar 7;266(4):814-30. Petlje mogu biti otvorene ili zatvorene. Zatvorene petlje ili "ciklične" petlje mogu biti formirane kada su dve aminokiseline povezane premošćujućom grupom. Ciklična petlja obuhvata aminokiseline zajedno sa polipeptidom prisutnim između premošćenih aminokiselina. Ciklične petlje mogu da obuhvate 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više aminokiselina.
[0112] Kako se ovde koristi kada se odnosi na polipeptide, pojam "polu-petlja" se odnosi na deo identifikovane petlje koji ima najmanje polovinu ostataka aminokiselina kao petlja iz koje je dobijena. Smatra se da petlje ne moraju uvek da sadrže jednak broj ostataka aminokiselina. Stoga, u ovim slulajevima gde petlja sadrži ili je identifikovana da obuhvata neparan broj aminokiselina, poli-petlja petlje neparnog broja obuhvata deo celog broja ili deo sledećeg celog broja petlje (broj aminokiselina petlje /2+/-0.5 aminokiseline). Na primer, petlja identifikovana kao petlja od 7 aminokiselina može da proizvede polu-petlje od 3 aminokiseline ili 4 aminokiseline (pri čemu 7/2=3.5+/-0.5 predstavljaju 3 ili 4).
[0113] Kako se ovde koriste kada se odnose na proteine, pojam "region" se odnosi na jednu ili opštu oblast. U nekim slučajevima, kada se odnosi na protein, region može da obuhvata ravnu sekvencu aminokiseline zajedno sa proteinom ili može da obuhvata specifičnu sekundarnu ili tercijarnu strukturu i/ili jednu ili više osobina ili domena proteina.
[0114] Kako se ovde koristi, pojam "domen" kada se odnosi na proteine, odnosi se na motiv polipeptida koji ima jedan ili više strukturalnih (kao što su sekundarne ili tercijarne strukture) ili funkcionalnih karakteristika ili osobina koje se mogu identifikovati (npr., kapacitet vezivanja, koji služi kao mesto za interakcije protein-protein.)
[0115] Kako se ovde koristi, pojam "polu-domen," kada se odnosi na proteine, odnosi se na deo identifikovanog domena koji ima najmanje polovinu broja ostataka aminokiselina kao domen iz kog je izveden. Smatra se da domeni ne moraju uvek da sadrže jednak broj aminokiselinskih ostataka. Prema tome, u ovim slučajevima gde domen sadrži ili je identifikovan da obuhvata neparan broj aminokiselina, polu-domen domena sa neparnim brojem obuhvata deo celog broja ili deo narednog celog broja (broj aminokiselina domena/2+/-0.5 aminokiseline). Na primer, domen identifikovan kao domen 7 aminokiselina može da proizvede polu-domene 3 aminokiseline ili 4 aminokiseline (pri čemu 7/2=3.5+/-0.5 predstavljaju 3 ili 4). Takođe se smatra da pod-domeni mogu biti identifikovani unutar domena ili polu-domena, pri čemu ovi pod-domeni poseduju manje od svih strukturnih ili funkcionalnih osobina identifikovanih u domenima ili polu-domenima iz kojih su izvedeni. Takođe se smatra da se aminokiseline koje obuhvataju bilo koje tipove domena opisane u ovom tekstu ne smeju dodirivati duž kičme polipeptida (tj., nesusedne aminokiseline se strukturalno mogu pregibati kako bi proizvele domen, polu-domen ili pod-domen).
[0116] Kako se ovde koristi kada se odnosi na polipeptide pojam "mesto" budući da se odnosi na primere izvođenja pronalaska bazirane na aminokiselinama, se koristi kao sinonim za „aminokiselinski ostatak“ i „aminokiselinski bočni lanac.“ Mesto predstavlja poziciju unutar polipeptida koja može biti modifikovana, manipulisana, izmenjena, derivatizovana ili koja može varirati unutar molekula ovog pronalaska zasnovanih na polipeptidu.
[0117] Kako se ovde koriste pojmovi "terminalni krajevi" ili "terminalni kraj" kada se odnose na polipeptide, odnose se na ekstrmitet polipeptida. Takav ekstremitet nije ograničena samo na prvo ili konačno mesto polipeptida već može da uključi dodatne aminokiseline u terminalnim regionima.
Molekuli bazirani na polipeptidima mogu biti okarakterisani kao oni koji imaju oba, i N-terminalni kraj i C-terminalni kraj. Polipeptidi i/ili polipeptidne kompozicije ovog pronalaska su u nekim slučajevima sačinjeni od višestrukih polipeptidnih lanaca sastavljenih zajedno disulfidnom vezom ili ne-kovalentnoim silama (multimerima, oligomerima). Ove vrste proteina imaju višestruke N- i C-terminalne krajeve. Alternativno, terminalni krajevi polipeptida mogu biti modifikovani tako da počinju ili se završavaju, u zavisnosti od slučaja, sa grupom koja nije bazirana na polipeptidu kao što je organski konjugat.
[0118] Polipeptidi mogu da uključuju terminalni region. Kako se ovde koristi, "terminalni region" predstavlja terminalni region aminokiselina koji može da uključi cistein. Terminalni region može predstavljati region N- i/ili C-terminalnog kraja. U nekim slučajevima, terminalni regioni mogu biti povezani sa polipeptidom roditelejem pomoću premošćujuće grupe. Kako se ovde koristi, "roditelj polipeptid" se odnosi na deo polipeptida koji ne uključuje terminalni region. Terminalni region može biti odvojen od polipeptida roditelja pomoću 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više ostataka. Dodati ostaci mogu biti odabrani od, ali bez ograničenja na, bilo koju prirodnu ili neprirodnu aminokiselinu, N-metilisani oblik bilo koje prirodne ili neprirodne aminokiseline, D-steroizomer bilo koje prirodne ili neprirodne aminokiseline, norvalin, tert-butilglicin, fenilglicin, azatriptofan, 7-azatriptofan, 4-fluorofenilalanin, penicilamin, sarkozin, homocistein, 1-aminociklopropan-karboksilna kiselina, 1-aminociklobutankarboksilna kiselina, 1-aminociklopentan-karboksilna kiselina, 1-aminocikloheksan-karboksilna kiselina, 4-aminotetrahidro-2H-piran-4-karboksilna kiselina, aminoizobutirna kiselina, (S)-2-amino-3-(1H-tetrazo)-5-il)propionska kiselina, ciklopentiglicin, cikloheksilglicink, ciklopropilglicin, η-ω-metil-arginin, 4-hlorofenilalanin, 3-hlorotirozin, 3-fluorotirozin, 5-fluorotriptofan, 5-hlorotriptofan, citrulin, 4-hlorohomofenilalanin, homofenilalanin, 4-aminometil-fenilalanin, 3-aminometil-fenilalanin, oktilglicin, norleucin, traneksaminska kiselina, 2-amino pentanoinska kiselina, 2-amino heksanoična kiselina, 2-amino heptanoična kiselina, 2-amino oktanoična kiselina, 2-amino nonanoična kiselina, 2-amino dekanoična kiselina, 2-amino undekanoična kiselina, 2-amino dodekanoinska kiselina, aminovalerinska kiselina, i 2-(2-aminoetoksi)sirćetna kiselina, pipekolinska kiselina, 2-karboksi azetidin, heksafluoroleucin, 3-Fluorovalin, 2-amino-4,4-difluoro-3-metilbutanoinska kiselina, 3-fluoro-izoleucin, 4-fluoroizoleucin, 5-fluoroizoleucin, 4-metil-fenilglicin, 4-etil-fenilglicin, 4-izopropil-fenilglicin, (S)-2-amino-5-(3-metilgvanidino) pentanoinska kiselina, (S)-2-amino-3-(4-(aminometil)fenil)propionska kiselina, (S)-2-amino-3-(3-(aminometil)fenil)propionska kiselina, (S)-2-amino-4-(2-aminobenzo[d]oksazol-5-il)butanoinska kiselina, (S)-leucinol, (S)-valinol, (S)-tert-leucinol, (R)-3-metilbutan-2-amin, (S)-2-metil-1-fenilpropan-1-amin, i (S)-N,2-dimetil-1-(piridin-2-il)propan-1-amin, (S)-2-amino-3-(oksazol-2-il)propionska kiselina, (S)-2-amino-3-(oksazol-5-il)propionska kiselina, (S)-2-amino-3-(1,3,4-oksadiazol-2-il)propionska kiselina, (S)-2-amino-3-(1,2,4-oksadiazol-3-il)propionska kiselina, (S)-2-amino-3-(5-fluoro-1H-indazol-3-il)propionska kiselina, i (S)-2-amino-3-(1H-indazol-3-il)propionska kiselina.
[0119] Dodatne neprirodne aminokiseline koje su korisne u optimizaciji polipeptida uključuju ali bez ograničenja na fluorinisane aminokiseline pri čemu je jedan ili više atoma vodonika vezanih za ugljenik zamenjeno fluorom. Broj obuhvaćenih atoma fluora može da bude u opsegu od 1 do i uključujući sve atome vodonika. Primeri takvih aminokiselina uključuju ali bez ograničenja 3-fluoroprolin, 3,3difluoroprolin, 4-fluoroprolin, 4,4-difluoroprolin, 3,4-difluroprolin, 3,3,4,4-tetrafluoroprolin, 4-fluorotriptofan, 6-fluorotriptofan, 7-fluorotriptofan, i njihove stereoizomere.
[0120] Dalje neprirodne aminokiseline koje su korisne u optimizaciji polipeptida uključuju ali bez ograničenja na one koji su disupstituisane na α-ugljeniku. One uključuju aminokiseline kod kojih su dva supstituenta na α-ugljeniku ista, na primer α-amino izobutirnu kiselinu, i 2-amino-2-etil butanoinsku kiselinu, kao i one kod kojih su supstituenti različiti, na primer α-metilfenilglicin i α-metilprolin. Dalje supstituenti na α-ugljeniku mogu biti uzeti zajedno kako bise formirao prsten, na primer 1-aminociklopentan-karboksilna kiselina, 1-aminociklobutan-karboksilna kiselina, 1-aminocikloheksankarboksilna kiselina, 3-aminotetrabidrofuran-3-karboksilna kiselina, 3-aminotetrahidropiran-3-karboksilna kiselina, 4-aminotetrahidropiran-4-karboksilna kiselina, 3-aminopirolidin-3-karboksilna kiselina, 3-aminopiperidin-3-karboksilna kiselina, 4-aminopiperidin-4-karboksilna kiselina, i njihovi stereoizomeri.
[0121] Dodatne neprirodne aminokiseline koje su korisne u optimizaciji polipeptida uključuju ali bez ograničenja na, analoge triptofana kod kojih je sistem prstena indola zamenjen drugim 9 ili 10-članim bicikličnim prstenastim sistemom koji obuhvata 0,1,2,3,ili 4 heteroatoma nezavisno odabranih od N,O, ili S. Svaki prstenasti sistem može biti zasićen, delimično nezasićen ili u potpunosti nezasićen. Prstenasti sistem može biti supstituisan sa 0,1,2,3, ili 4 supstituenta na bilo kom atomu koji se može supstituisati. Svaki supstituent je nezavisno odabran od H, F, Cl, Br, CN, okso, COOR, CONRR', OR, NRR'. Svaki R i R' je nezavisno odabran od H, C1-C20 alkil, C1-C20 alkil-O-Cl-20 alkil.
[0122] U nekim slučajevima, analozi triptofana (takođe u daljem tekstu označeni kao "analozi triptofana") koji su korisni u optimizaciji polipeptida čine, ali se ne ograničavaju na, 5-fluorotriptofan [(5-F)W], 5-metil-O-triptofan [(5-MeO)W], 1-metiltriptofan [(1-Me-W) ili (1-Me)W], D-triptofan (D-Trp), 7-azatriptofan (uključujući, ali ne ograničavajući se na 4-azatriptofan, 7-azatriptofan i 5-azatriptofan,) 5-hlorotriptofan, 4-fluorotriptofan, 6-fluorotriptofan, 7-fluorotriptofan, i njihove stereoizomere. Osim u slučajevima gde je to suprotno naznačeno, pojam "azatriptofan" i njegova skraćenica, "azaTrp," kako se ovde koristi, se odnose na 7-azatriptofan.
[0123] Polipeptidi mogu da uključuju N- ili C-terminalnu modifikaciju sa dodatkom 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više ostataka i/ili cistein u terminalnom regionu. Dodati ostaci mogu biti odabrani od, ali bez ograničenja na, bilo koje prirodne ili neprirodne aminokiselina, N-metilisanog oblika bilo koje prirodne ili neprirodne aminokiseline, D-steroizomera bilo koje aminokiseline, norvalina, tert-butilglicina, fenilglicina, azatriptofana, 7-azatriptofana, 4-fluorofenilalanina, penicilamina, sarkozina, homocistein, 1-aminociklopropan-karboksilne kiseline, 1-aminociklobulan-karboksilne kiseline, 1-aminociklopentankarboksilne kiseline, 1-ammocikloheksan-karboksilne kiseline, 4-aminotetrahidro-2H-piran-4-karboksilne kiseline, aminoizobuterinske kiseline, (S)-2-amino-3-(1H-tetrazol-5-il)propionske kiseline, ciklopentiglicina, cikloheksilglicina, ciklopropilglicina, η-ω-metil-arginina, 4-hlorofenilalanina, 3hlorotirozina, 3-fluorotirozina, 5-fluorotriptofana, 5-hlorotriptofana, citrulina, 4-hloro-homofenilalanina, homofenilalanina, 4-aminometil-fenilalanina, 3-aminometil-fenilalanina, oktilglicina, norleucina, traneksaminske kiseline, 2-amino pentanoinske kiseline, 2-amino heksanoične kiseline, 2-amino heptanoične kiseline, 2-amino oktanoične kiseline, 2-amino nonanoične kiseline, 2-amino dekanoične kiseline, 2-amino undekanoične kiseline, 2-amino dodekanoinske kiseline, aminovalerinske kiseline, i 2-(2-aminoetoksi)sirćetne kiseline, pipekolinske kiseline, 2-karboksi azetidina, heksafluoroleucina, 3-Fluorovalian, 2-amino-4,4-difluoro-3-metilbutanoinske kiseline, 3-fluoro-izoleucina, 4-fluoroizoleucina, 5-fluoroizoleucina, 4-metil-fenilglicina, 4-etil-fenilglicina, 4-izopropil-fenilglicina, (S)-2-amino-5-(3-metilgvanidino) pentanoinske kiseline, (S)-2-amino-3-(4-(aminometil)fenil)propionske kiseline, (S)-2-amino-3-(3-(aminometil)fenil)propionske kiseline, (S)-2-amino-4-(2-aminobenzo[d]oksazol-5-il)butanoinske kiseline, (S)-leucinola, (S)-valinola, (S)-tert-leucinola, (R)-3-metilbutan-2-amina, (S)-2-metil-1-fenilpropan-1-amina, i (S)-N,2-dimetil-1-(piridin-2-il)propan-1-amina, (S)-2-amino-3-(oksazol-2-il)propionske kiseline, (S)-2-amino-3-(oksazol-5-il)propionske kiseline, (S)-2-amino-3-(1,3,4-oksadiazol-2-il)propionske kiseline, (S)-2-amino-3-(1,2,4-oksadiazol-3-il)propionske kiseline, (S)-2-amino-3-(5-fluoro-1H-indazol-3-il)propionske kiseline, i (S)-2-amino-3-(1H-indazol-3-il)propionske kiseline.
[0124] Polipeptidi mogu biti konjugovani sa polipeptidom koji povećava ili smanjuje vezivanje proteina iz plazme uključujući ali be ograničenja na one opisane u Dennis, M.S. et al., Albumin binding as a general strategy for improving the pharmacokinetics of proteins. J Biol Chem.2002 Sep 20;
277(38):35035-43; Nguyen, A. et al. Farmakokinetika albumin-vezujućeg Fab (AB Fab) može biti prilagođena kao funkcija afiniteta za albumin. Protein Eng Des Sel.2006 Jul;
19(7):291-7 and Langerheim, J.F. et al., Improving the pharmacokinetics/pharmacodynamics of prolactin, GH, and their antagonists by fusion to a synthetic albumin-binding polypeptide. J Endocrinol.
2009 Dec;203(3):375-87. U nekim slučajevima, takvi albumin-vezujući polipeptidi (u daljem tekstu označeni kao "albumin-vezujući polipeptidi"). U nekim slučajevima, takvi albumin-vezujući polipeptidi su ciklisani disulfidnom bezom formiranja između ostataka cisteina prisutnih u njihovim polipeptidnim sekvencama. U nekim slučajevima, albumin-vezujući polipeptidi su konjugovani ili njihovim N ili C-terminalnim krajevima. U nekim slučajevima, konjugacija u albumin-vezujući polipeptid prilagođava količinu vremena tokom kog polipeptid ostaje netaktan kod nekog subjekta. U nekim slučajevima, konjugacija u albumin-vezujući polipeptid povećava količinu vremena tokom kog polipeptid ostaje u krvi subjekta. Polipeptidi mogu biti konjugovani sa polipeptidima koji imaju osobine prodiranja u ćeliju (u daljem tekstu označeni kao "polipeptidi koji prodiru u ćelije") uključujući ali bez ograničenja one opisane u Milletti, F., Cell-penetrating peptides: classes, origin, i current landscape. Drug Discov Today.
2012 Aug;17(15-16):850-60. Dodatni polipeptidi koji prodiru u ćelije su poznati stručnjacima u tehnici. Polipeptidi mogu biti konjugovan sa bilo kojim poznatim konjugatom polipeptida, na primer, u US patent publications US20110172126 ili US20030040472. Polipeptidi mogu biti konjugovan sa liofiziranim molekulom koji povećava vezivanje proteina u plazmi kao što su poznati liofilizovani supstituenti, na primer, u US Patent No.6,268,343 ili US Publication No. US2013/0053311.
[0125] Kada se bilo koja od ovih osobina identifikuje ili definiše kao poželjna komponenta polipeptida, bilo koja od nekoliko manipulacija i/ili modifikacija tih osobina može biti izvedena pomeranjem, razmenom, inverzijom, brisanjem, randomiziranjem ili dupliranjem. Pored toga, smatra se da manipulacija osobinama može da dovede do istog ishoda kao i modifikacija molekula opisana u ovom tekstu. Na primer, manipulacija koja uključuje brisanje domena dovodi do izmene dužine molekula upravo kao i modifikacija nukleinske kiseline dovodi do kodiranja koje je manje od onog do kog bi doveo molekul pune dužine.
[0126] Modifikacije i manipulacije se mogu postići postupcima poznatim u tehnici kao što je, ali ne ograničavajući se na, mutagenezu usmerenu ka mestu. Dobijeni modifikovani molekuli se zatim mogu ispitivati radi aktivnosti upotrebom in vitro ili in vivo ogleda kao što su oni opisani ovde ili bilo koji drugi prikladni skrining ogled poznat u tehnici.
[0127] Polipeptidi mogu da obuhvate konsezusnu sekvencu koja je otkrivena putem krugova eksperimentisanja. Kako se ovde koristi "koncenzusna" sekvenca je pojedinačna sekvenca koja predstavlja kolektivnu populaciju sekvenci što dozvoljava varijabilnost na jednom ili više mesta.
[0128] Pojam "identitet" kako je poznato u tehnici, se odnosi na odnos između sekvence dva ili više polipeptida, kako je određeno poređenjem sekvenci. U tehnici, identitet takođe znači stepen povezanosti sekvence između polipeptida, kako je određeno brojem parova između nizova dva ili više aminokiselinskih ostataka. Identitet meri procenat identičnih parova između manje od dve ili više sekvenci sa poravnanjima gapova (ukoliko postoje) kojima se bavi odrešeni matematički model ili kompjuterski program (tj., "algoritmi"). Identitet povezanih polipeptida se može brzo izračunati poznatim postupcima. Takvi postupci čine, ali se ne ograničavaju na, one postupke koje su prethodno drugi opisali (Lesk, A. M., ed., Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, 1988; Smith, D. W., ed., Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, New York, 1993; Griffin, A. M. et al., ed., Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Humana Press, New Jersey, 1994; von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press, 1987; Gribskov, M. et al., ed., Sequence Analysis Primer, M. Stockton Press, New York, 1991; i Carillo et al., Applied Math, SIAM J, 1988, 48, 1073).
[0129] U nekim slučajevima, varijanta polipeptida može imati istu ili sličnu aktivnost kao referentni polipeptid. Alternativno, varijanta može da ima izmenjenu aktivnost (npr., povećanu ili smanjenu) u odnosu na referentni polipeptid. Generalno, varijante određenih polipeptida mogu da imaju najmanje oko 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ali manje od 100% identiteta sekvence u poređenju sa sekvencom određenog referentnog polipeptida kako je određeno programima i parametrima za poravnanje sekvence opisanim ovde i poznatih stručnjacima. Takvi alati za poravnanje uključuju jedan iz BLAST paketa (Altschul, S.F. et al., Gapped BLAST i PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, Nucleic Kiselinas Res.1997, 25:3389-3402). Ostali alati su ovde opisani, specifično kod definicije "identiteta."
[0130] Zadati parametri u BLAST algoritmu uključuju, na primer, očekivanu graničnu vrednost od 10, dužinu reči od 28, Par/Nepar rezultati 1, -2, cene praznine Ravni. Može se primeniti bilo koji filter kao i odabir za ponavljanja specifičnih vrsta, npr., Homo sapiens.
Skraćenice koje se koriste kod polipeptida
[0131] Kako se ovde koriste, skraćenice imaju sledeće značenje: "Ac" i "NH2" ukazuju na acetil i amidisane terminalne krajeve; "Nvl" označava norvalin; "Phg" označava fenilglicin; "Tbg" označava tertbutilglicin; "Chg" označava cikloheksilglicin; "(N-Me)X" označava N-metilisani oblik aminokiseline na koju ukazuje slovo ili troslovna šifra aminokiseline na mestu varijable "X" napisane kao N-metil-X [npr. (N-Me)A ili (N-Me)Ala označava N-metilisani oblik alanina ili N-metil-alanin]; "azaTrp" označava azatriptofan; "(4-F)Phe" označava 4-fluorofenilalanin; "Tyr(OMe)" označava O-metil tirozin, "Aib" označava amino izobutirnu kiselinu; "(homo)F" ili "(homo)Phe" označava homofenilalanin; "(2-OMe)Phg" se odnosi na 2-O-metilfenilglicin; "(5-F)W" se odnosi na 5-fluorotriptofan; "D-X" se odnosi na D-steroizomer date aminokiseline "X" [npr. (D-Chg) označava D-cikloheksilglicin]; "(5-MeO)W" se odnosi na 5-metil-O-triptofan; "homoC" se odnosi na homocistein; "(1-Me-W)" ili "(1-Me)W" se odnosi na 1-metiltriptofan; "Nle" se odnosi na norleucin; "Tiq" se odnosi na ostatak tetrahidroizokvinolina; "Asp(T)" se odnosi na (S)-2-amino-3-(1H-tetrazol-5-il)propionsku kiselinu; "(3-Cl-Phe)" se odnosi na 3-hlorofenilalanin; "[(N-Me-4-F)Phe]" ili "(N-Me-4-F)Phe" se odnosi na N-metil-4-fluorofenilalanin; "(m-Clhomo)Phe" se odnosi na meta-hloro homofenilalanin; "(des-amino)C" se odnosi na 3-tiopropionsku kiselinu; "(alpha-methyl)D" se odnosi na alfa-metil L-asparaginsku kiselinu; "2Nal" se odnosi na 2-naftilalanin; "(3-aminomethyl)Phe" se odnosi na 3-aminometil-L-fenialanin; "Cle" se odnosi na cikloleucin; "Ac-Piran" se odnosi na 4-amino-tetrahidro-piran-4-karboksilnu kiselinu; "(Lys-C16)" se odnosi na N-ε-palmitoil lizin; "(Lys-C12)" se odnosi na N-ε-lauril lizin; "(Lys-C10)" se odnosi na N-ε-capryl lizin; "(Lys-C8)" se odnosi na N-ε-kaprilični lizin; "[xXylyl(y,z)]" se odnosi na ksilil premošćujuću grupu između dva tiola koja sadrži aminokiseline gde x može biti m, p ili o da bi se ukazalo na upotrebu meta-, para- ili orto- dibromoksilena (tim redom) radi generisanja premošćujuće grupe i numeričkih identifikatora, y i z, zauzimaju pozicije aminokiseline unutar polipeptida aminokiselina koje učestvuju u ciklizaciji; "[cyclo(y,z)]" se odnosi na formiranje veze između dva aminokiselinska ostatka pri čemu numerički identifikatori, y i z, zauzimaju poziciju ostataka koji učestvuju u vezi; "[cyclo-olefinyt(y,z)]" se odnosi na formiranje veze između dva aminokiselinska ostatka metastazom olefina pri čemu numerički identifikatori, y i z, zauzimaju poziciju ostataka koji učestvuju u vezi; "[cyclo-thioalkyl(y,z)]" se odnosi na formiranje tioetarske veze između dva aminokiselinska ostatka pri čemu numerički identifikatori, y i z, zauzimaju poziciju ostataka koji učestvuju u vezi; "[cyclo-triazolyl(y,z)]" se odnosi na formiranje prstena triazola između dva aminokiselinska ostatka pri čemu numerički identifikatori, y i z, zauzimaju poziciju ostataka koji učestvuju u vezi. "B20" se odnosi na N-ε-(PEG2-γ-glutaminsku kiselinu-N-αoktadekanedionska kiselina) lizin [takođe poznat kao (1S,28S)-1-amino-7,16,25,30-tetraokso-9,12,18,21-tetraoksa-6,15,24,29-tetraazaheksatetrakontan-1,28,46-trikarboksilna kiselina.]
"B28" se odnosi na N-ε-(PEG24-γ-glutaminska kiselina-N-α-heksadekanoil)lizin.
"K14" se odnosi na N-ε-1-(4,4-dimetil-2,6-dioksocikloheks-1-iliden)-3-metilbutil-L-lizin. Svi drugi simboli se odnose na standardne jednoslovne šifre aminokiselina.
Antitela
[0132] U nekim slučajevima, jedinjenja i/ili kompozicije mogu da obuhvataju antitela ili njihove fragmente. Kako se ovde koristi, pojam "antitelo" se u najširem smislu odnosi i specifično pokriva razne primere izvođenja uključujući, ali ne ograničavajući se na monoklonalna antitela, poliklonalna antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela formirana od najmanje dva netaktna antitela), i fragmente antitela kao što su dijatela dokle god eksprimiraju poželjnu biološku aktivnost. Antitela takođe mogu da obuhvate humana antitela ili humanizovana antitela. Antitela predstavljaju molekule primarno bazirane na aminokiselinama ali takođe mogu da obuhvataju jednu ili više modifikacija (uključujući, ali ne ograničavajući se na dodavanje grupa šećera, fluorescentnih grupa, hemijskih tagova, itd.)
[0133] Kako se ovde koristi pojam, "fragment antitela" se odnosi na bilo koji deo netaktnog antitela. U nekim slučajevima, fragmenti antitela obuhvataju antigen vezujuće regione od netaktnih antitela.
Primeri fragmenata antitela mogu da čine, ali se ne ograničavaju na, Fab, Fab', F(ab')2, i Fv fragmenti; dijatela; ravna antitela; molekuli antitela pojedinačnog lanca; i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela. Varenje papina antitela proizvodi dva identična antigen-vezujuća fragmenta, koja se nazivaju "Fab" fragmenti, od kojih je svaki sa pojedinačnim antigen-vezujućim mestom. Takođe je proizveden preostali "Fc" fragment, čije ime odražava njegovu sposobnost da se brzo kristališe. Lečenje pepsinom daje F(ab')2fragment koji ima dva antigen-vezujuća mesta i dalje je sposoban za unakrsno vezivanje sa antigenom. Jedinjenja i/ili kompozicije opisane ovde mogu da obuhvate jedan ili više ovih fragmenata. U ovu svrhu, "antitelo" može da obuhvati težak i lak varijabilni domen kao i Fc region.
[0134] Kako se ovde koristi, pojam "nativno antitelo" se obično odnosi na heterotetramerični glikoprotein od oko 150,000 daltona, sastavljen od dva identična laka (L) lanca i dva identična teška (H) lanca. Svaki laki lanac je vezan za teški lanac jednom kovalentnom disulfidnom vezom, dok broj disulfidnih veza varira među teškim lancima različitih imunoglobulinskih izotipova. Svaki težak i lak lanac takođe je redovno odvojen disulfidnim mostovima unutar lanca. Svaki težak lanac ima na jednom kraju varijabilni domen (VH) praćen brojem konstantnih domena. Svaki lak lanac ima varijabilni domena na jednom kraju (VL) i konstantni domen na drugom kraju; konstantni domen lakog lanca je poravnan sa prvim konstantnim domenom teškog lanca, a domen varijable lakog lanca je poravnan sa domenom varijable teškog lanca.
[0135] Kako se ovde koristi, pojam "varijabilni domen" se odnosi na specifične domene antitela koji se u velikoj meri razlikuju u sekvenci među antitelima i koriste se u vezivanju i specifičnosti svakog određenog antitela za njegov određeni antigen.
Kako se ovde koristi, pojam "Fv" se odnosi se fragmente antitela koja obuhvataju potpuno antigenprepoznavanje i antigen-vezujuća mesta. Ovi regioni se sastoje od dimera jednog teškog lanca i jednog varijabilnog domena lakog lanca, u tesnoj, nekovalentnoj vezi.
[0136] Kako se ovde koristi, pojam "laki lanac" se odnosi na komponentu antitela od bilo koje vrste kičmenjaka dodeljenu jednom ili dva jasno različita tipa, koji se nazivaju kappa i lambda na osnovu sekvenci aminokiselina konstantnih domena.
[0137] Zavisno od sekvence aminokiseline konstantnog domena njihovih teških lanaca, antitela mogu biti dodeljena različitim klasama, postoji pet glavnih klasa netaktnih antitela: IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM, i nekoliko ovih se dalje može podeliti u podklase (izotipove), npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, i IgA2.
[0138] Kako se ovde koristi, pojam "Fv pojedinačni lanac Fv" ili "scFv" se odnosi na fuzioni protein VHi VLdomena antitela, pri čemu su ovi domeni povezani zajedno u pojedinačni polipeptidni lanac. U nekim slučajevima, veznik Fv polipeptida omogućava scFv radi formiranja željene strukture za vezivanje antigena.
[0139] Kako se ovde koristi, pojam "dijatelo" se odnosi na mali fragment antitela sa dva antigenvezujuća mesta. Dijatela obuhvataju varijabilni domen teškog lanca VHkoji je povezan sa varijabilnim domenom VLlakog lanca u istom polipeptidnom lancu. Upotrebom veznika koji je previše kratak da bi omogućio sparivanje između dva domena na istom lancu, domeni su primorani da se sparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca i da kreiraju dva antigen-vezujuća mesta. Dijatela su potpunije opisana u, na primer, EP 404,097; WO 93/11161; i Hollinger et al. (Hollinger, P. et al., "Diabodies":Small bivalent and bispecific antibody fragments. PNAS.1993.90:6444-8).
[0140] Kako se ovde koristi, pojam "monoklonalno antitelo" se odnosi na antitelo dobijeno od populacije suštinski homogenih ćelija (ili klonova), tj., pojedinačna antitela koja obuhvataju populaciju su identična i/ili se vezuju za isti epitop, izuzev za posebne varijante koje mogu proisteći tokom proizvodnje monoklonalnih antitela, pri čemu su takve varijante generalno prisutne u manjim količinama. Nasuprot priprema poliklonalnih antitela koja obično uključuju različita antitela usmerena na različite determinanate (epitope), pri čemu je svako monoklonalno antitelo usmereno na pojedinačnu determinantu na antigenu.
[0141] Modifikator "monoklonalno" ukazuje na to da je antitelo dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, i ne konstruiše se kao što to nalaže proizvodnja antitela nekim određenim postupkom. Monoklonalna antitela pomenuta ovde uključuju "himerična" antitela (immunoglobuline) kod kojih je deo teškog i/ili lakog lanca identičan sa ili je homologan sa odgovarajućim sekvencama u antitelima dobijenim iz određene vrste ili pripada određenoj klasi ili podklasi antitela, dok je ostatak lanca(lanaca) identičan sa ili homologan sa odgovarajućim sekvencama u antitelima dobijenim od drugih vrsta ili koji pripadaju drugoj klasi ili podklasi antitela, kao i fragmentima takvih antitela.
[0142] Kako se ovde koristi, pojam "humanizovano antitelo" se odnosi na himerično antitelo koje obuhvata minimalni deo od jednog ili više ne-humanih izvora (npr., mišjih) antitela sa ostatkom koji je dobijen od jednog ili više izvora humanih imunoglobulina. Za najveći deo, humanizovana antitela predstavljaju humane imunoglobuline (antitelo primaoca) kod kojih se ostaci iz jednog hipervarijabilnog regiona iz antitela primaoca zamenjuju ostacima iz drugog hipervarijabilnog regiona iz antitela nehumanih vrsta (antitelo davaoca) kao što je miš, pacov, zec ili nehumani primat koji ima željenu specifičnost, afinitet, i/ili kapacitet.
[0143] Kako se ovde koristi, pojam "hipervarijabilni region" se odnosi na regione unutar antigenvezujućeg domena antitela koji obuhvataju ostatke odgovorne za vezivanje antigena. Aminokiseline prisutne unutar hipervarijabilnih regiona određuju strukturu regiona koji određuje komplementarnost (CDR). Kako se ovde koristi, pojam "CDR" se odnosi na regione antitela koji obuhvataju strukturu koja je komplementarna sa svojim ciljnim antigenom ili epitopom.
[0144] U nekim slučajevima, jedinjenja i/ili kompozicije mogu biti ili obuhvatati mimetiku antitela. Kako se ovde koristi, pojam "mimetici antitela" se odnosi na bilo koji molekul koji oponaša funkciju ili efekat antitela i koji se specifično vezuje i sa visokim afinitetom za svoje molekulske ciljeve. Mimetici antitela mogu biti monotela, dizajnirani da inkorporišu domen fibronectin tipa III (Fn3) kao proteinsku poroznu strukturu (US 6,673,901 i US 6,348,584). Mimetici antitela mogu da uključe ona koja su poznata u tehnici uključujući, ali ne ograničavajući se na molekule afitela, afiline, afitine, antikalcine, avimere, i peptide eomena Centyrins, DARPINS™, Fynomers, Adnectins, i Kunitz. Mimetici antitela mogu da uključe jedan ili više ne-peptidnih regiona.
[0145] Kako se ovde koristi, pojam "varijanta antitela" se odnosi na biomolekul koji liči na antitelo i/ili funkciju koja obuhvata neke razlike u njihovoj sekvenci aminokiseline, kompoziciji ili strukturi u poređenju sa nativnim antitelom.
[0146] Priprema antitela, bilo monoklonalnih ili poliklonalnih, je poznata u tehnici. Tehnike za proizvodnju antitela su dobro poznate u tehnici i opisane, npr. u Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 i Harlow and Lane "Using Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999.
[0147] Sekvence polipeptida opisane ovde mogu biti iskorišćene u proizvodnji jednog ili više antitela. U nekim slučajevima, takve sekvence polipeptida mogu biti inkorporisane u varijabilne domene antitela. Takvi varijabilni domeni mogu biti inkorporisani u antitela, mimetike antitela i varijante antitela.
Mali molekuli
[0148] Ovde opisana jedinjenja mogu predstavljati male molekule. Takva jedinjenja mogu da obuhvataju veličinu od oko 100 do oko 2000 Daltona (npr. od oko 100 do oko 200, do oko 300, do oko 400, do oko 500, do oko 600, do oko 700, do oko 800, do oko 900, do oko 1000, do oko 1100, do oko 1200, do oko 1300, do oko 1400, do oko 1500, do oko 1600, do oko 1700, do oko 1800, do oko 1900 ili do oko 2000 Daltona.) Mali molekuli mogu biti ne-peptidni ili deliti neke ili mnogo karakteristika polipeptida i cikličnih polipeptida, uključujući amidne veze, ciklične strukture, i supstituente koji liče na aminokiseline.
Aptameri
[0149] Ovde opisana jedinjenja mogu da obuhvate parametre (Keefe, A.D., Pai, S. and Ellington, A. (2010). Nat. Rev. Drug Discovery 9:537-550). Kako se ovde koristi, pojam "aptamer" se odnosi na oligonukleinske ili polipeptidne molekule koji su sposobni za vezivanje specifičnih ciljnih molekula. Neki aptameri mogu da usvoje trodimenzionalnu konformaciju sposobnu za vezivanje takvih ciljnih molekula sa visokim afinitetom i specifičnošću.
Izotopne varijacije
[0150] Polipeptidi mogu da obuhvate jedan ili više atoma koji su izotopi. Kako se ovde koristi, pojam "izotop" se odnosi na hemijski element koji ima jedan ili više dodatnih neutrona. Polipeptidi mogu biti deuterisani. Kako se ovde koristi, pojam "deuterisani" se odnosi na supstancu koja ima jedan ili više atoma vodonika zamenjenih sa izotopima deuteriuma. Izotopi deuterijuma predstavljaju izotope vodonika. Jezgro vodonika sadrži jedan proton dok jezgra deuterijuma sadrže i proton i neutron.
Jedinjenja i farmaceutske kompozicije opisane ovde mogu biti deuterisane kako bi se promenilo fizičko svojstvo, kao što je stabilnost, ili da im se dozvoli da se koriste u dijagnostičke i eksperimentalne svrhe.
Formulacija i isporuka
[0151] Pojam "farmaceutska kompozicija" se odnosi na kompoziciju koja obuhvata najmanje jedan aktivni sastojak (npr., kao što je polipeptid) u obliku i količini koja dopušta aktivnom sastojku da bude efektivan.
[0152] Polipeptidne formulacije uključuju formulacije sa kontrolisanim duodenalnim otpuštanjem, formulacije sa vremenskim otpuštanjem, sisteme isporuke sa osmotski-kontrolisanim otpuštanjem, mikroemulzije, mikrosfere, lipozome, nanočestice, flastere, pumpe, depoe lekova i njima slične.
Specifično su uključene čvrste oralne dozne forme, kao što su praškovi, meki gelovi, želatinaste kapsule, kapsule, pilule, i tablete.
[0153] Farmaceutske kompozicije se mogu davati bilo kojim putem koji obezbeđuje terapeutski efektivan ishod. U njih se ubrajaju ali bez ograničenja na, enteralni, gastroenteralni, epiduralni, oralni, periduralni, intracerebralni (u mozak), intratrahealni (u disajne puteve za isporuku u pluća), intracerebroventrikularno (u cerebralne ventrikule), epikutano (primena na kožu), intradermalno, (u samu kožu), subkutano (pod kožu), nazalno (kroz nos), intravensko (u venu), intraarterijalno (u arteriju), intramuskularno (u mišić), intrakardijalno (u srce), intraosalnom infuzijom (u kičmeni stub), intratekalno (u kičmeni kanal), intraperitonelano, (infuzijom ili njekcijom u stomačnu membranu), intravezikalnom infuzijom, intravitrealno, (u zadnju komoru oka), intrakavernoznom injekcijom, (u osnovu penisa), intravaginalnim putem, intrauterinski, ekstra-amniotskim putem, transdermalno (difuzijom kroz netaktnu kožu radi sistematske distribucije), transmukozalno (difuzija putem sluzokože) insuflacijom (ušmrkavanjem), bukalno, sublingvalno, sublabijalno, klistirom, u obliku kapi za oči (na konjuktivu), ili u obliku kapi za uši.
[0154] U nekim slučajevima, polipeptidi opisani ovde su formulisani u obliku sterilnog vodenog rastvora. U nekim slučajevima, polipeptidi opisani ovde su formulisani u obliku lipidne ili ne-lipidne formulacije. U nekim slučajevima ovde opisani polipeptidi su formulisani u obliku katjonskih ili ne-katjonskih formulacija. U bilo kom slučaju, sterilni vodeni rastvor može sadržati dodatne aktivne ili neaktivne komponente. Neaktivne komponente, takođe u daljem tekstu označene kao "ekscipijensi," mogu da obuhvataju, ali ne ograničavajući se na ,, fiziološki kompatibilne soli, šećere, sredstva za povećanje zapremine, surfaktante ili pufere.
[0155] Polipeptidi i/ili polipeptidne kompozicije mogu da obuhvataju ili da budu formulisane ili isporučene u vezi sa jednim ili više agenasa nosača. Kako se ovde koristi, pojam "nosač" se odnosi na supstancu koja pomaže isporuku ili poboljšava efektivnost polipeptida i/ili polipeptidnih kompozicija ovog pronalaska. Nosač može biti supstanca koja se prirodno javlja, kao što je protein (npr., humani serum albumin (HSA), lipoprotein niske gustine (LDL), ili globulin); ugljovodonik (npr., dekstran, pululan, hitin, hitozan, inulin, ciklodekstrin, ili hijaluronska kiselina); ili lipid. Molekul nosača takođe može biti rekombinantni ili sintetički molekul, kao što je sintetički polimer, npr., sintetička poliaminokiselina. Primeri poliaminokiselina uključuju poli-L-lizin (PLL), poli-L-asparaginsku kiselinu i , poli-L-glutaminsku kiselinu, kao i polimere koji obuhvataju D-stereoizomere ovih aminokiselina. Drugi nosači uključuju poli(L-laktid-ko-glikolid) kopolimer, polietilen glikol (PEG), polivinil alkohol (PVA), poli(2-etilakrilnu kiselinu), i N-izopropilakrilamidne polimere. Drugi korisni molekuli nosača se mogu identifikovati rutinskim postupcima.
[0156] Ovde opisana jedinjenja se mogu kombinovati sa jednim ili više prihvatljivih ekscipijenasa kako bi se formirala farmaceutska kompozicija. Kako se ovde koristi, pojam "farmaceutski prihvatljiv" se odnosi na ona jedinjenja, materijale, kompozicije, i/ili dozne oblike koji su, u domenu zdravog medicinskog rasuđivanja, pogodni za upotrebu u kontaktu sa tkivima ljudskih bića i životinja bez prekomerne toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora, ili drugog problema ili komplikacija, srazmerno sa odnosom koristi i rizika. Fraza "farmaceutski prihvatljiv ekscipijens," kako se ovde koristi, se odnosi na bilo koji sastojak koji ne predstavlja inventivno ovde opisano jedinjenje (na primer, nosač sposoban za suspendovanje ili rastvaranje aktivnog jedinjenja) i koji imaju osobine suštinske netoksičnosti i koje nemaju zapaljensko dejstvo na pacijenta. Ekscipijensi mogu da uključuju, na primer: sredstva protiv prijanjanja, antioksidansi, sredstva vezivanja, omotači, kompresivna pomagala, disintegrante, boje (boje), emoliente, emulzifikatore, punjače (razblaživače), sredstva za formiranje filma ili omotače, arome, mirirse, sredstva za klizanje (pojačavači protoka), lubrikante, konzervanse, mastila za štampanje, sorbense, sredstva za suspendovanje ili raspršivanje, zaslađivače, i vodu hidratacije. Primeri ekscipijenasa uključuju, ali se ne ograničavaju na,: butilisani hidroksitoluen (BHT), kalcijum karbonat, kalcijum fosfat (dvobazni), kalcijum stearat, kroskarmelozu, ukršteni polivinil pirolidon, limunsku kiselinu, krospovidon, cistein, etilcelulozu, želatin, hidroksipropil celulozu, hidroksipropil metilcelulozu, lakzotu, magnezijum stearat, maltitol, manitol, metionin, metilcelulozu, metil paraben, mikrokristalnu celulozu, polietilen glikol, polivinil pirolidon, povidon, preželatinasti skrob, propil paraben, retinil palmitat, šelak, silicijum dioksid, natrium karboksimetil celulozu, natrijum citrat, natrijum skrob glikolat, corbitol, skrob (kukuruz), stearinsku kiselinu, talk, titanijum-dioksid, vitamin A, vitamin E, vitamin C, i ksilitol. U nekim slučajevima, farmaceutske kompozicije obuhvataju jedan ili više aktivnih sastojaka polipeptida zajedno sa etanolom, skrob ulje-mono-di-trigliceride, hidrogenisano ricinusovo ulje, DL-tokoferol, propilen glikol, želatin, glicerol, sredstva za bojenje, arome i zaslađivači.
[0157] U nekim slučajevima, farmaceutske kompozicije obuhvataju jedan ili više aktivnih sastojaka polipeptida zajedno sa sredstvom isporuke kao što je 4-(2-hidroksi-4-metoksibenzamido)butanoinska kiselina (ili bilo koje drugo sredstvo isporuke opisano u US patent number 7,744,910B2, farmaceutski prihvatljiv pufer, sredstvo za raspadanje, deterdžent, hidroksipropilmetilceluloza, sredstva za bojenje, arome i zaslađivači.
[0158] U nekim slučajevima, farmaceutske kompozicije obuhvataju jedan ili više aktivnih sastojaka polipeptida zajedno sa etanolom, soja fosfatidil holin, glicerol diolat koji se ubrizgava u višak slanog rastvora kako je opisano u US patent application 2008/0146490A1.
[0159] Isporuka jednog ili više polipeptida subjektu kom je potrebna se može postići na više različitih načina. In vivo isporuka se može izvesti direktno davanjem subjektu kompozicije koja obuhvata jedan ili više polipeptida. Alternativno, isporuka se može izvesti indirektno davanjem jednog ili više vektora koji kodiraju i usmeravaju eksprimiranje polipeptida.
[0160] Lokalnom primenom se izbegava propustljivost creva i sistemska izloženost. Na primer, polipeptidi i/ili polipeptidne kompozicije ovog pronalaska mogu se primeniti u oči u obliku kapi ili u zadnji deo oka direktnim ubrizgavanjem. Mogu se primeniti i u crevima, ciljanom enzimu. Mogu se primeniti topikalno putem dermatoloških primena (npr., kremama, mastima, transdermalnim flasterima).
[0161] Polipeptidi i/ili polipeptidne kompozicije mogu da obuhvataju ili da budu formulisane sa jednim ili više fuzogenih agenasa. Kako se ovde koristi, pojam "fuzogeno sredstvo" se odnosi na sredstvo koji reaguje na promene, kao što su na primer promene pH u sredini. Nakon susreta pH endozoma, fuzogeno sredstvo može da izazove fizičku promenu, npr., promenu osmotskih osobina koja prekida ili povećava propustljivost endozomske membrane. Poželjno, fuzogeno sredstvo menja punjenje, npr., postaje protonisan, pri pH nižoj od fiziološkog opsega. Na primer, fuzogeno sredstvo može da postane protonisan pri pH od 4.5-6.5. Fuzogeno sredstvo može da služi za otpuštanje polipeptida u citoplazmu ćelije nakon što je kompozicija upijena, npr., putem endocitoze, ćelijom, samim tim povećavajući ćelijsku koncentraciju polipeptida u ćeliji.
[0162] Fuzogena sredstva mogu da imaju grupu, npr., amino grupu, koja kada je izložena specifičnom pH opsegu, može da doživi promenu, npr., u punjenju, npr., protonaciju. Promene u punjenju fuzogenih agenasa mogu da izazovu promene, npr., osmotske promene, u vezikulama, npr., endocitnim vezikulama, npr., endozomima. Na primer, fuzogena sredstva, nakon što je izložen sredini u kojoj je pH vrednost endozoma, izaziva rastvorljivost ili osmotsku promenu koja je dovoljno suštinska da poveća poroznost (poželjno, pucanje) endozomatske membrane.
[0163] Fuzogena sredstva mogu biti polimeri, poželjno poliamino lanci, npr., polietileniminski (PEI). PEI može biti ravan, razgranat, sintetički ili prirodni. PEI može biti, npr., PEI supstituisan alkilom, ili PEI supstituisan lipidom.
[0164] Fuzogena sredstva mogu biti polihistidin, poliimidazol, polipiridin, polipropilenimin, mellitin, ili poliacetalne supstance, npr., katjonski poliacetali. Fuzogena sredstva mogu da imaju alfa spiralnu strukturu. Fuzogena sredstva mogu biti sredstva koji prekidaju membranu, npr., melitin. Druga prikladna sredstva može da identifikuje stručnjak.
[0165] Polipeptidi i/ili polipeptidne kompozicije mogu da obuhvataju ili da budu formulisane sa jednim ili više agenasa za kondenzovanje. Sredstva za kondenzovanje kompozicije opisane ovde mogu da stupe u interakciju sa (npr., da privuku, drže ili da se vežu za) polipeptide i da deluju tako da (a) kondenzuju, npr., smanje veličinu ili punjenje polipeptida i/ili (b) zaštite polipeptide, npr., da zaštite polipeptide do degradiranja. Sredstva za kondenzovanje mogu da uključe grupu, npr., grupu pod nabojem, koja može da stupi u interakciju sa polipeptidima putem jonskih interakcija. Sredstva za kondenzovanje poželjno mogu da budu napunjena polimerima, npr., polikatjonskim lancima. Sredstva za kondenzovanje mogu biti polilizin (PLL), spermin, spermidin, poliamin, pseudopeptid-poliamin, peptidomimetik poliamin, dendrimer poliamin, arginin, amidin, protamin, katjonski lipid, katjonski porfirin, kvartenarna so poliamina, ili alfa spiralni peptid.
[0166] U nekim slučajevima, polipeptidi mogu biti biciklični polipeptidi. Kako se ovde koristi, pojam "biciklični polipeptid" se odnosi na polipeptid sa dve petlje. Kao n-ograničavajući primer, biciklični C5 inhibitori polipeptida mogu biti proizvedeni u kombinatornim bibliotekama. Biciklični polipeptidi mogu da imaju 2, 3, 4, 5, 6 ili više aminokiselina po petlji.
[0167] Polipeptidi i/ili polipeptidne kompozicije mogu biti obezbeđene kao prolekovi. Kako se ovde koristi, pojam "prolek" se odnosi na lek koji je obezbeđen u neaktivnom obliku koji postaje aktivan u nekom trenutku nakon davanja. U nekim slučajevima kada se polipeptidi primenjuju kao prolek, aminokiseline koje su kritične po inhibitornu aktivnost polipeptida su nedostupne da stupe u interakciju sa ciljem usled reverzibilne hemijske veze, npr. estarske veze. Nakon davanja, takvi prolekovi mogu da podlegnu cepanju reverzibilne hemijske veze, npr., putem enzimatske ili hidrolize kiselina u stomaku, krvi i/ili ćelijama datog ciljanog tkiva.
C5 inhibitori
[0168] Neki polipeptidi i/ili polipeptidne kompozicije inhibiraju aktivaciju komplementa na nivou komponente C5 komplementa, koje su u daljem tekstu označene kao "C5 inhibitori." Neki C5 inhibitori funkcionišu tako što sprečavaju cepanje C5 na proizvode cepanja C5a i C5b, i takvi inhibitori su u daljem tekstu označeni kao "C5 inhibitori cepanja." U nekim slučajevima, postupci ovog pronalaska mogu da obuhvate inhibisanje C5 cepanja u sistemu. Kako se ovde koristi, "sistem" se odnosi na grupu povezanih delova koji funkcionišu zajedno. Takvi sistemi uključuju one koji obuhvataju C5, koji su u daljem tekstu označeni kao "C5 sistemi." C5 sistemi mogu da uključe, ali se ne ograničavaju na, rastvore, matrice, ćelije, tkiva, organe, i telesne tečnosti (uključujući, ali ne ograničavajući se na krv). U nekim slučajevima, C5 sistemi mogu predstavljati ćelijske sisteme. Kako se ovde koristi pojam "ćelijski sistem" odnosi se na sistem koji obuhvata jednu ili više ćelija ili jednu ili više komponenti ili proizvoda ćelije. U nekim slučajevima, C5 sistemi mogu da uključuju in vivo sisteme, in vitro sisteme i ex vivo sisteme. In vivo C5 sistemi mogu da obuhvate ili da budu obuhvaćeni subjektom. Kako se ovde koristi, pojam "subjekat" odnosi se na bilo koji organizam kom se jedinjenje u skladu sa ovim pronalaskom može primeniti, npr., za eksperimentalne, dijagnostičke, profilaktičke, i/ili terapeutske svrhe. Obično subjekti uključuju životinje (npr., sisare, kao što su miševi, pacovi, zečevi, ne-humani primati, i ljudi.)
[0169] U nekim slučajevima, C5 inhibitori ovog pronalaska mogu da uključuju bilo koji od polipeptida navedenih u Tabeli 1.
Table 1. Jedinjenja ovog pronalaska
[0170] U C5 sistemima, C5 i druge komponente sistema mogu biti u rastvoru ili mogu biti fiksni, kao u bunarčiću za ispitivanje. C5 sistemi mogu dalje da obuhvate druge komponente komplementa, u nekim slučajevima uključujući sve komponente neophodne za formiranje membranskog napadnog kompleksa (MAC.) U nekim slučajevima, polipeptidi i/ili polipeptidne kompozicije ovog pronalaska se mogu primeniti tako da inhibiraju C5 cepanje kod humanog subjekta. Takvi polipeptidi i/ili polipeptidne kompozicije mogu pronaći korist u lečenju različitih poremećaja povezanih sa komplementom i/ili bolesti kao i pratećih zapaljenskih stanja. Određeni C5 inhibitori su poznati u tehnici i oni se izučavaju u U.S. Pat Nos.7,348,401 i 6,355,245.
[0171] Cepanje C5 daje proteolitičke proizvode C5a i C5b. Mesto cepanja C5 koje se cepa kako bi se dobili proizvodi je ovde označeno kao mesto cepanja C5a-C5b. C5b doprinosi formiranju membranskog napadnog kompleksa (MAC) dok C5a stimuliše imuni sistem i zapaljenski odgovor. U nekim slučajevima, polipeptidi i/ili polipeptidne kompozicije ovog pronalaska sprečavaju cepanje C5 i prema tome mogu biti korisne u lečenju zapaljenja putem inhibicije zapaljenskih događaja uključujući, ali ne ograničavajući se na hemotaksis i aktivaciju zapaljenskih ćelija (npr. makrofaga, mastocita, neutrofilisa i pločica), proliferaciju endotelijalnih ćelija i edema.
[0172] Mnoge od komponenata komplementnog sistema, uključujući ali ne ograničavajući se na C3, C4, i C5, su funkcionalno inertne u njihovom nativnom stanju dok nisu ciljane za cepanje na više aktivnih komponenata. Cepanje C3 ili C4 izaziva konformacionu promenu koja izlaže interni domen tioestra. Unutar domena, interna tioestarska veza između bočnih lanaca ostatka cisteina i glutaimina je hemijski labilna veza koja doprinosi sposobnosti C3 i C4 da se veže za ćelijsku površinu i/ili biološki molekuli. Cepanje C3 i C4 takođe obezbeđuje komponente C5 konvertaze, ili C3bC4bC2a ili (C3b)2Bb. (Law, S.K., et al. (1997). Protein Science.6:263-274; van den Elsen, J.M.H., (2002). J. Mol. Biol.322:1103-1115.)
[0173] Struktura višestrukog domena C5 je slična sa C3 i C4. C5 konvertaza cepa C5 na komponente C5a i C5b. Cepanje C5 izaziva konformacionu promenu koja izlaže domenu C5b koji je sličan tioestru, koji ima ulogu u vezivanju C5 za C6, što je praćeno interakcijama sa C7 i C8 radi formiranja citolitičnog MAC. Strukture domena C5 obuhvataju regulatorne osobine koje su kritične za obradu i nishodnu aktivnost komplementa. (Fredslund, F. et al. (2008). Nature.9:753-760; Hadders, M.A. et al. (2012). Cell Reports.
1:200-207.)
[0174] Jedinjenja iz opisa mogu da vezuju C5 i da spreče cepanje C5 u C5a i C5b proizvode cepanja.
[0175] U skorije vreme, predložena je nova paradigma za aktivaciju komplemenata, zasnovana na otkriću da trombin generiše prethodno neidentifikovane C5 proizvode koji podržavaju aktivaciju putanje terminalnog komplementa (Krisinger, et al., (2014). Blood.120(8): 1717-1725).
[0176] Trombin deluje u kaskadi koagulacije, drugom procesu koji se zasniva na cirkulaciji kojim su organizmi, u odgovoru na povredu, sposobni da ograniče krvarenje, povrate vaskularni integritet, i promovišu zarastanje. Nakon oštećenja suda, faktor tkiva je izložen cirkulaciji, postavljanjem kaskade proteolitičkih reakcija što dovodi do generisanja centralne koagulacije trombina enzima, koji pretvara fibrinogen u ugrušak fibrina.
[0177] Istorijski gledano, aktivacija putanje komplementa se posmatrala odvojeno od kaskade koagulacije; međutim, međusobno uticanje između ova dva sistema je vredno ponovnog razmatranja. Koagulacija i komplement su koordinisano aktivirani tako da im se mesto i vreme preklapaju u odgovoru na uobičajene patofiziološke stimulanse radi održavanja homeostaze, i bolest se pojavljuje kada postoji neproverena aktivacija urođenih imunih i odgovora na koagulaciju, kako je dokazano, na primer, aterosklerozom, moždanim udarom, dijabetesom, ishemijskom-reperfuzijskom povredom, traumom, paroksizmalnom noćnom hemoglobinurijom, makularnom degeneracijom povezanom sa uzrastom, i atipičnim hemolitičko-uremijskim sindromom. Zapravo, zaključeno je da uvođenje inhibitora komplementa simultano leči zapaljenske i trombocitne smetnje povezane sa nekim od ovih poremećaja.
[0178] Kako je gore napomenuto, sistem komplementa se aktivira putem tri glavne putanje, pri čemu sve konverguju sa proteolitičkom aktivacijom centralne komplementne komponente C3. Naknadno, formiranje C5 konvertaza dovodi do cepanja C5 na argininu 751 (R751) da bi se oslobodio hemotaktički i anafilatoksični C5a fragment i da bi se generisao C5b. C5b je inicijalni faktor za sklop C5b zavisnog litičkog napadnog kompleksa (MAC; takođe poznatog i kao C5b-9), odgovornog za uništavanje oštećenih ćelija i patogena.
[0179] Identifikovano je nekoliko molekulskih veza između komplementa i koagulacije. Kao najupečatljivije u onome što je opisano kao nova putanja aktivacije komplementa, je to što je zaključeno da je trombin sposoban da direktno unapredi aktivaciju komplementa cepanjem C5, verovatno na R751, samim tim otpuštajući C5a u odsustvu C3 (Huber-Lang, et al., 2006. Nature Med.12(6):682-687).
Međutim, ova ispitivanja se ne bave poređenjem trombina sa bona fide C5 konvertazom, i izvode se samo ograničene biohemijske analize; stoga, fiziološka relevantnost putanje se ne može proceniti.
[0180] Upotrebom prečišćenih i sistema zasnovanih na plazmi, efekti trombina i C5 konvertaza na C5 se procenjuju merenjem otpuštanja anafilatoksina C5a i generisanja C5b, komponenta MAC-a. Otkriveno je da, dok trombin slabo cepa C5 na R751, obezbeđujući minimalan C5a i C5b, efikasno cepa C5 na novoidentifikovanom, visoko-konzervativnom R947 mestu, stvarajući prethodno neopisane intermedijere C5Ti C5bT. Zgrušavanje plazme u tkivu indukovano faktorom dovodi do proteolize na mestu osetljivom na trombin koje odgovara ovom novom R947 mestu a ne R751. Kombinovano lečenje C5 sa trombinom i C5 konvertazom obezbeđuje C5a i C5bT, pri čemu potonji formira C5bT-9 membranski napadni kompleks sa značajno više litičke aktivnosti nego sa C5b-9. Stoga, je predložena nova paradigma za aktivaciju komplementa, u kojoj je trombin konstantan i kritičan partner sa C5 konvertazom u iniciranju stvaranja aktivnijeg MAC-a putem formiranja prethodno neidentifikovanih C5 proizvoda koji su generisani putem kooperativne proteolize sa dva enzima. Ova otkrića obezbeđuju nove uvide u regulisanje urođenog imuniteta u kontekstu aktivacije koagulacije koja se javlja kod mnogih bolesti. (Krisinger, et al., (2014). Blood.120(8): 1717-1725).
[0181] Polipeptidi i/ili polipeptidne kompozicije opisane ovde mogu da inhibiraju trombinomindukovanu aktivaciju komplementa. Takvi polipeptidi i/ili polipeptidne kompozicije prema tome mogu da se koriste za lečenje hemolize koja je nastala kao rezultat trombinom-indukovane aktivacije komplementa.
[0182] Uzimajući u obzir nalaze molekulskih veza između komplementa i putanja koagulacije, veruje se da komplement množe biti aktiviran dodatnim komponentama koagulacije i/ili kaskadama zapaljenja. Na primer, druge proteaze serina sa blago različitom specifičnošću supstrata mogu da imaju slično dejstvo. Huber-Lang et al. (2006) pokazuju da trombin ne cepa samo C5 već i in vitro-generisan C3a kada se inkubira sa nativnim C3 (Huber-Lang, et al., 2006. Nature Med.12(6):682-687). Slično, za druge komponenete putanje koagulacije, kao što su FXa, FXIa i plazmin, je takođe zaključeno da cepaju i C5 i C3.
[0183] Konkretno, u mehanizmu sličnom onom koji je slično onom koji je primećen putem aktivacije trombina, primećeno je da su plazmin, FXa, FIXa i FXIa sposobni da cepaju C5 da bi se dobili C5a i C5b (Amara, et al., (2010). J. Immunol.185:5628-5636; Amara, et al., (2008) "Interaction Between the Coagulation and Complement System" in Current Topics in Complement II, J.D. Lambris (ed.), pp.71-79). Zaključeno je da su proizvedeni anafilatoksini biološki aktivni kako je demonstrirano dozno-zavisnim hemotatičkim odgovorom neutrofilisa i HMC-1 ćelija. Aktivnost cepanja indukovana plazminom može biti dozno-zavisno blokirana od strane aprotinina i leupeptina, inhibitora serinskih proteaza. Ovi nalazi ukazuju da različite proteaze serina koje pripadaju sistemu koagulacije mogu da aktiviraju kaskadu komplementa nezavisno od ustanovljenih putanja. Štaviše, funkcionalne C5a i C3a su generisane (kako je detektovano imunoblotiranjem i ELISA-om), pri čemu se za obe tehnike zna da su ključne kod zapaljenskog odgovora.
[0184] Polipeptidi i/ili polipeptidne kompozicije opisane ovde mogu da inhibiraju aktivaciju C5 plazminom, FXa, FIXa, FXIa i drugim proteazama putanje koagulacije.
[0185] Elastaza humanog leukocita (HLE), enzima koji se izlučuje neutrofilisom i makrofazima tokom zapaljenskog procesa, je dugo poznat da se otpušta iz C5 hemotaktičkog fragmenta, i fragmenta koji liči na C5a. Međutim, ovaj fragment koji liči na C5a, nije identičan sa C5a, jer HLE ne cepa veze peptida na mestu cepanja koje obično cepa C5 na C5a i C5b nakon izloženosti konvertazama komplementa.
Konkretno, za cepanje komplementa C5 putem HLE je takođe zaključeno da generiše funkcionalno aktivan molekul koji liči na C5b koji je sposoban da učestvuje u formiranju MAC-a (Vogt, (1999).
Immunobiology.201:470-477).
[0186] Polipeptidi i/ili polipeptidne kompozicije opisane ovde mogu da inhibiraju aktivaciju C5 putem HLE i drugih proteaza kaskada zapaljenja.
[0187] Polipeptidi i/ili polipeptidne kompozicije ovog pronalaska mogu biti korisne u lečenju bolesti, poremećaja i/ili stanja kod kojih cepanje C5 dovodi do napretka bolesti, poremećaja i/ili stanja. U takve bolesti, poremećaji i/ili stanja mogu da se ubroje, ali se ne ograničavaju na, imune i autoimune, neurološke, kardiovaskularne, pulmološke, i očne bolesti, poremećaji i/ili stanja. U imune i autoimune bolesti i/ili poremećaje mogu da se ubrajaju, ali se ne ograničavaju na, akutni diseminirani encefalomijelitis (ADEM), akutni nekrotizirajući hemoragijski leukoencefalitis, Adisonova bolest, agamaglobulinemija, alopecia areata, amiloidoza, ankilozirajući spondilitis, akutno odbacivanje organa nakon transplatacije posredovano antitelom, anti-GBM/Anti-TBM nefritis, antifosfolipidni sindrom (APS), autoimuna angioedema, autoimuna aplastična anemija, autoimuna disautonomija, autoimuni hepatitis, autoimuna hiperlipidemija, autoimuna imunodeficijencija, autoimuna bolest unutrašnjeg uha (AIED), autoimuni miokarditis, autoimuni pankreatitis, autoimuna retinopatija, autoimuna trombocitopenijska purpura (ATP), autoimuna bolest tiroidne žlezde, autoimuna urtikarija, aksonalna & neuronalna neutropatija, bakterijska sepsa i septički šok, balo bolest, Behčetova bolest, bulozni pemfigoid, kardiomiopaija, Kastlemanova bolest, celijačna bolest, čagas, sindrom hroničnog umora, hronična zapaljenska demijelinišuća polineuropatija (CIDP), hronični rekurentni multifokalni osteomijelitis (CRMO), Čarg-Štrausov sindrom, Ožiljavajući pemfigoid/benigni mukozalni pemfigoid, Kronova bolest, Koganov sindrom, bolest hladnih aglutinina, kongenitalni srčani zastoj, miokarditis izazvan koksaki virusom, CREST bolest, esencijalna mešana krioglobulinemija, demijelinišuće neutropatije, dermatitis herpetiformis, dermatomiozitis, devicova bolest (neuromyelitis optica), dijabetes tip I, diskoidni lupus, Dreslerov sindrom, endometrioza, eozinofilni ezofagitis, eozinofilni fascitis, eritema nodozum, eksperimentalni alergijski encefalomijelitis, Evansov sindrom, fibromijalgija, fibrozni alveolitis, arteritis džinovskih ćelija (temporalni arteritis), glomerulonefritis, Gudpastorov sindrom, granulomatoza sa poliangitisom (GPA) videti Vegenerova, Gravesova bolest, Gilijen-Bareov sindrom, Hashimoto encefalitis, Hashimoto tiroiditis, hemolitička anemija (uključujući atipični hemolitičko uremički sindrom i terapiju plazmom otpornu na atipični hemolitičko-uremijski sindrom), Henoh-Šenlajnova purpura, herpes gestationis, hipogamaglobulinemija, idiopatska trombocitopenijska purpura (ITP), IgA nefropatija, skrelozna bolest povezana sa IgG4, imunoregulatorni lipoproteini, inkluzioni telsni miozitis, insulinski-zavistan dijabetes (tip 1), intersticijalni cistitis, juvenilni artritis, juvenilni dijabetes, Kawasaki sindrom, Lamber-Itonov sindrom, vaskulopatija velikog suda, leukocitoklastični vaskulitis, lihen planus, lihen sklerozus, lignozni konjuktivitis, bolest ravnog IgA (LAD), lupus (SLE), lajmska bolest, Menijerova bolest, mikroskopski poliangiitis, bolest mešanih vezivnih tkiva (MCTD), Morenov ulkus, Muha-Habermanova bolest, sindromi višestuke neoplazije endokrine, ultipla skleroza, multifokalna motorna neuropatija, miozitis, mijastenija gravis, narkolepsija, neuromijelitis optiaa (devicova bolest), neutropenija, okularni ožiljavajuči pemfigoid, optički neuritis, osteoartritis, palindromski reumatizam, PANDAS (pedijatrijski autoimuni neuropsihijatrijski poremećaji povezani sa streptokokama), paraneoplastična cerebelarna degeneracija, paroksizmalna noćna hemoglobinurija (PNH), Pari Rombergov sindrom, lični Tarnerov sindrom, pars planitis (periferni uveitis), pemfigus, periferna neuropatija, perivenzni encefalomijelitis, perniciozna anemija, POEMS sindrom, poliarteritis nodosa, tip I, II, & III autoimunog poliglandularnih sindroma, poliendokrinopatije, reumatska polimijalgija, polimiozitis, sindrom postmiokardijalnog infarkta, sindrom postperikardiotomije, progesteron dermatitis, primarna bilijarna ciroza, primarni sklerozni holangitis, psorijaza, psorijazni artritis, idiopatska plućna fibroza, pyoderma gangrenosum, aplazija čistih crvenih krvnih zrnaca, Rejnodsov fenomen, reaktivni artritis, refleksna simpatetička distrofija, Rejterov sindrom, povratni polihondritis, sindrom nemirnih nogu, retroperitonelana fibroza, reumatska groznica, reumatoidni artritis, sarkoidoza, Šmitov sindrom, skleritis, skleroderma, šiga-toksin hemolitično-uremični sindrom koji proizvodi Escherichia Coli (STEC-HUS), Sjogrenov sindrom, vaskulopatija malih sudova, autoimunitet sperme i testisa, sindrom ukočene osobe, subakutni bakterijski endokarditis (SBE), Sudekov sindrom, simpatetička oftalmija, Takajasu arteritis, temporalni arteritis/arteritis džinovskih ćelija, trombocitopenijska purpura (TTP), Tolosa-Hunt sindrom, transverzni mijelitis, tubularni autoimuni poremećaj, ulcerativni kolitis, bolest neizdeferenciranog vezivnog tkiva (UCTD), uveitis, vezikulobulozna dermatoza, vasculitis, vitiligo i Vegenerova granulomatoza (takođe poznata i kao granulomatoza sa poliangiitisom (GPA)). U neurološke bolesti, poremećaje i/ili stanja mogu da se ubrajaju, ali se ne ograničavaju na, Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest, demencija se Levijevim telima i multipla skleroza. U kardiovaskularne bolesti, poremećaje i/ili stanja se ubrajaju, ali se ne ograničavaju na, ateroskleroza, infarkt miokarida, moždani udar, vaskulitis, trauma i stanja koja nastaju kao posledica kardiovaskularne intervencije (uključujući, ali ne ograničavajući se na operaciju ugrađivanja bajpasa na srcu, presađivanje arterije i angioplastija). U plućne bolesti, poremećaje i/ili stanja mogu da se ubrajaju, ali se ne ograničavaju na, astma, plućna fibroza, hronična opstruktivna plućna bolest (COPD) i respiratorni distres sindrom. Primene povezane sa očima čine, ali se ne ograničavaju na,: maskularnu degeneraciju koja je povezana sa starosnom dobi, alergijski i džinovski papilarni konjuktivitis, Behčetova bolest, horoidalno zapaljenje, komplikacije povezane sa intraokularnom operacijom, odbacivanje transplanta rožnjače, čirovi na rožnjači, citomegalovirus retinitis, sindrom suvog oka, endoftalmitis, Fušova bolest, glaukom, vaskulitis imunog kompleksa, zapaljenski konjunktivitis, ishemijska retinalna bolest, keratitis, macularna edema, očna parazitska infestacija/migracija, retinitis pigmentosa, skleritis, Stargardt bolest, subretinalna fibroza, uveitis, vitreo-retinalno zapaljenje, i Vogt-Koyanagi-Harada bolest.
[0188] Polipeptidi i/ili polipeptidne kompozicije ovog pronalaska mogu biti naročito korisni u lečenju pacijenata sa PNH koji pokazuju slab odgovor na terapije monoklonalnim antitelom, kao što je terapija ECULIZUMAB®, usled mutacija kod C5 gena koja sprečava vezivanje antitela za C5 (Nishimura, J-I. (2012).
54th ASH Annual Meeting, Abstract 3197).
[0189] Polipeptidi i/ili polipeptidne kompozicije ovog pronalaska mogu biti korisne u lečenju infektivnih bolesti, poremećaja i/ili stanja, na primer, kod nekog subjekta koji ima infekciju. U nekim slučajevima, subjekat ima infekciju i pod rizikom je da dođe do razvoja sepse ili spetičkog sindroma. Polipeptidi i/ili polipeptidne kompozicije ovog pronalaska su naročito korisni u lečenju sepse.
[0190] Polipeptidi i/ili polipeptidne kompozicije ovog pronalaska takođe se mogu davati kako bi se poboljšao ishod kliničkih postupaka pri čemu je poželjna inhibicija komplementa. U takve postupke mogu da se ubroje, ali se ne ograničavaju na, presađivanje, transplatacija, implantacija, kateterizacija, intubacija i njima slični. U nekim slučajevima, polipeptidi i/ili polipeptidne kompozicije ovde opisani se koriste za oblaganje uređaja, materijala i/ili biomaterijala koji se koriste u takvim postupcima. U nekim slučajevima, unutrašnja površna cevi može biti obložena sa polipeptidima i/ili polipeptidnim kompozicijama kako bi se sprečila aktivacija komplementa unutar telesne tečnosti koja prolazi kroz cev, ili in vivo ili ex vivo, npr., ekstrakorporalno preusmeravanje, npr., dijalizom i srčanim bajpasom.
Postupci upotrebe
Terapeutske indikacije
[0191] Ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu polipeptida (npr. peptidomimetika i cikličnih polipeptida) i kompozicija koje sadrže najmanje jedan polipeptid, za lečenje poremećaja, stanja ili bolesti. U nekim slučajevima, jedinjenja i kompozicije ovog pronalaska mogu se primeniti za lečenje subjekti koji boluju od paroksizmalne noćne hemoglobinurije (PNH). Subjekti sa PNH nisu sposobni da sintetizuju funkcionalne verzije komplementa regulatornih proteina CD55 i CD59 na hematopietičnim matičnim ćelijama. To dovodi do hemolize i raznih posledičnih komplikacija posredovanih komplementom. Drugi poremećaji i bolesti povezane sa komplementom čine, ali se ne ograničavaju na, autoimune bolesti i poremećaje, neurološke bolesti i poremećaje, bolesti i poremećaje krvi i infektivne bolesti i poremećaje. Eksperimentalni dokaz sugeriše da su mnogi poremećaji povezani sa komplementom zaobiđeni inhibitorskom aktivnošću komplementa.
[0192] Stečena mutacija u biosintezi fosfatidilinositol glikan ankora, klasa A (PIG-A) gena koji potiče od višepotentne hematopietične matične ćelije dovodi do retke bolesti poznate kao noćna hemoglobinurija (PNH) (Pu, J.J. et al., Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria from bench to bedside. Clin Transl Sci.2011 Jun;4(3):219-24). PNH karakteriše poremećaj kičmenog stuba, hemolitička anemija i tromboza. Proizvod PIG-A gena je neophodan za proizvodnju glikolipid ankora, glikosilfosfatidilinositol (GPI), koji se koristi da ograniči proteine na membranu plazme. Dvokomponentni regulatorni proteini, CD55 i CD59, postaju nefunkcionalni u odsustvu GPI. Ovo dovodi do komplementom-posredovanog uništavanja ovih ćelija. Polipeptidi i/ili polipeptidne kompozicije ovog pronalaska su naročito korisni u lečenju PNH. Kako se ovde koriste pojmovi "lečiti," "lečenje," i njima slični, se odnose na olakšanje od ili ublažavanje patoloških procesa. U kontekstu ovog pronalaska do sada kako se odnosi na bilo koja druga stanja navedena u nastavku, pojmovi "lečiti," "lečenje," i njima slični označavaju olakšavanje ili ublažavanje najmanje jednog simptoma povezanog sa takvim stanjem, ili usporavanje ili obrtanje napredovanja bolesti ili očekivanog napredovanja takvog stanja, kao što je usporavanje napredovanja maligniteta kancera, ili povećavanje klirensa neinfektivnog organizma kako bi se ublažili/smanjili simptomi izazvani infekcijom, npr., hepatitisa izazvanog infekcijom sa virusom hepatitisa ili smanjivanje uništavanja crvenih krvnih zrnaca (kako su izmerena zahtevima smanjene transfuzije ili povećanih nivoa hematokrita ili hemoglobina) što proističe od paroksizmalne noćne hemoglobinurije.
[0193] "Sniziti" ili "smanjiti" u kontekstu markera bolesti ili simptoma označavaju statistički značajno smanjenje na takvom nivou. Takvo smanjenje može biti, na primer, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40% ili više, i poželjno do nivoa koji je prihvatljiv u okviru normalnog opsega za pojedinca bez takvog poremećaja.
[0194] "Povećati" ili "povisiti" u kontekstu markera bolesti ili simptoma označava statistički značajan porast kod takvog nivoa. Povećanje može biti, na primer, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40% ili više, i poželjno do nivoa prihvatljivog unutar normalnog opsega pojedinca bez takvog poremećaja.
[0195] Kako se ovde koriste, fraze "terapeutski efektivna količina" i "profilaktički efektivna količina" se odnose na količinu koja obezbeđuje terapeutsku korist u lečenju, prevenciji, ili upravljanju patološkim procesima ili očiglednim simptomom jednog ili više patoloških procesa. Specifična količina koja je terapeutski efektivna brzo može odrediti doktor opšte prakse, i može veoma zavisiti od faktora poznatih u tehnici, kao što su, na primer, tip patološkog procesa, istorija pacijenta i uzrast, faza patoloških procesa, i davanje drugih sredstava koja inhibiraju patološke procese.
[0196] Kako se ovde koristi, "farmaceutska kompozicija" obuhvata farmakološki efektivnu količinu polipeptida i farmaceutski prihvatljiv nosač. Kako se ovde koristi, "farmakološki efektivna količina," "terapeutski efektivna količina" ili jednostavno "efektivna količina" se odnosi na onu količinu polipeptida koja je efektivna u postizanju nameravanog farmakološkog, terapeutskog ili preventivnog rezultata. Na primer, ukoliko se zadato kliničko lečenje smatra efektivnim kada postoji najmanje 10% izmena (povećanje ili smanjenje) parametra koji se može izmeriti povezanog sa bolešću ili poremećajem, terapeutski efektivna količina leka za lečenje te bolesti ili poremećaja je količina neophodna da se ostvari najmanje 10% promena kod parametra. Na primer, terapeutski efektivna količina polipeptida može biti ona koja menja vezivanje cilja za njegov prirodni vezujući partner za najmanje 10%.
[0197] Pojam "farmaceutski prihvatljiv nosač" se odnosi na nosač za davanje terapeutskog sredstva. Takve nosače čine, ali se ne ograničavaju na,, slani rastvor, puferovani slani rastvor, dekstroza, voda, glicerol, etanol, i njihove kombinacije. Pojam konkretno isključuje podlogu ćelijske kulture. Za lekove koji se primenjuju oralno, farmaceutski prihvatljiv nosači čine, ali se ne ograničavaju na, farmaceutski prihvatljive ekscipijense kao što su inertni razblaživači, sredstva za raspadanje, sredstva za vezivanje, sredstva za podmazivanje, zaslađivači, arome, sredstva za bojenje i konzervansi. Prikladni inertni razblaživači uključuju natrijum i kalcijum karbonat, natrijum i kalcijum fosfat, i laktoza, dok su kukuruzni skrob i alginska kiselina prikladna sredstva za raspadanje. Sredstva za vezivanje mogu da uključuju skrob i želatin, dok sredstvo za podmazivanje, ukoliko je prisutno, generalno može biti magnezijum stearat, stearinska kiselina ili talk. Ukoliko je poželjno, tablete mogu biti obložene materijalom kao što je gliceril monostearat ili gliceril distearat, kako bi se odložila apsorpcija u gastrointestinalnom traktu. Sredstva koja su uključena u formulacije leka su opisana u nastavku.
[0198] Efikasnost lečenja ili poboljšanje bolesti se može oceniti, na primer, merenjem napredovanja bolesti, remisijom bolesti, ozbiljnosti simptoma, smanjenja bola, kvalitetom života, dozom leka koja je potrebna za suzbijanje efekta lečenja, markera nivoa bolesti ili bilo kog drugog parametra koji se može izmeriti a koji je odgovarajući za datu bolest koja se leči ili kojima je cilj prevencija. Stručnjak je i te kako sposoban da prati efikasnost lečenja ili prevencije merenjem jednog od takvih parametara, ili neke kombinacije parametara. U vezi sa davanjem polipeptida ili njegove faramaceutske kompozicije, "efektivan protiv" bolesti ili poremećaja znači da davanje na klinički adekvatan način dovodi do korisnog efekta za najmanje deo pacijenata, efekta kao što je poboljšanje simptoma, izlečenje, smanjenje tereta bolesti, smanjenje tumorske mase ili broja ćelija, produžetak života, poboljšanje kvaliteta života, smanjenja potrebe za transfuzijom krvi ili drugog efekata koji doktori koji su upoznati sa lečenjem odrešenog tipa bolesti ili poremećaja smatraju generalno pozitivnim.
[0199] Lečenje ili preventivni efekat je očigledan kada postoji statistički značajno poboljšanje jednog ili više parametara u statusu bolesti, ili kada ne dođe do pogoršanja ili razvoja simptoma tamo gde se inače očekuju njihov razvoj. Kao primer, povoljna promena od najmanje 10% kod parametra koji se može izmeriti, i poželjno najmanje 20%, 30%, 40%, 50% ili više može značiti da je lečenje efektivno. Efikasnost datog polipeptidnog leka ili formulacije tog leka se takođe može proceniti korišćenjem eksperimentalnog životinjskog modela za datu bolest na način koji je poznat u tehnici. Kada se koristi eksperimentalni životinjski model, efikasnost lečenja je očigledna kada se primeti statistički značajna modulacija kod markera ili simptoma.
[0200] Polipeptid i dodatno terapeutsko sredstvo se mogu primenjivati u kombinaciji u istoj kompoziciji, npr., parenteralno, ili se dodatno terapeutsko sredstvo može primenjivati kao deo zasebne kompozicije drugim postupkom opisanim ovde.
Zapaljenske indikacije
[0201] Jedinjenja i kompozicije opisane ovde mogu se primeniti za lečenje subjekta sa bolešću, poremećajem i/ili uslovima povezanim sa zapaljenjem. Zapaljenje može biti ushodno regulisano tokom proteolitičkog sistema kaskada komplementa. Iako zapaljenje može da ima koristan efekat, prekomerno zapaljenje može da dovede do različitih patologija (Markiewski et al.2007. Am J Pathol.17:715-27). S tim u vezi, jedinjenja i kompozicije ovog pronalaska mogu se primeniti kako bi se smanjilo ili eliminisalo zapaljenje povezano sa aktivacijom komplementa.
Sterilno zapaljenje
[0202] Jedinjenja i kompozicije ovog pronalaska mogu se primeniti za lečenje, prevenciju ili odlaganje sterilnog zapaljenja. Sterilno zapaljenje predstavlja zapaljenje koje se odvija kao odgovor na stimulanse koji nisu infekcija. Sterilno zapaljenje može biti uobičajeni odgovor na stres kao što je genomski stres, hipoksični stres, hranjivi stres ili endoplazmatski stres izazvan fizičkim, hemijskim ili metaboličkim škodljivim stimulansima. Sterilno zapaljenje može da doprinese patogenezi mnogih bolesti kao što je, ali ne ograničavajući se na, povrede indukovane ishemijom reumatoidni artritis, akutno oštećenje pluća, oštećenje jetre indukovano lekovima, zapaljenske bolesti creva i/ili druge bolesti, poremećaji ili stanja. Mehanizam sterilnog zapaljenja i postupci i kompozicije za lečenje, lečenje, prevenciju i/ili odlaganje simptoma sterilnog zapaljenja mogu da uključuju bilo koja od onih o koji sa govori u Rubartelli et al. in Frontiers in Immunology, 2013, 4:398-99, Rock et al. in Annu Rev Immunol.2010, 28:321-342 ili in United States Patent No.8,101,586.
Sistemski zapaljenski odgovor (SIRS) i sepsa
[0203] Jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti za lečenje i/ili prevenciju sindroma sistemskog zapaljenskog odgovora (SIRS). SIRS predstavlja zapaljenje koje pogađa ceo organizam. Tamo gde je SIRS izazvan infekcijom, označen je kao sepsa. SIRS može takođe biti izazvan ne-infektivnim događajima kao što je trauma, povreda, čvoruge, ishemija, hemoragija i/ili druga stanja. Tokom sepse o SIRS-a, aktivacija komplementa dovodi do prekomernog stvaranja proizvoda aktivacije komplementa koji mogu da izazovu višestruko otkazivanje organa (MOF) kod subjekata. Jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti radi kontrolisanja i/ili balansiranja aktivacije komplementa radi prevencije i lečenje SIRS-a, sepse i/ili MOF-a. Ti postupci primenjivanja inhibitora komplementa za lečenje SIRS-a i sepse mogu da uključuju i one o kome se govori kod Rittirsch et al. in Clin Dev Immunol, 2012, 962927, u U.S. publication No. US2013/0053302 ili u United States Patent No.8,329,169.
Akutni respiratorni distresni sindrom (ARDS)
[0204] Jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti za lečenje i/ili prevenciju razvoja akutnog respiratornog distresnog sindroma (ARDS). ARDS je široko rasprostranjeno zapaljenje pluća i mogu ga izazvati trauma, infekcija (npr., sepsa), ozbiljna pneumonija i/ili udisanje štetnih supstanci. ARDS je obično ozbiljna, životno-ugrožavajuća komplikacija. Ispitivanja ukazuju da neutrofilis može da doprinese razvoju ARDS-a uticanjem na akumuliranje polimorfonuklearnih ćelija kod povređenih plućnih alveola i intersticijalnog tkiva pluća. S tim u vezi, jedinjenja i kompozicije opisani ovde se mogu primenjivati kako bi se smanjila i/ili sprečila proizvodnja faktora tkiva kod alveolarnog neutrofilisa. Jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu dalje da se koriste za lečenje, prevenciju i/ili odlaganje ARDS-a, u nekim slučajevima u skladu sa vilo kojim od postupaka koji se pominju International publication No. WO2009/014633.
Periodontitis
[0205] Jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti za lečenje ili sprečavanje razvoja periodontitisa i/ili povezanih stanja. Periodontitis je široko rasprostranjeno, hronično zapaljenje koje dovodi do uništavanja periodontalnog tkiva koje je tkivo koje predstavlja potporu i okružuje zube. Stanje takođe uključuje gubitak alveolarne kosti (kosti koja drži zube). Periodontitis može biti izazvan nedostatkom higijene što dovodi do taloženja bakterija u liniji desni, što je takođe poznato kao zubni plak. Određena zdravstvena stanja kao što je dijabetes ili neuhranjenost i/ili navike kao što je pušenje mogu da povećavaju rizik od periodontitisa. Periodontitis može da poveća rizik od moždanog udara, infarkta miokarda, ateroskleroze, dijabetesa, osteoporoze, prevremenog porođaja, kao i do drugih zdravstvenih problema. Ispitivanja su pokazala da postoji korelacija između periodontitisa i nedostatka aktivnosti komplementa. Periodontalne bakterije mogu ili da inhibiraju ili da aktiviraju odrešene komponente kaskade komplementa. S tim u vezi, jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti da bi se sprečio i/ili lečio periodontitis i povezane bolest i stanja. Aktivacija inhibitora komplemenata i postupci lečenja mogu da uključuju bilo koje od postupaka opisanih u Hajishengallis in Biochem Pharmacol.2010, 15; 80(12):1 and Lambris ili u US publication No. US2013/0344082.
Rane i povrede
[0206] Jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti za lečenje i/ili promovisanje zarastanja raznih vrsta rana i/ili povreda. Kako se ovde koristi, pojam "povreda" se obično odnosi na fizičku traumu, ali može da obuhvati i lokalizovanu infekciju ili procese bolesti. Povrede mogu da karakterišu povreda, oštećenje ili uništavanje izazvano spoljnim događajima koji utiču na delove tela i/ili organa. Rane su povezane sa posekotinama, udarcima, opekotinama i/ili drugim uticajima na kožu, od kojih koža puca ili je oštećena. Rane i povrede su često akutne ali ukoliko pravilno ne zarastu, mogu da dovedu do hroničnih komplikacija i/ili zapaljenja.
Rane i opekotine
[0207] Jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti za lečenje i/ili radi promovisanja zarastanja rana. Zdrava koža obezbeđuje vodootpornu, zaštitnu barijeru od patogenih i drugih uticaja iz spoljašnje sredine. Koža takođe kontroliše telesnu temperaturu i isparavanje tečnosti. Kada je koža povređena ove funkcije se prekidaju i time zarastanje kože postaje izazov. Zarastanje je inicirano skupom fizioloških procesa povezanih sa imunim sistemom koji oporavlja i regeneriše tkivo. Aktivacija komplementa predstavlja jedan od tih postupaka. Ispitivanja aktivacije komplementa su identifikovala nekoliko komplemenata uključenih u zarastanje rana kako je opisano u van de Goot et al. in J Burn Care Res 2009, 30:274-280 i Cazander et al. Clin Dev Immunol, 2012, 2012:534291. U nekim slučajevima, aktivacija komplementa može biti prekomerna, što izaziva smrt ćelije i pojačano zapaljenje (koje dovodi do oštećenog zarastanja rane i hronične rane ). U nekim slučajevima, jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti kako bi se smanjila ili eliminisala takva aktivacija komplementa da bi se promovisalo zarastanje rane. Lečenje sa jedinjenjima i kompozicijama opisanim ovde se može sprovesti u skladu sa nekim od postupaka za lečenje opisanim u International publication
number WO2012/174055.
Povreda glave
[0208] Jedinjenja i kompozicije opisan ovde mogu se primeniti za lečenje i/ili promovisanje zarastanja povrede glave. Povrede glave uključuje povredu skalpa, lobanje ili mozga. Primeri povreda glave čine, ali se ne ograničavaju na, potrese, kontuzije, frakturu lobanje, traumatske povrede mozga i/ili druge povrede. Povrede glave mogu biti manje ili ozbiljne. U nekim slučajevima, povreda glave može da dovede do dugoročnih fizičkih i/ili mentalnih komplikacija ili smrti. Ispitivanja ukazuju da povrede glave mogu da izazovu aktivaciju nepravilne intrakranijalne kaskade komplementa, koja može da dovede do lokalnih zapaljenskih odgovora što doprinosi sekundarnom oštećenju mozga razvojem edema mozga i/ili neuronalne smrti (Stahel et al. in Brain Research Reviews, 1998, 27: 243-56). Jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti za lečenje povreda glave i/ili kako bi se smanjile ili sprečile povezane sekundarne komplikacije. Postupci primene jedinjenja i kompozicije opisane ovde radi kontrolisanja aktivacije kaskade komplementa kod povrede glave mogu da uključuju bilo koji od onih opisanih u Holers et al. in United States Patent No.8,911,733.
Povrede nagnječenja
[0209] Jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti za lečenje i/ili promovisanje izlečenja povreda nagnječenja. Povrede nagnječenja su povrede izazvane snagom ili pritiskom na telo što izaziva krvarenje, modrice, frakture, povrede nerva, rane i/ili druga oštećenja tela. Jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti kako bi se smanjila aktivacija komplementa nakon povreda nagnječenja, samim tim promovišući zarastanje nakon povrede nagnječenja (npr. promovisanjem regeneracije nerva, promovisanjem zarastanja frakture, sprečavanjem ili lečenjem zapaljenja, i/ili drugih povezanih komplikacija). Jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti za promovisanje zarastanja u skladu sa bilo kojim od postupaka opisanih u United States Patent No.8,703,136; International Publication Nos. WO2012/162215; WO2012/174055; ili US publication No. US2006/0270590.
Autoimuna bolest
[0210] Jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti za lečenje subjekata sa autoimunim bolestima i/ili poremećajima. Imuni sistem može biti podeljen na urođeni i adaptivni sistem, što se odnosi na nespecifične mehanizme neposredne odbrane i složenije antigen-specifične sisteme. Sistem komplementa predstavlja deo urođenog imunog sistema, koji prepoznaje i eliminiše patogene. Dodatno, proteini komplementa mogu da prilagođavaju adaptivni imunitet, povezivanjem urođenih i adaptivnih odgovora. Autoimune bolesti i poremećaji su imunološke abnormalnosti koje izazivaju da sistem cilja sopstvena tkiva i supstance. Autoimuna bolest može da obuhvati određena tkiva ili organe tela.
Jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti kako bi se prilagodio komplement u lečenju i/ili sprečavanju autoimunih bolesti. U nekim slučajevima, takva jedinjenja i kompozicije mogu se primeniti u skladu sa postupcima predstavljenim u Ballanti et al. Immunol Res (2013) 56:477-491.
Antifosfolipidni sindrom (APS) i katastrofalni antifosfolipidni sindrom (CAPS)
[0211] Jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti radi sprečavanja i/ili lečenja antifosfolipidnog sindroma (APS) aktivacijom kontrole komplementa. APS je autoimuno stanje izazvano antifosfolipidnim antitelima koja dovode do zgrušavanja krvi. APS može da dovede do rekurentne venozne ili arterijalne tromboze u organima, i komplikacija u placentnim cirkulacijama što dovodi do komplikacija u trudnoći kao što je pobačaj, mrtvo novorođenče, preeklampsija, prevremeni porođaj i/ili drugih komplikacija. Katastrofalni antifosfolipidni sindrom (CAPS) predstavlja ekstrem i akutnu verziju sličnog stanja koje dovodi do okluzije vena istovremeno kod nekoliko organa. Ispitivanja su pokazala da aktivacija komplementa može da doprinese komplikacijama povezanim sa APS-om uključujući komplikacije u trudnoći, tromboske komplikacije (zgrušavanje), i vaskularne komplikacije. Jedinjenje i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti za lečenje stanja povezanih sa APS-om smanjivanjem ili eliminisanjem aktivacije komplementa. U nekim slučajevima, jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti za lečenje APS i/ili komplikacija povezanih sa APS-om u skladu sa postupcima opisanim u Salmon ct al. Ann Rheum Dis 2002;61(Suppl II):ii46-ii50 i Mackworth-Young in Clin Exp Immunol 2004, 136:393-401.
Bolest hladnih aglutinina
[0212] Jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti za lečenje bolesti hladnih aglutinina (CAD), koja je takođe označena i kao hemoliza posredovana hladnim aglutininima. CAD je autoimuna bolest koja nastaje usled visoke koncentracije IgM antitela koja stupaju u interakciju sa crvenim krvnim zrncima pri niskom opsegu telesnih temperatura [Engelhardt et al. Blood, 2002, 100(5): 1922-23]. CAD mogu da dovedu do stanja kao što je anemija, umor, dispneja, hemoglobinurijaa i/ili akrocijanoza. CAD je povezana sa robusnom aktivacijom komplementa i ispitivanja su pokazala da se CAD može lečiti sa terapijama inhibitora komplementa. S tim u vezi, ovaj pronalazak opisuje postupke lečenja CAS upotrebom jedinjenja i kompozicija opisanih ovde. U nekim slučajevima, jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti za lečenje CAD u skladu sa postupcima opisanim u Roth et al in Blood, 2009, 113:3885-86 ili u International publication No. WO2012/139081.
Vaskularna indikacije
[0213] Jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti za lečenje vaskularnih indikacija koje utiču na krvne sudove (npr., arterije, vene, i kapilare). Takve indikacije mogu da utiču na cirkulaciju, krvni pritisak, krvotok, funkciju organa i/ili druge telesne funkcije.
Trombotična mikroangiopatija (TMA)
[0214] Jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti za lečenje i/ili sprečavanje trombotične mikroangiopatije (TMA) i povezanih bolesti. Mikroangiopatije pogađaju male krvne sudove (kapilare) u telu i dovodeći do toga da zidovi kapilara postanu tvrdi, slabi, i skloni krvarenju i sporoj cirkulaciji. TMAs imaju tendenciju da dovedu do razvoja vaskularnih trombova, oštećenja endotelijalne ćelije, trombocitopenije, i hemolize. Organi kao što su mozak, bubreg, mišići, gastrointestinalni sistem, koža, i pluća takođe mogu biti zahvaćeni. TMAs mogu da se jave kao posledica medicinskih operacija i/ili stanja koja čine, ali se ne ograničavaju na, transplatacija hematopietičih matičnih ćelija (HSCT), poremećaji bubrega, dijabetes i/ili druga stanja. TMAs mogu biti izazvani disfunkcijom inherentnog sistema komplementa, kako je opisano kod Meri et al. in European Journal of Internal Medicine, 2013, 24: 496-502. Generalno, TMAs mogu da nastanu kao rezultat povećanih nivoa određenih komponente komplementa što dovodi do tromboze. U nekim slučajevima, ovo može biti izazvano mutacijama u proteinima komplementa i povezanim enzimima. Nastala disfunkcija komplementa može da dovede do ciljanja komplementa endotelijalnih ćelija i pločica što dovodi do povećane tromboze. TMAs se mogu sprečiti i/ili lečiti sa jedinjenjem i kompozicijama opisanim ovde. U nekim slučajevima, postupci lečenja TMAs sa jedinjenjima i kompozicijama opisanim ovde se mogu sprovesti u skladu sa onim opisanim u US publication Nos. US2012/0225056 ili US2013/0246083.
Diseminirana intravaskularna koagulacija (DIC)
[0215] Jedinjenja i kompozicije opisan ovde mogu se primeniti radi sprečavanja i/ili lečenja diseminirane intravaskularne koagulacije (DIC) kontrolisanjem aktivacije komplementa. DIC je patološko stanje gde je kaskada zgrušavanja u krvi široko aktivirana i dovodi do formiranja krvnih ugrušaka naročito u kapilarima. DIC može da dovede do opstruktivnog protoka krvi u tkivima i vremenom može da ošteti organe. Pored toga, DIC pogađa normalan proces zgrušavanja krvi što može da dovede do ozbiljnog krvarenja. Jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti za lečenje, sprečavanje ili umanjenje ozbiljnosti DIC prilagođavanjem aktivnosti komplementa. U nekim slučajevima jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti u skladu sa bilo kojim od postupaka lečenja DIC opisnih u US Patent No.
8,652,477.
Vaskulitis
[0216] Jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti radi sprečavanja i/ili lečenja vaskulitisa. Generalno, vaskulitis predstavlja poremećaj povezan sa zapaljenjem krvnih sudova, uključujući vene i arterije, koga karakteriše to da bela krvna zrnca napadaju tkiva i izazivaju oticanje krvnih sudova.
Vaskulitis može biti povezan sa infekcijom, kao kod Rocky Mountain tačkaste groznice ili autoimunitetom. Primer autoimuniteta povezanog sa vaskulitisom je vaskulitis antineutrofilnih citoplazmatskih anti-antitela (ANCA vasculitis). ANCA vaskulitis izazivaju abnormalna antitela koja napadaju sopstvene ćelije i tkiva. ANCAs napada citoplazmu određenih belih krvnih zrnaca i neutrofile, što dovodi do toga da oni napadaju zidove sudova u određenim telesnim organima i tkivima. ANCA vaskulitis može da zahvati kožu, pluća, oči i/ili bubrege. Ispitivanja pokazuju da ANCA bolest aktivira alternativnu putanju komplementa i generiše određene komponente komplementa koje stvaraju zapaljenje amplifikacione petlje što dovodi do vaskularne povrede (Jennette et al.2013, Semin Nephrol.
33(6): 557-64). U nekim slučajevima, jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti za sprečavanje i/ili lečenje ANCA vaskulitisa inhibiranjem aktivacije komplementa.
Neurološke indikacije
[0217] Jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti radi sprečavanja, lečenja i/ili olakšavanja simptoma neuroloških indikacija, uključujući, ali ne ograničavajući se na neurodegenerative bolesti i povezane poremećaje. Neurodegeneracija se generalno odnosi na gubitak strukture ili funkcije neurona, uključujući smrt neurona. Ovi poremećaji se mogu lečiti inhibiranjem efekta komplementa na neuronske ćelije upotrebom jedinjenja i kompozicije opisanih ovde. Neurodegenerativne poremećaje čine, ali se ne ograničavaju na, amioklotofična lateralna skleroza (ALS), multipla skleroza (MS), Parkinsonova bolest i Alchajmerova bolest.
Amiotrofična lateralna skleroza (ALS)
[0218] Jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti za sprečavanje, lečenje i/ili ublažavanje simptoma ALS. ALS predstavlja fatalnu bolest motornog neurona koju karakteriše degeneracija neurona kičmene moždine, moždanog stabla, motornog korteksa. ALS izaziva gubitak mišićne snage koja vremenom dovodi do prestanka rada pluća. Disfunkcija komplementa može da doprinese ALS-u, i samim tim ALS se može sprečiti, lečiti i/ili se simptomi mogu smanjiti terapijom jedinjenjem ili kompozicijama opisanim ovde koji ciljaju aktivnost komplementa. U nekim slučajevima, jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti kako bi se promovisalo regenerisanje nerva. U nekim slučajevima, jedinjenja i kompozicije opisane ovde mogu se primeniti kao inhibitori komplemenata u skladu sa bilo kojim od postupaka opisanih u US publication No. US2014/0234275 ili US2010/0143344.
[0219] Jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti radi sprečavanja i/ili lečenja Alchajmerove bolesti kontrolisanjem aktivnosti komplementa. Alchajmerova bolest je hronična neurodenerativna bolest sa simptomima koji mogu da uključe dezorijentisanost, gubitak pamćenja, promene raspoloženja, problemi u ponašanju i vremenom gubitak telesnih funkcija. Smatra se da Alchajmerovu bolest izazivaju ekstracelularni depoi amiloida u mozgu koji su povezani sa proteinima koji se odnose na zapaljenje kao što su proteini komplementa (Sjoberg et al.2009. Trends in Immunology.
30(2): 83-90). Jedinjenja i kompozicije opisani ovde se mogu primenjivati kao inhibitori komplementa u skladu sa bilo kojim od postupaka za lečenje Alchajmerove bolesti opisanim u US publication
No. US2014/0234275.
Indikacije povezane sa bubrezima
[0220] Jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti za lečenje određenih bolesti, poremećaja i/ili stanja povezanih sa bubrezima, u nekim slučajevima inhibiranjem aktivnosti komplementa. Bubrezi su organi koji su odgovorni za uklanjanje proizvoda metaboličkog otpada iz krvotoka. Bubrezi regulišu krvni pritisak, urinarni sistem, hmeostaske funkcije i prema tome su suštinski neophodni za različite telesne funkcije. Bubrezi mogu biti ozbiljnije pogođeni zapaljenjem (u poređenju sa drugim organima) zbog jedinstvenih strukturnih osobina i izloženosti krvi. Bubrezi takođe proizvode svoje sopstvene proteine komplementa koji se mogu aktivirati nakon infekcije, bolesti bubrega i transplantacije bubrega. U nekim slučajevima, jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti kao inhibitori komplementa u lečenju određenih bolesti, stanja, i/ili poremećaja bubrega u skladu sa postupcima opisanim kod Quigg, J Immunol 2003; 171:3319-24.
Lupus Nefritis
[0221] Jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti radi sprečavanja i/ili lečenja lupus nefritisa inhibiranjem aktivnosti komplementa. Lupus nefritis je zapaljenje bubrega izazvano autoimunom bolešću sistemiki lupus eritematosus (SLE). U simptome lupus nefritisa se ubrajaju visok krvni pritisak; penušav urin; oticanje nogu, stopala, ruku ili lica; bol u zglobovima; bol u mišićima; temperatura; i osip. Lupus nefritis može biti lečen inihibitorima koji kontrolišu aktivnost komplementa, uključujući jedinjenja i kompozicije ovog pronalaska. Postupci i kompozicije za sprečavanje i/ili lečenje lupus nefritisa inhibicijom komplementa mogu da uključuju bilo koji postupak opisan u US publication No. US2013/0345257 ili United States Patent No.8,377,437.
Membranski glomerulonefritis (MGN)
[0222] Jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti radi sprečavanja i/ili lečenja poremećaja membranskog glomerulonefritisa (MGN) inhibiranjem aktivacije određene komponente komplementa. MGN je poremećaj bubrega koji može da dovede do zapaljenja i strukturne promene. MGN izazivaju antitela koja se vezuju za rastvorljivi antigen u kapilarima bubrega (glomerulus). MGN može da utiče na funkcije bubrega, kao što je filtriranje tečnosti i mogu da dovedu do otkazivanja bubrega. Jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti u skladu sa postupcima sprečavanja i/ili lečenja MGN inhibicijom komplementa opisanom u U.S. publication No. US2010/0015139 ili u International publication No. WO2000/021559.
Komplikacije kod hemodijalize
[0223] Jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti radi sprečavanja i/ili lečenja komplikacija povezanih sa hemodijalizom inhibiranjem aktivacije komplementa. Hemodijaliza je medicinski postupak koji se koristi za održavanje funkcije bubrega kod subjekata sa disfunkcijom bubrega. U hemodijalizi, uklanjanje otpadnih proizvoda kao što je kreatinin, urea, slobodna vode iz krvi se izvodi eksterno.
Uobičajena komplikacija lečenja hemodijalizom je hronično zapaljenje izazvano kontaktom između krvi i membrane dijalize. Druga uobičajena komplikacija je tromboza koja se odnosi na formiranje krvnih ugrušaka koji opstruiraju cirkulaciju krvi. Ispitivanja su pokazala da su ove komplikacije povezane sa aktivacijom komplementa. Hemodijaliza se može kombinovati sa terapijom inhibitora komplementa kako bi se obezbedila sredstva kontrolisanja zapaljenskih odgovora i patologija i/ili sprečavanja ili lečenja tromboze kod subjekata koji su na hemodijalizi usled disfunkcije bubrega. Postupci primene jedinjenja i kompozicija opisanih ovde za lečenje komplikacija hemodijalize se može sprovesti u skladu sa nekim od postupaka opisanih u DeAngelis et al in Immunobiology, 2012, 217(11): 1097-1105 ili Kourtzelis et al. Blood, 2010, 116(4):631-639.
Očne bolesti
[0224] Jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti radi sprečavanja i/ili lečenja određenih očnih bolesti, poremećaja i/ili stanja. U zdravom oku, komplementni sistem se aktivira na niskom nivou i kontinuirano se reguliše intraokularnim rastvorljivim i proteinima koji su vezani za membranu koji je štite od patogena. Prema tome aktivacija komplementa ima važnu ulogu kod nekoliko komplikacija povezanih sa okom a kontrolisana aktivacija komplementa se može primeniti za lečenje takvih bolesti. Jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti kao inhibitori komplementa u lečenju očne bolesti u skladu bilo kojim od postupaka opisanih u Jha et al. in Mol Immunol.2007; 44(16): 3901-3908 ili u US Patent No.8,753,625.
Mišićna degeneracija povezana sa starosnom dobi (AMD)
[0225] Jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti radi sprečavanja i/ili lečenja mišićne degeneracije povezane sa starosnom dobi (AMD) inhibiranjem očne aktivacije komplementa. AMD je hronična očna bolest koja izaziva zamagljen centralni vid, slepe tačke u centralnom vidnom polju, i/ili potencijalan gubitak vida. Centrali vid utiče na sposobnost čitanja, vožnje motornog vozila i/ili prepoznavanja lica. AMD se generalno deli na dva tipa, ne-eksudativni (suvi) i eksudativni (vlažni). Suvi AMD se odnosi na propadanje mrlja koje predstavljaju tkivo u centru mrežnjače. Vlažna AMD se odnosi na disfunkciju krvnih sudova ispod mrežnjače što dovodi do curenja krvi i tečnosti. Nekoliko ispitivanja na ljudima i životinjama je identifikovalo proteine komplementa koji su povezani sa AMD i novim terapeutskim strategijama koje su uključene u kontrolisanje aktivacije putanja komplementa, kako je opisano kod Jha et al. in Mol Immunol.2007; 44(16): 3901-8. Postupci koji uključuju upotrebu jedinjenja i kompozicija opisanih ovde radi sprečavanja i/ili lečenja AMD-a mogu da uključuju bilo koji od postupaka opisanih u US publication Nos. US2011/0269807 ili US2008/0269318.
Bolest rožnjače
[0226] Jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti radi sprečavanja i/ili lečenja bolesti rožnjače inhibiranjem očne aktivacije komplementa. Sistem komplementa ima važnu ulogu u zaštiti rožnjače od patogenih predmeta i/ili zapaljenskih antigena. Rožnjača je najistureniji prednji deo oka koji pokriva i štiti dužicu, zenicu i prednju komoru i samim tim je izložena spoljašnjim faktorima. Bolesti rožnjače bolesti čine, ali se ne ograničavaju na, keratokonus, keratitis, očni herpes i/ili druge bolesti. Komplikacije sa rožnjačom mogu da izazovu bol, zamagljen vid, suzenje oka, crvenilo, blagu osetljivost, i/ili ožiljke na rožnjači. Sistem komplementa je kritičan za zaštitu rožnjače, ali aktivacija komplementa može da izazove oštećenje tkiva rožnjače nakon povlačenja infekcije budući da su određena jedinjenja komplementa jako eksprimirana. Postupci za prilagođavanje aktivnosti komplementa u lečenju bolesti rožnjače mogu da uključuju bilo koji od postupaka opisanih u Jha et al. in Mol Immunol.2007; 44(16): 3901-8.
Autoimuni uveitis
[0227] Jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti radi sprečavanja i/ili lečenja uveitisa, koji je zapaljenje uvealnog sloja u oku. Uvea je pigmentisai deo oka koji obuhvata sudovnjaču, dužicu i cilijarno telo oka. Uveitis izaziva crvenilo, zamagljen vid, bol, sinehiju i može vremenom da izazove slepilo. Ispitivanja su pokazala da su proizvodi aktivacije komplementa prisutni u očima pacijenata sa autoimunim uveitisom i komplement ima važnu ulogu u razvoju bolesti. U nekim slučajevima, jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti za lečenje i/ili sprečavanje uveitisa u skladu sa bilo kojim postupkom identifikovanim u Jha et al. in Mol Immunol.2007.44(16): 3901-8.
Dijabetesna retinopatija
[0228] Jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti radi sprečavanja i/ili lečenja dijabetesne retinopatije koja je bolest izazvana promenama u krvnim sudovima mrežnjače kod pacijenata sa dijabetesom. Retinopatija može da izazove oticanje krvnih sudova i curenje tečnosti i/ili rast abnormalnihkrvnih sudova. Dijabetesna retinoaptija pogađa vid i može vremenom da dovede do slepila. Ispitivanja su pokazala da aktivacija komplementa ima važnu ulogu u opisanom razvoju dijabetesne retinopatije. U nekim slučajevima, jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primenjivati u skladu sa postupcima dijabetesne retinopatije u skladu sa postupcima lečenje dijabetesne retinopatije opisanim u Jha et al. Mol Immunol.2007; 44(16): 3901-8.
Preeklampsija i HELLP- sindrom
[0229] Jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti radi sprečavanja i/ili lečenja preeklampsije i/ili HELLP (skraćenica koja označava osobine sindroma 1) hemolize, 2) povišenih enzima jetre i 3) niskog broja krvnih pločica) sindroma terapijom inhibitora komplementa. Preeklampsija je poremećaj u trudnoći sa simptomima koji uključuju povišeni krvni pritisak, oticanje, gubitak daha, disfunkcija bubrega, oštećena funkcija jetre i/ili nizak broj krvnih pločica. Preklampsija se obično dijagnostikuje visokim nivoom proteina u urinu i visokim krvnim pritiskom. HELLP sindrom je kombinacija hemolize, povišenih enzima jetre i niskog broja pločica. Hemoliza je bolest koja uključuje pucanje crvenih krvnih zrnaca što dovodi do otpuštanja hemoglobina iz crvenih krvnih zrnaca. Povišeni enzimi jetre mogu da ukažu na stanje jetre indukovano trudnoćom. Niski nivoi dovode do smanjene sposobnosti zgrušavanja, što dovodi do opasnosti od preteranog krvarenja. HELLP je povezan sa preeklampsijom i poremećajem jetre. HELLP sindrom se obično javlja tokom kasnijih faza trudnoće ili nakon porođaja. Obično se dijagnostikuje ispitivanjem krvi koja ukazuje na prisustvo ova tri stanja koja bolest obuhvata. HELLP se obično leči indukovanim porođajem.
[0230] Ispitivanja ukazuju da se aktivacija komplementa javlja tokom HELLP sindroma i preeklampsije i da su određene komponente komplementa prisutne u povišenim nivoima tokom HELLP-a i preeklampsije. Inhibitori komplementa se mogu primeniti kao terapeutska sredstva radi sprečavanja i/ili lečenja ovih stanja. Jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu se primeniti u skladu sa postupcima sprečavanja i/ili lečenja HELLP-a i preeklampsije opisanim u Heager et al. in Obstetrics & Gynecology, 1992, 79(1):19-26 ili u International publication No. WO201/078622.
Doziranje i primena
[0231] Za upotrebu u svrhu lečenja humanih subjekata, polipeptidi mogu biti formulisani kao farmaceutske kompozicije. Zavisno od subjekta koji se leči, režim davanja, i vrsta željenog lečenja (npr., prevencija, profilaksa, ili terapija) polipeptidi su formulisani tako da su usklađeni sa ovim parametrima. Sažetak takvih tehnika je dat kod Remington-a: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams & Wilkins, (2005); i Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York.
[0232] Kompozicije ovog pronalaska su poželjno dostupne u terapeutski efektivnoj količini, koja može biti, na primer, dnevna količina od oko 0.1 mg do oko 100 mg, od oko 0.5 mg do oko 200 mg, od oko 1 mg do oko 300 mg, od oko 5 mg do oko 500 mg, od oko 10 mg do oko 750 mg, od oko 50 mg do oko 1000 mg ili najmanje 1000 mg. U nekim slučajevima farmaceutska kompozicija obuhvata kapsulu, na primer u jediničnom doznom obliku.
Jedinični dozni oblici
[0233] Polipeptidi opisani ovde mogu biti prisutni u količinama od ukupno 0.1-95% mase od ukupne mase kompozicije. Kompozicija može biti obezbeđena u doznom obliku koji je pogodan za oralno davanje. Samim tim, farmaceutska kompozicija može biti u obliku, npr., čvrstih kapsula, (npr., čvrste želatinaste kapsule ili čvrste kapsule od hidroksipropil metilceluloze), meke želatinaste kapsule, tablete, kaplete, tablete obložene enteričnim omotačem, tablete za žvakanje, čvrste želatinaste kapsule obložene enteričnim omotačem, meke želatinaste kapsule obložene enteričnim omotačem, minikapsule, lozenge, filmovi, trake, želatinaste kapsule, dražeje, emulzije, suspenzije, sirupi, ili sprejevi.
[0234] Subjektima se može davati terapeutska količina polipeptida, kao što je 0.01 mg/kg, 1.0 mg/kg, ili 15 mg/kg. Za davanje humanim subjektima, doza polipeptida ovog pronalaska je obično 0.01 do 15 mg/kg, poželjnije 3 do 5 mg/kg. Međutim, dozni nivoi mogu u velikoj meri biti zavisni od prirode stanja; efikasnosti leka; stanja pacijenta; mišljenja lekara; i učestalosti i režima davanja.
[0235] U drugim slučajevima, polipeptidi se daju u intervalima na npr., svaka 4 sati, svakih 6 sati, svakih 12 sati, svakih 18 sati, svaka 24 sati, svakih 36 sati, svaka 72 sata, svaka 84 sata, svakih 96 sati, svakih 5 dana, svakih 7 dana, svakih 10 dana, svakih 14 dana, svake 3 nedelje, ili više. Kompozicije se mogu davati jednom dnevno ili se polipeptid može davati u obliku dve, tri ili više pod-doza u odgovarajućim intervalima tokom dana ili isporuke putem formulacije sa kontrolisanim otpuštanjem. U takvom slučaju, polipeptid koji je sadržan u svakoj pod-dozi mora biti na odgovarajući način manji u cilju postizanja ukupne dnevne doze. Dozna jedinica može takođe biti jedinjenje za isporuku od nekoliko dana, npr., upotrebom konvencionalne formulacije sa produženim otpuštanjem, koja obezbeđuje produženo otpuštanje tokom perioda od nekoliko dana.
[0236] Formulacije sa produženim otpuštanjem su dobro poznate u tehnici i naročito su korisne za isporuku sredstava na odrešeno mesto, kao što je na primer upotreba sa polipeptidnim kompozicijama opisanim ovde. Efekat pojedinačne doze može biti dugotrajan, takav da se naredne doze primenjuju na najviše 3-, 4-, ili 5-dana ili na najviše 1 , 2-, 3-, ili 4- nedelje.
[0237] Polipeptid može biti primenjen putem intravenske infuzije u određenom trajanju, kao što je 5 minuta, 10 minuta, 15 minuta, 20 minuta ili 25 minuta. Davanje se može ponavljati, na primer, redovno, kao što je dva puta nedeljno (tj., svake dve nedelje) mesec dana, dva, tri, četiri meseca ili duže. Nakon početnog režima lečenja, terapije se mogu davati sa manjom učestalošću. Na primer, nakon davanja dva puta nedeljno u periodu od tri meseca, davanje se može ponoviti jednom mesečno, jednom u šest meseci ili jednom godišnje ili duže. Davanje polipeptida ili kompozicije može da smanjim snizi, poveća ili izmeni vezivanje ili bilo koji drugi fiziološki škodljiv proces, npr., u ćeliji, tkivu, krvi, urinu ili drugom delu pacijenta za najmanje 10%, a najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80% ili najmanje 90% ili više.
[0238] Pre davanja pune doze polipeptida i/ili polipeptidne kompozicije, pacijentima se može davati manj adoza, kao što je 5% pune doze, i prate se neželjeni efekti, kao što je alergijska reakcija ili reakcija na infuziju, ili za povišene nivoe lipida ili krvnog pritiska. U drugom primeru, kod pacijenta se prate neželjeni imunostimulativni efekti, kao što su povišeni nivoi citokina (npr., TNF-alfa, Il-1, Il-6, ili Il-10).
[0239] Genetska predispozicija ima važnu ulogu u razvoju nekih bolesti i poremećaja. Prema tome, pacijent kome trebaju polipeptid i/ili polipeptidna kompozicija može biti identifikovan uzimanjem porodične anamneze, ili, na primer, skriningom na jedan ili više genetskih markera ili varijanti.
Medicinski radnik, kao što je doktor, medicinska sestra, ili član porodice mogu da uzmu porodičnu anamnezu pre prepisivanja ili davanja terapeutske kompozicije.
Kompleti
[0240] Bilo koja od kompozicija opisanih ovde može biti obuhvaćena kompletom. U ne-ograničavajućem primeru, polipeptidi mogu biti uključeni u komplet za lečenje bolesti. Komplet može da uključi fiolu sterilnog, suvog polipeptidnog praška, sterilnog rastvora za rastvaranje suvog praška, i špric u setu za infuziju za davanje polipeptida.
[0241] Kada su polipeptidi obezbeđeni u obliku suvog praška, razmatra se između 10 mikrograma i 1000 mikrograma polipeptida, ili najmanje ili najviše su te količine dostupne u kompletima opisanim ovde.
[0242] Pakovanje se generalno sastoji od najmanje jedne fiole, test cevčice, suda, boce, šprica i/ili drugog kontejnera, u koji se stavljaju formulacije polipeptida, poželjno prikladno obezbeđenog. Ti kompleti takođe mogu da obuhvataju drugi kontejner koji sadrži sterilni, farmaceutski prihvatljiv pufer i/ili drugi razblaživač.
[0243] Komplet uključuje uputstva za upotrebu komponenti kompleta kao i upotrebu bilo kog drugog reagensa koji nije obuhvaćen kompletom. Uputstva mogu da obuhvate varijacije koje se mogu primenjivati.
PRIMERI
Primer 1. Priprema biotinilisanog C5
[0244] Efektivni finalni molarni odnos od 1:4 C5 i biotina se koristi za biotinilaciju velikih razmera. A 10 mM rastvor EZ-Link Sulfo-NHS-LC Biotin (Thermo Scientific, Billerica, MA) se priprema prema uputstvima proizvođača.1 miligramu 1 mg/ml C5 (komplement Tech, Tyler TX), dodaje se 2.1 µl -10mM rastvor biotina i inkubira se na ledu 2 sata. Reakcija se ugasi za 30 minuta na 4°C nakon dodavanja 100 µl 1 M Tris HCl pH 7.5. Reakcija se dijalizira preko noći protiv hladnoće PBST (slani rastvor puferovan fosfatom (PBS) 0.1% Tween 80). BIotinilasn-C5 se alikvotira i čuva na -80°C. Biotinilisani C5 je karakterisan SDS-PAGE-om u smanjenim i ne-smanjeni uslovima i karakteriše ga aktivnost ogledom hemolize crvenih krvnih zrnaca. Biotinilisani C5 se takođe proveri radi oporavka na perlama streptavidina (Invitrogen, Grand Island, NY). Hvatanje se izvodi upotrebom uslova koje preporučuje proizvođač. Da bi se uhvatilo 4 µg biotinilisanog C5 iz 100 nM rastvora, 40 µl perlaste suspenzije se koristi i inkubira se na 4°C 1 sat. Koncentracija uhvaćenog biotinilisanog C5 se izračuna pokretanjem poznate količine C5 na NuPage 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen, Grand Island, NY).
Primer 2. Humani hemolitički ogled za QC biotinilisani C5
[0245] Hemolitički ogled se izvodi sa serumima koji ne sadrže C5 i biotinilisanim C5 i ne-biotinilisanim C5 kako bi se uporedile aktivnosti lize C5 pre i posle biotinilacije. Eritrociti ovce koja je senzibilisana antitelom (Complement Technology, Tyler TX) u rastvoru na 5 x 10<8>ćelija/ml se centrifugiraju na 2,090 x gravitacija 3 minuta i ponovo se suspenduju u GVB++ pufer (Complement Technology, Tyler TX).
Humani serumi koji ne sadrže C5 (Complement Technology, Tyler TX) se brzo otope na 37°C i stave se na led do razblaženja u GVB++. Ne-biotinilisani C5 protein (Complement Technology, Tyler TX) i biotinilisani C5 protein (in-house biotinilacija) se brzo otopi na 37°C i stavi se na vlažnu ledenu suspenziju do razblaženja u GVB++.100 µl ćelija (u konačnoj koncentraciji od 2.5 x 10<7>ćelije/ml) kombinovano sa humanim serumima koji ne sadrže C5 i 50 µl biotinilisanog C5 ili ne-biotinilisanog C5 (sa konačnom koncentracijom ili od 10 µg/ml, 3 µg/ml ili 1 µg/ml) u mikrolitarskoj ploči čistog 96-baznečića tkiva lečenog kulturom (USA Scientific, Ocala, FL). Ploča se inkubira 1 sat na 37°C. Nakon inkubacije, ploče se zatim centrifugiraju na 2.090 x gravitacija 2 minuta pre nego što se 100 µl supernatanta prebaci u novu mikroploču. Absorbanca se očita na 412 nm i uporedi se procenat aktivnosti lize ne-biotinilisanog C5 i biotinilisanog C5.
Primer 3. Odabir vezujućeg C5 polipeptida
[0246] C5 inhibitori se identifikuju putem nekoliko rundi mRNK prikaza i odabira. mRNK prikaz se izvodi generalno kako je opisano (Roberts, R.W., i Szostak, J.W. (1997). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 12297-12302; WO2009067191) sa modifikacijama kako je ovde opisano. RNK bazeni, se generišu putem in vitro transkripcije iz DNK sintetizovanog sa fiksnim kodonima metionina i cisteina sa N-terminalnim krajem, iza kojih se nalaze tri pozicije mešavine fosforamidita šesnaest kodona, nakon čega se nalazi osam pozicija druge mešavine kodona koja takođe sadrži kodon. Nastala mRNK biblioteka ima fiksni početni metionin iza kog ide cisteinski ostatak, nakon čega se nalaze tri pozicije kojima nedostaje cistein, nakon čega se nalazi osam pozicija u kojima se cistein javlja sa učestalošću od 12.5%. Da bi se odabir sproveo, prva runda obogaćenja obuhvata prvu fazu u kojoj RNK bazeni koji sadrže UV unakrsno-povezane oligonukleotide sa 3' terminalnim krajem koji sadrže puromicin se translatuju in vitro sa prečišćenim komponentama translacije navedenim u Tabeli 2. Translacija se sprovodi pri dva odvojena uslova kako bi se generisale dve jedinstvene biblioteke zasnovane na varijaciji aminokiseline. Prvi uslov koristi samo 20 prirodnih aminokiselina dok drugi uslov koristi prirodne aminokiseline (0.1 mM histidina, treonina, prolina, lizina, asparagina, tirozina, glutaminske kiseline i cisteina), neprirodne aminokiseline (2 mM tertbutil-glicin (Tbg), 0.8 mM 7-azatriptofan (skraćeno sa "azaTrp" u ovom primeru) i 1 mM norvalin (Nvl), azaleucin i fenil-glicin (Phg)) i N-metil aminokiseline (450 µM mešavinu N-metilisanog serina [(N-Me)S], alanina [(N-Me)A], glicina [(N-Me)G] i 4-fluoro-N-metilfenilalanina [(N-Me-4-F)Phe]).<35>S-obeleženi ostaci cisteina su uključeni u oba uslova kako bi se omogućilo praćenje obogaćenja polipeptida po rundi.
Tabela 2. In vitro komponente translacije
[0247] tRNK se enzimatski napune sa njihovim odgovarajućima aminokiselinama pomoću tRNK sintetaza. Četiri N-metil tRNK se prethodno napune, pri čemu sve drug etTNK se enzimatski pune tokom in vitro reakcije translacije. Sintetaze tRNK se dodaju po zapreminskoj osnovi nevezano za njihove koncentracije.0.1 µl svake tRNK sintetaze (izuzev metionina tRNK syntetaze, koja se dodaje na 0.4 µl po 25 µl reakciji translacije) se dodaje za in-situ punjenje tokom translacije za 25 µl reakciju translacije. Unakrsno-povezana mRNK se dodaje u konačnoj koncentraciji od 0.75 µM. Reakcija translacije se drži na 37°C, 1 sat. Nakon translacije, fuzija translatovanih polipeptida u njihove odgovarajuće mRNK se realizuje dodavanjem visokog sadržaja soli u translacionu mešavinu i inkubira se na 37°C, 1.5 sat.
Biblioteka za odabir prirodnih polipeptida se priprema od osam pojedinačnih biblioteka sa fiksnim kodonom cisteina na pozicijama 5-11. Nasumične pozicije u ovim bibliotekama, sa svih 20 mogućih aminokiselina, se naprave kombinatorikom sa ponavljanjem jedinica NNS kodona (N predstavlja A,G,C, ili T; S predstavlja G ili C) (Devlin, J.J., et. al., (1990). Science 249, 404-406.) Translacija ovih biblioteka u prirodne polipeptide se radi upotrebom retikulocita zeca in vitro kompleta za translaciju pre nego sa gore opisanim rekonstituisanim sistemom.
[0248] Oporavak mRNK-prikazanih polipeptida se radi i sa Oligo dT i Ni-NTA affinitetom, kako bi se izolovali fuzioni molekuli koji sadrže i poliA mRNK i His tagovane polipeptide. Oligo dT polipeptidi vezani za perlu se zatim ciklišu sa dibromoksilenom kako su to drugi opisali (J. Am. Chem. Soc.127:11727 (2005)).
[0249] Zatim se izvodi direktni odabir polipeptida ciljnim afinitetom. mRNK-prikazanim polipeptidima se dopusti da se 1 sat vezuju na 4°C za biotinilisani C5 u 100 nM rastvoru biotinilisanog C5 u PBST. RNK koja odgovara afinitetu odabranih polipeptida se obrnuto transkribuje i PCR se amplifikuje kako bise dobio dvostruko razgranati DNK bazen. DNK bazen se in vitro transkribuje da bi se dobila mRNK, i proizvedena mRNK se unakrsno vezuje kao pre na svom 3' terminalnom kraju sa oligonukleotidom koji sadrži puromicin. mRNK-puromicin fuzije su podložne in vitro translaciji kako bi se generisala druga runda biblioteke, koja je sada obogaćena polipeptidima koji se vezuju za komponentu C5 komplementa. Krug odabira se ponavlja kroz šest rundi. Nakon šeste runde, DNK bazen koji predstavlja odabrane polipeptide se klonira i sekvencira, i sekvence amino kiseline kandidata C5 inhibitora se određuju na osnovu DNK sekvence. Identifikovane sekvence polipeptida su navedene u Tabeli 3.
[0250] Kako se koristi u svim sledećim tabelama kao i u listi sekvenci, skraćenice imaju sledeće značenje: "Ac" i "NH2" označavaju acetil i amidne terminalne krajeve, tim redom; "Nvl" označava norvalin; "Phg" označava fenilglicin; "Sar" označava sarkozin; "Tbg" označava tert-butilglicin; "Trt" označava tritil ili trifenilmetil; "Chg" označava cikloheksilglicin; "(N-Me)X" označava N-metilisani oblik aminokiselina naznačen jednoslovnom ili troslovnom skraćenicom za aminokiselinu koja je na mestu varijable "X" napisane kao N-metil-X [npr. (N-Me)A i (N-Me)Ala označava i N-metilisan oblik alanina ili N-metil-alanin]; 7-aza-triptofan je inkorporisana gde je "azaTrp" označen; "(4-F)Phe" označava 4-fluorofenilalanin; "Tyr(OMe)" označava O-metil tirozin, "Aib" označava amino izobutirnu kiselinu;
"(homo)F" ili "(homo)Phe" označava homofenilalanin; "(2-OMe)Phg"se dnosi na 2-O-metilfenilglicin; "PropargilGly" odnosi se na propargil-glicin; "(5-F)W" ili "(5-F)Trp" se odnosi na 5-fluorotriptofan; "D-X" se odnosi na D-steroizomer date aminokiseline "X" pri čemu aminokiselina može biti skraćena upotrebom jednoslovne ili troslovne šifre [npr. (D-Chg) označava D-cikloheksilglicin i (D-W) označava D-triptofan]; "(5-MeO)W" ili "(5-MeO)Trp" odnosi se na 5-metil-O-triptofan; "homoC" odnosi se na homocistein; "(1-Me-W)" ili "(1-Me)W" ili "(1-Me-Trp)" ili "(1-Me)Trp" odnosi se na 1-metiltriptofan; "Nle" odnosi se na norleucin; 1,2,3,4-tetrahidroizokvinolin-1-karboksilna kiselina je inkorporisana gde je "Tiq" označen; "Asp(T)" odnosi se na (S)-2-amino-3-(1H-tetrazol-5-il)propionsku kiselinu; "(3-Cl-Phe)" odnosi se na 3-hlorofenilalanin; "[(N-Me-4-F)Phe]" ili "(N-Me-4-F)Phe" odnosi se na N-metil-4-fluorofenilalanin; "Boc" predstavlja tert-butiloksikarbonil zaštitnu grupu; "[xKsilil(y, z)]" odnosi se na ksilil premošćujuću grupu između dva cisteina gde x može biti m, p ili o kako bi se označila upotreba meta-, para- ili orto- dibromoksilena (tim redom) kako bi se generisale premošćujuće grupe i numerički identifikatori, y i z, zauzimaju poziciju aminokiseline unutar polipeptida cisteina koja učestvuje u ciklizaciji; "[cyclo(y,z)]" se odnosi na formiranje veze između dva ostatka gde numerički identifikatori, y i z, zauzimaju mesto ostataka koji učestvuju u vezi; "[mXylyl-bicyclo]" znači da polipeptid obuhvata dve ciklične petlje i da se premošćujuća grupa generiše reakcijom sa meta-dibromoksilenom. Svi drugi simboli se odnose na standardne jednoslovne šifre aminokiselina. Pored toga, polipeptidi koji obuhvataju PEG2000 ili BODIPY-TMR-X tagove sekvence su označeni.
Tabela 3. Sekvence polipeptida
Primer 4. Sinteza polipeptida
[0251] Polipeptidi se sintetišu pomoću standardnih čvrsto-faznih Fmoc/tBu postupaka. Snteza se obično izvodi na Liberty automatskom mikrotalasnom sintezatoru peptida (CEM, Matthews NC) koristeći standardne protokole sa Rink amid smolom, iako se takođe mogu koristiti i drugi automatizovani sintetizatori bez mikrotalasne sposobnosti. Sve aminokiseline se dobijaju od komercijalnih izvora ukoliko nije drugačije naznačeno. Reagens koji se koristi za kuplovanje je 2-(6-hloro-1-H-benzotriazol-1il)-1,1,3,3,-tetrametilaminijum heksafluorofosfat (HCTU) a baza je diizopropiletilamin (DIEA). Polipeptidi se cepaju od smole sa 95% TFA, 2.5% TIS i 2.5% vode za 3 sata i izoluju se taloženjem sa etrom. Sirovi polipeptidi se prečiste na preparativnom HPLC reverzen faze koristeći C18 kolonu, sa acetonitrilom/vodom 0.1% TFA gradijentom od 20%-50% tokom 30 minuta. Frakcije koje sadrže čist polipeptid se sakupe i liofilizuju i svi polipeptidi se analiziraju putem LC-MS.
Primer 5. Formiranje disulfidnih ciklizovanih polipeptida
[0252] Da bi se proizvela disulfidni ciklični polipeptidi, ravan polipeptid se rastvori u mešavini vode i DMSO i dobijeni rastvor se snažno meša u vazdušnoj atmosferi 12 sati.
Primer 6. Ciklizacija polipeptida dibromoksilena
[0253] Sud od 100 mL se napuni acetonitrilom (12 mL) i vodom (24 mL) i degasira se sa argonom oko 5 min. Ravan polipeptid (0.01 mmol) i 200 mM amonijum bikarbonata (6mL) se dodaje a zatim se dodaje 0.012 mmol ili 1,3-bis(bromometil) benzen, 1,2-bis(bromometil)benzen, 1,4-bis(bromometil)benzen, 2,6-bis(bromometil)piridin ili (E)-1,4-dibromobut-2-en. Reakciona mešavina se meša pod argonom na sobnoj temperaturi otprilike 2 sata i prati se putem LC-MS. Nakon završetka reakcije, reakcioni rastvor se zamrzne i liofizira. HPLC prečišćavanje sirovog liofiziranog proizvoda je praćeno liofilizacijom frakcija koje sadrže čist polipeptid koja da je finalni ciklizovani proizvod kao što je beli prašak.
Primer 7. Ciklizacija laktamskom polipeptida
[0254] Ciklizacija polipeptida korišćenjem laktam grupe se izvodi u čvrstoj fazi. Polipeptid se prvo sintetizuje na čvrstoj podršci Wang smole standardnom Fmoc hemijom. Fmoc-ASP(allyl)-OH i Fmoc-LYS(alloc)-OH su inkorporisani u polipeptidu na naznačenim pozicijama kao dva monomera prekursora za formiranje laktamskog mosta. Nakon potpunog izduživanja smola se opere sa suvim dihlorometnaom (3x) i prečišćava se sa suvim gasom azota 10 minuta. Da bi se uklonile allyl i alloc zaštitne grupe, smola se tretira sa petostrukim molarnim viškom fenilsilana i prečišćava se azotom 10 minuta. Katalitička količina tetrakisa tetrakis Pd(0) se rastvori u suvom dihlorometanu i doda se suspenziji smole. Nakon jednog sata smola se opere po pravilno sa dihlorometanom (3x), dimetilformamidom (3x), natrijum dietilditiokarbamat trihidratom (3x), dimetilformamidom (3x) i dihlorometanom (3x). Ciklizacija laktama se postiže u dimetilformamidu (DMF) lečenjem nezaštićenog polipeptida koji sadrži smolu sa PyAOP ((3-Hidroksi-3H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinato-O)tri-1-pirolidinil-fosforus heksafluorofosfatom) i diizopropiletilaminom i ostavi se da izreaguje preko noći. Smola se opere sa DMF-om i tretira se sa svežim PyAOP i diizopropiletilaminom dodatnih 60 minuta na 45 °C. Smola se ispere i opere sa dimetilformamidom pet puta. Polipeptid se cepa i prečisti kako je opisano u primeru 4.
Primer 8. Ciklizacija polipeptida triazola
[0255] Ciklizacija polipeptida koja sadrži azid i grupu alkina se izvodi na solidnoj fazi. Polipeptid koji sadrži smolu (0.05 mmol) se tretira dihlorometanom i ostavi se da bubri 10 minuta. Rastvarač se zatim zameni na DMF (3-5 mL) i nakon 10 minuta, rastvor Cu-TBTA liganda se dodaje (125 µL 20 mM rastvora). Suspenzija se pročisti sa gasom Argona a zatim se dodaje askorbinska kiselina (5 µmola). Rastvor se promućka 2h a višak reagenasa se ukloni, smola se opere sa rastvorom EDTA u DMF kako bi se uklonio višak bakra. Polipeptid se cepa i prečisti kako je opisano u Primeru 4.
Primer 9. Polipeptidi ovog opisa
[0256] Polipeptidi ovog opisa su sintetizovani. U njih se ubrajaju jedinjenja navedena u Tabeli 4.
Table 4. Ovde opisana jedinjenja
[0257] Polipeptidi R3183 (SEQ ID NO: 184) i R3193 (SEQ ID NO: 194) se sintetišu u skladu sa sekvencom aminokiseline R3176 (SEQ ID NO: 177) sa izuzetkom zamene Nvl-NH2sa Lys. Bočni lanac amin grupe ostatka Lys se modifikuje sa različitim liofilnim grupama što dovodi do lipidovanih polipeptida.
Primer 10. Optimizacija i ispitivanje C5 inhibitora
[0258] Polipeptidi odabrani u skladu sa Primerom 3 i navedeni u Tabeli 3 su ispitani radi njihove sposobnosti da inhibiraju komplementom-posredovanu ćelijsku liziju. Pored toga, razni optimizovani polipeptidi su sintetizovani u skladu sa postupcima iz Primera 4-8 i takođe su i ispitani (videti Tabelu 4). Optimizovane sekvence polipeptida uključuju i jednu koja se dobija pravljenjem raznih skraćivanja, brisanja, dodavanja i/ili supstitucija jedinjenja R3002 (SEQ ID NO: 3), R3008 (SEQ ID NO: 9) i R3021 (SEQ ID NO: 11) ili putem formiranja hibridnih polipeptida koji obuhvataju kombinacije regiona odabranih od ova tri.
Humani hemolitički ogled (RBC eksperiment lize korišćenjem humanih seruma)
[0259] Polipeptidi navedeni u Tabeli 3, kao i njihovi optimizovani derivati (videti Tabelu 4) su procenjeni zbog aktivnosti inhibitora korišćenjem hemolitičkog ogleda crvenih krvnih zrnaca. Eritrociti ovce senzibilisane antitelom (Complement Technology, Tyler, TX) su popločane na 2.5 x
10<7>ćelijama/bunarčiću sa potpunim humanim serumima (Complement Technology, Tyler TX) i polipeptidima kako bi se odredio inhibitorni efekat polipeptida na lizi crvenih krvnih zrnaca. Ćelije se centrifugiraju 3 minuta na 2,090 x gravitacija i ponovo se suspenduju u svežem GVB++ puferu (Complement Technology, Tyler TX). Humani serumi se brzo otope na 37°C i zatim se čuvaju na ledu dok se ne razblaže u GVB++. Deset šestostrukih serijskih razblaženja polipeptida (10mM osnovni rastvor, DMSO) je izvedeno u DMSO i zatim se dodaju puferu.50 µl od svakog razblaženja polipeptida se kombinuje sa serumima i 100 µl ćelija u pojedinačnim bunarčićima bistre kulturom tretirane mikrotitracione ploče sa 96 bunarčića (USA Scientific, Ocala, FL) i ponovo suspenduje pipetiranjem. Uzorci se inkubiraju na 37°C za jedan sat. Sledeća inkubacija, ploče se centrifugiraju na 2,090 x gravitacija u trajanju od 2 minuta.100 µl supernatanta se prenese u novu ploču i absorbanca se očita na 412 nm. Podaci se uklapaju sa log-logit formulom proizvodeći krivu doza-odgovor i "IC50". Kako se ovde koristi izraz "IC50" se odnosi na polumaksimalnu inhibitornu koncentraciju, vrednost koja se koristi da bi se ukazalo na količinu potrebnih inhibitora da bi se smanjila data reakcija ili postupak za pola. Ispitana jedinjenja su navedena u Tabeli 5.
Tabela 5 Analizirana jedinjenja
Primer 11. Alternativni humani hemolitički ogled pomoću seruma koji ne sadrže C5
[0260] Polipeptidi navedeni u Tabeli 6 su ispitani zbog funkcionalne aktivnosti u hemolitičkom ogledu sa crvenim krvnim zrncima koristeći humane serume koji ne sadrže C5 i prečišćeni humani C5 pre nego sa potpunim humanim serumima. Da bi se procenila aktivnost, eritrociti ovce senzibilisane antitelom (Complement Technology, Tyler, TX) su stavljeni u ploču 2.5 x 10<7>ćelija/bunarčića sa 1.5% humanih seruma koji ne sadrže C5 (Complement Technology, Tyler, TX) i 0.5nM prečišćenog humanog C5 (Complement Technology, Tyler, TX). Eritoricti ovce senzibilisane antitelom se centrifugiraju na 2,090 x gravitacija u periodu od 3 minuta i zatim se ponovo suspenduju u svežem GVB + (Complement Technology, Tyler, TX). Humani serumi koji ne sadrže C5 i prečišćeni humani C5 se brzo otope na 37°C i zatim se čuvaju na ledu ili vlažnom ledu. Osnovni rastvor polipeptida (10mM, DMSO) se serijski razblažuje u DMSO kako bi se dobila 106-strukih razblaženja a zatim im se dodaje GVB++.50 µl svakog polipeptidnog razblaženja se kombinuje sa 25 µl seruma koji ne sadrže C5, 25 µl prečišćenog humanog C5 i 100 µl ćelija u pojedinačnim bunarčićima kulturom-tretirane, jasne, mikrotitracione ploče tkiva sa 96 bunarčića (USA Scientific, Ocala, FL) i ponovo se suspenduju pipetiranjem. Uzorci se inkubiraju na 37°C sat vremena. Po terminalnom kraju inkubacije, ploče se centrifugiraju na 2,090 x gravitacija u trajanju od 2 minuta.100 µl supernatanta se prebaci na novu ploču i absorbanca se očita na 412 nm. Podaci se usklade sa log-logit formulom proizvodeći krivu doza-odgovor i IC50.
Tabela 6. Analizirana jedinjenja
Primer 12. Enzimski imunoogled radi procene C5 inhibicije
[0261] C5 inhibitorna aktivnost se procenjuje enzimskim imunoogledom (EIA). Inhibicija proizvodnje C5a i membranski napadni kompleks (MAC) se izmere pomoću MicroVue EIA kompleta (Quidel Corporation, San Diego, CA).
[0262] Supernatant iz humanog RBC hemolitičkog ogleda R3002 (SEQ ID NO: 3) i R3008 (SEQ ID NO: 9) se razblaži sa 1:50 i proceni sa C5a EIA (FIG.1). I polipeptidi inhibiraju formiranje C5a. R3002 (SEQ ID NO: 3) ima IC505.4 nM, R3008 (SEQ ID NO: 9) ima IC5054.5 nM.
Membranski napadni kompleks (MAC) EIA
[0263] MAC EIA se izvodi sa razblaženim supernatantom (1:5) od R3008 (SEQ ID NO: 9) iz humanog RBC hemolitičkog ogleda (FIG.2). Ovaj polipeptid se pokazao da inhibira formiranje MAC sa IC50od 33 nM.
Primer 13. Karakterizacija vezivanja poliptidomimetika fluorescentnom polarizacijom
[0264] Fluorescentna polarizacija (FP) omogućava da se pojave vezivanja izmere u homogenom rastvoru (Banks, P. et al., Impact of a red-shifted dye label for high throughput fluorescence polarization assays of G protein-coupled receptors. J Biomol Screen.2000 Oct;5(5):329-34 i Parker, G.J. et al., Development of high throughput screening assays using fluorescence polarization: nuclear receptor-ligand-binding and kinase/phosphatase assays. J Biomol Screen.2000 Apr;5(2):77-88). Ključni koncept FP je da je dražeja kojom fluorofor polarizuje svetlo, obrnuto povezana sa molekularanom rotacijom (Lea, W.A. et al., Fluorescence polarization assays in small molecule screening. Expert Opin Drug
Discov.2011 Jan;6(1):17-32), fluorofor vezan za dosta veći ciljni protein se rotira sporije od nevezanog fluorofora, što dovodi do povećanja polarizacije koja može biti kvantifikovana. FP se koristi sve više u kampanjama visokog propusta podataka kao postupak za merenje ligand-ciljanog vezivanja (Parker, G.J. et al., Development of high throughput screening assays using fluorescence polarization: nuclear receptor-ligand-binding and kinase/phosphatase assays. J Biomol Screen.2000 Apr;5(2):77-88), za određivanje konstante ravnoteže disocijacije (KD) (Prystay, L. et al., Determination of equilibrium dissociation constants in fluorescence polarization. J Biomol Screen.2001 Jun;6(3):141-50), and lead discovery through competitive binding assays (Tian, W. et al., Development of novel fluorescence polarization-based assay for studying the β-catenin/Tcf4 interaction. J Biomol Screen.2012 Apr;17(4):530-4).
[0265] FP se koristi za skrining konkurentnih polipeptida inhibitora C5 proteina. SondaR3076 (SEQ ID NO: 40) se generiše inkubiranjem polipeptida roditelja, R3072 (SEQ ID NO: 20) sa BODIPY-TMR-X, SE (Life Technologies, Grand Island, NY) u DMF (Sigma, Saint Louis, MO) u trajanju od 4 sata. BODIPY-TMR boja je pričvršćena za lizin C-terminalnog kraja proteina i naknadno obeležena sonda se prečisti HPLC-om.
[0266] Konstanta ravnoteže disocijacije (KD) za vezivanje R3076 (SEQ ID NO: 40) za humani C5 protein (Complement Technology, Tyler, TX) se određuje inkubiranjem rastvora 25 nM R3076 (SEQ ID NO: 40) sa rastućim koncentracijama C5 proteina. Polarizacija se izmeri tokom vremena, dok vezivanje ne dostigne ravnotežu. KDse određuje korišćenjem Graphpad Prism (korišćenjem "Kriva zasićenog vezivanja, jedno mesto – specifično vezivanje sa Hilovim nagibom krive" kao uklapanje krive KD). Ravnoteža se postiže nakon 10 minuta, sa vrednostima za KD, hilov nagib krive i maksimalnim vezivanjem koje ostaje stabilno tokom perioda od 60 minuta. Konačna KDvrednost od 8.07 nM (0.53 standardna devijacija) se određuje prosekom KDvrednosti od 10 do 60 minuta. Na osnovu ovih informacija, 25 nM i 50 nM koncentracije za R3076 (SEQ ID NO: 40) i C5 protein, se biraju za upotrebu u ogledu konkurencije. Ove koncentracije predstavljaju približan nivo proteina neophodnog za 95% vezivanje sonde za C5 protein. R3023 (SEQ ID NO: 104) je ispremetana varijanta polipeptida R3002 (SEQ ID NO: 3) i uključena je u sve oglede kao negativna kontrola.
[0267] Humani C5 protein se razblaži do 200 nM u ogledu pufera, koji je sastavljen od TBS (EMD Millipore, Billerica, MA) 0.005% Triton-X (Sigma, Saint Louis, MO).10 µl pufera ogleda se dodaje u bunarčiće crne, ne-vezujuće, ogledne ploče sa 384-bunarčića (Greiner, Monroe, NC) i 10 µl razblaženog osnovnog rastvora C5 proteina se dodaje eksperimentalnim i označenim kontrolnim bunarčiće.
[0268] Sonda R3076 (SEQ ID NO: 40) se razblaži 1 do 10 u DMSO (Life Technologies, Grand Island, NY) i 30 µl tog osnovnog rastvora se razblaži sa 3 ml oglednog pufera da bi se dobilo 100 nM osnovnog rastvora.10 µl ovog radnog osnovnog rastvora se zatim dodaje u svaki bunarčić ogledne ploče. Ogledna ploča se inkubira na sobnoj temperaturi, zaštićena od svetlosti, 20 minuta kako bi se vezivanje ostavilo da dostigne ravnotežu.
[0269] Ispitivani predmeti navedeni u Tabeli 7 se naknadno razblaže u DMSO zatim u oglednom puferu, koji obuhvata 10 dvostrukih razblaženja i zatim se brzo dodaju oglednoj ploči u tri primerka. Ogledna ploča se zatim inkubira u Paradigm (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) čitaču ploče 60 minuta na 25°C.
[0270] Nakon inkubacije od 60 minuta, ploča se očita pomoću Paradigm FP protokola (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) i vrednosti sirove polarizacije se uvezu u Graphpad Prism. Ki(upotrebom jednog mesta Kimodela uklapanja krive, koncentracija sonde = 25 nM, KD= 8.07 nM, sa osnovnom linijom koja se ograničava na prosek od 0% vezujuće kontrole) i IC50(log inhbitor nasuprot odgovora, 4 parametar uklapanja krive) se odrede u Graphpad-u.
Rezultati
[0271] Svi ispitivani predmeti su sposobni da uđu u kompetenciju sa obeleženom sondom za vezivanje za humani C5 protein (FIG.3, Tabela 7). R3003 (SEQ ID NO: 4) je najpotentniji ispitivani polipeptid, sa vrednošću KZod 9.54 nM. R3023 (SEQ ID NO: 104) vezivanje nije detektovano kod najvećih ispitivanih koncentracija.
Tabela 7. Kompetetivni podaci fluorescentne polarizacije
[0272] Podaci prikazani u Tabeli 7 se dobijaju iz analize uklapanja krive koja je izvedena pomoću Graphpad Prism softvera kako je gore opisano. Izvede se prosek vrednosti tri primerka da bi se dobile tačke podataka predstavljene u svakom eksperimentu. Od ispitanih polipeptida, R3003 (SEQ ID NO: 4) je identifikovan originalno odabirom mRNK prikaza. Afinitet R3003 (SEQ ID NO: 4) za C5 se verifikuje regulisanjem FP analize koja pokazuje niske Kikao i IC50vrednosti. Inhibitori R3011 (SEQ ID NO: 31) i R3050 (SEQ ID NO: 23) takođe su prikazali relativno jak afinitet za C5. Kontrolni polipeptid, R3023 (SEQ ID NO: 104), nije prikazao afinitet za C5, dok su inhibitori R3014 (SEQ ID NO: 55) i R3043 (SEQ ID N0:50) prikazali slab afinitet.
Primer 14. Analiza stabilnosti jedinjenja u plazmi
[0273] Jedinjenja su ispitana radi stabilnosti u humanoj plazmi pod sledećim uslovima. Humana plazma se dobija iz Bioreclamation-a (Westbury, NY) i sakuplja se u natrijum heparinu. pH plazme se podesi na pH 7.4. DMSO osnovni rastvori pri koncentracijama od 10 mM se pripreme za ispitivana jedinjenja. Alikvoti DMSO rastvora se doziraju u 1 mL plazme, koja je prethodno zagrejana do 37°C, pri konačnoj koncentraciji ispitivanog jedinjenja od 10 µM. Fiole se čuvaju u stonom THERMOMIXER® (Eppendorf, Hauppauge, NY) za vreme trajanja eksperimenta. Alikvoti (100 µL) se uzimaju u svakom vremenskom intervali i dodaju se ploči sa 96 bunarčića koja je prethodno napunjena sa 300 µL rastvora acetonitrila koji sadrži mešavinu internih standarda (metoprolola, propranolola i varfarin, svaki na 500 ng/mL). Uzorci se čuvaju na 4°C do kraja eksperimenta. Nakon što je poslednji vremenski period uzorkovan, ploča se meša a zatim centrifugira na 3,000 rpm u trajanju od 10 minuta. Alikvoti supernatanta se uklone i analiziraju LC-HRAMS-om. Podešavanja tečne hromatografije su navedena u Tabeli 8 a podešavanja masene spektrometrije su navedena u Tabeli 9.
Tabela 8. Podešavanja tečne hromatografije
Tabela 9. Podešavanja masene spektrometrije
[0274] Koncentracija ispitivanog jedinjenja R3050 (SEQ ID NO: 23) se određuje poređenjem sa prethodno određenom kalibracionom krivom (Tabela 10).
Tabela 10. Profil stabilnosti
[0275] U ovim uslovima, R3050 (SEQ ID NO: 23) se poakzao kao veoma stabilan.
Primer 15. Varijante polipeptida koje obuhvataju analoge triptofana
[0276] U nekim slučajevima, polipeptidi ovog pronalaska obuhvataju 7-azatriptofan. Da bi se odredio značaj ovog ostatka u inhibiciji C5, analiza supstitucije aminokiseline se sprovodi pri čemu se 7-azatriptofan zameni sa prirodnim triptofanom kao raznim drugim analozima triptofana uključujući 5-fluorotriptofan [(5-F)W], 1-metil-triptofan [(1-Me)W], D-triptofan i 5-metil-O-triptofan [(5-MeO)W]. Slični polipeptidid sa supstitucijama ne-triptofana se takođe analiziraju.
[0277] Varijante polipeptida R3002 (SEQ ID NO: 3) i R3008 (SEQ ID NO: 9) se sintetišu i ispituju radi njihove sposobnosti da inhibiraju lizu crvenih krvnih zrnaca kako je opisano u Primeru 10 (videti Tabele 11 i 12). Od ispitanih varijanti, sve sa supstitucijom ostatka 7-azatriptofana su pokazale smanjenu sposobnost da inhibiraju lizu crvenih krvnih zrnaca kako je naznačeno povećanjem prosečnih ICso vrednosti (mera polumaksimalne inhibitorne koncentracije, vrednost koja se koristi za ukazivanje količine inhibitora koja je potrebna da se smanji data reakcija ili postupak za pola).
Tabela 11.7-azatriptofan varijanta polipeptida R3002 (SEQ ID NO: 3) analizirana humanim hemolitičkim ogledom
Table 12.7-azatriptofan varijanta polipeptida R3008 (SEQ ID NO: 9) analizirana humanim hemolitičkim ogledom
Primer 16. Efekat skraćivanja polipeptida i brisanja aminokiselile analiziranjem humanog hemolitičkog ogleda
[0278] Varijante polipeptida skraćene na C-terminalnom kraju R3021 (SEQ ID NO: 11) su sintetizovane i procenjene hemolitičkim ogledom opisanim u Primeru 10 radi njihove sposobnosti da inhibiraju lizu C5-zavisnih crvenih krvnih zrnaca. Prosečne IC50vrednosti (mera polumaksimalne inhibitorne koncentracije, vrednost koja se koristi da se ukaže na količinu inhibitora koja je potrebna da se smanji data reakcija ili postupak za pola) za svaki ispitani polipeptid su navedene u Tabeli 13. Skraćeni polipeptidi pokazuju smanjenu sposobnost (kako je pokazano povećanjem IC50vrednosti) da inhibiraju lizu crvenih krvnih zrnaca sa onim varijantama kojima nedostaje triptofan koji ima najveće IC50vrednosti.
[0279] Dodatno, varijante polipeptida R3021 (SEQ ID NO: 11) sa internim brisanjima aminokiselina se sintetišu i procenjuju (videti Tabelu 14) radi sposobnosti da inhibiraju lizu C5-zavisnih crvenih krvnih zrnaca u skladu sa postupkom opisanim u Primeru 10. Dodatno, metionin sa N-terminalnim krajem u ovim varijantama se menja acetil grupom. Prosečne IC50vrednosti za svaki ispitani polipeptid su navedene u Tablei 14. Zanimljivo, zamena samog metinonina sa N-terminalnim krajem acetil grupom [R3048 (SEQ ID NO: 19)] povećava sposobnost polipeptida da inhibira lizu crvenih krvnih zrnaca.
Uklanjanje internog ostatka D [R3124 (SEQ ID NO: 130)] ili internih ostataka DVY [R3125 (SEQ ID NO: 131), koji odgovaraju ostacima 8, 9 i 10 iz R3021 (SEQ ID NO: 11)] dovodi do smanjenja sposobnosti polipeptida da inhibira lizu crvenih krvnih zrnaca.
Tabela 13. Varijante polipeptida skraćenih na C-terminalnom kraju R3021 (SEQ ID NO: 11) analizirane humanim hemolitičkim ogledom
Tabela 14. Varijante polipeptida R3021 (SEQ ID NO: 11) sa internim brisanjima aminokiselina analizirani humanim hemolitičkim ogledom
Primer 17. Inkorporacija albumin-vezujućih polipeptida
[0280] Polipeptidi se konjuguju u jedan ili više polipeptida koji podešavaju vezivanje proteina plazme. Ovi polipeptidi, koji su u daljem tekstu označeni kao "albumin-vezujući polipeptidi" su navedeni u Tabeli 15.
Tabela 15. Albumin-vezujući polipeptidi
[0281] Albumin-vezujući polipeptidi se ciklišu stvaranjem disulfidne veze na ostacima cisteina. U nekim slučajevima, albumin-vezujući polipeptidi se konjuguju ili njihovim N ili C-terminalnim krajevima, i samim tim imaju blago različite strukture (npr. bez acetil grupe).
Primer 18. Inkorporacija polipeptida koji prodiru u ćelije
[0282] Polipeptidi se konjuguju u polippetid koji ima svojstva prodiranja u ćelije. Ovi polipeptidi su navedeni u Tabeli 16 i opisani su u Milletti, F., polipeptidi koji prodiru u ćelije: klase, poreklo, i trenutno stanje. Drug Discov Today.2012 Aug;17(15-16):850-60.
Tabela 16. Polipeptidi koji prodiru u ćelije
Primer 19. Analiza mešavina polipeptida koje obuhvataju stereoizomere aminokiselina
[0283] Polipeptidi R3136 (SEQ ID NO: 137) i R3137 (SEQ ID NO: 138) su sintetizovani u skladu sa sekvencom aminokiseline R3085 (SEQ ID NO: 90) i R3082 (SEQ ID NO: 116), sa izuzetkom zamene Phg u svakom D-Phg (videti Tabelu 17). Kompozicije koje obuhvataju ili R3136 (SEQ ID NO: 137) i R3085 (SEQ ID NO: 90) ili R3137 (SEQ ID NO: 138) i R3082 (SEQ ID NO: 116) se analiziraju radi njihove sposobnosti da inhibiraju lizu crvenih krvnih zrnaca u skladu sa humanim hemolitičkim ogledom opisanim u Primeru 10. Kompozicija koja obuhvata R3136 (SEQ ID NO: 137) i R3085 (SEQ ID NO: 90) obezbeđuje prosečnu IC50(nM) od >50,000, dok kompozicija koja obuhvata R3137 (SEQ ID NO: 138) i R3082 (SEQ ID NO: 116) obezbeđuje prosečnu IC50(nM) od >100,000.
Tabela 17. Jedinjenja koja se koriste u mešavinama steroizomera polipeptida aminokiseline
Primer 20. Farmakokinetička ispitivanja kod ne-humanih primata
[0284] Farmakokinetička ispitivanja se sprovode kod ne-humanih primata pomoću jedinjenja navedenih u Tabeli 18. U tabeli, "Cmpd" se odnosi na jedinjenje a "Avg" se odnosi na prosečnu vrednost.
Tabela 18. Jedinjenja ispitana u in vivo ispitivanjima
[0285] Koncentracija polipeptida R3152 (SEQ ID NO: 153) u plazmi se određuje kod makaki majmuna nakon intravenozne (IV) doze. Tri mužjaka su primila 3 mg/kg polipeptida i koncentracije polipeptida u plazmi se odrede koristeći LC/MS-MS sledeći talog acetonitrila i ekstrakciju na Sirocco ploču za taloženje proteina (Waters Corporation, Milford, MA.) Farmakokinetički parametri (PK) se izračunaju od vremena kursa (videti FIG.4) kombinovanih koncentracija R3152 (SEQ ID NO: 153,) u plazmi određenih odmah nakon doze do 48 h nakon doze. Nivoi leka u plazmi brzo padaju tokom inicijalne faze distribucije (<1 sata) i zatim se poravnaju i mogu se detektovati do 48 sati. R3152 (SEQ ID NO: 153) imaju srednji poluživot završetka od 10.9 ± 0.8 sati. Srednja stopa klirensa je 0.129 ± 0.0122 L/h/kg što je približno 5% protoka krvi u jetri tipičnog majmuna (2.6 L/h/kg). Srednja zapremina distribucije je 1.49 ± 0.152 L/kg što je približno duplo od ukupne vode u telu za tipičnog majmuna (0.7 L/kg). Prosečna AUC∞ iznosi 23319 ± 2120 h*ng/mL.
[0286] R3152 (SEQ ID NO: 153) se sa velikim afinitetom vezuje za protein C5 primata i blokira putanju komplementa sprečavanjem generisanja C5a i C5b proizvoda i proizvodnje multimerijskog membranskog napadnog kompleksa (MAC). Inhibicija komplementom-posredovanog formiranja MAC-a u uzorcima plazme iz gore pomenutog PK ispitivanja se ispituje upotrebom ustanovljenog ex vivo ogleda (videti humani hemolitički ogled opisan u Primeru 10), u kom je plazma razblažena sa je 1:100 i inkubirana sa aktiviranim crvenim krvnim zrncima ovce (Complement Technology, Tyler, TX). U svakoj vremenskoj tački, hemolitička aktivnost se određuje kao pokazatelj aktivnog komplementa iz seruma (videti FIG.4). U plazmi koja sadrži >200 ng/mL R3152 (SEQ ID NO: 153) postoji jasna inhibicija komplementom-posredovane hemolize, koja ukazuje na blokadu formiranja MAC-a. Egzogeni R3152 (SEQ ID NO: 153) koji se dodaje plazmi normalnih makaki majmuna ima IC50= 2-20 ng/mL. Hemolitička aktivnost se vraća na normalne nivoe 47 sati nakon doziranja kako nivoi plazme R3152 (SEQ ID NO: 153) padaju ispod 100 ng/ml.
Primer 21. Farmakokinetička ispitivanja kod pacova
[0287] R3152 (SEQ ID NO: 153) se isporučuje kao intravenozna (IV) ili subkutana (SC) doza mužjacima pacova u dozama od 2 i 30 mg/kg, (FIG.5) Sledeći IV doziranje, R3152 (SEQ ID NO: 153) se prati upotrebom LC/MS-MS sledeći talog acetonitrila i ekstrakciju na ploču Sirocco Protein Precipitation. (Waters Corporation, Milford, MA) kako je gore opisano. Farmakokinetički (PK) parametri se izračunavaju iz vremena kursa kombinovanih koncentracija u plazmi (videti FIG.5) R3152 (SEQ ID NO: 153) i njegovog ekvipotentnog C-terminalnog deaminovanog metabolita, R3201 (SEQ ID NO: 211).
[0288] R3152 (SEQ ID NO: 153)/ R3201 (SEQ ID NO: 211) ispoljava brzu fazu distribucije, nakon čega sledi spora eliminacija sa t1⁄2 = 5.3 sati. Slična stopa eliminacije se primećuje nakon SC doziranja 30 mg/kg, sa približno 65% bioraspoloživosti doze, bazirane na AUC. Tmax4 sata i produžena izloženost leka koja se vidi kod SC doza omogućava produženo pokrivanje terapeutske koncentracije u plazmi. Budući da se R3152 (SEQ ID NO: 153) i R3201 (SEQ ID NO: 211) ne vezuju za pacove C5, veoma mala inhibitorna aktivnost se primećuje kod ex vivo hemolitičkih ogleda.
[0289] Lipidovana i ne-lipidovana jedinjenja R3183 (SEQ ID NO: 184) i R3176 (SEQ ID NO: 177), se procenjuju radi farmakokinetičkih osobina kod mužjaka Sprague-Dawley pacova sledeći intravensko ili subkutano davanje. FIG.6 prikazuje rezultate. Preostali panel FIG.6 prikazuje mužjake Male Sprague-Dawley pacova (n=3) kojima je intravensko ubrizgana šojedinačna doza od 2 mg/kg. Uzorci krvi sakupljeni su u indikovanim vremenskim tačkama, obrađeni u plazmi, i analizirani za indikovano jedinjenje putem LC-MS. Crni kružići: R3176 (SEQ ID NO: 177) (ne-lipidovano jedinjenje); Otvoreni kružići: R3183 (SEQ ID NO: 184) (C16 lipidovano jedinjenje). Desni panel FIG.6 prikazuje mužjake Sprague-Dawley pacova (n=3) kojima je subkutano ubrizgana pojedinačna doza od 15 mg/kg. Uzorci krvi sakupljeni su u indikovanim vremenskim tačkama, obrađeni u plazmu, i analizirani za indikovano jedinjenje putem LC-MS. Crni kružići: R3176 (SEQ ID NO: 177) (ne-lipidovano jedinjenje); Otvoreni kružići: R3183 (SEQ ID NO: 184) (C16 lipidovano jedinjenje). Lipidacija je dovela do povećanja izloženosti kako je procenjeno određivanjem oblasti ispod krive (AUC) 2.1-strukim intravenoznim putem i 2.7-struko subkutanim putem.
Primer 22. Inhibicija hemolize u trombinom-indukovanoj putanji komplementa
[0290] Trombin može da indukuje aktivnost komplementa cepanjem C5 u C5Tkoji se kasnije cepa u C5a i C5bT. C5bT, kao C5b, se združuje sa C6 i ostatkom terminalnih komponenti putanje komplementa, C7, C8 i C9, što dovodi do formiranja membranskog napadnog kompleksa (MAC) koji izaziva lizu crvenih krvnih zrnaca (Krisinger, et al., (2014). Blood.120(8):1717-1725). Na taj način, R3183 i anti-C5 monoklonalno antitelo slično ECULIZUMAB® se ispituju radi njihove sposobnosti da inhibiraju hemolizu putem trombinom-indukovane putanje komplementa.
[0291] Kako bi se procenila aktivnost inhibitora, C5 (Complement Technology, Tyler, TX) se dodaje kako bi se postigla koncentracija od 400 nM, i uzorak se inkubira sa C6 pri finalnoj koncentraciji od 600 nM (Complement Technology, Tyler, TX) a trombin pri koncentraciji od 50 nM (Enzyme Research Laborites, South Bend, IN) na 37°C u trajanju od 30 minuta, u prisustvu ili R3183 ili anti-C5 monoklonalnog antitela slično ECULIZUMAB®, ili bez inhibitora. Reakcija se zaustavlja dodaavanjem hirudina 150 nM (Cell Sciences, Canton, MA) u puferu GVB+EDTA (Complement Technology, Tyler, TX) i inkubira se 5 minuta na sobnoj temperaturi. Ovi razblaženi uzorci se mešaju sa eritorcitima ovce koja je senzibilisana antitelom (Complement Technology, Tyler, TX) u mikrotitracionoj ploči sa 96 bunarčića (USA Scientific, Ocala, FL) i inkubira se na 37°C u trajanju od 5 minuta. C7 (Complement Technology, Tyler, TX) se zatim dodaje u bunarčiće kako bi se postigla koncentracija od 15 nM i ploča se vrati na 37°C u trajanju od 15 minuta. Kompleks od C8 (10 nM; Complement Technology, Tyler, TX) i C9 (25 nM; Complement Technology, Tyler, TX) se zatim dodaje oglednoj mešavini i uzorci se inkubiraju na 37°C u trajanju od 30 minuta. Nakon inkubacije, ploča se centrifugira na 1000 x g i 100 µL supernatanta se prenese u novu mikrotitracionu ploču i absorbanca se očitava na 412 nm. Dobijeni podaci su prikazani na FIG.7.
Zaključeno je da R3183 inhibira hemolizu trombin-indukovanom putanjom komplementa pri koncentraciji većoj od 6 ng/mL, dok za anti-C5 monoklonalno antitelo to nije zaključeno.

Claims (12)

Patentni zahtevi
1. Polipeptid, pri čemu je taj polipeptid odabran od: SEQ ID NO: 177, 184, i 191-195.
2. Polipeptid prema zahtevu 1, pri čemu je pomenuti polipeptid odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO 177, 184, i 194.
3. Polipeptid prema zahtevu 1, pri čemu je pomenuti polipeptid SEQ ID NO: 177.
4. Polipeptid prema zahtevu 1, pri čemu je pomenuti polipeptid SEQ ID NO: 184.
5. Polipeptid prema zahtevu 1, pri čemu je pomenuti polipeptid SEQ ID NO: 194.
6. Kompozicija koja obuhvata polipeptid prema bilo kom od zahteva 1-5 i prihvatljiv nosač ili ekscipijens.
7. Kompozicija prema zahtevu 6 koja obuhvata ekscipijens, pri čemu pomenuti ekscipijens obuhvata farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.
8. Kompozicija prema zahtevu 7 za upotrebu u terapeutskom postupku za inhibiranje C5 cepanja u ćelijskom sistemu, pri čemu pomenuti postupak obuhvata dovođenje u kontakt pomenutog ćelijskog sistema sa ovom kompozicijom.
9. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 8, pri čemu pomenuti polipeptid inhibira cepanje C5 sa IC50 manjom od 50 nM.
10. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 8, pri čemu je pomenuti ćelijski sistem humani subjekt.
11. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 10, pri čemu pomenuti humani subjekt obuhvata bolest, poremećaj i/ili stanje povezano sa komplementom.
12. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 11, pri čemu je pomenuta bolest, poremećaj i/ili stanje povezano sa komplementom odabrana iz grupe koju čine zapaljenska indikacija, rana, povreda, autoimuna bolest, vaskularna indikacija, neurološka indikacija, indikacija povezana sa bubrezima, očna bolest, paroksizmalna noćna hemoglobinurija i atipični hemolitičko uremički sindrom.
RSP20191263 2014-06-12 2015-06-12 Modulacija aktivnosti komplementa RS59353B1 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462011368P 2014-06-12 2014-06-12
US201462077460P 2014-11-10 2014-11-10
US201562108772P 2015-01-28 2015-01-28
PCT/US2015/035473 WO2015191951A2 (en) 2014-06-12 2015-06-12 Modulation of complement activity
EP15807069.8A EP3154561B1 (en) 2014-06-12 2015-06-12 Modulation of complement activity

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59353B1 true RS59353B1 (sr) 2019-10-31

Family

ID=54834568

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211214A RS62428B1 (sr) 2014-06-12 2015-06-12 Modulacija aktivnosti komplementa
RSP20191263 RS59353B1 (sr) 2014-06-12 2015-06-12 Modulacija aktivnosti komplementa

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211214A RS62428B1 (sr) 2014-06-12 2015-06-12 Modulacija aktivnosti komplementa

Country Status (31)

Country Link
US (7) US10106579B2 (sr)
EP (4) EP3973994A1 (sr)
JP (4) JP6432954B2 (sr)
KR (3) KR102346228B1 (sr)
CN (3) CN111187338B (sr)
AP (1) AP2016009612A0 (sr)
AU (3) AU2015274482B2 (sr)
BR (3) BR112016029076B1 (sr)
CA (3) CA3174909A1 (sr)
CY (3) CY1122227T1 (sr)
DK (2) DK3154561T3 (sr)
ES (2) ES2895029T3 (sr)
FI (1) FIC20240015I1 (sr)
FR (1) FR24C1022I2 (sr)
HR (2) HRP20191763T1 (sr)
HU (3) HUE055931T2 (sr)
IL (3) IL249093B (sr)
LT (3) LT3154561T (sr)
MX (2) MX2016016449A (sr)
NL (1) NL301275I2 (sr)
NO (1) NO2024023I1 (sr)
NZ (1) NZ727420A (sr)
PL (2) PL3154561T3 (sr)
PT (2) PT3628680T (sr)
RS (2) RS62428B1 (sr)
RU (1) RU2670988C2 (sr)
SG (1) SG11201610222UA (sr)
SI (2) SI3154561T1 (sr)
SM (2) SMT202100588T1 (sr)
WO (1) WO2015191951A2 (sr)
ZA (3) ZA201706379B (sr)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3973994A1 (en) 2014-06-12 2022-03-30 RA Pharmaceuticals, Inc. Modulation of complement activity
US9937222B2 (en) 2015-01-28 2018-04-10 Ra Pharmaceuticals, Inc. Modulators of complement activity
RU2733720C2 (ru) 2015-12-16 2020-10-06 Ра Фармасьютикалз, Инк. Модуляторы активности комплемента
WO2017189837A1 (en) * 2016-04-29 2017-11-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Protein kinase rna-like endoplasmic reticulum kinase (perk) inhibitors for prevention and/or treatment of lung injury and/or inflammation
KR20190093196A (ko) 2016-12-07 2019-08-08 라 파마슈티컬스 인코포레이티드 보체 활성의 조절인자
WO2019246405A1 (en) 2018-06-21 2019-12-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Cyclic polypeptides for pcsk9 inhibition
IL279363B2 (en) 2018-06-21 2025-12-01 Merck Sharp & Dohme Pcsk9 antagonist compounds
EP3810177B1 (en) * 2018-06-21 2024-12-04 Ra Pharmaceuticals, Inc. Cyclic polypeptides for pcsk9 inhibition
WO2019246386A1 (en) 2018-06-21 2019-12-26 Ra Pharmaceuticals Inc. Cyclic polypeptides for pcsk9 inhibition
EP3870221A1 (en) 2018-10-22 2021-09-01 RA Pharmaceuticals, Inc. Neurological disease treatment with zilucoplan
TW202100179A (zh) 2019-03-08 2021-01-01 美商Ｒａ製藥公司 補體活性之調節劑
SG11202109837SA (en) * 2019-04-24 2021-10-28 Ra Pharmaceuticals Inc Compositions and methods for modulating complement activity
JP2022535411A (ja) 2019-06-04 2022-08-08 ラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 補体阻害剤による炎症性疾患治療
CA3150594A1 (en) 2019-09-12 2021-03-18 Ra Pharmaceuticals, Inc. Neurological disease treatment with complement inhibitors
EP4076492A4 (en) 2019-12-20 2024-01-17 Merck Sharp & Dohme LLC PCSK9 ANTAGONIST COMPOUNDS
BR112022010742A2 (pt) 2019-12-26 2022-08-16 Eisai R&D Man Co Ltd Composição farmacêutica contendo ácido ribonucleico de fita dupla que inibe a expressão de c5 complementar
US11932705B2 (en) 2020-12-18 2024-03-19 Merck Sharp & Dohme Llc Cyclic polypeptides for PCSK9 inhibition
CA3204051A1 (en) 2021-01-20 2022-07-28 Brian Lian Compositions and methods for the treatment of metabolic and liver disorders
WO2022177635A2 (en) * 2021-02-22 2022-08-25 Ra Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for microbial disease treatment
JP7642830B2 (ja) 2021-09-15 2025-03-10 バイキング・セラピューティクス・インコーポレイテッド 代謝及び肝臓障害の処置のための組成物及び方法
WO2023215294A1 (en) * 2022-05-02 2023-11-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Complement pathway inhibition for wound healing
WO2024039636A1 (en) * 2022-08-16 2024-02-22 Ps Therapy, Inc. Methods of use for disulfiram and metabolites thereof
EP4687881A2 (en) * 2023-03-31 2026-02-11 Flexsys IP Holdings, LLC Heteroaryl antidegradants

Family Cites Families (116)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4271068A (en) 1968-05-10 1981-06-02 Ciba-Geigy Corporation Process for the manufacture of cystine-containing peptides
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4033940A (en) 1975-11-12 1977-07-05 Armour Pharmaceutical Company Cyclization of peptides
US4216141A (en) 1978-07-19 1980-08-05 The Salk Institute For Biological Studies Method for cyclization of peptides
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
NZ199722A (en) 1981-02-25 1985-12-13 Genentech Inc Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US6309669B1 (en) * 1984-03-16 2001-10-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Therapeutic treatment and prevention of infections with a bioactive materials encapsulated within a biodegradable-biocompatible polymeric matrix
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US5371109A (en) 1986-07-01 1994-12-06 Drilletten Ab Controlled release composition for a biologically active material dissolved or dispersed in an L2-phase
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
FR2641081A1 (sr) * 1988-12-23 1990-06-29 Medgenix Group
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
AU638762B2 (en) 1989-10-05 1993-07-08 Optein Inc Cell-free synthesis and isolation of novel genes and polypeptides
US5585353A (en) 1990-02-02 1996-12-17 The Rockefeller University Antibiotic peptides containing D-amino acids
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5766897A (en) 1990-06-21 1998-06-16 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Cysteine-pegylated proteins
US5843701A (en) 1990-08-02 1998-12-01 Nexstar Pharmaceticals, Inc. Systematic polypeptide evolution by reverse translation
US5270170A (en) 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
ATE207080T1 (de) 1991-11-25 2001-11-15 Enzon Inc Multivalente antigen-bindende proteine
AU684510B2 (en) 1993-05-28 1997-12-18 Chiron Corporation Method for selection of biologically active peptide sequences
PT710243E (pt) 1993-06-29 2000-11-30 Ferring Bv Sintese melhorada de peptidos ciclicos.
US6074642A (en) 1994-05-02 2000-06-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Use of antibodies specific to human complement component C5 for the treatment of glomerulonephritis
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US6037453A (en) * 1995-03-15 2000-03-14 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants
US5834318A (en) 1995-05-10 1998-11-10 Bayer Corporation Screening of combinatorial peptide libraries for selection of peptide ligand useful in affinity purification of target proteins
US5912014A (en) 1996-03-15 1999-06-15 Unigene Laboratories, Inc. Oral salmon calcitonin pharmaceutical products
US6720472B2 (en) 1996-07-12 2004-04-13 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey HMGI proteins in cancer and obesity
US6268343B1 (en) 1996-08-30 2001-07-31 Novo Nordisk A/S Derivatives of GLP-1 analogs
US6348584B1 (en) 1996-10-17 2002-02-19 John Edward Hodgson Fibronectin binding protein compounds
DE69730157T2 (de) 1996-10-17 2005-07-28 Mitsubishi Chemical Corp. Molekül, welches genotyp und phänotyp zusammenführt und dessen anwendungen
US5922680A (en) 1996-10-23 1999-07-13 Ferring, B.V. Stabilized composition for oral administration of peptides
US6261804B1 (en) 1997-01-21 2001-07-17 The General Hospital Corporation Selection of proteins using RNA-protein fusions
ATE332368T1 (de) 1997-01-21 2006-07-15 Gen Hospital Corp Selektion von proteinen mittels rns-protein fusionen
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
EP1958962A3 (en) 1997-06-12 2013-05-01 Novartis International Pharmaceutical Ltd. Artificial antibody polypeptides
EP0896001A1 (en) 1997-08-08 1999-02-10 Daicel Chemical Industries, Ltd. Method for preparing oxytocin antagoniste derivatives, intermediates for the preparation of oxytocin antagonist derivatives and method for preparing the intermediates
US6429301B1 (en) 1998-04-17 2002-08-06 Whitehead Institute For Biomedical Research Use of a ribozyme to join nucleic acids and peptides
IL140930A0 (en) 1998-08-07 2002-02-10 Emisphere Tech Inc Compounds and compositions for delivering active agents
WO2000018895A1 (en) * 1998-09-25 2000-04-06 The Children's Medical Center Corporation Short peptides which selectively modulate the activity of protein kinases
AU1705100A (en) 1998-10-09 2000-05-01 Musc Foundation For Research Development Blocking factor b to treat complement-mediated immune disease
US6962781B1 (en) 2000-05-19 2005-11-08 Proteonova, Inc. In vitro evolution of nucleic acids and encoded polypeptide
US7244701B2 (en) 2000-06-16 2007-07-17 Zealand Phama A/S Diuretic peptide conjugate
AU2003228269A1 (en) * 2002-03-01 2003-09-16 Mds Proteomics Inc. Phosphorylated proteins and uses related thereto
WO2004035624A2 (en) * 2002-10-14 2004-04-29 Novo Nordisk A/S Glucagon - like peptide - 2 variants
AU2003298650B2 (en) * 2002-11-15 2010-03-11 Musc Foundation For Research Development Complement receptor 2 targeted complement modulators
EP1961416B1 (en) * 2003-05-05 2013-01-23 Probiodrug AG Use of inhibitors of glutaminyl cyclase for treating psoriasis, rheumatoid arthritis or atherosclerosis.
EP2266606B1 (en) 2003-05-15 2014-09-10 Genentech, Inc. Methods and compositions for the prevention and treatment of sepsis
CA2579635A1 (en) * 2003-09-10 2005-03-17 Baxter International Inc. Peptides that inhibit complement activation
JP4994039B2 (ja) 2003-11-26 2012-08-08 スパーナス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 脂溶性または疎水性化合物の送達に有用なミセル系
US7803931B2 (en) 2004-02-12 2010-09-28 Archemix Corp. Aptamer therapeutics useful in the treatment of complement-related disorders
US20060027059A1 (en) 2004-08-09 2006-02-09 Chih-Ching Hsien Extendable handle device
WO2006066258A2 (en) * 2004-12-17 2006-06-22 Neose Technologies, Inc. Lipoconjugation of peptides
WO2006078161A1 (en) 2005-01-24 2006-07-27 Pepscan Systems B.V. Binding compounds, immunogenic compounds and peptidomimetics
CA2610502A1 (en) 2005-03-29 2006-10-05 Cardax Pharmaceuticals, Inc. Reduction in complement activation and inflammation during tissue injury by carotenoids, carotenoid analogs, or derivatives thereof
WO2006128006A1 (en) 2005-05-26 2006-11-30 The Regents Of The University Of Colorado Inhibition of the alternative complement pathway for treatment of traumatic brain injury, spinal cord injury and related conditions
EP1888031B1 (en) 2005-06-06 2013-01-23 Camurus Ab Glp-1 analogue formulations
SG10201804008UA (en) 2005-11-04 2018-06-28 Genentech Inc Use of complement pathway inhibitors to treat ocular diseases
US20090220508A1 (en) 2006-03-15 2009-09-03 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Treatment Of Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria Patients By An Inhibitor Of Complement
EP1876183A1 (en) * 2006-07-04 2008-01-09 Technische Universität München Minimized small peptides with high affinity for factor VIII and factor VIII-like proteins
EP2073898A1 (en) 2006-10-10 2009-07-01 Academisch Ziekenhuis Bij De Universiteit Van Amsterdam Complement inhibition for improved nerve regeneration
US7736860B2 (en) 2006-11-09 2010-06-15 Univeristy Of Massachusetts Methods of identifying compounds for the treatment of sterile inflammation
US20100092493A1 (en) 2007-03-06 2010-04-15 Novo Nordisk A/S Modulation of Complement System Activation for Treatment of Bleeding-Related Inflammation
AU2008228247A1 (en) * 2007-03-22 2008-09-25 Novartis Ag C5 antigens and uses thereof
US20100015139A1 (en) 2008-07-10 2010-01-21 Rekha Bansal METHOD OF INHIBITING COMPLEMENT ACTIVATION WITH FACTOR Ba SPECIFIC ANTIBODIES AND USE THEREOF
CA2680833A1 (en) 2007-04-30 2008-11-13 Alcon Research, Ltd. Treatment of age-related macular degeneration using inhibitors of complement factor d
RU2473563C2 (ru) 2007-06-07 2013-01-27 Дженентек, Инк. АНТИТЕЛА ПРОТИВ C3b И СПОСОБЫ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ СВЯЗАННЫХ С КОМПЛЕМЕНТОМ НАРУШЕНИЙ
US20110142837A1 (en) 2007-07-20 2011-06-16 Trustees Of The University Of Pennsylvania Method Of Treating Acute Respiratory Distress Syndrome
BRPI0817524A2 (pt) 2007-10-02 2017-05-02 Potentia Pharmaceuticals Inc liberação prolongada de análogos de compstatina provenientes de géis
WO2009067191A2 (en) 2007-11-16 2009-05-28 The General Hospital Corporation Methods and compositions for the treatment of hepatitis c virus (hcv) infection
US20110190221A1 (en) 2008-03-28 2011-08-04 Apellis Ag Modulation and repletion/enhancement of the complement system for treatment of trauma
EP2324048A2 (en) 2008-07-30 2011-05-25 Cosmix Therapeutics Llc Peptide therapeutics that bind vegf and methods of use thereof
PY09026846A (es) * 2008-08-05 2015-09-01 Novartis Ag Composiciones y métodos para anticuerpos que se dirigen a la proteína de complemento c5
US20110172126A1 (en) 2008-09-03 2011-07-14 Xenome Ltd Libraries of peptide conjugates and methods for making them
CA2742802C (en) 2008-11-10 2019-11-26 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating complement-associated disorders
AU2009230735B1 (en) 2009-01-08 2010-01-21 Shane Ramodien Electronic equipment housing
DK2488203T3 (en) 2009-10-16 2017-03-13 Omeros Corp METHODS OF TREATING DISSEMINATED INTRAVASCULAR COAGULATION BY INHIBITION OF MASP-2 DEPENDENT COMPLEMENT ACTIVATION
CA2795311A1 (en) * 2009-11-05 2011-05-12 Taligen Therapeutics, Inc. Treatment of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, hemolytic anemias and disease states involving intravascular and extravascular hemolysis
JP6006118B2 (ja) 2009-12-16 2016-10-12 ノヴォ ノルディスク アー／エス Ｇｌｐ−１アナログ及び誘導体
US9172511B2 (en) 2009-12-24 2015-10-27 Samsung Electronics Co., Ltd. Apparatus and method of communicating automatic repeat request (ARQ) feedback in a wireless communication network
US9358266B2 (en) 2010-02-25 2016-06-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Treatment of sepsis using complement inhibitors
EP2545072B1 (en) * 2010-03-12 2017-11-22 The Regents of The University of California Lipid-peptide-polymer conjugates and nanoparticles thereof
WO2011139343A2 (en) * 2010-04-28 2011-11-10 Wu Nian Amino acid linked peg-lipid conjugates
EP2563359A1 (en) 2010-04-30 2013-03-06 Allergan, Inc. Novel treatment for age related macular degeneration and ocular ischemic disease associated with complement activation by targeting 5-lipoxygenase
TW201241008A (en) * 2010-10-01 2012-10-16 Alexion Pharma Inc Polypeptides that bind to human complement component C5
PH12013501865A1 (en) * 2011-03-16 2014-01-06 Amgen Inc Potent and selective inhibitors of nav1.3 and nav1.7
BR112013025917A2 (pt) 2011-04-08 2016-12-20 Omeros Corp uso de um anticorpo masp-2 ou fragmento do mesmo que inibe ativação de complemento dependente de masp-2
WO2012162215A1 (en) 2011-05-20 2012-11-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Promotion of fracture healing using complement inhibitors
WO2012174055A1 (en) 2011-06-13 2012-12-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Wound healing using complement inhibitors
CN102321170B (zh) * 2011-09-14 2013-11-13 深圳翰宇药业股份有限公司 利拉鲁肽变构体及其缀合物
US20140296147A1 (en) * 2011-10-06 2014-10-02 The Medicines Company Methods of treating or preventing blood loss during surgery using the serine protease inhibitor mdco-2010
EP3511339B1 (en) * 2012-02-20 2025-04-09 IPC Research, LLC Polypeptides binding to human complement c5
US20130246083A1 (en) 2012-03-16 2013-09-19 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of distributing complement-inhibiting drugs to patients receiving a complement inhibitor
WO2013172954A1 (en) 2012-05-17 2013-11-21 Ra Pharmaceuticals, Inc Peptide and peptidomimetic inhibitors
US9579360B2 (en) 2012-06-20 2017-02-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of treating or preventing periodontitis and diseases associated with periodontitis
US20130345257A1 (en) 2012-06-26 2013-12-26 The Regents Of The University Of California Composition for lupus nephritis and methods of making and using the same
WO2014078622A1 (en) 2012-11-15 2014-05-22 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Method and system for diagnosing and treating preeclampsia
US9700633B2 (en) * 2013-01-28 2017-07-11 Jenkem Technology Co., Ltd., Tianjin Branch Conjugates of water soluble polymer-amino acid oligopeptide-drug, preparation method and use thereof
GB201301632D0 (en) * 2013-01-30 2013-03-13 Imp Innovations Complement System
US20140234275A1 (en) 2013-02-15 2014-08-21 Jason Williams Method for treating als via the increased production of factor h
US20150057342A1 (en) 2013-08-21 2015-02-26 Cannabics Pharmaceuticals Inc Compositions for combined immediate and sustained release of cannabinoids, methods of manufacture and use thereof
CA2940319A1 (en) 2014-03-20 2015-09-24 Inflarx Gmbh Inhibitors of c5a for the treatment of viral pneumonia
EP3973994A1 (en) 2014-06-12 2022-03-30 RA Pharmaceuticals, Inc. Modulation of complement activity
US20160168237A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Method for treating a complement mediated disorder caused by an infectious agent in a patient
EP3142656B1 (en) 2015-01-21 2018-10-17 Pacira Pharmaceuticals, Inc. Multivesicular liposome formulations of tranexamic acid
US9937222B2 (en) * 2015-01-28 2018-04-10 Ra Pharmaceuticals, Inc. Modulators of complement activity
WO2017035362A1 (en) 2015-08-26 2017-03-02 Achillion Pharmaceuticals, Inc. Use of complement pathway inhibitor compounds to mitigate adoptive t-cell therapy associated adverse immune responses
RU2733720C2 (ru) 2015-12-16 2020-10-06 Ра Фармасьютикалз, Инк. Модуляторы активности комплемента
KR20190093196A (ko) 2016-12-07 2019-08-08 라 파마슈티컬스 인코포레이티드 보체 활성의 조절인자
TWI826364B (zh) 2017-04-03 2023-12-21 德商因夫萊亞斯有限公司 活性抑制劑於發炎性疾病之治療
EP3682016A4 (en) 2017-09-11 2021-06-02 RA Pharmaceuticals, Inc. FORMULATIONS FOR THE ADMINISTRATION OF COMPOUNDS
CN111683672A (zh) 2017-12-04 2020-09-18 Ra制药公司 补体活性调节剂
TW202100179A (zh) 2019-03-08 2021-01-01 美商Ｒａ製藥公司 補體活性之調節劑
SG11202109837SA (en) 2019-04-24 2021-10-28 Ra Pharmaceuticals Inc Compositions and methods for modulating complement activity

Also Published As

Publication number Publication date
EP3154561A4 (en) 2018-04-18
SI3628680T1 (sl) 2021-12-31
CN119236050A (zh) 2025-01-03
US10435438B2 (en) 2019-10-08
FR24C1022I2 (fr) 2025-05-23
JP2022034057A (ja) 2022-03-02
DK3628680T3 (da) 2021-10-11
KR101981532B1 (ko) 2019-09-02
NL301275I2 (nl) 2024-06-20
CN111187338A (zh) 2020-05-22
US11014965B2 (en) 2021-05-25
US20210246167A1 (en) 2021-08-12
AU2021204313A1 (en) 2021-07-22
FR24C1022I1 (fr) 2024-07-19
NZ727420A (en) 2018-06-29
AU2019200828A1 (en) 2019-02-28
LT3154561T (lt) 2019-11-25
ZA202001859B (en) 2021-04-28
KR20190057420A (ko) 2019-05-28
CA2949985A1 (en) 2015-12-17
US20200123202A1 (en) 2020-04-23
PL3628680T3 (pl) 2022-01-10
AU2015274482B2 (en) 2018-11-08
US10106579B2 (en) 2018-10-23
IL249093A0 (en) 2017-01-31
RU2018136750A (ru) 2018-11-06
EP3628680A1 (en) 2020-04-01
SMT202100588T1 (it) 2021-11-12
JP6770043B2 (ja) 2020-10-14
KR102346228B1 (ko) 2022-01-04
HUE045646T2 (hu) 2020-01-28
EP3628680B1 (en) 2021-09-08
EP3973994A1 (en) 2022-03-30
BR112016029076B1 (pt) 2024-02-15
RU2670988C2 (ru) 2018-10-29
RU2016147080A3 (sr) 2018-06-01
CY2024015I1 (el) 2024-12-13
CY1124595T1 (el) 2022-07-22
IL273746B (en) 2021-03-25
SG11201610222UA (en) 2017-01-27
RU2018136750A3 (sr) 2021-10-19
US11965040B2 (en) 2024-04-23
KR20220002727A (ko) 2022-01-06
BR112016029076A2 (pt) 2018-06-05
LTPA2024514I1 (sr) 2024-06-10
EP3154561A2 (en) 2017-04-19
RU2016147080A (ru) 2018-06-01
US20190119328A1 (en) 2019-04-25
IL281264A (en) 2021-04-29
HUE055931T2 (hu) 2022-01-28
CY1122227T1 (el) 2020-11-25
LTC3154561I2 (sr) 2025-11-10
EP3154561B1 (en) 2019-09-04
JP2019048834A (ja) 2019-03-28
IL273746A (en) 2020-05-31
NO2024023I1 (no) 2024-05-24
HRP20211561T8 (hr) 2022-03-04
US11535650B1 (en) 2022-12-27
US10208089B2 (en) 2019-02-19
AP2016009612A0 (en) 2016-12-31
BR122023024819A2 (pt) 2023-12-26
US10562934B2 (en) 2020-02-18
EP4223317A2 (en) 2023-08-09
ZA201900497B (en) 2019-10-30
RS62428B1 (sr) 2021-11-30
CA3241273A1 (en) 2015-12-17
PL3154561T3 (pl) 2019-12-31
JP7002597B2 (ja) 2022-02-04
IL281264B (en) 2022-05-01
PT3628680T (pt) 2021-10-07
HUS2400015I1 (hu) 2024-06-28
ES2750556T3 (es) 2020-03-26
HRP20211561T1 (hr) 2021-12-24
BR122021025449B1 (pt) 2024-02-15
HRP20191763T1 (hr) 2019-12-27
ES2895029T3 (es) 2022-02-17
MX2016016449A (es) 2017-08-24
JP7454545B2 (ja) 2024-03-22
FIC20240015I1 (fi) 2024-05-28
CA2949985C (en) 2023-10-17
MX2021009309A (es) 2021-10-26
BR112016029076A8 (pt) 2022-02-08
WO2015191951A3 (en) 2016-03-03
US20200002380A1 (en) 2020-01-02
CN106456701B (zh) 2020-01-07
IL249093B (en) 2020-05-31
WO2015191951A2 (en) 2015-12-17
KR20170003993A (ko) 2017-01-10
ZA201706379B (en) 2018-12-19
AU2019200828B2 (en) 2021-04-08
NZ736573A (en) 2024-03-22
KR102503319B1 (ko) 2023-02-28
JP2020128417A (ja) 2020-08-27
LT3628680T (lt) 2021-11-25
US20180371019A1 (en) 2018-12-27
NZ761610A (en) 2024-03-22
CN111187338B (zh) 2024-08-02
JP6432954B2 (ja) 2018-12-05
CA3174909A1 (en) 2015-12-17
SI3154561T1 (sl) 2019-11-29
JP2017523232A (ja) 2017-08-17
EP4223317A3 (en) 2023-09-27
DK3154561T3 (da) 2019-10-07
CY2024015I2 (el) 2024-12-13
US20170137468A1 (en) 2017-05-18
AU2021204313B2 (en) 2024-01-04
AU2015274482A1 (en) 2017-01-12
PT3154561T (pt) 2019-10-25
CN106456701A (zh) 2017-02-22
SMT201900568T1 (it) 2019-11-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2021204313B2 (en) Modulation of complement activity
EP3250230B9 (en) Modulators of complement activity
RU2778514C2 (ru) Модуляция активности комплемента
HK40072986A (en) Modulation of complement activity
HK40073624A (en) Modulators of complement activity
HK40023699A (en) Modulation of complement activity
HK40023699B (en) Modulation of complement activity
HK1234338B (en) Modulation of complement activity
HK1234338A1 (en) Modulation of complement activity
HK1246672B (en) Modulators of complement activity