RS59370B1

RS59370B1 - Molekuli anti-gcc antitela i njihova upotreba u ispitivanju osetljivosti na gcc-ciljanu terapiju

Info

Publication number: RS59370B1
Authority: RS
Inventors: Helen Alison Frank; Alice A Mcdonald; Theresa L O'keefe
Original assignee: Millennium Pharm Inc
Priority date: 2012-04-27
Filing date: 2013-04-27
Publication date: 2019-11-29
Also published as: JP6472746B2; US20160130344A1; BR112014026742A2; SG11201406855TA; CN104395470A; HRP20191690T1; CO7280144A2; PH12014502399A1; AU2013251312B2; US9273146B1; ES2749181T3; US9000129B2; ECSP14028523A; AU2013251312A1; KR20150004882A; ME03560B; EA201491977A1; CN104395470B; DOP2014000242A; CR20140497A

Description

Opis

Povezane prijave

[0001] Predmetna prijava zahteva korist i prioritet od SAD privremene prijave serijski br.

61/639,376, podnete 27.04.2012.

Oblast pronalaska

[0002] Pronalazak se odnosi na molekule antitela koji vezuju GCC, i postupke za njihovu upotrebu u odabiru pacijenata za lečenje GCC-ciljanom terapijom, kao što je imunokonjugat koji sadrži molekul anti-GCC antitela, ili njegov fragment, konjugovan sa agensom kao što je terapijski agens.

Osnova pronalaska

[0003] Guanilil ciklaza C ("GCC") je transmembranski receptor ćelijske površine koji ima ulogu u održavanju intestinalnog fluida, homeostazi elektrolita i ćelijskoj proliferaciji, videti, npr., Carrithers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:3018-3020 (2003). GCC se eksprimira u mukoznim ćelijama koje oblažu tanko crevo, debelo crevo i rektum (Carrithers et al., Dis Colon Rectum 39: 171-181 (1996)). Ekspresija GCC se održava nakon neoplastične transformacije ćelija crevnog epitela, uz eksprimiranje u svim primarnim i metastatskim kolorektalnim tumorima (Carrithers et al., Dis Colon Rectum 39: 171-181 (1996); Buc et al. Eur J Cancer 41: 1618-1627 (2005); Carrithers et al., Gastroenterology 107: 1653-1661 (1994)). Antitela i antigen-vezujući fragmenti antitela koji vezuju GCC opisani su u WO 2011/050242.

Suština pronalaska

[0004] Predmet za koji se traži zaštita je kao što je definisano u patentnim zahtevima. Otkriće se, bar delimično, zasniva na otkriću novih anti-GCC antitela. Prema tome, u jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje molekul anti-GCC antitela, kao što je ovde opisano. Molekuli anti-GCC antitela su korisni kao „goli“ molekuli antitela i kao komponente imunokonjugata. Prema tome, u drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje imunokonjugate koji sadrže ovde opisani molekul anti-GCC antitela i terapijski agens ili oznaku. Pronalazak takođe obezbeđuje postupke za upotrebu molekula anti-GCC antitela i ovde opisanih imunokonjugata, npr., za detekciju GCC i ćelija ili tkiva koja eksprimiraju GCC. Takvi postupci su korisni, između ostalog, za dijagnozu, prognozu, snimanje, ili utvrđivanje stadijuma GCC-posredovane bolesti. Prema tome, u nekim aspektima, pronalazak obezbeđuje postupke za identifikaciju subjekta za lečenje GCC- ciljanom terapijom, npr., terapijom anti-GCC antitelom, npr., imunokonjugatom koji sadrži anti-GCC antitelo konjugovano sa terapijskim agensom. Pronalazak takođe obezbeđuje in vitro ili in vivo postupak za određivanje da li je subjekt koji ima kancer potencijalni kandidat za GCC-ciljanu terapiju, npr., ovde opisanu GCC-ciljanu terapiju.

[0005] Anti-GCC antitela, npr., ovde opisana anti-GCC antitela, takođe su korisna npr., za modulaciju aktivnosti ili funkcije GCC proteina; i za lečenje GCC-posredovane bolesti, kao što je ovde opisano. U nekim aspektima, lečenje uključuje sticanje saznanja i/ili procenu uzorka ili subjekta za određivanje nivoa ekspresije GCC, i da li subjekat eksprimira GCC, a zatim primenu GCC-ciljane terapije, npr., ovde opisane GCC-ciljane terapije. U drugim aspektima, postupak obezbeđuje izradu izveštaja o personalizovanom lečenju, npr., izveštaja o GCC-ciljanom lečenju, uzimanjem uzorka od subjekata i određivanjem nivoa ekspresije GCC, npr., ovde opisanim postupkom detekcije, npr., upotrebom ovde opisanog anti-GCC antitela, i na osnovu tog određivanja, izbora izveštaja o ciljanom lečenju subjekta.

[0006] U još jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje i izolovane i/ili rekombinantne nukleinske kiseline koje kodiraju aminokiselinske sekvence molekula anti-GCC antitela, kao i vektore i ćelijedomaćine koje sadrže takve nukleinske kiseline, i postupke za proizvodnju molekula anti-GCC antitela. U ovom dokumentu obezbeđene su i reakcione smeše i kompleti koji sadrže anti-GCC antitela, npr., ovde opisani imunokonjugat, kao i in vitro testove, npr., koji obuhvataju ovde opisano anti-GCC antitelo, za detekciju ekspresije GCC.

[0007] Ostale karakteristike, ciljevi i prednosti ovde opisanog pronalaska/pronalazaka biće očigledni iz opisa i crteža, i iz patentnih zahteva.

Kratak opis crteža

[0008]

Slika 1 je kružna mapa vektora za ekspresiju proteina korišćenog za stvaranje fuzionog proteina (hGCC-ECD-mFc) ekstracelularnog domena (ECD) humanog GCC (hGCC) mišjeg Fc (mFc) prema pronalasku.

Slike 2A-2D prikazuju histograme koji rezimiraju raspodelu kombinovane/zbirne (apikalne i citoplazmatske) H-skora ekspresije GCC po vrstama tumora kod pacijenata sa kancerom koji su podvrgnuti skriningu za uključivanje u studiju C26001 faze I kliničkog ispitivanja GCC-ciljanog imunokonjugata. Slika 2A prikazuje raspodelu kombinovane zbirne H-skora kod pregledanih pacijenata sa kolorektalnim kancerom; Slika 2B prikazuje raspodelu kombinovane zbirne H-skora kod pregledanih pacijenata sa kancerom želuca; Slika 2C prikazuje raspodelu kombinovane zbirne H-skora kod pregledanih pacijenata sa kancerom pankreasa; Slika 2D prikazuje raspodelu kombinovane zbirne H-skora kod pregledanih pacijenata sa kancerom jednjaka.

Slike 3A-3C prikazuju histograme koji rezimiraju raspodelu kombinovane/zbirne (apikalne i citoplazmatske) H-skora ekspresije GCC u različitim specifičnim tumorskim mikromatricama podvrgnutim skriningu. Slika 3A prikazuje raspodelu kombinovane/zbirne H-skora u uzorcima na različitim mikromatricama kolorektalnih tumora ispitivanih na ekspresiju GCC; Slika 3B prikazuje raspodelu kombinovane/zbirne H-skora u uzorcima na mikromatricama tumora želuca ispitivanim na ekspresiju GCC; Slika 3C prikazuje raspodelu kombinovane/zbirne H-skora u uzorcima na različitim mikromatricama tumora pankreasa ispitivanim na ekspresiju GCC.

Detaljan opis pronalaska

[0009] Guanilil ciklaza C (GCC) (poznata i kao STAR, ST receptor, GUC2C i GUCY2C) je transmembranski receptor ćelijske površine koji ima ulogu u održavanju intestinalnog fluida, homeostazi elektrolita i ćelijskoj proliferaciji (Carrithers et al., Proc Natl Acad Sci USA 100: 3018-3020 (2003); Mann et al., Biochem Biophys Res Commun 239: 463-466 (1997); Pitari et al., Proc Natl Acad Sci USA 100: 2695-2699 (2003)); GenBank pristupni br. NM_004963. Ova uloga je posredovana vezivanjem guanilina (Wiegand et al. FEBS Lett.311:150-154 (1992)). GCC je takođe receptor za termo-stabilni enterotoksin (ST, npr., koji ima aminokiselinsku sekvencu NTFYCCELCCNPACAGCY, SEQ ID NO: 1) koji predstavlja peptid koji proizvodi E. coli, kao i drugi infektivni organizmi (Rao, M. C. Ciba Found. Symp.112:74-93 (1985); Knoop F. C. i Owens, M. J. Pharmacol. Toxicol. Methods 28:67-72 (1992)). Vezivanje ST za GCC aktivira signalnu kaskadu koja rezultuje enteričkom bolešću, npr., dijarejom.

[0010] Nukleotidna sekvenca za humani GCC (GenBank pristupni br. NM_004963; SEQ ID NO:

[0011] Aminokiselinska sekvenca za humani GCC (GenPept pristupni br. NP_004954; SEQ ID NO: 3):

[0012] GCC protein ima neke opšte prihvaćene domene od kojih svaki doprinosi odvojivoj funkciji molekula GCC. Delovi GCC uključuju signalnu sekvencu (za usmeravanje proteina do ćelijske površine) od aminokiselinske rezidue 1 do oko rezidue 23, ili rezidue 1 do oko rezidue 21 u SEQ ID NO: 3 (isecanje pri sazrevanju da bi se dobio funkcionalni zreli protein od oko aminokiselinskih rezidua 22 ili 24 do 1073 u SEQ ID NO: 3), ekstracelularni domen za vezivanje liganda, npr., guanilina ili ST, od oko aminokiselinske rezidue 24 do oko rezidue 420, ili oko rezidue 54 do oko rezidue 384 u SEQ ID NO: 3, transmembranski domen od oko aminokiselinske rezidue 431 do oko rezidue 454, ili oko rezidue 436 do oko rezidue 452 u SEQ ID NO: 3, kinaza-homologi domen, za koji se predviđa da ima aktivnost tirozin kinaze od oko aminokiselinske rezidue 489 do oko rezidue 749, ili oko rezidue 508 do oko rezidue 745 u SEQ ID NO: 3 i guanilil ciklazni katalitički domen od oko rezidue 750 do oko rezidue 1007, ili oko rezidue 816 do oko rezidue 1002 u SEQ ID NO: 3.

[0013] U normalnim humanim tkivima, GCC se eksprimira u mukoznim ćelijama, npr., na apikalnoj membrani četkaste ivice, koja oblaže tanko crevo, debelo crevo i rektum (Carrithers et al., Dis Colon Rectum 39: 171-181 (1996)). ekspresija GCC se održava nakon neoplastične transformacije intestinalnih epitelnih ćelija, uz ekspresiju u svim primarnim i metastatskim kolorektalnim tumorima (Carrithers et al., Dis Colon Rectum 39: 171-181 (1996); Buc et al. Eur J Cancer 41: 1618-1627 (2005); Carrithers et al., Gastroenterology 107: 1653-1661 (1994)). Neoplastične ćelije iz želuca, jednjaka i gastroezofagealnog spoja takođe eksprimiraju GCC (videti, npr., SAD pat. br.6,767,704; Debruyne et al. Gastroenterology 130:1191-1206 (2006)). Tkivno-specifična ekspresija i povezivanje sa kancerom, npr., gastrointestinalnog porekla, (npr., kolorektalni kancer, kancer želuca, kancer jednjaka ili kancer tankog creva), mogu da se iskoriste za upotrebu GCC kao dijagnostičkog markera za ovu bolest (Carrithers et al., Dis Colon Rectum 39: 171-181 (1996); Buc et al. Eur J Cancer 41: 1618-1627 (2005)). Dodatno, kao što je pokazano u ovde prikazanim primerima, za nekoliko različitih tipova kancera koji nisu gastrointestinalnog porekla pokazano je da eksprimiraju GCC, uključujući, ali bez ograničenja kancer pankreasa, kancer pluća, sarkome mekog tkiva (npr., leiomiosarkom i rabdomiosarkom) gastrointestinalne ili bronhopulmonalne neuroendokrine tumore i neuroektodermalne tumore.

[0014] Kao protein ćelijske površine, GCC može da služi i kao dijagnostičko ili terapijsko ciljno mesto za proteine koji se vezuju za receptor kao što su antitela ili ligandi. U normalnom intestinalnom tkivu, GCC se eksprimira na apikalnoj strani čvrstih veza epitelnih ćelija koje stvaraju nepropusnu barijeru između okruženja u lumenu creva i vaskularnog odeljka (Almenoff et al., Mol Microbiol 8: 865-873); Guarino et al., Dig Dis Sci 32: 1017-1026 (1987)). Budući da je tako, sistemska intravenska primena GCC-vezujućeg proteina kao terapeutika imala bi minimalno dejstvo na intestinalne GCC receptore, dok bi imala pristup neoplastičnim ćelijama gastrointestinalnog sistema, uključujući ćelije invazivnog ili metastatskog kancera debelog creva, ekstraintestinalnih ili metastatskih tumora debelog creva, tumora jednjaka ili tumora želuca, adenokarcinoma na gastroesofagealnom spoju. Dodatno, GCC internalizuje putem receptorom posredovane endocitoze po vezivanju liganda (Buc et al. Eur J Cancer 41: 1618-1627 (2005); Urbanski et al., Biochem Biophys Acta 1245: 29-36 (1995)).

[0015] Poliklonska antitela razvijena protiv ekstracelularnog domena GCC (Nandi et al. Protein Expr. Purif. 8:151-159 (1996)) mogla su da inhibiraju vezivanje ST peptida za humani i pacovski GCC i inhibiraju ST-posredovanu proizvodnju cGMP pomoću humanog GCC.

[0016] GCC je okarakterisan kao protein uključen u kancere, uključujući kancere debelog creva. Videti takođe, Carrithers et al., Dis Colon Rectum 39: 171-181 (1996); Buc et al. Eur J Cancer 41: 1618-1627 (2005); Carrithers et al., Gastroenterology 107: 1653-1661 (1994); Urbanski et al., Biochem Biophys Acta 1245: 29-36 (1995). Molekuli antitela usmerenih na GCC mogu stoga da se koriste sami u nekonjugovanom obliku da inhibiraju kancerske ćelije koje eksprimiraju GCC. Dodatno, molekuli antitela usmereni na GCC mogu da se koriste u „golom“ ili obeleženom obliku, za detekciju kanceroznih ćelija koje eksprimiraju GCC. Molekuli anti-GCC antitela prema pronalasku mogu da se vežu za humani GCC. U nekim primerima izvođenja, molekul anti-GCC antitela prema pronalasku može da inhibira vezivanje liganda, npr., guanilina ili termo-stabilnog enterotoksina za GCC. U drugim primerima izvođenja, molekul anti-GCC antitela prema pronalasku ne inhibira vezivanje liganda, npr., guanilina ili termo-stabilnog enterotoksina za GCC.

[0017] Monoklonska antitela specifična za GCC uključuju GCC:B10 (Nandi et al., J. Cell. Biochem.

66:500-511 (1997)), GCC:4D7 (Vijayachandra et al. Biochemistry 39:16075-16083 (2000)) i GCC:C8 (Bakre et al. Eur. J. Biochem.267:179-187 (2000)). GCC:B10 ima kapa laki lanac i IgG2a izotip i unakrsno reaguje sa GCC pacova, svinje i majmuna. GCC:B10 se vezuje za prve 63 aminokiseline intracelularnog domena GCC, specifično za rezidue 470-480 u SEQ ID NO: 3 (Nandi et al. Protein Sci. 7:2175-2183 (1998)). GCC:4D7 se vezuje za kinaza-homologi domen, unutar rezidua 491-568 u GCC (Bhandari et al. Biochemistry 40:9196-9206 (2001)). GCC:C8 se vezuje za domen sličan protein kinazi u citoplazmatskom delu GCC.

Definicije

[0018] Osim ako ovde nije drugačije definisano, naučni i tehnički termini korišćeni zajedno sa predmetnim pronalaskom imaju značenja koja obično podrazumevaju stručnjaci u ovoj oblasti. Uopšteno, nomenklatura korišćena u vezi sa, i tehnike ćelijske i tkivne kulture, molekularne biologije, i proteinske i oligo- ili polinukleotidne hemije i hibridizacije koje su ovde opisane poznate su u stanju tehnike. GenBank ili GenPept pristupni brojevi i korisne sekvence nukleinske kiseline i peptidne sekvence mogu da se nađu na veb-sajtu koji odražava Nacionalni centar za biotehnološke informacije, Bethesda Md. Standardne tehnike se koriste za rekombinantnu DNK, sintezu oligonukleotida i kulturu tkiva i transformaciju i transfekciju (npr., elektroporacija, lipofekcija). Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja se izvode prema specifikacijama proizvođača ili kao što se uobičajeno radi u stanju tehnike, ili kao što je ovde opisano. Gore navedene tehnike i procedure se uopšteno sprovode postupcima poznatim u stanju tehnike, npr., kao što je opisno u različitim opštim i specifičnijim referencama koje su citirane i o kojima je diskutovano u predmetnoj specifikaciji. Videti npr., Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000)) ili videti uopšteno, Harlow, E. i Lane, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Nomenklatura korišćena u vezi sa, i laboratorijske procedure i tehnike opisane u ovom dokumentu poznate su u stanju tehnike. Osim toga, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, termini u jednini će uključivati množinu i termini u množini će uključivati jedninu.

[0019] U značenju koje je ovde primenjeno, termin "molekul antitela" odnosi se na antitelo, peptid(e) antitela ili imunoglobulin, ili antigen-vezujući fragment bilo čega gore navedenog, npr., antitela. Molekuli antitela uključuju jednolančane molekule antitela, npr., scFv, videti. npr., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; i Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883), i jednodomenske molekule antitela, videti, npr., WO9404678. Iako ne u okviru termina "molekuli antitela", pronalazak takođe uključuje "analog(e) antitela", druge nosače na bazi proteina koji nisu molekul antitela, npr., fuzione proteine i/ili imunokonjugate koji koriste CDR da obezbede specifično vezivanje za antigen.

[0020] "Molekul anti-GCC antitela" se odnosi na molekul antitela (tj., antitelo, antigen-vezujući fragment antitela ili analog antitela) koji interaguje sa, ili prepoznaje, npr., vezuje se za, (npr., vezuje se specifično) za GCC, npr., humani GCC. Primeri molekula anti-GCC antitela su oni kao što je prikazano u tabelama 1 i 2.

[0021] U značenju koje je ovde primenjeno, termin "antitelo", "peptid(i) antitela" ili "imunoglobulin" odnose se na jednolančane, dvolančane, i višelančane proteine i glikoproteine. Termin antitelo uključuje poliklonska, monoklonska, himerna, CDR-graftovana i humana ili humanizovana antitela, koja su sva detaljnije razmatrana na drugom mestu u ovom dokumentu. u termin su uključena i kamelidna antitela, videti, npr., US2005/0037421, i nano-antitela, npr., IgNAR (antitela ajkule), videti, npr., WO03/014161. Termin "antitelo" takođe uključuje sintetičke i genetski konstruisane varijante.

[0022] U značenju koje je ovde primenjeno, termin "fragment antitela" ili "antigen-vezujući fragment" antitela odnosi se na, npr., to Fab, Fab’, F(ab’)2i Fv fragmente, jednolančana antitela, funkcionalna antitela sa teškim lancem (nano-antitela), kao i bilo koji deo antitela koji ispoljava specifičnost prema bar jednom željenom epitopu, koji kompetira sa intaktnim antitelom za specifično vezivanje (npr., fragment koji ima dovoljno CDR sekvenci i ima dovoljno okvirnih sekvenci da se specifično veže za epitop). Npr., antigen-vezujući fragment može da kompetira za vezivanje za epitop koji vezuje antitelo od koga je fragment izveden. Izveden, kako se koristi u ovom i sličnim kontekstima, ne uključuje bilo koji konkretan metod ili postupak dobijanja, već se odnosi samo na sličnost sekvence. Antigen-vezujući fragmenti mogu da se proizvedu rekombinantnim tehnikama, ili enzimskim ili hemijskim cepanjem intaktnog antitela. Termin, antigen-vezujući fragment, kada se koristi u vezi sa jednim lancem, npr., teškim lancem, antitela koje ima laki i teški lanac znači da je fragment lanca dovoljan da kada se spari sa kompletnim varijabilnim regionom drugog lanca, npr., lakog lanca, omogući vezivanje najmanje 25, 50, 75, 85 ili 90% onoga viđenog sa celim teškim i lakim varijabilnim regionom.

[0023] Termin, "antigen-vezujuća konstelacija CDR" ili "broj CDR dovoljan da omogući vezivanje" (i slični izrazi), u značenju koje je ovde primenjeno, odnosi se na dovoljno CDR lanca, npr., teškog lanca, tako da kada se smeste u okvirni region i spare sa kompletnim varijabilnim regionom drugog lanca, ili sa delom varijabilnog regiona drugog lanca slične dužine i koji ima isti broj CDR, npr., lakog lanca, omogući će vezivanje, npr., najmanje 25, 50, 75, 85 ili 90% onoga viđenog sa celim teškim i lakim varijabilnim regionom.

[0024] U značenju koje je ovde primenjeno, termin "humanizovano antitelo" odnosi se na antitelo koje potiče od nehumanog antitela npr., kunića, glodara (npr., miša), ovce ili koze, koje zadržava ili suštinski zadržava antigen-vezujuća svojstva parentalnog antitela ali je manje imunogeno za ljude. Humanizovano, u značenju koje je ovde primenjeno, uključuje deimunizovana antitela. Tipično, humanizovana antitela uključuju nehumane CDR, i okvirne i konstantne regione koji su humani ili potiču od humanih.

[0025] Termin "modifikovano" antitelo, u značenju koje je ovde primenjeno, odnosi se na antitela koja su pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana na rekombinantne načine, kao što su antitela eksprimirana upotrebom rekombinantnog ekspresionog vektora transficiranog u ćelijudomaćina, antitela izolovana iz rekombinantne, kombinatorijalne biblioteke antitela, antitela izolovana iz nehumane životinje (npr., kunića, miša, pacova, ovce ili koze) koja je transgena za humane imunoglobulinske gene ili antitela pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana na bilo koji drugi način koji uključuje splajsovanje humanih imunoglobulinskih genskih sekvenci sa drugim DNK sekvencama. Takva modifikovana antitela uključuju humanizovana, CDR-graftovana (npr., antitelo koje ima CDR regione iz prvog antitela i okvirni region iz drugog izvora, npr., drugog antitela ili konsenzus okvirni region), himerna, in vitro stvorena (npr., prikazom na fagu) antitela, i mogu opciono da uključuju varijabilne ili konstantne regione poreklom iz imunoglobulinskih sekvenci humane klicine linije ili humane imunoglobulinske gene ili antitela koja su pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana na bilo koji način koji uključuje splajsovanje humanih imunoglobulinskih genskih sekvenci sa alternativnim imunoglobulinskim sekvencama. U primerima izvođenja modifikovani molekul antitela uključuje molekul antitela koji ima izmenu sekvence u odnosu na referentno antitelo.

[0026] Termin "monospecifično antitelo" odnosi se na antitelo ili preparat antitela koji ispoljava jedinstvenu specifičnost vezivanja i afinitet za određeni epitop. Ovaj termin uključuje "monoklonsko antitelo" ili "kompoziciju monoklonskog antitela".

[0027] Termin "bispecifično antitelo" ili "bifunkcionalno antitelo" odnosi se na antitelo koje ispoljava dvojnu specifičnost vezivanja za dva epitopa, pri čemu se svako vezujuće mesto razlikuje i prepoznaje drugačiji epitop.

[0028] Termini "nekonjugovano antitelo" i "golo antitelo" koriste se kao sinonimi da označe molekul antitela koji nije konjugovan sa fragmentom koji nije antitelo, npr., sa agensom ili oznakom.

[0029] Svaki od termina "imunokonjugat", " konjugat antitelo-lek" i " konjugat antitela", koristi se međusobno zamenljivo sa ostalima, i odnosi se na antitelo koje je konjugovano sa fragmentom koji nije antitelo, npr., sa agensom ili oznakom. Termin "agens" se ovde koristi da označi hemijsko jedinjenje, smešu hemijskih jedinjenja, biološki makromolekul, ili ekstrakt napravljen od bioloških materijala. Termin "terapijski agens" odnosi se na agens koji ima biološku aktivnost. Primeri terapijskih agenasa su hemioterapijski agensi.

[0030] Termin "anti-kancerski agens" ili "hemioterapijski agens" ovde se koristi da označi agense koji imaju funkcionalno svojstvo inhibicije razvoja ili progresije neoplazme kod čoveka, posebno maligne (kancerozne) lezije, kao što je karcinom, sarkom, limfom, ili leukemija. Inhibicija metastaze ili angiogeneze je često svojstvo anti-kancerskih ili hemioterapijskih agenasa. Hemioterapijski agens može da bude citotoksični ili citostatski agens. Termin "citostatski agens" odnosi se na agens koji inhibira ili suprimira ćelijski rast i/ili multiplikaciju ćelija.

[0031] "Citotoksični agensi" se odnosi na jedinjenja koja izazivaju ćelijsku smrt primarno tako što direktno interferiraju sa funkcionisanjem ćelije, uključujući, ali bez ograničenja, alkilirajuće agense, inhibitore faktora nekroze tumora, interkalatore, inhibitore mikrotubula, inhibitore kinaze, inhibitore proteazoma i inhibitore topoizomeraze. "Toksično opterećenje", u značenju koje je ovde primenjeno, odnosi se na dovoljnu količinu citotoksičnog agensa koja, kada se dostavi u ćeliju rezultuje ćelijskom smrću. Dostavljanje toksičnog opterećenja može da se ostvari primenom dovoljne količine imunokonjugata koji sadrži antitelo ili antigen-vezujući fragment prema pronalasku i citotoksični agens. Dostavljanje toksičnog opterećenja može takođe da se ostvari primenom dovoljne količine imunokonjugata koji sadrži citotoksični agens, pri čemu imunokonjugat sadrži sekundarno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji prepoznaje i vezuje se za antitelo ili antigen-vezujući fragment prema pronalasku.

[0032] U značenju koje je ovde primenjeno izraz, sekvenca "koja potiče od" ili "specifična za naznačenu sekvencu" odnosi se na sekvencu koja sadrži kontinuiranu sekvencu od približno najmanje 6 nukleotida ili najmanje 2 aminokiseline, najmanje oko 9 nukleotida ili najmanje 3 aminokiseline, najmanje oko 10-12 nukleotida ili 4 aminokiseline, ili najmanje oko 15-21 nukleotida ili 5-7 aminokiselina koje odgovaraju, tj., identične su ili komplementarne, npr., kontinuiranom regionu naznačene sekvence. U određenim primerima izvođenja, sekvenca sadrži sve naznačene nukleotidne ili aminokiselinske sekvence. Sekvenca može da bude komplementarna (u slučaju polinukleotidne sekvence) ili identična regionu sekvence koji je jedinstven za određenu sekvencu određeno tehnikama poznatim u stanju tehnike. Regioni od kojih sekvence mogu da potiču, uključuju, ali nisu ograničeni na regione koji kodiraju specifične epitope, regione koji kodiraju CDR, regione koji kodiraju okvirne sekvence, regione koji kodiraju regione konstantnog domena, regione koji kodiraju regione varijabilnog domena, kao i netranslatirane i/ili netranskribovane regione. Izvedena sekvenca neće neophodno biti fizički izvedena iz sekvence od interesa u studiji, već može da bude stvorena na bilo koji način, uključujući, ali bez ograničenja, hemijsku sintezu, replikaciju, reverznu transkripciju ili transkripciju, koja je zasnovana na informaciji koju daje sekvenca baza u regionu/regionima od kojih polinukleotid potiče. Kao takva, ona može da ima direktnu ili obrnutu orjentaciju originalnog polinukleotida. Pored toga, kombinacije regiona koji odgovaraju onoj u naznačenoj sekvenci mogu da budu modifikovane ili kombinovane na načine za koje je u stanju tehnike poznato da su u skladu sa planiranom upotrebom. Na primer, sekvenca može da sadrži dve ili više kontinuiranih sekvenci od kojih svaka sadrži deo naznačene sekvence, i prekinute su regionom koji nije identičan naznačenoj sekvenci ali je predviđeno da predstavlja sekvencu koja potiče od naznačene sekvence. U pogledu molekula antitela, "potiče od njega" uključuje molekul antitela koji je funkcionalno ili strukturno srodan uporednom antitelu, npr., "potiče od njega" uključuje molekul antitela koji ima sličnu ili suštinski istu sekvencu ili strukturu, npr., ima iste ili slične CDR, okvirne ili varijabilne regione. "Potiče od" za antitelo takođe uključuje rezidue, npr., jednu ili više, npr., 2, 3, 4, 5, 6 ili više rezidua, koje mogu ili ne moraju da budu kontinuirane, ali su definisane ili identifikovane prema šemi numeracije ili homologiji sa opštom strukturom antitela ili trodimenzionalnom blizinom, tj., u CDR ili okvirnom regionu, sa uporednom sekvencom. Termin "potiče od njega" nije ograničen na fizičko poreklo, već uključuje stvaranje na bilo koji način, npr., upotrebom informacije o sekvenci iz uporednog antitela za konstruisanje drugog antitela.

[0033] U značenju koje je ovde primenjeno, izraz "kodiran" odnosi se na sekvencu nukleinske kiseline koja kodira polipeptidnu sekvencu, u kojoj polipeptidna sekvenca ili njen deo sadrži aminokiselinsku sekvencu od najmanje 3 do 5 aminokiselina, najmanje 8 do 10 aminokiselina, ili najmanje 15 do 20 aminokiselina iz polipeptida kodiranog sekvencom nukleinske kiseline.

[0034] U značenju koje je ovde primenjeno, termin "kolorektalni kancer", takođe uobičajeno poznat kao kancer kolona ili kancer debelog creva, odnosi se na kancer od nekontrolisanog ćelijskog rasta u kolonu ili rektumu (delovi debelog creva), ili u slepom crevu.

[0035] Termini "kancer želuca" i "gastrični kancer" koriste se kao sinonimi.

[0036] Izračunavanje "homologije" između dve sekvence može da se izvede kao što sledi. Sekvence se poravnavaju u svrhu optimalnog poređenja (npr., praznine mogu da se uvedu u jednu ili obe od prve ili druge aminokiselinske sekvence ili sekvence nukleinske kiseline za optimalno poravnanje i nehomologe sekvence mogu da se zanemare u cilju poređenja). Dužina referentne sekvence koja je poravnata u svrhu poređenja je najmanje 30%, 40%, ili 50%, najmanje 60%, ili najmanje 70%, 80%, 90%, 95%, 100% dužine referentne sekvence. Zatim se porede aminokiselinske rezidue ili nukleotidi na odgovarajućim aminokiselinskim pozicijama ili nukleotidnim pozicijama. Kada je pozicija u prvoj sekvenci zauzeta istom aminokiselinskom reziduom ili nukleotidom kao odgovarajuća pozicija u drugoj sekvenci, tada su molekuli identični na toj poziciji (u značenju koje je ovde primenjeno "identičnost" aminokiseline ili nukleinske kiseline je ekvivalent "homologije" aminokiseline ili nukleinske kiseline). Procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija koje dele sekvence, uzimajući u obzir broj praznina, i dužinu svake praznine, koje treba de se uvedu za optimalno poravnanje dve sekvence.

[0037] Poređenje sekvenci i određivanje procenta homologije između dve sekvence može da se ostvari upotrebom matematičkog algoritma. Procenat homologije između dve aminokiselinske sekvence može da se odredi upotrebom bilo kog metoda poznatog u stanju tehnike. Na primer, algoritma prema autorima Needleman i Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970), koji je ugrađen u program GAP u programskom paketu GCG, upotrebom matrice Blossum 62 ili matrice PAM250, i težine praznine od 16, 14, 12, 10, 8, 6, ili 4 i težine dužine praznine od 1, 2, 3, 4, 5, ili 6. Procenat homologije između dve nukleotidne sekvence može takođe da se odredi upotrebom programa GAP u programskom paketu GCG (Accelerys, Inc. San Diego, Calif.), upotrebom matrice NWSgapdna.CMP i težine praznine od 40, 50, 60, 70, ili 80 i težine dužine praznine od 1, 2, 3, 4, 5, ili 6. Primer niza parametara za određivanje homologije je matrica bodovanja Blossum 62 sa negativnim poenima za prazninu od 12, negativnim poenima za dužinu praznine od 4, i negativnim poenima za prazninu pomeranja okvira od 5.

[0038] U značenju koje je ovde primenjeno, izraz "hibridizuje pod strogim uslovima" opisuje uslove hibridizacije i pranja. Vodič za izvođenje reakcija hibridizacije može da se nađe u Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. U toj referenci su opisani postupci u vodenoj sredini i sredini koja nije vodena, i oba mogu da se koriste. Specifični uslovi hibridizacije označeni su ovde kao što sledi: 1) uslovi hibridizacije niske strogosti u 6X natrijum hloridu/natrijum citratu (SSC) na oko 45° C, praćeni sa dva pranja u 0.2X SSC, 0.1% SDS najmanje na 50° C. (temperatura pranja može da se poveća do 55° C za uslove niske strogosti); 2) uslovi hibridizacije srednje strogosti u 6X SSC na oko 45° C, praćeni sa jednim ili više pranja u 0.2 X SSC, 0.1% SDS na 60° C; 3) uslovi hibridizacije visoke strogosti u 6X SSC na oko 45° C, praćeni sa jednim ili više pranja u 0.2X SSC, 0.1% SDS na 65° C; i 4) uslovi hibridizacije veoma visoke strogosti su 0.5M natrijum fosfatom, 7% SDS na 65° C, praćeni sa jednim ili više pranja u 0.2X SSC, 1% SDS na 65° C. Uslovi veoma visoke strogosti (4) su često poželjni uslovi i oni koji bi trebalo da se koriste osim ako nije drugačije naznačeno.

[0039] Podrazumeva se da antitela i njihov antigen-vezujući fragment prema pronalasku mogu da imaju dodatne konzervativne ili neesencijalne aminokiselinske supstitucije, koje nemaju suštinsko dejstvo na funkcije polipeptida. Da li će, ili ne, određena supstitucija biti tolerisana, tj., neće negativno uticati na željena biološka svojstva, kao što je aktivnost vezivanja, može da se odredi kao što je opisano kod Bowie, J U et al. Science 247:1306-1310 (1990) ili Padlan et al. FASEB J.9:133-139 (1995). "Konzervativna aminokiselinska supstitucija" je ona kod koje je aminokiselinska rezidua zamenjena aminokiselinskom reziduom koja ima sličan bočni lanac. Familije aminokiselinskih rezidua koje imaju slične bočne lance definisane su u stanju tehnike. Ove familije uključuju aminokiseline sa baznim bočnim lancima (npr., lizin, arginin, histidin), kiselim bočnim lancima (npr., asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nenaelektrisanim polarnim bočnim lancima (npr., asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein), nepolarnim bočnim lancima (npr., glicin, alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta-razgranatim bočnim lancima (npr., treonin, valin, izoleucin) i aromatičnim bočnim lancima (npr., tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin).

[0040] "Neesencijalna" aminokiselinska rezidua je rezidua koja može da bude izmenjena u odnosu na sekvencu divljeg tipa vezujućeg agensa, npr., antitela, bez ukidanja ili, bez suštinske izmene biološke aktivnosti, dok "esencijalna" aminokiselinska rezidua dovodi do takve promene. U antitelu, esencijalna aminokiselinska rezidua može da bude rezidua koja određuje specifičnost (SDR).

[0041] U značenju koje je ovde primenjeno, termin "izolovani" odnosi se na materijal koji je uklonjen iz svog originalnog okruženja (npr., prirodnog okruženja, ako se javlja u prirodi). Na primer, prirodni polinukleotid ili polipeptid prisutan u živoj životinji nije izolovan, ali isti polinukleotid ili DNK ili polipeptid, razdvojen od nekih ili svih koegzistirajućih materijala u prirodnom sistemu, je izolovan. Takav polinukleotid ili polipeptid može da bude deo vektora i/ili takav polinukleotid ili polipeptid može da bude deo kompozicije, npr., smeše, rastvora ili suspenzije ili da sadrži izolovanu ćeliju ili gajenu ćeliju koja sadrži polinukleotid ili polipeptid, i da i dalje bude izolovan po tome što vektor ili kompozicija nije deo svog prirodnog okruženja.

[0042] U značenju koje je ovde primenjeno, termin "replikon" odnosi se bilo koji genetski element, kao što je plazmid, hromozom ili virus, koji se ponaša kao autonomna jedinica replikacije polinukleotida u ćeliji.

[0043] U značenju koje je ovde primenjeno, termin "funkcionalno vezano" odnosi se na situaciju u kojoj su opisane komponente u odnosu koji im omogućava da funkcionišu na predviđeni način. Tako, na primer, kontrolna sekvenca "funkcionalno vezana" za kodirajuću sekvencu, vezana je na takav način da se ekspresija kodirajuće sekvence ostvaruje pod uslovima kompatibilnim sa kontrolnom sekvencom.

[0044] U značenju koje je ovde primenjeno, termin "vektor" odnosi se na replikon u kome je vezan drugi polinukleotidni segment, na taj način da dovodi do replikacije i/ili ekspresije vezanog segmenta.

[0045] U značenju koje je ovde primenjeno, termin "kontrolna sekvenca" odnosi se na polinukleotidnu sekvencu koja je neophodna za postizanje ekspresije kodirajuće sekvence sa kojom je spojena. priroda takvih kontrolnih sekvenci razlikuje se u zavisnosti od organizma-domaćina. Kod prokariota, takve kontrolne sekvence uopšteno uključuju promotor, mesto vezivanja za ribozom i terminatore i, u nekim slučajevima, pojačivače. Termin "kontrolna sekvenca" stoga je namenjen da uključuje najmanje sve komponente čije prisustvo je neophodno za ekspresiju, i takođe može da uključuje dodatne komponente čije prisustvo predstavlja prednost, na primer, liderske sekvence.

[0046] U značenju koje je ovde primenjeno, termin "prečišćeni proizvod" odnosi se na pripremu proizvoda koji je izolovan od ćelijskih konstituenata sa kojima je proizvod normalno povezan i/ili od drugih tipova ćelija koje mogu da budu prisutne u uzorku od interesa.

[0047] U značenju koje je ovde primenjeno, termin "epitop" odnosi se na proteinsku determinantu sposobnu da se specifično veže za antitelo. Epitopske determinante obično se sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupa molekula kao što su aminokiseline ili bočni lanci šećera i obično imaju specifične karakteristike trodimenzionalne strukture, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Neki epitopi su linearni epitopi, dok su drugi konformacioni epitopi. Linearni epitop je epitop u kome primarna kontinuirana aminokiselinska sekvenca sadrži prepoznati epitop. Linearni epitop tipično uključuje najmanje 3, i češće, najmanje 5, na primer, oko 8 do oko 10 kontinuiranih aminokiselina. Konformacioni epitop može da rezultuje iz najmanje dve situacije, kao što su: a) linearna sekvenca koja je izložena vezivanju antitela samo u određenim konformacijama proteina, npr., koje zavise od vezivanja liganda, ili koje zavise od modifikacija (npr., fosforilacije) signalnim molekulima; ili b) kombinacija strukturnih odlika iz više od jednog dela proteina, ili, u multisubjediničnim proteinima, iz više od jedne subjedinice, pri čemu su ove odlike dovoljno blizu u trodimenzionalnom prostoru da učestvuju u vezivanju.

[0048] U značenju koje je ovde primenjeno, "izotip" odnosi se na klasu antitela (npr., IgM, IgA, IgE ili IgG) koja je kodirana genima za konstantni region teškog lanca.

[0049] U značenju koje je ovde primenjeno, termini "detektabilni agens," "oznaka" ili "obeležen" koriste se da označe ugradnju detektabilnog markera na polipeptid ili glikoprotein. Različiti postupci obeležavanja polipeptida i glikoproteina su poznati u stanju tehnike i mogu da se koriste. Primeri oznaka za polipeptide uključuju, ali nisu ograničeni na sledeće: radioizotope ili radionuklide (npr., indijum (111In), jod (131I ili 125I), itrijum (90Y), lutecijum (177Lu), aktinijum (225Ac), bizmut (212Bi ili 213Bi), sumpor (35S), ugljenik (14C), tricijum (3H), rodijum (188Rh), tehnicijum (99 mTc), prazeodimijum, ili fosfor (32P) ili radionuklid koji emituje pozitrone, npr., ugljenik-11 (11C), kalijum-40 (40K), azot-13 (13N), kiseonik-15 (15O)9, fluor-18 (18F), galijum-68 (68Ga) i jod-121 (121I)), fluorescentne oznake (npr., FITC, rodamin, lantanid fosfor), enzimske oznake (npr., peroksidaza rena, beta-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza), hemiluminiscentne grupe, biotinil grupe (koje mogu da se detektuju obeleženim avidinom, npr., molekul koji sadrži fragment streptavidina i fluorescentni marker ili enzimsku aktivnost koja može da se detektuje optičkim ili kalorimetrijskim metodama), i unapred određene polipeptidne epitope koje prepoznaje sekundarni reporterski molekul (npr., sekvence leucinskog rajsferšlusa, vezivna mesta za sekundarna antitela, domeni za vezivanje metala, epitopske oznake). U nekim primerima izvođenja, oznake su spojene pomoću spejsera različitih dužina da bi se smanjilo potencijalno prostorno ometanje.

[0050] U značenju koje je ovde primenjeno, "specifično vezivanje", "vezuje/vezuju specifično" ili " specifičnost vezivanja" znači, za molekul anti-GCC antitela, da se molekul antitela vezuje za GCC, npr., humani GCC protein, sa većim afinitetom nego što se vezuje za protein koji nije GCC, npr., BSA. Tipično će anti-GCC molekul imati Kdza protein koji nije GCC, npr., BSA, koja je više od 2, više od 10, više od 100, više od 1000 puta, više od 10<4>, više od 10<5>, ili više od 10<6>puta veća od njegove Kdza GCC, npr., humani GCC protein. Pri određivanju Kd, određivanje Kdza GCC i za protein koji nije GCC, npr., BSA, treba da se izvede pod istim uslovima.

[0051] Termin "afinitet" ili "afinitet vezivanja" odnosi se na prividnu konstantu asocijacije ili Ka. Kaje recipročna vrednost konstante disocijacije (Kd). Antitelo može, na primer, da ima afinitet vezivanja od najmanje 105, 106, 107, 108, 109, 1010 i 1011 M-1 za određeni ciljni molekul. Veći afinitet vezivanja antitela za prvi ciljni molekul u odnosu na drugi ciljni molekul može da bude naznačen većom KA(ili manjom numeričkom vrednošću KD) za vezivanje prvog ciljnog molekula od KA(ili numeričke vrednosti KD) za vezivanje drugog ciljnog molekula. U takvim slučajevima, antitelo ima specifičnost za prvi ciljni molekul (npr., protein u prvoj konformaciji ili njenoj imitaciji) u odnosu na drugi ciljni molekul (npr., isti protein u drugoj konformaciji ili njenoj imitaciji; ili drugi protein). Razlike u afinitetu vezivanja (npr., za specifičnost ili druga poređenja) mogu da budu najmanje 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 37.5, 50, 70, 80, 91, 100, 500, 1000, ili 105 puta.

[0052] Afinitet vezivanja može da se odredi različitim metodama uključujući ravnotežnu dijalizu, ravnotežno vezivanje, gel filtraciju, ELISA metod, rezonanca površinskog plazmona 19akt cm<3>, ili spektroskopiju (npr., upotrebom fluorescentnog testa). Na primer, relativni afinitet molekula anti-GCC može da se meri pomoću ELISA merenja GCC proteina (npr., imunogen korišćen za razvijanje molekula anti-GCC antitela), pomoću FACS merenja sa ćelijama koje eksprimiraju GCC.

[0053] Primeri uslova za procenu afiniteta vezivanja su u TRIS-puferu (50mM TRIS, 150mM NaCl, 5mM CaCl2na pH 7.5). Ove tehnike mogu da se koriste za merenje koncentracije vezanog i slobodnog vezujućeg proteina u funkciji koncentracije vezujućeg proteina (ili ciljnog molekula). Koncentracija vezanog vezujućeg proteina ([Vezani]) povezana je sa koncentracijom slobodnog vezujućeg proteina ([Slobodni]) i koncentracijom vezivnih mesta za vezujući protein na ciljnom molekulu pri čemu je (N) broj vezivnih mesta po ciljnom molekulu, sledećom jednačinom:

[Vezani] = N · [Slobodni]/((1/KA) [Slobodni]).

[0054] Nije uvek neophodno precizno odrediti KA, budući da je nekad dovoljno dobiti kvantitativnu meru afiniteta, npr., određenu upotrebom metoda kao što su ELISA ili FACS analiza, koja je proporcionalna KA, i stoga može da se koristi za poređenja, kao što je određivanje da li je afinitet veći, npr., 2 puta veći, da bi se dobilo kvalitativno merenje afiniteta, ili da bi se izveo zaključak o afinitetu, npr., pomoću aktivnosti u funkcionalnom testu, npr., in vitro ili in vivo testu. Afinitet molekula anti-GCC antitela može takođe može takođe da se meri upotrebom tehnologije kao što je analiza biomolekulske interakcije u realnom vremenu (BIA) (videti, npr., Sjolander, S, i Urbaniczky, C., 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345 i Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705). U značenju koje je ovde primenjeno, "BIA" ili "rezonanca površinskog plazmona" je tehnologija za ispitivanje biospecifičnih interakcija u realnom vremenu, bez obeležavanja bilo kog od interaktivnih molekula (npr., BIACORE™). Promene mase na površini vezivanja (indikativne za događaj vezivanja) rezultuju izmenama refraktornog indeksa svetlosti blizu površine (optički fenomen rezonance površinskog plazmona (SPR)), što daje detektabilni signal koji može da se koristi kao indikacija reakcija u realnom vremenu između bioloških molekula.

[0055] Merenje afiniteta molekula anti-GCC antitela upotrebom sistema BIACORE™ T100 (GE Healthcare, Piscataway, N.J.) opisano je u primeru 1 u objavi SAD patentne prijave br. US2011/0110936. Ukratko, anti-GCC antitelo (Prep A) se razblaži do odgovarajuće koncentracije (npr., 20 µg/mL) u 10 mM natrijum acetatu, pH 4.0, i referentno/kontrolno antitelo (Prep B) se razblaži do odgovarajuće koncentracije (npr., 10 µg/mL) u 10 mM natrijum acetatu, pH 4.0. Svako antitelo je kovalentno imobilisano na nekoliko čipova CM4 BIACORE upotrebom standardnog kuplovanja amina. Za svaki pripremljeni čip CM4, Prep A antitelo je imobilisano na dve protočne ćelije pri oko 75-100 RU, dok je B antitelo imobilisano na jednoj protočnoj ćeliji pri oko 70-80 RU. Preostala četvrta protočna ćelija svakog čipa CM4 koristi se kao referentna protočna ćelija. Koncentracija GCC proteina može da se odredi upotrebom metoda detaljno opisanih kod Pace et al. u Protein Science, 4:2411 (1995), i Pace i Grimsley u Current Protocols in Protein Science 3.1.1-3.1.9 (2003). Za svaki pripremljeni čip CM4, GCC protein se injektuje tokom 2 minuta pri opsegu koncentracija od 202 nM -1.6 nM (dvostruko serijsko razblaženje) praćeno disocijacijom od 7 minuta. Uzorci se nasumično injektuju u triplikatu isprekidanih sa nekoliko ciklusa injektovanja pufera zbog dvostrukog referenciranja. Da bi se dobili podaci veće značajnosti o opadanju brzine disocijacije, sprovedena su tri dodatna injektovanja 101 nM GCC proteina i tri dodatna injektovanja pufera pri čemu je vreme injektovanja 2 minuta, a vreme disocijacije 4 časa. Brzina protoka od 100 µL/min korišćena je za sve eksperimente i sve površine su regenerisane pomoću pulsa od 20 sekundi 10 mM glicina-HCl (pH 2.0). Svi uzorci su pripremljeni u radnom puferu (npr., Hepes-puferisani slani rastvor, 0.005% polisorbat 20, pH 7.4 (HBS-P)) uz dodatak 100 µg/mL BSA. Svi podaci sa senzorgrama (grafički prikaz rezonance površinskog plazmona nasuprot vremenu) mogu da se obrade pomoću kompjuterskog programa Scrubber 2.0 (BioLogic Software, Campbell, Australija) i uopšteno uklope u model interakcije 1:1 uključujući vreme konstante kmprenosa mase upotrebom kompjuterskog programa CLAMP™ (Myszka i Morton Trends Biochem. Sci.23:149-150 (1998)).

[0056] U značenju koje je ovde primenjeno, termin "lečiti" ili "tretman" definiše se kao primena molekula anti-GCC antitela kod subjekta, npr., pacijenta, ili primena, npr., nanošenjem, na izolovano tkivo ili ćeliju subjekta koje se vraća u telo subjekta. Molekul anti-GCC antitela može da se primeni sam ili u kombinaciji sa drugim agensom. Tretman može da bude lečenje, zaceljivanje, umanjivanje, olakšavanje, izmena, ublažavanje, poboljšanje, palijacija, popravljanje ili uticanje na poremećaj, simptome poremećaja ili predispoziciju za poremećaj, npr., kancer. Bez želje za vezivanjem za neku posebnu teoriju, smatra se da lečenje uzrokuje inhibiciju, ablaciju, ili ubijanje ćelija in vitro ili in vivo, ili drugačije smanjivanje kapaciteta ćelija, npr., aberantnih ćelija, da posreduju u poremećaju, npr., poremećaju kao što je ovde opisano (npr., kancer).

[0057] U značenju koje je ovde primenjeno, termin "subjekt" namenjen je da uključuje sisare, primate, ljude i nehumane životinje. Na primer, subjekt može da bude pacijent (npr., humani pacijent ili veterinarski pacijent), koji ima kancer u kome najmanje neke od ćelija eksprimiraju GCC, kao što je kancer gastrointestinalnog porekla (npr., kolorektalni kancer, kancer želuca, kancer tankog creva, ili kancer jednjaka), kancer pankreasa, kancer pluća (npr., karcinom skvamoznih ćelija, adenoskvamozni karcinom, adenokarcinom), sarkom mekog tkiva (npr., leiosakrom ili rabdomiosarkom), neuroendokrini tumori (npr., gastrointestinalni ili bronhopulmonalni), ili neuroektodermalni tumori; simptom ovakvih kancera koji eksprimiraju GCC; ili predispoziciju za takve kancere koji eksprimiraju GCC. Kao drugi primer, subjekt može da bude pacijent koji ima gastrointestinalni poremećaj u kome najmanje neke od ćelija gastrointestinalnog sistema eksprimiraju GCC, kao što je sindrom zapaljenja debelog creva, Kronova bolest i konstipacija. Kao još jedan primer, subjekt može da bude pacijent koji ima neurološki poremećaj u kome najmanje neki neuroni u centralnom nervnom sistemu pacijenta eksprimiraju GCC, kao što je Parkinsonova bolest. Termin "nehumane životinje" prema pronalasku uključuje sve nehumane kičmenjake, npr., nehumane sisare i one koji nisu sisari, kao što su nehumani primati, ovca, pas, krava, kokoške, vodozemci, reptili, miš, pacov, kunić ili koza itd., osim ako nije drugačije navedeno. U jednom primeru izvođenja, "subjekt" isključuje jedan ili više ili sve elemente od miša, pacova, kunića ili koze.

[0058] U značenju koje je ovde primenjeno, količina molekula anti-GCC antitela "efikasna" ili "dovoljna" za lečenje poremećaja, ili "terapijski efikasna količina" ili "terapijski dovoljna količina" odnosi se na količinu molekula antitela koja je efikasna, nakon jedne ili višedozne primene kod subjekta, u lečenju ćelije, npr., kancerske ćelije (npr., tumorske ćelije koja eksprimira GCC), ili u produženom izlečenju, ublažavanju, olakšavanju ili poboljšanju kod subjekta sa poremećajem kao što je ovde opisano, iznad očekivanog u odsustvu takvog tretmana. U značenju koje je ovde primenjeno, "inhibiranje rasta" tumora ili kancera odnosi se na usporavanje, prekidanje ili zaustavljanje ili prestanak rasta i/ili metastaza, i ne označava neophodno potpunu eliminaciju tumorskog rasta.

[0059] U značenju koje je ovde primenjeno, "GCC," takođe poznat kao "STAR", "GUC2C", "GUCY2C" ili "ST receptor" protein odnosi se na sisarski GCC, poželjno humani GCC protein. Humani GCC se odnosi na protein prikazan u SEQ ID NO: 3 i prirodne alelne varijante proteina. Alel u SEQ ID NO: 3 može da bude kodiran sekvencom nukleinske kiseline za GCC prikazanom u SEQ ID NO: 2. Druge varijante su poznate u stanju tehnike. Videti, npr., pristupni broj Ensp0000261170, Ensembl baza podataka, Evropski bioinformatički institut i Institut Wellcome Trust Sanger, koji ima leucin na rezidui 281; SEQ ID NO: 14 objavljene SAD patentne prijave broj 20060035852; ili GenBank pristupni broj AAB 19934. Tipično, prirodna alelna varijanta ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, 97% ili 99% identična GCC sekvenci SEQ ID NO: 3. Transkript kodira proteinski proizvod od 1073 aminokiseline, i opisan je u GenBank pod pristupnim br.: NM_004963. GCC protein je okarakterisan kao transmembranski receptorski protein ćelijske površine, i smatra se da igra kritičnu ulogu u održavanju intestinalnog fluida, homeostaze elektrolita i ćelijske proliferacije.

Anti-GCC antitela

[0060] Ovde su opisani molekuli anti-GCC antitela korisni, između ostalog, za detekciju ekspresije GCC. Molekuli anti-GCC antitela, npr., korisni za detekciju GCC, mogu da uključuju nehumane molekule anti-GCC antitela (npr., nehumane i molekule antitela koji nisu mišjeg porekla) koji se specifično vezuju za GCC, npr., sa afinitetom vezivanja od najmanje 10<3>, 10<4>, 10<5>, 10<6>, 10<7>,10<8>, 10<9>, 1010 i 1011 M-1 za GCC. Molekul anti-GCC antitela može da bude molekul antitela koji nije humani, mišji, ni pacovski, npr., molekul anti-GCC antitela kunića, npr., kao što je ovde opisano.

[0061] U određenim aspektima, opis se odnosi na molekule anti-GCC antitela koji uključuju svojstva kao što su ona prikazana u tabelama 1 i 2. U drugim aspektima, opis se odnosi na molekule anti-GCC antitela koji uključuju svojstva kao što su ona prikazana u tabelama 3, 4, 5 i/ili 6.

[0062] U predmetnom opisu, molekul anti-GCC antitela je antitelo hibridoma kunića i predstavlja jedno od antitela MIL-44-148-2 ili MIL-44-67-4. U predmetnom opisu, molekul anti-GCC antitela potiče od antitela MIL44-148-2 ili MIL-44-67-4.

[0063] U jednom primeru izvođenja pronalaska molekul anti-GCC antitela imaće afinitet za GCC, npr., mereno direktnim vezivanjem ili testom kompetitivnog vezivanja. U predmetnom opisu molekul anti-GCC antitela ima Kdmanju od 1x10-6 M, manju od 1x10-7 M, manju od 1x10-8 M, manju od 1x10-9 M, manju od 1x10-10 M, manju od 1x10-11 M, manju od 1x10-12 M, ili manju od 1x10-13 M. U predmetnom opisu molekul antitela je IgG, ili njegov antigen-vezujući fragment, i ima Kdmanju od 1x10-6 M, manju od 1x10-7 M, manju od 1x10-8 M, ili manju od 1x10-9 M. U predmetnom opisu, molekul anti-GCC antitela, npr., MIL-44-148-2 antitelo ili antitelo koje potiče od njega ima Kdod oko 80 do oko 200 pM, poželjno oko 100 do oko 150 pM ili oko 120 pM. U predmetnom opisu, molekul anti-GCC antitela, npr., MIL-44-148-2 antitelo ili antitelo koje potiče od njega ima k -1

aod oko 0.9 do oko 1.25x105 M-1 s , poželjno oko 1.1x10<5>M<-1>s<-1>. U predmetnom opisu molekul antitela je ScFv i ima Kdmanju od 1x10-6 M, manju od 1x10-7 M, manju od 1x10-8 M, manju od 1x10-9 M, manju od 1x10-10 M, 1x10-11 M, manju od 1x10-12 M, ili manju od 1x10-13 M.

[0064] U predmetnom opisu, molekuli antitela nisu imunokonjugati, tj., oni su "goli" i u predmetnom opisu dovode do ćelijske reakcije po vezivanju za GCC. U vezi sa predmetnim opisom, ćelijsku reakciju sprovodi ćelija koja eksprimira GCC za koju se antitelo vezuje. Takva ćelijska reakcija može da bude signalna transdukcija posredovana pomoću GCC, npr., ako je molekul antitela agonist GCC (videti, npr., objavu SAD patentne prijave br. US20040258687). U predmetnom opisu, ćelijsku reakciju sprovodi druga ćelija, npr., imuno-efektorska ćelija (npr., ćelija prirodni ubica) koja prepoznaje molekul antitela vezan za GCC na prvoj ćeliji. U predmetnom opisu, molekuli koji vrše nadzor, npr., molekuli komplementa, dolaze u kontakt sa GCC-vezanim molekulom antitela pre ćelijske reakcije. Ćelijske reakcije u ovom opisu mogu da izazovu smrt ćelije koja eksprimira GCC.

[0065] U predmetnom opisu, molekuli antitela koji su imunokonjugati mogu da izazovu i ćelijsku reakciju po vezivanju za GCC i da internalizuju kako bi dostavili agens ćeliji koja eksprimira GCC za koju se on vezuje.

[0066] U predmetnom opisu, molekul anti-GCC antitela opisa može da blokira vezivanje liganda za GCC.

[0067] U predmetnom opisu, molekul antitela nije GCC:B10, GCC:4D7 ili GCC:C8. U predmetnom opisu, molekul anti-GCC antitela ne vezuje intracelularni domen GCC, oko aminokiselinske rezidue 455 do 1073 u SEQ ID NO: 3. Na primer, u predmetnom opisu, molekul anti-GCC antitela ne vezuje kinaza-homologi domen ili guanilil ciklazni domen u GCC.

[0068] Strukturna jedinica prirodnog antitela sisara predstavljena je tetramerom. Svaki tetramer se sastoji od dva para polipeptidnih lanaca, pri čemu svaki par ima jedan "laki" (oko 25 kDa) i jedan "teški" lanac (oko 50-70 kDa). Amino-terminalni deo svakog lanca uključuje varijabilni region od oko 100 do 110 ili više aminokiselina prvenstveno odgovornih za prepoznavanje antigena. Karboksi-terminalni deo svakog lanca definiše konstantni region prvenstveno odgovoran za efektorsku funkciju. Humani laki lanci mogu da budu klasifikovani kao kapa i lambda laki lanci. Teški lanci mogu da budu klasifikovani kao mi, delta, gama, alfa, ili epsilon, i definišu izotip antitela kao IgM, IgD, IgG, IgA, i IgE, redom. Unutar lakih i teških lanaca, varijabilni i konstantni regioni spojeni su "J" regionom od oko 12 ili više aminokiselina, sa teškim lancem koji takođe uključuje "D" region od oko još 10 aminokiselina. Videti uopšteno, Fundamental Immunology Ch.7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Varijabilni regioni svakog para laki/teški lanac obrazuju vezivno mesto antitela. Poželjni izotipovi za molekule anti-GCC antitela su IgG imunoglobulini, koji mogu da budu klasifikovani u četiri podklase, IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4, koje imaju različite gama teške lance. Većina terapijskih antitela su humana, himerna, ili humanizovana antitela izotipa IgG1. U predmetnom opisu, molekul anti-GCC antitela je IgG antitelo kunića.

[0069] Varijabilni regioni svakog para teškog i lakog lanca obrazuju antigen-vezujuće mesto. Tako, intaktno IgG antitelo ima dva vezivna mesta koja su ista. Međutim, bifunkcionalna ili bispecifična antitela su veštački hibridni konstrukti koji imaju dva različita para teški/laki lanac, što rezultuje postojanjem dva različita vezivna mesta.

[0070] Svi lanci ispoljavaju istu opštu strukturu relativno očuvanih okvirnih regiona (FR) spojenih pomoću tri hipervarijabilna regiona, takođe nazvana regioni koji određuju komplementarnost ili CDR. CDR iz dva lanca svakog para su poravnati okvirnim regionima, što omogućava vezivanje za specifični epitop. Od N-terminusa ka C-terminusu, i laki i teški lanci sadrže domene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Dodeljivanje aminokiselina svakom domenu je u skladu sa definicijama autora Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 i 1991)), ili Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989). U značenju koje je ovde primenjeno, CDR su označeni za svaki od teških (HCDR1, HCDR2, HCDR3) i lakih (LCDR1, LCDR2, LCDR3) lanaca.

[0071] Molekul anti-GCC antitela može da sadrži sve, ili antigen-vezujući podset CDR, jednog ili oba, teškog i lakog lanca, jednog od gore navedenih antitela kunića. Aminokiselinske sekvence antitela hibridoma kunića, koje uključuju varijabilne regione i CDR regione, mogu da se nađu u tabeli 3 i tabeli 5.

[0072] Tako, molekul antitela predmetnog opisa uključuje jedno ili oba od:

(a) jednog, dva, tri, ili antigen-vezujućeg broja, CDR regiona lakog lanca (LCDR1, LCDR2 i/ili LCDR3) jednog od gore navedenih antitela hibridoma kunića. U predmetnom opisu CDR region/regioni mogu da sadrže aminokiselinsku sekvencu jednog ili više ili svih LCDR1-3 kao što sledi: LCDR1, ili modifikovani LCDR1 u kome su jedna do sedam aminokiselina konzervativno supstituisane) LCDR2, ili modifikovani LCDR2 u kome su jedna ili dve aminokiseline konzervativno supstituisane); ili LCDR3, ili modifikovani LCDR3 u kome su jedna ili dve aminokiseline konzervativno supstituisane; i

(b) jednog, dva, tri, ili antigen-vezujućeg broja, CDR regiona teškog lanca (HCDR1, HCDR2 i/ili HCDR3) jednog od gore navedenih antitela hibridoma kunića. U predmetnom opisu CDR region/regioni mogu da sadrže aminokiselinsku sekvencu jednog ili više ili svih HCDR1-3 kao što sledi: HCDR1, ili modifikovani HCDR1 u kome su jedna ili dve aminokiseline konzervativno supstituisane; HCDR2, ili modifikovani HCDR2 u kome su jedna do četiri aminokiseline konzervativno supstituisane; ili HCDR3, ili modifikovani HCDR3 u kome su jedna ili dve aminokiseline konzervativno supstituisane.

[0073] Korisni imunogeni za proizvodnju molekula anti-GCC antitela uključuju ćelije koje eksprimiraju GCC npr., humani GCC (npr., tumorska ćelijska linija, npr., T84 ćelije, ili sveže ili zamrznute ćelije tumora debelog creva, rekombinantne ćelije koje eksprimiraju GCC); membranske frakcije ćelija koje eksprimiraju GCC (npr., ćelijska linija tumora debelog creva, npr., T84 ćelije), ili sveže ili zamrznute ćelije tumora debelog creva; rekombinantne ćelije koje eksprimiraju GCC; izolovani ili prečišćeni GCC, npr., humani GCC protein (npr., biohemijski izolovani GCC, npr., izolovan iz ćelija gastrointestinalnog tumora ili rekombinantnih ćelija koje eksprimiraju GCC ili njegovu varijantu), ili njegov deo (npr., ekstracelularni domen GCC, kinaza-homologi domen GCC ili guanilil ciklazni katalitički domen GCC ili peptid koji odgovara njegovom delu, npr., koji sadrži najmanje oko 8, 10, 12, 14, 16, 20, 24, 28 ili 32 aminokiselinskih rezidua iz SEQ ID NO: 3); ili imunogen koji sadrži SEQ ID NO: 46 ili koji sadrži njegov zreli deo bez signalne sekvence (tj., bez aminokiselinskih rezidua 1 do oko 21 ili 23 iz SEQ ID NO: 46), npr., zreli hGCC(ECD)-mIgG2a FcR r-mutII (takođe ovde označen kao "pLKTOK108") protein, SEQ ID NO: 48.

[0074] Imunogeni mogu da budu fuzionisani sa heterologim sekvencama da bi se olakšale biohemijska manipulacija, prečišćavanje, imunizacija ili merenje titra antitela. Takvi imunogeni mogu da sadrže deo GCC, npr., ekstracelularni domen, i deo koji sadrži polipeptid koji nije GCC. Postoje mnoge opcije za konstruisanje fuzionog proteina za olakšavanje prečišćavanja ili imobilizaciju na čvrstoj podlozi, npr., afinitetna kolona ili mikrotitar ploča ili drugi supstrat/čip pogodan za test. Na primer, fuzioni fragment može da doda domen, npr., glutation-S-transferazu/kinazu (GST), koji može da veže glutation; Fc region imunoglobulina, koji može da se veže za protein A ili protein G; aminokiselinske rezidue, npr., dve, tri, četiri, pet, poželjno šest histidinskih rezidua koje mogu da vežu nikl ili kobalt na afinitetnoj koloni; epitopsku oznaku, npr., deo c-myc onkogena (myc-tag), FLAG oznaku (SAD pat. br. 4,703,004), hemaglutininsku (HA) oznaku, T7 gen 10 oznaku, V5 oznaku, HSV oznaku, ili VSV-G oznaku koja može da veže antitelo specifično za oznaku; ili kofaktor, npr., biotin, koji može da veže streptavidin.

[0075] Imunogeni koji sadrže Fc deo imunoglobulina mogu da zadrže GCC, ili u rastvoru ili vezan za ćeliju, u konfiguraciji koja omogućava strukturni pristup komponente imunog nadzora domaćina GCC epitopima za efikasno stvaranje antitela. Imunogeni koji nastaju fuzijom sa Fc regionima su dimeri, jer se imunoglobulinski teški lanci koji sadrži Fc regione udružuju u dimere preko međulančanih disulfidnih veza. Valenca fuzionih proteina može da odražava tip imunoglobulina koji daje Fc region. Na primer, fuzije sa IgG proteinima mogu da budu dimeri, IgA fuzije mogu da naprave tetramerne imunogene, i IgM fuzije mogu da naprave dekamerne imunogene, pri čemu su poslednja dva olakšana ko-transfekcijom sa J lancem. Primer imunoglobulina za Fc fuzioni protein je IgG1. Upotrebljeni deo tipično ima zglobni, CH2 i CH3 domene IgG1 kodirane jednim egzonom. Budući da ovaj egzon takođe ima deo CH1 regiona, koji ima cistein orjentisan ka disulfidnom vezivanju sa cisteinom iz lakog lanca, korisna modifikacija predstavlja mutaciju cisteina u CH1, npr., u serin, da bi se osiguralo da nema nesparenih cisteina u fuzionom proteinu. Takva mutacija takođe povećava fleksibilnost zgloba.

[0076] Fc deo koji potiče od vrsta koje nisu domaćini, npr., Fc region humanog Ig, za fuzionisanje sa imunogenom za imunizaciju vrste-domaćina, npr., miša, pacova, kunića, koze, deluje kao adjuvans. Ova funkcija adjuvansa može da pokrene specifična antitela protiv Fc, kao i GCC epitopa.

Fc-reaktivna antitela mogu da budu identifikovana i odbačena tokom skrininga. Fc deo može da ima sekvencu divljeg tipa ili sekvencu koja je mutirana tako da modifikuje efektorsku funkciju. Na primer, mutirani konstantni region (varijanta) može da bude ugrađen u fuzioni protein da smanji vezivanje za Fc receptore i/ili sposobnost fiksacije komplementa (videti npr. Winter et al, GB 2,209,757 B; Morrison et al., WO 89/07142; Morgan et al., WO 94/29351). U poželjnom primeru, lizin 235 i glicin 237, numerisani prema standardima za Fc region, su mutirani, npr., u alanin. Imunogen/fuzioni protein sa Fc-mutiranim IgG mogu da imaju redukovanu interakciju sa Fc receptorima domaćina. Poželjni rastvorljivi imunogeni fuzioni protein (nakon sazrevanja isecanjem signalnog peptida i sekrecije) je hGCC(ECD)-mIgG2a FcR r-mutII (pLKTOK108), koji se sastoji od aminokiselinskih rezidua 24 do 430 u SEQ ID NO: 3 fuzionisanih sa mutiranim imunoglobulinskim Fc mišjeg IgG2a (zajedno SEQ ID NO:48).

[0077] Za pripremu imunogen eksprimiran u ćeliji, imunoglobulinski deo može da bude strukturiran tako da imitira imunoglobulinski deo B-ćelijskog receptora. Na primer, imunoglobulinski Fc region može dodatno da bude fuzionisan sa polipeptidom koji sadrži transmembranski region imunog receptora, kao što su Fcγ receptori, Fcα receptori, Fcα/m receptor ili Fcε receptori. Ispravna orjentacija takvog Fc receptora ćelijski-vezanog imunogena sa odgovarajućom izloženošću na površini ćelije može da se poboljša ako ćelija koja eksprimira imunogeni fuzioni protein dalje sadrži dodatne komponente antigen-receptorskog kompleksa, npr., B-ćelijski IgM receptor ili IgD receptor. Pogodne komponente kompleksa uključuju imunoglobulinske (Ig) proteine omotača, kao što su MB-1 i B29 (CD79A i CD79B; Hombach et al. Eur. J. Immunol.20:2795-2799 (1990) za IgM receptor), koji obrazuju heterodimer. Proteini omotača Ig mogu da budu obezbeđeni endogeno putem transfekcije ćelija, npr., ako se transficira ćelijska linija B-ćelijskog limfoma; ili putem kotransfekcije imunogenom i proteinima omotača, npr., u posebnim vektorima ili u istom vektoru.

[0078] Korisni epitopi, npr., referentni epitopi, iz molekula GCC, sa kojima molekuli anti-GCC antitela, npr., monoklonska antitela kunića, ili njihove humanizovane verzije, kao što je ovde opisano, mogu da se vežu, mogu da se nađu na ekstracelularnom delu GCC. Takvi GCC epitopi mogu da vežu molekule antitela na površini ćelija, npr., na ćelijskoj spoljašnjosti.

[0079] Na primer, epitop za molekul anti-GCC antitela može da se nalazi unutar, ili da uključuje reziduu/rezidue od rezidue 1-50 u SEQ ID NO: 3, ili njegov fragment koji vezuje molekul anti-GCC antitela prema opisu, npr., njegov MIL-44-148-2-vezujući fragment. Takvi fragmenti mogu da sadrže rezidue 1-25, 5-30, 10-35, 15-40, 20-45, 25-50, 5-45, 10-40, 15-35, 20-30 ili 33-50 of SEQ ID NO: 3. U predmetnom opisu, epitop za molekul anti-GCC antitela, npr., a MIL-44-148-2 antitelo, je konformacioni epitop, koji dodatno sadrži jednu ili više dodatnih aminokiselinskih rezidua u aminokiselinskoj sekvenci GCC iza rezidue 50, tj., odabrano od oko rezidue 50 do 1073 u SEQ ID NO: 3.

[0080] Antitela koja su razvijena protiv takvih epitopa ili ekstracelularnog domena, npr., epitopa koji se nalaze unutar, ili uključuju reziduu/rezidue od aminokiselinskih rezidua 24 do 420 u SEQ ID NO: 3, ili njihov referentni deo, npr., rezidue 24 do 75, 75 do 150, 150 do 225, 225 do 300, 300 do 375 ili 375 do 420 of GCC, ili molekuli antitela koji potiču od njih, mogu da budu korisni kao terapeutici ili dijagnostička antitela, kao što je ovde opisano.

[0081] U predmetnom opisu, molekul anti-GCC antitela ima jedno ili više od sledećih svojstava:

a) kompetira za vezivanje, npr., vezivanje za GCC ćelijske površine ili prečišćeni GCC, sa jednim od gore navedenih molekula anti-GCC antitela prikazanih u tabelama 1 i 2 npr., antitelima hibridoma kunića (npr., MIL-44-148-2);

b) vezuje se za isti, ili suštinski isti, epitop na GCC kao jedan od gore navedenih molekula anti-GCC antitela prikazanih u tabelama 1 i 2, npr., npr., antitela hibridoma kunića (npr., MIL-44-148-2). U opisu, antitelo se vezuje za isti epitop, određeno pomoću jednog ili više peptidnih testova na mikro-čipovima ili vezivanjem za skraćene mutante, himere ili tačkaste mutante eksprimirane na površini ćelije ili membranskim preparatima, npr., kao što su testovi koji su ovde opisani;

c) vezuje se za epitop koji ima najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 8, 10, 15 ili 20 kontinuiranih aminokiselinskih rezidua zajedničkih sa epitopom jednog od gore navedenih molekula anti-GCC antitela prikazanih u tabelama 1 i 2, npr., antitela hibridoma kunića (npr., MIL-44-148-2);

d) vezuje region humanog GCC koji je vezan sa anti-GCC antitelom pronalaska, pri čemu region npr., ekstracelularni ili citoplazmatski region, ima dužinu od 10-15, 10-20, 20-30, ili 20-40 rezidua, i vezivanje se određuje, npr., vezivanjem za skraćene mutante; u predmetnom opisu molekul anti-GCC antitela vezuje ekstracelularni region humanog GCC. U predmetnom opisu molekul anti-GCC antitela može da veže deo ekstracelularnog domena humanog GCC definisan aminokiselinskim reziduama 24 do 420 u SEQ ID NO: 3. U predmetnom opisu molekul anti-GCC antitela može da veže karakteristično mesto guanilat ciklaze na aminokiselinskim reziduama 931 do 954 u SEQ ID NO: 3; ili

e) vezuje ovde opisani referentni epitop.

[0082] U predmetnom opisu molekul anti-GCC antitela vezuje GCC sekvencu ILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLS (SEQ ID NO: 8).

[0083] U predmetnom opisu molekul anti-GCC antitela vezuje GCC sekvencu FAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDV (SEQ ID NO: 9).

[0084] U predmetnom opisu molekul antitela vezuje konformacioni epitop. U drugoj varijanti predmetnog opisa molekul antitela vezuje linearni epitop.

[0085] Molekuli anti-GCC antitela mogu da budu poliklonska antitela, monoklonska antitela, monospecifična antitela, himerna antitela (Videti SAD pat. br. 6,020,153) ili humanizovana antitela ili fragmenti antitela ili njihovi derivati. Sintetske i genetski konstruisane varijante (videti SAD pat. br. 6,331,415) bilo čega od gore navedenog su takođe obuhvaćene predmetnim opisom. Monoklonska antitela mogu da budu proizvedena različitim tehnikama, uključujući uobičajenu metodologiju mišjeg monoklonskog antitela (npr., standardna tehnika hibridizacije somatskih ćelija autora Kohler i Milstein, Nature 256: 495 (1975); videti uopšteno, Harlow, E. i Lane, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y), i tehnologiju monoklonskog antitela kunića i servise koje obezbeđuje Epitomics (Burlingame, CA), koji proizvode naručena monoklonska antitela kunića (RabMAbs®) upotrebom hibridoma kunićkunić stvorenih fuzijom izolovanih B-ćelija iz imunizovanih kunića sa ćelijskom linijom koja je fuzioni partner, u vlasništvu kompanije Epitomics, kao što je opisano u SAD patentima 7,402,409, 7,429,487, 7,462,697, 7,575,896, 7,732,168, i 8,062,867.

[0086] Imunizacija proteinom, npr., GCC ili rastvorljivim delom, ili fuzionim proteinom koji sadrži deo GCC (npr., hGCC(ECD)-mIgG2a FcRbr-mutII (pLKTOK108), ili ćelijama ili njihovim membranskim frakcijama, npr., ćelijama koje eksprimiraju površinski izložen GCC ili njegov deo (npr., proizvod pLKTOK4), može da bude izvedena pomoću imunogena pripremljenog za injektovanje na način koji indukuje odgovor, npr., sa adjuvansom, npr., kompletnim Freundovim adjuvansom. Drugi pogodno adjuvansi uključuju, Titermax Gold<®>adjuvans (CYTRX Corporation, Los Angeles, Calif.) i alum. Mali peptidni imunogeni mogu da budu vezani za veći molekul, kao što je hemocijanin puža. Miševi ili kunići mogu da budu injektovani na brojne načine, npr., subkutano, intravenski ili intramuskularno na brojnim mestima, npr., u peritoneum (i.p.), osnovu repa, ili jastuče šape, ili u kombinaciju mesta, npr., iP i u osnovu repa (BIP). Buster injekcije mogu da uključuju isti ili drugačiji imunogen i mogu dodatno da uključuju adjuvans, npr., nekompletni Freundov adjuvans. Imunizacija sa DNK, npr., DNK koja kodira GCC ili njegov deo ili fuzioni protein koji sadrži GCC ili njegov deo (npr., koja kodira hGCC(ECD)-mIgG2a FcRbr-mutII) može da bude ostvarena injektovanjem upotrebom tehnologije genskog pištolja. Na primer, DNK nanosi na mikroskopske zlatne čestice i injektuje u miševe ili kuniće u čestim intervalima tokom kratkog perioda.

[0087] Uopšteno, kada je poželjno monoklonsko antitelo, proizvodi se hibridom fuzijom pogodne ćelije iz besmrtne ćelijske linije (npr., ćelijska linija mijeloma kao što je SP2/0, P3X63Ag8.653 ili heteromijeloma) sa ćelijama koje proizvode antitelo. Ćelije koje proizvode antitelo mogu da se dobiju iz periferne krvi ili, poželjno slezine ili limfnih čvorova, ljudi, transgenih životinja za humano antitelo ili drugih pogodnih životinja (npr., kunića) imunizovanih antigenom od interesa. Ćelije koje proizvode antitela humanog porekla (npr., humano antitelo) mogu da budu proizvedene upotrebom pogodnih postupaka, na primer, fuzijom humanih ćelija koje proizvode antitelo i heteromijeloma ili trioma, ili imortalizacijom aktiviranih humanih B ćelija putem infekcije virusom Epštajn-Bar. (Videti, npr., SAD pat. br.6,197,582 (Trakht); Niedbala et al., Hybridoma, 17:299-304 (1998); Zanella et al., J Immunol Methods, 156:205-215 (1992); Gustafsson et al., Hum Antibodies Hybridomas, 2:26-32 (1991).) Fuzionisane ili imortalizovane ćelije koje proizvode antitelo (hibridomi) mogu da budu izolovane upotrebom selektivnih uslova kultivisanja, i klonirane postupkom graničnih razblaženja. Ćelije koje proizvode antitela željene specifičnosti mogu da budu identifikovane upotrebom pogodnog testa (npr., ELISA (npr., sa imunogenom, npr., hGCC(ECD)-mIgG2a FcRbr-mutII, imobilisanim u bunarčiću mikrotitarske ploče) ili FACS analizom ćelije koja eksprimira GCC ili njen deo, npr., ćelije koja eksprimira proizvod pLKTOK4). Na primer, ako GCC-imunogen sadrži fuzioni fragment koji je afinitetni reagens, ovaj fragment može da omogući fuziju proteina koji sadrži GCC ili njegov deo tako da bude vezan za matricu, npr., proteinom G obložene, streptavidinom obložene, glutationom derivatizovane ili antitelom obložene mikrotitarske ploče ili čipove za test, koji se zatim kombinuju sa imunim serumom ili kondicioniranim medijumom za hibridom ili rekombinantnu ćeliju koja eksprimira antitelo, i smeša se inkubira pod uslovima koji dovode do obrazovanja kompleksa (npr., pod fiziološkim uslovima u pogledu soli i pH). Nakon inkubacije, ćelije u bunarčiću mikrotitarske ploče ili na čipu ćelije se peru da bi se uklonile nevezane komponente i meri se vezivanje anti-GCC antitela.

[0088] U predmetnom opisu, za terapijske primene, antitela predmetnog opisa su humanizovana antitela. Prednost humanizovanih antitela je to što ona potencijalno smanjuju ili otklanjaju imunogenost antitela u primaocu, dozvoljavajući tako povećanje biološke raspoloživosti i smanjenje mogućnosti neželjene imune reakcije, i na taj način potencijalno omogućavaju višestruke primene antitela.

[0089] Modifikovana antitela uključuju humanizovana, himerna ili CDR-graftovana antitela. Odgovori na humano anti-mišje antitelo (HAMA) vodili su razvoju himernih ili drugačije humanizovanih antitela. Iako himerna antitela imaju humani konstantni region i nehumani varijabilni region, očekivano je da će doći do pojave određenih odgovora u vidu humanog antihimernog antitela (HACA), posebno pri hroničnim i višedoznim upotrebama antitela. Prisustvo takvih proteina koji nisu humanog porekla (npr., mišji, pacovski, proteini kunića, ovce ili koze) može da vodi brzom klirensu antitela ili može da vodi stvaranju imunog odgovora protiv antitela kod pacijenta. Kako bi se izbegla upotreba antitela nehumanog porekla, razvijena su humanizovana antitela kod kojih su sekvence uvedene u sekvencu antitela da bi se učinila bližim sekvenci humanog antitela, ili potpuno humana antitela stvorena uvođenjem funkcije humanog antitela u nehumane vrste, kao što su miš, pacov, kunić, ovca ili koza, tako da bi nehumane vrste proizvodile antitela koja imaju potpuno humane sekvence. Humana antitela omogućavaju da se izbegnu određeni problemi povezani sa antitelima koja imaju varijabilne i/ili konstantne regione kunića, glodara, ovce ili koze.

Humanizacija i tehnologije prikaza i modifikacije antitela

[0090] Humanizovani molekuli antitela mogu da umanje imunogene i alergijske odgovore svojstvene nehumanim ili mAb koja imaju nehumano poreklo i da na taj način povećaju efikasnost i bezbednost primenjenih antitela. Upotreba humanizovanih molekula antitela može da obezbedi suštinsku prednost u lečenju hroničnih i rekurentnih humanih bolesti kao što su zapaljenje, autoimunitet i kancer, koje zahtevaju ponovljene primene antitela.

[0091] Proizvodnja humanizovanih antitela sa smanjenom imunogenošću može da se ostvari u spoju sa tehnikama humanizacije i tehnikama prikaza upotrebom odgovarajućih biblioteka. Jasno je da antitela nehumanih vrsta, kao što su miševi, pacovi, kunići, ovce, koze, itd., mogu da budu humanizovana ili primatizovana upotrebom tehnika poznatih u ovoj oblasti. Videti npr., Winter i Harris Immunol Today 14:43-46 (1993) i Wright et al. Crit. Reviews in Immunol. 12125-168 (1992). Antitelo od interesa može da se konstruiše pomoću tehnika rekombinantne DNK da bi se zamenili CH1, CH2, CH3, domeni zglobnog regiona, i/ili domen okvirnog regiona odgovarajućom humanom sekvencom (videti WO 92/02190 i SAD pat. br. 5,530,101, 5,585,089, 5,693,761, 5,693,792, 5,714,350, i 5,777,085). Takođe, upotreba Ig cDNK za konstruisanje himernih imunoglobulinskih gena poznata je u stanju tehnike (Liu et al. Proc Natl Acad Sci USA. 84:3439 (1987) i J. Immunol. 139:3521 (1987)). Iz hibridoma ili drugih ćelija koje proizvode antitelo izdvaja se iRNK i koristi za proizvodnju cDNK: cDNK od interesa može da se umnoži lančanom reakcijom polimeraze upotrebom specifičnih prajmera (SAD pat. br.4,683,195 i 4,683,202).

[0092] Alternativno, tehnologija prikaza na fagu (videti, npr., McCafferty et al, Nature, 348:552-553 (1990)) može da se koristi za proizvodnju humanog antitela ili antitela iz drugih vrsta, kao i fragmenata antitela in vitro, iz gena imunoglobulinskog varijabilnog (V) domena, npr., iz repertoara poreklom od neimunizovanih donora. Prema ovoj tehnici, geni V domena antitela kloniraju se u okviru čitanja u gen velikog ili u malog proteina omotača filamentoznog bakteriofaga, kao što je M13 ili fd, i ispoljavaju kao funkcionalni fragmenti antitela na površini čestice faga. Budući da filamentozna čestica sadrži kopiju jednolančane DNK fagnog genoma, selekcije na osnovu funkcionalnih svojstava antitela takođe rezultuje selekcijom gena koji kodira antitelo koje ispoljava ova svojstva. Tako, fag imitira neke od svojstava B ćelija. Prikaz na fagu može da se izvede u različitim formatima; za njihov pregled videti, npr., Johnson i Chiswell, Current Opinion in Structural Biology, 3:564-571 (1993). Nekoliko izvora segmenata V-gena mogu da se koriste za prikaz na fagu. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) su izolovali raznovrstan niz antioksazolonskih antitela iz male nasumične kombinatorne biblioteka V gena poreklom iz slezine imunizovanih miševa. Repertoar V gena iz neimunizovanih humanih donora može da se konstruiše i antitela na raznovrstan niz antigena (uključujući sopstvene antigene) mogu da budu izolovana suštinskim sprovođenjem tehnika opisanih kod Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), ili Griffith et al, EMBO J., 12:725-734 (1993). Videti, takođe, SAD pat. br. 5,565,332 i 5,573,905. Biblioteke prikaza mogu da sadrže antitela ili antigen-vezujuće fragmente antitela koja sadrže veštačke aminokiselinske sekvence. Na primer, biblioteka može da sadrži Fab fragmente koji sadrže veštačke CDR (npr., nasumične aminokiselinske sekvence) i humane okvirne regione. (Videti, na primer, SAD pat. br.6,300,064 (Knappik, et al.).)

[0093] Sekvence gena humanog konstantnog regiona mogu se naći kod Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, N.I.H. publication no. 91-3242. Geni humanog C regiona su lako dostupni iz poznatih klonova. Izbor izotipa biće vođen željenim efektorskim funkcijama, kao što je fiksacija komplementa, ili aktivnost u antitelo-zavisnoj ćelijskoj citotoksičnosti. Izotipovi mogu da budu IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4. U predmetnom opisu, molekuli antitela opisa su IgG1 i IgG2. Može da se koristi bilo koji od konstantnih regiona humanog lakog lanca, kapa ili lambda. Himerno, humanizovano antitelo se zatim eksprimira uobičajenim postupcima.

[0094] U predmetnom opisu, molekul anti-GCC antitela opisa može da privuče antitelo-zavisnu ćelijsku citotoksičnost (ADCC) ka ćeliji koja eksprimira GCC, npr., tumorskoj ćeliji. Antitela sa izotipovima IgG1 i IgG3 su korisna za izazivanje efektorske funkcije u antitelo-zavisnom citotoksičnom kapacitetu, zahvaljujući svojoj sposobnosti da se vežu za Fc receptor. Antitela sa izotipovima IgG2 i IgG4 su korisna u smanjenju ADCC odgovora zbog njihove niske sposobnosti da se vežu za Fc receptor. U predmetnom opisu supstitucije u Fc regionu ili izmene glikozilacije kompozicije antitela, npr., rastom u modifikovanim eukariotskim ćelijskim linijama, mogu da budu učinjene da bi se poboljšala sposobnost Fc receptora da prepozna, veže i/ili posreduje u citotoksičnosti ćelija za koje se anti-GCC antitela vezuju (videti, npr., SAD pat. br. 7,317,091, 5,624,821 i publikacije uključujući WO 00/42072, Shields, et al. J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001), Lazar et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103:4005-4010 (2006), Satoh et al. Expert Opin Biol. Ther. 6:1161-1173 (2006)). U predmetnom opisu, antitelo ili antigen-vezujući fragment (npr., antitelo humanog porekla, humano antitelo) može da uključuje aminokiselinske supstitucije ili zamene koje menjaju ili stvaraju funkciju (npr., efektorsku funkciju). Na primer, konstantni region humanog porekla (npr., γ1 konstantni region, γ2 konstantni region) mogu da budu konstruisani da smanje aktivaciju komplementa i/ili vezivanje Fc receptora. (Videti, na primer, SAD pat. br.

5,648,260 (Winter et al.), 5,624,821 (Winter et al.) i 5,834,597 (Tso et al.). Poželjno, aminokiselinska sekvenca konstantnog regiona humanog porekla koja sadrži takve aminokiselinske supstitucije ili zamene je najmanje oko 95% identična po celoj dužini aminokiselinskoj sekvenci neizmenjenog konstantnog regiona humanog porekla, poželjnije najmanje oko 99% identična po celoj dužini aminokiselinskoj sekvenci neizmenjenog konstantnog regiona humanog porekla.

[0095] U predmetnom opisu, efektorske funkcije mogu takođe da budu izmenjene moduliranjem obrasca glikozilacije antitela. Pod izmenom se misli na ukidanje jednog ili više fragmenata ugljenih hidrata koji se nalaze u antitelu, i/ili dodavanje jednog ili više glikozilacionih mesta koja nisu prisutna u antitelu. Na primer, antitela sa poboljšanim ADCC aktivnostima sa zrelom strukturom ugljenih hidrata kojoj nedostaje fukoza vezana za Fc region antitela opisana su u objavi SAD patentne prijave br. 2003/0157108 (Presta). Videti takođe objavu SAD patentne prijave br.

2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Glycofi je takođe razvio ćelijske linije kvasca sposobne da proizvedu specifične glikoforme antitela.

[0096] Dodatno ili alternativno, može da bude napravljeno antitelo koje ima izmenjen tip glikozilacije, kao što je hipofukozilisano antitelo koje ima smanjene količine fukozilnih rezidua ili antitelo koje ima povećane račvaste GlcNac strukture. Pokazano je da ovakvi izmenjeni obrasci glikozilacije povećavaju sposobnost ADCC reakcija antitela. Takve modifikacije ugljenih hidrata mogu da budu ostvarene, na primer, eksprimiranjem antitela u ćeliji-domaćinu sa izmenjenom glikozilacionom mašinerijom. Ćelije sa izmenjenom glikozilacionom mašinerijom su opisane u stanju tehnike i mogu da se koriste ćelije-domaćini koje su konstruisane da eksprimiraju rekombinantna antitela opisa da tako proizvode antitelo sa izmenjenom glikozilacijom. Na primer, EP 1,176,195 autora Hang et al. opisuje ćelijsku liniju sa funkcionalno narušenim FUT8 genom, koji kodira fukozil transferazu, tako da antitela eksprimirana u takvoj ćelijskoj liniji ispoljavaju hipofukozilaciju. PCT objava WO 03/035835 autora Presta opisuje varijantu CHO ćelijske linije, Lec13 ćelije, sa smanjenom sposobnošću da vežu fukozu za Asn(297)-vezane ugljene hidrate, što takođe rezultuje hipofukozilacijom antitela eksprimiranog u toj ćeliji-domaćinu (videti takođe Shields, R. L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740). PCT objava WO 99/54342 autora Umana et al. opisuje ćelijske linije konstruisane da eksprimiraju glikoprotein-modifikujuće glikozil transferaze (npr., beta(1,4)-N acetilglukozaminiltransferaza III (GnTIII)) tako da antitela eksprimirana u konstruisanim ćelijskim linijama ispoljavaju povećanje račvastih GlcNac struktura što rezultuje povećanom ADCC aktivnošću antitela (videti takođe Umana et al., 1999 Nat. Biotech.

17:176-180).

[0097] Humanizovana antitela mogu takođe da se naprave upotrebom pristupa kalemljenja CDR. Tehnike stvaranja takvih humanizovanih antitela su poznate u stanju tehnike. Uopšteno, humanizovana antitela se proizvode dobijanjem sekvenci nukleinske kiseline koje kodiraju sekvence varijabilnog teškog i varijabilnog lakog regiona antitela koje se vezuje za GCC, identifikovanjem regiona koji određuje komplementarnost ili "CDR" u sekvencama varijabilnog teškog i varijabilnog lakog regiona i kalemljenja CDR sekvenci nukleinske kiseline na humane sekvence nukleinske kiseline okvirnog regiona. (Videti, na primer, SAD pat. br.4,816,567 i 5,225,539). Položaji rezidua CDR i okvirnog regiona mogu da budu određeni (videti, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health i Human Services, NIH objava br. 91-3242, i Chothia, C. et al. J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Ovde opisani molekuli anti-GCC antitela imaju CDR aminokiselinske sekvence i sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju CDR navedene u tabelama 5 i 6. U predmetnom opisu sekvence iz tabela 5 i 6 mogu da budu ugrađene u molekule koji prepoznaju GCC za upotrebu u terapijskim i dijagnostičkim metodama koje su ovde opisane. Odabrani humani okvirni region je onaj koji je pogodan za in vivo primenu, što znači da ne ispoljava imunogenost. Na primer, takvo određivanje može da se sprovede na osnovu prethodnog iskustva sa in vivo upotrebom takvih antitela i studija o sličnosti aminokiselina. Pogodni okvirni region može da se odabere od antitela humanog porekla koja imaju najmanje oko 65% identičnosti aminokiselinske sekvence, i poželjno najmanje oko 70%, 80%, 90% ili 95% identičnosti aminokiselinske sekvence dužinom okvirnog regiona sa aminokiselinskom sekvencom ekvivalentnog dela (npr., okvirni region) donorskog antitela, npr., molekula anti-GCC antitela (npr., 3G1). Identičnost aminokiselinske sekvence može da bude određena upotrebom pogodnog algoritma za poravnanje aminokiselinskih sekvenci, kao što je CLUSTAL W, upotrebom zadatih parametara. (Thompson J. D. et al., Nucleic Acids Res.22:4673-4680 (1994).)

[0098] Kada su CDR i FR regioni kloniranog antitela koje treba da se humanizuje identifikovani, identifikuju se aminokiselinske sekvence koji kodiraju CDR i odgovarajuće sekvence nukleinske kiseline je kaleme na odabrane humane FR regione. Ovo može da se uradi upotrebom poznatih prajmera i linkera, čiji je izbor poznat u stanju tehnike. Svi CDR konkretnog humanog antitela mogu da se zamene najmanje delom nehumanog CDR ili samo neki od CDR mogu da se zamene nehumanim CDR regionima. Neophodno je samo zameniti broj CDR potreban za vezivanje humanizovanog antitela za unapred određeni antigen. Nakon kalemljenja CDR na odabrane humane FR, rezultujući "humanizovane" sekvence varijabilnog teškog i varijabilnog lakog lanca se eksprimiraju da bi se proizveo humanizovani Fv ili humanizovano antitelo koje se vezuje za GCC. Poželjno, antitelo sa graftovanim CDR (npr., humanizovano) vezuje GCC protein sa afinitetom sličnim, suštinski istim kao, ili boljim od onog kod donorskog antitela. Tipično, humanizovane sekvence varijabilnog teškog i varijabilnog lakog lanca se eksprimiraju kao fuzioni protein sa sekvencama humanog konstantnog domena tako da se dobije intaktno antitelo koje se vezuje za GCC. Međutim, može da se proizvede humanizovano Fv antitelo koje ne sadrži sekvence konstantnog regiona.

[0099] Takođe, obimom opisa su obuhvaćena i humanizovana antitela u kojima su specifične aminokiseline supstituisane, deletirane ili dodate. Konkretno, humanizovana antitela mogu da imaju aminokiselinske supstitucije u okvirnom regionu, da bi se poboljšalo vezivanje antigena. Na primer, odabrani, mali broj rezidua akceptorskog okvirnog regiona humanizovanog imunoglobulinskog lanca može da bude zamenjen odgovarajućim donorskim aminokiselinama. Lokacije supstitucija uključuju aminokiselinske rezidue odmah do CDR, ili one koje mogu da interaguju sa CDR (videti npr., SAD pat. br. 5,585,089 ili 5,859,205). Akceptorski okvirni region može da bude sekvenca okvirnog regiona ili konsenzus sekvenca zrelog humanog antitela. U značenju koje je ovde primenjeno, termin "konsenzus sekvenca" odnosi se na sekvencu koja se najčešće sreće, ili je osmišljena iz najčešće rezidue na svakoj poziciji u sekvenci u regionu među srodnim članovima familije. Brojne konsenzus sekvence humanog antitela su dostupne, uključujući konsenzus sekvence za različite podgrupe humanih varijabilnih regiona (videti, Kabat, E. A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health i Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)). Baza podataka Kabata i njene primene su besplatno dostupne na internetu, npr. preko IgBLAST pri Nacionalnom centru za biotehnološke informacije, Bethesda, Md. (takođe videti, Johnson, G. i Wu, T. T., Nucleic Acids Research 29:205-206 (2001)).

[0100] Druge tehnike za humanizovanje antitela opisane su kod Padlan et al. u EP 519596 A1, objavljenom 23. decembra 1992.

[0101] Molekul anti-GCC antitela uključuje druga humanizovana antitela koja mogu takođe da budu modifikovana specifičnom delecijom epitopa T ćelija čoveka ili "deimunizacijom" postupcima opisanim u PCT objavama br. WO 98/52976 i WO 00/34317. Ukratko, u varijabilnim regionima teškog i lakog lanca anti-GCC antitela kunića, ili drugih nehumanih vrsta, mogu da se analiziraju peptidi koji se vezuju za MHC klase II; ovi peptidi predstavljaju potencijalne T-ćelijske epitope. Za detekciju potencijalnih T-ćelijskih epitopa, pristup kompjuterskog modelovanja označen kao "prepoznavanje savijanja peptida" može da se primeni, i dodatno može da se pretraži baza podataka peptida koji vezuju humani MHC kompleks klase II za motive prisutne u VH i VL sekvencama kunića, kao što je opisano u PCT objavama br. WO 98/52976 i WO 00/34317. Ovi motivi se vezuju za bilo koji od 18 DR alotipova glavnog MHC kompleksa klase II, i stoga čine potencijalne T-ćelijske epitope. Detektovani potencijalni T-ćelijske epitopi mogu da budu eliminisani supstitucijom malog broja aminokiselinskih rezidua u varijabilnim regionima, ili poželjno, jednom aminokiselinskom supstitucijom. Sve dok je moguće, uvode se konzervativne supstitucije, često, ali ne isključivo, može da se koristi aminokiselina koja je uobičajeno na ovoj poziciji u sekvencama antitela humane klicine linije. Sekvence humane klicine linije opisane su kod Tomlinson, I. A. et al., J. Mol. Biol.227:776-798 (1992); Cook, G. P. et al., Immunol. Today Vol.16 (5): 237-242 (1995); Chothia, D. et al., J. Mol. Bio. 227:799-817 (1992). Direktorijum V BASE pruža sveobuhvatan direktorijum sekvenci varijabilnog regiona humanog imunoglobulina (sastavio autor Tomlinson, I. A. et al. MRC Centar za proteinsko inženjerstvo, Cambridge, Velika Britanija). Nakon konstruisanja deimunizovanih VH i VL anti-GCC antitela putem mutageneza VH i VL gena kunića, mutagenizovane varijabilne sekvence mogu, opciono, da budu fuzionisane sa humanim konstantnim regionom, npr., humanim IgG1 ili K (kapa) konstantnim regionima.

[0102] U predmetnom opisu, redukcija imunogenog odgovora CDR-graftovanog antitela može da se postigne izmenama, npr., delecijama, supstitucijama, aminokiselinskih rezidua u CDR regionima (Kashmiri et al. Methods 36:25-34 (2005), SAD pat. br.6,818,749, Tan et al. J. Immunol.169:1119-1125 (2006)). Na primer, rezidue na pozicijama uključenim u kontakt sa antigenom poželjno ne bi bile izmenjene. Tipično, takve rezidue, rezidue koje određuju specifičnost (SDR), su na pozicijama koje ispoljavaju visoke nivoe varijabilnosti među antitelima. Konsenzus sekvence dobijene, npr., pomoću metoda Clustal (Higgins D. G. et al., Meth. Enzymol. 266:383-402 (1996)), od molekula anti-GCC antitela, npr., od ovde opisanih antitela, pomažu u identifikovanju SDR. U ovde opisanim molekulima anti-GCC antitela, SDR su sledeći, najmanje prva rezidua, ili u predmetnom opisu, prve četiri rezidue CDR1 teškog lanca; najmanje N-terminalni deo, npr., prvih sedam, deset ili 13 rezidua CDR2 teškog lanca; skoro ceo CDR3 teškog lanca; C-terminalni deo, npr., posle rezidue šest, osam, ili devet CDR1 lakog lanca; oko prve, srednje i/ili poslednje rezidue CDR2 lakog lanca; i veći deo CDR3 lakog lanca, ili najmanje posle rezidue dva ili tri. Prema tome, da bi se održalo vezivanje za GCC protein posle humanizacije ili modifikacije molekula anti-GCC antitela, takve SDR rezidue u CDR regionima molekula anti-GCC antitela su manje podložne promenama, npr., od rezidua kunića do humanih konsenzus rezidua nego što su rezidue na drugim reziduama CDR ili okvirnih regiona. Nasuprot tome, može da bude korisno izmeniti rezidue u nehumanim, npr., CDR regionima kunića u rezidue identifikovane kao konsenzusne u humanim CDR, npr., CDR molekula anti-GCC antitela opisanim u objavljenoj SAD patentnoj prijavi br.20110110936.

[0103] Anti-GCC antitela koja nisu intaktna antitela takođe su korisna u ovom otkriću. Takva antitela mogu da budu dobijena od bilo kog gore opisanog antitela. Korisni molekuli antitela ovog tipa uključuju (i) Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena; (ii) F(ab’)2fragment, bivalentni fragment koji sadrži dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u regionu zgloba; (iii) Fd fragment koji se sastoji od VH i CH1 domena; (iv) Fv fragment koji se sastoji od VL i VH domena jedne ručice antitela, (v) dAb fragment (Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)), koji se sastoji od VH domena; (vii) jednodomenski funkcionalni teški lanac antitela, koji se sastoji od VHH domena (poznat kao nano-telo) videti npr., Cortez-Retamozo, et al., Cancer Res. 64: 2853-2857 (2004), i reference citirane u tom delu; i (vii) izolovani CDR, npr., jedan ili više izolovanih CDR zajedno sa dovoljno okvirnih regiona da se dobije antigen-vezujući fragment. Osim toga, iako dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodiraju odvojeni geni, oni mogu da budu spojeni, upotrebom rekombinantnih postupaka, pomoću sintetskog linkera koji im omogućava da budu napravljeni kao jedan proteinski lanac u kome se VL i VH regioni sparuju da bi obrazovali monovalentne molekule (poznate kao jednolančani Fv (scFv); videti npr., Bird et al. Science 242:423-426 (1988); i Huston et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988). Predviđeno je da takav pojedinačni lanac antitela takođe bude obuhvaćen terminom "antigen-vezujući fragment" antitela. Ovi fragmenti antitela dobijaju se upotrebom uobičajenih tehnika poznatih stručnjacima u oblasti, i upotrebljivost fragmenata se pregleda na isti način kao kada su u pitanju intaktna antitela. Fagmenti antitela, kao Fv, F(ab’)2i Fab mogu da se pripreme degradacijom intaktnog proteina, npr. proteaznom ili hemijskom degradacijom.

[0104] U predmetnom opisu, neke ili sve CDR sekvence, jednog ili oba od teškog i lakog lanca, mogu da se koriste u drugim molekulima antitela, npr., u CDR-graftovanom, humanizovanom, ili himernom molekulu antitela.

[0105] Primeri izvođenja uključuju molekul antitela koji sadrži dovoljno CDR, npr., svih šest CDR regiona iz jednog od ovde opisanih antitela hibridoma kunića da bi se omogućilo vezivanje za GCC ćelijske površine.

[0106] U predmetnom opisu CDR, npr., svi HCDR, ili svi LCDR, ili svih šest, ubačeni su u humani okvirni region/regione ili okvirni region/regione humanog porekla. Primeri humanih okvirnih regiona uključuju sekvence okvirnog regiona humane klicine linije, sekvence humane klicine linije čiji je afinitet sazreo (ili in vivo ili in vitro), ili sintetske humane sekvence, npr., konsenzus sekvence. U predmetnom opisu okvirni region teškog lanca je IgG1 ili IgG2 okvirni region. U predmetnom opisu okvirni region lakog lanca je kapa okvirni region.

[0107] U predmetnom opisu molekul anti-GCC antitela, npr., CDR-graftovani ili humanizovani molekul antitela, sadrži dovoljno CDR, npr., svih šest CDR iz jednog od ovde opisanih antitela, npr., sekvence navedene u tabeli 5, da bi se omogućilo vezivanje za GCC. (Primeri sekvenci nukleinske kiseline koje mogu da kodiraju CDR aminokiselinske sekvence navedene u tabeli 5, date su u tabeli 6 u ovom dokumentu). U predmetnom opisu, molekul anti-GCC antitela mogu da sadrže CDR iz MIL-44-148-2 ili MIL-44-67-4.

[0108] Fragmenti antitela za in vivo terapijsku ili dijagnostičku upotrebu mogu da imaju korist od modifikacija koje poboljšavaju njihove serumske polu-živote. Pogodni organski fragmenti namenjeni da povećaju in vivo serumski polu-život antitela mogu da uključuju jedan, dva ili više linearnih ili granatih fragmenata odabranih od hidrofilne polimerne grupe (npr., linearni ili granati polimer (npr., polialkan glikol kao što je polietilen glikol, monometoksi-polietilen glikol i slično), ugljenog hidrata (npr., dekstran, celuloza, polisaharid i slično), polimera hidrofilne aminokiseline (npr., polilizin, poliaspartat i slično), polialkan oksida i polivinil pirolidona), grupe masne kiseline (npr., monokarboksilna kiselina ili dikarboksilna kiselina), grupe estra masne kiseline, lipidne grupe (npr., grupa diacilglicerola, grupa sfingolipida (npr., ceramidil)) ili fosfolipidne grupe (npr., fosfatidil etanolaminska grupa). Poželjno, organski fragment je vezan za unapred određeno mesto gde organski fragment ne umanjuje nivo funkcija (npr., smanjuje antigen-vezujući afinitet) rezultujućeg imunokonjugata u poređenju sa fragmentom nekonjugovanog antitela. Organski fragment može da ima molekulsku težinu od oko 500 Da do oko 50000 Da, poželjno oko 2000, 5000, 10,000 ili 20000 Da. Primeri i metode za modifikovanje polipeptida, npr., antitela, organskim fragmentima mogu da se nađu, na primer, u SAD pat. br. 4,179,337 i 5,612,460, PCT objavama br. WO 95/06058 i WO 00/26256, i objavi SAD patentne prijave br.20030026805.

[0109] Molekul anti-GCC antitela može da sadrži sve, ili antigen-vezujući fragment varijabilnog regiona, jednog ili oba, teškog i lakog lanca, jednog od gore navedenih antitela hibridoma kunića.

[0110] U predmetnom opisu aminokiselinska sekvenca lakog lanca iz (a) može da se razlikuje od jedne od referentnih aminokiselinskih sekvenci na koje se poziva u (a)(i-ii) za 1, 2, 3, 4, 5, 10, ili 15 rezidua. U predmetnom opisu razlike su konzervativne supstitucije. U predmetnom opisu, razlike su u okvirnim regionima. U predmetnom opisu aminokiselinska sekvenca teškog lanca iz (b) može da se razlikuje od jedne od referentnih aminokiselinskih sekvenci na koje se poziva u (b)(i-ii) za 1, 2, 3, 4, 5, 10, ili 15 rezidua. U predmetnom opisu razlike su konzervativne supstitucije. U predmetnom opisu razlike su u okvirnim regionima.

[0111] U predmetnom opisu molekul anti-GCC antitela sadrži jedno ili oba od:

(a) aminokiselinske sekvence lakog lanca cele, ili antigen-vezujućeg fragmenta, ili, (i) aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca iz tabele 3, npr., SEQ ID NO:13, ili (ii) aminokiseline varijabilnog regiona lakog lanca kodirane nukleotidnom sekvencom iz tabele 4, npr., SEQ ID NO:12; i

(b) aminokiselinske sekvence teškog lanca cele, ili antigen-vezujućeg fragmenta, ili (i) aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca iz tabele 3, npr., SEQ ID NO:11, ili (ii) aminokiselinske sekvence teškog lanca kodirane nukleotidnom sekvencom iz tabele 4, npr., SEQ ID NO:10.

[0112] U predmetnom opisu molekul anti-GCC antitela sadrži jedno ili oba od:

a) varijabilnog regiona lakog lanca, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koji ima najmanje 85, 90, 95, 97 ili 99% homologije sa varijabilnim regionom lakog lanca molekula anti-GCC antitela prema opisu; i

(b) varijabilnog regiona teškog lanca, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koji ima najmanje 85, 90, 95, 97 ili 99% homologije sa varijabilnim regionom teškog lanca molekula anti-GCC antitela prema opisu.

[0113] Aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona anti-GCC antitela opisa mogu da se nađu u tabeli 3.

[0114] U jednom pristupu, konsenzus sekvence koje kodiraju J regione teškog i lakog lanca mogu da se koriste za konstruisanje oligonukleotida za upotrebu kao prajmeri za uvođenje korisnih restrikcionih mesta u J region za naredno vezivanje segmenata V regiona za segmente humanog C regiona. C region cDNK može da bude modifikovan usmerenom mutagenezom da bi se restrikciono mesto postavilo na analogu poziciju u humanoj sekvenci.

[0115] Ekspresioni vektori uključuju plazmide, retroviruse, kozmide, YAC, epizome poreklom od EBV, i slično. Pogodan vektor je onaj koji kodira funkcionalno kompletne CH ili CL sekvence humanog imunoglobulina, sa odgovarajućim restrikcionim mestima konstruisan tako da bilo koja VH ili VL sekvenca može da bude lako ubačena i eksprimirana. U takvim vektorima, splajsovanje se obično odvija između mesta donora za splajsovanje u insertovanom J regionu i mesta akceptora za splajsovanje koje prethodi humanom C regionu, i takođe u regionima splajsovanja koji se javljaju u humanim CH egzonima. Pogodni ekspresioni vektori mogu da sadrže brojne komponente, na primer, mesto početka replikacije, gen za selektabilni marker, jedan ili više elemenata za kontrolu ekspresije, kao što je transkripcioni kontrolni element (npr., promotor, pojačivač, terminator) i/ili jedan ili više translacionih signala, signalnu sekvencu ili lidersku sekvenca, i slično. Terminacija poliadenilacije i transkripcije odvija se na nativnim hromozomskim mestima nishodno od kodirajućih regiona. Rezultujuće himerno antitelo može da se poveže sa bilo kojim jakim promotorom. Primeri pogodnih vektora koji mogu da se koriste uključuju one koji su pogodni za sisarske domaćine i zasnovani na virusnim replikacionim sistemima, kao što je majmunski virus 40 (SV40), Raus sarkoma virus (RSV), adenovirus 2, goveđi papiloma virus (BPV), papovavirus BK mutant (BKV), ili mišji i humani citomegalovirus (CMV), i Moloney virus leukemije miša (MMLV), nativni Ig promotori, itd. Različiti pogodni vektori su poznati u stanju tehnike, uključujući vektore koji se održavaju kao jedna kopija ili kao višestruke kopije, ili koje se integrišu u hromozom ćelije-domaćina, npr., putem LTR, ili putem veštačkih hromozoma konstruisanih sa višestrukim mestima za integraciju (Lindenbaum et al. Nucleic Acids Res. 32:e172 (2004), Kennard et al.

Biotechnol. Bioeng. Online May 20, 2009). Dodatni primeri pogodnih vektora navedeni su u odeljku kasnije u tekstu.

[0116] Prema tome, otkriće opisuje ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo, antigen-vezujući fragment antitela (npr., humanizovano, himerno antitelo ili antigenvezujući fragment bilo čega od gore navedenog), lanac antitela (npr., teški lanac, laki lanac) ili antigen-vezujući deo lanca antitela koji vezuje GCC protein.

[0117] Ekspresija u eukariotskim ćelijama-domaćinima korisna je jer takve ćelije će sa većom verovatnoćom nego prokariotske ćelije sklopiti i izlučiti pravilno savijeno i imunološki aktivno antitelo. Međutim, bilo koje proizvedeno antitelo koje je neaktivno zbog nepravilnog savijanja može da bude renaturisano poznatim postupcima (Kim i Baldwin, "Specific Intermediates in the Folding Reactions of Small Proteins and the Mechanism of Protein Folding", Ann. Rev. Biochem. 51, pp.

459-89 (1982)). Moguće je da ćelije-domaćini proizvedu delove intaktnih antitela, kao što su dimeri lakog lanca ili dimeri teškog lanca, koji su takođe homolozi antitela prema predmetnom opisu.

[0118] Dalje, kao što je opisano na drugom mestu u ovom dokumentu, antitela ili antitela humanih ili nehumanih vrsta mogu da budu stvorena pomoću tehnologija tipa prikaza, uključujući, bez ograničenja, prikaz na fagu, retrovirusni prikaz, ribozomalni prikaz, i druge tehnike, upotrebom tehnika dobro poznatih u ovoj oblasti i rezultujući molekuli mogu da budu podvrgnuti dodatnom sazrevanju, kao što je sazrevanje afiniteta, budući da su takve tehnike poznate u ovoj oblasti. Winter i Harris Immunol Today 14:43-46 (1993) i Wright et al. Crit. Reviews in Immunol. 12125-168 (1992), Hanes i Plucthau PNAS USA 94:4937-4942 (1997) (ribozomalni prikaz), Parmley i Smith Gene 73:305-318 (1988) (prikaz na fagu), Scott TIBS 17:241-245 (1992), Cwirla et al. Proc Natl Acad Sci USA 87:6378-6382 (1990), Russel et al. Nucl. Acids Research 21:1081-1085 (1993), Hoganboom et al. Immunol. Reviews 130:43-68 (1992), Chiswell i McCafferty TIBTECH 10:80-84 (1992), i SAD pat. br. 5,733,743. Ako se tehnologije prikaza koriste za proizvodnju antitela koja nisu humana, takva antitela mogu da budu humanizovana kao što je gore opisano.

[0119] Jasno je da antitela koja su stvorena ne moraju na početku da poseduju određeni željeni izotip, već, antitelo kakvo je stvoreno može da ima bilo koji izotip. Na primer, antitelo proizvedeno u MIL-44-148-2 hibridomu kunića ima izotip IgG. Izotip antitela može da bude promenjen nakon toga, npr., u IgG2, ili IgG3 da izazove ADCC odgovor kada se antitelo veže za GCC na ćeliji, upotrebom uobičajenih tehnika poznatih u ovoj oblasti. Takve tehnike uključuju upotrebu direktnih rekombinantnih tehnika (videti npr., SAD pat. br.4,816,397), tehnika fuzije ćelija-ćelija (videti npr., SAD pat. br. 5,916,771), između ostalih. U tehnici fuzije ćelija-ćelija, priprema se ćelijska linija mijeloma ili druga ćelijska linija koja poseduje teški lanac bilo kog željenog izotipa i priprema se još jedna ćelijska linija mijeloma ili druga ćelijska linija koja poseduje laki lanac. Takve ćelije mogu, kasnije, da se fuzionišu i može da bude izolovana ćelijska linija koja eksprimira intaktno antitelo.

[0120] U predmetnom opisu, GCC molekul antitela je anti-GCC IgG1 antitelo kunića. Budući da takva antitela poseduju željeno vezivanje za molekul GCC, bilo kom od takvih antitela može lako da se promeni izotip da bi se dobio drugi izotip a da pri tome i dalje ima isti varijabilni region (koji definiše specifičnost i afinitet antitela, u izvesnom stepenu). Prema tome, stvaraju se kandidati za antitela koji zadovoljavaju željene "strukturne" atribute kao što je gore diskutirano, uopšteno mogu da im se obezbede najmanje određeni dodatni "funkcionalni" atributi koji su poželjni kroz promenu izotipa.

[0121] U predmetnom opisu varijabilni region ili njegov antigen-vezujući fragment može da bude kuplovan sa konstantnim regionom (ili njegovim fragmentom) koji nije konstantni region sa kojim je stvoren, npr., konstantnim regionom (ili njegovim fragmentom) iz drugog antitela ili sa sintetskim konstantnim regionom (ili njegovim fragmentom). U predmetnom opisu konstantni region je konstantni region IgG1 ili IgG2 (ili njegov fragment). Izmene sekvence mogu da budu napravljene u varijabilnim ili konstantnim regionima da bi se modifikovala efektorska aktivnost molekula antitela.

Konstruisanje i stvaranje drugih terapeutika

[0122] Antitela koja su ovde proizvedena i okarakterisana u odnosu na GCC obezbeđuju olakšano konstruisanje drugih terapijskih modaliteta uključujući druga antitela, druge antagoniste, ili hemijske fragmente koji nisu antitela. Takvi modaliteti uključuju, bez ograničenja, antitela koja imaju sličnu aktivnost vezivanja ili funkcionalnost, napredne terapeutike na bazi antitela, kao što su bispecifična antitela, imunokonjugati, i radioaktivno obeležene terapeutike, stvaranje peptidnih terapeutika, naročito intra-tela, i malih molekula. Osim toga, kao što je ovde razmatrano, efektorska funkcija antitela prema opisu može da se menja promenom izotipa u IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA1, IgA2, IgE, ili IgM za različite terapijske upotrebe.

[0123] U vezi sa bispecifičnim antitelima, mogu da budu stvorena bispecifična antitela koja sadrže (i) dva antitela, jedno sa specifičnošću za GCC i drugo za drugi molekul, koja su međusobno konjugovana, (ii) jedno antitelo koje ima jedan lanac specifičan za GCC i drugi lanac specifičan za drugi molekul, ili (iii) jedan lanac antitela koji ima specifičnost za GCC i drugi molekul. Takva bispecifična antitela mogu da se dobiju upotrebom poznatih tehnika. Na primer, bispecifična antitela mogu da budu proizvedena unakrsnim vezivanjem dva ili više antitela (istog tipa ili različitih tipova). Pogodni agensi za unakrsno vezivanje uključuju one koji su heterobifunkcionalni, koji imaju dve različite reaktivne grupe razdvojene odgovarajućim spejserom (npr., mmaleimidobenzoil-N-hidroksisukcinimid estar) ili homobifunkcionalni (npr., disukcinimidil suberat). Takvi linkeri su dostupni kod kompanije Pierce Chemical, Rockford, Ill. Videti takođe, npr., Fanger et al. Immunomethods 4:72-81 (1994) i Winter i Harris Immunol Today 14:43-46 (1993) i Wright et al. Crit. Reviews in Immunol. 12125-168 (1992) u vezi sa (iii) videti npr., Traunecker et al. Int. J. Kancer (Suppl.) 7:51-52 (1992). Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny et al. J. Immunol. 148:1547-1553 (1992).

[0124] Dodatno, mogu da se pripreme i "kapa-tela" (Ill. et al. "Design and construction of a hybrid immunoglobulin domain with properties of both heavy and light chain variable regions" Protein Eng 10:949-57 (1997)), "minitela" (Martin et al. EMBO J. 13:5303-9 (1994), SAD pat. br. 5,837,821), "dia-tela" (Holliger et al. Proc Natl Acad Sci USA 90:6444-6448 (1993)), ili "Janusins-tela" (Traunecker et al. EMBO J. 10:3655-3659 (1991) i Traunecker et al. Int J Cancer Suppl 7:51-52 (1992)).

Nukleinske kiseline i polipeptidi

[0125] U predmetnom otkriću, predmetni opis se odnosi na polinukleotidne i polipeptidne sekvence koje kodiraju ili predstavljaju ovde opisane molekule antitela. Takvi polinukleotidi kodiraju i varijabilni i konstantni region svakog od teškog i lakog lanca, iako su i druge kombinacije takođe obuhvaćene predmetnim otkrićima u skladu sa ovde opisanim kompozicijama. Predmetni opis takođe razmatra oligonukleotidne fragmente koji potiču od opisanih polinukleotida i sekvence nukleinske kiseline komplementarne ovim polinukleotidima.

[0126] Polinukleotidi mogu da budu u obliku RNK ili DNK. Polinukleotidi u obliku DNK, cDNK, genomske DNK, analoga nukleinske kiseline i sintetske DNK obuhvaćeni su obimom predmetnog opisa. DNK može da bude dvolančana ili jednolančana, i ako je jednolančana, može da bude kodirajuća (sens) lanac ili nekodirajuća (anti-sens) lanac. Kodirajuća sekvenca koja kodira polipeptid može da bude identična sa ovde obezbeđenom kodirajućom sekvencom ili može da bude drugačija kodirajuća sekvenca koja, kao rezultat viška ili degeneracije genetskog koda, kodira isti polipeptid kao DNK koja je ovde obezbeđena.

[0127] Polinukleotidi koji su obezbeđeni u predmetnom opisu, kodiraju najmanje jedan varijabilni region teškog lanca i najmanje jedan varijabilni region lakog lanca predmetnog opisa, npr., kao što je prikazano u tabeli 4.

[0128] Predmetni opis takođe uključuje varijantu polinukleotida koja sadrži modifikacije kao što su delecije, supstitucije ili adicije polinukleotida, i bilo koju polipeptidnu modifikaciju koja rezultuje iz varijante polinukleotidne sekvence. Polinukleotid predmetnog opisa može takođe da ima kodirajuću sekvencu koja je varijanta ovde obezbeđene kodirajuće sekvence. Na primer, varijanta polinukleotida može da ima najmanje 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 97% identičnosti sa polinukleotidom navedenim u tabeli 4. U predmetnom opisu, varijanta polinukleotida kodira molekul anti-GCC antitela.

[0129] Predmetni opis dodatno se odnosi na polipeptide koji predstavljaju antitela predmetnog opisa kao i fragmente, analoge i derivate takvih polipeptida. Polipeptidi predmetnog opisa mogu da budu rekombinantni polipeptidi, prirodno proizvedeni polipeptidi ili sintetski polipeptidi. Fragment, derivat ili analozi polipeptida predmetnog opisa mogu da budu oni u kojima je jedna ili više aminokiselinskih rezidua supstituisana konzervisanom ili nekonzervisanom aminokiselinskom reziduom (poželjno konzervisanom aminokiselinskom reziduom) i takva supstituisana aminokiselinska rezidua može, ali ne mora da bude kodirana genetskim kodom; ili može da bude ona u kojoj jedna ili više aminokiselinskih rezidua uključuje grupu supstituenta; ili može da bude ona u kojoj je polipeptid fuzionisan sa drugim jedinjenjem, kao što je jedinjenje za produžavanje polu-života polipeptida (na primer, polietilen glikol); ili može da bude ona u kojoj su dodatne aminokiseline fuzionisane sa polipeptidom, kao što je liderska ili sekretorna sekvenca ili sekvenca koja se koristi za prečišćavanje polipeptidne ili proteinske sekvence. Takvi fragmenti, derivati i analozi obuhvaćeni su obimom predmetnog opisa. U različitim aspektima polipeptidi opisa mogu da budu delimično prečišćeni, ili prečišćeni proizvod.

[0130] Polipeptid predmetnog opisa može da ima aminokiselinsku sekvencu koja je identična onoj kod ovde opisanih antitela, npr., prikazanih u tabelama 2 ili 3, ili koja se razlikuje po malim varijacijama zbog jedne ili više aminokiselinskih supstitucija. Varijacija može da bude "konzervativna izmena" tipično u opsegu od oko 1 do 5 aminokiselina, pri čemu supstituisana aminokiselina ima slična strukturna ili hemijska svojstva, npr., zamena leucina izoleucinom ili treonina serinom; zamena lizina argininom ili histidinom. Nasuprot tome, varijacije mogu da uključuju nekonzervativne izmene, npr., zamenu glicina triptofanom. Slične manje varijacije mogu takođe da uključuju aminokiselinske delecije ili insercije ili oba. Smernice pri određivanju koje i koliko aminokiselinskih rezidua mogu da budu supstituisane, insertovane, ili deletirane bez promene biološke ili imunološke aktivnosti mogu da se nađu upotrebom kompjuterskih programa poznatih u stanju tehnike, na primer softver DNKSTAR (DNKSTAR, Inc., Madison, Wis.).

[0131] U drugom aspektu, otkriće uvodi, izolovane i/ili rekombinantne nukleinske kiseline koje kodiraju molekule anti-GCC antitela. U predmetnom opisu, nukleinske kiseline kodiraju jedno ili više od molekula antitela, teškog lanca, lakog lanca, varijabilnog regiona lakog lanca, varijabilnog regiona teškog lanca, delove teških lanaca i lakih lanaca ovde opisanih molekula antitela (npr., fragment varijabilnog regiona lakog lanca koji je kada se spari sa celom dužinom varijabilnog regiona teškog lanca antigen-vezujući, ili fragment varijabilnog regiona teškog lanca koji je kada se spari sa celom dužinom varijabilnog regiona lakog lanca antigen-vezujući), i CDR. Primeri izvođenja uključuju takve nukleinske kiseline raspoložive u vektorima, npr., ekspresionim vektorima. Dodatno, otkriće obuhvata molekule antitela koje proizvode ćelije-domaćini, npr., eksprimiranjem molekula antitela kodiranih takvim plazmidima.

[0132] U predmetnom opisu, obezbeđen je vektor, npr., ekspresioni vektor, koji sadrži jedno ili oba od:

sekvenci koje kodiraju varijabilni region lakog lanca, npr., varijabilni region lakog lanca opisan u tabeli 3, npr., sekvenca navedena u tabeli 4, njegov antigen-vezujući fragment, ili jedan, dva ili tri CDR regiona lakog lanca (i opciono okvirni region), kao što je ovde opisano, npr., CDR regione opisane u tabeli 5, npr., sekvenca koja kodira CDR data u tabeli 6; i

sekvenci koje kodiraju varijabilni region teškog lanca, npr., varijabilni region teškog lanca opisan u tabeli 3, npr., sekvenca navedena u tabeli 4, njegov antigen-vezujući fragment, ili jedan, dva ili tri CDR regiona teškog lanca (i opciono okvirni region), kao što je ovde opisano, npr., CDR regione opisane u tabeli 5, npr., sekvenca koja kodira CDR data u tabeli 6.

[0133] Polinukleotidi obezbeđeni u predmetnom opisu kodiraju najmanje jedan varijabilni region teškog lanca ili najmanje jedan varijabilni region lakog lanca antitela predmetnog opisa. Polinukleotidi obezbeđeni u predmetnom opisu mogu da kodiraju najmanje jedan varijabilni region teškog lanca i jedan teškog lanca lakog lanca antitela predmetnog opisa.

[0134] U predmetnom opisu molekul anti-GCC antitela sadrži jedno ili oba od:

(a) varijabilnog regiona lakog lanca, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, kodiranog nukleinskom kiselinom koja hibridizuje pod uslovima odabrane strogosti sa, (i) sekvencom komplementarnom sekvenci nukleinske kiseline koja kodira molekul anti-GCC antitela opisan u ovom dokumentu, npr., u tabeli 4, ili (ii) bilo kojom sekvencom nukleinske kiseline koja kodira laki lanac molekula anti-GCC antitela prema opisu, npr., jednog od gore opisanih antitela kunića prikazanih u tabelama 1 i 2; i

(b) varijabilnog regiona teškog lanca, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, kodiranog nukleinskom kiselinom koja hibridizuje pod uslovima odabrane strogosti sa, (i) sekvencom komplementarnom sekvenci nukleinske kiseline koja kodira molekul anti-GCC antitela opisanog u ovom dokumentu, npr., u tabeli 4, ili (ii) bilo kojom sekvencom nukleinske kiseline koja kodira teški lanac molekula anti-GCC antitela prema opisu, npr., jednog od gore opisanih antitela kunića prikazanih u tabelama 1 i 2.

[0135] U predmetnom opisu uslovi odabrane strogosti su uslovi visoke strogosti ili uslovi veoma visoke strogosti, npr., kao uslovi koji su ovde opisani.

[0136] Predmetni opis takođe obezbeđuje vektore koji uključuju polinukleotide predmetnog opisa, ćelije-domaćine koje su genetski konstruisane sa vektorima predmetnog opisa i proizvodnju antitela predmetnog opisa rekombinantnim tehnikama.

[0137] Odgovarajuća DNK sekvenca može da bude insertovana u vektor različitim procedurama. Uopšteno, DNK sekvenca se insertuje u odgovarajuća restrikciona mesta endonukleaze procedurama poznatim u stanju tehnike. Polinukleotidna sekvenca u ekspresionom vektoru je funkcionalno povezana sa odgovarajućom sekvencom za kontrolu ekspresije (tj. promotor) za usmeravanje sinteze iRNK. Primeri takvih promotora uključuju, ali nisu ograničeni na LTR Raus sarkoma virusa ili na rani ili kasni SV40 promotor, E. coli lac ili trp, PL promotor lambda faga i druge promotore za koje je poznato da kontrolišu ekspresiju gena kod prokariotskih (npr., tac, T3, T7 promotori za E. coli) ili eukariotskih (npr., citomegalovirusni promotor, adenovirusni kasni promotor, EF-1a promotor) ćelija ili njihovih virusa. Ekspresioni vektor takođe sadrži mesto vezivanja ribozoma za inicijaciju transkripcije i terminaciju transkripcije. Vektor može takođe da uključuje odgovarajuće sekvence za pojačavanje ekspresije. Na primer, vektor može da sadrži pojačivače, koji predstavljaju DNK sekvence virusnog porekla koje stimulišu transkripciju, kao što su one koje potiču od majmunskog virusa kao SV40, polioma virusa, citomegalovirusa, goveđeg papiloma virusa ili Moloney sarkoma virusa, ili genomskog porekla. Vektor poželjno takođe sadrži mesto početka replikacije. Vektor može da bude konstruisan da sadrži egzogeno mesto početka replikacije, ili takvo mesto početka replikacije može da potiče iz SV40 ili drugog virusnog izvora, ili da se replicira pomoću mehanizma replikacije hromozoma ćelije-domaćina.

[0138] Dodatno, vektori opciono sadrže genski marker za selekciju transficiranih ćelija-domaćina kao što su genski markeri za dihidrofolat reduktazu čime se omogućava selekcija metotreksatom u različitim domaćinima, ili antibioticima, kao što je gen za beta-laktamazu (rezistencija na ampicilin), Tet gen (za rezistenciju na tetraciklin) korišćenim u prokariotskim ćelijama ili geni za rezistenciju na neomicin, GA418 (geneticin, derivat neomicina) gpt (mikofenolna kiselina), ampicilin, ili na higromicin, ili geni koji komplementiraju genetsko oštećenje ćelija-domaćina kao što je odsustvo timidin kinaze, hipoksantin fosforibozil transferaze, dihidrofolat reduktaze, itd. Geni koji kodiraju genski proizvod auksotrofnih markera domaćina (npr., LEU2, URA3, HIS3) često se koriste kao selektabilni markeri kod kvasaca.

[0139] Kako bi se dobila antitela predmetnog opisa, jedna ili više polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju varijabilne regione lakog i teškog lanca i konstantne regione lakog i teškog lanca antitela predmetnog opisa treba da budu ugrađeni u vektor. Polinukleotidne sekvence koji kodiraju lake i teške lance antitela predmetnog opisa mogu da budu ugrađene u jedan ili više vektora a zatim ugrađene u ćelije-domaćine.

[0140] Pogodni ekspresioni vektori za ekspresiju u sisarskim ćelijama uključuju, na primer, pCDM8, pcDNA1.1/amp, pcDNA3.1, pRc/RSV, pEF-1 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, Calif.), pCMV-SCRIPT, pFB, pSG5, pXT1 (Stratagene, La Jolla, Calif.), pCDEF3 (Goldman, L. A., et al., Biotechniques, 21:1013-1015 (1996)), pSVSPORT (GIBCO division of Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, Calif.), pEF-Bos (Mizushima, S., et al., Nucleic Acids Res., 18:5322 (1990)), Bicistronic GPEX® Retrovector (Gala Biotech, Middleton, Wis.) i slično. Ekspresioni vektori koji su pogodni za upotreba u različitim ekspresionim domaćinima, kao što su prokariotske ćelije (E. coli), insekatske ćelije (Drosophila Schnieder S2 ćelije, Sf9) i kvasac (P. methanolica, P. pastoris, S. cerevisiae) su takođe dostupni. Primeri vektora su pLKTOK58 (Fc sekvenca divljeg tipa IgG1) i pLKTOK59 (mutirana Fc sekvenca IgG1) (videti objavu SAD patentne prijave br.

20060147445).

[0141] Jasno je da antitela u skladu sa predmetnim opisom mogu da budu eksprimirana u ćelijskim linijama drugačijim od ćelijskih linija hibridoma. Sekvence koji kodiraju cDNK ili genomski klonovi za konkretna antitela mogu da se koriste za pogodne sisarske ili ne-sisarske ćelije-domaćine. Transformacija može da se sprovede pomoću bilo kog poznatog postupka za uvođenje polinukleotida u ćeliju-domaćina, uključujući, na primer pakovanje polinukleotida u virus (ili u virusni vektor) i transdukcija ćelije-domaćina virusom (ili vektorom) ili pomoću procedura transfekcije poznatih u stanju tehnike, za uvođenje heterologih polinukleotida u sisarske ćelije, npr., transfekcija posredovana dekstranom, precipitacija kalcijum fosfatom, transfekcija posredovana polibrenom, fuzija protoplasta, elektroporacija, inkapsulacija jednog ili više polinukleotida u lipozome i direktno mikroinjektovanje DNK molekula. Upotrebljena procedura transformacije zavisi od domaćina koji treba da se transformiše. Postupci za uvođenje heterologih polinukleotida u sisarske ćelije su poznati u stanju tehnike i uključuju, ali nisu ograničeni na transfekciju posredovanu dekstranom, precipitaciju kalcijum fosfatom, transfekciju posredovanu polibrenom, fuziju protoplasta, elektroporaciju, bombardovanje česticama, inkapsulaciju jednog ili više polinukleotida u lipozome, peptidne konjugate, dendrimere i direktno mikroinjektovanje DNK u jedro.

[0142] U još jednom aspektu, otkriće uvodi, ćeliju-domaćina koja sadrži ovde opisanu nukleinsku kiselinu. U predmetnom opisu ćelija eksprimira molekul antitela, ili njegovu ovde opisanu komponentu. Dalje, predmetni opis opisuje postupak za proizvodnju molekula antitela, npr., ovde opisanog molekula anti-GCC antitela, npr. molekul antitela kunića, ili njegove humanizovane verzije, koji obuhvata održavanje ćelije-domaćina u uslovima pogodnim za ekspresiju, pri čemu se imunoglobulinski lanac/lanci eksprimiraju i proizvodi se molekul antitela. Predmetno otkriće opisuje ćeliju-domaćina koja sadrži bilo koji od gore navedenih ekspresionih vektora koji kodiraju sekvence teškog i lakog lanca antitela. Ćelija-domaćin može da bude a eukariotska ćelija, npr., sisarska ćelija, insekatska ćelija, ćelija kvasca, ili prokariotska ćelija, npr., E. coli. Na primer, sisarska ćelija može da bude gajena ćelija ili ćelijska linija. Primeri sisarskih ćelija uključuju limfocitne ćelijske linije (npr., NS0), ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), COS ćelije. U predmetnom opisu, gajena ćelijadomaćin je CHO ćelija koja sadrži sekvence nukleinske kiseline koja kodira MIL-44-148-2 molekul antitela. U predmetnom opisu, ćelija-domaćin je hibridom MIL-44-148-2 (PTA-8132). Dodatno ćelije uključuju oocite, i ćelije poreklom od transgene životinje, npr., epitelnu ćeliju mlečne žlezde. Na primer, nukleinske kiseline koje kodiraju ovde opisani molekul antitela mogu da budu eksprimirane u transgenoj nehumanoj životinji.

[0143] Sisarske ćelijske linije dostupne kao domaćini za ekspresiju su poznate u stanju tehnike i uključuju mnoge imortalizovane ćelijske linije dostupne iz Američke kolekcije kultura sojeva (ATCC), uključujući, ali bez ograničenja ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), NSO ćelije, HeLa ćelije, ćelije bubrega bebe hrčka (BHK), ćelije majmunskog bubrega (COS), ćelije humanog hepatocelularnog karcinoma (npr., Hep G2), i brojne druge ćelijske linije. Ne-sisarske ćelije, uključujući, ali bez ograničenja, bakterijske, ćelije kvasca, insekata, i biljaka mogu takođe da se koriste za eksprimiranje rekombinantnih antitela. Može da bude poželjno izvođenje usmerene mutageneze CH2 domena antitela da bi se eliminisala glikozilacija u cilju sprečavanja promena imunogenosti, farmakokinetike, i/ili efektorskih funkcija koja rezultuje iz nehumane glikozilacije. Postupci za ekspresiju biraju se na osnovu određivanja koji sistem stvara najviše nivoe ekspresije i proizvodi antitela sa konstitutivnim svojstvima vezivanja GCC.

[0144] U predmetnom opisu opisan je postupak za proizvodnju molekula anti-GCC antitela, npr., molekula antitela kunića ili njegove humanizovane verzije, koji obuhvata održavanje ćelijedomaćina koja sadrži ovde opisane nukleinske kiseline, npr., jednu ili više sekvenci nukleinskih kiselina navedenih u tabeli 4 ili 6, u uslovima pogodnim za ekspresiju imunoglobulina, pri čemu se imunoglobulinski lanci eksprimiraju i proizvodi molekul antitela, npr., molekul antitela kunića, ili njegova humanizovana verzija, koji vezuje GCC, ili njegov fragment ili varijanta. Na primer, postupci za ekspresiju molekula antitela uključuju upotrebu ćelije-domaćina kod koje su prvi molekul rekombinantne nukleinske kiseline koji kodira molekul antitela, npr., laki lanac antitela kunića ili njegovu humanizovanu verziju, i drugi molekul rekombinantne nukleinske kiseline koji kodira molekul antitela, npr., teški lanac antitela kunića ili njegovu humanizovanu verziju, sadržani u jednom ekspresionom vektoru. U predmetnom opisu, oni su na različitim vektorima. Postupak može dalje da sadrži korak izolovanja ili izdvajanja antitela, antigen-vezujućeg fragmenta antitela, lanca antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta lanca antitela, po potrebi.

[0145] Na primer, molekul nukleinske kiseline (tj., jedan ili više molekula nukleinske kiseline) koji kodira teške i lake lance antitela kunića (ili humanizovanog antitela) koje vezuje GCC protein, ili ekspresioni konstrukt (tj., jedan ili više konstrukata) koji sadrži takav molekul/molekule nukleinske kiseline, može da bude uveden u pogodnu ćeliju-domaćina da bi se stvorila rekombinantna ćelijadomaćin upotrebom bilo kog postupka pogodnog za odabranu ćeliju-domaćina (npr., transformacija, transfekcija, elektroporacija, infekcija), tako da molekul/molekuli nukleinske kiseline budu funkcionalno vezani za jedan ili više elemenata za kontrolu ekspresije (npr., u vektoru, u konstruktu stvorenom procesima u ćeliji, integrisanom u genom ćelije-domaćina). Rezultujuća rekombinantna ćelija-domaćin može da bude održavana u uslovima pogodnim za ekspresiju (npr., u prisustvu induktora, u pogodnoj nehumanoj životinji, u pogodnom medijumu za kulturu obogaćenom odgovarajućim solima, faktorima rasta, antibioticima, hranljivim suplementima, itd.), pri čemu se proizvodi kodirani polipeptid/polipeptidi. Po želji, kodirani protein može da bude izolovan ili izdvojen (npr., iz životinje, ćelije-domaćina, medijuma, mleka). Ovaj postupak obuhvata ekspresiju u ćeliji-domaćinu transgene nehumane životinje (videti, npr., WO 92/03918, GenPharm International) ili biljke.

[0146] Dodatno, ekspresija antitela prema opisu (ili drugih njihovih fragmenata) u proizvodnim ćelijskim linijama može da bude pojačana upotrebom brojnih poznatih tehnika. Na primer, glutamin sintetaza i DHFR genski ekspresioni sistemi predstavljaju uobičajeni pristup za pojačavanje ekspresije pod određenim uslovima. Ćelijski klonovi sa visokom mogu da se identifikuju upotrebom uobičajenih tehnika, kao što je kloniranje metodom graničnog razblaženja, Microdrop technology, ili bilo kojim drugim metodama poznatim u stanju tehnike. Sistem GS se razmatra u celini ili delimično u vezi sa evropskim patentima br. 0 216 846, 0 256 055, i 0 323 997 i evropskom patentnom prijavom br.89303964.4.

[0147] U sistemu datom kao primer za rekombinantnu ekspresiju modifikovanog antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg dela, prema otkriću, rekombinantni ekspresioni vektor koji kodira i teški lanac antitela i laki lanac antitela uveden je u dhfr-CHO ćelije pomoću transfekcije posredovane kalcijum fosfatom. U rekombinantnom ekspresionom vektoru, geni za teški i laki lanac antitela su funkcionalno vezeni za regulatorne elemente pojačivača/promotora (npr., poreklom od SV40, CMV, adenovirusa i slično, kao što je regulatorni element CMV pojačivač/AdMLP promotor ili regulatorni element SV40 pojačivač/AdMLP promotor) da bi se pokrenuli visoki nivoi transkripcije gena. Rekombinantni ekspresioni vektor takođe nosi DHFR gen, koji omogućava selekciju CHO ćelija koje su transficirane vektorom upotrebom postupka selekcija metotreksatom/amplifikacija. Odabrani transformanti ćelija-domaćina se gaje da bi se omogućila ekspresija teških i lakih lanaca antitela i intaktno antitelo se izdvaja iz medijuma kulture. Za pripremu rekombinantnog ekspresionog vektora korišćene su standardne tehnike molekularne biologije, transfekcija ćelija-domaćina, selekcija transformanata, gajenje ćelija-domaćina i izdvajanje antitela iz medijuma kulture.

[0148] Antitela prema otkriću mogu takođe da se proizvedu transgeno putem stvaranja sisara ili biljke koja je transgena za sekvence od interesa imunoglobulinskog teškog i lakog lanca i proizvodnje antitela u obliku koji se može izdvojiti od njih. Kada je u pitanju transgena proizvodnja u sisarima, antitela mogu da se proizvedu u, i izdvoje iz, mleka koza, krava, ili drugih sisara. Videti, npr., SAD pat. br.5,827,690, 5,756,687, 5,750,172, i 5,741,957.

[0149] Antitela, antigen-vezujući fragmenti, lanci antitela i njihovi antigen-vezujući delovi koji su ovde opisani, mogu da se proizvedu i u in vitro ekspresionom sistemu, hemijskom sintezom ili bilo kojim drugim pogodnim postupkom.

Fuzioni proteini i imunokonjugati

[0150] Ovde opisana anti-GCC antitela mogu da budu funkcionalno vezana bilo kojim pogodnim postupkom (npr., hemijskim kuplovanjem, genetičkom fuzijom, nekovalentnim povezivanjem ili na drugi način) za jedan ili više molekulskih entiteta koji nisu antitelo.

[0151] Mogu da se proizvedu fuzioni proteini u kojima su ovde opisani molekul anti-GCC antitela i fragment koji nije antitelo komponente jednog neprekidnog polipeptidnog lanca. Fragment koji nije antitelo može da bude smešten N-terminalno, C-terminalno, ili u unutrašnjosti, u odnosu na fragment antitela. Na primer, predmetni opis može da bude ostvaren insercijom nukleinske kiseline koja kodira imunoglobulinske sekvence u pogodan ekspresioni vektor, kao što je pET vektor (npr., pET-15b, Novagen), fagni vektor (npr., pCNATAB 5 E, Pharmacia), ili drugi vektor, npr., pRIT2T Protein A fuzioni vektor, Pharmacia). Rezultujući konstrukt može da bude eksprimiran da bi se proizvelo lanci antitela koji sadrže fragment koji nije antitelo (npr., histidinsku oznaku, E-oznaku, ili Protein A IgG-vezujući domen). Fuzioni proteini mogu da budu izolovani ili izdvojeni upotrebom bilo koje pogodne tehnike, kao što je hromatografija upotrebom pogodne afinitetne matrice (videti, npr., Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F. M et al., eds., Vol. 2, Suppl. 26, pp.

16.4.1-16.7.8 (1991)).

[0152] Otkriće opisuje molekule anti-GCC antitela koji su usmereni na i, u predmetnom opisu, internalizuju u ćelije. Oni mogu da dostave terapijske agense ili detektabilne agense do, ili u ćelije koje eksprimiraju GCC, ali ne do, ili u ćelije na kojima ciljni molekul nije eksprimiran. Prema tome, otkriće takođe opisuje anti-GCC imunokonjugate koji sadrže molekul anti-GCC antitela kao što je ovde opisano, koji je konjugovan sa terapijskim agensom ili sa detektabilnim agensom. U predmetnom opisu, afinitet za GCC anti-GCC imunokonjugata je najmanje 10, 25, 50, 75, 80, 90, ili 95% afiniteta nekonjugovanog antitela. Ovo može da se odredi upotrebom GCC na ćelijskoj površini ili izolovanog GCC. U predmetnom opisu molekul anti-GCC antitela, npr., imunokonjugat, ima LD50, određeno ovde opisanim testom, manji od 1,000, 500, 250, 100, ili 50 pM.

[0153] Molekul anti-GCC antitela mogu da budu modifikovani da deluju kao imunokonjugat upotrebom tehnika koje su poznate u stanju tehnike. Videti npr., Vitetta Immunol Today 14:252 (1993). Videti takođe SAD pat. br. 5,194,594. Priprema radioaktivno obeleženih antitela može takođe lako da se izvede upotrebom tehnika koje su poznatu u stanju tehnike. Videti npr., Junghans et al. in Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2d edition, Chafner i Longo, eds., Lippincott Raven (1996)). Videti takođe SAD pat. br. 4,681,581, 4,735,210, 5,101,827, 5,102,990 (SAD Re. Pat. br.35,500), 5,648,471, i 5,697,902.

[0154] U predmetnom opisu, molekul antitela i fragment koji nije antitelo spojeni su pomoću linkera. U predmetnom opisu, imunokonjugat je predstavljen formulom (I):

Ab(X-Z)m

u kojoj,

Ab je molekul ovde opisanog anti-GCC antitela;

X je fragment koji povezuje Ab i Z, npr., rezidua ovde opisanog linkera nakon kovalentnog vezivanja za jedno ili oba od Ab i Z;

Z je terapijski agens ili oznaka; i

m je u opsegu od oko 1 do oko 15.

[0155] Varijabila m predstavlja broj fragmenata --X--Z po molekulu antitela u imunokonjugatu formule (I). U predmetnom opisu, m je u opsegu od 1 do 15, 1 do 10, 1 do 9, 1 do 8, 1 do 7, 1 do 6, 1 do 5, 1 do 4, 1 do 3, ili 1 do 2. U predmetnom opisu, m je u opsegu od 2 do 10, 2 do 9, 2 do 8, 2 do 7, 2 do 6, 2 do 5, 2 do 4 ili 2 do 3. U predmetnom opisu, m je 1, 2, 3, 4, 5 ili 6. U kompozicijama koje sadrže mnoštvo imunokonjugata formule (I), m je prosečan broj fragmenata --X--Z po Ab, takođe označen kao prosečno opterećenje lekom. Prosečno opterećenje lekom može da bude u opsegu od 1 do oko 15 fragmenata -X--Z po Ab. U predmetnom opisu, kada m predstavlja prosečno opterećenje lekom, m je oko 1, oko 2, oko 3, oko 4, oko 5, oko 6, oko 7, ili oko 8. U predmetnom opisu, m je od oko 2 do oko 8. U predmetnom opisu, m je oko 8. U predmetnom opisu, m je oko 4. U predmetnom opisu, m je oko 2.

[0156] Prosečan broj fragmenata --X--Z po Ab može da se okarakteriše na uobičajene načine kao što su masena spektroskopija, ELISA test i HPLC. Kvantitativna raspodela imunokonjugata u smislu m može takođe da se odredi. U nekim slučajevima, razdvajanje, prečišćavanje i karakterizacija homogenih imunokonjugata u kojima m predstavlja određenu vrednost, za razliku od imunokonjugata sa drugačijim opterećenjima lekom, može da se postigne pomoću reverzno-fazne HPLC ili elektroforezom.

[0157] Imunokonjugati formule (I) mogu da postoje kao smeše, u kojima svaka komponenta smeše ima drugačiju m vrednost. Na primer, imunokonjugat formule (I) može da postoji kao smeša dve posebne komponente imunokonjugata: jedne komponente imunokonjugata u kojoj m iznosi 7, i druge komponente imunokonjugata u kojoj m iznosi 8.

[0158] U predmetnom opisu, imunokonjugat formule (I) postoji kao smeša tri posebna imunokonjugata u kojoj je m za tri posebna imunokonjugata 1, 2 i 3, redom; 3, 4 i 5, redom; 5, 6 i 7, redom; 7, 8 i 9, redom; 9, 10 i 11, redom; 11, 12 i 13, redom; ili 13, 14 i 15, redom.

[0159] Mnoštvo pogodnih linkera (npr., heterobifunkcionalni reagensi za spajanje molekula antitela sa terapijskim agensom ili oznakom) i metode za pripremu imunokonjugata su poznatu u stanju tehnike. (Videti, na primer, Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992).) Linker može da bude odvojiv, npr., pod fiziološkim uslovima, npr., pod intracelularnim uslovima, tako da odvajanje linkera oslobađa lek (tj., terapijski agens ili oznaku) u intracelularnom okruženju. U predmetnom opisu, linker nije odvojiv, i lek se oslobađa, na primer, degradacijom antitela.

[0160] Linker može da bude vezan za hemijski reaktivnu grupu na fragmentu antitela, npr., za slobodnu amino, imino, hidroksil, tiol ili karboksilnu grupu (npr., za N- ili C-terminus, za epsilon amino grupu jedne ili više lizinskih rezidua, slobodnu grupu karboksilne kiseline jedne ili više rezidua glutaminske kiseline ili asparaginske kiseline, ili za sulfhidrilnu grupu jedne ili više cisteinilskih rezidua). Mesto za koje je linker vezan može da bude prirodna rezidua u aminokiselinskoj sekvenci antitela ili može da bude uvedena u fragment antitela, npr., tehnologijom rekombinantne DNK (npr., uvođenjem cisteina ili mesta cepanja proteazom u aminokiselinsku sekvencu) ili proteinskom biohemijom (npr., redukcija, podešavanje pH ili proteoliza).

[0161] Jedna od najčešće korišćenih nespecifičnih metoda kovalentnog vezivanja je karbodiimidna reakcija za povezivanje karboksi (ili amino) grupa jedinjenja sa amino (ili karboksi) grupama molekula antitela. Dodatno, bifunkcionalni agensi kao što su dialdehidi ili imidoestri korišćeni su za povezivanje amino grupe jedinjenja sa amino grupama molekula antitela. Pogodna za vezivanje leka (tj., terapijskog agensa ili oznake) za molekule antitela je i reakcija Šifove baze. Ovaj postupak uključuje oksidaciju perjodatom leka koji sadrži glikolne ili hidroksi grupe, čime se obrazuje aldehid koji zatim reaguje sa molekulom antitela. Spajanje se odvija putem obrazovanja Šifove baze sa amino grupama molekula antitela. Izotiocijanati mogu takođe da se koriste kao agensi za kuplovanje za kovalentno vezivanje lekova za molekul antitela. Druge tehnike su poznate stručnjaku u oblasti i pripadaju obimu predmetnog opisa.

[0162] U predmetnom opisu, intermedijer, koji je prekursor linkera (X), reaguje sa lekom (Z) pod odgovarajućim uslovima. U predmetnom opisu, koriste se reaktivne grupe na leku i/ili intermedijeru. Proizvod reakcije između leka (tj., terapijskog agensa ili oznake) i intermedijera, ili derivatizovanog leka, nakon toga reaguje sa molekulom antitela pod odgovarajućim uslovima.

[0163] Imunokonjugat može da bude prečišćen od reaktanata korišćenjem metodologija dobro poznatih stručnjacima u oblasti, npr., hromatografijom na koloni (npr., afinitetnom hromatografijom, jonoizmenjivačkom hromatografijom, gel filtracijom, hromatografijom hidrofobnih interakcija), dijalizom, dijafiltracijom ili precipitacijom. Imunokonjugat može da bude procenjen upotrebom metodologija dobro poznatih stručnjacima u oblasti, npr., SDS-PAGE analizom, masenom spektroskopijom, ili kapilarnom elektroforezom.

[0164] U predmetnom opisu, linker je odvojiv pomoću agensa za cepanje koji je prisutan u intracelularnom okruženju (npr., unutar lizozoma ili endozoma ili kaveola). Linker može da bude, npr., peptidil linker koji se cepa intracelularnom peptidazom ili enzimom proteazom, uključujući, ali bez ograničenja, lizozomalne ili endozomalne proteaze. U predmetnom opisu, peptidil linker je dug najmanje dve aminokiseline ili najmanje tri aminokiseline. Agensi za cepanje mogu da uključuju katepsine B i D i plazmin, za koje je poznato da hidrolizuju dipeptidne derivate leka što rezultuje oslobađanjem aktivnog leka (tj., terapijskog agensa ili oznake) unutar ciljnih ćelija (videti, npr., Dubowchik i Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123). Najtipičniji su peptidil linkeri koji mogu da se cepaju pomoću enzima prisutnih u ćelijama koje eksprimiraju GCC. Na primer, može da se koristi peptidil linker koji može da se cepa pomoću tiol-zavisne proteaze katepsina-B, koja je visoko eksprimirana u kanceroznom tkivu (npr., Phe-Leu ili Gly-Phe-Leu-Gly linker (SEQ ID NO:319)). Drugi primeri takvih linkera opisani su, npr., u SAD pat. br. 6,214,345. U predmetnom opisu, peptidil linker koji može da se cepa pomoću intracelularne proteaze je Val-Cit linker ili Phe-Lys linker (videti, npr., SAD pat. br. 6,214,345, koji opisuje sintezu doksorubicina sa val-cit linkerom). Jedna prednost upotrebe intracelularnog proteolitičkog oslobađanja leka (tj., terapijskog agensa ili oznake) je to što je lek tipično oslabljen kada je konjugovan i serumske stabilnosti konjugata su tipično visoke.

[0165] U predmetnom opisu, linker koji može da se iseče je osetljiv na pH, tj., osetljiv na hidrolizu na određenim vrednostima pH. Tipično, linker osetljiv na pH može da hidrolizuje pod kiselim uslovima. Na primer, može da se upotrebi linker osetljiv na kiselu sredinu koji može da hidrolizuje u lizozomu (npr., hidrazon, semikarbazon, tiosemikarbazon, cis-akonitinski amid, ortoestar, acetal, ketal, ili slično). (Videti, npr., SAD pat. br.5,122,368; 5,824,805; 5,622,929; Dubowchik i Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661.) Takvi linkeri su relativno stabilni pod neutralnim pH uslovima, kao što su oni u krvi, ali su nestabilni ispod pH 5.5 ili 5.0, što je približna vrednost pH lizozoma. U predmetnom opisu, linker koji može da hidrolizuje je tioetarski linker (kao što je, npr., tioetar vezan za terapijski agens putem acilhidrazonske veze (videti, npr., SAD pat. br.5,622,929).

[0166] U predmetnom opisu, linker može da se cepa pod redukujućim uslovima (npr., disulfidni linker). Različiti disulfidni linkeri su poznati u stanju tehnike, uključujući, na primer, koji mogu da se obrazuju upotrebom SATA (N-sukcinimidil-5-acetiltioacetat), SPDP (N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)propionat), SPDB (N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)butirat) i SMPT (N-sukcinimidiloksikarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio)toluen)-, SPDB i SMPT (Videti, npr., Thorpe et al., 1987, Cancer Res.47:5924-5931; Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987. Videti takođe SAD pat. br.4,880,935.)

[0167] U predmetnom opisu, linker je malonatni linker (Johnson et al., 1995, Anticancer Res.

15:1387-93), maleimidobenzoil linker (Lau et al., 1995, Bioorg Med. Chem. 3(10):1299-1304), ili 3’-N-amidni analog (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1305-12).

[0168] U predmetnom opisu, jedinica linkera ne može da se cepa i lek (tj., terapijski agens ili oznaka) se oslobađa razgradnjom antitela. (Videti na primer SAD objavu br.20050238649).

[0169] Tipično, linker nije suštinski osetljiv na ekstracelularno okruženje. U značenju koje je ovde primenjeno, "nije suštinski osetljiv na ekstracelularno okruženje", u kontekstu linkera, znači da se ne više od oko 20%, tipično ne više od oko 15%, more tipično ne više od oko 10%, i čak tipičnije ne više od oko 5%, ne više od oko 3%, ili ne više od oko 1% linkera, u uzorku imunokonjugata, cepa kada je imunokonjugat prisutan u ekstracelularnom okruženju (npr., u plazmi). Da li je linker suštinski osetljiv na ekstracelularno okruženje može da se odredi, na primer, inkubacijom imunokonjugata sa plazmom tokom unapred određenog vremenskog perioda (npr., 2, 4, 8, 16, ili 24 časova) i zatim kavantifikovanjem količine slobodnog leka prisutnog u plazmi.

[0170] U predmetnom opisu, linker podstiče ćelijsku internalizaciju. U predmetnom opisu, linker podstiče ćelijsku internalizaciju kada je konjugovan sa terapijskim agensom ili oznakom (Z). U predmetnom opisu, linker podstiče ćelijsku internalizaciju kada je konjugovan i sa Z fragmentom i sa molekulom anti-GCC antitela.

[0171] Različiti primeri linkera koji mogu da se koriste sa predmetnim kompozicijama i metodama opisani su u WO 2004-010957, SAD objavi br.20060074008, SAD objavi br.20050238649 i SAD objavi br.20060024317.

[0172] Primeri linkera koji mogu da se koriste za kuplovanje molekula antitela sa terapijskim agensom ili oznakom uključuju, na primer, maleimidokaproil (mc); maleimidokaproil-paminobenzilkarbamat; maleimidokaproil-peptidaminobenzilkarbamatne linkere, npr., maleimidokaproil-L-fenilalanin-L-lizin-p-aminobenzilkarbamat i maleimidokaproil-L-valin-L-citrulin-p-aminobenzilkarbamat (vc); N-sukcinimidil 3-(2-piridilditio)proprionat (takođe poznat kao N-sukcinimidil 4-(2-piridilditio)pentanoat ili SPP); 4-sukcinimidil-oksikarbonil-2-metil-2-(2-piridilditio)-toluen (SMPT); N-sukcinimidil 3-(2-piridilditio)propionat (SPDP); N-sukcinimidil 4-(2-piridilditio)butirat (SPDB); 2-iminotiolan; S-acetilsukcinski anhidrid; disulfid benzil karbamat; karbonat; hidrazonske linkere; N-(α-maleimidoacetoksi) sucinimidni estar; N-[4-(pazidosalicilamido) butil]-3’-(2’-piridilditio)propionamid (AMAS); N-[.beta.-maleimidopropiloksi]sukcinimid estar (BMPS); [N-ε-maleimidokaproiloksi]sukcinimid estar (EMCS); N-[γ-maleimidobutiriloksi]sukcinimid estar (GMBS); sukcinimidil-4-[N-maleimidometil]cikloheksan-1-karboksi-[6-amidokaproat] (LC-SMCC); sukcinimidil 6-(3-[2-piridilditio]-propionamido)heksanoat (LC-SPDP); m-maleimidobenzoil-N-hidroksisukcinimid estar (MBS); N-sukcinimidil-[4-jodoacetil]aminobenzoat (SIAB); sukcinimidil 4-[N-maleimidometil]cikloheksan-1-karboksilat (SMCC); N-sukcinimidil 3-[2-piridilditio]-propionamido (SPDP); [N-ε-maleimidokaproiloksi]sulfosukcinimid estar (sulfo-EMCS); N-[γmaleimidobutiriloksi]sulfosukcinimid estar (sulfo-GMBS); 4-sulfosukcinimidil-6-metil-α-(2-piridilditio)toluamido]heksanoat) (sulfo-LC-SMPT); sulfosukcinimidil 6-(3’-[2-piridilditio]-propionamido)heksanoat (sulfo-LC-SPDP); m-maleimidobenzoil-N-hidroksisulfosukcinimid estar (sulfo-MBS); N-sulfosukcinimidil[4-jodoacetil]aminobenzoat (sulfo-SIAB); sulfosukcinimidil 4-[N-maleimidometil]cikloheksan-1-karboksilat (sulfo-SMCC); sulfosukcinimidil 4-[pmaleimidofenil]butirat (sulfo-SMPB); etilen glikol-bis(sukcinska kiselina-N-hidroksisukcinimid estar) (EGS); disukcinimidil tartrat (DST); 1,4,7,10-tetraazaciklododekan-1,4,7,10-tetrasirćetnu kiselinu (DOTA); dietilentriamin-pentasirćetnu kiselinu (DTPA); i linkere na bazi tiouree.

[0173] U predmetnom opisu, terapijski agens je citostatski ili citotoksični agens. Primeri uključuju, bez ograničenja, antimetabolite (npr., azatioprin, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, fludarabin, pentostatin, kladribin, 5-fluorouracil (5FU), floksuridin (FUDR), citozin arabinozid (citarabin), metotreksat, trimetoprim, pirimetamin, pemetreksed); alkilirajuće agense (npr., ciklofosfamid, mehloretamin, uramustin, melfalan, hlorambucil, tiotepa/hlorambucil, ifosfamid, karmustin, lomustin, streptozocin, busulfan, dibromomanitol, cisplatin, karboplatin, nedaplatin, oksaliplatin, satraplatin, triplatin tetranitrat, prokarbazin, altretamin, dakarbazin, mitozolomid, temozolomid); antracikline (npr., daunorubicin, doksorubicin, epirubicin, idarubicin, valrubicin); antibiotike (npr., daktinomicin, bleomicin, mitramicin, antramicin, streptozotocin, gramicidin D, mitomicine (npr., mitomicin C), duokarmicine (npr., CC-1065), kaliheamicine); antimitotske agense (uključujući, npr., majtanzinoide, auristatine, dolastatine, kriptoficine, vinka alkaloide (npr., vinkristin, vinblastin, vindesin, vinorelbin), taksane (npr., paklitaksel, docetaksel, ili novi taksan (videti, npr., međunarodnu patentnu objavu br. WO 01/38318, objavljenu 31. maja 2001.)), i kolhicine; inhibitore topoizomeraze (npr., irinotekan, topotekan, amsakrin, etoposid, teniposid, mitoksantron); i inhibitore proteazoma (npr., peptidil boronske kiseline).

[0174] U predmetnom opisu, terapijski agens je majtanzinoid. Jedinjenja majtanzinoida metode za njihovu konjugaciju sa antitelima opisane su, na primer, kod Chari et al., Cancer Res., 52: 127-131 (1992); Widdison et al., J. Med. Chem.49: 4392-4408 (2006); i SAD pat. br.5,208,020 i 6,333,410. Primeri majtanzinoida uključuju analoge majtanzina koji imaju modifikovani aromatični prsten (npr., C-19-dehloro, C-20-demetoksi, C-20-aciloksi) i one koji imaju modifikacije na drugim pozicijama (npr., C-9-CH, C-14-alkoksimetil, C-14-hidroksimetil ili aciloksimetil, C-15-hidroksi/aciloksi, C-15-metoksi, C-18-N-demetil, 4,5-deoksi). U predmetnom opisu, majtanzinoid je N2’ -deacetil-N2’ -(4-merkapto-1-oksopentil)majtanzin (DM3), N2’ -deacetil-N2’ -(3-merkapto-1-oksopropil)-majtanzin (DM1), ili N2’ -deacetil-N2’ -(4-merkapto-4-metil-1-oksopentil)majtanzin (DM4).

[0175] Jedinjenja majtanzinoida koja sadrže sulfhidril grupu mogu da se kupluju sa antitelima upotrebom heterobifunkcionalnog linkera koji je spojen sa jedinjenjem majtanzinoida pomoću tioetarske ili disulfidne veze. U predmetnom opisu, linker je kuplovan sa amino grupom na antitelu (npr., terminalnom amino grupom ili epsilon amino grupom lizinske rezidue. U predmetnom opisu, heterobifunkcionalni linker koji se koristi za kuplovanje jedinjenja majtanzinoida sa antitelom je N-sukcinimidil 3-(2-piridilditio)proprionat (takođe poznat kao N-sukcinimidil 4-(2-piridilditio)pentanoat, ili SPP), 4-sukcinimidil-oksikarbonil-2-metil-2-(2-piridilditio)-toluen (SMPT), N-sukcinimidil 4[N-maleimidometil]cikloheksan-1-karboksilat (SMCC), N-sukcinimidil 3-(2-piridilditio)propionat (SPDP); N-sukcinimidil 4-(2-piridilditio)butirat (SPDB), 2-iminotiolan, ili S-acetilsukcinski anhidrid.

[0176] U predmetnom opisu terapijski agens je dolastatin. U predmetnom opisu, terapijski agens je auristatin, kao auristatin E (takođe poznat u stanju tehnike kao derivat dolastatina-10) ili njihov derivat. Jedinjenja auristatina i metode za njihovu konjugaciju sa antitelima opisane su, na primer, u Doronina et al., Nature Biotech., 21: 778-784 (2003); Hamblett et al, Clin. Cancer Res., 10: 7063-7070 (2004); Carter i Senter, Cancer J., 14 154-169 (2008); SAD pat. br. 7,498,298, 7,091,186, 6,884,869; 6,323,315; 6,239,104; 6,034,065; 5,780,588; 5,665,860; 5,663,149; 5,635,483; 5,599,902; 5,554,725; 5,530,097; 5,521,284; 5,504,191; 5,410,024; 5,138,036; 5,076,973; 4,986,988; 4,978,744; 4,879,278; 4,816,444; i 4,486,414; SAD patentnim objavama br.

20090010945, 20060074008, 20080300192, 20050009751, 20050238649, i 20030083236; i međunarodnim patentnim objavama br. WO 04/010957 i WO 02/088172.

[0177] Auristatin može da bude, na primer, estar obrazovan između auristatina E i keto kiseline. Na primer, auristatin E može da reaguje sa paraacetil benzojevom kiselinom ili benzoilvalerinskom kiselinom da bi se proizveo AEB i AEVB, redom. Drugi tipični auristatini uključuju auristatin fenilalanin fenilendiamin (AFP), monometil auristatin E (MMAE) i monometil auristatin F (MMAF).

[0178] U predmetnom opisu, terapijski agens je radionuklid. Primeri radionuklida koji su korisni kao toksini u radijacionoj terapiji uključuju:<47>Sc,<67>Cu,<90>Y,<109>Pd,<123>I,<125>I,<131>I,<186>Re,<188>Re,<199>Au, 211At, 212Pb i 212B. Drugi radionuklidi koje koriste stručnjaci u ovoj oblasti uključuju:<32>P i<33>P,<71>Ge, 77As, 103Pb, 105Rh, 111Ag, 119Sb, 121Sn, 131Cs, 143Pr, 161Tb, 177Lu, 191Os, 193MPt, 197Hg, sve beta negativne i/ili Ožeove emitere. Neki poželjni radionuklidi uključuju:<90>Y,<131>I,<211>At i<212>Pb/<212>Bi.

[0179] Stručnjak sa prosečnim znanjem u oblasti može da konjuguje molekul anti-GCC antitela sa radionuklidom upotrebom dobro poznatih tehnika. Na primer, Magerstadt, M. (1991) Antibody Conjugates And Malignant Disease, CRC Press, Boca Raton, Fla.,; and Barchel, S. W. and Rhodes, B. H., (1983) Radioimaging and Radiotherapy, Elsevier, NY, N.Y., opisuju konjugaciju različitih terapijskih i dijagnostičkih radionuklida sa aminokiselinama antitela. Takve reakcije mogu da se primene za konjugovanje radionuklida sa molekulima anti-GCC antitela prema opisu sa odgovarajućim helatnim agensom i/ili linkerom.

Sekvence anti-GCC antitela

[0180] Monoklonska anti-GCC antitela kunića su napravljena različitim metodama, kao što se detaljnije razmatra u primerima. Ukratko, monoklonska antitela kunića MIL-44-148-2 i MIL-44-67-4 stvorena su tradicionalnom tehnologijom imunizacije kunića. Originalni hibridomi kunić-kunić stvoreni su u kompaniji Epitomics (Burlingame, CA) fuzijom izolovanih B-ćelija iz imunizovanog kunića sa ćelijskom linijom koja je fuzioni partner, u vlasništvu kompanije Epitomics (videti SAD patente 7,402,409; 7,429,487; 7,462,697; 7,575,896; 7,732,168; i 8,062,867). Specifičnost antitela prema GCC ispitivana je ELISA testom i protočnom citometrijom (FCM).

[0181] Tabela 1 ispod prikazuje monoklonska anti-GCC antitela kunića prema opisu stvorena upotrebom imunogena hGCC(ECD)/mIgG2a FcR-mutII.

[0182] Sekvence varijabilnih regiona lakog i teškog lanca su određene. Tabela 2 ispod je kratak prikaz SEQ ID NO za varijabilne regione nekoliko antitela. Aminokiselinske i sekvence nukleinske kiseline za varijabilne regione svakog od teškog i lakog lanca anti-GCC antitela kunića prikazane su u tabelama 3 i 4, redom.

[0183] Aminokiselinske i sekvence nukleinske kiseline za svaki od CDR teškog i lakog lanca anti-GCC antitela prikazane su u tabelama 5 i 6, redom.

[0184] Sekvenciranje CDR regiona omogućilo je određivanje zastupljenosti rezidua koje mogu da služe kao mesta konjugacije sa toksinom. Na primer, nespareni slobodno cistein u antigenvezujućem regionu mogao bi da bude mesto za konjugaciju auristatina, a lizin bi mogao da bude mesto za konjugaciju majtanzina. Konjugacija toksina sa aminokiselinom u CDR stvorila bi zabrinutost u vezi sa izmenom afiniteta vezivanja antitela za GCC. Tako, u predmetnom opisu CDR regionima nedostaje aminokiselina koja može da bude konjugovana sa terapijskim agensom.

Tabela 1: Rezime SEQ ID NO teških i lakih lanaca anti-GCC mAb kunića

Nukleinska kiselina MIL-44-148-2 H2 (SEQ ID NO: 4)

Nukleinska kiselina MIL-44-148-2 L5 (SEQ ID NO: 5)

Nukleinska kiselina MIL-44-67-4 H2 (SEQ ID NO: 6)

Aminokiselina MIL-44-67-4 H2 (SEQ ID NO: 44)

Aminokiselina MIL-44-67-4 L4 (SEQ ID NO: 45)

Tabela 2: Rezime SEQ ID NO varijabilnih regiona anti-GCC mAb kunića

Tabela 3: Aminokiselinske sekvence mAb varijabilnih regiona anti-GCC mAb kunića

Tabela 4: Sekvence nukleinske kiseline mAb varijabilnih regiona anti-GCC mAb kunića

Tabela 5: Aminokiselinske sekvence CDR anti-GCC mAb kunića

Tabela 6: Sekvence nukleinskih kiselina CDR anti-GCC mAb kunića

Terapijske upotrebe

[0185] Molekuli monoklonskih anti-GCC antitela kunića koja su ovde opisana imaju in vitro i in vivo primene. Na primer, ovi molekuli antitela mogu da se primene na ćelije u kulturi, npr. in vitro ili ex vivo, ili da se primene kod subjekta, npr., in vivo, za lečenje i/ili prevenciju, različitih poremećaja. U određenim primerima izvođenja terapijskih primena prema opisu, molekuli monoklonskih anti-GCC antitela kunića prema opisu su humanizovani, upotrebom jedne ili više tehnika opisanih u ovom dokumentu u tekstu iznad.

[0186] Molekuli antitela, imunokonjugati, i fuzioni proteini koji su ovde opisani mogu da se koriste za modulaciju aktivnosti ili funkcije GCC proteina, kao što je vezivanje liganda (npr., vezivanje ST ili guanilina), prenos signala posredovan sa GCC, održavanje intestinalnog fluida, homeostaza elektrolita, intracelularno oslobađanje kalcijuma (fluks kalcijuma), ćelijska diferencijacija, ćelijska proliferacija, ili ćelijska aktivacija.

[0187] U jednom aspektu, otkriće donosi postupak za ubijanje, inhibiciju ili modulaciju rasta, ili interferira sa metabolizmom, ćelije koja eksprimira GCC. U predmetnom otkriću, otkriće opisuje postupak za inhibiciju ćelijskog prenosa signala posredovanog sa GCC ili postupak za ubijanje ćelija. Postupak može da se koristi sa bilo kojom ćelijom ili tkivom koje eksprimira GCC, kao što je kancerozna ćelija. Primeri kanceroznih ćelija koje eksprimiraju GCC uključuju, ali nisu ograničeni na ćelije kancera gastrointestinalnog porekla (npr., kolorektalni kancer, kancer želuca, kancer tankog creva, ili kancer jednjaka), kancera pankreasa, kancera pluća (npr., karcinom skvamoznih ćelija, adenoskvamozni karcinom, adenokarcinom), sarkoma mekih tkiva kao leiosakrom ili rabdomiosarkom, gastrointestinalnih ili bronhopulmonalnih neuroendokrinih tumora, ili neuroektodermalnih tumora, ili bilo kakvih njihovih metastatskih lezija. Neograničavajući primeri ćelija koje eksprimiraju GCC uključuju T84 ćelije humanog adenokarcinoma debelog creva, sveže ili zamrznute ćelije tumora debelog creva, i ćelije koje sadrže rekombinantnu nukleinsku kiselinu koja kodira GCC ili njegov deo.

[0188] Postupci prema opisu uključuju korake dovođenja u kontakt ćelija sa molekulom anti-GCC antitela ili njegovog imunokonjugata, kao što je ovde opisano, u efikasnoj količini, tj., količini dovoljnoj da inhibira ćelijski prenos signala posredovan sa GCC ili količinom dovoljnom da ubije ćeliju. Postupak može da se koristi na ćelijama u kulturi, npr. in vitro, in vivo, ex vivo, ili in situ. Na primer, ćelije koje eksprimiraju GCC (npr., ćelije sakupljene biopsijom tumora ili metastatske lezije; ćelije iz uspostavljene kancerske ćelijske linije; ili rekombinantne ćelije), mogu da se kultivišu in vitro u medijumu za kulturu i korak dovođenja u kontakt može da bude ostvaren dodavanjem molekula anti-GCC antitela ili imunokonjugata u medijum za kulturu. U postupcima za ubijanje ćelije, postupak obuhvata upotrebu „golog“ molekula anti-GCC antitela, ili imunokonjugata koji sadrži molekul anti-GCC antitela i citotoksičnog agensa. Postupak će rezultovati ubijanjem ćelija koje eksprimiraju GCC, uključujući naročito tumorske ćelije koje eksprimiraju GCC (npr., ćelije tumora debelog creva).

[0189] Ćelijska internalizacija monoklonskih antitela kunića prema opisu, ili njihovih humanizovanih verzija, može da se ispita nakon vezivanja za GCC upotrebom tehnika imunofluorescentne mikroskopije koja je dobro poznata stručnjacima u ovoj oblasti. Takva antitela za koja je potvrđeno da internalizuju bila bi korisna u terapijske svrhe kada su vezana za citotoksični fragment, ili za fragment za snimanje ćelija. Antitela koja ne internalizuju ipak mogu da se koriste u dijagnostičke svrhe ili za terapijske metode upotrebom „golog“ antitela konstruisanog da izazove ćelijski-posredovani citotoksični odgovor zavisan od antitela, ili možda za postupke isporuke pomoću lipozoma.

[0190] Molekuli anti-GCC antitela predmetnog opisa vezuju se za ekstracelularne domene GCC ili njegove delove u ćelijama koje eksprimiraju antigen. Kao rezultat, kada se postupci predmetnog opisa praktično koriste za ubijanje, supresiju, ili detekciju kanceroznih ćelija, antitela ili antigenvezujući fragmenti se vezuju za sve takve ćelije, a ne samo za ćelije koje su fiksirane ili ćelije čiji su intracelularni antigeni domeni na drugi način izloženi ekstracelularnom okruženju. Posledično, vezivanje antitela ili antigen-vezujućih fragmenata, koncentrisano je u oblastima gde ima ćelija koje eksprimiraju GCC, bez obzira na to da li su ove ćelije fiksirane, ili nisu fiksirane, da li su vijabilne ili nekrotične. Dodatno ili alternativno, molekuli anti-GCC antitela, vezuju se za, i internalizuju sa GCC nakon vezivanja za ćelije koje eksprimiraju antigen.

[0191] Postupak takođe može da bude sproveden na ćelijama prisutnim u subjektu, kao deo in vivo protokola. U predmetnom opisu, subjekt je humani subjekt. Alternativno, subjekt može da bude sisar koji eksprimira a GCC antigen sa kojim molekul ovde opisanog anti-GCC antitela unakrsno reaguje.

Molekul anti-GCC antitela ili njegov imunokonjugat može se primeni kod humanog subjekta u terapijske svrhe. Molekul anti-GCC antitela ili imunokonjugat takođe može da se primeni kod nehumanog sisara koji eksprimira antigen sličan GCC sa kojim antitelo unakrsno reaguje (npr., primat, svinja ili miš) u veterinarske svrhe ili kao životinjski model humane bolesti. Životinjski modeli mogu da budu korisni za procenu terapijske efikasnosti antitela prema opisu (npr., ispitivanje doziranja i vremenski tokovi primene). Za in vivo primenu predmetnog opisa, korak dovođenja u kontakt ostvaruje se u subjektu i uključuje primenu molekula anti-GCC antitela ili njegovog imunokonjugata kod subjekta pod uslovima koji su efikasni u omogućavanju vezivanja molekula antitela za ekstracelularni domen GCC eksprimiranog na ćeliji, i lečenju ćelije.

[0192] U predmetnom opisu, otkriće opisuje postupak za lečenje kancera primenom molekula anti-GCC antitela ili imunokonjugata koji sadrži molekul anti-GCC antitela i citotoksičnog agensa kod pacijenta kome je takvo lečenje potrebno. Postupak može da se koristi za lečenje bilo kog kanceroznog poremećaja koji uključuje najmanje neke ćelije koje eksprimiraju GCC antigen. U značenju koje je ovde primenjeno, termin "kancer" namenjen je da uključuje sve tipove kanceroznog rasta ili onkogenih procesa, metastatskih tkiva ili maligno transformisanih ćelija, tkiva, ili organa, bez obzira na histopatološki tip ili stadijum invazivnosti. Termini "kancer" i "tumor" mogu da se koriste međusobno zamenljivo (npr., kada se koriste u kontekstu metoda lečenja, "lečenje kancera" i "lečenje tumora" imaju isto značenje).

[0193] U predmetnom opisu, lečenje je dovoljno da redukuje ili inhibira rast tumora kod subjekta, redukuje broj ili veličinu metastatskih lezija, redukuje tumorsko opterećenje, redukuje primarno tumorsko opterećenje, redukuje invazivnost, produži vreme preživljavanja, ili održi ili poboljša kvalitet života.

[0194] Primeri kanceroznih poremećaja uključuju, ali nisu ograničeni na solidne tumore, tumore mekih tkiva i metastatske lezije. Primeri solidnih tumora uključuju malignitete, npr., sarkome, adenokarcinome i karcinome različitih organskih sistema, kao što su oni koji pogađaju debelo crevo. Adenokarcinomi uključuju malignitete kao što je nesitnoćelijski karcinom pluća. Metastatske lezije gore pomenutih kancera mogu takođe da se leče ili preveniraju upotrebom postupaka i kompozicija prema otkriću.

[0195] U predmetnom opisu, kancer koji eksprimira GCC koji treba da se leči je primarni ili metastatski kancer gastrointestinalnog porekla, kao što je kolorektalni kancer, kancer želuca, kancer tankog creva, ili kancer jednjaka. U predmetnom opisu, kancer koji eksprimira GCC koji treba da se leči je primarni ili metastatski kancer pankreasa. U predmetnom opisu, kancer koji eksprimira GCC koji treba da se leči je primarni ili metastatski kancer pluća, kao što je karcinom skvamoznih ćelija, adenoskvamozni karcinom, ili adenokarcinom. U predmetnom opisu, kancer koji eksprimira GCC koji treba da se leči je sarkom, kao što je leiomiosarkoma ili rabdomiosarkom. U predmetnom opisu, kancer koji eksprimira GCC koji treba da se leči je primarni ili metastazirani neuroektodermalni tumor, kao što je afaehromotcitom ili paragangliom. U predmetnom opisu, kancer koji eksprimira GCC koji treba da se leči je primarni ili metastazirani bronhopulmonalni ili gastrointestinalni neuroendokrini tumor.

[0196] Postupak može da bude koristan za lečenje relevantnog poremećaja bilo kog stadijuma ili podklasifikacije. Na primer, postupak može da se koristi za lečenje ranog ili kasnog stadijuma kancera debelog creva, ili kancera debelog creva bilo kog od stadijuma 0, I, IIA, IIB, IIIA, IIIB, IIIC i IV.

[0197] U predmetnom opisu, postupak za lečenje kancera koji eksprimira GCC (npr., kolorektalni kancer, kancer želuca, kancer tankog creva, kancer jednjaka, kancer pankreasa, kancer pluća, leiomiosarkom, rabdomiosarkom, neuroendokrini tumor, neuroektodermalni tumor itd.) obuhvata primenu kod pacijenta kome je potrebno takvo lečenje „golog“ molekula ovde opisanog anti-GCC antitela. U predmetnom opisu, postupak obuhvata primenu imunokonjugata koji sadrži molekul ovde opisanog anti-GCC antitela i citotoksični agens kao što je majtanzinoid ili auristatin, ili njihovih derivata. Postupci za primenu molekula antitela i imunokonjugata opisani su u tekstu iznad. Pogodne doze molekula koje se koriste zavisiće od starosti i težine subjekta i konkretnog jedinjenja koje se koristi.

[0198] U predmetnom opisu, molekul anti-GCC antitela ili imunokonjugat primenjuju se u ciklusima lečenja. "Ciklus lečenja" sastoji se od perioda lečenja, tokom koga se molekul anti-GCC antitela ili imunokonjugat primenjuje kao što je gore opisano, praćenog periodom odmora, tokom koga se molekul anti-GCC antitela ili imunokonjugat ne primenjuje. Ciklus lečenja može da se ponavlja ako je potrebno da bi se postiglo željeno dejstvo.

[0199] Ovde opisana anti-GCC antitela (npr., “goli” molekuli anti-GCC antitela ili imunokonjugati koji sadrže molekul anti-GCC antitela i terapijski agens) mogu da se koriste u kombinaciji sa drugim terapijama. Na primer, kombinovana terapija može da uključuje kompoziciju predmetnog opisa koformulisanu sa, i/ili zajednički primenjenu sa, jednim ili više dodatnih terapijskih agenasa, npr., jednim ili više anti-kancerskih agenata, npr., citotoksičnim ili citostatskim agensima, hormonskim lečenjem, vakcinama, i/ili drugim imunoterapijama. U predmetnom opisu, anti-GCC antitela se primenjuju u kombinaciji sa drugim terapijskim modalitetima lečenja, uključujući hiruršku operaciju, zračenje, kriohirurgiju, i/ili termoterapiju. Takve kombinovane terapije mogu pogodno da koriste niže doze primenjenih terapijskih agenasa, izbegavajući tako moguću toksičnost ili komplikacije povezane sa različitim monoterapijama.

[0200] Primenjen "u kombinaciji", u značenju koje je ovde primenjeno, znači da se dva (ili više) različitih tretmana primenjuju kod subjekta tokom trajanja perioda u kome subjekat pati od poremećaja, npr., dva ili više tretmana se primenjuju nakon što je kod subjekta dijagnostikovan poremećaj i pre nego što se poremećaj izleči ili otkloni. U predmetnom opisu, primena jednog tretmana se još uvek odvija kada primena drugog počne, tako da postoji preklapanje. To je ponekad ovde označeno kao "istovremena" ili "konkurentna primena". U predmetnom opisu, primena jednog tretmana završava se pre nego što primena drugog počne. U predmetnom opisu, u drugom slučaju, lečenje je efikasnije zbog kombinovane primene. Na primer, drugo lečenje je efikasnije, npr., ekvivalentno dejstvo se javlja sa manje drugog lečenja, ili drugo lečenje redukuje simptome u većem stepenu, nego što bi to bio slučaj kada bi drugo lečenje bilo primenjeno u odsustvu prvog lečenja, ili se analogna situacija javlja kod prvog lečenja. U predmetnom opisu, primena je takva da je redukcija simptoma, ili drugog parametra povezanog sa poremećajem, veća nego što bi to bilo zapaženo sa jednim lečenjem primenjenim u odsustvu drugog. Dejstvo dva lečenja može da bude delimično aditivno, potpuno aditivno, ili veće od aditivnog. Primena može da bude takva da je dejstvo prvog primenjenog lečenja još uvek detektabilno u trenutku kada se primeni drugo.

[0201] U predmetnom opisu, molekul anti-GCC antitela ili njegov imunokonjugat se koristi u kombinaciji sa hemioterapijskim agensom. Neograničavajući primeri hemioterapijskih agenasa koji oštećuju DNK uključuju inhibitore topoizomeraze I (npr., irinotekan, topotekan, kamptotecin i njihove analoge ili metabolite i doksorubicin); inhibitore topoizomeraze II (npr., etoposid, teniposid i daunorubicin); alkilirajuće agense (npr., melfalan, hlorambucil, busulfan, tiotepa, ifosfamid, karmustin, lomustin, semustin, streptozocin, dekarbazin, metotreksat, mitomicin C i ciklofosfamid); interkalatore DNK (npr., cisplatin, oksaliplatin i karboplatin); interkalatore DNK i agense koji stvaraju slobodne radikale kao što je bleomicin; i nukleozidne mimetike (npr., 5-fluorouracil, kapecitibin, gemcitabin, fludarabin, citarabin, merkaptopurin, tioguanin, pentostatin i hidroksiurea).

[0202] Hemioterapijski agensi koji ometaju ćelijsku replikaciju uključuju: paklitaksel, docetaksel i srodne analoge; vinkristin, vinblastin i srodne analoge; talidomid, lenalidomid i srodne analoge (npr., CC-5013 i CC-4047); inhibitore protein tirozin kinaze (npr., imatinib mezilat i gefitinib); inhibitore proteazoma (npr., bortezomib); inhibitore NF-κB, uključujući inhibitore IκB kinaze; antitela koja se vezuju za proteine koji su prekomerno eksprimirani u kancerima i time nishodno regulišu ćelijsku replikaciju (npr., trastuzumab, rituksimab, cetuksimab, i bevacizumab); i druge inhibitore proteina ili enzima za koje se zna da su ushodno regulisani, prekomerno eksprimirani ili aktivirani u kancerima, čija inhibicija nishodno reguliše ćelijsku replikaciju.

[0203] Izbor terapijskog agensa/agenasa ili modaliteta lečenja koji treba da se kombinuje sa molekulom anti-GCC antitela ili imunokonjugata prema opisu zavisiće od poremećaja koji treba da se leči. Dodatni agens/agensi ili modaliteti lečenja mogu da uključuju, na primer, standardne odobrene terapije za indikaciju koja se leči. Na primer, kada se molekul anti-GCC antitela ili njegov imunokonjugat koristi za lečenje kancera debelog creva, može da se koristi u kombinaciji sa, npr., hirurškom operacijom; terapijom zračenjem; 5-fluorouricilom (5-FU), kapecitibinom, leukovorinom, irinotekanom, oksaliplatinom, bevacizumabom, cetuksimabom, panitumumom, ili njihovim kombinacijama (npr., oksaliplatin/kapecitibin (XELOX), 5-fluorouricil/leukovorin/-oksaliplatin (FOLFOX), 5-fluorouricil/leukovorin/irinotekan (FOLFIRI), FOLFOX plus bevacizumab, ili FOLFIRI plus bevacizumab).

[0204] U drugom aspektu, otkriće opisuje upotrebu molekula anti-GCC antitela ili imunokonjugata kao što je ovde opisano u proizvodnji leka. U predmetnom opisu, lek je za lečenje kancera, npr., gastrointestinalnog kancera. U predmetnom opisu, lek sadrži molekul anti-GCC antitela koji ima svojstva prikazana u tabelama 1-6. U predmetnom opisu, lek sadrži MIL-44-148-2 ili MIL-44-67-4 molekul antitela, ili njegovu humanizovanu verziju.

Obeležavanje i detekcija antitela

[0205] Molekuli anti-GCC antitela koji se koriste u ovde opisanim postupcima, npr., u in vitro i in vivo detekciji, npr., dijagnostičkim, metodama određivanja stadijuma, ili metodama snimanja, mogu da budu direktno ili indirektno obeleženi detektabilnom supstancom da bi se olakšala detekcija vezanog ili nevezanog vezujućeg agensa. Pogodne detektabilne supstance uključuju različite biološki aktivne enzime, ligande, prostetičke grupe, fluorescentne materijale, luminiscentne materijale, hemiluminiscentne materijale, bioluminiscentne materijale, hromoforne materijale, elektronski guste materijale, paramagnetne (npr., materijale aktivne pri nuklearnoj magnetnoj rezonanci) materijale i radioaktivne materijale. U predmetnom opisu, molekul anti-GCC antitela je kuplovan sa radioaktivnim jonom, npr., indijumom (111In), jodom (131I ili 125I), itrijumom (90Y), lutecijumom (177Lu), aktinijumom (225Ac), bizmutom (212Bi ili 213Bi), sumporom (35S), ugljenikom (14C), tricijumom (3H), rodijumom (188Rh), tehnicijumom (99mTc), prazeodijumom, ili fosforom (32P); ili radionuklidom koji emituje pozitrone, npr., ugljenikom-11 (11C) kalijumom-40 (40K), azotom-13 (13N), kiseonikom-15 (15O), fluorom-18 (18F), galijumom (68Ga), i jodom-121 (121I). Dodatni radioaktivni agensi koji mogu da budu konjugovani sa antitelima opisa za upotrebu u in vitro ili in vivo dijagnostičkim metodama/metodama detekcije opisani su ispod.

[0206] Primeri oznaka uključuju fluorofore kao što su helati retkih zemljanih elemenata ili fluorescein i njegovi derivati, rodamin i njegovi derivati, dansil, umbeliferon, luceriferaze, npr., luciferaza svica i bakterijska luciferaza (SAD pat. br. 4,737,456), luciferin, i 2,3-dihidroftalazindioni. Drugi primeri oznaka uključuju peroksidazu rena (HRP), alkalnu fosfatazu, galaktozidazu, glukoamilazu, lizozim, oksidaze saharida, npr., oksidazu glukoze, oksidazu galaktoze, i glukoza 6-fosfat dehidrogenazu, heterociklične oksidaze kao što je urikaza i ksantin oksidaza, kuplovane sa enzimom koji koristi vodonik peroksid da oksiduje prekursor boje kao što je HRP, laktoperoksidazu, ili mikroperoksidazu, biotin/avidin, spin oznake, bakteriofagne oznake, stabilne slobodni radikali, i slično.

[0207] Molekuli antitela obeleženi fluoroforom i hromoforom mogu da se pripreme od standardnih fragmenata poznatih u stanju tehnike. Budući da antitela i drugi proteini apsorbuju svetlost talasne dužine do oko 310 nm, fluorescentni fragmenti bi trebalo da budu odabrani tako da suštinski apsorbuju na talasnoj dužini iznad 310 nm i poželjno iznad 400 nm. Mnoštvo pogodnih fluorescentnih jedinjenja i hromofora opisano je u Stryer Science, 162:526 (1968) i Brand, L. et al. Annual Review of Biochemistry, 41:843-868 (1972). Antitela mogu da budu obeležena fluorescentnim hromofornim grupama uobičajenim procedurama kao što su one opisane u SAD pat. br. 3,940,475, 4,289,747, i 4,376,110.

[0208] Jednu grupu fluorescentnih agenasa koji imaju brojna poželjna svojstva opisana gore u tekstu čine ksantenske boje, koje uključuju fluoresceine poreklom od 3,6-dihidroksi-9-henilksantidrola i rezamine i rodamine poreklom od 3,6-diamino-9-fenilksantidrola i lisamin rodamina B. Rodamin i derivati fluoresceina 9-o-karboksifenilksantidrola imaju 9-o-karboksifenil grupu. Jedinjenja fluoresceina koja imaju reaktivne kuplujuće grupe kao što su amino i izotiocijanatne grupe, kao što je fluorescein izotiocijanat i fluorescamin, su lako dostupna. Još jedna grupa fluorescentnih jedinjenja su naftilamini, koji imaju amino grupu na α ili β poziciji.

[0209] Obeleženi molekuli antitela mogu da se koriste, na primer, dijagnostički i/ili eksperimentalno u brojnim kontekstima, uključujući (i) izolovanje unapred određenog antigena pomoću standardnih tehnika, kao što je afinitetna hromatografija ili imunoprecipitacija; (ii) detekciju unapred određenog antigena (npr., u ćelijskom lizatu ili ćelijskom supernatantu) kako bi se procenila zastupljenost i obrazac ekspresije proteina; (iii) praćenje nivoa proteina u tkivu kao deo procedure kliničkog ispitivanja, npr., zao određivanje efikasnosti datog režima lečenja.

In vitro dijagnostika

[0210] Anti-GCC antitela i imunokonjugati koji su ovde opisani mogu da se koriste za detekciju prisustva ili odsustva GCC, npr., za detekciju prisustva ili odsustva GCC u ex vivo biološkom uzorku dobijenom od subjekta (tj., in vitro detekcija), ili za detekciju prisustva ili raspodele ili odsustva GCC kod subjekta (tj., in vivo detekcija). Takvi postupci za detekciju korisni su za detektovanje ili dijagnostikovanje različitih poremećaja, ili za usmeravanje terapijskih odluka. Termin "detektovanje" u značenju koje je ovde primenjeno obuhvata kvantitativno ili kvalitativno detektovanje. Detektovanje GCC ili GCC proteina, u značenju koje je ovde primenjeno, označava detektovanje intaktnog GCC proteina ili detektovanje dela GCC proteina koji sadrži epitop za koji se molekul anti-GCC antitela vezuje.

[0211] Prema tome, u drugom aspektu, otkriće opisuje, postupak za detekciju ekspresije GCC u biološkom uzorku kao što je ćelija ili tkivo, npr., tumorska ćelija, ili tumor koji ima jednu ili više ćelija koje eksprimiraju GCC. Postupak obuhvata: dovođenje u kontakt biološkog uzorka, sa molekulom ovde opisanog anti-GCC antitela (npr., MIL-44-148-2 ili MIL-44-67-4), pod uslovima koji omogućavaju obrazovanje kompleksa između molekula anti-GCC antitela i GCC proteina; i detekciju obrazovanja kompleksa između molekula anti-GCC antitela i GCC proteina, čime se detektuje prisustvo GCC proteina, npr., da bi se detektovala ćelija ili tumor koji eksprimiraju GCC.

[0212] U predmetnom opisu, molekul anti-GCC antitela je imunokonjugat koji sadrži detektabilnu oznaku. Detektabilna oznaka može da bude radioaktivni agens. Alternativno, detektabilna oznaka je neradioaktivni agens (npr. fluorofor ili hromofor kao što je gore opisano).

[0213] U predmetnom opisu, biološki uzorak uključuju normalne i/ili kancerozne ćelije ili tkiva koja eksprimiraju GCC. Primeri normalnih ćelija ili tkiva koja eksprimiraju GCC uključuju, ali nisu ograničeni na ćelije ili tkivo gastrointestinalnog porekla, posebno normalne kolorektalne ćelije ili tkivo. Primeri kanceroznih ćelija ili tkiva koja eksprimiraju GCC uključuju, ali nisu ograničeni na: kancer gastrointestinalnog porekla, kao što je kolorektalni kancer, kancer želuca, kancer tankog creva i kancer jednjaka; kancer pankreasa; kancer pluća kao što je karcinom skvamoznih ćelija, adenoskvamozni karcinom i adenokarcinom; sarkomi mekih tkiva kao što je leiomiosarkom i rabdomiosarkom; gastrointestinalni i bronhopulmonalni neuroendokrini tumori; i neuroektodermalni tumori. U predmetnom opisu, tkiva normalnih i/ili kanceroznih ćelija mogu da eksprimiraju GCC na višim nivoima u odnosu na druga tkiva, na primer drugo tkivo kao što su B ćelije i/ili tkiva udružena sa B ćelijama.

[0214] Ovde opisani postupci za detekciju, in vitro ili in vivo, mogu da se koriste za ocenu poremećaja kod subjekta. U predmetnom opisu, poremećaj je ćelijski proliferativni poremećaj, kao što je kancer ili tumor, npr., kolorektalni kancer, kancer želuca ili kancer pankreasa.

[0215] U jednom aspektu, otkriće opisuje, postupak za detekciju the prisustva ili odsustva GCC proteina u biološkom uzorku in vitro (npr., npr., u biopsiji ćelije ili tkiva dobijenoj od subjekta). Postupak obuhvata: (i) dovođenje u kontakt biološkog uzorka dobijenog od subjekta sa molekulom anti-GCC antitela ili njegovim imunokonjugatom i (ii) detektovanje obrazovanja kompleksa između molekula anti-GCC antitela i GCC proteina. Obrazovanje kompleksa ukazuje na prisustvo ili nivo GCC proteina u biološkom uzorku, dok izostanka obrazovanja kompleksa ukazuje na odsustvo GCC proteina u biološkom uzorku.

[0216] Biološki uzorci dati kao primer za ovde opisane postupke obuhvataju ćeliju, ćelije, tkivo ili telesnu tečnost, kao što je inflamatorni eksudat, krv, serum, crevna tečnost, uzorak stolice. U predmetnom opisu, biološki uzorak obuhvata kanceroznu ćeliju/ćelije ili tkivo. Na primer, uzorak može da bude biopsija tumora, npr., biopsija kolorektalnog tumora, tumora želuca, tumora jednjaka, tumora tankog creva, tumora pluća, sarkoma mekih tkiva, neuroendokrinog tumora, neuroektodermalnog tumora, ili iz uzorka tkiva sa bilo kog mesta metastaze navedenog. U predmetnom opisu, biološki uzorak može da bude krv ili drugi fluid, pri čemu fluid sadrži ćeliju kancera. Biološki uzorak može da bude dobijen upotrebom bilo kojom od brojnih metoda u stanju tehnike. Dalje, biološki uzorak može da bude obrađen fiksativom kao što je formaldehid i ukalupljen u parafin i isečen za upotrebu. Alternativno, može da se koristi sveže ili smrznuto tkivo. U predmetnom opisu, mogu da se koriste aspirati uzeti tankim iglama.

[0217] U predmetnom opisu, ispitivana ćelija ili tkivo dobijeno je od osobe za koju se sumnja da ima poremećaj udružen sa ekspresijom GCC. U predmetnom opisu, ispitivana ćelija ili tkivo dobijeno je od osobe za koju se sumnja da ima poremećaj udružen sa ekspresijom GCC na lokaciji drugačijoj od apikalne površine intestinalnih epitelnih ćelija (npr., citoplazmatska ekspresija GCC u intestinalnim epitelnim ćelijama), ili poremećaj udružen sa ekspresijom GCC u ćelijama ili tkivu koje ne pripadaju tankom crevu, kao što je pankreasno, plućno, meko tkivo, ili tkivo neuroendokrinog ili neuroektodermalnog porekla. U predmetnom opisu, ispitivana ćelija ili tkivo dobijeno je od osobe za koju se sumnja da ima poremećaj udružen sa povećanom ekspresijom GCC.

[0218] U predmetnom opisu nivo GCC, u uzorku dobijenom od subjekta, ili u subjektu, poredi se sa referentnim nivoom, npr., nivo GCC u kontrolnom materijalu, npr., normalnoj ćeliji istog tkivnog porekla kao ćelija subjekta ili ćeliji koja ima GCC na nivoima uporedivim sa takvom normalnom ćelijom. Postupak može da obuhvata, npr., reagovanje na otkriveni nivo GCC, davanje dijagnoze, prognoze, procenu efikasnosti lečenja, ili određivanje stadijuma poremećaja. Viši nivo GCC u uzorku ili kod subjekta, u poređenju sa kontrolnim materijal, ukazuje na prisustvo poremećaja udruženog sa povećanom ekspresijom GCC. Viši nivo GCC u uzorku ili kod subjekta, u poređenju sa kontrolnim materijalom, može takođe da ukazuje na relativni nedostatak efikasnosti lečenja, relativno lošiju prognozu, ili kasniji stadijum bolesti. Nivo GCC može takođe da se koristi za procenu ili izbor budućeg lečenja, npr., potrebe za više ili manje agresivnim lečenjem, ili potrebe za prelaskom sa jednog režima lečenja na drugi. U predmetnom opisu, postupci dalje obuhvataju izbor terapije usmerene na GCC, npr., ovde opisane GCC-ciljane terapije, na osnovu, bar delom, određenih nivoa GCC, i opciono primenu odabrane GCC-ciljane terapije kod subjekta.

[0219] Obrazovanje kompleksa između molekula anti-GCC antitela i GCC može da bude detektovano merenjem ili vizuelizacijom antitela (ili fragmenta antitela) vezanog za GCC antigen ili nevezanog molekula antitela. Stručnjak sa prosečnim znanjem u oblasti može lako da zna mnoštvo načina za detekciju vezivanja anti-GCC antitela za GCC. Takvi postupci uključuju, ali nisu ograničeni na antigen-vezujuće testove poznate u stanju tehnike, kao što su vestern blotovi, radioimunoeseji, ELISA (enzimski vezani imunosorbentni test), "sendvič" imunoeseji, imunoprecipitacioni testovi, fluorescentni imunoeseji, protein A imunoeseji, i imunohistohemija (IHC).

[0220] U predmetnom opisu, GCC se detektuje ili meri imunohistohemijski upotrebom anti-GCC antitela prema opisu. Imunohistohemijske tehnike mogu da se koriste za identifikovanje i esencijalno bojenje ćelija koje eksprimiraju GCC. Takvo "bojenje" omogućava analizu metastatske migracije. Anti-GCC antitela kao što su ona koja su ovde opisana dovode se u kontakt sa fiksiranim ćelijama i GCC koji je prisutan u ćelijama reaguje sa antitelima. Antitela su detektabilno obeležena ili se detektuju upotrebom obeleženog drugog antitela ili proteina A za bojenje ćelija. U predmetnom opisu, za detekciju ili merenje ekspresije GCC u biološkom uzorku koristi se antitelo MIL44-148-2 u testu IHC.

[0221] Mogu da se koriste i drugi konvencionalni testovi za detekciju, npr., vestern blotovi, radioimunoeseji, ELISA (enzimski vezani imunosorbentni test), "sendvič" imunoeseji, imunoprecipitacioni testovi, fluorescentni imunoeseji, protein A imunoeseji, i imunohistohemija (IHC) ili radioimunoesej (RIA).

[0222] Kao alternativa obeležavanju molekula anti-GCC antitela, prisustvo GCC u uzorku može da se ispita pomoću kompetitivnog imunoeseja upotrebom standarda obeleženih detektabilnom supstancom i neobeleženog molekula anti-GCC antitela. U ovom testu, kombinuju se biološki uzorak, obeleženi standardi i GCC-vezujući agens i određuje se količina obeleženog standarda vezanog za neobeleženo antitelo. Količina GCC u uzorku je obrnuto proporcionalna količini obeleženog standarda vezanog za GCC-vezujući agens.

[0223] Moguće je i direktno detektovati obrazovanje kompleksa GCC sa molekulom anti-GCC antitela bez dodatne manipulacije ili obeležavanja bilo koje od komponenti (GCC ili molekula antitela), na primer upotrebom tehnike fluorescentnog transfera energije (FET, videti, na primer, Lakowicz et al., SAD pat. br. 5,631,169; Stavrianopoulos, et al., SAD pat. br. 4,868,103). Fluoroforna oznaka na prvom, "donorskom" molekulu bira se tako da, nakon ekscitacije udarom svetlosti odgovarajuće talasne dužine, fluorescentnu energiju koju on emituje apsorbuje fluorescentna oznaka na drugom "akceptorskom" molekulu, koji je zauzvrat sposoban da fluorescira zahvaljujući apsorbovanoj energiji. Alternativno, "donorski" proteinski molekul može jednostavno da koristi prirodnu fluorescentnu energiju triptofanske rezidue. Odabrane su oznake koje emituju različite talasne dužine svetlosti, tako da oznaka "akceptorskog" molekula može da se razlikuje od one na "donoru". Budući da je efikasnost prenosa energije između oznaka povezana sa rastojanjem koje razdvaja molekule, prostorni odnosi između molekula mogu da se procene. U situaciji u kojoj dolazi do vezivanja između molekula, fluorescentna emisija oznake "akceptorskog" molekula u testu bi trebalo da bude maksimalna. FET događaj vezivanja može da bude pogodno meren putem standardnih načina fluorometrijske detekcije dobro poznatim u stanju tehnike (npr., upotrebom fluorimetra).

[0224] U drugom primeru, određivanje sposobnosti molekula antitela da prepoznaju GCC može da se postigne bez obeležavanja bilo koje komponente testa (GCC ili molekula antitela) upotrebom tehnologije kao što je analiza biomolekulske interakcije u realnom vremenu (BIA) (videti, npr., Sjolander, S, i Urbaniczky, C., 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345 i Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705). U značenju koje je ovde primenjeno, "BIA" ili "rezonanca površinskog plazmona" je tehnologija za ispitivanje biospecifičnih interakcija u realnom vremenu, bez obeležavanja bilo kog od interagujućih elemenata (npr., BIACORE™). Promene mase na površini vezivanja (indikativne za događaj vezivanja) rezultuju izmenama refraktornog indeksa svetlosti blizu površine (optički fenomen rezonance površinskog plazmona (SPR)), što daje detektabilni signal koji može da se koristi kao indikacija reakcija u realnom vremenu između bioloških molekula.

[0225] U nekim aspektima, otkriće opisuje reakcionu smešu koja uključuje molekul ovde opisanog antitela (npr., imunokonjugat koji uključuje ovde opisani molekul antitela i, npr., oznaku) i biološki uzorak, npr., ovde opisani biološki uzorak. U predmetnom opisu, reakciona smeša može da uključuje molekul ovde opisanog antitela (npr., imunokonjugat koji uključuje molekul ovde opisanog antitela i, npr., oznaku) i GCC dobijen iz biološkog uzorka, npr., ovde opisanog biološkog uzorka.

[0226] U predmetnom opisu, postupak, kao što su oni koji su ovde opisani, obuhvata detektovanje vezivanja anti-GCC antitela za GCC eksprimiran na površini ćelije ili u preparatu membrane dobijene iz ćelije koja eksprimira GCC na svojoj površini. U predmetnom opisu, postupak obuhvata dovođenje u kontakt ćelije sa anti-GCC antitelom pod uslovima koji omogućavaju vezivanje anti-GCC antitela za GCC, i utvrđivanje da li je obrazovan kompleks između anti-GCC antitela i GCC na površini ćelije. Primer testa za detektovanje vezivanja anti-GCC antitela za GCC eksprimiranog na površini ćelije je test "FACS".

In vivo dijagnostika

[0227] U predmetnom opisu, otkriće opisuje postupak za detekciju prisustva ili odsustva ćelija ili tkiva koja eksprimiraju GCC in vivo. Postupak uključuje (i) primenu kod subjekta (npr., pacijenta koji ima kancer) molekula anti-GCC antitela prema opisu (tj., MIL-44-148-2 ili MIL-44-67-4), ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, poželjno antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta konjugovanog sa detektabilnom oznakom ili markerom; (ii) izlaganje subjekta sredstvima za detektovanje navedene detektabilne oznake ili markera u tkivima ili ćelijama koje eksprimiraju GCC. Takvi in vivo postupci mogu da se koriste za procenu, dijagnozu, određivanje stadijuma i/ili prognozu kod pacijenta koji pati od poremećaja kao što je kancer. Postupak obuhvata: (i) primenu kod subjekta molekula anti-GCC antitela ili njegovog imunokonjugata; i (ii) detektovanje obrazovanja kompleksa između molekula anti-GCC antitela i GCC proteina. Obrazovanje kompleksa ukazuje na prisustvo ili nivo GCC kod subjekta, dok izostajanje obrazovanja kompleksa ukazuje na odsustvo GCC kod subjekta.

[0228] Kod takvih osoba može da se dijagnostikuje da pate od metastaziranja kancera koji eksprimira GCC, i ćelije metastaziranog kancera koje eksprimiraju GCC mogu da se detektuju primenom kod osobe, poželjno intravenskom primenom, farmaceutske kompozicije koja sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač i konjugovano jedinjenje koje sadrži molekul anti-GCC antitela i aktivni fragment pri čemu je aktivni fragment radioaktivni agens, i detektovanjem prisustva lokalizovanog nakupljanja ili agregacije radioaktivnosti, što ukazuje na prisustvo ćelija koje eksprimiraju GCC. U predmetnom opisu predmetnog otkrića, farmaceutska kompozicija sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač i konjugovano jedinjenje koje sadrži molekul anti-GCC antitela i aktivni fragment pri čemu je aktivni fragment radioaktivni agens i molekul anti-GCC antitela je ovde opisano MIL-44-148-2 antitelo, ili njegovi fragmenti ili derivati.

[0229] U predmetnom opisu, radionuklidi mogu da budu konjugovani sa molekulom anti-GCC antitela opisa za upotrebu kao agens za snimanje u in vivo procedurama snimanja. Agensi za snimanje su korisne dijagnostičke procedure kao i procedure koje se koriste za identifikovanje lokacije metastaziranih ćelija. Na primer, osobama može da se dijagnostikuje da pate od metastaziranog kolorektalnog kancera i ćelije metastaziranog kolorektalnog kancera mogu da se detektuju primenom kod osobe, poželjno intravenskom primenom, farmaceutske kompozicije koja sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač i konjugovano jedinjenje koje sadrži molekul anti-GCC antitela prema opisu i aktivni fragment pri čemu je aktivni fragment radioaktivni agens, i da se detektuje prisustvo lokalizovanog nakupljanja ili agregacije radioaktivnosti, što ukazuje na prisustvo ćelija koje eksprimiraju GCC.

[0230] Snimanje može da se sprovede pomoću mnogih procedura koje su dobro poznate stručnjacima u oblasti i odgovarajući agens za snimanje koristan u takvim procedurama može da se konjuguje sa molekulom anti-GCC antitela opisa na dobro poznate načine. Primeri oznaka korisnih za dijagnostičko snimanje u skladu sa predmetnim opisom su radioaktivne oznake kao što su:<32>P, 3H, 14C, 188Rh, 43K, 52Fe, 57Co, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 77Br, 81Rb/ 81MKr, 87MSr, 99Tc, 111In, 113M In, 123I, 125I, 127Cs, 129Cs, 131I, 132I, 197Hg, 203Pb i 206Bi, i 213Bi; fluorescentne oznake kao što je fluorescein i rodamin; oznake aktivne pri nuklearnoj magnetnoj rezonanci; izotopi kiseonika, azota, gvožđa, ugljenika, ili galijuma (npr., 68Ga, 18F) koji emituju pozitrone detektabilni pomoću detektora jednofotonske emisione kompjuterizovane tomografije ("SPECT") ili skenera pozitronske emisione tomografije ("PET"); hemiluminiscentna jedinjenja kao što je luciferin; i enzimski markeri kao što je peroksidaza ili fosfataza. Emiteri zračenja kratkog dometa, kao što su izotopi detektabilni probamadetektorima kratkog dometa, kao što je transrektalna proba, mogu takođe da se koriste. Snimanje može da se sprovede i, na primer, radioscintigrafijom, snimanjem nuklearnom magnetnom rezonancom (MRI) ili kompjuterizovanom tomografijom (CT skeniranje). Snimanje pomoću CT skeniranja može da koristi teški metal kao što su helati gvožđa. MRI skeniranje može da koristi helate gadolinijuma ili mangana.

[0231] Antitelo može da bude obeleženo takvim reagensima upotrebom tehnika poznatih u ovoj oblastie. Na primer, Magerstadt, M. (1991) Antibody Conjugates And Malignant Disease, CRC Press, Boca Raton, Fla.; and Barchel, S. W. and Rhodes, B. H., (1983) Radioimaging and Radiotherapy, Elsevier, NY, N.Y., opisuje konjugaciju različitih terapijskih i dijagnostičkih radionuklida sa aminokiselinama antitela. Takve reakcije mogu da se primene na konjugat radionuklidda sa anti-GCC molekulima antitela prema opisu sa odgovarajućim helatnim agensom i/ili linkerom. Videti takođe Wensel i Meares (1983) Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, N.Y., za tehnike koje se odnose na radioaktivno obeležavanje antitela. Videti takođe, D. Colcher et al. Meth. Enzymol.121: 802-816 (1986).

[0232] U slučaju radioaktivno obeleženog antitela, antitelo koje se primenjuje kod pacijenta, lokalizovano je na tumoru koji nosi antigen sa kojim antitelo reaguje, i detektuje se ili "snima" in vivo upotrebom poznatih tehnika kao što je radionuklearno skeniranje upotrebom npr., gama kamera ili emisionom tomografijom ili kompjuterizovanom tomografijom. Videti npr., A. R. Bradwell et al., "Developments in Antibody Imaging", Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, R. W. Baldwin et al., (eds.), pp 65-85 (Academic Press 1985). Alternativno, skener pozitronske emisione transaksijalne tomografije, kao što je naznačeni Pet VI smešten u Nacionalnoj laboratoriji Brookhaven, može da se koristi kada radioaktivna oznaka emituje pozitrone (npr.,<11>C,<18>F,<15>O, i 13N, 68Ga).

[0233] U predmetnom opisu, otkriće opisuje postupke za određivanje doze, npr., doze zračenja, kojoj se različita tkiva izlažu kada se kod subjekta, npr., humanog subjekta, primeni molekul anti-GCC antitela koji je konjugovan sa radioaktivnim izotopom. Postupak uključuje: (i) primenu molekula anti-GCC antitela kao što je ovde opisano, npr., molekula anti-GCC antitela, koje je obeleženo radioaktivnim izotopom kod subjekta; (ii) merenje količine radioaktivnog izotopa lokalizovanog u različitim tkivima, npr., tumoru, ili krvi, u različitim vremenskim tačkama dok deo ili sav radioaktivni izotop ne bude eliminisan iz tela subjekta; i (iii) izračunavanje ukupne doze radijacije koju je primilo svako analizirano tkivo. Merenje može da se obavi u vremenskim tačkama prema rasporedu, npr., dan 1, 2, 3, 5, 7, i 12, nakon primene (na dan 0) radioaktivno obeleženog molekula anti-GCC antitela kod subjekta. Koncentracija radioizotopa prisutna u datom tkivu, integrisana tokom vremena, i pomnožena specifičnom aktivnošću radioizotopa može da se koristi za izračunavanje doze koju dato tkivo prima. Farmakološka informacija dobijena upotrebom molekula anti-GCC antitela obeleženih radioaktivnim izotopom, npr., gama-emiterom, npr.,<111>In može da se koristi za izračunavanje očekivane doze koju bi isto tkivo primilo iz drugog radioaktivnog izotopa koji ne može lako da se meri, npr., beta-emitera, npr.,<90>Y.

Prateća dijagnostika za GCC-ciljanu terapiju

[0234] In vitro i in vivo dijagnostički postupci koji su ovde opisani korisni su za dobijanje informacije da li pacijent koji pati od proliferativne bolesti kao što je kancer, ili od gastrointestinalnog poremećaja kao što je sindrom zapaljenja debelog creva, Kronova bolest ili konstipacija, treba da se leči, ili ne, GCC-ciljanom terapijom, na osnovu prisustva ili odsustva, redom, ekspresije GCC na površini ili unutar ćelija ili tkiva pacijenta. Pacijent koji ima još jednu ćeliju koja eksprimira GCC na površini ćelije ili unutar ćelije je kandidat za lečenje GCC-ciljanom terapijom.

[0235] U određenim aspektima, otkriće opisuje postupak za određivanje osetljivosti pacijenta za koga se sumnja da pati od bolesti ili poremećaja koji eksprimira GCC na GCC-ciljanu terapiju, koji obuhvata korake: (i) dovođenja u kontakt biološkog uzorka dobijenog od subjekta sa molekulom anti-GCC antitela opisa; (ii) detektovanja obrazovanja kompleksa između molekula anti-GCC antitela i GCC proteina; pri čemu obrazovanje kompleksa ukazuje na prisustvo ili nivo GCC proteina u biološkom uzorku, pri čemu izostajanje obrazovanja kompleksa ukazuje na odsustvo GCC proteina u biološkom uzorku, čime se određuje osetljivost pacijenta na GCC-ciljanu terapiju. U predmetnom opisu, obrazovanje kompleksa između molekula anti-GCC antitela i GCC proteina u biološkom uzorku detektuje se putem imunohistohemije upotrebom molekula ovde opisanog antitela, npr., ovde opisanog MIL-44-1482 antitela.

[0236] Biološki uzorci dati kao primer mogu da obuhvataju ćeliju, ćelije, tkivo ili telesnu tečnost, kao što je inflamatorni eksudat, krv, serum, crevna tečnost, uzorak stolice. U predmetnom opisu, biološki uzorak obuhvata kanceroznu ćeliju/ćelije ili tkivo. Na primer, uzorak može da bude biopsija tumora, npr., biopsija kolorektalnog tumora, tumora želuca, tumora jednjaka, tumora tankog creva, tumora pluća, sarkoma mekih tkiva, neuroendokrinog tumora, neuroektodermalnog tumora, ili iz uzorka tkiva sa bilo kog mesta metastaze navedenog. U predmetnom opisu, biološki uzorak može da bude krv ili drugi fluid, pri čemu fluid sadrži ćeliju kancera. Biološki uzorak može da bude dobijen upotrebom bilo kojom od brojnih metoda u stanju tehnike. Dalje, biološki uzorak može da bude obrađen fiksativom kao što je formaldehid i ukalupljen u parafin i isečen za upotrebu. Alternativno, može da se koristi sveže ili smrznuto tkivo. U predmetnom opisu, mogu da se koriste aspirati uzeti tankim iglama.

[0237] Primeri bolesti/poremećaja koji mogu da se procene (npr., dijagnostikuju) i leče upotrebom pratećih dijagnostičkih metoda koje su ovde opisane uključuju, ali bez ograničenja, proliferativne poremećaje uključujući, ali bez ograničenja, kolorektalni kancer, kancer želuca, kancer tankog creva, kancer jednjaka, kancer pankreasa, kancer pluća (npr., karcinom skvamoznih ćelija, adenoskvamozni karcinom, adenokarcinom), sarkom mekih tkiva kao što je leiomiosarkom i rabdomiosarkom, gastrointestinalne i bronhopulmonalne neuroendokrine tumore, i neuroektodermalne tumore, gastrointestinalne poremećaje, kao što je sindrom zapaljenja debelog creva, Kronova bolest i konstipacija, i neurološke poremećaje kao što je Parkinsonova bolest.

[0238] Postupci prema opisu usmeravaju odluke lekara pri određivanju da li da leči pacijenta GCC-ciljanom terapijom. Postupci koji su ovde obezbeđeni takođe omogućavaju stvaranje personalizovanog izveštaja o lečenju, npr., personalizovanog izveštaja o lečenju kancera, npr., pomoću ovde opisane GCC-ciljane terapije.

[0239] GCC-ciljana terapija je terapijski agens koji leči ili sprečava bolest koja eksprimira GCC ili GCC-posredovanu bolest, npr., bolest koja eksprimira GCC ili GCC-posredovanu bolest kao što je ovde opisano. U određenim aspektima opisa, GCC-ciljana terapija je GCC-ligand kao što je molekul anti-GCC antitela ili peptidni ligand (npr., ST peptid) konjugovan sa agensom, kao što je terapijski agens. Primeri GCC-liganda konjugovanih sa terapijskim agensima (tj., imunokonjugati) opisani su u, npr., objavljenoj SAD patentnoj prijavi br. 20110110936. U predmetnom opisu, GCC-ciljani terapijski agens je humano IgG1 monoklonsko anti-GCC antitelo konjugovano sa citotoksičnim agensom, pri čemu mAb uključuje varijabilni region lakog lanca (VL) koji ima tri regiona za određivanje komplementarnosti (CDR1, CDR2, i CDR3) lakog lanca i varijabilni region teškog lanca (VH) koji ima tri regiona za određivanje komplementarnosti (CDR1, CDR2, i CDR3) teškog lanca navedena u tabelama 7 (aminokiselinske sekvence) i 8 (odgovarajuće sekvence nukleinske kiseline) ispod, i varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca navedene u tabelama 9 (aminokiselinske sekvence) i 10 (odgovarajuće sekvence nukleinske kiseline) ispod.

Tabela 7: Aminokiselinska sekvenca VL CDR i VH CDR

Tabela 8: Sekvenca nukleinske kiseline VL CDR i VH CDR

Tabela 9: Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona mAb

Tabela 10: Sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog regiona mAb

[0240] Aminokiselinske sekvence i odgovarajuće sekvence nukleinske kiseline za cele sekvence teškog lanca hIgG1 i lakog lanca hKapa koje sadrže VL CDR i VH CDR prikazane u tabelama 7 i 8, i varijabilne regione teškog i lakog lanca prikazane u tabelama 9 i 10, navedene su ispod:

Nukleotidna sekvenca teškog lanca hIgG1 je:

Proteinska sekvenca teškog lanca hIgG1 je;

Nukleotidna sekvenca lakog lanca Kapa je:

Proteinska sekvenca lakog lanca hKapa je:

[0241] U jednom određenom aspektu opisa, GCC-ciljana terapija je imunokonjugat koji ima anti-GCC molekul antitela konjugovan sa molekulom auristatina. U predmetnom opisu imunokonjugat sadrži molekul anti-GCC antitela koji uključuje tri CDR regiona teškog lanca (VH) prema SEQ ID NO: 67, 68 i 69, i tri CDR regiona lakog lanca (VL) prema SEQ ID NO: 70, 71 i 72, konjugovan sa molekulom auristatina. U predmetnom opisu, imunokonjugat sadrži molekul anti-GCC antitela koji uključuje varijabilni region teškog lanca prema SEQ ID NO: 79, i varijabilni region lakog lanca prema SEQ ID NO: 80, konjugovan sa molekulom auristatina. U predmetnom opisu, imunokonjugat sadrži molekul anti-GCC antitela koji uključuje varijabilne regione teškog i lakog lanca prema SEQ ID NO 79 i 80, redom, konjugovan sa molekulom auristatina.

[0242] U predmetnom opisu, molekul auristatina je vezan za cisteinski fragment na molekulu anti-GCC antitela putem linkera koji sadrži maleimidni fragment, npr., maleimidokaproilni fragment.

[0243] U predmetnom opisu, molekul auristatina je kuplovan sa molekulom anti-GCC antitela upotrebom heterobifunkcionalnog linkera koji je povezana sa hidroksilnom grupom na molekulu auristatina. U predmetnom opisu, linker sadrži hidrazon. U predmetnom opisu, linker je hidrazonsko jedinjenje obrazovano reakcijom maleimidokaproilhidrazida i ketokarboksilne kiseline, npr., 5-benzoilvalerinske kiseline. U predmetnom opisu, linker je (Z)6-(2-(6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoil)hidrazono)-6-fenilheksanska kiselina.

[0244] U predmetnom opisu molekul auristatina je kuplovan sa molekulom anti-GCC antitela upotrebom heterobifunkcionalnog linkera koji je spojen sa monometil amino grupom na molekulu auristatina. U predmetnom opisu, linker sadrži fragment koji može da se cepa, npr., peptidni fragment, i samouništavajući p-aminobenzilkarbamatni spejser. Primeri linkera uključuju maleimidokaproil (mc), maleimidokaproil-L-fenilalanin-L-lizin-p-aminobenzilkarbamat i maleimidokaproil-L-valin-L-citrulin-p-aminobenzilkarbamat (vc).

[0245] U predmetnom opisu, GCC-ciljana terapija je imunokonjugat okarakterisan formulom Ab-(vc-MMAF)m(formula (I-4)); Ab-(vc-MMAE)m(formula (I-5)); Ab-(mc-MMAE)m(formula (I-6)); ili Ab-(mc-MMAF)m, (formula (I-7)), u kojoj je Ab molekul anti-GCC antitela koji uključuje svojstva kao što je su svojstva opisana u bilo kojoj od tabela 7, 8, 9 ili 10, S je atom sumpora antitela, i m je u opsegu od oko 1 do oko 15. U predmetnom opisu, m je ceo broj od 1 do oko 5.

[0246] U predmetnom opisu, varijabila m u formulama (I-4), (I-5), (I-6), ili (I-7) je u opsegu od oko 2 do oko 10, od oko 6 do oko 8, od oko 4 do oko 6, od oko 3 do oko 5, ili od oko 1 do oko 3.

[0247] U predmetnom opisu, GCC-ciljana terapija je imunokonjugat formule (I-4), (I-5), (I-6), ili (I-7), u kojoj je Ab molekul antitela koji uključuje tri CDR regiona teškog lanca (VH) prema SEQ ID NO: 67, 68 i 69, i tri CDR regiona lakog lanca (VL) CDR prema SEQ ID NO: 70, 71 i 72, i m je oko 3 do oko 5 (npr., oko 4). U određenim aspektima, Ab koje uključuje CDR regione teškog lanca prema SEQ ID NO: 67, 68 i 69, i tri CDR regiona lakog lanca prema SEQ ID NO: 70, 71 i 72, redom, je humano monoklonsko antitelo, poželjno humano IgG1 antitelo.

[0248] U predmetnom opisu, GCC-ciljana terapija je imunokonjugat formula (I-4), (I-5), (I-6), ili (I-7), u kojoj je Ab molekul monoklonskog antitela koji uključuje varijabilni region teškog lanca prema SEQ ID NO: 79, i varijabilni region lakog lanca prema SEQ ID NO: 80, i m je oko 3 do oko 5 (npr., oko 4). U određenim aspektima, Ab koje uključuje varijabilne regione teškog i lakog lanca prema SEQ ID NO 79 i 80, redom, je humano monoklonsko antitelo, poželjno humano IgG1 antitelo.

[0249] U predmetnom opisu, GCC-ciljana terapija je imunokonjugat formule (I-4), (I-5), (I-6), ili (I-7), u kojoj je Ab molekul humanog monoklonskog antitela IgG koji uključuje sekvencu teškog lanca IgG1 prema SEQ ID NO: 84, i sekvencu Kapa lakog lanca prema SEQ ID NO: 86, i m je oko 3 do oko 5 (npr., oko 4).

[0250] U predmetnom opisu, GCC-ciljana terapija je konjugat GCC-liganda koji može da prođe kroz krvno-moždanu barijeru. Na primer, u određenim aspektima opis se odnosi na GCC-ligand konjugovan sa neuroprotektivnim agensom kao što je L-dopa, koji može da prođe kroz krvnomoždanu barijeru. Primeri takvih konjugata GCC-liganda opisani su u objavljenoj PCT prijavi WO2013/016662. U primerima izvođenja pronalaska, pacijenti koji pate od ili se sumnja da imaju neurološki poremećaj (npr., Parkinsonovu bolest) čiji neuroni eksprimiraju GCC bili bi smatrani dobrim kandidatima za lečenje GCC-ligandom konjugovanim sa neuroprotektivnim agensom.

[0251] U nekim aspektima pronalaska, GCC-ciljana terapija je GCC antagonist. U jednom primeru izvođenja, GCC-ciljana terapija je peptidni antagonist (npr., ST peptid) ili mali molekul inhibitor GCC.

[0252] U nekim aspektima, GCC-ciljana terapija je GCC agonist. U predmetnom opisu, GCC agonist je ST peptid. U predmetnom opisu, GCC agonist je ST peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: H-Cys1-cys2-Glu3-Tyr4-Cys5-Cys6-Asn7-Pro8-Ala9-Cys10-Thr11-Gly12-Cys13-Tyr14-OH (SEQ ID NO: 87), u kojoj postoje tri disulfidne veze: između Cys<1>i Cys<6>, između Cys<2>i Cys<10>, i između Cys<5>i Cys<13>. U predmetnom opisu GCC agonist je peptidni agonist koji vezuje GCC kao što je Linaklotid (Ironwood Pharmaceuticals).

[0253] U predmetnom opisu otkrića, pacijenti čije tumorske ćelije eksprimiraju GCC na svojoj površini bili bi smatrani dobrim kandidatima za lečenje molekulima anti-GCC antitela konjugovanim sa toksinom, kao što je ovde opisani imunokonjugat, ili antitelima konjugovanim sa toksinom kao što je opisano u objavljenoj SAD patentnoj prijavi br. 20110110936. Bez želje za vezivanjem za bilo koju teoriju, pacijenti čije tumorske ćelije eksprimiraju niske količine GCC na svojoj površini, možda nisu dobri kandidati za ovo, ili mogu da budu kandidati za kombinovanje GCC-ciljane terapije sa dodatnim postupkom lečenja, ili da budu kandidati za terapiju “golim” antitelom. U drugom primeru, doza GCC-ciljane terapije bi mogla da se prilagodi tako da reflektuje broj molekula GCC eksprimiranih na površini tumorskih ćelija. Na primer, pacijenti sa velikim brojem molekula GCC na površini tumorskih ćelija mogli bi da budu lečeni nižom dozom GCC-ciljane terapije nego pacijenti sa velikim brojem molekula GCC eksprimiranih na površini tumorske ćelije. Detektovanje prisustva tumorskih ćelija koje eksprimiraju GCC in vivo može da omogući identifikaciju tkiva u kojima je primarni tumor koji eksprimira GCC metastazirao. Saznanje o tome koja tkiva imaju metastaze može da vodi ciljanoj primeni tumorske terapije.

[0254] Kao što je gore razmatrano, ovde opisani molekuli antitela omogućavaju procenu prisustva GCC proteina u normalnim nasuprot neoplastičnih tkiva, čime može da se oceni prisustvo ili ozbiljnost bolesti, uznapredovalost bolesti i/ili efikasnost terapije. Na primer, terapija može da se prati i oceni njena efikasnost. U jednom primeru, GCC protein može da bude detektovan i/ili meren u prvom uzorku dobijenom od subjekta koji ima proliferativnu bolest i može da se započne terapija. Kasnije može da bude uzet drugi uzorak od subjekta i GCC protein u uzorku može da bude detektovan i/ili izmeren. Smanjenje količine GCC proteina detektovano ili izmereno u drugom uzorku može da ukazuje na efikasnost terapije.

[0255] Bez želje za vezivanjem za bilo koju teoriju, da bi GCC-ciljana terapija dospela do tumora koji eksprimira GCC može da bude neophodna vaskularizacija, posebno u slučajevima kada se GCC-ciljana terapija primenjuje intravenski. Prema tome, u određenim primerima izvođenja postupaka prema pronalasku, može da bude korisno proceniti ili okarakterisati vaskulaturu tumora pored, ili zajedno sa detekcijom GCC proteina. Na primer, uzorak tkiva može da se oboji agensom koji identifikuje vaskularnu endotelnu ćeliju, kao što je anti-CD-31 antitelo ili molekul antitela protiv faktora fon Vilebranda, i anti-GCC antitelo prema pronalasku za simultano ili istovremeno karakterisanje ekspresije GCC i vaskularizacije tkiva. U određenim aspektima pronalaska, takva simultana ili istovremena karakterizacija ekspresije GCC i vaskulature korisna je kao alat za selekciju pacijenata za ciljanu terapiju.

[0256] U drugom aspektu, ekspresija GCC na ćelijskoj površini može da bude potrebna za GCC-ciljanu terapiju da bi se postiglo da se tumorske ćelije koje eksprimiraju GCC ubiju. Na primer, neke tumorske ćelije mogu da budu ćelije koje eksprimiraju GCC, ali ne na površini ćelije. Ako terapija zavisi od ekspresije GCC na ćelijskoj površini, takva terapija možda neće moći da ubije ćeliju u kojoj je GCC primarno intracelularan. Prema tome, u nekim primerima izvođenja pronalaska, dijagnostički ili prognostički test može dodatno da uključuje analizu i/ili kvantifikaciju ćelijske lokacije GCC, npr., postupak koji može da napravi razliku i/ili kvantifikuje ekspresiju na ćelijskoj površini od intracelularne ekspresije. Bez želje za vezivanjem za bilo koju teoriju, pacijent čiji tumor primarno ima intracelularnu ekspresiju GCC možda nije dobar kandidat za molekul anti-GCC antitela koji se vezuje za ekstracelularni domen GCC. Alternativno, takav analitički rezultat može podstaći početno lečenje agensom koji indukuje ekspresiju GCC na ćelijskoj površini (videti, npr., PCT objavu br. WO04/071436). Nakon, ili zajedno sa indukcijom GCC ćelijske površine može da se primeni molekul anti-GCC antitela koji ima pristup, ili se vezuje samo za ekstracelularno eksprimirani GCC.

Kompleti

[0257] Obimom pronalaska obuhvaćeni su i kompleti koji sadrže molekul anti-GCC antitela ili imunokonjugat kao što je ovde opisano. Dodatno su uključeni kompleti koji sadrže lipozomske kompozicije koje sadrže molekul anti-GCC antitela ili imunokonjugat. Komplet može da uključuje jedan ili više drugih elemenata uključujući: uputstvo za upotrebu; druge reagense, npr., oznaku, terapijski agens, ili agens koristan za heliranje, ili drugačije kuplovanje, antitelo usmereno na oznaku ili terapijski agens, ili radioprotektivnu kompoziciju; uređaje ili druge materijale za pripremu antitela za primenu; farmaceutski prihvatljive nosače; i uređaje ili druge materijale za primenu kod subjekta. Uputstvo za upotrebu može da uključuje uputstvo za dijagnostičku primenu molekula anti-GCC antitela ili imunokonjugata za detektovanje GCC, in vitro, npr., u uzorku, npr., biopsiji ili ćelijama pacijenta koji ima kancer, ili in vivo. Uputstvo može da uključuje smernice za terapijsku primenu uključujući predložene doze i/ili načine primene, npr., kod pacijenta sa kancerom (npr., kancerom gastrointestinalnog porekla, kao što je, na primer, kancer debelog creva, kancer želuca, kancer jednjaka). Druga uputstva mogu da uključuju uputstva za kuplovanje antitela sa helatorom, oznakom ili terapijskim agensom, ili za prečišćavanje konjugovanog antitela, npr., iz neizreagovane komponente konjugacije. Kao što je gore razmatrano, komplet može da uključuje oznaku, npr., bilo koju od ovde opisanih oznaka. Kao što je gore razmatrano, komplet može da uključuje terapijski agens, npr., ovde opisani terapijski agens. U nekim primenama, antitelo će reagovati sa drugim komponentama, npr., helatorom ili oznakom ili terapijskim agensom, npr., radioizotopom, npr., itrijumom ili lutecijumom. U takvim slučajevima, komplet može da uključuje jednu ili više reakcionih posuda za izvođenje reakcije ili uređaj za razdvajanje, npr., kolonu za hromatografiju, za upotrebu u razdvajanju gotovog proizvoda od polaznih materijala ili reakcionih intermedijera.

[0258] Komplet može dalje da uključuje najmanje jedan dodatni reagens, kao što je dijagnostički ili terapijski agens, npr., dijagnostički ili terapijski agens kao što je ovde opisano, i/ili jedan ili više dodatnih molekula anti-GCC antitela ili imunokonjugata, formulisanih na odgovarajući način, u jednom ili više odvojenih farmaceutskih preparata.

[0259] Komplet može dalje da sadrži radioprotektant. Radiolitička priroda izotopa, npr.,<90>itrijuma (90Y) je poznata. Kako bi se prevazišla ova radioliza, radioprotektanti mogu da budu uključeni, npr., u reakcioni pufer, sve dok su takvi radioprotektanti benigni, u smislu da ne inhibiraju ili drugačije negativno utiču na reakciju obeležavanja antitela, npr., izotopom, kao što je<90>Y. Pufer za formulaciju predmetnog opisa može da uključuje radioprotektant kao što je humani serumski albumin (HSA) ili askorbat, koji smanjuju radiolizi zbog itrijuma ili drugih snažnih radionuklida. Drugi radioprotektanti su poznati u stanju tehnike i mogu takođe da se koriste u puferu za formulaciju predmetnog opisa, tj., hvatači slobodnih radikala (fenol, sulfiti, glutation, cistein, gentizinska kiselina, nikotinska kiselina, askorbil palmitat, HOP(:O)H2I glicerol, natrijum formaldehid sulfoksilat, Na2S2O, Na2S2O3i SO2, itd.).

[0260] Obezbeđeni komplet je koristan za radioaktivno obeležavanje helatorom-konjugovanog proteina ili peptida terapijskim radioizotopom za primenu kod pacijenta. Komplet uključuje (i) bočicu koja sadrži helatorom-konjugovano antitelo, (ii) bočicu koja sadrži pufer za formulaciju za stabilizovanje i primenu radioaktivno obeleženog antitela kod pacijenta, i (iii) uputstvo za izvođenje procedure radioaktivnog obeležavanja. Komplet obezbeđuje izlaganje helatorom-konjugovanog antitela radioizotopu ili njegovoj soli tokom dovoljno vremena pod pogodnim uslovima, npr., kao što je preporučeno u uputstvu. Proizvedeno je radioaktivno obeleženo antitelo koje ima dovoljnu čistoću, specifičnu aktivnost i specifičnost vezivanja. Radioaktivno obeleženo antitelo može da se razblaži do odgovarajuće koncentracija, npr., u puferu za formulaciju, i primeni direktno kod pacijenta sa, ili bez daljeg prečišćavanja. Helatorom-konjugovano antitelo može da se obezbedi u liofilizovanom obliku.

[0261] Primeri koji slede su ilustrativni, ali nisu namenjeni da budu ograničavajući za predmetni pronalazak.

PRIMERI

Primer 1: Stvaranje fuzionog proteina ekstracelularnog domena humanog GCC-mišjeg Fc (hGCC-ECD-mFc)

[0262] Dobijanje fuzionog proteina ekstracelularnog domena (ECD) sekretorne humane (h) guanilil ciklaze (GCC) (hGCC)/konstantnog (Fc) regiona (sa mutacijom u regionu za vezivanje receptora (FcRbr-mutII)) teškog lanca mišjeg imunoglobulina (Ig)G2a (tj., hGCC(ECD)-mIgG2a RcRbr-mutII fuzionog proteina, ovde označenog i kao pLKTOK108 i MIL-44) za imunizaciju i skrining izvedeno je kao što sledi. GCC antigen je pripremljen subkloniranjem dela GCC gena koji kodira sekvencu koja sadrži sledeću GCC sekvencu (signalna sekvenca i ekstracelularni domen) u ekspresioni vektor pLKTOK4:

[0263] Aminokiselinska sekvenca GLy-Arg-Gly-Pro-Gln (SEQ ID NO: 66), na pozicijama 427 do 430, odabrana je da završi ekstracelularni GCC fragment. U GCC, ova sekvenca je neposredno praćena sa Pro koji se dobro poravnava sa Pro na poziciji koja je homologa sa Pro koji se tradicionalno koristi za započinjanje fuzionih proteina Fc humanog IgG1.

[0264] Fc region mišjeg IgG2a pLKTOK108 konstruisan je tako da počinje sa aminokiselinskom sekvencom koja predstavlja funkcionalni završetak CH1 domena [Pro-Arg-Valin (Val)-Proizoleucin (Ile)-treonin (Thr)-Glu-asparagin (Asn)] (SEQ ID NO: 58). Dva regiona su mutirana u konstantnom regionu IgG2a miša. Pored mutacija leucin (Leu)-Leu-Gly-Gly (SEQ ID NO: 59) u Leu-alanin (Ala)-Gly-Ala (SEQ ID NO: 60) (pozicije 234 do 237 Lizin [Lys]-Lys-Gly-Gly (SEQ ID NO: 61) u Lys-Ala-Gly-Ala (SEQ ID NO: 62), drugi receptorski region Fc na pozicijama 318 do 322 je takođe mutiran kao što sledi: glutaminska kiselina (Glu)-fenilalanin (Phe)-Lys-cistein (Cys)-Lys (SEQ ID NO: 63) u AlaPhe-Lys-Cys-Lys (SEQ ID NO: 64) a zatim u Phe-Lys-Cys-Lys (SEQ ID NO: 65).

[0265] Kada je kompletna sekvenca fuzionog proteina konstruisana, dodate su granične sekvence restrikcionog enzima za BamHI i Xbal, kao i Kozak sekvenca (CTCACC) i terminalni stop kodon za kompletiranje cDNK fuzionog proteina. Nukleotidne i aminokiselinske sekvence fuzionog proteina pLKTOK108 (hGCC/mIgG2a FcRmutII) date su ispod (restrikciona mesta BamHI i Xbal prikazana su malim slovima u SEQ ID NO: 47):

Nukleotidna sekvenca humanog GCC-ECD/mišjeg IgG2a Fc (SEQ ID NO: 47):

Aminokiselinska sekvenca humanog GCC-ECD/mišjeg IgG2a Fc (SEQ ID NO: 48):

[0266] Kao što je gore navedeno, rekombinantni protein pLKTOK108 kombinuje ekstracelularni region humanog GCC fuzionisan sa Fc regionom mišjeg IgG2a u kome su dva mutirana regiona koja vezuju Fc receptor (FcRs) mutirana da spreče vezivanje Fc receptora (mIgG2a FcRmutII). Insert rekombinantne DNK za pLKTOK108 stvoren je PCR postupkom u tri koraka kao što sledi: Prvi korak stvorio je DNK fragmente prilagođenog ekstracelularnog humanog GCC i prilagođenog FcRmutII mišjeg IgG2a koji sadrže 35 nukleotida preklapajućih sekvenci. Ove PCR reakcije koristile su matrice i prajmere opisane u tabeli 11 i tabeli 12 sa protokolom opisanim u tabeli 13 za stvaranje dva fragmenta. Ovi DNK fragmenti su izolovani sa 1% agaroznog gela upotrebom kompleta Qiagen Gel Purification Kit (Valencia, CA). Matrica za humani GCC obezbeđena je pomoću vektora koji eksprimira protein koji sadrži sekvencu za humani GCC (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, SAD. Matrica za Fc domen dobijena je sa ekspresionog konstrukta za humani 1228 fuzionisanog sa mišjim IgG2aFc sa dva mutirana regiona koja vezuju Fc receptor (FcRmutII), označena kao pLKTOK84, koji su stvoreni upotrebom vektora pLKTOK61 (opisano u SAD patentu br.7,053,202) kao matrice.

Tabela 11: Matrice korišćene u prvom koraku PCR reakcija sklapanja za stvaranje rekombinantne DNK za pLKTOK108

Tabela 12: Prajmeri korišćeni u svim PCR reakcijama za stvaranje pLKTOK108

Tabela 13: Protokol reakcije korišćen u prvom koraku PCR reakcija sklapanja za stvaranje rekombinantne DNK za pLKTOK108

[0267] Druga PCR reakcija je kombinovala matrice u koncentracijaa navedenim u tabeli 14. Protokol reakcije naveden u tabeli 15 stvorio je jedan gen za rekombinantni fuzioni protein. Proizvod ove reakcije korišćen je direktno kao matrica u trećoj PCR reakciji.

Tabela 14: Matrice korišćene u drugom koraku PCR reakcija sklapanja za stvaranje rekombinantne DNK za pLKTOK108

Tabela 15: Protokol reakcije korišćen u drugom koraku PCR reakcija sklapanja za stvaranje rekombinantne DNK za pLKTOK108

[0268] Treća PCR reakcija je koristila matrice i prajmere opisane u tabeli 16 i tabeli 12 sa protokolom opisanim u tabeli 17 ispod za stvaranje kompletnih fragmenata. Ovi DNK fragmenti su izolovani sa 0.7% agaroznog gela upotrebom kompleta Qiagen Gel Purification Kit (dodatak F), i kompleta za kloniranje TOPO® TA sa tiamin adenozin (TA) lepljivim krajevima (dodatak F). Jedinstveni klonovi su izolovani i DNK je prečišćena upotrebom DNK miniprep kompleta Qiagen (dodatak F). DNK je sekvencirana sa prajmerima M13f, M13r i pSMUCH2 za identifikovanje onih sa željenom sekvencom. Intermedijerni TOPO klon TOK108-15 sadržao je željenu rekombinantnu DNK sekvencu.

Tabela 16: Matrice korišćene u trećem koraku PCR reakcija sklapanja za stvaranje rekombinantne DNK za pLKTOK108

Tabela 17: Protokol reakcije korišćen u trećem koraku PCR reakcija sklapanja za stvaranje rekombinantne DNK za pLKTOK108

[0269] Za dobijanje ekspresionog vektora pLKTOK4, korišćen je pcDNK3.1™ kao osnovni vektor. On sadrži neomicinski (NEO) gen za otpornost na G-418 (Geneticin<®>) da bi se omogućila laka selekcija pod uslovima istraživanja. Restrikciono mesto SpeI je uklonjeno iz pcDNK ™3.1 usmerenom mutagenezom. Promotor EF-1α iz plazmida pcDEF3 (originalno pEF-BOS4) ubačen je u pcDNK ™3.1, čime je uklonjen promotor CMV. Kružna mapa ekspresionog vektora pLKTOK4 prikazana je na slici 1.

[0270] Kloniranje je izvedeno na finalnim PCR proizvodima upotrebom kompleta TOPO® TA Cloning Kit. Nakon digestije sa BamHI i XbaI restrikcionim enzimima, željeni fragment iz TOPO klona je ligiran u ekspresioni vektor pLKTOK4 koji je takođe digestiran sa BamHI i XbaI. Reakcija ligacije je korišćena za transformaciju hemijske kompetente K12 ćelija E.coli, a zatim je sprovedena selekcija na bujonu Luria (LB)/pločama agara sa ampicilinom. Plazmidi iz pojedinačnih E. Coli klonova su izolovani upotrebom QIAGEN DNK miniprep kompleta i sekvencirani sa prajmerima SP6 (SEQ ID NO: 55), EF5S (SEQ ID NO: 54) i pSMUCH2 (SEQ ID NO: 53).

[0271] Klon za koji je utvrđeno da sadrži željenu rekombinantnu DNK pomoću DNK sekvenciranja korišćen je za pravljenje velike količine čiste plazmidne DNK upotrebom QIAGEN Maxiprep kompleta. DNK dobijena upotrebom ovog kompleta korišćena je za transfekciju dihidrofolat reduktaza-deficijentnih ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO-DG44).

[0272] Ćelijska linija CHO-DG44 adaptirana na rast u suspenziji i medijum bez seruma, nazvana S1-CHO-DG44, korišćena je za razvoj ćelijskih linija koje proizvode pLKTOK108. Ukratko, transfekcije su urađene upotrebom uređaja Nucleofector<®>kompanije Amaxa Biosystems i Nucleofection® kompleta V upotrebom nelinearizovane, cirkularne DNK ili linearizovane plazmidne DNK obrađene restrikcionim enzimom Pvu I. Transficirane ćelije su održavane u medijumu za rast IS-CHO-V-GS 48 časova pre izmene sa selkcionim medijumom G-418. Žive, transficirane ćelije su nahranjene svežim selekcionim medijumom G-418 i održavane u kulturi do dostizanja konfluentnosti (∼10 do 14 dana). Produktivnost svakog transficiranog pula za pLKTOK108 procenjivana je upotrebom ELISA testa za mišji IgG2a i ćelije su umnožene za pravljenje banaka zamrznutih ćelija. Transficirani pul sa najvišom produktivnošću prema ELISA testu za mišji IgG2a identifikovan je za kloniranje postupkom graničnog razblaženja u kome su ćelije zasejane na 5 ploča za kulturu tkiva sa 96 bunarčića u selekcionom medijumu G-418 (približno 1 ćelija u svakom drugom bunarčiću). Ploče sa 96 bunarčića su inkubirane u inkubatoru na 37°C sa 5% CO2tokom 2 nedelje bez hranjenja. Pedeset μL supernatanta iz svakog bunarčića koji je imao jednu koloniju preneto je direktno u ploču za test sa 96 bunarčića za izvođenje ELISA testa za mišji IgG2a. Dvadeset tri klona sa visokom produktivnošću su identifikovana i sekvencijalno umnožena na pločama za ćelijsku kulturu sa 24 bunarčića, a zatim na pločama za ćelijsku kulturu sa 6 bunarčića. Titar antitela supernatanta iz ovih klonova meren je u 3 različita razblaženja u ELISA testu za mišji IgG2a.

[0273] Najboljih 6 klonova na osnovu titra mišjeg IgG2a umnoženo je u selekcionom medijumu G-418 da bi se napravile banke zamrznutih ćelija i prilagođene su na suspenzioni medijum bez seruma Sigma br.21. Gustina i vijabilnost ćelija određene su upotrebom analizatora Automated Cell Culture Cedex, a koncentracija proteina u supernatantu merena je upotrebom ELISA testa za mišji IgG2a. Kada su ćelije dostigle logaritamsku fazu rasta, sakupljene su i zamrznute na -80°C preko noći, a zatim prenete u kriokomoru za skladištenje sa tečnim azotom.

[0274] Da bi se proizveo fuzioni protein, ćelije su odmrznute i zasejane, a zatim serijski umnožene u većim T-flaskovima, a zatim u bocama koje se mućkaju pri polaznim gustinama od 3.0x10<5>ćelija/mL i inkubirane u inkubatoru sa ovlaživačem podešenom na 37°C, sa 5% CO2na orbitalnom šejkeru podešenom na 105 rpm. Finalne kulture su nahranjene sa 10% zapremine specijalnog hranljivog medijuma Sigma br.21 4. i 7. dana, i 5% zapremine 10. dana. Hranljivi medijum Sigma br. 21 sastoji se od medijuma Sigma br. 21 obogaćenog sa 40 g/L glukoze, 10 g/L L-glutamina, 10 g/L ekstrakta kvasca, i 10 g/L soja peptona. Mućkana kultura je sakupljena centrifugiranjem. Supernatant koji sadrži sekretovani pLKTOK108 protein je filtriran kroz polietarsulfonsku (PES) membransku filtersku jedinicu sa niskim vezivanjem proteina promera 0.2 μm, sa sirovim filtratom koji sadrži pLKTOK108 spremnim za prečišćavanje ili skladištenim na -80°C za buduće prečišćavanje.

[0275] Polazno prečišćavanje uključivalo je cirkulaciju filtriranih supernatanta koji sadrže pLKTOK108 preko Protein A sefarozne kolone na približno 4°C. Smola je zatim oprana pomoću PBS pH7.4, i protein je eluiran 0.1M glicinom u PBS na pH 3.0 i neutralizovan 1M natrijum fosfatom na pH 6.5. Neutralizovani eluat je koncentrovan upotrebom koncentratora Vivaspin sa graničnom vrednošću molekulske težine (MWCO) od 30KDa i nanesen na kolonu za ekskluzionu hromatografiju (SEC) Superdex 200 (dodatak G) koja je prethodno uravnotežena puferom PBS pH 7.4 u cilju odvajanja agregata ovog proteina. Prečišćeni protein pLKTOK108 eluira kao jedan pik, sa čistoćom potvrđenom metodom SDS-PAGE i bojenjem Coomassie bojom. Frakcije koje sadrže hGCC(ECD)/mIgG2a Fc homodimere su sakupljene. Nakon što je koncentracija sakupljenog materijala određena pomoću UV apsorbance na 280 nm na spektrofotometru NanoDrop™ ND1000, prečišćeni protein pLKTOK108 je podeljen u alikvote i skladišten na - 80°C.

Primer 2: Dobijanje mAb kunića imunizacijom proteinom

[0276] Monoklonska antitela kunića protiv fuzionog proteina hGCC(ECD)-mIgG2a RcRbr-mutII (pLKTOK108) stvorena su upotrebom servisa RabMAb® koji pruža kompanija Epitomics (Burlingame, CA). U svrhu stvaranja MAb, fuzioni protein hGCC(ECD)-mIgG2a RcRbr-mutII (pLKTOK108) u ovom dokumentu je označen kao MIL-44.

[0277] Tri kunića (ML1009, ML1010 i ML1011) su imunizovana sa MIL-44 upotrebom uobičajenih tehnika imunizacije. Serumski titrovi protiv MIL-44 i ne-GCC antigena za obrnuti skrining (hMadCAM-mFc) procenjeni su upotrebom probnih krvarenja. Buster imunizacije su sprovedene nakon početnih imunizacija. Kunić sa najvišim serumskim titrom, kunić ML1010, izabran je kao kandidat za splenektomiju i monoklonsku fuziju upotrebom ćelijske linije koja je fuzioni partner i postupcima u vlasništvu kompanije Epitomics.

[0278] U dva odvojena dana (1. dana i 2. dana), dve stotine miliona limfocitnih ćelija fuzionisano je sa 100 miliona ćelija koje su fuzioni partner i zasejano na 20 ploča sa 96 bunarčića, redom. Ploče su držane u inkubatorima za kulturu tkiva pod standardnim uslovima. Rast ćelija ispitivan je 2-3 nedelje nakon fuzije i efikasnost fuzije je izračunata pomoću broja bunarčića u kojima se javio rast podeljenog ukupnim brojem ispitivanih bunarčića. Izmerena efikasnost fuzije za fuziju 1. dana bila je 72% fuzione efikasnosti, dok je efikasnost fuzije 2. dana bila 79%. Najmanje dve ploče ispitane su za svaku fuziju kao što sledi:

Svih 40 ploča skenirano je upotrebom standardnih ELISA metoda sa pločama obloženim sa 50 ng MIL-44/bunarčiću. Mešavina ML1010 u razblaženju 1:10K korišćena je kao pozitivna kontrola.151 klon koji je imao O.D. veću od 0.5 smatran je potencijalno pozitivnim i dalje je umnožavan u ploči sa 24 bunarčića.

[0279] Naredni potvrdni skrining sproveden je pomoću ELISA testa upotrebom ploča obloženih sa 50 ng MIL-44 ili 50 ng hMadCAM-mFc/bunarčiću. Potvrđeno je da su 143 klona pozitivna protiv MIL-44 i među njima 72 je identifikovano kao specifično za MIL44, tj., oni su bili negativni protiv hMadCAM-mFc proteina.

[0280] Nakon procene multiklonalnog supernatanta, nekoliko multiklonova specifičnih za MIL-44 je subklonirano: uključujući multiklon br. 148 i br. 67. Subkloniranje je urađenom upotrebom metode graničnog razblaženja ćelija. Nekoliko supernatanta subklonova je podvrgnuto skriningu pomoću ELISA testa. Ćelije hibridoma za subklonove br. 148-2 i br. 67-4 odabrane su zamrzavanje/pravljenje banke i za dalji skrining i analizu kao reagens za detekciju GCC u imunohistohemijskom (IHC) testu, kao što je opisano u primeru 3.

[0281] Antitela MIL-44-148-2 i MIL-44-67-4 su takođe klonirana u pcDNK3.1+ neo (Invitrogen) za proizvodnju prolaznom transfekcijom u sisarskim ćelijama i za sekvenciranje. Sekvence nukleinske kiseline i aminokiselinske sekvence za teški i laki lanac za MIL-44-148-2 i MIL-44-67-4 antitela date su ispod. Signalna sekvenca u svakom lancu IgG prikazana je kurzivom; varijabilni region u svakom lancu IgG prikazan je podebljanim slovima; CDR regioni su podvučeni.

Sekvenca nukleinske kiseline MIL-44-148-2 H2 (SEQ ID NO: 4)

Aminokiselinska sekvenca MIL-44-148-2 H2 (SEQ ID NO: 42)

Sekvenca nukleinske kiseline MIL-44-148-2 L5 (SEQ ID NO: 5)

Sekvenca nukleinske kiseline MIL-44-67-4 H2 (SEQ ID NO: 6)

Sekvenca nukleinske kiseline MIL-44-67-4 L4 (SEQ ID NO: 7)

Aminokiselinska sekvenca MIL-44-67-4 L4 (SEQ ID NO: 45)

Primer 3: Imunohistohemija upotrebom anti-GCC antitela

Detekcija ekspresije GCC u humanim tumorskim kenograft modelima za mCRC

[0282] IHC test koji koristi antitela MIL-44-148-2 razvijen je za procenu ekspresije GCC u HEK293-GCC ksenograftskim tumorima i nekoliko ksenografta primarnih humanih tumora (PHTX) poreklom iz uzoraka pacijenata sa metastatskim kolorektalnim kancerom (mCRC) u ženkama SCID miševa.

[0283] Nivoi proteina GCC u tkivima fiksiranim u formalinu i obloženim parafinom (FFPE) procenjivani su na isečcima debljine 5 μm i inkubirani sa MIL-44-148-2 antitelom (3.5 μg/mL) tokom 1 časa u automatskom uređaju za bojenje Ventana Medical Systems (Tucson, AZ) Discovery XT®. Antitela su biotinilisana sekundarnim anti-kozjim antitelom kunića (Vektor Laboratories) i razvijena pomoću sistema mape supstrata 3,3’-diaminobeksidina (DAB) (Ventana Medical Systems). Isečci su kontrastno obojeni hematoksilinom i snimljeni upotrebom sistema za skeniranje celog preparata Aperio.

[0284] Nivoi GCC su se značajno razlikovali među ovim tumorima prema H-skorovima (sistem bodovanja opisan ispod) u opsegu od 4+ u HEK293-GCC ksenograftima tumora, i od 1+, 1-2+, 2+, 2-3+, i 4+ u različitim PHTX ksenograftima tumora. Uopšteno, u tumorima sa umereno/dobro diferenciranim tumorskim ćelijama koje su održale polarizovanu epitelnu strukturu, GCC je bio koncentrisan na strani lumena u tumorskom tkivu.

Detekcija ekspresije GCC u uzorcima humanog debelog creva i tumorskim mikromatricama

[0285] Ovde opisana antitela MIL-44-148-2 i MIL-44-67-4 su takođe podvrgnuta skriningu kao reagens za detekciju GCC u gore opisanom IHC protokolu upotrebom gore navedenih ksenografta primarnih humanih tumora (PHTX), ćelijskih peleta HT29 i HEK293 transficiranih sa GCC, pored uzoraka humanog malignog i benignog debelog creva (FFPE i tumorske mikromatrice (TMA)).

[0286] HT-29 i HEK293 ćelijski peleti transficirani sa GCC bojili su se kao što je očekivano. PHTX su pokazali širok opseg intenziteat bojenja sa klonovima MIL-44-148-2 i MIL-44-67-4. I MIL-44-148-2 i MIL-44-67-4 su se bojili pozitivno u dobro ili umereno diferenciranom karcinomu debelog creva in situ ili u metastazi. Slabo diferencirani tumori su se bojili manje intenzivno. Normalno tkivo debelog creva pokazalo je pozitivno apikalno bojenje upotrebom antitela proizvedenih u oba subklona MIL-44-148-2 i MIL-44-67-4.

[0287] Antitela iz oba subklona MIL-44-148-2 i MIL-44-67-4 dala su očigledno, intenzivno i specifično bojenje u HEK293 ćelijama i HT29 ćelijama transficiranim sa GCC bez ikakvog nespecifičnog bojenja u parentalnim ćelijskim linijama HEK293 i HT29. Oba klona takođe su se bojila pozitivno u dobro ili umereno diferenciranom karcinomu debelog creva in situ ili u metastazi. Kod oba subklona zapaženo je manje bojenja u slabo diferenciranim karcinomima. Normalno debelo crevo pokazalo je pozitivno apikalno bojenje sa oba klona, kao što se i očekivalo. MIL-44-148-2 je pokazalo ukupno veću senzitivnost i specifičnost od MIL-44-67-4 u IHC. Dok je MIL-44-67-4 pokazalo bolji dinamički opseg nego MIL-44-148-2 u ćelijskim peletima, MIL-44-148-2 je pokazalo superioran dinamički opseg u odnosu na MIL-44-67-4 u TMA. Ukupno, subklon MIL44-148-2 je pokazao superiornost nad MIL-67-4, ispoljavajući veću senzitivnost i specifičnost u IHC, i puni dinamički opseg u TMA, i intenzivno bojenje (+2 IHC skor) u normalnom debelom crevu pri niskoj koncentraciji.

[0288] Na osnovu rezultata gore opisanih početnih IHC eksperimenata, subklon MIL-44-148-2 je odabran za razvoj i validaciju automatizovanog protokola ekvivalentnog gore opisanom IHC protokolu upotrebom automatizovanog uređaja za bojenje Tek-Mate. Automatizovani IHC test je koristan alat za skrining pacijenata sa kancerom na tumore koji eksprimiraju GCC kao kriterijum za uključivanje u kliničko ispitivanje za kancerski terapeutik usmeren na GCC, i uopšteno kao alat za skrining za izbor pacijenata (npr., pacijenata sa kancerom) koji bi trebalo da prime GCC-ciljanu terapiju.

[0289] IHC protokol prikazan u tabeli 18 razvijen je za detekciju GCC u FFPE humanim ćelijama i tkivima, i približno 53 kolorektalna tumora i 20 normalnih tkiva debelog creva, kao i 2 TMA kancera debelog creva (nabavljena od US Biomax) podvrgnuta su skriningu za ekspresiju GCC. Ovi tumori pokrivaju opseg stadijuma tumora kao i metastatskih tkiva kancera debelog creva.

[0290] Iz različitih uzoraka tkiva pripremljeni su isečci od četiri mikrona. Vosak je uklonjen sa isečaka tkiva uz pomoć 4, 5-minutne promene ksilena praćene stepenastom serijom alkohola do destilovane vode. Oporavak epitopa izazvan toplotom pare (SHIER) korišćen je sa rastvorom SHIER2 tokom 20 minuta u kapilarnom otvoru gornje komore parne jedinice Black i Decker.

Tabela 18A: Procedura IHC

Tabela 18B: Specifikacija reaktivnosti antitela

[0291] Stručnjak u oblasti će prepoznati da pojačivač primarnog antitela može da bude sekundarno antitelo protiv kunića razvijeno u vrstama drugačijim od kunića (npr., čovek, pacov, koza, miš, itd.) koje ima isti izotip kao mAb MIL44-148-2 ili MIL-44-67 kunića (IgG kunića) ili slični reagens koji je pogodan za pojačavanje MIL-44 signala.

[0292] Gornji protokol koristi prekonoćnu inkubaciju antitela MIL-44-148-2 pri 1.0 μg/ml sa peroksidaznom detekcijom koja se ne zasniva na biotinu (komplet Ultravision kompanije Thermo/Lab Vision) i sa DAB u svojstvu hromogena. Ova procedura je u potpunosti automatizovana upotrebom TechMate 500 ili TechMate 1000 (Roche Diagnostics). Posle bojenja, preparati su dehidratisani kroz seriju alkohola do apsolutnog etanola što je praćeno ispiranjima ksilenom. Preparati su trajno pokriveni pokrovnom ljuspicom pomoću staklenih pokrovnih ljuspica i CytoSeal. Preparati su ispitani pod mikroskopom da bi se procenilo bojenje. Pozitivno bojenje je prikazano prisustvom smeđeg (DAB-HRP) reakcionog proizvoda. Kontrastno bojenje hematoksilinom daje plavo bojenje jedra za procenu morfologije ćelije i tkiva.

[0293] Nakon procene GCC bojenja, utvrđeno je da bi pristup H-skora bio najbolji pristup za kvantifikaciju ekspresije GCC. Pristup H-skora pruža optimalnu rezoluciju podataka za određivanje varijacije u intenzitetu i procentu tumorskog bojenja unutar i među tipovima tumora. On takođe obezbeđuje dobar alat za određivanje pragova za pozitivno bojenje. U ovom postupku, dat je procenat ćelija (0-100) u tumoru sa intenzitetima bojenja u opsegu od 0-3+. Pomoću ovog postupka, dati su skorovi sa intenzitetima od 0, 0.5, 1, 2 i 3. U zavisnosti od markera, bojenje od 0.5 može da bude bodovano kao pozitivno ili negativno, i odslikava blago, ali primetno bojenje za taj marker. Da bi se dobio H-skor, procenat tumorskih ćelija se množi svakim intenzitetom i sabira: H skor = (% tumor∗1) (% tumor∗2) (% tumor∗3). Na primer, ako je tumor 20% negativan (0), 30% 1, 10% 2, 40% 3, to bi dalo H skor od 170.

[0294] Maksimalni H-skor je 300 (100% ∗ 3), po subcelularnoj lokalizaciji (tj., apikalno ili citoplazmatski), ako se 100% tumorskih ćelija označi intenzitetom 3+. Polazno, kao kontrola, sam ukupni H-skor se ne koristi za poređenje uzoraka, već se procenjuje zajedno sa pregledom raspodele procenta ćelija za svaki intenzitet. Na primer, skor od 90 bi mogao da predstavlja 90% bojenja tumorskih ćelija intenzitetom 1+ ili 30% ćelija intenzitetom 3+. Ovi uzorci imaju isti H-skor, ali veoma različitu ekspresiju GCC. Procenat ćelija za bodovanje na svakom intenzitetu može da varira, ali se obično boduju u koracima od 10%; međutim, mali procenat bodovanja jedne komponente može da bude procenjen na 1% i 5% kao i da bi se pokazalo da je određeni nivo bojenja prisutan. Za GCC, apikalno bojenje može da se razmatra za procenu u malim koracima, kao što je 1 i 5%.

[0295] Dve različite subcelularne lokalizacije su bodovane za GCC upotrebom pristupa H-skora. One uključuju citoplazmatsko bojenje i apikalno bojenje. Obrazac citoplazmatskog bojenja uopšteno je zapažen kao difuzno bojenje kroz citoplazmu tumorskih ćelija. Međutim, u nekim slučajevima postojale su varijacije citoplazmatskog bojenja, koje su uključivale intenzivno globularno bojenje ili tačkasto, grubo zrnasto bojenje. Intenzivno globularno bojenje bodovano je kao 3+ citoplazmatsko bojenje. Tačkasto bojenje je povezano sa apikalnim bojenjem i nije dat odvojeni skor za ovaj tip citoplazmatskog bojenja (n=4 uzorka za tačkasto bojenje). Apikalno bojenje GCC je zapaženo kada je bio prisutan lumen. Ostali zapaženi obrasci GCC bojenja uključivali su bojenje koje ne obuhvata lumen tipa membrane (jedan slučaj) i ekstracelularno bojenje prisutno u lumenu tumora. Kod normalnih tkiva debelog creva, bojenje je uopšteno bilo apikalno zajedno sa difuznim citoplazmatskim bojenjem.

[0296] Budući da su H skorovi dobijeni i za citoplazmatsko i za apikalno ekspresija GCC, i budući da nije poznato da li je jedan tip lokalizacije kritičniji u odnosu na drugi za efikasnost GCC-ciljane terapije, svi podaci su snimljeni i u nekim slučajevima, dobijen je zbirni H skor upotrebom zbira apikalne i citoplazmatske ekspresije GCC. U tim slučajevima, maksimalni H skor postaje 600 za zbirni skor (300 apikalno 300 citoplazmatsko).

[0297] Ukupno, bojenje u uzorcima normalnog debelog creva ilustruje da je GCC anatomski favorizovan, budući da se eksprimira na apikalnoj površini. GCC je eksprimiran na više od 95% tumorskih uzoraka i, nasuprot normalnom tkivu, pokazuje difuzno citoplazmatsko bojenje u nekim slučajevima. Snažno fokalno GCC bojenje u uzorcima humanih CRC metastazama jetre takođe je zapaženo.

[0298] Tabela 19A prikazuje rezultate H-skora za citoplazmatsko i apikalno bojenje za normalna i tumorska tkiva koja su bila podvrgnuta skriningu. Podaci prikazani u tabeli 19A su raspoređeni prema poreklu uzorka (interni (označeni kao MLNM), TMA (označeni kao BIOMAX) i CRO (označeni kao QualTek)) i stepenu tumora. Sumirani podaci za pozitivnost dati su kada se koriste pragovi od 0.5 i 1.0+ intenziteta bojenja. Bodovana su ukupno 173 uzorka tumora. Pri upotrebi vrednosti praga od 0.5+ za pozitivni intenzitet bojenja za citoplazmatsko ili apikalno bojenje, 95% tumora smatrano je pozitivnim. Pri upotrebi vrednosti praga od 1.0+, 92% uzoraka smatrano je pozitivnim.

[0299] Izvor tkiva pokazuje varijacije u procentu pozitivnih tumorskih ćelija kao i H-skorovima. Za vrednost praga od 1+ za pozitivnost bojenja, opseg je od 84% (MTB uzorci CRO tumora) do 100% (interni uzorci ili CRO pojedinačni uzorci tkiva - zapaziti manji broj uzoraka u ovim grupama). Interna tumorska tkiva pokazala su veoma visok apikalni H-skor od 253 (n=9 uzoraka). Takođe su postojale razlike u rezultatima bodovanja za 2 TMA. US Biomax TMA C0992 su se bojili jače od C0701. Bez želje za vezivanjem za neku određenu teoriju, razlike između TMA mogu da budu posledica razlike u fiksacijama na izvoru tkiva ili je jedan blok mogao da bude isečen skorije od drugog.

[0300] Stabilnost antigena u isečku i svežina isečenih uzoraka su razmatrani. Uzorci ispitivani u ovoj studiji uključivali su uzorke koji su isečeni i skladišteni i uzorke koji su sveže isečeni, ukazujući na potrebu da se dodatno istraži stabilnost uzoraka tkiva tokom vremena.

[0301] Zapažene su izvesne razlike u pozitivnosti GCC i stepenu tumora (videti tabelu 19B), sa pozitivnijim bojenjem udruženim sa dobro diferenciranim tumorima nasuprot slabo diferenciranim tumorima (šest tumora kompanije US Biomax nisu uključivali stepen). Stepen 1 tumora (n=20) pokazao je 100% pozitivnosti; Stepen 2 tumora (n=95) obeležilo je 98% pozitivnih slučajeva; i stepen 3 tumora (n=44) obeležen je stopom pozitivnosti od 88%. Slabo diferenciranim tumorima uglavnom nedostaje lumen, što može da rezultira nekim od ovih smanjenja bojenja zbog izostanka apikalnog bojenja. Ovaj procenat pozitivnost zasnovan je na vrednosti praga od 0.5+ intenziteta bojenja. Sedam od 7 udaljenih metastaza bilo je pozitivno (od internih i CRO tkiva). Metastatski tumori kompanije US Biomax TMA navedeni su kao metastaze na limfnim čvorovima.

[0302] Ukupno, GCC boji veoma visok procenat tumora debelog creva i normalnih tkiva debelog creva bez obzira na izvor tkiva ili stepen tumora.

Tabela 19A: Sažet prikaz bojenja kancera kolona prema izvoru uzoraka

Tabela 19B: Sažet prikaz bojenja kancera kolona prema stepenu tumora

[0303] Preciznost unutar testa IHC testa za GCC procenjena je u jednom ciklusu korišćenjem 5 replikata svaki od tri ćelijska peleta i 14 različitih tkiva karcinoma debelog creva. Ćelijski peleti su pripremljeni na različitim preparatima. Uzorci tumora debelog creva su uključeni u dva različita multi-tumorska bloka. Kod ovih tkiva bodovana je IHC reaktivnost GCC.

[0304] Preciznost bojenja ćelijskih peleta: Gotovo identično bojenje zapaženo je kod svih 5 replikata 3 ćelijska peleta unutar ciklusa.

[0305] Preciznost bojenja uzoraka tumora debelog creva: Vrlo slično do gotovo identično bojenje zapaženo je među 5 replikata 14 uzoraka tumora debelog creva unutar ciklusa. Uzorke je bodovao sertifikovani patolog upotrebom pristupa H-skora kao što je prethodno gore opisano. Standardna devijacija je pokazala da je u svim slučajevima varijansa bila minimalna, pokazujući tako dobru preciznost bojenja u istom ciklusu. Ukupno uzevši, IHC bojenje GCC ispitivanih ćelijskih peleta i uzoraka karcinoma debelog creva unutar ciklusa bilo je veoma dosledno.

[0306] Varijabilnost testa između ciklusa i varijabilnost zbog različitih operatera procenjena je u 5 odvojenih ciklusa IHC bojenja GCC. Četiri ciklusa je izveo jedan operator u različitim danima, a drugi operater je izveo peti ciklus. Bojenje je uključivalo ispitivanje istih tkiva kao u gore opisanom ispitivanju preciznosti.

[0307] Reproducibilnost bojenja ćelijskih peleta: Gotovo identično bojenje između ciklusa zapaženo je kod svih 5 replikata 3 ćelijska peleta.

[0308] Reproducibilnost bojenja uzoraka tumora debelog creva: Vrlo slično do gotovo identično bojenje zapaženo je među 5 replikata 14 uzoraka tumora debelog creva između ciklusa. Uzorke je bodovao sertifikovani patolog upotrebom pristupa H-skora kao što je prethodno gore opisano. Standardna devijacija je pokazala da je u svim slučajevima varijansa bila minimalna, pokazujući tako dobru reproducibilnost bojenja među različitim danima i sa drugim operaterom. Ukupno uzevši, IHC bojenje GCC ispitivanih ćelijskih peleta i uzoraka karcinoma debelog creva između ciklusa i između operatera bilo je veoma dosledno.

[0309] Specifičnost IHC testa za GCC procenjena je ispitivanjem panela normalnih humanih tkiva. Ova normalna humana tkiva su uključivala 30 različitih tipova tkiva: adrenalnu žlezdua, mokraćnu bešiku, kosnu srž, dojku, cerebralni korteks, grlić materice, Falopijeve tube, srce, bubreg, jetru, pluća, limfni čvor, nerv, jajnik, pankreas, parotidnu žlezdu (pljuvačnu žlezdu), hipofizu, placentu, prostatu, skeletni mišić, kožu, kičmenu moždinu, slezinu, želudac, testis, timus, tireoidnu žlezdu, krajnik, ureter i matericu. Za svaki tip tkiva, najmanje 3 jedinstvena uzorka su obojena i procenjena im je GCC imunoreaktivnost.

[0310] Ukupno uzevši, IHC test za GCC upotrebom antitela MIL-44-148-2 pokazao je pomoću ovde opisanog IHC testa da je veoma specifičan za uzorke tumora debelog creva u poređenju sa bojenjem normalnog tkiva, posebno za apikalno bojenje. Apikalno bojenje je detektovano samo u 2 uzorka želuca; međutim, ovo bojenje je takođe zapaženo u negativnoj kontroli. Citoplazmatsko bojenje, uglavnom blago, zapaženo je u nekoliko tipova tkiva, uključujući folikul jajnika (1 od 3 uzorka), kožu (folikul i dermis, 2 od 3 uzorka), parijetalne ćelije želuca (2 od 3 uzorka), žlezdani epitel prostate (blago u 3 od 3 slučaja), hipofizu (2 od 3 slučaja), epitel materice (3 od 3 slučaja), epitel Falopijevih tuba (2 od 3 slučaja), trofoblast placente (blago u 2 od 3 slučaja) i pluća (endotel u 3 od 3 slučaja i epitel bronhiola u 1 od 3 slučaja). Najjače citoplazmatsko bojenje (2+) bilo je prisutno u jednom slučaju Falopijevih tuba i jednom slučaju hipofize. U oba slučaja postojalo je blaže bojenje u istim odeljcima negativne kontrole. Plazma ćelije su bile pozitivne u brojnim tkivima, uključujući slezinu, krajnik i limfni čvor. Histiociti su bili pozitivni u slezini, plućima i limfnom čvoru. Bojenje strome bilo je prisutno u testisu (2 od 3 slučaja), materici (3 od 3 slučaja) i jajniku (1 od 3 slučaja). Ekstracelularno bojenje krvnih sudova široko je zapaženo i izgleda da predstavlja nespecifično vezivanje seruma.

[0311] GCC test, upotrebom monoklonskog antitela kunića, MIL-44-148-2, na bazi platforme za bojenje TechMate pokazalo je doslednost bojenja tumora i kontrolnih ćelijskih peleta između i unutar ciklusa bojenja. Izgleda da je GCC test visoko senzitivan kod karcinoma debelog creva budući da boji veliku većinu ispitivanih uzoraka tumora debelog creva. Izgleda, takođe, da je GCC test mnogo specifičniji za tumore debelog creva u odnosu na normalna tkiva. Ekspresija GCC zapažena kod mnogih tumora debelog creva je daleko snažnija od bilo kog bojenja zapaženog kod 30 panela normalnog tkiva sa najmanje 3 replikata svakog tipa tkiva. Nikakvo specifično apikalno GCC bojenje nije zapaženo ni u jednom od normalnih tkiva, dok je apikalno bojenje uobičajeno u većini GCC uzoraka. Samo je citoplazmatsko bojenje zapaženo kod nekih tipova normalnog tkiva i ovo bojenje je uglavnom blago. Izgleda da je MIL-44-148-2 antitelo predstavlja reproducibilan, senzitivan i relativno specifičan IHC marker za bojenje tumora debelog creva fiksiranih formalinom, i obloženih parafinom (FFPE).

Primer 4: Dodatna imunohistohemija u ne-kolorektalnim PHTX modelima i tumorskim mikromatricama i kolorektalnim i ne-kolorektalnim humanim kliničkim uzorcima

[0312] Automatizovani IHC test opisan u primeru 3 korišćen je za procenu ekspresije GCC (tj., apikalne, citoplazmatske i/ili zbirne ekspresije GCC) u različitim ne-kolorektalnim uzorcima iz različitih izvora, uključujući ksenografte primarnih humanih tumora (PHTX) poreklom iz uzoraka uzetih od pacijenata sa kancerom želuca i kancerom pankreasa kod ženki SCID miševa, i različitim tumorskim mikromatricama (TMA) nabavljenim kod US BioMax, Pantomics i iz drugih komercijalnih izvora) specifične za kancer pankreasa, kancer želuca, kancer jednjaka, kancer pluća i leiomiosarkome/rabdomiosarkome. Ekspresija GCC je takođe procenjena putem automatizovanog IHC testa opisanog u primeru 3 u različitim humanim kliničkim uzorcima, uključujući uzorke humanih tumora želuca, pankreasa i jednjaka dobijene iz baze podataka tkiva specijalnosti CRO (QualTek) angažovane za automatizovani IHC test, i kolorektalnog kancera, kancera želuca, kancera pankreasa, kancera jednjaka, i kancera tankog creva poreklom od pacijenata sa kancerom ispitanih na ekspresiju GCC pre uključivanja u otvoreno-obeleženu, multicentričnu, dozno-rastuću, prvu studiju na ljudima konjugata antitelo usmereno na GCC-lek, naznačenog kao MLN0264, kod odraslih pacijenata sa uznapredovalim gastrointestinalnim malignitetima koji eksprimiraju guanilil ciklazu C (Studija C26001, ClinicalTrials.gov identifikator NCT01577758).

[0313] Rezultati IHC bojenja u različitim uzorcima normalnih tkiva i kanceroznih kolorektalnih i ne-kolorektalnih tkiva (želuca, pankreasa, tankog creva, jednjaka, pluća, rabdomiosarkoma, leiomiosarkoma) iz različitih izvora (PHTX, humani klinički uzorci i tumorske mikromatrice) prikazani su u tabelama 20-32 ispod. Tabele 20-32 uključuju IHC skorove (0, 0.5+, 1+, 2+ i 3+) i odgovarajuće H skorove izračunate na osnovu IHC skorova za apikalno ("A") i citoplazmatsko ("C" ili "Cito") GCC bojenje u različitim ispitivanim tkivima. Dodatno, tabela 32 prikazuje poređenje podataka o IHC ekspresiji GCC u humanim kliničkim uzorcima primarnog i metastatskog kancera, u oba slučaja poreklom od istog pacijenta. Kao što je prikazano u prvoj levoj koloni, "A" uzorci (tj., 1A, 2A, 3A, 4A, 5A, 6A, 7A, 8A, 9A 10A, itd.), odnose se na primarne uzorke tumora, dok se "B" uzorci (tj., 1B, 2B, 3B, 4B, 5B, 6B, 7B, 8B, 9B, 10B, itd.) odnose na uzorke metastatskog tumora poreklom od istog pacijenta od koga potiče odgovarajući uzorak primarnog tumora (odgovarajući uzorak "A"). Drugim rečima, oznake "1A" i "1B" odnose se na primarne i metastatske tumore, redom, poreklom od istog pacijenta; oznake "2A" i "2B" odnose se na primarne i metastatske tumore, redom, poreklom od drugog pacijenta, i tako dalje. Većina uzoraka tumora prikazanih u tabeli 32 potiču od pacijenata koji imaju primarni i metastatski kolorektalni kancer, osim ako je naznačeno drugačije kao što je prikazano u koloni "Komentari", u tom slučaju konkretan tip nekolorektalnog kancera je naveden. Kao što može da se vidi u koloni "Komentari" u tabeli 32, neki uzorci neuroendokrinih tumora, karcinoma renalnih ćelija, tumora želuca, želudačnog GIST, tumora pankreasa, i leiomiosarkoma materice ispitani su takođe na ekspresiju GCC pomoću IHC testa.

Tabela 20: IHC test u PHTX modelu humanog kancera želuca

a askre pan g ano m hu acerna lk ode m X T PH

21: a abel T

) A

M

(Tsarea k

pan

ora m itutric a

romik m 1

P192 ax

Biom S

U

u C C

G

nje

boje C

:IH

22A ael ab T

Tabela 22B: Rezime GCC bojenja u US Biomax P1921 mikromatricama tumora pankreasa

(TMA)

) A

M

(Tsarea nk pa

ora m tu a am ric at

romik m 02 10 A

P

ax om BiS

U

u C C

G

je en bojC

:IH A

23 la

abeT

Tabela 23B: Rezime GCC bojenje u US Biomax PA1002 mikromatricama tumora pankreasa

(TMA)

1 eo -Dsarea nk pa

ora

tum a am ricta mroik m

481 C PA

ics om

Pantu C C

G

e enjbojC

:IH

24A a

abel T

Tabela 24B: Rezime GCC bojenja u Pantomics PAC481 TMA pankreasa-Deo 1

2 eo a-D askre an p

ora m tu a mica atr m

ikro m

481 C PA

sictom

Pan u C C

G

jejen bo C

H

:I

24C a

abel T

Tabela 24D: Rezime GCC bojenja u Pantomics PAC481 TMA pankreasa-Deo 2

1eo D-

uca žel

ora

tum a am

atric mroik m 01 15 C ST

ax

Biom S

U

u C C

G

jejen bo CIH

25: a

abel T

Tabela 25B: Rezime GCC bojenja u US Biomax STC1501 TMA želuca-Deo 1

2eo D

a-ucžel

ora

tum a am ric atmroik m 01 15 C ST

ax mo BiS

U

u C C

G

e enj

bojC

:IH

25C a

abel T

Tabela 25D: Rezime GCC bojenja u US Biomax STC1501 TMA želuca-Deo 2

kaja

jedn a or

itum ric at

romik m 1

102 SC

E

sic mto

Pan u C C

G

nje

boje C

:IH A

26 la

abeT

Tabela 26B: Rezime GCC bojenja u Pantomics ESC1021 mikromatricama tumora jednjaka

1 oe -D akja n jed

ora

tum a amic atr mroik m 10 S80 E

ax M

Bio S

U

u C C

G

je

bojen C

:IH

27A ael ab T

Tabela 27B: Rezime GCC bojenja u US BioMax ES8010 TMA jednjaka-Deo 1

2eo -D kaja dn je

ora m tu a m ca riatmoikrm 10

S80 E

ax M

Bio S

U

u C C

G

njeje bo C

:IH C

27 la

abeT

Tabela 27D: Rezime GCC bojenja u US BioMax ES8010 TMA jednjaka -Deo 2

ća

plu aro

um it ic atr mroik m 3 81 20 C

L

ax

BioM S

U

u C C

G

jejen bo C HI

:

28A ael ab T

Tabela 28B: Rezime GCC bojenja u US BioMax LC20813 TMA pluća

a

m

ko

sar

io

m

do

ab

a/r

om

ark

ios

m

io

ile

ic

atr

m

ro

ik

jm

o

orsk

tum

u

C C

G

enje

boj

C

:IH

A

29

le

ab

T

a

m

ko

ar

ios

om

abd

a/r

om

rk

sa

io

m

io

ile

ic

atr

m

ikro

m

oj

sk

or

tum

u

b

A

le

ro

nt

ko

ne

iv

at

neg

ja

an

ov

od

bi

at

lt

ezu

:R

B

29

la

abe

T

tkiv ka a at

pod

aze )b

lTek ua (Q O R

C iz a

ncerka

nogtal rek olo

ne-k og an m hu aim

uzorc

imičk

klin u C C

G

nje

boje C

H

:IA

30ela ab

T 2

2,

1,

a

pen

ste

or

(tum

ra

nce ka glno kta ore ol iva i k tk a a nlo ak atko d og po aln

aze )b norm

alTek muarci

(Qzo u O R

C

kim nič )iz ili 3 kli

3 i anim

m

hu

u

C C

G

je

jen

bo

C

:IH

B

30

a

abel

T

C C

G

na genoersm u 64 02 N L

M

atik

peurate e dij stuće tu aso-rzn do I

ze fa 01 00 26 C

iz cizoriuičklin K

31: a

abel T

ora

m

tu

og

ln

kta

ore

kol

og

atsk

etast

i m

g

no

ar

im

pr

a

im

cr

uzo

u

C C

G

a

ij

pres

eks

CIH

32:

a

el

ab

T

Rezime rezultata IHC bojenja GCC

[0314] Rezultati IHC bojenja GCC prikazani u primerima 3 i 4 pokazuju da se GCC eksprimira kod različitih gastrointestinalnih maligniteta, uključujući kolorektalne tumore, tumore želuca, tankog creva i jednjaka, kao i kod ne-gastrointestinalnih tumora uključujući tumore pankreasa i adenokarcinome pluća, karcinome skvamoznih ćelija pluća, leiomiosarkome i rabdomiosarkome. Sažet prikaz različitih analiza tumorskih mikromatrica prikazan je u tabeli 33 ispod.

Tabela 33: TMA analiza pokazuje da se GCC eksprimira u različitim malignitetima

[0315] Humani klinički uzorci gastrointestinalnih i GI-srodnih maligniteta takođe su dali pozitivni rezultat za različite nivoe ekspresije GCC, kao što je rezimirano u tabeli 34 ispod.

Tabela 34: Procenat pozitivnih tumora podvrgnutih skriningu u C26001

[0316] Rezultati rezimirani u tabeli 34 slični su rezultatima zapaženim tokom TMA skrininga sumiranim u tabeli 33.

[0317] Raspodela kombinovanog/zbirnog H-skora ekspresije GCC kod različitih tipova tumora iz skrininga za uključivanje pacijenata u studiju C26001 prikazana je na slikama 2A-2D.

[0318] Raspodela kombinovanog/zbirnog H-skora ekspresije GCC kod različitih ispitivanih kolorektalnih, želudačnih i pankreasnih tumorskih mikromatrica prikazana je na slikama 3A-3C.

Claims

Patentni zahtevi

1. Molekul anti-GCC antitela koji sadrži tri regiona koji određuju komplementarnost teškog lanca (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 21, 22 i 23, redom; i tri regiona koji određuju komplementarnost lakog lanca (LCDR1, LCDR2, i LCDR3) koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 27, 28 i 29, redom.

2. Molekul anti-GCC antitela prema patentnom zahtevu 1, koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 11 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13.

3. Molekul anti-GCC antitela prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, naznačen time, što je molekul antitela:

(a) monoklonsko antitelo; i/ili

(b) antitelo kunića ili antitelo koje potiče od kunića, opciono monoklonsko antitelo kunića ili humanizovano monoklonsko antitelo kunića.

4. Molekul anti-GCC antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, naznačen time, što je molekul antitela konjugovan sa detektabilnom oznakom, pri čemu je detektabilna oznaka odabrana od biološki aktivnog enzima, liganda, prostetičke grupe, fluorescentnog materijala, luminiscentnog materijala, hemiluminiscentnog materijala, bioluminiscentnog materijala, hromofornog materijala, elektronski gustog materijala, paramagnetnog materijala i radioaktivnog materijala.

5. Izolovane sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju molekul antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3.

6. Vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira laki lanac i teški lanac molekula antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, ili koji sadrži izolovane sekvence nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 5.

7. Postupak za proizvodnju molekula antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, koji obuhvata gajenje ćelije koja sadrži izolovane sekvence nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 5 ili vektor prema patentnom zahtevu 6, pod uslovima koji omogućavaju proizvodnju molekula antitela, čime se proizvodi molekul antitela.

8. Postupak za detekciju molekula GCC u biološkom uzorku koji obuhvata dovođenje u kontakt biološkog uzorka sa molekulom antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3 i određivanje da li se navedeni molekul antitela vezuje za navedeni molekul GCC.

9. Postupak prema patentnom zahtevu 8, naznačen time, što detektovanje molekula GCC uključuje imunohistohemijski test.

10. Postupak prema patentnom zahtevu 8 ili patentnom zahtevu 9, naznačen time, što je navedeni biološki uzorak biopsija tumora dobijena od pacijenta za koga se sumnja da ima kancer koji eksprimira GCC, pri čemu je kancer opciono izapran od kolorektalnog kancera, kancera želuca, kancera tankog creva, kancera jednjaka, kancera pankreasa, kancera pluća, sarkoma mekog tkiva, neuroektodermalnog tumora i neuroendokrinog tumora.

11. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 8 do 10, koji dalje obuhvata kvantitativno određivanje apikalne i/ili citoplazmatske ekspresije GCC u navedenom biološkom uzorku.

12. Postupak prema patentnom zahtevu 11, naznačen time, što kvantitativno određivanje obuhvata pristup H-skora.

13. Komplet koji sadrži molekul anti-GCC antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4 i uputstvo za upotrebu.

14. Postupak određivanja osetljivosti ćelija kancera na GCC-ciljanu terapiju i/ili procene da li je subjekt potencijalni kandidat za GCC-ciljanu terapiju, koji obuhvata:

i) dovođenje u kontakt uzorka kancerskih ćelija uzetog od pacijenta koji ima kancer sa molekulom antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4; i

ii) detekciju formiranja kompleksa između molekula antitela i GCC proteina u uzorku, čime se određuje osetljivost kancerskih ćelija na GCC-ciljanu terapiju, i/ili se određuje da li je subjekt kandidat za lečenje GCC-ciljanom terapijom.

15. Reakciona smeša koja sadrži biološki uzorak i molekul anti-GCC antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4.

16. Postupak za stvaranje personalizovanog izveštaja o lečenju kancera upotrebom molekula anti-GCC antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, koji obuhvata:

i) dovođenje u kontakt biološkog uzorka koji sadrži jednu ili više kancerskih ćelija uzetih od pacijenta sa kancerom za koga se sumnja da ima kancer koji eksprimira GCC sa molekulom antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4;

ii) detektovanje formiranja kompleksa između molekula antitela i GCC proteina u biološkom uzorku;

iii) kvantitativno određivanje ekspresije GCC u biološkom uzorku iz kompleksa;

iv) poređenje nivoa ekspresije GCC sa bazom podataka koja sadrži GCC-ciljanu terapiju; i v) odabiranje GCC-ciljane terapije i, opciono, doznog režima na bazi nivoa ekspresije GCC određenog u uzorku.

17. Postupak prema patentnom zahtevu 14 ili patentnom zahtevu 16, naznačen time, što je kancer odabran od kolorektalnog kancera, kancera želuca, kancera tankog creva, kancera jednjaka, kancera pankreasa, kancera pluća, sarkoma mekog tkiva, neuroektodermalnog tumora i neuroendokrinog tumora.